BR122019024895B1 - uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular de hsp70 - Google Patents

Abstract

A presente invenção diz respeito a um método para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP, o dito método compreendendo a etapa de administrar ou induzir Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante do mesmo, em uma forma adequada para permitir a interação entre BMP e Hsp70, ou o dito fragmento funcional ou variante do mesmo, e deste modo, modular a atividade enzimática de uma enzima que interage com BMP.

Description

[001] Este pedido é um pedido não provisório do pedido de patente DK PA 2008 00885 depositado em 26 de Junho de 2008, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade. Todas as referências de patente e que não de patente citadas no pedido provisório, ou no presente pedido, também são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade.

Campo da invenção

[002] A presente invenção diz respeito ao campo da modulação da atividade de enzima pela exploração da interação entre o chaperona molecular Hsp70 e o fosfolipídeo lisossômico Bis(monoacilglicero)-fosfato (BMP, também conhecido sob o nome LBPA). A interação de Hsp70-BMP modula a atividade de enzimas que interagem com BMP do compartimento lisossômico e a presente invenção fornece assim um meio para reverter a patologia das doenças de armazenagem lisossômica.

Fundamentos da invenção

[003] Os chaperonas moleculares são encontrados em todos os compartimentos de uma célula onde rearranjos conformacionais de proteínas ocorrem e embora a síntese de proteína seja a maior fonte de peptídeos não dobrados na célula, uma inoculação à célula pela temperatura alta ou outros estímulos que poderiam tomar as proteínas estruturalmente instáveis e consequentemente propensas a desdobrar e agregar, é atingida com uma resposta celular específica envolvendo a produção de proteínas de proteção. Esta resposta é um fenômeno observado em cada tipo de célula variando de procariotas a eucariotas e é aludido como a resposta ao choque térmico ou estresse. As proteínas induzidas por esta resposta são conhecidas como as proteínas de choque térmico (HSPs), das quais existem várias famílias.

[004] Um exemplo primário de uma família de chaperonas é o das proteínas Hsp70. Esta família foi recentemente implicada em outros aspectos da homeostase celular além de servir como um chaperona - mais acentuadamente através das suas características anti-apoptóticas, suas funções na imunidade e a dependência evidente de células cancerosas na supra regulagem de Hsp70. Além disso, Hsp70 pode servir para um papel na proteção da integridade lisossômica. Entretanto, o mecanismo molecular portanto tem permanecido incerto.

[005] As doenças de armazenagem lisossômica são um grupo raro de doenças, caracterizadas pelo acúmulo de substâncias no compartimento lisossômico e que resulta na sua desestabilização, com um efeito devastador resultante para os indivíduos afetados. As substâncias se acumulam no compartimento lisossômico devido a deficiências nas enzimas envolvidas no seu catabolismo.

[006] Até esta data, nenhum tratamento está disponível para a maioria das doenças de armazenagem lisossômica. A causa subjacente deste grupo de doenças é a incapacidade de enzimas lisossômicas específicas para catabolizar eficientemente substâncias lisossômicas específicas tais como lipídeos. Portanto o uso da terapia de reposição de enzima (ERT), pelo fornecimento a um paciente da enzima recombinante, foi utilizada para um subconjunto destas doenças, incluindo a doença de Gaucher e Fabry. Entretanto, a ERT é uma forma muito cara de terapia que pode limitar o seu uso em algumas áreas e também é eficazes apenas para o tipo específico de doença para o qual a enzima recombinante foi produzida. A presente invenção é intencionada a fornecer novos meios para tratar os distúrbios de armazenagem lisossômicas.

Sumário da invenção

[007] Na presente invenção, a base molecular para a contribuição de Hsp70 para a estabilidade da membrana lisossômica é divulgada pelo fornecimento de um entendimento da base molecular para a associação entre Hsp70 e membranas celulares - em particular membranas plasmáticas e lisossômicas.

[008] É conhecido da literatura que Hsp70 pode servir para um papel na proteção da integridade lisossômica. Entretanto, o mecanismo molecular tem permanecido incerto. Além disso, a questão como se este atributo é específico para o Hsp70 indutível pelo estresse principal (HspAl A/Al B - chamado de Hsp70 por todo este estudo) ou se outros membros da família de Hsp70 teriam a mesma característica, não foi tampouco tratado.

[009] Estas questões não respondidas induziram um dos objetivos principais desta invenção, que foi investigar a base molecular para o efeito de proteção de lisossoma de Hsp70. Para esta finalidade, um método para a produção de Hsp70 recombinantes e seus mutantes foi estabelecido, como foi um protocolo de fracionamento subcelular com base na ultracentrifugação de gradiente de iodixanol. Um ensaio para a avaliação direta da integridade da membrana lisossômica foi estabelecida com base na permeabilização induzida pela fotooxidação de lisossomas, que permitiu um método microscópico em tempo real para avaliar o efeito de Hsp70 e de outros componentes com respeito à sua capacidade para sensibilizar ou proteger as membranas lisossômicas. A interação de Hsp70 recombinantes e mutantes com vários lipídeos foi investigada em diferentes sistemas in vitro incluindo medições da dispersão de luz a 90° do lipossoma, mudanças na fluorescência do triptofano e ressonância de plasma de superfície (BIAcore). A criação de um modelo conceituai para a interação de Hsp70-BMP foi auxiliada pela modelagem de superfície eletrostática in silico de Hsp70. De modo a verificar a relevância in vivo da interação de lipídeo presenciada nos sistemas in vitro, a interação de BMP-Hsp70 foi alvejada com respeito a ambos componentes. Para mostrar ainda mais a praticabilidade de explorar este mecanismo, o modo de morte celular induzida pela administração de cisplatina foi caracterizada e o Hsp70 lisossômico foi alvejada neste sistema de morte celular tanto no câncer assim como em linhagens de célula não transformadas.

[0010] De modo a tratar a base molecular para a contribuição de Hsp70 para a estabilidade da membrana lisossômica, os inventores procuraram estabelecer um sistema que eliminaria a influência do Hsp70 citossólico, isto é, o alvejamento de Hsp70 diretamente aos lisossomas foi necessário. Imagens da microscopia eletrônica por Nilandsted et al. mostraram que Hsp70 pode estar presente dentro dos lisossomas e foi assim decidido estabelecer um método para a produção de Hsp70 humano recombinante (rHsp70) e confiantemente explorar o mecanismo endocítico como um caminho de liberação do rHsp70 diretamente aos lisossomas. Os presentes inventores por meio deste puderam desviar a necessidade quanto a adicionar sinais de classificação lisossômica para Hsp70, rompendo potencialmente a função e evitando complicações que poderiam surgir devido à superexpressão. Um método endocítico além disso permitiria uma titulação das quantidades de rHsp70 e em uma perspectiva mais extensa abrir possibilidades para estudar o mecanismo para a captação de Hsp70 extracelular.

[0011] Tendo estabelecido o método para a produção de Hsp70, o mesmo foi depois rotulado com o fluoróforo Alexa Fluor 488 (Hsp70-AF488) de modo a validar a sua endocitose. A formação de imagem confocal revelou que rHsp70 de fato seria alvejado aos lisossomas deste modo. De modo a avaliar o impacto sobre a estabilidade da membrana lisossômica, os inventores em seguida estabeleceram um método para quantificar a permeabilização da membrana lisossômica ao nível de lisossomas únicos e utilizaram este método para avaliar o efeito de rHsp70 submetido à endocitose. Estes métodos formaram a base para os exemplos 1 e 2, em que os inventores mostraram que Hsp70 intensifica a sobrevivência de célula pela estabilização de lisossomas através de uma ligação de alta afinidade dependente de pH ao fosfolipídeo endo-lisossômico aniônico bis(monoacil- glicero)fosfato (BMP). O domínio de ATPase positivamente carregado do Hsp70 é responsável pela ligação mas o domínio que liga o substrato também é requerido para a estabilização eficaz de lisossomas. De modo interessante, esta interação e a proteção que ela oferece, é dependente de triptofano 90, que está localizado na borda positivamente carregada do domínio de ATPase. De maneira importante, o efeito citoprotetor pode ser obtido pela liberação endocítica de rHsp70 e especificamente revertido pela administração extracelular de anticorpos BMP ou inibidores de Hsp70.

[0012] Além disso, os inventores também procuraram ligar o mecanismo para a proteção de Hsp70 de membranas lisossômicas para os eventos de tumorigênese e morte celular programada. Os inventores assim caracterizaram o programa de morte celular iniciado pela administração de um agente quimioterapêutico comum, cisplatina e descobriram que o mesmo é independente de caspases, mas caracterizado pela liberação lisossômica de proteases. Hsp70 transgênico assim como submetido à endocitose Hsp70 é capaz de intensificar a sobrevivência de célula na face de inoculação da cisplatina pela estabilização das membranas lisossômicas. De modo interessante, os inventores mostram que o alvejamento lisossômico do próprio Hsp70 ou do seu parceiro de interação lisossômica bis(monoacil- glicero)fosfato (BMP), sensibilizam as linhagens de célula prostática transformadas, mas não as não transformadas, para cisplatina que fornece evidência experimental para explorar a interação de BMP-Hsp70 como um alvo farmacológico para a terapia do câncer.

[0013] De modo interessante Hsp70-2, embora compartilhando 86 % de homologia de aminoácido com Hsp70, não foi capaz de proteger as membranas lisossômicas diretamente. Entretanto, o esgotamento de Hsp70-2 também resulta na permeabilização da membrana lisossômica e garante a morte celular programada. Este efeito não depende de uma interação direta entre Hsp70-2 e o compartimento lisossômico, mas é ao invés orquestrado via a infra-regulagem do Fator de Crescimento Derivado de Epitélio de Lente (LEDGF), em resposta ao esgotamento de Hsp70-2.

[0014] Os métodos e resultados desta investigação são tratados em mais detalhes na seção de Exemplos.

[0015] Tendo aqui elucidado a base molecular do efeito citoprotetor de Hsp70 via uma interação com BMP lisossômico para promover a estabilização lisossômica, estas descobertas fornecem a base para o alvejamento terapêutico das doenças de armazenagem lisossômica.

[0016] Foi agora demonstrado surpreendentemente que, fornecer Hsp70 recombinante às células eficientemente reverte a patologia das doenças de armazenagem lisossômica, como aqui mostrado para a doença de Niemann-Pick e doença de Farber. Além disso, fornecer o indutor de Hsp70 álcool benzílico às células eficientemente reverte a patologia das doenças de armazenagem lisossômica, como aqui mostrado para a doença de Niemann-Pick.

[0017] A presente invenção fornece assim um método para tratar doenças de armazenagem lisossômica aumentando-se direta ou indiretamente a concentração intracelular e/ou atividade de Hsp70 em indivíduos em necessidade deste, pelo fornecimento de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, ou pelo fornecimento de um indutor ou co-indutor de Hsp70.

[0018] A presente invenção em um aspecto diz respeito a um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70 para o uso como um medicamento ou para o uso no tratamento de um distúrbio de armazenagem lisossômica.

[0019] Em uma forma de realização, o dito agente bioativo é Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[0020] Em uma outra forma de realização, o dito agente bioativo é um indutor ou co-indutor de Hsp70.

[0021] Também é um aspecto da presente invenção fornecer um método para o tratamento de uma doença de armazenagem lisossômica que compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade deste.

[0022] Em uma forma de realização, o dito tratamento é profilático, curativo ou que tende à melhora.

[0023] Em uma forma de realização, a dita doença de armazenagem lisossômica é selecionada do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Sialidose, Leucodistrofia metacromática e deficiência de saposina.

[0024] Em uma outra forma de realização, a dita doença de armazenagem lisossômica é caracterizada como tendo atividade enzimática residual da enzima defeituosa envolvida na patologia da doença.

[0025] A presente invenção também diz respeito a um método de tratamento de uma doença de armazenagem lisossômica que compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento.

[0026] Um aspecto adicional da presente invenção é fornecer um método para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP (bis(monoacilglicero)fosfato), o dito método compreendendo as etapas de

[0027] administrar o agente bioativo de acordo com a presente invenção,

[0028] permitir a interação entre BMP e Hsp70, e

[0029] modular a atividade enzimática de uma enzima que interage com BMP.

[0030] Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para o uso como um medicamento.

[0031] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP, o dito método compreendendo a etapa de administrar Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, em uma forma adequada para permitir a interação entre BMP e Hsp70, ou o dito fragmento funcional ou variante deste e deste modo modular a atividade enzimática de uma enzima que interage com BMP.

[0032] Preferivelmente, Hsp70 ou o dito fragmento funcional ou variante deste forma um complexo covalente ou não covalente com BMP.

[0033] Preferivelmente, BMP interage com uma saposina.

[0034] Preferivelmente, a dita saposina é selecionada do grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C e saposina D.

[0035] Preferivelmente, a dita enzima é selecionada do grupo que consiste de esfingomielinase, esfingomielinase ácida, sialidase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, beta-galactosilceremidase, glucosil- ceremidase e ceramidase ácida.

[0036] Preferivelmente a dita modulação da atividade enzimática é uma supra-regulagem da atividade enzimática da dita enzima.

[0037] Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para o uso como um medicamento. Preferivelmente, a dita Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, podem ser usados no tratamento, alívio, ou profilaxia de um distúrbio de armazenagem lisossômica, tal como os distúrbios de Niemann- Pick, Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry e Sialidose.

[0038] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para aumentar a captação de um composto, o dito método compreendendo a etapa de administrar o dito composto junto com Hsp70 ou um fragmento funcional ou variante deste. Em uma forma de realização, a dita Hsp70 ou um fragmento funcional ou variante deste é covalentemente ligado ao dito composto. Em uma outra forma de realização, a dita Hsp70 ou um fragmento funcional ou variante deste não são covalentemente ligados ao dito composto.

[0039] Uma forma de realização da invenção diz respeito a um método para a supra-regulagem de uma atividade enzimática de uma enzima associada com um distúrbio de armazenagem lisossômica, tal como Niemann- Pick, Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry e Sialidose. Preferivelmente, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é de Niemann-Pick.

[0040] Visto que os distúrbios de armazenagem lisossômica são causados pela atividade enzimática insuficiente, é o objetivo da invenção aumentar a atividade enzimática de modo a aliviar ou curar o distúrbio.

[0041] Hsp70 foi mostrado interagir com BMP. Visto que BMP atua como um co-fator para várias outras proteínas, a interação entre Hsp70 e BMP pode modular a função destas várias outras proteínas. Por exemplo, BMP atua como um co-fator para a aSMase. Assim, a interação entre Hsp70 e BMP pode aumentar a atividade de aSMase. Visto que o distúrbio de Niemann-Pick está associado com uma atividade de aSMase diminuída, Hsp70 pode aliviar ou curar o distúrbio de Niemann-Pick aumentando-se a atividade de aSMase. Similarmente, BMP atua como um co-fator para a saposina A, saposina B, saposina C e saposina D. Estas proteínas de saposina são implicadas em outros distúrbios de armazenagem lisossômica e portanto Hsp70 pode aliviar ou curar outros distúrbios de armazenagem lisossômica aumentando-se a atividade de uma saposina ou de uma enzima associada com a dita saposina.

[0042] Em uma forma de realização da invenção, Hsp70 é administrado junto com terapia de reposição de enzima no tratamento de um distúrbio de armazenagem lisossômica. Desta maneira, a quantidade de enzima necessária pode ser significantemente reduzida devido ao efeito de ativação de enzima de Hsp70.

[0043] Em uma outra forma de realização, Hsp70 é usado para facilitar a captação de enzimas na terapia de reposição de enzima, aumentando deste modo a quantidade de enzima que foi captada pelas células relevantes. Definições e abreviações aSMase / ASM Esfingomielinase ácida ADD70: isca derivada de AIF para Hsp70 AIF: Fator indutor de apoptose AO: Laranja de Acridina Apaf-1: fator ativador de protease apoptótica 1 Bag-1: Atanogene-1 associado a Bcl-2 Bcl-2: Linfoma/leucemia de célula B 2 Bid: agonista de morte do domínio que interage BH3 BMP: Bis(monoacilglicero)fosfato CARD: Domínio de recrutamento de Caspase Caspase: Protease específica da Cisteina aspartato CHIP: Terminal carbóxi da proteína de ligação de Hsp70 CytC: Citocromo C DD: Domínio de morte DED: Domínio efetor de morte  dsRNA: RNA de filamento duplo eHsp70: Hsp70 extracelular ER: Retículo endoplasmático ERT Terapia de reposição de enzima FADD: Proteína que contém domínio de morte associado a Fas HIP: Hsp70 que interage proteína HRP: Rábano peroxidase HS: Choque térmico/estresse HSE: Elemento de choque térmico HSF: Fator de choque térmico Hsp: Proteína de choque térmico HspBPl: Proteína 1 que liga a proteína de choque térmico IAP: Inibidor da proteína de apoptose iMEF Fibroblastos Embrionários de Murino Imortalizados JNK: cinase de terminal NH2 c-jun LAMP-1 /-2: proteína de membrana associada a lisossoma -1/-2 LBPA: Acido lisobisfosfatídico LEDGF: Fator de crescimento derivado de epitélio de lente LMP: Permeabilização da membrana lisossômica MIC-1: Citocina 1 inibidora de macrófago MOMP: Permeabilização da membrana externa mitocondrial MPR receptor da manose 6-fosfato MTT: brometo de 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio NPD doença de Niemann-Pick NPDA doença de Niemann-Pick, tipo A NPDB doença de Niemann-Pick, tipo B NPDC doença de Niemann-Pick, tipo C NPDD doença de Niemann-Pick, tipo D  PCD: Morte celular programada PKC: Proteína cinase C POPC: Pahnitoil-oleoil-fosfatidilcolina POPS: Palmitoil-oleoil-fosfatidilserina RN Ai: interferência de RNA ROS: Espécies de oxigênio reativo SD: Desvio padrão siRNA: RNA interferente curto Smac/Diablo: Ativador derivado de mitocôndria secundário de caspases tBid: Bid truncado TNF: Fator de necrose de tumor TNFR: receptor de TNF TRADD: proteína do domínio de morte associada a TNFR TRAF: Fator associado a TNFR

[0044] Distúrbio de armazenagem lisossômica (LSD): Os termos “distúrbio de armazenagem lisossômica” e “doença de armazenagem lisossômica” são usados como sinônimos.

[0045] Fragmento funcional de Hsp70: O termo “fragmento funcional de Hsp70” deve ser interpretado como significando qualquer fragmento de Hsp70 tendo a função desejada. Em relação à modulação da atividade enzimática, um fragmento funcional é um fragmento capaz de modular a atividade enzimática. Em relação ao aumento da captação de uma substância, um fragmento funcional de Hsp70 é um fragmento capaz de aumentar a captação da dita substância. E avaliado que o efeito quantitativo exato do fragmento funcional pode ser diferente do efeito da molécula de tamanho natural. Em alguns casos, o fragmento funcional pode de fato ser mais eficaz do que a molécula de tamanho natural. Além disso, o uso de fragmentos ao invés de moléculas de tamanho natural pode ser vantajoso em vista do tamanho menor dos fragmentos.

[0046] Variante funcional de Hsp70: O termo “variante funcional de Hsp70” deve ser interpretado como significando qualquer variante de Hsp70 tendo a função desejada. Em relação à modulação da atividade enzimática, uma variante funcional é uma variante capaz de modular a atividade enzimática. Em relação ao aumento da captação de uma substância, uma variante funcional de Hsp70 é um fragmento capaz de aumentar a captação da dita substância. E avaliado que o efeito quantitativo exato da variante funcional pode ser diferente do efeito da molécula de tamanho natural. Em alguns casos, a variante funcional pode de fato ser mais eficaz do que a molécula de tamanho natural.

[0047] Um “agente bioativo” (isto é, substância/agente biologicamente ativo) é qualquer agente, medicamento, composto, composição de matéria ou mistura que forneça algum efeito farmacológica, frequentemente benéfico, que pode ser demonstrado in vivo ou in vitro. Como aqui usado, este termo inclui ainda qualquer substância fisiológica ou farmacologicamente ativa que produza um efeito localizado ou sistêmico em um indivíduo. Outros exemplos de agentes bioativos incluem, mas não são limitados a, agentes que compreendem ou que consistem de um oligossacarídeo, agentes que compreendem ou que consistem de um polissacarídeo, agentes que compreendem ou que consistem de um peptídeo opcionalmente glicosilado, agentes que compreendem ou que consistem de um polipeptídeo opcionalmente glicosilado, agentes que compreendem ou que consistem de um ácido nucléico, agentes que compreendem ou que consistem de um oligonucleotídeo, agentes que compreendem ou que consistem de um polinucleotídeo, agentes que compreendem ou que consistem de um lipídeo, agentes que compreendem ou que consistem de um ácido graxo, agentes que compreendem ou que consistem de um éster de ácido graxo e agentes que compreendem ou que consistem de metabolites secundários. O mesmo pode ser usado profilático ou terapeuticamente, em conexão com o tratamento de um indivíduo, tal como um ser humano ou qualquer outro animal. Como aqui usado, um agente bioativo é uma substância capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70.

[0048] Os termos “droga” ou “medicamento” como aqui usados incluem substâncias biológica, fisiológica ou farmacologicamente ativas que atuam local ou sistemicamente no corpo humano ou animal.

[0049] Os termos “tratar”, “tratamento” e “terapia” como aqui usados referem-se igualmente à terapia curativa, terapia profilática ou preventiva e que tende à melhora ou terapia paliativa. Os termos incluem um método para a obtenção de resultados fisiológicos benéficos ou desejados, que podem ser clinicamente estabelecidos. Para os propósitos desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio de sintomas, diminuição do grau da doença, condição estabilizada (isto é, não piora), demora ou retardo da progressão ou piora da condição/sintomas, melhora ou paliação da condição ou sintomas e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou não detectável. O termo “paliação” e variações deste, como aqui usado, significa que o grau e/ou manifestações indesejáveis de uma condição ou sintoma fisiológicos são diminuídos e/ou o curso de tempo da progressão é diminuído ou dilatado, quando comparado com a não administração das composições da presente invenção.

[0050] Um “efeito de tratamento” ou “efeito de terapêutico” é manifestado se houver uma mudança na condição que é tratada, como medida pelos critérios que constituem a definição dos termos “tratar” e “tratamento.” Existe uma “mudança” na condição que é tratada se houver pelo menos 5 % de melhora, preferivelmente 10 % de melhora, mais preferivelmente pelo menos 25 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 50 %, tal como pelo menos 75 % e o mais preferivelmente pelo menos 100 % de melhora. A mudança pode ser com base nas melhoras na severidade da condição tratada em um indivíduo, ou em uma diferença na frequência de condições melhoradas nas populações de indivíduos com e sem tratamento com o agente bioativo, ou com o agente bioativo em combinação com uma composição farmacêutica da presente invenção.

[0051] “Quantidade farmacologicamente eficaz”, “quantidade farmaceuticamente eficaz” ou “quantidade fisiologicamente eficaz de um “agente bioativo” é a quantidade de um agente ativo presente em uma composição farmacêutica como aqui descrita que é necessária para fornecer um nível desejado de agente ativo na corrente sanguínea ou no local de ação em um indivíduo (por exemplo, nos pulmões, no sistema gástrico, nos sistema colorretal, próstata, etc.) a ser tratado para dar uma resposta fisiológica prevista quando tal composição é administrada. A quantidade precisa dependerá de numerosos fatores, por exemplo, do agente ativo, da atividade da composição, do dispositivo de liberação utilizado, das características físicas da composição, do uso no paciente pretendido (isto é, do número de doses administrado por dia), considerações do paciente e outros e pode ser facilmente determinada por uma pessoa habilitada na técnica, com base na informação aqui fornecida. Uma “quantidade eficaz” de um agente bioativo pode ser administrada em uma administração, ou através de administrações múltiplas de uma quantidade que totaliza uma quantidade eficaz, preferivelmente dentro de um período de 24 horas. A mesma pode ser determinada usando procedimentos clínicos padrão para determinar as quantidades apropriadas e o controle de tempo da administração. E entendido que a “quantidade eficaz” pode ser o resultado da determinação empírica e/ou individualizada (caso a caso) por parte do profissional de cuidado de saúde no tratamento e/ou indivíduo.

[0052] Os termos “intensificar” e “melhorar” um efeito benéfico e variações destes, como aqui usados, referem-se ao efeito terapêutico do agente bioativo contra placebo, ou um aumento no efeito terapêutico de um tratamento médico do estado da técnica acima daquele normalmente obtido quando uma composição farmacêutica é administrada sem o agente bioativo desta invenção. “Um aumento nos efeitos terapêuticos” é manifestado quando há uma aceleração e/ou aumento na intensidade e/ou grau dos efeitos terapêuticos obtidos como um resultado de administrar o(s) agente(s) bioativo(s). O mesmo também inclui a extensão da longevidade dos benefícios terapêuticos. O mesmo também pode manifestar-se onde uma quantidade mais baixa da composição farmacêutica é requerida obter os mesmos benefícios e/ou efeitos quando a mesma é co-administrada com agente(s) bioativo(s) fomecido(s) pela presente invenção quando comparada com a administração em uma quantidade mais alta da composição farmacêutica na ausência de agente bioativo. O efeito intensificador preferivelmente, mas não necessariamente, resulta no tratamento de sintomas agudos para os quais a composição farmacêutica sozinha não é eficaz ou é menos eficaz terapeuticamente. O realce é obtido quando existe pelo menos um aumento de 5 % no efeito dos produtos terapêuticos, tal como pelo menos 10 % de aumento nos efeitos terapêuticos quando um agente bioativo da presente invenção é co-administrado com uma composição farmacêutica comparada com a administração da composição farmacêutica sozinha. Preferivelmente o aumento é de pelo menos 25 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 75 %, o mais preferivelmente pelo menos 100 %.

[0053] “Co-administrar” ou “co-administração” de agente(s) bioativo(s), ou agentes bioativos e medicamentos do estado da técnica, como aqui usados, referem-se à administração de um ou mais agentes bioativos da presente invenção, ou administração de um ou mais agentes bioativos da presente invenção e uma composição farmacêutica do estado da técnica dentro de um certo período de tempo. O período de tempo é preferivelmente menor do que 72 horas, tal como 48 horas, por exemplo menor do que 24 horas, tal como menor do que 12 horas, por exemplo menor do que 6 horas, tal como menor do que 3 horas. Entretanto, estes termos também significam que o agente bioativo e uma composição terapêutica podem ser administrados juntos.

[0054] O termo “Individual” refere-se aos vertebrados, em particular um membro de uma espécie mamífera, preferivelmente primatas incluindo seres humanos. Em uma forma de realização preferida, um indivíduo como aqui usado é um ser humano, macho ou fêmea, de qualquer idade.

[0055] Um “indivíduo em necessidade deste” refere-se a um indivíduo que pode se beneficiar da presente invenção. Em uma forma de realização, o dito indivíduo em necessidade deste é um indivíduo doente, em que a dita doença é uma doença de armazenagem lisossômica.

[0056] Os termos “nucleotídeo natural” ou “nucleotídeo” referem-se a qualquer um dos quatro desoxirribonucleotídeos, dA, dG, dT e dC (constituintes do DNA) e os quatro ribonucleotídeos, A, G, U e C (constituintes do RNA), como encontrados na natureza. Cada nucleotídeo natural compreende ou essencialmente consiste de uma porção de açúcar (ribose ou desoxirribose), uma porção de fosfato e uma porção base natural/padrão. Os nucleotídeos naturais ligam-se aos nucleotídeos complementares de acordo com regras bem conhecidas de formação de par de base (Watson e Crick), onde adenina (A) forma par com timina (T) ou uracila (U); e onde guanina (G) forma par com citosina (C), em que os pares de base correspondentes são parte dos filamentos de nucleotídeo complementares, anti-paralelos. A formação de par de base resulta em uma hibridização específica entre nucleotídeos pré-determinados e complementares. A formação de par de base é a base pela qual as enzimas são capazes de catalisar a síntese de um oligonucleotídeo complementar ao oligonucleotídeo padrão. Nesta síntese, blocos de construção (normalmente os trifosfatos de derivados de ribo ou desoxirribo de A, T, U, C, ou G) são direcionados por um oligonucleotídeo padrão para formar um oligonucleotídeo complementar com a sequência correta, complementar. O reconhecimento de uma sequência de oligonucleotídeo pela sua sequência complementar é mediada pelas bases correspondentes e interventoras que formam pares de base. Na natureza, as interações específicas que levam à formação de par de base são controladas pelo tamanho das bases e pelo padrão de doadores e aceitadores de ligação de hidrogênio das bases. Uma base de purina grande (A ou G) forma par com uma base de pirimidina pequena (T, U ou C). Adicionalmente, o reconhecimento de par de base entre as bases é influenciado pelas ligações de hidrogênio formadas entre as bases. Na geometria do par de base de Watson- Crick, um anel de seis membros (uma pirimidina em oligonucleotídeos naturais) é justaposta a um sistema de anel composto de um anel fundido, de seis membros e um anel de cinco membros (uma purina em oligonucleotídeos naturais), com uma ligação de hidrogênio central ligando dois átomos do anel e ligações de hidrogênio em cada lado unindo grupos funcionais anexados a cada um dos anéis, com grupos doadores formando par com grupos aceitadores.

[0057] Como aqui usado, “ácido nucléico” ou “molécula de ácido nucléico” refere-se aos polinucleotídeos, tais como o ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reação da cadeia da polimerase (PCR) e fragmentos gerados por qualquer um de ligação, cisão, ação de endonuclease e ação de exonuclease. As moléculas de ácido nucléico podem ser compostas de monômeros que são nucleotídeos que ocorrem naturalmente (tais como DNA e RNA), ou análogos de nucleotídeos que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas alfa-enantioméricas dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente), ou uma combinação de ambos. Os nucleotídeos modificados podem ter alterações em porções de açúcar e/ou em porções de base de pirimidina ou purina. As modificações de açúcar incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxila com halogênios, grupos alquila, aminas e grupos azido, ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a porção de açúcar inteira pode ser substituída com estruturas estérica e eletronicamente similares, tais como aza-açúcares e análogos de açúcar carbocíclicos. Os exemplos de modificações em uma porção de base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos de heterocíclicos bem conhecidos. Os monômeros de ácido nucléico podem ser ligados pelas ligações de fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Os análogos de ligações de fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e outros. O termo “molécula de ácido nucléico” também inclui por exemplo, os chamados “ácidos nucléicos peptídicos,” que compreendem bases de ácido nucléico que ocorrem naturalmente ou modificadas ligadas a uma cadeia principal de poliamida. Os ácidos nucléicos podem ser de filamento único ou de filamento duplo.

[0058] O termo “complemento de uma molécula de ácido nucléico” refere-se a uma molécula de ácido nucléico tendo uma sequência de nucleotídeo complementar e orientação reversa quando comparada a uma sequência de nucleotídeo de referência. Por exemplo, a sequência 5’ ATGCACGGG 3’ é complementar à 5’ CCCGTGCAT 3’.

[0059] Uma “molécula de ácido nucléico isolada” é uma molécula de ácido nucléico que não é integrada no DNA genômico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifica um fator de crescimento que foi separado do DNA genômico de uma célula é uma molécula de DNA isolada. Um outro exemplo de uma molécula de ácido nucléico isolada é uma molécula de ácido nucléico quimicamente sintetizada que não é integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucléico que foi isolada de uma espécie particular é menor do que a molécula de DNA completa de um cromossoma desta espécie.

[0060] Uma “construção de molécula de ácido nucléico” é uma molécula de ácido nucléico, de filamento único ou duplo, que foi modificada através de intervenção humana para conter segmentos de ácido nucléico combinados e justapostos em um arranjo não existente na natureza.

[0061] “DNA linear” indica moléculas de DNA não circulares tendo extremidades 5’ e 3’ livres. O DNA linear pode ser preparado a partir de moléculas de DNA circulares fechadas, tais como plasmídeos, pela digestão enzimática ou rompimento físico.

[0062] “DNA complementar (cDNA)” é uma molécula de DNA de filamento único que é formada a partir de um padrão de mRNA pela transcriptase reversa de enzima. Tipicamente, um iniciador complementar às porções de mRNA é utilizado para a iniciação da transcrição reversa. Aqueles habilitados na técnica também usam o termo “cDNA” para se referir a uma molécula de DNA de filamento duplo que consiste de uma tal molécula de DNA de filamento único e os seu filamento de DNA complementar. O termo “cDNA” também refere-se a um clone de uma molécula de cDNA sintetizado a partir de um padrão de RNA.

[0063] “DNA heterólogo” refere-se a uma molécula de DNA, ou uma população de moléculas de DNA, que não existem naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. As moléculas de DNA heterólogas a uma célula hospedeira particular podem conter DNA derivado da espécie de célula hospedeira (isto é, DNA endógeno) contanto que o DNA hospedeiro seja combinado com o DNA não hospedeiro (isto é, DNA exógeno). Por exemplo, uma molécula de DNA que contém um segmento de DNA não hospedeiro que codifica um polipeptídeo operavelmente ligado a um segmento de DNA hospedeiro que compreende um promotor de transcrição é considerado ser uma molécula de DNA heteróloga. Ao contrário, uma molécula de DNA heteróloga pode compreender um gene endógeno operavelmente ligado com um promotor exógeno. Como uma outra ilustração, uma molécula de DNA que compreende um gene derivado de uma célula do tipo selvagem é considerada ser DNA heterólogo se esta molécula de DNA é introduzida em uma célula mutante que carece do gene do tipo selvagem.

[0064] Um “polipeptídeo” é um polímero de resíduos de aminoácido preferivelmente unidos exclusivamente pelas ligações de peptídeo, seja produzido natural ou sinteticamente. Um polipeptídeo produzido pela expressão de uma molécula de DNA não hospedeira é um peptídeo ou polipeptídeo “heterólogo”. O termo “polipeptídeo” como aqui usado abrange proteínas, peptídeos e polipeptídeos, em que as ditas proteínas, peptídeos ou polipeptídeos podem ter sido pós-traducionalmente modificados ou não. A modificação pós-traducional por exemplo pode ser fosforilação, metilação e glicosilação.

[0065] O termo “expressão” refere-se à biossíntese de um gene ou um produto de gene.

[0066] Para “hibridizar” significa recozer os filamentos de ácido nucléico de fontes diferentes; isto é, formar pares de base entre regiões complementares de dois filamentos de DNA que originalmente não formaram pares. O termo “hibridização sob condições severas” é definido de acordo com Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1,101-1,104. Preferivelmente, a hibridização sob condições severas significa que depois da lavagem por 1 h com 1 vez SSC e 0,1 % de SDS a 50 graus C, preferivelmente a 55 graus C, mais preferivelmente a 62 graus Ceo mais preferivelmente a 68 graus C, particularmente por 1 h em 0,2 vezes SSC e 0,1 % de SDS a 50 graus C, preferivelmente a 55 graus C, mais preferivelmente a 62 graus Ceo mais preferivelmente a 68 graus C, um sinal de hibridização positivo é observado.

[0067] Um trecho de “homologia completa” é definido como um emparelhamentto de nucleotídeos que formam par ao longo da sequência dos nucleotídeos que interagem; no RNA que ocorre naturalmente a formação de par de A com U e G com C.

[0068] Um “promotor” é uma sequência de nucleotídeo que direciona a transcrição de um gene estrutural. Tipicamente, um promotor está localizado na região não codificadora 5’ de um gene, próximo ao sítio de início transcricional de um gene estrutural. Os elementos de sequência dentro dos promotores que funcionam no início da transcrição são frequentemente caracterizados pelas sequências de nucleotídeo de consenso. Se um promotor é um promotor indutível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Ao contrário, a taxa de transcrição não é regulada por um agente indutor se o promotor é um promotor constitutivo. Os promotores repressíveis também são conhecidos.

[0069] Um “elemento regulador” é uma sequência de nucleotídeo que modula a atividade de um promotor. Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma sequência de nucleotídeo que se liga com fatores celulares que possibilitam a transcrição exclusiva ou preferencialmente em células, tecidos, ou organelas particulares. Estes tipos de elementos reguladores são normalmente associados com genes que são expressados em uma maneira “específica de célula,” “específica de tecido,” ou “específica de organela”.

[0070] Um “intensificador” é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficiência de transcrição, independente da distância ou orientação do intensificador em relação ao sítio de início de transcrição.

[0071] Um “vetor de clonagem” é uma molécula de ácido nucléico, tal como um plasmídeo, cosmídeo, ou bacteriófago que tem a capacidade de replicar autonomamente em uma célula hospedeira. Os vetores de clonagem tipicamente contém um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que permite a inserção de uma molécula de ácido nucléico em uma maneira determinável sem a perda de uma função biológica essencial do vetor, assim como sequências de nucleotídeo que codificam um gene marcador que é adequado para o uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem. Os genes marcadores tipicamente incluem genes que fornecem resistência à tetraciclina ou ampicilina.

[0072] Um “vetor de expressão” é uma molécula de ácido nucléico que codifica um gene que é expressado em uma célula hospedeira, tipicamente, um vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene e um terminador de transcrição. A expressão de gene é usuahnente colocada sob o controle de um promotor e um tal gene é dito estar “operavelmente ligado ao” promotor. Similarmente, um elemento regulador e um promotor de núcleo são operavelmente ligados se o elemento regulador modula a atividade do promotor de núcleo. Vetores mais simples chamados de “vetores de transcrição” são apenas capazes de serem transcritos mas não traduzidos: eles podem ser replicados em uma célula alvo mas não expressados, diferente dos vetores de expressão. Os vetores de transcrição são usados para amplificar o seu inserto.

[0073] Um “hospedeiro recombinante” é uma célula que contém uma molécula de ácido nucléico heteróloga, tal como um vetor de clonagem ou vetor de expressão.

[0074] A transfecção descreve a introdução de material estranho em células eucarióticas. O termo ‘transfecção’ para métodos não virais é mais frequentemente usado em referência às células de mamífero, enquanto que o termo ‘transformação’ é preferido para descrever a transferência de DNA não virai em bactérias e células eucarióticas não animais tais como fungos, algas e plantas. Métodos tanto químicos quanto físicos podem ser utilizados para transfectar células.

[0075] Um “polipeptídeo” é um polímero de resíduos de aminoácido preferivelmente unidos exclusivamente pelas ligações peptídicas, seja natural ou sinteticamente produzido. Um polipeptídeo produzido pela expressão de uma molécula de DNA não hospedeira é um peptídeo ou polipeptídeo “heterólogo”. O termo “polipeptídeo” como aqui usado abrange proteínas, peptídeos e polipeptídeos, em que os ditos proteínas, peptídeos ou polipeptídeos podem ou ter sido pós-traducionalmente modificados ou não. A modificação pós-traducional por exemplo pode ser a fosforilação, metilação e glicosilação.

[0076] Um “resíduo de aminoácido” pode ser um resíduo de aminoácido natural ou não natural ligado pelas ligações peptídicas ou ligações diferentes das ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácido podem estar na configuração D ou configuração L. Um resíduo de aminoácido compreende uma parte de terminal de amino (NH2) e uma parte de terminal carbóxi (COOH) separadas por uma parte central que compreende um átomo de carbono, ou uma cadeia de átomos de carbono, pelo menos um dos quais compreende pelo menos uma cadeia lateral ou grupo funcional. NH2 refere-se ao grupo amino presente na extremidade do terminal de amino de um aminoácido ou peptídeo e COOH refere-se ao grupo carbóxi presente na extremidade de terminal carbóxi de um aminoácido ou peptídeo. O termo genérico aminoácido compreende aminoácidos tanto naturais quanto não naturais. Os aminoácidos naturais da nomenclatura padrão como listados na J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969) e adotados na 37 C.F.R., seção 1.822(b)(2) pertencem ao grupo de aminoácidos listados na Tabela 1 aqui abaixo. Os aminoácidos não naturais são aqueles não listados na Tabela 1. Os exemplos de aminoácidos não naturais são aqueles listados por exemplo, na 37 C.F.R. seção 1.822(b)(4), todos dos quais são aqui incorporados por referência. Também, os resíduos de aminoácido não naturais incluem, mas não são limitados a, resíduos de aminoácido modificados, resíduos de L-aminoácido e estereoisômeros de resíduos de D-aminoácido.

Tabela 1. Aminoácidos naturais e seus respectivos códigos.

[0077] Um “resíduo de aminoácido equivalente” refere-se a um resíduo de aminoácido capaz de substituir um outro resíduo de aminoácido em um polipeptídeo sem substancialmente alterar a estrutura e/ou funcionalidade do polipeptídeo. Os aminoácidos equivalentes assim têm propriedades similares tais como tamanho da cadeia lateral, polaridade da cadeia lateral (polar ou não polar), hidrofobicidade (hidrofóbico ou hidrofílico), pH (ácido, neutro ou básico) e organização da cadeia lateral de moléculas de carbono (aromática/alifática). Como tal, “resíduos de aminoácido equivalentes” podem ser considerados como “substituições de aminoácido conservativas”.

[0078] A classificação de aminoácidos equivalentes refere-se em uma forma de realização às seguintes classes: 1) HRK, 2) DENQ, 3) C, 4) STPAG, 5) MILV e 6) FYW.

[0079] Dentro do significado do termo “substituição de aminoácido equivalente” como aqui aplicado, um aminoácido pode ser substituído no lugar de um outro, em uma forma de realização, dentro dos grupos de aminoácidos indicados aqui abaixo: Aminoácidos tendo cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr e Cys) Aminoácidos tendo cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro e Met) Aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile) Aminoácidos tendo cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) Aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp) Aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas (Asp, Glu) Aminoácidos tendo cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His) Aminoácidos tendo cadeias laterais de amida (Asn, Gin) Aminoácidos tendo cadeias laterais de hidróxi (Ser, Thr) Aminoácidos tendo cadeias laterais que contém enxofre (Cys, Met), Aminoácidos neutros, fracamente hidrofóbicos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr) Aminoácidos hidrofílicos, ácidos (Gin, Asn, Glu, Asp), e Aminoácidos hidrofóbicos (Leu, Ile, Vai)

[0080] A presente invenção também diz respeito a variantes de Hsp70, ou fragmentos deste, em que as substituições foram planejadas pela análise computacional que usa a homologia de sequência para prognosticar se uma substituição afeta a função da proteína (por exemplo, Pauline C. Ng e Steven Henikoff, Genome Research, Vol. 11, Issue 5, 863-874, Maio de 2001).

[0081] Devido à imprecisão dos métodos analíticos padrão, os pesos moleculares e comprimentos de polímeros são entendidos ser valores aproximados. Quando um tal valor é expressado como “cerca de” X ou “aproximadamente” X, o valor estabelecido de X será entendido ser preciso até +/- 20 %, tal como +/- 10 %, por exemplo +/- 5 %. Descrição dos Desenhos

Figura 1

[0082] Os efeitos de Hsp70 sobre a ligação de aSMase a BMP e níveis de ceramida. (A) Ligação de 0,2 pM de aSMase aos lipossomas que contém BMP no pH 4,5 como uma função de Hsp70 pré-ligado (experimento análogo ao Exemplo 1, ver materiais e métodos aqui para mais detalhes). Hsp70 foi deixado dissociar por 10 min, por meio deste atingindo uma assintota inferior para dissociação antes da adição de aSMase). (B) Microscopia confocal e quantificação de níveis de ceramida em iMEFs tipo selvagem (WT) e transgênico em Hsp70 (Hsp70-TG). A imunodetecção foi realizada com um anticorpo monoclonal de camundongo contra ceramida (clone 15b4). A quantificação foi feita com base nas micrografias de varredura de laser de 6 áreas pré-definidas, depois que a quantificação foi feita no software LSM Duo.

Figura 2

[0083] O efeito de rHsp70 sobre a atividade da esfingomielinase ácida em iMEF-WT (fibroblastos embrionários de murino imortalizados, tipo selvagem). rHsp70 foi administrado às células a 3 nM, 30 nM e 300 nM e a atividade de aSMase medida (A500 é uma medida da ceramida produzida que aumenta a turbidez). As células de controle foram tratadas com BS A (albumina sérica bovina).

Figura 3

[0084] Atividade de SMase ácida em fibroblastos diferentes. NPDA: doença de Niemann-Pick tipo A.

Figura 4

[0085] Esquema de hidrólise de esfingolipídeo principal. A ruptura exoidrolítica de esfingolipídeos com grupos de ponta hidrofílicos curtos requer proteínas ativadoras de esfingolipídeo de co-fatores não enzimáticos (SAPs ou saposinas). Tanto as deficiências herdadas da respectiva enzima assim como da proteína ativadora correspondente causa a armazenagem de lipídeo lisossômica e resulta na expressão de vários esfingolipídeos. A partir de Ferlintz etal., Chem. Phys. Lipids, (102) 35-43, 1999.

Figura 5

[0086] Hsp70 lisossômico estabiliza membranas lisossômicas. (a) Imagens confocais representativas de células U-2-OS incubadas com 300 nM de rHsp70-AF488 (verde) por 24 h, fixadas e tingidas quanto a proteína-1 de membrana integral lisossômica (LIMP-1; vermelho). Para a co-localização com outros marcadores de organela ver a Fig. 9. (b) as células U-2-OS foram incubadas com 300 nM de rHsp70-AF488 por 24 h antes da quantificação de rHsp70-AF488 em membranas (memb.) e sobrenadante (sup.) obtido pelos ciclos de congelamento/ descongelamento repetidos e centrifugação da fração de membrana leve (LMF). A análise de imunomancha de proteína de membrana associada a lisossoma 2 (LAMP-2) e catepsina B (Cat B) demonstram a validade do procedimento de fracionamento, (c) Imagens fotográficas representativas de células U-2-OS expostas à foto-oxidação (laranja de acridina e azul claro). A perda de integridade lisossômica é visualizada pela perda de vermelho e aumento no tingimento verde, (d e e) As células U-2-OS foram incubadas com proteínas recombinantes indicadas (300 nM) por 24 h e analisadas quanto a integridade lisossômica na foto-oxidação. Quando indicado, as células foram tratadas com siRNAs indicados por 48 h antes da adição de proteínas recombinantes (e). Os valores representam médias ± SD para três (d) ou cinco (e) experimentos independentes. As imunomanchas representativas de proteínas indicadas de células U-2-OS deixadas não tratadas ou tratadas com controle ou siRNAs de Hsp70 são mostradas na direita. Barras de escala: 20 pm (a e c).

Figura 6

[0087] Uma interação dependente do pH entre Hsp70 e BMP estabiliza as membranas lisossômicas. (a) Mudanças relativas na dispersão de luz a 90° de lipossoma na adição de rHsp70 (em alíquotas de 0,12 nmol) aos lipossomas que contém os lipídeos indicados (x = 0,2) no pH 7,4 (esquerdo) e pH 6,0 (direita), (b) As células U-2-OS foram deixadas não tratadas (-) ou incubadas com 50 pg/ml de anti-BMP ou IgG de controle por 7 h antes da adição de veículo (-) ou 300 nM de rHsp70 por 24 h e analisadas quanto a integridade lisossômica na foto-oxidação, (c) As células U-2-OS foram deixadas não tratadas ou incubadas com 50 pg/ml de anti-BMP ou IgG de controle por 7 h antes da adição de veículo (-) ou 25 pM de cisplatina por 24 h e analisadas quanto a morfologia de célula apoptótica a seguir do tingimento Hoechst 33342. (d) Interação de rHsp70 e seus mutantes com lipossomas POPC/ BMP (XBMP = 0,2) no pH 6,0 como medido pelas mudanças na intensidade de fluorescência de pico relativa. As concentrações de proteína foram de 0,36 pM (rHsp70), 0,5 pM (ΔATP) e 0,35 pM (ΔPBD) (esquerda) ou 0,43 pM (direita) e lipossomas foram adicionados em 10 pM alíquotas, (e) a análise BIAcore de interações entre rHsp70 tipo selvagem (WT) e a sua deleção (ΔATP e ΔPBD) e mutantes pontuais (W90F e W580F) com LUVs imobilizadas no pH 4,5 (diâmetro médio: 100 nm; concentração de lipídeo total: 0,1 mM; composição: esfingomielina (x = 0,1), fosfatidilcolina (x = 0,5), colesterol (x = 0,2) e BMP (x = 0,2)). Os lipossomas foram injetados até o equilíbrio (100 s) e concentrações indicadas (esquerda) ou 300 nM (direita) de proteínas recombinantes em tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5) foram injetados por 200 s em uma taxa de fluxo de 20 pl/min seguido por uma fase de dissociação por 10 min. ARU é definido como a diferença entre o sinal de resposta medido depois do equilíbrio de lipossoma e equilíbrio de proteína-lipossoma. (f e g) As células U-2-OS foram deixadas não tratadas (Controle) ou incubadas com proteínas Hsp70 recombinantes indicadas (300 nM) por 24 h e analisadas quanto a integridade lisossômica na foto-oxidação (f), ou tratadas com veículo (barras brancas) ou 25 pM de cisplatina (barras pretas) por 24 h e analisadas quanto a apoptose como morfologia (g). (h) modelos de fita e superfície celular do domínio de ATPase de Hsp70. ATP (representação de superfície de van der Waal) pode ser visualizado ligado na bolsa de ligação de ATP. As esferas verde e púrpura denotam a superfície de van der Waals dos íons de Cálcio e Sódio coordenados, respectivamente. Informação da parte positivamente carregada do domínio no fundo e na posição de W90. Os valores representam médias ± SD por um mínimo de cinco experimentos independentes (b, c, f e g).

Figura 7

[0088] Hsp70 estimula a atividade de ASM que por sua vez estabiliza lisossomas. (a) Medição Biacore da ligação de 200 nM de rASM para lipossomas que contém BMP no pH 4,5 como uma função de rHsp70 pré- ligado. Os experimentos foram realizados como descrito na legenda para a fig. 6e com rASM adicionado por 180 segundos depois que a fase de dissociação de rHsp70 de 10 min seguida ainda por uma fase de dissociação de 10 min. (b) atividade ASM nos lisados do tipo selvagem (WT) e MEFs transgênicos em Hsp70 (Hsp70) (painel esquerdo) e em MEFs WT incubados com 300 nM de rHsp70 por 24 ou 48 horas como indicado, (c e d) Viabilidade (redução de MTT; c) e atividade de catepsina citossólica (zFRase; d) em iMEFs WT e Hsp70 tratados com as concentrações indicadas de desipramina por 3 horas, (e) Formação de imagem de célula única viva de perda de integridade lisossômica (foto-oxidação em MEFs WT e Hsp70 assim como MEFs Hsp70 incubados por 3 horas com 12,5 e 25 pM de Desipramina (painéis esquerdo e direito, respectivamente). Perda de vermelho (painel esquerdo) e aumento na fluorescência verde (painel direito) foram continuamente medidos para dar curvas cinéticas completas quanto a perda de integridade lisossômica. 25 a 60 células foram examinadas pr. experimento a partir de áreas pré-definidas), p < 0,001 para Hsp70 vs. WT e Hsp70 + despramina vs. Hsp70. Todos os valores representam médias ± SD para um mínimo de 3 experimentos independentes.

Figura 8

[0089] rHsp70 estimula a atividade de ASM, estabiliza lisossomas e diminui o volume lisossômico em fibroblastos de NPDA. (a) A formação de imagem de célula única viva de estabilidade lisossômica de fibroblastos primários de um paciente com NPDA analisado como na Fig 3e, p < 0,001. (b) atividade ASM de fibroblastos NPDA deixados não tratados ou tratados com 300 nM de rHsp70 por 48 h (painel esquerdo), ou com 150 nM de rASM sozinho ou em combinação com 300 nM de rHsp70 por 24 h (painel direito). Os valores p foram calculados a partir da velocidade enzimática obtida (DA 500/mg proteína/min). O quadro na direita demonstra a captação endocítica de rASM (verde) e a sua localização para o compartimento lisossômico como visualizado pelo co-tingimento com Lysotracker Red. (c) Estabilidade lisossômica de fibroblastos de NPDA deixados não tratados ou tratados por 24 h com 300 nM de rHsp70, 150 nM de aSMase ou uma combinação de rHsp70 e aSMase foram analisados como na Fig 3e. p < 0,001 para todos os tratamentos quando comparados com células não tratadas, (d) Quantificação da área lisossômica de seções cruzadas confocais de células em fibroblastos NPDA deixados não tratados ou tratados por 24 h com 300 nM de BSA, 300 nM de rHsp70, 150 nM de rASM (150 nM) ou uma combinação de rHsp70 e rASM. O quadro na direita demonstra o efeito de rHsp70 (verde) sobre o volume do compartimento lisossômico (vermelho) em fibroblastos NPDA. As setas brancas indicam células com rHsp70 submetido à endocitose e compartimento lisossômico deminshed. Os valores representam médias ± SD para 3 experimentos independentes. Barras de escala = 20 pM. UT = não tratado.

Figura 9

[0090] Colocalização de rHsp70-AF488 submetido à endocitose com lisossomas. Imagens confocais representativas de células U-2-OS incubadas com 300 nM de rHsp70-AF488 (verde) por 24 h, fixadas e tingidas para os seguintes marcadores de organela (vermelho): proteína-1 de membrana associada a lisossoma (LAMP-1; lisossomas), LAMP-2 (lisossomas), LBPA/BMP (6C4; compartimento endolisossômico), corte c (mitocondria), SERCA (ER) e golgin-97 (Golgi). Barras de escala: 20 pm (LAMP-1, LAMP- 2 e BMP) ou 10 pm (Cyt c, SERCA e Golgin97).

Figura 10

[0091] Interação de rASM (aSMase recombinante) e BMP na presença de rHsp70. (a) interação de rASM com lipossomas aniônicos imobilizados (o diâmetro médio é de 100 nm, a concentração de lipídeo total é de 0,1 mM e composição; 10 % em mol de esfmgomielina, 50 % em mol de fosfatidilcolina, 20 % em mol de colesterol e 20 % em mol de BMP) no pH 4,5. Os sinais de resposta medidos subsequente à ligação dos lipossomas foram definidos como zero, (b) O efeito de rHsp70 pré-ligado sobre a ligação subsequente de rASM. As quantidades indicadas de rHsp70 foram incubadas com lipossomas aniônicos imobilizados de modo idêntico a (a). Depois de uma fase de dissociação de 10 min de rHsp70, 200 nM de rASM foram adicionados por 180 s seguidos por 10 min de dissociação.

Figura 11

[0092] Efeito do indutor de molécula pequena de Hsp70; Álcool Benzílico sobre fibroblastos de paciente com Niemann-Pick Tipo A (NPDA). (A) Indução de Hsp70 em NPDA Gõtz pelo Álcool benzílico em uma maneira dependente da dose (expressão da proteína). (B) Estabilidade aumentada de lisossomas NPDA Gõtz depois do tratamento de células NPDA Gõtz com 40 mM de Álcool benzílico. (C) Patologia diminuída em células NPDA Gõtz depois do tratamento com 40 mM de Álcool benzílico, como medida pela área de seção transversal lisossômica (método detalhado ainda mais no Exemplo 2).

Figura 12

[0093] Efeito do esgotamento de aSMase sobre a estabilidade lisossômica. RNAs interferentes pequenos (siRNAs) que alvejam a Esfingomielinase ácida (si938, sil257, sil340) e um siRNA de controle (mm) foram transfectados em células U2OS usando Oligofectamina (Invitrogen) de acordo com as diretrizes do fabricante. Concentração de siRNAs: 50 nM. Depois de 72 h horas o silenciamento foi confirmado via RT-PCR (não mostrado) e a células analisadas quanto a estabilidade lisossômica via formação de imagem de célula única viva na foto-oxidação mediada pelo laranja de acridina. O aumento na fluorescência verde foi continuamente medido para dar curvas cinéticas completas para a perda de integridade lisossômica. Como evidente a parir dos gráficos as células tratada com siRNAs que alvejam aSMase mostram uma diminuição acentuada na estabilidade lisossômica. O método é explicado ainda no Exemplo 2.

Figura 13

[0094] Tratamento de todas as linhagens de célula NPDA/B com rHsp70 dramaticamente reverte a patologia lisossômica, isto é, reduz a área de seção transversal de lisossomas. A quantificação da área lisossômica de seções transversais confocais de células de fibroblastos na doença de Niemann-Pick Tipo A e B (NPDA/NPDB) e fibroblastos normais (BJ) deixados não tratados ou tratados por 24 h com 300 nM de BSA ou Dextrano como controle, ou tratados por 24 h com 300 nM de rHsp70, 150 nM de rhaSMase ou uma combinação destes. As células NPDA tratadas por 24 h com 300 nM de rHsp70-W90F (W90F) - o mutante de Hsp70 que não interage com BMP, tem um efeito comparável às células de controle. Ver o Exemplo 2 para métodos.

Figura 14

[0095] Atividade aumentada de aSMase em fibroblastos transgênicos em Hsp70 e fibroblastos de NPDA tratados com rHsp70. A análise espectrométrica de massa de espécies de lipídeo (esfingomielina e ceramida como indicado) em fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados (iMEFs), tipo selvagem (WT) ou transgênicos em Hsp70 (TG) (A e B), assim como fibroblastos de paciente com a doença de Niemann-Pick tipo A (NPDA 83/24) deixados não tratados ou tratados com rHsp70 (C). Os níveis mais baixos de esfingomielina e os níveis mais altos de ceramida indicam uma atividade aumentada de esfingomielinase ácida.

Figura 15

[0096] Reversão da Patologia em Fibroblastos de Paciente com a Doença de Farber. Quantificação de área lisossômica de seções transversais confocais de células de Pacientes com a Doença de Farber. Os fibroblastos de paciente com a Doença de Farber (Farber 89/73 e Farber 89/78) foram deixados não tratados ou tratados por 24 h com 300 nM de BSA ou 300 nM de rHsp70 como indicado. Como evidente a partir das figuras, o tratamento de fibroblastos de paciente com a doença de Farber com rHsp70 dramaticamente reverte a patologia lisossômica, isto é, reduz a área de seção transversal de lisossomas. Ver o Exemplo 2 para uma descrição de métodos.

Figura 16

[0097] Hsp70 aumenta a captação endocítica de outras moléculas. Painel A: fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados (iMEF), tipo selvagem (WT) ou transgênico quanto a Hsp70 (TG) foram incubados com 20 pg/ml de BSA rotulado com Alexa Fluor-488 (BSA*) por 24 h. A captação endocítica foi verificada pela microscopia de fluorescência (não mostrada) (ver o exemplo 2). As células foram depois colhidas e analisadas quanto a captação de BSA*. Como evidente a partir da figura as iMEFs transgênicas em Hsp70 tiveram uma captação significantemente mais alta de BSA* do que as iMEFs tipo selvagem. Painel B: Células de osteossarcoma U2OS foram incubadas com 20 pg/ml de BSA* por 24 h com 3000 nM de rHsp70 ou sem como indicado. A captação endocítica foi verificada pela microscopia de fluorescência (não mostrado) (ver o exemplo 2). As células foram depois colhidas e analisadas quanto a captação de BSA*. Como evidente a partir da figura, as células U2OS em que BSA* e rHsp70 foram adicionadas juntas tiveram uma captação significantemente mais alta de BSA* do que as células incubadas apenas com BSA*. Descrição Detalhada da Invenção

[0098] Como é demonstrado pelos presentes inventores, Hsp70 exerce uma parte maior do seu efeito citoprotetor através de uma interação direta com membrana endo-lisossômicas; uma interação que é orquestrada por um fosfolipídeo específico, a saber BMP (bis(monoacilglicero)fosfato). BMP está presente apenas em endossomas e lisossomas tardios. Os inventores mostram que a interação Hsp70-BMP é dependente do domínio de ATP-ase do terminal N de Hsp70, especificamente triptofano 90 e também que a interação é dependente do pH. A interação entre Hsp70 e BMP é essencial para o efeito de estabilização de membrana de Hsp70, pelo fornecimento de uma plataforma para modular a estabilidade de um subconjunto específico de enzimas lisossômicas e prevenir a desestabilização das membranas lisossômicas com a liberação resultante de enzimas lisossômicas. Estas descobertas formam a base para uma nova e promissora modalidade de tratamento para os distúrbios de armazenagem lisossômica, como aqui divulgados.

Lisossomas

[0099] Desde a descoberta dos lisossomas por de Duve em 1955, a idéia desta organela foi dominada pelo dogma de que a mesma é unicamente o término do caminho endocítico em células de animal - um compartimento que abriga um vasto arranjo de hidrolases, que, se liberadas no citossol, causam necrose e inflamação de tecido. Esta idéia dos lisossomas como, na melhor das hipóteses, uma unidade de descarte de lixo e na pior, um “saco suicida” não específico tem mudado dramaticamente devido às descobertas recentes que fornecem evidência para numerosas tarefas mais específicas para os lisossomas e seus conteúdos.

Hidrolases Lisossômicas

[00100] Como o compartimento principal para a degradação intracelular e subsequente reciclagem de constituintes celulares, os lisossomas recebem cargas tanto hetero- quanto autofágicas, que no lúmen desta organela encontram o seu destino final. A degradação é realizada por várias hidrolases ácidas (fosfatases, nucleases, glicosidases, proteases, peptidases, sulfatases, Upases, etc) capazes de digerir todas as macromoléculas celulares principais. Entre as proteases lisossômicas melhor estudadas está a família de catepsina proteases. As catepsinas podem ser divididas em três subgrupos de acordo com seu aminoácido de sítio ativo, isto é, catepsinas de cisteína (B, C, H, F, K, L, O, S, V, W e X/Z), aspartato (D e E) e serina (G). As catepsinas funcionam otimamente no pH ácido dos lisossomas (pH 4 a 5) embora elas possam funcionar ainda no pH neutro fora dos lisossomas, ainda que tenham estabilidade diminuída e/ou especificidade alterada.

[00101] Até recentemente a função das catepsinas foi considerada ser limitada à metabolização de proteína intralisossômica e a degradação da matriz extracelular uma vez secretada. Entretanto, durante os poucos anos passados muitas das catepsinas foram reconhecidas com funções mais específicas incluindo papéis na remodelagem óssea, apresentação de antígeno, homeostase epidérmica, processamento pró-hormonal, proteção de linfócitos citotóxicos de auto-destruição depois da desgranulação, manutenção do sistema nervoso central em camundongos, angiogênese, invasão de célula cancerosa assim com a morte celular programada (PCD).

[00102] Independentemente da ruptura de proteínas, os lisossomas e endossomas tardios também são responsáveis pelo metabolismo de lipídeos celulares, tais como os glicoesfingolipídeos, através de uma série de enzimas e co-ensimas endolisossômicas, cuja própria função depende da composição do lipídeo das membranas intra-lisossômicas. A importância do metabolismo de lipídeo endolisossômico funcional pode ser facilmente avaliada pelo fato de que a doença clínica está evidente no caso de disfunção em qualquer estágio do metabolismo esfmgolipídico, dando origem a doenças tais como Doenças de Tay-Sachs, Sandhoff, Farber, Fabry, Gaucher, Krabbe e Niemann-Pick.

Trafego para os e a partir dos lisossomas

[00103] O tráfego de membranas endociticas serve para um papel essencial na célula de mamífero através da sua liberação de componentes de membrana, várias moléculas solúveis e ligantes associados a receptor a uma faixa de compartimentos intracelulares. Embora as várias vias endocíticas até recentemente parecessem simples, com os caminhos principais convergindo nos lisossomas, onde a degradação e possível reciclagem de volta para a membrana plasmática ocorreria, evidência recente mostra que estes caminhos são mais complexos do que primeiro imaginado.

A via endocítica

[00104] A endocitose é melhor entendida em termos da endocitose mediada por receptor de moléculas via a formação de buracos revestidos com clatrina, embora uma variedade de vias endocíticas não mediadas por clatrina (por exemplo, macropinocitose, fagocitose, captação via formação de cavéolas e formação de buraco não revestido por clatrina) também tenha sido identificada. A nomenclatura do sistema endocítico não foi totalmente padronizado e o termo habitualmente usado “endossoma inicial” de fato descreve dois compartimentos endossômicos distintos - o endossoma classificador e o compartimento de reciclagem endocítica (ERC). No caminho endocítico mediado por receptor convencional, receptores tais como o receptor de transferrina, o receptor da lipoproteína de densidade baixa e o receptor da 6-fosfato manose (MPR) concentram-se nos buracos revestidos de clatrina na superfície da membrana plasmática em virtude de interações entre os motivos de sequência em suas caudas citoplásmicas e elementos no revestimento de clatrina. Depois de desprendido do seu revestimento de clatrina, o endossoma recém formado funde com outros endossomas e endossomas classificadores pré-existentes para se tomar um endossoma classificador. Como o nome implica, a sua tarefa primária é classificar componentes recém adquiridos para as suas localizações corretas. Os três destinos conhecidos incluem a membrana plasmática, os endossomas tardios e o ERC. Conforme o endossoma classificador amadurece, o mesmo experiencia uma queda no pH, que facilita a liberação de ligantes ligados ao receptor no lúmen do endossoma. Antes da maturação completa do endossoma classificador no endossoma tardio, entretanto, as moléculas destinadas à reciclagem devem ser separadas. Acredita-se que este processo ocorre através do estrangulamento de túbulos estreitos, um processo, que favorece a separação de proteínas de membrana das moléculas solúveis visto que a razão da área de superfície para o volume dos túbulos é maior do que aquele dos endossomas de separação vesicular. Os túbulos estrangulados podem colocar as proteínas de membrana diretamente de volta à membrana plasmática (o caminho de retomo direto) ou ao ERC. O ERC é principalmente uma coleção de organelas tubulares, cuja localização varia entre tipos de célula. Embora o ERC seja capaz de classificar moléculas para vários destinos diferentes, a maioria das moléculas que transitam via o ERC retomam para a membrana plasmática.

[00105] Conforme o endossoma de classificação amadurece, o seu pH luminal cai constantemente, principalmente devido à ação da ATPase de próton tipo vacuolar (V-ATPase), enquanto que mudanças no lipídeo de membrana e composição de proteína também ocorrem. O tráfego de membrana do endossoma de classificação para o endossoma tardio e ainda no lisossoma foi o cenário de alguma controvérsia. A disputa diz respeito a se este transporte é melhor explicado via transporte vesicular ou pela maturação do endossoma de classificação. Ambos os modelos fornecem um intermediário entre os endossomas de classificação e o tardio. Embora o modelo de maturação prova que a vesícula, que atinge o endossoma tardio, é o que permanece depois da remoção de componentes do primeiro endossoma de classificação, o modelo de compartimento pré-existente prova que o transporte de moléculas para os endossomas tardios ocorre via uma vesícula carregadora endocítica (ECV), uma vesícula de transporte específica entre os compartimentos endossômicos de classificação e tardios pré-existentes. Tanto o compartimento endossômico de classificação quanto o tardio são considerados ser estruturalmente mais complexos e ter funções mais especializadas do que as vesículas carregadoras. Entretanto, estudos de formação de imagem de célula viva recentes têm conciliado aspectos mecanísticos de ambos os modelos, visto que as vesículas que surgem de uma rede endossômica inicial dinâmica podem sofrer uma conversão em que elas perdem o GTPase RAB5 pequeno e recrutam RAB7, um marcador de endossomas tardio. Embora a organização do caminho endocítico é funcionalmente bem definido, a nomenclatura pode ser confusa. Funcionalmente, o caminho endocítico é definido pelos receptores de administração interna (por exemplo, o receptor de transferrina) e outros lipídeos e proteínas que são ciciados através do endossoma inicial/endossoma de classificação onde o desacoplamento de receptor-ligando ocorre - mas não através de endossomas tardios onde a proteólise pode ocorrer. Entretanto além desses critérios funcionais, a situação se toma mais nebulosa quando a mesma atinge a nomenclatura, não menos importante de modo a gerar vesículas intraluminais, começando nos endossomas iniciais e tomando-se mais e mais proeminentes durante a maturação para endossomas tardios, tem dado origem ao termo “corpos multivesiculares” (MVB). Este termo foi usado intercambiavelmente como um outro nome para as ECVs e endossomas tardios assim como para todas as vesículas endocíticas que contém regiões ou elementos multivesiculares, incluindo a organela híbrida que se forma quando os lisossomas se fundem com os endossomas tardios (que contêm estruturas multivesiculares). Entretanto, os endossomas tardios contêm mais vesículas de membrana luminal do que os endossomas iniciais e são assim frequentemente o compartimento descrito pelo termo “corpos multivesiculares”.

[00106] Finalmente, uma quantidade substancial de confusão no campo tem surgido da definição, ou antes da falta desta, de endossomas tardios versus lisossomas. Ambos os compartimentos são igualmente ácidos e a maioria, se não todas, das proteínas presentes nos lisossomas também são encontradas nos endossomas tardios. De acordo com o modelo de maturação, os endossomas tardios seriam precursores para os lisossomas, mas dado o desenvolvimento gradual, como a teoria sugere, uma classificação severa pode ser muito difícil de se obter. Recentemente, entretanto, evidência tem sido apresentada quanto a lisossomas e endossomas tardios sendo compartimentos separados, que depois passam ambos por eventos de “tocar de leve” (fusões transitórias) assim como eventos de fusão completa, depois do que os lisossomas pode reformar a partir da organela híbrida. A via biossintética

[00107] Independentemente da endocitose, os endossomas tardios também recebem carga via o caminho MPR da rede trans-golgi (TGN) (a via biossintética). A MPR dependente de cátion e o receptor da MPR independente de cátion/ fator de crescimento-II como insulina (IGF-II) compartilham a tarefa de liberação de hidrolases ácidas recém sintetizadas a partir de TGN para os lisossomas. O reconhecimento de hidrolases ácidas pelas MPRs requer a adição de carboidratos no retículo endoplasmático e a modificação e fosforilação subsequentes dos resíduos de carboidrato para porções de manose-6-fosfato no cis-Golgi. As hidrolases ligadas a MPR são primeiro liberadas aos endossomas, onde elas se dissociam dos receptores devido à queda no pH do lúmen, permitindo deste modo que os receptores reciclem de volta para o TGN. A proteína principalmente responsável pela classificação das MPRs em buracos revestidos de clatrina no TGN, é uma proteína-1 adaptadora (AP-1), Embora as proteínas que ligam o fator de ribosilação de ADP que contém alça y (GGAs) localizadas em Golgi, também desempenhem uma parte. Se AP-1 e as GGAs funcionam de comum acordo ou de fato alvejam as duas MPRs para localizações subcelulares diferentes é presentemente desconhecido. AP-1 é parte de uma família de proteína adaptadora que consiste de quatro membros, todos os quais são proteínas heterotetraméricas utilizadas extensivamente no caminho secretor e endocítico. Além do papel mencionado acima de AP-1 em buracos revestidos de clatrina formados em TGN, AP-1 e AP-2 são usados em buracos revestidos de clatrina durante a endocitose na membrana plasmática, enquanto que AP-3 e AP-4 funcionam no tráfego das proteínas de membrana associadas com lisossoma (LAMPs).

A via autofágica

[00108] A autofagia é a terceira via bem caracterizada pela qual as macromoléculas atingem o lisossoma. A autofagia é um caminho evolucionariamente conservado envolvido na metabolização de proteínas e organelas de vida longa. A mesma usualmente opera em níveis basais baixos, embora possa ser induzida, por exemplo sob condições de privação de nutriente. Sob estas condições a macroautofagia é o caminho principal responsável pela liberação de material para os lisossomas. A macroautofagia é caracterizada por uma cisterna de membrana plana que se enrola em tomo das organelas citoplásmicas e/ou uma porção do citossol formando deste modo um vacúolo fechado ligado à membrana dupla, o autofagossoma. O autofagossoma finalmente funde com lisossomas formando autofagolisossomas/autolisossomas, onde a degradação e reciclagem das macromoléculas engolfadas ocorrem. A origem da membrana de autofagossoma ainda não foi esclarecida. O retículo endoplasmático, Golgi, um compartimento de membrana menos bem caracterizado chamado fagóforo assim como a síntese de novo todos foram propostos como origens da membrana autofagossômica. Progresso recente através das genéticas da levedura e a descoberta subsequente de homólogos de mamífero estão rapidamente intensificando o entendimento do processo de autofagia e esperançosamente verterá luz também sobre a origem da membrana autofagossômica no futuro próximo.

[00109] Existe também outras vias pelas quais os lisossomas recebem carga autofágica. Um processo bastante indiscriminado denominado microautofagia é caracterizado pelo engolfamento de citossol pelos lisossomas através de invaginações da membrana lisossômica. Além das macromoléculas, que estão presentes no citossol engolfado, este processo também pode envolver a captação de organelas tais como peroxissomas. Finalmente, o transporte mediado por chaperona de proteínas citossólicas no lúmen lisossômico apresenta uma forma mais direta e seletiva de autofagia. Este caminho é dependente da presença do membro constitutivamente expressado da família da proteína de choque térmico 70, Hsc70, em ambos os lados da membrana lisossômica. O processo é além disso dependente do reconhecimento de um motivo de sequência KDEL nas proteínas alvo por LAMP-2a.

Reforma de lisossomas e secreção lisossômica

[00110] Depois da fusão de lisossomas com endossomas tardios ou autofagossomas, os lisossomas são reformados a partir das organelas híbridas resultantes através do sequestro de proteínas de membrana e condensação do teor do lúmen. Das proteínas de membrana que necessitam ser removidas ou recicladas da organela híbrida, as mais óbvias são as MPRs, visto que por definição elas são ausentes dos lisossomas. Os lisossomas, entretanto, não podem ser vistos como o ponto terminal dos caminhos endocíticos visto que eles também são capazes de formar lisossomas secretores através da fusão com grânulos secretores, um processo que é dependente de Ca2+ e foi primeiro reconhecido nas células secretoras de origem hematopoiéticas. Entretanto, evidência também existe quanto a um compartimento lisossômico próximo à membrana regulado por Ca2+ responsável pela exocitose em células não secretoras. O processo de exocitose é dependente da proteína Rab27a, um membro da família da proteína Rab, que conta mais do que 60 membros. As Rabs são GTPases pequenas que têm papéis reguladores chave na maioria das etapas de transporte de membrana incluindo a formação, motilidade, ancoragem e fusão de vesícula. Pelo menos 13 proteínas Rab são utilizadas nos caminhos endocíticos de modo a determinar o destino das várias moléculas submetidas à endocitose e suas vesículas.

Morte celular programada

[00111] A regulagem do número de célula global assim como da quantidade de células que constituem os diferentes tecidos junto com a necessidade quanto a um mecanismo de eliminação de células não desejadas é de importância fundamental em organismos multicelulares. A morte celular programada é o meio para esta finalidade, dotando o organismo multicelular com o potencial se desfazer por si mesmo de células não desejadas sem o vazamento de constituintes celulares, evitando assim a inflamação associada com a necrose, a contraparte conceituai para a morte celular programada.

Apoptose

[00112] A palavra apoptose é usado no grego para descrever a “queda” ou “desprendimento” de pétalas de flores, ou folhas das árvores e foi primeiro inventado por Currie e colegas em 1972 para descrever um tipo comum de morte celular programada, que os autores tinham observado em vários tecidos e tipos de célula. Os autores mencionaram que os eventos que eles observaram tiveram similaridades morfológicas significantes, que foram distintas dos traços morfológicos que caracterizam células que sofrem morte patológica, necrótica e sugeriram que estes traços morfológicos comuns seriam devido a um processo subjacente idêntico.

[00113] Quando as células morrem pela apoptose, elas passam por uma série de eventos transformadores. Entre estes eventos e essencial para o fenótipo apoptótico característico, é a ativação de caspases - uma família de endopeptidases de cisteína, que cliva substratos em resíduos de aspartato específicos, consequentemente o nome. A ativação das caspases leva ao processamento proteolítico de outras caspases assim como um hospedeiro de outras mudanças nas atividades de proteína globais dentro das células, produzindo no final das contas os traços morfológicos característicos associados com a ativação de caspase e assim, per definição, a apoptose. Os traços apoptóticos clássicos incluem célula encolhimento e formação de vesícula da membrana citoplásmica, condensação da cromatina dentro do núcleo em formas claras, geométricas, fragmentação do DNA em - inteiros de 200 pares de base, a chamada escada nucleossômica, descolamento celular das suas células vizinhas e desintegração da célula em vesículas pequenas, fechadas chamadas de corpos apoptóticos. Em um ambiente multicelular estes corpos apoptóticos são basicamente fagocitados pelos macrófagos ou células vizinhas completando deste modo a remoção da célula não desejada.

Morte celular programada

[00114] A morte celular programada (PCD) não é sinônimo com apoptose embora possa-se ser inclinado a pensar deste modo com base na quantidade de literatura que usa estes termos indiscriminadamente. O termo PCD é gradualmente assumido, mas o termo apoptose é ainda usado para descrever um programa de morte celular orquestrado pela ativação de caspases, em particular caspase-3. Entretanto, a capacidade de certas células para sobreviver à ativação de caspases pró-apoptóticas assim como PCD com ausência completa de ativação de caspase e ativação de caspase levando à PCD não apoptótica, tem revelado uma plasticidade acentuável do(s) programa(s) de morte celular e PCD pode assim ser mais precisamente definida como morte celular dependente dos sinais ou atividades dentro da célula que morre. Foi sugerido que PCD pode ser subdividida em apoptose, PCD equivalente à apoptose e equivalente à necrose, de acordo com a morfologia nuclear das células que morrem, cada definição inventada para distinguir características morfológicas, a característica principal sendo a forma de condensação da cromatina ou a sua ausência, embora possa ser preferível fazer distinções de PCD com base nos caminhos de sinalização que participam sob qualquer conjunto de dados de condições que levam à PCD. Este modo de distinguir entre modos diferentes de PCD não é ainda aplicável entretanto, visto que os processos que levam aos tipos variáveis de morte celular permanecem para ser classificados.

Necrose

[00115] A necrose é a contraparte conceituai para PCD, visto que a mesma não pode ser prevenida por qualquer outro meio além da remoção do estímulo que dão origem à necrose. Este modo de morte celular é usualmente observado durante insultos patológicos a um organismo.

O mecanismo molecular de morte celular programada Apoptose

[00116] Como mencionado na seção anterior, a apoptose é definida pela ativação de membros da família de endopeptidases de cisteína conhecida como as caspases e a morfologia associada com a sua ativação. As caspases residem em células como zimogênios inativos, que podem ser rapidamente ativados pelo processamento proteolítico. Este processamento se processa em uma cascata hierárquica em que um estímulo apoptótico ativa uma caspase iniciadora (por exemplo, caspases 8 e 9), que por sua vez ativa o nível seguinte na hierarquia, as caspases efetoras (por exemplo, caspases 3, 6 e 7). As últimas são consideradas as executoras da apoptose visto que elas clivam vários substratos, o processamento dos quais por fim leva ao fenótipo Ari 1188 associado com a apoptose. O programa apoptótico pode ser ativado por uma variedade de estímulos, que podem ser amplamente divididos em estímulos extracelulares e intracelulares, o último considerando a mitocôndria como um desempenhador essencial. Os estímulos extracelulares e a resposta que segue dando origem à apoptose também são aludidos como o caminho da sinalização extrínseca e são compreendidos de uma série de eventos começando com a ativação de um de uma variedade de receptores de morte tal como Fas/Apo-1/CD95, TNFR ou TRAIL. Na ligação de seu ligando apropriado, estes receptores recrutam as moléculas adaptadoras que contém o domínio de morte (DD), tais como TRADD (proteína do domínio de morte associada a TNFR1) e FADD (proteína com domínio de morte que se associa a Fas), através da interação com o DD presente nos receptores. Estas moléculas adaptadoras depois recrutam a caspase-8 para o complexo receptor, onde a caspase é ativada, possivelmente pelo processamento autocatalítico induzido pela proximidade. Em certas células (as chamadas células tipo I) a caspase-8 depois diretamente cliva e ativa a pró-caspase-3, ao passo que nas células tipo II, o substrato para a caspase-8 é a proteína citoplásmica Bid. A divagem de Bid gera um fragmento (Bid truncada (tBid)), que induz a oligomerização, translocação e inserção de dois membros da família pró- apoptótica Bcl-2, Bax e Bak na membrana mitocondrial externa. Esta inserção medeia a liberação do citocromo c que carrega elétron (CytC) do espaço intermembrana mitocondrial junto com um hospedeiro de outras proteínas, a mais proeminente das quais inclui o Fator indutor de apoptose (AIF), Smac/DIABLO que antagoniza os efeitos das proteínas conhecidas como proteínas inibidoras de apoptose (LAP) e endonuclease G, uma DNAse. Deve ser mencionado, que embora este seja o ponto central nas teorias de ativação de caspase através da mitocondria, nenhuma evidência conclusiva foi apresentada com respeito a como a inserção de Bax e Bak facilita a liberação de citocromo c. Na liberação da mitocondria, CytC acumula-se no citoplasma, onde se liga à proteína Apaf-1 (fator-1 ativador da protease apoptótica) resultando em uma mudança conformacional, que promove a oligomerização de Apaf-1. Este oligômero depois liga-se à pró-caspase-9 através de interações homotípicas entre domínios de recrutamento de caspase (CARDs) resultando na formação de um complexo chamado de apoptossoma. A formação deste complexo leva a uma atividade enzimática enormemente intensificada de pró-caspase-9, a atividade da qual leva à ativação proteolítica da caspase-3.

[00117] A apoptose também pode ser deflagrada pelos fatores intracelulares que evocam a permeabilização da membrana externa mitocondrial (MOMP), um processo conhecido como o caminho intrínseco. Estes fatores incluem mensageiros secundários associados com o estresse celular tal como Ca2+, NO e ácido araquidônico assim como bilirrubina, sais biliares e estímulos que podem dar origem à desnaturação de proteína e dano do DNA nuclear e mitocondrial tal como radiação ionizante, estresse térmico, espécies de oxigênio reativo (ROS) e agentes quimioterapêuticos. No evento de dano do DNA nuclear, isto é percebido por uma variedade de cinases de proteína, que depende da forma de dano do DNA mas também do agente nocivo que a evoca. A atividade destas cinases induzem o acúmulo de p53, que pode depois atuar como um fator de transcrição, dando origem a uma transcrição intensificada de genes pró-apoptóticos tais como Bax, Noxa e PUMA, todos os quais podem induzir MOMP. Ao nível mitocondrial, p53 induz a expressão de enzimas mitocondriais que localmente geram ROS assim como uma proteína de matriz mitocondrial (p53AIPl), cuja superexpressão deflagra a perda do potencial de membrana mitocondrial e apoptose.

[00118] A indução de MOMP pela p53 ou pela ação dos estímulos intrínsecos descritos acima é o ponto no qual os caminhos intrínseco e extrínseco convergem, a via do caminho intrínseco seguindo o já descrito para o extrínseco com liberação de citocromo c, formação do apoptossoma e ativação de caspase-3 constituindo as etapas finais para a morte da célula não desejada.As Alternativas para a Apoptose

[00119] Dentro da década passada, o papel exclusivo das caspases como as executoras de PCD foi desafiado e evidência de suporte sugere que existe mais para vida - e especialmente morte - de uma célula do que pode ser atribuído apenas às caspases.

[00120] Visto que os inibidores farmacológicos específicos da caspase recém desenvolvidos assim como a inativação de caminhos da caspase pelos fatores tais como esgotamento de energia, estresse nitrativo/oxidativo e membros da família do inibidor de proteína da apoptose (IAP) nem sempre interrompem a progressão para a morte, eles revelaram, ou ainda intensificaram, um subconjunto de programas de morte independentes de caspase subjacentes. Estes programas incluem caminhos iniciados pelo receptor de morte assim como caminhos evocados pelos medicamentos cancerosos, perda do fator de crescimento, estaurosporina, proteínas relacionadas com Bax e o esgotamento de Hsp70. Os traços morfológicos destes programas de morte independentes de caspase são frequentemente similares a aqueles observados para a apoptose clássica e suporte experimental para um papel para outras proteases tais como catepsinas, calpaínas e serina proteases como cofatores essenciais a montante ou a jusante das caspases foi rapidamente crescente. O argumento é reforçado pelas descobertas de que muitas proteases não caspase são capazes de clivar pelo menos alguns dos substratos de caspase clássicos, que explicariam algumas das similaridades observadas entre os programas de morte dependentes e independentes de caspase.

[00121] Embora se possa sustentar a relevância de tais programas de morte, visto que eles são mascarados pela eficácia das caspases, evidência é reunida para um papel evolucionariamente conservado para as catepsina proteases lisossômicas em programas de morte celular iniciados como uma resposta aos vários estímulos tais como receptores de morte da família de receptor do fator de necrose de tumor, hipoxia, estresse oxidativo, estresse osmótico, calor e medicamentos anticâncer.

Envolvimento lisossômico na morte celular programada

[00122] Embora o papel de lisossomas e suas hidrolases na fase de limpeza de PCD, isto é, o engolfamento de células e corpos apoptóticos pelas células vizinhas ou fagócitos, é bem estabelecido, tem se levado um tempo longo para reconhecer a importância dos lisossomas e hidrolases lisossômicas nos eventos mais imediatos de PCD. Uma das razões para esta demora pode ser o fato de que os inibidores peptídicos de metil cetona habitualmente usados para avaliar o papel das caspases na PCD (por exemplo, zVAD-fmk, Ac-DEVD-fmk, Boc-D-fmk, etc) também inibem outras cisteína proteases, incluindo várias catepsinas de cisteína. Exatos nove anos depois do reconhecimento desta reação cruzada, os efeitos de proteçãos com estes inibidores nas concentrações capazes de inibir proteases que não caspase são ainda frequentemente interpretados como uma prova para os caminhos de morte mediados pela caspase e o papel de outras cisteína proteases em PCD assim continua a ser subestimadas. A descoberta de PCD lisossômica pode ter sido adicionalmente demorada, porque a ultraestrutura lisossômica aparece intacta em células apoptóticas analisadas pela microscopia eletrônica. Assim, a ruptura lisossômica até recentemente foi considerada como uma mudança tudo ou nada durante estágios tardios de morte celular necrótica e autólise de tecido descontrolada. Entretanto, novas técnicas que permitem uma avaliação mais precisa da integridade da membrana lisossômica têm revelado que lisossomas com ultraestrutura normal podem ter vazado parte de suas enzimas e que a permeabilização lisossômica de membrana parcial (LMP) não apenas ocorre cedo em muitos paradigmas de morte, mas pode de fato deflagrar a apoptose e PCD equivalente à apoptose.

[00123] Permeabilização da membrana lisossômica (LMP) e suas consequências

[00124] Estudos com vários compostos que diretamente alvejam a integridade das membranas lisossômicas, tais como H2O2, éster metílico de L- leucil-L-leucina, estresse osmótico, esfingosina, os antibióticos lisossomotrópicos norfloxacina e ciprofloxacina e dano lisossômico foto- oxidativo (fotólise), convincentemente provaram que a permeabilização lisossômica moderada pode resultar em PCD. Uma relação quantitativa entre a quantidade de ruptura lisossômica e o modo de morte celular foi sugerida explicar os resultados morfológicos amplamente diferentes a seguir da LMP. De acordo com este modelo, intensidades de estresse baixas deflagram uma liberação limitada de conteúdos lisossômicos para o citoplasma seguida pela apoptose ou morte celular equivalente à apoptose, enquanto estresses de alta intensidade levam a uma ruptura lisossômica generalizada e necrose celular rápida. Consequentemente, concentrações baixas de esfingosina, um metabolite gerado pela ceramidase ácida de ceramida com propriedades equivalentes a detergente em pH baixo, induz LMP parcial e apoptose mediada pela caspase, ao passo que concentrações mais altas resultam em LMP maciça e morte celular necrótica independente de caspase. Neste modelo, a morte deflagrada pela LMP parcial pode ser inibida pelos inibidores farmacológicos de catepsinas de cisteína e aspartate e o aumento na atividade da catepsina citossólica precede a ativação de caspases e as mudanças potenciais na membrana mitocondrial sugerem um papel direto para as catepsinas citossólicas no processo de morte. De maneira importante, o papel de LMP e catepsinas na morte celular não é limitado aos modelos experimentais que utilizam rompedores lisossômicos diretos. A LMP também participa na execução da morte celular em resposta a uma ampla variedade de estímulos apoptóticos clássicos, tais como ativação de receptores de morte da família do receptor do fator de necrose de tumor (TNF), interleucina-1, ativação de p53, inanição do fator de crescimento, agentes estabilizadores de microtúbulo, etoposida, ativação do receptor sigma-2, retinóide sintético CD437, ativação do receptor de célula B, estaurosporina, estresse osmótico, assim como moléculas pequenas identificadas em uma triagem quanto a novos medicamentos contra o câncer que induz a apoptose independente de p53.

[00125] LMP como um deflagrador do caminho da apoptose mitocondrial

[00126] Os efeitos citotóxicos de LMP frequentemente contam, pelo menos parcialmente, com a ativação do caminho de morte mitocondrial. Um estudo de microinjeção elegante tem demonstrado que quando localizado no citossol, uma única hidrolase lisossômica, a catepsina D, é suficiente para deflagrar a permeabilização da membrana externa mitocondrial e apoptose em fibroblastos humanos em doses celulares que correspondem a metade da atividade da catepsina D celular total. A catepsina D, entretanto, não é suficiente para deflagrar PCD em todos os modelos de morte celular que envolvem LMP. Outros mediadores bem documentados de PCD deflagrado pela LMP incluem catepsinas de cisteína B e L assim como espécies de oxigênio reativas. Entretanto, deve ser enfatizado que o papel de outras hidrolases lisossômicas, mensageiros secundários derivados de lisossoma e acidificação induzida pela LMP de citossol não foram apropriadamente descartados. Uma das ligações entre catepsinas e a permeabilização da membrana mitocondrial pode ser Bid, uma proteína apenas de BH3 pró- apoptótica da família Bcl-2 que pode ser processada e ativada por diversas catepsinas de cisteína, mas não pela catepsina D, no pH citossólico. A Catepsina D, entretanto, foi sugerida clivar e ativar Bid no ambiente ácido do compartimento endolisossômico a seguir da intemalização do receptor-1 de TNF (TNF-R1). De acordo com este modelo, a endocitose do TNF-R1 ativado por ligando resulta na geração mediada pela esfingomielinase ácida de ceramida, que depois se liga à catepsina D inativa e a ativa por intermédio do processamento autocatalítico. A Catepsina D pode também ativar Bax em uma maneira independente de Bid como demonstrado em células T tratadas com estaurosporina. Também em fibroblastos tratados com ciprofloxacina, LMP deflagra a permeabilização da membrana mitocondrial através de uma ativação independente de Bid de Bax e Bak. Neste sistema modelo a ativação de Bax é independente da catepsina D, mas ao invés conta com espécies de oxigênio. Deve ser mencionado que a permeabilização da membrana mitocondrial induzida pela ciprofloxacina não é totalmente inibida em células que carecem tanto de Bax quanto de Bak. Os mecanismos alternativos que conectam LMP com a permeabilização da membrana mitocondrial podem incluir os efeitos diretos de espécies de oxigênio reativas e/ou mediadores lipídicos tais como o ácido araquidônico que pode ser gerado em uma maneira dependente da catepsina B.

[00127] Estudos que utilizam fibroblastos embrionários de murino imortalizados (MEFs) de camundongos deficientes quanto às catepsinas individuais têm claramente revelado que catepsinas diferentes são engrenadas na execução da morte celular dependendo do estímulo que deflagra LMP. As MEFs imortalizadas de camundongos deficientes em catepsina B e L, mas não de camundongos deficientes em catepsina D, são altamente resistentes ao TNF, ao passo que o quadro oposto emerge quando as células são tratadas com estaurosporina. Estudos extensivos sobre os caminhos da morte celular induzidos por TNF revelaram ainda que o papel de catepsinas individuais em PCD depende do tipo de célula estudado. Como indicado acima, a morte induzida por TNF de MEFs imortalizadas depende das catepsinas de cisteína, mas não da catepsina D. Contudo, o esgotamento de catepsina D eficazmente protege as células cancerosas da cerviz HeLa a citotoxicidade induzida pela TNF e cisplatina. Esta diferença não parece ser devido às diferenças gerais entre as células de ser humano e de murino, porque a catepsina B sozinha ou junto com outras catepsinas de cisteína também é crucial para a morte induzida pela TNF eficaz nas linhagens de célula cancerosa da cerviz (ME- 180) e mama (MCF-7) humanas. A explicação para esta diversidade é até agora desconhecida, mas níveis de expressão variáveis de catepsinas individuais e seus inibidores em linhagens de célula diferentes podem desempenhar um papel. Consequentemente, a capacidade variável de estímulos de morte diferentes para regular os níveis de expressão de catepsinas individuais ou seus inibidores explicariam a diferença em resposta aos estímulos diferentes. Por exemplo, adriamicina e etoposida são conhecidas intensificar a expressão de catepsina D via a ativação de p53. Altemativamente, outros caminhos de sinalização induzidos pelos vários estímulos podem cooperar com catepsinas específicas. Caminhos de morte independentes da mitocôndria induzidos por LMP

[00128] De maneira importante, os efeitos letais de LMP e catepsinas citossólicas não são limitadas à ativação do caminho de apoptose intrínseca. Em células de câncer pulmonar de célula pequena tratadas com medicamentos que estabilizam microtúbulos (paclitaxel, epotilona B e discodermolida), LMP ocorre inicialmente no processo de morte e as catepsinas de cisteína medeiam a micronucleação e morte celular em uma maneira independente de caspase. Em linhagens de célula de carcinoma humana tratada com TNF, a LMP ocorre a jusante da permeabilização da membrana externa mitocondrial. Entretanto, a inibição da atividade ou expressão da catepsina de cisteína confere proteção significante contra a morte celular induzida por TNF sem inibir significantemente a ativação da caspase efetora. Além disso, a catepsina B é responsável pelas mudanças equivalentes à apoptose, tais como condensação de cromatina, exposição de fosfatidilserina e formação de vesícula da membrana plasmática, na ausência de atividade da caspase em células de fibrossarcoma WEHI-S de murino tratadas com TNF. Além disso, o esgotamento da proteína de choque térmico 70 (Hsp70) em várias células cancerosas humanas assim como a ativação supraótima de células T deflagram LMP e PCD equivalente à apoptose mediada pela catepsina sem a ativação do caminho de apoptose intrínseco. Em Unha com estes dados, a catepsina B pode induzir a apoptose nuclear em núcleos isolados. Assim, as catepsinas parecem carregar tanto a capacidade para atuar como proteases iniciadoras assim como efetoras da morte celular programada dependendo do estímulo e do contexto celular. Especialmente a sua capacidade para mediar PCD em células cancerosas, onde o caminho de morte mitocondrial é bloqueado por exemplo devido à superexpressão de Bcl-2, aumenta expectativas de que os tratamentos que induzem LMP podem se mostrar eficazes no tratamento de cânceres que são resistentes aos indutores de apoptose clássica. Esta idéia é sustentada ainda pelos dados que mostram que a imortalização e transformação pode sensibilizar células para a morte celular lisossômica. Sinalização para LMP

[00129] Como descrito acima, LMP seguida pela liberação de conteúdos lisossômicos, especialmente catepsinas, para o citossol é considerado ser a etapa de ativação chave do caminho de morte lisossômica. Entretanto, os caminhos de sinalização que levam ao LMP estão ainda apenas começando a emergir. Um dos mecanismos melhor estudados é a sinalização do receptor 1 do fator de necrose de tumor embora a clarificação deste caminho de sinalização para LMP tenha sido enormemente complicado pelas respostas amplamente diferentes em células alvo diferentes.

[00130] Em resumo, TNF pode induzir LMP dependente ou independente de caspase dependendo do contexto celular. Além disso, os ligantes relacionados com TNF FasL, TRAIL e TWEAK também foram todos associados com PCD independente de caspase com morfologia apoptótica ou necrótica. Estudos farmacológicos e genéticos indicam que o caminho mediado pela caspase que leva de TNF para LMP é dependente das caspases 8 e 9, embora a ativação da caspase-9 difira amplamente entre células humanas e de murino. A ligação entre caspases e LMP é até agora desconhecida e embora a clivagem mediada pela caspase 8 induzida por TNF de Bid fosse sugerida contribuir para LMP, estas descobertas não puderam ser verificadas pela LMP induzida por TNF em iMEFs deficientes em Bid. Bid além disso foi sugerido ser um alvo para catepsinas nos caminhos de morte lisossômica implicando Bid a jusante, ao invés de a montante, da LMP.

[00131] TNF também estimula a decomposição da esfmgomielina para fosforilcolina e ceramida pela ativação da esfingomielinase neutra (SMase) na membrana plasmática e ácido ou SMase ácida (aSMase) no compartimento lisossômico. Ambos os eventos foram implicados nos caminhos de morte celular induzida por TNF, mas até agora apenas SMase neutra foi conectada à LMP através do fator associado com SMase neutra (FAN). Estudos com base em iMEFs deficientes em FAN assim como fibroblastos humanos que expressam uma forma negativa dominante de FAN mostrou que FAN não apenas medeia a produção de ceramida induzida pelo TNF, mas também contribui para o processamento de caspase 8 e morte celular. Visto que a LMP induzida pelo TNF em hepatócitos de murino depende da caspase-8, o seu processamento reduzido pode explicar a LMP reduzida em hepatócitos tratados com TNF que expressam FAN negativo dominante. O papel da ceramida e seus metabolites pode, entretanto, não ser descartado. O seu papel na sinalização de morte induzida pelo TNF é sustentado pelo TNF reduzido e hepatotoxicidade induzida por Faz em camundongos deficientes em aSMase, que é ativada a jusante da caspase-8. Especialmente a esfingosina que é gerada a partir da ceramida em uma reação catalisada pela enzima lisossômica de ceramidase ácida é um candidato atraente, como tal, contrário à ceramida, pode atuar como um detergente, desestabilizando diretamente a membrana lisossômica. Além de aumentar a geração do precursor de esfingosina, a ceramida, pelas SMases ativadoras, o TNF regula os níveis de esfingosina também pela infraregulagem mediada pela catepsina B de esfingosina cinase- 1, enzima en que converte a esfingosina pró-apoptótica para uma esfingosina- 1-fosfato anti-apoptótica. Esta atividade de catepsina B resultaria no acúmulo de esfingosina nos lisossomas e pode assim, pelo menos parcialmente, explicar a exigência da catepsina B para uma LMP eficiente em hepatócitos tratados com TNF.

[00132] TNF também pode deflagrar LMP e a morte celular na presença de inibidores de caspase. Este caminho é independente da caspase-8, mas requer o receptor que contém a proteína-1 que interage com o domínio de morte (RIP-1) e envolve a geração de espécies de oxigênio reativo. O estresse oxidativo pode, junto com o ferro intra-lisossômico, gerar radicais de oxigênio através de uma química tipo Fenton e deste modo pode causar a oxidação de lipídeos da membrana lisossômica, resultando na desestabilização da membrana e a liberação do conteúdo lisossômico. As ligações moleculares entre RIP-1, estresse oxidativo e LMP, entretanto, ainda não são compreendidas.

[00133] A indução da morte celular pelos diversos indutores da apoptose clássicos (por exemplo, p53, etoposida e estaurosporina) também envolve LMP seguida pela permeabilização da membrana mitocondrial dependente da catepsina. Entretanto, os caminhos da sinalização a partir destes estímulos para LMP permanecem para ser revelados. Mecanismos de defesa celular contra LMP

[00134] Dado o resultado fatal potencial de LMP, não é surpresa que as células tenham desenvolvido numerosas estratégias para neutralizá-lo - pela inibição da própria ou pela proteção das células contra as hidrolases ácidas que vazam para o citossol como uma consequência da LMP.

[00135] Entre muitas outras de suas funções, a fosfatidilinositol 3- cinase (P13K) foi relatada proteger lisossomas contra a desestabilização. A inibição da P13K em células endoteliais vasculares humanas induz a liberação da catepsina B para o citossol demonstrando um papel bastante direto de P13K na preservação da integridade da membrana lisossômica. Além disso, os inibidores de P13K sensibilizam as células para os caminhos de morte lisossômica induzidos por TNF e interleucina-1. As funções lisossômica alteradas e os níveis de expressão aumentados de catepsinas em células cancerosas podem apresentar uma ameaça na forma de estabilidade diminuída de lisossomas. Assim, P13K, que é habitualmente ativada em células cancerosas humanas, também pode contribuir para a estabilidade lisossômica de células de tumor e deste modo aumentar a sua resistência à morte celular. Considerando que o papel de P13K na estabilidade de lisossomas de célula de tumor seja puramente especulativo, dados recentes defendem um papel para Hsp70 na proteção de lisossomas contra estímulos disruptivos da membrana. Este trabalho foi principalmente feito em células de tumor, que também frequentemente demonstram uma localização de Hsp70 na membrana plasmática assim como no compartimento endolisossômico.

[00136] No evento de liberação de proteases lisossômicas para o citossol na LMP, os inibidores da protease citossólica apresentam uma proteção contra as suas consequências nocivas. Considerando que nenhum inibidor endógeno de catepsina D é conhecido, as catepsinas de cisteína podem ser eficazmente inibidas por pelo menos três inibidores da protease citossólica, isto é, cistatina A e B e inibidor da senna protease 2A (Spi2A) que foi recentemente descoberto possuir atividade inibidora potente também contra várias catepsinas de cisteína (B, H, K, L e V) e catepsina G. A importância destes inibidores na prevenção da PCD em condições fisiológicas e patológicas é demonstrada pelos camundongos deficientes em cistatina B que demonstram apoptose aumentada de células de grânulo cerebelar. Além disso, a expressão de Spi2A é induzida no tratamento com TNF via o caminho de NF-KB e eficazmente inibe a atividade de catepsina B citossólica induzida pelo TNF e a morte celular em MEFs. De modo interessante, foi apenas relatado que em C. Elegans, o inibidor da serina protease citossólica (serpin)- 6 pode proteger tanto contra a indução assim como os efeitos letais da lesão lisossômica causada pelo estresse hipo-osmótico assim como uma variedade de outros estresses lisossômicos, que demonstram que a proteção contra LMP é um mecanismo evolucionariamente conservado.

Doenças de Armazenagem Lisossômica

[00137] As doenças de armazenagem lisossômica (LSDs) são um grupo de aproximadamente 40 distúrbios metabólicos herdados raros que resultam de defeitos na função lisossômica. As LSDs são causadas pela disfunção lisossômica usualmente como uma consequência da deficiência de uma única enzima requerida para o metabolismo de lipídeos, glicoproteínas ou mucopolissacarídeos. Embora cada distúrbio resulte de mutações genéticas diferentes que traduzem em uma deficiência na atividade enzimática, todos eles compartilham uma característica bioquímica comum - todos os distúrbios lisossômicos originam-se de um acúmulo anormal de substâncias dentro do lisossoma.

[00138] Individualmente, LSDs ocorrem com incidências de menos do que 1:100.000, entretanto, como um grupo a incidência é de cerca de 1:5000 a 1:10.000. A maioria destes distúrbios são autossômicos recessivamente herdados, entretanto uns poucos são recessivamente herdados ligados a X, tais como a doença de Fabry.

[00139] As doenças de armazenagem lisossômica são no geral classificadas pela natureza do material armazenado primário envolvido e podem ser amplamente decompostos nos seguintes: distúrbios de armazenagem de lipídeo (ou lipidoses), principalmente esfingolipidoses (incluindo Doença de Gaucher e de Niemann- Pick) gangliosidose (incluindo doença de Tay-Sachs) leucodistrofias mucopolissacaridoses (incluindo síndrome de Hunter e doença de Hurler) distúrbios de armazenagem de glicoproteína (glicoproteinose) mucolipidoses

[00140] Dependendo da severidade da doença os pacientes morrem em uma idade jovem e não prognosticável, muitos dentro de uns poucos meses ou anos de nascimento, considerando que outros sobrevivem na idade adulta inicial sucumbindo finalmente às várias patologias de seu distúrbio particular. Os sintomas de LSD variam, dependendo do distúrbio particular e podem ser de brandos a severos. Eles podem incluir retardo no desenvolvimento, distúrbios de movimento, convulsão, demência, surdez e/ou cegueira. Algumas pessoas com LSD têm o fígado ampliado (hepatomegalia) e baços ampliados (esplenomegalia), problemas pulmonares e cardíacos e crescimento ósseo anormal.

[00141] A maioria dos pacientes são inicialmente triados por um ensaio enzimático, que é o método mais eficiente para se chegar a um diagnóstico definitivo. Em algumas famílias onde a(s) mutação(ões) que causa(m) a doença é conhecida e em certos isolados genéticos, a análise da mutação pode ser realizada. Visto que pode haver numerosas mutações diferentes, o sequenciamento do gene que codifica a enzima afetada particular é algumas vezes necessária para confirmar o diagnóstico. O diagnóstico pré-natal pode ser útil quando existe um fator de risco genético conhecido.

[00142] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada a um método para tratar distúrbios de armazenagem lisossômica. Hidrólise de esfingolipídeo lisossômico

[00143] Uma multidão de enzimas estão envolvidas no catabolismo lisossômico de esfingolipídeos (ou glicofingolipídeos) (ver a figura 4). Estas enzimas, ou mais especificamente as hidrolases, são cada uma responsáveis pela degradação de um esfingolipídeo específico.

[00144] As esfingolipídeo hidrolases lisossômicas interagem com as proteínas ativadoras de esfingolipídeo (SAP ou saposinas) para estimular a atividade das ditas hidrolases. As SAPs são consideradas facilitar a interação de enzima/substrato entre enzimas solúveis em água e substratos ligados à membrana.

[00145] Além disso, a composição de lipídeo de compartimentos endossômicos e lisossômicos tardios são caracterizados pela presença de fosfolipídeos negativamente carregados tais como BMP e PI (fosfatidilinositol), que também estimulam a atividade de algumas hidrolases. As hidrolases lisossômicas dependentes de BMP incluem sialidase, a- galactosidase A, glicosilceramidase, β-galactosilceramidase, arilsulfatase A, ácido ceramidase e Esfmgomielinase. Saposinas de co-fator

[00146] As Saposinas são proteínas lisossômicas pequenas que servem como ativadores de várias enzimas que degradam lipídeo lisossômico. Estas provavelmente atuam pelo isolamento do substrato lipídico dos arredores da membrana, tomando-a assim mais acessível às enzimas degradativas solúveis. Todas as saposinas de mamífero são sintetizadas como uma molécula precursora única (pró-saposina) que contém quatro domínios de Saposina-B, produzindo as saposinas ativas depois da clivagem proteolítica e dois domínios de Saposina-A que são removidos na reação de ativação. Os domínios de Saposina-B também ocorrem em outras proteínas, muitas delas ativas na lise de membranas.

[00147] A pró-saposina (PSAP) é uma proteína que em seres humanos é codificada pelo gene PS AP. Este gene codifica uma glicoproteína altamente conservada que é um precursor para 4 produtos de clivagem: saposina A, B, C e D. A saposina é um acrônimo para Proteína Ativadora de Esfingolipídeo ou SAP. Cada domínio da proteína precursor tem aproximadamente 80 resíduos de aminoácido de comprimento com disposição quase idêntica de resíduos de cisteína e sítios de glicosilação. As saposinas A-D localizam-se primariamente no compartimento lisossômico onde eles facilitam o catabolismo de glicoesfingolipídeos com grupos de oligossacarídeo curtos. A proteína precursora existe tanto como uma proteína secretora quanto como uma proteína de membrana integral e tem atividades neurotróficas. As Saposinas A-D são requeridas para a hidrólise de certos esfingolipídeos pelas hidrolases lisossômicas específicas.

[00148] As saposinas são co-activadores importantes de sialidase (SAP-B), a-galactosidase A (SAP-B), glicosilceramidase (SAP-C), β- galactosilceramidase (SAP-C), arilsulfatase A (SAP-B) e ceramidase ácida (SAP-D). A esfingomielinase ácida (aSMase) não é criticamente dependente de nenhuma das proteínas ativadoras conhecidas, entretanto a presença de saposinas aumenta a atividade desta enzima. Uma quinta saposina; a proteína ativadora de GM2 também foi caracterizada. BMP

[00149] O bis(monoacilglicero)fosfato (BMP), também conhecida como o ácido lisobisfosfatídico, é uma parte importante da composição lipídica de compartimentos endossômicos e lisossômicos tardios. O mesmo é um fosfolipídeo negativamente carregado, mais especificamente um glicerol- fosfolipídeo.

[00150] O BMP foi primeiro isolado do pilmão de coelho mas é agora conhecida ser um constituinte comum embora menor de todos os tecidos de animal. A sua configuração estereoquímica difere daquela de outros glicero- fosfolipídeos de animal em que a porção de fosfodiéster é ligada às posições sn-1 e sn-1’ de glicerol, ao invés da posição sn-3. Permanece incerto se as posições sn-3 e 3’ ou sn-2 e sn-2’ nas porções de glicerol são esterificadas com ácidos graxos. Qualquer que seja a posição dos ácidos graxos na molécula de glicerol, as suas composições podem ser distintivas com 18:l(n- 9) e 18:2(n-6), 20:4 e 22:6(n-3) sendo abundantes, embora isto seja altamente dependente do tecido, tipo de célula ou organela específicos. Tais composições distintivas sugerem funções bastante específicas, algumas das quais já foram reveladas.

[00151] BMP é usualmente um componente muito menor de tecidos de animal. Entretanto, o mesmo é altamente enriquecido nos lisossomas do fígado e outros tecidos, onde ele pode corresponder a 15 % ou mais dos fosfolipídeos de membrana e é agora reconhecido como um marcador para esta organela. São os endossomas tardios e os lisossomas que contêm o lipídeo único, BMP. De fato, parece haver membranas internas dos endossomas tardios que contêm tanto quanto 70 % dos fosfolipídeos como BMP.

[00152] Se a presença relatada de BMP em algumas cepas alcalofílicas da espécie Bacillus pode ser confirmada, isto será a única exceção conhecida para a regra de que este lipídeo é estritamente de origem mamífera e não presente em procariotas, leveduras e plantas superiores.

[00153] Existe boa evidência de que BMP seja sintetizado a partir de fosfatidilglicerol, primariamente no sistema endossômico. Até o grau em que acredita-se seja a via primária, uma fosfolipase A2 remove o ácido graxo da posição sn-2 de fosfatidilglicerol na primeira etapa. Na segunda etapa, o lisofosfatidilglicerol é acilado na posição sn-2’ da porção de glicerol do grupo de ponta para produzir o ácido lisobisfosfatídico sn-3:sn-l’, por meio de uma reação de transacilase com lisofosfatidilglicerol tanto como o doador de acila quanto o receptor de acila. A terceira etapa tem ainda que ser adequadamente descrita mas deve envolver a remoção do ácido graxo da posição sn-1 da inidade de glicerol primária e um rearranjo do éster fosforílico da posição sn- 3 para a sn-1. Finalmente a posição sn-2 da unidade de glicerol primária é esterificada, provavelmente por uma reação de transacilação com um outro fosfolipídeo como doador (consequentemente as composições de ácido graxo distintivas). Outras vias biossintéticas podem ser possíveis.

[00154] A função de BMP em lisossomas está sob investigação ativa. O mesmo pode ter um papel estrutural no desenvolvimento do sistema de membrana intraluminal complexo, auxiliado por uma tendência de não formar uma bicamada. Este é uma molécula na forma de cone e encoraja a fusão de membranas no pH nos endossomas. Além disso, a sua estereoquímica única significa que é resistente às fosfolipases, de modo que impedirá ou prevenirá a auto digestão das membranas lisossômicas. Os constituintes de ácido graxo pode modificar rapidamente pela transacilação, mas a cadeia principal de glicerofosfato é estável. Uma outra possibilidade é que este lipídeo possa associar-se com proteínas específicas em domínios de membrana, funcionalmente similares a jnagadas. Foi sugerido que a rede característica de membranas ricas em BMP contidas dentro de endossomas tardios multivesiculares regula o transporte de colesterol pela atuação como um ponto de coleta e re-distribuição. Por exemplo, quando as membranas lisossômicas são incubadas com anticorpos para BMP, o colesterol tende a acumular. O processo está sob o controle de Alix/AIPl, que é uma proteína que interage especificamente com BMP e está envolvida na classificação em endossomas multivesiculares.

[00155] BMP é conhecido por estimular enormemente as enzimas envolvidas na degradação de glicosilceramidas, tais como as proteínas ativadoras de esfingolipídeo como as saposinas. Neste caso, o mesmo pode simplesamente funcionar para fornecer um ambiente adequado para a interação das glicoesfingolipídeo hidrolases e seu ativador. Além disso, o mesmo tem um papel dinâmico no fornecimento de araquidonato para a produção de eicosanóide em macrófagfos alveolares.

[00156] Para as enzimas dependentes de BMP, a taxa de hidrólise é dramaticamente aumentada quando BMP está presente na membrana, para aSMase mesmo sem a presença de uma proteína ativadora tal como saposina. Na figura 4, um círculo pontilhado marca as enzimas, ou a doença na qual esta enzima é defeituosa, que mostra uma dependência do BMP.

[00157] BMP está envolvido na patologia de doenças de armazenagem lisossômica tais como a doença de Niemann-Pick C (acúmulo de colesterol) e certas lipidoses induzidas por medicamento. Nestas circunstâncias, a sua composição tende a mudar para favorecer espécies moleculares que contém menos do componentes poliinsaturados. O mesmo é um antígeno reconhecido pelos soros autoimunes de pacientes com uma doença rara e deficientemente entendida conhecida como a síndrome de antifosfolipídeo, de modo que o mesmo seja provavelmente um fator na base patológica desta enfermidade.

[00158] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar distúrbios de armazenagem lisossômica, pela exploração da interação entre Hsp70 e BMP. Os distúrbios de armazenagem de lipídeo

[00159] Os distúrbios de armazenagem de lipídeo (ou lipidoses) são um subgrupo dos distúrbios de armazenagem lisossômicas em que quantidade nocivas de lipídeos acumulam-se no espaço intracelular devido à expressão ou função reduzidas das enzimas necessárias para metabolizar lipídeos. Com o tempo, esta armazenagem excessiva de lipídeos pode causar dano celular e tecidual permanente, particularmente no cérebro, sistema nervoso periférico, fígado, baço e medula óssea.

[00160] Os lipídeos são um amplo grupo de moléculas que ocorrem naturalmente que inclui gorduras, ceras, esteróis, vitaminas solúveis em água (tais como vitaminas A, D, E e K), monoglicerideos, diglicerídeos, fosfolipídeos e outros. As funções biológicas principais dos lipídeos incluem armazenagem de energia, como componentes estruturais de membranas celulares e como moléculas de sinalização importantes.

[00161] Os lipídeos podem ser amplamente definidos como moléculas hidrofóbicas ou anfifílicas pequenas; a natureza anfifílica de alguns lipídeos permitre que os mesmos formem estruturas tais como vesículas, lipossomas, ou membranas em um ambiente aquoso, os lipídeos biológicos originam-se totalmente ou em parte de dois tipos distintos de subunidades bioquímicas: grupos cetoacila e isopreno. Usando este método, os lipídeos podem ser divididos em oito categorias: acilas graxas, glicerolipídeos, glicerofosfolipídeos, esfingolipídeos, sacarolipídeos e policetídeos (derivados da condensação de subunidades de cetoacila); e lipídeos de esterol e lipídeos de prenol (derivado da condensação de subunidades de isopreno).

[00162] Embora o termo lipídeo seja algumas vezes usado como um sinônimo para gorduras, as gorduras são um subgrupo de lipídeos chamado triglicerídeos. Os lipídeos também abrangem moléculas tais como ácidos graxos e seus derivados (incluindo tri-, di- e monoglicerídeos e fosfolipídeos), assim como outros metabolites que contém esterol tais como colesterol.

[00163] Vários distúrbios de armazenagem lisossômica caracterizados pelo acúmulo de lipídeos (isto é, distúrbios de armazenagem de lipídeo) forma caracterizados; estes são resumidos aqui abaixo.

[00164] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada a um método para tratar distúrbios de armazenagem de lipídeo. Doença de Niemann-Pick

[00165] A doença de Niemann-Pick (NPD) é causada por um defeito na enzima de esfingomielinase ácida (aSMase), com o nome sistemático de esfingomielina fosfodiesterase. O volume de esfingomielina de membrana é hidrolisado pela enzima lisossômica aSMase para produzir ceramida (e fosfocolina). A esfingomielina consiste de uma âncora de membrana de ceramida que é ligada a uma porção de fosforilcolina hidrofílica curta.

[00166] A esfingomielinase não é criticamente dependente de qualquer uma das proteínas ativadoras conhecidas, tomando o domínio ativador intramolecular assumido de aSMase e a presença de lipídeos negativamente carregados nos lisossomas suficientes para a metabolização da esfingomielina. A aSMase assim não requer a presença de saposinas como um co-fator; entretanto a presença de saposinas invariavelmente estimula ainda mais a atividade desta enzima. (Ferlinz et al., 1999). A atividade de aSMase é estimulada pelo BMP.

[00167] Quando a esfingomielina não pode ser metabolizada apropriadamente a mesma é acumulada dentro da célula, eventualmente causando a morte celular e a má função de sistemas de órgão maior. Os sintomas podem incluir a falta de coordenação muscular, degeneração cerebral, problemas de aprendizado, perda do tônus muscular, sensibilidade aumentada ao toque, espasticidade, dificuldades de alimentação e deglutição, fala não compreensível e um fígado e baço ampliados. Pode haver turvação da cómea e um halo vermelho cereja característico se desenvolve em tomo do centro da retina.

[00168] A doença de Niemann-Pick (NPD) tem 4 tipos relacionados; tipos A, B, C e D. Todos os tipos de NPD são herdados em um padrão recessivo autossômico e pode afetar tanto homens quanto mulheres. Nos tipos A e B, atividade insuficiente da enzima aSMase causa a formação de quantidades tóxicas de esfingomielina. A doença ocorre quando ambas as cópias de um gene aSMase da pessoa (ambos os alelos) têm uma mutação.

[00169] Niemann-Pick Tipo A (NPDA), o tipo mais comum, ocorre em bebês. A mesma é caracterizada por icterícia, um fígado ampliado e dano cerebral profundo. Correntemente não existe nenhum tratamento eficaz para as pessoas com tipo A e pacientes com tipo A morrem na infância, usualmente antes da idade de 18 meses.

[00170] Niemann-Pick Tipo B (NPDB) envolve um fígado e baço ampliados, que usualmente ocorre nos anos pré-adolescentes e problemas respiratórios são comuns. A ampliação de órgãos e os problemas respiratórios podem causar estresse cardiovascular e podem levar à doença cardíaca mais tarde na vida. Pacientes com NPDB no geral têm pouco ou nenhum envolvimento neurológico. O transplante de medula óssea foi tentado em uns poucos pacientes com tipo B e resultados misturados foram relatados. O desenvolvimento futuro das terapia de reposição de enzima e gene também podem ser úteis para aqueles com tipo B. Crianças com Tipo B podem viver um tempo comparativamente longo, mas podem requerer oxigênio suplementar por causa da degradação pulmonar.

[00171] NPDA e NPDB são ambas causadas pela mesma deficiência enzimática e existe evidência crescente de que as duas formas representam extremidades opostas de uma sequência contínua. Pessoas com NPDA no geral têm pouca ou nenhuma produção de aSMase (menos do que 1 % do normal) enquanto aquelas com NPDB têm aproximadamente 10 % do nível normal de aSMase.

[00172] Existem aproximadamente 1.200 casos de NPA e NPB no mundo todo com a maioria sendo Tipo B ou uma forma intermediária.

[00173] NPDA e NPDB são diagnosticadas medindo-se o nível de atividade de aSMase em células sanguíneas brancas a partir de uma amostra de sangue. Embora este teste identificará pessoas com Tipo e B, o mesmo não é muito confiável para detectar pessoas que são portadores (que têm apenas uma cópia não funcional do gene ASM). Além disso, o teste mostrará atividade diminuída de aSMase, mas não pode sempre prognosticar se o indivíduo terá Tipo A ou Tipo B ou uma variante intermediária da doença; que requer a avaliação clínica do indivíduo.

[00174] Em certas populações, as mutações específicas são responsáveis por uma alta porcentagem de casos de deficiência de aSMase. Para NPDA, as mutações R496L, fsP330 e L302P são responsáveis por mais de 95 % das mudanças genéticas causadas pela doença na população Judia Ashkenazi. O teste direto de indivíduos nesta população para estas 3 mudanças é usado para a identificação de portador. Em outras populações, as mutações devem ser primeiro identificadas no indivíduo afetado antes que o teste de portador de DNA possa ser realizado para os membros da família.

[00175] Para NPDB, as mutações aSMase H421Y e K576N são responsáveis por 85 % da população NPDB da Arábia Saudita; as mutações L137P, fsP189 e L549P são responsáveis por 75 % da população NPDB Turca; as mutações S379P, R441X e R474W são responsáveis por 55 % da população NPDB Portuguesa; a mutação A196P é responsável por 42 % da população NPDB Inglesa/Escocesa e as mutações F480L e DeltaR608 também foram identificadas como causadora de doença em pacientes com NPDB.

[00176] A Niemann-Pick Tipo C (NPDC) é muito diferente da Tipo A ou B. Os Pacientes NPDC não são capazes de metabolizar colesterol e outros lipídeos apropriadamente dentro da célula e são caracterizados por um defeito que rompe o transporte de colesterol entre as células cerebrais. Consequentemente, quantidades excessivas de colesterol e outros lipídeos acumulam-se dentro do fígado, baço e cérebro. A NPDC causa uma redução secundária da atividade de aSMase, que leva a todos os três tipos que são considerados formas da mesma doença.

[00177] Existe variação considerável quando sintomas do Tipo C primeiro aparecem e na progressão da doença. Os sintomas podem aparecer tão cedo quanto uns poucos meses de idade ou tão tarde quanto na idade adulta. A paralisia do olhar vertical (a incapacidade para mover os olhos para cima e para baixo), fígado ampliado, baço ampliado, ou icterícia em crianças jovens são indicações fortes de que NPC deve ser considerado. É comum que apenas um ou dois sintomas apareçam nos estágios da doença. Na maioria dos casos, sintomas neurológicos começam a aparecer entre as idades de 4 e 10. No geral, quanto mais tarde os sintomas neurológicos começam, mais lenta a progressão da doença.

[00178] A doença de Niemann-Pick Tipo C tem cerca de 500 casos diagnosticados no mundo todo. Entretanto, acredita-se que o número de pessoas afetadas pela NPDC seja mais alto, mas dificuldades de diagnóstico não permitem uma avaliação exata da taxa de ocorrência. NPDC foi inicialmente diagnosticada como uma incapacidade de aprendizado, retardo brando, falta de jeito e desenvolvimento retardado de habilidades motoras finas.

[00179] A Niemann-Pick Tipo D é agora considerada uma variante da tipo C. A Tipo D usualmente ocorre em pessoas com um fundo ancestral na Nova Escócia. Os indivíduos com tipos C e D são frequentemente colocados em uma dieta de colesterol baixa, mas seu benefício clínico não é convincente. A expectativa de vida de pessoas com tipos C e D varia, entretanto a doença é sempre fatal. A vasta maioria das crianças morrem antes da idade de 20.

[00180] A NPDC é uma condição rara e extremamente variável e portanto não pode ser reconhecida por alguns provedores de cuidado de saúde. Para aqueles especialistas que suspeitam deste diagnóstico em um paciente, o mesmo pode ser determinado tomando-se uma biópsia de pele, cultivando os fibroblastos e estudando a sua capacidade para transportar e armazenar colesterol. O transporte de colesterol nas células é estudado medindo-se a conversão do colesterol de uma forma para uma outra (esterificação). A armazenagem de colesterol é avaliada tingindo-se as células com um produto químico (filipina) que brilha sob luz ultravioleta.

[00181] Em 1997, o gene NPC1 foi identificado. Mutações, ou mudanças que causam a doença, neste gene são responsáveis por cerca de 95 % de todos os casos de NPDC. Desde então, mais de 250 mutações genéticas diferentes relacionadas com NPDC foram identificadas neste gene e no segundo gene de NPDC, chamado NPC2. Por toda parte, em cerca de 95 % dos casos, é possível identificar as mudanças genéticas que causaram a doença se o diagnóstico de NPC foi primeiro confirmado pelo teste esboçado acima. Entretanto, porque existem muitas mutações únicas nestes genes e existem pacientes com NPC clássica em quem mutações não foram identificadas, não é ideal usar teste genético como uma ferramenta de diagnóstico geral para NPDC.

[00182] A doença de Niemann-Pick afeta todos os segmentos da população com casos relatados da América do Norte, América do Sul, Europa, África, Ásia e Austrália. Entretanto uma incidência mais alta foi descoberta e certas populações: população judia de Ashkenazi (NPDA e NPDB) população do Canadá Francês de Nova Escócia (tipo D - agora considerada uma variante de NPDC) região do Maghreb (Tunísia, Morrocos e Algéria) da África do Norte (NPDB) população hipano-Americana do Novo México meridional e Colorado (NPDC)

[00183] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada a um método para tratar a doença de Niemann-Pick, pela modulação da atividade da enzima de esfingomielinase ácida (aSMase). Doença de Farber

[00184] A doença de Farber é causada por um defeito na enzima de ceramidase ácida. A ceramidase ácida é responsável pela conversão de ceramida para esfingosina (e ácido graxo); o defeito assim leva a um acúmulo de ceramida. A sua atividade é estimulada pela BMP e é dependente de saposinas.

[00185] A ceramidase ácida também é conhecida como N- acilesfingosina amidoidrolase e é codificada pelo gene ASAH1. A mesma é uma proteína heterodimérica que consiste de uma subunidade alfa não glicosilada e uma subunidade beta glicosilada que é clivada para a enzima madura pós traducionalmente.

[00186] A doença de Farber também é conhecida como lipogranulomatose de Farber, deficiência de ceramidase, dismucopolissacaridose fibrocítica e Lipogranulomatose. A mesma é uma doença recessiva autossômica extremamente rara caracterizada pelas anormalidades nas juntas, fígado, garganta, tecidos e sistema nervoso central. O fígado, coração e rins também podem ser afetados. Os sintomas são tipicamente observados nas primeiras poucas semanas de vida e incluem capacidade motora e mental prejudicadas e dificuldade com a deglutição. Outros sintomas podem incluir artrite, linfônodos e juntas inchados, rouquidão, nódulos sob a pele (e algumas vezes nos pulmões e outras partes do corpo), encurtamento crônico dos músculos ou tendões em tomo das juntas e vômito. As pessoas afetadas podem requerer a inserção de um tubo de respiração. Em casos graves, o fígado e baço são ampliados.

[00187] Correntemente não existe nenhum tratamento específico para a doença de Farber. Corticosteróides podem ajudar a aliviar a dor. Os nódulos podem ser tratados com transplantes de medula óssea, em certos casos, ou podem ser cirurgicamente reduzidos ou removidos. A maioria das crianças com a forma clássica da doença de Farber morrem na idade de 2 anos, usualmente de doença pulmonar. Indivíduos tendo uma forma mais branda da doença podem viver até seus anos de juventude.

[00188] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a doença de Farber, pela modulação da atividade da enzima de ceramidase ácida. Doença de Krabbe

[00189] A doença de Krabbe é causada por um defeito na enzima β- galactosilceramidase. A β-galactosilceramidase é responsável pela conversão de galactosilceramida para ceramida; o defeito assim leva a um acúmulo de galactosilceramida. A sua atividade é estimulada pela BMP e é dependente das saposinas.

[00190] A doença de Krabbe também é conhecida como leucodistrofia de célula globóide ou lipideóse de galactosilceramida. A mesma é um distúrbio raro, recessivo autossômico degenerativo frequentemente fatal que afeta a bainha de mielina do sistema nervoso. A mesma ocorre em cerca de 1 em 100.000 de nascimentos. Uma prevalência mais alta, cerca de 1 em 6.000 tem sido relatada em algumas comunidades árabes em Israel.

[00191] A doença de Krabbe é causada pelas mutações no gene GALC, que causa uma deficiência da enzima galactosilceramidase. O aumento gradual de lipídeo afeta o crescimento da bainha de mielina protetiva do nervo (a cobertura que isola muitos nervos) e causa degeneração severa de habilidades motoras.

[00192] Bebês com a doença de Krabbe são normais no nascimento. Os sintomas começando entre as idades de 3 e 6 meses com irritabilidade, febres, dureza dos membros, convulsões, dificuldades de alimentação, vômito e retardo de desenvolvimento mental e motor. Nos primeiros estágios da doença, os médicos frequentemente se confundem com os sintomas para aqueles da paralisia cerebral. Outros sintomas incluem fraquesa muscular, espasticidade, surdez, atrofia ótica e cegueira, paralisia e dificuldade quando da deglutição. A perda de peso prolongada também pode ocorrer. Existem também casos de início na juventude e na idade adulta da doença de Krabbe, que têm sintomas similares mas progressão mais lenta. Nos bebês, a doença é no geral fatal antes da idade de 2 anos. Pacientes com a doença de Krabbe de início tardio tendem a ter uma progressão mais lenta da doença e vivem significantemente mais tempo.

[00193] Embora não haja cura para a doença de Krabbe, o transplante de medula óssea foi mostrado ser benéfico em casos iniciais no curso da doença. No geral, o tratamento para o distúrbio é sintomático e sustentativo. A terapia física pode ajudar a manter ou aumentar o tônus muscular e a circulação. Um estudo recente relata que os transplantes do sangue de cordão tem sido bem sucedido na interrupção da doença contanto que a mesma seja dada antes que sintomas observáveis apareçam.

[00194] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a doença de Krabbe, pela modulação da atividade da enzima β-galactosilceramidase. Doença de Fabry

[00195] A doença de Fabry é causada por um defeito na enzima a- galactosidase A. A a-galactosidase A é responsável pela conversão de globotriaosilceramida para lactosilceramida; o defeito assim leva a um acúmulo de globotriaosilceramida (também abreviada como Gb3, GL-3, ou ceramida triexosídeo). A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas.

[00196] A doença de Fabry também é conhecida como doença de Anderson-Fabry, Angioqueratoma corporal difusa, síndrome de Ruiter- Pompen-Wyers, Ceramida triexosidose e doença de Sweeley-Klionsky. A mesma é uma doença recessiva (herdada) ligada em X que afeta hemizigotos masculinos, assim como tanto heterozígotos quanto homozigotos femininos; os homens tendem a experienciar os sintomas clínicos mais severos, enquanto que as mulheres variam de virtualmente nenhum sintoma até aqueles tão sérios quanto os dos homens. Esta variabilidade é considerada ser devida aos padrões de inativação de X durante o desenvolvimento embrionário da mulher.

[00197] Os sintomas incluem anidrose (falta de suor), fadiga, angioqueratomas (lesão cutânea benigna de capilares), dor de extremidade queimada e envolvimento ocular. Angioqueratomas são pápulas muito pequenas, indolores que aparecem em qualquer região do corpo, mas são predominantes nas coxas, nádegas, abdômen inferior e virilha. O envolvimento ocular cosmético pode estar presente mostrando cómea encaracolada (também conhecida como queratopatia de turbilhão). A queratopatia pode ser a que apresenta característica nos pportadores assintomáticos e devem ser diferenciadas de outras causas de queratopatia de turbilhão (por exemplo, deposição de medicamento na cómea). Outras descobertas oculares que podem ser observadas incluem aneurismas conjuntivais, cataratas como raio posterior, papiloedema, edema macular, atrofia ótica e dilatação vascular retinal. As complicações renais são um efeito comum e sério da doença; a insuficiência renal e a falha renal podem piorar por toda a vida. Proteinuria é frequentemente o primeiro sinal de envolvimento renal. As complicações cardíacas também podem ocorrer; os efeitos relacionados com o coração pioram com a idade e podem levar a risco aumentado de doença cardíaca. Os efeitos cerebrovasculares levam a um risco aumentado de acidente vascular cerebral. Outros sintomas incluem zumbido no ouvido, vertigem, náusea e diarréia.

[00198] Os sintomas são tipicamente primeiro experienciados na infância precoce e pode ser muito difícil de entender; a raridade da doença de Fabry para muitos médicos algumas vezes leva a diagnóstico equivocado ou ignorância. As manifestações da doença usualmente aumentam em número e severidade conforme um indivíduo envelhece.

[00199] Até recentemente, o tratamento da doença de Fabry alvejou os efeitos sintomáticos. Entretanto, a mesma está sendo recentemente tratada ao nível celular através da terapia de reposição de enzima (ERT) usando Agalsidase alfa (Replagal) e Agalsidase beta (Fabrazyme). O custo destes medicamentos é problemático (aproximadamente $250.000 US ao ano/paciente) e permanece uma barreira para muitos pacientes em alguns países. A terapia de reposição de enzima (tipicamente administrada a cada duas semanas) pode ser realizada na casa do paciente pelos próprios pacientes. A terapia de reposição de enzima não é uma cura e deve ser administrada periodicamente para benefício máximo.

[00200] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a doença de Fabry, pela modulação da atividade da enzima a-galactosidase A. Doença de Gaucher

[00201] A doença de Gaucher é causada por um defeito na enzima de glicosilceramidase (também conhecida como glicocerebrosidase e ácido 6- glicosidase); uma proteína de 55,6 KD, de 497 aminoácidos de comprimento. A glicosilceramidase é responsável pela conversão da glicosilceramida (ou glicocerebrosídeo) para ceramida; o defeito assim leva a um acúmulo de glicosilceramida. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas.

[00202] A doença de Gaucher é a mais comum das doenças de armazenagem lisossômica. O material graxo pode coletar no baço, fígado, rins, pulmões, cérebro e medula óssea.

[00203] Os sintomas podem incluir baço e fígado ampliados, mal funcionamento do fígado, distúrbios esqueletais e lesões ósseas que podem ser dolorosas, complicações neurológicas severas, inchaço dos linfônodos e (ocasionalmente) das juntas adjacentes, abdômen distendido, um tom amarronzado da pele, anemia, plaquetas sanguíneas baixas e depósitos gordurosos amarelos na esclera. As pessoas afetadas mais seriamente também podem ser mais suscetíveis à infecção.

[00204] A doença mostra herança recessiva autossômica e portanto afeta tanto homens quanto mulheres. Mutações diferentes de glicosilceramidase determinam a atividade remanescentes da enzima, e, a um grau maior, o fenótipo. Pesquisa sugere que heterozigotos para mutações de glicosilceramidase particulares estão em um risco aumentado da doença de Parkinson e particular malignidades (linfoma de não Hodgkin, melanoma e câncer pancreático).

[00205] A glicosilceramida é um constituinte da membrana celular de células sanguíneas vermelhas e brancas. Os macrófagos que limpam estas células são incapazes de eliminar o produto residual, que se acumula em fibrilas e transformam-se em células de Gaucher, que aparecem no microscópio ótico lembrando papel amassado.

[00206] A doença de Gaucher tem três subtipos clínicos comuns. Cada tipo foi ligado às mutações particulares. Em todos, existe cerca de 80 mutações conhecidas.

[00207] Tipo I (ou tipo não neuropático) é a forma mais comum da doença, ocorrendo em aproximadamente 1 em 50.000 nascimentos vivos. O mesmo ocorre mais frequentemente entre pessoas de herança judia de Ashkenazi, 100 vezes a ocorrência na população geral. Os sintomas podem começar cedo na vida ou na idade adulta e incluem fígado ampliado e baço grosseiramente ampliado (junto com hepatoesplenomegalia); o baço pode romper e causar complicações adicionais. A fraqueza esqueletal e doença óssea podem ser extensivas. A ampliação do baço e a reposição da medula óssea causam anemia, trombocitopenia e leucopenia. O cérebro não é afetado, mas pode haver dano aos pulmões e, raramente, aos rins. Pacientes neste grupo usualmente se machucam facilmente (devido aos níveis baixos de plaquetas) e experienciam fadiga devido aos números baixos de células sanguíneas vermelhas. Dependendo do início e severidade da doença, pacientes do tipo 1 podem viver bem até a idade adulta. Muitos pacientes têm uma forma branda da doença ou pode não apresentar nenhum dos sintomas.

[00208] Tipo II (ou doença de Gaucher neuropática infantil aguda) tipicamente começa dentro de 6 meses do nascimento e tem uma taxa de incidência de aproximadamente 1 em 100.000 nascimentos vivos. Os sintomas incluem um fígado e baço ampliados, dano cerebral extensivo e progressivo, distúrbios de movimento dos olhos, espasticidade, convulsões, rigidez de membros e uma capacidade pobre para sugar e engolir. As crianças afetadas usualmente morrem aos 2 anos de idade.

[00209] Tipo in (a forma neuropática crônica) pode começar em qualquer tempo na infância ou mesmo na idade adulta e ocorre em aproximadamente 1 em 100.000 nascimentos vivos. O mesmo é caracterizado pelos sintomas neurológicos lentamente progressivos mais mais brandos comparados com a versão aguda ou tipo 2. Os sintomas principais incluem um baço e/ou fígado ampliados, convulsões, coordenação deficiente, irregularidades esqueletais, distúrbios de movimento dos olhos, distúrbios sanguíneos incluindo anemia e problemas respiratórios. Os pacientes frequentemente vivem até seus anos de adolescência iniciais e idade adulta.

[00210] O National Gaucher Foundation estabelece que em tomo de 1 em 100 pessoas na população U.S. geral é um portador para a doença de Gaucher do tipo 1, dando uma prevalência de 1 em 40.000; entre judeus Ashkenazi a taxa de portadores é consideravelmente mais alta, a aproximadamente 1 em 15. A doença de Gaucher Tipo 2 não mostra nenhuma preferência particular por qualquer grupo étnico. A doença de Gaucher Tipo 3 é especialmente comum na população da região Sueca Setentrional de Norrbotten onde a incidência da doença é de 1 em 50.000.

[00211] Para os pacientes do tipo 1 e a maioria dos de tipo 3, o tratamento de reposição de enzima com glicosilceramidase recombinante intravenosa pode diminuir o tamanho do fígado e baço, reduzir as anormalidades esqueletais e reverter outras manifestações. A raridade da doença significa que estudos de descoberta de dose têm sido difíceis de conduzir, assim permanece controvérsia sobre a dose e frequência de dosagem ideais. Devido à baixa incidência, isto tem se tomado um medicamento órfão em muitos países. O tratamento correntemente existente da doença de Gaucher, Cerezyme® (imiglucerase para injeção), custa até $550.000 anualmente para um único paciente e o tratamento deve ser continuado por toda a vida. Miglustat é um outro medicamento aprovado para esta doença em 2003.

[00212] O transplante de medula óssea bem sucedido cura as manifestações não neurológicas da doença, porque a mesma introduz uma população de monócito com glicosilceramidase ativa. Entretanto, este procedimento carrega risco significante e é raramente realizado em pacientes com a doença de Gaucher. A cirurgia para remover o baço (esplenoctomia) pode ser requerida em raras ocasiões se os pacientes são anêmicos ou quando o órgão ampliado afeta o conforto do paciente. A transfusão de sangue pode beneficiar alguns pacientes anêmicos. Outros pacientes podem requerer a cirurgia de substituição de junta para melhorar a mobilidade e qualidade de vida. Outras opções de tratamento incluem antibióticos para infecções, antiepilépticos para convulsão, bisfosfonatos para lesões ósseas e transplantes de fígado.

[00213] A terapia de redução de substrato pode provar ser eficaz em deter a Tipo 2, visto que a mesma pode cruzar através da barreira sanguínea no cérebro. Não existe correntemente nenhum tratamento eficaz para o dano cerebral severo que pode ocorrer em pacientes com doença de Gaucher tipos 2 e 3.

[00214] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a doença de Gaucher, pela modulação da atividade de enzima de glicosilceramidase. Sialidose

[00215] A sialidose, ou mucolipidose tipo I (ML I), é causada por um defeito na enzima sialidase (ou alfa-neuraminidase). A sialidase é responsável pela conversão de GM3 à lactosilceramida; o defeito assim leva a um acúmulo de GM3. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente das saposinas.

[00216] A sialidose é herdada em uma maneira recessiva autossômica. Os sintomas estão presentes no nascimento ou se desenvolvem dentro do primeiro ano de vida. Em muitos bebês afetados, o inchaço excessivo por todo o corpo é notado no nascimento. Estes bebês frequentemente nascem com traços faciais grosseiros, tais como uma ponte nasal plana, pálpebras inchadas, aumento das gengivas e tamanho da língua excessivo (macroglossia). Muitos bebês também nascem com má-formações esqueletais tais como deslocamento de quadril. Os bebês frequentemente desenvolvem contrações musculares involuntárias súbitas (chamadas de mioclonia) e têm manchas vermelho cereja nos seus olhos (máculas vermelho cereja). Eles são frequentemente incapazes de coordenar movimento voluntário (chamado ataxia). Tremores, visão prejudicada e convulsões também ocorrem. Testes revelam o aumento anormal do fígado (hepatomegalia) e baço (esplenomegalia) e inchaço abdominal extremo. Os bebês no geral carecem de tônus muscular (hipotonia) e têm retardo mental que é inicial ou progressivamente severo. Muitos pacientes sofrem de insuficiência para se desenvolver e de infecções respiratórias recorrentes. A maioria dos bebês com ML I morrem antes da idade de 1 ano.

[00217] A sialidose pode ser sub-categorizada de acordo com a idade na qual os sintomas começam e os tipos de sintomas presentes. Os efeitos da doença pode variar de brando a severo.

[00218] A sialidose é um distúrbio raro que não tem nenhuma predileção racial. Muito poucos dados de população estão disponíveis, mas um estudo dos Países Baixos relatou uma frequência de aproximadamente 1 caso em 2.175.000 nascimentos vivos. Entretanto, esta taxa pode não se aplicar a todas as populações, algumas das quais pode ter uma incidência mais alta; além disso, o reconhecimento clínico errado é um fator importante quando a triagem de recém-nascido não é uma opção.

[00219] As opções de tratamento para a sialidose permanece limitada e são primariamente direcionadas em cuidado sustentador e alívio sintomático.

[00220] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a sialidose, pela modulação da atividade de sialidase. Leucodistrofia metacromática

[00221] Leucodistrofia metacromática (MLD) ou deficiência de Arilsulfatase A é causada por um defeito na enzima de arilsulfatase A (ou cerebrosídeo-sulfatase). A arilsulfatase A é responsável pela conversão de sulfatídeo (ou cerebrosídeo 3-sulfato) para galactosil-ceramida; o defeito assim leva a um acúmulo de sulfatídeo. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente das saposinas.

[00222] A mesma é uma doença de armazenagem lisossômica que é habitualmente listada na família de leucodistrofias. A leucodistrofia afeta o crescimento e/ou desenvolvimento de mielina, a cobertura graxa que atua como um insulante em tomo das fibras nervosas por todo os sistemas nervosos centrais e periféricos.

[00223] Como muitos outros distúrbios genéticos que afetam o metabolismo de lipídeo, existem várias formas de MLD, que são infantil tardia, juvenil e adulta:

[00224] Na forma infantil tardia, que é a forma mais comum de MLD, crianças afetadas começam tendo dificuldade para andar depois do primeiro ano de vida. Os sintomas incluem enfraquecimento muscular e fraqueza, rigidez muscular, retardos desenvolvimentais, perda progressiva da visão levando à cegueira, convulsões, deglutição prejudicada, paralisia e demência. As crianças podem se tomar comatosas. Não tratadas, a maioria das crianças com esta forma de MLD morrem aos 5 anos de idade, frequentemente muito mais cedo.

[00225] Crianças com a forma juvenil de MLD (início entre 3 e 10 anos de idade) usualmente começam com desempenho escolar prejudicado, deterioração mental e demência e depois desenvolvem sintomas similares à forma infantil tardia mas com progressão mais lenta. A idade da morte é variável, mas normalmente dentro dos 10 a 15 anos do início dos sintomas.

[00226] A forma adulta habitualmente começa depois da idade de 16 anos como um distúrbio psiquiátrico ou demência progressiva. A MLD de início na idade adulta progride mais lentamente do que as formas infantil tardia e juvenil, com um curso prolongado de uma década ou mais.

[00227] Em casos raros o corpo pode compensar quanto a deficiência e a pessoa não exibe nenhum sintoma.

[00228] Não existe nenhuma cura para MLD e nenhum tratamento padrão, a mesma é uma doença terminal. Crianças com juvenil avançado ou pacientes de início adulto e infantil tardio que demonstram sintomas têm tratamento limitado para dor e controle de sintoma. Pacientes com MLD infantil tardia pré-sintomáticos, assim como aqueles com MLD juvenil ou adulta que são pré-sintomáticos ou demonstram sintomas brandos a moderados, têm a opção de transplante da medula óssea (incluindo transplante de célula tronco), que está sob investigação.

[00229] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a Leucodistrofia metacromática, pela modulação da atividade da enzima arilsulfatase A. Deficiência de saposina

[00230] Tanto em seres humanos quanto em camundongos, as deficiências de pró-saposina/saposina levam a déficits neurológicos severos.

[00231] Pacientes humanos com mutações pontuais na saposina A, B e C mostram fenótipos da doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática e doença de Gaucher, indicando que os seus substratos primários in vivo são galactosilceramida, sulfatídeo e glicosilceramida, respectivamente.

[00232] A doença de Krabbe, atípica, devido à deficiência de saposina A: Um distúrbio bioquímico herdado que resulta em regressão neurológica dentro de uns poucos meses de nascido. A morte usualmente ocorre durante os primeiros poucos anos de vida. O distúrbio é similar para a doença de Krabbe mas é diferenciada pela origem genética do defeito bioquímico. A doença de Krabbe envolve um defeito no gene da galactocerebrosidase considerando que a doença de Krabbe atípica envolve um defeito no gene de prosaposina que causa uma deficiência de saposina A.

[00233] A saposina B, previamente conhecida como SAP-1 e ativador de sulfatídeo, estimula a hidrólise de uma ampla variedade de substratos incluindo sulfato de cerebrosídeo, gangliosídeo GM1 e globotriaosilceramida pela arilsulfatase A, ácido beta-galactosidase e alfa-galactosidase, respectivamente. A deficiência em saposina B humana, transmitida como um traço recessivo autossômico, resulta no acúmulo tecidual de sulfato de cerebrosídeo e um quadro clínico que se parece com a leucodistrofia metacromática (leucodistrofia metacromática deficiente em ativador) embora com atividade de arilsulfatase normal. A deficiência em Saposina B é uma doença heterogênea com um espectro similar a aquele na leucodistrofia metacromática.

[00234] A Saposina (SAP-) C é requerida para a degradação da glucosilceramida e a sua deficiência resulta em uma forma variante da doença de Gaucher; doença de Gaucher não neuronopática devido à deficiência de SAP-C. Níveis muito altos de atividade de quitotriosidase, quimiocina CCL18 e concentração aumentada de glicosilceramida em plasma e atividade de 8- glicosidase normal em fibroblastos dérmicos são observados nos pacientes. Uma mutação de sentido errado, p.L349P, localizada no domínio SAP-C e uma outra mutação, p.MIL, localizada no códon de início da proteína precursora de pró-saposina foi identificada.

[00235] Em uns poucos pacientes de Gaucher não neuronopáticos, uma mutação tanto na Saposina C quanto na saposina D foi identificada.

[00236] As deficiências na saposina C e D combinadas em camundongos levam a um fenótipo neuronopático com acúmulo de glicosilceramida e alfa-hidróxi ceramida.

[00237] Em camundongos, a deficiência de saposina D é associada com o acúmulo de ceramida, a perda parcial das células de Purkinje e a função do sistema urinário prejudicada. Este fenótipo não imita a letalidade embrionária exibida pelos camundongos com deficiência completa de ceramidase ácida, enzima cognata da saposina D.

[00238] Duas mutações são conhecidas em seres humanos que resultam na inativação completa de todas as quatro saposinas e pró-saposinas. A deficiência de saposina total é uma doença devastadora com envolvimento de órgãos múltiplos e esfmgolipídeos múltiplos. A deficiência de saposina combinada (ou deficiência de pró-saposina) foi relatada em um caso que se apresenta com uma distrofia neurovisceral que causou a morte de um neonato. Esfingolipídeos múltiplos foram elevados na urina, com globotriaosilceramida mostrando o maior aumento. Uma nova mutação no gene PSAP foi identificada, que é homozigota para uma mutação de sítio aceitador de junção duas bases a montante do exon 10. Esta mutação levou a um códon de parada prematura e produziu níveis baixos de transcrito.

[00239] A presente invenção está em uma forma de realização relacionada com um método para tratar a deficiência de saposina. A dita deficiência de saposina pode ser selecionada do grupo que consiste de deficiência de saposin A, deficiência de saposina B, deficiência de saposina C, deficiência de saposin C e deficiência de saposina combinada (ou deficiência de pró-saposina). Atividade enzimática residual

[00240] As doenças de armazenagem lisossômica são, como esboçado aqui acima, causadas por uma enzima defeituosa. A dita enzima defeituosa pode não ter nenhuma atividade residual, ou pode ter alguma atividade residual.

[00241] Atividade enzimática residual como aqui usada significa que embora a enzima seja defeituosa, por exemplo causada por uma mutação, a atividade da enzima não é completamente abolida, mas bastante reduzida a um nível patológico.

[00242] A presente invenção em um aspecto diz respeito a um agente bioativo para o uso no tratamento de uma doença de armazenagem lisossômica e um método para o tratamento de um indivíduo com uma doença de armazenagem lisossômica.

[00243] Em uma forma de realização da presente invenção, a doença de armazenagem lisossômica que é tratada de acordo com a presente invenção é caracterizada como tendo atividade enzimática residual da enzima defeituosa envolvida na patologia da doença.

[00244] Em uma forma de realização, a dita atividade enzimática residual está na faixa de 0,1 % a 50 %, tal como na faixa de 0,1 a 1 %, por exemplo de 1 a 2 %, tal como de 2 a 3 %, por exemplo de 3 a 4 %, tal como de 4 a 5 %, por exemplo de 5 a 6 %, tal como de 6 a 7 %, por exemplo de 7 a 8 %, tal como de 8 a 9 %, por exemplo de 9 a 10 %, tal como de 10 a 11 %, por exemplo de 11 a 12 %, tal como de 12 a 13 %, por exemplo de 13 a 14 %, tal como de 14 a 15 %, por exemplo de 15 a 20 %, tal como de 20 a 25 %, por exemplo de 25 a 30 %, tal como de 30 a 35 %, por exemplo de 35 a 40 %, tal como de 40 a 45 %, por exemplo na faixa de 45 a 50 % de atividade enzimática residual. Modalidade de tratamento corrente para LSD

[00245] Não existe nenhuma cura para as doenças de armazenagem lisossômica e o tratamento é principalmente sintomático, embora o transplante de medula óssea e a terapia de reposição de enzima (ERT) tenham sido tentados com algum sucesso. Além disso, o transplante de sangue do cordão umbilical está sendo realizado em centros especializados para várias destas doenças. A terapia de transplante é entretanto acompanhada por efeitos colaterais maiores e frequentemente apresenta complicações para os pacientes. Além disso, a terapia de redução de substrato, um método usado para diminuir o acúmulo de material de armazenagem, está sendo correntemente avaliada para algumas destas doenças.

[00246] Para a maioria das doenças de armazenagem lisossômica, uma necessidade maior não atingida para fornecer uma modalidade de tratamento eficaz permanece.

[00247] A terapia de reposição de enzima foi desenvolvida para um subconjunto das doenças de armazenagem lisossômica e Cerezyme® esteve no mercado por vários anos para o tratamento da doença de Gaucher. A enzima defeituosa, glicocerebrosidase, é fabricada pelas técnicas recombinantes e dada pela infusão intravenosa em umas poucas horas. O tratamento não é uma cura e os pacientes requerem tratamento para toda a vida para deter a progressão da doença. Alguns sintomas podem melhorar pela ERT.

[00248] Entretanto, para a maioria das LSDs, uma ERT eficiente não foi desenvolvida. Isto pode ser porque a produção de enzima ativa tem se mostrado uma tarefa difícil, devido à estrutura de sub-unidade complexa das enzimas defeituosas. De fato, as enzimas podem dobrar incorretamente na produção.

[00249] Para aquelas LSDs em que a ERT está disponível, existem desvantagens que tomam esta forma de terapia menos desejável. Primeiramente antes de tudo, a ERT é uma forma muito cara de terapia, que é uma carga finaceira para a sociedade e a toma inacessível a alguns pacientes. Também, a ERT é alvejada especificamente apenas a uma doença. Alguns efeitos colaterais foram relatados para Cerezyme®, incluindo o desenvolvimento de uma resposta imune, náusea, vômito, dor abdominal, diarréia, brotoeja, fadiga, dor de cabeça, febre, vertigem, calafrios, dor lombar e frequência cardíaca rápida assim como sintomas sugestivos de reações alérgicas.

[00250] As divulgações feitas na presente invenção fornece assim um método novo e inovador para o tratamento das doenças de armazenagem lisossômica. Isto é particularmente relevante para estas doenças para as quais nenhuma terapia eficaz foi desenvolvida, aqueles que podem se beneficiar de um tratamento menos caro e aqueles que podem se beneficiar de uma terapia de combinação que compreende o agente bioativo da presente invenção.

[00251] Como aqui divulgado, o método de acordo com a presente invenção fornece uma modalidade de tratamento que é substancialmente mais barata para produzir do que a ERT e que alveja mais do que um distúrbio de armazenagem lisossômica específico.

[00252] As chaperonas moleculares, ou proteínas de choque térmico, são introduzidas aqui abaixo visto que os inventores descobriram que uma interação entre a proteína de choque térmico 70 e BMP lisossômico, como introduzidos aqui acima, forma a base para modular a atividade enzimática lisossômica e tratar distúrbios de armazenagem lisossômica, de acordo com a presente invenção.

Chaperonas Moleculares

[00253] Tendo gasto vasta quantidade de energia primeiro na transcrição e depois na tradução do código genético do DNA, a célula finalmente produziu um polipeptídeo, cuja função presumivelmente é requerida neste ponto na vida da célula. Entretanto, alguns obstáculos finais têm que ser superados de modo a obter uma proteína totalmente funcional — um destes sendo a dobra correta desta cadeia de polipeptídeo nascente. Os imperativos evolucionários de obter a dobra correta são óbvios — não apenas seria um gasto terrível de energia para ter sintetizado um peptídeo sem a conformação e consequentemente a função apropriadas, mas também a agregação de tais proteínas no lúmen celular mostrar-se-ia nocivo para a célula. Esta agregação é de fato um resultado muito provável, considerando o ambiente intracelular de alta concentração de proteína, de modo a não ser pego de surpresa que um mecanismo complicado e sofisticado de proteínas existe para ajudar a dobra de proteína, permitir que o estado funcional das proteínas seja mantido sob tais condições. Estas proteínas são coletivamente chamadas de chaperonas moleculares, porque, como as suas contrapartes humanas, elas impedem interações indesejadas entre seus clientes imaturos.

[00254] Os chaperonas moleculares são encontrados em todos os compartimentos de uma célula onde rearranjos conformacionais de proteínas ocorrem e embora a síntese de proteína seja a fonte principal de peptídeos não dobrados na célula, uma inoculação para a célula pela temperatura alta ou outros estímulos que tomariam as proteínas estruturalmente instáveis e consequentemente propensas a não dobrar e agregação, é atingido com uma resposta celular específica envolvendo a produção de proteínas de proteção. Esta resposta é um fenômeno observado em cada tipo de célula variando de procariotas a eucariotas e é aludida como a resposta ao choque térmico ou estresse. As proteínas induzidas por esta resposta são conhecidas como as proteínas de choque térmico (HSPs), das quais existem várias famílias. Estas famílias são compostas de proteínas tanto sequencial, estrutural quanto funcionalmente relacionadas, considerando que chaperonas de famílias diferentes podem diferir acentuadamente tanto em estrutura assim como função celular. Um exemplo primário de uma família de chaperonas são as proteínas Hsp70, que constituem a parte central de um sistema de chaperona ubíquo presente na maioria dos compartimentos de células eucarióticas, em eubactérias e em muitas archae. Esta família foi recentemente implicada em outros aspectos da homeostase celular além de servir como um chaperona - mais acentuadamente através das suas características anti-apoptóticas, as suas funções na imunidade e a dependência evidente de células cancerosas na supra regulagem de Hsp70.

A Família da Proteína de Choque Térmico 70

[00255] As proteínas Hsp70 estão envolvidas em uma ampla faixa de processos celulares incluindo a dobra e degradação de proteína de proteínas celulares instáveis assim como servindo a outros papéis citoprotetors. A função comum de Hsp70 nestes processos parece ser a ligação de segmentos hidrofóbicos curtos em polipeptídeos parcialmente dobrados, facilitando deste modo a dobra apropriada e prevenindo a agregação. Em eucariotas, chaperonas de Hsp70 interagem in vivo com classes diferentes de proteínas que serve para regular etapas críticas de seu ciclo funcional; entre estas a proteína Hsp40 da família do domínio J. Além disso, proteínas parceiras adicionais foram identificadas, algumas das quais estão ligando Hsp70 a outros sistemas de chaperona tais como o sistema Hsp90. Membros da Família Hsp70 Humana

[00256] Algumas das funções importantes atribuídas aos chaperonas moleculares incluem a importação de proteínas dentro dos compartimentos celulares, dobra de proteínas no citossol, retículo endoplasmático e mitocondria, prevenção da agregação de proteína e redobra de proteínas mal dobradas. No presente a família Hsp70 humana inclui 10 membros codificados pelos genes diferentes e esta seção é intencionada a fornecer um vista geral destes membros da família com respeito à função, padrões de expressão e homologia. Alguma confusão existe a cerca da nomenclatura dos membros da família Hsp70 humana diferentes, embora um conjunto de diretrizes gerais fosse apresentado por Tavaria et al., que fornecem uma ligação lógica entre nomes locais, genes e proteínas. Entretanto, como existe ainda alguma confusão interespécies, os genes e proteínas Hsp70 são aqui aludidos pelo seu nome local. O nome Hsp70 pode referir-se aos dois membros da família Hsp70 indutíveis com nomes locais HSPA1 A e HSPA1 B ou à família Hsp70 inteira no geral como evidente do consenso do texto. Entretanto, como usado por toda a presente invenção, Hsp70 é intencionado a denotar qualquer um dos dois membros da família de Hsp70 indutível com nomes locais HSPA1 A e HSPA1 B. HspAl A e HspAl B

[00257] Os genes transcritos dos locais HSPA1A e HSPA1 B são os dois genes Hsp70 induzível por calor/estresse e a maioria da literatura que diz respeito a Hsp70 humano refere-se às proteínas codificadas por estes dois genes. Os genes dão origem às proteínas que consiste de 641 aminoácidos, tendo 99 % de homologia entre si e foram os primeiros membros da família de Hsp70 humana a ser clonado e caracterizado. Os genes são ligados no complex de MHC-classe III em 6p21.3, são isentos de intron e com regiões promotoras que contém HSEs, que os permitem ligar HSFs e induzir a transcrição em resposta a uma variedade de ataques celulares.

[00258] A sequência de proteína para a proteína IA de 70 kDa de choque térmico de Homo sapiens (HSPA1A) é (SEQ ID NO: 1) (Acesso n- NM_005345.5): MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRL IGRKFGDPWQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITV PAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEV KATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGID FYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNKSINP DEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIFTTYSDNQPGV LIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKANKITITNDKGRLS KEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDAN TLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD

[00259] A sequência de ácido nucléico (DNA) para a proteína IA de 70 kDa de choque térmico de Homo sapiens (HSPA1A) é (SEQ ID NO: 2) (acesso ne NM.005345.5): 1 ataaaagccc aggggcaagc ggtccggata acggctagcc tgaggagctg ctgcgacagt 61 ccactacctt tttcgagagt gactcccgtt gtcccaaggc ttcccagagc gaacctgtgc 121 ggctgcaggc accggcgcgt cgagtttccg gcgtccggaa ggaccgagct cttctcgcgg 181 atccagtgtt ccgtttccag cccccaatct cagagcggag ccgacagaga gcagggaacc 241 ggcatggcca aagccgcggc gatcggcatc gacctgggca ccacctactc ctgcgtgggg 301 gtgttccaac acggcaaggt ggagatcatc gccaacgacc agggcaaccg caccaccccc 361 agctacgtgg ccttcacgga caccgagcgg ctcatcgggg atgcggccaa gaaccaggtg 421 gcgctgaacc cgcagaacac cgtgtttgac gcgaagcggc tgattggccg caagttcggc 481 gacccggtgg tgcagtcgga catgaagcac tggcctttcc aggtgatcaa cgacggagac 541 aagcccaagg tgcaggtgag ctacaagggg gagaccaagg cattctaccc cgaggagatc 601 tcgtccatgg tgctgaccaa gatgaaggag atcgccgagg cgtacctggg ctacccggtg 661 accaacgcgg tgatcaccgt gccggcctac ttcaacgact cgcagcgcca ggccaccaag 721 gatgcgggtg tgatcgcggg gctcaacgtg ctgcggatca tcaacgagcc cacggccgcc 781 gccatcgcct acggcctgga cagaacgggc aagggggagc gcaacgtgct catctttgac 841 ctgggcgggg gcaccttcga cgtgtccatc ctgacgatcg acgacggcat cttcgaggtg 901 aaggccacgg ccggggacac ccacctgggt ggggaggact ttgacaacag gctggtgaac 961 cacttcgtgg aggagttcaa gagaaaacac aagaaggaca tcagccagaa caagcgagcc 1021 gtgaggcggc tgcgcaccgc ctgcgagagg gccaagagga ccctgtcgtc cagcacccag 1081 gccagcctgg agatcgactc cctgtttgag ggcatcgact tctacacgtc catcaccagg 1141 gcgaggttcg aggagctgtg ctccgacctg ttccgaagca ccctggagcc cgtggagaag 1201 gctctgcgcg acgccaagct ggacaaggcc cagattcacg acctggtcct ggtcgggggc 1261 tccacccgca tccccaaggt gcagaagctg ctgcaggact tcttcaacgg gcgcgacctg 1321 aacaagagca tcaaccccga cgaggctgtg gcctacgggg cggcggtgca ggcggccatc 1381 ctgatggggg acaagtccga gaacgtgcag gacctgctgc tgctggacgt ggctcccctg 1441 tcgctggggc tggagacggc cggaggcgtg atgactgccc tgatcaagcg caactccacc 1501 atccccacca agcagacgca gatcttcacc acctactccg acaaccaacc cggggtgctg 1561 atccaggtgt acgagggcga gagggccatg acgaaagaca acaatctgtt ggggcgcttc 1621 gagctgagcg gcatccctcc ggcccccagg ggcgtgcccc agatcgaggt gaccttcgac 1681 atcgatgcca acggcatcct gaacgtcacg gccacggaca agagcaccgg caaggccaac 1741 aagatcacca tcaccaacga caagggccgc ctgagcaagg aggagatcga gcgcatggtg 1801 caggaggcgg agaagtacaa agcggaggac gaggtgcagc gcgagagggt gtcagccaag 1861 aacgccctgg agtcctacgc cttcaacatg aagagcgccg tggaggatga ggggctcaag 1921 ggcaagatca gcgaggcgga caagaagaag gtgctggaca agtgtcaaga ggtcatctcg 1981 tggctggacg ccaacacctt ggccgagaag gacgagtttg agcacaagag gaaggagctg 2041 gagcaggtgt gtaaccccat catcagcgga ctgtaccagg gtgccggtgg tcccgggcct 2101 gggggcttcg gggctcaggg tcccaaggga gggtctgggt caggccccac cattgaggag 2161 gtagattagg ggcctttcca agattgctgt ttttgttttg gagcttcaag actttgcatt 2221 tcctagtatt tctgtttgtc agttctcaat ttcctgtgtt tgcaatgttg aaattttttg 2281 gtgaagtact gaacttgctt tttttccggt ttctacatgc agagatgaat ttatactgcc 2341 atcttacgac tatttcttct ttttaataca cttaactcag gccatttttt aagttggtta 2401 cttcaaagta aataaacttt aaaattcaaa aaaaaaaaaa aaaaa

[00260] A sequência de proteína para a proteína 1B de 70 kDa de choque térmico de Homo sapiens (HSPAl B) é (SEQ ID NO: 3) (acesso n- NM.005346):

[00261] MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQV ALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPWQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAE AYLGYPVTNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTF DVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSST QASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQ DFFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQ TQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGK ANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKV LDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD

[00262] A sequência de ácido nucléico (DNA) para a proteína IB de 70 kDa de choque térmico de Homo sapiens (HSPA1 B) é (SEQ ID NO: 4) (acesso n- NM_005346): 1 ggaaaacggc cagcctgagg agctgctgcg agggtccgct tcgtctttcg agagtgactc 61 ccgcggtccc aaggctttcc agagcgaacc tgtgcggctg caggcaccgg cgtgttgagt 121 ttccggcgtt ccgaaggact gagctcttgt cgcggatccc gtccgccgtt tccagccccc 181 agtctcagag cggagcccac agagcagggc accggcatgg ccaaagccgc ggcgatcggc 241 atcgacctgg gcaccaccta ctcctgcgtg ggggtgttcc aacacggcaa ggtggagatc 301 atcgccaacg accagggcaa ccgcaccacc cccagctacg tggccttcac ggacaccgag 361 cggctcatcg gggatgcggc caagaaccag gtggcgctga acccgcagaa caccgtgttt 421 gacgcgaagc ggctgatcgg ccgcaagttc ggcgacccgg tggtgcagtc ggacatgaag 481 cactggcctt tccaggtgat caacgacgga gacaagccca aggtgcaggt gagctacaag 541 ggggagacca aggcattcta ccccgaggag atctcgtcca tggtgctgac caagatgaag 601 gagatcgccg aggcgtacct gggctacccg gtgaccaacg cggtgatcac cgtgccggcc 661 tacttcaacg actcgcagcg ccaggccacc aaggatgcgg gtgtgatcgc ggggctcaac 721 gtgctgcgga tcatcaacga gcccacggcc gccgccatcg cctacggcct ggacagaacg 781 ggcaaggggg agcgcaacgt gctcatcttt gacctgggcg ggggcacctt cgacgtgtcc 841 atcctgacga tcgacgacgg catcttcgag gtgaaggcca cggccgggga cacccacctg 901 ggtggggagg actttgacaa caggctggtg aaccacttcg tggaggagtt caagagaaaa 961 cacaagaagg acatcagcca gaacaagcga gccgtgaggc ggctgcgcac cgcctgcgag 1021 agggccaaga ggaccctgtc gtccagcacc caggccagcc tggagatcga ctccctgttt 1081 gagggcatcg acttctacac gtccatcacc agggcgaggt tcgaggagct gtgctccgac 1141 ctgttccgaa gcaccctgga gcccgtggag aaggctctgc gcgacgccaa gctggacaag 1201 gcccagattc acgacctggt cctggtcggg ggctccaccc gcatccccaa ggtgcagaag 1261 ctgctgcagg acttcttcaa cgggcgcgac ctgaacaaga gcatcaaccc cgacgaggct 1321 gtggcctacg gggcggcggt gcaggcggcc atcctgatgg gggacaagtc cgagaacgtg 1381 caggacctgc tgctgctgga cgtggctccc ctgtcgctgg ggctggagac ggccggaggc 1441 gtgatgactg ccctgatcaa gcgcaactcc accatcccca ccaagcagac gcagatcttc 1501 accacctact ccgacaacca acccggggtg ctgatccagg tgtacgaggg cgagagggcc 1561 atgacgaaag acaacaatct gttggggcgc ttcgagctga gcggcatccc tccggccccc 1621 aggggcgtgc cccagatcga ggtgaccttc gacatcgatg ccaacggcat cctgaacgtc 1681 acggccacgg acaagagcac cggcaaggcc aacaagatca ccatcaccaa cgacaagggc 1741 cgcctgagca aggaggagat cgagcgcatg gtgcaggagg cggagaagta caaagcggag 1801 gacgaggtgc agcgcgagag ggtgtcagcc aagaacgccc tggagtccta cgccttcaac 1861 atgaagagcg ccgtggagga tgaggggctc aagggcaaga tcagcgaggc ggacaagaag 1921 aaggttctgg acaagtgtca agaggtcatc tcgtggctgg acgccaacac cttggccgag 1981 aaggacgagt ttgagcacaa gaggaaggag ctggagcagg tgtgtaaccc catcatcagc 2041 ggactgtacc agggtgccgg tggtcccggg cctggcggct tcggggctca gggtcccaag 2101 ggagggtctg ggtcaggccc taccattgag gaggtggatt aggggccttt gttctttagt 2161 atgtttgtct ttgaggtgga ctgttgggac tcaaggactt tgctgctgtt ttcctatgtc 2221 atttctgctt cagctctttg ctgcttcact tctttgtaaa gttgtaacct gatggtaatt 2281 agctggcttc attatttttg tagtacaacc gatatgttca ttagaattct ttgcatttaa 2341 tgttgatact gtaagggtgt ttcgttccct ttaaatgaat caacactgcc accttctgta 2401 cgagtttgtt tgtttttttt tttttttttt ttttttgctt ggcgaaaaca ctacaaaggc 2461 tgggaatgta tgtttttata atttgtttat ttaaatatga aaaataaaat gttaaacttt 2521 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a HspAlL e HspA2

[00263] Dois membros da família Hsp70 foram chamados “genes chauvinistas” porque as células germinativas masculinas favorecem a sua expressão com forte descriminação. O gene hspAÍL é um membros da família Hsp70 isento de intron constitutivamente expressado localizado 4 kb telomérico ao local HSPA1A no mesmo complexo de MHC-classe III no cromossoma 6. O mesmo é expressado em baixa quantidade tanto antes quanto depois do choque térmico mas com o padrão de expressão favorecendo os testes em camundongo, rato e seres humanos com a proteína de 641 aminoácidos (aa) sendo 90 % homólogos a HspAlA. O gene hspA2 foi primeiro isolado de uma biblioteca genômica de camundongo e foi mais tarde mostrada ser constitutivamente expressada embora em níveis baixos em vários tecidos no corpo humano incluindo músculo esqueletal, ovário, intestino delgado, cólon, cérebro, placenta e os rins, mas altamente expressada em testículo. A sua expressão, ou de preferência a falta desta, foi conectada com espermatogênese humana anormal e os camundongos hspA2( / ) machos são estéreis. O gene está localizado no cromossoma 14, dando origem a uma proteína de 639 aa com 84 % de homologia a HspAlA, embora a localização exata seja objeto de debate visto que dois documentos apresentaram posições em locais diferentes - 14q24.1 vs. 14q22. HspA6 e HspA7

[00264] Os genes hspA6 e hspA7 são membros termicamente indutíveis da família Hsp70 sem nenhuma contraparte evidente em camundongos. Eles contêm HSEs nos seus sítios promotores e os genes são isentos de intron. Eles estão co-localizados no cromossoma 1 e são 94 % homólogos entre si na sequência de nucleotídeo. Entretanto, apenas HspA6 é funcional visto que o gene hspA7 abriga uma única inserção de nucleotídeo gerando um códon de parada prematuro em +1324. A proteína HspA6 tem 643 aminoácidos de comprimento e mostram 77 % de homologia com HspAl A e HspAl B.

[00265] HspA5 e HspA9

[00266] Os genes de hspA5 e hspA9 são os dois membros específicos de compartimento da família Hsp70. A proteína HspA5 de 655 aminoácidos está localizada no retículo endoplasmático (ER) e facilita a dobra e o transporte de proteínas recém sintetizadas neste compartimento. A proteína é 64 % homóloga a HspAl A, o gene estando localizado em 9q34. A proteína HspA9 de 679 aminoácidos está localizada na mitocondria onde a mesma ajuda na dobra de proteínas depois do seu transporte através da membrana mitocondrial. HspA9 está localizada em 5q31.1, a proteína sendo 52 % homóloga à HspAl A. HspA8

[00267] O membro Hsp70 cognato conhecido como Hsc70 é codificado por um gene chamado de hspA8 em 11 q24, dando origem a uma proteína de 646 aminoácidos com 86 % de homologia à HspAl A e é constitutivamente expressada em todos os tecidos e linhagens de célula. A proteína é análoga ao Hsp70 nas suas funções celulares, fornecendo o chaperonismo requerido sob circunstâncias normais, mas também foi designado um papel na retirada do revestimento de vesículas revestidas com clatrina assim como na autofagia mediada por chaperona. HspA3 e HspA4

[00268] Estas não serão debatidas aqui, visto que existem dúvidas se HSPA3 existe de fato e visto que HSPA4 é mais provavelmente um membro da família Hspl 10 e nada é conhecido a respeito dela até agora, exceto quanto a sua localização cromossômica em 5q31.1-2. Locus Name Used herein, Gene/Protein Position % aa Homology to HSPA1A Alternative Names

Tabela 1: Lista da Família de Gene Hsp70 Humana. Os genes são listados de acordo com o nome local, nomes aqui usados, localização (posição) cromossômica, homologia de aminoácido para HspAlA assim como nomes alternativos frequentemente observados na literatura.

Regulagem Transcricional de Hsp70

[00269] A pegada genômica do promotor Hsp70 humano tem revelado que o choque térmico/estresse induzem uma ligação rápida de fatores de transcrição de choque térmico (HSF) a uma região que abrange sequências nGAAn chamadas de elementos de choque térmico (HSEs). Sob condições normais Hsp70 é ligada aos HSFs, que reside no citossol, mas durante o estresse os HSFs são separados da Hsp70 e adaptam uma conformação homotrimérica na fosforilação por PKC ou outras serina/treonina cinases. Os trímeros de HSF entram no núcleo, onde eles ligam HSEs localizados na região promotora de genes Hsp70 e tomam-se ainda mais fosforilados pelas HSF cinases.

[00270] Três HSFs foram até agora caracterizadas em seres humanos (HSF1, HSF2 e HSF4).

[00271] HSF1 é o fator de transcrição principal ativado sob a maioria das condições de estresse e responde a uma ampla faixa de estímulos, que podem ser categorizados em fisiológicos (por exemplo, divisão celular, estimulação hormonal), patológica (por exemplo, infecções, febre, inflamação, malignidade) e condições ambientais (por exemplo, choque térmico, metais pesados, etanol).

[00272] HSF2 responde apenas à hemina, considerando que HSF4 é preferencialmente expressado no coração, pâncreas, cérebro e musculo esqueletal humanos, carece da repetição hidrofóbica de terminal C que é compartilhada entre todos os vertebrados HSFs e aparecem para reprimir a expressão de HSPs. A regulagem do gene Hsp70 responsável pela síntese da Hsp70 constitutivamente expressada (Hsc70) não é claramente entendida, mas HSFs não parecem estar envolvidos.

[00273] Embora os HSFs sejam o mais prominentes dos fatores que regulam a expressão de HSP, outros fatores de transcrição têm sido mostrado possuir a mesma capacidade. Os fatores de ligação CCAAT-box específicos (CBF) têm sido mostrados induzir a transcrição de Hsp70, o supressor de tumor p53 pode reprimir a transcrição pela ligação à região promotora de Hsp70 e pela neutralização de CBF e HSFs podem ser antagonizados pela proteína de ligação do fator de choque térmico 1 (HSBP1), que deste modo atenua a transcrição de Hsp70.

Propriedades Estruturais e Funcionais de Hsp70

[00274] A estrutura e função do sistema Hsp70 são melhor entendidos para a Hsp70 eubacteriana, DnaK, seu co-chaperona Hsp40 DnaJ e o fator de troca de nucleotídeo GrpE. Entretanto, o mecanismo é no geral considerado ser análogo em eucariotas, embora evidência sugira um desacoplamento de GrpE. Esta seção focalizará no sistema Hsp70 eucariótico, mas também incluirá comentários sobre o sistema eubacteriano, onde isto é considerado apropriado.

[00275] Hsp70 é compreendido de duas entidades funcionais - um domínio de ATPase de terminal N e um domínio de ligação de peptídeo de terminal C menor. O domínio de ATPase é compreendido de dois subdomínios separados por uma fenda que contém o sítio de ligação de nucleotídeo, que determina as propriedades de ligação de peptídeo do domínio de terminal C. Quando ATP é ligado, substratos de peptídeo se ligam e dissociam rapidamente, embora com baixa afinidade, considerando que em um estado onde nenhum nucleotídeo ou ADP é ligado ao domínio de terminal N, a taxa de ligação e dissociação de peptídeo diminui e a afinidade aumenta. A hidrólise de ATP serve assim como um comutador molecular entre dois estados de Hsp70, a ciclagem da qual é regulada pela proteína da família de domínio J Hsp40 em eucariotas e DnaJ e GrpE em eubactérias. O domínio J de terminal N de Hsp40 liga-se ao Hsp70 acelerando a hidrólise de ATP, facilitando desse modo a captura de peptídeo, considerando que a parte de terminal C de Hsp40 funciona como um chaperona pelo reconhecimento de peptídeos hidrofóbicos, por meio do qual Hsp70 é recrutado para as cadeias de polipeptídeo nascentes. É importante mencionar que os chaperonas moleculares não fornecem informação estérica específica para a dobra da proteína ligada, mas de preferência inibem interações não produtivas, permitir assim que a proteína dobre mais eficientemente na sua estrutura nativa.

[00276] Nas eubactérias, GrpE induz a liberação de ADP a partir de DnaK (Hsp70 bacteriana), considerando que para as proteínas Hsp70 eucarióticas um tal fator parece ser dispensável porque a etapa limitante de taxa neste ciclo de ATPase não é a dissociação de ADP ligado mas de preferência a propria hidrólise de ATP. Entretanto, proteínas asicionais servem para regular a função de Hsp70 em eucariotas; a proteína homo- oligomérica Hip (proteína que interage com Hsp70) que serve como um regulador positivo pela estabilização do estado ligado ao ADP de Hsp70, considerando que o terminal carbóxi das proteínas da proteína que liga Hsp70 (CHIP) e atanogene-1 associado a Bcl-2 (Bag-1) ambos têm efeitos inibidores - CHIP pela inibição da atividade de ATPase de Hsp70 e Bag-1 pela antagonização da atividade de redobra de Hsp70. Interações adicionais são fornecidas pelas duas proteínas Hsp40 humanas Hdjl e Hdj2, que, além das suas funções de Hsp40 (descritas acima), foi mostrada facilitar a ligação de Hsp70 e Hsp90 através de Hop (proteína que organiza Hsp), uma proteína adaptadora que fisicamente figa os chaperonas através dos seus dois domínios de repetição de tetratricopeptídeo (TPR) que ligam as sequências de terminal C extendido de Hsp70 e Hsp90, respectivamente. Foi recentemente mostrado que algumas das proteínas acima mencionadas são reguladoras na transferência de proteínas mal dobradas não nativas ou irreversíveis dos chaperonas para o mecanismo de ubiquitina-proteassoma. A proteína CHIP é, à parte do seu papel regulador negativo sobre Hsp70, capaz de associar com Hsp90 através de um domínio TPR de terminal N e alveja substratos de Hsp90 para degradação através de um domínio da ubiquitina ligase de terminal C, mas também é capaz de cooperar funcionalmente com BAG-1, que se liga a Hsp70 (assim como o proteassoma. Estas descobertas fornecem uma ligação possível entre os mecanismos que integram a dobra auxiliada pelo chaperona e a degradação preoteolítica, os dois componentes principais do controle de qualidade da proteína no citossol.

Citoproteção via Hsp70

[00277] A parte das suas capacidades anti-apoptóticas como uma consequência de ser um chaperona molecular, isto é, facilitação da dobra de proteína sob condições de outro modo desnaturantes, Hsp70 também é capaz de afetar a sobrevivência de células em vários outros modos, incluindo a função de proteção da mitocondrial depois da lesão de isquemia-reperfusão, bloqueio da ativação da cinase de estrese c-jun da cinase de terminal N (JNK) na estimulação de fibroblastos primários com TNF e um complexo Hsp70/Bag-l foi proposto para regular o crescimento de célula e mitogênese durante condições de estresse celular. A capacidade de Hsp70 para proteger células da morte celular induzida por uma série de estímulos tais como TNF, TRAIL, estresse oxidativo, radiação por UV e os medicamentoos anticâncer doxorrubicina, etoposida e taxol enfatizam ainda mais as suas características antiapoptótica. Finalmente, relatos também têm fornecido evidência de interações mais diretas entre Hsp70 e o mecanismo apoptótico visto que Hsp70 foi mostrado antagonizar o fator que induz a apoptose (AIF), assim como exerce uma função antiapoptótica a jusante da caspase-3.

[00278] Evidência recente também sugere que partes do efeito citoprotetor potente de Hsp70 são devidas à estabilização de membranas lisossômicas. Em evidência disto, o esgotamento de Hsp70 deflagra uma permeabilização precoce das membranas lisossômicas e morte celular mediada pela catepsina em células cancerosas e a Hsp70 exógena eficazmente inibe a destabilização lisossômica induzida pelos vários estresses. Além disso, camundongos deficientes quanto à Hsp70 sofrem de pancreatite causada pelo vazamento de proteases lisossômicas no citossol. Todos estes eventos enfatizam o papel de Hsp70 como um regulador importante de PCD e consequentemente fator de sobrevivência para as células.

Hsp70 no Câncer

[00279] Hsp70 é frequentemente super-expressada em tumores humanos malignos e a sua expressão correlaciona-se com o prognóstico deficiente em tumores mamários e endometriais. De acordo com isto, Hsp70 aumenta o potencial tumorigênico de células de roedor implantadas em animais imunocomprometidos ou singênicos.

[00280] O papel de Hsp70 como um fator essencial para a sobrevivência de célula cancerosa é ainda mais substanciado a partir de um relato por Wei et al., que fizeram o primeiro estudo de esgotamento de Hsp70 em células cancerosas. Os resultados indicaram que quando a expressão de Hsp70 foi inibida em várias linhagens de célula cancerosa pelo uso de um oligômero anti-sentido, a inibição da proliferação de célula e apoptose subsequente foram induzidas. Este trabalho foi substanciado em uma série de experimentos em que o esgotamento mediado por anti-sentido adenoviral de Hsp70 deflagra um programa de morte lisossômica específico de célula de tumor.

[00281] Estudos in vivo que utilizam xenoenxertos ortotópicos de glioblastoma e carcinomas mamários assim como xenoenxertos sub-cutâneos de carcinoma de cólon em camundongos imunodeficientes tem demonstrado ainda mais o potencial anticâncer do esgotamento de Hsp70, visto que os tumores de camundongos que recebem aplicação locoregional das construções adenovirais mencionadas acima mostraram morte celular equivalente à apoptose maciça e recrutamento de macrófagos. Estes estudos claramente demonstram a dependência de alguns tumores na presença de Hsp70, embora outros estudos tenham debatido que a citotoxicidade observada em cultura de célula no esgotamento mediado por adenovirus de Hsp70 é devido a uma combinação de estresse celular viralmente mediado e infra regulagem de Hsp70. A despeito desta controvérsia, a citotoxicidade em cultura celular induzida pelo esgotamento de Hsp70 não foi dependente das caspases visto que nem a superexpressão de Bcl-2 nem a inibição farmacológica das caspases puderam recuperar as células. De preferência, a deflagração de LMP e a liberação de catepsinas ao citossol foram provavelmente os eventos que induziram a morte visto que a inibição de catepsinas de cisteína conferiram citoproteção significante. Além disso, o esgotamento de Hsp70 nos xenoenxertos de tumor anteriormente mencionados em camundongos leva à liberação de catepsina e morte celular do tumor.

[00282] Como mencionado mais no princípio, um dos mecanismos citoprotetors de Hsp70, que muitas células cancerosas parece ter adaptado, é a translocação de Hsp70 para o compartimento endolisossômico onde o mesmo serve a um papel de proteção de membrana. Esta translocação pode não ser acionada apenas pela necessidade de proteger as membranas lisossômicas, visto que estudos têm mostrado que mais do que 50 % dos tumores mostram a localização de Hsp70 na superfície da membrana plasmática - uma area que é diretamente conectada com o compartimento endolisossômico por intermédio de eventos endocitósicos e secretores, como descrito mais no princípio. A Hsp70 exposta na superfície apresenta um epítopo único que pode atuar como uma estrutura de reconhecimento para as células matadoras naturais (NK), estimulando a sua proliferação e atividade citolítica. As células NK ativadas por esta sequência de peptídeo de Hsp70 foram mostradas inibir o crescimento de tumor em camundongos com imunodeficiência combinada severa (SLID), um possível mecanismo para isto pode ser aquele em que a Hsp70 ligada à superfície da célula medeia a apoptose pela ligação específica e a captação de granzima B, independente de perforina.

[00283] Como anteriormente escrito, as membranas endolisossômicas e as membranas plasmáticas são constantemente intercambiadas. Assim, a presença de Hsp70 na superfície de células cancerosas pode ser uma consequência “infeliz” de dois eventos que promovem a progressão de tumor; a secreção de catepsinas, que promove a invasão e angiogênese e a localização de Hsp70 nas membranas lisossômicas, que impede a liberação acidental de catepsinas de cisteína para o citossol e a morte celular subsequente. Hsp70 Extracelular

[00284] Como evidente a partir dos primeiros parágrafos, as funções intracelulares de Hsp70 são essenciais para a homeostase celular apropriada, não tão menos importante diante de inoculações nocivas. Entretanto, papéis interessantes também estão emergindo para a Hsp70 extracelular (eHsp70) especialmente quando os mesmos vem de respostas imunes e inflamatórias, que mais uma vez teriam papéis importantes para a depuração de células cancerosas. Além disso, o envolvimento em uma adaptação fisiológica geral ao estresse e proteção versus dano celular também são temas emergentes para a eHsp70.

Hsp70 Extracelular e Neuroproteção

[00285] A primeira evidência quanto a presença de eHsp70 veio de estudos no axônio gigante de lula, em que foi mostrado que a elevação da temperatura induziu um conjunto de proteínas de choque térmico na bainha glial que circunda o axônio que foram transferidos no axônio. Estas descobertas foram logo reproduzidas em células de embrião de rato cultivadas e de maneira importante, já neste ponto, evidência foi apresentada para um caminho não clássico de exocitose que é responsável pela liberação de Hsp70 visto que nem monensina nem colcicina, ambos inibidores do caminho secretor clássico, puderam bloquear a secreção de Hsp70. Desde estas publicações, outros relatos têm fornecido exemplos de liberação de Hsps pela glia e a captação pelos neurônios em vários sistemas de modelo de animal tais como sapos, pitu e ratos. Suporte de um papel para as células gliais como fontes de eHsp70 em seres humanos foi fornecido por um estudo de células de glioblastoma humano cultivadas. Este estudo mostrou que sob as condições de controle as células liberaram ~10 pg de Hsp70 por milhão de células ao meio em um período de tempo de 24 h. Esta liberação foi aumentada de 2,5 a 5 vezes quando um choque térmico de 20 min foi aplicado no começo do período de tempo. De maneira importante, este estudo também mostrou que a liberação de eHsp70 foi maior do que aquela que pode ser responsbilizada pela morte celular. Estes dados todos sustentam a hipótese originalmente sugerida apresentada por Tytell et al., de que a liberação glial de Hsps pode ser um caminho para sustentar a função neuronal durante os estresses metabólicos.

[00286] A evidência in vivo para eHsp70 tendo um papel neurode proteção durante o estresse agudo vem de uma variedade de estudos. Um estudo por Tidwell et al. descobriu que eHsp70 é capaz de reduzir a quantidade de morte celular de neurônio motor após a axotomia, quando eHsp70 foi aplicado por intermédio de um gel-esponja depois da axotomia. No mesmo estudo, a sobrevivência aumentada de células neuronais sensoriais do gânglio da raiz dorsal também foram observados na administração de Hsp70, embora isto dependesse de doses levemente mais altas de Hsp70 do que nos neurônios motores. Além disso, eHsp70 foi mostrada proteger os neurônios motores de outro modo destinados a morrer durante o desenvolvimento embrionário de pinto e também proteger neurônios motores isolados das medulas espinhais de pinto no esgotamento de fator tráfico. Um papel de proteção in vivo para eHsp70 também foi descrito quando foi descoberto o dano da retina. Neste estudo, Yu et al., intravitrealmente injetaram uma solução de Hsp70 e Hsc70 recombinantes depois da exposição à luz que induz dano em uma dose que foi previamente descrita causar degeneração fotorreceptora extensiva. De modo interessante, a presença da mistura de eHsp70 na câmara vítrea do olho direito resultou significantemente em mais fotorreceptores sobrevivendo na retina. Além disso, a avaliação da captação de Hsc/Hsp70 rotulados com fhioresceína demonstrou que a mesma foi presente na retina 6 h depois da administração. Hsp70 extracelular administrada via tratamento intranasal também mostrou prevenir as consequências de estresse inevitáveis em ratos e foi recentemente descrito que Hsp70 recombinante humano intraperitonealmente injetado foi eficaz em aumentar a expectativa de vida, retardar o início do sintoma, preservar a função motora e prolongar a sobrevivência de neurônio motor em um modelo de camundongo de esclerose lateral amiotrófica. Trabalho in vitro adicional usando Hsp70 ou a mistura de Hsc/Hsp70 em sistemas neuronais tem além disso mostrado que eHsp70 pode intensificar a tolerância ao estresse de célula neuronal e reduzir a toxicidade da poliglutamina e agregação. Hsp70 Extracelular e Imunidade

[00287] Além dos papéis na citoproteção, tanto a eHsp70 associada com a membrana plasmática assim como a sistêmica livre forma documentadas servir a papéis na imunidade. Considerando que uma das funções principais de Hsp70 é ser chaperona de proteínas intracelulares, talvez não seja surpreendente que a mesma possa estar envolvida na ligação de peptídeos imunogênicos e ajudar na apresentação destas pelas moléculas de classe 1 do complexo de histocompatibilidade maior (MHC). Além disso, eHsp70 derivada de tumor foi mostrada ser chaperona de peptídeos imunogênicos e seletivamente liga-se às células que apresentam antígeno (APC). A seguir da endocitose mediada por receptor estes complexos de Hsp70-peptídeo são depois apresentados nas moléculas de classe 1 MHC levando a uma resposta de célula t citotóxica. Além disso para o chaperonamento de auto-antígenos, Hsp70 também é capaz de ligar peptídeos microbianos e motivos CpG não metilados em DNA bacteriano.

[00288] Além disso para o seu papel como um chaperona que apresenta antígeno, eHsp70 também foi implicado na estimulação de imunidade inata. Embora vários tipos de célula tenham sido mostrados liberar Hsp70, eHsp70 também foi mostrada ligar-se a vários receptores em sub- populações de leucócito diferentes incluindo células matadoras naturais (NK), macrófagos, monócitos e células dendríticas. Os receptores envolvidos no reconhecimento de eHsp70 principalmente incluem receptores de reconhecimento padrão (PRR’s) e consistem de uma variedade de receptores de famílias receptoras diferentes tais como os reecptores equivalentes a toll (TLR), receptores descontaminadores e lectinas tipo C. Na ligação de receptor, eHsp70 é capaz de evocar uma ampla resposta de citocina incluindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias tais como TNF-a, IL-lb, IL-12, IL- 6 e GM-CSF, um processo deflagrado pela translocação de NF-kB para o núcleo, sugerindo uma ação da citocina de eHsp70, que também levou à sugestão de cunhar o termo chaperocina para eHsp70 de modo a melhor descrever as funções únicas de eHsp70 tanto como um chaperona quanto citocina.

[00289] Muito do trabalho in vivo sobre um papel de eHsp70 na imunidade foi conduzido em modelos de roedor. Por exemplo, aumentos na concentração de eHsp70 em resposta ao choque de calda foram associados com inflamação reduzida e tempos de recuperação mais rápidos a seguir de uma injeção subcutânea de E. coli. Além disso, a liberação in vivo de Hsp70 no fechamento de ferimento acelerado de camundongos, uma característica que foi provavelmente devida à fagocitose de macrófago realçada de fragmentos de ferimento.

[00290] Evidência para os papéis imunomoduladores de Hsp70 em seres humanos está em falta, mas estudos têm demonstrado relações entre eHsp70 aumentado e prognóstico/resultado melhorados para trauma cerebral, embora o contrário também tenha sido mostrado. Entretanto, também é conhecido que as concentrações de eHsp70 declinam com o avanço da idade, que pode ser indicativo de uma capacidade reduzida relacionada com a idade para montar uma resposta ao estresse completa, que mais uma vez seria responsável pela morbidez e mortalidade aumentadas observadas com o envelhecimento, embora isto permaneça puramente especulativo. Liberação de Hsp70

[00291] A parte dos dados que demonstram a transferência de eHsp70 entre células vizinhas tal como no modelo glia/axônio, vários relatos têm documentado a presença de eHsp70 livre na circulação. Para Hsp70 estar presente neste compartimento, necessariamente tem que ser liberada de um órgão/célula. Dois caminhos principais de obter isto são usuahnente considerados. Um é um caminho passivo em que a observação de eHsp70 na circulação periférica é a consequência da liberação de uma reunião intracelular de Hsp70 devido à lise ou morte de célula. Altemativamente, ou talvez adicionahnente, Hsp70 é ativamente liberada via um caminho exocitótico clássico.

[00292] Foi sugerido que Hsp70 junto com outras proteínas de choque térmico são apenas liberadas sob circunstâncias patológicas que resultam na morte necrótica e não durante a morte celular programada. Sem dúvida, as condições de trauma severo e patológicas que resultam em necrose podem levar à liberação de Hsp70 para a corrente sanguínea. Isto foi bem documentado e também logicamente seria esperado. Estudos recentes entretanto, têm mostrado que Hsp70 pode ser liberado de células intactas pelos mecanismos ativos e que os graus de estímulo determina o modo de liberação. Evidência forte para a liberação não necrótica de Hsp70 também vem de estudos sobre a liberação induzida por exercício de eHsp70 para a corrente de sangue periférico. Dependente do modo de exercício (quanto mais alto o esforço físico, mais liberação) aumentos maiores de eHsp70 podem ser detectados na corrente de sangue periférico e de maneira importante, nenhum estudo conhecido relatou uma correlação direta entre eHsp70 e marcadores de dano muscular. Que eHsp70 pode ser liberada independente do dano celular ou tecidual além disso foi elegantemente demonstrado por Fleshner e colaboradores que mostraram que o estresse psicológico tal como medo predatório e choque elétrico podem evocar uma liberação de eHsp70 induzida pelo estresse, um processo que foi sugerido ser dependente da sinalização de catecolamina.

[00293] O caminho pelo qual hsp70 deixa a célula é ainda incerto embora, não tão menos importante porque Hsp70 não contém nenhuma sequência líder de peptídeo clássica, que o alvejaria para a secreção. Além disso, visto que a secreção clássica já foi questionada mais no princípio, isto sugere que mecanismos alternativos para a liberação de eHsp70 devem existir. Foi demonstrado que eHsp70 pode ser liberado em vesículas caracterizadas como exossomas, mas evidência também foi apresentada de que eHsp70 pode ser liberado como eHsp70 livre, tanto em sistemas celulares assim como in vivo. Foi sugerido que jangadas de lipídeo são necessárias para a liberação de eHsp70 embora isto também tenha sido contestado. Além disso, foi mostrado que um compartimento lisossômico funcional é necessário para a liberação de eHsp70 e que esta liberação é acompanhada pela presença de proteínas marcadoras lisossômicas na superfície das células, sugerindo uma secreção dependente da fusão lisossômica plasmática e de membrana. Independente de se a liberação é por intermédio de exossomas ou por intermédio da liberação direta de lisossomas, é interessante mencionar que algum tipo de compartimento endossômico/ lisossômico MVB/tardio secretor está aparentemente envolvido em todos os modos de liberação.

[00294] Visto que as catecolaminas por intermédio do receptor cti- adrenérgico pode levar aos fluxos de cálcio intracelular e visto que os mesmos fluxo de cálcio foram sugeridos causar exocitose de exossomas, corpos multivesiculares e lisossomas, uma hipótese corrente é que sob tempos de estresse, aumentos na ação da noradrenalina que atua sobre os receptores ai- adrenérgicos resulta em um fluxo de cálcio dentro da célula e uma liberação subsequente de Hsp70 dentro dos exossomas.

Agente bioativo de acordo com a presente invenção

[00295] A presente invenção em uma forma de realização diz respeito à modulação da atividade enzimática, em que a dita enzima interage com BMP, pelo uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70.

[00296] A modulação da atividade enzimática de acordo com a presente invenção pode ser obtida pelo fornecimento de uma das seguintes classes de compostos e terapias, que aumentam a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70: Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta indutores ou co-indutores de Hsp70 Medicamentos de molécula pequena tais como Bimoclomol e Arimoclomol Fluidizadores de membrana tais como álcool benzílico Terapia térmica sub-letal (42 °C) ou hipertermia Certos medicamentos do grupo de medicamentos anti-inflamatórios e anti- neoplásticos Estresse celular Espécies de oxigênio reativo (ROS) Adrenalina, noradrenalina -LuzUV Terapia de radiação

[00297] Um agente bioativo de acordo com a presente invenção é assim qualquer agente, produto químico ou composto que aumenta a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70; e inclui o próprio Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta e qualquer indutor ou co-indutor de Hsp70 conhecidos pela pessoa habilitada, por meio dos quais o dito agente bioativo é capaz de modular a atividade de uma enzima que interage com BMP.

[00298] Segue que um agente bioativo pode aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70 direta ou indiretamente.

[00299] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[00300] Em uma outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é um indutor ou co-indutor de Hsp70.

[00301] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta e um indutor ou co-indutor de Hsp70.

[00302] E um aspecto da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70, para o uso como um medicamento.

[00303] É um aspecto adicional da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70, para o uso no tratamento de um distúrbio de armazenagem lisossômica.

[00304] É um aspecto adicional da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70, para o uso como um medicamento ou para o uso no tratamento de um distúrbio de armazenagem lisossômica.

[00305] Em uma forma de realização, o dito tratamento pode ser profilático, curativo ou que tende à melhora. Em uma forma de realização particular, o dito tratamento é profilático. Em uma outra forma de realização, o dito tratamento é curativo. Em uma outra forma de realização, o dito tratamento é que tende à melhora.

[00306] Em uma forma de realização, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina.

[00307] Em uma forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Niemann-Pick tipo A ou B. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Farber. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Krabbe. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a Leucodistrofia metacromática. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a Sialidose. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Fabry. Já em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Gaucher. Já em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a deficiência de saposina.

[00308] Também é um aspecto da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70, para o uso no tratamento de um distúrbio de armazenagem lisossômica, em que o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é um, tal como dois, por exemplo três, tal como quatro, por exemplo cinco, tal como seis, por exemplo sete distúrbios selecionados do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina.

[00309] Segue que o agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser usado para o tratamento de um subconjunto dos distúrbios de armazenagem lisossômica selecionados do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina.

[00310] Em uma forma de realização particular, o agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser usado para o tratamento da doença de Niemann-Pick tipo A e B e doença de Farber.

[00311] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta e uma substância que aumenta a interação entre Hsp70 e BMP.

[00312] E ainda um aspecto adicional da presente invenção fornecer uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de armazenagem lisossômica.

Agente bioativo - Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta

[00313] A presente invenção em uma forma de realização diz respeito à modulação da atividade enzimática, em que a dita enzima interage com BMP, pelo uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[00314] É um aspecto da presente invenção fornecer Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para o uso como um medicamento.

[00315] É um aspecto adicional da presente invenção fornecer Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00316] É ainda um aspecto adicional da presente invenção fornecer o uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para a fabricação de um medicamento para tratar distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00317] Em uma forma de realização, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina.

[00318] É entendido que Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, de acordo com a presente invenção pode ser qualquer produto natural ou sintético e pode ser produzido por qualquer técnica convencional conhecida pela pessoa habilitada na técnica.

[00319] Em uma forma de realização, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, é purificado a partir de uma fonte natural. A dita fonte natural pode ser qualquer planta, animal ou bactérias que expressem, ou possam ser induzidos a expressar, Hsp70 em uma forma adequado para administrar a um indivíduo em necessidade deste.

[00320] Em uma forma de realização preferida entretanto, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, é fabricado sinteticamente. Segue que Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, em uma forma de realização preferida podem ser uma proteína recombinante fabricada pelas técnicas convencionais portanto e como tal é denotado rHsp70.

[00321] O Hsp70 de acordo com a presente invenção, sintético ou natural, pode ter uma sequência que seja derivada de qualquer espécie adequada de planta, animal ou bactérias. Em uma forma de realização, o dito rHsp70 é derivado de um mamífero. O dito mamífero pode ser selecionado do grupo que consiste de ser humano (Homo sapiens), camundongo (mus musculus), vaca, cão, rato, furão, porco, ovelha e macaco. Em uma outra forma de realização, o dito rHsp70 é derivado de bactérias.

[00322] O Hsp70 é caracterizado em parte por ter um grau muito alto de conservação de interespécies, permitindo assim possivelmente que o derivado de Hsp70 de uma espécie seja usado em uma outra espécie sem evocar uma resposta imune nociva.

[00323] Em uma forma de realização particular, a dita rHsp70 tem uma sequência derivada de Hsp70 humana.

[00324] Em uma forma de realização particular, a dita rHsp70 tem uma sequência derivada de mais do que uma espécie. A dita Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode assim em uma forma de realização ser uma quimera.

[00325] Uma proteína recombinante é uma proteína que é derivada de DNA recombinante. DNA recombinante é uma forma de DNA que não existe naturalmente, que é criada pela combinação de sequências de DNA que normalmente não ocorreriam juntas. Em termos de modificação genética, o DNA recombinante é introduzido através da adição de DNA relevante em um DNA de um organismo existente, tal como os plasmídeos de bactérias, para codificar quanto a traços diferentes para um propósito específico. Isto difere de recombinação genética, em que a mesma não ocorre através de processos dentro da célula, mas é engendrada pelo ser humano.

[00326] Em uma forma de realização, a Hsp70 de acordo com a presente invenção tem 100 % de homologia com a proteína de Hsp70 do tipo selvagem. Em uma outra forma de realização, a Hsp70 de acordo com a presente invenção tem menos do que 100 % de homologia com a proteína de Hsp70 do tipo selvagem, tal como entre 99,9 a 95 % de homologia, por exemplo 95 a 90 % de homologia, tal como 90 a 85 % de homologia, por exemplo 85 a 80 % de homologia, tal como 80 a 75 % de homologia, por exemplo 75 a 60 % de homologia com a proteína do tipo selvagem. Independente do grau de homologia, qualquer variante de Hsp70 que retenha a sua capacidade para modular a atividade enzimática de uma enzima que se figa a BMP é abrangida pela presente invenção.

[00327] Em uma forma de realização, o agente bioativo é Hsp70. Em uma forma de realização, a dita Hsp70 é Hsp70 de tamanho natural.

[00328] Também é um forma de realização fornecer um fragmento funcional ou variante de Hsp70. Como aqui definido, um fragmento funcional ou variante é qualquer fragmento de Hsp70 tendo a função desejada, que em termos da presente invenção é uma capacidade para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP.

[00329] Em uma forma de realização, o agente bioativo é um fragmento funcional ou variante de Hsp70.

[00330] Em uma forma de realização, o agente bioativo é um fragmento funcional ou variante de Hsp70, em que Hsp70 é modificado por deleção(ões), adição(ões) ou substituição(ões) da Hsp70 tipo selvagem.

[00331] A proteína Hsp70 tipo selvagem tem um comprimento total de 641 aminoácidos. Um fragmento de Hsp70 em uma forma de realização é intencionado a compreender qualquer fragmento com um comprimento total menor do que o da proteína do tipo selvagem de 641 aminoácidos, tal como menor do que 625 aminoácidos, por exemplo menor do que 600 aminoácidos, tal como menor do que 575 aminoácidos, por exemplo menor do que 550 aminoácidos, tal como menor do que 525 aminoácidos, por exemplo menor do que 500 aminoácidos, tal como menor do que 475 aminoácidos, por exemplo menor do que 450 aminoácidos, tal como menor do que 425 aminoácidos, por exemplo menor do que 400 aminoácidos, tal como menor do que 375 aminoácidos, por exemplo menor do que 350 aminoácidos, tal como menor do que 325 aminoácidos, por exemplo menor do que 300 aminoácidos, tal como menor do que 275 aminoácidos, por exemplo menor do que 250 aminoácidos, tal como menor do que 225 aminoácidos, por exemplo menor do que 200 aminoácidos, tal como menor do que 175 aminoácidos, por exemplo menor do que 150 aminoácidos, tal como menor do que 125 aminoácidos, por exemplo menor do que 100 aminoácidos, tal como menor do que 75 aminoácidos, por exemplo menor do que 50 aminoácidos, tal como menor do que 25 aminoácidos.

[00332] A proteína Hsp70 do tipo selvagem tem um comprimento total de 641 aminoácidos. Um fragmento de Hsp70 em uma forma de realização é intencionado a compreender qualquer fragmento com um comprimento total de mais do que 10 aminoácidos, tal como mais do que 25 aminoácidos, por exemplo mais do que 50 aminoácidos, tal como mais do que 75 aminoácidos, por exemplo mais do que 100 aminoácidos, tal como mais do que 125 aminoácidos, por exemplo mais do que 150 aminoácidos, tal como mais do que 175 aminoácidos, por exemplo mais do que 200 aminoácidos, tal como mais do que 225 aminoácidos, por exemplo mais do que 250 aminoácidos, tal como mais do que 275 aminoácidos, por exemplo mais do que 300 aminoácidos, tal como mais do que 325 aminoácidos, por exemplo mais do que 350 aminoácidos, tal como mais do que 375 aminoácidos, por exemplo mais do que 400 aminoácidos, tal como mais do que 425 aminoácidos, por exemplo mais do que 450 aminoácidos, tal como mais do que 475 aminoácidos, por exemplo mais do que 500 aminoácidos, tal como mais do que 525 aminoácidos, por exemplo mais do que 550 aminoácidos, tal como mais do que 575 aminoácidos, por exemplo mais do que 600 aminoácidos, tal como mais do que 625 aminoácidos.

[00333] Segue que o comprimento total do fragmento de Hsp70 de acordo com a presente invenção em uma forma de realização pode estar dentro da faixa de 5 a 25 aminoácidos, tal como 25 a 50 aminoácidos, por exemplo 50 a 75 aminoácidos, tal como 75 a 100 aminoácidos, por exemplo de 100 a 125 aminoácidos, tal como de 125 a 150 aminoácidos, por exemplo de 150 a 175 aminoácidos, tal como de 175 a 200 aminoácidos, por exemplo 200 a 225 aminoácidos, tal como 225 a 250 aminoácidos, por exemplo 250 a 275 aminoácidos, tal como 275 a 300 aminoácidos, por exemplo 300 a 325 aminoácidos, tal como 325 a 350 aminoácidos, por exemplo 350 a 375 aminoácidos, tal como 375 a 400 aminoácidos, por exemplo 400 a 425 aminoácidos, tal como 425 a 450 aminoácidos, por exemplo 450 a 475 aminoácidos, tal como 475 a 500 aminoácidos, por exemplo 500 a 525 aminoácidos, tal como 525 a 550 aminoácidos, por exemplo 550 a 575 aminoácidos, tal como 575 a 600 aminoácidos, por exemplo 600 a 625 aminoácidos, tal como 625 a 640 aminoácidos.

[00334] Em uma forma de realização particular, o fragmento ou variante de Hsp70 compreende todo ou parte do domínio de ATPase de Hsp70. Segue que o fragmento ou variante de Hsp70 de acordo com a presente invenção em uma forma de realização compreende todo ou parte dos números de aminoácidos de 30 a 382.

[00335] Em uma outra forma de realização particular, o fragmento ou variante de Hsp70 compreende triptofano na posição de aminoácido 90 do domínio de ATPase de Hsp70.

[00336] Um fragmento de Hsp70 pode ser uma versão truncada da proteína do tipo selvagem, significando que a mesma é uma versão mais curta. Um fragmento pode ser truncado pelo encurtamento da proteína a partir das extremidades de terminal amino ou do terminal carbóxi da proteína, ou pode ser truncado pela deleção de uma ou mais regiões internas de qualquer tamanho da proteína.

[00337] Um fragmento ou variante de Hsp70 pode em uma forma de realização ter 100 % de homologia com a proteína do tipo selvagem. Em uma outra forma de realização, o fragmento ou variante de Hsp70 também pode ser uma variante de Hsp70 que tem menos do que 100 % de homologia com a proteína do tipo selvagem, tal como entre 99,9 a 95 % de homologia, por exemplo de 95 a 90 % de homologia, tal como de 90 a 85 % de homologia, por exemplo de 85 a 80 % de homologia, tal como de 80 a 75 % de homologia, por exemplo de 75 a 60 % de homologia com a proteína do tipo selvagem.

[00338] Deve ser entendido que qualquer fragmento ou variante de Hsp70 que retenha a sua capacidade para modular a atividade da enzima lisossômica são abrangidos pela presente invenção.

[00339] Deve ser entendido que qualquer fragmento ou variante de Hsp70 que retenha a sua capacidade para interagir com BMP são abrangidos pela presente invenção.

[00340] É avaliado que o efeito quantitativo exato do fragmento funcional ou variante pode ser diferente do efeito da molécula de tamanho natural. Em alguns casos, o fragmento funcional ou variante podem de fato ser mais eficazes do que a molécula de tamanho natural. Além disso, o uso de fragmentos ao invés de moléculas de tamanho natural pode ser vantajoso em vista do tamanho menor dos fragmentos.

[00341] Em uma forma de realização, um fragmento funcional ou variante de Hsp70 podem ser uma variante de Hsp70 em que um ou mais aminoácidos foram substituídos. A(s) dita(s) substituição(ões) pode(m) ser uma substituição(ões) equivalente(s) ou conservativa(s), ou uma substituição(ões) não equivalente(s) ou não conservativa(s).

[00342] Em uma forma de realização, entre 0,1 a 1 % dos resíduos de aminoácido da Hsp70 tipo selvagem foi substituído, tal como entre 1 e 2 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 2 e 3 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 3 e 4 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 4 e 5 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 5 e 10 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 10 e 15 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 15 e 20 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 20 e 30 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 30 e 40 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 40 e 50 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 50 e 60 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 60 e 70 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 70 e 80 % dos resíduos de aminoácido, por exemplo entre 80 e 90 % dos resíduos de aminoácido, tal como entre 90 e 100 % dos resíduos de aminoácido.

[00343] Em uma forma de realização, entre 1 e 5 dos resíduos de aminoácido da Hsp70 tipo selvagem foram substituídos, tal como entre 5 e 10 resíduos de aminoácido, por exemplo entre 10 e 15 resíduos de aminoácido, tal como entre 15 e 20 resíduos de aminoácido, por exemplo entre 20 e 30 resíduos de aminoácido, tal como entre 30 e 40 resíduos de aminoácido, por exemplo entre 40 e 50 resíduos de aminoácido, tal como entre 50 e 75 resíduos de aminoácido, por exemplo entre 75 e 100 resíduos de aminoácido, tal como entre 100 e 150 resíduos de aminoácido, por exemplo entre 150 e 200 resíduos de aminoácido, tal como entre 200 e 300 resíduos de aminoácido, por exemplo entre 300 e 400 resíduos de aminoácido, tal como entre 400 e 500 resíduos de aminoácido.

[00344] Em uma forma de realização, o fragmento funcional ou variante de Hsp70 é uma proteína de fusão. Em uma forma de realização, o dito fragmento funcional ou variante de Hsp70 são fundidos a um rótulo.

[00345] Vantagens de usar Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta

[00346] Como debatido aqui acima, não existe nenhuma cura para as doenças de armazenagem lisossômica e o tratamento é principalmente sintomático, com a exceção do desenvolvimento das terapias de reposição de enzima (ERT) para a doença de Gaucher e doença de Fabry. Como mencionado, a ERT é uma forma muito cara de terapia que é eficaz apenas para um tipo de doença específico.

[00347] Para o conhecimento dos inventores, até agora nenhuma tentativa bem-sucedida foi feita para fornecer ERT para o resto das doenças de armazenagem lisossômica associadas com o acúmulo de lipídeo, assim uma necessidade não atingida principal para um tratamento eficaz e específico destas LSDs permanece presentemente.

[00348] A administração de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, a um indivíduo em necessidade desta tem várias vantagens comparadas com as modalidades de tratamento convencionais para os distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00349] Primeiro, produzir uma proteína recombinante, tal como rHsp70 ou um fragmento funcional ou variante deste, é com tecnologia moderna um modo simples e direto de produzir quantidades suficientes de rHsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. Técnicas convencionais para produzir enzimas recombinantes são bem conhecidas pela pessoa habilitada.

[00350] Além disso, produzir uma proteína recombinante, tal como rHsp70 um fragmento funcional ou variante desta, é um método barato para produzir quantidades suficientes de rHsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. Comparado com a produção de enzimas para ERT, o custo é drasticamente reduzido.

[00351] Também, o uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta pode ser usado para o tratamento de mais do que um distúrbio de armazenagem lisossômica específico. Isto também se aplica aos indutores e co-indutores de Hsp70 da presente invenção. De fato, o agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70 pode ser usado para o tratamento de qualquer doença de armazenagem lisossômica que possa ser revertida pela modulação da atividade enzimática da enzima defeituosa envolvida, em que a dita enzima interage com BMP.

[00352] Finalmente, como Hsp70 é uma molécula que ocorre endogenamente, isto é, uma molécula que se origina de dentro de um organismo, tecido, ou célula, deve ser esperado que nenhuma ou uma resposta imune muito limitada seja deflagrada pela administração de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. Esta é uma vantagem principal visto que ela facilita o tratamento e reduz efeitos colaterais potenciais quando administrada a um indivíduo.

[00353] Expressão Ectópica de Hsp70

[00354] Em uma forma de realização, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser expressada a partir de um vetor. A invenção assim em uma forma de realização diz respeito a um vetor que codifica Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[00355] Em uma forma de realização da presente invenção, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser administrada a um indivíduo em necessidade deste na forma de um vetor.

[00356] O vetor usado para expressar Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser selecionado do grupo que consiste de: vetores virais (retroviral e adenoviral) ou vetores não virais (plasmídeo, cosmídeo, bacteriofago).

[00357] Em uma forma de realização, o dito vetor compreende um ou mais de uma origem de replicação, um marcador para seleção e um ou mais sítios de reconhecimento para uma endonuclease de restrição. Em uma outra forma de realização, o dito vetor é operavelmente ligado às sequências reguladoras que controlam a transcrição da dita Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, em uma célula hospedeira adequada.

[00358] A presente invenção em uma forma de realização diz respeito a um método para produzir Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, como aqui descrita; o dito método compreendendo as etapas de fornecer um vetor que codifica a dita Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta e expressar o dito vetor in vitro, ou in vivo em um organismo hospedeiro adequado, produzindo deste modo a dita Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[00359] A invenção diz respeito ainda a uma célula hospedeira recombinante ou transgênica isolada que compreende um vetor que codifica Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, de acordo com a presente invenção.

[00360] A invenção também diz respeito a um método para gerar uma célula hospedeira recombinante ou transgênica, o dito método compreendendo as etapas de fornecer um vetor que codifica Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, introduzir o dito vetor na dita célula hospedeira recombinante ou transgênica e opcionalmente também expressar o dito vetor na dita célula hospedeira recombinante ou transgênica, gerando deste modo uma célula hospedeira recombinante ou transgênica que produza a dita Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[00361] Em uma outra forma de realização a presente invenção diz respeito a um organismo transgênico, mamífero que compreende a célula hospedeira descrita acima.

[00362] Em uma outra forma de realização, o organismo transgênico, mamífero que compreende a célula hospedeira recombinante ou transgênica de acordo com a presente invenção não é o ser humano.

[00363] A célula hospedeira transgênica pode ser selecionada do grupo que consiste de uma célula hospedeira de mamífero, planta, bacteriana, de levedura ou fúngica.

[00364] Para melhorar a liberação do DNA dentro da célula, o DNA deve ser protegido de dano e a sua entrada na célula deve ser facilitada. Lipoplexos e poliplexos, foram criados que têm a capacidade para proteger o DNA da degradação indesejada durante o processo de transfecção. O DNA plasmídico pode ser coberto com lipídeos em uma estrutura organizada como uma micela ou um lipossoma. Quando a estrutura organizada é complexada com DNA a mesma é chamada de um lipoplex. Existem três tipos de lipídeos que podem ser utilizados para formar lipossomas; aniônico (negativamente carregado), neutro, ou catiônico (positivamente carregado). Os complexos de polímeros com DNA são chamados poliplexos. A maior parte dos poliplexos consistem de polímeros catiônicos e a sua produção é regulada pelas interações iônicas.

[00365] Em uma forma de realização, o vetor que compreende Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser usado para a terapia de gene. A terapia de gene é a inserção de genes dentro de uma célula ou tecido do indivíduo para tratar uma doença, tal como uma doença hereditária em que um alelo mutante nocivo é substituído com um funcional.

[00366] Em uma outra forma de realização, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser administrada como DNA nu. Esta é a forma mais simples de transfecção não virai. A liberação de DNA nu pode ser realizada pelo uso de eletroporação, sonoporação, ou o uso de uma “pistola de gene”, que atira partículas de ouro revestidas com DNA dentro de uma célula usando gás em alta pressão.

Agente bioativo - indutores e co-indutores de de Hsp70

[00367] A presente invenção em uma forma de realização diz respeito à modulação da atividade enzimática, em que a dita enzima interage com BMP, pelo uso de indutores ou co-indutores de Hsp70.

[00368] Um indutor de Hsp70 é um composto que por si só pode amplificar a expressão de gene e a expressão de proteína de Hsp70 sem um estresse concomitante.

[00369] Um co-indutor de Hsp70 é um composto que não pode amplificar a expressão de gene e a expressão de proteína de Hsp70 sem um estresse concomitante (brando), mas o aumento induzido pelo estresse nos níveis de Hsp70 é ainda elevado ou intensificado pela sua presença.

[00370] É um aspecto da presente invenção fornecer um indutor ou co- indutor de Hsp70 para o uso como um medicamento.

[00371] É um aspecto adicional da presente invenção fornecer um indutor ou co-indutor de Hsp70 para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00372] É ainda um aspecto adicional da presente invenção fornecer o uso de um indutor ou co-indutor de Hsp70, para a fabricação de um medicamento para tratar distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00373] Em uma forma de realização, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina.

[00374] Em uma forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Niemann-Pick tipo A ou B. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Farber. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Krabbe. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a Leucodistrofia metacromática. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a Sialidose. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Fabry. Já em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Gaucher. Já em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a deficiência de saposina.

[00375] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é um indutor ou co-indutor de Hsp70. Em uma forma de realização particular, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é um indutor de Hsp70. Em uma outra forma de realização particular, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é um co-indutor de Hsp70.

[00376] Medicamentos de molécula pequena - derivados de hidroxilamina

[00377] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é um co-indutor de Hsp70. Em uma outra forma de realização, o dito co-indutor de Hsp70 é um medicamento de molécula pequena.

[00378] Em uma forma de realização particular, o co-indutor de Hsp70 de acordo com a presente invenção é um derivado de hidroxilamina. O dito derivado de hidroxilamina em uma outra forma de realização pode ser selecionado do grupo de Bimoclomol (BRLP-42), Arimoclomol (BRX220), BRX-345 e BGP-15.

[00379] Em uma forma de realização particular, o dito derivado de hidroxilamina é Arimoclomol (BRX-220).

[00380] O Bimoclomol (maleato de [2-hidróxi-3-(l-piperidinil) propóxi]-3-piridino-carboximidoíla-cloreto) é um composto não tóxico que foi originalmente desenvolvido para o tratamento de complicações diabéticas tais como neuropatias. O bimoclomol foi mostrado melhorar a sobrevivência de célula sob condições de estresse experimentais parcialmente pelo aumento das proteínas de choque térmico (HSPs) intracelulares, incluindo Hsp70, via uma ativação de HSF-1. Foi mostrado que o bimoclomol possui a capacidade de co-induzir Hsp70 na ausência de proteínas não dobradas e que o bimoclomol interage com e aumenta a fluidez de lipídeos de membrana negativamente carregados. BRX-345 é um análogo estrutural de bimoclomol com uma capacidade um tanto menor para induzir HSPs.

[00381] Arimoclomol (BRX-220) é um análogo de bimoclomol, que também interage com e amplifica a resposta de choque térmico. Arimoclomol está correntemente em testes clínicos para o tratamento de ALS (esclerose lateral amiotrófica); um distúrbio neurodegenerativo progressivo. Arimoclomol é propriedade da CytRx Corporation.

[00382] É assim um aspecto da presente invenção fornecer um co- indutor de Hsp70 derivado de hidroxilamina para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00383] É ainda um aspecto adicional da presente invenção fornecer o uso de um co-indutor de Hsp70 de derivado de hidroxilamina para a fabricação de um medicamento para tratar distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00384] Em uma forma de realização, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina. Fluidizadores de Membrana

[00385] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é um indutor de Hsp70. Em uma outra forma de realização, o dito indutor de Hsp70 é um fluidizador de membrana.

[00386] O tratamento com um fluidizador de membrana também pode ser chamado de terapia de lipídeo.

[00387] Em uma forma de realização particular, o indutor de Hsp70 de acordo com a presente invenção é um fluidizador de membrana selecionado do grupo de álcool benzílico, heptanol, AL721, Acido docosaexaenóico, álcoois alifáticos, álcool oleílico, dimetilaminoetanol, A2C, famesol e anestésicos tais como lidocaína, ropivacaína, bupivacaína e mepivacaína, assim como outros conhecidos pela pessoa habilitada.

[00388] Além da desnaturação de uma proporção de proteínas celulares durante o aquecimento (proteotoxicidade), uma mudança na fluidez das membranas também é proposta como sendo um termossensor celular que inicia a resposta de choque térmico e induz HSPs. De fato, perturbações de membrana quimicamente induzidas - análogas com a fluidização de membrana plasmática induzida pelo calor - são capazes de ativar HSP, sem causar a desnaturação da proteína.

[00389] A fluidez da membrana refere-se à viscosidade da bicamada lipídica de uma membrana celular. Os fosfolipídeos da membrana incorporam ácidos graxos de comprimento e saturação variáveis.

[00390] Os fluidizadores de membrana atuam pela intercalação entre lipídeos de membrana induzindo assim um efeito de desordem pelo enfraquecimento das interações de van der Vaals entre as cadeias de acila do lipídeo.

[00391] É assim um aspecto da presente invenção fornecer um fluidizador de membrana selecionado do grupo de álcool benzílico, heptanol, AL721, Ácido docosaexaenóico, álcoois alifáticos, álcool oleílico, dimetilaminoetanol, A2C, famesol e anestésicos tais como lidocaína, ropivacaína, bupivacaína e mepivacaína, assim como outros conhecidos pela pessoa habilitada, para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00392] É ainda um aspecto adicional da presente invenção fornecer o uso de um fluidizador de membrana selecionado do grupo de álcool benzílico, heptanol, AL721, ácido docosaexaenóico, álcoois alifáticos, álcool oleílico, dimetilaminoetanol, A2C, famesol e anestésicos tais como lidocaína, ropivacaína, bupivacaína e mepivacaína, assim como outros conhecidos pela pessoa habilitada, para a fabricação de um medicamento para tratar distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00393] Em uma forma de realização, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina. Outros meios para induzir Hsp70

[00394] Quaisquer meios para induzir a expressão de Hsp70 é considerado ser abrangido pela presente invenção, alguns dos quais são esboçados aqui abaixo.

[00395] Aumentar a temperatura de um indivíduo é um indutor potente de HSPs incluindo Hsp70 e como tal a terapia de calor sub-letal é um aspecto da presente invenção. Em uma forma de realização, a terapia de calor sub- letal compreende aumentar a temperatura de um indivíduo até uma temperatura de núcleo de cerca de 38 °C, tal como cerca de 39 °C, por exemplo cerca de 40 °C, tal como cerca de 41 °C, por exemplo cerca de 42 °C, tal como cerca de 43 °C.

[00396] É assim um aspecto da presente invenção fornecer terapia de calor sub-letal para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica.

[00397] O estresse psicológico tal como o medo predatório e choque elétrico pode evocar uma liberação de eHsp70 induzida pelo estresse, um processo que é sugerido ser dependente da sinalização da catecolamina. Além disso, a adrenalina e a noradrenalina podem evocar a liberação de Hsp70.

[00398] Os seguintes compostos foram mostrados induzir (ou co- induzir) HSPs, incluindo Hsp70: o composto interativo na membrana alquillisofosfolipídeo Edelfosina (ET-18- OCH3 ou l-octadecil-2-metil-rac- glicero-3-fosfocolina); medicamentos anti-inflamatória incluindo inibidores da ciclooxigenase 1/2 tal como celecoxib e rofecoxib, assim como NSAIDs tais como o ácido acetil-salicílico, salicilato de sódio e indometacina; prostaglandinas PGA1, PGj2 e 2-ciclopenteno-l-ona; agonistas gama do receptor ativado pelo proliferador da peroxidase; agentes anticâncer que interagem com tubulina incluindo vincristina e paclitaxel; o sensibilizador de insulina pioglitazona; agentes anti-neoplásticos tais como carboplatina, doxorrubicina, fhidarabina, ifosfamida e citarabina; os inibidores de Hsp90 geldanamicina, 17-AAG, 17-DMAG, radicicol, herbimicina-A e ácido araquidônico; inibidores de proteassoma MG132 e lactacistina; inibidores da serina protease DCIC, TLCK e TPCK; os medicamentos anti-úlcera geranilgeranilacetona (GGA), rebamipida, carbenoxolona e polaprezinco (zinco L-camosina); metais pesados (zinco e estanho); o medicamento anti- inflamatório dexametasona; cocaína; nicotina; álcool; agonistas alfa- adrenérgicos; prostanóides de ciclopentenona; assim como remédios herbáceos paeoniflorina, glicirrizina, celastrol, diidrocelastrol, diacetato de diidrocelastrol e curcumina.

[00399] É assim um aspecto da presente invenção fornecer um composto selecionado do grupo de Edelfosina (ET-18-OCH3 ou 1-octadecil- 2-metil-rac-glicero-3-fosfocolina), celecoxib, rofecoxib, ácido acetil- salicílico, salicilato de sódio, indometacina, PGA1, PGj2 2-ciclopenteno-l- ona, agonistas gama do receptor ativado pelo proliferador de peroxidase, vincristina, paclitaxel, pioglitazona, carboplatina, doxorrubicina, fludarabina, ifosfamida citarabina, geldanamicina, 17-AAG, 17-DMAG, radicicol, herbimicina-A, ácido araquidônico, MG132, lactacistina, DCIC, TLCK, TPCK, geranilgeranilacetona (GGA), rebamipida, carbenoxolona, polaprezinco (zinco L-camosina), dexametasona, cocaína, nicotina, álcool, agonistas alfa-adrenérgicos, prostanóides de ciclopentenona, paeoniflorina, glicirrizina, celastrol, diidrocelastrol, diacetato de diidrocelastrol e curcumina, assim como outros indutores de HSP conhecidos pela pessoa habilitada, para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica.

Composição farmacêutica de acordo com a presente invenção

[00400] A presente invenção diz respeito à modulação da atividade enzimática, em que a dita enzima interage com BMP, pelo uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade de Hsp70, beneficiando deste modo pacientes que sofrem de doenças de armazenagem lisossômica.

[00401] Embora seja possível para os agentes bioativos da presente invenção serem administrados como o produto químico bruto, é preferido apresentá-los na forma de uma formulação farmacêutica. Consequentemente, a presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica, para a aplicação medicinal, que compreende um agente bioativo da presente invenção ou sais deste farmaceuticamente aceitáveis, como aqui definidos e um carregador farmaceuticamente aceitável para estes.

[00402] E um aspecto da presente invenção fornecer uma composição, tal como uma composição farmacêutica, que compreende um agente bioativo aqui identificado que possa ser administrado a um indivíduo em necessidade deste.

[00403] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma composição que compreende um agente bioativo de acordo com a presente invenção. A composição como aqui divulgada em uma forma de realização pode ser formulada em combinação com um carregador fisiologicamente aceitável. A composição como aqui divulgada em uma forma de realização pode ser formulada em combinação com um carregador farmaceuticamente aceitável.

[00404] As composições farmacêuticas que contém um agente bioativo da presente invenção podem ser preparadas pelas técnicas convencionais, por exemplo, como descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edição, Easton, Pa.

[00405] Os agentes bioativos da presente invenção podem ser formulados para a administração parenteral e podem ser apresentados na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-enchidas, infusão de volume pequeno ou em recipientes de dose múltipla com um preservante adicionado. As composições pode tomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos, carregadores, diluentes, ou solventes oleosos ou aquosos incluindo soluções aquosas de sais minerais ou outras moléculas solúveis em água, propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, óleos animais, óleos sintéticos, ésteres orgânicos injetáveis e podem conter agentes de formulação tais como preservantes, umectantes, emulsificantes ou agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão, corantes, tampões, espessadores, agentes de solubilização e outros. Altemativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó, obtido pela isolação asséptica de sólido estéril ou pela liofilização de solução para constituição antes do uso com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, isenta de pirogênio.

[00406] Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos agentes bioativos, onde eles podem ser preparados, também são intencionados a ser abrangidos por esta invenção, como o são as formas de hidrato específicas de um sal. Estes sais serão aqueles que são aceitáveis na sua aplicação para um uso farmacêutico. Para isto é intencionado que o sal retenha a atividade biológica do composto precursor e o sal não terá efeitos desagradáveis ou deletérios na sua aplicação e uso no tratamento de doenças.

[00407] Os sais farmaceuticamente aceitáveis são preparados em uma maneira padrão. Se o composto precursor é uma base o mesmo é tratado com um excesso de ácido um orgânico ou inorgânico em um solvente adequado. Se o composto precursor é um ácido, o mesmo é tratado com uma base inorgânica ou orgânica em um solvente adequado.

[00408] Qualquer formulação do agente bioativo adequada de acordo com a presente invenção pode ser utilizada, conhecida pela pessoa habilitada.

[00409] Em uma forma de realização, a Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, é formulada em uma microesfera biodegradável, tal como um lipossoma.

Administração

[00410] Qualquer via adequada de administração pode ser utilizada para prover um mamífero, preferivelmente um ser humano, com uma quantidade eficaz de um agente bioativo de acordo com a presente invenção, em que o dito agente bioativo pode ser Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

[00411] A administração de agentes bioativos ou composições farmacêuticas a um indivíduo em necessidade deste pode ocorrer por intermédio das três vias principais de liberação: 1) Tópica (aplicada às superfícies corporais tais como a pele ou membranas mucósicas), 2) Enteral (por intermédio dos tratos gastrointestinal ou digestivo) e 3) Parenteral (vias outras que não os tratos gastrointestinal ou digestivo).

[00412] A administração tópica inclui a administração epicutânea (aplicação sobre a pele), inalacional, enema, gotas oculares (sobre a conjuntiva), gotas auriculares, via intranasal e vaginal.

[00413] A administração enteral é qualquer forma de administração que envolve qualquer parte do trato gastrointestinal e inclui a administração oral (pela boca por exemplo, tabletes, cápsulas ou gotas), administração intrarretal (por exemplo, supositório ou enema) além de pelo tubo de alimentação gástrica ou duodenal.

[00414] A liberação parenteral, tal como pela injeção ou infusão, são eficazes para liberar o agente bioativo a um sítio alvo ou para introduzir o medicamento na corrente sanguínea e inclui intravenosa (em uma veia), intraarterial (em uma artéria), intramuscular (em um músculo), intracardíaca (no coração), subcutânea (sob a pele), intraóssea (na medula óssea), intradérmica, (dentro da própria pele), intratecal ou intraespinhal (dentro do canal espinhal), intraperitoneal, (dentro do peritôneo), transdérmica (difusão através da pele intacta), transmucósica (difusão através de uma membrana mucósica, por exemplo, insuflação (inalação através do nariz), sublingual, bucal e supositórios vaginais), inalacional, epidural (no espaço epidural) e intravítrea (nos olhos). A administração sublingual (sob a língua) também é uma forma de administração parenteral, por meio da qual agentes bioativos difundem na corrente sanguínea através do tecido mucósico sob a lingua. O agente bioativo da presente invenção pode ser administrado por qualquer via parenteral de liberação e preferivelmente qualquer uma das acima.

[00415] A liberação parenteral tem a vantagem de evitar a degradação no trato gastrointestinal, quando associada com a liberação enteral.

[00416] A liberação parenteral tem a vantagem adicional de abolir o metabolismo de primeira passagem, quando associada com a liberação enteral, por que a mesma permite que os compostos sejam absorvidos diretamente na circulação sistêmica.

[00417] O metabolismo de primeira passagem é um fenômeno de metabolismo de medicamento por meio do qual a concentração de um medicamento é enormemente reduzida antes que o mesmo atinja a circulação sistêmica. É a fração de medicamento perdido durante o processo de absorção que é no geral relacionado com o fígado e a parede do intestino.

[00418] Depois que um medicamento é deglutido, o mesmo é absorvido pelo sistema digestivo e entra no sistema portal hepático. O mesmo é transportado através da veia porta para dentro do fígado antes que ele atinja o resto do corpo. O fígado metaboliza muitos medicamentos, algumas vezes a um tal grau que apenas uma pequena quantidade de medicamento ativo emerge do fígado para o resto do sistema circulatório. Esta primeira passagem através do fígado reduz assim enormemente a biodisponibilidade do medicamento.

[00419] Os quatro sistemas primários que afetam o efeito de primeira passagem de um medicamento são as enzimas do lúmen gastrointestinal, enzimas da parede do intestino, enzimas bacterianas e enzimas hepáticas.

[00420] As formas de dosagem apropriadas para tal administração podem ser preparadas pelas técnicas convencionais. As formas de dosagem apropriadas para a administração pela inalação, tais como uma formulação de aerossol ou um inalador de dose medida, podem ser preparadas pelas técnicas convencionais.

[00421] Em uma forma de realização, um modo particular de administração de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é pela administração parenteral.

[00422] Em uma forma de realização, um modo particular de administração parenteral de um agente bioativo da presente invenção é pela injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraarterial, subcutânea ou intraperitoneal.

[00423] Em uma forma de realização, um modo particular de administração parenteral de um agente bioativo da presente invenção é pela inalação.

[00424] Em uma forma de realização, um modo particular de administração parenteral de um agente bioativo da presente invenção é pela infusão intravenosa.

[00425] A infusão intravenosa de acordo com a presente invenção em uma forma de realização pode ocorrer em um período de tempo de 10 minutos a 20 minutos, tal como de 20 a 30 minutos, por exemplo de 30 a 40 minutos, tal como de 40 a 50 minutos, por exemplo de 50 a 60 minutos, tal como de 60 a 90 minutos, por exemplo de 90 a 120 minutos, tal como de 2 horas a 3 horas, por exemplo de 3 a 4 horas, tal como de 4 a 5 horas, por exemplo de 5 a 6 horas, tal como de 6 a 7 horas, por exemplo de 7 a 8 horas.

[00426] Em uma forma de realização particular, o modo de administração parenteral de um agente bioativo da presente invenção é pela liberação transmucósica. A dita liberação transmucósica é em uma forma de realização a liberação sublingual, em uma outra forma de realização a dita liberação transmucósica é a liberação bucal e ainda em uma outra forma de realização a dita liberação transmucósica é a insuflação ou liberação intranasal.

[00427] As formas de dosagem incluem tabletes, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, unguentos, emulsões, géis, loções, pastas, aerossóis, ou outras formas conhecidas na técnica.

[00428] A dosagem eficaz de ingrediente ativo utilizado pode variar dependendo da composição particular utilizada, do modo de administração, da condição que é tratada e da severidade da condição que é tratada. Tal dosagem pode ser averiguada facilmente por uma pessoa habilitada na técnica.

[00429] Em uma forma de realização, o agente bioativo da presente invenção é administrado em uma dosagem diária de cerca de 1 micrograma a cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal do animal, dada como uma dose diária única ou em doses divididas, ou na forma de liberação prolongada. O regime de dosagem pode ser ajustado dentro desta faixa ou mesmo fora desta faixa para fornecer a resposta terapêutica ideal.

[00430] Em uma forma de realização, o agente bioativo da presente invenção é administrado em uma dosagem de cerca de 1 pg a cerca de 10 pg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 10 pg a cerca de 50 pg por kg de peso corporal, por exemplo de cerca de 50 pg a cerca de 100 pg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 100 pg a cerca de 250 pg por kg de peso corporal, por exemplo de cerca de 250 pg a cerca de 500 pg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 500 pg a cerca de 750 pg por kg de peso corporal, por exemplo de cerca de 750 pg a cerca de 1000 pg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg por kg de peso corporal, por exemplo de cerca de 10 mg a cerca de 50 mg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 50 mg a cerca de 100 mg por kg de peso corporal.

[00431] A dita dosagem pode ser administrada em certos intervalos de tempo e pode ser expressada como mg por kg de peso corporal por unidade de tempo. A dita unidade de tempo em uma forma de realização pode ser por minuto, tal como por hora, por exemplo por dia, tal como por semana.

Tratamento de Combinação

[00432] É um aspecto da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70 para o uso no tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica, em combinação com outras modalidades de tratamento.

[00433] A presente invenção em um aspecto diz respeito a um método de tratamento de uma doença de armazenagem lisossômica que compreende a administração do agente bioativo de acordo com qualquer da presente invenção em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento.

[00434] Assim, em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento, tal como modalidades de tratamento convencionais ou conhecidas para LSDs.

[00435] É entendido que o agente bioativo de acordo com a presente invenção é Hsp70 ou um fragmento funcional ou variante deste, ou um indutor ou co-indutor de Hsp70.

[00436] Administrar mais do que uma modalidade de tratamento em combinação pode ocorrer simultânea, ou sequencialmente. A administração simultânea pode ser dois compostos compreendidos na mesma composição ou compreendidos em composições separadas, ou pode ser uma composição e uma outra modalidade de tratamento realizada essencialmente ao mesmo tempo. A administração sequencial significa que a mais do que uma modalidade de tratamento é administrada em pontos de tempo diferentes, tais como administrando uma modalidade de tratamento primeiro e administrando a segunda modalidade de tratamento subsequentemente. O intervalo de tempo para administrar mais do que uma modalidade de tratamento sequencialmente pode ser determinado por uma pessoa habilitada na técnica para obter o efeito ideal e em uma forma de realização pode estar entre 30 minutos a 72 horas.

[00437] As modalidades de tratamento na forma de compostos químicos podem ser administradas juntas ou separadamente, cada uma na sua dosagem mais eficaz. A administração de mais do que um composto pode ter um efeito sinergístico, reduzindo assim eficazmente a dosagem requerida de cada medicamento.

[00438] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com a terapia de reposição de enzima (ERT). A dita ERT em uma forma de realização pode ser selecionada do grupo que consiste de Cerezyme® (imiglucerase para injeção), Miglustat, Fabrazyme® (agalsidase beta) e Replagal (Agalsidase alfa).

[00439] Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com doença de Gaucher em combinação com Cerezyme® (imiglucerase para injeção) ou Miglustat.

[00440] Em uma outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com doença de Fabry em combinação com Fabrazyme® (agalsidase beta) ou Replagal (Agalsidase alfa).

[00441] Em uma outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com aliviadores de dor.

[00442] Já em uma outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com corticosteróides.

[00443] O agente bioativo de acordo com a presente invenção em uma forma de realização pode ser administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com um transplante, tal como transplante de medula óssea, transplante de sangue de cordão ou transplantação de célula tronco.

[00444] O agente bioativo de acordo com a presente invenção em uma outra forma de realização pode ser administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com terapia de redução de substrato.

[00445] Em uma outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo em necessidade deste em combinação com terapia sintomática e sustentativa, tal como terapia física. Hsp70 aumenta a captação de compostos

[00446] Os presentes inventores mostraram ainda que Hsp70 aumenta a captação endocítica de outras moléculas (figura 16). Esta captação aumentada pode ocorrer independentemente na Hsp70 devido a um mecanismo passivo que permite que um composto seja mais facilmente absorvido pela célula na presença de Hsp70, ou a mesma pode ocorrer dependentemente da Hsp70 devido a uma associação direta com Hsp70.

[00447] A capacidade de Hsp70 para aumentar a captação celular de compostos é uma vantagem em que a mesma permite que a Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, administrada às células seja facilmente absorvida pela célula.

[00448] Além disso, a capacidade de Hsp70 para aumentar a captação celular de compostos é uma vantagem em regimes de tratamento de combinação, visto que a presença de Hsp70 pode aumentar a captação tanto de Hsp70 quanto do composto dado em combinação com Hsp70.

[00449] A respeito da terapia de combinação em que um composto é uma enzima para ERT e o outro é Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, isto pode ajudar eficazmente a reduzir a quantidade de enzima para ERT necessária para se obter uma dose intracelular eficaz. Isto é relevante visto que a ERT é muito cara.

[00450] Na situação em que o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta e um indutor ou co-indutor de Hsp70, a presença de Hsp70 pode portanto aumentar a captação do dito indutor ou co-indutor de Hsp70.

Método para modular a atividade enzimática de uma enzima

[00451] A presente invenção em um aspecto diz respeito à modulação da atividade enzimática. A dita enzima pode ser uma enzima envolvida no catabolismo de substâncias lisossômicas. E a dita modulação pode derivar de uma interação entre Hsp70 e BMP.

[00452] Os presentes inventores têm assim descrito uma interação entre Hsp70 e BMP, em que Hsp70 interage com ou se liga ao BMP com uma certa afinidade. Por uma molécula tendo uma “afinidade” para a molécula X é aqui intencionado que uma molécula com afinidade para a molécula X ligar- se-á à molécula X em uma certa quantidade detectável sob certas condições mas não se ligará (opcionalmente de modo detectável) a outras moléculas diferentes (para as quais o mesmo não tem afinidade) no mesmo grau sob condições idênticas. Uma medida para descrever uma afinidade da molécula a uma outra molécula é uma constante de dissociação, Kd. Quanto menor o Kd, mais forte a afinidade. As constantes de dissociação podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica, tais como a análise de ressonância de plasma de superfície. Aqui, é preferido que uma molécula com “afinidade” para uma outra molécula X tenha um Kd para a dita molécula X que seja menor do que 100 mM, tal como menor do que 10 mM, por exemplo menor do que 5 mM, tal como menor do que 1 mM, por exemplo menor do que 0,1 mM, tal como menor do que 0,01 mM, por exemplo menor do que 1 pM , tal como menor do que 100 nM, por exemplo menor do que 10 nM, tal como menor do que 1 nM, por exemplo menor do que 100 pM, tal como menor do que 10 pM, por exemplo menor do que 1 pM. Além disso, é aqui preferido que uma molécula que “não têm uma afinidade” com a molécula X tem uma constante de dissociação, Kd com respeito à ligação com a molécula X que é pelo menos 10 vezes maior, tal como pelo menos 20 vezes maior, por exemplo pelo menos 30 vezes maior, tal como pelo menos 40 vezes maior, por exemplo pelo menos 50 vezes maior, tal como pelo menos 60 vezes maior, por exemplo pelo menos 70 vezes maior, tal como pelo menos 80 vezes maior, por exemplo pelo menos 90 vezes maior, tal como pelo menos 100 vezes maior, do que a Kd da ligação (com a molécula X) de uma molécula que não tem afinidade com a molécula X. Mais preferivelmente, existe pelo menos uma diferença de dez vezes na Kd entre estas moléculas consideradas ter uma afinidade e aquelas julgadas não ter uma afinidade com uma molécula X.

[00453] É um aspecto da presente invenção fornecer um método para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP (bis(monoacilglicero)fosfato), o dito método compreendendo as etapas de administrar um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou atividade intracelulares de Hsp70, e permitir a interação entre BMP e Hsp70, e modular a atividade enzimática de uma enzima que interage com BMP.

[00454] A dita interação em uma forma de realização pode ser direta, ou a dita interação em uma outra forma de realização pode ser indireta.

[00455] Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP (bis(monoacilglicero)fosfato), o dito método compreendendo as etapas de administrar o agente bioativo de acordo com a presente invenção, permitir a interação entre BMP e Hsp70, e modular a atividade enzimática de uma enzima que interage com BMP.

[00456] Em uma forma de realização, a dita Hsp70 forma um complexo covalente ou não covalente com BMP.

[00457] Em uma forma de realização, o dito BMP interage com uma saposina. Em uma outra forma de realização, a dita saposina pode ser selecionada do grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C e saposina D.

[00458] Em uma outra forma de realização, a dita enzima é selecionada do grupo que consiste de esfingomielinase, esfingomielinase ácida (aSMase), ceremidase ácida, betagalactosilceremidase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, glicosilceremidase, sialidase e aril sulfatase.

[00459] Em uma forma de realização particular, a modulação da atividade enzimática é um aumento na atividade enzimática.

[00460] Em uma forma de realização, o dito aumento na atividade enzimática é um aumento na faixa de 1 a 5 %, tal como na faixa de 5 a 10 %, por exemplo na faixa de 10 a 15 %, tal como na faixa de 15 a 20 %, por exemplo na faixa de 20 a 25 %, tal como na faixa de 25 a 30 %, por exemplo na faixa de 30 a 35 %, tal como na faixa de 35 a 40 %, por exemplo na faixa de 40 a 45 %, tal como na faixa de 45 a 50 %, por exemplo na faixa de 50 a 60 %, tal como na faixa de 60 a 70 %, por exemplo na faixa de 70 a 80 %, tal como na faixa de 80 a 90 %, por exemplo na faixa de 90 a 100 %, tal como na faixa de 100 a 120 %, por exemplo na faixa de 120 a 140 %, tal como na faixa de 140 a 160 %, por exemplo na faixa de 160 a 180 %, tal como na faixa de 180 a 200 %, por exemplo na faixa de 200 a 250 %, tal como na faixa de 250 a 300 %, por exemplo na faixa de 300 a 400 %, tal como na faixa de 400 a 500 %, por exemplo na faixa de 500 a 750 %, tal como na faixa de 750 a 1000 %, por exemplo na faixa de 1000 a 1500 %, tal como na faixa de 1500 a 2000 %, por exemplo na faixa de 2000 a 5000 %.

[00461] A presente invenção em um outro aspecto diz respeito a um método para identificar parceiros de ligação para o complexo de Hsp70-BMP, o dito método compreendendo as etapas de extrair o dito complexo de Hsp70- BMP e isolar os ditos parceiros de ligação. Em uma forma de realização, o dito parceiro de ligação é um agonista. Em uma outra forma de realização, o dito parceiro de ligação é um antagonista.

[00462] A presente invenção em um outro aspecto diz respeito a um complexo de Hsp70-BMP e seu uso para um medicamento, tal como para o tratamento de uma doença de armazenagem lisossômica.

[00463] Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um anticorpo que especificamente reconhece o complexo de Hsp70-BMP.

Método de tratamento

[00464] A presente invenção em um aspecto diz respeito a um método para tratar um indivíduo em necessidade deste.

[00465] É assim um aspecto da presente invenção fornecer um método para o tratamento de uma doença de armazenagem lisossômica que compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade deste.

[00466] Segue, que em uma forma de realização o dito tratamento pode ser profilático, curativo ou que tende à melhora. Em uma forma de realização particular, o dito tratamento é profilático. Em uma outra forma de realização, o dito tratamento é curativo. Em uma outra forma de realização, o dito tratamento é que tende à melhora.

[00467] O agente bioativo usado de acordo com a presente invenção em uma forma de realização pode ser formulado como uma composição farmacêutica.

[00468] Em uma forma de realização, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste de doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência de saposina.

[00469] Em uma forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Niemann-Pick tipo A ou B. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Farber. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Krabbe. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a Leucodistrofia metacromática. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a Sialidose. Em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Fabry. Já em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a doença de Gaucher. Já em uma outra forma de realização particular, o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é a deficiência de saposina.

[00470] Em uma forma de realização, a dita doença lisossômica é caracterizada por um acúmulo intracelular aumentado de um esfingolipídeo.

[00471] Em uma forma de realização, o dito tratamento reduz o acúmulo intracelular de substâncias em um indivíduo em necessidade deste. A dita substância pode ser uma substância que é normalmente degradada nos lisossomas. Em uma forma de realização, a dita substância é um esfingolipídeo.

[00472] Em uma forma de realização, o tratamento de acordo com a presente invenção reduz o acúmulo intracelular de uma substância lisossomicamente degradável tal como um esfingolipídeo a menos do que 100 % da quantidade acumulada, tal que menos do que 90 % da quantidade acumulada, por exemplo menos do que 80 % da quantidade acumulada, tal que menos do que 70 % da quantidade acumulada, por exemplo menos do que 60 % da quantidade acumulada, tal que menos do que 50 % da quantidade acumulada, por exemplo menos do que 40 % da quantidade acumulada, tal que menos do que 30 % da quantidade acumulada, por exemplo menos do que 20 % da quantidade acumulada, tal que menos do que 10 % da quantidade acumulada, por exemplo menos do que 5 % da quantidade acumulada.

[00473] Em uma forma de realização, o tratamento de acordo com a presente invenção reduz o acúmulo intracelular de um esfingolipídeo em pelo menos 5 %, tal como pelo menos 10 %, por exemplo pelo menos 15 %, tal como pelo menos 20 %, por exemplo pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 %, por exemplo pelo menos 35 %, tal como pelo menos 40 %, por exemplo pelo menos 45 %, tal como pelo menos 50 %, por exemplo pelo menos 55 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 65 %, tal como pelo menos 70 %, por exemplo pelo menos 75 %, tal como pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, tal como pelo menos 90 %, por exemplo pelo menos 95 %, tal como pelo menos 100 %.

[00474] Em uma forma de realização, o dito esfingolipídeo acumulado é selecionado do grupo que consiste de esfingomielina, ceramida, galactosilceramida, globotriaosilceramida, glicosilceramida, GM3 e sulfatide.

[00475] A taxa de reduzir a concentração intracelular de uma substância lisossomicamente degradável tal como um esfingolipídeo pode depender de fatores tais como a forma de administração, regimes de dosagem e outros.

[00476] Em uma forma de realização, o dito tratamento prolonga a expectativa de vida do dito indivíduo em necessidade deste.

[00477] Segue, que a expectativa de vida em uma forma de realização pode ser aumentada entre 6 meses a 1 ano, tal como de 1 ano a 2 anos, por exemplo de 2 a 3 anos, tal como de 3 a 4 anos, por exemplo de 4 a 5 anos, tal como de 5 a 6 anos, por exemplo de 6 a 7 anos, tai como de 7 a 8 anos, por exemplo de 8 a 9 anos, tai como de 9 a 10 anos, por exemplo de 10 a 12 anos, tai como de 12 a 14 anos, por exemplo de 14 a 16 anos, tai como de 16 a 18 anos, por exemplo de 18 a 20 anos, tai como de 20 a 25 anos, por exemplo de 25 a 30 anos, tai como de 30 a 40 anos, por exemplo de 40 a 50 anos, tai como de 50 a 60 anos, por exemplo de 60 a 70 anos, tai como de 70 a 80 anos, por exemplo de 80 a 90 anos, tai como de 90 a 100 anos.

[00478] Em uma forma de realização a expectativa de vida é aumentada em pelo menos 6 meses, tal como pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo 3 anos, tal como pelo menos 4 anos, por exemplo 5 anos, tal como pelo menos 6 anos, por exemplo 7 anos, tal como pelo menos 8 anos, por exemplo 9 anos, tal como pelo menos 10 anos, por exemplo de 12 anos, tal como pelo menos 14 anos, por exemplo de 16 anos, tal como pelo menos 18 anos, por exemplo 20 anos, tal como pelo menos 25 anos, por exemplo 30 anos, tal como pelo menos 40 anos, por exemplo 50 anos, tal como pelo menos 60 anos, por exemplo 70 anos, tal como pelo menos 80 anos, por exemplo 90 anos, tal como pelo menos 100 anos.

[00479] Também é um aspecto da presente invenção fornecer um método para prolongar a expectativa de vida em um paciente com uma doença de armazenagem lisossômica, em que o dito método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade deste.

[00480] Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para prolongar a expectativa de vida em um paciente com uma doença de armazenagem lisossômica, em que o dito método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade deste, em que a dita expectativa de vida é aumentada entre 6 meses a 1 ano, tal como de 1 ano a 2 anos, por exemplo de 2 a 3 anos, tal como de 3 a 4 anos, por exemplo de 4 a 5 anos, tal como de 5 a 6 anos, por exemplo de 6 a 7 anos, tal como de 7 a 8 anos, por exemplo de 8 a 9 anos, tal como de 9 a 10 anos, por exemplo de 10 a 12 anos, tal como de 12 a 14 anos, por exemplo de 14 a 16 anos, tal como de 16 a 18 anos, por exemplo de 18 a 20 anos, tal como de 20 a 25 anos, por exemplo de 25 a 30 anos, tal como de 30 a 40 anos, por exemplo de 40 a 50 anos, tal como de 50 a 60 anos, por exemplo de 60 a 70 anos, tal como de 70 a 80 anos, por exemplo de 80 a 90 anos, tal como de 90 a 100 anos.

[00481] Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para prolongar a expectativa de vida em um paciente com uma doença de armazenagem lisossômica, em que o dito método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade deste, em que a dita expectativa de vida é aumentada em pelo menos 6 meses, tal como pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo 3 anos, tal como pelo menos 4 anos, por exemplo 5 anos, tal como pelo menos 6 anos, por exemplo 7 anos, tal como pelo menos 8 anos, por exemplo 9 anos, tal como pelo menos 10 anos, por exemplo de 12 anos, tal como pelo menos 14 anos, por exemplo de 16 anos, tal como pelo menos 18 anos, por exemplo 20 anos, tal como pelo menos 25 anos, por exemplo 30 anos, tal como pelo menos 40 anos, por exemplo 50 anos, tal como pelo menos 60 anos, por exemplo 70 anos, tal como pelo menos 80 anos, por exemplo 90 anos, tal como pelo menos 100 anos. Exemplos Exemplo 1: A interação entre Hsp70 e bis(monoacilglicero) fosfato estabiliza lisossomas e promove a sobrevivência de célula

Abstrato

[00482] A permeabilização da membrana lisossômica é uma marca evolucinariamente conservada de morte celular induzida pelo estresse. Aqui os inventores mostram que a proteína de choque térmico 70 (Hsp70) indutível pelo estresse principal realça a sobrevivência de célula pela estabilização de lisossomas através de uma ligação de alta afinidade dependente de pH a um fosfolipídeo aniônico endo-lisossômico bis(monoacilglicero)fosfato (BMP; também aludido como ácido lisobisfosfatídico). O domínio de ATPase positivamente carregado de Hsp70 é responsável pela ligação mas o domínio de ligação de substrato também é requerido para a estabilização eficaz de lisossomas. De maneira importante, o efeito citoprotetor pode ser obtido pela liberação endocítica de Hsp70 recombinante e especificamente revertido pela administração extra celular de anticorpos de BMP ou inibidores de Hsp70. Assim, esta interação de proteína-lipídeo abre possibilidades excitantes para o desenvolvimento de terapias específicas de lisossoma citoprotetor e citotóxicas para o tratamento de doenças degenerativas e câncer, respectivamente.

Introdução

[00483] Os lisossomas são organelas citossólicas altamente dinâmicas que recebem a entrada do tráfego de membrana dos caminhos biossintéticos (rede trans-Golgi), endocíticos, fagocíticos e autofágicos. Eles contêm mais de 50 hidrolases ácidas que podem processar todas as macromoléculas principais da célula para decompor produtos disponíveis para a reutilização metabólica. Além disso para as suas funções de administração interna catabólicas, as proteases lisossômica, as catepsinas, foram recentemente identificadas como efetores importantes nos programas de morte celular evolucionariamente conservada induzida por exemplo pelos receptores de morte da família do receptor do fator de necrose de tumor, hipoxia, estresse oxidativo, estresse osmótico, calor e medicamentos anticâncer. A morte celular dependente da Catepsina é caracterizada por uma permeabilização da membrana lisossômica inicial e a translocação subsequente de catepsinas para dentro do citossol, onde elas podem iniciar os caminhos de morte celular tanto dependentes quanto independentes de caspase. Assim, a integridade da membrana lisossômica emerge como um regulador importante da sobrevivência de célula durante várias condições de estresse. Considerando que os inibidores da protease de cisteína citossólica foram relatados conferir proteção contra o dano celular induzido pela catepsina tanto em células de mamífero assim como no nematóide Caenorhabditis elegans, os mecanismos pelos quais as células regulam a estabilidade da membrana lisossômica permaneceram predominantemente obscuros. Evidência indireta recente sugere, entretanto, que o efeito citoprotetor potente da Hsp70 indutível pelo estresse principal é devido à estabilização da membrana lisossômica. O esgotamento de Hsp70 deflagra uma permeabilização inicial das membranas lisossômicas e morte celular mediada pela catepsina em células cancerosas e a Hsp70 exógena eficazmente inibe a desestabilização lisossômica induzida por vários estresses. Além disso, camundongos deficientes quanto a Hsp70 sofrem de pancreatite causada pelo vazamento de proteases lisossômica no citossol.

[00484] O mecanismo molecular que forma a base do potencial de proteção de lisossoma da Hsp70 tem permanecido indefinível, mas pistas para este mecanismo de ação pode residir na translocação associada com estresse e câncer de uma pequena porção de Hsp70 para o compartimento endo- lisossômico. O objetivo maior deste estudo foi definir se a localização lisossômica, de fato, é crucial para o efeito citoprotetor de Hsp70. Extraordinariamente, os dados aqui apresentados demonstram que a Hsp70 se liga com alta afinidade a um lipídeo específico de lisossoma BMP e que esta interação de proteína-lipídeo estabiliza lisossomas. De maneira importante este novo mecanismo citoprotetor pode ser explorado pela administração extracelular do próprio Hsp70 citoprotetor ou compostos que interferem com a ligação de Hsp70-BMP ou função de Hsp70 especificamente no compartimento lisossômico.

Resultados e debate

[00485] De modo a testar se a localização lisossômica é crucial para o efeito citoprotetor de Hsp70, os presentes inventores produziram Hsp70 recombinant (rHsp70) e tiraram vantagem do mecanismo endocítico das células para alvejar rHsp70 no lúmen lisossômico. A análise imunocitoquímica de células de osteossarcoma U-2-OS incubada com rHsp70 rotulada com Alexa Fluor 488 revelou uma co-localização clara da rHsp70 submetida à endocitose com proteínas marcadoras endossômicas e lisossômica tardias (proteínas de membrana associadas a lisossoma 1 e 2 e proteína de membrana integral lisossômica 1 (LIMP-1)) e um lipídeo específico de endo-lisossoma (BMP), considerando que nenhuma co- localização foi observada com marcadores para o retículo endoplasmático (retículo endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA)), complexo de Golgi (golgin-97) ou mitocondria (citocromo c (cyt c)). A localização lisossômica também foi observada nas células vivas, onde a rHsp70 submetida à endocitose co-localizada com Lysotracker® Red mas não com Mitotracker® Red. De modo a determinar a quantidade de Hsp70 submetida à endocitose o sinal fluorescente das células carregadas com rHsp70* foi quantificado, que revelou que uma média de 70 ng de rHsp70* é absorvida pr. l*105 células. Para determinar se rHsp70* submetido à endocitose foi meramente localizado no lúmen ou se a mesma teria uma ligação direta às membranas endo- lisossômicas, asd células U-2-OS carregadas com rHsp70* foram sub- fracionadas e a quantidade de rHsp70* presente na fração de membrana leve (LMF) medida (organelas celulares incluindo endossomas iniciais e tardios e lisossomas). A fratura congelada das organelas na LMF via ciclos de congelamento/descongelamento repetidos em nitrogênio líquido, resultou na liberação total de Catepsina B no sobrenadante, considerando que a proteína de membrana lisossômica LAMP-2 foi retida na fração de membrana pelotizada, fraturada. A quantificação da rHsp70* submetido à endocitose revelou que aprox. 1/3 da rHsp70* permaneceu na pelota, sugerindo fortemente que a mesma estava ligada às membranas endo-lisossômicas. De modo a avaliar se a rHsp70 submetido à endocitose pode estabilizar as membranas lisossômicas, as células foram carregadas com laranja de acridina, uma base metacromática fraca que se acumula no compartimento ácido das células, isto é, endossomas e lisossomas tardios e os sensibiliza à foto- oxidação na exposição à luz azul (Brunk et al., 1997; Nilandsted et al., 2004). A foto-oxidação resulta na perda do gradiente do pH lisossômico e vazamento de laranja de acridina para o citossol. Isto pode ser facilmente visualizado e quantificado visto que o laranja de acridina exibe fluorescência vermelha quando concentrado no compartimento ácido da célula e fluorescência verde quando em uma concentração mais baixa no citossol. Extraordinariamente, a rHsp70 submetida à endocitose protegeu os lisossomas contra a foto-oxidação induzida pela luz azul, considerando que nenhuma proteção foi observada em células carregadas com Hsc70 recombinante e Hsp70-2, que compartilham 86 % e 84 % de homologia de sequência de aminoácido com Hsp70, respectivamente. Além disso, um RNA interferente curto (siRNA) específico para Hsp70 sensibilizou lisossomas de células U-2-OS à foto-oxidação e este efeito foi totalmente revertido submetendo-se rHsp70 à endocitose apropriadamente demonstrando que o efeito de proteção de Hsp70 endógeno é mediado pela fração pequena da proteína localizada no lúmen lisossômico de preferência depois que a reunião grande reside no citossol. O acima demonstrou a captação endocítica eficaz de Hsp70 e a estabilização lisossômica pode explicar os efeitos neurode proteçãos surpreendentes recentemente relatados de Hsp70 extra celular administrada aos sítios de lesão a seguir de uma variedade de tratamentos conhecidos por deflagrar o caminho da morte celular lisossômica, isto é, dano luminoso retinal e axotomia de nervo ciático.

[00486] De modo a testar se o efeito de proteção de Hsp70 pode ser uma consequência de uma associação direta de Hsp70 com as membranas lisossômicas, os inventores investigaram a sua interação com vesículas unilamelares grandes (LUVs) de palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) que contém uma variedade de lipídeos aniônicos associados com a membrana, isto é, palmitoil-oleoil-fosfatidilserina (POPS; primariamente no folíolo interno da membrana plasmática), cardiolipina (primariamente mitocondrial) e BMP (primariamente em endossomas e lisossomas tardios). Levando-se em conta o meio ácido aumentado do compartimento endolisossômico na maturação para lisossomas, as interações de proteína-lipídeo em condições neutras (pH 7,4) e ácidas (pH 6,0) foram comparadas. No pH 7,4, rHsp70 causou uma pequena mudança relativa na dispersão da luz a 90° em lipossomas POPC indicando uma ligação muito fraca à bicamada de POPC. Como relatado mais no princípio para POPS, todos os lipídeos negativamente carregados intensificaram a ligação de rHsp70 para os lipossomas em pH neutro. Este realce foi de aproximadamente 4 vezes independente do lipídeo negativo ou da densidade de carga na superfície do lipossoma (POPS tem uma carga líquida de -1 e a cardiolipina e BMP têm uma carga líquida de -2). Extraordinariamente, a diminuição do pH de 7,4 para 6,0 dramaticamente mudou o perfil de associação do lipídeo de rHsp70. Considerando que a ligação ao POPS foi apenas levemente aumentada na acidificação, a ligação ao BMP foi quase 20 vezes mais forte no pH ácido quando comparado ao pH neutro. A ligação de alta afinidade, dependente de pH de Hsp70 ao BMP foi confirmada em um conjunto independente de experimentos BIAcore.

[00487] De modo a testar se a interação de alta afinidade dependente do pH entre Hsp70 e BMP observada in vitro foi requerida para a estabilização mediada por Hsp70 de lisossomas em células vivas, os inventores alvejaram o BMP celular carregando-se o compartimento endolisossômico de células U-2-OS com anticorpos BMP como demonstrado mais no princípio (Kobayashi et al., 1998). Extraordinariamente, os anticorpos BMP eficazmente inibiram a capacidade de rHsp70 para conferir proteção contra o vazamento lisossômico induzido pela fotooxidação. De maneira ainda mais importante, os anticorpos BMP significantemente sensibilizaram as células de osteossarcoma U-2-OS à cisplatina, que induz uma permeabilização da membrana lisossômica inicial em células U-2-OS assim como outras linhagens de célula sensíveis à cisplatina usadas neste estudo. Consequentemente, também as células de carcinoma da próstata PC-3 e DU-145 foram significantemente sensibilizadas para a morte celular induzida por cisplatina no tratamento com anticorpos anti-BMP.

[00488] Tendo confirmado que a interação Hsp70 lisossômica - BMP é essencial para o efeito citoprotetor de Hsp70, os inventores em seguida investigaram que parte da proteína de Hsp70 é responsável pela ligação de lipídeo. Para determinar isto, a mudança de fluorescência dos triptofanos (W90 e W580) na ancoragem de rHsp70 nos lipossomas que contém BMP no pH 6,0 foi medida. Os inventores produziram proteínas mutantes em rHsp70 com deleções dos dois domínios funcionais principais da proteína, isto é, o domínio de ATPase de terminal amino (rHsp70-ΔATP; deleção de aminoácidos 119-426) e o domínio de ligação de peptídeo do terminal carbóxi (rHsp70-ΔPBD; deleção dos aminoácidos 437-617). A perda de sinal na intensidade de fluorescência de pico relativo para Hsp70-AATP indicou que o domínio de ATPase é requerido para a ligação de alta afinidade de Hsp70 à bicamada de POPC/BMP. Em seguida, os dois triptofanos em Hsp70 foram substituídos com fenilalaninas (W90F e W580F) de modo a estudar que o triptofano é responsável pela ligação de lipídeo e mudança na fluorescência. A redução do sinal com rHsp70-W90F que carece do triptofano no domínio de ATPase (rHsp70-W90F) e o sinal imutável com rHsp70-W580F que carece do triptofano no domínio de ligação de peptídeo indicou que o triptofano na posição 90 ancorou na camada de lipídeo. Visto que o método usado acima apenas mediu a mudança relativa na fluorescência no embutimento de triptofano no ambiente lipofílico, os inventores também analisaram a associação do lipídeo de rHsp70 e seus mutantes em uma maneira mais quantitativa utilizando um sistema BIAcore 2000 com LUVs contendo BMP imobilizado na superfície de um chip sensor LI no pH 4,5- Tanto rHsp70 quanto rHsp70-APBD mostraram uma interação forte com BMP, considerando que a ligação de rHsp70-AATP foi acentuadamente reduzida confirmando que Hsp70 interage com BMP principalmente através do seu domínio de ATPase. Surpreendentemente, os mutantes de triptofano mostraram uma diferença impressionante na sua capacidade para interagir com BMP. Considerando que o mutante rHsp70-W580F teve essencialmente o mesmo perfil de interação como a rHsp70, a ligação do mutante rHsp70- W90F foi dramaticamente diminuída. Visto que rHsp70-W90F foi apropriadamente dobrado como analisado pelo dicroísmo circular de UV distante e próximo e capaz de dobrar luciferace e hidrolizar ATP, a mutação W90F especificamente aboliu a interação entre Hsp70 e BMP enquanto reteve os aspectos estruturais e funcionais do chaperona Hsp70. Assim, o mutante rHsp70-W90F inesperadamente nos muniu com uma ferramenta inestimável para testar ainda mais se a interação direta entre Hsp70 e BMP dota Hsp70 com seus atributos de proteçãos de lisossoma. De fato, o mutante rHsp70- W90F perdeu completamente a sua capacidade para proteger as membranas lisossômicas contra a foto-oxidação e as células contra a morte celular lisossômica induzida pela cisplatina, embora o mutante rHsp70-W580F mostrasse a mesma eficácia como a proteína do tipo selvagem. Também o mutant rHsp70-ΔPBD que mostrou uma capacidade inalterada para ligar-se às membranas ricas em BMP perdeu a sua capacidade para proteger contra a foto-oxidação e cisplatina. Estas descobertas demonstram que a ligação de Hsp70 a BMP é requerida mas não é suficiente para dotar as membranas lisossômicas com proteção. Além disso, um domínio de ligação de peptídeo de terminal carbóxi intacto é necessário para a estabilização das membranas lisossômicas em células vivas.

[00489] Os inibidores de Hsp70 a muito foram considerados como medicamentos anticâncer interessantes. A atenção, entretanto, tem se concentrado na inibição da Hsp70 citossólica e em problemas com respeito à liberação de medicamento e a falta de especificidade entre os membros da família Hsp70 tem apresentado barreiras intransponíveis para o desenvolvimento de antagonistas de Hsp70 adequados. Tendo estabelecido que tanto a ligação a BMP e um domínio de ligação de peptídeo intacto são requeridos para o efeito citoprotetor de Hsp70 e tendo verificado o potencial no alvejamento da interação de Hsp70 - BMP, os inventores em seguida testaram se o efeito de proteção da Hsp70 endo-lisossômica também seria neutralizado pelos inibidores da atividade de chaperona da Hsp70. Isto foi realizado incubando-se as células com um peptídeo derivado do fator indutor de apoptose (ADD70), que inibe a função de chaperona de Hsp70 pela ligação ao seu domínio de ligação de peptídeo. Deve ser mencionado que este peptídeo grande (388 aminoácidos) não cruzam a membrana plasmática e deste modo nos proveu com uma outra ferramenta para alvejar especificamente a Hsp70 endo-lisossômica. Notavelmente, a incubação de células com peptídeo ADD70 completamente bloqueou o efeito de proteção de lisossoma de rHsp70 submetido à endocitose em células U-2-OS. De modo a testar se ADD70 também neutralizaria o efeito citoprotetor de células da própria Hsp70, os inventores investigaram o seu efeito sobre a citotoxicidade induzida por cisplatina em fibroblastos embrionários de murino imortalizados transgênicos em Hsp70 (iMEFs), em que a Hsp70 transgênica confere resistência quase completa contra a morte celular induzida por cisplatina. Extraordinariamente, o tratamento com ADD70 de iMEFs transgênicos em Hsp70 eficazmente aboliu o efeito de proteção mediado por Hsp70 e tomou- os tão sensíveis à cisplatina quanto os iMEFs tipo selvagem. Os iMEFs tipo selvagem expressam níveis muito baixos de Hsp70 e assim a incapacidade de ADD70 para os sensibilizar ainda mais à cisplatina sustenta a idéia de que a sensibilização mediada por ADD70 é, de fato, devido à inibição de Hsp70. Similar ao tratamento anti-BMP, também o tratamento ADD70 sensibilizou as células do carcinoma da próstata PC-3 e DU-145 à citotoxicidade induzida por cisplatina.

[00490] Os dados aqui apresentados mostram que Hsp70 interage diretamente com o fosfolipídeo aniônico endo-lisossômico BMP e que esta interação estabiliza as membranas endo-lisossômicas. Porque a concentração de BMP aumenta nas vesículas endocíticas conforme os endossomas amadurecem para formar corpos multivesiculares, endossomas e lisossomas tardios, a regulagem do pH seria o caminho pelo qual a Hsp70 é alvejada a BMP e lisossomas. Os subdomínios de Hsp70 diferem acentuadamente em seus valores pl, o domínio de ATPase tendo 1,72 unidade mais alta de pl do que o domínio de ligação de peptídeo. Esta característica sugere que no pH ácido, o domínio de ATPase é de modo preferencial positivamente carregado, o que facilitaria a sua interação com lipídeos aniônicos. Conforme o pH é diminuído durante a maturação endocítica, a carga positiva aumentaria e qualquer interação aniônica seria realçada ainda mais. Os dados aqui apresentados demonstrando a dependência da interação de Hsp70 - BMP no pH ácido e no domínio ATPase sustenta esta teoria. Além disso, a modelagem molecular da superfície eletrostática do domínio de ATPase de Hsp70 revelou que a mesma forma uma estrutura quase igual a cunha com uma carga predominantemente positiva no fundo da cunha mesmo no pH 7,0. De modo interessante, W90 reside dentro deste domínio positivamente carregado, que daria pistas do por que a mutação Hsp70-W90F tem um tal impacto profundo na capacidade de Hsp70 para interagir com BMP e estabilizar lisossomas. BMP está localizado exclusivamente nas membranas internas do compartimento endolisossômico, onde o mesmo sustenta a desintegração e extração de lipídeo das vesículas lipídicas pela esfingomielinase ácido e proteínas ativadoras de esfingolipídeo dando origem a metabolites tais como ceramida e esfingosina-1-fosfato, que foram implicados na desestabilização de membranas e morte celular. Deve ser mencionado que as membranas lisossômicas internas podem ser atingidas pela invaginação das membranas de perímetro ao nível de endossomas iniciais e tardios, e, portanto, as respectivas vesículas são prováveis de conter também Hsp70. Consequentemente, Hsp70 pode interferir com o papel do BMP como um cofator para a hidrólise de esfingolipídeo e deste modo alterar a composição de lipídeo do lisossomas. De modo a testar esta hipótese, os inventores estão presentemente desenvolvendo tecnologia com base na espectroscopia de massa para a quantificação de metabolites de esfingolipídeo lisossômico.

[00491] Dados acumulativos sugerem que a expressão aumentada e o tráfego alterado de proteases lisossômicas podem formar um “Calcanhar de Aquiles” para as células de tumor sensibilizando-as para a permeabilização de membrana lisossômica. Portanto, a interação de BMP-Hsp70 sobre as membranas endo-lisossômicas e a estabilização resultante do compartimento endolisossômico provêem as células cancerosas com proteção contra esta via de outro modo direta para a morte celular. O mecanismo molecular subjacente a este efeito citoprotetor agora abre novas possibilidades existentes para a sensibilização de células cancerosas aos agentes que induzem caminhos celulares de morte lisossômica por intermédio da inibição específica da função de estabilização de lisossoma de Hsp70. Reciprocamente, a interação entre Hsp70 e BMP forneceria novas estratégias de tratamento que contam com a citoproteção oferecida pela função estabilizadora de lisossoma de Hsp70 exogenamente administrado para insultos tão diversos quanto pancreatite, lesões de nervo motor e sensorial e dano retinal induzido por luz.

Materiais e métodos

[00492] Cultura celular e reagentes

[00493] As linhagens de célula de osteossarcoma U-2-OS humanas foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 6 % de soro de bezerro inativado por calor e penicilina-estreptomicina. Hsp70 transgênico e iMEFs de controle apropriadas foram geradas e mantidas como anteriormente descrito (Nilandsted et al., 2004). Todas as células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera com ar umidificado com 5 % de CO2 e repetidamente testadas e descobertas negativas quanto a micoplasma.

[00494] A menos que de outro modo estabelecido, todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Denmark A/S). Proteínas Recombinantes

[00495] Hsp70 recombinante e seus mutantes foram gerados usando o sistema de vetor pET-16b (Novagen) com indução da expressão de proteína e subsequente purificação pela afinidade de Ni2+ otimizado de acordo com o protocolo do fabricante.

[00496] A rotulação de rHsp70 com Alexa Fluor 488 foi feita de acordo com o protocolo do fabricante (Molecular Probes). Captação celular de proteínas recombinantes e anticorpos:

[00497] As células sub-confluentes foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 6 % de soro de bezerro inativado por calor e penicilina-estreptomicina. As proteínas recombinantes ou lisados de reticulócito foram adicionados diretamente ao meio para se obter a concentração final. As células foram depois cultivadas mais 20 h na presença da proteína/lisado.

[00498] O carregamento de células com um anticorpo para BMP (LBPA) (6C4) foi feito de acordo com técnicas no ramo.

[00499] A quantificação de rHsp70* submetido à endocitose foi feita pelas células cultivadas 20 h na presença de rHsp70* depois do que as células foram colhidas, lavadas 3 vezes em PBS e contadas. Para a captação de célula inteira l*105 células foram usadas. As células foram lisadas pela incubação por 30 min em gelo em 100 pl de digitonina-PBS (200 pg/ml). A fluorescência foi medida em uma leitora de placa Spectramax Gemini (Molecular Devices). Para as frações de membrana leves (LMF) um total de 10*106 células foram colhidas, lavadas 3 vezes em PBS e homogeneizado em oscilador até que a ruptura da membrana atingiu 90 % como determinado pelo fingimento com azul de tripano. As células foram depois submetidas ao fracionamento de membrana depurando-se primeiro a membrana plasmática, núcleo e frações de membrana pesadas depois que a LMF foi colhida pela centrifugação a 17000*g por 20 min. A LMF foi depois dividida em duas - a primeira sendo mantida como a LMF “completa”. A segunda fração foi congelada/descongelada por 5 ciclos em nitrogênio líquido para romper as membranas e subsequentemente centrifugada a 20000*g por 20 min de modo a separar as membranas do conteúdo luminal. Todo o trabalho com célula depois de colher foi feito no máx. a 4 °C. Ensaios quanto a integridade lisossômica e viabilidade celular

[00500] Células U-2-OS sub-confluentes incubadas com 2 pg/ml de laranja de acridina por 15 min a 37 °C foram lavadas, irradiadas e analisadas em solução salina balanceada de Hanks complementada com 3 % de FCS. As células para a formação de imagem de célula única foram selecionadas de 8 áreas pré-definidas de cada reservatório no modo de luz transmitida depois que as mesmas células foram imediatamente visualizadas e expostas à luz azul de queimador de arco de mercúrio USH102 100W (Ushio electric) instalado em um suporte U-ULS100HG (Olympus) por 20 s. A microscopia de fluorescência foi realizada no microscópio invertido Olympus IX-70 com uma objetiva LCPIanFl x20 com NA = 0,40. A perda de gradiente de pH lisossômico foi quantificada contando-se a perda do fingimento vermelho intenso.

[00501] A morte celular como apoptose foi avaliada tingindo-se as células com 0,05 pg/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) e contando as células com núcleos condensados em um Microscópio fluorescente Olympus IX-70 invertido (Filtro U-MWU 330-385 nm). Para cada experimento um mínimo de oito áreas aleatoriamente escolhida foram contadas. A viabilidade de células foi analisada pelo ensaio de redução com brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) como descrito anteriormente67. As células necróticas foram quantificadas pela citometria de fluxo tingindo-se as células por 10 min a 37 °C com 2,5 pM de SYTOX Verde (Molecular Probes) e em seguida medindo-se as células positivamente tingidas pela sua intensidade de fluorescência no canal FL1 de um citômetro de fluxo (FACSCalibur®; Becton Dickinson).

[00502] As células foram tratadas com cisplatina como indicado, as frações citossólicas foram obtidas pelo tratamento com digitonina e as atividades de cisteína catepsina citossólica (zFRase) e equivalentes à caspase- 3 (DEVDase) foram determinadas. Interferência de RNA

[00503] Os siRNAs usados incluíram um que alveja os dois genes que codificam contra Hsp70 (HSPA1A e HSPA1B); 5’- GCCAUGACGAAAGA CAACAAUCUGU-3’ (Invitrogen) e um siRNA de Hsp70 de controle descrito anteriormente. Oligofectamina (Invitrogen) foi usada como um agente de transfecção. Imunodetecção

[00504] Os anticorpos primários usados incluíram anticorpos monoclonais de camundongo contra Hsp70 (2H9; gentilmente fornecido por Boris Margulis, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Rússia), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; Biogenesis), BMP (6C4; (Kobayashi et al., 1998)), LIMP-1 (H5C6; desenvolvido por J. Thomas August e James E. K. Hildret e obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank desenvolvido sob os auspícios da NICHD e mantido pela University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, USA), cyt c (clone 6H2.B4, BD PharMingen), SERCA (I1D8, Calbiochem) e golgin-97 (CDF4, Molecular Probes). As proteínas separadas por 10 % de SDS-PAGE e transferidas a uma membrana de nitrocelulose foram detectadas usando-se os anticorpos primários indicados, anticorpos secundários conjugados a peroxidase apropriados da Dako, reagentes de Western blotting ECL (Amersham) e Leitora de Imagem Luminescente (LAS-1000Plus, Fujifilm). Espectros de fluorescência de triptofano e dispersão de luz a 90° de lipossoma

[00505] Os espectros de fluorescência de triptofano (RFI) e a dispersão de luz a 90° de lipossoma (RSI) foram analisados em um tampão de HEPES (20 mM de HEPES, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4 ou 6,0 como indicado) utilizando LUVs que consistem dos lipídeos indicados essencialmente como descrito anteriormente. Para RFI, LUVs foram adicionadas em alíquotas de 10 pM e os espectros registrados depois de um período de estabilização de 20 min. Para o RSI, as proteínas recombinantes foram adicionadas em alíquotas de 0,12 nmol. Ressonância de plasma de superfície (BIAcore)

[00506] Para a preparação de LUVs uma mistura de lipídeo que consiste de 10 % em mol de esfingomielina, 50 % em mol de fosfatidilcolina, 20 % em mol de colesterol e 20 % em mol de BMP dissolvidos em solventes orgânicos, foi secada sob uma corrente de argônio e reidratada em tampão de Tris/HCl (pH 7,4) (Kolzer et al., 2004). A mistura foi congelada- descongelada nove vezes em nitrogênio líquido e depois em uma incubadora a 37 °C. Depois de banho de ultra-som por 15 min a mistura foi passada 21 vezes através de uma membrana de policarbonato com um diâmetro de poro de 100 nm. As medições de ressonância de plasma de superfície foram realizadas usando um sistema BIAcore 2000 a 25 °C. LUVs (concentração de lipídeo total 0,1 mM) foram imobilizadas na superfície de um chip sensor LI (BIAcore) em PBS (tampão de carga). O tampão de condução usado foi tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5). Como um controle, a esfingomielinase ácida (0,2 pM, 60 pl em tampão de condução) foi injetado diretamente na superfície do lipossoma. Unidades de resposta entre 4100 RU e 5250 RU foram obtidas. A proteína de interesse foi injetada em tampão de condução a uma taxa de fluxo de 20 pl/min nas concentrações indicadas. Depois da injeção uma fase de dissociação de 10 min foi anexada. Modelagem Molecular

[00507] A análise de estrutura primária assim como a modelagem molecular foram feitas com software disponível do servidor de proteômicos do Expert Protein Analysis System (EXPaSy) do Swiss Institute of Bioinformatics (http://expasy.org/). A modelagem molecular foi feita com base na estrutura cristalina do domínio de Hsp70-ATPase humano (código pdb: 1 S3X) e o domínio de ligação de substrato Hsc70 humano (código pdb: 7HSC) com Visualizador DeepView-Swiss PDB. Os modelos de superfície foram fundamentados na interação de coulomb no pH 7,0 usando uma constante dielétrica de solvente de 80 (H2O). Análise estatística

[00508] A análise estatística foi realizada usando um teste T de Student de duas caudas, emparelhado de modo a avaliar a hipótese nula. O nível de corte para a significância estatística foi ajsutado para 5 % e todos os grupos de dados testados quanto a comparabilidade de suas variações usando um teste F. Todas as estatísticas foram feitas em um mínimo de n = 3 experimentos independentes.

Debate

[00509] A literatura tem fornecido evidência de que Hsp70 pode estar presente nas membranas plasmáticas de células de tumor, assim como no sistema endolisossômico. Foi além disso conhecido que Hsp70 pode ser liberada na corrente sanguínea durante diferentes eventos indutores de estresse, os mais típicos sendo febre, trauma e exercícios exaustivos, o mais intrigante provavelmente sendo dos estresses psicológicos, embora este trabalho fosse principalmente feito no campo da imunologia. A presença de espécies de Hsp70 dentro do compartimento endolisossômico também foi descrito para um outro membro da família de Hsp70; a Hsc70 constitutivamente expressada. A função de Hsc70 nesta localização de fato deu nome ao processo conhecida como autofagia mediada por chaperona.

[00510] Entretanto, da literatura nada foi conhecido a cerca da base molecular para a associação de Hsp70 com membranas plasmáticas e endolisossômicas, que levou os inventores à formulação deste projeto.

[00511] Os dados apresentados no Exemplo 1 mostram que Hsp70 é capaz de interagir com lipídeos de membrana negativamente carregados tais como fosfatidilserina (PS), cardiolipina e bis(monoacilglicero)-fosfato (BMP) no pH neutro. Na imitação da acidez que pode ser esperada no sistema endolisossômico inicial (pH 6,0), entretanto, o perfil de interação dramaticamente muda e a afinidade de Hsp70 quanto a BMP toma-se 20 vezes mais alta do que no pH neutro e quase 9 vezes maior do que para PS. Esta interação Hsp70-BMP foi verificada em um sistema BIAcore mais elaborado, em que o pH foi agora ajustado para aquele esperado nos endossomas e lisossomas tardios (pH 4,5), os sítios principais para a maioria dos BMPs celulares. De modo interessante, a proteína que interage com BMP conhecida; a esfingomielinase ácido (aSMase), que conta com o BMP como um cofator, apenas mostra metade da afinidade para BMP comparada com aquela de Hsp70, ilustrando a alta afinidade relative de Hsp70 para BMP.

[00512] A interação de Hsp70 com PS também foi relatada por outros, visto que tem uma interação entre Hsp70 de camundongo e glicoceramidas ácidas, em que a interação dependeu do domínio de ATPase de terminal N e em alguns casos também do domínio de ligação de peptídeo (PBD). Entretanto, contrário aos sistemas aqui utilizados, estas descobertas foram feitas em sistemas que consistem basicamente de apenas um lipídeo (lipídeos 90 a 100 % e 100 % puro, respectivamente), provavelmente não se parece com nenhum ambiente lipídico marginalmente complexo, que esperar-se-ia na célula eucariótica. Entretanto, a importância da região de terminal N de Hsp70 para a associação de lipídeo ácido como mostrado por Harada et dl. está de acordo com a descoberta dos inventores, de que a interação de Hsp70 com BMP depende do seu domínio de ATPase de terminal N. Os inventores mostram ainda que o triptofano 90 (W90) de Hsp70 é um aminoácido crítico visto que a sua mutação significantemente reduz a interação de Hsp70-BMP. Um modelo hipotético argumenta que Hsp70 contém sítios de ligação específicos para as partes hidrofílica e hidrofóbica de glicolipídeos ácidos tanto na ATPase assim como no domínio de ligação de peptídeo (PBD).

[00513] Embora este modelo possa ser aplicável para a ligação de Hsp70 aos glicolipídeos ácidos, os inventores de preferência sugerem um outro modelo para a interação de Hsp70-BMP. Com base nos dados aqui apresentados que; I) o PBD é apenas capaz de interações muito fracas com BMP; II) a importância de W90; III) as propriedades de ligação do domínio de ATPase; e IV) a modelagem molecular do potencial eletrostático de superfície de Hsp70, os inventores sugerem que Hsp70 interage com BMP via um sub-domínio de modo eletrostático positivamente carregado, como cunha, no fundo da fenda de ATPase. Visto que a mutação conservativa de W90 para fenilalanina significantemente reduz a interação de Hsp70-BMP sem afetar as atividades de redobra ou ATPase de Hsp70 e desde que esta mutação de aminoácido única não mude o perfil eletrostático, é possível, entretanto, que um intermediário dos dois modelos seja mais apropriado em explicar a interação de Hsp70 com um motivo de lipídeo aniônico mais comum. Em um tal modelo, a carga de superfície positiva pode facilitar as interações eletrostáticas e resíduos particulares tais como W90 podem estar envolvidos na determinação da especificidade de ligação de parceiros de ligação de lipídeo aniônico - neste caso, BMP. De modo interessante, isto pode potencialmente implicar Hsp70 como um regulador mais geral da homeostasia de lipídeo na célula. Sustentando isto estão dados que demonstram que as membranas lipídicas das células podem servir como os sensores primários de estresse tais como febre e estresse oxidativo e consequentemente como os indutores iniciais da resposta ao estresse. Em face do estresse, argumentar-se-ia que as membranas lipídicas da célula seriam compartimentos cruciais para manter na homeostasia ou de fato modificar de modo a deflagrar eventos de sinalização específicos como uma resposta à inoculação celular. A ligação de Hsp70 aos lipídeos tais como BMP e os seguintes aumentaram a estabilidade de membranas lisossômicas e talvez outros eventos lipídicos celulares podem assim representar uma parte de uma resposta ao estresse celular geral. No caso de câncer uma tal resposta teria sido sequestrada para servir o final do próprio câncer, mas também de uma perspectiva evolucionária mais ampla, uma resposta de proteína-lipídeo coordenada diante do estresse celular faria bom sentido.

[00514] Os dados aqui apresentados que mostram que apenas Hsp70, não Hsc70 e Hsp70-2, é capaz de proteger diretamente as membranas lisossômicas argumentam que uma resposta de estresse de lipídeo potencial seria especificamente regulada pela própria Hsp70 induzida pelo estresse principal e não outra espécie de Hsp70. Entretanto, como também é mostrado, o esgotamento de Hsp70-2 também leva à permeabilização da membrana lisossômica e à morte celular, embora neste caso o caminho seja indireto visto que o mesmo depende de LEDGF. O mecanismo para como LEDGF afeta as membranas lisossômicas entretanto permanece não resolvido.

[00515] De modo a validar a relevância in vivo da interação de Hsp70- BMP, os inventores alvejaram BMP submetendo à endocitose anticorpos e Hsp70 lisossômica pela endocitose do polipeptídeo ADD70 derivado de AIF de outro modo impermeável à célula. Isto verificou que a interação entre Hsp70 e BMP serve para estabilizar as membranas lisossômicas visto que as células subsequentemente foram significantemente sensibilizadas para os efeitos de estímulos disruptivos de membrana lisossômica direta assim como o agente quimioterapêutico que induz LMP cisplatina, o perfil de morte celular programada do qual foi caracterizado como parte deste projeto. A expressão de ADD70 foi primeiramente mostrado sensibilizar as células cancerosas a uma variedade de estímulos de morte e diminui a tumorigenicidade de carcinoma de cólon de rato e células de melanoma de camundongo em animais singênicos. A diferença principal entre este método e o método aqui apresentado é que os presentes inventores procuraram alvejar especificamente a Hsp70 lisossômica através da endocitose de ADD70, considerando que os primeiros estudos utilizaram a expressão citossólica de ADD70 de modo a alvejar a Hsp70 citoplásmica mais abundante. O sucesso no alvejamento da interação de Hsp70-BMP endolisossômica também forneceu uma certa prova de conceito da idéia de alvejar componentes lisossômicos através da endocitose para métodos terapêuticos, um conceito que teria implicações terapêuticas amplas, como imaginar-se-ia sensibilizar por exemplo, células cancerosas para agentes que induzem caminhos da morte celular lisossômica via inibição específica da função de estabilização de lisossoma de Hsp70. Reciprocamente, a interação entre Hsp70 e BMP pode fornecer novas estratégias de tratamento que contam com a citoproteção oferecida pela função estabilizadora de lisossoma de Hsp70 exogenamente administrada para insultos tão diversos quanto pancreatite, lesões de nervo motor e sensorial e dano retinal induzido por luz. De fato, o conceito de utilizar o mecanismo endocítico para a introdução de compostos citotóxicos específicos já foi explorado, visto que a liberação endocítica de uma hélice BH3 grampeada em hidrocarboneto com base no agonista de morte do domínio que interage com BH3 pró-apoptótica, Bid, foi mostrado induzir apoptose em células de leucemia. Este processo dependeu da hélice BH3 que deixa o compartimento endocítico intacto e ativando Bax e Bak de modo a induzir a liberação de citocromo c libera e ativa um programa mitocondrial de apoptose. Entretanto, o mecanismo de escape do sistema endocítico infelizmente não foi tratado neste documento.

[00516] Como aqui mostrado, a interação entre Hsp70 e BMP depende do domínio de ATPase de Hsp70. De modo interessante, relatos recentes sobre o co-chaperona Hsp70, a proteína 1 de ligação de Hsp70 (HspBPl), enfatizaria a importância desta área positivamente carregada de Hsp70. Um estudo da estrutura cristalina de HspBPl complexada com parte do domínio de ATPase de Hsp70 revelou que a interação entre estas duas foi mediada por uma dobra curva, toda a-helicoidal em HspBPl que contém quatro repetições equivalentes a tatu. A face côncava desta dobra curva abrange o lóbulo II do domínio de ATPase, o mesmo lóbulo que forma a parte principal do volume de modo eletrostático positivamente carregado do domínio de ATPase de Hsp70s, que os inventores debatem mediar a interação entre Hsp70 e BMP. Uma outra perspectiva sobre isto é fornecida por um outro estudo, em que 14 linhagens de célula cancerosa foram caracterizadas com respeito a seus níveis de Hsp70/HspBPl relativos. Este outro estudo descobriu que as linhagens de célula com uma razão molar de HspBPl/Hsp70 alta foram mais suscetível aos medicamentos anticâncer do que aqueles com razão baixa e que a superexpressão de HspBPl promoveu a permeabilização da membrana lisossômica. Com base nestes relatos e os dados apresentados neste Exemplo, argumentar-se-ia quanto a um modelo em que HspBPl pela ligação à área positivamente carregada do domínio de ATPase de Hsp70, rompe a sua interação com BMP e consequentemente o seu efeito de estabilização das membranas endo-lisossômicas, resultando em sensibilidade aumentada para estímulos indutores de LMP. Como tal, o domínio repetido de tatu de HspBPl potencialmente formaria a base de um planejamento de medicamento inteligente, tanto quanto o caso para ADD70. A eficácia de tais moléculas derivadas de HspBPl seria fácil de testar nos sistemas aqui descritos e apresenta um caminho interessante para outras aplicações do mecanismo molecular aqui descrito.

[00517] Como os inventores mostra aqui, Hsp70 liga-se com alta afinidade a BMP no pH ácido de 4,5, mesmo quase 2 vezes mais alto do que é o case para o parceiro de ligação de BMP “clássico”, a esfingomielinase ácido (aSMase). De modo interessante, BMP serve como um cofator estimulador para a hidrólise enzimática não apenas da esfingomielina via aSMase, mas da maioria dos esfingohpídeos ligadas à membrana visto que o mesmo também funciona como um cofator para as proteínas ativadoras de esfingolipídeo (SAPS/Saposinas) A-D. Uma questão óbvia seria assim, se Hsp70 pela sua ligação a BMP de certo modo altera as propriedades de ligação de aSMase e as Saposinas, por meio deste modificam o catabolismo de esfingolipídeos e glicoesfingolipídeos da membrana e a geração de moléculas efetoras a jusante tais como ceramida e seus metabolites, Ceramida-1-fosfato, esfingosina e esfingosina-1-fosfato, todas as quais foram implicadas tanto na sobrevivência quanto na morte de célula. De fato, os inventores descobriram que Hsp70 é capaz de modular a ligação de aSMase aos lipossomas que contém BMP no pH 4,5, dependendo da concentração de Hsp70. Como pode ser observado, concentrações baixas (3 a 150 nM) de Hsp70 facilitam a interação de aSMase com lipossomas BMP Hsp70, considerando que concentrações mais altas de Hsp70 (300 a 1500 nM) tem o efeito oposto. Embora a nossa concentração de trabalho no meio quando Hsp70 é adicionado para endocitose seja de 300 nM, seria difícil estimar uma dada concentração intralisossômica nesta base e qualquer conclusão como qual efeito Hsp70 teria sobre a atividade de aSMase in vivo permaneceria especulativo. Entretanto, o fingimento de iMEFs transgênicas em Hsp70 (Hsp70-TG) e tipo selvagem (WT) com um anticorpo monoclonal contra ceramida revelou que os camundongos transgênicos em Hsp70 mostram uma supra-regulagem evidente de ceramida, que está presente em um padrão de pérolas em um fio característico na periferia das células assim como próximo ao núcleo. Outra análise do perfil de ceramida das iMEFs via extração de lipídeo e espectroscopia de massa de lipídeo subsequente tem confirmado estas descobertas, conforme os níveis acumulativos de ceramida foram aumentados de uma média de 10,2 ng de ceramida/mg de proteína para a iMEF-WT para 14,9 ng/mg para as iMEFs transgênicas em Hsp70. Os inventores comprovaram ainda que este efeito pode ser atribuído à ação de Hsp70, visto que os inventores também traçaram o perfil nossas células U-2-OS carregadas com rHsp70 (isto é, 300 nM de rHsp70 em meio completo por 24 h, análogo a todos os outros experimentos de endocitose de Hsp70 aqui apresentados). A quantificação de ceramida em células U-2-OS carregadas com Hsp70 mostrou um aumento nos níveis acumulativos de ceramida de 2,99 ng de ceramida/mg de proteína para as células de controle para 5,10 ng/mg para as células carregadas com Hsp70 (o experimento foi feito apenas uma vez no momento de escrever). Entretanto, quando juntos eles todos sustentam um papel para Hsp70 na modulação dos níveis de ceramida em células, embora validação adicional naturalmente é necessária. Todavia, se estes dados pudessem ser verificados, uma série de questões por si só se apresentaria, tais como a compartimentalização da espécie de ceramida, quantificação de espécie de ceramida específica (da qual existem pelo menos 50 espécies moleculares distintas), perfil de níveis de ceramida diante de vários estresses, situação de transformação de células, etc.

[00518] De modo interessante, um estudo anterior tratou uma destas questões, que mostra que o choque térmico (42,5 °C por 2 h) causa o acúmulo de ceramida em linfócitos de leucemia aguda Molt-4. Este acúmulo pode ser bloqueado pelos inibidores farmacológicos Fumonisina BI e miriocina, o último dos quais é considerado como um inibidor específico do caminho de novo da síntese de ceramida visto que o mesmo bloqueia a ação de serina palmitoiltransferase, a enzima que inicia a síntese de novo de novos esfingohpídeos de serina e palmitoil-CoA. Um mecanismo parcial para este aumento na síntese de novo de ceramida foi descrito em levedura, em que o estresse térmico induz um influxo agudo de serina no ER que aciona a síntese de novo. Será interessante testar se o aumento nos níveis de ceramida observados na endocitose de rHsp70 pode ser modulado por estes inibidores farmacológicos ou se os aumentos observados derivam dos caminhos catabólicos da degradação de esfingolipídeo e a estimulação destes pela ligação de Hsp70 ao BMP. Naturalmente, um modelo do composto também seria hipotizado. Neste modelo, um estresse térmico inicial levaria à fluidização da membrana, influxo de serina e início rápido da síntese de esfingolipídeo de novo. Subsequentemente, a indução de Hsp70, como uma consequência do estresse térmico, levaria aos níveis de Hsp70 aumentados na célula, a interação de Hsp70 com BMP, aumento na atividade de aSMase - e possivelmente também atividade de SAP - que resulta na geração de ceramida pelos caminhos catabólicos. Esta resposta secundária complementaria a indução inicial de novo ou talvez a assuma visto que a resposta de novo contínua contaria com um fornecimento contínuo de serina e palmitoil-CoA. Permanece entretanto, para ser testado se a proteção celular é uma consequência do aumento na ceramida por si só ou talvez deve estar contribuindo para os níveis alterados destes metabolites a montante e a jusante.

[00519] Neste ponto, algumas questões maiores permanecem para serem respondidas - Como a Hsp70 acaba no meio extracelular e dentro do compartimento endolisossômico? É a Hsp70 secretada e depois absorvida pela endocitose? - ou a mesma está presente dentro dos lisossomas ou lisossomas secretores mais especializados, esperando por um sinal de liberação na forma de estresse? E talvez de maneira mais importante - qual é a significância biológica da presença de Hsp70 no ambiente extracelular?

[00520] Embora o trabalho apresentado neste trabalho não seja capaz de responder estas questões complexas, algumas deduções entretanto podem ser feitas. Primeiro, Hsp70 pode ser submetida à endocitose em todas as linhagens de célula testadas neste projeto, argumentando quanto a um modo comum de reconhecer Hsp70 extracelular (eHsp70). Isto está de acordo com os dados que mostram que eHsp70 pode ligar-se a vários receptors em sub- populações de leucócito diferentes. Os receptores envolvidos no reconhecimento da Hsp70 extracelular (eHsp70) principahnente incluem receptores de reconhecimento padrão (PRRs) e consistem de uma variedade de receptores de famílias de receptor diferentes tais como os receptores equivalentes a toll (TLR), receptores descontaminantes e lectinas tipo c. Visto que o trabalho neste projeto não tratou por qual mecanismo inicial Hsp70 é submetido à endocitose (mediado por receptor, dependente de jangada, dependente de clatrina, etc.) não pode ser dito se PRRs são responsáveis pela endocitose de eHsp70 observada em nossos sistemas. Entretanto, o excesso de 10 vezes de Hsp70 não rotulado pode não competir com a captação de Hsp70 rotulado com AF488 nem nas células U-2-OS nem iMEFs - ao contrário, a endocitose foi significantemente realçada na presença de excesso de Hsp70 não rotulado, que em algum grau argumenta contra um mecanismo saturável de captação.

[00521] O foco do campo imunológico tem sido principalmente sobre a resposta e ativação de citocina da defesa imune inata evocada pela ligação de eHsp70 aos PRRs e consequentemente não muita consideração tem sido dada ao efeito de eHsp70 depois da ligação do receptor e início de sinalização.

[00522] Os mecanismos de liberação de Hsp70 no meio extracelular e os efeitos de Hsp70 uma vez aqui foram em algum grau tratados, embora um discernimento molecular que satisfaça nestes mecanismos instigantes ainda esteja faltando. Não obstante, um monte de evidências existe quanto a presença de Hsp70 no sistema circulatótio depois do estresse e dados acumulativos sustentam um papel para a eHsp70, seja induzida pelo estresse ou exogenamente liberada, na neuroproteção assim como na imprimação do sistema de defesa imune primário. Com respeito à liberação de Hsp70, a primeira evidência para a transferência de Hsp70 a partir de uma célula para uma outra veio de estudos no axônio gigante de lula e durante a reprodução destes resultados em células embrionárias de rato cultivadas, evidência foi apresentada de que um caminho não clássico de exocitose pode ser responsável pela liberação de Hsp70.

[00523] Foi sugerido que Hsp70 junto com outras proteínas de choque térmico são apenas liberadas sob circunstâncias patológicas que resultam em morte necrótica e não durante a morte celular programada. Estudos recentes entretanto, têm mostrado que Hsp70 pode ser liberado de células intactas pelos mecanismos ativos e que os graus de estímulo determina o modo de liberação. De maneira importante, nenhum estudo conhecido têm relatado uma correlação direta entre eHsp70 e marcadores de dano muscular embora aumentos maiores de eHsp70 possam ser detectados na corrente de sangue periférico no exercício físico. Mais convincente e talvez também mais intrigante, são as descobertas que mostram que os estresses psicológicos tais como medo predatório e choque elétrico podem evocar uma liberação de eHsp70 induzida pelo estresse, um processo que foi sugerido ser dependente da sinalização da catecolamina. Isto é particularmente interessante visto que as catecolaminas via o receptor ai-adrenérgico podem levar aos fluxos de cálcio intracelulares e os fluxos de cálcio podem causar exocitose de exossomas, corpos multivesiculares e lisossomas. Como tal, durante momentos de estresse, aumentos na noradrenalina que atua nos receptores αi- adrenérgicos podem resultar em um fluxo de cálcio dentro da célula com a liberação subsequente de Hsp70 dentro de exossomas. Evidência para estas hipóteses vêm das demonstrações de que eHsp70 pode ser liberada em vesículas caracterizadas como exossomas, mas evidência também foi apresentada de que eHsp70 pode ser liberada como eHsp70 livre, tanto em sistemas celulares assim como in vivo. Também foi sugerido que as jangadas de lipídeo são necessárias para a liberação de eHsp70 embora isto também tenha sido contestado. Além disso, foi mostrado que um compartimento lisossômico funcional é necessário para a liberação de eHsp70 e que esta liberação é acompanhada pela presença de proteínas marcadoras lisossômicas na superfície das células, sugerindo uma secreção dependente da fusão das membranas plasmática lisossômica.

[00524] Independente de se a Hsp70 liberada está presente em exossomas ou como eHsp70 livre, é interessante mencionar que algum tipo de compartimento endossômico/lisossômico MVB/tardio secretor está aparentemente envolvido em todos os modos de liberação. Com base nestes dados e os resultados aqui obtidos, uma hipótese mais complexa para como Hsp70 escapa do citossol para o ambiente extracelular pode ser formulada. A liberação de Hsp70 ainda depende dos aumentos no cálcio intracelular, visto que isto serviria como o sinal para a exocitose de endo-lisossomas. A presença de Hsp70 dentro deste compartimento entretanto seria dependente da interação de Hsp70 e BMP como aqui descrito, visto que Hsp70 seria eficazmente agregada nas membranas internas que contêm BMP em endossomas tardios/ MVBs/lisossomas. A Hsp70 pode chegar nos endossomas e lisossomas tardios a partir da captação extracelular tal como endocitose como também aqui descrito, ou através de invaginações das membranas perimétricas de endossomas iniciais e tardios assim como lisossomas, que levariam a Hsp70 intracelular e BMP em proximidade. A acidez do compartimento manteria uma forte preferência para a localização de Hsp70s para as membranas que contêm BMP. Na exocitose, alguma Hsp70 ainda estaria ligada aos exossomas que contêm BMP, mas o pH neutro encontrado no ambiente extracelular favoreceria agora um equilíbrio de Hsp70-BMP mudado significantemente para mais Hsp70 não ligada, resultando tanto em Hsp70 livre assim como ligada a exossoma, que depois exerceriam as suas funções extracelulares.

[00525] Em resumo, os dados aqui apresentados mostram que Hsp70 interage diretamente e de modo dependente do pH com o fosfolipídeo aniônico endo-lisossômico BMP. Os inventores demonstram que a ligação de Hsp70 ao BMP é mediada por intermédio do domínio de ATPase de Hsp70, envolvendo triptofano 90 e que esta interação resulta na estabilização de membranas endo-lisossômicas, possivelmente pela influenciação da atividade de outras proteínas de ligação de BMP. Os inventores também mostram que a elucidação deste mecanismo molecular abre novas possibilidades exitantes para a sensibilização de células cancerosas aos agentes que induzem os caminhos da morte celular lisossômica via inibição específica da função estabilizante do lisossoma da Hsp70. Reciprocamente, a interação entre Hsp70 e BMP forneceria novas estratégias de tratamento que contam com a citoproteção oferecida pela função que estabiliza lisossoma de Hsp70 exogenamente administrada. Exemplo 2: Interação entre Hsp70 e Bis(monoacilglicero) fosfato Ativa a Esfingomielinase Ácida, Estabiliza as Membranas Lisossômicas e Promove a Sobrevivência de Célula

[00526] A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é um chaperona molecular de modo evolucionário altamente conservado que promove a sobrevivência de células estressadas pela inibição da permeabilizaçãoda membrana lisossômica, uma marca da morte celular induzida por estresse. Pistas para o seu mecanismo molecular de ação pode residir na translocação associada a estresse e câncer recentemente relatada de uma porção pequena de Hsp70 para o compartimento lisossômico. Aqui, nós mostramos que Hsp70 estabiliza lisossomas pelo realce da atividade da esfingomielinase ácida (ASM), uma lipase lisossômica que hidrolisa esfingomielina para ceramida e fosforilcolina. No ambiente ácido Hsp70 liga-se com alta afinidade e especificidade a um fosfolipídeo aniônico endo-lisossômico bis(monoacilglicero)fosfato (BMP), um co-fator essencial para ASM, facilitando deste modo a ligação de ASM para BMP e estimulando a atividade de ASM. A inibição da interação de Hsp70 - BMP pelos anticorpos BMP ou uma mutação pontual (W90A) na Hsp70 assim como a inibição da atividade de ASM pela desipramina eficazmente reverte a estabilização mediada pela Hsp70 de lisossomas. Notavelmente, a atividade de ASM reduzida em células de pacientes com doença de Niemann-Pick A (NPDA), um distúrbio de armazenagem lisossômica severo causado pelas mutações no gene ASM, também está associada com uma diminuição dramática na estabilidade lisossômica e este fenótipo pode ser eficazmente corrigido pela restauração da atividade de ASM lisossômica pelo tratamento com Hsp70 recombinante ou ASM. Quando juntos, estes dados abrem possibilidades excitantes para o tratamento de distúrbios de armazenagem lisossômica e câncer com compostos não permeáveis à célula que entram no lúmen lisossômico por intermédio do caminho de liberação endocítica.

[00527] As proteases lisossômicas, catepsinas, são efetores importantes nos programas de morte celular evolucionariamente conservados induzidos por uma ampla variedade de estresses. A morte celular dependente da catepsina é caracterizada por uma permeabilização da membrana lisossômica inicial e translocação subsequente de catepsinas no citossol, onde elas podem iniciar caminhos de morte celular dependentes e independentes da caspase. De modo a testar se a localização lisossômica é crucial para a capacidade relatada de Hsp70 para estabilizar as membranas lisossômicas e proteger as células contra a morte celular induzida por estresse, nós levamos vantagem do mecanismo endocítico de células para alvejar Hsp70 recombinante (rHsp70) nos lisossomas. As análises de imunocitoquímica e bioquímica de células de osteossarcoma U-2-OS incubadas com rHsp70 rotulada com fluorocromo revelaram a captação eficaz de rHsp70, a sua co-localização específica com marcadores endossômicos e lisossômicos tardios e a ligação às membranas lisossômicas (Fig. 5a,b e Fig. 9). Usando uma imagem em tempo real para monitorar a integridade da membrana lisossômica (Fig. 5c), nós mostramos que a rHsp70 submetida à endocitose protegeu lisossomas contra a foto- oxidação (Fig. 5d). Além disso, um RNA interferente curto (siRNA) específico para Hsp70 sensibilizou os lisossomas para a foto-oxidação e este efeito foi totalmente revertido submetendo-se rHsp70 à endocitose apropriadamente demonstrando que o efeito de proteção da Hsp70 endógena é mediado pela fração pequena da proteína no lúmen lisossômico (Fig. 5e). A despeito da captação similar (dados não mostrados), nenhuma estabilização lisossômica foi observada com Hsc70 recombinante e Hsp70-2, que compartilham 86 % e 84 % de homologia de sequência de aminoácido com Hsp70, respectivamente (Fig. 5d).

[00528] A presença de Hsp70 nas membranas lisossômicas e a sua capacidade para sobreviver o ambiente lisossômico hidrolítico sugerem que a mesma se liga com os lipídeos da membrana lisossômica. Assim, nós investigamos a interação de Hsp70 com vesículas unilamelares grandes (LUVs) de pahnitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) que contém vários lipídeos aniônicos associados à membrana, isto é, palmitoil-oleoil- fosfatidilserina (POPS; primariamente na membrana plasmática), cardiolipina (primariamente mitocondrial) e BMP (primariamente em endossomas/lisossomas tardios). Levando-se em conta o meio crescentemente ácido do compartimento endolisossômico na maturação para lisossomas, nós comparamos as interações de proteína-lipídeo em condições neutras (pH 7,4) e ácidas (pH 6,0) (Fig. 6a). No pH 7,4, rHsp70 causou uma mudança pouco relativa na dispersão de luz a 90° em lipossomas POPC indicando uma ligação muito fraca. Como relatado mais no princípio para POPS, todos os lipídeos negativamente carregados intensificaram a ligação de rHsp70 aos lipossomas no pH neutro aproximadamente 4 vezes independente da densidade de carga na superfície do lipossoma (variando de -1 para -2) (Fig. 6a). Extraordinariamente, a ligação ao BMP foi quase 20 vezes mais forte no pH ácido quando comparado ao pH neutro, considerando que a ligação a POPS foi apenas levemente aumentada na acidificação (Fig. 6a). A ligação de alta afinidade de Hsp70 ao BMP no pH ácido foi confirmada em um conjunto independente de experimentos BIAcore (Fig. 6e e 7a). De maneira importante, os anticorpos BMP liberados para o compartimento endolisossômico pela endocitose eficazmente inibiu a capacidade de rHsp70 para estabilizar os lisossomas em células vivas (Fig. 6b) e sensibilizou as células para cisplatina (Fig. 6c), um medicamento anti-câncer que induz o vazamento lisossômico.

[00529] De modo a investigar que parte da proteína Hsp70 é responsável pela ligação ao BMP, nós medimos a mudança de fluorescência dos triptofanos na ancoragem de rHsp70 e seus mutantes nos lipossomas que contêm BMP. A perda de sinal na intensidade de fluorescência de pico relativo para o mutante de Hsp70 que carece dos aminoácidos 119-426 no domínio de ATPase do terminal amino (rHsp70-ΔATP), mas não para aqueles que carecem dos aminoácidos 437-617 no domínio de ligação de peptídeo do terminal carbóxi (rHsp70-APBD), indicou que o domínio de ATPase foi requerido para a ligação de alta afinidade de Hsp70 ao BMP (Fig. 6d). Em seguida, nós substituímos os dois triptofanos em Hsp70 com fenilalaninas (W90F e W580F) e estudamos que o triptofano é responsável pela mudança da fluorescência induzida pela ligação de lipídeo. A redução do sinal apenas com rHsp70-W90F indicou que o terminal NH2 da proteína ancorou na camada lipídica (Fig. 6d). Uma análise BIAcore mais quantitativa da interação de BMP-rHsp70 confirmou que Hsp70 interagiu com BMP principalmente através do seu domínio de ATPase (Fig. 6e). Surpreendentemente, a mutação W90F especificamente aboliu a interação entre rHsp70 e BMP enquanto reteve os aspectos estruturais (dobra como analisada pelo dicroísmo circular de UV distante e próximo) e funcionais (dobra da luciferace e hidrólise de ATP) do chaperona Hsp70 (Fig. 6e e dados não mostrados). Assim, o mutante rHsp70-W90F nos proveu com uma ferramenta inestimável para testar ainda mais se a interação direta entre Hsp70 e BMP dota Hsp70 com os seus atributos de proteçãos de lisossoma. De fato, o mutante rHsp70-W90F perdeu completamente a sua capacidade para proteger as membranas lisossômicas contra a foto-oxidação e as células contra a morte celular lisossômica induzida pela cisplatina, considerando que o mutante rHsp70-W580F mostrou o mesmo efeito de proteção como a proteína do tipo selvagem (Fig. 6f e g). De maneira importante, as proteínas de Hsp70 mutantes foram submetidas à endocitose essencialmente tão eficazmente quanto a Hsp70 do tipo selvagem (dados não mostrados). Assim, nós concluímos que a ligação de Hsp70 ao BMP é essencial para o efeito de estabilização de lisossoma da Hsp70.

[00530] Porque a concentração de BMP aumenta nas vesículas endocíticas conforme os endossomas amadurecem para formar lisossomas, a regulagem do pH seria o modo pelo qual Hsp70 é alvejada aos lisossomas. Os cálculos (PROTPARAM, EXPaSy proteomics server, Swiss Institute of Bioinformatics) revelaram que o domínio de ATPase de Hsp70 tem 1,72 unidades mais alto de pl teórico do que o domínio de ligação de peptídeo (6,62 vs. 4,9). Esta característica sugere que no pH ácido, o domínio de ATPase é de modo preferencial positivamente carregado, que facilitaria a sua interação com lipídeos aniônicos. Nossos dados que demonstram a dependência da interação de Hsp70 - BMP no pH ácido e no domínio de ATPase sustentam esta teoria. Além disso, a modelagem molecular da superfície eletrostática do domínio de ATPase de Hsp70 revelou que o mesmo forma uma estrutura quase igual a cunha com uma carga predominantemente positiva no fundo da cunha que contém W90 possivelmente explica o impacto profundo da mutação W90F sobre a capacidade de Hsp70 para interagir com BMP e estabilizar lisossomas (Fig. 6h).

[00531] BMP liga ASM com alta afinidade e estimula a sua capacidade para hidrolisar esfingomielina para ceramida e fosforilcolina. A análise BIAcore revelou que o pré-tratamento das LUVs que contêm BMP com rHsp70 nas concentrações sub-equimolares facilitou a ligação subsequente de ASM, considerando que concentrações de rHsp70 mais altas mostraram um efeito inibidor (Fig. 7a e 10). Extraordinariamente, os fibroblastos embrionários de murino transgênicos em Hsp70 (Hsp70-MEFs), que são protegidos contra o dano lisossômico induzido por estresse (Fig. 7e), demonstraram atividade de ASM significantemente mais alta do que as MEFs tipo selvagem (WT-MEFs) e o tratamento das WT-MEFs com rHsp70 em uma concentração citoprotetiva (300 nM) aumentaram a atividade de ASM ao nível comparável a aquele em Hsp70-MEFs (Fig. 7b). De modo a testar se ASM é responsável pelo efeito que estabiliza lisossoma nós tratamos as células com desipramina, um inibidor de ASM farmacológico bem caracterizado. Desipramina reduziu a viabilidade de MEFs em uma maneira dependente da dose e a morte celular foi associada com uma permeabilização maciça de lisossomas como demonstrado pelo vazamento de catepsinas lisossômicas no citossol (Fig. 7c e d). Notavelmente, a morte celular e o vazamento lisossômico induzidos pela desipramina foram significantemente reduzidos em Hsp70-MEFs quando comparadas com WT-MEFs. Além disso, a inibição de ASM com concentração subtóxica de desipramina reverteu a resistência ao estresse lisossômico de Hsp70-MEFs ao nível das WT-MEFs como evidenciado pela perda acelerada de integridade da membrana lisossômica na foto-oxidação (Fig. 7e). O papel de proteção de lisossoma de ASM foi ainda sustentado pelos dados que mostram que os lisossomas em fibroblastos de pacientes com NPDA, um distúrbio de armazenagem lisossômica fatal causado pelas mutações no gene ASM, demonstrou sensibilidade extrema ao dano induzido pela foto-oxidação (Fig. 8a). Extraordinariamente, rHsp70 foi também capaz de intensificar a atividade enzimática do ASM mutado endógeno assim como o rASM simultaneamente carregado nas células do paciente (Fig. 8b). A atividade de ASM aumentada obtida pelo carregamento dos lisossomas com rHsp70, rASM ou a combinação dos dois correlacionou-se com a sua capacidade para estabilizar os lisossomas e para normalizar o volume do compartimento lisossômico dramaticamente ampliado nas células NPDA (Fig. 8b-d). Deve ser mencionado que semelhante à rHsp70, também rASM localizou para os lisossomas (Fig. 8b).

[00532] Quando juntos nossos dados indicam que a interação de Hsp70-BMP estabiliza lisossomas via um mecanismo que envolve a regulagem do metabolismo de esfingomielina de preferência além da estabilização física direta da membrana. Um tal efeito indireto é sustentado pelo fato de que o BMP está localizado exclusivamente nas membranas internas do compartimento endolisossômico, onde a sua função principal é sustentar a desintegração e extração de lipídeo das vesículas de lipídeo pelo ASM e proteínas ativadoras de esfingolipídeo. De modo interessante, o aumento mediado por ASM na concentração de ceramida lisossômica modifica a conformação estérica de membranas lisossômicas e deste modo facilita a sua fusão com outras vesículas intracelulares e membrana plasmática. Assim, as mudanças na composição e volume da membrana lisossômica como um resultado da capacidade de fusão realçada induzida pela ceramida pode contribuir para o aumento mediado pela Hsp70 na estabilidade lisossômica. Por outro lado, vários estímulos apoptóticos induzem a translocação de ASM para o folículo extemo da membrana plasmática, onde a ceramida pode formar microdomínios de lipídeo que funcionam como sítios para a ativação de moléculas de sinalização associadas com a membrana envolvidas na sinalização apoptótica. Assim, a ceramida pode ter efeitos opostos sobre a sobrevivência de célula dependendo se a mesma é produzida dentro do lisossoma ou na membrana plasmática. O mecanismo molecular descrito acima subjacente ao efeito citoprotetor de Hsp70 abre novas possibilidades exitentes para a sensibilização de células cancerosas aos agentes que induzem os caminhos de morte celular lisossômica por intermédio da inibição específica da função de estabilização de lisossoma de Hsp70. Reciprocamente, a capacidade de administrar exogenamente, a rHsp70 sozinha ou em combinação com rASM pode ser diretamente inoculada como um novo tratamento para pacientes com NPD, cujas opções terapêuticas são correntemente limitadas às terapias de gene e célula tronco.

Resumo de Métodos

[00533] WT- e Hsp70-MEFs foram geradas, imortalizadas e mantidas como descrito na técnica. Fibroblastos de NPDA humanos (83/24) originam- se de uma biópisa de pele de um paciente de 5 meses de idade com hepatosplenomegalia. As proteínas recombinantes foram geradas usando o sistema de vetor pET-16b e purificação pela afinidade de Ni2+ (Novagen) e rotuladas com Alexa Fluor 488 de acordo com o protocolo do fabricante (Molecular Probes). Para analisar a integridade lisossômica, nós desenvolvemos um método de formação de imagem em tempo real de células tingidas com laranja de acridina, uma base metacromática fraca que acumula no compartimento ácido das células tingindo-as de vermelho e sensibilizando- as à foto-oxidação. A perda induzida pela foto-oxidação do gradiente de pH lisossômico e o vazamento de laranja de acridina para o citossol de lisossomas individuais foram quantificados visualmente como “perda de ppontos vermelhos” em células U2-O-S e como uma diminuição na fluorescência vermelha e um aumento na verde pelo Software Zeiss LSM DUO em fibroblastos. As atividades de catepsina total e citoplásmica (extraída com digitonina) foram medidas em amostras tratadas com digitonina usando sonda zFRAFC (Enzyme System Products) como descrito na técnica. Os espectros de fluorescência do triptofano e a dispersão de luz a 90° do lipossoma foram analisados em um tampão HEPES (20 mM de HEPES, 0,1 mM de EDTA, pH como indicado) essencialmente como descrito na técnica. As medições da ressonância de plasma de superfície foram realizadas com LUVs imobilizadas usando um sistema BIAcore 2000 como descrito na técnica. siRNA de Hsp70 (5’-GCCAUGACGAAAG ACAACAAUCUGU-3’) e um siRNA de Hsp70 de controle foram transfectados com Oligofectamina (Invitrogen). A imunodetecção foi realizada com protocolos padrão. A morte celular como apoptose e a permeabilização da membrana lisossômica foram analisadas essenciualmente como descrito na técnica. A atividade de ASM foi analisada pelo Kit de Ensaio da Esfingomielinase Arnplex Red (A12220) da Molecular Probes com as modificações descritas na técnica. A análise estatística foi realizada usando um teste T de Student de duas caudas, emparelhado e todos os grupos de dados foram testados quanto a comparabilidade de suas variações usando um teste F.

Métodos

[00534] Cultura celular e reagentes. Células de osteossarcoma humanas U-2-OS foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 6 % de soro de bezerro inativado por calor e penicilina-estreptomicina. Hsp70 transgênica e MEFs de controle apropriadas foram geradas e mantidas como descrito na técnica. Fibroblastos NPDA primários humanos foram cultivados em meio de MEF suplementado ainda com 1 % de Na-Piruvato, 1 % de HEPES, 1 % de L-Glutamina. Todas as células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera de ar umidificado com 5 % de CO2 e repetidamente testadas e descobertas negativas para micoplasma. A menos que de outro modo estabelecido, todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Denmark A/S).

[00535] Ensaios para a integridade lisossômica. Células subcontinentes incubadas com 2 pg/ml de laranja de acridina por 15 min a 37 °C foram lavadas, irradiadas e analisadas em solução salina balanceada de Hanks complementada com 3 % de soro de bezerro fetal. As células para a formação de imagem de célula única foram selecionadas de 8 áreas pré-definidas de cada reservatório no modo de luz transmitida depois que as mesmas células foram imediatamente visualizadas e expostas à luz azul de queimador de arco de mercúrio USH102 100W (Ushio electric) instalado em um suporte U- ULS100HG (Olympus) por 20 s. a microscopia de fluorescência foi realizada em microscópio invertido Olympus IX-70 com uma objetiva LCPIanFl x20 com NA = 0,40. A perda de gradiente de pH lisossômico foi quantificado pela contagem da perda de fingimento vermelho intenso. Um método mais elaborado para ensaiar a integridade lisossômica foi desenvolvido para manusear o compartimento lisossômico maior dos vários fibroblastos usados neste estudo. As células para a formação de imagem de célula única foram selecionadas de 8 áreas pré-definidas de cada reservatório no modo de luz transmitida depois que as mesmas células foram imediata e continuamente expostas a 489 nm de luz de um laser de diodo de 100 mW enquanto micrografias de varredura de laser foram capturadas a cada 330 ms em um sistema confocal Zeiss LSM LIVE DUO em dois canais definidos pelos filtros de passagem de faixa por luz a 495-555 nm (verde) e LP650 nm (vermelha). Os filmes de intervalos de tempo resultantes foram subsequentemente analisados pelo software Zeiss LSM DUO integrado. As atividades da catepsina total e citoplásmica (extraída com digitonina) foram medidas em amostras tratadas com digitonina usando sonda zFR-AFC (Enzyme System Products) como descrito na técnica.

[00536] Ensaios para a viabilidade celular. A densidade celular foi avaliada pelo ensaio de redução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrassódio (MTT, SIGMA-Aldrich) essencialmente como descrito na técnica. A morte celular como apoptose foi avaliada tingindo-se as células com 0,05 pg/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) e contando-se as células com núcleos condensados em um Microscópio fluorescente invertido Olympus IX-70 (Filtro U-MWU 330-385 nm). Para cada experimento um mínimo de oito áreas aleatoriamente escolhidas foram contadas.

[00537] Imunodeteção e microscopia. Os anticorpos primários usados incluíram anticorpos monoclonais de camundongo contra Hsp70 (2H9; gentilmente fornecido por Boris Margulis, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Rússia), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; Biogenesis), BMP (6C4), proteína-1 de membrana integral lisossômica (H5C6; desenvolvida por J. Thomas August e James E. K. Hildret e obtida do Developmental Studies Hybridoma Bank desenvolvido sob os auspícios da NICHD e mantido pela The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, USA). As proteínas separadas em 10 % de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose foram detectadas usando-se os anticorpos primários indicados, anticorpos secundários conjugados à peroxidase apropriados da Dako, reagentes de Western blotting ECL (Amersham) e Leitora de Imagem Luminescente (LASlOOOPlus, Fujifilm). Para a imunocitoquímica anticorpos secundários conjugados a Alexa Fluor®- 576 ou Alexa Fluor8-488 foram usados. Lysotracker Red® foi usado para visualização ao vivo do compartimento lisossômico. As imagens de fluorescência foram tiradas usando um microscópio de varredura a laser Zeiss Axiovert 100M. A quantificação de Lysotracker e os filmes em intervalos de tempo para a integridade lisossômica foram feitos em um sistema Zeiss LSM LIVE DUO.

[00538] Espectros de fluorescência de triptofano e a dispersão de luz a 90° de lipossoma. Os espectros de fluorescência de triptofano (RFI) e a dispersão de luz a 90° de lipossoma (RSI) foram analisadas em um tampão HEPES (20 mM de HEPES, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4 ou 6,0 como indicado) utilizando LUVs que consiste de lipídeos indicados essencialmente como descrito na técnica. Para RFI, LUVs foram adicionados em alíquotas de 10 pM e os espectros registrados depois de um período de estabilização de 20 min. Para RSI, as proteínas recombinantes foram adicionadas em alíquotas de 0,12 nmol.

[00539] Ressonância de plasma de superfície (BIAcore). Para a preparação de LUVs uma mistura de lipídeo que consiste de 10 % em mol de esfingomielina, 50 % em mol de fosfatidilcolina, 20 % em mol de colesterol e 20 % em mol de BMP dissolvidos em solventes orgânicos, foi secada sob uma corrente de argônio e reidratada em tampão de Tris/HCl (pH 7,4). A mistura foi congelada-descongelada nove vezes em nitrogênio líquido e depois em um incubador a 37 °C. Depois de banho de ultra-som por 15 min a mistura foi passada 21 vezes através de uma membrana de policarbonato com um diâmetro de poro de 100 nm. As medições de ressonância de plasma de superfície foram realizadas usando um sistema BIAcore 2000 a 25 °C. LUVs (concentração de lipídeo total 0,1 mM) foram imobilizadas na superfície de um chip sensor LI (BIAcore) em PBS (tampão de carga). O tampão de condução usado foi tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5). Como um controle, a esfingomielinase ácida (0,2 pM, 60 pl em tampão de condução) foi injetada diretamente na superfície do lipossoma. As unidades de resposta entre 4100 RU e 5250 RU foram obtidas. A proteína de interesse foi injetada em tampão de condução em uma taxa de fluxo de 20 pl/min nas concentrações indicadas. Depois da injeção uma fase de dissociação de 10 min foi anexada. No caso onde rASM seguiu rHsp70, rASM foi adicionado por 180 s depois da fase de dissociação de rHsp70 de 10 min seguida ainda por uma fase de dissociação de 10 min.

[00540] Modelagem Molecular. A análise de estrutura primária assim como a modelagem molecular foram feitas com software disponível do servidor proteômico da Expert Protein Analysis System (EXPaSy) da Swiss Institute of Bioinformatics (http://expasy.org/). A modelagem molecular foi feita com base na estrutura cristalina do domínio Hsp70-ATPase humano (código pdb: 1 S3X) e no domínio de ligação de substrato de Hsc70 humano (código pdb: 7HSC) com o Visualizador DeepView-Swiss PDB. Os modelos de superfície foram com base na interação de coulomb no pH 7,0 usando uma constante dielétrica do solvente de 80 (H2O).

[00541] Análise Estatística. A análise estatística foi realizada usando um teste T de Student de duas caudas, emparelhado de modo a avaliar a hipótese nula. O nível de corte para a significância estatística foi ajustado a 5 % e todos os grupos de dados testados quanto a comparabilidade de suas variações usando um teste F. Todas as estatísticas foram feitas em um mínimo de n = 3 experimentos independentes.

[00542] Exemplo 3: Efeito do álcool benzílico sobre a doença de armazenagem lisossômica

[00543] É mostrado nos Exemplos 2 e 3 que Hsp70 tem um efeito estabilizador de lisossoma via uma interação com BMP. De modo a avaliar se este efeito também é observado quando da exposição das células a um indutor químico de Hsp70, fibroblastos de pacientes com Niemann-Pick Tipo A (NPDA) foram tratados com o indutor de molécula pequena de Hsp70; Álcool benzílico (BA). Os resultados são mostrados na figura 11. Primeiro, as células NPDA foram tratadas com doses crescentes de BA (0, 20, 30, 35, 40, 45 mM), Usadas e anahsadas por western blotting. A mesma quantidade de proteína foi carregada em cada reservatório. A expressão da proteína de Hsp70 foi avaliada para cada condição e mostra que BA induziu a expressão de Hsp70 em uma maneira dependente da dose (anticorpo primário: Estressegen SPA-810, específico para Hsp70). Em seguida, a estabilidade de lisossomas NPDA Gõtz depois do tratamento com 40 mM de BA foi avaliada, usando os mesmos métodos como descrito no Exemplo 2. Uma estabilidade lisossômica aumentada foi observada em resposta a BA. Finalmente, a área de seção transversal lisossômica em células NPDA Gõtz depois do tratamento com 40 mM de BA foi avaliada, usando os mesmos métodos como descritos no Exemplo 2. Uma patologia diminuída é observada. ITENS Método para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a dita enzima interage com BMP, o dito método compreendendo a etapa de administrar Hsp70, ou um fragmento funcional deste, em uma forma adequada para permitir a interação entre BMP e Hsp70, ou o dito fragmento funcional deste e deste modo modular a atividade enzimática de uma enzima que interage com BMP. Método do item 1, em que Hsp70 ou o dito fragmento funcional deste forma um complexo covalente ou não covalente com BMP. Método de qualquer um dos itens precedentes, em que BMP interage com uma saposina. Método do item 3, em que a dita saposina é selecionada do grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C e saposina D. Método de qualquer um dos itens precedentes, em que a dita enzima é selecionada do grupo que consiste de esfingomielinase, esfingomielinase ácida, sialidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta- galactosilceremidase, glicosilceremidase e ceremidase ácida. Hsp70, ou um fragmento funcional desta, para o uso como um medicamento. Hsp70, ou um fragmento funcional deste, para o uso no tratamento, alívio, ou profilaxia de um distúrbio de armazenagem lisossômica. Uso do item 7, em que o dito distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste dos distúrbios de Niemann- Pick, Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry e Sialidose. Um método para aumentar a captação de um composto, o dito método compreendendo a etapa de administrar o dito composto junto com Hsp70 ou um fragmento funcional deste. Método do item 9, em que a dita Hsp70 ou um fragmento funcional desta são covalentemente ligados ao dito composto.

Claims (13)

1. Uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular de Hsp70 através da amplificação da expressão gênica de Hsp70, caracterizado pelo fato de ser no preparo um medicamento para tratar um distúrbio de armazenagem lisossômica, em que o referido agente bioativo é um derivado de hidroxilamina selecionado do grupo que consiste em bimoclomol ou análogo estrutural deste, arimoclomol, BRX-220, BRX-345 e BGP-15.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente bioativo é selecionado do grupo que consiste em arimoclomol, BRX-220 e BRX-345.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente bioativo é arimoclomol.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito agente bioativo é formulado em uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste em: doença de Niemann- Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Sialidose, leucodistrofia metacromática e deficiência de saposina.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida doeça de Niemann-Pick é selecionada do grupo que consiste em: doeça de Niemann-Pick tipo A, doeça de Niemann-Pick tipo B, doeça de Niemann-Pick tipo C e doeça de Niemann-Pick tipo D.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio de armazenagem lisossômica é um distúrbio de armazenagem de lipídeo.

8. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio de armazenagem de lipídeo é selecionado do grupo que consistem em: esfingolipidoses, gangliosidoses e leucodistrofias.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio de armazenagem lisossômica é selecionado do grupo que consiste em: mucopolissacaridoses, distúrbios de armazenagem de glicoproteína e mucolipidoses.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido agente bioativo é administrado em combinação com pelo menos outra modalidade de tratamento para distúrbio de armazenagem lisossômica.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos outra modalidade de tratamento para distúrbio de armazenagem lisossômica é uma terapia de reposição de enzima (ERT).

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida terapia de reposição de enzima é selecionada do grupo que consiste em: imiglucerase, Miglustat, agalsidase beta e agalsidase alfa.

13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos outra modalidade de tratamento é selecionada do grupo que consiste em: terapia de redução de substrato; transplantes, tais como transplante de medula óssea, transplante de sangue do cordão umbilical e transplante de células tronco; corticosteróides; analgésicos; e terapias sintómaticas e de suporte, tal como fisioterapia.

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