CN102123729A - Hsp70作为酶促活性调节物的应用 - Google Patents

Hsp70作为酶促活性调节物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102123729A
CN102123729A CN2009801319859A CN200980131985A CN102123729A CN 102123729 A CN102123729 A CN 102123729A CN 2009801319859 A CN2009801319859 A CN 2009801319859A CN 200980131985 A CN200980131985 A CN 200980131985A CN 102123729 A CN102123729 A CN 102123729A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aminoacid
hsp70
bioactivator
disease
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801319859A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102123729B (zh
Inventor
托马斯·基尔克高·延森
玛丽亚·海伦娜·耶泰莱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zela Denmark Ltd
Original Assignee
Orphazyme AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orphazyme AS filed Critical Orphazyme AS
Priority to CN201410713260.3A priority Critical patent/CN104586846B/zh
Publication of CN102123729A publication Critical patent/CN102123729A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102123729B publication Critical patent/CN102123729B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
    • C12Y306/01003—Adenosine triphosphatase (3.6.1.3)

Abstract

本发明涉及用于调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所述方法包括施用或诱导Hsp70或其功能片段或变体并从而调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的步骤，其中所述Hsp70或其功能片段或变体是适合使BMP和Hsp70或所述功能片段或变体之间相互作用的形式。

Description

Hsp70作为酶促活性调节物的应用
本申请为2008年6月26日提交的丹麦专利申请PA 2008 00885的非临时申请，丹麦专利申请PA 2008 00885通过引用整体并入本文。在该临时申请或本申请中引用的所有专利文献和非专利文献也都通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及通过利用分子伴侣Hsp70和溶酶体的磷脂二(单酰基甘油)磷酸酯(BMP，还被称为LBPA)之间的相互作用来调节酶活性的领域。Hsp70-BMP相互作用调节了溶酶体区室中与BMP相互作用的酶的活性，因此本发明提供了用于逆转溶酶体贮积病理的方式(means)。
背景技术
分子伴侣见于发生蛋白构象重排的细胞的所有区室中，虽然蛋白合成是细胞内不折叠肽的主要来源，但当面临高温或可能使蛋白结构易变并由此易于不折叠和集聚的其它刺激物的冲击时，细胞利用包括产生保护蛋白在内的特定细胞反应进行应对。这种反应是可以在从原核生物至真核生物的各种细胞类型中观察到的现象，被称为热休克反应或热应激反应。由这种反应诱导的蛋白被称为热休克蛋白(HSP)，其具有几个家族。
伴侣分子家族的主要实例是Hsp70蛋白。除了作为伴侣分子外，最近还发现该家族参与细胞稳态的其它方面——最明显地通过其抗凋亡性质，其在免疫中的功能以及癌细胞对Hsp70上调的明显依赖性。此外，Hsp70还可以在保护溶酶体完整性方面发挥作用。然而其分子机制仍不清楚。
溶酶体贮积病是一类罕见疾病，特征是物质在溶酶体区室中集聚并引起溶酶体区室不稳定，由此对受影响的个体具有破坏性作用。由于物质代谢中涉及的酶缺陷而使该物质在溶酶体区室中集聚。
迄今为止，对于多数溶酶体贮积病还没有可用的治疗方法。这类疾病的根本原因是特定溶酶体酶不能够高效地代谢诸如脂质的特定溶酶体物质。因此，已经针对这些疾病中包括戈谢病(Gaucher disease)和法布里病(Fabry disease)的亚组采用通过向患者提供重组酶的酶替代疗法(ERT)。然而，ERT是一种费用非常昂贵的治疗形式，这可能限制了其在某些领域的应用，并且ERT还仅对已经产生重组酶的特定类型的疾病有效。本发明旨在提供用于治疗溶酶体贮积症的新方法。
发明概述
在本发明中，通过提供对Hsp70和细胞膜(尤其是质膜和溶酶体膜)结合的分子基础的理解，公开了Hsp70促进溶酶体膜稳定性的分子基础。
由文献已知Hsp70可以在保护溶酶体完整性中发挥作用，然而其分子机制仍不清楚。此外，对于是否这种作用是主要的应激可诱导的Hsp70(HspA1A/A1B，在本研究中称为Hsp70)所特有的或者是否其它Hsp70家族成员也可能具有相同性质的问题，仍未得到解答。
这些未解答的问题促成了本发明的主要目的之一，即研究Hsp70的溶酶体保护作用的分子基础。为此，建立了产生重组Hsp70及其突变体的方法，即基于碘克沙醇梯度超离心的亚细胞分级(subcellular fractionation)方案。在光致氧化诱导的溶酶体通透化的基础上建立了直接评价溶酶体膜完整性的实验，该实验使得可进行实时显微法评价Hsp70和其它成分敏化或保护溶酶体膜的能力的作用。在包括脂质体90°光散射测定、色氨酸荧光移位和表面等离子共振(BIAcore)的多种体外系统中都对重组Hsp70和突变体与多种脂质之间的相互作用进行了研究。Hsp70的计算机(in silico)静电表面模建有助于Hsp70-BMP相互作用的概念性模型的建立。为了证明在体外系统中证实的脂质相互作用的体内相关性，着眼于关于BMP和Hsp70两个组分的BMP-Hsp70相互作用。为了进一步证明利用这种机制的可行性，对施用顺铂诱导的细胞死亡模型进行了表征，并在癌细胞系和未转化细胞系两种细胞系中的所述细胞死亡系统中靶向溶酶体Hsp70。
为了解决Hsp70对溶酶体膜稳定性的作用的分子基础，本发明人试图建立可消除胞质的Hsp70的影响的系统，即需要使Hsp70直接靶向溶酶体。Nylandsted et al.的电子显微照片显示Hsp70可存在于溶酶体内，因此本发明人决定建立用于产生重组人Hsp70(rHsp70)的方法，并期望利用细胞内吞机器作为直接向溶酶体递送rHsp70的途径。本发明人在此绕开了向Hsp70添加可能破坏功能的溶酶体分选信号的需要，并避免了由于过表达而可能引起的并发症。内吞方法还可以滴定rHsp70的量，并且从更长远的观点出发开启了研究细胞外Hsp70的摄取机制的可能性。
为了验证Hsp70的内吞，在建立Hsp70产生方法后，用荧光团Alexa Fluor 488对其进行标记(Hsp70-AF488)。共聚焦成像显示，确实可以这种方式使rHsp70靶向至溶酶体。为了评价对溶酶体膜稳定性的影响，本发明人接着建立了在单个溶酶体的水平上定量溶酶体膜通透化的方法，并利用该方法评价了细胞内吞的rHsp70的作用。这些方法形成了实施例1和2的基础，在实施例1和2中，本发明人证明，Hsp70通过与内溶酶体(endo-lysosomal)阴离子磷脂二(单酰基-甘油)磷酸酯(BMP)的pH依赖性高亲和结合而对溶酶体进行稳定，从而增强了细胞的存活。Hsp70带正电荷的ATPase结构域负责结合，但还需要底物结合功能域以有效稳定溶酶体。有趣的是，这种相互作用以及其产生的保护作用取决于位于ATPase结构域的带正电荷的楔形内的色氨酸90。重要的是，所述细胞保护作用可以通过rHsp70的细胞内吞递送而获得，并且尤其是通过BMP抗体或Hsp70抑制剂的细胞外施用而逆转。
此外，本发明人还试图将Hsp70的溶酶体膜保护机制与肿瘤产生和程序性细胞死亡相关联。因此，本发明人表征了通过施用常规化疗剂顺铂启动的细胞死亡程序，并发现其与caspases无关，但特征在于蛋白酶的溶酶体释放。转基因Hsp70以及细胞内吞的Hsp70能够通过稳定溶酶体膜而增强细胞在面临顺铂攻击时的存活。有趣的是，本发明人证明，靶向溶酶体Hsp70本身或者其在溶酶体中的相互作用物二(单酰基-甘油)磷酸酯(BMP)使转化的前列腺细胞系对顺铂变得敏感(未转化的细胞没有这种变化)，从而为利用BMP-Hsp70相互作用作为癌症治疗的药理学靶标提供了实验证据。
有趣的是，虽然Hsp70-2与Hsp70具有86％的氨基酸同源性，但Hsp70-2不能直接保护溶酶体膜。然而，缺失Hsp70-2也导致溶酶体膜通透化，并促进细胞的程序性死亡。这种作用不依赖于Hsp70-2与溶酶体区室之间的直接相互作用，而是通过晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)的下调(响应Hsp70-2的缺失)关联起来。
本研究的方法和结果将在实施例部分进行更详细的阐述。
在本发明中阐明了Hsp70通过与溶酶体BMP的相互作用增强溶酶体稳定性的细胞保护作用的分子基础，这些发现为治疗性靶向溶酶体贮积病提供了基础。
本发明现在已经证明，令人惊奇地，向细胞提供重组Hsp70有效逆转溶酶体贮积病(如本发明证明的尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)和法伯氏病(Farber disease))的病理。此外，向细胞提供Hsp70诱导剂苯甲醇有效逆转溶酶体贮积病(如本发明证明的尼曼-皮克病)的病理。
因此，本发明提供了通过提供Hsp70或其功能片段或变体，或者通过提供Hsp70诱导物或辅诱导物(co-inducer)而直接或间接提高有此需要的个体中Hsp70的细胞内浓度和/或活性来治疗溶酶体贮积病的方法。
一方面，本发明涉及能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用作药物或用于溶酶体贮积症的治疗。
在一个实施方式中，所述生物活性剂为Hsp70或其功能片段或变体。
在另一个实施方式中，所述生物活性剂为Hsp70诱导物或辅诱导物。
另一方面，本发明提供了治疗溶酶体贮积病的方法，其包括向有此需要的个体施用本发明的生物活性剂。
在一个实施方式中，所述治疗为预防、治愈或改善。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积病选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病(Krabbe disease)、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病(Sialidosis)、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白(saposin)缺乏病。
在另一个实施方式中，所述溶酶体贮积病的特征在于具有所述疾病病理涉及的缺陷酶的残留酶促活性。
本发明还涉及治疗溶酶体贮积病的方法，其包括施用本发明的生物活性剂和至少一种其它治疗形式(modality)的组合。
本发明再一方面提供了调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP(二(单酰基甘油)磷酸酯)相互作用，所述方法包括以下步骤：
i)施用本发明的生物活性剂，
ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，和
iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。
另一方面，本发明涉及Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。
一方面，本发明涉及调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所述方法包括施用Hsp70或其功能片段或变体并由此调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的步骤，其中所述Hsp70或其功能片段或变体是适合使BMP和Hsp70或所述功能片段或变体之间相互作用的形式。优选地，Hsp70或所述其功能片段或变体与BMP形成共价或非共价复合物。
优选地，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。
优选地，所述鞘脂激活蛋白(Saposin)选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
优选地，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、葡糖神经酰胺酶和酸性神经酰胺酶。
优选地，所述酶促活性的调节是上调所述酶的酶促活性。
另一方面，本发明涉及Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。优选地，所述Hsp70或其功能片段或变体可用于治疗、减缓或预防溶酶体贮积症，例如尼曼-皮克病、戈谢病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病。
另一方面，本发明涉及提高化合物的摄取的方法，所述方法包括施用所述化合物和Hsp70或其功能片段或变体的步骤。在一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变体与所述化合物共价结合。在另一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变体与所述化合物非共价结合。
本发明的实施方式涉及上调与溶酶体贮积症(例如尼曼-皮克病、戈谢病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病)相关的酶的酶促活性的方法。优选地，所述溶酶体贮积症为尼曼-皮克病。
由于所述溶酶体贮积症由酶促活性不足引起，因此本发明的目的是提高所述酶促活性，从而减轻或治愈所述病症。
已经证明，Hsp70与BMP相互作用。由于BMP作为其它多种蛋白的辅因子，Hsp70和BMP之间的相互作用可以调节所述其它多种蛋白的功能。例如，BMP作为aSMase的辅因子。因此，Hsp70和BMP之间的相互作用可以提高aSMase的活性。由于尼曼-皮克病与aSMase活性的降低有关，因此Hsp70可以通过提高aSMase的活性来减轻或治愈尼曼-皮克病。类似地，BMP作为鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D的辅因子发挥作用。这些鞘脂激活蛋白在其它溶菌酶贮积症中均有涉及，因此Hsp70可以通过提高鞘脂激活蛋白或与所述鞘脂激活蛋白相关的酶的活性来减轻或治愈其它溶酶体贮积症。
在本发明的一个实施方式中，在溶酶体贮积症的治疗中同时施用Hsp70和酶替代疗法。在这种方式中，由于Hsp70的酶激活作用，因此可以显著降低所必需的酶量。
在另一个实施方式中，使用Hsp70促进酶替代疗法中酶的摄取，由此提高被相关细胞摄取的酶量。
定义和简称
aSMase/ASM   酸性鞘磷脂酶
ADD70：      用于Hsp70的源自AIF的诱饵(AIF-derived decoy for Hsp70)
AIF：        凋亡诱导因子
AO：         吖啶橙
Apaf-1：     凋亡蛋白酶激活因子-1
Bag-1：      Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1(Bcl-2 associated athanogene-1)
Bcl-2：      B细胞淋巴瘤/白雪病2
Bid：        BH3相互作用结构域凋亡激动蛋白
BMP：        二(单酰基甘油)磷脂
CARD：       Caspase招募域
Caspase：    半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶
CHIP：       Hsp70-结合蛋白的羧基末端
CytC：       细胞色素C
DD：         死亡结构域
DED：        死亡效应域
dsRNA：      双链RNA
eHsp70：     细胞外Hsp70
ER：         内质网
ERT          酶替代疗法
FADD：       包含Fas相关死亡结构域的蛋白
HIP：        Hsp70相互作用蛋白
HRP：        辣根过氧化物酶
HS：         热休克/热应激
HSE：        热休克元件
HSF：        热休克因子
Hsp：        热休克蛋白
HspBP1：     热休克蛋白结合蛋白1
IAP：        凋亡蛋白抑制蛋白
iMEF         永生化的鼠胚胎成纤维细胞
JNK：        c-Jun氨基末端激酶
LAMP-1/-2：  溶酶体相关膜蛋白-1/-2
LBPA：       溶血二磷脂酸(lysobisphosphatidic acid)
LEDGF：      晶状体上皮源性生长因子
LMP：        溶酶体膜通透化
MIC-1：      巨噬细胞抑制细胞因子1
MOMP：       线粒体外膜通透化
MPR          甘露糖6-磷酸受体
MTT：        3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物
NPD          尼曼-皮克病
NPDA         A型尼曼-皮克病
NPDB         B型尼曼-皮克病
NPDC         C型尼曼-皮克病
NPDD         D型尼曼-皮克病
PCD：        程序性细胞死亡
PKC：        蛋白激酶C
POPC：       棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱
POPS：       棕榈酰-油酰-磷脂酰丝氨酸
RNAi：       RNA干扰
ROS：        活性氧
SD：         标准偏差
siRNA：      小干扰RNA
Smac/Diablo：第二个线粒体来源的caspase激活因子
tBid：       截短Bid
TNF：        肿瘤坏死因子
TNFR：       TNF-受体
TRADD：      TNFR相关死亡结构域蛋白
TRAF：       TNFR相关因子
溶酶体贮积症(LSD)：所使用的术语“溶酶体贮积症”和“溶酶体贮积病”同义。
Hsp70的功能片段：术语“Hsp70的功能片段”解释为表示Hsp70的具有预期功能的任何片段。与酶促活性的调节有关时，功能片段是能够调节所述酶促活性的片段。与提高物质的摄取有关时，Hsp70的功能片段是能够提高所述物质的摄取的片段。应该理解，所述功能片段的精确量化作用可能与全长分子的作用不同。在一些情况下，所述功能片段可能确实比全长分子更有效。此外，从片段的较小尺寸考虑，使用片段代替全长分子可能是有利的。
Hsp70的功能变体：术语“Hsp70的功能变体”解释为表示Hsp70的具有预期功能的任何变体。与酶促活性的调节有关时，功能变体是能够调节所述酶促活性的变体。与提高物质的摄取有关时，Hsp70的功能变体是能够提高所述物质的摄取的片段。应该理解，所述功能变体的精确量化作用可能与全长分子的作用不同。在一些情况下，所述功能变体可能确实比全长分子更有效。
“生物活性剂”(即在生物学上具有活性的物质/试剂)是提供可以通过体内或体外证明的某些药理学作用(通常为有益作用)的任何试剂、药物、化合物、物质组分或组合物。在本文中使用的该术语进一步包括在个体中产生局部或全身作用的任何生理学或药理学活性物质。生物活性剂的另外实例包括，但不限于包含寡糖或由寡糖组成的试剂，包含多糖或由多糖组成的试剂，包含任选糖基化的肽或由任选糖基化的肽组成的试剂，包含任选糖基化的多肽或由任选糖基化的多肽组成的试剂，包含核酸或由核酸组成的试剂，包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的试剂，包含多核苷酸或由多核苷酸组成的试剂，包含脂质或由脂质组成的试剂，包含脂肪酸或由脂肪酸组成的试剂，包含脂肪酸酯或由脂肪酸酯组成的试剂，以及包含次级代谢物或由次级代谢物组成的试剂。在个体(例如人和其它任何动物)的治疗中，生物活性剂可以用于预防疾病、治疗疾病。本文使用的生物活性剂是能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的物质。
本文使用的术语“药”或“药物”包括作用于人或动物体局部或全身的在生物学上、生理学上或药学上具有活性的物质。
本文使用的术语“治疗”和“疗法”等同地表示治愈性治疗、预防性治疗和改善性治疗或减轻性治疗。该术语包括用于获得可以在临床上建立的有益的或期望的生理学结果的方法。出于本发明的目的，有益的或预期的临床效果包括，但不限于缓解症状，减小疾病的程度，稳定(即不恶化)病况，延迟或减慢病况/症状的发展或恶化，改善或减轻病况或症状，以及不论可测与否的缓和(部分或完全)。本文使用的术语“减轻”及其变式表示，与不施用本发明组合物相比，生理病况或症状的程度和/或有害表现减少和/或发展时间减慢或延长。
如果根据构成术语“治疗”和“疗法”的定义的标准测定，所治疗的病况有变化，则“治疗效果”或“疗效”是明显的。如果有至少5％的改善，优选10％的改善，更优选至少25％，甚至更优选至少50％，如至少75％，最优选至少100％的改善，则所治疗的病况有“变化”。所述变化可基于所治疗个体病况的严重程度的改善，或者基于利用生物活性剂或生物活性剂和本发明的药物组合物治疗和不治疗的个体群病况改善频率的差异。
“生物活性剂”的“药理学上的有效量”、“药学上的有效量”或“生理学上的有效量”是在使用本发明所述药物组合物时，为在所治疗的个体血流中或作用部位(即肺、胃系统、结肠系统、前列腺等)提供预期水平的活性剂以产生预期的生理反应所需要的此组合物中存在的活性剂的量。准确的量将取决于多种因素，例如活性剂、组合物的活性、所采用的递送装置、组合物的物理特征、计划的患者用法(即每天施用的剂量数)和患者因素等，并且可以由本领域技术人员根据本文提供的信息而容易地确定。可以在一次给药中，或者通过多次施用总和为有效量的量(优选在24小时的时间内)而施用“有效量”的生物活性剂。可以通过用于测定合适量和给药时间的标准临床方法确定有效量。应该理解，“有效量”可以是由医疗专家和/或个人确定的经验性和/或个性化(根据个案)结果。
本文使用的术语“增强”和“提高”有益效果及其变式是指，与安慰剂相比生物活性剂的治疗效果，或者本发明的药物治疗的治疗效果高于通常利用不含本发明生物活性剂的药物组合物所获得的治疗效果的提高。作为施用生物活性剂的结果，当治疗效果的强度和/或程度得到促进和/或提高时，“治疗效果的提高”是明显的。“治疗效果的提高”还包括治疗益处的时间得到延长。它还可以表现为，与施用不含生物活性剂的较高量的药物组合物相比，当共同施用所述药物组合物和本发明提供的生物活性剂时获得相同益处和/或效果所需要的所述药物组合物的量较低。优选但不必需地，所述效果的增强引起对所述药物组合物单独不能有效治疗或者治疗效果较小的急性症状的治疗。与单独施用药物组合物相比，当本发明的生物活性剂与药物组合物共同施用时治疗效果具有至少5％的提高，例如治疗效果具有至少10％的提高，则实现了增强(提高)。优选地，所述提高为至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少100％。
本文使用的“共同施用”、“同时施用”或“一起施用”生物活性剂或者生物活性剂和现有药物是指，在一定时间内施用本发明的一种或多种生物活性剂，或者施用本发明的一种或多种生物活性剂和现有药物组合物。所述时间优选小于72小时，例如48小时，例如小于24小时，例如小于12小时，例如小于6小时，如小于3小时。然而，所述术语还表示可以同时施用所述生物活性剂和治疗性组合物。
术语“个体”指脊椎动物，尤其是哺乳动物中的一种，优选包括人在内的灵长类。在优选的实施方式中，本文使用的个体为任意年龄的人，男性或女性。
“有此需要的个体”是指可以从本发明受益的个体。在一个实施方式中，所述有此需要的个体为患病个体，其中所述疾病为溶酶体贮积病。
术语“天然核苷酸”或“核苷酸”是指在自然界中发现的任意四种脱氧核苷酸dA、dG、dT和dC(DNA的组分)和四种核苷酸A、G、U和C(RNA的组分)。各种天然的核苷酸包括糖部分(核糖或脱氧核糖)、磷酸部分和天然/标准的碱基部分或基本由上述部分组成。天然核苷酸根据熟知的碱基配对原则(Watson和Crick)与互补核苷酸结合，其中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，其中相应的碱基对是互补且反向平行的核苷酸链的一部分。碱基配对引起预定的互补核苷酸之间的特异杂交。碱基配对是酶能够催化合成与模板寡核苷酸互补的寡核苷酸的基础。在这种合成中，结构单元(通常为A、T、U、C或G的核糖衍生物或脱氧核糖衍生物的三磷酸酯)在模板寡核苷酸的指导下形成具有正确的互补序列的互补寡核苷酸。互补序列对其寡核苷酸序列的识别由形成碱基对的相应相互作用碱基介导。实质上，导致碱基配对的具体相互作用由碱基的大小以及碱基的氢键供体和受体的模式控制。大的嘌呤碱基(A或G)与小的嘧啶碱基(T、U或C)配对。此外，碱基之间的碱基配对识别还受碱基之间形成的氢键的影响。在Watson-Crick碱基配对几何中，利用连接两个环原子的中间氢键和在任意一侧结合附加于各所述环的官能基团的氢键，利用与受体基团配对的供体基团，使六元环(天然寡核苷酸中的嘧啶)与由稠合六元环和五元环(天然寡核苷酸中的嘌呤)构成的环系统并列。
本文使用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段和通过连接、剪切、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中任何一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或二者的组合的单体构成。修饰核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分具有变化。糖修饰包括，例如利用卤素、烷基基团、胺和叠氮基团取代一个或多个羟基基团，或者可以使糖官能化作醚或酯。此外，还可以用空间上和电子上相似的结构，例如氮杂-糖和碳环糖类似物取代完整的糖部分。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶，酰化嘌呤或嘧啶或者其它熟知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这些连接的类似物进行连接。磷酸二酯键连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate和氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”也包括，例如包含连接至聚酰胺骨架上的天然存在的或修饰的核酸碱基的所谓的“肽核酸”。核酸可以为单链或双链。
术语“核酸分子的互补物”是指与参考核苷酸序列相比具有互补核苷酸序列并且为反方向的核酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
“分离的核酸分子”是指没有整合在生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已经从细胞的基因组DNA分离的编码生长因子的DNA分子即为分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个实例是没有整合在生物体的基因组中的化学合成的核酸分子。已经从特定物种分离的核酸分子小于该物种的染色体的完整DNA分子。
“核酸分子构建体”是已经通过人为介入进行修饰从而包含以天然不存在的排列结合或并列的核酸片段的单链或双链核酸分子。
“线性DNA”是指具有游离5’和3’末端的非环状DNA分子。可以通过酶促降解或物理断裂由闭合的环状DNA分子(例如质粒)制备线性DNA。
“互补DNA(cDNA)”是反转录酶由mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，采用与部分mRNA互补的引物起始反转录。本领域技术人员还使用术语“cDNA”表示由此类单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还表示由RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
“异源DNA”是指在给定宿主细胞中天然不存在的DNA分子或DNA分子群。异源于具体宿主细胞的DNA分子可以包含源自所述宿主细胞的物种的DNA(内源DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即异源DNA)结合。例如，可以将包含非宿主DNA片段的DNA分子认为是异源DNA分子，其中所述非宿主DNA片段编码可操作地与包含转录启动子的宿主DNA片段连接的多肽。相反，异源DNA分子可以包含可操作地与外源启动子相连的内源基因。作为另一个示例，如果DNA分子被引入到缺乏野生型基因的突变细胞内，则也可以将包含源自野生型细胞的所述基因的该DNA分子认为是异源DNA。
“多肽”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，优选其仅通过肽键相连。通过非宿主DNA分子表达产生的多肽为“异源”肽或多肽。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已经经过翻译后修饰或可以不经过翻译后修饰。翻译后修饰可以为，例如磷酸化、甲基化和糖基化。
术语“表达”是指基因或基因产物的生物合成。
“杂交”表示不同来源的核酸链的退火；即，在初始时没有配对的两条DNA链的互补区之间形成碱基对。根据Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press(1989)，1.101-1.104，对术语“在严格条件下的杂交”进行定义。优选地，在严格条件下的杂交表示，利用1×SSC和0.1％SDS在50℃、优选在55℃、更优选在62℃且最优选在68℃洗涤1小时后，尤其是在0.2×SSC和0.1％SDS中在50℃、优选在55℃、更优选在62℃且最优选在68℃洗涤1小时后，观察到阳性杂交信号。
“完全同源”的延长(stretch)定义为配对核苷酸沿着相互作用的核苷酸的序列的匹配；在天然存在的RNA中，A与U配对，G与C配对。
“启动子”为指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码区，与结构基因的转录起始位点相邻近。在转录起始中发挥作用的启动子内的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。如果启动子为诱导型启动子，则在对诱导剂的应答中提高转录速率。相反，如果启动子为组成型启动子，则诱导剂不能调节转录速率。还已知有阻遏型启动子。
“调控元件”是调节启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可以包含与能够排他地或优先地在特定细胞、组织或器官中进行转录的细胞因子结合的核苷酸序列。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“器官特异性”的方式表达的基因结合。
“增强子”是一种类型的调控元件，其能够提高转录效率，而不论增强子相对于转录起始位点的距离或方向。
“克隆载体”为具有能够在宿主细胞中自主复制的能力的核酸分子，例如质粒、粘粒或细菌噬菌体。克隆载体通常包含一个或少数几个限制性内切酶识别位点，该位点允许以可确定的方式插入核酸分子，而不使载体丧失主要的生物功能；和编码标记基因的核苷酸序列，该序列适合用于转化有所述克隆载体的细胞的鉴别和筛选。标记基因通常包括提供四环素或氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达常常处于启动子的控制之下，将此类基因称为“可操作地连接至”所述启动子上。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件和核心启动子被可操作地连接。被称作“转录载体”的较简单载体仅能够转录但不能翻译：它们能够在靶细胞中复制但不能表达，其与表达载体不同。转录载体用于扩增其插入物。
“重组宿主”是包含异源核酸分子，例如克隆载体或表达载体的细胞。
转染描述的是将外来物质引入真核细胞中。用于非病毒方法的术语“转染”最常用于指哺乳动物细胞，而术语“转化”优选用于描述非病毒DNA转移至细菌和非动物真核细胞，例如真菌、藻类和植物。化学方法和物理方法均可以用于转染细胞。
“多肽”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，其优选仅通过肽键连接。通过非宿主DNA分子表达产生的多肽为“异源”肽或多肽。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已经经过翻译后修饰或可以不经过翻译后修饰。翻译后修饰可以为，例如磷酸化、甲基化和糖基化。
“氨基酸残基”可以为肽键或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨基酸残基可以为D-构型或L-构型。氨基酸残基包括被包含碳原子或碳原子链的中心部分分开的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(COOH)，它们的至少之一包括至少一个侧链或官能团。NH2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基基团，COOH是指存在于氨基酸或肽的羧基末端的羧基基团。常用术语氨基酸包括天然的或非天然的氨基酸。J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)and adopted in 37 C.F.R.，section 1.822(b)(2)中列出的标准命名法的天然氨基酸属于下表1中列出的氨基酸组。非天然氨基酸是未列在表1中的氨基酸。非天然氨基酸的实例是，例如37 C.F.R.section 1.822(b)(4)中列出的氨基酸，其均通过引用并入本文。此外，非天然氨基酸残基包括，但不限于经修饰的氨基酸残基、L-氨基酸残基和D-氨基酸残基的立体异构体。
Figure BPA00001311158300141
Figure BPA00001311158300151
表1：天然氨基酸及其各自的代号
“等价氨基酸残基”是指能够取代多肽中的另一个氨基酸残基而基本不改变该多肽的结构和/或功能的氨基酸残基。因此，等价氨基酸具有类似的性质，例如侧链的体积(bulkiness)、侧链极性(极性或非极性)、疏水性(疏水或亲水)、pH(酸性、中性或碱性)和(芳族/脂肪族)碳分子的侧链构造。因此，可以将“等价氨基酸残基”认为是“保守氨基酸取代”。
在一个实施方式中，等价氨基酸的分类是指以下类：1)HRK，2)DENQ，3)C，4)STPAG，5)MILV和6)FYW。
在一个实施方式中，在本文使用的术语“等价氨基酸取代”的含义内，以下所指的氨基酸组中的一个氨基酸可以被另一个氨基酸取代。
i)具有极性侧链的氨基酸(Asp，Glu，Lys，Arg，His，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr和Cys)
ii)具有非极性侧链的氨基酸(Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，和Met)
iii)具有脂肪族侧链的氨基酸(Gly，Ala Val，Leu，Ile)
iv)具有环形侧链的氨基酸(Phe，Tyr，Trp，His，Pro)
v)具有芳族侧链的氨基酸(Phe，Tyr，Trp)
vi)具有酸性侧链的氨基酸(Asp，Glu)
vii)具有碱性侧链的氨基酸(Lys，Arg，His)
viii)具有酰胺侧链的氨基酸(Asn，Gln)
ix)具有羟基侧链的氨基酸(Ser，Thr)
x)具有含硫侧链的氨基酸(Cys，Met)，
xi)中性、弱疏水性氨基酸(Pro，Ala，Gly，Ser，Thr)
xii)亲水性、酸性氨基酸(Gln，Asn，Glu，Asp)，和
xiii)疏水性氨基酸(Leu，Ile，Val)
本发明还涉及Hsp70的变体或其片段，其中已经通过计算机分析设计了取代，该计算机分析利用序列同源性以预测取代是否影响蛋白功能(例如，Pauline C.Ng and Steven Henikoff，Genome Research，Vol.11，Issue 5，863-874，May 2001)。
由于标准分析方法的不精确性，聚合物的分子量和长度被理解为近似的数值。应当理解，当此数值被表示为“约”X或“近似于”X时，所指的数值X精确至+/-20％，例如+/-10％，如+/-5％。
附图说明
图1
Hsp70对aSMase与BMP的结合以及神经酰胺水平的影响。(A)作为事先结合的Hsp70的作用，0.2μM aSMase与含BMP的脂质体在pH 4.5结合(类似于实施例1的实验，详细参见本文的材料和方法部分)。使Hsp70解离10分钟，从而在添加aSMase之前达到较低的解离渐近线)。(B)野生型(WT)和Hsp70转基因(Hsp70-TG)iMEF的共聚焦显微照片以及其中神经酰胺水平的定量。利用抗神经酰胺的小鼠单克隆抗体(克隆15b4)进行免疫检测。在6个预定区域的激光扫描显微照片的基础上进行定量，之后在LSM Duo软件中进行量化。
图2
rHsp 70对iMEF-WT(永生化鼠胚胎成纤维细胞，野生型)中的aSMase活性的影响。向细胞施予3nM、30nM和300nM的rHsp70，并测定aSMase的活性(A500是所产生的提高浊度的神经酰胺的量度)。对照细胞用BSA(牛血清白蛋白)处理。
图3
不同成纤维细胞中的aSMase活性。NPDA：A型尼曼-皮克病。
图4
主要的鞘脂水解示意图。具有短亲水性头部基团的鞘脂类的外水解断裂需要非酶促辅因子鞘脂激活因子蛋白(SAP或鞘脂激活蛋白)。各酶以及相应激活蛋白的遗传性缺乏都引起溶酶体脂质贮积，并导致各种鞘脂贮积病的出现。Ferlintz et al.，Chem.Phys.Lipids，(102)35-43，1999。
图5
溶酶体Hsp70稳定了溶酶体膜。(a)利用300nM rHsp70-AF488(绿色)温育，固定并用溶酶体膜整合蛋白-1(LIMP-1；红色)染色的U-2-OS细胞的代表性共聚焦图像。对于用其它细胞器标记物的共定位，参见图9。(b)在对通过反复冻融循环和离心轻膜部分(LMF)获得的膜(memb.)中和上清液(sup.)中的rHsp70-AF488定量前，利用300nM rHsp70-AF488温育U-2-OS细胞24小时。溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)和组织蛋白酶B(Cat B)的免疫印迹分析证明了分级方法的可行性。(c)暴露于光致氧化下的U-2-OS细胞的代表性静止图像(吖啶橙和蓝光)。通过红色染色降低和绿色染色增加使溶酶体完整性的丢失可视化。(d和e)用所示的重组蛋白(300nM)温育U-2-OS细胞24小时，并在光致氧化后分析溶酶体的完整性。如所示，在加入重组蛋白之前用所示siRNA处理细胞48小时。数值表示的是3个(d)或5个(e)独立试验的平均值±SD。来自未处理的或用对照siRNA或Hsp70 siRNA处理的U-2-OS细胞的所示蛋白的代表性免疫印迹结果示于右侧。比例尺：20μm(a和c)。
图6
Hsp70和BMP之间的pH依赖性相互作用稳定了溶酶体膜。(a)在pH 7.4(左)和pH 6.0(右)向包含所示脂质(χ＝0.2)的脂质体中加入rHsp70(0.12nmol试样量)时脂质体90°光散射的相对变化。(b)U-2-OS细胞未处理(-)或用50μg/ml抗-BMP IgG或对照IgG温育7小时然后加入载体(-)或300nM rHsp70温育24小时，并分析光致氧化时溶酶体的完整性。(c)U-2-OS细胞未处理(-)或用50μg/ml抗-BMP IgG或对照IgG温育7小时然后加入载体(-)或25nM顺铂温育24小时，并分析Hoechst 33342染色时凋亡细胞的形态。(d)通过相对峰荧光强度的变化测定的在pH 6.0时rHsp70及其突变体与POPC/BMP(χBMP＝0.2)脂质体的相互作用。蛋白浓度为0.36μM(rHsp70)、0.5μM(ΔATP)和0.35μM(ΔPBD)(左)或0.43μM(右)，并加入10μM试样量的脂质体。(e)野生型rHsp70(WT)及其缺失突变体(ΔATP和ΔPBD)和点突变体(W90F和W580F)在pH4.5下与固定化LUV(平均直径：100nm；总脂质浓度：0.1mM；组成：鞘磷脂(χ＝0.1)、磷脂酰胆碱(χ＝0.5)、胆固醇(χ＝0.2)和BMP(χ＝0.2))之间的相互作用的BIAcore分析。注射脂质体直至平衡(100s)，并以20μl/分钟的流速注射包含所示浓度(左)或300nM(右)重组蛋白的乙酸钠缓冲液(50mM，pH 4.5)共200s，然后为10分钟的解离阶段。ΔRU定义为脂质体平衡后和蛋白-脂质体平衡后测定的响应信号之间的差异。(f和g)U-2-OS细胞未处理(对照)或者用所示的重组Hsp70蛋白(300nM)温育24小时并在光致氧化后分析溶酶体的完整性(f)，或者用载体(白色柱)或25μM顺铂(黑色柱)处理24小时并分析凋亡样形态(g)。(h)Hsp70的ATPase结构域的带结构和分子表面模型。ATP(范德华-表面表示)可以被可视化地结合在ATP-结合口袋内。绿色和紫色球体分别表示配位结合的钙和钠离子的范德华-表面。注意底部结构域的带正电荷的部分和W90的位置。数值表示的是最少5次独立试验的平均值±SD(b、c、f和g)。
图7
Hsp70刺激ASM活性，进而稳定溶酶体。(a)作为预先结合的rHsp70的功能，200nM rASM与包含BMP的脂质体在pH4.5时结合的Biacore测定。按照图6e图例的描述进行试验，在10分钟的rHsp70-解离阶段之后加入rASM共180秒，随后为再一个10分钟的解离阶段。(b)如图所示，野生型(WT)和Hsp70转基因(Hsp70)MEF的裂解物中ASM的活性(左侧图)以及用300nM rHsp70温育24小时或48小时的WT MEF中ASM的活性。(c和d)用所示浓度的地昔帕明(Desipramine)处理3小时的WT和Hsp70 iMEF的存活率(MTT还原法；c)和胞质组织蛋白酶的活性(zFRase；d)。(e)WT和Hsp70 MEF以及用12.5μM和25μM地昔帕明(分别为左侧图和右侧图)温育3小时的Hsp70 MEF的溶酶体完整性丢失(光致氧化)的活单细胞成像。连续测定红色荧光的降低(左侧图)和绿色荧光的增加(右侧图)，以获得溶酶体完整性丢失的完整动态曲线。每次试验在预定的区域测定25-60个细胞，Hsp70与WT之间以及Hsp70+地昔帕明与Hsp70之间p＜0.001。所有数值表示的均为最少3次独立试验的平均值±SD。
图8
rHsp70刺激ASM的活性，稳定溶酶体并降低了NPDA成纤维细胞中溶酶体的体积。(a)按照图3e分析的NPDA患者的原代成纤维细胞溶酶体稳定性的活单细胞成像，p＜0.001。(b)未处理的，或者用300nM rHsp70处理48小时(左侧图)，或者单独用150nM rASM或150nM rASM与300nM rHsp70的组合处理24小时(右侧图)的NPDA成纤维细胞的ASM活性。根据所获得的酶促反应速率(DA500/mg蛋白/分钟)计算的p值。右图证明了rASM(绿色)的细胞内吞摄取，以及通过用溶酶体红色荧光探针(Lysotracker Red)共染色可视化的溶酶体区室的定位。(c)按照图3e进行的未处理的，或者用300nM rHsp70或用150nM aSMase或用rHsp70和aSMase的组合处理24小时的NPDA成纤维细胞的溶酶体稳定性的分析，与未处理细胞相比所有处理组p＜0.001。(d)未处理的，或者用300nM BSA、300nM rHsp70、150nM rASM(150nM)或rHsp70和rASM的组合处理24小时的NPDA成纤维细胞的细胞共聚焦横截面的溶酶体面积的定量。右图证明了rHsp70(绿色)对NPDA成纤维细胞内溶酶体区室(红色)体积的影响。白色箭头表示具有细胞内吞的rHsp70且溶酶体区室减小的细胞。数值表示为三个独立试验的平均值±SD。比例尺＝20μM。UT＝未处理。
图9
细胞内吞的rHsp70-AF488和溶酶体的共定位。利用300nM rHsp70-AF488(绿色)温育，固定并用以下细胞器标记物(红色)染色的U-2-OS细胞的代表性聚焦图像。溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1；溶酶体)，LAMP-2(溶酶体)，LBPA/BMP(6C4；内溶酶体区室)，Cyt c(线粒体)，SERCA(ER)和golgin-97(高尔基体)。比例尺：20μm(LAMP-1、LAMP-2和BMP)或者10μm(Cyt c、SERCA和Golgin-97)。
图10
在rHsp70存在下rASM(重组aSMase)和BMP的相互作用。(a)rASM与固定的阴离子脂质体(平均直径为100nm，总脂质浓度为0.1mM，组成为：10mol％鞘磷脂、50mol％磷脂酰胆碱、20mol％胆固醇和20mol％BMP)在pH4.5的相互作用。在脂质体的结合(此时定义为0)之后测定的响应信号。(b)预先结合的rHsp70对随后的rASM的结合的影响。利用与(a)相同的固定化阴离子脂质体温育所示量的rHsp70。在10分钟的rHsp70解离阶段后，加入200nM rASM共180秒，然后解离10分钟。
图11
Hsp70小分子诱导剂苯甲醇对A型尼曼-皮克病(NPDA)患者成纤维细胞的影响。(A)苯甲醇以剂量依赖的形式对NPDA 
Figure BPA00001311158300201
中Hsp70的诱导(蛋白表达)(B)在用40mM苯甲醇处理NPDA 
Figure BPA00001311158300202
细胞后，NPDA 
Figure BPA00001311158300203
溶酶体的稳定性增加。(C)在用40mM苯甲醇处理后，通过溶酶体横截面面积测定的NPDA 
Figure BPA00001311158300204
细胞的病理减少(方法将在实施例2中详述)。
图12
aSMase缺失对溶酶体稳定性的影响根据厂商的方法利用Oligofectamine(Invitrogen)将靶向酸性鞘磷脂酶(aSMase)的小干扰RNA(siRNA)(si938、si1257、si1340)和对照siRNA(mm)转染至U2OS细胞中。siRNA的浓度：50nM。72小时后，通过RT-PCR(未显示)，以及通过吖啶橙介导的光致氧化的活单细胞成像的细胞溶酶体稳定性分析证明了敲减。持续测定绿色荧光的增加，以获得溶酶体完整性丢失的完整动态曲线。由图片可以看出，用靶向aSMase的siRNA处理的细胞的溶酶体稳定性显著降低。所述方法将在实施例2中作进一步解释。
图13
用rHsp70对所有NPDA/B细胞系的处理显著逆转了溶酶体的病理，即降低了溶酶体的横截面面积。A型和B型尼曼-皮克病成纤维细胞(NPDA/NPDB)和未处理的正常成纤维细胞(BJ)用作为对照的300nM BSA或葡聚糖处理24小时，或者用300nM rHsp70、150nM rhaSMase或300nM rHsp70和150nM rhaSMase组合处理24小时的细胞共聚焦横截面的溶酶体面积定量。用300nM rHsp70-W90F(W90F)(不与BMP相互作用的Hsp-70突变体)处理24小时的NPDA细胞具有与对照细胞相当的作用。方法参见实施例2。
图14
在Hsp70转基因成纤维细胞中和rHsp70处理的NPDA成纤维细胞中aSMase活性增加。野生型(WT)或Hsp70-转基因(TG)永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)(A和B)中，以及A型尼曼-皮克病患者的未处理的或用rHsp70处理的成纤维细胞(NPDA 83/24)(C)中的脂质物质(所示的鞘磷脂和神经酰胺)的质谱分析。鞘磷脂水平的降低和神经酰胺水平的增高表明aSMase的活性提高。
图15
法伯氏病患者成纤维细胞中病理的逆转。法伯氏病患者细胞的共聚焦横截面的溶酶体面积定量。法伯氏病患者成纤维细胞(法伯氏89/73和法伯氏89/78)未处理或者如所示用300nM BSA或300nM rHsp70处理24小时。由图明显看出，用rHsp70处理法伯氏病患者成纤维细胞显著逆转了溶酶体的病理，即减少了溶酶体的横截面面积。关于方法的描述，参见实施例2。
图16
Hsp70提高了对其它分子的内吞摄取。A图：野生型的(WT)或者Hsp70转基因(TG)的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF，用20μg/mL Alexa Fluor-488-标记的BSA(BSA*)温育24小时)。通过荧光显微照片(未显示)证明了内吞摄取(参见实施例2)。然后收集细胞，并分析BSA*的摄取。由图明显看出，Hsp70-转基因iMEF的BSA*摄取量显著高于野生型iMEF。B图：如所示，用含或不含3000nM rHsp70的20μg/mL BSA*温育24小时的U2OS骨肉瘤细胞。通过荧光显微照片(未显示)证明了内吞摄取(参见实施例2)。然后收集细胞，并分析BSA*的摄取量。由图明显看出，同时加入BSA*和rHsp70的U2OS细胞的BSA*摄取量显著高于单独用BSA*温育的细胞。
发明详述
本发明人证明，Hsp70通过与内溶酶体膜的直接相互作用(由特定的磷脂，即BMP(二(单酰基甘油)磷脂)关联起来的相互作用)发挥其细胞保护作用的主要部分。BMP仅存在于在晚期内涵体和溶酶体中。本发明人证明Hsp70-BMP相互作用依赖于Hsp70的N端ATPase结构域，尤其是色氨酸90，并且这种相互作用是pH依赖性的。Hsp70和BMP间的相互作用通过提供用于调节特定亚类溶酶体酶的稳定性以及抑制溶酶体膜的去稳定化并确保溶酶体酶的释放的平台，而对Hsp70的膜稳定性作用至关重要。这些发现形成了本文所公开的用于溶酶体贮积症的有前景的新治疗形式的基础。
溶酶体
自de Duve在1955年发现溶酶体以来，对该细胞器的认识一直被“溶酶体是独立的动物细胞内吞途径的终点——容纳大量如果释放至胞质中将引起坏死和组织炎症的水解酶的区室”的理论所统治。由于近来的发现为溶酶体及其内容物的更多特异任务提供了证据，因此对溶酶体的这种认识(最好的认识是垃圾处理单元，最差的认识是非特异的“自杀袋”)已经发生巨大变化。
溶酶体水解酶
作为细胞内降解和随后的细胞组分回收的主要区室，溶酶体接受异源的和自噬的物质，所述物质在溶酶体细胞器的内腔中找到其最终命运。降解由能够消化所有主要细胞大分子的多种酸性水解酶(磷酸酶、核酶、糖苷酶、蛋白酶、肽酶、硫酸酯酶、脂酶等)实现。其中，研究的最透彻的溶酶体蛋白酶为组织蛋白酶家族。根据其活性位点的氨基酸可以将组织蛋白酶分成三个亚组，即半胱氨酸(B、C、H、F、K、L、O、S、V、W和X/Z)、天冬氨酸(D和E)和丝氨酸(G)组织蛋白酶。虽然组织蛋白酶在溶酶体外的中性pH仍能够发挥作用(虽然稳定性降低和/或特异性改变)，但优选在溶酶体的酸性pH(pH 4-5)发挥作用。
直至最近仍认为组织蛋白酶的功能限于溶酶体内蛋白的转换，以及在分泌后对细胞外基质的降解。然而，在过去的几年中，已经公认一些组织蛋白酶具有更特异的功能，包括在骨重建、抗原提呈、表皮稳态、激素原加工、保护细胞毒性淋巴细胞在脱粒后不受自身的破坏、保持小鼠的中枢神经系统、血管生成、癌细胞的侵袭以及程序性细胞死亡(PCD)中的作用。
除了蛋白断裂之外，溶酶体以及晚期内涵体还通过一系列的内吞溶酶体酶和辅酶(其正常功能依赖于溶酶体内膜的脂质组成)负责细胞脂质(例如鞘糖脂)的代谢。可以容易地通过在鞘脂代谢的任何阶段的功能失常的情况下临床疾病明显，产生诸如泰-萨氏病(Tay-Sachs disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、法伯氏病、法布里病(Fabry disease)、戈谢病(Gaucher disease)、克拉伯病和尼曼-皮克病的疾病的事实，理解功能性内溶酶体脂质代谢的重要性。
向溶酶体的运输和从溶酶体的运输
内吞膜的运送作用通过向多种细胞内区室递送膜组分、各种溶质分子和受体相关的配体而在哺乳动物细胞中发挥重要作用。然而多种内吞途径(主要途径集中于溶酶体，在溶酶体中发生降解并可能回收至质膜)直至目前似乎都很简单，但最近的证据表明这些途径比之前想象的更复杂。
内吞途径
对内吞作用的最佳理解是通过形成披网格蛋白小窝的受体介导的分子内吞作用，不过还鉴定出多种非网格蛋白(non-clathrin)介导的细胞内吞途径(例如巨胞饮作用、吞噬作用、通过形成细胞小窝和形成披非网格蛋白小窝的摄取)。内吞系统的命名还没有完全标准化，通常使用的术语“早期内涵体”实际上描述了两种不同的内涵体区室——分选内涵体和内吞再循环区室(ERC)。在常规的受体介导的细胞内吞途径中，诸如转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体和甘露糖-6-磷酸受体(MPR)的受体通过披网格蛋白小窝的胞质末端序列基序和网格蛋白层中元件(element)之间的相互作用而集中于质膜表面的披网格蛋白小窝内。在其网格蛋白层脱落后，新形成的内涵体与其它内涵体以及预存在的分选内涵体融合，以成为分选内涵体。如名称所揭示的，分选内涵体的主要任务是将新获取的组分分选到其正确的位置。已知的三种目的地包括质膜、晚期内涵体和ERC。随着分选内涵体的成熟，其pH降低，从而促进了受体结合的配体向内涵体腔内的释放。然而，在分选内涵体完全成熟为晚期内涵体前，必须将去往再循环的分子分选出来。该过程被认为是通过夹断狭窄小管(有利于从溶质分子分选出膜蛋白的过程)而发生，原因是小管的表面积-体积比大于由小泡组成的分选内涵体。夹断的小管可以使膜蛋白直接返回质膜(直接归还途径)或至ERC。ERC主要是一类管状细胞器，其位置随细胞类型而不同。虽然ERC能够将分子分选至数种不同的目的地，但通过ERC运输的分子多数返回质膜。
随着分选内涵体的成熟，主要由于空泡型质子ATPase(V-ATPase)的作用而使腔内pH稳定下降，同时还发生膜脂质和蛋白组成的转移。从分选内涵体至晚期内涵体以及进一步进入溶酶体的膜运输存在一些争议。争议在于通过小泡运输或通过分选内涵体的成熟能否对这种运输作出最佳解释。提出的分选内涵体和晚期内涵体之间的中间体的模型有两种。虽然成熟模型派认为到达晚期内涵体的小泡是在从前分选内涵体除去组分后所留下的，但预存在分隔模型派认为分子向晚期内涵体的分子运输通过内吞载体小泡(ECV，预存分选内涵体区室和晚期内涵体区室之间的特异运输小泡)而发生。认为分选内涵体区室和晚期内涵体区室两者的结构均比运输小泡复杂且具有更特异的功能。然而，由于从早期内涵体动态网产生的小泡可以经历释放小的GTPase RAB5并募集RAB7(晚期内涵体标记)的转变，最近的活细胞成像研究对两种模型的机械方面进行了协调。虽然在功能上很好地定义了内涵体途径的机体组成，但其命名可能仍令人困扰。利用通过早期内涵体/分选内涵体(在此发生受体-配体解偶联)但不通过晚期内涵体(在此可以发生蛋白水解)回收的管家受体(例如转铁蛋白受体)以及其它脂质和蛋白在功能上对细胞内吞途径进行了定义。然而在这些功能性定义之外，当面对命名时所述描绘图则变得较为模糊，当在早期内涵体中开始并且在向晚期内涵体的成熟过程中变得越来越明显的腔内小泡的产生形成了所谓的“多泡体”(MVB)时尤其如此。术语多泡体一直与用于ECV和晚期内涵体以及用于包含多泡区或元件的所有内吞小泡的另一个名称交换使用，其包括当溶酶体与晚期内涵体(包含多泡结构)融合时形成的杂细胞器。然而，晚期内涵体包含的腔膜小泡多于早期内涵体，并因此常常用术语“多泡体”描述该区室。
最后，该领域的大量混淆来自晚期内涵体相对于溶酶体的定义，或者甚至是缺乏此定义。两个区室酸性相当且多数(如非所有)存在于溶酶体的蛋白也可以在晚期内涵体中发现。根据成熟模型，晚期内涵体是溶酶体的前体，但考虑到逐步发育(如理论所提示)，很难获得严格的分类。然而，最近的证据提出溶酶体和晚期内涵体为独立的区室，其在经历“接吻”事件(短暂融合)和完全融合事件之后，可由所述杂合细胞器重新形成溶酶体。
生物合成途径
除细胞内吞作用之外，晚期内涵体还通过MPR途径接受来自高尔基体外侧网络(TGN)的物质(生物合成途径)。阳离子依赖性MPR和非阳离子依赖性MPR/胰岛素样生长因子-II(IGF-II)受体共同完成向溶酶体递送来自TGN的新合成的酸性水解酶的任务。MPR对酸性水解酶的识别需要向内质网中加入碳水化合物以及随后碳水化合物残基对高尔基体内侧甘露糖-6-磷酸部分的修饰和磷酸化。结合有MPR的水解酶首先被递送至内涵体中，在此其由于腔内pH的下降而从受体解离，由此使受体重新被回收至TGN。虽然定位于高尔基体的含γ-耳ADP核糖基化因子结合蛋白(γ-ear-containing ADP ribosylation factor-binding proteins，GGA)也发挥作用，但披网格蛋白小窝中主要负责将MPR分选至TGN处的蛋白为衔接蛋白-1(AP-1)。AP-1和GGA是否为共同作用或者实际上将两种MPR靶向不同的亚细胞定位，目前还不知道。AP-1是由四个成员(均为广泛用在分泌和内吞途径中的杂四聚体蛋白)组成的接合蛋白家族的一部分。AP-1除了在TGN中形成的披网格蛋白小窝内的上述作用外，质膜的内吞过程中在披网格蛋白小窝中也使用AP-1和AP-2，同时AP-3和AP-4在溶酶体相关的膜蛋白(LAMP)的运输中发挥作用。
自噬途径
自噬作用是大分子到达溶酶体的第三个被很好表征的途径。自噬作用是进化保守性途径，其涉及长寿命蛋白和细胞器的转换。其通常在低基础水平上发挥作用，不过可以在例如营养饥饿的条件下诱导自噬作用。在这些条件下，巨自噬是负责向溶酶体递送物质的主要途径。巨自噬的特征在于包裹胞质细胞器的扁平膜池和/或由此形成闭合的双膜结合空泡(自噬体)的胞质部分。自噬体最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体/自溶酶体，在此发生所吞噬的大分子的降解和回收。自噬体膜的来源仍未阐明。内质网、高尔基体、被称为吞噬核心的没有被很好表征的膜区室以及从头合成(de novo synthesis)都被认为自噬体膜的来源。通过酵母基因组学的新进展和后来的哺乳动物同源物的发现迅速增强了对自噬过程的理解，并且还有望在不久后阐明自噬体膜的来源。
还有其它的溶酶体接受自噬物质的途径。被称为巨自嗜作用的相当难区分的过程的特征在于溶酶体通过溶酶体膜的内陷吞没胞质。除了存在于所吞没的胞质中的大分子外，该过程还可能涉及细胞器(例如过氧化物酶体)的摄取。最后，分子伴侣介导的胞质蛋白至溶酶体腔内的运输代表了自噬作用的更直接的选择形式。该途径依赖于溶酶体膜两侧存在的热休克蛋白70家族的组成型表达成员Hsc70。该过程还依赖于LAMP-2a对目标蛋白内的KDEL序列基序的识别。
溶酶体的重新形成和溶酶体分泌
在溶酶体与晚期内涵体或自噬体融合后，通过酶蛋白的扣押和腔内容物的凝缩由所产生的杂合细胞器重新形成溶酶体。在需要从杂合细胞器除去或回收的膜蛋白中，最明显的是MPR，原因是根据定义其是不存在于溶酶体中的。然而，不能将溶酶体看作是细胞内吞途径的终点，原因是溶酶体也能够通过与分泌颗粒融合而形成分泌溶酶体，这是一个Ca2+-依赖性过程并首先在造血来源的分泌细胞中被认可。然而，也存在Ca2+-调节的接近膜的溶酶体区室负责非分泌细胞的胞吐作用的证据。胞吐的过程依赖于蛋白Rab27a，其为具有大于60个成员的Rab蛋白家族的成员。Rab是在大多数膜转运步骤(包括小泡形成、运动、停靠和融合)中具有重要调节作用的小GTPases。在细胞内吞途径中为了确定各种细胞内吞分子及其小泡的命运，至少使用了13种Rab。
程序性细胞死亡
调节总细胞数以及构成不同组织的细胞数并需要用于清除不需要的细胞的机制，这在多细胞生物体中都非常重要。程序性细胞死亡是实现这种目的的一种方式，其使多细胞生物体具有自身除去不需要的细胞而不泄漏细胞组分，并由此避免与坏死(与程序性细胞死亡在概念上相似)相关的炎症的潜能。
凋亡
术语凋亡使用的是希腊语，用以描述花瓣从花上或者树叶从树上“脱落”或“掉落”，并且在1972年由Currie及其同事首次创造，用以描述作者在多种组织和细胞类型中观察到的程序性细胞死亡的通用类型。作者注意到他们观察到的事件具有明显的形态相似性，其不同于表征细胞经历病理的坏死性死亡的形态特征，并提出这些共同的形态特征可能是由于经历了一个共同的过程。
当细胞通过凋亡死亡时，其经历一系列的转变事件(transforming event)。在这些事件中且对特征性凋亡表型至关重要的是caspase的激活，caspase是半胱氨酸肽链内切酶家族，其在特异的天冬氨酸残基处切割底物，由此得名。caspase的激活导致其它caspase的蛋白水解加工以及细胞内总蛋白活性的其它一些变化，最终产生与caspase激活相关的典型的形态特征，并由此被定义为凋亡。典型的凋亡特征包括细胞收缩和胞质膜起泡，核内染色质凝聚为清晰的几何形状，DNA片段化为～200bp的部分，所谓的核小体梯度，细胞从其相邻细胞脱离和细胞被瓦解成所谓的凋亡体的小的封闭小泡。在多细胞环境中，这些凋亡体最终被巨噬细胞或相邻细胞吞噬，由此实现不利细胞的清除。
程序性细胞死亡
程序性细胞死亡(PCD)与凋亡不同意，虽然由于大量文献不加区别地使用这些术语而可能趋向于认为两者相同。术语PCD逐渐接替，但术语凋亡仍然被用于描述由caspase(尤其是caspase-3)的激活而产生的细胞死亡程序。然而，某些细胞在促凋亡caspase的激活下存活以及完全没有caspase激活的PCD和caspase激活导致非凋亡PCD的能力揭示了细胞死亡程序的显著可塑性，并由此PCD可能被更准确地定义为依赖于死亡细胞内的信号或活性的细胞死亡。虽然优选根据在任何导致死亡的给定条件组下参与的信号途径来区分PCD，但已经提议可以根据死亡细胞的细胞核形态将PCD分成凋亡、凋亡样PCD和坏死样PCD，所杜撰的每种定义对应于不同的形态特征，主要特征是染色质凝聚的形状或没有染色质凝聚。然而，由于仍在挑选导致不同种类的细胞死亡的线索，所以仍没有可用于区分不同PCD模型的方法。
坏死
坏死是PCD的概念相似物，原因是除了除去产生坏死的刺激外不能通过任何其它方式抑制坏死。这种细胞死亡模式通常见于生物体的病理损害过程中。
程序性细胞死亡的分子机器
凋亡
如在之前部分所提及的，通过被称为caspase的半胱氨酸肽链内切酶家族成员的激活以及与其激活相关的形态来定义凋亡。Caspase以未激活的酶原的形式存在于细胞中，蛋白水解加工可迅速激活该酶原。所述加工以级联形式进行，在该级联中，凋亡刺激物激活起始caspase(例如caspase-8和caspase-9)，其进一步激活级联中的下一级——效应caspase(例如caspase-3、caspase-6和caspase-7)。由于效应caspase切割多种底物(该加工最终导致凋亡相关的表型)，其被认为是凋亡的执行者。凋亡程序可以由多种刺激物激活，可以将所述刺激物广义地分为细胞外刺激物和细胞内刺激物，细胞内刺激物参见作为主要参与者的线粒体。所述细胞外刺激物和产生凋亡的以下反应也可以被称为外来信号途径，其包括由多种死亡受体之一(例如Fas/Apo-1/CD95、TNFR或TRAIL)的激活起始的一系列事件。与其适当的配体结合后，这些受体通过与受体中存在的死亡结构域(DD)相互作用而募集包含死亡结构域的衔接分子(adaptor molecule)，例如TRADD(TNFR1相关死亡结构域蛋白)和FADD(具有死亡结构域的Fas相关蛋白)。然后，这些衔接分子将caspase-8招募至受体复合物，在此可能通过接近诱导的自催化加工激活caspase。然后，在某些细胞(所谓的I型细胞)中，caspase-8直接切割并激活procaspase-3，然而在II型细胞中，caspase-8的下一级为胞质蛋白Bid。Bid的切割产生片段(截短Bid(tBid))，其诱导两个促凋亡Bcl-2家族成员Bax和Bak的低聚化、转位并插入至线粒体外膜。这种插入介导了电子载体细胞色素c(CytC)以及其它一些蛋白从线粒体膜间间隙释放，其中在所述其它一些蛋白中，最突出的包括凋亡诱导因子(AIF)、对抗已知的凋亡抑制(IAP)蛋白的作用的Smac/DIABLO和内切核酶G(其为DNAse)。应该注意到，虽然这是通过线粒体激活caspase的理论的关键点，但并没有关于Bax和Bak的插入如何促进细胞色素c的释放的决定性证据。从线粒体释放后，CytC在细胞质中积聚，在此其与蛋白Apaf-1(凋亡蛋白酶激活因子-1)结合，引起构象变化，从而促进Apaf-1的低聚化。然后，该低聚物通过caspase募集结构域(CARD)之间的同型相互作用而与procaspase-9结合，导致形成所谓凋亡体的复合物。该复合物的形成很大程度上增强了pro-caspase-9的酶促活性，从而导致caspase-3蛋白水解激活。
凋亡还可以由引发线粒体外膜通通透化(MOMP，被称为内部途径的过程)的细胞内因素触发。这些因素包括与细胞应激相关的第二信使，例如Ca2+、NO和花生四烯酸以及胆红素、胆汁盐和能够产生蛋白变性以及核DNA和线粒体DNA受损的刺激物(例如电离辐射、热应激、活性氧(ROS)和化疗剂。在核DNA受损事件中，多种蛋白激酶都可感应该事件，但其依赖于DNA损害的形式且由Noxa引发。这些激酶的活性诱导p53的集聚，然后p53可以作为转录因子导致促凋亡基因(例如Bax、Noxa和PUMA，均可诱导MOMP)的转录增强。p53在线粒体水平上诱导局部产生ROS的线粒体酶和线粒体基质蛋白(p53AIP1)的表达，而其过表达则触发线粒体膜电位的丢失和凋亡。
上述通过p53或内在刺激物作用的MOMP的诱导是内在途径和外在途径的交汇点，内在途径在已经描述的外在途径之后，具有细胞色素c的释放、凋亡体的形成和caspase-3的激活，其构成了使不利细胞死亡的最后几个步骤。
凋亡的选择
在过去十年，caspase作为PCD执行者的排他性作用已经遭到挑战，越来越多的证据表明，对于细胞的生命并且尤其是死亡来说，起作用的不单是caspase。
新开发的caspase特异性药理学抑制剂以及诸如能量损耗、硝化/氧化应激和凋亡蛋白抑制物(IAP)家族的因素对caspase途径的灭活并不总是阻止步入死亡的进程，其显露出或者甚至增强一些基础的非caspase依赖性死亡程序。这些程序包括死亡受体起始的途径和由癌症药物、失去生长因子、星形孢菌素(staurosporine)、Bax相关蛋白和Hsp70缺乏引发的途径。这些非caspase依赖性死亡程序的形态特征常常使人想起经典凋亡所观察到的形态特征，诸如组织蛋白酶、需钙蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的其它蛋白酶作为caspase上游或下游的主要辅因子的作用的实验证据迅速增多。许多非-caspase蛋白酶能够切割至少一些经典caspase底物的发现更加强了该论点，该发现可能能够解释所观察到的caspase依赖性死亡程序和非caspase依赖性死亡程序之间的一些相似性。
尽管由于此类死亡程序被caspase的功效所掩蔽而可以争论此类死亡程序的相关性，但证据集中于溶酶体组织蛋白酶在作为对多种刺激物(例如肿瘤坏死因子受体家族的死亡受体、缺氧、氧化应激、渗透应激、热和抗癌药)的反应所起始的细胞死亡程序中的进化保守性作用。
溶酶体在程序性细胞死亡中的作用
虽然充分确定了溶酶体及其水解酶在PCD清除期(即相邻细胞或吞噬细胞对凋亡细胞或凋亡体的吞没)的作用，但认识到溶酶体及溶酶体水解酶在PCD的较立即事件中的重要性花费了很长时间。这种延迟的一个原因可能是通常用于评价caspase在PCD中的作用的甲基酮肽抑制剂(例如zVAD-fmk、Ac-DEVD-fmk、Boc-D-fmk等)还抑制包括几个半胱氨酸组织蛋白酶在内的其它半胱氨酸蛋白酶的事实。即使在认识到这种交叉作用后九年，能够抑制非-caspase蛋白酶的浓度的这些抑制剂的保护性作用仍然常常被理解为是caspase介导的死亡途径的证据，因此其它半胱氨酸蛋白酶在PCD中的作用仍被低估。由于在电子显微镜分析的凋亡细胞中显示完整的溶酶体超微结构，溶酶体PCD的发现可能也一直被延迟。因此，直至最近一直认为溶酶体破裂是不受控的坏死细胞死亡和组织自溶的晚期阶段过程中的全或无开关。然而，可以更准确的评价溶酶体膜完整性的新技术已经揭示，具有正常超微结构的溶酶体可能泄漏了其部分酶，并且部分溶酶体膜通透化(LMP)不仅发生在许多死亡模式的早期，事实上还可以触发凋亡和凋亡样PCD。
溶酶体膜通透化(LMP)及其结果
利用直接靶向溶酶体膜完整性的多种化合物(例如H2O2、L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯、渗透应激、鞘氨醇、趋溶酶体抗生素诺氟沙星和环丙沙星和光致氧化溶酶体损害(光分解))的研究已经令人信服地证明了中等溶酶体通透化能够导致PCD。已经提出用溶酶体破裂量和细胞死亡模式之间的定量关系解释LMP之后的差异很大的形态结果。根据该模型，低应激强度触发溶酶体内容物向细胞质的有限释放，之后是凋亡或凋亡样细胞死亡，而高强度应激导致广义的溶酶体破裂和细胞的迅速坏死。因此，低浓度鞘氨醇(在低pH具有类似于去污剂的性质的酸性神经酰胺酶产生的神经酰胺的代谢物)诱导部分LMP和caspase介导的凋亡，而高浓度则导致大量的LMP和非caspase依赖的坏死性细胞死亡。在该模型中，由部分LMP触发的死亡可以被半胱氨酸和天冬氨酸组织蛋白酶的药理学抑制剂所抑制，并且胞质组织蛋白酶活性的提高先于caspase的激活和线粒体膜的潜在变化，这提示胞质组织蛋白酶在死亡过程中的直接作用。重要的是，LMP和组织蛋白酶在细胞死亡中的作用并不局限于采用直接溶酶体破裂物的实验模型。LMP还参与完成应对多种典型的凋亡刺激物(例如肿瘤坏死因子(INF)受体家族的死亡受体的激活、白介素-1、p53激活、生长因子饥饿、微管稳定剂、依托泊苷、σ-2受体激活、合成的类视色素CD437、B细胞受体激活、星形孢菌素、渗透应激以及在诱导不依赖于p53的凋亡的新型抗癌药的筛选中鉴定的小分子)的细胞死亡。
作为线粒体凋亡途径触发器的LMP
LMP的细胞毒性作用常常依赖于(至少部分依赖于)线粒体死亡途径的激活。线虫微注射研究已经证明，当位于胞质中时，与细胞总组织蛋白酶D活性的一半对应的细胞剂量的单个溶酶体水解酶(组织蛋白酶D)足以在人成纤维细胞中触发线粒体外膜通透化和凋亡。然而，组织蛋白酶D不足以触发涉及LMP的所有细胞死亡模型中的PCD。其它被文献充分证明的由LMP触发的PCD的介质(mediator)包括半胱氨酸组织蛋白酶B和L以及活性氧。然而，应该强调的是，并没有恰当地排除其它溶酶体水解酶、溶酶体来源的第二信使和LMP-诱导的胞质的酸化的作用。组织蛋白酶和线粒体膜通透化之间的一个连接可能是Bid，其是Bcl-2家族的唯BH3促凋亡蛋白，其在胞质pH下能够被数种半胱氨酸组织蛋白酶加工并激活，但不被组织蛋白酶D加工和激活。然而，已经提出组织蛋白酶D在TNF受体-1(TNF-R1)内在化后在溶酶体区室内的酸性环境中切割并激活Bid。根据该模型，配体激活的TNF-R1的内吞引起酸性鞘磷脂酶介导的神经酰胺的产生，然后神经酰胺与未活化的组织蛋白酶D结合并通过自催化加工激活组织蛋白酶D。如在星形孢菌素处理的T细胞中所证明的，组织蛋白酶D还可以以不依赖于Bid的方式激活Bax。此外，在用环丙沙星处理的成纤维细胞中，LMP通过Bax和Bak的Bid非依赖性激活而触发线粒体膜通透化。在该模型系统中，Bax的激活不依赖于组织蛋白酶D，而依赖于活性氧。应该注意到，在缺乏Bax和Bak的细胞中没有完全抑制环丙沙星诱导的线粒体膜通透化。将LMP与线粒体膜通透化联系起来的另一个机制可能包括活性氧和/或可以以依赖于组织蛋白酶B的方式产生的脂质介质(例如花生四烯酸)的直接作用。
利用来自单个组织蛋白酶缺陷的小鼠的永生化鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的研究已经清楚的表明，细胞死亡执行根据触发LMP的刺激物而由不同的组织蛋白酶参与。来自组织蛋白酶B和L缺陷小鼠而非组织蛋白酶D缺陷小鼠的永生化MEF对TNF高度耐受，而当用星形孢菌素对所述细胞进行处理后则出现相反的结果。对TNF诱导的细胞死亡途径的深入研究进一步揭示了单个组织蛋白酶在PCD中的作用取决于所研究的细胞类型。如上所述，TNF诱导的永生化MEF的死亡与半胱氨酸组织蛋白酶有关，而与组织蛋白酶D无关。然而，组织蛋白酶D的缺失可有效保护HeLa宫颈癌细胞不受TNF-诱导的和顺铂诱导的细胞毒性。这种区别似乎不是由于人和鼠细胞的一般差别，原因是组织蛋白酶B单独或者与其它半胱氨酸组织蛋白酶一起还对在人宫颈癌细胞系((ME-180))和乳腺癌细胞系(MCF-7)中TNF诱导的有效杀伤至关重要。对这种差别的解释仍不为人所知，但不同细胞系中单个组织蛋白酶及其抑制剂的不同表达水平可能起作用。因此，不同死亡刺激物调节单个组织蛋白酶或其抑制剂的表达水平的能力可能解释了对不同刺激物的应答的区别。例如，已知阿霉素和依托泊苷通过p53的激活增强组织蛋白酶D的表达。或者，多种刺激物诱导的其它信号途径可以与特定的组织蛋白酶协作。
LMP诱导的线粒体非依赖性死亡途径
重要的是，LMP和胞质组织蛋白酶的致死作用不限于内在凋亡途径的激活。在用微管稳定药物(紫杉醇、埃博霉素B和盘皮海绵内酯(discodermolide)处理的小细胞肺癌细胞中，LMP在死亡过程的早期发生，并且半胱氨酸组织蛋白酶以不依赖于caspase的方式介导微核化和细胞死亡。在TNF处理的人癌细胞系中，在线粒体外膜通透化的下游发生LMP。然而，对半胱氨酸组织蛋白酶活性或表达的抑制可显著保护细胞免受TNF诱导的细胞死亡，且没有明显抑制效应子caspase的激活。此外，在TNF处理的鼠WEHI-S纤维肉瘤细胞中，在缺乏caspase活性下，组织蛋白酶B引起凋亡样变化，例如染色质凝聚、磷脂酰丝氨酸外露和质膜起泡。另外，多种人癌细胞中热休克蛋白70(Hsp70)的缺失和T细胞的超最适度激活触发了LMP和组织蛋白酶介导的凋亡样PCD，而没有激活内在凋亡途径。与这些数据相符的是，组织蛋白酶B可以在分离的核中诱导核凋亡。因此，取决于刺激物和细胞情况，组织蛋白酶似乎具有作为程序性细胞死亡的起始物和效应蛋白酶两种能力。特别地，组织蛋白酶在癌细胞(其中，由于例如Bcl-2的过表达使线粒体死亡途径被阻断)中介导PCD的能力使得有望证明诱导LMP的治疗可有效治疗对常规凋亡诱导物耐受的癌症。永生化和转化能使细胞对溶酶体细胞死亡敏感的数据进一步支持了该观点。
向LMP的信号传导
如以上所述，LMP之后向胞质中释放溶酶体内容物(尤其是组织蛋白酶)被认为是溶酶体死亡途径的主要激活步骤。然而，导致LMP的信号途径仍然仅仅开始显现。虽然不同靶细胞中广泛不同的应答已经使向LMP的信号传导途径的解释在很大程度上复杂化，但研究的最透彻的机制之一是来自肿瘤坏死因子受体1的信号。
总之，TNF可以根据细胞情况诱导caspase依赖性LMP或caspase非依赖性LMP。此外，TNF相关配体FasL、TRAIL和TWEAK也都与具有凋亡或坏死形态的caspase非依赖性PCD有关。药理学和遗传研究表明，caspase介导的由TNF导向LMP的途径依赖于caspase-8和caspase-9，不过人和鼠细胞中caspase-9的激活相差较大。Caspase和LMP之间的关联仍不知晓，并且虽然已经提出由TNF诱导的caspase-8介导的Bid切割导致LMP，但在Bid缺乏的iMEF中TNF诱导的LMP不能证实这些发现。进一步提出Bid是组织蛋白酶在溶酶体死亡途径中的靶标，从而提示Bid在LMP下游而非上游。
TNF还通过激活质膜上的中性鞘磷脂酶(SMase)以及溶酶体区室内酸的或酸性的SMase(aSMase)而刺激鞘磷脂降解为磷酸胆碱和神经酰胺。这两个事件都在TNF诱导的细胞死亡途径中有牵连，但目前仅中性SMase通过与中性SMase(FAN)相关的因子与LMP相连。基于FAN缺陷性iMEF和表达负显性形式的FAN的人成纤维细胞的研究表明，FAN不仅介导TNF诱导的神经酰胺产生，还参与caspase-8加工和细胞死亡。由于鼠肝细胞中TNF诱导的LMP依赖于caspase-8，其加工减少可以解释表达负显性FAN的经TNF处理的肝细胞中LMP的减少。然而，不能排除神经酰胺及其代谢物的作用。aSMase缺陷性(其在caspase-8下游被激活)小鼠体内TNF的降低和Fas诱导的肝毒性支持了神经酰胺及其代谢物在TNF-诱导的死亡信号传导中的作用。特别地，在由溶酶体酶酸性神经酰胺酶催化的反应中由神经酰胺生产的鞘氨醇是诱人的候选物，原因是与神经酰胺相反，鞘氨醇可以作为去污剂，直接使溶酶体膜不稳定。除了通过激活SMases提高产生的鞘氨醇前体神经酰胺外，TNF还通过组织蛋白酶B介导的鞘氨醇激酶-1(将促凋亡的鞘氨醇转化为抗凋亡的鞘氨醇-1-磷酸的酶)的下调而调节鞘氨醇的水平。组织蛋白酶B的这种活性可能导致鞘氨醇在溶酶体中的集聚，并由此可以(至少部分地)解释在经TNF处理的肝细胞中，高效的LMP需要组织蛋白酶B。
TNF还可以在存在caspase抑制剂的条件下触发LMP和细胞死亡。该途径不依赖于caspase-8，但需要含死亡结构域的受体相互作用蛋白-1(RIP-1)，并涉及活性氧的产生。氧化应激可以通过Fenton型化学与溶酶体内离子共同产生氧自由基，并由此可以引起溶酶体膜脂质的氧化，导致溶酶体膜不稳定和溶酶体内容物的释放。然而，RIP-1、氧化应激和LMP之间的分子联系仍然未知。
几种典型的凋亡诱导物(例如p53、依托泊苷和星形孢菌素)对细胞死亡的诱导还涉及LMP，之后为组织蛋白酶依赖性线粒体膜通透化。然而，从这些刺激物至LMP的信号途径仍待揭示。
抗LMP的细胞防御机制
考虑到LMP的潜在致死结果，细胞已经发展出多种策略，或者通过抑制LMP本身，或者通过保护细胞不向胞质泄漏酸性水解酶(LMP的后果)进行应对并不奇怪。
在其多种其它功能中，已经报道磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)保护溶酶体不被去稳定(destabilization)。在人血管内皮细胞中抑制PI3K诱导组织蛋白酶B向胞质中的释放，这证明了PI3K在保持溶酶体膜的完整性中的相当直接的作用。此外，PI3K抑制剂使细胞对TNF诱导的和白介素-1诱导的溶酶体死亡途径敏感。癌细胞中溶酶体功能的改变和组织蛋白酶表达水平的增加可能以降低溶酶体稳定性的方式造成威胁。因此，通常在人癌细胞中被激活的PI3K还可以促进肿瘤细胞中溶酶体的稳定，并由此提高其细胞死亡抗性。尽管PI3K在肿瘤细胞溶酶体稳定性中的作用只是推测性的，但最新的数据支持Hsp70在保护溶酶体免受细胞膜破坏性刺激物中的作用。这项工作主要在肿瘤细胞中进行，这也常常证明了Hsp70在质膜以及溶酶体内区室中的定位。
在LMP时向胞质中释放溶酶体蛋白酶的事件中，胞质蛋白酶抑制剂提供了对抗其有害结果的屏障。尽管没有已知的组织蛋白酶D的内源性抑制剂，但至少三种胞质蛋白酶抑制剂，即胱抑素A和B以及丝氨酸蛋白酶抑制剂2A(Spi2A，最近发现其还具有针对几种半胱氨酸组织蛋白酶(B、H、K、L和V)和组织蛋白酶G的高效抑制剂活性)可以有效抑制半胱氨酸组织蛋白酶。胱抑素B缺陷性小鼠(显示其小脑颗粒细胞的凋亡增加)证明了这些抑制剂在防止生理和病理条件下的PCD中的重要性。此外，Spi2A的表达在TNF处理时通过NF-κB途径被诱导，并有效抑制了TNF诱导的MEF中胞质组织蛋白酶B的活性和细胞死亡。有趣的是，已经报道在秀丽线虫(C.Elegans)中，胞质丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)-6可保护对抗来自由高渗应激和多种其它溶酶体应激引起的溶酶体损伤的诱导和致死效应，这证明对抗LMP的保护作用是进化保守性机制。
溶酶体贮积病
溶酶体贮积病(LSD)是由溶酶体功能缺陷引起的包括大约40种罕见的遗传代谢病症的一类疾病。LSD由通常作为脂质、糖蛋白或粘多糖代谢所需的单个酶的缺陷的结果的溶酶体功能失常所引起。虽然各个病症是由被翻译成酶活性缺陷的不同基因突变引起的，但其具有一个共同的生化特征——所有溶酶体病症源自物质在溶酶体内的异常集聚。
单个地，LSD的发生率小于1∶100,000，但作为组，其发生率为约1∶5000-1∶10,000。这些病症中的大多数是常染色体隐性遗传，然而也有一些是X-连锁的隐性遗传，例如法布里病。
通常根据所涉及的主要贮积物质的性质对所述溶酶体贮积病进行分类，可以将其大致分成以下组：
-脂质贮积症(或脂沉积病(lipidose))，主要是鞘脂贮积症(包括戈谢病和尼曼-皮克病)
○神经节苷脂贮积病(包括泰-萨氏病)
○脑白质营养不良
-粘多糖贮积病(包括Hunter综合征和Hurler病)
-糖蛋白贮积病(糖蛋白贮积病)
-粘脂贮积病
根据疾病的严重程度，患者或者在年轻时或在不可预测的年龄死亡，许多患者在出生后数月或数年死亡，然而，其他存活进入成人早期的，最终死于其特定病症的多种病理。LSD的症状根据特定病症而不同，并且可以为轻微的至严重的症状。所述症状可以包括发育延迟、运动障碍、癫痫发作、痴呆、耳聋和/或失明。一些患有LSD的人的肝脏增大(肝肿大)，脾增大(脾肿大)，具有肺和心脏问题以及骨骼生长异常。
通过酶测定初步筛出多数患者，酶测定是实现确诊的最有效方法。在一些家族(其中引起疾病的突变是已知的)中和某些遗传隔离群体中，可以进行突变分析。由于可能具有多种不同的突变，有时对编码受影响的特定酶的基因进行测序是确诊必须的。当具有已知的遗传风险因子时，产前诊断可能是有用的。
在一个实施方式中，本发明涉及用于治疗溶酶体贮积症的方法。
溶酶体的鞘脂水解
许多酶都参与溶酶体对鞘脂(或糖鞘脂)的代谢(参见图4)。这些酶(或者更具体地为水解酶)均参与特定鞘脂的降解。
溶酶体鞘脂水解酶与鞘脂激活因子蛋白(SAP或鞘脂激活蛋白)相互作用以刺激所述水解酶的活性。认为SAP有利于水溶性酶和膜结合底物之间的酶/底物相互作用。
此外，晚期内涵体和溶酶体区室的脂质组成的特征在于存在带负电荷的磷脂，例如BMP和PI(磷脂酰肌醇)，其也刺激一些水解酶的活性。BMP-依赖性溶酶体水解酶包括唾液酸酶、α-半乳糖苷酶A、葡糖神经酰胺酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶A、酸性神经酰胺酶和鞘磷脂酶。
辅因子鞘脂激活蛋白
鞘脂激活蛋白是作为多种溶酶体脂质降解酶的激活剂的小的溶酶体蛋白，其可能通过从膜环境分离脂质底物，由此使其更易接近可溶的降解酶而发挥作用。所有哺乳动物鞘脂激活蛋白均以单个前体分子(鞘脂激活蛋白原)合成，所述前体分子包含在蛋白水解切割后产生活性鞘脂激活蛋白的四个鞘脂激活蛋白-B结构域和在激活反应中被除去的两个鞘脂激活蛋白-A结构域。所述鞘脂激活蛋白-B结构域还存在于其它蛋白中，其中一些在膜裂解中具有活性。
鞘脂激活蛋白原(PSAP)是在人中由PSAP基因编码的蛋白。该基因编码高度保守的糖蛋白，其是4个裂解产物鞘脂激活蛋白A、B、C和D的前体。鞘脂激活蛋白是鞘脂激活因子蛋白或SAP的缩写。所述前体蛋白的各结构域的长度均为大约80个氨基酸残基，并且半胱氨酸残基以及糖基化位点的位置几乎相同。鞘脂激活蛋白A-D主要位于溶酶体区室，在此其促进具有短的寡糖基团的糖鞘脂的代谢。所述前体蛋白同时作为分泌蛋白和膜内在蛋白(integral membrane protein)而存在，并且具有亲神经活性。特定溶酶体水解酶对某些鞘脂的水解需要鞘脂激活蛋白A-D。
鞘脂激活蛋白是唾液酸酶(SAP-B)、α-半乳糖苷酶A(SAP-B)、葡糖神经酰胺酶(SAP-C、β-半乳糖苷神经酰胺酶(SAP-C)、芳基硫酸酯酶A(SAP-B)和酸性神经酰胺酶(SAP-D)的重要辅激活物。酸性鞘磷脂酶(aSMase)并不决定性地依赖于任何已知的激活蛋白，然而鞘脂激活蛋白的存在提高了该酶的活性。第五个鞘脂激活蛋白GM2-激活蛋白也已经被表征。
BMP
二(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)还被称为溶血二磷脂酸，是晚期内涵体和溶酶体区室的脂质成分的主要部分，其是带负电荷的磷脂，更具体地是甘油-磷脂。
BMP首次分离自兔肺部，但现在已知是所有动物组织的常见但却很少的组分。BMP的立体化学构型与其它动物甘油-磷脂的区别在于磷酸二酯部分与甘油的sn-1和sn-1’而非sn-3位置相连。甘油部分中的sn-3和3’或sn-2和sn-2’位置是否被脂肪酸酯化仍不清楚。不论脂肪酸在甘油分子上的位置如何，其组成都可以以18:1(n-9)和18:2(n-6)、20:4和22:6(n-3)的丰度而不同，不过这高度取决于具体的组织、细胞类型或细胞器。这种不同的组成提示十分特异的功能，这些中的一些仍未被揭示。
BMP通常为动物组织的相当少的组分。然而，在肝脏和其它组织的溶酶体中高度富含BMP，在这些组织中其可占膜磷脂的15％或更高，并且目前被认作是该细胞器的标记物。含有特有的脂质BMP的是晚期内涵体和溶酶体。确实，包含70％之多的BMP磷脂的似乎是晚期内涵体的内膜。
如果所报道的BMP存在于杆菌种的一些嗜碱株中能被证实，则这将是BMP脂质严格地为哺乳动物来源且不存在于原核生物、酵母和高等植物中这一规则的唯一已知的例外。
有利的证据是BMP主要在内涵体系统中由磷脂酰甘油合成。在所认为的主要途径中，在第一步，磷脂酶A2从磷脂酰甘油的sn-2位置除去脂肪酸。在第二步，通过与溶血磷脂酰甘油(作为酰基供体和酰基受体)的酰基转移酶反应使溶血磷脂酰甘油在头部基团甘油部分的sn-2’位置被酰化，从而产生sn-3:sn-1’溶血二磷脂酸。第三步仍没有被适当地描述，但肯定包括从主要甘油单元的sn-1位置除去脂肪酸，以及磷酰基酯从sn-3到sn-1位置的重排。最终，可能通过与作为供体的另一个磷脂的酰基转移反应使主要甘油单元的sn-2位置被酯化(由此产生独特的脂肪酸组成)。也可能是其它生物合成途径。
BMP在溶酶体中的功能仍处于积极研究中，其可能通过倾向不形成双层的帮助在复杂的腔内膜系统的形成中发挥结构性作用。BMP是锥形分子，并且促进在内涵体中的pH下的膜融合。此外，BMP的独特立体化学性质意味着其对磷脂酶具有抗性，因此将阻止或防止溶酶体膜的自降解。脂肪酸组分可以通过酰基转移反应而迅速转换(turn over)，但甘油磷脂骨架是稳定的。另一种可能性是该脂质可以与膜区域中功能类似于筏(raft)的特定蛋白结合。已经提出，在多泡晚期内涵体内包含的富含BMP的膜的特征性网络通过作为收集和重分配点而调节胆固醇运输。例如，当用抗BMP抗体温育溶酶体膜时，胆固醇易于集聚。该过程受Alix/AlP1的控制，Alix/AlP1是特异性地与BMP相互作用的蛋白且参与向多泡内涵体中的分选。
已知BMP极大地刺激参与糖基神经酰胺降解的酶，例如鞘脂激活因子蛋白，如鞘脂激活蛋白。在这种情况下，BMP可以简单地发挥功能以提供适合鞘糖脂水解酶与其激活物相互作用的环境。此外，BMP还在为在肺泡巨噬细胞中产生二十烷酸提供花生四烯酸酯中发挥极大作用。
当膜中存在BMP时，BMP依赖性酶的水解速度极大提高，对于aSMase，甚至在没有诸如鞘脂激活蛋白的激活蛋白存在的情况下也如此。在图4中，点划圈标记的是具有BMP依赖性的酶或所述酶的缺陷性疾病。
BMP与溶酶体贮积病，例如尼曼-皮克C病(胆固醇集聚)和某些药物诱导的脂沉积症的病理有关。在这些情况下，其组成易于改变从而有利于包含较少多不饱和组分的分子。BMP是被患有所谓抗磷脂综合征的罕见且尚不清楚的疾病的患者的自免疫血清识别的抗原，因此，其可能是该疾病的病理基础中的因子。
在一个实施方式中，本发明涉及通过利用Hsp70和BMP之间的相互作用而治疗溶酶体贮积症的方法。
脂质贮积症
脂质贮积症(或脂沉积病)是溶酶体贮积症的一个亚群，在该组疾病中由于脂质代谢所需的酶的表达或功能的降低使有害量的脂质积聚在细胞内。这种过量贮积的脂质可随时间引起永久的细胞和组织损伤，尤其在脑、外周神经系统、肝、脾和骨髓中。
脂质是一大组天然存在的分子，其包括脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素(例如维生素A、D、E和K)、单甘油酯、二甘油酯、磷脂及其它。脂质的主要生物功能包括能量储存、作为细胞膜的结构组成和作为重要的信号传导分子。
脂质可以被宽泛地定义为疏水性或两性小分子，一些脂质的两性性质可使其在水环境中形成诸如小泡、脂质体或膜的结构。生物脂质完全或部分源自两种不同类型的生化亚基：酮酰基基团和异戊二烯基团。利用该方法可以将脂质分成8类：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮(源自酮酰基亚基的缩合)；以及固醇脂和孕烯醇酮脂(prenol lipids，源自异戊二烯亚基的缩合)。
虽然有时将术语脂质用作脂肪的同义词，但脂肪是被称为三甘油酯的脂质的亚组。脂质还包括诸如脂肪酸及其衍生物(包括三甘油酯、二甘油酯和单甘油酯和磷脂)以及含固醇的其它代谢物(例如胆固醇)。
已经对以脂质集聚为特征的一些溶酶体贮积症(即脂质贮积症)进行了表征；这些溶酶体贮积症概述于下文。
在一个实施方式中，本发明涉及用于治疗脂质贮积症的方法。
尼曼-皮克病
尼曼-皮克病(NPD)由酸性鞘磷脂酶(aSMase，其系统命名为鞘磷脂磷酸二酯酶)的缺陷引起。溶酶体酶aSMase水解大量膜鞘磷脂，以产生神经酰胺(和胆碱磷酸)。鞘磷脂由与短的亲水性磷酸胆碱部分相连的神经酰胺膜锚定组成。
鞘磷脂酶并不决定性的依赖于任何已知的激活蛋白，这使aSMase的假定分子内激活结构域和溶酶体中存在的带负电荷脂质足以用于鞘磷脂转换。因此，aSMase不需要作为辅因子的鞘脂激活蛋白的存在，然而存在的鞘脂激活蛋白总是进一步刺激该酶的活性。(Ferlinz et al.，1999)。BMP刺激aSMase的活性。
当鞘磷脂不能被完全代谢时，其积聚在细胞内，最终导致细胞死亡和主要器官系统功能不全。症状可能包括肌肉协调缺乏，脑退化，学习问题，肌肉张力丧失，对碰触的敏感性增加，痉挛、喂食和吞咽困难，言语含糊(slurred speech)以及肝和脾增大。可能具有角膜混浊并且在视网膜中心周围形成典型的樱桃红的晕。
尼曼-皮克病(NPD)具有4个相关类型，类型A、B、C和D。所有类型的NPD都以常染色体隐性模式遗传，且可以影响男性和女性。在A型和B型中，aSMase酶活性的不足引起毒性量的鞘磷脂的增加。当人的两份aSMase基因(两个等位基因)都发生突变时，产生这种疾病。
A型尼曼-皮克病(NPDA)是最常见的类型，其发生在婴儿期。NPDA的特征是黄疸、肝增大和深度脑损伤。目前还没有针对A型患者的有效治疗，A型患者在婴儿期死亡，通常在18个月龄之前死亡。
B型尼曼-皮克病(NPDB)包括肝和脾增大，其通常发生在前十年，并且常见呼吸问题。器官的增大和呼吸问题可引起心血管应激，并可在生命晚期导致心脏病。NPDB患者通常不涉及或几乎不涉及神经系统损害。已经试图对一些B型患者进行骨髓移植，并且报道的结果混杂。酶替代和基因治疗的进一步开发也可能对B型患者有帮助。B型儿童可以存活相对长的时间，但由于肺损伤而可能需要补充氧。
NPDA和NPDB均由同一酶促缺陷引起，并且越来越多的证据表明这两种形式代表连续体的相反端。NPDA患者通常产生的aSMase极少或者没有(小于正常的1％)，而NPDB患者的aSMase为正常水平的约10％。
全世界大约有1,200例NPA和NPB，且主要为B型或中间形式。
通过测定血液样本中白细胞内的aSMase活性水平对NPDA和NPDB进行诊断。虽然这种检测将鉴别出A型和B型患者，但对于携带者(其仅具有一个没有功能的ASM基因拷贝)的检测则非常不可信。此外，该检测显示aSMase的活性降低，但其始终不能预测该个体为A型或B型或该疾病的中间变体，而这需要对个体进行临床评估。
在某些人群中，特定突变在aSMase缺陷病例中占高百分比。在德裔犹太人(Ashkenazi Jewish)人群中，对于NPDA，R496L、fsP330和L302P突变占引起疾病的遗传变化的比例大于95％。将该人群个体中这三个变化的直接检测用于鉴定携带者。在其它人群中，在能够对家族成员进行DNA携带者检测前，必须首先在累的个体中检测所述突变。
对于NPDB，H421Y和K576N aSMase突变占沙特阿拉伯NPDB人群的85％；L137P、fsP189和L549P突变占土耳其NPDB人群的75％；S379P、R441X和R474W突变占葡萄牙NPDB人群的55％；A196P突变占英格兰/苏格兰NPDB人群的42％，并且在NPDB患者中还已经将F480L和DeltaR608突变确定为引起疾病的原因。
C型尼曼-皮克病(NPDC)非常不同于A型或B型。NPDC患者不能在细胞中完全代谢胆固醇和其它脂质，并且其特征是具有中断胆固醇在脑细胞之间的运输的缺陷。因此，过量胆固醇和其它脂质积聚在肝、脾和脑中。NPDC引起aSMase活性的间接降低，从而导致被认为是同一疾病形式的3种类型。
当C型症状首次出现时和在所述疾病进展中具有相当大的变化。症状可以在早至数月龄或晚至成人期出现。垂直性动眼麻痹(Vertical gaze palsy，眼睛不能上下运动)、肝增大、脾增大或者儿童黄疸是可以确定为NPC的强指证。通常在该疾病的早期阶段仅出现一个或两个症状。在多数情况下，神经学上的症状在4-10岁时开始出现。通常，神经学上的症状开始的越晚，该疾病的发展越慢。
全世界诊断出约500例C型尼曼-皮克病。然而，认为受NPDC影响的人数较多，但诊断困难使得不能准确评估其发生率。NPDC最初被诊断为无学习能力、轻度迟钝、笨拙和精细运动技能发育延迟。
D型尼曼-皮克病目前被认为是C型的变体。D型通常发生在新斯科舍省具有遗传背景的人中。患有C型和D型的个体常常需要低胆固醇膳食，但其临床效果并不令人信服。患有C型和D型的患者的预期寿命不同，然而该疾病通常为致命的。绝大多数儿童在20岁之前死亡。
NPDC是罕见且变化极大的疾病，因此可能不被一些医护人员识别。对于怀疑患者中该诊断的专家，可以通过组织活检、培养成纤维细胞并研究其运输和储存胆固醇的能力而进行确定。通过测定胆固醇从一种形式至另一种形式(酯交换)的转变研究细胞中胆固醇的运输。通过用在紫外光下发光的化学剂(filipin)对细胞进行染色对胆固醇的储存进行评价。
NPC1基因在1997年被鉴定出来。该基因中的突变或引起疾病的变化导致约95％的NPDC病例。自此，已经在该基因中和被称为NPC2的第二NPDC基因中鉴定出大于250种与NPDC相关的不同遗传突变。总的来说，在大约95％的病例中，如果首先通过上述检测确定了NPC的诊断，则可能鉴定出引起所述疾病的遗传变化。然而，由于这些基因的特定突变非常多，并且具有突变没有鉴定出来的典型NPC患者，因此将遗传检测用作NPDC的常规诊断工具并不是最理想的。
尼曼-皮克病影响北美、南美、欧洲、非洲、亚洲和澳洲报道的所有部分的病例群。然而，发现在某些人群中的发生率更高：
●德裔犹太人人群(NPDA和NPDB)
●新斯科舍省的法裔加拿大人(D型-现在认为是NPDC的变体)
●北非的马格里布区(突尼斯、摩洛哥和阿尔及利亚)(NPDB)
●南部新墨西哥和科罗拉多的西班牙裔美国人群(NPDC)
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节酸性鞘磷脂酶(aSMase)的活性治疗尼曼-皮克病的方法。
法伯氏病
法伯氏病由酸性神经酰胺酶缺陷引起。酸性神经酰胺酶负责将神经酰胺转化为鞘氨醇(和脂肪酸)；因此所述缺陷导致神经酰胺的集聚。酸性神经酰胺酶的活性由BMP刺激并依赖于鞘脂激活蛋白。
酸性神经酰胺酶还被称为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶，并且由ASAH1基因编码。它是由未糖基化的α亚基和糖基化β亚基组成的杂二聚体蛋白，其中所述糖基化β亚基在翻译后被切割成成熟的酶。
法伯氏病还被称为法伯氏脂肉芽肿病、神经酰胺酶缺乏病、纤维细胞粘多糖障碍病(Fibrocytic dysmucopolysaccharidosis)和脂肉芽肿病。它是非常罕见的常染色体隐性疾病，特征是关节、肝、喉、组织和中枢神经系统异常。肝、心脏和肾也可被影响。症状通常在出生的前几周出现，并且包括运动和智力能力消弱以及吞咽困难。其它症状可包括关节炎、淋巴结和关节肿胀、嘶哑、皮下节结(并且有时在肺内和身体的其它部位)、关节周围的肌肉或肌腱慢性变短和呕吐。受影响的人可能需要插入呼吸管。在严重情况下，肝和脾扩大。
目前没有针对法伯氏病的特异治疗。皮质类固醇激素可有助于缓解疼痛。可以用骨髓移植治疗节结，在某些情况下，或者可以通过手术减小或除去。患有典型形式的法伯氏病的多数儿童在2岁死亡，通常死于肺病。患有较轻微形式的所述疾病的个体可以活到十几岁。
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节酸性神经酰胺酶的酶活性治疗法伯氏病的方法。
克拉伯病
克拉伯病由β-半乳糖苷神经酰胺酶缺陷引起。β-半乳糖苷神经酰胺酶负责将半乳糖基神经酰胺转化为神经酰胺；因此该缺陷导致半乳糖基神经酰胺的集聚。β-半乳糖苷神经酰胺酶的活性由BMP刺激并依赖于鞘脂激活蛋白。
克拉伯病还被称为球形细胞脑白质营养不良或半乳糖基神经酰胺脂沉积病。它是一种罕见且常常致命的退行性常染色体隐性病症，影响神经系统的髓鞘。它在100,000新生儿中出现约1例。作为较高的流行性，已经报道在以色列的一些阿拉伯区域约为1/6,000。
克拉伯病由引起半乳糖苷神经酰胺酶缺乏的GALC基因的突变引起。脂质累积影响神经保护性髓鞘(隔离许多神经的表层)的生长，并引起运动技能的严重退化。
患有克拉伯病的婴儿在出生时是正常的。症状开始于3-6月龄，表现为易怒、发烧、四肢僵硬、癫痫发作、喂食困难、呕吐和智力和运动开发缓慢。在疾病初期，医生常常会将所述症状误认为是大脑性麻痹的症状。其它症状包括肌无力、痉挛、耳聋、视神经萎缩和失明、瘫痪和吞咽时困难。还可能发生长期减重。也有青少年和成年发作的克拉伯病例，其具有相似的症状但发展较慢。在婴儿中，该疾病通常在2岁前致死。晚发性克拉伯病的患者疾病发展较慢，且存活时间显著较长。
虽然还没有治愈克拉伯病的方法，但已经显示在疾病早期进行骨髓移植是有益的。通常，对于该病症的治疗是对症和支持性治疗。物理治疗可能有助于维持或提高肌肉张力和循环。根据最近的研究报道，只要在明显症状出现之前给予脐带血移植就可成功地终止该疾病。
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节β-半乳糖苷神经酰胺酶的酶活性治疗克拉伯病的方法。
法布里病
法布里病是由α-半乳糖苷酶A缺陷引起的。α-半乳糖苷酶A负责将红细胞三糖基神经酰胺转化成乳糖基神经酰胺；因此该缺陷导致红细胞三糖基神经酰胺(也简称为Gb3、GL-3或神经酰胺三己糖苷)的集聚。α-半乳糖苷酶A的活性由BMP刺激并依赖于鞘脂激活蛋白。
法布里病也被称为Anderson-Fabry病、弥漫性躯体血管角皮瘤、Ruiter-Pompen-Wyers综合征、神经酰胺三己糖苷沉积病和Sweeley-Klionsky病。它是X-连锁隐性(遗传性)病，影响半合子男性以及杂合和纯合女性；男性具有经历最严重的临床症状的趋势，而女性则不同，其可以从临床上没有症状至与男性一样严重。这种变化被认为是由于在女性胚胎发育过程中的X-失活模式。
症状包括缺汗症(缺汗)、疲劳、血管角质瘤(毛细管的良性皮肤损伤)、烧伤极度疼痛和眼睛病变。血管角质瘤是出现于身体任何区域但主要位于大腿、臀部、下腹部和腹股沟的小的无痛丘疹。表面的眼睛病变可能存在，表明角膜涡状营养不良(也被称为涡状角膜病)。角膜病可能是无症状携带者出现的特征，且一定与涡状角膜病的其它原因(例如角膜内的药物沉积)不同。其它可见的眼睛表现包括结膜动脉瘤、较晚期的车辐状白内障、视神经乳头水肿、黄斑水肿、视神经萎缩和视网膜血管膨胀。肾并发症是该疾病的常见严重结果；肾功能不全和肾功能衰竭可能在生命过程中加重。蛋白尿常常是肾脏病变的第一个症状。还可能发生心脏并发症；与心脏血管的影响随年龄恶化，且可能导致心脏病风险的增加。对脑血管的影响导致中风风险的增加。其它症状包括耳鸣、眩晕、反胃和腹泻。
症状通常首次出现于儿童期早期，并且可能非常难以理解；法布里病对许多临床医生的罕见性有时可导致误诊或被忽视。该疾病的表现的数量和严重程度常常随个体年龄而增加。
直至最近，对法布里病的治疗是对症治疗。然而，目前利用α半乳糖苷酶(Agalsidase alpha)(利甫盖素(Replagal))和β半乳糖苷酶(Agalsidase beta)(法布瑞酶(Fabrazyme))通过酶替代疗法(ERT)在细胞水平上治疗该疾病。这些药物的费用是个难题(每年每位患者大约250,000美元)，从而对许多国家的许多患者造成了障碍。酶替代疗法(通常每两周进行输注)可以在患者家中由患者自身实施。酶替代疗法不是治愈，并且其必须经常输注以获得最大效果。
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节α-半乳糖苷酶A的酶活性治疗法布里病的方法。
戈谢病
戈谢病由葡糖神经酰胺酶(也被称为葡糖脑苷脂酶和酸性β-葡糖苷酶)缺陷引起，葡糖神经酰胺酶是55.6KD、497个氨基酸长度的蛋白。葡糖神经酰胺酶负责糖基神经酰胺(或葡糖脑苷脂)转化为神经酰胺；因此该缺陷导致糖基神经酰胺的集聚。葡糖神经酰胺酶的活性由BMP刺激并依赖于鞘脂激活蛋白。
戈谢病是最常见的溶酶体贮积病。脂肪物质可集中于脾、肝、肾、肺、脑和骨髓中。症状可包括脾和肝增大、肝功能不全、骨骼病症和可能疼痛的骨损伤、严重的神经学并发症、淋巴结和(偶而的)临近关节的肿胀、腹部膨胀、皮肤成褐色、贫血、血小板低和巩膜上堆积黄色脂肪。所受影响最严重的人还可能更易于感染。
该疾病显示常染色体隐性遗传性，因此同时影响男性和女性。葡糖神经酰胺酶的不同突变决定剩余的酶活性并且很大程度上决定表型。研究表明，特定葡糖神经酰胺酶突变的杂合体患帕金森病和某些恶性病(非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤和胰腺癌)的风险提高。
糖基神经酰胺是红细胞和白细胞的细胞膜组分。清理这些细胞的巨噬细胞不能够除去废产物，这些废产物集聚在原纤维内，并进入戈谢细胞，其在光学显微镜下看起来像起皱的纸。
戈谢病有三种常见的临床亚型。每种类型都与特定的突变相关联。整体上有约80种已知突变。
●I型(或非神经类型)是该疾病的最常见形式，在50,000新生儿中发生大约1例。I型最常发生在德裔犹太人家系的人中，其发生率是普通人群的100倍。症状可开始于生命早期或者成人期，并且包括肝增大和脾增大很多(同时肝脾增大)；脾可能破裂并引起额外的并发症。可能广泛出现骨骼无力和骨病。脾增大和骨髓替代引起贫血、血小板减少和白细胞减少。脑不受影响，但可能具有肺损伤和罕见的肾损伤。该组患者通常容易擦伤(由于血小板水平低)并且由于红细胞数量少而感到疲劳。根据疾病发作和严重程度，I型患者可以很好地活到成人期。一些患者具有轻度形式的所述疾病，或者可能不显示任何症状。
●II型(或者急性婴儿神经病性戈谢病)通常开始于出生6个月内，且发生率为每100,000新生儿中约有1例。症状包括肝和脾增大、广泛且发展的脑损伤、眼动病症、痉挛、癫痫发作、四肢僵硬、吮吸和吞咽能力差。受影响的儿童通常在2岁死亡。
●III型(慢性神经病形式)可开始于儿童期的任何时间或者甚至在成人期，并且在100,000新生儿中约发生1例。它的特征是发展缓慢但与急性类型或II型相比神经学症状较轻。主要症状包括脾和/或肝增大、癫痫发作、协调性差、骨骼不规则、眼动病症、包括贫血在内的血液病症和呼吸问题。患者通常活到十几岁的早期和成人期。
国家戈谢病基金会称在普通美国人群中每100人中约有1人是I型戈谢病(流行度为1/40,000)携带者；在德裔犹太人中，携带者的比例相当高，约为1/15。显示II型戈谢病对任何种族都没有特定偏好。III型戈谢病在瑞典北部北博滕人群中尤其常见，其在该地区的发病率为1/50,000。
对于I型患者和多数III型患者，用静脉内重组葡糖神经酰胺酶的酶替代治疗可降低肝和脾的大小，减少骨骼异常并逆转其它表现。该疾病的罕见性意味着一直难以进行用于决定剂量的研究，因此对于最佳剂量和给药频率一直存在争议。由于发病率低，重组葡糖神经酰胺酶在许多国家已经变成唯一的药物。单个患者用于目前存在的戈谢病的治疗剂Cerezyme
Figure BPA00001311158300461
(注射用伊米苷酶(imiglucerase))的花费高达550,000美元，且这种治疗需要持续终生。美格鲁特(Miglustat)是在2003年批准用于该疾病的另一种药物。
成功的骨髓移植治愈了该疾病的非神经学表现，原因是其引入了具有活性葡糖神经酰胺酶的单核细胞群。然而，该过程具有巨大的风险，且在戈谢患者中进行的极少。在罕见情况下，如果患者贫血或者当器官增大影响到患者的舒适度，则可能需要除去脾的手术(脾切除术)。输血可能对一些贫血患者有益。其它患者可能需要关节置换术，以改善活动性和生活质量。其它治疗选择包括用于感染的抗生素，用于癫痫的抗癫痫药，用于骨损伤的二磷脂和肝脏移植。
可以证明底物减少疗法(substrate reduction therapy)可有效阻止II型，原因是其可以穿过血脑屏障进入脑中。目前还没有用于可能发生在II型和III型戈谢病患者中的严重脑损伤的有效治疗。
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节葡糖神经酰胺酶的酶活性治疗戈谢病的方法。
唾液酸贮积病
唾液酸贮积病或I型粘脂贮积病(ML I)由唾液酸酶(或α-神经氨酸酶)的缺陷引起。唾液酸酶负责将GM3转化为乳糖基神经酰胺；因此该缺陷导致GM3的集聚。唾液酸酶的活性由BMP刺激并依赖于鞘脂激活蛋白。
唾液酸贮积病以常染色体隐性方式遗传。症状或者在出生时出现或者在生命的第一年内形成。在许多累的婴儿中，注意到在出生时全身过度肿胀。这些婴儿通常天生具有粗糙的面部特征，如平鼻梁、眼睑肿胀、齿龈增大且舌头尺寸过大(巨舌)。一些婴儿还天生具有骨骼畸形，例如胯关节脱位。婴儿通常显示出突然不自觉的肌肉收缩(所谓的肌阵挛)，并且眼睛中具有红点(樱桃红的斑点)。所述婴儿常常不能调整主动动作(所谓的共济失调)，还发生颤动、视力削弱和癫痫发作。检查发现肝(肝肿大)和脾异常增大(脾肿大)且腹部极端肿胀。所述婴儿通常缺乏肌张力(张力减退)且智力延迟(或者在最初或者日益严重)。一些患者不能茁壮成长且患有周期性呼吸道感染。患有ML I的多数婴儿在1岁前死亡。
可以根据症状开始的年龄和症状出现的类型将唾液酸贮积病分成亚类。该疾病的影响可以从轻微到严重。
唾液酸贮积病是没有种族偏好的罕见病症。可获得的人群数据非常少，但据荷兰的研究报道，发生率为在2,175,000新生儿中约有1例。然而，这种比例可能并不适用于所有人群，一些人群可能具有更高的发病率；此外，当没有新生儿筛查的选项时，错误的临床识别是一个重要因素。
针对唾液酸贮积病的治疗选择有限，且主要涉及支持性护理和症状缓解。
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节唾液酸酶的活性治疗唾液酸贮积病的方法。
异染性脑白质营养不良
异染性脑白质营养不良(MLD)或芳基硫酸酯酶A缺陷症由芳基硫酸酯酶A(或脑苷脂硫酸酶)的缺陷引起。芳基硫酸酯酶A负责将硫脑苷脂(或者脑苷脂3-硫酸)转化为半乳糖基神经酰胺；因此该缺陷导致硫脑苷脂的集聚。芳基硫酸酯酶A的活性由BMP刺激并依赖于鞘脂激活蛋白。
异染性脑白质营养不良是溶酶体贮积病，常列在脑白质营养不良家族中。脑白质营养不良影响髓鞘质(作为整个中枢和外周神经系统的神经纤维周围的隔离物的脂肪表层)脂肪生长和/或发育。
与影响脂质代谢的其它一些遗传病症相同，MLD有晚婴儿期、青少年期和成年期几种形式，
●在晚婴儿期形式(最常见形式的MLD)中，受影响的婴儿在1岁后开始行走困难。症状包括肌肉消瘦和无力，肌肉僵硬，发育延迟，逐渐丧失视力导致失明，抽搐、吞咽受损，麻痹和痴呆。儿童可能变得昏睡。未治疗时，患有这种形式的MLD的多数儿童在5岁死亡，且常常死亡早的多。
●患有青少年期形式的MLD(在3-10岁发作)的儿童通常开始于学校表现削弱、智力退化和痴呆，然后出现类似于晚婴儿期形式但发作较慢的症状。死亡年龄不同，但通常在症状发作的10-15年内。
●成年期形式通常在16岁后开始精神病或逐步的痴呆。成人期发作的MLD的发展比晚婴儿期和青少年期形式慢的多，拖延时间为10年或更长。
在罕见的情况下，机体能够弥补所述缺陷，人将不出现症状。
对于MLD没有治愈也没有标准的治疗，MLD是终期疾病。对具有晚期青少年发作或成年发作的儿童和显示症状的晚婴儿期患者的治疗限于处理疼痛和症状。前驱症状性晚婴儿期MLD患者和患有青少年期或成年期MLD(或者为前驱症状或者显示温和至中等症状)的患者可选择正在研究中的骨髓移植(包括干细胞移植)。
在一个实施方式中，本发明涉及通过调节芳基硫酸酯酶A的酶活性治疗异染性脑白质营养不良的方法。
鞘脂激活蛋白缺乏症
在人和小鼠中，鞘脂激活蛋白原/鞘脂激活蛋白缺乏症导致严重的神经学缺陷。
在鞘脂激活蛋白A、B和C中具有点突变的人患者显示克拉伯病、异染性脑白质营养不良和戈谢病的表型，这表明其在体内的主要底物分别是半乳糖基神经酰胺、硫脑苷脂和葡糖神经酰胺。
由于鞘脂激活蛋白A缺乏的非典型克拉伯病：一种遗传性生化病症，在出生数月导致神经衰退。死亡通常发生在生命的最初几年。该病症与克拉伯病类似，但区别在于生化缺陷的遗传起源不同。克拉伯病与半乳糖脑苷脂酶基因的缺陷有关，而非典型克拉伯病与引起鞘脂激活蛋白A缺乏的鞘脂激活蛋白原基因的缺陷有关。
鞘脂激活蛋白B(之前被称为SAP-1和硫脑苷脂激活蛋白)分别刺激芳基硫酸酯酶A、酸性β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶对包括硫酸脑苷脂、GM1神经节苷脂和红细胞三糖基神经酰胺在内的多种底物的水解。人鞘脂激活蛋白B缺乏症(作为常染色体隐性性质遗传)导致硫酸脑苷脂在组织中集聚和类似于异染性脑白质病变的临床图像(缺乏激活蛋白的异染性脑白质营养不良)，不过具有正常的芳基硫酸酯酶活性。鞘脂激活蛋白B缺乏症是与异染性脑白质营养不良中的谱(spectrum)类似的异质性疾病(heterogeneous disease)。
葡糖神经酰胺的降解需要鞘脂激活蛋白(SAP-)C，并且鞘脂激活蛋白(SAP-)C的缺乏导致戈谢病的一种变式：由于缺乏SAP-C的无神经病变的戈谢病。在患者中观察到非常高水平的壳三糖苷酶活性和趋化因子CCL18，以及血浆中葡糖神经酰胺的浓度增高，而皮肤成纤维细胞中β-葡糖苷酶活性正常。已经鉴定出位于SAP-C结构域的错义突变p.L349P和位于鞘脂激活蛋白原前体蛋白的起始编码中的另一个突变p.M1L。
在一些无神经病变的戈谢患者中，已经鉴定出了在鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D两者中的突变。
小鼠中鞘脂激活蛋白C和D的联合缺陷导致神经病变的表型以及葡糖神经酰胺和α-羟基神经酰胺的集聚。
在小鼠中，鞘脂激活蛋白D与神经酰胺集聚、浦肯野细胞(Purkinje cell)的部分丧失和泌尿系统功能受损相关联。这种表型没有模仿完全缺失酸性神经酰胺酶(鞘脂激活蛋白D的同源酶(cognate enzyme))的小鼠所表现的胚胎致死性。
在人中已知两种引起所有四种鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白原完全失活的突变。总鞘脂激活蛋白缺乏是多个器官和多个鞘脂病变的破坏性疾病。已经在出现引起新生儿死亡的严重性脑脊髓交感神经系统营养不良(neurovisceral dystrophy)病例中报道了鞘脂激活蛋白联合缺乏(或鞘脂激活蛋白原缺乏)。尿中的多种鞘脂均提高，红细胞三糖基神经酰胺显示最大增加。在PSAP基因中鉴定出了新突变，是纯合性外显子10上游的2个碱基的剪接受体位点突变。这种突变导致早熟终止密码并产生低水平转录。
在一个实施方式中，本发明涉及治疗鞘脂激活蛋白缺乏症的方法。所述鞘脂激活蛋白缺乏症可选自鞘脂激活蛋白A缺乏症、鞘脂激活蛋白B缺乏症、鞘脂激活蛋白C缺乏症、鞘脂激活蛋白C缺乏症和鞘脂激活蛋白联合缺乏症(或者鞘脂激活蛋白原缺乏症)。
残留酶促活性
如上文所列出的，溶酶体贮积病由缺陷性酶引起。所述缺陷性酶可以没有残留活性，或者可以具有一些残留活性。
本文使用的残留酶促活性表示，虽然所述酶是缺陷性的，例如由突变引起，但该酶的活性并没有完全失去，但是被降低至病理水平。
在一个方面，本发明涉及用于治疗溶酶体贮积病的生物活性剂，和用于治疗患溶酶体贮积病的个体的方法。
在本发明的实施方式中，根据本发明治疗的溶酶体贮积病的特征在于所述疾病病理涉及的缺陷性酶具有残留酶促活性。
在一个实施方式中，所述残留酶促活性为0.1％-50％，如0.1-1％，例如1-2％，如2-3％，例如3-4％，如4-5％，例如5-6％，如6-7％，例如7-8％，如8-9％，例如9-10％，如10-11％，例如11-12％，如12-13％，例如13-14％，如14-15％，例如15-20％，如20-25％，例如25-30％，如30-35％，例如35-40％，如40-45％，例如45-50％的残留酶促活性。
LSD的当前治疗形式
针对溶酶体贮积病没有治愈，治疗多为症状性的，不过已经尝试了骨髓移植和酶替代疗法(ERT)并且取得一些成功。此外，在专科中心正在进行母系脐带血移植用于这些疾病中的一些。然而，移植疗法伴随有多种副作用，且常常使患者产生并发症。此外，底物减少疗法(用于减少贮积物质的集聚的方法)目前正在用于评价这些疾病中的一些。
对于多数溶酶体贮积病，未满足的主要需求仍然是提供有效的治疗形式。
已经针对一些溶酶体贮积病开发出了酶替代疗法，用于治疗戈谢病的Cerezyme
Figure BPA00001311158300501
已经上市多年。通过重组技术制备缺陷性酶葡糖脑苷脂酶，并通过静脉输注数小时施予。治疗不是治愈性的，且患者需要终生治疗以阻止疾病的发展。通过ERT可改善一些症状。
然而，对于多数LSD，还没有开发出有效地ERT。这可能是因为缺陷性酶的复杂亚基结构使活性酶的生产被证明是一个难题。确实，酶在生成后可能错误折叠。
对于可利用ERT的那些LSD，存在使该治疗形式较不理想的缺点。首先且最重要地，ERT是非常昂贵的治疗形式，其对社会造成经济负担且使许多患者难以接近。此外，ERT仅特异地针对一种疾病。已经报道了Cerezyme
Figure BPA00001311158300502
的一些副作用，包括免疫反应的形成、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、皮疹、疲劳、头疼、发烧、头晕眼花、寒战、背疼和心率快速以及过敏性反应的提示性症状。
因此，本发明公开的内容提供了用于治疗溶酶体贮积病的创新性新方法。这尤其与还没有开发出有效疗法的这些疾病、可能受益于较低廉的治疗的那些疾病以及可能受益于包含本发明的生物活性剂的组合疗法的那些疾病有关。
如本文所公开的，本发明的方法提供了显著比ERT廉价且针对多于一种具体溶酶体贮积症的治疗形式。
下文对分子伴侣或热休克蛋白进行介绍，原因是根据本发明，本发明人发现本文所介绍的热休克蛋白70和溶酶体BMP之间的相互作用形成调节溶酶体酶促活性和治疗溶酶体贮积病的基础。
分子伴侣
细胞在开始转录以及之后翻译DNA遗传密码时消耗大量能量，最终产生具有细胞生命的这个点所需要的功能的多肽。然而，为了获得完整功能的蛋白，必须克服最后的许多障碍，其中之一是该新生多肽链的正确折叠。获得正确折叠的进化意义是明显的，合成没有正确构象并由此没有功能的肽不仅是一种可怕的能量浪费，而且此类蛋白在细胞腔室中的聚合可能证明对细胞是有害的。考虑到高蛋白浓度的细胞内环境，这种聚合事实上是一种完全可能的结果，由此蛋白产生了复杂且完善的机器帮助蛋白折叠以使蛋白在此条件下维持功能状态并不意外。这些蛋白被统称为分子伴侣，因为象其人类对应物一样，它们防止其不成熟客户之间的不利相互作用。分子伴侣发现于蛋白发生构象重排的所有细胞区室中，虽然蛋白合成是细胞内未折叠肽的主要来源，但当细胞面临高温或可能使蛋白结构变化由此易于未折叠和聚合的其它刺激物时，利用包括产生保护性蛋白的特定细胞应答应对。这种应答是在从原核细胞至真核细胞的各种细胞类型中观察到的现象，被称为热休克反应或应激反应。由这种应答诱导的蛋白被称为热休克蛋白(HSP)，其具有几个家族。这些家族由在序列上、结构上和功能上相关的蛋白组成，然而不同家族的伴侣分子可在结构和细胞功能上明显不同。伴侣分子家族的主要实例是Hsp70蛋白，其构成了真核细胞的多数区室中、真细菌中和许多古细菌(archae)中存在的普遍性伴侣系统的核心部分。除了作为伴侣分子外，最近发现该家族参与细胞稳态的其它方面，最明显地通过其抗凋亡性质、其免疫性功能和癌细胞对Hsp70上调的明显依赖性。
热休克蛋白70家族
Hsp70蛋白参与包括蛋白折叠和不稳定细胞蛋白的降解在内的多种细胞过程，并且还发挥其它细胞保护性作用。Hsp70在这些过程中的共同作用似乎是与部分折叠的多肽的短疏水部分结合，由此促进准确折叠并防止聚合。在真核细胞中，Hsp70伴侣分子在体内与调节其功能循环的主要步骤的不同类蛋白相互作用；在这些蛋白中有J-结构域家族蛋白Hsp40。此外，已经鉴定出了额外的结伴蛋白，其中一些将Hsp70连接至诸如Hsp90系统的其它伴侣分子系统。
人Hsp70家族的成员
分子伴侣的一些重要功能包括蛋白至细胞区室的输送、在胞质溶胶、内质网和线粒体中的蛋白折叠、防止蛋白聚合以及错误折叠蛋白的重折叠。目前，人Hsp70家族包括由不同基因编码的10个成员，该部分旨在提供这些家族成员在功能、表达谱和同源性方面的概述。虽然Tavaria et al.已经制定了一套通用的规则，该规则提供了基因座名称、基因和蛋白之间的逻辑联系，但关于不同人Hsp70家族成员的命名仍存在许多混淆。然而，由于种类间仍然存在一些混淆，在本文中提供其基因座的名称表示Hsp70基因和蛋白。名称Hsp70可以表示基因座名称为HSPA1A和HSPA1B的两种诱导型Hsp70家族成员，或者如本文本的通用性所显示的整体表示整个Hsp70家族。然而，如本发明全文所使用的，Hsp70意在表示基因座名称为HSPA1A和HSPA1B的两种诱导型Hsp70家族成员的任一个。
HspA1A和HspA1B
由基因座HSPA1A和HSPA1B转录的基因是两个热/应激诱导Hsp70基因，涉及人Hsp70的多数文献都指的是由这两个基因编码的蛋白。所述基因产生由641个氨基酸构成，彼此具有99％的同源性且是首个被克隆和表征的人Hsp70家族成员的蛋白。这些基因在6p21.3被联锁在MHC III类复合体中、无内含子且启动子区域包含HSE，使其能够与HSF结合，并在多种细胞攻击的应答中诱导转录。
人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)的蛋白质序列是(SEQ ID NO：1)(登录号：NM_005345.5)：
MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDA
KRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPV
TNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTI
DDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLE
IDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNG
RDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIF
TTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKAN
KITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKK
VLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEV
D
人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)的核酸(DNA)序列是(SEQ ID NO：2)(登录号：NM_005345.5)：
1 ataaaagccc aggggcaagc ggtccggata acggctagcc tgaggagctg ctgcgacagt
61 ccactacctt tttcgagagt gactcccgtt gtcccaaggc ttcccagagc gaacctgtgc
121 ggctgcaggc accggcgcgt cgagtttccg gcgtccggaa ggaccgagct cttctcgcgg
181 atccagtgtt ccgtttccag cccccaatct cagagcggag ccgacagaga gcagggaacc
241 ggcatggcca aagccgcggc gatcggcatc gacctgggca ccacctactc ctgcgtgggg
301 gtgttccaac acggcaaggt ggagatcatc gccaacgacc agggcaaccg caccaccccc
361 agctacgtgg ccttcacgga caccgagcgg ctcatcgggg atgcggccaa gaaccaggtg
421 gcgctgaacc cgcagaacac cgtgtttgac gcgaagcggc tgattggccg caagttcggc
481 gacccggtgg tgcagtcgga catgaagcac tggcctttcc aggtgatcaa cgacggagac
541 aagcccaagg tgcaggtgag ctacaagggg gagaccaagg cattctaccc cgaggagatc
601 tcgtccatgg tgctgaccaa gatgaaggag atcgccgagg cgtacctggg ctacccggtg
661 accaacgcgg tgatcaccgt gccggcctac ttcaacgact cgcagcgcca ggccaccaag
721 gatgcgggtg tgatcgcggg gctcaacgtg ctgcggatca tcaacgagcc cacggccgcc
781 gccatcgcct acggcctgga cagaacgggc aagggggagc gcaacgtgct catctttgac
841 ctgggcgggg gcaccttcga cgtgtccatc ctgacgatcg acgacggcat cttcgaggtg
901 aaggccacgg ccggggacac ccacctgggt ggggaggact ttgacaacag gctggtgaac
961 cacttcgtgg aggagttcaa gagaaaacac aagaaggaca tcagccagaa caagcgagcc
1021 gtgaggcggc tgcgcaccgc ctgcgagagg gccaagagga ccctgtcgtc cagcacccag
1081 gccagcctgg agatcgactc cctgtttgag ggcatcgact tctacacgtc catcaccagg
1141 gcgaggttcg aggagctgtg ctccgacctg ttccgaagca ccctggagcc cgtggagaag
1201 gctctgcgcg acgccaagct ggacaaggcc cagattcacg acctggtcct ggtcgggggc
1261 tccacccgca tccccaaggt gcagaagctg ctgcaggact tcttcaacgg gcgcgacctg
1321 aacaagagca tcaaccccga cgaggctgtg gcctacgggg cggcggtgca ggcggccatc
1381 ctgatggggg acaagtccga gaacgtgcag gacctgctgc tgctggacgt ggctcccctg
1441 tcgctggggc tggagacggc cggaggcgtg atgactgccc tgatcaagcg caactccacc
1501 atccccacca agcagacgca gatcttcacc acctactccg acaaccaacc cggggtgctg
1561 atccaggtgt acgagggcga gagggccatg acgaaagaca acaatctgtt ggggcgcttc
1621 gagctgagcg gcatccctcc ggcccccagg ggcgtgcccc agatcgaggt gaccttcgac
1681 atcgatgcca acggcatcct gaacgtcacg gccacggaca agagcaccgg caaggccaac
1741 aagatcacca tcaccaacga caagggccgc ctgagcaagg aggagatcga gcgcatggtg
1801 caggaggcgg agaagtacaa agcggaggac gaggtgcagc gcgagagggt gtcagccaag
1861 aacgccctgg agtcctacgc cttcaacatg aagagcgccg tggaggatga ggggctcaag
1921 ggcaagatca gcgaggcgga caagaagaag gtgctggaca agtgtcaaga ggtcatctcg
1981 tggctggacg ccaacacctt ggccgagaag gacgagtttg agcacaagag gaaggagctg
2041 gagcaggtgt gtaaccccat catcagcgga ctgtaccagg gtgccggtgg tcccgggcct
2101 gggggcttcg gggctcaggg tcccaaggga gggtctgggt caggccccac cattgaggag
2161 gtagattagg ggcctttcca agattgctgt ttttgttttg gagcttcaag actttgcatt
2221 tcctagtatt tctgtttgtc agttctcaat ttcctgtgtt tgcaatgttg aaattttttg
2281 gtgaagtact gaacttgctt tttttccggt ttctacatgc agagatgaat ttatactgcc
2341 atcttacgac tatttcttct ttttaataca cttaactcag gccatttttt aagttggtta
2401 cttcaaagta aataaacttt aaaattcaaa aaaaaaaaaa aaaaa
人热休克蛋白70kDa蛋白1B(HSPA1B)的蛋白序列是(SEQ ID NO：3)(登录号：NM_005346)：
MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDA
KRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPV
TNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTI
DDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLE
IDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNG
RDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIF
TTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKAN
KITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKK
VLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEV
D
人热休克蛋白70kDa蛋白1B(HSPA1B)的核酸(DNA)序列是(SEQ ID NO：4)(登录号：NM_005346)：
1 ggaaaacggc cagcctgagg agctgctgcg agggtccgct tcgtctttcg agagtgactc
61 ccgcggtccc aaggctttcc agagcgaacc tgtgcggctg caggcaccgg cgtgttgagt
121 ttccggcgtt ccgaaggact gagctcttgt cgcggatccc gtccgccgtt tccagccccc
181 agtctcagag cggagcccac agagcagggc accggcatgg ccaaagccgc ggcgatcggc
241 atcgacctgg gcaccaccta ctcctgcgtg ggggtgttcc aacacggcaa ggtggagatc
301 atcgccaacg accagggcaa ccgcaccacc cccagctacg tggccttcac ggacaccgag
361 cggctcatcg gggatgcggc caagaaccag gtggcgctga acccgcagaa caccgtgttt
421 gacgcgaagc ggctgatcgg ccgcaagttc ggcgacccgg tggtgcagtc ggacatgaag
481 cactggcctt tccaggtgat caacgacgga gacaagccca aggtgcaggt gagctacaag
541 ggggagacca aggcattcta ccccgaggag atctcgtcca tggtgctgac caagatgaag
601 gagatcgccg aggcgtacct gggctacccg gtgaccaacg cggtgatcac cgtgccggcc
661 tacttcaacg actcgcagcg ccaggccacc aaggatgcgg gtgtgatcgc ggggctcaac
721 gtgctgcgga tcatcaacga gcccacggcc gccgccatcg cctacggcct ggacagaacg
781 ggcaaggggg agcgcaacgt gctcatcttt gacctgggcg ggggcacctt cgacgtgtcc
841 atcctgacga tcgacgacgg catcttcgag gtgaaggcca cggccgggga cacccacctg
901 ggtggggagg actttgacaa caggctggtg aaccacttcg tggaggagtt caagagaaaa
961 cacaagaagg acatcagcca gaacaagcga gccgtgaggc ggctgcgcac cgcctgcgag
1021 agggccaaga ggaccctgtc gtccagcacc caggccagcc tggagatcga ctccctgttt
1081 gagggcatcg acttctacac gtccatcacc agggcgaggt tcgaggagct gtgctccgac
1141 ctgttccgaa gcaccctgga gcccgtggag aaggctctgc gcgacgccaa gctggacaag
1201 gcccagattc acgacctggt cctggtcggg ggctccaccc gcatccccaa ggtgcagaag
1261 ctgctgcagg acttcttcaa cgggcgcgac ctgaacaaga gcatcaaccc cgacgaggct
1321 gtggcctacg gggcggcggt gcaggcggcc atcctgatgg gggacaagtc cgagaacgtg
1381 caggacctgc tgctgctgga cgtggctccc ctgtcgctgg ggctggagac ggccggaggc
1441 gtgatgactg ccctgatcaa gcgcaactcc accatcccca ccaagcagac gcagatcttc
1501 accacctact ccgacaacca acccggggtg ctgatccagg tgtacgaggg cgagagggcc
1561 atgacgaaag acaacaatct gttggggcgc ttcgagctga gcggcatccc tccggccccc
1621 aggggcgtgc cccagatcga ggtgaccttc gacatcgatg ccaacggcat cctgaacgtc
1681 acggccacgg acaagagcac cggcaaggcc aacaagatca ccatcaccaa cgacaagggc
1741 cgcctgagca aggaggagat cgagcgcatg gtgcaggagg cggagaagta caaagcggag
1801 gacgaggtgc agcgcgagag ggtgtcagcc aagaacgccc tggagtccta cgccttcaac
1861 atgaagagcg ccgtggagga tgaggggctc aagggcaaga tcagcgaggc ggacaagaag
1921 aaggttctgg acaagtgtca agaggtcatc tcgtggctgg acgccaacac cttggccgag
1981 aaggacgagt ttgagcacaa gaggaaggag ctggagcagg tgtgtaaccc catcatcagc
2041 ggactgtacc agggtgccgg tggtcccggg cctggcggct tcggggctca gggtcccaag
2101 ggagggtctg ggtcaggccc taccattgag gaggtggatt aggggccttt gttctttagt
2161 atgtttgtct ttgaggtgga ctgttgggac tcaaggactt tgctgctgtt ttcctatgtc
2221 atttctgctt cagctctttg ctgcttcact tctttgtaaa gttgtaacct gatggtaatt
2281 agctggcttc attatttttg tagtacaacc gatatgttca ttagaattct ttgcatttaa
2341 tgttgatact gtaagggtgt ttcgttccct ttaaatgaat caacactgcc accttctgta
2401 cgagtttgtt tgtttttttt tttttttttt ttttttgctt ggcgaaaaca ctacaaaggc
2461 tgggaatgta tgtttttata atttgtttat ttaaatatga aaaataaaat gttaaacttt
2521 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
HspA1L和HspA2
由于雄性生殖细胞的强表达偏好而将这两种Hsp70家族成员称为“沙文基因(chauvinist gene)”。hspA1L基因是组成型表达的无内含子的Hsp70家族成员，位于第6号染色体上相同的MHC III类复合体中的HSPA1A基因座端粒端(telomeric)4kb。该基因在热休克前后均以少量表达，但具有有利于在小鼠、大鼠和人中的睾丸的表达图谱，其是与HspA1A具有90％同源性的641个氨基酸(aa)的蛋白质。hspA2基因首次分离自小鼠基因文库，后来显示在包括骨骼肌、卵巢、小肠、结肠、脑、胎盘和肾的多种人体组织中以低水平组成型表达，但在睾丸中高表达。该基因的表达(或者缺乏表达)与人的异常精子发生有关，hspA2(-/-)雄性小鼠是不育的。该基因位于第14号染色体上，产生与HspA1A具有84％同源性的639aa的蛋白，虽然由于两篇文献已经提出了不同的基因座位置14q24.1和14q22使得其准确位置仍在讨论中。
HspA6和HspA7
hspA6和hspA7基因是Hsp70家族的热诱导型成员，在小鼠中没有明显的对应物。这两个基因在启动子位置包含HSE，且无内含子。所述基因共同位于第1号染色体上，其核苷酸序列彼此具有94％的同源性。然而，由于hspA7基因具有单个核苷酸插入，从而在+1324产生早熟的终止密码，仅HspA6具有功能。HspA6蛋白的长度为643aa，且显示与HspA1A和HspA1B具有77％的同源性。
HspA5和HspA9
hspA5和hspA9基因是Hsp70家族的两个区室特异性成员。655aa的HspA5蛋白位于内质网(ER)中，并促进该区室内新合成蛋白的折叠和运输。该蛋白与HspA1A具有64％的同源性，其基因位于9q34。679aa的HspA9蛋白位于线粒体中，其在此帮助蛋白质在运输穿过线粒体膜后的折叠。HspA9位于5q31.1，蛋白与HspA1A具有52％的同源性。
HspA8
同源Hsp70成员(被称为Hsc70)由位于11q24的hspA8基因编码，产生与HspA1A具有86％同源性的646aa的蛋白，并且其在所有组织和细胞系中均组成型地表达。该蛋白在细胞内的功能与Hsp70类似，提供在正常条件下所需的伴侣，但还在披网格蛋白小泡的去包被中以及伴侣分子介导的自吞噬中发挥作用。
HspA3和HspA4
由于对HSPA3是否根本不存在还存在怀疑并且HSPA4最可能是Hsp110家族的成员但关于其目前还没有了解(除了其位于5q31.1-2的染色体位置外)，因此在本文中将不对这两者进行讨论。
表1：人Hsp70基因家族的列表。列出了这些基因的基因组座名称、本文使用的名称、染色体的定位(位置)、与HspA1A的氨基酸同源性以及文献中参见的可选名称。
Hsp70的转录调控
人Hsp70启动子的基因组印迹显示，热休克/应激诱导热休克转录因子(HSF)与被称为热休克元件(HSE)的包含nGAAn序列的区域迅速结合。正常情况下，Hsp70与残留在胞质中的HSF结合，但在应激过程中HSF从Hsp70分离并在被PKC或其它丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化后采取均三聚体构象(homotrimeric conformation)。HSF三聚体进入细胞核，在此其与位于Hsp70基因的启动子区域的HSE结合并进一步被HSF激酶磷酸化。
目前已经在人中表征了三种HSF(HSF1、HSF2和HSF4)。HSF1是在多数应激条件下均被激活的主要转录因子，并且对可被分类成生理(例如细胞分裂、激素刺激)、病理(例如感染、发烧、炎症、恶性病)和环境条件(例如热休克、重金属、乙醇)的多种刺激物产生应答。HSF2仅对氯高铁血红素产生应答，而HSF4优先在人心脏、胰腺、脑和骨骼肌中表达，缺乏在所有脊椎动物HSF中均有且似乎抑制HSP表达的C-末端疏水性重复。不清楚负责合成组成型表达的Hsp70(Hsc70)的Hsp70基因调控，但似乎HSF不并参与其中。
虽然HSF是调节HSP表达的最著名因子，但已知其它转录因子也具有同一功能。已经证明特异性CCAAT-盒结合因子(CBF)诱导Hsp70转录，肿瘤抑制因子p53可以通过与Hsp70的启动子区结合和通过中和CBF而抑制转录，并且HSF能够被热休克因子结合蛋白1(HSBP1)拮抗，其通过这种方式削弱Hsp70的转录。
Hsp70的结构和功能性质
通过真细菌Hsp70(DnaK)、其Hsp40辅伴侣(DnaJ)和核苷酸置换因子GrpE，最大程度了解Hsp系统的结构和功能。然而，虽然有证据提示GrpE的解偶联，但通常认为所述机制在真核生物中是类似的。本部分将集中于真核生物Hsp70系统，但在恰当时也将包括对真细菌系统的讨论。
Hsp70包括两个功能实体——N末端ATPase结构域和较小的C-末端肽结合结构域。ATPase结构域包含被裂隙(cleft)分开的两个亚结构域，其中，所述裂隙含有决定C-末端结构域的肽结合性质的核苷酸结合位点。当结合ATP时，肽底物迅速结合和解离(虽然亲合力低)，而在没有核苷酸或ADP结合至N-末端结构域的情况下，肽结合和解离的速率下降而亲合力提高。因此，ATP水解作为Hsp70的两种状态之间的分子开关，其在真核细胞中的循环受到J-结构域家族蛋白Hsp40的控制而在真细菌中则受DnaJ和GrpE的控制。Hsp40的N-末端J-结构域与Hsp70结合，加速ATP-水解，由此促进肽捕获，而Hsp40的C-末端部分通过识别疏水肽而作为伴侣分子发挥作用，由此将Hsp70募集至新生肽链。重要的是注意到，分子伴侣不提供用于结合蛋白的折叠的特定立体构象，但抑制非生产性的相互作用，由此使所述蛋白更高效地折叠成其新生结构。
在真细菌中，GrpE诱导从DnaK(细菌Hsp70)释放ADP，而对于真核细胞的Hsp70蛋白，这种因子似乎可有可无，原因是该ATPase循环中的限速步骤不是结合ADP的解离而是ATP水解本身。然而，在真核细胞中由额外的蛋白调节Hsp70的功能；均低聚蛋白Hip(Hsp70相互作用蛋白)通过稳定Hsp70的ADP结合态而作为正调节子，而Hsp-70结合蛋白(CHIP)和Bcl-2-相关抗凋亡蛋白-1(Bag-1)的蛋白羧基末端均具有抑制作用：CHIP通过抑制Hsp70的ATPase活性，Bag-1通过拮抗Hsp70的重折叠活性。进一步的相互作用由两种人Hsp40蛋白Hdj1和Hdj2提供，除了其Hsp40功能(如上所述)外，这两种蛋白还显示通过Hop(Hsp-组织蛋白)促进Hsp70和Hsp90的偶联，所述Hop是通过其分别与Hsp70和Hsp90的延长C-末端序列结合的两个三十四肽重复(TPR)结构域与伴侣分子物理连接的衔接蛋白。最近表明，上述一些蛋白调控非天然或不可逆错误折叠蛋白从伴侣分子至泛素-蛋白酶体机器的运输。除了其对Hsp70的负调节作用外，CHIP蛋白还能够通过N-末端TPR结构域与Hsp90结合并通过C-末端泛素激酶结构域靶向Hsp90底物降解，而且还能够在功能上与结合了Hsp70和蛋白酶体的BAG-1配合。这些发现提供了使伴侣分子帮助的折叠和蛋白水解降解(胞质中蛋白组质量控制的两个主要成分)一体化的机制间的可能关联。
通过Hsp70的细胞保护
除了其作为分子伴侣的结果的抗凋亡能力(即在使蛋白变性的条件下促进蛋白折叠)外，Hsp70还能够以多种其它方式影响细胞存活，包括保护在缺血再灌注损伤后线粒体的功能，阻断在用TNF刺激原代成纤维细胞后应激激酶c-jun N-末端激酶(JNK)的激活，并且已经提出Hsp70/Bag-1复合物在细胞应激条件过程中调节细胞生长和有丝分裂。Hsp70保护细胞免受由一些诸如TNF、TRAIL、氧化应激、UV-辐射和抗癌药多柔比星、依托泊苷和紫杉醇的刺激物诱导的细胞死亡的能力进一步凸显了其抗凋亡性质。最后，由于已经证明Hsp70拮抗凋亡诱导因子(AIF)，并在caspase-3下游发挥抗凋亡功能，报道还提供了Hsp70和凋亡机器之间的更直接的相互作用的证据。
最近的证据还证明，Hsp70的有效细胞保护作用部分是由于溶酶体膜的稳定化。作为对此的印证，Hsp70的缺失触发癌细胞中溶酶体膜的早通透化和组织蛋白酶介导的细胞死亡，外源Hsp70有效抑制由多种应激诱导的溶酶体去稳定。此外，Hsp70缺陷型小鼠患有由溶酶体蛋白酶至胞质中的泄漏引起的胰腺炎。所有这些事件强调了Hsp70作为PCD的重要调节物并由此作为细胞存活因子的作用。
癌症中的Hsp70
Hsp70通常在人恶性肿瘤在过量表达，并且其表达与乳腺癌和子宫内膜癌的预后差有关。因此，Hsp70增加了向免疫受损的动物或同基因动物灌输的啮齿动物细胞产生肿瘤的潜能。
Hsp70作为癌细胞存活的重要因子的作用进一步被Wei et al.(其首次在癌细胞中进行了Hsp70的缺失研究)的报道所证实。该结果表明，当通过使用反义低聚物抑制多种癌细胞系中Hsp70的表达时，诱导了对细胞增殖的抑制和随后的凋亡。该工作已经在多种试验中得到证实，在所述试验中，反义腺病毒介导的Hsp70缺失触发了肿瘤细胞特异性溶酶体死亡程序。
利用在免疫缺陷小鼠中的胶质母细胞瘤和乳腺癌原位异种移植以及结肠癌皮下异种移植的体内研究进一步证明了Hsp70缺失的抗癌潜能，因为接受上述腺病毒构建体的局部区域性施用的小鼠的肿瘤显示大量凋亡样细胞死亡和巨噬细胞的募集。这些研究清楚地证明了一些肿瘤对Hsp70的存在的依赖性，虽然其它研究辩称在腺病毒介导的Hsp70缺失后在细胞培养物中观察到的细胞毒性是由于病毒介导的细胞应激和Hsp70下调。尽管存在这种矛盾，但由于Bcl-2过表达和caspase的药物抑制均不能拯救细胞，所以由Hsp70缺失诱导的细胞培养物中的细胞毒性不依赖于caspase。相反，由于抑制半胱氨酸组织蛋白酶具有显著的细胞保护作用，因此LMP的触发和组织蛋白酶向胞质中的释放可能是死亡诱导事件。此外，Hsp70在之前提及的小鼠肿瘤异体移植物中的缺失导致组织蛋白酶释放和肿瘤细胞死亡。
如之前所述，许多癌细胞似乎都采用的Hsp70的细胞保护机制之一是Hsp70转位至内溶酶体区室，在此其发挥膜保护作用。由于研究已经证明大于50％的肿瘤显示Hsp70在质膜表面(通过前述的内吞作用和分泌事件与内溶酶体区室直接相连的区域)的定位，驱动这种转移的可能不仅仅是保护溶酶体膜的需要。表面暴露的Hsp70作为能够用作自然杀伤(NK)细胞的识别结构，刺激NK细胞增殖和溶细胞活性的独特表位。已经证明，由该Hsp70肽序列激活的NK细胞在患有严重的合并免疫缺陷症(SCID))的小鼠中抑制肿瘤生长，其可能机制可能是细胞表面结合的Hsp70通过不依赖于穿孔素(perforin)的颗粒溶解酶B(granzyme B)的特异结合和摄取介导凋亡。
如上文，内溶酶体膜和质膜经常相互交换。因此，癌细胞表面存在的Hsp70可能是促进肿瘤发展的两个事件的“不幸”结果；组织蛋白酶的分泌，其促进侵袭和血管生成，以及Hsp70在溶酶体膜上的定位，其防止半胱氨酸组织蛋白酶向细胞胶质的意外释放并保证细胞死亡。
细胞外的Hsp70
由前面的段落可以看出，Hsp70的细胞内功能对正确的细胞稳态至关重要，尤其是在面对毒性应激时。然而，细胞外Hsp70(eHsp70)的有益作用(尤其当提及免疫和炎症应答时)也在显示，其可能还在癌细胞的清除中发挥重要作用。此外，对于eHsp70，还显示参与对应激的一般生理适应和保护对抗细胞损伤的作用。
细胞外Hsp70和神经保护
关于eHsp70存在的首个证据来自对乌贼巨大神经索的研究，其中证明温度的提高诱导围绕轴索的神经胶质细胞鞘中并被转移至所述轴索的一些热休克蛋白。这些发现不久即在培养的大鼠胚胎细胞中重现，并且重要的是，关于这点，已经提供了负责Hsp70释放的非典型胞吐途径的证据，因为典型分泌途径的两个抑制剂莫能菌素或秋水仙碱均不能阻挡Hsp70的分泌。自这些出版物公开以来，其它报道也提供了在多种动物模型系统(例如青蛙、小龙虾和大鼠)中神经胶质释放Hsps和神经元摄取的实例。培养的人成胶质细胞瘤细胞的研究提供了在胶质细胞作为人体中eHsp70来源的作用的证据。该研究表明，在对照条件下，每一百万细胞在24小时的时间内向培养基释放～10pg Hsp70。当时间开始时采用20分钟热休克时，这种释放提高2.5-5倍。重要的是，该研究还证明，eHsp70的释放量大于细胞死亡可能占的量。这些数据都支持由Tytell et al.阐明的最先建议的假设，即Hsps的神经胶质释放可能是在代谢应激过程中维持神经元功能的一种途径。
eHsp70在急性应激过程中具有神经保护作用的体内证据来自于多个研究。Tidwell et al.的研究发现，当在轴索断裂后通过凝胶海绵应用eHsp70时，eHsp70能够减少轴索断裂后运动神经细胞的数量。在同一研究中，在施用Hsp70后还观察到背根神经节感觉神经元(dorsal root ganglion sensory neuron)细胞存活增加，虽然这依赖于比运动神经元稍高的Hsp70剂量。此外，还证明eHsp70保护运动神经元(否则在小鸡胚胎发育观察中注定死亡)，并且还保护在营养因子缺乏后从小鸡脊髓分离的运动神经元。当涉及视网膜的光损害时，也描述了eHsp70在体内的保护作用。在该研究中，Yu et al.在暴露于之前已经描述的剂量的诱导损伤的光以引起严重的光感受器变性后，玻璃体内注射重组Hsp70和Hsc70溶液。有趣的是，右眼的玻璃体室中存在的eHsp70混合物在视网膜中引起明显更多的光感受器。此外，对荧光标记的Hsc/Hsp70的摄取的评价证明，在施用后6小时，其仍然存在于视网膜中。通过鼻内治疗施用的细胞外Hsp70也显示防止大鼠内不可避免的应激的后果，并且最近指出，在肌萎缩性侧索硬化症小鼠模型中，腹膜内注射的重组人Hsp70可有效提高寿命、延迟症状发生、保持运动功能并延长运动神经元的存活。在神经元系统中利用Hsp70或Hsc/Hsp70混合物的其他体外工作进一步证明，eHsp70能够增强神经细胞应激耐受，并降低多聚谷氨酰胺(polyglutamine)的毒性和聚合。
细胞外Hsp70和免疫性
除了在细胞保护中的作用外，文献已经证明与质膜结合的eHsp70和游离的全身性eHsp70在免疫性中发挥作用。考虑到Hsp70的主要功能之一是作为细胞内蛋白的伴侣，Hsp70能够参与免疫原性肽的结合并通过主要组织相容性复合体(MHC)1类分子帮助这些肽的提呈可能并不惊奇。此外，还证明肿瘤来源的eHsp70作为免疫原性肽的伴侣并选择性地与抗原提呈细胞(APC)结合。在受体介导的内吞后，这些Hsp70-肽复合体被呈递至MHC 1类分子上，导致细胞毒性t细胞应答。除了作为自身抗原(self-antigen)的伴侣外，Hsp70还能够结合细菌DNA中的微生物肽和未甲基化的CpG基序。
除了其作为抗原提呈伴侣分子的作用外，eHsp70还参与先天免疫的刺激。在证明许多细胞类型释放Hsp70的同时，还证明eHsp70与包括天然自杀(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞在内的不同白细胞亚群上的多种受体结合。参与eHsp70识别的受体主要包括模式识别受体(PRR)并且由来自不同受体家族(例如toll样受体(TLR)、清道夫受体和C型凝聚素)的多种受体构成。受体结合后，eHsp70能够引起多种细胞因子应答，包括释放诸如TNF-a、IL-1b、IL-12、IL-6和GM-CSF的促炎症性细胞因子(由NF-kB向细胞核的转位触发的过程)，这提示eHsp70的细胞因子作用，其还形成使新创造的术语伴侣细胞因子(chaperokine)表示eHsp70，以更好地描述eHsp70同时作为伴侣和细胞因子的独特功能的提议。
eHsp70在免疫中的作用的体内研究的大部分已经在啮齿动物模型中进行。例如，在应答尾休克(tail-shock)中eHsp70浓度的提高与皮下大肠杆菌注射后炎症的降低和恢复时间的加快有关。此外，向小鼠体内递送Hsp70加快了伤口的愈合，这一特点可能是由于巨噬细胞对伤口死细胞的吞噬作用增强。
缺乏Hsp70在人体内的免疫调节作用的证据，但研究已经证明了eHsp70的增加和脑损伤的预后/结果的改善之间的关系(虽然也已经证明了相反的结论)。然而，还显示eHsp70的浓度随年龄而下降，这可能提示与年龄相关的进行全面应激反应减少的能力，这又可能解释了随着年龄增长发病率和死亡率增加，不过这还是纯的推测。
Hsp70的释放
除了证明eHsp70在邻近细胞之间(例如在神经胶质/轴索模型中)的转移的数据外，一些报道证明了循环中存在游离的eHsp70。对该区室中存在的Hsp70，必须从器官/细胞中释放出来。实现这种释放通常考虑两种主要方法。一个是主动方法，其中在外周循环中观察到的eHsp70是由于细胞裂解或死亡而使细胞中Hsp70库释放的结果。可选地，或可能另外地，Hsp70通过非典型胞吐途径被主动释放。
已经提出，Hsp70和其它热休克蛋白仅在引起坏死性死亡的病理条件下释放而不在程序性细胞死亡过程中释放。毫无疑问，引起坏死的严重性损伤和病理条件可导致Hsp70向血液中释放。这已经被文献充分证明并且也可从逻辑上推导。然而，最近的研究已经证明，可以通过主动机制从完整细胞释放Hsp70，并且刺激物的程度决定释放模式。Hsp70的非坏死性释放的有力证据还来自对锻炼诱导(exercise-induced)的eHsp70至外周血的释放的研究。取决于锻炼的模式(身体应变度(physical strain)越高，释放的越多)，在外周血中能够检测到较多的eHsp70释放，并且重要地，还没有已知研究报道过eHsp70和肌肉损伤标记物之间的直接相关性。eHsp70能够被释放而与细胞或组织损伤无关这一结论还被Fleshner及其同事极好地证明，他们证明诸如掠食性恐惧和电击的心里应激能够引发应激诱导的eHsp70释放，这被认为是一个依赖于儿茶酚胺信号传导的过程。
不过，Hsp70离开细胞的方式仍不清楚，尤其是因为Hsp70不含可能使其分泌的任何典型的肽引导序列。此外，由于典型分泌早就已经遭到质疑，这提示必定存在释放eHsp70的其它机制。已经证明eHsp70能够被释放至特征为外来体的小泡中，但还提出了在细胞体系和体内eHsp70可以作为游离eHsp70被释放的证据。已经提出eHsp70的释放需要脂质筏，不过这还处于争论中。此外，已经表明，功能溶酶体区室对于eHsp70的释放是必须的，并且该释放伴随有溶酶体标记物蛋白在细胞表面的出现，提示这是一个依赖于质膜和溶酶体膜融合的分泌。与所述释放是否通过外来体或者通过溶酶体的直接释放无关，有趣的是注意到一些类型的分泌性MVB/晚期内涵体/溶酶体区室明显与所有类型的释放有关。
由于儿茶酚胺通过α1-肾上腺素受体可导致细胞内钙流动，并且由于已经提出相同的钙流动引起外来体、多泡体和溶酶体的胞吐，目前的假设是在应激情况下，作用于α1-肾上腺素受体的去甲肾上腺素的增加导致细胞内的钙流动和随后Hsp70在外来体中的释放。
本发明的生物活性剂
在一个实施方式中，本发明涉及通过使用能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂的酶促活性调节，其中，所述酶与BMP相互作用。
本发明的酶促活性调节可以通过提供提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的以下类型的化合物和疗法之一而实现：
-Hsp70或其功能片段或变体
-Hsp70诱导物和辅诱导物
■小分子药物，例如氯吡哌醇(Bimoclomol)和Arimoclomol
■膜流化剂，例如苯甲醇
■亚致死热疗(sublethal heat therapy)(≤42℃)或过高热
■来自消炎药和抗肿瘤药类的某些药物
■细胞应激
■活性氧(ROS)
■肾上腺素，去甲肾上腺素
■UV光线
■放射治疗
因此，本发明的生物活性剂可以为提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的任何试剂、化学品或化合物；并且包括Hsp70本身、或其功能片段或变体，以及本领域技术人员已知的任何Hsp70诱导物或辅诱导物，由此，所述生物活性剂能够调节与BMP相互作用的酶的活性。
认为生物活性剂可以直接或间接提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70或其功能片段或变体。
在另一个实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70诱导物或辅诱导物。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂包含Hsp70或其功能片段或变体与Hsp70诱导物或辅诱导物的组合。
本发明一方面提供了能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用作药物。
本发明另一方面提供了能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用于溶酶体贮积症的治疗。
本发明另一方面提供了能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用作药物或用于溶酶体贮积症的治疗。
在一个实施方式中，所述治疗为预防、治愈或改善。在一个具体的实施方式中，所述治疗为预防。在另一个实施方式中，所述治疗是治愈。在再一个实施方式中，所述治疗为改善。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症。
在一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症是A型或B型尼曼-皮克病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为法伯氏病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为克拉伯病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为异染性脑白质营养不良。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为唾液酸贮积病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为法布里病。在再一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为戈谢病。在再一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为鞘脂激活蛋白缺乏症。
本发明的再一个方面提供了能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用于溶酶体贮积症的治疗，其中，所述溶酶体贮积症为选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症中的一种，如两种，例如三种，如四种，例如五种，如六种，例如七种病症。
认为本发明的生物活性剂可用于治疗选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症的溶酶体贮积症的亚组。
在一个具体的实施方式中，本发明的生物活性剂可用于治疗A型和B型尼曼-皮克病和法伯氏病。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂包含Hsp70或其功能片段或变体与提高Hsp70和BMP之间相互作用的物质的组合。
本发明再一方面提供了能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂在制备用于治疗溶酶体贮积症的药物中的应用。
生物活性剂-Hsp70或其功能片段或变体
本发明在一个实施方式中涉及通过使用Hsp70或其功能片段或变体的酶促活性调节，其中，所述酶与BMP相互作用。
本发明一方面提供了Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。
本发明的再一方面提供了Hsp70或其功能片段或变体，其用于溶酶体贮积症的治疗。
本发明的再一方面提供了Hsp70或其功能片段或变体在制备用于治疗溶酶体贮积症的药物中的应用。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症。
应该理解，本发明的Hsp70或其功能片段或变体可以为任何天然的或合成的产物，并且可以通过本领域技术人员已知的任何常规技术生产。
在一个实施方式中，Hsp70或其功能片段或变体从天然来源中纯化。所述天然来源可以为任何植物、动物或细菌，所述植物、动物或细菌表达或者可诱导表达适合向有此需要的个体施用的形式的Hsp70。
然而，在优选的实施方式中，Hsp70或其功能片段或变体通过合成制备。在一个优选的实施方式中，认为Hsp70或其功能片段或变体可以为通过常规技术制备的重组蛋白，并由此被称为rHsp70。
本发明的合成或天然Hsp70可以具有源自任何合适的植物、动物或细菌物种的序列。在一个实施方式中，所述rHsp70源自哺乳动物。所述哺乳动物可以选自人(homo sapiens)、小鼠(mus musculus)、牛、狗、大鼠、鼬(ferret)、猪、绵羊和猴。在另一个实施方式中，所述rHsp70源自细菌。
Hsp70的部分特征在于种间序列保守程度非常高，由此可能使源自一个物种的Hsp70可用于另一个物种而不引发有害的免疫应答。
在一个具体的实施方式中，所述rHsp70具有源自人Hsp70的序列。
在一个具体的实施方式中，所述rHsp70具有源自多于一个物种的序列。因此，在一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变体可以为嵌合体。
重组蛋白是源自重组DNA的蛋白。重组DNA是通过将天然不共同存在的DNA序列结合而形成的天然不存在的DNA形式。对于遗传修饰，通过向加入相关DNA而将重组DNA引入到已有生物体DNA(例如细菌质粒)中，从而编码针对特定目的的不同性状。遗传修饰不同于遗传重组，遗传修饰不通过细胞内过程发生，而是人为工程化。
在一个实施方式中，本发明的Hsp70与野生型Hsp70蛋白具有100％的同源性。在另一个实施方式中，本发明的Hsp70与野生型Hsp70蛋白具有小于100％的同源性，例如与野生型蛋白具有99.9-95％的同源性，例如95-90％的同源性，如90-85％的同源性，例如85-80％的同源性，如80-75％的同源性，例如75-60％同源性。与同源性的程度无关，保留了调节与BMP结合的酶的酶促活性的能力的Hsp70的任何变体均涵盖于本发明内。
在一个实施方式中，所述生物活性剂是Hsp70。在一个实施方式中，所述Hsp70是全长Hsp70。
一个实施方式还提供了Hsp70的功能片段或变体。如本文所定义的，Hsp70的功能片段或变体具有期望的功能，所述期望的功能就本发明而言是调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的能力。
在一个实施方式中，所述生物活性剂是Hsp70的功能片段或变体。
在一个实施方式中，所述生物活性剂是Hsp70的功能片段或变体，其中通过野生型Hsp70的缺失、添加或取代对Hsp70进行修饰。
野生型Hsp70蛋白的全长为641个氨基酸。在一个实施方式中，Hsp70的片段意在表示包括全长小于641个氨基酸的野生型蛋白，如小于625个氨基酸，例如小于600个氨基酸，如小于575个氨基酸，例如小于550个氨基酸，如小于525个氨基酸，例如小于500个氨基酸，如小于475个氨基酸，例如小于450个氨基酸，如小于425个氨基酸，例如小于400个氨基酸，如小于375个氨基酸，例如小于350个氨基酸，如小于325个氨基酸，例如小于300个氨基酸，如小于275个氨基酸，例如小于250个氨基酸，如小于225个氨基酸，例如小于200个氨基酸，如小于175个氨基酸，例如小于150个氨基酸，如小于125个氨基酸，例如小于100个氨基酸，如小于75个氨基酸，例如小于50个氨基酸，如小于25个氨基酸的任何片段。
野生型Hsp70蛋白的全长为641个氨基酸。在一个实施方式中，Hsp70的片段意在表示包括全长大于10个氨基酸，如大于25个氨基酸，例如大于50个氨基酸，如大于75个氨基酸，例如大于100个氨基酸，如大于125个氨基酸，例如大于150个氨基酸，如大于175个氨基酸，例如大于200个氨基酸，如大于225个氨基酸，例如大于250个氨基酸，如大于275个氨基酸，例如大于300个氨基酸，如大于325个氨基酸，例如大于350个氨基酸，如大于375个氨基酸，例如大于400个氨基酸，如大于425个氨基酸，例如大于450个氨基酸，如大于475个氨基酸，例如大于500个氨基酸，如大于525个氨基酸，例如大于550个氨基酸，如大于575个氨基酸，例如大于600个氨基酸，如大于625个氨基酸的任何片段。
在一个实施方式中，认为本发明的Hsp70的片段的全长为5-25个氨基酸，如25-50个氨基酸，例如50-75个氨基酸，如75-100个氨基酸，例如100-125个氨基酸，如125-150个氨基酸，例如150-175个氨基酸，如175-200个氨基酸，例如200-225个氨基酸，如225-250个氨基酸，例如250-275个氨基酸，如275-300个氨基酸，例如300-325个氨基酸，如325-350个氨基酸，例如350-375个氨基酸，如375-400个氨基酸，例如400-425个氨基酸，如425-450个氨基酸，例如450-475个氨基酸，如475-500个氨基酸，例如500-525个氨基酸，如525-550个氨基酸，例如550-575个氨基酸，如575-600个氨基酸，例如600-625个氨基酸，如625-640个氨基酸。
在一个具体的实施方式中，Hsp70的片段或变体包含Hsp70的全部或部分ATPase结构域。在一个实施方式中，认为本发明的Hsp70的片段或变体包含第30至第382的所有或部分氨基酸。
在另一个具体的实施方式中，Hsp70的片段或变体包含Hsp70 ATPase结构域的第90位氨基酸色氨酸。
Hsp70的片段可以为野生型蛋白的截短形式，即其是较短的形式。可以通过从所述蛋白的氨基末端或羧基末端缩短该蛋白而使片段截短，或者也可以通过缺失所述蛋白的任何大小的一个或多个内部区域而使其截短。
在一个实施方式中，Hsp70的片段或变体可以与野生型蛋白具有100％的同源性。在另一个实施方式中，所述Hsp70的片段或变体还可以为与野生型蛋白具有小于100％的同源性，例如与野生型蛋白具有99.9-95％的同源性，例如95-90％的同源性，如90-85％的同源性，例如85-80％的同源性，如80-75％的同源性，例如75-60％同源性的Hsp70变体。
应该理解，保留了调节溶酶体酶活性的能力的Hsp70的任何片段或变体都被涵盖于本发明中。
应该理解，保留了与BMP相互作用的能力的Hsp70的任何片段或变体都被涵盖于本发明中。
应该理解，所述功能片段或变体的准确量化作用可能不同于全长分子的作用。在一些情况下，所述功能片段或变体可能确实比全长分子更有效。此外，考虑到片段的尺寸较小，利用片段代替全长分子可能是有利的。
在一个实施方式中，Hsp70的功能片段或变体可以为其中的一个或多个氨基酸已经被取代的Hsp70变体。所述取代可以为等同或保守性取代，或者非等同或非保守取代。
在一个实施方式中，野生型Hsp70的0.1-1％的氨基酸被取代，例如1-2％氨基酸残基，例如2-3％氨基酸残基，如3-4％氨基酸残基，例如4-5％氨基酸残基，如5-10％氨基酸残基，例如10-15％氨基酸残基，如15-20％氨基酸残基，例如20-30％氨基酸残基，如30-40％氨基酸残基，例如40-50％氨基酸残基，如50-60％氨基酸残基，例如60-70％氨基酸残基，如70-80％氨基酸残基，例如80-90％氨基酸残基，如90-100％的氨基酸残基被取代。
在一个实施方式中，野生型Hsp70的1-5个氨基酸残基被取代，如5-10个氨基酸残基，例如10-15个氨基酸残基，如15-20个氨基酸残基，例如20-30个氨基酸残基，如30-40个氨基酸残基，例如40-50个氨基酸残基，如50-75个氨基酸残基，例如75-100个氨基酸残基，如100-150个氨基酸残基，例如150-200个氨基酸残基，如200-300个氨基酸残基，例如300-400个氨基酸残基，如400-500氨基酸残基被取代。
在一个实施方式中，所述Hsp70的功能片段或变体是融合蛋白。在一个实施方式中，所述Hsp70的功能片段或变体与标签融合。
利用Hsp70或其功能片段或变体的优势
如上文所讨论的，除了针对戈谢病和法布里病开发的酶替代疗法(ERT)外，还没有治愈溶酶体贮积病的方法并且治疗多是对症治疗。如所述，ERT是仅对一种具体疾病有效的非常昂贵的治疗形式。
据本发明人所知，目前还没有为其它与脂质集聚相关的溶酶体贮积病提供ERT的成功尝试，因此当前未满足的主要需求是针对这些LSD的有效且特异的治疗。
与溶酶体贮积病的常规治疗形式相比，向有此需要的个体施用Hsp70或其功能片段或变体具有多种优势。
首先，利用现代技术生产重组蛋白(例如rHsp70或其功能片段或变体)是以简单且直接的方式生产足够量的rHsp70或其功能片段或变体。生产重组酶的常规技术为本领域技术人员所熟知。
此外，生产重组蛋白，例如rHsp70、其功能片段或变体是用于生产足够量的rHsp70或其功能片段或变体的廉价方法。与用于ERT的酶的生产相比，其费用大幅减少。
此外，使用Hsp70或其功能片段或变体可用于治疗多于一种特异的溶酶体贮积症。这还适用于本发明的Hsp70诱导物和辅诱导物。确实，能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂可用于治疗可通过调节所涉及的与BMP相互作用的缺陷性酶的酶促活性而逆转的任何溶酶体贮积病。
最后，由于Hsp70是内源产生的分子，即源自生物体、组织或细胞内的分子，因此预期施用Hsp70或其功能片段或变体不触发免疫应答或触发的免疫应答非常有限。由于当施用于个体时其促进治疗且减少了潜在的副作用，因此这是主要优势。
Hsp70的异位表达
在一个实施方式中，Hsp70或其功能片段或变体可以由载体表达。因此，在一个实施方式中，本发明涉及编码Hsp70或其功能片段或变体的载体。
在本发明的一个实施方式中，Hsp70或其功能片段或变体可以以载体的形式施用于有此需要的个体。
用于表达Hsp70或其功能片段或变体的载体可以选自以下：病毒载体(逆转录病毒和腺病毒)或非病毒载体(质粒、粘粒、噬菌体)。
在一个实施方式中，所述载体包含一个或多个复制起点、筛选标记和一个或多个限制性内切酶识别位点。在另一个实施方式中，所述载体可操作地与在合适的宿主细胞中控制所述Hsp70或其功能片段或变体转录的调控序列相连。
如本文所述，在一个实施方式中，本发明涉及生产Hsp70或其功能片段或变体的方法；所述方法包括提供编码所述Hsp70或其功能片段或变体的载体，并在体外或在合适的宿主生物内以体内方式表达所述载体，由此产生所述Hsp70或其功能片段或变体的步骤。
本发明还涉及所分离的包含编码本发明的Hsp70或其功能片段或变体的载体的重组或转基因宿主细胞。
本发明还涉及产生重组或转基因宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供编码Hsp70或其功能片段或变体的载体，将所述载体引入所述重组或转基因宿主细胞并任选地在所述重组或转基因宿主细胞中表达所述载体，由此产生生产所述Hsp70或其功能片段或变体的重组或转基因宿主细胞。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含上述宿主细胞的转基因哺乳动物生物体。
在再一个实施方式中，包含本发明的重组或转基因宿主细胞的所述转基因哺乳动物生物体不是人。
所述转基因宿主细胞可选自哺乳动物、植物、细菌、酵母或真菌宿主细胞。
为了提高DNA至细胞的递送，必须保护所述DNA免受损伤，且必须有利于其进入细胞。已经产生了具有保护DNA在转染过程中免受不利降解的能力的Lipoplex和polyplex。质粒DNA可以被脂质以类似于胶束或脂质体的组织性结构所包被。当所述组织性结构与DNA结合时，其被称为lipoplex。有三种类型的脂质可用于形成脂质体：阴离子性(带负电荷)、中性或阳离子性(带正电荷)。聚合物与DNA的复合体被称为polyplex。多数polyplex由阳离子性聚合物构成，且其产生有离子的相互作用调节。
在一个实施方式中，包含Hsp70或其功能片段或变体的载体可用于基因治疗。基因治疗是向个体的细胞或组织中插入基因以治疗诸如遗传病的疾病，在基因治疗中利用功能基因替代有害的突变等位基因。
在另一个实施方式中，可以将Hsp70或其功能片段或变体作为裸DNA而施用。这是非病毒转染的最简单形式。可以通过使用电转化、声致孔(sonoporation)或者使用“基因枪”(利用高压气体将DNA包被的金颗粒射入细胞中)，进行裸DNA的递送。
生物活性剂——Hsp70诱导物和辅诱导物
在一个实施方式中，本发明涉及通过使用Hsp70诱导物或辅诱导物的酶促活性调节，其中，所述酶与BMP相互作用。
Hsp70诱导物是在没有伴随应激(concomitant stress)的情况下本身能够提高Hsp70基因表达和蛋白表达的化合物。
Hsp70辅诱导物是在没有伴随(轻度)应激的情况下不能提高Hsp70基因表达和蛋白表达，但应激诱导的Hsp70水平的提高可被存在的Hsp70辅诱导物进一步提高或增强的化合物。
本发明一方面提供了Hsp70诱导物或辅诱导物，其用作药物。
本发明再一方面提供了Hsp70诱导物或辅诱导物，其用在溶酶体贮积症的治疗中。
本发明再一方面提供了Hsp70或其功能片段或变体在制造用于治疗溶酶体贮积症的药物中的应用。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症。
在一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症是A型或B型尼曼-皮克病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为法伯氏病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为克拉伯病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为异染性脑白质营养不良。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为唾液酸贮积病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为法布里病。在再一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为戈谢病。在再一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为鞘脂激活蛋白缺乏症。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70诱导物或辅诱导物。在一个具体的实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70诱导物。在另一个具体的实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70辅诱导物。
小分子药物——羟胺衍生物
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70辅诱导物。在再一个实施方式中，所述Hsp70辅诱导物是小分子药物。
在一个具体的实施方式中，本发明的Hsp70辅诱导物是羟胺衍生物。在再一个实施方式中，所述羟胺衍生物可选自氯吡哌醇(BRLP-42)、Arimoclomol(BRX-220)、BRX-345和BGP-15。
在一个具体的实施方式中，所述氢胺衍生物是Arimoclomol(BRX-220)。
氯吡哌醇([2-羟基-3-(1-哌啶基)
丙氧基]-3-吡啶-carboximidoyl-氯马来酸盐)([2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridine-carboximidoyl-chloride maleate)是最初开发用于治疗糖尿病并发症(例如神经病)的无毒性化合物。已经证明氯吡哌醇部分地通过HSF-1的激活提高细胞内包括Hsp70在内的热休克蛋白(HSP)，从而提高在试验应激条件下的细胞存活。已经证明氯吡哌醇在没有未折叠蛋白时具有Hsp70辅诱导的能力，并且氯吡哌醇与带负电荷的膜脂质相互作用并提高其流动性。BRX-345是氯吡哌醇的结构类似物，并且诱导HSP的能力略小。
Arimoclomol(BRX-220)是氯吡哌醇的类似物，其与热休克蛋白相互作用并放大热休克反应。Arimoclomol目前正处于ALS(肌萎缩性侧索硬化，一种进行性神经退化病症)治疗的临床试验中。Arimoclomol为CytRx公司所有。
因此，本发明一方面提供了在溶酶体贮积症治疗中使用的羟胺衍生物Hsp70辅诱导物。
本发明再一方面提供了羟胺衍生物Hsp70辅诱导物在制造用于治疗溶酶体贮积症的药物中的应用。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症。
膜流化剂
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂是Hsp70诱导物。在再一个实施方式中，所述Hsp70诱导物是膜流化剂。
利用膜流化剂的治疗还可以被称为脂质疗法。
在一个具体的实施方式中，本发明的Hsp70诱导物是选自以下的膜流化剂：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和诸如利多卡因、罗哌卡因、布比卡因和马比佛卡因的麻醉剂以及本领域技术人员已知的其它膜流化剂。
除了一部分细胞蛋白在受热过程中变性(蛋白毒性)外，还认为膜流动性的改变是启动热休克反应并诱导HSP的细胞热感器(thermosensor)。确实，化学诱导的膜扰乱(类似于热诱导的质膜流动化)能够激活HSP，而不引起蛋白变性。
膜流动性是指细胞膜脂双层的粘性。膜磷脂加入了不同长度和饱和度的脂肪酸。
膜流化剂的作用是通过插入到膜脂质之间由此通过消弱脂酰基链间的范德华相互作用而诱导扰乱作用。
因此，本发明一方面提供了选自以下的膜流化剂：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和诸如利多卡因、罗哌卡因、布比卡因和马比佛卡因的麻醉剂以及本领域技术人员已知的其它膜流化剂，其用在溶酶体贮积症的治疗中。
本发明再一方面提供了选自以下的膜流化剂在制造用于治疗溶酶体贮积症的药物中的应用：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和诸如利多卡因、罗哌卡因、布比卡因和马比佛卡因的麻醉剂以及本领域技术人员已知的其它膜流化剂。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症。
用于诱导Hsp70的其它方式
用于诱导Hsp70表达的任何方式都被视为涵盖于本发明中，其中一些列于下文。
提高个体温度是包括Hsp70在内的HSP的有效诱因，并且因此亚致死热疗是本发明的一个方面。在一个实施方式中，亚致死热疗包括提高个体的温度至约38℃，如约39℃，例如约40℃，如约41℃，例如约42℃，如约43℃的核心温度。
因此，本发明一方面提供了亚致死热疗，用于治疗溶酶体贮积症。
诸如掠食性恐惧和电击的心里应激能够引发应激诱导的eHsp70释放，这被认为是一个依赖于儿茶酚胺信号传导的过程。此外，肾上腺素和去甲肾上腺素也可以引发Hsp70释放。
已经证明以下化合物诱导(或辅诱导)包括Hsp70在内的HSP：膜相互作用化合物：烷基溶血磷脂依地福新(Edelfosine)(ET-18-OCH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱)；消炎药，包括环氧合酶1/2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)和罗非昔布(rofecoxib)，以及NSAID，例如乙酰水杨酸、水杨酸钠和吲哚美辛；前列腺素PGA1、PGj2和2-环戊烯-1-酮；过氧化物酶增殖物激活型受体γ-激动剂，微管蛋白相互作用抗癌剂，包括长春新碱和紫杉醇；胰岛素增敏剂吡格列酮；抗肿瘤剂，例如卡铂、多柔比星、氟达拉滨、异环磷酰胺和阿糖胞苷；Hsp90抑制剂格尔德霉素(geldanamycin)、17-AAG、17-DMAG、根赤壳菌素(radicicol)、除莠霉素-A(herbimycin-A)和花生四烯酸；蛋白酶体抑制剂MG132和乳胞素(lactacystin)；丝氨酸蛋白酶抑制剂DCIC、TLCK和TPCK；抗溃疡药替普瑞酮(geranylgeranylacetone)(GGA)、瑞巴匹特(rebamipide)、甘珀酸(carbenoxolone)和聚普瑞锌(polaprezinc)(L-肌肽锌)；重金属(锌和锡)；消炎药地塞米松；可卡因；烟碱；醇(alcohol)；α-肾上腺素激动剂；环戊烯酮前列腺素(cyclopentenone prostanoids)；以及草本药芍药苷(paeoniflorin)、甘草甜素(glycyrrhizin)、雷公藤红素(celastrol)、二氢雷公藤红素(dihydrocelastrol)、二氢雷公藤红素二乙酸酯(dihydrocelastrol diacetate)和姜黄色素。
因此，本发明一方面提供了选自以下的化合物：依地福新(ET-18-OCH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱)、塞来昔布和罗非昔布、乙酰水杨酸、水杨酸钠、吲哚美辛、PGA1、PGj2、2-环戊烯-1-酮、过氧化物酶增殖物激活型受体γ-激动剂、长春新碱、紫杉醇、吡格列酮、卡铂、多柔比星、氟达拉滨、异环磷酰胺、阿糖胞苷、格尔德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤壳菌素、除莠霉素-A、花生四烯酸、MG132、乳胞素、DCIC、TLCK和TPCK、替普瑞酮(GGA)、瑞巴匹特、甘珀酸、聚普瑞锌(L-肌肽锌)、地塞米松、可卡因、烟碱、醇、α-肾上腺素激动剂、环戊烯酮前列腺素、芍药苷、甘草甜素、雷公藤红素、二氢雷公藤红素、二氢雷公藤红素二乙酸酯和姜黄素以及本领域已知的其他HSP诱导物，其用于治疗溶酶体贮积病。
本发明的药物组合物
本发明涉及通过使用能够提高Hsp70的浓度和/或活性的生物活性剂进行酶促活性的调节，从而使溶酶体贮积病患者受益，所述酶与BMP相互作用。
虽然本发明的生物活性剂可能以原料化学物施用，但优选以药物制剂的形式提供。因此，本发明还提供了用于医药应用的药物组合物，其包含本发明的生物活性剂或本文所定义的其药学上可接受的盐和其药学上可接受的载体。
本发明一方面提供了可以向有此需要的个体施用的包含本文定义的生物活性剂的组合物，例如药物组合物。
在一个实施方式中，本发明涉及包含本发明的生物活性剂的组合物。在一个实施方式中，本文公开的组合物可以与生理学上可接受的载体组合配制。在一个实施方式中，本文公开的组合物可以与药学上可接受的载体组合配制。
可以通过常规技术，例如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy 1995，edited by E.W.Martin，Mack Publishing Company，19th edition，Easton，Pa.中描述的技术，制备包含本发明的生物活性剂的药物组合物。
本发明的生物活性剂可经配制用于肠胃外施用，并且可以以安瓿、预填充针剂、小体积输注的单位剂量形式或添加了防腐剂的多剂量容器的形式提供。所述组合物可以采取诸如包含于油性或水性介质、载体、稀释剂或溶剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，其中所述溶剂包括矿物盐或其它水溶分子的水溶液、丙二醇、乙二醇、植物油、动物油、合成油、可注射有机酯，并且所述组合物可以包含诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂或助悬剂、稳定剂和/或分散剂、色素、缓冲剂、稠化剂和增溶剂等的制剂用试剂。或者，所述活性成分可以为通过无菌固体的无菌分离或通过冻干获得的粉末形式，以在使用前利用合适的介质(例如无菌且无热原质的水)形成。
预期本发明还包括可制备的所述生物活性剂的药学上可接受的盐，作为盐的特定水合物形式。这些盐是其在药学应用上可接受的形式，即所述盐将保留母体化合物的生物活性并且所述盐将在其应用中不具有不恰当的或有害的作用，并用在疾病治疗中。
药学上可接受的盐以标准方式制备。如果所述母体化合物是碱，利用过量有机酸或无机酸在合适溶剂中对其进行处理。如果所述母体化合物是酸，利用过量有机碱或无机碱在合适溶剂中对其进行处理。
可以采用本领域技术人员已知的本发明的生物活性剂的任何合适的制剂。
在一个实施方式中，Hsp70或其功能片段或变体被配制在生物可降解的微球(例如脂质体)中。
施用(给药)
可以采用任何合适的给药途径以向哺乳动物(优选人)提供有效量的本发明生物活性剂，其中所述生物活性剂可以为Hsp70或其功能片段或变体。
可以通过三种主要递送途径向有此需要的个体施用生物活性剂或药物组合物：1)外用(涂敷于身体表面，例如皮肤或粘膜)，2)经肠(通过胃肠或消化道)，和3)肠胃外(除胃肠或消化道外的途径)
外用包括表皮给药(epicutaneous)(涂敷于皮肤上)、吸入剂、灌肠剂、滴眼剂(滴至结膜)、滴耳剂、鼻内途径和阴道给药。
经肠给药除经胃或十二指肠营养管外，还可以为胃肠道的任何部分参与的任何给药形式，并且包括口服给药(通过口，例如片剂、胶囊或滴剂)、直肠(例如栓剂或灌肠剂)给药。
肠胃外递送(例如注射或输注)可有效地将生物活性剂递送至靶位点或者将药物引入至血液，并且包括静脉内(进入至静脉内)、动脉内(进入至动脉)、肌肉内(进入至肌肉)、心脏内(进入至心脏)、皮下(在皮肤下面)、骨质内(进入至骨髓)、皮内(进入至皮肤本身)、鞘内或脊柱内(进入至椎管内)、腹膜内(进入腹膜内)、透皮(通过完整的皮肤扩散)、经粘膜(通过粘膜扩散，例如吹入(insufflation)(嗅吸入)、舌下、口含(buccal)和阴道栓剂)、吸入、硬膜(进入硬膜区)和玻璃体内(进入眼睛)。舌下给药(在舌下)也是一种肠胃外给药方式，由此生物活性剂通过舌下的粘膜组织扩散至血液中。本发明的生物活性剂可以通过任何肠胃外递送途径而施用，并优选通过上述任意方式施用。
肠胃外递送具有避免与肠递送相关的在胃肠道中降解的优势。
由于肠胃外递送可以使化合物直接被吸收至体循环内，所以肠胃外递送还具有消除与肠递送相关的首过代谢的优势。
首过代谢是药物代谢的一种现象，该现象使药物浓度在到达体循环前大幅降低。通常与肝和肠壁相关的是在吸收过程中损失的药物部分。
服用药物后，其被消化系统吸收并进入到肝门脉系统。该药物在到达身体其它部分之前通过门静脉进入肝。肝脏代谢多种药物，有时将药物代谢至仅少量活性药物从肝脏排出进入体循环其它部分的程度。因此，经过肝的这种首过(first pass)大幅降低了所述药物的生物利用度。
影响药物的首过效应的四个主要系统是胃肠腔的酶、肠壁酶、细菌酶和肝酶。
可以通过常规技术制备此种给药的适当剂型。可以通过常规技术制备适合通过吸入给药的剂型，例如喷雾制剂或定量吸入剂(a metered dose inhaler)。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂的具体给药方式是通过肠胃外给药。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂的肠胃外给药的具体方式是通过静脉、皮下、肌内、动脉、皮下或腹膜内注射。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂的肠胃外给药的具体方式是通过吸入。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂的肠胃外给药的具体方式是通过静脉内输注。
在一个实施方式中，本发明的静脉内输注进行的时间可以为10分钟-20分钟，如20-30分钟，例如30-40分钟，如40-50分钟，例如50-60分钟，如60-90分钟，例如90-120分钟，如2小时-3小时，例如3-4小时，如4-5小时，例如5-6小时，如6-7小时，例如7-8小时。
在一个具体的实施方式中，本发明的生物活性剂的肠胃外给药的方式是通过经粘膜递送。在一个实施方式中，所述经粘膜递送为舌下递送，在另一个实施方式中，所述经粘膜递送为口含(buccal)递送，在再一个实施方式中，所述经粘膜递送为吹入或鼻内递送。
剂型包括片剂、锭剂、分散体、混悬剂、溶液、胶囊、乳膏、软膏、乳剂、凝胶、洗剂、糊剂、气雾剂或本领域已知的其它形式。
所采用的活性成分的有效剂量可以随所采用的具体组合物、给药形式、所治疗的病况和所治疗病况的严重程度而不同。本领域技术人员可以容易地确定此剂量。
在一个实施方式中，本发明的生物活性剂以单次日剂量或分次剂量或者以缓释形式以约1微克/kg动物体重-约100毫克/kg动物体重的日剂量施用。可以在该范围内或甚至该范围外对给药方案进行调整，以提供最佳的治疗结果。
在一个实施方式中，所施用的本发明生物活性剂的剂量为约1μg/kg体重-约10μg/kg体重，如约10μg/kg体重-约50μg/kg体重，例如约50μg/kg体重-约100μg/kg体重，如约100μg/kg体重-约250μg/kg体重，例如约250μg/kg体重-约500μg/kg体重，如约500μg/kg体重-约750μg/kg体重，例如约750μg/kg体重-约1000μg/kg体重，如约1mg/kg体重-约10mg/kg体重，例如约10mg/kg体重-约50mg/kg体重，如约50mg/kg体重-约100mg/kg体重。
可以以某种时间间隔施用所述剂量，并且所述剂量可以以mg/kg体重/时间单位表示。在一个实施方式中，所述时间单位可以为每分钟，如每小时，例如每天，如每周。
联合治疗
一方面，本发明提供了能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂和其它治疗形式的组合，用于溶酶体贮积症的治疗。
一个方面，本发明涉及治疗溶酶体贮积病的方法，其包括施用本发明的任一生物活性剂和至少一种其它治疗形式的组合。
因此，在一个实施方式中，本发明的生物活性剂与至少一种其它治疗形式(例如用于LSD的常规或已知治疗形式)组合施用于有此需要的个体。
应该理解，本发明的生物活性剂包含Hsp70或其功能片段或变体，或者Hsp70诱导物或辅诱导物。
组合多于一种治疗形式的施用可以同时发生或依次发生。同时施用可以为包含在同一组合物或包含在独立的组合物中的两种化合物，或者可以为基本在同一时间进行的一种组合物和另一种治疗形式。依次施用表示在不同时间点施用多于一种治疗形式，例如首先施用一种治疗形式，然后施用第二种治疗形式。依次施用多于一种治疗形式的时间框架可以由本领域技术人员确定，以获得最佳结果，并且在一个实施方式中可以为30分钟-72小时。
化学化合物的治疗形式可以一起施用或分开施用，每种均为最有效的剂量。施用多于一种化合物可以具有协同作用，从而有效降低各药物的所需剂量。
在一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与酶替代疗法(ERT)共同施用于有此需要的个体。在一个实施方式中，所述ERT可以选自Cerezyme
Figure BPA00001311158300801
(注射用伊米苷酶)、美格鲁特、Fabrazyme
Figure BPA00001311158300802
(β-半乳糖苷酶)和利甫盖素(α-半乳糖苷酶)。
在一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与Cerezyme(注射用伊米苷酶)或美格鲁特共同施用于患戈谢病的个体。
在另一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与Fabrazyme(β-半乳糖苷酶)或利甫盖素(α-半乳糖苷酶)或美格鲁特共同施用于患法布里病的个体。
在另一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与止痛物品(pain reliever)共同施用于有此需要的个体。
在再一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与皮质类固醇共同施用于有此需要的个体。
在一个实施方式中，可以将本发明的生物活性剂与移植(例如骨髓移植、脐带血移植或干细胞移植)共同施用于有此需要的个体。
在另一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与底物减少疗法共同施用于有此需要的个体。
在另一个实施方式中，将本发明的生物活性剂与对症和支持治疗(例如物理治疗)共同施用于有此需要的个体。
Hsp70提高了化合物的摄取
本发明人进一步证明Hsp70提高了其它分子的胞吞摄取(图16)。由于在Hsp70存在下使化合物更易于被细胞摄取的被动机制，该提高的摄取可能是不依赖于Hsp70发生的，或者由于与Hsp70的直接结合，其可能是依赖于Hsp70发生的。
Hsp70提高化合物的细胞摄取的能力有利于施用于细胞的Hsp70或其功能片段或变体易于被细胞所摄取。
此外，由于Hsp70的存在可提高Hsp70和与Hsp70组合施用的化合物的摄取，Hsp70提高化合物的细胞摄取的能力有利于组合治疗方案。
对于其中的一个化合物是ERT用酶而另一个是Hsp70或其功能片段或变体的组合治疗，这可能有助于有效降低为达到有效细胞内剂量而所需的ERT用酶量。由于ERT非常昂贵，这种降低具有重大意义。
因此，在本发明的生物活性剂包含Hsp70或其功能片段或变体和Hsp诱导物或辅诱导物的情况下，Hsp70的存在可提高所述Hsp70诱导物或辅诱导物的摄取。
调节酶的酶促活性的方法
本发明一个方面涉及酶促活性的调节。所述酶可以为溶酶体物质分解代谢所涉及的酶。并且所述调节可来自Hsp70和BMP之间的相互作用。
因此，本发明人描述了Hsp70和BMP之间的相互作用，其中，Hsp70与BMP相互作用或以特定亲合力与BMP结合。在本文中，与分子X具有“亲合力”的分子表示与分子X具有亲合力的分子将在某种条件下以某种可检测的量与分子X结合，但在同一条件下并不与其它不同的分子(与其没有亲合力的分子)以相同的程度结合(优选可检测的结合)。描述一种分子与其它分子的亲合力的一个方式是解离常数Kd。Kd越小，亲合力越强。可以利用本领域熟知的方法，例如表面等离子共振分析测定解离常数。在本文中，与另一个分子X具有“亲合力”的分子与所述分子X的Kd小于100mM，如小于10mM，例如小于5mM，如小于1mM，例如小于0.1mM，如小于0.01mM，例如小于1μM，如小于100nM，，例如小于10nM，如小于1nM，例如小于100pM，如小于10pM，例如小于1pM。此外，本文优选与分子X“没有亲合力”的分子的与分子X结合的解离常数Kd比与分子X具有亲合力的分子(与分子X)的结合的Kd高至少10倍，如高至少20倍，例如高至少30倍，如高至少40倍，例如高至少50倍，如高至少60倍，例如高至少70倍，如高至少80倍，例如高至少90倍，如高至少100倍。最优选地，认为与分子X具有亲合力的分子和确定与分子X没有亲合力的分子之间Kd的差异至少为10倍。
本发明一方面提供了调节与BMP(二(单酰基甘油)磷酸酯)相互作用的酶的酶促活性的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)施用能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，和
ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，和
iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。
在一个实施方式中，所述相互作用可以是直接的，或者在另一个实施方式中，所述相互作用可以是间接的。
在一个实施方式中，本发明一方面涉及调节与BMP(二(单酰基甘油)磷酸酯)相互作用的酶的酶促活性的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)施用本发明的生物活性剂，
ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，和
iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。
在一个实施方式中，所述Hsp70与BMP形成共价或非共价复合物。
在一个实施方式中，所述BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。在再一个实施方式中，所述鞘脂激活蛋白可选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
在再一个实施方式中，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶(aSMase)、酸性神经酰胺酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖神经酰胺酶、唾液酸酶和芳基硫酸酯酶。
在一个具体的实施方式中，所述酶促活性的调节是酶促活性的提高。
在一个实施方式中，所述酶促活性的提高是提高1-5％，如5-10％，例如10-15％，如15-20％，例如20-25％，如25-30％，例如30-35％，如35-40％，例如40-45％，如45-50％，例如50-60％，如60-70％，例如70-80％，如80-90％，例如90-100％，如100-120％，例如120-140％，如140-160％，例如160-180％，如180-200％，例如200-250％，如250-300％，例如300-400％，如400-500％，例如500-750％，如750-1000％，例如1000-1500％，如1500-2000％，例如2000-5000％。
本发明另一方面涉及鉴定Hsp70-BMP复合物的结合伴侣的方法，所述方法包括提取所述Hsp70-BMP复合物并分离所述结合伴侣的步骤。在一个实施方式中，所述结合伴侣为激动剂。在另一个实施方式中，所述结合伴侣为拮抗剂。
本发明另一方面涉及Hsp70-BMP复合物及其作为药物的应用，如用于治疗溶酶体贮积病。
在一个实施方式中，本发明涉及特异性识别Hsp70-BMP复合物的抗体。
治疗方法
本发明一方面涉及治疗有此需要的个体的方法。
因此，本发明一方面提供了治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的生物活性剂。
在一个实施方式中，认为所述治疗为预防、治愈或改善。在一个具体的实施方式中，所述治疗为预防。在另一个实施方式中，所述治疗是治愈。在再一个实施方式中，所述治疗为改善。
在一个实施方式中，本发明使用的生物活性剂可以被配制为药物组合物。
在一个实施方式中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、异染性脑白质营养不良、唾液酸贮积病和鞘脂激活蛋白缺乏症。
在一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症是A型或B型尼曼-皮克病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为法伯氏病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为克拉伯病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为异染性脑白质营养不良。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为唾液酸贮积病。在另一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为法布里病。在再一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为戈谢病。在再一个具体的实施方式中，所述溶酶体贮积症为鞘脂激活蛋白缺乏症。
在一个实施方式中，所述溶酶体病的特征是细胞内集聚的鞘脂增加。
在一个实施方式中，所述治疗减少了有此需要的个体细胞内集聚的物质。所述物质可以为通常在溶酶体中降解的物质。在一个实施方式中，所述物质为鞘脂。
在一个实施方式中，本发明的治疗将溶酶体可降解物质(例如鞘脂)的细胞内集聚量减少至小于100％的集聚量，如小于90％的集聚量，例如小于80％的集聚量，如小于70％的集聚量，例如小于60％的集聚量，如小于50％的集聚量，例如小于40％的集聚量，如小于30％的集聚量，例如小于20％的集聚量，如小于10％的集聚量，例如小于5％的集聚量。
在一个实施方式中，本发明的治疗将鞘脂的细胞内集聚量减少了至少5％，如小于10％，例如小于15％，如小于20％，例如小于25％，如小于30％，例如小于35％，如小于40％，例如小于45％，如小于50％，例如小于55％，如小于60％，例如小于65％，如小于70％，例如小于75％，如小于80％，例如小于85％，如小于90％，例如小于95％，如小于100％。
在一个实施方式中，所述集聚的鞘脂选自鞘磷脂、神经酰胺、半乳糖苷神经酰胺、球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)、糖基神经酰胺、GM3和硫脑苷脂。
溶酶体可降解物质(例如鞘脂)的细胞内浓度的降低速度可取决于诸如施用形式和剂量方案等因素。
在一个实施方式中，所述治疗延长了有此需要的个体的预期寿命。
在一个实施方式中，认为所述预期寿命可提高6月-1年，如1年-2年，例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6-7年，如7-8年，例如8-9年，如9-10年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90年，如90-100年。
在一个实施方式中，预期寿命提高了至少6个月，如至少1年，如至少2年，例如3年，如至少4年，例如5年，如至少6年，例如7年，如至少8年，例如9年，如至少10年，例如12年，如至少14年，例如16年，如至少18年，例如20年，如至少25年，例如30年，如至少40年，例如50年，如至少60年，例如70年，如至少80年，例如90年，如至少100年。
因此，本发明一方面还提供了延长溶酶体贮积病患者预期寿命的方法，其中，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的生物活性剂。
在一个实施方式中，本发明涉及延长溶酶体贮积病患者预期寿命的方法，其中所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的生物活性剂，其中所述预期寿命被提高6月-1年，如1年-2年，例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6-7年，如7-8年，例如8-9年，如9-10年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90年，如90-100年。
在一个实施方式中，本发明涉及延长溶酶体贮积病患者预期寿命的方法，其中所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的生物活性。在一个实施方式中，其中所述预期寿命被提高至少6个月，如至少1年，如至少2年，例如3年，如至少4年，例如5年，如至少6年，例如7年，如至少8年，例如9年，如至少10年，例如12年，如至少14年，例如16年，如至少18年，例如20年，如至少25年，例如30年，如至少40年，例如50年，如至少60年，例如70年，如至少80年，例如90年，如至少100年。
实施例
实施例1：Hsp70和二(单酰基甘油)磷酸酯之间的相互作用稳定了溶酶体并促进了细胞存活
简述
溶酶体膜通透化是应激诱导的细胞死亡的进化保守性特点。本发明人在此证明了，主要的应激诱导热休克蛋白70(Hsp70)通过pH依赖性亲合结合至内溶酶体的阴离子磷脂二(单酰基甘油)磷酸酯(BMP；还被称为溶血二磷脂酸)稳定溶酶体，从而增强细胞存活。Hsp70的带正电荷的ATPase结构域负责结合，但为了溶酶体的有效稳定还需要底物结合结构域。重要的是，细胞保护作用可以通过重组Hsp70的内吞递送获得，并特别通过BMP抗体或Hsp70抑制剂的额外细胞给药逆转。因此，这种蛋白-脂质相互作用提供了分别用于治疗退行性疾病和癌症的细胞保护疗法和细胞毒性溶酶体特异性疗法的令人兴奋的可能性。
介绍
溶酶体是处于高动态的胞质细胞器，其接受来自生物合成(高尔基体反面网络结构)、内吞、吞噬和自我吞噬途径的膜运输输入物。溶酶体包含大于50种酸性水解酶，其能够加工细胞的所有主要大分子以降解可用于代谢回收利用的产物。除了其分解代谢的看家功能外，最近证明溶酶体酶(组织蛋白酶)是由例如肿瘤坏死因子受体家族的死亡受体、组织缺氧、氧化应激、渗透应激、热和抗癌药诱导的进化保守性细胞死亡程序中的重要效应子。组织蛋白酶依赖性细胞死亡的特征是早期溶酶体膜通透化和随后组织蛋白酶向胞质中的转移，在此组织蛋白酶可以启动caspase-依赖性和caspase-非依赖性细胞死亡途径。因此，溶酶体膜完整性是多种应激条件下细胞存活的重要调节因素。虽然已经报道了胞质半胱氨酸蛋白酶抑制剂在哺乳动物细胞和线虫类秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中提供不受组织蛋白酶诱导的细胞损伤的保护作用，但细胞调节溶酶体膜稳定性的机制还很不清楚。然而，最近的间接证据表明，主要应激诱导Hsp70的有效细胞保护作用是由于溶酶体膜的稳定化。癌细胞中Hsp70的缺失触发了溶酶体膜的早期通透化和组织蛋白酶介导的细胞死亡，并且外源性Hsp70有效抑制了由多种应激诱导的溶酶体去稳定化。此外，Hsp70缺陷小鼠患有由溶酶体蛋白酶泄漏至胞质引起的胰腺炎。
Hsp70的溶酶体保护潜能的分子机制仍不清楚，但其作用机制的线索可能在于少部分Hsp70向内溶酶体区室的与应激和癌相关的转移。本研究的主要目的是确定溶酶体定位是否确实对Hsp70的细胞保护作用至关重要。引人注意地，本文提供的数据证明Hsp70以高亲合力与溶酶体特异性脂质BMP结合，并且这种蛋白-脂质相互作用稳定了溶酶体。重要的是，能够通过细胞外施用细胞保护性Hsp70本身或干扰Hsp70-BMP结合或Hsp70功能(特别是溶酶体区室内)的化合物，利用这种新型细胞保护机制。
结果和讨论
为了检测溶酶体定位是否对Hsp70的细胞保护至关重要，本发明人制备了重组Hsp70(rHsp70)并利用细胞的内吞机器使rHsp70进入溶酶体腔内。用标记有Alexa Fluor 488的rHsp70温育的U-2-OS骨肉瘤细胞的免疫细胞化学分析证明了内吞的rHsp70与晚期内涵体和溶酶体标记蛋白(溶酶体相关膜蛋白1和2以及溶酶体膜内在蛋白-1(LIMP-1))以及内溶酶体特异性脂质(BMP)的明显共定位，然而利用内质网标记物(内质网Ca2+-ATPase(SERCA))、高尔基体(golgin-97)或线粒体标记物(细胞色素c(cyt c))没有观察到共定位。还在活细胞中观察到所述溶酶体定位，其中内吞rHsp70与溶酶体红色荧光探针(Lysotracker
Figure BPA00001311158300861
 Red)共定位，但不与线粒体红色荧光探针(Mitotracker
Figure BPA00001311158300862
 Red)共定位。为了测定内吞Hsp70的量，对荷载rHsp70*的细胞的荧光信号进行定量，结果表明每1*105细胞平均摄取70ng rHsp70*。为了测定内吞的rHsp70*是否仅位于腔内或者其是否直接结合至内溶酶体膜上，将荷载rHsp70*的U-2-OS进行亚分级，并测定轻膜部分(LMF)中存在的rHsp70*量(包括早期内涵体和晚期内涵体以及溶酶体的细胞器)。通过在液氮中反复冻融的循环使LMF中的细胞器冷冻破裂，引起组织蛋白酶B完全释放至上清液中，然而溶酶体膜蛋白LAMP-2停留在沉淀的破裂膜部分中。内吞rHsp70*的定量表明，大约1/3的总rHsp70*保留在沉淀中，强有力地证明其被结合在内溶酶体膜上。为了评价内吞的rHsp70是否能够稳定溶酶体膜，使细胞荷载吖啶橙(集聚在细胞的酸性区室中，是晚期内涵体和溶酶体中的因光异色的弱碱)，并在暴露于蓝光后使其对光致氧化敏感(Brunk et al.，1997；Nylandsted et al.，2004)。光致氧化引起溶酶体pH-梯度的丧失，并使吖啶橙泄漏至胞质中。当吖啶橙集中在细胞的酸性区室内时显示红色荧光，而当以较低浓度存在于胞质中时则显示绿色荧光，因此很容易可视化和定量。显著地，内吞的rHsp70保护溶酶体免受蓝光诱导的光致氧化，而在荷载重组Hsc70和Hsp70-2(与Hsp70分别具有86％和84％的氨基酸序列同源性)的细胞中没有观察到保护作用。此外，Hsp70特异性小干扰RNA(siRNA)使U-2-OS细胞的溶酶体对光致氧化敏感，并且这种作用可适当地被内吞的rHsp70完全逆转，由此证明内吞Hsp70的保护作用是由位于溶酶体腔内的小部分蛋白所介导而非残留在胞质中的大的蛋白池所介导。以上证明的Hsp70的有效内吞摄取和溶酶体稳定化可以解释最近报道的在多种已知触发溶酶体细胞死亡途径的处理(即视网膜光损害和坐骨神经轴索切断)后向受损位点施用细胞外Hsp70的意外神经保护作用。
为了检测Hsp70的所述保护作用是否可能是Hsp70与溶酶体膜的直接结合的结果，本发明人研究了其与包含多种膜相关阴离子脂质(即棕榈酰基-油酰基-磷脂酰丝氨酸(POPS；主要存在于质膜的内小叶中)、心磷脂(主要存在于线粒体中)和BMP(主要存在于晚期内涵体和溶酶体中))的棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)大单层囊泡(LUV)的相互作用。考虑到内溶酶体区室在成熟为溶酶体后环境酸性的提高，对中性(pH 7.4)和酸性(pH 6.0)条件下的蛋白-脂质相互作用进行了比较。在pH 7.4时，rHsp70引起POPC溶酶体中90°光散射的小的相对变化，表明其非常弱地结合至POPC双层上。根据针对POPS的早期报道，所有带负电荷的脂质都增强了中性pH下rHsp70与脂质体的结合。这种增强约为4倍，且与负电荷脂质或脂质体表面的电荷密度(POPS的净电荷为-1，心磷脂和BMP的净电荷为-2)无关。显著地，将pH由7.4降低至6.0显著改变了rHsp70的脂质结合谱(lipid association profile)。然而，酸化后与POPS的结合仅略有提高，与中性pH相比，在酸性pH中与BMP的结合强度提高了几乎20倍。Hsp70与BMP的pH依赖性高亲合力结合在一组独立的BIAcore实验中得到验证。
如之前所证明的(Kobayashi et al.，1998)，为了测定活细胞中Hsp70介导的溶酶体稳定化是否需要在体外观察到的Hsp70和BMP之间的pH依赖性高亲合力相互作用，本发明人通过使U-2-OS细胞的内溶酶体区室荷载BMP抗体以靶向细胞BMP。显著地，BMP抗体有效抑制了rHsp70提供的保护免受光致氧化诱导的溶酶体泄漏的能力。更重要地，BMP抗体使U-2-OS骨肉瘤细胞对顺铂显著敏感，而顺铂在U-2-OS细胞中和本研究中使用的其它顺铂敏感性细胞系下诱导早期溶酶体膜通透化。因此，在用抗BMP抗体处理后，PC-3和DU-145前列腺癌细胞对顺铂诱导的细胞死亡显著敏感。
证明了溶酶体Hsp70-BMP相互作用对Hsp70的细胞保护作用至关重要后，本发明人接着研究了Hsp70的哪部分负责脂质结合。为了实现该目的，在pH 6.0下使rHsp70停靠在包含BMP的脂质体中后对酪氨酸的荧光转移(W90和W580)进行测定。本发明人生产了在rHsp70的两个主要功能结构域即氨基末端ATPase结构域(rHsp70-ΔATP；缺失第119-426氨基酸)和羧基末端肽结合结构域(rHsp70-ΔPBD；缺失第437-617氨基酸)具有缺失的rHsp70突变蛋白。Hsp70-ΔATP相对峰荧光强度信号的丧失表明，Hsp70与POPC/BMP双层的高亲合力结合需要ATPase结构域。接着，为了研究哪个酪氨酸负责脂质结合和荧光转移，利用苯丙氨酸取代Hsp70中的两个酪氨酸(W90F和W580F)。在ATPase结构域缺乏酪氨酸(rHsp70-W90F)的rHsp70-W90F的信号减少，在肽结合结构域中缺乏酪氨酸的rHsp70-W580F的信号不变，这表明第90位的酪氨酸被停靠在脂质层中。以上使用的方法仅测定了酪氨酸包埋在亲脂环境中后荧光的相对转移，本发明人还采用BIAcore 2000系统利用固定在L1传感芯片表面的含BMP的LUV以更加量化的方式分析了pH4.5时rHsp70及其突变体的脂质结合。rHsp70和rHsp70-ΔPBD均与BMP具有强的相互作用，然而rHsp70-ΔATP的结合显著降低，这证明Hsp70主要通过其ATPase结构域与BMP相互作用。惊人的是，酪氨酸突变体的与BMP的相互作用的能力具有显著差异。然而，rHsp70-W580F突变体具有与rHsp70基本相同的相互作用谱，rHsp70-W90F突变体的结合显著降低。由于根据远UV圆二色性和近UV圆二色性分析rHsp70-W90F被准确折叠并且能够折叠荧光素酶和水解ATP，W90F突变特异性地消除了Hsp70和BMP之间的相互作用并同时保持了Hsp70伴侣分子的结构和功能方面。因此，rHsp70-W90F突变体意外地为本发明人提供了用于进一步测定Hsp70和BMP之间的直接相互作用是否使Hsp70具有溶酶体保护性质的无价工具。确实，rHsp70-W90F突变体完全丧失了其保护溶酶体膜免受光致氧化和保护细胞免受顺铂诱导的溶酶体细胞死亡的能力，而rHsp70-W580F突变体显示与野生型蛋白相同的功效。此外，显示与富含BMP的膜的结合能力不变的rHsp70-ΔPBD突变体丧失了其保护免受光致氧化和顺铂的能力。这些发现证明，为赋予溶酶体膜保护作用需要Hsp70与BMP的结合但这并不是充分条件。此外，完整的羧基末端肽结合结构域对于活细胞中溶酶体膜的稳定化也是必须的。
Hsp70抑制剂长期被认作是重要的抗癌药。然而，由于注意力集中于胞质Hsp70的抑制，并且由于药物递送问题和对Hsp70家族成员间特异性的不了解使合适Hsp70拮抗剂的开发面临不可逾越的障碍。已经确定了Hsp70的细胞保护作用需要与BMP的结合以及完整的肽结合结构域，并且已经证明了靶向Hsp70-BMP相互作用的可能，本发明人接着检测了内溶酶体Hsp70的保护作用是否也可能被Hsp70伴侣分子活性的抑制剂所削弱。通过用凋亡诱导因子衍生肽(ADD70，其通过与Hsp70的肽结合结构域结合而抑制Hsp70的伴侣功能)温育细胞，实现此目的。应该注意到，该大的衍生肽(388个氨基酸)不跨过质膜，并由此为我们提供了特异性地靶向内溶酶体Hsp70的另一个工具。特别地，用ADD70肽温育细胞完全阻断了内吞的rHsp70在U-2-OS细胞中的溶酶体保护作用。为了检测ADD70是否也可能削弱细胞自身的Hsp70的细胞保护作用，本发明人研究了ADD70对Hsp70转基因的永生化鼠胚胎成纤维细胞(iMEFs)中顺铂诱导的细胞毒性的影响，其中，在Hsp70转基因的永生化鼠胚胎成纤维细胞中转基因Hsp70几乎提供了完整的对顺铂诱导的细胞死亡的抗性。显著地，Hsp70转基因iMEFs的ADD70-治疗有效消除了Hsp70介导的细胞保护作用，并使其具有与野生型iMEFs相同的对顺铂的敏感性。野生型iMEFs表达非常低水平的Hsp70，因此ADD70不能进一步使野生型iMEFs对顺铂敏感，这支持了ADD70介导的敏化确实是由于Hsp70的抑制的观点。类似于抗-BMP治疗，ADD70治疗也使PC-3和DU-145前列腺癌细胞对顺铂诱导的细胞毒性敏感。
本文提供的数据显示，Hsp70与内溶酶体阴离子磷脂BMP直接相互作用并且这种相互作用稳定了内溶酶体膜。由于内吞小泡中BMP浓度随内涵体成熟形成多泡体、晚期内涵体和溶酶体而增加，pH调节可能是使Hsp70靶向BMP和溶酶体的方式。Hsp70的亚结构域的pI值明显不同，ATPase结构域的pI高于肽结合结构域1.72个单位。这种特征表明，在酸性pH时，优选ATPase结构域带正电荷，这可促进其与阴性脂质的相互作用。由于内吞成熟过程中pH降低，将增加正电荷并且任何阴离子相互作用也将被进一步增强。本文提供的证明Hsp70-BMP相互作用依赖于酸性pH和ATPase结构域的数据支持了该理论。此外，Hsp70的ATPase结构域的静电表面的分子模建表明，Hsp70的ATPase结构域形成接近楔样的结构，并且甚至在pH 7.0时在楔的底部都具有大量正电荷。有趣的是，W90位于该带正电荷的结构域内部，其可能给出Hsp70-W90F突变体为何对Hsp70的与BMP相互作用并稳定溶酶体的能力产生此种深刻影响的线索。BMP全部位于内溶酶体区室的内膜中，在此，其支持酸性鞘磷脂酶和鞘脂激活因子蛋白对脂质小泡的分裂和从脂质小泡提取脂质，产生参与膜去稳定和细胞死亡的诸如神经酰胺和鞘氨醇-1-磷脂的代谢物。应该注意，可以通过早期内涵体和晚期内涵体水平上的周界膜的内陷形成溶酶体内膜，并且因此各小泡可能也含有Hsp70。因此，Hsp70可以干扰BMP作为鞘脂水解的辅因子的作用，并由此改变溶酶体的脂质组成。为了检测这种假设，本发明人当前开发了基于质谱的技术，用于量化溶酶体鞘脂代谢。
大量数据证明，溶酶体蛋白酶表达的提高和运输的改变可以通过使肿瘤细胞对溶酶体膜通透化敏感而形成“致命点”。因此，内溶酶体膜上BMP-Hsp70相互作用所产生的内溶酶体区室稳定化为癌细胞提供了免受这种死亡直接途径的保护作用。作为这种细胞保护作用基础的分子机制开启了用于使癌细胞对通过特异抑制Hsp70的溶酶体稳定功能而诱导溶酶体细胞死亡途径的试剂敏感的新的令人兴奋的可能。反之亦然，Hsp70和BMP之间的相互作用可能提供了依赖于外源施用的Hsp70的溶酶体稳定功能产生的细胞保护作用的新治疗策略，用于胰腺炎、运动神经病变和感官神经病变和光诱导的视网膜损伤的多种损伤。
材料和方法
细胞培养和试剂
在补充有6％的热灭活小牛血清和青霉素-链霉素的RPMI 1640(Invitrogen)中培养人U-2-OS骨肉瘤细胞系。按照现有技术的描述(Nylandsted et al.，2004)，产生Hsp70转基因iMEF和适宜的对照iMEF并维持生长。所有细胞都在含有5％CO2的37℃加湿空气气氛下培养，反复测定并确定支原体阴性。
除非另有说明，所有化学物质都购自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich Denmark A/S)。
重组蛋白
利用pET-16b载体系统(Novagen)产生重组Hsp70及其突变体，并根据厂商的方法进行蛋白表达的诱导和随后的Ni2+-亲合-纯化的优化。
根据厂商的方法(Molecular Probes)利用Alexa Fluor 488标记rHsp70。
重组蛋白和抗体的细胞摄取
在补充有6％的热灭活小牛血清和青霉素-链霉素的RPMI 1640(Invitrogen)中培养亚汇合的细胞。将重组蛋白或网状细胞裂解物直接加入到培养基中，达到最终浓度。然后在所述蛋白裂解物存在下使细胞再生长20小时。
根据本领域技术，利用抗BMP抗体(LBPA)(6C4)荷载细胞。
通过在rHsp70*存在下培养细胞20小时，然后收集细胞，在PBS中洗涤3次并计数，对内吞的rHsp70*进行量化。对于整个细胞摄取，使用了1*105个细胞。通过在100μL毛地黄皂苷-PBS(200μg/mL)中于冰上温育30分钟裂解细胞。在Spectramax Gemini酶标仪(Molecular Devices)上测定荧光。对于轻膜部分(LMF)，总共收集了10*106个细胞，在PBS中洗涤3次并进行Dounce-匀浆化，直到通过台盼蓝染色测定的膜裂解达到90％。然后，通过首先清除质膜、细胞核和重膜部分使细胞进行膜分级，之后通过在17000*g离心20分钟收集LMF。然后将LMF分成两份，保持第一份为“完整”LMF(“full”LMF)。为了从腔内容物(luminal content)中分离膜，第二部分在液氮中冻融5个循环以裂解膜，然后在20000*g离心20分钟。收集后，所有细胞操作都在最高4℃下进行。
溶酶体完整性和细胞存活率试验
在补充有3％FCS的Hanks平衡盐溶液中洗涤、照射并分析利用2μg/ml吖啶橙在37℃温育15分钟的亚汇合U-2-OS细胞。以透射光模式从各个孔的8个预定区域选择用于单细胞成像的细胞，之后立即可视化并暴露在来自安装在U-ULS100HG housing(Olympus)中的USH102 100W汞弧灯(Ushio electric)的蓝光下20秒。在具有LCPlanF1×20物镜(NA＝0,40)的Olympus IX-70倒置显微镜上进行荧光显微检测。
在倒置的Olympus IX-70荧光显微镜(Filter U-MWU 330-385nm)下，通过用0.05μg/ml Hoechst 33342(Molecular Probes公司)对细胞染色来评价凋亡样细胞死亡，并利用缩聚的细胞核对细胞进行计数。对于每次试验，最少对八个随机选择的区域进行计数。按照现有技术的描述67，通过3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)还原试验分析细胞存活率。利用2.5μM SYTOX Green(Molecular Probes)在37℃对细胞染色10分钟的流式细胞术对坏死细胞进行定量，然后通过在流式细胞仪(FACSCaliburTM；Becton Dickinson)的FL1通道中的荧光强度测定正染色的细胞。
如所述的，用顺铂处理细胞，并通过洋地黄皂苷处理获得胞质部分，并测定胞质半胱氨酸组织蛋白酶(zFRase)和类caspase-3(DEVDase)的活性。
RNA干扰
所使用的siRNA包括靶向编码Hsp70的两个基因(HSPA1A和HSPA1B)的一个siRNA：5′-GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3′(Invitrogen)，以及之前描述的对照Hsp70 siRNA。使用Oligofectamine(Invitrogen)作为转染试剂。
免疫检测
所使用的一抗包括针对Hsp70的小鼠单克隆抗体(2H9；由Boris Margulis，Russian Academy of Sciences，St.Petersburg，Russia惠赠)，针对3-磷酸甘油醛脱氢酶的小鼠单克隆抗体(GAPDH；Biogenesis)，针对BMP的小鼠单克隆抗体(6C4；(Kobayashi et al.，1998))，针对LIMP-1的小鼠单克隆抗体(H5C6；由J.Thomas August和James E.K.Hildreth开发，并获自在NICHD资助下开发的并由美国爱荷华市的爱荷华大学生物科学系维护的发育研究用杂交瘤库)，针对cyt c的小鼠单克隆抗体(克隆6H2.B4，BD PharMingen)，针对SERCA的小鼠单克隆抗体(IID8，Calbiochem)和针对golgin-97的小鼠单克隆抗体(CDF4，Molecular Probes)。利用所示的一抗、结合有过氧化物酶的适当二抗和Luminescent Image Reader(LAS-1000Plus，Fujifilm)对通过10％SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜上的蛋白进行检测。
色氨酸荧光谱和脂质体90°光散射
利用由基本如之前所述的脂质组成的LUV在HEPES缓冲液(20mM HEPES，0.1mM EDTA，所示pH为7.4或6.0)中分析色氨酸荧光谱(RFI)和脂质体90°光散射(RSI)。对于RFI，将LUV加入到10μM试样量中，并在20分钟的稳定期后记录光谱。对于RSI，将重组蛋白加入到0.12nmol试样量中。
表面等离子共振(BIAcore)
为了制备LUV，将由溶解在有机溶剂中的10mol％鞘磷脂、50mol％磷脂酰胆碱、20mol％胆固醇和20mol％BMP构成的脂质混合物在氩气流下干燥，并在Tris/HCl缓冲液(pH 7.4)中再水化(Kolzer et al.，2004)。将所述混合物在液氮中然后在37℃的孵箱中冻融9次。在超声浴中持续15分钟后，使混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜21次。利用BIAcore 2000系统在25℃进行表面等离子共振测定。将包含于PBS(上样缓冲液)中的LUV(总脂质浓度为0.1mM)固定在L1传感芯片(BIAcore)的表面。所使用的运行缓冲液为醋酸钠缓冲液(50mM，pH 4.5)。作为对照，向脂质体表面直接注射aSMase(0.2μM，包含在60μl运行缓冲液中)。获得4100RU-5250RU的响应单位。以20μl/分钟的流速将所示浓度的感兴趣蛋白注射在运行缓冲液中。注射后，附加10分钟的解离阶段。
分子模建
利用从瑞士生物信息研究所的Expert Protein Analysis System(EXPaSy)蛋白组学服务器(http://expasy.org/)获得的软件进行初级结构分析和分子模建。利用DeepView-Swiss PDB Viewer在人Hsp70-ATPase结构域(pdb码：1S3X)和人Hsc70底物结合结构域(pdb码：7HSC)的晶体结构的基础上，进行分子模建。使用介电常数为80(H2O)，使表面模型基于pH 7.0的库伦相互作用。
统计学分析
为了评价零假设，利用双侧成对Student′s T-检验进行统计学分析。统计学显著性的截断水平设定为5％，并且利用F-检验对所有组数据的方差可比性进行检验。所有统计都基于最小n＝3的独立试验。
讨论
文献已经提供了Hsp70可能存在于肿瘤细胞的质膜上和内溶酶体系统中的证据。此外，还已知在不同的应激诱导事件(最典型的是发烧、外伤和大量锻炼，最吸引人的可能来自心理应激)过程中，Hsp70可能被释放于血液中，虽然该工作主要在免疫学领域中进行。内溶酶体区室内存在的Hsp70-物质(Hsp70-species)还描述了Hsp70家族的另一个成员——组成型表达的Hsc70。确实，Hsc70在该位置的功能是被称为所谓伴侣分子介导的自噬的过程。
然而，根据文献，关于Hsp70与质膜和内溶酶体膜之间的结合的分子基础一无所知，从而促使使本发明人形成了本方案。
实施例1中提供的数据表明，Hsp70能够在中性pH下与带负电荷的膜脂质，例如磷脂酰丝氨酸(PS)、心磷脂和二(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)相互作用。然而，在模拟了能够预期的早期内溶酶体系统(pH 6.0)中的酸性后，相互作用谱发生巨变，并且Hsp70与BMP的亲合力变为比中性pH时高20倍，且几乎比PS高9倍。这种Hsp70-BMP相互作用在较成熟的BIAcore系统中得到证实，在所述BIAcore系统中，pH目前被设定为作为多数细胞BMP的主要位点的晚期内涵体和溶酶体(pH 4.5)中的预期值。有趣的是，与Hsp70与BMP的亲合力相比，已知的BMP相互作用蛋白——酸性鞘磷脂酶(aSMase，其作为依赖于BMP的辅因子)与BMP的亲合力仅显示为一半，这证明了Hsp70对BMP的相对高的亲合力。
其它人也报道了Hsp70与PS的相互作用，即小鼠Hsp70和酸性糖基神经酰胺之间具有相互作用，其中，该相互作用依赖于N-末端ATPase结构域，并且在某些情况下还依赖于肽结合结构域(PBD)。然而，与本文采用的系统相反，这些研究结果是在基本上仅由一种脂质(分别为90-100％和100％的纯脂质)组成的系统中进行的，而不可能类似于预期的真核细胞中的任何最低限度复杂的脂质环境。然而，Harada et al.所证明的Hsp70的N-末端区域对酸性脂质结合的重要性与本发明人的Hsp70与BMP的相互作用依赖于其N-末端ATPase结构域的发现一致。本发明人进一步证明，Hsp70的色氨酸90(W90)是至关重要的氨基酸，原因是该氨基酸的突变显著降低了Hsp70-BMP相互作用。假想模型认为，Hsp70在ATPase和肽结合结构域(PBD)中均包含针对酸性糖脂的亲水部分和疏水部分的特异结合位点。
虽然该模型可能应用于Hsp70与酸性糖脂的结合，但本发明人仍提出了Hsp70-BMP相互作用的另一个模型。基于本文提供的数据：I)PBD仅能与BMP具有弱得多的相互作用；II)W90的重要性；III)ATPase结构域的结合性质；和IV)Hsp70的表面静电势的分子模建，本发明人提出Hsp70通过在ATPase裂隙底部带正静电荷的楔样亚结构域与BMP相互作用。然而，由于W90至苯丙氨酸的保守性突变显著降低了Hsp70-BMP相互作用，而不影响Hsp70的折叠或ATPase活性，并且由于该单个氨基酸突变不改变静电谱，所述两个模型的中间体更适合解释Hsp70和较常见的阴离子脂质基序的相互作用是可能的。在此模型中，表面正电荷可能促进静电相互作用，并且尤其是诸如W90的残基可能参与决定这种情况下的阴离子结合伴侣BMP的结合特异性。有趣的是，该研究潜在暗示Hsp70可作为细胞中较常见的脂质静电荷调节物。支持该论点的是证明细胞的脂质膜可能作为诸如发烧和氧化应激的应激的初级感应器(primary sensor)并由此作为应激应答的起始诱导物的数据。在面对应激时，有人可能争辩，细胞的脂质膜是为保持稳态或者为了触发作为对细胞冲击的应答的特异信号事件而确实进行修饰的至关重要的分隔。因此，Hsp70与诸如BMP的脂质的结合和随后溶酶体膜稳定性的提高以及可能的其它细胞脂质事件可能代表了一部分常规细胞应激应答。在癌的情况下，此种应答可能被绑架以服务于癌症本身，而且从更宽泛的进化角度出发，在面临细胞应激时协作的蛋白-脂质应答可能是很好的解释。
本文提供的证明仅Hsp70而非Hsc70和Hsp70-2能够直接保护溶酶体膜的数据认为，潜在的脂质应激应答可能特异地由主要的应激诱导的Hsp70本身且非其它Hsp70-物质调节。然而，如还证明的，Hsp70-2缺失也导致溶酶体膜通透化和细胞死亡，不过在Hsp70-2缺失的情况下通路是间接的，因为其依赖于LEDGF。然而，LEDGF如何影响溶酶体膜的机制并未解决。
为了验证体内Hsp70-BMP相互作用的相关性，本发明人通过内吞抗体和溶酶体Hsp70靶向BMP，其中所述溶酶体Hsp70是由另外的不能渗透细胞的源自AIF的多肽ADD70的内吞作用实现的。这证明了Hsp70和BMP之间的相互作用用于稳定溶酶体膜，原因是细胞随后对直接溶酶体膜破裂性刺激物和LMP诱导的化疗剂顺铂的作用明显敏感(程序性细胞死亡作为该方案的一部分的特征)。之前已经证明，ADD70的表达使癌细胞对多种死亡刺激物敏感，并在同系动物中降低大鼠结肠癌和小鼠黑色素瘤细胞的成瘤性。该方法与本文提供的方法间的主要区别在于本发明人通过ADD70的内吞作用而特异性地靶向溶酶体Hsp70，而之前的研究为了靶向更多的胞质Hsp70使用了ADD70的胞质表达。靶向内溶酶体Hsp70-BMP相互作用的成功还为通过内吞作用靶向溶酶体组分以用于治疗手段的思路提供了某种观念的证据(proof-of-concept)，所述观念可具有宽的治疗性应用，原因是能够设想使例如癌细胞对通过特异性抑制Hsp70的溶酶体稳定功能来诱导细胞死亡途径的试剂敏感。反之亦然，Hsp70和BMP之间的相互作用可能提供了依赖于外源施用于诸如胰腺炎、运动神经损伤和感官神经损伤和光诱导的视网膜损伤的身体损伤的Hsp70的溶酶体稳定功能提供的细胞保护作用的新治疗策略。确实，由于显示基于促凋亡BH3相互作用结构域死亡激动剂Bid的烃钉BH3螺旋的内吞递送可诱导白血病细胞死亡，已经产生了利用内吞机器引入特定细胞毒性化合物的观念。该过程依赖于使内吞区室完整并激活Bax和Bak的BH3螺旋，以诱导细胞色素c释放并激活凋亡的线粒体程序，。然而，令人遗憾的是，在该论文中并没有解决逃脱内吞系统的机制。
如本文所示，Hsp70与BMP相互作用依赖于Hsp70的ATPase。有趣的是，最近关于Hsp70辅伴侣分子——hsp70结合蛋白1(HspBP1)的报道可能强调了Hsp70的这个带正电荷区域的重要性。与Hsp70的部分ATPase结构域结合的HspBP1的晶体结构的研究表明，这两者之间的相互作用由包含四个犰狳样重复(armadillo-like repeat)的HspBP1中的弯曲的全部α-螺旋折叠介导。该弯曲折叠的凹面环绕ATPase结构域的圆形凸出部II(lobe II)，所述圆形凸出部II是形成Hsp70的ATPase结构域的大部分正静电荷量的同一圆形凸出部，并且本发明人认为其介导Hsp70和BMP之间的相互作用。另一项研究提供了对此的进一步看法，其中，在所述研究中利用14种癌细胞系的相对Hsp70/HspBP1水平对这14种癌细胞系进行了表征。该研究发现，HspBP1/Hsp70摩尔比高的细胞系比比例低的细胞系更易于受抗癌药的影响，并且HspBP1的过量表达促进了溶酶体膜的通透化。基于这些报道以及该实施例中提供的数据，能够认为在模型中HspBP1通过结合至Hsp70的ATPase结构域的带正电荷区域扰乱了其与BMP的相互作用以及由此扰乱了其对内溶酶体膜的稳定作用，从而导致对LMP-诱导刺激物的敏感性提高。因此，HspBP1的犰狳重复结构域可潜在形成智能药物设计的基础，ADD70即是如此。这种源自HspBP1的分子的功效在本文描述的系统中易于检测，并提供了本文描述的分子机制的进一步应用的有意义的途径。
如本发明人在本文所证明的，Hsp70在pH 4.5下以高亲合力与BMP结合，甚至亲合力几乎比“经典”BMP结合伴侣酸性鞘磷脂酶(aSMase)高2倍。有趣的是，由于BMP还具有鞘脂激活蛋白(SAPs/鞘脂激活蛋白)A-D辅因子的功能，因此BMP不仅作提供aSMase的鞘脂的酶促水解的刺激性辅因子，还作为多数膜结合鞘脂的酶促水解的刺激性辅因子。由此产生的明显问题可能是，Hsp70是否通过其与BMP的结合设法改变aSMase和鞘脂激活蛋的结合性质，由此改变膜鞘脂和糖鞘脂的代谢和下游效应分子(例如神经酰胺及其代谢物、神经酰胺-1-磷酸酯、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸酯，所有均参与细胞存活和死亡)的产生。确实，本发明人发现，Hsp70能够调节aSMase与含BMP的脂质体在pH 4.5的结合，这取决于Hsp70的浓度。可以看出，低浓度的Hsp70(3-150nM)有利于aSMase和BMP-Hsp70的相互作用，而高浓度的Hsp70(300-1500nM)的作用相反。虽然在加入用于内吞的Hsp70时本发明在培养基中的工作浓度为300nM，但难以在该基础上估测溶酶体内浓度，并且关于Hsp70在体内对aSMase活性的影响的任何结论都可能是纯理论的。然而，用抗神经酰胺的单克隆抗体对Hsp70-转基因(Hsp70-TG)和野生型(WT)iMEF染色证明，Hsp70-转基因小鼠显示明显的神经酰胺上调，这种上调显示于细胞轮廓和接近细胞核的轮廓的特征性的序列微珠谱图(beads-on-a-string pattern)。由于神经酰胺的累积水平由iMEF-WT的平均10.2ng神经酰胺/mg蛋白至Hsp70转基因iMEF的14.9ng/mg，通过脂质提取和随后的脂质质谱对iMEF的神经酰胺谱的进一步分析印证了这些发现。由于本发明人还表征了荷载rHsp70的U-2-OS细胞的谱(即300nM rHsp70的完全培养基24小时，类似于本文提供的所有其它Hsp70内吞试验)，本发明人进一步证明，这种作用可归功于Hsp70的作用。荷载Hsp70的U-2-OS细胞中神经酰胺的定量表明了神经酰胺的累积水平由对照细胞的2.99ng神经酰胺/mg蛋白提高至荷载Hsp70细胞的5.10ng/mg(该实验在写作时仅作一次)。然而，虽然还需要进一步的验证，但总体来说这些都支持Hsp70在调节细胞中神经酰胺水平的作用。然而，如果这些数据得到证明，则产生了一系列的问题，例如神经酰胺物质的区分、特定神经酰胺物质的定量(至少有50种不同的分子种类)、面临各种应激时的神经酰胺水平谱图和细胞的转化态等。
有趣的是，之前的研究已经解决了这些问题中的一个，其证明热休克(42.5℃持续2小时)引起神经酰胺在Molt-4急性白血病淋巴细胞中的集聚。这种集聚可被药物抑制剂伏马毒素B1(Fumonisin B1)和多球壳菌素(myriocin)阻断，伏马毒素B1被认为是神经酰胺体内合成途径的特定抑制剂并且其阻断了丝氨酸棕榈酰转移酶的作用，而丝氨酸棕榈酰转移酶启动体内由丝氨酸和棕榈酰-CoA合成新鞘脂。已经在酵母中阐明了神经酰胺体内合成的这种提高的部分机制，其中，在酵母中热应激诱导丝氨酸向ER的急速流入，由此促进体内合成。这些药物抑制剂是否可以调节在rHsp70内吞后观察到的神经酰胺水平的提高或者观察到的提高是否源于鞘脂降解的代谢途径和Hsp70与BMP结合对其的刺激，这种验证是有趣的。当然，还可能假设化合物模型。在该模型中，初始热应激可能导致膜流化，丝氨酸流动和体内鞘脂合成的快速启动。因此，作为热应激的后果，Hsp70的诱导可导致细胞内Hsp70水平的提高、Hsp70与BMP的相互作用、aSMase活性和可能的SAP活性的提高，而SAP活性的提高可通过代谢途径产生神经酰胺。这种二级应答可能补充初始从头诱导或者可能接过初始从头诱导，因为连续的从头应答将依赖于丝氨酸和棕榈酰-CoA的连续供应。然而，还需要测定细胞保护是否是神经酰胺本身增加的结果，或者可能是由于其上游和下游代谢物水平的改变造成的。
从这点看，许多主要问题仍需解答：Hsp70如何在细胞外环境和内溶酶体区室内终结？Hsp70是被分泌并然后通过内吞摄取？还是Hsp70存在于溶酶体内或者更专门的分泌溶酶体内，等待应激形式的释放信号？并且，可能更重要的是，细胞外环境中存在的Hsp70的生物意义是什么？
虽然本发明的工作不能解答这些复杂的问题，但能够作出一些推理。首先，Hsp70可能在本课题中所检测的所有细胞系中被内吞，认为这是识别细胞外Hsp70(eHsp70)的一般途径。这与证明eHsp70能够与不同白细胞亚群上的多种受体结合的数据一致。参与细胞外Hsp70(eHsp70)识别的受体主要包括模式识别受体(PPP)并由来自不同受体家族(例如toll样受体(TLR)、清道夫受体和C型凝聚素)的多种受体构成。由于本课题的工作并没有解决Hsp70被内吞的初始机制(受体介导、依赖于筏、依赖于网格蛋白)，在本发明的系统中不能确定PPP是否负责eHsp70的内吞。然而，10倍过量的无标记Hsp70不能与U-2-OS细胞或iMEF摄取的标记有AF488的Hsp70竞争，相反，在过量无标记Hsp70存在下内吞被显著增强，这在一定程度反驳了摄取的可饱和机制。
免疫学领域主要焦点在于由eHsp70与PRRs的结合引发的细胞因子应答和先天免疫防御的激活，并且因此对受体结合和信号传导开始后eHsp70的作用没有太多关心。
虽然关于仍然缺乏这些惊人机制的令人满意的分子解释，但本文一定程度上解决了Hsp70向细胞外环境释放和Hsp70的作用的机制。不过，存在大量关于Hsp70在应激后存在于循环系统中的证据，并且大量数据支持了eHsp70(无论是应激诱导的还是外源递送的)在神经保护和准备初级免疫防御系统中的作用。关于Hsp70的释放，第一个关于Hsp70从一个细胞转移至另一个细胞的证据来自乌贼巨大神经索中的研究，并且在所培养的大鼠胚胎细胞中重现这些结果时，出现了胞吐的非典型途径可能负责Hsp70的释放的证据。
已经提出，Hsp70和其它热休克蛋白仅在病理条件下释放，引起坏死性死亡，而不在程序性细胞死亡过程中释放。然而，最近的研究表明，Hsp70可以由主动机制从完整细胞释放，并且刺激程度决定释放的模式。重要的是，虽然在身体锻炼时可在外周血中检测到eHsp70的大量增加，但已知研究没有eHsp70和肌肉损伤标记物之间的直接相互关系的报道。最令人信服的并且可能也是最诱人的是，发现诸如掠食性恐惧和电击的心里应激能够引发应激诱导的eHsp70释放(这被认为是一个依赖于儿茶酚胺信号过程)。由于儿茶酚胺α1-肾上腺素受体可导致细胞内钙流通，并且钙流通可引起外来体、多泡体和溶酶体的胞吐，因此这尤其有趣。因此，在应激时间内，作用于α1-肾上腺素受体的去甲肾上腺素的增加可能导致细胞内的钙流通，随后为Hsp70向外来体内的释放。该假说的证据来自eHsp70可由外来体特征的小泡释放的实证，但还存在在细胞系统和体内eHsp70可作为游离eHsp70释放的证据。虽然这还存在争议，但还证明了eHsp70的释放需要脂质筏。此外，已经证明功能溶酶体区室是eHsp70释放必须的，并且这种释放伴随着溶酶体标记物蛋白在细胞表面的存在，提示这是依赖于质膜和溶酶体膜融合的分泌。
不管所释放的Hsp70是否存在于外来体中或作为游离eHsp70，有趣的是，注意到一些类型的分泌MVB/晚期内涵体/溶酶体区室明显地参与到所有释放方式中。在这些数据和本文获得的结果的基础上，可以形成Hsp70如何从胞质逃至细胞外环境的更复杂的假说。Hsp70的释放仍依赖于细胞内钙的增加，原因是这可作为内溶酶体胞吐的信号。然而，如本文所述，由于Hsp70将大量集聚在晚期内涵体/MVB/溶酶体的含有BMP的内膜中，Hsp70在该区室内的存在将依赖于Hsp70和BMP相互作用。由于如本文所述，或者通过早期和晚期内涵体和溶酶体的周界膜的内陷，从细胞外摄取(例如内吞)的Hsp70可到达晚期内涵体和溶酶体中，从而使细胞内的Hsp70和BMP接近。所述区室的酸性将维持使Hsp70定位至含BMP膜的强的偏好。胞吐后，一些Hsp70仍与含BMP的外来体结合，但在细胞外环境中遇到的中性pH将使此时的Hsp70-BMP平衡明显地向更多的未结合Hsp70的方向偏移，产生游离和与外来体结合的Hsp70，然后这些Hsp70可发挥细胞外功能。
总之，本文提供的数据表明，Hsp70与内溶酶体阴离子磷脂BMP直接且pH依赖性地相互作用。本发明人证明，Hsp70与BMP的结合由包含色氨酸90的Hsp70 ATPase结构域介导，并且这种相互作用可能通过影响其它BMP结合蛋白的活性而引起内溶酶体膜的稳定。本发明人还证明，该分子机制的阐明开启了用于使癌细胞对通过特异抑制Hsp70的溶酶体稳定功能而诱导溶酶体细胞死亡途径的试剂敏感的惊人的新可能。反之亦然，Hsp70和BMP之间的相互作用可能提供了依赖于外源施用的Hsp70的溶酶体稳定功能产生的细胞保护作用的新治疗策略。
实施例2：Hsp70和二(单酰基甘油)磷酸酯之间的相互作用激活了酸性鞘磷脂酶，稳定了溶酶体膜并促进了细胞存活
热休克蛋白70(Hsp70)是在进化上高度保守的分子伴侣，其通过抑制溶酶体膜通透化(应激诱导的细胞死亡的特点)而促进受应激的细胞的存活。该作用的分子机制的线索可能在于最近报道的应激相关和癌症相关的少部分Hsp70至溶酶体区室的转移。在此，本发明人证明Hsp70通过增强酸性鞘磷脂酶(ASM，将鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酸胆碱的溶酶体酯酶)而稳定溶酶体。在酸性环境中，Hsp70以高亲合性和高特异性与内溶酶体阴离子磷脂二(单酰基甘油)磷酸酯(BMP，ASM的主要辅因子)结合，由此促进ASM与BMP的结合并刺激ASM活性。BMP抗体或Hsp70中的点突变(W90A)对Hsp70-BMP相互作用的抑制以及地昔帕明对ASM活性的抑制有效地逆转了Hsp70介导的溶酶体稳定作用。显著地，A型尼曼-皮克病(NPDA，由ASM基因的突变引起的严重的溶酶体贮积症)患者细胞中ASM活性的降低还与溶酶体稳定性的大幅降低有关，并且可通过用重组Hsp70或ASM处理来恢复溶酶体ASM活性而有效地纠正这种表型。总之，这些数据开启了利用通过内吞递送途径进入溶酶体腔的非细胞渗透性化合物治疗溶酶体贮积症和癌症的惊人可能。
溶酶体蛋白酶，即组织蛋白酶，是由多种应激诱导的进化保守性细胞死亡程序中的重要因子。组织蛋白酶依赖性细胞死亡的特征在于早期溶酶体膜通透化和随后组织蛋白酶向胞质的转移，组织蛋白酶在此能够启动caspase依赖性和caspase非依赖性细胞死亡途径。为了测定溶酶体定位是否对所报道的Hsp70稳定溶酶体膜并保护细胞免受细胞应激诱导的细胞死亡的能力至关重要，本发明人利用细胞内吞机器以使重组Hsp70(rHsp70)靶向至溶酶体内。用标记有荧光团的rHsp70温育的U-2-OS骨肉瘤细胞的免疫细胞化学和生物化学分析表明了rHsp70的有效摄取，其与晚期内涵体标记物和溶酶体标记物的共定位以及与溶酶体膜的结合(图5a、b和图9)。通过利用实时成像监测溶酶体膜的完整性(图5c)，本发明人证明内吞的rHsp70保护溶酶体免受光致氧化(图5d)。此外，特异于Hsp70的小干扰RNA(siRNA)使溶酶体对光致氧化敏感，并且通过内吞rHsp70完全逆转了这种作用，这证明内源性Hsp70的保护作用是由溶酶体腔内的小部分蛋白介导的(图5e)。尽管摄取类似(数据未显示)，但是重组Hsc70和Hsp70-2(其与Hsp70分别具有86％和84％的氨基酸序列同源性)没有观察到溶酶体定位。
Hsp70在溶酶体膜中的存在以及其在产生水解作用的溶酶体环境中存活，这提示其与溶酶体膜脂质结合。因此，本发明人研究了Hsp70与包含多种膜相关阴离子脂质，即棕榈酰基-油酰基-磷脂酰丝氨酸(POPS；主要存在于质膜中)、心磷脂(主要存在于线粒体中)和BMP(主要存在于晚期内涵体和溶酶体中))的棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)大单层囊泡(LUV)的相互作用。考虑到内溶酶体区室在成熟为溶酶体后环境酸性的提高，本发明人对中性(pH 7.4)和酸性(pH 6.0)条件下的蛋白-脂质相互作用进行了比较。在pH 7.4时，rHsp70引起POPC溶酶体中90°光散射的小的相对变化，表明非常弱地结合。如之前关于POPS的报道，不论脂质体表面的电荷密度(从-1至-2)，所有带负电荷的脂质都使rHsp70与溶酶体在中性pH下的结合增强了约4倍，(图6a)。显著地，与中性pH相比，在酸性pH下与BMP的结合增强几乎20倍，而与POPS的结合在酸化后仅略有提高(图6a)。Hsp70与BMP在酸性pH下的高亲合性在一组独立的BIAcore实验中得到验证(图6e和图7a)。重要的是，通过内吞作用递送至内溶酶体区室的BMP抗体有效抑制了rHsp70在活细胞中稳定溶酶体的能力(图6b)，并使细胞对诱导溶酶体泄漏的抗癌药顺铂敏感(图6c)。
为了研究Hsp70的哪部分负责结合BMP，本发明人测定了rHsp70色氨酸及其突变体在停靠在含BMP的脂质体中后色氨酸的荧光转移。缺乏氨基末端ATPase结构域(rHsp70-ΔATP)内的第119-426氨基酸的Hsp70突变体丧失相对峰荧光强度信号，而缺乏羧基末肽结合结构域(rHsp70-ΔPBD)中的第437-617氨基酸的突变体则没有丧失相对峰荧光强度信号，这表明Hsp70与BMP的高亲合力结合需要ATPase结构域(图6d)。接着，本发明人用苯丙氨酸取代Hsp70中的两个色氨酸(W90F和W580F)并研究了哪个色氨酸负责脂质结合诱导的荧光转移。仅rHsp70-W90F的信号具有减少表明，所述蛋白的NH2-末端停靠在脂质层中(图6d)。对BMP-rHsp70相互作用的更量化的BIAcore分析证明，Hsp70主要通过其ATPase结构域与BMP相互作用(图6e)。令人吃惊的是，W90F突变特异性地消除了rHsp70与BMP之间的相互作用，同时保留了Hsp70分子伴侣的结构(通过远UV圆二色性和近UV圆二色性分析的折叠)和功能(荧光酶折叠和ATP水解)方面(图6e以及未显示的数据)。因此，rHsp70-W90F突变体意外地为本发明人提供了用于进一步测定Hsp70和BMP之间的直接相互作用是否使Hsp70具有溶酶体保护性质的无价工具。确实，rHsp70-W90F突变体完全丧失了其保护溶酶体膜免受光致氧化和保护细胞免受顺铂诱导的溶酶体细胞死亡的能力，而rHsp70-W580F突变体显示与野生型蛋白相同的功效。重要的是，突变Hsp70蛋白的内吞效果与野生型Hsp70基本相同(数据未显示)。因此，本发明人得出结论，Hsp70与BMP的结合对于Hsp70的溶酶体稳定作用至关重要。
由于内吞小泡中BMP的浓度随内涵体成熟以形成溶酶体而提高，所以pH调节可能是使Hsp70靶向至溶酶体的方式。计算(PROTPARAM，EXPaSy蛋白质组学服务器，瑞士生物信息研究所)表明，Hsp70的ATPase结构域的理论pI比肽结合结构域高1.72个单位(6.62与4.9)。该特征表明，在酸性pH时，ATPase结构域优选带正电荷，这可能有利于其与阴离子脂质的相互作用。本发明人的证明Hsp70-BMP相互作用对酸性pH和ATPase结构域的依赖性的数据支持了该理论。此外，Hsp70的ATPase结构域的静电表面的分子模建表明，Hsp70的ATPase结构域形成接近楔样的结构，并且在包含W90的楔的底部具有大量正电荷，这可能解释了W90F突变对Hsp70的与BMP相互作用并稳定溶酶体的能力产生的深刻影响。
BMP以高亲合力与ASM结合，并刺激其将鞘磷脂水解成神经酰胺饱和磷酸胆碱的能力。BIAcore分析表明，用亚-等摩尔(sub-equimolar)浓度的rHsp70预处理含BMP的LUV有利于ASM的随后结合，而较高的rHsp70浓度则显示抑制作用(图7a和10)。显著的是，具有免受应激诱导的溶酶体损伤的保护的Hsp70转基因鼠胚胎成纤维细胞(Hsp70-MEF)(图7e)显示了比野生型MEF(WT-MEF)显著高的ASM活性，并且用细胞保护浓度(300nM)的rHsp70处理WT-MEF将ASM的活性提高至与Hsp70-MEF相当的水平(图7b)。为了测定ASM是否负责溶酶体稳定作用，本发明人用被完全表征的药理学ASM抑制剂地昔帕明处理细胞。地昔帕明以剂量依赖方式降低了MEF的存活性，并且细胞死亡与由溶酶体组织蛋白酶向胞质中的泄漏证明的大量溶酶体通透化有关(图7c和d)。显著的是，与WT-MEF相比，在Hsp70-MEF中地昔帕明-诱导的细胞死亡和溶酶体泄漏被显著降低。此外，如在光致氧化后加速了溶酶体膜完整性的丧失所证明的，用亚毒性浓度的地昔帕明抑制ASM将Hsp70-MEF的溶酶体应激抗性逆转至WT-MEF的水平。证明NPDA(由ASM基因突变引起的致命的溶酶体贮积症)患者成纤维细胞中的溶酶体显示对光致氧化诱导的损伤的敏感性的数据进一步支持了ASM的溶酶体保护作用(图8a)。显著地，rHsp70还能够增强患者细胞中内源性突变ASM和同时荷载的rASM的酶促活性。通过使溶酶体荷载rHsp70、rASM或前述两者的组合获得的ASM活性的提高与其在NPDA细胞中稳定溶酶体和使大幅扩大的溶酶体区室的体积规格化的能力有关(图8b-d)。应该注意，类似于rHsp70，rASM也位于溶酶体中(图8b)。
本发明的全部数据表明，Hsp70-BMP相互作用通过包括鞘磷脂代谢的调节而非膜的直接物理稳定化的机制稳定溶酶体。BMP全部位于内溶酶体区室的内膜中(在此，其主要功能是支持ASM和鞘脂激活因子蛋白对脂质小泡的分裂和从脂质小泡提取脂质)的事实支持了此种间接作用。有趣的是，ASM介导的溶酶体神经酰胺浓度的增加修饰了溶酶体膜的立体构象并由此促进了其与其它细胞内小泡和质膜的融合。因此，溶酶体膜组成和体积的改变(作为神经酰胺诱导的增强的融合能力的结果)可有助于Hsp70介导的溶酶体稳定性的提高。另一方面，多种凋亡刺激物诱导ASM向质膜外小叶转位，在此，神经酰胺可以形成功能是作为凋亡信号传导中涉及的膜相关信号分子的激活位点的脂质微结构域。因此，神经酰胺可以对细胞存活产生相反作用，这取决于神经酰胺产生于溶酶体内部或者质膜上。上述潜藏在Hsp70的细胞保护作用之下的分子机制开启了用于使癌细胞对通过特异抑制Hsp70的溶酶体稳定功能而诱导溶酶体细胞死亡途径的试剂敏感的令人兴奋的新可能。反之亦然，外源单独施用rHsp70或与rASM组合施用都可直接作为NPD患者的新疗法，其中，目前用于所述NPD患者的治疗选择限于基因治疗和干细胞治疗。
方法概述
根据现有技术的描述产生了WT-MEF和Hsp70-MEF，对其进行永生化并保持。人NPDA成纤维细胞(83/24)起源自患有肝脾大的5月龄患者的皮肤活检。利用pET-16b载体系统和Ni2+-亲合-纯化(Novagen)产生重组蛋白，并根据厂商的说明用Alexa Fluor 488(Molecular Probes)标记。为了分析溶酶体的完整性，本发明人形成了用吖啶橙(在细胞的酸性区室中集聚的因光异色的弱碱)染色的细胞实时成像方法，将所述细胞染成红色并使其对光致氧化敏感。通过Zeiss LSM DUO软件，成纤维细胞中光致氧化诱导的溶酶体pH梯度的丧失和吖啶橙自单个溶酶体向胞质中的泄漏被可视地量化为U2-O-S细胞中“红点的消失”和红色的减少以及绿色荧光的增加。按照现有技术的描述，利用zFR-AFC(Enzyme System Products)探针在地高辛处理的样本中测定总的组织蛋白酶活性和胞质的(地高辛提取的)组织蛋白酶活性。基本按照现有技术的描述，在HEPES缓冲液(20mM HEPES，0.1mM EDTA，所示pH)中分析色氨酸荧光谱(RFI)和脂质体90°光散射(RSI)。按照现有技术的描述，通过BIAcore 2000利用固定化的LUV进行表面等离子共振。利用Oligofectamine(Invitrogen)转染Hsp70 siRNA(5′-GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3′)和对照Hsp70 siRNA。利用标准方法进行免疫检测。基本按照现有技术分析凋亡样细胞死亡和溶酶体膜通透化。通过经现有技术描述修饰的Molecular Probes的Amplex Red Sphingomyelinase Assay Kit(A12220)分析ASM活性。利用双侧成对学生T检验进行统计学分析，并且利用F-检验检验所有数据组的所有方差的可比性。
方法
细胞培养和试剂在补充有6％的热灭活小牛血清和青霉素-链霉素的RPMI 1640(Invitrogen)中培养人U-2-OS骨肉瘤细胞系。按照现有技术的描述，产生Hsp70转基因iMEF和适当的对照iMEF，并维持。人原代NPDA成纤维细胞生长在进一步补充有1％丙酮酸钠、1％HEPES、1％L-谷氨酰胺的MEF培养基中。所有细胞都在含有5％CO2的37℃加湿空气气氛下培养，反复测定并确定支原体阴性。除非另有说明，所有化学物质都购自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich Denmark A/S)。
溶酶体完整性的测定在补充有3％胎牛血清的Hanks平衡盐溶液中洗涤、照射并分析利用2μg/ml吖啶橙在37℃温育15分钟的亚汇合细胞。以透射光模式从各个孔的8个预定区域选择用于单细胞成像的细胞，之后立即可视化并暴露在来自安装在U-ULS100HG housing(Olympus)中的USH102 100W汞弧灯(Ushio electric)的蓝光下20秒。在具有LCPlanF1 x20物镜(NA＝0,40)的Olympus IX-70倒置显微镜上进行荧光显微检测。通过计数强的红色染色的损失而对溶酶体pH梯度的损失进行定量。研发了用于检测溶酶体完整性的更成熟的方法以处理该研究使用的各种成纤维细胞的较大的溶酶体区室。以透射光模式从各个孔的8个预定区域选择用于单细胞成像的细胞，之后使同样的细胞立即并持续暴露在来自100mW二极管激光的489nm光下，同时在Zeiss LSM LIVE DUO共聚焦系统上每隔330ms在由用于495-555nm(绿色)和LP650nm(红色)光的带通滤波器限定的两个通道中捕获激光扫描显微照片。随后通过完整的Zeiss LSM DUO软件分析所产生的延时电影(timelapse movie)。按照现有技术的描述，利用zFR-AFC(Enzyme System Products)探针在地高辛处理的样本中测定总的组织蛋白酶活性和胞质的(地高辛提取的)组织蛋白酶活性。
细胞存活率试验通过基本按照现有技术的描述，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)还原试验分析细胞密度。通过利用0.05μg/ml Hoechst 33342(Molecular Probes)对细胞染色并在倒置的Olympus IX-70荧光显微镜(Filter U-MWU 330-385nm)下对具有缩聚细胞核的细胞计数来评价凋亡样细胞死亡。对于各个试验，对最小八个随机选取的区域进行计数。
免疫检测和显微镜方法所使用的一抗包括针对Hsp70的小鼠单克隆抗体(2H9；由Boris Margulis，Russian Academy of Sciences，St.Petersburg，Russia惠赠)，针对3-磷酸甘油醛脱氢酶的小鼠单克隆抗体(GAPDH；Biogenesis)，针对BMP的小鼠单克隆抗体(6C4)，针对溶酶体膜内在蛋白-1的小鼠单克隆抗体(H5C6；由J.Thomas August和James E.K.Hildreth开发，并获自在NICHD资助下开发的并由美国爱荷华市的爱荷华大学生物科学系维护的发育研究杂交瘤库)。利用所示的一抗、来自Dako，ECL Western blotting reagents(Amersham)的结合有过氧化物酶的适当二抗和Luminescent Image Reader(LAS-1000Plus，Fujifilm)对通过10％SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜上的蛋白进行检测。使用了结合有Alexa Fluor
Figure BPA00001311158301061
-576的二抗或结合有Alexa Fluor-488的二抗用于免疫细胞化学。使用溶酶体红色荧光探针
Figure BPA00001311158301063
(Lysotracker Red
Figure BPA00001311158301064
)用于溶酶体区室的生动可视化。利用Zeiss Axiovert 100M激光扫描显微镜拍摄荧光图片。在Zeiss LSM LIVE DUO系统上进行溶酶体完整性的溶酶体荧光探针(Lysotracker)定量和延时摄影。
色氨酸荧光谱和脂质体90°光散射利用由基本如之前所述的脂质组成的LUV在HEPES缓冲液(20mM HEPES，0.1mM EDTA，所示的pH7.4或6.0)中分析色氨酸荧光谱(RFI)和脂质体90°光散射(RSI)。对于RFI，将LUV加入到10μM试样量中，并在20分钟的稳定期后记录光谱。对于RSI，将重组蛋白加入到0.12nmol试样量中。
表面等离子共振(BIAcore)为了制备LUV，将由溶解在有机溶剂中的10mol％鞘磷脂、50mol％磷脂酰胆碱、20mol％胆固醇和20mol％BMP构成的脂质混合物在氩气流下干燥，并在Tris/HCl缓冲液(pH 7.4)中再水化。将所述混合物在液氮中然后在37℃的孵箱中冻融9次。在超声浴中持续15分钟后，使混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜21次。利用BIAcore 2000系统在25℃进行表面等离子共振测定。将包含PBS(上样缓冲液)中的LUV(总脂质浓度为0.1mM)固定在L1传感芯片(BIAcore)的表面。所使用的运行缓冲液为醋酸钠缓冲液(50mM，pH 4.5)。作为对照，向脂质体表面直接注射酸性磷脂酶(0.2μM，包含在60μl运行缓冲液中)。获得4100RU-5250RU的响应单位。以20μl/分钟的流速将所示浓度的感兴趣蛋白注射在运行缓冲液中。注射后，附加10分钟的解离阶段。在rASM跟随rHsp70的情况下，在10分钟的rHsp70-解离阶段后，加入rASM180秒钟，之后仍为10分钟的解离阶段。
分子模建利用从瑞士生物信息研究所的Expert Protein Analysis System(EXPaSy)蛋白组学服务器(http://expasy.org/)获得的软件进行初级结构分析和分子模建。利用DeepView-Swiss PDB Viewer在人Hsp70-ATPase结构域(pdb码：1S3X)和人Hsc70底物结合结构域(pdb码：7HSC)的晶体结构的基础上，进行分子模建。使用介电常数为80(H2O)，使表面模型基于pH 7.0的库伦相互作用。
统计学分析为了评价零假设，利用双侧成对学生T检验进行统计分析。统计学显著性的截断水平设定为5％，并利用F-检验对所有组数据的方差可比性进行检验。所有统计都基于最小n＝3的独立试验。
实施例3：苯甲醇对溶酶体贮存病的影响
在实施例2和3中证明了，Hsp70通过与BMP的相互作用而具有溶酶体稳定作用。为了评价当使细胞暴露在Hsp70化学诱导物时是否也可以观察到这种作用，利用Hsp70的小分子诱导物苯甲醇(BA)处理A型尼曼-皮克病(NPDA)患者的成纤维细胞。结果示于图11。首先，利用剂量逐增的BA(0、20mM、30mM、35mM、40mM、45mM)处理NPDA细胞，裂解细胞并通过蛋白印迹进行分析。将同样量的蛋白上样至各个孔中。针对各个情况评价Hsp70蛋白表达，显示BA以剂量依赖的形式诱导Hsp70表达(一抗：Hsp70特异性的Stressgen SPA-810)。接着，利用如实施例2中所述的同一方法评价用40mM BA处理后NPDA 
Figure BPA00001311158301081
溶酶体的稳定性。在对BA的应答中观察到了溶酶体稳定性的提高。最后，利用如实施例2中所述的同一方法评价用40mM BA处理后NPDA 
Figure BPA00001311158301082
细胞的溶酶体横截面积。观察到病理减轻。
项
1.调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所述方法包括施用Hsp70或其所述功能片段并从而调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的步骤，其中所述Hsp70或其所述功能片段为适合使BMP和Hsp70或其功能片段之间相互作用的形式。
2.如第1项所述的方法，其中，Hsp70或其所述功能片段与BMP形成共价复合物或非共价复合物。
3.如前述任一项所述的方法，其中，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。
4.如第3项所述的方法，其中，所述鞘脂激活蛋白选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
5.如前述任一项所述的方法，其中，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、葡糖神经酰胺酶和酸性神经酰胺酶。
6.Hsp70或其功能片段，其用作药物。
7.Hsp70或其功能片段，其用于治疗、减轻或预防溶酶体贮积症。
8.如第7项所述的应用，其中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、戈谢病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病。
9.提高化合物的摄取的方法，所述方法包括将所述化合物和Hsp70或其功能片段一起施用的步骤。
10.如第9项所述的方法，其中，所述Hsp70或其功能片段与所述化合物共价结合。
Figure IPA00001311157800021
Figure IPA00001311157800031
Figure IPA00001311157800041

Claims (79)

1.能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其作为药物或用于溶酶体贮积症的治疗。
2.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂为Hsp70或其功能片段或变体。
3.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体与野生型Hsp70蛋白具有100％的同源性。
4.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体与野生型Hsp70蛋白具有99.9-95％的同源性，例如95-90％的同源性，如90-85％的同源性，例如85-80％的同源性，如80-75％的同源性，例如75-60％的同源性。
5.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70。
6.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70是全长Hsp70。
7.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂为Hsp70的功能片段或变体。
8.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长小于641个氨基酸，如小于625个氨基酸，例如小于600个氨基酸，如小于575个氨基酸，例如小于550个氨基酸，如小于525个氨基酸，例如小于500个氨基酸，如小于475个氨基酸，例如小于450个氨基酸，如小于425个氨基酸，例如小于400个氨基酸，如小于375个氨基酸，例如小于350个氨基酸，如小于325个氨基酸，例如小于300个氨基酸，如小于275个氨基酸，例如小于250个氨基酸，如小于225个氨基酸，例如小于200个氨基酸，如小于175个氨基酸，例如小于150个氨基酸，如小于125个氨基酸，例如小于100个氨基酸，如小于75个氨基酸，例如小于50个氨基酸，如小于25个氨基酸。
9.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长大于10个氨基酸，如大于25个氨基酸，例如大于50个氨基酸，如大于75个氨基酸，例如大于100个氨基酸，如大于125个氨基酸，例如大于150个氨基酸，如大于175个氨基酸，例如大于200个氨基酸，如大于225个氨基酸，例如大于250个氨基酸，如大于275个氨基酸，例如大于300个氨基酸，如大于325个氨基酸，例如大于350个氨基酸，如大于375个氨基酸，例如大于400个氨基酸，如大于425个氨基酸，例如大于450个氨基酸，如大于475个氨基酸，例如大于500个氨基酸，如大于525个氨基酸，例如大于550个氨基酸，如大于575个氨基酸，例如大于600个氨基酸，如大于625个氨基酸。
10.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体具有的氨基酸取代为Hsp70的0.1-1％的氨基酸残基，如1-2％的氨基酸残基，例如2-3％的氨基酸残基，如3-4％的氨基酸残基，例如4-5％的氨基酸残基，如5-10％的氨基酸残基，例如10-15％的氨基酸残基，如15-20％的氨基酸残基，例如20-30％的氨基酸残基，如30-40％的氨基酸残基，例如40-50％的氨基酸残基，如50-60％的氨基酸残基，例如60-70％的氨基酸残基，如70-80％的氨基酸残基，例如80-90％的氨基酸残基，如90-100％的氨基酸残基。
11.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长为5-25个氨基酸，如25-50个氨基酸，例如50-75个氨基酸，如75-100个氨基酸，例如100-125个氨基酸，如125-150个氨基酸，例如150-175个氨基酸，如175-200个氨基酸，例如200-225个氨基酸，如225-250个氨基酸，例如250-275个氨基酸，如275-300个氨基酸，例如300-325个氨基酸，如325-350个氨基酸，例如350-375个氨基酸，如375-400个氨基酸，例如400-425个氨基酸，如425-450个氨基酸，例如450-475个氨基酸，如475-500个氨基酸，例如500-525个氨基酸，如525-550个氨基酸，例如550-575个氨基酸，如575-600个氨基酸，例如600-625个氨基酸，如625-640个氨基酸。
12.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体包含Hsp70的ATPase结构域的全部或部分。
13.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体在Hsp70ATPase结构域的第90位氨基酸位置包含色氨酸。
14.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体为重组Hsp70(rHsp70)。
15.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70源自选自人(homo sapiens)、小鼠(mus musculus)、牛、狗、大鼠、鼬、猪、绵羊和猴的哺乳动物。
16.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70诱导物或辅诱导物。
17.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70诱导物。
18.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70辅诱导物。
19.如权利要求18所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70辅诱导物是羟胺衍生物。
20.如权利要求19所述的生物活性剂，其中，所述羟胺衍生物选自氯吡哌醇(BRLP-42)、Arimoclomol(BRX-220)、BRX-345和BGP-15。
21.如权利要求19所述的生物活性剂，其中，所述羟胺衍生物是Arimoclomol(BRX-220)。
22.如权利要求17所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70诱导物是膜流化剂。
23.如权利要求22所述的生物活性剂，其中，所述膜流化剂选自苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇、利多卡因、罗哌卡因、布比卡因和马比佛卡因。
24.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70诱导物或辅诱导物选自依地福新(ET-18-OCH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱)、塞来昔布、罗非昔布、乙酰水杨酸、水杨酸钠、吲哚美辛、PGA1、PGj2、2-环戊烯-1-酮、过氧化物酶增殖物激活型受体γ-激动剂、长春新碱、紫杉醇、吡格列酮、卡铂、多柔比星、氟达拉滨、异环磷酰胺、阿糖胞苷、格尔德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤壳菌素、除莠霉素-A、花生四烯酸、MG132、乳胞素、DCIC、TLCK和TPCK、替普瑞酮(GGA)、瑞巴匹特、甘珀酸、聚普瑞锌(L-肌肽锌)、地塞米松、可卡因、烟碱、醇、α-肾上腺素激动剂、环戊烯酮前列腺素、芍药苷、甘草甜素、雷公藤红素、二氢雷公藤红素、二氢雷公藤红素二乙酸酯和姜黄素。
25.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是亚致死热疗。
26.如权利要求25所述的生物活性剂，其中，所述亚致死热疗包括提高个体的温度至约38℃的核心温度，如约39℃，例如约40℃，如约41℃，例如约42℃，如约43℃的核心温度。
27.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂包括Hsp70或其功能片段或变体和Hsp70诱导物或辅诱导物的组合。
28.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂包括Hsp70或其功能片段或变体和提高Hsp70和BMP之间的相互作用的物质的组合。
29.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述治疗为预防、治愈或改善。
30.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白缺乏病。
31.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂经肠胃外施用于有此需要的个体。
32.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是静脉内、皮下、肌内、动脉内、皮下或腹膜内注射。
33.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是静脉内输注。
34.如权利要求33所述的生物活性剂，其中，所述静脉内输注进行的时间为10分钟-20分钟，如20-30分钟，例如30-40分钟，如40-50分钟，例如50-60分钟，如60-90分钟，例如90-120分钟，如2小时-3小时，例如3-4小时，如4-5小时，例如5-6小时，如6-7小时，例如7-8小时。
35.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是经粘膜递送。
36.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是舌下递送。
37.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是口含递送。
38.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是吹入递送。
39.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是鼻内递送。
40.Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。
41.调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP(二(单酰基甘油)磷酸酯)相互作用，所述方法包括以下步骤：
i)施用权利要求1-39中任一项所述的生物活性剂，
ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，和
iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述Hsp70与BMP形成共价或非共价复合物。
43.如权利要求41所述的方法，其中，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述鞘脂激活蛋白选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
45.如权利要求41所述的方法，其中，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶(aSMase)、酸性神经酰胺酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖神经酰胺酶、唾液酸酶和芳基硫酸酯酶。
46.如权利要求41所述的方法，其中，所述酶促活性的调节是所述酶促活性的提高。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述酶促活性的提高是提高1-5％，如5-10％，例如10-15％，如15-20％，例如20-25％，如25-30％，例如30-35％，如35-40％，例如40-45％，如45-50％，例如50-60％，如60-70％，例如70-80％，如80-90％，例如90-100％，如100-120％，例如120-140％，如140-160％，例如160-180％，如180-200％，例如200-250％，如250-300％，例如300-400％，如400-500％，例如500-750％，如750-1000％，例如1000-1500％，如1500-2000％，例如2000-5000％。
48.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用权利要求1-39中任一项所述的生物活性剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述治疗为预防、治愈或改善。
50.如权利要求48所述的方法，其中，所述治疗延长了有此需要的所述个体的预期寿命。
51.如权利要求48所述的方法，其中，所述预期寿命提高了6个月-1年，如1年-2年，例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6-7年，如7-8年，例如8-9年，如9-10年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90年，如90-100年。
52.如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白缺乏病。
53.如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病的特征是在细胞内积聚的鞘脂增加。
54.如权利要求53所述的方法，其中，所述治疗将细胞内积聚的鞘脂降低了至少5％，如至少10％，例如至少15％，如至少20％，例如至少25％，如至少30％，例如至少35％，如至少40％，例如至少45％，如至少50％，例如至少55％，如至少60％，例如至少65％，如至少70％，例如至少75％，如至少80％，例如至少85％，如至少90％，例如至少95％，如至少100％。
55.如权利要求54所述的方法，其中，所述鞘脂选自鞘磷脂、神经酰胺、半乳糖苷神经酰胺、球形三酰神经酰胺、糖基神经酰胺、GM3和硫脑苷脂。
56.如权利要求48所述的方法，其中，所述生物活性剂被配制为药物组合物。
57.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为A型尼曼-皮克病或B型尼曼-皮克病。
58.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为法伯氏病。
59.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为克拉伯病。
60.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为唾液酸贮积病。
61.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为异染性脑白质营养不良。
62.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为戈谢病。
63.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为法布里病。
64.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为鞘脂激活蛋白缺乏病。
65.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病的特征是具有与所述疾病病理相关的缺陷酶的残余酶促活性。
66.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述残余酶促活性为0.1％-50％，如0.1-1％，例如1-2％，如2-3％，例如3-4％，如4-5％，例如5-6％，如6-7％，例如7-8％，如8-9％，例如9-10％，如10-11％，例如11-12％，如12-13％，例如13-14％，如14-15％，例如15-20％，如20-25％，例如25-30％，如30-35％，例如35-40％，如40-45％，例如45-50％的残余酶促活性。
67.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括施用权利要求1-39中任一项所述的生物活性剂和至少一种其它治疗形式的组合。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是用于溶酶体贮积病的常规或已知治疗形式。
69.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式同时或序贯施用。
70.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是酶替代疗法(ERT)。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述ERT选自Cerezyme
Figure FPA00001311158200081
(注射用伊米苷酶)、美格鲁特、Fabrazyme
Figure FPA00001311158200082
(β半乳糖苷酶)和利甫盖素(α半乳糖苷酶)。
72.如权利要求67所述的方法，其中，向患有戈谢病的个体施用所述生物活性剂和Cerezyme(注射用伊米苷酶)或美格鲁特的组合。
73.如权利要求67所述的方法，其中，向患有法布里病的个体施用所述生物活性剂和Fabrazyme(β半乳糖苷酶)或利甫盖素(α乳糖苷酶)的组合。
74.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是止痛物品。
75.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是皮质类固醇。
76.如权利要求56所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是移植。
77.权利要求76所述的方法，其中，所述移植选自骨髓移植、脐带血移植和干细胞移植。
78.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是底物减少疗法。
79.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是对症和支持疗法，如物理疗法。
CN200980131985.9A 2008-06-26 2009-06-26 Hsp70作为酶促活性调节物的应用 Active CN102123729B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410713260.3A CN104586846B (zh) 2008-06-26 2009-06-26 Hsp70作为酶促活性调节物的应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200800885 2008-06-26
DKPA200800885 2008-06-26
PCT/DK2009/050151 WO2009155936A1 (en) 2008-06-26 2009-06-26 Use of hsp70 as a regulator of enzymatic activity

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410713260.3A Division CN104586846B (zh) 2008-06-26 2009-06-26 Hsp70作为酶促活性调节物的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102123729A true CN102123729A (zh) 2011-07-13
CN102123729B CN102123729B (zh) 2015-04-29

Family

ID=41124251

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410713260.3A Active CN104586846B (zh) 2008-06-26 2009-06-26 Hsp70作为酶促活性调节物的应用
CN200980131985.9A Active CN102123729B (zh) 2008-06-26 2009-06-26 Hsp70作为酶促活性调节物的应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410713260.3A Active CN104586846B (zh) 2008-06-26 2009-06-26 Hsp70作为酶促活性调节物的应用

Country Status (18)

Country Link
US (8) US8540985B2 (zh)
EP (6) EP4285909A3 (zh)
JP (2) JP5616336B2 (zh)
CN (2) CN104586846B (zh)
AT (1) ATE552010T1 (zh)
AU (1) AU2009262670B2 (zh)
BR (2) BR122019024895B8 (zh)
CA (2) CA2728363C (zh)
DK (4) DK3578195T3 (zh)
ES (4) ES2963910T3 (zh)
FI (1) FI3578195T3 (zh)
HK (3) HK1153678A1 (zh)
HU (1) HUE025852T2 (zh)
IL (2) IL209979A (zh)
PL (3) PL2484371T3 (zh)
PT (3) PT2318032E (zh)
RU (2) RU2521672C2 (zh)
WO (1) WO2009155936A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108026142A (zh) * 2016-07-04 2018-05-11 厦门大学 孤儿核受体Nur77 的配体及其用途
CN109069496A (zh) * 2016-04-29 2018-12-21 奥菲泽米有限公司 用于治疗葡糖脑苷脂酶相关疾病的arimoclomol
CN110054677A (zh) * 2012-05-21 2019-07-26 科罗拉多大学董事会 用于治疗退变性病症的ledgf肽及其制剂
CN112166326A (zh) * 2018-05-28 2021-01-01 奥菲泽米有限公司 Pbmc样本中的hsp70蛋白水平作为疾病的生物标记物
CN112301000A (zh) * 2020-11-16 2021-02-02 吉林大学 一种能将应激信号转变为egfp荧光信号的报告细胞系

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8889127B2 (en) 2004-07-01 2014-11-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Targeted protein replacement for the treatment of lysosomal storage disorders
CA2728363C (en) 2008-06-26 2019-02-19 Orphazyme Aps Use of hsp70 as a regulator of enzymatic activity
AU2011335545A1 (en) 2010-11-30 2013-06-13 Orphazyme Aps Methods for increasing intracellular activity of Hsp70
JP6175431B2 (ja) * 2011-06-20 2017-08-02 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ ムコ多糖症およびその他のリソソーム障害に対する抗ｔｎｆ療法
WO2013003593A1 (en) * 2011-06-28 2013-01-03 Alternative Innovative Technologies Llc Methods of use of hsp70 for increased performance or hsp70 related disorders
WO2013006076A1 (en) * 2011-07-04 2013-01-10 New York University The use of intranasally administered hsp70 protein to treat neurodegenerative diseases
LT2753346T (lt) 2011-09-07 2020-08-10 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidazė ir ląstelių diferenciacija
HUP1100535A2 (en) * 2011-09-26 2013-04-29 Bracelia Invest Ltd Pharmaceutical composition for enhancement of stem cell treatment
HUP1100534A2 (en) * 2011-09-26 2013-04-29 Balazs Dr Hazay Pharmaceutical composition for the treatment of muscle atrophy
RU2685867C2 (ru) * 2011-12-15 2019-04-23 Алтернатив Инновейтив Текнолоджиз Ллц Гибридные белки и белковые конъюгаты на основе белка теплового шока-70 (БТШ70) и способы их применения (варианты)
JP5789724B2 (ja) 2011-12-16 2015-10-07 リ−コール インコーポレーティッド ルミネッセンス撮像スキャナ
WO2013103792A2 (en) * 2012-01-05 2013-07-11 Beech Tree Labs, Inc. Method of treating cancer by administration of low levels of heat shock protein 70 (hsp70)
WO2013130654A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Coyote Pharmaceuticals, Inc. Gga and gga derivatives, compositions thereof and methods for treating neurodegenerative diseases including paralysis including them
ES2897825T3 (es) 2012-06-01 2022-03-02 Icahn School Med Mount Sinai Niveles de ceramida en el tratamiento y prevención de infecciones
JP6124046B2 (ja) * 2012-07-06 2017-05-10 日立工機株式会社 背負式電源
US9119808B1 (en) 2012-10-08 2015-09-01 Coyote Pharmaceuticals, Inc. Treating neurodegenerative diseases with GGA or a derivative thereof
WO2014107686A1 (en) * 2013-01-07 2014-07-10 Coyote Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating neuron damage
EP2968479B1 (en) 2013-03-14 2019-07-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Therapeutic acid ceramidase compositions and methods of making and using them
CN104237168B (zh) * 2013-06-21 2017-12-12 国家纳米科学中心 一种检测液体样品中外囊体的方法
PT3193840T (pt) * 2014-09-15 2021-08-10 Orphazyme Aps Formulação de arimoclomol
US20160270458A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Mean Green Products, LLC Cooling backpack apparatus
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
US11753682B2 (en) 2016-03-07 2023-09-12 Father Flanagan's Boys'Home Noninvasive molecular controls
EP3442530A1 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Orphazyme A/S Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
US20180099024A1 (en) * 2016-10-06 2018-04-12 Ramp Research, Llc Methods, compositions, and kits involving alteration of the chaperone protein axis in a subject
AU2018274176A1 (en) 2017-05-24 2020-01-16 Zevra Denmark A/S Heat shock protein inducers and frontotemporal disorders
WO2019118734A1 (en) * 2017-12-13 2019-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for treating motor neuron diseases
HUP1800298A1 (hu) 2018-08-30 2020-05-28 N Gene Res Laboratories Inc Gyógyszerkombináció béta-receptor blokkolók hatásának módosítására és a mellékhatások csökkentésére
CN109867715B (zh) * 2019-02-28 2022-06-17 中国科学院昆明植物研究所 一种叶绿体蛋白和ATPase酶活性突变体在提高植物抗逆性中的应用
WO2021113464A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Friedman Simon Protein blocking assembly and methods of making and using
IL299250A (en) * 2020-06-24 2023-02-01 Kempharm Denmark As Arimoclomol for the treatment of Gaucher disease
EP4247792A1 (en) * 2020-11-19 2023-09-27 Zevra Denmark A/S Processes for preparing arimoclomol citrate and intermediates thereof
US20230404972A1 (en) * 2020-11-25 2023-12-21 Lysosomal and Rare Disorders Research and Treatment Center, Inc. Inhibition of caspase pathway as a treatment for lysosomal storage disorders
CN115192712B (zh) * 2022-07-05 2023-08-01 四川大学华西第二医院 Hsp抑制剂在制备胚胎神经系统畸形治疗的产品中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003061684A2 (en) * 2002-01-24 2003-07-31 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Tumour treatment compositions comprising hsp70 and tumour necrosis factor
US20050153906A1 (en) * 2001-02-20 2005-07-14 Bedwell David M. Aminoglycoside treatment for lysosomal storage diseases
WO2007150064A2 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Amicus Therapeutics, Inc. METHOD FOR THE TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS BY ENHANCING THE ACTIVITY OF β-GLUCOCEREBROSIDASE

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03503410A (ja) * 1988-03-18 1991-08-01 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション ヒト熱ショック因子
US5348945A (en) 1990-04-06 1994-09-20 Wake Forest University Method of treatment with hsp70
PT700445E (pt) 1993-06-04 2002-07-31 Whitehead Biomedical Inst Proteinas de stress e suas utilizacoes
ATE260295T1 (de) 1994-03-21 2004-03-15 Univ Utrecht Peptidfragmente von mikrobiellen stressproteinen und daraus hergestellte pharmazeutische zusammensetzungen für die behandlung und vorbeugung von entzündungserkrankungen
US5935576A (en) 1995-09-13 1999-08-10 Fordham University Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens
US5985270A (en) 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
US5837251A (en) 1995-09-13 1998-11-17 Fordham University Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases
HU222994B1 (hu) * 1995-11-02 2004-01-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
CA2265935C (en) 1996-09-20 2006-09-05 The University Of New Mexico Heat shock protein complexes
US7157089B1 (en) 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
US6017540A (en) 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US5830464A (en) 1997-02-07 1998-11-03 Fordham University Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy
US6007821A (en) 1997-10-16 1999-12-28 Fordham University Method and compositions for the treatment of autoimmune disease using heat shock proteins
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
IL137404A0 (en) 1998-01-23 2001-07-24 Nat Jewish Med & Res Center Method for treating inflammatory diseases using heat shock proteins
ATE359084T1 (de) 1998-02-20 2007-05-15 Univ Miami Modifizierter hitzeschockprotein/peptidantigen komplex
WO1999049881A2 (de) 1998-03-27 1999-10-07 Gabriele Multhoff Verwendung von hsp70 protein
FR2777890B1 (fr) 1998-04-22 2000-12-29 Roussy Inst Gustave Composes peptidiques d'hsp70 utiles dans l'immunotherapie du cancer
US6274597B1 (en) 1998-06-01 2001-08-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Method of enhancing lysosomal α-Galactosidase A
US6475490B1 (en) 1998-10-19 2002-11-05 Fordham University Compositions and methods for promoting tissue repair using heat shock proteins
HU226617B1 (en) 1998-12-14 2009-04-28 Cytrx Corp Optically active pyridyl-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives, and pharmaceutical composition containing the compound as active ingredient
HUP9900475D0 (en) 1999-02-26 1999-04-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)-hiyroximic acid-halogenid derivative, it's use for treating insulin resistance, and pharmaceutical compositions containing them as active component
WO2001017554A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Fordham University Methods and compositions for the treatment and prevention of graft rejection using heat shock proteins
US20020039583A1 (en) 1999-09-30 2002-04-04 Subjeck John R. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
US20030236300A1 (en) 1999-10-27 2003-12-25 Yale University Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
AU1582801A (en) 1999-11-05 2001-06-06 Board Of Regents Of The University Of Nebraska, The Methods and compositions for protection against bovine herpesvirus
US6964851B2 (en) 1999-12-07 2005-11-15 Stressgen Biotechnologies Corp. Compositions and methods for detecting stress-inducible proteins
GB9930443D0 (en) 1999-12-22 2000-02-16 King S College London Novel use of heat shock proteins
US20020127219A1 (en) 1999-12-30 2002-09-12 Okkels Jens Sigurd Lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
US20010034042A1 (en) 2000-01-20 2001-10-25 Srivastava Pramod K. Complexes of peptide-binding fragments of heat shock proteins and their use as immunotherapeutic agents
WO2001052877A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 University Of Connecticut Health Center Compositions and methods to treat neurodegenerative disorders
AU2001227960A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 University Of Connecticut Health Center Heat shock/stress protein complexes as vaccines against neurodegenerative disorders
HUP0001583A2 (hu) 2000-04-18 2002-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Egy piridin-1-oxid-származék és eljárás annak átalakítására gyógyászati hatású vegyületekké
AU2001269923A1 (en) * 2000-06-19 2002-01-02 Genzyme Corporation Combination enzyme replacement, gene therapy and small molecule therapy for lysosomal storage diseases
AU2001277961A1 (en) 2000-08-07 2002-02-18 Antigenics, Llc Compositions comprising heat shock proteins or alpha(2)macroglobulin, antigenic molecules and saponins, and methods of use thereof
ATE430161T1 (de) 2000-09-13 2009-05-15 Multimmune Gmbh Peptid aus hsp70 welches nk zellaktivtät stimuliert und seine verwendung
WO2002032923A2 (en) 2000-09-15 2002-04-25 University Of Connecticut Health Center Improved formulations using heat shock/stress protein-peptide complexes
US20020172682A1 (en) 2000-10-20 2002-11-21 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to increase immune response
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
WO2002041921A2 (en) 2000-11-03 2002-05-30 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions for protection against bovine viral diseases
EP1209226A3 (en) 2000-11-07 2002-06-05 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Maturation of dendritic cells by recombinant heat shock protein 70 (hsp70)
US20020142299A1 (en) 2001-01-09 2002-10-03 Davidson Beverly L. PTD-modified proteins
IL160511A0 (en) 2001-08-20 2004-07-25 Univ Connecticut Health Ct Methods for preparing compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin useful for the treatment of cancer and infectious disease
US20050267020A1 (en) 2001-09-27 2005-12-01 Olivier Faure Polypeptides derived from inducible hsp70 and pharmaceutical compositions containing the same
HU0103939D0 (en) 2001-09-27 2001-11-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Pharmaceutical composition containing methformin and n-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridine-1-oxide-3-carboximidoyl chloride
GB0123756D0 (en) 2001-10-03 2001-11-21 King S College London A novel chaperone-type of adjuvant for vaccination - Basic 1
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
ITMI20012573A1 (it) 2001-12-06 2003-06-06 D B P Dev Biotechonologica L P Gli acilsalicilati:una nuova classe di induttori di risposta heat shock
NZ533795A (en) 2002-01-11 2006-03-31 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Carboxamidine derivatives and their use in the treatment of vascular diseases
JP4632664B2 (ja) 2002-02-13 2011-02-16 デューク ユニバーシティ 非ペプチド結合ストレス応答性ポリペプチドによる免疫応答の調節
IL148401A0 (en) 2002-02-26 2002-09-12 Hadasit Med Res Service Hsp70-derived peptides and uses thereof in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases
US7658916B2 (en) 2002-04-05 2010-02-09 Genzyme Corporation Methods of enhancing lysosomal storage disease therapy by modulation of cell surface receptor density
JP3912790B2 (ja) 2002-04-12 2007-05-09 三菱電機株式会社 車両用交流発電機
US6984389B2 (en) 2002-04-25 2006-01-10 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to improve the therapeutic benefit of a non-vaccine treatment modality
IL164799A0 (en) 2002-04-25 2005-12-18 Univ Connecticut Using heat shock proteins to improve the therapeutic benefit of a non-vaccine treatment modality
WO2004035602A2 (en) 2002-05-02 2004-04-29 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins and alpha-2-macroglobulins to increase immune response to vaccines
US20060093612A1 (en) 2002-05-02 2006-05-04 Srivastava Pramod K Use of heat shock proteins to enhance efficacy of antibody therapeutics
GB0216414D0 (en) 2002-07-15 2002-08-21 Novartis Ag Organic compounds
CA2498274A1 (en) 2002-09-16 2004-03-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis of immune related diseases using pro7
US8436136B2 (en) 2003-05-21 2013-05-07 Biotech Tools S.A. Peptide complex
US7244616B2 (en) 2003-06-27 2007-07-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells
HUP0303584A3 (en) 2003-10-30 2009-12-28 Cytrx Corp Use of a hydroximic acid halide derivative in the treatment of neurodegenerative diseases
DE60335549D1 (de) 2003-11-12 2011-02-10 Alfa Biogene Internat B V Gewinnung von Hitzeschockproteinen
JP2007514661A (ja) 2003-11-25 2007-06-07 マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ニューヨーク ユニバーシティー ニーマンピック病のシャペロンに基づく治療方法
ES2484340T3 (es) 2003-12-05 2014-08-11 Multimmune Gmbh Anticuerpos anti hsp70 terapéuticos y diagnósticos
US20060009520A1 (en) 2004-05-12 2006-01-12 Tall Alan R Retinoid-based methods for altering macrophage cholesterol
WO2005120558A2 (en) 2004-05-25 2005-12-22 University Of Connecticut Health Center Methods for making compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin for the treatment of cancer and infectious disease
JP2008523055A (ja) 2004-12-10 2008-07-03 ゼルニケ ビジネス サポート ビー．ヴィー． 熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）および上室性不整脈
RU2283128C1 (ru) * 2005-04-05 2006-09-10 Сергей Викторович Луценко Способ получения препарата белка из семейства стрессовых и препарат белка hsp70, полученный этим способом
EP1888068B1 (en) 2005-06-08 2014-05-21 Amicus Therapeutics, Inc. Treatment of cns disorders associated with mutations in genes encoding lysosomal enzymes
WO2007041285A2 (en) 2005-09-29 2007-04-12 Viral Genetics, Inc. Complexes of inactivated pepsin fraction and heat shock protein
HUE032640T2 (en) 2005-11-08 2017-10-30 Vertex Pharma Heterocyclic modulator of ATP-binding cassette transcripts
US20080039400A1 (en) * 2006-01-24 2008-02-14 Universiteit Utrecht Uu Holding B.V. Treatment and prevention of inflammatory bowel diseases
WO2007089548A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Foldrx Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein trafficking
CA2653052A1 (en) 2006-05-19 2007-11-29 The Scripps Research Institute Treatment of protein misfolding
US10336757B2 (en) 2006-06-30 2019-07-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Treatment of neurodegenerative diseases through inhibition of HSP90
WO2008021210A2 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Combinatorx, Incorporated Methods and compositions for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2008047243A2 (en) 2006-08-29 2008-04-24 Forhumantech. Co., Ltd. Pharmaceutical composition for suppression of apoptosis and method for delivering the same
EP2089033A2 (en) * 2006-12-01 2009-08-19 CytRx Corporation Stroke recovery
CA2680063A1 (en) 2007-02-23 2008-08-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treating glycogen storage diseases
EP2155197A4 (en) 2007-03-09 2011-10-12 Link Medicine Corp TREATMENT OF LYSOSOMAL STORAGE DISEASES
GB0705626D0 (en) 2007-03-23 2007-05-02 Royal Veterinary College Method for enhancing sperm survival
WO2008127680A2 (en) 2007-04-11 2008-10-23 The Jackson Laboratory Diagnosis and treatment of diseases caused by misfolded proteins
MX2009011055A (es) 2007-04-13 2010-01-13 Amicus Therapeutics Inc Tratamiento de la enfermedad de gaucher con chaperonas farmacologicas especificas y supervision del tratamiento utilizando marcadores sustitutos.
EP3542792B1 (en) 2007-04-25 2023-06-28 EirGen Pharma Ltd. Controlled release 25-hydroxyvitamin d
EP2150254A4 (en) 2007-04-26 2010-11-10 Amicus Therapeutics Inc DOSAGES FOR THE TREATMENT OF LYSOSOMAL STORAGE DISEASES WITH PHARMACOLOGICAL CHAPTERONES
TW200901958A (en) 2007-05-04 2009-01-16 Cytrx Corp Diabetic wound healing
GB0712494D0 (en) 2007-06-27 2007-08-08 Isis Innovation Substrate reduction therapy
US7678764B2 (en) 2007-06-29 2010-03-16 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein formulations for use at elevated temperatures
CN101801402B (zh) 2007-07-06 2013-08-28 乌得勒支大学控股有限公司 炎性疾病和自身免疫疾病的治疗和预防
WO2009036349A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Anaphore, Inc. Hsp70-based treatment for autoimmune diseases
WO2009066069A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Summit Corporation Plc Treatment of protein folding disorders
WO2009073564A1 (en) 2007-11-29 2009-06-11 The Hospital For Sick Children Compositions and methods for treating lysosomal disorders
DK2247716T3 (da) 2008-01-30 2012-05-29 Geron Corp Syntetiske overflader til dyrkning af celler i kemisk defineret medie
WO2009095452A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 Crystax Pharmaceuticals, S.L. Crystal structure of the atpase domain of proteins of the hsp70 family
WO2009100037A1 (en) 2008-02-01 2009-08-13 The Scripps Research Institute Methods for treating a condition characterized by dysfunction in protein homeostasis
PL2279210T3 (pl) 2008-05-07 2017-10-31 Biomarin Pharm Inc Lizosomalne peptydy kierujące i ich zastosowania
WO2009137796A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Northwestern University Method of regulating the heat shock response
GB0809360D0 (en) * 2008-05-22 2008-07-02 Isis Innovation Calcium modulation
CA2728363C (en) 2008-06-26 2019-02-19 Orphazyme Aps Use of hsp70 as a regulator of enzymatic activity
US20110237538A1 (en) 2008-08-06 2011-09-29 Summit Corporation Plc Treatment of lysosomal storage disorders and other proteostatic diseases
WO2010022461A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Children, Youth And Women's Health Service Sulphated sugars to increase activity of sulphatases en lysosomal storage disorders
MX2011003249A (es) 2008-09-29 2011-05-19 Vertex Pharma Unidades de dosificacion del acido 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1 ,3]dioxol-5-il)ciclopropancarboxamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoi co.
WO2010053655A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 University Of Kansas Therapeutic methods with withaferin a and analogs
EP2391229B1 (en) 2009-01-29 2015-07-15 Alfa Biogene International B.V. Functional food product comprising heat shock protein or a hydrolysate thereof from alfalfa
EP2218458A1 (en) 2009-02-13 2010-08-18 Fondazione Telethon Molecules able to modulate the expression of at least a gene involved in degradative pathways and uses thereof
WO2010102988A1 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Alfa Biogene International B.V. Skin care product
GB0906159D0 (en) 2009-04-09 2009-05-20 Summit Corp Plc Drug combination for the treatment of proteostatic diseases
EP3075386B1 (en) 2009-06-17 2019-10-16 BioMarin Pharmaceutical Inc. Formulations for lysosomal enzymes
ES2668079T3 (es) 2009-07-28 2018-05-16 Shire Human Genetic Therapies Composiciones y métodos para tratar la enfermedad de Gaucher
US20120156180A1 (en) 2009-08-10 2012-06-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions and methods for the treatment of krabbe and other neurodegenerative diseases
US20110081428A1 (en) 2009-09-16 2011-04-07 The Buck Institute For Age Research Use of thioflavin-like compounds to increase life span and/or health span
US8628979B2 (en) 2009-10-21 2014-01-14 Pronota N.V. MCAM as a biomarker for fluid homeostasis
US8609416B2 (en) 2009-12-18 2013-12-17 Ventria Bioscience Methods and compositions comprising heat shock proteins
US20130209549A1 (en) 2010-07-21 2013-08-15 University Of South Florida Materials and methods for treating neurodegenerative diseases
AU2011335545A1 (en) 2010-11-30 2013-06-13 Orphazyme Aps Methods for increasing intracellular activity of Hsp70
WO2013006076A1 (en) 2011-07-04 2013-01-10 New York University The use of intranasally administered hsp70 protein to treat neurodegenerative diseases
WO2013148333A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Salicylic acid derivatives useful as glucocerebrosidase activators
TW201427695A (zh) 2012-11-05 2014-07-16 Genzyme Corp 用於治療蛋白質病變（ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）的組成物及方法
WO2014079000A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Bispecific antibody
PT3193840T (pt) 2014-09-15 2021-08-10 Orphazyme Aps Formulação de arimoclomol

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050153906A1 (en) * 2001-02-20 2005-07-14 Bedwell David M. Aminoglycoside treatment for lysosomal storage diseases
WO2003061684A2 (en) * 2002-01-24 2003-07-31 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Tumour treatment compositions comprising hsp70 and tumour necrosis factor
WO2007150064A2 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Amicus Therapeutics, Inc. METHOD FOR THE TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS BY ENHANCING THE ACTIVITY OF β-GLUCOCEREBROSIDASE

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110054677A (zh) * 2012-05-21 2019-07-26 科罗拉多大学董事会 用于治疗退变性病症的ledgf肽及其制剂
CN109069496A (zh) * 2016-04-29 2018-12-21 奥菲泽米有限公司 用于治疗葡糖脑苷脂酶相关疾病的arimoclomol
CN108026142A (zh) * 2016-07-04 2018-05-11 厦门大学 孤儿核受体Nur77 的配体及其用途
CN112166326A (zh) * 2018-05-28 2021-01-01 奥菲泽米有限公司 Pbmc样本中的hsp70蛋白水平作为疾病的生物标记物
CN112301000A (zh) * 2020-11-16 2021-02-02 吉林大学 一种能将应激信号转变为egfp荧光信号的报告细胞系

Also Published As

Publication number Publication date
US20150004151A1 (en) 2015-01-01
AU2009262670A1 (en) 2009-12-30
PL2318032T3 (pl) 2012-08-31
US11938125B2 (en) 2024-03-26
HK1190644A1 (zh) 2014-07-11
CA2728363A1 (en) 2009-12-30
US20200113888A1 (en) 2020-04-16
EP3031467B1 (en) 2019-03-06
PL2484371T3 (pl) 2015-05-29
US20220362234A1 (en) 2022-11-17
JP5860493B2 (ja) 2016-02-16
US9884058B2 (en) 2018-02-06
EP3578195B1 (en) 2023-08-09
CN102123729B (zh) 2015-04-29
EP2318032B1 (en) 2012-04-04
BRPI0914684C1 (pt) 2021-05-25
JP2011525500A (ja) 2011-09-22
BR122019024895B1 (pt) 2020-08-18
HK1153678A1 (en) 2012-04-05
JP2014132016A (ja) 2014-07-17
US8540985B2 (en) 2013-09-24
RU2011102781A (ru) 2012-08-10
US11304941B2 (en) 2022-04-19
IL209979A (en) 2016-02-29
CA3004867A1 (en) 2009-12-30
EP2484371B1 (en) 2014-12-17
HUE025852T2 (en) 2016-04-28
ES2555908T3 (es) 2016-01-11
PT2659904E (pt) 2016-01-22
PT2318032E (pt) 2012-06-19
DK2318032T3 (da) 2012-06-11
US20160263096A1 (en) 2016-09-15
FI3578195T3 (fi) 2023-11-08
EP2484371A1 (en) 2012-08-08
BR122019024895B8 (pt) 2021-07-27
CN104586846B (zh) 2017-10-24
EP3578195A1 (en) 2019-12-11
BRPI0914684B1 (pt) 2020-09-24
EP3031467A1 (en) 2016-06-15
US11045460B2 (en) 2021-06-29
EP2318032A1 (en) 2011-05-11
PL2659904T3 (pl) 2016-01-29
IL209979A0 (en) 2011-02-28
ES2385735T3 (es) 2012-07-31
PT2484371E (pt) 2015-03-03
CN104586846A (zh) 2015-05-06
US20110286993A1 (en) 2011-11-24
US10543204B2 (en) 2020-01-28
EP2659904B1 (en) 2015-09-16
EP4285909A2 (en) 2023-12-06
JP5616336B2 (ja) 2014-10-29
IL235342B (en) 2018-11-29
EP2659904A1 (en) 2013-11-06
EP4285909A3 (en) 2024-02-28
US20200121668A1 (en) 2020-04-23
AU2009262670B2 (en) 2013-06-20
ES2532083T3 (es) 2015-03-24
ES2963910T3 (es) 2024-04-03
RU2571946C2 (ru) 2015-12-27
US20180185349A1 (en) 2018-07-05
CA2728363C (en) 2019-02-19
US9289472B2 (en) 2016-03-22
RU2521672C2 (ru) 2014-07-10
HK1175395A1 (zh) 2013-07-05
BRPI0914684B8 (pt) 2020-10-13
DK3578195T3 (da) 2023-10-30
RU2014116069A (ru) 2015-07-20
DK2484371T3 (en) 2015-03-02
CA3004867C (en) 2020-09-15
BRPI0914684A2 (pt) 2017-06-06
DK2659904T3 (en) 2015-12-07
US20140050714A1 (en) 2014-02-20
WO2009155936A1 (en) 2009-12-30
ATE552010T1 (de) 2012-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102123729B (zh) Hsp70作为酶促活性调节物的应用
US20220374361A1 (en) Methods for increasing intracellular activity of hsp70

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230131

Address after: Fla

Patentee after: KEMPHARM, Inc.

Address before: Copenhagen, Denmark

Patentee before: Orphazyme APS

Effective date of registration: 20230131

Address after: Copenhagen, Denmark

Patentee after: Kem Pharmaceutical Denmark Ltd.

Address before: Fla

Patentee before: KEMPHARM, Inc.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230607

Address after: Copenhagen, Denmark

Patentee after: Zela Denmark Ltd.

Address before: Copenhagen, Denmark

Patentee before: Kem Pharmaceutical Denmark Ltd.