PT2318032E - Uso da hsp70 como um regulador da atividade enzimática - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "USO DA HSP70 COMO UM REGULADOR DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA" 0 presente pedido de patente é um pedido não-provisório do pedido de patente DK PA 00885 2008 depositado em 26 de junho de 2008.

Campo de invenção A presente invenção refere-se ao campo da modulação da atividade da enzima através da exploração da interação entre a chaperona molecular Hsp70 e do fosfolípido lisossomal Bis (monoacilglicero) fosfato (BMP, também conhecido sob a designação REAP). A interação Hsp70-BMP modula a atividade de enzimas gue interatuam com o BMP do compartimento lisossomal e a presente invenção proporciona assim um meio para reverter a patologia de doenças de armazenamento lisossómicas.

Antecedentes da invenção

As chaperonas moleculares são encontradas em todos os compartimentos de uma célula em que ocorrem rearranjos conformacionais de proteínas e embora a sintese de proteínas seja a principal fonte de péptidos desdobrados na célula, um desafio para a célula através da temperatura elevada ou de outros estímulos que possam tornar as proteínas estruturalmente lábeis, e, portanto, propensas a desdobramento e agregação, é recebido com uma resposta celular especifica envolvendo a produção de proteínas protetoras. Esta resposta é um fenómeno observado em cada tipo de célula, que vão desde procariotas a eucariotas e é referido como choque térmico ou resposta ao stress. As proteínas induzidas por esta resposta são conhecidas como 2 proteínas de choque térmico (HSPs), das quais existem várias famílias.

Um exemplo primário de uma família de chaperonas é o das proteínas Hsp70.Esta família foi recentemente implicada em outros aspetos da homeostase celular, além de servir como uma chaperona - mais marcadamente através das suas características anti-apoptóticas, das suas funções na imunidade e da dependência aparente de células cancerosas na sobreregulação da Hsp70. Além disso, as Hsp70 podem desempenhar um papel na salvaguarda da integridade lisossomal. No entanto, o mecanismo molecular manteve-se, por conseguinte, por clarificar.

As doenças relacionadas com o armazenamento lisossomal são um grupo raro de doenças, caracterizado pela acumulação de substâncias no compartimento lisossomal, resultando na destabilização deste, com um efeito resultante devastador para os indivíduos afetados. As substâncias acumulam-se no compartimento lisossomal devido a deficiências nas enzimas envolvidas no seu catabolismo.

Até à data, não existe tratamento disponível para a maioria das doenças relacionadas com o armazenamento lisossomal.A causa subjacente a este grupo de doenças é a incapacidade das enzimas lisossomais específicas para catabolizar eficientemente as substâncias lisossomais específicas, tais como lípidos. Portanto o uso da terapia de substituição enzimática (ERT), através do fornecimento a um paciente da enzima recombinante, tem sido empregue para um subconjunto destas doenças, incluindo a doença de Gaucher e a doença de Fabry. No entanto, a ERT é uma forma muito dispendiosa de terapia que pode limitar o seu uso em algumas áreas e também é eficaz apenas para um tipo específico de doença para a qual a enzima recombinante foi produzida. A presente 3 invenção destina-se a proporcionar novos meios para tratar os distúrbios relacionados com o armazenamento lisossomal.

Sumário da invenção

Na presente invenção, a base molecular para a contribuição das Hsp70 para a estabilidade da membrana lisossomal é divulgada, fornecendo um entendimento da base molecular para a associação entre as Hsp70 e as membranas celulares -em particular as membranas plasmáticas e lisossómicas. É sabido com base na bibliografia que as Hsp70 podem assumir um papel na manutenção da integridade lisossomal.No entanto, o mecanismo molecular permanece por clarificar. Além disso, a questão relativamente a se este atributo é especifico para as principais Hsp70 induzidas por stress (HspAlA/Al B - designadas Hsp70 ao longo deste estudo) ou se outros membros da familia Hsp70 poderiam ter a mesma caracteristica, também não tinha sido endereçada.

Estas perguntas não respondidas conduziram a um dos principais objetivos da presente invenção, que foi investigar a base molecular para o efeito protetor do lisossoma das Hsp70. Para este fim, foi estabelecido um método para a produção da Hsp70 recombinante e seus mutantes, assim como um protocolo de fracionamento subcelular baseado em ultracentrifugação com gradiente de iodixanol. Um ensaio para a avaliação direta da integridade da membrana lisossomal foi estabelecido com base na permeabilização induzida por foto-oxidação dos lisossomas, o que permitiu uma abordagem microscópica em tempo real para avaliar o efeito das Hsp70 e de outros componentes no que diz respeito à sua capacidade para sensibilizar ou proteger as membranas lisossómicas. A interação das Hsp70 recombinantes e mutantes com diversos lipidos foi investigada em diferentes sistemas in vitro, incluindo 4 medições de dispersão de luz no lipossoma 90 T, os desvios da fluorescência no triptofano e por ressonância de plasmão de superfície (BIAcore). A criação de um modelo conceptual para a interação Hsp70-BMP foi auxiliada pela modelação de superfície eletrostática in silico das Hsp70. A fim de verificar a relevância in vivo da interação lipídica testemunhada nos sistemas in vitro, a interação BMP-Hsp70 foi dirigida relativamente a ambos os componentes. Para melhor demonstrar a viabilidade de explorar este mecanismo, o modo de morte celular induzida pela administração de cisplatina foi caracterizado e a Hsp70 lisossomal foi dirigida neste sistema de morte celular, tanto em cancro, como em linhas celulares não transformadas. A fim de endereçar a base molecular à contribuição das Hsp70 para a estabilidade da membrana lisossómica, os inventores procuraram estabelecer um sistema que pudesse eliminar a influência da Hsp70 citosólica, i.e., era necessário direcionar as Hsp70 diretamente para os lisossomas. As imagens de microscopia eletrónica por Nylandsted et al. mostraram que as Hsp70 podem estar presentes dentro dos lisossomas e que se decidiu assim estabelecer um método para a produção da Hsp70 humanas recombinantes (rHsp70) e esperando explorar a maquinaria endocítica como uma via de entrega da rHsp70 diretamente nos lisossomas. Os presentes inventores decidiram contornar a necessidade de adicionar sinais de classificação lisossomal para as Hsp70, potencialmente disrompendo a função e evitando complicações que podem resultar devido à sobre-expressão. Uma abordagem endocítica permitiria ainda uma titulação das quantidades da rHsp70 e numa perspetiva qa longo prazo abre possibilidade ao estudo do mecanismo de captação da Hsp70 extracelular. 5

Tendo estabelecido o método para a produção das Hsp70, foi então marcada com o fluoróforo Alexa Fluor 488 (Hsp70- AF488), a fim de validar a sua endocitose. 0 imageamento confocal revelou que a rHsp70 poderia realmente ser dirigida aos lisossomas deste modo. A fim de avaliar o impacto sobre a estabilidade da membrana lisossomal, os inventores estabelecem de seguida um método para a quantificação da permeabilização da membrana lisossomal, ao nivel dos lisossomas individuais e utilizaram este método para avaliar o efeito da rHsp70 endocitada. Estes métodos formaram a base para os Exemplos 1 e 2, nos quais os inventores demonstram que a Hsp70 aumenta a sobrevivência das células por estabilização dos lisossomas através de uma ligação de afinidade elevada, dependente do pH, ao fosfolipido endo-lisossomal aniónico bis (monoacil-glicero) fosfato (BMP). 0 domínio ATPase carregado positivamente da Hsp70 é responsável pela ligação mas o domínio de ligação ao substrato é também necessário para a estabilização eficaz dos lisossomas. Curiosamente, esta interação e a proteção que oferece, é dependente do triptofano 90, que está localizado na fatia carregada positivamente do domínio ATPase. De um modo importante, o efeito citoprotetor poderia ser obtido por entrega endocítica da rHsp70 e especificamente revertida por administração extracelular de anticorpos BMP ou de inibidores Hsp70.

Além disso, os inventores procuraram também acoplar o mecanismo de proteção das Hsp70 das membranas lisossómicas aos eventos da tumorigénese e morte celular programada. Os inventores caracterizaram assim o programa de morte celular iniciado por administração de um agente quimioterapêutico comum, a cisplatina e verificaram que o mesmo é independente das caspases, mas é caracterizado pela libertação lisossomal de proteases. A Hsp70 transgénica, assim como a endocitada, é capaz de aumentar a 6 sobrevivência das células em face do desafio colocado pela cisplatina ao estabilizar as membranas lisossómicas. Curiosamente, os inventores demonstram que quer dirigindo a própria Hsp70 lisossomal, ou a sua interação lisossomal parceira do bis (monoacil-glicero) fosfato (BMP), sensibilizam as linhas celulares da próstata transformadas, mas não as não transformadas, com a cisplatina, o que fornece evidência experimental para explorar a interação BMP-Hsp70 como um alvo farmacológico para a terapia do cancro.

Curiosamente a Hsp70-2, embora partilhando uma homologia de 8 6% em aminoácidos com a Hsp7 0, não foi capaz de proteger as membranas lisossómicas diretamente. No entanto, a depleção de Hsp70-2 também resulta na permeabilização da membrana lisossómica e subsequente morte celular programada. Este efeito não depende de uma interação direta entre a Hsp70-2 e o compartimento lisossomal, mas é bastante orquestrada através da sub-regulação do Fator de Crescimento Derivado do Epitélio da Córnea (LEDGF), em resposta à depleção em Hsp70-2.

Os métodos e os resultados desta investigação são abordados em mais detalhe na secção de Exemplos.

Tendo elucidado aqui a base molecular do efeito citoprotetor da Hsp70 através de uma interação com o BMP lisossomal para promover a estabilização lisossomal, estes resultados fornecem a base para o direcionamento terapêutico às doenças dos reservatórios lisossomais.

Foi agora demonstrado que, surpreendentemente, proporcionando Hsp70 recombinantes às células reverte-se de forma eficiente a patologia das doenças do armazenamento 7 lisossomal, como aqui apresentado para a doença de Niemann-Pick e a doença de Farber. A presente invenção proporciona assim um método para o tratamento de doenças de armazenamento lisossómicas, aumentando a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70 em indivíduos com essa necessidade, proporcionando Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. A presente invenção refere-se, em um aspeto, a um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp7 0 para uso como um medicamento ou para utilização no tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal.

Em uma forma de realização, o referido agente bioativo é a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. É também um aspeto da presente invenção proporcionar um método para o tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal compreendendo a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo.

Em uma forma de realização, o referido tratamento é profilático, curativo ou para melhoramento.

Em uma forma de realização, a referida doença do armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo na doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, Sialidose, leucodistrofia metacromática e deficiência em saposrna.

Em outra forma de realização, a referida doença do armazenamento lisossomal é caracterizada como tendo atividade enzimática residual da enzima defeituosa envolvido na patologia da doença. A presente invenção também diz respeito ao tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal compreendendo o agente bioactivo de acordo com a presente invenção, em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento.

Num outro aspeto, a presente invenção refere- se a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, para utilização como um medicamento.

De preferência, a Hsp70 ou o seu referido fragmento funcional ou a sua variante, forma um complexo covalente ou não covalente com o BMP.

De preferência, o BMP interatua com uma saposina.

De preferência, a referida saposina é selecionada a partir do grupo consistindo em saposina A, saposina B, saposina C, e saposina D.

De preferência, a referida enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em esfingomielinase, esfingomielinase ácida, sialidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-galactosilceremidase, glucosilceremidase e ceremidase ácida.

Preferencialmente, a referida modulação da atividade enzimática é uma sobre-regulação da atividade enzimática da referida enzima. 9

Num outro aspeto, a presente invenção diz respeito à Hsp70, ou a um seu fragmento funcional ou uma sua variante, para utilização como um medicamento. Preferencialmente, a referida Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode ser utilizada no tratamento, alivio, ou profilaxia de uma doença do armazenamento lisossomal, tais como as desordens de Niemann-Pick, de Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry e Sialidose.

Uma forma de realização da invenção diz respeito a um método para a sobre-regulação de uma atividade enzimática de uma enzima associada a um distúrbio do armazenamento lisossomal, como a doença de Niemann-Pick, Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry, e sialidose. De preferência, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é o de Niamann-Pick.

Uma vez que as doenças do armazenamento lisossomal são causadas pela atividade enzimática insuficiente, é objetivo da presente invenção aumentar a atividade enzimática, a fim de aliviar ou curar a doença. A Hsp70 foi demonstrada como interagindo com o BMP. Uma vez que o BMP atua como um co-factor para várias outras proteínas, a interação entre a Hsp70 e o BMP podem modular a função destas várias outras proteínas. Por exemplo, o BMP atua como um co-fator para aSMase. Assim, a interação entre as proteínas Hsp70 e BMP pode aumentar a atividade da aSMase. Como o distúrbio de Niemann-Pick está associado com um decréscimo na atividade da aSMase, a Hsp70 pode aliviar ou curar o distúrbio de Niemann-Pick, aumentando a atividade da aSMase. De um modo semelhante, o BMP atua como um co-factor para a saposina A, saposina, B, saposina C e saposina D. Estas proteínas saposina estão implicadas em outras desordens de armazenamento lisossómicas e, portanto, a Hsp70 pode aliviar ou curar outras desordens de 10 armazenamento lisossómicas, aumentando a atividade de uma saposina ou de uma enzima associada à referida saposina.

Em uma forma de realização da invenção, a Hsp70 é administrada em conjunto com a terapia de substituição enzimática no tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal. Deste modo, a quantidade de enzima necessária pode ser significativamente reduzida devido ao efeito de ativação da enzima da Hsp70.

Definições e abreviaturas

aSMase / Esfingomielinase acídica ASM ADD70: AIF: AO: Apaf-1: Bag-1: Bcl-2: Bid: BMP: CARD: Caspase: CHIP: CytC: DD: DED: dsARN: eHsp7 0: ER: ERT FADD: HIP: HRP:

Chamariz derivado do AIF para a Hsp70 fator indutor da apoptose laranja de acridina

fator de ativação da protease apoptótico-1 atanogene-1 associado ao Bcl-2 linfoma/leucemia 2 das células B agonista da morte do domínio de interação com o BH3

Bis(monoacilglicero)fosfato domínio de recrutamento da caspase Protease específica para aspartato-cisteína terminação carboxilo da proteína de ligação à Hsp7 0

Citocromo C domínio de morte

Domínio efetor da morte ARN de cadeia dupla

Hsp70 extracelular retículo endoplasmático terapia de substituição enzimática proteína contendo um domínio de morte associado ao Fas proteína de interação com a Hsp70 peroxidase de rábano 11 HS : choque/stress térmico HSE : elemento de choque térmico HSF: fator de choque térmico Hsp: proteína de choque térmico HspBPl: proteína de choque térmico Proteína de Ligação 1 IAP: inibidor da proteína de apoptose IMEF fibroblastos embrionários murínicos imortalizados JNK: c-jun NH2- cinase terminal LAMP-1/-2 : Proteína de membrana associada ao Lisossoma 1/-2 REAP: Ácido lisobisfosfatídico LEDGF: Fator de crescimento derivado do epitélio da córnea LMP: permeabilização da membrana lisossomal MIC-1: citocina inibitória dos macrófagos 1 MOMP: permeabilização da membrana exterior mitocondrial MPR recetor de manose-6 fosfato MTT : Brometo de 3 - (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5- difenil-2H-tetrazólio

NPD doença de Niemann-Pick NPDA Doença de Niemann-Pick, tipo A NPDB Doença de Niemann-Pick, tipo B NPDC Doença de Niemann-Pick, tipo C NPDD Doença de Niemann-Pick, tipo D PCD: morte celular programada PKC: proteína cinase C POPC: Palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina POPS: Palmitoil-oleoil-fosfatidilserina RNAi : ARN de interferência ROS : espécies reativas de oxigénio DP: desvio-padrão siRNA: ARN de interferência reduzida Smac/Diablo: Segundo ativador de caspases derivado das mitocôndrias tBid: Bid truncado TNF: fator de necrose tumoral TNFR: recetor TNF TRADD: proteína do domínio de morte associada ao TNFR TRADD: 12

TRAF: fator associado ao TNFR

Doença do armazenamento lisossomal (LSD): Os termos "distúrbio do armazenamento lisossomal" e "doença do armazenamento lisossomal" são usados como sinónimos.

Fragmento funcional da Hsp70: 0 termo "fragmento funcional da Hsp70" deve ser interpretado no sentido de representar qualquer fragmento da Hsp70 tendo a função desejada. Em relação à modulação da atividade enzimática, um seu fragmento funcional é um fragmento capaz de modular a atividade enzimática. Em relação ao aumento da absorção de uma substância, um seu fragmento funcional da Hsp70 é um fragmento capaz de aumentar a captação da referida substância. É apreciado que o efeito quantitativo exato do fragmento funcional pode ser diferente do efeito da molécula de comprimento completo. Em alguns casos, o fragmento funcional pode de facto ser mais eficaz do que a molécula de comprimento completo. Além disso, a utilização de fragmentos em vez das moléculas de comprimento total pode ser vantajosa, tendo em conta o menor tamanho dos fragmentos.

Variante funcional da Hsp70: 0 termo "variante funcional da Hsp70" deve ser interpretado no sentido de qualquer variante da Hsp70 tendo a função desejada. Em relação à modulação da atividade enzimática, uma variante funcional é uma variante capaz de modular a atividade enzimática. Em relação ao aumento da captação de uma substância, uma variante funcional da Hsp70 é um fragmento capaz de aumentar a captação da referida substância. É apreciado que o efeito da quantidade exata da variante funcional possa ser diferente do efeito da molécula de comprimento completo. Em alguns casos, a variante funcional pode de 13 facto ser mais eficaz do que a molécula de comprimento completo.

Um "agente bioativo" (isto é, a substância/agente biologicamente ativo) é qualquer agente, fármaco, composto, composição de matéria ou mistura que proporciona um efeito farmacológico, frequentemente benéfico, que pode ser demonstrado in vivo ou in vitro. Tal como aqui utilizado, este termo inclui ainda qualquer substância fisiológica ou farmacologicamente a tiva que produz um efeito localizado ou sistémico em um indivíduo. Outros exemplos de agentes bioativos incluem, mas não estão limitados a, agentes compreendendo ou consistindo num oligossacarideo, agentes compreendendo ou consistindo num polissacarideo, agentes compreendendo ou consistindo num péptido, opcionalmente glicosilado, agentes compreendendo ou consistindo num polipéptido opcionalmente glicosilado, agentes compreendendo ou consistindo num ácido nucleico, agentes compreendendo ou consistindo num oligonucleótido, agentes compreendendo ou consistindo num polinucleótido, agentes compreendendo ou consistindo num lipido, agentes compreendendo ou consistindo num ácido gordo, agentes compreendendo ou consistindo num éster de ácido gordo e agentes compreendendo ou consistindo em metabolitos secundários. Pode ser usado tanto profilaticamente, terapeuticamente, em associação com o tratamento de um indivíduo, tal como um ser humano ou qualquer outro animal. Como aqui utilizado, um agente bioativo é uma substância capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70.

Os termos "fármaco" ou "medicamento" como aqui utilizados incluem substâncias biologicamente, psicologicamente ou farmacologicamente ativas que atuam localmente ou sistemicamente no corpo humano ou animal. 14

Os termos "tratando", "tratamento" e "terapia" como aqui utilizados referem-se igualmente a terapia curativa, profilática ou terapia preventiva e terapia paliativa ou de melhoramento. 0 termo inclui uma abordagem para a obtenção dos resultados fisiológicos benéficos ou desejados, os quais podem ser estabelecidos clinicamente. Para efeitos desta invenção, os resultados clinicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alivio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, condição estabilizada (isto é, o não agravamento) atraso ou diminuição da progressão ou agravamento do estado / sintomas, melhoria ou paliação da condição ou sintomas e remissão (quer parcial ou total), quer seja detetável ou indetetável. 0 termo "paliação" e suas variações, tal como aqui utilizado, significa que a extensão e/ou manifestações indesejáveis de um estado fisiológico ou sintoma são diminuídas e/ou o curso de tempo da progressão é retardado ou alongado, em comparação com a não administração de composições da presente invenção.

Um "efeito do tratamento" ou "efeito terapêutico" é manifestado se existe uma alteração na condição a ser tratada, tal como medida pelos critérios que constituem a definição dos termos "tratando" e "tratamento". Há uma "mudança" na condição a ser tratada se houver pelo menos 5% de melhoria, de preferência 10% de melhoria, mais preferencialmente pelo menos 25%, ainda mais preferencialmente pelo menos 50%, tal como pelo menos 75% e mais preferencialmente pelo menos 100% de melhoria. A mudança pode ser baseada em melhorias na gravidade da condição tratada num indivíduo, ou numa diferença na frequência das condições melhoradas em populações de indivíduos com e sem tratamento com o agente bioativo, ou 15 com o agente bioativo em combinação com uma composição farmacêutica da presente invenção. A "quantidade farmacologicamente eficaz", "quantidade farmaceuticamente eficaz" ou a "quantidade fisiologicamente eficaz de um "agente bioativo" é a quantidade de um agente ativo presente numa composição farmacêutica tal como aqui descrito, que é necessário para fornecer um nivel desejado do agente ativo na corrente sanguinea ou no local de ação num individuo (por exemplo, os pulmões, o sistema gástrico, o sistema coloretal, a próstata, etc), a ser tratado de modo a dar uma resposta fisiológica antecipada quando tal composição é administrada. A quantidade exata dependerá de numerosos factores, por exemplo, o agente ativo, a atividade da composição, o dispositivo de distribuição empregue, as caracteristicas fisicas da composição, o uso pretendido no paciente (isto é, o número de doses administradas por dia), as considerações dos doentes e semelhantes, e pode ser prontamente determinada por um perito na arte, com base na informação aqui fornecida. Uma "quantidade eficaz" de um agente bioactivo pode ser administrada numa única administração, ou através de administrações múltiplas de uma quantidade que totalizam uma quantidade eficaz, de preferência dentro de um periodo de 24 horas. Ela pode ser determinada utilizando procedimentos clinicos normalizados para a determinação das quantidades apropriadas e do tempo de administração. Entende-se que a "quantidade eficaz" pode ser o resultado da determinação empirica e/ou individualizada (caso a caso) da parte do profissional de cuidados médicos e/ou do individuo.

Os termos "potenciação" e "melhoria" um efeito benéfico e suas variações, tal como aqui utilizados, referem-se ao 16 efeito terapêutico do agente bioativo contra um placebo, ou um aumento do efeito terapêutico de um tratamento médico do estado-da-arte acima do que normalmente se obtém quando uma composição farmacêutica é administrada sem o agente bioactivo da presente invenção. "Um aumento nos efeitos terapêuticos" manifesta-se quando há uma aceleração e/ou um aumento da intensidade e/ou da extensão dos efeitos terapêuticos obtidos como resultado da administração do(s) agente (s) bioativo(s). Também se inclui a extensão da longevidade dos benefícios terapêuticos. Também se pode manifestar onde uma quantidade menor da composição farmacêutica é necessária para obter os mesmos benefícios e / ou efeitos quando é co-administrada com agente(s) bioativo(s) fornecido(s) pela presente invenção, em comparação com a administração de uma quantidade mais elevada da composição farmacêutica na ausência do agente bioativo. 0 efeito potenciador de preferência, mas não necessariamente, resulta no tratamento de sintomas agudos para os quais a composição farmacêutica por si só não é eficaz ou é menos eficaz terapeuticamente. A potenciação é conseguida quando existe pelo menos um aumento de 5% nos efeitos terapêuticos, tais como um aumento de pelo menos 10% nos efeitos terapêuticos quando um agente bioativo da presente invenção é co-administrado com uma composição farmacêutica em comparação com a administração da composição farmacêutica isolada. De preferência o aumento é de, pelo menos 25%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 100%. "Coadministrar" ou a "co-administração" do(s) agente(s) bioativo(s), ou agentes bioativos e medicamentos do estado da técnica, tal como aqui utilizados, referem-se a administração de um ou mais agentes bioativos da presente invenção, ou à administração de um ou mais agentes 17 bioativos da presente invenção e uma composição farmacêutica do estado-da-arte dentro de um determinado período de tempo. 0 período de tempo é, de preferência menos de 72 horas, tal como 48 horas, por exemplo menos de 24 horas, tal como menos de 12 horas, por exemplo menos de 6 horas, tal como menos de 3 horas. No entanto, estes termos também significam que o agente bioativo e uma composição terapêutica podem ser administrados em conjunto. 0 termo "individual" refere-se aos vertebrados, em particular a um determinado membro de uma espécie de mamífero, preferencialmente primatas incluindo os seres humanos. Em uma forma de realização preferida, um indivíduo, como aqui utilizado, é um ser humano, macho ou fêmea, de qualquer idade.

Um "indivíduo com necessidade do mesmo" refere-se a um indivíduo que pode beneficiar da presente invenção.Em uma forma de realização, o referido indivíduo em necessidade do mesmo é um indivíduo doente, em que a referida doença é uma doença do armazenamento lisossomal. 0 termo "nucleótido natural" ou "nucleótido" refere-se a qualquer um dos quatro desoxirribonucleótidos, dA, dG, dT e dC (constituintes do ADN), e os quatro ribonucleótidos A, G, U e C (constituintes de ARN) , tal como encontrados na natureza. Cada nucleótido natural compreende ou consiste essencialmente de uma porção açúcar (ribose ou desoxirribose), uma porção fosfato e uma porção de base natural / padrão. nucleótidos naturais ligam-se a nucleótidos complementares de acordo com regras bem conhecidas do emparelhamento de bases (Watson e Crick), onde a adenina (A) emparelha com a timina (T) ou uracilo (U) e onde a guanina (G) emparelha com a citosina (C), em que os correspondentes pares de bases são parte de cadeias 18 de nucleótidos complementares, anti-paralelos. 0 emparelhamento das bases resulta numa hibridização específica entre os nucleótidos predeterminados e complementares. 0 emparelhamento de bases é a base através da qual as enzimas são capazes de catalisar a síntese de um oligonucleótido complementar ao oligonucleótido molde. Nesta síntese, os blocos de construção (normalmente os trifosfatos de ribo ou desoxiribo derivados de A, T, U, C ou G) são dirigidos por um oligonucleótido molde para formar um oligonucleótido complementar com a sequência correta, complementar. 0 reconhecimento de uma sequência oligonucleotídica pela sua sequência complementar é mediado por bases correspondentes e interagindo, formando pares de bases. Na natureza, as interações específicas que levam ao emparelhamento de bases são reguladas pelo tamanho das bases e pelo padrão de dadores de ligações de hidrogénio e aceitadores das bases. A base de purina grande (A ou G) emparelha com uma base de pirimidina pequena (T, U ou C) . Além disso, o reconhecimento do par de bases entre as bases é influenciado por ligações de hidrogénio formadas entre as bases. Na geometria do par de bases de Watson-Crick, um anel de seis membros (uma pirimidina em oligonucleótidos naturais) é justaposto a um sistema de anéis composto por um anel de seis membros fundido e por um anel de cinco membros (uma purina em oligonucleótidos naturais), com uma ligação de hidrogénio média, ligando dois átomos do anel, e ligações de hidrogénio em ambos os lados juntando grupos funcionais anexos a cada um dos anéis, com grupos doadores emparelhados com grupos aceitadores.

Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a polinucleótidos, tais como o ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos gerados pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e os fragmentos 19 gerados por qualquer ação de ligação, cisão, ação de endonuclease e ação de exonuclease. As moléculas de ácido nucleico podem ser compostas por monómeros que são nucleótidos que ocorrem naturalmente (como o ADN e ARN), ou análogos dos nucleótidos de ocorrência natural (por exemplo, as formas alfa-enantioméricas de nucleótidos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos. Os nucleótidos modificados podem ter alterações em porções de açúcar e/ou em porções com base de pirimidina ou purina. As modificações da porção açúcar incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxilo com halogéneos, grupos alquilo, aminas, e grupos azido, ou açúcares que podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a porção açúcar inteira pode ser substituída com estruturas semelhantes, estéria e electronicamente, tais como aza-açúcares e análogos carbocíclicos de açúcar. Os exemplos de modificações numa porção de base incluem as purinas e pirimidinas alquiladas, purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros bem conhecidos substitutos heterocíclicos. Os monómeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Os análogos das ligações fosfodiéster incluem o fosforotioato, fosforoditioato, o fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e semelhantes. 0 termo "molécula de ácido nucleico" também inclui por exemplo os chamados "ácidos nucléicos peptídicos", que compreendem as bases dos ácidos nucleicos de ocorrência natural ou modificados ligados a um suporte principal de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. 0 termo "complemento de uma molécula de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleótidos complementar e orientação inversa quando comparada com uma sequência de nucleótidos de 20 referência. Por exemplo, a sequência 5 'ATGCACGGG 3' é complementar a 5 'CCCGTGCAT 3'.

Uma "molécula de ácido nucleico isolado" é uma molécula de ácido nucleico que não está integradoa no ADN genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de ADN que codifica para um fator de crescimento que foi separada a partir do ADN genómico de uma célula, é uma molécula de ADN isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico quimicamente sintetizada que não está integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucleico que foi isolada a partir de uma espécie particular é menor que a molécula de ADN completa de um cromossoma dessa espécie.

Um "constructo de molécula de ácido nucleico" é uma molécula de ácido nucléico, de cadeia simples ou dupla, que foi modificada por meio de intervenção humana para conter segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos num arranjo não existente na natureza. O "ADN linear" indica moléculas não circulares de ADN possuindo extremidades livres 5 'e 3'.O ADN linear pode ser preparado a partir de moléculas de ADN circulares fechadas, tais como plasmídeos, por digestão enzimática ou rutura fisica. O "ADN complementar (cADN)" é uma molécula de ADN de cadeia simples que é formada a partir de um molde de mARN pela enzima transcritase reversa. Tipicamente, um iniciador complementar a porções de mARN é empregue para a iniciação da transcrição reversa. Os peritos na arte também usam o termo "cADN" para se referir a uma molécula de ADN de cadeia dupla consistindo numa tal molécula de ADN de cadeia simples e na sua cadeia de ADN complementar. O termo "cADN" 21 também se refere a um clone de uma molécula de cADN sintetizado a partir de um molde de ARN. 0 "ADN heterólogo" refere-se a uma molécula de ADN, ou a uma população de moléculas de ADN, que não existe naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. As

moléculas de ADN heterólogo para uma determinada célula hospedeira podem conter ADN derivado da espécie da célula hospedeira (í.e., o ADN endógeno), desde que tal ADN hospedeiro seja combinado com o ADN não hospedeiro (i.e. ADN exógeno). Por exemplo, uma molécula de ADN contendo um segmento de ADN não-hospedeiro que codifica para um polipéptido ligado operativamente a um segmento de ADN hospedeiro compreendendo um promotor da transcrição é considerada como sendo uma molécula de ADN heterólogo. Inversamente, uma molécula de ADN heterólogo pode compreender um gene endógeno operativamente ligado a um promotor exógeno. Como outra ilustração, uma molécula de ADN compreendendo um gene derivado de uma célula de tipo selvagem é considerada como sendo ADN heterólogo se essa molécula de ADN for introduzida numa célula mutante que não tem o gene de tipo selvagem.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácidos, de preferência unidos exclusivamente por ligações peptídicas, quer seja produzido naturalmente ou sinteticamente. Um polipéptido produzido por expressão de uma molécula de ADN não-hospedeiro é um péptido ou polipéptido "heterólogo". 0 termo "polipéptido" tal como aqui utilizado abrange proteínas, péptidos e polipéptidos, em que as referidas proteínas, péptidos ou polipéptidos podem ou não ter sido modificados após a tradução. A modificação pós-traducional pode ser, por exemplo, a fosforilação, a metilação e a glicosilação. 22 0 termo "expressão" refere-se à biossíntese de um gene ou de um produto de um gene. 0 termo "hibridar" significa o emparelhamento de cadeias de ácido nucleico de fontes diferentes, isto é, para formar pares de bases entre regiões complementares de duas cadeias de ADN que não estavam originalmente emparelhadas. 0 termo "hibridização sob condições estringentes" é definido de acordo com Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1,101-1,104. De preferência, a hibridação sob condições estringentes significa que após a lavagem durante 1 h com SSC IX e SDS 0,1% a 50° C, preferencialmente a 55° C, mais preferencialmente a 62° C e mais preferencialmente a 68° C, em particular durante 1 h em SSC 0,2X e SDS 0,1% a 50° C, de preferência a 55°C, mais preferencialmente a 62° C e mais preferencialmente a 68° C, um sinal de hibridação positiva é observado.

Uma extensão da "homologia completa" é definida como um jogo de emparelhamento dos nucleótidos ao longo da sequência dos nucleótidos que interatuam; em ARNs que ocorrem naturalmente, o emparelhamento de A com U e G com C.

Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos que dirige a transcrição de um gene estrutural. Tipicamente, um promotor está localizado na região 5' não codificante de um gene, próxima ao local de inicio da transcrição de um gene estrutural. Os elementos da sequência compreendidos nos promotores que funcionam no inicio de transcrição são frequentemente caracterizados por sequências de nucleótidos de consenso. Se um promotor é um promotor indutivel, então a taxa da transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, a taxa de transcrição não é regulada 23 por um agente indutor se o promotor for um promotor constitutivo. Os promotores reprimíveis também são conhecidos.

Um "elemento regulador" é uma sequência de nucleótidos que modula a atividade de um promotor.Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma sequência de nucleótidos que se liga a fatores celulares que permitem a transcrição exclusivamente ou, preferencialmente, em células particulares, tecidos ou organelos. Estes tipos de elementos reguladores estão normalmente associadas a genes que são expressos de modo "especifico para a célula", "específico para o tecido", ou "especifico para o organelo".

Um "potenciador" é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficiência da transcrição, independentemente da distância ou da orientação do potenciador em relação ao local de inicio da transcrição. 0 "vetor de clonagem" é uma molécula de ácido nucleico, tal como um plasmídeo, cosmideo ou bacteriófago que tem a capacidade de se replicar autonomamente numa célula hospedeira. Os vetores de clonagem contêm tipicamente um ou um pequeno número de endonucleases de restrição, locais de reconhecimento que permitem a inserção de uma molécula de ácido nucleico de uma forma determinável sem perda de uma função biológica essencial do vetor, bem como das sequências de nucleótidos que codificam para um gene marcador que é adequado para utilizar na identificação e seleção das células transformadas com o vetor de clonagem. Os genes marcadores incluem tipicamente genes que proporcionam resistência à ampicilina ou à tetraciclina. 24

Um "vetor de expressão" é uma molécula de ácido nucleico que codifica para um gene que é expresso numa célula hospedeira.Tipicamente, um vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene e um terminador da transcrição. A expressão genética é geralmente colocada sob o controlo de um promotor e um tal gene é referido como sendo "operacionalmente ligado" ao promotor. De um modo semelhante, um elemento regulador e um promotor central são operacionalmente ligados, se o elemento regulador modula a atividade do promotor central. Os vetores mais simples chamados "vetores de transcrição" apenas são capazes de ser transcritos mas não traduzidos: eles podem ser replicados numa célula alvo, mas não expressos, ao contrário dos vetores de expressão. Os vetores de transcrição são usados para amplificar a sua inserção.

Um "hospedeiro recombinante" é uma célula que contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. A transfeção descreve a introdução de material estranho em células eucarióticas.0 termo "transfeção" para métodos não virais é o mais frequentemente usado em referência a células de mamíferos, enquanto que "transformação" é o termo preferido para descrever transferência de ADN não-viral em bactérias e células eucariotas não animais, tais como fungos, algas e plantas. Ambos os métodos químicos e fisicos podem ser empregues para transfetar células.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácidos, de preferência associado exclusivamente por ligações peptídicas, quer seja produzido naturalmente ou sinteticamente. Um polipéptido produzido por expressão de uma molécula de ADN não-hospedeiro é um péptido ou polipéptido "heterólogo". 0 termo "polipéptido" tal como 25 aqui utilizado abrange proteínas, péptidos e polipéptidos, em que as referidas proteínas, péptidos ou polipéptidos podem ou não ter sido modificadas após a tradução. A modificação pós-traducional pode ser, por exemplo, a fosforilação, metilação e glicosilação.

Um "residuo de aminoácido" pode ser um residuo de aminoácido natural ou não-natural ligado através de ligações peptídicas ou ligações diferentes das ligações peptidicas. Os residuos de aminoácidos podem estar na configuração D ou na configuração L. Um residuo de aminoácido compreende uma parte terminal amino (NH 2) e uma parte terminal carboxi (COOH), separadas por uma parte central que compreende um átomo de carbono, ou uma cadeia de átomos de carbono, pelo menos, um dos quais compreende pelo menos uma cadeia lateral ou um grupo funcional. 0 NH 2 refere-se ao grupo amino presente no final da terminação amino de um aminoácido ou péptido, e o COOH refere-se ao grupo carboxi presente na extremidade da terminação carboxi de um aminoácido ou péptido. 0 termo genérico aminoácido compreende ambos aminoácidos naturais e não naturais. Os aminoácidos naturais de nomenclatura padrão como listados em J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) e adotados em 37 CFR, secção 1,822 (b) (2) pertencem ao grupo dos aminoácidos listados na Tabela 1 aqui abaixo. Os aminoácidos não naturais são aqueles que não se encontram listados na Tabela 1. Os exemplos de aminoácidos não naturais são aqueles listados, por exemplo, em 37 CFR secção 1,822 (b) (4), todos os quais são aqui incorporados por referência. Além disso, os residuos de aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a, residuos de aminoácidos modificados, residuos de L-aminoácidos e estereoisómeros dos residuos de D-aminoácidos.

Tabela 1. Aminoácidos naturais e respectivos códigos 26 Símbolos Aminoácido 1 Letra 3 Letras Y Tyr G Gly F Phe M Met A Ala S Ser I Ile L Leu T Thr V Vai P Pro K Lys H His Q Gin E Glu W Trp R Arg D Asp N Asn C Cys

Tirosina

Glicina

Fenilalanina

Metionina

Alanina

Serina

Isoleucina

Leucina

Treonina

Valina

Prolina

Lisina

Histidina

Glutamina Ácido glutâmico

Triptofano

Arginina Ácido aspartico

Asparagina

Cisteína

Um "resíduo de aminoácido equivalente" refere-se a um residuo de aminoácido capaz de substituir um outro resíduo de aminoácido num polipéptido sem alterar substancialmente a estrutura e/ou funcionalidade do polipeptideo. Os aminoácidos equivalentes têm assim propriedades semelhantes, tais como volume da cadeia lateral, polaridade da cadeia lateral (polar ou não polar), hidrofobicidade (hidrofóbico ou hidrofílico) , pH (ácido, neutro ou básico) e organização da cadeia lateral de moléculas de carbono (Aromático / alifático) . Como tal, os "resíduos de 27 aminoácidos equivalentes" podem ser considerados como "substituições de aminoácidos conservadoras". A classificação de aminoácidos equivalentes refere-se, numa forma de realização, às seguintes classes: 1) HRK, 2) DENQ, 3) C, 4) ST PAG, 5) MILV e 6) FYW [0072 Na aceção do termo "substituição de um aminoácido equivalente" como aqui aplicado, um aminoácido pode ser substituido por outro, numa forma de realização, dentro dos grupos de aminoácidos aqui indicados abaixo: i) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin , Ser, Thr, Tyr e Cys) ii) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, e Met) iii) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala Vai, Leu, Ile) iv) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) v) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp) vi) Os aminoácidos possuindc > cadeias laterais ácidas (Asp, Glu) vii) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His) viii) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais de amida (Asn, Gin) ix) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais hidroxilo (Ser, Thr) X) Os aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre (Cys, Met), xi) Os aminoácidos fracamente hidrofóbicos, neutros (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr) 28 xii) Os aminoácidos ácidos hidrófilos (Gin, Asn, Glu, Asp) , xiii) aminoácidos hidrofóbicos (Leu, lie, Vai) A presente invenção também diz respeito a variantes da Hsp70, ou aos seus fragmentos, em que as substituições são concebidas por meio de análise computacional que usa a homologia de sequência para prever se uma substituição afeta a função da proteina (por exemplo, Pauline C. Ng e Steven Henikoff, Genome Research, Vol. 11., Issue 5, 863- 874, Maio de 2001).

Devido à imprecisão dos métodos analíticos, pesos moleculares e comprimentos dos polímeros são entendidos como sendo valores aproximados. Quando um valor tal é expresso como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor estabelecido para X deve ser entendido como tendo uma precisão de +/- 20%, tal como +/- 10%, por exemplo +/- 5%.

Descrição das Figuras Figura 1

Os efeitos da Hsp70 sobre a ligação de aSMase ao BMP e os níveis de ceramida. (A) A ligação de 0,2 P M aSMase com o BMPcontendo lipossomas a pH 4,5 como função da Hsp70 pré-ligada (experiência análoga ao Exemplo 1, ver materiais e métodos aqui para mais detalhes) . A Hsp70 foi deixada dissociar durante 10 min, atingindo assim uma menor assintota para a dissociação antes da adição de aSMase). (B) A microscopia confocal e quantificação dos níveis de ceramida na Hsp70 do tipo selvagem (WT) e na Hsp70-transgénica (Hsp70-TG) iMEFs. A imunodeteção foi realizada com um anticorpo monoclonal de rato contra ceramida (clone 15b4) . A quantificação foi feita com base em micrografias de varrimento a laser a partir de 6 áreas pré-definidas, 29 após o que a quantificação foi realizada em software Duo LSM.

Figura 2 0 efeito da rHsp70 na atividade da esfingomielinase ácida em IMEF-WT (fibroblastos embrionários murinicos imortalizados,· do tipo selvagem) . A rHsp70 foi administrada em células a 3nM, 30nM e 300nM e a atividade da aSMase medida (A500 é uma medida da ceramida produzida que aumenta a turbidez). As células de controlo foram tratadas com BSA (albumina do soro de bovino).

Figura 3

Atividade da SMase ácida em fibroblastos diferentes. NPDA: Doença de Niemann-Pick tipo A.

Figura 4

Esquema de uma hidrólise de esfingolípidos significativa. A quebra exo-hidrolitica de esfingolípidos com grupos superiores hidrofílicos requer co-fatores não enzimáticos, proteínas ativadoras dos esfingolípidos (SAPs ou saposinas). Ambas as deficiências, herdadas da enzima respetiva, bem como a proteína ativadora correspondente causa o armazenamento de lípidos lisossomal e resulta na expressão de várias esfingolipidoses. De Ferlintz et ai., Chem. Phys. Lípidos, (102) 35-43, 1999.

Figura 5 A Hsp70 lisossomal estabiliza as membranas lisossómicas. (A) Imagens confocais representativas de células U-2-OS incubadas com rHsp70-AF488 (verde) 300 nM durante 24 h, fixadas e coradas para a proteína-1 de membrana integral lisossomal (LIMP-1; vermelho). Para a co-localização com outros marcadores de organelos ver Fig. 9. (b) células U-2- 30 OS foram incubadas com rHsp70-AF488 300 nM durante 24h antes da quantificação da rHsp70-AF488 em membranas (memb.) e sobrenadante (ALIM.) obtido por ciclos repetidos de congelamento / descongelamento e centrifugação da fração de membrana de luz (LMF). As análises de immunoblot da proteína de membrana 2 (LAMP-2) associada ao lisossoma e da catepsina B (Cat B) demonstram a validade do procedimento de fracionamento. (c) imagens fixas representativas de células U-2-OS expostas a foto-oxidação (laranja de acridina e azul claro). A perda da integridade lisossomal é visualizada pela perda de coloração vermelha e aumento da coloração verde, (d e e), as células U-2-OS foram incubadas com as proteínas recombinantes indicadas (300 nM) durante 24h e analisadas relativamente à integridade lisossomal sobre foto-oxidação. Quando indicado, as células foram tratadas com os siRNAs indicados durante 48 h antes da adição de proteínas recombinantes (e) . Os valores representam médias ± SD para três (d) ou cinco (e) ensaios independentes Os immunoblots representativos das proteínas indicadas a partir de células U-2-OS deixadas por tratar ou tratadas com controlo ou siRNAs da Hsp70 são apresentados do lado direito. Barras de escala: 20 ym (a e c).

Figura 6 A interação pH-dependente entre a Hsp70 e o BMP estabiliza as membranas lisossómicas. (a) as alterações relativas em dispersão de luz a 90° no lipossoma após a adição de rHsp70 (em alíquotas de 0,12 nmol) em lipossomas contendo os lípidos indicados (x = 0,2), a pH 7,4 (à esquerda) e pH 6,0 (à direita). (b) células U-2-OS foram deixadas sem tratamento (-) ou incubadas com 50 yg/mL de anti-BMP ou IgG de controlo durante 7 h antes da adição do veículo (-) ou rHsp70 300 nM durante 24 h e analisadas relativamente à integridade lisossomal aquando da foto-oxidação. (c) 31

células U-2-0S foram deixadas sem tratamento ou incubadas com 50 yg/mL de anti-BMP ou de IgG controlo durante 7 h antes da adição do veiculo (-) ou 25 μΜ de cisplatina durante 24 horas e analisadas quanto à morfologia das células apoptóticas após coloração Hoechst 33342. (d) A interação da rHsp70 e seus mutantes com POPC / BMP (XBMP = 0,2) lipossomas a pH 6,0 como medida por alterações na intensidade de fluorescência do pico relativo. As concentrações de proteina foram 0,36 μΜ (rHsp70), 0,5 μΜ (ΔΑΤΡ) e 0,35 μΜ (ΔΡΒϋ) (à esquerda) ou 0,43 μΜ (direita) e os lipossomas foram adicionados em aliquotas de 10 μΜ. (e) a análise BIAcore de interações entre a rHsp70 do tipo selvagem (WT) e a sua supressão (ΔΑΤΡ e ΔΡΒϋ) e mutações pontuais (W90F e W580F) com LUVs imobilizados a pH 4,5 (diâmetro médio: 100 nm, concentração de lipídos total: 0,1 mM; composição: esfingomielina (X = 0,1), fosfatidilcolina (x = 0,5), colesterol (x = 0,2) e BMP (x = 0,2)). Os lipossomas foram injetados até ao equilíbrio (100 s) e as concentrações indicadas (esquerda) ou 300 nM (direita) das proteínas recombinantes em tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5) foram injetadas durante 200 s, a uma taxa de fluxo de 20 yL/min seguidos por uma fase de dissociação durante 10 min. O ARU é definido como a diferença entre o sinal de resposta medido após o equilíbrio do lipossoma e o equilíbrio proteína-lipossoma. (f e g) células U-2-OS foram deixadas sem tratamento (controlo) ou incubadas com as proteínas Hsp70 recombinantes indicadas (300 nM) durante 24 h e analisadas relativamente à integridade lisossomal aquando da foto-oxidação (f) , ou tratados com veículo (barras brancas) ou cisplatina 25 μΜ (barras pretas) durante 24 horas e analisadas relativamente à apoptose como para morfologia (g). (h) modelos de superfície Molecular e em Laço do domínio ATPase da Hsp70. O ATP (representação van der Waalsurface) pode ser visualizado ligado na bolsa de ligação ao ATP. As esferas verdes e roxas denotam a 32 superfície de van der Waals dos iões coordenados de cácio e sódio, respetivamente. Notar a parte carregada positivamente do domínio na parte inferior e a posição do W90. Os valores representam Médias ± SD para um mínimo de cinco ensaios independentes (b, c, f e g).

Figura 7 A Hsp70 estimula a atividade ASM que, por sua vez estabiliza lisossomas. (a) medição Biacore da ligação de rASM 200 nM a lipossomas contendo BMP a pH 4,5 como uma função da rHsp70 pré-ligada. Os ensaios foram realizados tal como descrito na legenda da Fig. 6e com rASM adicionado durante 180 segundos após a fase de dissociação de 10 min da rHsp70 seguida por ainda outra fase de dissociação de 10 min. (b) A atividade ASM nos lisados de Hsp70 do tipo selvagem (WT) e transgénico (Hsp70) MEFs (painel da esquerda) e em WT MEFs incubadas com rHsp70 300 nM durante 24 ou 4 8 horas, tal como indicado. (c e d) Viabilidade (redução MTT; c) e atividade da catepsina citosólica (zFRase; d) em WT e Hsp70 iMEFs tratada com as concentrações indicadas de desipramina durante 3 h. (e) Imageamento de uma célula única viva com perda de integridade lisossomal (foto-oxidação em WT e Hsp70 MEFs, bem como Hsp70 MEFs incubadas durante 3 h com Desipramina 12,5 e 25 PM (painéis da esquerda e direita, respetivamente). A perda de vermelho (painel da esquerda) e aumento da fluorescência verde (painel da direita) foi continuamente medida para dar curvas cinéticas completas para a perda da integridade lisossomal. 25-60 células foram examinadas por ensaio a partir de áreas pré-definidas), p <0,001 para Hsp70 vs WT e Hsp70 + despramina vs. Hsp70. Todos os valores representam médias ± SD para um mínimo de 3 ensaios independentes. 33

Figura 8 A rHsplO estimula a atividade ASM, estabiliza lisossomas e diminui o volume lisossomal nos fibroblastos NPDA. (A) Imageamento de células únicas vivas de estabilidade lisossomal dos fibroblastos primários de um paciente com NPDA analisados como na Fig. 3e, p <0,001. (b) A atividade ASM dos fibroblastos NPDA deixados sem tratamento ou tratados com rHsp70 300 nM durante 48 h (painel da esquerda) , ou com rASM 150 nM sozinho ou em combinação com rHsp70 300 nM durante 24h (painel da direita). Os valores de p foram calculados a partir da velocidade enzimática obtida (DA 500/mg proteina / min) . A imagem à direita demonstra a captação endocitica do rASM (verde) e a sua localização relativamente ao compartimento lisossomal como visualizado por co-coloração com Vermelho LysoTracker. (c) a estabilidade lisossomal dos fibroblastos NPDA deixados sem tratamento ou tratados durante 24 h com rHsp70 300 nM, aSMase 150 nM ou uma combinação de rHsp70 e aSMase foi analisada como na Fig. 3e. p <0,001 para todos os tratamentos quando em comparação com células não tratadas, (d) Quantificação da área lisossomal de secções confocais transversais de células em fibroblastos NPDA deixados sem tratamento ou tratados durante 24 h com BSA 300 nM, rHsp70 300 nM, rASM 150 nM (150 nM) ou uma combinação de rHsp70 e rASM. A imagem do lado direito demonstra o efeito da rHsp70 (verde) no volume do compartimento lisossomal (vermelho) em fibroblastos NPDA. As setas brancas indicam células com rHsp70 endocitosadas e um compartimento lisossomal reduzido. Os valores representam médias ± SD durante 3 ensaios independentes. Barras de escala = 20 μΜ. UT = não tratado.

Figura 9 34

Colocalização de rHsp70-AF488 endocitosada com lisossomas. Imagens confocais representativas de células U-2-0S incubadas com rHsp70-AF488 (verde) 300 nM durante 24 h, fixas e coradas para os seguintes marcadores de organelos (vermelho): proteina-1 de membrana associada ao lisossoma (LAMP-1; lisossomas), LAMP-2 (lisossomas), LBPA / BMP (6C4; compartimento endolisossomal), corte c (mitocôndrias), SERCA (ER) e golgina-97 (Golgi) . Barras de escala: 20 ym (LAMP-1, LAMP-2 e BMP) ou 10 ym (Cit c, SERCA e Golgina-97) .

Figura 10

Interação dos rASM (aSMase recombinantes) e BMP na presença de rHsp70. (a) interação da rASM com lipossomas aniónicos imobilizados (o diâmetro médio é de 100 nm, a concentração total de lípidos é de 0,1 mM e a composição; 10 mol % de esf ingomielina, f osf atidilcolina 50 mol %, 20 mol % de colesterol e 20 mol % de BMP), a pH 4,5. Sinais de resposta medidos subsequentes à ligação dos lipossomas onde estão definidos como zero. (b) O efeito da rHsp70 pré-ligada na ligação subsequente da rASM. As quantidades indicadas da rHsp70 foram incubadas com lipossomas aniónicos imobilizados identicamente a (a) . Após uma fase de dissociação da rHsp70 de 10 min, o rASM 200 nM foi adicionado durante 180 s, seguido de uma dissociação de 10 min.

Figura 11

Efeito do indutor Hsp70 de pequenas moléculas; álcool benzilico em fibroblastos de pacientes Niemann-Pick do Tipo A (NPDA) . (A) A indução da Hsp7 0 em NPDA Gõtz por Álcool benzilico de um modo dependente da dose (expressão da proteina). B.Estabilidade aumentada de lisossomas NPDA Gõtz após o tratamento de células NPDA Gõtz com Álcool benzilico 35 40 mM. C. A patologia reduzida em células NPDA Gõtz após o tratamento com Álcool benzilico 40 mM, tal como medida por área de secção transversal lisossomal (método detalhado no Exemplo 2).

Figura 12

Efeito da depleção da aSMase sobre a estabilidade lisossomal. Os RNAs de interferência reduzida (siRNAs) direcionados para a esfingomielinase ácida (si938, sil257, sil340) e um siRNA controlo (mm) foram transfetados para células U20S usando Oligofectamina (Invitrogen) de acordo com as orientações do fabricante. A concentração de siRNAs: 50 nM. Após 72 horas, a redução da expressão genética foi confirmada através de RT-PCR (não apresentado) e as células analisadas quanto à estabilidade lisossomal através de imageamento de células únicas vivas da foto-oxidação mediada por laranja de acridina. O aumento na fluorescência verde foi medido continuamente para dar curvas cinéticas completas para a perda da integridade lisossomal. Como forma evidente, os gráficos das células tratadas com aSMase direcionada aos siRNAs mostram um decréscimo marcado na estabilidade lisossomal. O método é adicionalmente explicado no Exemplo 2.

Figura 13 O tratamento de todas as linhas de células NPDA / B com rHsp70 dramaticamente inverte a patologia lisossomal, isto é, reduz a área transversal dos lisossomas. A quantificação da área lisossomal de secções confocais transversais de células de fibroblastos da Doença de Niemann-Pick dos Tipos A e B (NPDA / NPDB) e fibroblastos normais (BJ) deixadas por tratar ou tratadas durante 24 horas com BSA 300 nM ou Dextrano como controlo, ou tratadas durante 24 horas com rHsp70 300 nM, rhaSMase 150nm ou uma sua combinação. As 36 células NPDA tratadas durante 24 horas com rHsp70 300nm -W90F (W90F) - o mutante Hsp70 que não interactua com BMP, tem um efeito comparável para controlar as células. Ver o Exemplo 2 para os métodos.

Figura 14

Aumento da atividade da aSMase nos fibroblastos transgênicos Hsp70 e fibroblastos NPDA tratados com rHsp70. Análise espetroscópica de massa da espécie lipidica (esfingomielina e ceramida como indicado) em fibroblastos embrionários de rato imortalizados (iMEFs) , quer do tipo selvagem (WT) ou Hsp70-transgénicos (TG) (A e B) , bem como fibroblastos de pacientes da doença de Niemann-Pick do tipo A (NPDA 83/24) quer sejam não tratados ou tratados com rHsp70 (C) . Os níveis mais baixos de esf ingomielina e os níveis mais elevados de ceramida indicam um aumento da atividade da esfingomielinase ácida.

Figura 15

Reversão da patologia nos fibroblastos de pacientes com a Doença de Farber. A quantificação da área lisossomal de secções confocais transversais de células de pacientes com doença de Farber. Os fibroblastos de pacientes com Doença de Farber (Farber 89/73 e Farber 89/78) foram deixados por tratar ou foram tratados durante 24 h com BSA 300 nM ou rHsp70 300 nM como indicado. Como é evidente a partir das figuras, o tratamento de fibroblastos de pacientes com doença de Farber com rHsp70 dramaticamente inverte a patologia lisossomal, isto é reduz a área de secção transversal dos lisossomas. Ver o Exemplo 2 para obter uma descrição dos métodos.

Figura 16 37 A Hsp70 aumenta a captação endocitica de outras moléculas. Painel A: fibroblastos embrionários de rato imortalizados (IMEF), ou tipo selvagem (WT) ou transgénicos para a Hsp70 (TG), onde foram incubados com 20 P g/mL de BSA marcado com Alexa Fluor-488 (BSA*) durante 24h. A captação endocitica foi verificada por microscopia de fluorescência (não apresentada) (ver exemplo 2) . As células foram posteriormente colhidas e analisadas relativamente à absorção de BSA*. Como é evidente a partir da figura, as iMEFs transgénicas da Hsp70 tiveram uma absorção significativamente maior de BSA * do que as iMEFs do tipo selvagem. Painel B: as células de osteossarcoma U20S foram incubadas com 20 pg/mL de BSA * durante 24 horas, quer com rHsp70 3000 nM ou sem, como indicado. A captação endocitica foi verificada por microscopia de fluorescência (não apresentada) (ver exemplo 2). As células foram então colhidas e analisadas para a absorção de BSA*. Como é evidente a partir da figura, as células U20S em que o BSA* e a rHsp70 foram adicionados em conjunto tiveram uma captação significativamente maior de BSA* do que as células incubadas com BSA* isoladamente.

Descrição detalhada da invenção

Tal como é demonstrado pelos presentes inventores, a Hsp70 exerce uma parte importante do seu efeito citoprotetor através de uma interação direta com membranas endo-lisossómicas; uma interação que é orquestrada por um fosfolipidio especifico, nomeadamente, o BMP (bis (monoacilglicero) fosfato) . O BMP está presente apenas em endossomas e lisossomas antigos. Os inventores demonstram que a interação Hsp70-BMP é dependente do dominio N-terminal ATP-ase da Hsp70, especificamente o triptofano 90 e também que a interação é dependente do pH. A interação entre as proteínas Hsp70 e o BMP é essencial para o efeito de estabilização da membrana da Hsp70, 38 proporcionando uma plataforma para modular estabilidade de um subconjunto especifico de enzimas lisossomais e prevenir a destabilização de membranas lisossómicas com a subsequente libertação de enzimas lisossomais. Estas descobertas formam a base para uma nova e promissora modalidade de tratamento para os distúrbios de armazenamento lisossomais, tal como aqui revelado.

Lisossomas

Desde a descoberta dos lisossomas por de Duve em 1955, a visão deste orqanelo tem sido dominada pelo doqma de que é apenas o término da via endocitica em células animais - um compartimento abriqando um largo conjunto de hidrolases, que, se libertadas no citosol, causam necrose e inflamação dos tecidos. Este ponto de vista dos lisossomas como, na melhor das hipóteses, uma unidade de recolha de residuos e, na pior das hipóteses, um "saco suicida" não especificado alterou dramaticamente devido a descobertas recentes que evidenciam as várias tarefas mais especificas para os lisossomas e seus conteúdos.

Hidrolases lisossomais

Como o compartimento principal para a degradação intracelular e subsequente reciclagem dos componentes celulares, os lisossomas recebem tanto cargas hetero- e autofágicas, que no lúmen do presente organelo encontram o seu destino final. A degradação é realizada por um número de hidrolases ácidas (fosfatases, nucleases, glicosidases, proteases, peptidases, sulfatases, lipases, etc), capazes de digerir todas as macromoléculas celulares principais. Entre as proteases lisossomais mais bem estudadas está a familia de proteases da catepsina. As catepsinas podem ser divididas em três sub-grupos, de acordo com o seu aminoácido do sitio ativo, i.e. catepsinas de cisteina (B, 39 C, H, F, K, L, 0, S, V, W e X / Z) , aspartato (D e E) e serina (G) . As catepsinas funcionam otimamente com o pH ácido dos lisossomas (pH 4-5), embora eles ainda possam funcionar com pH neutro fora dos lisossomas, tendo no entanto a estabilidade reduzida e/ou a especificidade alterada.

Até recentemente, a função das catepsinas foi pensada para ser limitada ao turnover da proteína intralisossomal e a degradação da matriz extracelular, uma vez secretada. No entanto, durante os últimos anos muitas das catepsinas têm sido conferidas com funções mais específicas, incluindo papéis na remodelação óssea, apresentação de antigénios, a homeostase epidérmica, processamento pro-hormonal, a proteção de linfócitos citotóxicos da auto-destruição após a degranulação, manutenção do sistema nervoso central em ratinhos, a angiogénese, a invasão de células cancerosas, bem como a morte celular programada (PCD).

Para além da degradação das proteínas, os lisossomas e os endossomas antigos também são responsáveis pelo metabolismo dos lípidos celulares, tais como os glicoesfingolípidos, através de uma série de enzimas endolisossomais e co-enzimas, cuja função adequada depende da composição lipídica das membranas intra-lisossomais. A importância do metabolismo lipídico endolisossomal funcional pode ser facilmente apreciado pelo facto de que a doença clínica é aparente em caso de disfunção em qualquer fase do metabolismo dos esfingolípidos, dando origem a doenças tais como a doença de Tay-Sachs, de Sandhoff, Farber, de Fabry, Gaucher, Krabbe e Niemann-Pick.

Tráfego para e dos lisossomas 40 O tráfego de membranas endocíticas serve um papel essencial na célula de mamífero através da sua entrega de componentes da membrana, várias moléculas de soluto e ligandos associados a recetor para uma gama de compartimentos intracelulares. Enquanto as várias vias endocíticas até recentemente pareciam simples, com as principais vias a convergir para os lisossomas, onde a degradação e reciclagem possível de volta à membrana plasmática teriam lugar, evidências recentes demonstram que estas vias são mais complexas do que se imaginou à primeira. A via endocítica A endocitose é mais bem entendida em termos da endocitose mediada pelo recetor de moléculas através da formação de poços revestidos com clatrina, embora uma variedade de vias endocíticas mediadas por não-clatrina (por exemplo, macropinocitose, fagocitose, absorção através da formação de cavéolas e poços revestidos por não-clatrina também têm sido identificadas. A nomenclatura do sistema endocítico não foi totalmente normalizada e o termo comumente usado "endossoma precoce" realmente descreve dois compartimentos distintos endossómicos - a triagem do endossoma e o compartimento de reciclagem endocítica (ERC). Na via convencional endocítica mediada pelo recetor, os recetores, tais como o recetor de transferrina, o recetor da lipoproteína de baixa densidade e o recetor de manose-6-fosfato (MPR) concentram-se em poços revestidos por clatrina na superfície da membrana plasmática em virtude das interações entre os motivos de sequência nas suas caudas citoplasmáticas e elementos do revestimento de clatrina. Após o derramamento do seu revestimento de clatrina, os endossomas recém-formados fundem-se com outros endossomas e com os endossomas selecionados pré-existentes para se tornarem um endossoma de triagem. Como o seu nome indica, a sua principal tarefa é a de selecionar os 41 componentes recém-adquiridos para as suas localizações corretas. Os três destinos conhecidos incluem a membrana plasmática, os endossomas finais e o ERC. À medida que o endossoma de triagem amadurece, experimenta uma queda no pH, o que facilita a libertação dos ligandos associados ao receptor no lúmen do endossoma. Antes da maturação completa do endossoma de triagem para o endossoma tardio, no entanto, as moléculas destinadas à reciclagem devem ser classificadas. Acredita-se que este processo tem lugar através da extração de túbulos estreitos, um processo, o que favorece a seleção das proteínas de membrana de moléculas de soluto pois a proporção área de superfície-para-volume dos túbulos é maior do que aquela do endossoma de triagem vesicular. Os túbulos extraídos podem transferir as proteínas da membrana diretamente para trás para a membrana plasmática (a via de retorno direto) ou para o ERC. 0 ERC é principalmente um conjunto de organelos tubulares, cuja localização varia entre tipos de células. Enquanto o ERC é capaz de selecionar moléculas para vários destinos diferentes, a maioria das moléculas que transitam através do ERC retorna à membrana plasmática. À medida que o endossoma de triagem amadurece, o seu pH luminal apresenta uma queda firme, principalmente devido à ação do ATPase protónico do tipo vacuolar (V-ATPase), enquanto que podem ocorrer alterações na membrana lipídica e na composição proteica. 0 tráfego de membrana a partir do endossoma de triagem para o endossoma tardio e adicionalmente para o interior do lisossoma tem sido objeto de alguma controvérsia. A disputa refere-se a se este tipo de transporte é melhor explicado através de transporte vesicular ou pela maturação do endossoma de triagem. Ambos os modelos proporcionam um intermediário entre endossoma de triagem e o endossoma tardio. Embora o modelo de maturação 42 defenda que a vesícula, que atinge o endossoma tardio, é o que resta após a remoção dos componentes a partir do endossoma de triagem anterior, o modelo de compartimento pré-existente defende que o transporte de moléculas para os endossomas tardios ocorre através de uma vesícula endocítica transportadora (ECV), uma vesícula de transporte específico entre os compartimentos endossomais de triagem e tardio. Ambos os compartimentos endossómicos de triagem e tardio são considerados como sendo estruturalmente mais complexos e como tendo funções mais especializadas do que as vesículas de transporte. Estudos recentes em imageamento de células vivas, vieram reconciliar aspetos mecanicistas de ambos os modelos, no entanto, como as vesículas resultantes de uma rede precoce dinâmica de endossomas podem sofrer uma conversão em que eles perdem a pequena GTPase RAB5 e recrutam Rab7, um marcador de endossomas tardios. Embora a organização da via endocítica esteja funcionalmente bem definida, a nomenclatura pode ser confusa. Funcionalmente, a via endocítica é definida por recetores de manutenção (por exemplo, o recetor da transferrina) e outros lípidos e proteínas sendo reciclados através do endossoma precoce / endossoma de triagem onde ocorre o desacoplamento receptor-ligando - mas não através dos endossomas tardios onde pode ocorrer a proteólise. Além destes critérios funcionais no entanto, o quadro torna-se mais turvo quando se trata de nomenclatura, não tanto como a geração de vesículas intraluminais, começando nos endossomas precoces e tornando-se cada vez mais proeminente durante a maturação até aos endossomas tardios, dando origem ao termo "corpos multivesiculares" (MVB). Este termo tem sido usado de forma intercambiável como um outro nome para as ECVs e endossomas tardios bem como para todas as vesículas endocíticas contendo regiões multivesiculares ou elementos, incluindo o organelo híbrido que se forma quando os lisossomas se fundem com os endossomas tardios (que 43 contêm estruturas multivesiculares). No entanto, os endossomas tardios contêm mais vesículas de membrana luminal do que endossomas precoces e são, portanto, muitas vezes o compartimento descrito pelo termo "corpos multivesiculares".

Finalmente, uma quantidade substancial de confusão na área surgiu a partir da definição, ou melhor, da falta da mesma, de endossomas tardios versus lisossomas. Ambos os compartimentos são igualmente ácidos e a maioria, se não todas, as proteínas presentes nos lisossomas também são encontradas nos endossomas tardios. De acordo com o modelo de maturação, os endossomas tardios seriam precursores para os lisossomas, mas dado o desenvolvimento gradual, como a teoria sugere, uma classificação rigorosa poderia ser muito difícil de conseguir. Recentemente, no entanto, foi apresentada evidência relativamente aos lisossomas e endossomas tardios como sendo compartimentos separados, os quais são, em seguida, submetidos a ambos os eventos "kissing" (fusões transientes), bem como a eventos de fusão completos, após o que os lisossomas se podem reformar a partir do organelo híbrido. Ά via biossintética

Além da endocitose, os endossomas tardios também recebem a carga pela via MPR da rede trans-golgi (TGN) (a via biossintética). A MPR dependente de catião e o MPR independente do catião / Recetor do Fator de Crescimento II semelhante a Insulina (IGF-II) partilham a tarefa de entrega das hidrolases ácidas recém-sintetizadas a partir do TGN para os lisossomas. 0 reconhecimento de hidrolases ácidas por MPRs requer a adição de hidratos de carbono no retículo endoplasmático e a subsequente modificação e fosforilação dos resíduos de hidratos de carbono para porções de manose-6-fosfato no cis-Golgi. As hidrolases 44 ligadas à MPR são primeiro entregues aos endossomas, onde se dissociam dos recetores devido à queda do pH do lúmen, permitindo assim a reciclagem dos recetores de volta para a TGN. A proteina principal responsável pela triagem dos MPRs em poços revestidos com clatrina no TGN, é uma proteina-1 adaptadora (AP-1), embora ο γ aparelho localizado no Golgi, contendo proteínas de ligação ao fator de ribosilação ADP (GGAS) também desempenham um papel. Se o AP-1 e as GGAs trabalham em conjunto ou de fato direcionam os dois MPRs para diferentes localizações subcelulares, é atualmente desconhecido. 0 AP-1 é parte de uma família de proteínas adaptadoras consistindo em quatro membros, todos os quais são proteínas heterotetraméricas utilizadas extensivamente nas vias de secreção e de endocitose. Além do papel acima mencionado do AP-1 em poços revestidos por clatrina formados em TGN, o AP-1 e o AP-2 são usados em poços revestidos com clatrina durante a endocitose na membrana plasmática, enquanto o AP-3 e o AP-4 funcionam no tráfego das proteínas de membrana associadas ao lisossoma (LAMPs). A via autofágica A autofagia é a terceira via bem caracterizada pela qual as macromoléculas atingem o lisossoma. A autofagia é uma via evolutiva conservada envolvida no turnover das proteínas e organelos de vida longa. Ela normalmente opera a baixos níveis basais, embora possa ser induzida, por exemplo, sob condições de privação de nutrição. Sob estas condições, a macroautofagia é a via principal responsável pela entrega de material aos lisossomas. A macroautofagia é caracterizada por um invólucro de membrana plano em cisterna em torno dos organelos citoplasmáticos e/ou uma porção de citosol formando assim um vacúolo ligado a uma dupla membrana fechada, o autofagossoma. 0 autofagossoma finalmente funde-se com os lisossomas formando 45 autofagolisossomas / autolisossomas, em que ocorre a degradação e a reciclagem das macromoléculas englobadas. A origem da membrana do autofagossoma ainda não está clarificada. 0 retículo endoplasmático, o Golgi, um compartimento membranar menos bem caracterizado denominado o fagóforo bem como a síntese de novo, foram todos propostos como origens da membrana autofagossómica. 0 progresso recente através da genética da levedura e da descoberta subsequente dos homólogos de mamífero aumentou rapidamente o entendimento do processo de autofagia e espera-se que ilumine também a origem da membrana autofagossomal no futuro próximo.

Existem também outras vias pelas quais os lisossomas recebem carga autofágica. Um processo relativamente indiscriminado denominado microautofagia caracteriza-se pelo englobamento do citosol pelos lisossomas através de invaginações da membrana lisossomal. Além das macromoléculas, que estão presentes no citosol englobado, este processo pode também envolver a captação de organelos tais como peroxissomas. Finalmente, o transporte mediado por chaperona das proteínas citosólicas no lúmen lisossomal apresenta uma forma mais direta e seletiva de autofagia. Esta via é dependente da presença do membro expresso constitutivamente da família de proteínas 70 de choque térmico, Hsc70, em ambos os lados da membrana lisossomal. O processo é, além disso, dependente do reconhecimento de um motivo da sequência KDEL em proteínas alvo por LAMP-2a.

Reforma dos lisossomas e secreção lisossomal

Após a fusão dos lisossomas com endossomas tardios ou autofagossomas, os lisossomas são reformados a partir dos organelos híbridos resultantes através do sequestro de proteínas de membrana e da condensação do conteúdo lumenal. Das proteínas de membrana que precisam de ser removidas ou 46 recicladas a partir do organelo híbrido, as mais óbvias são as MPRs, à medida que por definição estão ausentes dos lisossomas. Os lisossomas, no entanto, não podem ser vistos como o ponto terminal das vias endociticas como também são capazes de formar lisossomas secretores através da fusão com grânulos secretores, um processo que é Ca2+ dependente e foi identificado pela primeira vez em células secretoras de origem hematopoiética. No entanto, as evidências também existem para um compartimento lisossomal próximo da membrana regulado por Ca2+, responsável pela exocitose em células não secretoras. 0 processo de exocitose é dependente da proteína Rab27a, um membro da família de proteínas Rab, que conta com mais de 60 membros. As Rabs são GTPases pequenas que têm papéis-chave de regulação na maioria dos passos de transporte na membrana, incluindo a formação de vesículas, motilidade, encaixe e fusão. Pelo menos 13 proteínas Rab são utilizadas nas vias endociticas a fim de determinar o destino das várias moléculas endocitadas e das suas vesículas.

Morte Celular Programada A regulação do número de células em geral, bem como a quantidade de células que constituem os diferentes tecidos, juntamente com a necessidade de um mecanismo para eliminar células indesejáveis é de importância fundamental em organismos multicelulares. A morte celular programada é o meio para esse fim, dotando o organismo multicelular com potencial para se livrar de células indesejadas sem escoar os constituintes celulares, evitando assim a inflamação associada com a necrose, a contrapartida concetual da morte celular programada.

Apoptose 47 A palavra apoptose é usada em Grego para descrever a "soltura" ou "queda" de pétalas das flores, ou folhas de árvores e foi cunhado por Currie e colegas em 1972 para descrever um tipo comum de morte celular programada, que os autores observaram num certo número de tecidos e tipos de células. Os autores notaram que os eventos que observavam tinham semelhanças morfológicas significativas, que eram distintas das características morfológicas que caracterizam as células submetidas a morte patológica, necrótica e sugeriu que estas caracteristicas morfológicas comuns podiam ser devidas a um processo idêntico subjacente.

Quando as células morrem por apoptose, eles passam por uma série de eventos de transformação. Entre estes eventos, o essencial para o fenótipo apoptótico caracteristico, é a ativação das caspases - uma familia de endopeptidases de cisteina, que clivam substratos em resíduos de aspartato específicos, daí o nome. A ativação das caspases leva ao processamento proteolítico de outras caspases, bem como a uma série de outras alterações nas atividades globais das proteínas dentro das células, em última análise produzindo os elementos morfológicos característicos associados à ativação da caspase e, assim, por definição, à apoptose. As caracteristicas clássicas apoptóticas incluem a retração das células e a formação de bolhas na membrana citoplasmática, a condensação da cromatina dentro do núcleo em formas transparentes, geométricas, a fragmentação do ADN em porções inteiras de 200 pb inteiros, designando-se escada nucleossomal, desassociação celular das suas células vizinhas e desintegração da célula em vesículas pequenas, fechadas denominadas corpos apoptóticos. Num ambiente multicelular, estes corpos apoptóticos são fagocitados em última instância por macrófagos ou células vizinhas que por este meio completam a remoção da célula não desejada. 48

Morte Celular Programada A morte celular programada (PCD) não é sinónimo de apoptose embora se possa estar inclinado a pensar assim com base na quantidade de bibliografia utilizando estes termos indiscriminadamente. 0 termo PCD é gradualmente tomado em conta, mas o termo apoptose é ainda usado para descrever um programa de morte celular orquestrado pela ativação das caspases, em particular a caspase-3. No entanto, a capacidade de determinadas células para sobreviver à ativação de caspases pró-apoptóticas, bem como a PCD com ausência completa de ativação da caspase e ativação da caspase levando à PCD não-apoptótica, revelou uma plasticidade notável do(s) programa(s) de morte celular e a PCD pode assim ser mais precisamente definida como a morte celular dependente de sinais ou atividades dentro da célula a morrer. Tem sido sugerido que a PCD pode ser subdividida em PCD por apoptose, semelhante a apoptose e semelhante a necrose, de acordo com a morfologia nuclear das células moribundas, cada definição cunhada para distinguir caracteristicas morfológicas, sendo a principal caracteristica a forma de condensação da cromatina ou a sua ausência, embora seja preferível fazer distinções de PCD com base nas vias de sinalização que participam em qualquer determinado conjunto de condições que levam à PCD. Esta forma de distinguir entre diferentes modos de PCD não é ainda aplicável no entanto, uma vez que os caminhos que conduzem aos vários tipos de morte celular continua por esclarecer.

Necrose A necrose é o homólogo conceptual da PCD, uma vez que não pode ser evitada por quaisquer outros meios além da remoção 49 do estímulo que dá origem à necrose. Este modo de morte celular é normalmente observado durante ataques patológicos a um organismo. A maquinaria molecular da morte celular programada Apoptose

Como mencionado na secção anterior, a apoptose é definida pela ativação dos membros da família de endopeptidases de cisteína conhecidas como as caspases e a morfologia associada com a sua ativação. As caspases residem em células como zimogénios inativos, os quais podem ser rapidamente ativados pelo processamento proteolítico. Este processamento prossegue numa cascata hierárquica em que um estímulo apoptótico ativa uma caspase iniciadora (por exemplo caspase-8 e -9) , que por sua vez ativa o próximo nível na hierarquia, as caspases efetoras (por exemplo caspase-3, -6 e -7). Estas últimas são consideradas as executoras da apoptose à medida que clivam um número de substratos, cujo processamento conduz finalmente ao fenótipo associado à apoptose. 0 programa apoptótico pode ser ativado por uma variedade de estímulos, que podem ser amplamente divididos em estímulos extracelulares e intracelulares, os últimos vendo o mitocôndrio como um interveniente essencial. Os estímulos extracelulares e a resposta seguinte dando origem à apoptose são também referidos como a via de sinalização extrínseca e são compreendidos por uma série de eventos que começam com a ativação de um de uma variedade de recetores de morte, tais como Fas/Apo-l/CD95 TNFR, ou TRAIL. Após a ligação ao seu ligando adequado, estes recetores recrutam moléculas adaptadoras contendo domínio de morte (DD), tais como TRADD (proteína do domínio de morte asociado ao TNFR1) e FADD (proteína de associação do Fas com o domínio de morte), por 50 meio da interação com o DD presente nos recetores. Estas moléculas adaptadoras então recrutam a caspase-8 para o complexo recetor, onde o caspase é ativada, possivelmente através do processamento autocatalitico induzido pela proximidade. Em certas células (o chamado tipo I de células) caspase-8, em seguida clivam diretamente e ativam a procaspase-3, enquanto nas células do tipo II, o substrato para a caspase-8 é a proteina citoplasmática Bid. A clivagem da Bid gera um fragmento (Bid truncado (tBid)), que induz a oligomerização, translocação e inserção de dois membros da familia Bcl-2 pró-apoptóticos, o Bax e o Bak na membrana mitocondrial externa. Esta inserção medeia a libertação do citocromo c transportador de eletrões (CytC) a partir do espaço intermembranar mitocondrial juntamente com um hospedeiro de outras proteínas, o mais proeminente dos quais inclui o Fator Indutor da Apoptose (AIF), o Smac / DIABLO que antagoniza os efeitos das proteínas conhecidas como proteínas inibidoras de apoptose (IAP) e a endonuclease G, uma DNAse. Deve-se notar que, embora este ponto central nas teorias da ativação de caspase através do mitocôndrio, nenhuma evidência conclusiva foi apresentada no que diz respeito à forma como a inserção do Bax e do Bak facilita a libertação de citocromo c. Após a libertação do mitocôndrio, o CytC acumula-se no citoplasma, onde se liga à proteína Apaf-1 (fator 1 ativador da protease apoptótica) resultando numa alteração conformacional, que promovem a oligomerização do Apaf-1. Este oligómero liga-se então à procaspase-9 através de interações homotípicas entre os domínios de recrutamento da caspase (CARDS) resultando na formação de um complexo designado apoptossoma. A formação deste complexo conduz a uma atividade enzimática grandemente aumentada da procaspase-9, cuja atividade conduz à ativação proteolítica da caspase-3. 51 A apoptose também pode ser desencadeada por fatores intracelulares provocando a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP), um processo conhecido como via intrínseca.Estes fatores incluem segundos mensageiros associados ao stress celular , tais como Ca2+, NO e ácido araquidónico, bem como a bilirrubina, sais biliares e estímulos que podem dar origem à desnaturação da proteina e danos no ADN nuclear e mitocondrial, tais como a radiação ionizante, o stresse térmico, espécies reativas de oxigénio (ROS) e agentes quimioterapêuticos. No caso de danos no ADN nuclear, estes são detetados por uma variedade de proteínas cinases, que dependem da forma de danos no ADN, mas também a noxa os elicitam. A atividade destas cinases induz a acumulação de p53, que pode então atuar como um fator de transcrição, dando origem a uma transcrição aumentada dos genes pró-apoptóticos tais como o Bax, Noxa e PUMA, todos os quais podem induzir a MOMP. Ao nivel mitocondrial, o p53 induz a expressão de enzimas mitocondriais que localmente geram ROS, bem como uma proteina de matriz mitocondrial (p53AIPl), cuja sobre-expressão desencadeia a perda de potencial de membrana mitocondrial e apoptose. A indução da MOMP pelo p53 ou pela ação dos estímulos intrínsecos acima descritos é o ponto no qual as vias intrínseca e extrínseca convergem, o percurso da via intrínseca seguindo-se aquele já descrito para a via extrínseca com libertação de citocromo c, formação do apoptossoma e ativação da caspase-3 constituindo os últimos passos na direção à morte da célula indesejada.

As Alternativas à Apoptose

Na década passada, o papel exclusivo das caspases como executores de PCD foi contestado e evidências acumuladas sugerem que há mais na vida - e especialmente na morte - de uma célula que pode ser atribuído às caspases de um modo 52 exclusivo. Tanto os inibidores farmacológicos específicos da caspase recentemente desenvolvidos como a inativação das vias de caspase por fatores tais como o esgotamento energético, o stress nitrativo / oxidativo e os membros do inibidor da família de proteínas da apoptose (IAP) nem sempre pára a progressão até à morte, eles revelam, ou mesmo reforçam, um subconjunto de programas subjacentes de morte, independentes da caspase. Estes programas incluem as vias inciadas através do recetor da morte, bem como as vias elicitadas por fármacos anti-cancerígenos, privação do fator de crescimento, estaurosporina, proteínas relacionadas com o Bax e esgotamento da Hsp7 0. As características morfológicas destes programas de morte caspase-independentes fazem muitas vezes lembrar aqueles observados para a apoptose clássica e um suporte experimental para um papel para outras proteases, tais como catepsinas, calpaínas e serina proteases como cofatores essenciais quer a montante ou a jusante de caspases foi crescendo rapidamente. 0 argumento é reforçado pelas descobertas de que muitas proteases não-caspase são capazes de clivar, pelo menos, alguns dos substratos clássicos da caspase, os quais podem explicar algumas das semelhanças observadas entre os programas de morte dependentes e independentes da caspase. osmótico

Embora se possa argumentar a relevância de tais programas de morte, tal como eles são mascarados pela eficácia das caspases, reunem-se evidências para um papel evolutivamente conservado para proteases da catepsina lisossomal nos programas de morte celular iniciados como uma resposta a diversos estímulos, tais como recetores de morte da família de recetores do fator de necrose tumoral, hipóxia, stress oxidativo, stress osmótico, calor e fármacos anti-cancerígenos . 53

Envolvimento lisossomal na morte celular programada

Enquanto o papel dos lisossomas e suas hidrolases na fase de limpeza de PCD, ou seja, no englobamento das células e corpos apoptóticas por células ou fagócitos vizinhos, está bem estabelecido, levou muito tempo para reconhecer a importância dos lisossomas e das hidrolases lisossomais nos eventos mais imediatos da PCD. Uma das razões para este atraso pode ser o facto de que os inibidores peptídicos metilicos de cetona comumente utilizados para avaliar o papel das caspases em PCD (p.ex. zVAD-fmk, Ac-DEVD-fmk, Boc-D-fmk, etc) também inibem outras proteases de cisteina, incluindo várias catepsinas de cisteina. Mesmo nove anos após o reconhecimento desta reação cruzada, os efeitos de proteção com estes inibidores em concentrações capazes de inibir as proteases não caspase são ainda muitas vezes interpretadas como uma prova para as vias de morte mediadas pela caspase e o papel de outras proteases de cisteina em PCD continua assim a ser subestimado. A descoberta de PCD lisossomal pode ter sido adicionalmente retardada, porque a ultraestrutura lisossomal aparece intacta em células apoptóticas analisadas por microscopia eletrónica. Assim, a rutura lisossomal foi considerada até recentemente como um interruptor do tipo tudo-ou-nada durante as últimas fases da morte celular necrótica descontrolada e a autólise do tecido. No entanto, novas técnicas permitindo uma avaliação mais precisa da integridade da membrana lisossomal revelaram que os lisossomas com uma ultra-estrutura normal podem ter vertido parte de suas enzimas e que a permeabilização da membrana lisossomal parcial (LMP) não só ocorre no inicio de muitos paradigmas da morte, mas pode de facto gatilhar a apoptose e a PCD semelhante a apoptose.

Permeabilização da membrana lisossomal (LMP) e suas consequências 54

Estudos com vários compostos que visam diretamente a integridade das membranas lisossómicas, tais como H2C>2, éster metilico de L-leucil-L-leucina, stress osmótico, esfingosina, os antibióticos lisosomotrópicos norfloxacina e ciprofloxacina e danos lisossomais foto-oxidativos (fotólise), provaram de forma convincente que a permeabilização lisossomal moderada pode resultar em PCD. Uma relação quantitativa entre a quantidade de rutura lisossomal e o modo de morte celular tem sido sugerida para explicar os resultados morfológicos amplamente diferentes que se seguem à LMP. De acordo com este modelo, as intensidades de stress reduzido desencadeiam uma libertação limitada dos conteúdos lisossomais do citoplasma seguida por apoptose ou morte celular semelhante a apoptose, enquanto que stress de intensidade elevada conduzem a uma rotura generalizada lisossomal e à necrose celular rápida. De um modo concordante, baixas concentrações de esfingosina, um metabolito da ceramida gerado pela ceramidase ácida com propriedades semelhantes a detergente com pH reduzido, induz a LMP parcial e a apoptose mediada pela, enquanto que as concentrações mais elevadas resultam em LMP massiva e morte celular por necrose independente da caspase. Neste modelo, a morte provocada por LMP parcial pode ser inibida por inibidores farmacológicos da cisteina e as aspartato catepsinas e o aumento na atividade da catepsina citosólica precede a ativação das caspases e alterações potenciais à membrana mitocondrial, sugerindo um papel direto para as catepsinas citosólicas no processo de morte. De um modo importante, o papel da LMP e das catepsinas na morte celular não é limitado aos modelos experimentais empregando desreguladores diretos lisossómicos. A LMP também participa na execução da morte celular em resposta a uma grande variedade de estímulos clássicos apoptóticos, tais como a ativação de recetores de morte da família de recetores do fator de necrose tumoral 55 (TNF), a interleucina-1, a ativação do p53, privação do fator de crescimento, agentes estabilizadores de microtúbulos, etopósido, ativação do recetor sigma-2, retinóide sintético CD437, ativação do recetor da célula B, a estaurosporina, o stress osmótico, bem como pequenas moléculas identificadas num ecran para novos fármacos contra o cancro que induzem a apoptose independente do p53. LMP como gatilho da via de apoptose mitocondrial

Os efeitos citotóxicos da LMP geralmente dependem, pelo menos parcialmente, da ativação da via de morte mitocondrial. Um estudo de microinjecção elegante demonstrou que quando localizada no citosol, uma única hidrolase lisossomal, a catepsina D, é suficiente para desencadear a permeabilização da membrana mitocondrial externa e a apoptose em fibroblastos humanos em doses celulares correspondentes a metade da atividade celular total da catepsina D. A catepsina D não é, no entanto, suficiente para gatilhar a PCD em todos os modelos de morte celular que envolvem a LMP. Outros mediadores da LMP-PCD gatilhada bem documentados incluem as catepsinas B e L da cisteina, bem como espécies reativas de oxigénio. Deve, no entanto, ser enfatizado que o papel do outras hidrolases lisossómicas, segundos mensageiros derivados do liossoma e acidificação do citosol induzida por LMP-A não foi adequadamente descartado. Uma das ligações entre as catepsinas e a permeabilização da membrana mitocondrial pode ser o Bid, uma proteína singular BH3 proapoptótica da família Bcl-2 que pode ser processada e ativada por várias catepsinas de cisteina, mas não pela catepsina D, ao pH citosólico. A catepsina D foi, no entanto, sugerido como clivando e ativando o Bid no ambiente acídico do compartimento endolisossomal a seguir à internalização do recetor TNF-1 (TNF-R1). De acordo com este modelo, a endocitose do TNF-R1 ativado por ligando resulta na geração 56 de ceramida mediada por esfingomielinase, que, em seguida, se liga à catepsina D inativa e ativa-a através de um processamento autocatalitico. A catepsina D pode também ativar o Bax de um modo independente do Bid, tal como demonstrado em células T tratadas com estaurosporina. Também em fibroblastos tratados com ciprofloxacina, a LMP desencadeia a permeabilização da membrana mitocondrial por meio de uma ativação, independente do Bid, do Bax e Bak. Neste sistema modelo a ativação do Bax é independente da catepsina D, em vez disso baseia-se na espécie de oxigénio reactiva. Deve notar-se que a permeabilização da membrana mitocondrial induzida pela ciprofloxacina não é totalmente inibida em células que carecem de ambos Bax e Bak. Os mecanismos alternativos de ligação LMP para a permeabilização da membrana mitocondrial podem incluir os efeitos diretos de espécies reativas de oxigénio e/ou mediadores lipidicos como ácido araquidónico que podem ser gerados de uma maneira dependente da catepsina B.

Os estudos empregando fibroblastos embrionários murinicos imortalizados (MEFs) de ratinhos deficientes em catepsinas individuais revelaram claramente que estão envolvidas catepsinas diferentes na execução da morte celular, dependendo do estimulo desencadeado pela LMP. Os MEFs imortalizados de ratinhos deficientes em catepsina B e L, mas não de ratinhos deficientes em catepsina D, são altamente resistente ao TNF, enquanto que a imagem oposta surge quando as células são tratadas com estaurosporina. Estudos extensivos sobre as vias de morte celular induzida pelo TNF têm também revelado que o papel das catepsinas individuais em PCD depende do tipo de célula estudada. Como indicado acima, a morte induzida pelo TNF dos MEFs imortalizados depende das catepsinas de cisteina, mas não a catepsina D. No entanto, o esgotamento da catepsina D efetivamente protege as células de cancro do colo do útero 57

HeLa contra a citotoxicidade induzida pelo TNF e pela cisplatina. Esta diferença não parece ser devida a diferenças gerais entre células humanas e murinicas, porque a catepsina B isoladamente ou em conjunto com outros catepsinas de cisteina é também crucial para a morte induzida pelo TNF eficaz nas linhas celulares de cancro do colo do útero humano (ME-180) e da mama (MCF-7) . A explicação para esta diversidade é ainda desconhecida, mas niveis variados de expressão das catepsinas individuais e seus inibidores em linhas celulares diferentes podem desempenhar um papel. De um modo concordante, a capacidade variável de estimulos de morte diferentes poderem regular os niveis de expressão das catepsinas individuais ou dos seus inibidores pode explicar a diferença na resposta a estimulos diferentes. Por exemplo, a adriamicina e o etoposido são conhecidos por melhorar a expressão da catepsina D, através da ativação do p53. Alternativamente, outras vias de sinalização induzidas por vários estímulos podem cooperar com catepsinas específicas.

Vias de morte independentes dos mitocôndrios induzidas por LMP

De um modo importante, os efeitos letais da LMP e das catepsinas citosólicas não estão limitados à ativação da via de apoptose intrínseca Em pequenas células de cancro de células de pulmão tratadas com fármacos estabilizadores de microtúbulos (paclitaxel, epotilona B e discodermolide), a LMP ocorre no início do processo de morte e as catepsinas de cisteina medeiam a micronucleação e a morte celular de um modo independente da caspase. Em linhas celulares de carcinoma humano tratadas com TNF, a LMP ocorre a jusante da permeabilização da membrana exterior mitocondrial. No entanto, a inibição da atividade ou expressão da catepsina da cisteina confere uma proteção significativa contra a 58 morte celular induzida por TNF sem inibir significativamente a ativação da caspase efetora. Além disso, a catepsina B é responsável pelas alterações semelhantes à apoptose, tais como a condensação da cromatina, a exposição da fosfatidilserina e a formação de bolhas na membrana plasmática, na ausência de atividade da caspase em células de fibrossarcoma WEHI-S murinicas tratadas com TNF. Além disso, a depleção da proteína de choque térmico 70 (Hsp70) em várias células cancerígenas humanas, bem como a ativação supra-ótima das células T gatilha a LMP e a PCD semelhante a apoptose mediada por catepsina sem a ativação da via de apoptose intrínseca. Em linha com estes dados, a catepsina B pode induzir a apoptose nuclear em núcleos isolados. Assim, as catepsinas parecem desempenhar tanto a capacidade de actuar como iniciador, bem como as proteases efetoras da morte celular programada, dependendo do estímulo e do contexto celular. Especialmente a sua capacidade para mediar a PCD em células de cancro, em que a via da morte mitocondrial é bloqueada por exemplo devido à sobre-expressão do Bcl-2, aumenta a esperança de que os tratamentos que induzem a LMP possam provar a sua eficácia no tratamento de cancros que são resistentes a indutores da apoptose clássica. Esta ideia é reforçada por dados que mostram que a imortalização e transformação podem sensibilizar as células para a morte celular lisossomal.

Sinalização para LMP

Tal como descrito acima, a LMP seguida pela libertação dos conteúdos lisossomais, especialmente catepsinas, para o citosol é considerado como sendo o passo chave da ativação da via de morte lisossomal. No entanto, as vias de sinalização que conduzem à LMP ainda estão apenas a começar a emergir. Um dos mecanismos mais bem estudados é a sinalização a partir do recetor 1 do fator de necrose 59 tumoral, embora a clarificação desta via de sinalização para a LMP tem sido grandemente complicada por respostas amplamente diferentes em células-alvo diferentes.

Em resumo, o TNF pode induzir a LMP de um modo dependente ou independente da caspase, dependendo do contexto celular. Além disso, os ligandos relacionados com o TNF FasL, TRAIL e TWEAK têm foram associados à PCD independente da caspase, quer com uma morfologia apoptótica ou necrótica. Os estudos farmacológicos e genéticos indicam que a via mediada pela caspase e que conduz do TNF à LMP é dependente das caspases -8 e -9, embora a ativação da caspase-9 difira muito entre as células humanas e murinicas. A ligação entre caspases e LMP é ainda desconhecida e, embora a clivagem do Bid mediada pela caspase 8 induzida por TNF foi sugerida para contribuir para a LMP, estas descobertas não puderam ser verificadas por LMP induzida por TNF em iMEFs deficientes em Bid. 0 Bid tem, além disso, sido sugerido como sendo um alvo para catepsinas na vias de morte lisossomal, implicando o Bid a jusante em vez de a montante, da LMP. 0 TNF também estimula a quebra da esfingomielina em fosforilcolina e ceramida por ativação da esfingomielinase neutra (SMase) na membrana plasmática e SMase ácida ou acidica (aSMase) no compartimento lisossomal. Ambos os eventos foram implicados nas vias de morte celular induzidas por TNF, mas até agora apenas a SMase neutra foi associada à LMP através do fator associado à SMase neutra (FAN) . Estudos com base em iMEFs deficientes em FAN, bem como fibroblastos humanos que expressam uma forma dominante negativa de FAN têm mostrado que o FAN não só medeia a produção de ceramida induzida por TNF , mas contribui também para o processamento da caspase-8 e morte celular. Uma vez que a LMP induzida por TNF em hepatócitos murinicos depende da caspase-8, o seu processamento reduzido pode 60 explicar a LMP reduzida em hepatócitos tratados com TNF hepatócitos expressando o FAN negativo dominante. O papel da ceramida e dos seus metabolitos pode, no entanto, não ser descartado. O seu papel na sinalização da morte induzida por TNF é suportado pelo TNF reduzido e por hepatotoxicidade induzida por Fas em ratinhos deficientes relativamente à aSMase, a qual é ativada a jusante da caspase-8. Especialmente a esfingosina, que é gerada a partir de ceramida numa reação catalisada pela ceramidase ácida enzima lisossómica é um candidato tentador, uma vez que, contrariamente à ceramida, pode atuar como um detergente, desestabilizando diretamente a membrana lisossomal. Além de aumentar a geração do precursor da esfingosina, ceramida, através da ativação das SMases, o TNF regula os niveis de esfingosina também pela subregulação mediada pela catepsina B da esfingosina cinase-1, uma enzima que converte a esfingosina pró-apoptótica numa esfingosina-l-fosfato anti-apoptótico. A atividade da catepsina B pode resultar na acumulação de esfingosina nos lisossomas e pode assim, pelo menos parcialmente, explicar a necessidade da catepsina B para um LMP eficiente em hepatócitos tratados com TNF. O TNF também pode gatilhar a LMP e a morte celular na presença de inibidores da caspase.Esta via é independente da caspase-8, mas requer a proteína-1 que interatua com o recetor contendo o domínio de morte (RIP-1) e envolve a geração de espécies reativas de oxigénio. O stress oxidativo pode, juntamente com o ferro intra-lisossómico, gerar radicais de oxigénio por meio de uma química do tipo Fenton e, assim, pode causar oxidação de lípidos da membrana lisossomal, resultando na destabilização da membrana e na libertação do conteúdo lisossomal. As ligações moleculares entre a RIP-1, o stress oxidativo e LMP estão, no entanto, ainda em falta. 61 A indução da morte celular por vários indutores de apoptose clássicos (por exemplo, p53 etoposido e estaurosporina) também envolve a LMP seguida pela permeabilização da membrana mitocondrial catepsina-dependente. No entanto, as vias de sinalização destes estímulos para a LMP continuam por ser clarificadas.

Mecanismos de Defesa Celular contra a LMP

Dado o resultado potencialmente fatal da LMP, não é surpreendente que as células desenvolveram numerosas estratégias parao contrariar quer por inibição da própria LMP ou por proteção das células contra as hidrolases ácidas vertendo para o citosol como consequência da LMP.

Entre as suas muitas outras funções, a fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K) foi descrita como protegendo os lisossomas contra a destabilização. A inibição da PI3K em células endoteliais vasculares humanas induz a libertação de catepsina B para o citosol argumentando a favor de um papel bastante direto de PI3K na preservação da integridade da membrana lisossomal. Além disso, os inibidores da PI3K sensibilizam as células para as vias de morte lisossomal induzida por TNF e interleucina-1. As funções lisossómicas alteradas e os níveis de expressão aumentada de catepsinas em células de cancro podem representar uma ameaça na forma de estabilidade diminuída dos lisossomas. Assim, ο PI3K, que é comumente ativado em células de cancro humanas, podem também contribuir para a estabilidade lisossomal de células tumorais e, assim, aumentar a sua resistência à morte celular. Considerando que o papel de PI3K sobre a estabilidade de lisossomas das células tumorais é puramente especulativo, dados recentes defendem um papel para a Hsp70 na proteção dos lisossomas contra estímulos disruptivos da membrana. Este trabalho foi realizado principalmente em 62 células tumorais, o que muitas vezes demonstra uma localização da Hsp70 na membrana plasmática, bem como no compartimento endolisossomal.

No caso da libertação de proteases lisossomais para o citosol aquando da LMP, os inibidores da protease citosólica apresentam um baluarte contra as suas consequências prejudiciais. Considerando que não são conhecidos inibidores endógenos da catepsina D, as catepsinas de cisteina podem ser eficazmente inibidas por pelo menos três inibidores da protease citosólica, i.e., a cistatina A e B e o inibidor da serina protease 2a (Spi2A), que foi recentemente verificado como possuindo atividade potente inibidora também contra várias catepsinas de cisteina (B, Η, K, L e V) e catepsina G. A importância destes inibidores na prevenção da PCD em condições fisiológicas e patológicas é demonstrada por ratinhos deficientes em cistatina B que exibem um aumento da apoptose de células granulosas cerebelares. Além disso, a expressão de Spi2A é induzida aquando do tratamento com TNF através da via NF-κΒ, e inibe eficazmente a atividade B da catepsina B citosólica induzida por TNF e a morte celular em MEFs. Curiosamente, foi descrito que apenas em C. elegans, o inibidor da serina protease citosólica (serpina) -6 pode proteger contra ambos indução, bem como os efeitos letais de lesões lisossomais causadas por stress hipo-osmótico, bem como uma variedade de outros stresses lisossómicos, demonstrando que a proteção contra a LMP é um mecanismo evolutivamente conservado.

Doenças do armazenamento lisossomal

As doenças do armazenamento lisossomal (LSDs) são um grupo de cerca de 40 doenças metabólicas raras hereditárias que resultam de defeitos na função lisossomal. As LSDs são 63 causadas pela disfunção lisossomal, usualmente como uma consequência da deficiência de uma única enzima necessária para o metabolismo dos lípidos, glicoproteinas ou mucopolissacáridos. Embora cada distúrbio resulte em mutações genéticas diferentes que se traduzem numa deficiência na atividade enzimática, eles todos partilham uma caracteristica bioquímica comum - todas as perturbações lisossómicas originam-se a partir de uma acumulação anormal de substâncias no interior do lisossoma.

Individualmente, as LSDs ocorrem com incidências em menos de 1:100.000, no entanto, como um grupo a incidência é cerca de 1:5000 - 1:10.000. A maioria destes distúrbios são autossómicos recessivos hereditários, porém alguns são ligados ao X recessivamente herdados, tais como a doença de Fabry.

As doenças de armazenamento lisossomal são geralmente classificadas pela natureza do material primário armazenado envolvido e podem ser amplamente divididas nas seguintes: - Distúrbios no armazenamento de lípidos (ou lipidoses), principalmente esfingolipidoses (incluindo as doenças de Gaucher e de Niemann-Pick) gangliosidose (incluindo a doença de Tay-Sachs) leucodistrofias - Mucopolissacaridoses (incluindo o síndrome de Hunter e a doença de Hurler)

Doenças de armazenamento da Glicoproteína (glicoproteinose) - Mucolipidoses 64

Dependendo da gravidade dos pacientes doentes, ou morrera com uma idade jovem e imprevisível, muitos dentro de alguns meses ou anos de nascimento, enquanto outros sobrevivem até a idade adulta, finalmente sucumbindo às diversas patologias de seu distúrbio em particular. Os sintomas da LSD variam, dependendo da desordem particular e pode ser ligeira a grave. Elas podem incluir um atraso no desenvolvimento, distúrbios do movimento, convulsões, demência, surdez e/ou cegueira. Algumas pessoas com LSD têm aumento do fígado (hepatomegalia) e baço aumentado (esplenomegalia), problemas pulmonares e cardíacos e um crescimento ósseo anormal.

[A maioria dos pacientes é inicialmente testada por um ensaio enzimático, que é o método mais eficiente para chegar a um diagnóstico definitivo. Em algumas famílias onde a(s) mutação(ões) causadora (s) da doença é conhecida e, em certos isolados genéticos, pode ser realizada a análise de mutação. Como podem haver numerosas mutações diferentes, a sequenciação do gene que codifica para a enzima afetada em particular é por vezes necessária para confirmar o diagnóstico. 0 diagnóstico pré-natal pode ser útil quando há um fator de risco genético conhecido. A presente invenção é uma forma de realização relacionada com um método para o tratamento dos distúrbios de armazenamento lisossomal.

Hidrólise dos esfingolípidos lisossomais

Uma multiplicidade de enzimas estão envolvidas no catabolismo lisossomal dos esfingolípidos (ou glicoesfingolípidos) (ver figura 4). Estas enzimas, ou mais especificamente hidrolases, são responsáveis, cada uma, pela degradação de um esfingolípido específico. 65

As hidrolases dos esfingolípidos lisossómicos interatuam com proteínas ativadoras dos esfingolípidos (SAP ou saposinas) para estimular a atividade das referidas hidrolases. As SAPs são consideradas como facilitadoras da interação enzima/substrato entre enzimas solúveis em água e substratos ligados à membrana.

Além disso, a composição lipídica dos compartimentos endossómicos tardios e compartimentos lisossomais são caracterizados pela presença de fosfolípidos carregados negativamente, tais como BMP e PI (fosfatidilinositol) , os quais também estimulam a atividade de algumas hidrolases. As hidrolases lisossomais BMP-dependentes incluem a sialidase, α-galactosidase A, glucosilceramidase, β galactosilceramidase, arilsulfatase A, ceramidase ácida e esfingomielinase.

Saposinas do Co-fator

As saposinas são pequenas proteínas lisossómicas que servem como ativadoras de várias enzimas que degradam lípidos lisossómicos. Elas atuam provavelmente pelo isolamento do substrato lipídico das redondezas da membrana, tornando assim mais acessível para as enzimas solúveis degradativas. Todas as saposinas de mamíferos são sintetizadas como uma molécula precursora única (prosaposina) que contém quatro domínios de saposina B-, obtendo-se as saposinas ativas após clivagem proteolítica e dois domínios de saposina-A que são removidos na reação de ativação. Os domínios de saposina-B também ocorrem em outras proteínas, muitas das quais ativas na lise das membranas. A prosaposina (PSAP) é uma proteína que em seres humanos é codificada pelo gene PSAP. Este gene codifica para uma glicoproteína altamente conservada que é um precursor para 4 produtos de clivagem: saposina A, B, C e D. A saposina é 66 um acrónimo para a Proteína Ativadora do Esfingolípido. Cada domínio da proteína precursora é de aproximadamente 80 resíduos de aminoácidos juntamente com a colocação quase idêntica de resíduos de cisteína e sítios de glicosilação. As saposinas A-D localizam-se principalmente no compartimento lisossomal onde facilitam o catabolismo de glicoesfingolípidos com grupos de oligossacarídeos de pequena dimensão. A proteína precursora existe tanto como uma proteína secretora e como uma proteína de membrana integral e tem atividades neurotróficas. As saposinas A-D são necessárias para a hidrólise de determinados esfingolípidos por hidrolases lisossomais específicas.

As saposinas são importantes co-ativadores da sialidase (SAP-B), α-galactosidase A (SAP-B), glucosilceramidase (SAP-C), β-galactosilceramidase (SAP-C), arilsulfatase A (SAP-B) e ceramidase ácida (SAP-D). A esfingomielinase acídica (aSMase) não é criticamente dependente de qualquer uma das proteínas ativadoras conhecidas, no entanto, a presença de saposinas aumenta a atividade desta enzima. Uma quinta saposina; a proteína ativadora do GM2 também foi caracterizada.

BMP O Bis(monoacilglicero) fosfato (BMP), também conhecido como ácido lisobisfosfatídico, é uma parte importante da composição lipídica dos compartimentos endossómicos e lisossomal tardios. É um fosfolípido carregado negativamente, mais especificamente um fosfolípido glicerol. O BMP foi isolado pela primeira vez a partir de pulmão de coelho, mas agora é conhecido como sendo um constituinte menor comum de todos os tecidos animais. A sua configuração estereoquímica difere da de outros glicerofosfolípidos de 67 origem animal em que a porção fosfodiéster está ligada às posições sn-1 e sn-1 'do glicerol, em vez de estar à posição sn-3. Ainda não é claro se as posições sn-3 e 3' ou sn-2 e sn-2' nas porções glicerol são esterifiçados com ácidos gordos. Quaisquer que sejam as posições dos ácidos gordos na molécula de glicerol, as suas composições podem ser diferentes, com 18:1 (n-9) e 18:2 (n-6) , 20:4 e 22:6 (n-3) sendo abundantes, embora isto seja altamente dependente do tipo especifico de tecido, célula ou organelo. Tais composições distintas sugerem funções bastante especificas, algumas das quais encontrando-se ainda por revelar. O BMP é geralmente um componente menor dos tecidos animais. No entanto, é altamente enriquecedor nos lisossomas do figado e noutros tecidos, onde ele pode ascender a 15% ou mais dos fosfolípidos da membrana e é agora reconhecido como um marcador para este organelo. São os endossomas e os lisossomas tardios que contêm o lipido único, BMP. Com efeito, parecem existir membranas internas dos endossomas tardios que contêm tanto 70% dos fosfolipidos como BMP.

Se a presença descrita do BMP em algumas estirpes alcalofilicas de espécies de Bacillus pode ser confirmada, esta será a única exceção conhecida à regra de que este lipido é estritamente de origem mamífera e não está presente em procariotas, leveduras e plantas superiores. Há boas evidências de que o BMP é sintetizado a partir do fosfatidilglicerol, principalmente no sistema endossomal. No que se acredita ser a via primária, uma fosfolipase A 2 remove o ácido gordo da posição sn-2 de fosfatidilglicerol no primeiro passo. No segundo passo, o lisofosfatidilglicerol é acilado na posição sn-2' do grupo cabeça com a porção glicerol para originar ácido 68 lisobisfosfatidico sn-3:sn-l por meio de uma reação de transacilase lisofosfatidilglicerol tanto como o dador acilo e o aceitador de acilo. 0 terceiro passo ainda tem de ser adequadamente descrito, mas deve envolver a remoção do ácido gordo da posição sn-1 da unidade de glicerol primário e um rearranjo do éster de fosforilo a partir da posição sn-3 para a posição sn-1. Finalmente a posição sn-2 da unidade de glicerol primário é esterifiçada, provavelmente por uma reação de transacilação com outro fosfolipido como dador (dai as composições de ácidos gordos distintas). Outras vias biossintéticas podem ser possíveis. A função do BMP em lisossomas está sob investigação ativa.Ele pode ter um papel estrutural no desenvolvimento do sistema de membrana complexo intraluminal, auxiliado por uma tendência para não formar uma bicamada. É uma molécula em forma de cone e encoraja a fusão das membranas com o pH nos endossomas. Além disso, a sua estereoquímica única significa que é resistente às fosfolipases, por isso vai dificultar ou prevenir a autodigestão das membranas lisossómicas. Os constituintes de ácidos gordos podem transformar-se rapidamente por transacilação, mas o suporte glicerofosfato é estável. Uma outra possibilidade é que este lípido possa associar-se com proteínas específicas em domínios de membrana, funcionalmente semelhantes a jangadas. Foi sugeriram que a rede de características das membranas ricas em BMP contidas nos endossomas tardios multivesiculares regula o transporte de colesterol, atuando como um ponto de captação re-distribuição. Por exemplo, quando as membranas lisossómicas são incubadas com anticorpos para o BMP, o colesterol tende a acumular-se. 0 processo está sob o controlo de Alix/AIPl, que é uma proteína que interatua especificamente com o BMP e está envolvida na classificação em endossomas multivesiculares. 69 0 BMP é conhecido por estimular grandemente as enzimas envolvidas na degradação de glicosilceramidas, tais como as proteínas ativadoras dos esfingolipidos como as saposinas. Neste caso, pode simplesmente funcionar o fornecimento de um ambiente adequado para a interação das hidrolases dos glicoesfingolipidos e o seu ativador. Além disso, tem um papel dinâmico na provisão de araquidonato para a produção de eicosanóides em macrófagos alveolares.

Para enzimas dependentes do BMP, a taxa de hidrólise é aumentada drasticamente quando o BMP está presente na membrana, para aSMase mesmo sem a presença de uma proteína ativadora, tal como a saposina. Na figura 4, um círculo pontilhado marca as enzimas, ou a doença em que esta enzima é defeituosa, que mostram uma dependência do BMP. 0 BMP está envolvido na patologia de doenças de armazenamento lisossómicas, tais como a doença de Niemann-Pick C (acumulação de colesterol) e certas lipidoses induzidas por fármacos. Nestas circunstâncias, a sua composição tende a mudar para favorecer espécies moleculares que contêm menor quantidade dos componentes poli-insaturados. É um antigénio reconhecido pelos soros auto-imunes de pacientes com uma doença rara e pouco compreendida, conhecida como sindrome anti-fosfolípido, por isso é provavelmente um fator na base patológica desta doença. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para tratar distúrbios de armazenamento lisossómicas, por exploração da interação entre Hsp70 e BMP.

Os distúrbios de armazenamento lipidico 70

Os distúrbios do armazenamento lipidico (ou lipidoses) são um subgrupo do distúrbios do armazenamento lisossomal em que quantidades prejudiciais de lípidos se acumulam no espaço intracelular, devido à expressão ou função reduzida das enzimas necessárias para metabolizar os lípidos. Ao longo do tempo, este armazenamento excessivo de lípidos pode causar danos celulares permanentes e danos nos tecidos, particularmente no cérebro, sistema nervoso periférico, fígado, baço e medula óssea.

Os lípidos são um grande grupo de moléculas que ocorrem naturalmente e que incluem as gorduras, ceras, esteróis, vitaminas lipossolúveis (Tais como vitaminas A, D, E e K), monoglicéridos, diglicéridos, fosfolípidos e outros. As principais funções biológicas dos lípidos incluem o armazenamento de energia, como componentes estruturais das membranas celulares e como importantes moléculas sinalizadoras.

Os lípidos podem ser amplamente definidos como moléculas pequenas hidrófobas ou anfifílicas; a natureza anfifílica de alguns lípidos permite-lhes formar estruturas tais como vesículas, lipossomas, ou membranas em um ambiente aquoso. Os lípidos biológicos têm origem inteiramente ou em parte a partir de dois tipos distintos de subunidades bioquímicas: grupos cetoacilo e isopreno. Usando esta abordagem, os lípidos podem ser divididos em oito categorias: acilos gordos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos e policetidos (derivados da condensação de subunidades cetoacilo); e lípidos de esterol e lípidos de prenol (derivados da condensação de subunidades de isopreno).

Embora o termo lípido seja usado às vezes como sinónimo de gorduras, as gorduras são um subgrupo de lípidos chamados 71 triglicéridos. Os lípidos também englobam moléculas tais como ácidos gordos e seus derivados (incluindo tri-, di-, e monoglicéridos e fosfolípidos), bem como outros metabolitos contendo esteróis, tais como o colesterol. Várias doenças do armazenamento lisossomal caracterizadas pela acumulação de lipidos (i.e., doenças de depósito de lipidos) têm sido caracterizadas, estas são delineadas aqui abaixo. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para tratar distúrbios de armazenamento de lipidos.

Doença de Niemann-Pick A doença de Niemann-Pick (DNP) é causada por um defeito na enzima esfingomielinase ácida (aSMase), com o nome sistemático esfingomielina fosfodiesterase. Grande parte da esfingomielina da membrana é hidrolisada pela enzima lisossómica aSMase para produzir ceramida (e fosfocolina). A esfingomielina consiste em uma âncora na membrana de ceramida que está ligada a uma porção fosforilcolina curta e hidrófila. A esfingomielinase não é criticamente dependente de qualquer uma das proteínas ativadoras conhecidas, fazendo com que o presumível domínio ativador intramolecular da aSMase e na presença de lípidos carregados negativamente nos lisossomas seja suficiente para o turnover da esfingomielina. aSMase não requer, portanto, a presença de saposinas como um co-factor, no entanto a presença de saposinas invariavelmente estimula a atividade desta enzima. (Ferlinz et al., 1999). A atividade da aSMase é estimulada pelo BMP. 72

Quando a esfingomielina não pode ser metabolizada adequadamente, ela é acumulada no interior da célula, eventualmente causando a morte da célula e o mau funcionamento dos sistemas de órgãos principais. Os sintomas podem incluir falta de coordenação muscular, degeneração cerebral, problemas de aprendizagem, perda de tónus muscular, aumento da sensibilidade ao toque, espasticidade, dificuldades na alimentação e deglutição, discurso imperceptível e um aumento do fígado e do baço. Pode haver opacificação da córnea e um halo característico vermelho-cereja desenvolve-se em torno do centro da retina. A doença de Niemann-Pick (NPD) tem 4 tipos relacionados, tipos A, B, C e D. Todos os tipos de NPD são herdados de um padrão autossómico recessivo e pode afetar ambos machos e fêmeas. Nos tipos A e B, uma atividade insuficiente da enzima aSMase provoca a acumulação de quantidades tóxicas de esfingomielina. A doença ocorre quando as duas cópias do gene aSMase de uma pessoa (ambos os alelos) têm uma mutação. A Niemann-Pick Tipo A (NPDA), o tipo mais comum, ocorre em crianças. É caracterizada por icterícia, um aumento do fígado e lesões cerebrais profundas. Não há atualmente nenhum tratamento eficaz para pessoas com tipo A e os pacientes com tipo A morrem ainda na infância, geralmente antes dos 18 meses de idade. A Niemann-Pick Tipo B (NPDB) envolve um aumento do fígado e do baço, que normalmente ocorre na fase pré-adolescente e os problemas respiratórios são comuns. 0 alargamento dos órgãos e os problemas respiratórios podem causar stress cardiovascular e pode levar a doença cardíaca mais tarde na vida. Os doentes com NPDB geralmente têm pouco ou nenhum envolvimento neurológico. 0 transplante da medula óssea tem sido tentado em alguns pacientes com tipo B, e têm sido 73 descritos resultados mistos. 0 desenvolvimento futuro da reposição enzimática e as terapias genéticas também poderão ser úteis para aqueles com tipo B. As crianças com tipo B podem viver um tempo comparativamente longo, mas podem requerer suplementação de oxigénio por causa do enfraquecimento do pulmão. A NPDA e a NPDB são provocadas pela mesma deficiência enzimática e há uma evidência crescente de que as duas formas representam lados opostos de um continuo. Pessoas com NPDA geralmente têm pouca ou nenhuma produção de aSMase (menos de 1% do normal) , enquanto aquelas com NPDB têm aproximadamente 10% do nivel normal de aSMase. Há cerca de 1.200 casos de NPA e NPB no mundo, com a maioria sendo do tipo B ou uma forma intermediária. A NPDA e a NPDB são diagnosticadas através da medição do nível de atividade de aSMase em glóbulos brancos, a partir de amostras do sangue. Embora este teste vá identificar pessoas com o tipo B, não é muito fiável para a deteção de pessoas que são portadoras (que têm apenas uma cópia não funcional do gene ASM) . Além disso, o teste vai apresentar diminuição da atividade aSMase, mas nem sempre pode prever se o indivíduo terá o tipo A ou o tipo B ou uma variante intermediária da doença; que requer uma avaliação clínica do indivíduo.

Em certas populações, as mutações específicas contribuem para uma elevada percentagem de casos de deficiência da aSMase. Para a NPDA, as mutações R496L, fsP330 e L302P contribuem para mais de 95% das doenças que causam alterações genéticas na população judaica Ashkenazi. O teste direto de indivíduos nesta população para estas 3 variações é utilizado para a identificação do portador. Em 74 outras populações, as mutações devem primeiro ser identificadas no indivíduo afetado antes do teste ao portador do ADN poder ser realizado por membros da família. Para a NPDB, as mutações do H421 Y e K576N aSMase contribuem para 85% da população árabe saudita com NPDB; as mutações L137P, fsP189 e L549P contribuem para 75% da população turca com NPDB, as mutações S379P, R441X e R474W contrbuem para 55% da população Portuguesa com NPDB; as mutações A196P contribuem para 42% da população Inglesa/Escocesa com NPDB e as mutações F480L e DeltaR608 também têm sido identificadas como causadoras da doença em pacientes com NPDB. A Niemann-Pick do Tipo C (NPDC) é muito diferente do tipo A ou B. Os pacientes NPDC não são capazes de metabolizar o colesterol e outros lípidos adequadamente, no interior da célula e é caracterizada por um defeito que perturba o transporte do colesterol entre as células do cérebro. Consequentemente, quantidades excessivas de colesterol e outros lípidos acumulam-se dentro do fígado, baço e cérebro. A NPDC provoca uma redução da atividade secundária da aSMase, o que levou a que todos os três tipos sejam considerados como formas da mesma doença. Há uma variação considerável quando os sintomas do tipo C aparecem primeiro e na progressão da doença. Os sintomas podem aparecer tão cedo quanto alguns meses de idade ou tão tarde quanto a idade adulta. Paralisia do olhar fixo (a incapacidade de mover os olhos para cima e para baixo) , aumento do fígado, aumento do baço, ou icterícia em crianças pequenas são fortes indícios de que a NPC deve ser considerada. É comum que apenas um ou dois sintomas apareçam nos estágios iniciais da doença. Em muitos casos, os sintomas neurológicos começam a aparecer entre as idades 75 de 4 e 10. Geralmente, quanto mais tarde começam os sintomas neurológicos, mais lenta é a progressão da doença. A doença Niemann Pick do Tipo C tem cerca de 500 casos diagnosticados em todo o mundo.Acredita-se, contudo, que o número de pessoas afetadas pela NPDC é maior, mas as dificuldades de diagnóstico não permitem uma avaliação precisa da taxa de ocorrência. A NPDC foi inicialmente diagnosticada como uma deficiência na aprendizagem, atraso ligeiro, falta de jeito e desenvolvimento tardio da coordenação motora fina. A Niemann-Pick do Tipo D é agora considerada uma variante do tipo C. O Tipo D geralmente ocorre em pessoas com um passado ancestral na Nova Escócia. Os indivíduos com tipos C e D são frequentemente colocados com uma dieta baixa em colesterol, mas o seu benefício clínico não é convincente. A esperança de vida das pessoas com os tipos C e D varia, no entanto, a doença é sempre fatal. A grande maioria das crianças morrem antes dos 20 anos. A NPDC é uma condição rara e extremamente variável e, portanto, pode não ser reconhecida por alguns prestadores de cuidados de saúde para os especialistas que suspeitem deste diagnóstico para um paciente, ele pode ser determinado fazendo uma biópsia da pele, uma cultura dos fibroblastos e estudo da sua capacidade para transportar e armazenar o colesterol. O transporte de colesterol nas células é estudado através da medição da conversão do colesterol a partir de uma forma em outra (esterificação). O armazenamento do colesterol é avaliado por coloração das células com um produto químico (filipina) que brilha sob luz ultravioleta.

Em 1997, o gene NPC1 foi identificado.Mutações, ou variações causadoras da doença, neste gene são responsáveis 76 por cerca de 95% de todos os casos NPDC. Desde então, mais de 250 mutações genéticas diferentes relacionadas com a NPDC foram identificadas neste gene e no segundo gene NPDC, chamado NPC2. No global, em cerca de 95% dos casos, é possível identificar as alterações genéticas que causaram a doença, se o diagnóstico da NPC tiver sido confirmado pelos testes descritos acima. No entanto, porque há tantas mutações únicas nesses genes e há pacientes com NPC clássica nos quais as mutações não foram identificadas, não é ideal usar testes genéticos como uma ferramenta de diagnóstico geral para a NPDC. A Doença de Niemann-Pick afeta todos os segmentos da população com casos descritos da América do Norte, América do Sul, Europa, África, Ásia e Austrália. No entanto, uma incidência elevada tem sido encontrada em certas populações: • população judaica Ashkenazi (NPDA e NPDB) • população franco-canadiana de Nova Escócia (tipo D agora considerada uma variante da NPDC) • região do Magrebe (Tunísia, Marrocos e Argélia) do Norte de África (NPDB) • população hispano-americana do sul do Novo México e Colorado (NPDC) A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para o tratamento da doença de Niemann-Pick-, por modulação da atividade enzimática (aSMase) da esfingomielinase acídica.

Doença de Farber A doença de Farber é causada por um defeito na enzima ceramidase ácida.A ceramidase ácida é responsável pela conversão da ceramida em esfingosina (e ácido gordo); o 77 defeito, portanto, leva a uma acumulação de ceramida. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas. A ceramidase ácida é também conhecida como N-acilesfingosina amido-hidrolase e é codificada pelo gene ASAH1. É uma proteina heterodimérica consistindo de uma subunidade alfa não glicosilada e uma subunidade beta glicosilada que é clivada para a enzima madura pós-traducão. A doença de Farber é também conhecida como lipogranulomatose de Farber, deficiência em ceramidase, dismucopolisacaridose fibrocitica e Lipogranulomatose. É uma doença autossómica recessiva extremamente rara, caracterizada por anomalias nas articulações, fígado, garganta, tecidos e no sistema nervoso central. 0 fígado, coração e rins também podem ser afetados. Os sintomas são tipicamente observados nas primeiras semanas de vida e incluem deficiências na coordenação motora e mental e dificuldade na deglutição. Outros sintomas podem incluir artrite, inchaço dos nódulos linfáticos e articulações, rouquidão, nódulos sob a pele (e por vezes nos pulmões e outras partes do corpo), encurtamento crónico dos músculos ou tendões ao redor das articulações e vómitos. As pessoas afetadas podem necessitar da inserção de um tubo de respiração. Em casos graves, o fígado e o baço aumentam de tamanho.

Atualmente, não existe tratamento específico para a doença de Farber.Os corticosteróides podem ajudar a aliviar a dor. Os nódulos podem ser tratados com transplantes de medula óssea, em certos casos, ou podem ser reduzidos ou removidos cirurgicamente. A maioria das crianças com a forma clássica da doença de Farber morrem aos 2 anos de idade, geralmente 78 de doença pulmonar. Os indivíduos que tenham uma forma mais ligeira da doença podem viver até à adolescência. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para tratar a doença Farber, por modulação da atividade da enzima ceramidase ácida.

Doença de Krabbe A doença de Krabbe é causada por um defeito na enzima β-galactosilceramidase. A β-galactosilceramidase é responsável pela conversão da galactosilceramida em ceramida; o defeito, portanto, leva a uma acumulação de galactosilceramida. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas. A doença de Krabbe é também conhecida como leucodistrofia das célula globóides ou lipidose galactosilceramida.É uma desordem autossómica recessiva degenerativa rara, muitas vezes fatal que afeta a bainha de mielina do sistema nervoso. Ela ocorre em cerca de 1 em cada 100.000 nascimentos. Uma prevalência maior, com cerca de 1 em 6.000 foi descrita para algumas comunidades árabes em Israel. A doença de Krabbe é causada por mutações no gene GalC, o que provoca uma deficiência da enzima galactosilceramidase. A acumulação de lípidos afeta o crescimento da bainha de mielina que protege o nervo (o revestimento que isola muitos nervos) e provoca degeneração grave das capacidades motoras.

As crianças com a doença de Krabbe são normais no nascimento. Os sintomas começam entre as idades de 3 e 6 meses com irritabilidade, febre, rigidez dos membros, convulsões, dificuldade na alimentação, vómitos e atraso no desenvolvimento mental e motor. Nos primeiros estágios da 79 doença, os médicos muitas vezes confundem os sintomas com os da paralisia cerebral. Outros sintomas incluem fraqueza muscular, espasticidade, surdez, atrofia ótica e cegueira, paralisia e dificuldade na deglutição. A perda de peso prolongada também pode ocorrer. Há também casos juvenis e adultos com inicio da doença de Krabbe, que têm sintomas semelhantes, mas cuja progressão é mais lenta. Em crianças, a doença é geralmente fatal antes dos 2 anos. Os pacientes com inicio tardio da doença de Krabbe tendem a ter uma progressão mais lenta da doença e uma vida significativamente mais longa.

Embora não haja nenhuma cura para a doença de Krabbe, o transplante de medula óssea foi demonstrado como sendo benéfico para casos detetados no inicio do curso da doença. Geralmente, o tratamento para este distúrbio é sintomático e de apoio. A terapia fisica pode ajudar a manter ou a aumentar o tónus muscular e a circulação. Um estudo recente descreve que os transplantes de sangue do cordão umbilical foram bem sucedidos no impedimento da doença, desde que ocorram antes de surgirem sintomas evidentes. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para o tratamento da doença de Krabbe, por modulação da atividade da enzima β-galactosilceramidase.

Doença de Fabry A doença de Fabry é causada por um defeito no a-galactosidase A enzima, α-galactosidase A é responsável pela conversão de globotriaosilceramida em lactosilceramida; o defeito, assim, leva a uma acumulação de globotriaosilceramida (também abreviada como Gb3, GL-3, ou triexosida de ceramida). A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas. 80 A doença de Fabry é também conhecida como doença de Anderson-Fabry, angioqueratoma corpóreo difuso, sindrome de Ruiter-Pompen-Wyers, triexosidose Ceramida e doença de Sweeley-Klionsky. É uma doença (hereditária) recessiva associada ao X (herdado) que afeta machos hemizigóticos, bem como fêmeas, tanto heterozigóticas e homozigóticas, os machos tendem a experimentar os sintomas clínicos mais graves, enquanto as fêmeas variam desde praticamente nenhum sintoma até aqueles tão graves como nos machos. Esta variabilidade pensa-se ser devida aos padrões de inactivação do X durante o desenvolvimento embrionário do sexo feminino.

Os sintomas incluem anidrose (falta de sudação), fadiga, angioqueratomas (lesão cutânea benigna dos capilares), dor ardente nas extremidade e envolvimento ocular. Os angioqueratomas são minúsculos, pápulas indolores que aparecem em qualquer região do corpo, mas são predominantes nas coxas, nádegas, parte inferior do abdómen e virilha. O envolvimento ocular cosmético pode estar presente apresentando córnea verticillata (também conhecida como ceratopatia vórtice). A ceratopatia pode ser a caracteristica de apresentação em portadores assintomáticos e deve ser diferenciada de outras causas de ceratopatia Vortex (por exemplo, deposição de fármacos na córnea). Outras verificações oculares que podem ser observadas incluem aneurismas conjuntivais, cataratas posteriores, papiloedema, edema macular, atrofia ótica e dilatação vascular da retina.As complicações renais são um problema comum e um efeito grave da doença, a insuficiência renal e a falha renal podem piorar ao longo da vida. A proteinúria é muitas vezes o primeiro sinal do envolvimento renal. Complicações cardíacas também podem ocorrer, os efeitos cardíacos relacionados pioram com a idade e podem levar ao aumento do risco de doença cardíaca. Efeitos 81 cerebrovasculares levam a um aumento do risco de acidente vascular cerebral. Outros sintomas incluem zumbidos, vertigens, náuseas e diarréia.

Os sintomas são normalmente experimentados pela primeira vez na infância e podem ser muito difíceis de entender, a raridade da doença de Fabry para muitos médicos, por vezes, leva à realização de diagnósticos errados ou ignorância. As manifestações da doença geralmente aumentam em número e gravidade como a idade do indivíduo.

Até recentemente, o tratamento da doença de Fabry era direcionado aos efeitos sintomáticos.No entanto, está atualmente a ser tratada ao nível celular através da terapia de substituição enzimática (ERT), utilizando a agalsidase alfa (Replagal) e agalsidase beta (Fabrazyme). 0 custo destes fámacos é problemático (aproximadamente 250.000 dólares EUA por ano/paciente) e continua a constituir uma barreira para muitos pacientes, em alguns países. A terapia de substituição enzimática (tipicamente infundida a cada duas semanas) pode ser realizada na casa do paciente pelos próprios pacientes. A terapia de substituição enzimática não é uma cura e deve ser infundida recorrentemente para o máximo benefício. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para tratar a doença de Fabry, por modulação da atividade da enzima α-galactosidase A.

Doença de Gaucher A doença de Gaucher é causada por um defeito na enzima glucosilceramidase (também conhecida como glucocerebrosidase e β-glucosidase ácida); uma proteína longa com 497 aminoácidos e KD 55,6. A glucosilceramidase é responsável pela conversão de glicosilceramida (ou 82 glicocerebrosideo) a ceramida, o defeito, portanto, leva a uma acumulação de glicosilceramida. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas. A doença de Gaucher é a mais comum das doenças de armazenamento lisossómicas. 0 material gordo pode acumular-se no baço, figado, rins, pulmões, cérebro e medula óssea. Os sintomas podem incluir o aumento de tamanho do baço e figado, mau funcionamento do figado, distúrbios do esqueleto e lesões ósseas que podem ser dolorosos, complicações neurológicas graves, inchaço dos nódulos linfáticos e (ocasionalmente) articulações adjacentes, abdómen distendido, uma tonalidade acastanhada da pele, anemia, plaquetas sanguíneas baixas e depósitos de gordura amarelos sobre a esclerótica. As pessoas afectadas com maior gravidade também podem ser mais suscetíveis à infeção. A doença apresenta uma herança autossómica recessiva e, portanto, afeta ambos machos e fêmeas. Mutações diferentes da glucosilceramidase determinam a atividade remanescente da enzima e, em grande medida, o fenótipo. A investigação sugere que os heterozigóticos para determinadas mutações da glucosilceramidase têm um risco aumentado relativamente à Doença de Parkinson e determinadas doenças malignas (linfoma não-Hodgkin, melanoma e cancro pancreático). A glicosilceramida é um constituinte da membrana celular dos glóbulos vermelhos e brancos.Os macrófagos que limpam estas células são incapazes de eliminar os resíduos, os quais se acumulam em fibrilas e se transformam em células de Gaucher, que são visíveis em microscopia ótica assemelhando-se a papel amassado. 83 A doença de Gaucher tem três subtipos clínicos comuns.Cada tipo tem sido associado a determinadas mutações. Em todos, existem cerca de 80 mutações conhecidas. • Tipo I (ou tipo não neuropático) é a forma mais comum da doença, ocorrendo em aproximadamente 1 em 50.000 nados vivos. Ela ocorre mais frequentemente entre pessoas de origem judaica ashkenazi, com 100 vezes a ocorrência da população geral. Os sintomas podem começar cedo na vida ou na vida adulta e incluem o aumento do fígado e o baço grosseiramente aumentado (hepatoesplenomegalia conjunta), o baço pode romper e causar complicações adicionais. A fraqueza do esqueleto e a doença óssea pode ser extensa. O aumento do baço e a substituição da medula óssea causa anemia, trombocitopenia e leucopenia. O cérebro não é afetado, mas pode ocorrer a debilitação do pulmão e, raramente, insuficiência renal. Os pacientes deste grupo geralmente desenvolvem consusões facilmente (devido aos baixos níveis de plaquetas) e experimentam fadiga devido ao número reduzido de glóbulos vermelhos. Dependendo do início da doença e da sua gravidade, os pacientes tipo 1 podem viver bem até à idade adulta. Muitos pacientes têm uma forma moderada da doença ou podem não apresentar quaisquer sintomas. • Tipo II (ou doença de Gaucher neuropática aguda infantil) começa tipicamente até 6 meses após o nascimento e tem uma taxa de incidência de aproximadamente 1 em 100.000 nados vivos. Os sintomas incluem um aumento do fígado e do baço, danos cerebrais extensos e progressivos, distúrbios do movimento ocular, espasticidade, convulsões, rigidez dos membros e uma capacidade reduzida de sucção e deglutição. As crianças afetadas geralmente morrem até aos 2 anos. 84 • 0 Tipo III (forma neuropática crónica) pode começar a qualquer momento na infância ou mesmo na idade adulta e ocorre em aproximadamente 1 em cada 100.000 nados vivos. É caracterizada por sintomas neurológicos mais moderados de progressão lenta em comparação com a versão aguda ou do tipo 2. Os principais sintomas incluem um aumento do baço e/ou do figado, convulsões, coordenação fraca, irregularidades do esqueleto, distúrbios do movimento ocular, doenças do sangue, incluindo anemia e problemas respiratórios. Os pacientes normalmente vivem até ao inicio da adolescência e idade adulta. A Fundação Nacional de Gaucher afirma que cerca de 1 em cada 100 pessoas na população geral dos EUA é portadora do tipo 1 da doença de Gaucher, dando uma prevalência de 1 em 40.000; entre judeus Ashkenazi a taxa de portadores é consideravelmente mais elevada, com cerca de 1 em cada 15. A doença de Gaucher do tipo 2 não apresenta preferência por qualquer grupo étnico. A doença de Gaucher do Tipo 3 é especialmente comum na população da região Norte da Suécia de Norrbotten, onde a incidência da doença é de 1 em 50.000.

Para os paciente com o tipo 1 e para a maioria daqueles com o tipo 3, o tratamento de substituição enzimática com glucosilceramidase recombinante por via intravenosa pode diminuir o tamanho do figado e do baço, reduzir as anomalias do esqueleto e inverter outras manifestações. A raridade da doença significa que os estudos para averiguação da dose têm sido difíceis de conduzir, por isso ainda há controvérsia sobre a dose ideal e frequência de administração. Devido à baixa incidência, este tornou-se um fármaco órfão em muitos países. O tratamento atualmente existente para a doença de Gaucher, Cerezyme® (imiglucerase) , custa até 550 mil dólares por ano, para um 85 único paciente e o tratamento deve ser continuado por toda a vida. 0 Miglustat é um outro fármaco aprovado para esta doença em 2003.

Um transplante de medula óssea bem sucedido cura as manifestações não neurológicas da doença, porque apresenta uma população de monócitos com glucosilceramidase ativa. No entanto, este procedimento tem um risco significativo e raramente é realizado em pacientes de Gaucher. A cirurgia para remoção do baço (esplenectomia) pode ser necessária em raras ocasiões se o paciente estiver anémico ou quando o órgão alargado afetar o conforto do paciente. A transfusão de sangue pode beneficiar alguns pacientes anémicos. Outros pacientes podem necessitar de cirurgia de substituição articular para melhorar a mobilidade e a qualidade de vida. Outras opções de tratamento incluem antibióticos para infeções, anti-epiléticos para convulsões, bisfosfonatos para lesões ósseas e transplantes de figado. A terapia de redução do substrato pode provar ser eficaz na paragem do Tipo 2, pois pode atravessar a barreira sanguínea para o cérebro. Não existe atualmente um tratamento eficaz para os danos cerebrais graves que podem ocorrer em pacientes com os tipos 2 e 3 da doença de Gaucher. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para o tratamento de doença de Gaucher, por modulação da atividade enzimática da glucosilceramidase.

Sialidose A sialidose ou mucolipidose tipo I (MLI), é causada por um defeito na enzima sialidase (ou alfa-neuraminidase). A sialidase é responsável pela conversão de GM3 em 86 lactosilceramida; o defeito, portanto, leva a uma acumulação de GM3. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas. A sialidose é herdada de um modo autossómico recessivo.Os sintomas estão presentes quer ao nascimento ou se desenvolvem ao longo do primeiro ano de vida. Em muitas crianças afetadas, o inchaço excessivo em todo o corpo é notado aquando do nascimento. Estas crianças normalmente nascem com caracteristicas faciais grosseiras, tais como uma ponte nasal plana, pálpebras inchadas, alargamento das gengivas e uma lingua excessivamente grande (macroglossia). Muitas crianças também nascem com malformações esqueléticas, tais como a deslocação da anca. As crianças frequentemente desenvolvem súbitas contrações musculares involuntárias (chamadas mioclonia) e têm manchas vermelhas em seus olhos (máculas vermelho cereja). Elas são muitas vezes incapazes de coordenar os movimentos voluntários (chamado ataxia). Também podem ocorrer tremores, visão turva e convulsões. Os testes revelam um aumento anormal do figado (heptomegalia) e do baço (esplenomegalia) e um inchamento abdominal extremo. As crianças geralmente não têm tônus muscular (hipotonia) e tem atraso mental, que é inicialmente ou progressivamente grave. Muitos pacientes sofrem de défice de crescimento e de infeções respiratórias recorrentes. A maioria das crianças com ML I morre antes da idade de 1 ano. A sialidose pode ser sub-classifiçada de acordo com a idade em que os sintomas começam e com os tipos de sintomas presentes. Os efeitos da doença podem variar de moderados a graves. A sialidose é uma doença rara que não tem predileção racial. Estão disponíveis muito poucos dados populacionais, 87 mas um estudo da Holanda descreve uma frequência de aproximadamente 1 caso em 2,175,000 nados vivos. No entanto, esta taxa poderá não se aplicar a todas as populações, algumas das quais poderiam ter uma maior incidência, além disso, o reconhecimento clinico perdido é um fator importante na triagem neonatal não é uma opção.

As opções de tratamento para a sialidose permanecem limitadas e são principalmente dirigidas a cuidados de suporte e de alivio dos sintomas. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para o tratamento de sialidose, por modulação da atividade da sialidase.

Leucodistrofia metacromática A leucodistrofia metacromática (MLD) ou a deficiência em Arilsulfatase A é causada por um defeito na enzima arilsulfatase A (ou cerebrósido-sulfatase). A arilsulfatase A é responsável pela conversão do sulfatídeo (ou cerebrósido 3-sulfato) para a galactosilceramida; o defeito, portanto, leva a uma acumulação de sulfatídeo. A sua atividade é estimulada pelo BMP e é dependente de saposinas. É uma doença do armazenamento lisossomal que é comumente listada na família de leucodistrofias. A leucodistrofia afeta o crescimento e/ou o desenvolvimento de mielina, o revestimento gordo que atua como um isolador em torno das fibras nervosas ao longo do sistema nervoso central e periférico.

Como muitos outros distúrbios genéticos que afetam o metabolismo lipídico, existem várias formas de MLD, que são a infantil, juvenil e adulta tardias • Na forma infantil tardia, que é a forma de MLD mais comum, as crianças afetadas começam a ter dificuldade para caminhar após o primeiro ano de vida. Os sintomas incluem perda de massa muscular e fraqueza, rigidez muscular, atrasos de desenvolvimento, perda progressiva de visão levando à cegueira, convulsões, disfagia, paralisia e demência. As crianças podem entrar em coma. Quando não são tratadas, a maioria das crianças com esta forma de MLD morrer até aos 5 anos de idade, muitas vezes muito mais cedo. • As crianças com a forma juvenil da MLD (início entre os 3-10 anos de idade) geralmente começam a evidenciar um desempenho escolar prejudicado, a deterioração mental, demência e em seguida desenvolvem sintomas semelhantes aos da forma infantil tardia, mas com progressão mais lenta. A idade da morte é variável, mas normalmente dentro de 10 a 15 anos do início dos sintomas. • A forma adulta começa geralmente após os 16 anos como um distúrbio psiquiátrico ou demência progressiva.A MLD com início na idade adulta progride mais lentamente do que as formas infantil tardia e juvenil, com um curso prolongado de uma década ou mais.

Em casos raros o corpo pode compensar a deficiência e a pessoa não apresenta sintomas. Não há cura para a MLD nem um tratamento padrão, é uma doença terminal. As crianças com um início avançado juvenil ou adulto e pacientes infantis tardios apresentando sintomas, têm o tratamento limitado à dor e à gestão dos sintomas. Os pacientes MLD pré-sintomáticos infantis tardios , bem como aqueles com MLD juvenil ou adulta que ou são pré-sintomáticos ou exibem sintomas ligeiros a 89 moderados, têm a opção de transplante de medula óssea (incluindo o transplante de células estaminais), que está sob investigação. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para o tratamento da leucodistrofia metacromática, pela modulação da atividade da enzima arilsulfatase A. Défice em Saposina

Em ambos os seres humanos e ratos, as deficiências em prosaposina/deficiências levaram a graves défices neurológicos.

Os pacientes humanos com mutações pontuais na saposina A, B e C apresentam fenótipos da doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática e doença de Gaucher, indicando que os seus substratos primários in vivo são o sulfatideo de galactosilceramida e a glucosilceramida, respetivamente. A doença de Krabbe, atípica, devido à deficiência em saposina A: um distúrbio bioquímico hereditário que resulta na regressão neurológica em alguns meses após o nascimento. A morte geralmente ocorre durante os primeiros anos de vida. 0 distúrbio é semelhante ao da doença de Krabbe mas é diferenciado pela origem genética do defeito bioquímico. A doença de Krabbe envolve um defeito no gene galactocerebrosidase enquanto que a doença de Krabbe atípica envolve um defeito no gene prosaposina que causa uma deficiência de saposina A. A saposina B, anteriormente conhecida como SAP-1 e ativador sulfatideo, estimula a hidrólise de uma grande variedade de substratos, incluindo o sulfato de cerebrósido, gangliósido GM1 e globotriaosilceramida por arilsulfatase A, 90 betagalactosidase ácida, e alfa-galactosidase, respetivamente. A deficiência em saposina B humana, transmitida como uma caracteristica autossómica recessiva, resulta em acumulação no tecido de sulfato de cerebrósido e um quadro clinico semelhante à leucodistrofia metacromática (leucodistrofia metacromática deficiente no ativador), embora com atividade da arilsulfatase normal. A deficiência em saposina B é uma doença heterogénea com um espetro semelhante ao de leucodistrofia metacromática. A saposina (SAP-) C é necessária para a degradação da glucosilceramida e os resultados da sua deficiência em uma forma variante da doença de Gaucher; doença de Gaucher não neuronopática devido à deficiência em SAP-C. Níveis muito elevados da atividade da quitotriosidase atividade da quimiocina, CCL18 e aumento da concentração de glucosilceramida e atividade da β-glucosidase normal em fibroblastos na pele são observados nos pacientes. Uma mutação missense, p.L349P, localizada no domínio SAP-C e uma outra mutação, p.MIL, localizada no codão de iniciação da proteína precursora de prosaposina foi identificada.

Em alguns pacientes não-neuronopáticos de Gaucher, uma mutação em ambos saposina C e saposina D foi identificada. A combinação das deficiências em saposina C e D em ratinhos leva a um fenótipo neuronopático com glucosilceramida e acumulação de alfa-hidroxi ceramida.

Em ratinhos, a deficiência em saposina D está associada à acumulação de ceramida, perda parcial de células de Purkinje e comprometimento da função do sistema urinário. Este fenótipo não mimetiza a letalidade embrionária exibida por ratinhos com deficiência completa da ceramidase ácida, enzima do cognato da saposina D. 91

Duas mutações são conhecidas em seres humanos, que resultam na inativação completa de todas as quatro saposinas e da prosaposina. A deficiência total em saposina é uma doença devastadora, com envolvimento de múltiplos órqãos e esfinqolipidos múltiplos. A deficiência combinada em saposina (ou deficiência de prosaposina) foi descrita em um caso apresentando-se com uma grave distrofia neurovisceral que causou a morte em um recém-nascido. Esfinqolipidos múltiplos foram elevados na urina, com a qlobotriaosilceramida apresentando o maior aumento. Uma nova mutação no qene PSAP foi identificada, sendo homoziqótica para uma mutação localizada aceitadora de splice duas bases a montante do exão 10. Esta mutação conduziu a um codão de paraqem prematuro e rendeu niveis reduzidos de transcrito. A presente invenção está, em uma forma de realização, relacionada com um método para o tratamento de deficiência de saposina.A referida deficiência em saposina pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em deficiência em saposina A, deficiência em saposina B, deficiência em saposina C, deficiência em saposina D e deficiência combinada em saposina (ou deficiência em prosaposina).

Atividade enzimática residual

As doenças de armazenamento lisossómicas são, como descrito aqui acima, causadas por uma enzima com defeito. A referida enzima com defeito pode não ter uma atividade residual, ou pode ter alguma atividade residual. A atividade enzimática residual, tal como aqui utilizada, significa que, embora a enzima seja defeituosa, por exemplo, por causa de uma mutação, a atividade da enzima 92 não é completamente abolida, mas em vez disso é reduzida a um nivel patológico. A presente invenção refere-se, em um aspeto, a um agente bioativo para uso no tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal e a um método para o tratamento de um indivíduo com uma doença do armazenamento lisossomal.

Em uma forma de realização da presente invenção, a doença do armazenamento lisossomal, que é tratada de acordo com a presente invenção é caracterizada como tendo atividade residual enzimática da enzima defeituosa envolvida na patologia da doença.

Em uma forma de realização, a referida atividade enzimática residual está compreendida na gama de desde 0,1% a 50%, tal como na gama de 0,1 a 1%, por exemplo 1 a 2%, tal como 2 a 3%, por exemplo 3 a 4%, tal como 4 a 5%, por exemplo 5 a 6%, tal como 6 a 7%, por exemplo 7 a 8%, tal como 8 a 9%, por exemplo 9 a 10%, tal como 10 a 11%, por exemplo 11% a 12%, tal como 12 a 13%, por exemplo 13 a 14%, tal como 14 a 15%, por exemplo 15 a 20%, tal como 20 a 25%, por exemplo 25 a 30%, tal como 30 a 35%, por exemplo 35 a 40%, tal como 40 a 45%, por exemplo na gama de 45 a 50% de atividade enzimática residual.

Atuais modalidades de tratamento para LSD Não há cura para as doenças do armazenamento lisossomal e o tratamento é principalmente sintomático, embora o transplante da medula óssea e a terapia de substituição enzimática (ERT) tenham sido tentados com algum sucesso. Além disso, o transplante do sangue do cordão umbilical está a ser realizado em centros especializados para algumas destas doenças. A terapia do transplante é, no entanto, acompanhada por efeitos secundários significativos e muitas 93 vezes traz complicações para o paciente. Adicionalmente, a terapia de redução do substrato, um método utilizado para diminuir a acumulação de material de armazenamento, está atualmente a ser avaliada para algumas destas doenças.

Para a maioria das doenças do armazenamento lisossomal, persiste uma grande necessidade não atendida da prestação de uma modalidade de tratamento eficaz. A terapia de substituição enzimática foi desenvolvida para um subconjunto das doenças de armazenamento lisossómicas e o Cerezyme® tem estado no mercado durante alguns anos para o tratamento da doença de Gaucher. A enzima defeituosa, a glucocerebrosidase, é feita por técnicas recombinantes e administrada por infusão intravenosa durante algumas horas. 0 tratamento não é uma cura e os pacientes necessitam do tratamento ao longo da vida para impedir a progressão da doença. Alguns sintomas podem melhorar através da ERT.

No entanto, para a maioria das LSDs, uma ERT eficiente não foi desenvolvida.Isto pode ser devido ao facto da produção de enzima ativa ter provado ser uma tarefa difícil, devido à estrutura da sub-unidade complexa das enzimas defeituosas. Com efeito, enzimas podem adotar uma conformação incorreta aquando da sua produção.

Para aquelas LSDs em que a ERT está disponível, existem desvantagens que tornam este tipo de terapia menos desejável. Em primeiro lugar e antes de mais, a ERT é uma forma muito dispendiosa de terapia, o que representa um encargo financeiro para a sociedade, tornando-a inacessível a alguns pacientes. Além disso, a ERT dirige-se especificamente a uma única doença. Alguns efeitos colaterais foram descritos para a Cerezyme ®, incluindo o desenvolvimento de uma resposta imune, náuseas, vómitos, 94 dor abdominal, diarréia, erupções cutâneas, fadiga, cefaleias, febre, tonturas, calafrios, dor nas costas e aumento da frequência cardiaca, bem como sintomas que sugerem reações alérgicas.

As divulgações feitas na presente invenção proporcionam assim um método novo e inovador para o tratamento das doenças do armazenamento lisossomal. Isto é particularmente relevante para estas doenças para as quais não foi desenvolvida uma terapia eficaz, para aqueles que podem beneficiar de um tratamento menos dispendioso e para aqueles que podem beneficiar de uma combinação de terapias compreendendo o agente bioativo da presente invenção.

Tal como aqui divulgado, o método de acordo com a presente invenção prevê uma modalidade de tratamento que é substancialmente menos dispendiosa de produzir do que a ERT e que tem como alvo mais de um distúrbio especifico do armazenamento lisossomal.

As chaperonas moleculares, ou proteínas de choque térmico, são introduzidas aqui abaixo, a seguir, pois os inventores verificaram existir uma interação entre a proteína de choque térmico 70 e o BMP lisossomal, introduzido aqui acima, constituindo a base para a modulação da atividade enzimática lisossomal e para o tratamento de desordens do armazenamento lisossomal, de acordo com a presente invenção.

As chaperonas moleculares

Depois de gastar largas quantidades de energia aquando da primeira transcrição e, em seguida, a tradução do código genético do ADN, a célula finalmente produziu um polipéptido, cuja função presumivelmente é necessária neste ponto da vida da célula. No entanto, alguns obstáculos 95 finais têm de ser superados a fim de alcançar uma proteina plenamente funcional - um destes sendo o arranjo conformacional correto desta cadeia nascente de polipéptido. Os imperativos evolucionários de alcançar o arranjo conformacional correto são óbvios - não só seria um desperdício terrível de energia ter a síntese de um péptido sem a conformação adequada e, portanto, sem a função adequada, mas também a agregação de tais proteínas no lúmen celular poderá ser prejudicial à célula. Esta agregação é, de facto um resultado muito provável, considerando o ambiente intracelular de elevada concentração de proteínas, por isso, não surpreende que uma maquinaria complicada e sofisticada de proteínas exista para auxiliar no arranjo conformacional de proteínas, permitindo que o estado funcional das proteínas seja mantido sob tais condições. Estas proteínas são coletivamente chamadas chaperonas moleculares, porque, tal como os seus homólogos humanos, elas evitam interações indesejadas entre os seus clientes imaturos.

As chaperonas moleculares são encontradas em todos os compartimentos de uma célula em que os rearranjos conformacionais de proteínas ocorrem e, embora a síntese de proteínas seja a principal fonte de péptidos desdobrados na célula, um desafio para a celular por alta temperatura ou outros estímulos que possam tornar as proteínas estruturalmente lábeis e, portanto, sujeitas a desdobramento e agregação, é recebido com uma resposta celular específica envolvendo a produção de proteínas protetoras. Esta resposta é um fenómeno observado em cada tipo de célula que vão desde procariotas a eucariotas e é referido como a resposta de choque ou stress térmico.

As proteínas induzidas por esta resposta são conhecidas como as proteínas de choque térmico (HSPs), das quais 96 existem várias famílias. Estas famílias são compostas por proteínas relacionadas sequencialmente, estruturalmente e funcionalmente, enquanto que as chaperonas de famílias diferentes podem diferir significativamente tanto na estrutura, como na função celular. Um exemplo primário exemplo de uma família de chaperonas são as proteínas Hsp70, que constituem a parte central de um sistema de chaperonas ubíquas presentes na maioria dos compartimentos das células eucarióticas, em eubactérias e em muitos Archae. Esta família foi recentemente implicada em outros aspetos da homeostase celular além de servir como chaperonas - mais marcadamente através das suas características anti-apoptóticas, das suas funções na imunidade e da dependência aparente das células cancerosas na sobreregulação da Hsp70.

Família das Proteínas de Choque Térmico 70

As proteínas Hsp70 estão envolvidas numa ampla gama de processos celulares, incluindo o arranjo conformacional de proteínas e a degradação de proteínas celulares instáveis, além de servir outros papéis citoprotetores. A função comum da Hsp70 nestes processos parece ser a ligação de curtos segmentos hidrofóbicos em polipéptidos parcialmente dobrados, facilitando assim a adequada dobragem e a prevenção de agregação. Em eucariotas, as chaperonas Hsp70 interagem in vivo com diferentes classes de proteínas que servem para regular as etapas críticas do seu ciclo funcional; entre estas, a família de proteínas Hsp40 com domínio J. Além disso, têm sido identificadas proteínas parceiras adicionais, algumas das quais ligam a Hsp70 a outros sistemas de chaperonas, tais como o sistema Hsp90.

Membros da família da Hsp70 humana 97

Algumas das funções importantes atribuídas às chaperonas moleculares incluem a importação de proteínas para os compartimentos celulares, o arranjo conformacional de proteínas no citosol, retículo endoplasmático e mitocôndrias, prevenção da agregação de proteínas e redobragem de proteínas com erros conformacionais.

Atualmente, a família da Hsp70 humana inclui 10 membros codificados por genes diferentes e esta secção destina-se a fornecer uma visão geral destes membros da família com relação à função, padrões da expressão e homologia. Existe alguma confusão acerca da nomenclatura dos diferentes membros da família da Hsp70 humana, apesar de um conjunto de diretrizes gerais ter sido estabelecido por Tavaria et al., o que fornece uma ligação lógica entre os nomes do locus , genes e proteínas. No entanto, como ainda existe alguma confusão inter-espécies, os genes e proteínas Hsp70 são aqui referidos pelo seu nome de locus. O nome Hsp70 pode referir-se aos dois membros indutíveis da família Hsp70 com nomes de locus HSPA1A e HSPA1B ou para toda a família Hsp70, em geral, como é evidente a partir do consenso do texto. No entanto, como utilizado em toda a presente invenção, a Hsp70 destina-se a designar qualquer um dos dois membros indutíveis da família da Hsp70, com nomes de locus HSPA1A e HSPA1B.

HspAlA e HspAlB

Os genes transcritos a partir dos loci HSPA1A e HSPA1B são os dois genes Hsp70 indutíveis por calor/stress e a maioria da bibliografia sobre a Hsp70 humana refere-se a proteínas codificadas por estes dois genes. Os genes dão origem a proteínas consistindo em 641 aminoácidos, tendo 99% de homologia entre si e foram os primeiros membros da família da Hsp70 humana a ser clonados e caracterizados. Os genes estão ligados no complexo MHC de classe III em 6p21.3, são 98 desprovidos de intrão e com regiões promotoras contendo HSEs, permitindo-lhes ligar HSFs e induzir a transcrição em resposta a uma variedade de agressões celulares. A sequência de proteínas para a proteína IA de choque térmico com 70kDa de Homo sapiens (HSPA1A) é (SEQ ID NO: 1) (Acesso N°NM 005345.5):

MAKAAAÍ GIDLGIT í'SC VGVTOHGKVE i XAHDQGNRfTPS XVMThXSRt l GDMKKQVALT^QNTVFDA mLl GRKFGDPVVQS DRRHWPFQV INDGDKFKVOVÊ YKGEIKAFYPEE l S SMVLTKMKE I AEÃY LGYWT mvIWFM:r«DSQSíQÃIKDAG¥lAGLíí3Vl1EllNg?tAMlMGisOKTGKGSRíjVLÍFDL:ÔGGIFDVSIL IIDÇGlFEVKATACsOTKLG<3EDFDt'mU,NKFVSSrKSKHKKOISQKKRAVRai..RfACERAKRXLSSSTQA SLEI OS LFEG X OFYTSITKARFEEIX S OtFRSttfiSVEKAUfWAKLOKAQ X «OEVtVGGSf» XFKVGKI* ODFFMGEDLMKSINPDEAVAYGAAVQAAILHÇOKS EhVQDtLtL DVAPiS IXL STAGSVMfALIKRKSXX RXRQTGIFTTT SBI^OPG V0 lOVYESEK&MIKDMí tl.GR.FlL SG ϊ FFAPEGVPO l EVTFDIBAMG X LKVXA TDKS TGKAISKmIhDKGRtSKEE 1ÊBMWQBAEKYKASOEVQRERVSAKKAIE SYAFNMKSAVEDEGLKG KX SEA0KKKVLDKCQ.&V I $KL DM-ílLASRDBFEHKFt KSLEQVCNFXISGL Y QGAGC-PGPGGFGAOGPKGG SGSGFTIEEVO A sequência de ácido nucleico (ADN) para a proteína IA de choque térmico com 70kDa de Homo sapiens (HSPA1A) é (SEQ ID NO:2) (Acesso N°. NM_005345.5): 1 ataaaagccc aggggcaagc ggtccggata acggctagcc tgaggagctg ctgcgacagt 61 ccactacctt tttcgagagt gactcccgtt gtcccaaggc ttcccagagc gaacctgtgc 121 ggctgcaggc accggcgcgt cgagtttccg gcgtccggaa ggaccgagct cttctcgcgg 181 atccagtgtt ccgtttccag cccccaatct cagagcggag ccgacagaga gcagggaacc 99 341 ggcatggcca aagccgcggc gateggcafcc gacctggfc* ccâcctâefec ctgcgfcçggg 301 gtgtt«e«AC &eggeaaggt ggagatcaic gccaacgsec âgggeaaccg caccsccccc 3 6 5. âgctacgtgg cettç&egga cacegagcçg ctcatcgçgg átgcggccaa gsaecaggtg 4 21 gcgcEgaacc cgcagaacac cgtgtttgac gegaagçggc tgattggecg eaagttcggç 181 gacccggtgg tgcagtcgga c&tgaagcaç tggçctttec aggtg&te&a cgaeggagaç 541 aageecaagg fcgeaggtgag ctacaagggg gagaeeaegg cafcfccfcacce egaggagate SOL tegtccatgg tgetgaecaa gatgaaggag atçqccqàqg cgtacctggg ctaeccggig Sêl ãccaacgcgg tgatc&ccgt gccggcctac ttcaacgact cfcagcgeca ggeeaecaag 721 gat.gcgggtg tgatcgcfgg gctcaacgtg ctgeçgatca tcaacgagc.c cacggc.cgcc 7§l gccatcgcct aeggcctgga cagaacgggc aagggggage geaacgtgct catctttgae 841 ctgggcgggg gcaccttcga cgtgtccatc ctgacgatcg acgacggcat çttcgaggtg 901 aaggeeacgg ecggggaeac ccacctgggt ggggaggact ttgscaaeag gctggtgaac 981 cacttcgtgg aggagttcaa gagaaaacac aagaaggaca tcagccagaa caagcgagcc 1021 gtgaggcggc tgcgcaccgc ctgcgagagg gcc&agagga ccetgtcgfcc cagcacccag .1081 gccagectgg agatcgaete cctgtttgag g-gcatcgact tctacacgtc catcaccagg 1141 gcgaggtscg aggagctgfcg ofcecgaccfeg tfccegeagea ccefeggageç egtggagaag 1201 gctçtgcgeg acgoeaagct ggac*«çgcc cagsttcacg acctggtcet ggteggggçe 1281 tscacccgc® tccceaaggt gcsgaagctg etgsaggact tctteaacgg gegegacctg 1321 &&caagagea tcaaesccga cgaggctgtg gcctecgggg cggcggtgca ggeggccatc 1381 etgatggggg acaagtccga gaaegtgcag gacctgctgc Lgetggacgte ggctccectg 1441 tcgetggggc tggagaegge eggaggegtç atgactgc.ee tgatcaagcg caactccacc 1501 atccce&cca agcagacgca gatctteacc acctactccg «caaccaacc cggggtgctg 1561 «tecaggtgt scgagggcga gaggggcatg segas agasta acaatctgtt ggggcgette 1621 gagctgagcg gcacccctcc ggcccceagg ggcgtgcccc agatcgaggt çacvtteg&c X6âl afccgatgeea acggeatect gaacgtcacg gccacggaea agagcaccgg csaggccaae 1741 «agateacea tcaccaacga caagggccgc ctgagcasgg aggagatcga gegeatggtg 1801 eaggaggcgg agaagta««a «geggaggac gaggtgcagc gcgagagggt gtcagccaag 1881 aacgccetgg agtcctaegc ctteascatg a&gagegceg tggaggatgs ggggeteaãg 1921 ggcaagatca gegaçgcgga caagaagaag gtgetçgaca agtgtcaaga ggtcatctcg 1981 tggctggacg ccaacacctt ggecgagaag gacgagfcttg agcacaagag gaaggagctg 2041 gagcaggtgt gtaaccceat cateagcgga ctgtaccagg gtgccggtgg tcccgggect 2101 gggggettcg gggctcaggg teccáaggga gggtctgggt eaggccceag eafctgaggag 2161 gtagattagg ggcctttcca agattgctgt ttttgttttg gagcttcaag accttgcatt 2221 tcctagtatt tctgxttgtc agttctcest ttcctçtgfct tgcaatgttg aaattttfctg 2281 gtgaagtact gaacttgctt tttttccggt ttctacatge agagatgaat ttatactgcc 2341 atcttacgac xatttcttct ttttaataca ctfcaact.e.ag gççatttttt âagttggtta 2401 cttcaaacjtâ aataaacttt aaaatteaaa aaaaaaaaaa aaaaa A sequência da proteína para a proteína 1B de choque térmico com 70kDa de Homo sapiens (HSPA1B) é (SEQ ID NO: 3) (Acesso N°: NM_005346):

ΗΛ.ΚΑΑΑΙβΙ0ί,5ΤΤϊ5€ν«ν5>3ΗΚΚνΒΙΕΜ1ΟΟ<5ΜΚΤΤΡ5ϊνΑΓΧΟΤε3.ηΐεθΑΑΚΝΰνΑ11ίΡς3ΜτνΡΟΆ KR i-I ÊRíCFGDP VVí3 S DMKHWP BQVI li DGDKPKVQV S Ϊ KGETKAfYPEE 15$ W/LT KHKE1 A£ AYLGXP VT laVítWAYfSOSQROAtl^AeVílWSLMVIAríi^PtAAIim^WMRT^asSKÍMVLiroyaSStFWSlL·

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HspA 1 L e HspA2

Dois membros da família Hsp70 foram desiqnados "qenes chauvinistas", porque as células qerminais masculinas favorecem a sua expressão com parcialidade marcada. O gene hspAlL é um membro da família da Hsp70 desprovido de 101 intrão, expresso constitutivamente e localizado 4kb teloméricas ao locus HSPA1A no mesmo complexo MHC de classe III no cromossoma 6. É expresso em quantidades baixas tanto antes como após o choque térmico, mas com o padrão de expressão favorecendo os testículos em ratinho, rato e seres humanos com os 641 aminoácidos (aa) da proteína sendo 90% homólogos com a HspAlA. O gene hspA2 foi isolado pela primeira vez a partir da biblioteca genómica de um rato e mais tarde foi demonstrado como sendo constitutivamente expresso embora em níveis baixos em vários tecidos do corpo humano, incluindo o músculo esquelético, ovário, intestino delgado, cólon, cérebro, placenta e os rins, mas altamente expresso nos testículos. Sua expressão, ou melhor a falta dela, tem sido relacionada com a espermatogénese humana anormal e os ratinhos macho hspA2(-/-) são estéreis.O gene está localizado no cromossoma 14, dando origem a uma proteína com 639 aa e 84% de homologia com a HspAlA, embora a localização exata esteja sujeita a discussão, pois dois artigos apresentaram posições diferentes para os loci 14q2 4.1 vs. 14q22.

HspA6 e HspA7

Os genes hspA6 e hspA7 são membros indutíveis de calor da família Hsp70 sem homólogos aparentes em ratinhos. Eles contêm HSEs em seus locais promotores e os genes são desprovidos de intrão. Eles são co-localizados no cromossoma 1 e são 94% homólogos entre si na sequência de nucleótidos. No entanto, apenas a HspA6 é funcional ao paso que o gene hspA7 comporta uma única inserção de nucleótidos gerando um codão de paragem prematura em +1324. A proteína HspA6 tem 643 aa de comprimento e apresenta homologia de 77% para HspAlA e HspAlB.

HspA5 e HspA9 102

Os genes hspA5 e hspA9 são os dois membros específicos de compartimento da família Hsp70. A proteína HspA5 com 655 aa está localizada no retículo endoplasmático (RE) e facilita a dobragem e o transporte de proteínas recém-sintetizadas para este compartimento. A proteína é 64% homóloga à HspAlA, o gene sendo localizado em 9q34. A proteína HspA9 com 679 aa está localizada na mitocôndria onde auxilia no arranjo conformacional de proteínas após o seu transporte através da membrana mitocondrial. O gene da HspA9 está localizado em 5q31.1, sendo a proteína 52% homóloga à HspAlA.

HspA8 O membro cognato da Hsp70 conhecido como Hsc70 é codificado por um gene denominado hspA8 em llq24, dando origem a uma proteína com 646 aa com homologia de 86% com a HspAlA e é expressa constitutivamente em todos os tecidos e linhas celulares. A proteína é análogo à Hsp70 nas suas funções celulares, proporcionando o acompanhamento necessário sob circunstâncias normais, mas tem também atribuído um papel na remoção do revestimento de vesículas revestidas por clatrina, bem como em uma autofagia mediada por chaperona.

HspA3 e HspA4

Estas não serão discutidas aqui, pois há dúvida relativamente a se a HSPA3 existe e porque a HSPA4 é muito provavelmente um membro da família HspllO e nada se sabe sobre ela até agora, exceto a sua localização cromossómica em 5q31.1-2.

Tabela genes aqui 1: Lista da Família de Genes da Hsp70 Humana. Os cromossómica estão na lista de acordo com o nome do locus, nomes utilizados, localização cromossómica (posição), 103 homologia de aminoácidos para a HspAlA assim como nomes alternativos normalmente vistos na bibliografia.

Nome aqui % de Usado Homologia Nomes Locus Gene/ Posição com a Alternativo Proteína HSPA1A s hspA. MíHSpA 1A βρ23,1 Hsp70; Hsp72; (Hsp70) Hsp7íM HSPA1B tepAISMspMB (Hsp70) 8p23.1 Hsp7Q; Hsp72; Hsp7G-2 HSPA1L hspA '?L/HspA1 L 6p23.t 90 Hsp70-Hom; Hsp7Qt BSFA2 ίϊψΑ2ίΗ«μ&2 ’54q24.1 84 Hsp7Q-3 HSPA4 MpAátHspM 5q31.1 31 Hsp70RY; APG*2 HSPAS hspASHs pAS 9q34 64 BiP: GRP78 BSPA6 í3KpAfô'HspA6 1q 84 Hsp7Q-€; Hsp7ÕB' HSPA7 íTáÇ*A7ifHspA7 * Hsp70-7: HspTQB HSPA8 í!SpA$BspA8 >'MS07C· 11q24 m Hsc70:HSp73 GRP75; PBP74; HSPAS ffspA9Msp/® 5q31.S 52 srstHsp7S; morta&rç ;TÍCt-2

Regulação Transcricional da Hsp70 O perfil genómico do promotor da Hsp70 humana revelou que o choque térmico / stress induz uma ligação rápida dos fatores de transcrição do choque térmico (HSF) a uma região comportando sequências nGAAn denominadas elementos de choque térmico (HSEs). Em condições normais, a Hsp70 é obrigada a HSFs, que residem no citosol, mas durante o stress as HSFs são separadas da Hsp70 e adaptam uma conformação homotrimérica aquando da fosforilação pela PKC ou outra serina/treonina cinase. Os trimeros HSF entram no núcleo, onde se ligam às HSEs localizadas na região promotora dos genes Hsp70 e tornam-se mais fosforilados por cinases HSF. 104

Três HSFs foram até agora caracterizadas em seres humanos (HSF1, HSF2 e HSF4) . A HSF1 é o fator de transcrição principal ativado sob condições com mais stress e responde a uma vasta gama de estímulos, que podem ser categorizados em fisiológicos (por exemplo, a divisão celular, a estimulação hormonal), patológicos (por exemplo infeções, febre, inflamação, malignidade) e condições ambientais (por exemplo, choque térmico, metais pesados, etanol). A HSF2 responde apenas a hemina, enquanto que a HSF4 é preferencialmente expressa no coração, pâncreas, cérebro e músculo esquelético humanos, não possuindo uma repetição hidrofóbica C-terminal que é compartilhada entre todos os HSFs vertebrados e parece reprimir a expressão das HSPs. A regulação do gene Hsp70 responsável pela sintese da Hsp70 expressa constitutivamente (Hsc70) não é claramente compreendida, mas as HSFs não parecem estar envolvidas.

Embora os HSFs sejam os mais proeminentes dos fatores que regulam a expressão HSP, outros fatores de transcrição têm demonstrado possuir a mesma capacidade. Os fatores de ligação específicos CCAAT-box (CBF) demonstraram induzir a transcrição da Hsp70, o p53 supressor de tumor pode reprimir a transcrição ligando-se à região promotora da Hsp70 e por neutralização da CBF e as HSFs podem ser antagonizadas pela proteína 1 de ligação ao fator de choque térmico (HSBP1), que deste modo atenua a transcrição da Hsp70.

Propriedades estruturais e funcionais da Hsp70 A estrutura e função do sistema da Hsp70 são mais bem entendidas para as Hsp70, DnaK, a sua Hsp40 co-chaperona DnaJ e para o fator GrpE de permuta de nucleótidos em eubactérias. No entanto, o mecanismo é geralmente considerado como sendo análogo em eucariotas, embora a evidência sugira um desacoplamento de GrpE. Esta secção 105 será focada no sistema da Hsp70 eucariótico, mas também incluirá comentários sobre o sistema eubacteriano, onde este é considerado apropriado. A Hsp70 é compreendido por duas entidades funcionais - um domínio ATPase N-terminal e um domínio menor C-terminal de ligação a péptidos. O dominio ATPase é compreendido por dois subdomínios separados por uma fenda que contém o local de ligação aos nucleótidos, o que determina as propriedades de ligação aos péptidos do domínio C-terminal. Quando o ATP está ligado, os substratos peptídicos ligam-se e dissociam-se rapidamente, embora com baixa afinidade, enquanto que em um estado onde nenhum nucleótido ou ADP se liga ao domínio N-terminal, as taxas de ligação e de dissociação peptídica decresce e a afinidade aumenta. A hidrólise do ATP serve assim como um interruptor molecular entre dois estados da Hsp70, cujo ciclo é regulado pela Hsp40 da família de proteínas de domínio J em eucariotas e DnaJ e GrpE em eubactérias. O domínio J N-terminal da Hsp40 liga-se à Hsp70 acelerando a hidrólise do ATP, facilitando assim a captura de péptidos, enquanto que a parte C-terminal da Hsp40 funciona como uma chaperona por reconhecer péptidos hidrófobos, pelo que a Hsp70 é recrutada para cadeias polipeptídicas nascentes. É importante notar que as chaperonas moleculares não fornecem informação estereoespecífica para o arranjo conformacional da proteina ligada, em vez disso inibem as interações não produtivas, permitindo assim que a proteina se arranje na sua estrutura nativa.

Em eubactérias, a GrpE induz a libertação do ADP a partir de DnaK (Hsp70 bacteriana), enquanto que para as proteínas Hsp70 eucarióticas um tal fator parece ser dispensável porque o passo limitante da velocidade neste ciclo ATPase não é a dissociação do ADP ligado mas sim a hidrólise do 106 próprio ΔΤΡ. No entanto, as proteínas adicionais servem para regular a função Hsp70 em eucariotas, a proteína homo-oligomérica Hip (proteína interagindo com Hsp70) servindo como um regulador positivo por estabilização do estado de ligação ao ADP da Hsp70, enquanto que as proteínas carboxi-terminais da proteína de ligação a Hsp70 (CHIP) e atanogene-1 associado ao Bcl-2-(Bag-1) ambos têm efeitos inibitórios - CHIP por inibição da atividade da ATPase da Hsp70 e Bag-1 por antagonização da atividade do redobramento da Hsp70. São fornecidas interações adicionais pelas duas proteínas Hsp40 humanas, Hdj1 e Hdj2, que, além das suas funções Hsp40 (descritas acima), têm sido mostrados como facilitando o acoplamento da Hsp70 e da Hsp90 através da Hop (proteína da prganização da Hsp), uma proteína adaptadora que liga fisicamente as chaperonas através dos seus dois domínios de repetições tetratricopeptídicas (TPR) que ligam as extensas sequências C-terminais da Hsp70 e Hsp90, respetivamente. Foi recentemente demonstrado que algumas das proteínas acima mencionadas são reguladoras na transferência de proteínas com erros conformacionais não-nativos ou irreversíveis, das chaperonas para a maquinaria ubiquitina-proteassoma. A proteína CHIP é, para além do seu papel regulador negativo sobre a Hsp70, capaz de se associar com a Hsp90 através de um domínio TPR N-terminal e é direcionada para substratos Hsp90 para a degradação através de um domínio C-terminal da ubiquitina ligase, mas também é capaz de cooperar funcionalmente com o BAG-1, que se liga a Hsp70 (bem como o proteassoma. Estes resultados fornecem uma possível ligação entre os mecanismos que integram o arranjo conformacional assistido por chaperonas e a degradação proteolítica, os dois principais componentes de controlo da qualidade da proteína no citosol.

Citoproteção via Hsp70 107

Para além das suas capacidades anti-apoptóticas como uma consequência de ser um chaperona molecular, i.e., de facilitar o arranjo conformacional da proteína sob condições de outra forma desnaturantes, a Hsp70 também é capaz de afetar a sobrevivência das células de várias outras maneiras, incluindo a proteção da função mitocondrial após danos por isquemia-reperfusão, bloqueando a ativação da cinase do stress c-jun N-terminal cinase (JNK) aquando da estimulação dos fibroblastos primários com TNF e um complexo Hsp70/Bag-1 foi proposto como regulador do crescimento celular e da mitogénese durante as condições de stress celular. A capacidade da Hsp70 para proteger as células da morte celular induzida por uma matriz de estímulos, tais como TNF, TRAIL, stress oxidativo, radiação UV e fármacos anti-cancro doxorrubicina, etoposido e taxol enfatiza ainda mais as suas características anti-apoptóticas. Finalmente, as descrições também fornecem evidências de interações mais diretas entre a Hsp70 e a maquinaria apoptótica, uma vez que a Hsp70 demonstrou antagonizar o fator de indução da apoptose (AIF), bem como exercer uma função anti-apoptótica a jusante da caspase-3.

Evidências recentes também sugerem que partes do potente efeito citoprotetor da Hsp70 são devidas à estabilização das membranas lisossómicas. Em evidência disto, o esgotamento da Hsp70 desencadeia uma permeabilização precoce das membranas lisossómicas e morte celular mediada por catepsina em células cancerosas e a Hsp70 exógena, efetivamente, inibe a destabilização lisossomal induzida por vários stresses. Além disso, os ratinhos deficientes em Hsp70 sofrem de pancreatite causada por a perda de proteases lisossomais para o citosol. Todos estes eventos salientam o papel da Hsp70 como um regulador importante de PCD e, portanto, um fator de sobrevivência para as células. 108

Hsp70 no cancro. A Hsp70 é muitas vezes sobre-expressa nos tumores malignos humanos e a sua expressão se correlaciona com um prognóstico limitado em tumores da mama e do endométrio. Em conformidade com isto, a Hsp70 aumenta o potencial tumorigénico das células de roedores implantadas em animais singénicos imuno-comprometidos. O papel da Hsp70 como um fator essencial para a sobrevivência das célula cancerosas, é confirmado a partir de uma descrição de Wei et al., que fez o primeiro estudo de depleção em Hsp70 nas células cancerosas. Os resultados indicaram que, quando a expressão da Hsp70 foi inibida em várias linhas celulares cancerosas através da utilização de um oligómero anti-sentido, a inibição da proliferação celular e a subsequente apoptose foram induzidas. Este trabalho foi fundamentado em uma série de ensaios nos quais a depleção da Hsp70 mediada por adenovirus anti-sentido desencadeia um programa de morte lisossomal especifico para células tumorais.

Em estudos in vivo utilizando xenoenxertos ortotópicos de glioblastoma e carcinomas de mama, bem como xenoenxertos sub-cutâneos do carcinoma do cólon em ratinhos imunodeficientes demonstrou adicionalmente que o potencial anti-cancro do esgotamento em Hsp70, assim como os tumores de ratinhos que receberam aplicação locorregional do construto adenoviral acima mencionado mostrou morte celular massiva semelhante à apoptose e recrutamento de macrófagos. Estes estudos demonstram claramente a dependência de alguns tumores relativamente à presença da Hsp70, embora outros estudos tenham vindo argumentar que a citotoxicidade observada em cultura de células sobre a depleção em Hsp70 mediada por adenovirus é devida a uma combinação de stress 109 celular mediado viralmente e subregulação por Hsp70. Apesar desta controvérsia, a citotoxicidade em cultura de células induzida pelo esgotamento da Hsp70 não era dependente de caspases uma vez que nem a sobre-expressão do Bcl-2 nem a inibição farmacológica das caspases podem salvar as células. Em vez disso, o desencadeamento de LMP e libertação das catepsinas para o citosol foram os prováveis eventos indutores de morte pois a inibição das catepsinas de cisteina conferiu citoproteção significativa. Além disso, o esgotamento da Hsp70 nos xenoenxertos de tumor anteriormente mencionados, em ratinhos, levou à libertação da catepsina e morte das células tumorais.

Como mencionado anteriormente, um dos mecanismos citoprotetores da Hsp70, que muitas células cancerosas parecem ter adaptado, é a translocação da Hsp70 para o compartimento endo-lisossomal, onde ela tem uma função de membrana de proteção. Esta translocação não só pode ser conduzida pela necessidade de proteger as membranas lisossómicas, pois os estudos têm mostrado que mais de 50% dos tumores apresentam uma localização da Hsp70 sobre a superfície da membrana plasmática - uma área que é directamente ligada ao compartimento endo-lisossomal através de eventos endocíticos e secretores, tal como descrito anteriormente. A Hsp70 exposta à superfície apresenta um epitopo único, que pode atuar como uma estrutura de reconhecimento para as células assassinas naturais (NK), estimulando a sua proliferação e a atividade citolítica. As células NK ativadas por esta sequência peptídica da Hsp70 mostraram poder inibir o crescimento do tumor em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID), sendo um mecanismo possível para tal a apoptose mediada pela Hsp70 ligada à superfície celular através de ligação específica e absorção de granzima B, independente da perforina. 110

Tal como escrito anteriormente, as membranas endolisossómicas e as membranas plasmáticas são constantemente trocadas. Assim, a presença da Hsp70 na superfície de células cancerosas pode ser uma consequência "infeliz" de dois eventos que promovem a progressão do tumor; a secreção de catepsinas, que promove a invasão e angiogénese e a localização da Hsp70 nas membranas lisossómicas, queprevine a libertação acidental das catepsinas de cisteina para o citosol, seguindo-se a morte celular.

Hsp70 Extracelular

Como ficou claro nos pontos anteriores, as funções intracelulares da Hsp70 são essenciais para a homeostase celular adequada e não menos que isto quando se enfrentam desafios nocivos. No entanto, os papéis interessantes também estão a emergir para a Hsp70 extracelular (e Hsp70), especialmente quando se trata de respostas imunitárias e inflamatórias, as quais possam novamente ter papéis importantes papéis para a limpeza das células cancerosas. Além disso, o envolvimento em uma adaptação fisiológica geral ao stress e a proteção contra os danos celulares também são temas emergentes para a eHsp70.

Hsp70 extracelular e Neuroproteção A primeira evidência da presença de eHsp70 é proveniente de estudos no axónio gigante da lula, em que foi demonstrado que a elevação da temperatura induzia um conjunto de proteínas de choque térmico, na bainha glial em torno do axónio, que eram transferidas para o axónio. Estas observações foram rapidamente reproduzidas em culturas de células embrionárias de rato e, de um modo importante, já neste ponto, foram apresentadas evidências de uma via não-clássica de exocitose sendo responsável pela libertação da 111

Hsp70 pois nem a monensina nem a colchicina, ambos inibidores da via secretora clássica, conseguiram bloquear a secreção da Hsp70. Desde estas publicações, outros registos forneceram exemplos de libertação de Hsps através da glia e a captação por neurónios em vários sistemas de modelos animais, tais como sapos, lagostins e ratos. 0 suporte de um papel para as células da glia como fontes de eHsp70 em humanos foi fornecido por um estudo de culturas de células do glioblastoma humano. Este estudo demonstrou que, sob condições controladas as células libertam ~ lOpg da Hsp70 por milhão de células, para o meio, em um período de tempo de 24 horas. Esta libertação foi aumentada 2,5-5 vezes quando um choque térmico de 20 min foi aplicado no início do período de tempo. É importante ressaltar que este estudo também demonstrou que a libertação de eHsp70 foi maior do que se poderia esperar pela morte celular.Todos estes dados suportam a hipótese sugerida originalmente estabelecida por Tytell et al., que a libertação glial de Hsps pode ser uma forma de suportar a função neuronal durante o stress metabólico.

As evidências in vivo para a eHsp70 contendo um papel neuroprotetor durante o stress agudo provém de uma variedade de estudos. Um estudo de Tidwell et al. verificou que a eHsp70 é capaz de reduzir a quantidade morte celular nos neurónios motores pós-axotomia, quando a eHsp70 foi aplicada através de uma esponja em gel após a axotomia. No mesmo estudo, o aumento da sobrevivência das células neuronais sensoriais do gânglio da raiz dorsal foi também observado após a administração da Hsp70, ainda que isso dependesse de doses ligeiramente mais elevadas de Hsp70 do que os neurónios motores. Além disso, a eHsp70 demonstrou proteger os neurónios motores de outro modo destinados a morrer durante o desenvolvimento embrionário dos pintos e também proteger os neurónios motores isolados das medulas 112 espinais dos pintos aquando da privação do fator trófico. Um papel protetor in vivo para a eHsp70 também foi descrito quando se trata de danos na retina. Neste estudo, Yu et ai., injetou intravitrealmente uma solução da Hsp70 recombinante e Hsc70 após a exposição à luz indutora de danos a uma dose que tinha sido previamente descrita como causando a deqeneração de fotorrecetores extensa. Curiosamente, a presença da mistura de eHsp70 na câmara vitrea do olho direito resultou na sobrevivência de significativamente mais fotorreceptores na retina. Além disso, a avaliação da captação de Hsc/Hsp70 marcadas com fluoresceina demonstrou que estava presente na retina 6h após a administração. A Hsp70 extracelular administrada através do tratamento intranasal também tem sido demonstrada como evitando as consequências do stress inevitável em ratos e foi recentemente descrito que a Hsp70 recombinante humana injetada intraperitonealmente foi eficaz no aumento do tempo de vida, retardando o inicio dos sintomas, preservando a função motora e prolongando a sobrevivência dos neurónios motores em um modelo de rato com esclerose lateral amiotrófica. 0 trabalho in vitro adicional usando a Hsp70 ou a mistura Hsc/Hsp70 em sistemas neuronais tem mostrado que, além disso, a eHsp70 pode aumentar a tolerância ao stress celular neuronal e reduzir a toxicidade e agregação da poliglutamina.

Hsp70 Extracelular e Imunidade

Além de papéis na citoproteção, ambas as eHsp70, a associada à membrana plasmática, bem como a sua forma sistémica livre têm sido documentadas como desempenhando papéis na imunidade. Considerando que uma das principais funções da Hsp70 é a de chaperona para proteínas intracelulares, não é talvez surpreendente que ela possa estar envolvida na ligação de péptidos imunogénicos e 113 auxiliar na apresentação destes por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe 1. Além disso, a eHsp70 derivada do tumor demonstrou servir de chaperona aos péptidos imunogénicos e ligar-se seletivamente às células que apresentam os antigénios (APC) . A seguir à endocitose mediada pelo receptor, estes complexos Hsp70-péptidos são então apresentados em moléculas MHC de classe 1 que conduzem a uma resposta das células T citotóxicas. Além do papel de chaperona de auto-antigénios, a Hsp70 também é capaz de ligação a péptidos microbianos e motivos CpG não metilados no ADN bacteriano.

Em adição ao seu papel como uma chaperona apresentadora de antigénio, a eHsp70 também tem sido implicada na estimulação da imunidade inata. Embora alguns tipos de células tenham demonstrado libertar Hsp70, eHsp70 também demonstraram conseguir ligar-se a alguns recetores em sub-populações de leucócitos diferentes, incluindo as células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos e células dendriticas. Os recetores envolvidos no reconhecimento da eHsp70 incluem principalmente os recetores do reconhecimento de padrões (PRR's) e consistem em uma variedade de recetores de famílias de recetores diferentes, tais como os recetores idênticos a portagem (TLR) , recetores de captação e lectinas do tipo C. Aquando da ligação ao recetor, a eHsp70 é capaz de elicitar uma resposta vasta das citocinas, incluindo a libertação de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-a, IL-lb, IL-12, IL-6 e GM-CSF, um processo desencadeado por translocação das NF-kB para o núcleo, o que sugere uma ação de citocinas de eHsp70, que também levaram à sugestão de atribuição do termo chaperoquina à eHsp70 para melhor descrever as funções únicas da eHsp70 tanto como chaperona como citocina. 114

Muito do trabalho in vivo sobre um papel de eHsp7 0 na imunidade foi conduzido em modelos de roedores. Por exemplo, os aumentos na concentração de eHsp70 em resposta ao choque-cauda foram associados com a inflamação reduzida e tempos de recuperação mais rápidos após uma injeção subcutânea de E. Coli. Além disso, na entrega in vivo da Hsp70 nas lesões em fase de cicatrização acelerada em ratinhos, uma caracteristica que foi provavelmente devida à fagocitose pelos macrófagos reforçada dos residuos da lesão. A evidência dos papéis imunomoduladores da Hsp70 em seres humanos é escassa, mas estudos demonstraram relações entre a eHsp70 aumentada e a melhoria do prognóstico / resultado para o trauma cerebral, embora o contrário também tenha sido demonstrado. No entanto, sabe-se também que as concentrações de eHsp70 diminuem com o avanço da idade, o que pode ser indicativo de uma capacidade reduzida relacionada com a idade para se montar uma resposta ao stress completa, o que novamente poderia contribuir para o aumento morbidade e da mortalidade observadas com o envelhecimento, embora tal relação permaneça puramente especulativa.

Libertação da Hsp70

Além dos dados que demonstram a transferência da eHsp70 entre as células vizinhas, tais como no modelo glia / axónio, vários relatórios têm documentado a presença de eHsp70 livre na circulação. Para a Hsp70 estar presente neste compartimento, tem necessariamente de ser libertada a partir de um órgão / célula. As duas principais maneiras de conseguir isso são geralmente considerados. Uma é uma forma passiva em que a observação de eHsp70 na circulação periférica é a consequência da libertação a partir de uma 115 acumulação intracelular da Hsp70 devido à lise celular ou morte. Alternativamente, ou talvez adicionalmente, a Hsp70 é ativamente libertada através de uma via não clássica exocitótica.

Foi sugerido que a Hsp70, juntamente com outras proteínas de choque térmico, é apenas libertada sob circunstâncias patológicas, resultando na morte necrótico e não durante a morte celular programada. Sem dúvida, o trauma grave e as condições patológicas que resultam na necrose podem conduzir à libertação da Hsp70 para a corrente sanguínea. Isto tem sido bem documentado e também por isso, logicamente esperado. Estudos recentes no entanto, têm mostrado que a Hsp70 pode ser libertada a partir de células intactas por mecanismos ativos e que o grau de estímulo determina o modo de libertação. Existem evidências fortes da libertação não necrótica da Hsp70 também ser proveniente de estudos sobre a libertação, induzida por exercício, da eHsp70 para a circulação sanguínea periférica. Dependendo do modo de exercício (quanto maior a tensão física, mais libertação) grandes aumentos de eHsp70 podem ser detetados na corrente sanguínea periférica e, de um modo importante, não existem estudos conhecidos que descrevam uma correlação direta entre a eHsp70 e os marcadores de lesão muscular. Que a eHsp70 pode ser libertada, independentemente do dano celular ou nos tecidos, tem também sido elegantemente demonstrado por Fleshner e colegas que têm demonstrado que o stress psicológico, tal como o medo predatório e o choque elétrico pode provocar uma libertação de eHsp70 induzida por stress, um processo que foi sugerido como sendo dependente da sinalização da catecolamina. A maneira pela qual a Hsp70 deixa a célula é ainda pouco clara, porém, não menos importante porque a Hsp70 não contém qualquer sequência peptídica líder clássica, o que 116 poderia torná-lo um alvo para a secreção. Além disso, como a secreção clássica foi já questionada antes, isto sugere que têm de existir mecanismos alternativos para libertação da eHsp70. Foi demonstrado que a eHsp70 pode ser libertada em vesículas caracterizadas como exossomas, mas também foi apresentada evidência de que a eHsp70 pode ser libertada como eHsp70 livre, tanto em sistemas celulares, como in vivo. Foi sugerido que as jangadas lipídicas são necessárias para a libertação da eHsp70 embora esta também tem sido contestada. Além disso, foi demonstrado que um compartimento lisossomal funcional é necessário para a libertação de eHsp70 e que esta libertação é acompanhada pela presença de proteínas marcadoras lisossomais na superfície das células, sugerindo uma secreção dependente da fusão entre a membrana plasmática e a lisossomal. Independentemente de a libertação ser feita através de exossomas ou através de libertação direta a partir de lisossomas, é interessante notar que alguns tipos de MVB secretória / endossomal tardia / compartimento endossomal estão aparentemente envolvidos em todos os modos de libertação.

As catecolaminas, através do recetor de □ 1-adrenérgico podem levar a fluxos de cálcio intracelulares e como os mesmos fluxos de cálcio são sugeridos para causar exocitose dos exossomas, os corpos multivesiculares e os lisossomas, uma hipótese corrente hipótese é a que em momentos de stress, o aumento da noradrenalina atuando sobre os recetores αΐ-adrenérgicos resulta em um influxo de cálcio na célula e uma subsequente libertação da Hsp70 dentro dos exossomas.

Agente bioativo 117 A presente invenção refere-se, em uma forma de realização, à modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interatua com o BMP, pelo uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a actividade da Hsp70. A modulação da atividade enzimática de acordo com a presente invenção pode ser obtida através do fornecimento de uma das seguintes classes de compostos e terapias, o que aumenta a concentração intracelular e/ou a atividade da • Hsp70:Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, opcionalmente em combinação com indutores e co-indutores da Hsp70 tais como: o fármacos de moléculas pequenas tais como

Bimoclomol e arimoclomol; o Fluidificantes da Membrana ó tais como álcool benzilico; o 0 Terapia térmica sub-letal 42 ° C) ou hipertermia; o Certos fármacos a partir do grupo de fármacos anti-inflamatórios e anti-neoplásicos; o Stress celular • Espécies reativas de oxigénio (ROS); • adrenalina, noradrenalina; • luz UV; • Radioterapia

Um agente bioativo de acordo com a presente invenção inclui assim a própria Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, em que o referido agente bioativo é capaz de modular a atividade de uma enzima que interatua com o BMP. 118

Daqui resulta que um agente bioativo pode aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70.

Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante.

Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação da Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante e um indutor ou co-indutor da Hsp70. É um aspeto da presente invenção proporcionar um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70, para utilização como um medicamento. É um aspeto adicional da presente invenção proporcionar um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70, para utilização no tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal. É um aspeto adicional da presente invenção proporcionar um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70, para utilização como um medicamento ou para utilização no tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal.

Em uma forma de realização, o referido tratamento pode ser profilático, curativo ou de melhoria.Em uma forma de realização particular, o referido tratamento é profilático. Em uma outra forma de realização, o referido tratamento é curativo. Em uma forma de realização adicional, o referido tratamento é de melhoria.

Em uma forma de realização, a referida doença do armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo em Doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, 119 leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência em saposina.

Em uma forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a Doença de Niemann-Pick tipo A ou B. Em uma outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a doença de Farber. Em uma outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a doença de Krabbe. Em uma outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a leucodistrofia metacromática. Em uma outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a sialidose. Em outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a doença de Fabry. Em ainda outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a doença de Gaucher. Em ainda outra forma de realização particular, o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é a deficiência em saposina. É também um aspeto da presente invenção proporcionar um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70, para utilização no tratamento de um distúrbio do armazenamento lisossomal, em que o referido distúrbio do armazenamento lisossomal é um, tal como dois, por exemplo três, tal como quatro, por exemplo cinco, tal como seis, por exemplo sete desordens selecionadas a partir do grupo consistindo em doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, leucodistrofia metacromática, sialidose e deficiência em saposina.

Daqui resulta que o agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para o tratamento de 120 um subconjunto de desordens do armazenamento lisossomal, selecionadas a partir do grupo consistindo em doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência em saposina.

Em uma forma de realização particular, o agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para o tratamento da doença de Niemann-Pick do tipo A e B e da doença de Farber.

Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação da Hsp70, ou de um seu fragmento funcional ou uma sua variante e uma substância que aumenta a interação entre as proteínas Hsp70 e BMP. É ainda outro aspeto da presente invenção proporcionar a utilização de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem do armazenamento lisossomal.

Agente bioativo - Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante A presente invenção refere-se, em uma forma de realização, à modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interatua com o BMP, pelo uso da Hsp70, ou de um seu fragmento funcional ou uma sua variante. É um aspeto da presente invenção proporcionar a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, para utilização como um medicamento. 121 É um aspeto adicional da presente invenção proporcionar a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, para usar no tratamento de desordens do armazenamento lisossomal. É ainda outro aspeto da presente invenção proporcionar a utilização da Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de distúrbios do armazenamento lisossomal.

Em uma forma de realização, a referida doença do armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo na Doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência em saposina.

Entende-se que a Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, de acordo com a presente invenção pode ser qualquer produto natural ou sintético e pode ser produzido por qualquer técnica convencional conhecida para a pessoa especializada na arte.

Em uma forma de realização, a Hsp7 0, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, é purificada a partir de uma fonte natural. A referida fonte natural pode ser qualquer vegetal, animal ou bactéria que expresse, ou possa ser induzido a expressar, a Hsp70 numa forma adequada para administração a um individuo em necessidade da mesma.

Em uma forma de realização preferida, no entanto, a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, é feita sinteticamente. Daqui resulta que a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode, em uma forma de realização preferida ser uma proteina recombinante 122 produzida por técnicas convencionais, portanto, e como tal sendo denotada rHsp70. A Hsp70 de acordo com a presente invenção, sintética ou natural, pode ter uma sequência que é derivada de qualquer espécie adequada de plantas, animal ou bactéria. Em uma forma de realização, a referida rHsp70 é derivada de um mamífero. 0 referido mamífero pode ser selecionado do grupo consistindo em humano (Homo sapiens), ratinho (Mus musculus), vaca, cão, rato, furão, porco, ovelhas e macacos. Em uma outra forma de realização, a referida rHsp70 é derivada a partir de bactérias. A Hsp70 é caracterizada, em parte, por ter um grau muito elevado de conservação da sequência interespécie, assim permitindo possivelmente uma Hsp70 derivada de uma espécie para ser usada em outra espécie sem provocar uma resposta imune prejudicial.

Em uma forma de realização particular, a referida rHsp70 tem uma sequência derivada da Hsp70 humana.

Em uma forma de realização particular, a referida rHsp70 tem uma sequência derivada de mais de uma espécie.A referida Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou sua variante pode assim, em uma forma de realização, ser uma quimera.

Uma proteína recombinante é uma proteína que é derivada a partir do ADN recombinante. 0 ADN recombinante é uma forma de ADN que não existe naturalmente, que é criada através da combinação de sequências de ADN que normalmente não ocorreriam em conjunto. Em termos de modificação genética, o ADN recombinante é introduzido através da adição de ADN 123 relevante no ADN de um organismo existente, tais como os plasmideos de bactérias, para codificar para caracteristicas diferentes e para um fim especifico. Difere da recombinação genética na medida em que não ocorre por meio de processos dentro da célula, mas é concebido pelo homem.

Em uma forma de realização, a Hsp70 de acordo com a presente invenção tem homologia de 100% com a Hsp70 do tipo selvagem proteina. Em outra forma de realização, a Hsp70 de acordo com a presente invenção tem menos de 100% de homologia com o tipo selvagem da proteína Hsp70, tal como entre 99, 9 a 95% de homologia, por exemplo 95 a 90% de homologia, tal como 90 a 85% de homologia, por exemplo 85 a 80% de homologia, tal como 80 a 75% de homologia, por exemplo 7 5 a 60% de homologia para o tipo selvagem da proteina. Independentemente do grau de homologia, qualquer variante da Hsp70 que retém a sua capacidade de modular a atividade enzimática de uma enzima que se liga ao BMP encontra-se englobada pela presente invenção.

Em uma forma de realização, o agente bioativo é a Hsp70.Em uma forma de realização, a referida Hsp70 é a Hsp70 de comprimento completo. É também uma forma de realização para proporcionar um seu fragmento funcional ou variante da Hsp70.Tal como aqui definido, um fragmento funcional ou variante é qualquer fragmento da Hsp70 tendo a função desejada, o que em termos da presente invenção é uma capacidade para modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a referida enzima interatua com o BMP.

Em uma forma de realização, o agente bioativo é um fragmento funcional ou uma variante da Hsp70. 124

Em uma forma de realização, o agente bioativo é um fragmento funcional ou uma variante da Hsp7 0, em que a Hsp70 é modificada por deleção (ões), adição (ões) ou substituição (ões) do tipo selvagem da Hsp70. 0 tipo selvagem da proteína Hsp70 tem um comprimento total de 641 aminoácidos.Um fragmento da Hsp70 está, em uma forma de realização, destinado a compreender qualquer fragmento com um comprimento total inferior ao da proteína do tipo selvagem com 641 aminoácidos, tal como inferior a 625 aminoácidos, por exemplo inferior a 600 aminoácidos, tal como inferior a 575 aminoácidos, por exemplo inferior a 550 aminoácidos, tal como inferior a 525 aminoácidos, por exemplo menos de 500 aminoácidos, tal como inferior a 475 aminoácidos, por exemplo inferior a 450 aminoácidos, tal como inferior a 425 aminoácidos, por exemplo inferior a 400 aminoácidos, tal como inferior a 375 aminoácidos, por exemplo inferior a 350 aminoácidos, tal como inferior a 325 aminoácidos, por exemplo inferior a 300 aminoácidos, tal como inferior a 275 aminoácidos, por exemplo inferior a 250 aminoácidos, tal como inferior a 225 aminoácidos, por exemplo inferior a 200 aminoácidos, tal como inferior a 175 aminoácidos, por exemplo inferior a 150 aminoácidos, tal como inferior a 125 aminoácidos, por exemplo inferior a 100 aminoácidos, tal como inferior a 75 aminoácidos, por exemplo inferior a 50 aminoácidos, tal como inferior a 25 aminoácidos. O tipo selvagem da proteína Hsp70 tem um comprimento total de 641 aminoácidos. Um fragmento da Hsp70 está, em uma forma de realização, destinado a incluir qualquer fragmento com um comprimento total de mais de 10 aminoácidos, tal como mais do que 25 aminoácidos, por exemplo mais de 50 aminoácidos, tais como mais de 75 aminoácidos, por exemplo mais de 100 aminoácidos auxiliares, tais como mais de 125 125 aminoácidos, por exemplo mais de 150 aminoácidos, tais como mais de 175 aminoácidos, por exemplo mais de 200 aminoácidos, tais como mais de 225 aminoácidos, por exemplo mais de 250 aminoácidos, tais como mais de 275 aminoácidos, por exemplo mais de 300 aminoácidos, tais como mais de 325 aminoácidos, por exemplo mais de 350 aminoácidos, tais como mais de 375 aminoácidos, por exemplo mais de 400 aminoácidos, tais como mais do que 425 aminoácidos, por exemplo mais de 450 aminoácidos, tais como mais de 475 aminoácidos, por exemplo mais do que 500 aminoácidos, tais como mais de 525 aminoácidos, por exemplo mais de 550 aminoácidos, tais como mais do que 575 aminoácidos, por exemplo mais de 600 aminoácidos, tais como mais de 625 aminoácidos.

Daqui resulta que o comprimento total do fragmento da Hsp70 de acordo com a presente invenção pode, em uma forma de realização estar dentro da gama de 5 a 25 aminoácidos, tal como 25 a 50 aminoácidos, por exemplo, 50 a 75 aminoácidos, tal como 75 a 100 aminoácidos, por exemplo 100 a 125 aminoácidos, tais como 125 a 150 aminoácidos, por exemplo 150 a 175 aminoácidos , tais como 175 a 200 aminoácidos, por exemplo 200 a 225 aminoácidos, tais como 225 e 250 aminoácidos, por exemplo 250 a 275 aminoácidos, tais como 275 a 300 aminoácidos, por exemplo de 300 a 325 aminoácidos, tais como 325 a 350 amino ácidos, por exemplo 350 a 375 aminoácidos, tais como 375 a 400 aminoácidos, por exemplo 400 a 425 aminoácidos, tais como 425 a 450 aminoácidos, por exemplo 450 a 475 aminoácidos, tais como 475 a 500 aminoácidos, por exemplo 500 a 525 aminoácidos, tais como 525 a 550 aminoácidos, por exemplo 550 a 575 aminoácidos, tais como 575 a 600 aminoácidos, por exemplo 600 a 625 aminoácidos, tais como 625 a 640 aminoácidos. 126

Em uma forma de realização particular, o fragmento ou variante da Hsp70 compreende a totalidade ou parte do domínio ATPase da Hsp70. Daqui resulta que o fragmento ou variante da Hsp70 de acordo com a presente invenção, em uma forma de realização, compreende o todo ou parte do número de aminoácidos 30 a 382.

Em outra forma de realização particular, o fragmento ou variante da Hsp70 compreende o triptofano na posição 90 do aminoácido do domínio ATPase da Hsp70.

Um fragmento da Hsp7 0 pode ser uma versão truncada da proteína do tipo selvagem, o que significa que é uma versão mais curta. Um fragmento pode ser truncado por encurtamento da proteína a partir da terminação amino ou da terminação carboxilo da proteína, ou pode ser truncado por deleção de uma ou mais regiões internas de qualquer tamanho da proteína.

Um fragmento ou variante da Hsp70 pode, em uma forma de realização, ter homologia a 100% com a proteína do tipo selvagem. Em outra forma de realização, o fragmento ou variante da Hsp70 pode também ser uma variante da Hsp70, que tem menos do que 100% de homologia com a proteína do tipo selvagem, tal como entre 99, 9 e 95% de homologia, por exemplo 95 a 90% de homologia, tal como 90 a 85% de homologia, por exemplo 85 a 80% de homologia, tal como 80 a 75% de homologia, por exemplo 75 a 60% de homologia com a proteína do tipo selvagem.

Deve ser entendido que qualquer fragmento ou variante da Hsp70 que mantém a sua capacidade de modular a atividade enzimática lisossomal é englobado pela presente invenção. Deve ser entendido que qualquer fragmento ou variante da Hsp70 que mantém a sua capacidade de interagir com o BMP é 127 englobado pela presente invenção. É apreciado que o efeito quantitativo exato do fragmento funcional ou variante possa ser diferente do efeito da molécula de comprimento completo. Em alguns casos, o fragmento funcional ou variante pode na verdade ser mais eficaz do que a molécula de comprimento completo. Além disso, a utilização de fragmentos, em vez das moléculas com todo o comprimento pode ser vantajosa tendo em conta o menor tamanho dos fragmentos.

Em uma forma de realização, um fragmento funcional ou uma variante da Hsp70 pode ser uma variante da Hsp70 em que um ou mais aminoácidos tenha sido substituído. A(s) referida(s) substituição(ões) pode(m) ser uma substituição equivalente ou conservadora, ou uma substituição não equivalente ou não conservadora.

Em uma forma de realização, entre 0,1 e 1% dos residuos de aminoácidos do tipo selvagem da Hsp70 foram substituídos , tal como entre 1 a 2% dos resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 2 a 3% dos resíduos de aminoácidos, tais como entre 3 a 4% dos resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 4 a 5% dos resíduos de aminoácidos, tais como entre 5 a 10% de resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 10 a 15% de residuos de aminoácidos, tal como entre 15 a 20% de resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 20 a 30% de resíduos de aminoácidos, tais ; como entre 30 a 40% dos resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 40 a 50% de resíduos de aminoácidos, tal como entre 50 a 60% de resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 60 a 70% de resíduos de aminoácidos, tal como entre 70 a 80% de resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 80 a 90% de resíduos de aminoácidos, tal como entre 90 a 100% de resíduos de aminoácidos. 128

Em uma forma de realização, entre 1 a 5 dos resíduos de aminoácidos do tipo selvagem da Hsp7 0 têm sido substituídos, tais como entre 5 a 10 resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 10 a 15 resíduos de aminoácidos, tais como entre 15 a 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 20 a 30 resíduos de aminoácidos, tais como entre 30 a 40 resíduos de aminoácidos, por exemplo, entre 40 a 50 resíduos de aminoácidos, tais como entre 50 a 75 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 75 a 100 resíduos de aminoácidos, tais como entre 100 a 150 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 150 a 200 resíduos de aminoácidos, tais como entre 200 a 300 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 300 a 400 resíduos de aminoácidos, tais como entre 400 a 500 resíduos de aminoácidos .

Em uma forma de realização, o fragmento funcional ou a variante da Hsp70 é uma proteina de fusão. Em uma forma de realização, o referido fragmento funcional ou a variante da Hsp70 está fundido com uma etiqueta.

Vantagens da utilização da Hsp70, ou de um seu fragmento funcional ou uma sua variante

Tal como aqui discutido acima, não existe cura para as doenças do armazenamento lisossomal e o tratamento é essencialmente sintomático, com a exceção do desenvolvimento de terapias de substituição enzimática (ERT) para a doença de Gaucher e para a Doença de Fabry. Como mencionado, a ERT é uma forma muito dispendiosa de terapia que é eficaz apenas para uma doença especifica.

Do conhecimento dos inventores, até à data nenhuma tentativa bem sucedida foi feita para fornecer ERT para as 129 restantes doenças do armazenamento lisossomal associadas à acumulação de lipidos, existindo assim uma grande necessidade não atendida de um tratamento eficaz e especifico para estas LSDs, permanecendo até hoje. A administração da Hsp70, ou de um seu fragmento funcional ou de uma sua variante, a um individuo que dele necessite tem algumas vantagens em relação a modalidades de tratamento convencionais para as doenças do armazenamento lisossomal.

Em primeiro lugar, produzindo uma proteína recombinante, tal como a rHsp70 ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, é com tecnologia moderna uma maneira simples e direta de produzir quantidades suficientes de rHsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. As técnicas convencionais para a produção de enzimas recombinantes são bem conhecidas dos especialistas.

Além disso, a produção de uma proteina recombinante, tal como a rHsp7 0, um seu fragmento funcional ou uma sua variante, é um método pouco dispendioso para a produção de quantidades suficientes de rHsp70, ou de um seu fragmento funcional ou de uma sua variante. Em comparação com a produção de enzimas para a ERT, o custo é reduzido drasticamente.

Além disso, a utilização da Hsp70, ou de um seu fragmento funcional ou de uma sua variante pode ser feita para o tratamento de mais do que um distúrbio do armazenamento lisossomal especifico. Isso aplica-se também aos indutores Hsp70 e co-indutores da presente invenção. Com efeito, o agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70 pode ser utilizado 130 para o tratamento de qualquer doença do armazenamento lisossomal, que possa ser revertida por modulação da atividade enzimática da enzima envolvida defeituosa, em que a referida enzima interatua com o BMP.

Finalmente, como a Hsp70 é uma molécula que ocorre endogenamente, i.e., uma molécula que se origina a partir de dentro de um organismo, tecido, ou célula, sendo de esperar que nenhuma ou uma resposta imunitária muito limitada seja desencadeada por administração da Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. Esta é uma grande vantagem uma vez que facilita o tratamento e reduz os potenciais efeitos secundários quando administrado a um indivíduo.

Expressão ectópica da Hsp70

Em uma forma de realização, a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode ser expressa a partir de um vetor. A invenção, portanto, em uma forma de realização, diz respeito a um vetor que codifica para a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante.

Em uma forma de realização da presente invenção, a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode ser administrada a um indivíduo em necessidade da mesma, sob a forma de um vetor. O vetor utilizado para expressar a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em: vetores virais (retroviral e adenoviral) ou vetores não virais (plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago).

Em uma forma de realização, o referido vetor compreende um ou mais origens de replicação, um marcador para seleção e 131 um ou mais locais de reconhecimento para uma endonuclease de restrição. Em outra forma de realização, o referido vetor é operativamente ligado a sequências reguladoras que controlam a transcrição da referida Hsp70, ou de um seu fragmento funcional ou variante, numa célula hospedeira adequada. A presente invenção em uma forma de realização refere-se a um método para a produção da Hsp7 0, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, tal como aqui descrito; compreendendo o referido método os passos para proporcionar um vetor que codifique para a referida Hsp7 0, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante e expressando o referido vetor, quer in vitro, ou in vivo em um organismo hospedeiro adequado, produzindo assim a referida Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. A invenção diz ainda respeito a uma célula hospedeira recombinante isolada ou transgénica compreendendo um vetor que codifica para a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou variante, de acordo com a presente invenção. A invenção também se refere a um método para gerar uma célula hospedeira recombinante ou transgénica, o referido método compreendendo os passos de proporcionar um vetor que codifique para a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, introduzindo o referido vetor na referida célula hospedeira recombinante ou transgénica e, opcionalmente, também expressando o referido vetor na referida célula hospedeira recombinante ou transgénica, gerando assim uma célula hospedeira recombinante ou transgénica produzindo a referida Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou sua variante. 132

Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um organismo transgénico de mamífero compreendendo a célula hospedeira descrita acima.

Em uma forma de realização adicional, o organismo transgénico, de mamífero, compreendendo a célula hospedeira recombinante ou transgénica de acordo com a presente invenção é não humana. A célula hospedeira transgénica pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em uma célula hospedeira de mamífero, vegetal, bacteriana, levedura ou fúngica.

Para melhorar a distribuição do ADN na célula, o ADN deve ser protegido contra danos e a sua entrada na célula deve ser facilitada. Os lipoplexos e os poliplexos, foram criados com a capacidade de proteger o ADN da degradação indesejável durante o processo de transfeção. 0 ADN plasmídeo pode ser coberto com lípidos em uma estrutura organizada tal como uma micela ou um lipossoma. Quando a estrutura organizada é complexada com o ADN, designa-se por um lipoplex. Existem três tipos de lípidos que podem ser empregues para formar lipossomas; aniónicos (carregados negativamente), neutros, ou catiónicos (carregados positivamente) . Os complexos de polímeros com ADN são chamados poliplexos. A maioria dos poliplexos consistem em polímeros catiónicos e a sua produção é regulada por interações iónicas.

Em uma forma de realização, o vetor compreendendo a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode ser utilizado para terapia génica. A terapia génica é a inserção de genes em células e tecidos de um indivíduo para tratar uma doença, tal como uma doença hereditária em que um alelo mutante pernicioso é substituído por um funcional. 133 [0328 Em outra forma de realização, a Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, pode ser administrada como ADN nú. Esta é a forma mais simples de transfeção não-viral. A distribuição do ADN nú pode ser realizada por utilização de eletroporação, sonoporação, ou pelo uso de um "gene arma", que dispara partículas de ADN revestidas com ouro na direção de uma célula utilizando gás de alta pressão.

Agente bioativo - Em combinação com indutores e co-indutores da Hsp70 A presente invenção refere-se a uma forma de realização para a modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interatua com o BMP, pela utilização de indutores ou co-indutores da Hsp70, em combinação com a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante.

Um indutor da Hsp7 0 é um composto que pode por si só amplificar a expressão do gene Hsp70 e a expressão da proteína sem stress concomitante.

Um co-indutor da Hsp70 é um composto que não pode amplificar a expressão do gene Hsp70 nem a expressão de proteína sem um stress concomitante (leve), mas o aumento induzido pelo stress nos níveis da Hsp70 é mais elevado ou melhorado, pela sua presença. Fármacos de pequenas moléculas - derivados da hidroxilamina

Em uma forma de realização, o referido co-indutor da Hsp70 é um fármaco de pequenas moléculas.

Em uma forma de realização particular, o co-indutor da Hsp7 0 de acordo com a presente invenção é um derivado da hidroxilamina. O referido derivado de hidroxilamina pode, 134 em uma forma de realização adicional, ser selecionado de entre o grupo de Bimoclomol (BRLP-42), Arimoclomol (BRX-220), BRX-345 e BGP-15.

Em uma forma de realização particular, o referido derivado da hidroxilamina é o arimoclomol (BRX-220). O bimoclomol (maleato de [2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxi]-3-piridina-carboximidoyl cloreto) é um composto não-tóxico que foi originalmente desenvolvido para o tratamento de complicações diabéticas, tais como neuropatias. O bimoclomol demonstrou ter melhorado a sobrevivência das células em condições de stress experimentais, em parte, pelo aumento intracelular das proteínas de choque térmico (HSPs) , incluindo a Hsp70, através de uma ativação da HSF-1. Foi demonstrado que o bimoclomol possui a capacidade de co-indução da Hsp70, na ausência de proteínas desdobradas e que o bimoclomol interatua com e aumenta a fluidez dos lípidos da membrana carregados negativamente. O BRX-345 é um análogo estrutural de bimoclomol com uma capacidade um pouco menor para induzir HSPs. O arimoclomol (BRX-220) é um análogo do bimoclomol, que também interatua com e amplifica a resposta ao choque térmico. O arimoclomol está atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de ALS (esclerose lateral amiotrófica); um distúrbio neurodegenerativo progressivo. O arimoclomal é propriedade da CytRx Corporation.

Fluidizadores da membrana

Em uma forma de realização, o referido indutor da Hsp70 é um fluidizador da membrana. 135 0 tratamento com um fluidizador da membrana pode também ser denominado terapia lipidica.

Em uma forma de realização particular, o indutor Hsp70 de acordo com a presente invenção é uma membrana fluidizante selecionada entre o grupo de álcool benzilico, heptanol, AL721, ácido docosa-hexaenóico, álcoois alifáticos, álcool oleilico, dimetilaminoetanol, A 2 C, farnesol e anestésicos, tais como a lidocaina, ropivacaina, a bupivacaina e mepivacaína, bem como outros conhecidos para o especialista na técnica.

Além da desnaturação de uma proporção de proteínas celulares durante o calor (proteotoxicidade), uma alteração na fluidez de membranas é também proposta como sendo um sensor térmico celular que inicia a resposta ao choque térmico e induz as HSPs. De facto, as perturbações da membrana induzidas quimicamente - análogas ao calor induzido pela fluidização da membrana plasmática - são capazes de ativar a HSP, sem causar a desnaturação das proteínas. A fluidez da membrana refere-se à viscosidade da bicamada lipidica da membrana celular.Os fosfolípidos da membrana incorporam ácidos gordos de comprimento e saturação variáveis.

Os fluidizadores de membrana agem por intercalação entre os lípídos da membrana induzindo um efeito desorganizador por enfraquecimento das interações de van der Vaals entre as cadeias acilo lipídicas.

Em uma forma de realização o fluidizador da membrana é selecionado a partir do grupo de álcool benzilico, heptanol, AL721, ácido docosa-hexaenóico, álcoois 136 alifáticos, álcool oleílico, dimetilaminoetanol, A2C , farnesol e anestésicos, tais como lidocaina, ropivacaína, bupivacaina e mepivacaina, bem como outros conhecidos para o perito na arte, para utilização no tratamento de doenças do armazenamento lisossomal.

Outros meios para induzir Hsp70

Qualquer meio para induzir a expressão da Hsp70, alguns dos quais estão descritos aqui abaixo, pode ser utilizado em combinação com a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. 0 aumento da temperatura de um indivíduo é um potente indutor de HSPs incluindo a Hsp70, e como tal, a terapia de calor subletal é uma forma de realização da presente invenção. Em uma forma de realização, a terapia de calor subletal compreende o aumento da temperatura de um indivíduo até uma temperatura nuclear de cerca de 38° C, tal como cerca de 39° C, por exemplo, cerca de 40° C, tal como cerca de 41° C, por exemplo cerca de 42° C, tal como cerca de 43° C. É, portanto, uma forma de realização da presente invenção, proporcionar terapia de calor sub-letal para utilização no tratamento de distúrbios do armazenamento lisossomal doenças de depósito. 0 stress psicológico, tal como o medo predatório e o choque elétrico, pode provocar uma libertação de eHsp70 induzida por stress, um processo que é sugerido como sendo dependente da sinalização por catecolamina. Além disso, a adrenalina e a noradrenalina podem evocar a libertação de Hsp7 0. 137

Os compostos seguintes demonstraram induzir (ou co-induzir) HSPs, incluindo a Hsp70: o composto interativo da membrana Edelfosina alquil-lisofosfolípido (ET-18-OCH3 ou 1- octadecil-2-metil-rac-glicero-3-fosfocolina); fármacos anti-inflamatórios incluindo 1/2 inibidores de ciclo-oxigenase, tais como o celecoxib e o rofecoxib, bem como NSAIDs, tais como o ácido acetilsalicilico, salicilato de sódio e indometacina; prostaglandinas PGA1, PGJ2 e 2-ciclopenteno-l-ona; agonistas do gama-recetor ativado por proliferação da peroxidase; agentes anticancerigenos de interação com a tubulina, incluindo a vincristina e o paclitaxel; a pioglitazona sensibilizadora da insulina; agentes anti-neoplásicos, tais como a carboplatina, doxorrubicina, fludarabina, ifosfamida e citarabina, os inibidores da Hsp90, geldanamicina, 17-AAG, 17-DMAG, radicicol, herbimicina-A e ácido araquidónico; inibidores do proteassoma MG132 e lactacistina; inibidores da serina-protease do DCIC, TLCK e TPCK; os fármacos anti-úlcera geranilgeranilacetona (GGA), a rebamipida, a carbenoxolona e o polaprezinco (L-carnosina de zinco); metais pesados (zinco e estanho); o fármaco anti-inflamatório dexametasona; cocaína, nicotina, álcool; agonistas alfa-adrenérgicos; prostanóides da ciclopentenona;, bem como medicamentos à base de plantas pasoniflorina, glicirrizina, celastrol, di-hidrocelastrol, diacetato de di-hidrocelastrol e curcumina. É, assim, uma forma de realização da presente invenção proporcionar um composto selecionado de entre o grupo de Edeifosina (ET-18-OCH3 ou l-octadecil-2-metil-rac-glicero-3-fosfocolina), celecoxibe, rofecoxib, ácido acetilsalicilico, salicilato de sódio, indometacina, PGA1, PGJ2 2-ciclopenteno-l-ona, agonistas do gama recetor ativado por proliferação da peroxidase, vincristina, paclitaxel, pioglitazona, carboplatina, doxorrubicina, 138 fludarabina, citarabina de ifosfamida, geldanamicina, 17-AAG, 17-DMAG, radicicol, herbimicina-A, ácido araquidónico, MG132, lactacistina, DCIC, TLCK, TPCK, geranilgeranilacetona(GGA) , rebamipida, carbenoxolona, polaprezinco (L-carnosina de zinco), dexametasona, cocaína, nicotina, álcool, agonistas alfa-adrenérgicos, prostanóides de ciclopentenonas, paeoniflorina e glicirrizina, celastrol, di-hidrocelastrol, diacetato de di-hidrocelastrol e curcumina, bem como outros indutores da HSP conhecidos para o perito na arte, para utilização no tratamento de desordens do armazenamento lisossomal, em combinação com a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante.

Composição farmacêutica de acordo com a presente invenção A presente invenção refere-se à modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interatua com o BMP, por utilização de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração e/ou a atividade da Hsp70, beneficiando assim os pacientes que sofrem de doenças do armazenamento lisossomal.

Embora seja possível para os agentes bioativos da presente invenção serem administrados como produto químico em bruto, é preferível apresentá-los sob a forma de uma formulação farmacêutica. Por conseguinte, a presente invenção ainda proporciona uma composição farmacêutica, para aplicação medicinal, que compreende um agente bioativo da presente invenção ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, tal como aqui definidos e um transportador farmaceuticamente aceitável. É um aspeto da presente invenção proporcionar uma composição, tal como uma composição farmacêutica, 139 compreendendo um agente bioativo aqui identificado que pode ser administrado a um indivíduo que dele necessite.

Em uma forma de realização, a invenção refere-se a uma composição compreendendo um agente bioativo de acordo com a presente invenção. A composição, tal como aqui divulgada pode, em uma forma de realização, ser formulada em combinação com um veículo fisiologicamente aceitável. A composição, tal como aqui divulgada, pode, em uma forma de realização, ser formulada em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas contendo um agente bioativo da presente invenção podem ser preparadas por técnicas convencionais, p.ex., tal como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por EW Martin, Mack Publishing Company, 19 a edição, Easton, Pa.

Os agentes bioativos da presente invenção podem ser formulados para administração parentérica e podem ser apresentadas na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-cheias, infusão de pequenos volumes ou em recipientes multi-dose com um agente conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, transportadores, diluentes, ou solventes, incluindo as soluções aquosas de sais minerais ou outras moléculas hidrossolúveis, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, óleos animais, óleos sintéticos, ésteres orgânicos injetáveis e podem conter agentes de formulação tais como agentes conservantes, molhantes, emulsionantes ou de suspensão, estabilizantes e/ou agentes dispersantes, corantes, tampões, espessantes, agentes solubilizantes e semelhantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó, obtido por isolamento assético do sólido estéril ou por liofilização da solução para 140 constituição antes da utilização com um veiculo adequado, p.ex., água estéril isenta de pirogénios.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos agentes bioativos, onde eles podem ser preparados, também se destinam a ser abrangidos pela presente invenção, tal como o são as formas de hidrato especificas de um sal. Estes sais serão aqueles que são aceitáveis na sua aplicação a uma utilização farmacêutica. Por isto se quer dizer que o sal irá reter a atividade biológica do composto progenitor e o sal não terá efeitos indesejáveis ou perniciosos na sua aplicação e utilização no tratamento de doenças.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis são preparados de uma maneira padrão.Se o composto progenitor é uma base que é tratada com um excesso de um ácido orgânico ou inorgânico num solvente adequado. Se o composto progenitor é um ácido, é tratado com uma base inorgânica ou orgânica num solvente adequado.

Qualquer formulação adequada do agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser empregue, conhecida por o perito na arte.

Em uma forma de realização, a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, é formulada num microsfera biodegradável, tal como um lipossoma.

Admini s tração

Qualquer via de administração adequada pode ser empregue para fornecer um mamifero, preferencialmente um ser humano, com uma quantidade eficaz de um agente bioativo de acordo com a presente invenção, em que o referido agente bioativo pode ser a Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante. 141 A administração dos agentes bioativos ou de composições farmacêuticas a um indivíduo em necessidade dos mesmos, pode ocorrer através de três vias principais de entrega: 1) tópica (aplicada a superfícies corporais tais como a pele ou membranas mucosas), 2) via entérica através do trato gastrointestinal ou digestivo) e 3) parentérica (vias diferentes do trato gastrointestinal ou digestivo). A administração tópica inclui a administração epicutânea (aplicação sobre a pele), inalação, enema, colírio ocular (para a conjuntiva), gotas para os ouvidos, via intranasal e administração vaginal. A administração entérica é qualquer forma de administração que envolve qualquer parte do trato gastrointestinal e inclui a administração oral (pela boca, p.ex., comprimidos, cápsulas ou gotas), intra-retal (p.ex., supositório ou enema) administração além do tubo de alimentação gástrico ou duodenal.

Distribuição parentérica, tal como por injeção ou infusão, são eficazes para entregar o agente bioativo a um local alvo ou para introduzir o medicamento na corrente sanguínea e inclui a via intravenosa (em uma veia), intra-arterial (em uma artéria), intramuscular (no músculo), intracardíaca (no coração), subcutânea (sob a pele), intra-óssea (na medula óssea), intradérmica, (na própria pele), intratecal ou intraespinal (dentro do canal espinal), intraperitoneal, (no peritoneu), transdérmica (difusão através da pele intacta), transmucosa (difusão através de uma membrana mucosa, p.ex. insuflação (aspiração), supositórios sublinguais, bucais e vaginais) , por via inalatória, epidural (no espaço epidural) e intravítrea (no olho). A administração sublingual (sob a língua) é também uma forma de administração parentérica, através da qual os agentes 142 bioativos se difundem para a corrente sanguínea através do tecido da mucosa sob a língua. 0 agente bioativo da presente invenção pode ser administrado por qualquer via parentérica de distribuição e de preferência qualquer ums das mencionadas acima. A distribuição parentérica tem a vantagem de evitar a degradação no tracto gastrointestinal, tal como o associado à distribuição entérica. A distribuição parentérica tem a vantagem adicional de suprimir o metabolismo de primeira passagem, tal como associado com distribuição entérica , porque permite que os compostos sejam absorvidos diretamente para a circulação sistémica. 0 metabolismo de primeira passagem é um fenómeno do metabolismo dos fármacos através do qual a concentração de um fármaco é grandemente reduzida antes de atingir a circulação sistémica. É a fração do fármaco perdido durante o processo de absorção que é geralmente relacionado com o fígado e parede do intestino.

Após um fármaco ser engolido, ele é absorvido pelo sistema digestivo e entra no sistema de porta hepática. É transportado através da veia portal para o fígado antes de atingir o resto do corpo. 0 fígado metaboliza muitos fármacos, por vezes, numa extensão tal que apenas uma pequena quantidade de fármaco ativo emerge a partir do fígado para o resto do sistema circulatório. Esta primeira passagem através do fígado reduz, assim, grandemente a biodisponibilidade do fármaco.

Os quatro sistemas primários que afetam o efeito de primeira passagem de um fármaco são as enzimas do lúmen 143 gastrointestinal, as enzimas da parede intestinal, as enzimas bacterianas e as enzimas hepáticas.

Podem ser preparadas formas de dosagem adequadas para uma tal administração por técnicas convencionais.Formas de dosagem apropriadas para administração por inalação, tais como uma formulação de aerossol ou um inalador de dose medida, podem ser preparados por técnicas convencionais.

Em uma forma de realização, um modo particular de administração de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é por administração parentérica.

Em uma forma de realização, um modo particular de administração parentérica de um agente bioativo da presente invenção é por injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-arterial, subcutânea ou intraperitoneal.

Em uma forma de realização, um modo particular de administração parentérica de um agente bioativo da presente invenção é por inalação.

Em uma forma de realização, um modo particular de administração parentérica de um agente bioativo da presente invenção é por infusão intravenosa. A infusão intravenosa de acordo com a presente invenção pode, em uma forma de realização, ocorrer ao longo de um periodo de tempo desde 10 minutos até 20 minutos, tal como 20 a 30 minutos, por exemplo 30 a 40 minutos, tal como 40 a 50 minutos, por exemplo 50 a 60 minutos, tal como 60 a 90 minutos, por exemplo 90 a 120 minutos, tal como 2 horas a 3 horas, por exemplo 3 a 4 horas, tal como 4 a 5 horas, por 144 exemplo 5 a 6 horas, tal como 6 a 7 horas, por exemplo 7 a 8 horas.

Em uma forma de realização particular, o modo de administração parentérica de um agente bioativo do presente invento é por administração transmucosal. A referida distribuição transmucosal está em uma forma de realização por via sublingual, em uma outra forma de realização a referida distribuição transmucosal é a distribuição bucal e, ainda em outra forma de realização, a referida distribuição transmucosal é a distribuição intranasal por insuflação.

As formas de dosagem incluem comprimidos, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, pomadas, emulsões, géis, loções, pastas, aerossóis ou outras formas conhecidas na arte. A dosagem efetiva do ingrediente ativo utilizado pode variar, dependendo da composição particular empregue, do modo de administração, da condição a ser tratada e da gravidade da condição a ser tratada. Uma tal dosagem pode ser determinada facilmente por uma pessoa perita na arte.

Em uma forma de realização, o agente bioativo da presente invenção é administrado em uma dosagem diária de cerca de 1 micrograma até cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal do animal, dada como uma dose diária única ou em doses divididas, ou em forma de libertação controlada. O regime de dosagem pode ser ajustado dentro deste intervalo ou mesmo fora desta faixa para proporcionar a resposta terapêutica óptima.

Em uma forma de realização, o agente bioativo da presente invenção é administrado em uma dosagem de desde cerca de 1 145 yg até cerca de 10 yg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 10 yg até cerca de 50 yg por kg de peso corporal, por exemplo a partir de cerca de 50 yg até cerca de 100 yg por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 100 yg até cerca de 250 yg por kg de peso corporal, por exemplo desde cerca de 250 yg até cerca de 500 yg por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 500 yg a cerca de 750 yg por kg do peso corporal, por exemplo desde cerca de 750 yg a cerca de 1000 yg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg por kg de peso corporal, por exemplo desde cerca de 10 mg a cerca de 50 mg por kg de peso corporal, tal como de cerca de 50 mg a cerca de 100 mg por kg de peso corporal. A referida dosagem pode ser administrada em certos intervalos de tempo e pode ser expressa como mg por kg de peso corporal por unidade de tempo. A referida unidade de tempo pode ser, em uma forma de realização, por minuto, tal como por hora, por exemplo, por dia, tal como por semana.

Tratamento combinado É um aspeto da presente invenção para proporcionar um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade da Hsp70 para uso no tratamento de desordens de armazenamento lisossomal, em combinação com outras modalidades de tratamento. A presente invenção em um aspeto refere-se a um método de tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal compreendendo a administração do agente bioativo de acordo com qualquer um da presente invenção em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento.

Assim, em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um 146 indivíduo com necessidade do mesmo, em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento, tais como as modalidades de tratamento convencional ou conhecido para as LSDs.

Entende-se que o agente bioativo de acordo com a presente invenção é a Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante ou um indutor ou co-indutor da Hsp70. A administração de mais do que uma modalidade de tratamento em combinação pode ocorrer simultaneamente, ou sequencialmente. A administração simultânea pode ser dois compostos compreendidos na mesma composição ou integrados em composições separadas, ou pode ser uma composição e uma outra modalidade de tratamento realizada essencialmente ao mesmo tempo. A administração sequencial significa que mais do que uma modalidade de tratamento é administrada em momentos diferentes, tais como a administração de uma primeira modalidade de tratamento e a administração da segunda modalidade de tratamento subsequentemente. 0 período de tempo para a administração de mais do que uma modalidade de tratamento sequencial pode ser determinado por uma pessoa competente na técnica para atingir o efeito ótimo e pode, em uma forma de realização, estar compreendido entre 30 minutos a 72 horas.

As modalidades de tratamento sob a forma de compostos químicos podem ser administradas em conjunto ou separadamente, cada uma na sua dosagem mais eficaz. A administração de mais do que um composto pode ter um efeito sinérgico, reduzindo assim eficazmente a dosagem necessária de cada fármaco.

Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com 147 necessidade da mesma, em combinação com a terapia de substituição enzimática (ERT). A referida ERT pode, em uma forma de realização, ser seleccionada a partir do grupo consistindo em Cerezyme® (imiglucerase) , Miglustat Fabrazyme® (beta agalsidase), e Replagal (alfa agalsidase). Em uma forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um individuo com a doença de Gaucher em combinação com Cerezyme® (imiglucerase) ou Miglustat.

Em outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um individuo com doença de Fabry em combinação com Fabrazyme® (agalsidase beta) ou Replagal (alfa agalsidase).

Em outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um individuo em necessidade deste, em combinação com analgésicos.

Em ainda outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um individuo em necessidade deste, em combinação com corticosteróides. 0 agente bioativo de acordo com a presente invenção pode, em uma forma de realização, ser administrado a um individuo em necessidade deste, em combinação com um transplante, tal como o transplante de medula óssea, o transplante do sangue do cordão umbilical ou um transplante de células estaminais. 0 agente bioativo de acordo com a presente invenção pode, em outra forma de realização ser administrado a um individuo em necessidade deste, em combinação com a terapia de redução de substrato. 148

Em outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um individuo em necessidade deste, em combinação com a terapia sintomática e de suporte, tal como fisioterapia.

Hsp70 aumenta a absorção de compostos

Os presentes inventores demonstraram ainda que a Hsp70 aumenta a absorção endocitica de outras moléculas (figura 16) . Este aumento da captação pode ocorrer de forma independente em Hsp70 devido a um mecanismo passivo, que permite a um composto ser mais prontamente absorvida pela célula na presença da Hsp70, ou pode ocorrer dependentemente da Hsp70 devido a uma associação direta com a Hsp70. A capacidade da Hsp70 para aumentar a captação celular de compostos é uma vantagem na medida em que permite à Hsp70, ou a um seu fragmento funcional ou a uma sua variante, administrado a células e a ser prontamente absorvido pela célula.

Além disso, a capacidade da Hsp70 para aumentar a captação celular de compostos é uma vantagem na combinação de regimes de tratamento, como a presença da Hsp70 pode aumentar a absorção de ambos Hsp70 e do composto indicado na combinação com Hsp70.

No que diz respeito à terapia de combinação em que um composto é uma enzima para a ERT e o outro é Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante, esta pode ajudar a reduzir eficazmente a quantidade de enzima para a ERT, necessária para alcançar uma dose intracelular eficaz. Isto é relevante pois a ERT é muito dispendiosa. 149

Na situação em que o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um seu fragmento funcional ou uma sua variante e um indutor ou co-indutor Hsp70, a presença da Hsp70 pode portanto, aumentar a captação do referido indutor ou co-indutor da Hsp70. Método para modular a atividade enzimática de uma enzima A presente invenção refere-se, em um aspeto, à modulação da atividade enzimática.A referida enzima pode ser uma enzima envolvida no catabolismo das substâncias lisossomais. E a referida modulação pode derivar de uma interação entre a Hsp70 e o BMP.

Os presentes inventores descrevem assim uma interação entre as proteínas Hsp70 e BMP, em que a Hsp70 interatua com ou liga-se ao BMP com uma certa afinidade. Por uma molécula possuir uma "afinidade" para a molécula X pretende-se dizer que uma molécula com afinidade para a molécula X se ligará à molécula X em uma certa quantidade detetável sob certas condições, mas não (opcionalmente e de um modo detetável) se liga a outras moléculas diferentes (para as quais ela não tem afinidade) na mesma medida, sob condições idênticas. Uma medida para descrever a afinidade de uma molécula para outra molécula é uma constante de dissociação, Kd. Quanto menor for o Kd, mais forte a afinidade. As constantes de dissociação podem ser determinadas utilizando métodos bem conhecidos na arte, tais como a análise por ressonância do plasmão de superfície. Aqui, é preferido que uma molécula com "afinidade" para outra molécula X tenha um Kd para a referida molécula X que é inferior a 100 mM, tal como menos de 10 mM, por exemplo menos de 5 mM, tal como menos de 1 mM, por exemplo inferior a 0,1 mM, tal como menos do que 0,01 mM, por exemplo menos do que 1 P M, tal como menos do 150 que 100 nM, por exemplo menos do que 10 nM, tal como menos de 1 nM, por exemplo menos de 100 pM, tal como menos de 10 pM, por exemplo menos de 1 pM. Além disso, é aqui preferido que uma molécula que "não tem uma afinidade" para a molécula X tem uma constante de dissociação, Kd em relação à molécula X de ligação que é pelo menos 10 vezes maior, tal como pelo menos 20 vezes maior, por exemplo, pelo menos, 30 vezes maior, tal como pelo menos 40 vezes maior, por exemplo pelo menos 50 maior, tal como pelo menos 60 vezes maior, por exemplo, pelo menos, 70 vezes maior, tal como pelo menos 80 vezes maior, por exemplo, pelo menos, 90 vezes maior, tal como pelo menos 100 vezes maior do que o Kd da ligação (à molécula X) de uma molécula que tem afinidade para a molécula X. Mais preferencialmente, existe pelo menos uma diferença de dez vezes no Kd entre essas moléculas consideradas como tendo uma afinidade e aquelas que são consideradas como não tendo uma afinidade para uma molécula X. A referida interação pode ser direta, em uma forma de realização, ou a referida interação pode ser indireta em outra forma de realização.

Em uma forma de realização, a referida Hsp70 forma um complexo covalente ou não covalente com o BMP.

Em uma forma de realização, o referido BMP interatua com uma saposina. Em uma forma de realização adicional, a referida saposina pode ser seleccionada do grupo consistindo em saposina A, saposina B, saposina C, e saposina D.

Em uma forma de realização adicional, a referida enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em esfingomielinase, esfingomielinase acidica (aSMase), 151 ceremidase ácida, beta-galactosilceremidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase glucosilceremidase, sialidase e sulfatase arilo.

Em uma forma de realização particular, a modulação da atividade enzimática é um aumento na atividade enzimática. Em uma forma de realização, o referido aumento na atividade enzimática é um aumento na gama de 1 a 5%, tal como na gama de 5 a 10%, por exemplo na gama de 10 a 15%, tal como na gama de 15 a 20%, por exemplo, na gama de 20 a 25%, tal como na gama de 25 a 30%, por exemplo na gama de 30 a 35%, tal como na gama de 35 a 40%, por exemplo na gama de 40 a 45%, tal como na gama de 45 a 50%, por exemplo na gama de 50 a 60%, tal como na gama de 60 a 70%, por exemplo na gama de 70 a 80%, tal como na gama de 80 a 90%, por exemplo, na gama de 90 a 100%, tal como na gama de 100 a 120%, por exemplo na gama de 120 a 140%, tal como na gama de 140 a 160%, por exemplo na gama de 160 a 180%, tal como na gama de 180 a 200%, por exemplo, na gama de 200 a 250%, tal como na gama de 250 a 300%, por exemplo na gama de 300 a 400%, tal como na gama de 400 a 500%, por exemplo, na gama de 500 a 750%, tal como na gama de 750 a 1000%, por exemplo, na gama de 1000 a 1500%, tal como na gama de 1500 a 2000%, por exemplo na gama de 2000 a 5000%. A presente invenção em um outro aspeto refere-se a um complexo Hsp70-BMP e à sua utilização para um medicamento, tal como para o tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um anticorpo que reconhece especificamente o complexo Hsp70-BMP. Método de tratamento 152 A presente invenção divulga um método para o tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo. É divulgado um método para o tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal compreendendo a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo. 0 referido tratamento pode ser profilático, curativo ou de melhoria. 0 agente bioativo utilizado de acordo com a presente invenção pode ser formulado como uma composição farmacêutica. A referida doença do armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo na doença de Niemann-Pick, doença de Farber, doença de Krabbe, doença de Fabry, doença de Gaucher, leucodistrofia metacromática, Sialidose e deficiência em saposina. A referida doença lisossomal pode ser caracterizada por uma acumulação intracelular aumentada de um esfingolípido. 0 referido tratamento pode reduzir a acumulação intracelular de substâncias em um indivíduo com necessidade do mesmo. A referida substância pode ser uma substância que é normalmente degradada nos lisossomas. A referida substância pode ser um esfingolípido. 0 tratamento de acordo com a presente invenção pode reduzir a acumulação intracelular de uma substância lisossomalmente degradável tal como um esfingolípido para menos de 100% da quantidade acumulada, tal como menos de 90% da quantidade 153 acumulada, por exemplo, menos de 80% da quantidade acumulada, tal como menos de 70% da quantidade acumulada, por exemplo, menos de 60% da quantidade acumulada, tal como menos de 50% da quantidade acumulada , por exemplo menos de 40% da quantidade acumulada, tal como menos de 30% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 20% da quantidade acumulada, tal como menos de 10% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 5% da quantidade acumulada. O tratamento de acordo com a presente invenção pode reduzir a acumulação intracelular de um esfingolipido em pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos, 15%, tal como pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos, 25%, tal como pelo menos 30%, por exemplo, pelo menos , 35% , tal como pelo menos 40%, por exemplo, pelo menos, 45% , tal como pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos, 55%, tal como pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos, 65%, tal como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos, 75%, tal como pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos, 85%, tal como pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos, 95%, tal como pelo menos 100%. O referido esfingolipido acumulado pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em esfingomielina, ceramida, galactosilceramida, globotriaosilceramida, glicosilceramida, GM3 e sulfatideo. A taxa de redução da concentração intracelular de uma substância lisossomalmente degradável tal como um esfingolipido pode depender de fatores tais como a forma de administração, os regimes de dosagem e esquemas semelhantes. O referido tratamento prolonga a expetativa de vida do referido indivíduo em necessidade do mesmo. 154

Daqui resulta, que a esperança de vida pode ser aumentada de 6 meses a 1 ano, tal como desde 1 ano a 2 anos, por exemplo desde 2 a 3 anos, tal como desde 3 a 4 anos, por exemplo, desde 4 a 5 anos, tal como desde 5 a 6 anos, por exemplo, desde 6 a 7 anos, tal como desde 7 a 8 anos, por exemplo desde 8 a 9 anos, tal como desde 9 a 10 anos, por exemplo desde 10 a 12 anos, tal como desde 12 a 14 anos, por exemplo, desde 14 a 16 anos, tal como desde 16 a 18 anos, por exemplo, desde 18 a 20 anos, tal como desde 20 a 25 anos, por exemplo desde 25 a 30 anos, tal como 30 a 40 anos, por exemplo desde 40 a 50 anos, tal como desde 50 a 60 anos, por exemplo desde 60 a 70 anos, tal como desde 70 a 80 anos, por exemplo desde 80 a 90 anos, tal como desde 90 a 100 anos. A esperança de vida pode ser aumentada em pelo menos 6 meses, tal como pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo 3 anos, tal como pelo menos 4 anos, por exemplo 5 anos, tal como pelo menos 6 anos, por exemplo 7 anos, tal como pelo menos, 8 anos, por exemplo 9 anos, tal como, pelo menos, 10 anos, por exemplo 12 anos, tal como pelo menos 14 anos, por exemplo 16 anos, tal como pelo menos 18 anos, por exemplo, 20 anos, tal como pelo menos 25 anos, por exemplo 30 anos, tal como pelo menos 40 anos, por exemplo 50 anos, tal como pelo menos 60 anos, por exemplo 70 anos, tal como pelo menos 80 anos, por exemplo 90 anos, tal como pelo menos 100 anos.

Também é divulgado o facto de proporcionar um método para prolongar a expectativa de vida de um paciente com uma doença do armazenamento lisossomal , em que o referido método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo que dele necessite. 155 É divulgado um método para prolongar a expectativa de vida de um paciente com uma doença do armazenamento lisossomal, onde o referido método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um individuo em necessidade do mesmo, em que a referida esperança de vida é aumentada entre 6 meses a ul ano, tal como desde 1 ano a 2 anos, por exemplo desde 2 a 3 anos, tal como desde 3 a 4 anos, por exemplo, desde 4 a 5 anos, tal como desde 5 a 6 anos, por exemplo desde 6 a 7 anos, tal como desde 7 a 8 anos, por exemplo desde 8 a 9 anos, tal como desde 9 a 10 anos, por exemplo desde 10 a 12 anos, tal como desde 12 a 14 anos, por exemplo, desde 14 a 16 anos, tal como desde 16 a 18 anos, por exemplo, desde 18 a 20 anos, tal como desde 20 a 25 anos, por exemplo desde 25 a 30 anos, tal como desde 30 a 40 anos, por exemplo desde 40 a 50 anos, tal como desde 50 a 60 anos, por exemplo desde 60 a 70 anos, tal como desde 7 0 a 80 anos, por exemplo desde 80 a 90 anos, tal como desde 90 a 100 anos. É divulgado um método para prolongar a expectativa de vida de um paciente com uma doença do armazenamento lisossomal, em que o referido método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um individuo em necessidade do mesmo, em que a referida esperança de vida é aumentada em pelo menos 6 meses, tal como pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo, 3 anos, tal como pelo menos 4 anos, por exemplo 5 anos, tal como, pelo menos, 6 anos, por exemplo 7 anos, tal como, pelo menos, 8 anos, por exemplo 9 anos, tal como, pelo menos, 10 anos, por exemplo 12 anos, tal como pelo menos 14 anos, por exemplo 16 anos, tal como pelo menos 18 anos, por exemplo, 20 anos, tal como pelo menos 25 anos, por exemplo 30 anos, tal como pelo menos 40 anos, por exemplo 50 anos, tal como pelo menos 60 anos, por exemplo 156 70 anos, tal como pelo menos 80 anos, por exemplo 90 anos, tal como pelo menos 100 anos.

Exemplos

Exemplo 1: Interação entre a Hsp70 e o bis (monoacilglicero) fosfato estabiliza lisossomas e promove a sobrevivência das células

Resumo A permeabilização da membrana lisossomal é um marco evolutivo conservado da morte celular induzida por stress. Aqui, os inventores mostram que a principal proteína de choque térmico indutível por stress 70 (Hsp70) aumenta a sobrevivência das células através da estabilização dos lisossomas por meio de uma ligação de afinidade elevada, dependente do pH, a um fosfolípido bis (monoacilglicero) fosfato endo-lisossomal aniónico (BMP; também referido como ácido lisobisfosfatídico). O domínio ATPase carregado positivamente da Hsp70 é responsável pela ligação mas o domínio de ligação ao substrato é também necessário para a estabilização eficaz dos lisossomas. De um modo importante, o efeito citoprotetor pode ser obtido por distribuição endocítica da Hsp70 recombinante e especificamente revertido por administração extracelular de anticorpos para o BMP ou inibidores da Hsp70. Assim, esta interação proteína-lípido abre possibilidades interessantes para o desenvolvimento de terapias citoprotetoras e citotóxicas específicas do lisossoma para o tratamento de doenças degenerativas e cancro, respetivamente.

Introdução (rede

Os lisossomas são organelos citosólicos altamente dinâmicos que recebem o tráfego de entrada na membrana através das vias biossintética (rede Trans-Golgi), endocítica, 157 fagocítica e autofágica. Eles contêm mais de 50 hidrolases ácidas que podem processar todas as principais macromoléculas da célula em produtos da sua degradação disponíveis para reutilização metabólica. Além das suas funções catabólicas e de manutenção, as proteases lisossomais, catepsinas, foram recentemente identificadas como efetores importantes em programas de morte celular induzida evolutivamente conservada, por exemplo, por recetores de morte da família do recetor do fator de necrose tumoral, hipóxia, stress oxidativo, stress osmótico, calor e fármacos anti-cancerígenos. A morte celular dependente da catepsina é caracterizada por uma permeabilização da membrana lisossomal precoce e pela translocação subsequente das catepsinas para o citosol, onde podem iniciar ambas as vias de morte celular caspase-dependentes e independentes. Assim, a integridade da membrana lisossomal emerge como um importante regulador da sobrevivência das células durante várias condições de stress. Enquanto os inibidores da protease de cisteína citosólica foram descritos por conferir proteção contra os danos celulares induzidos pela catepsina em ambas as células de mamíferos, bem como em nemátodos Caenorhabditis elegans, permanecendo largamente obscuros os mecanismos pelos quais as células regulam a estabilidade da membrana lisossomal. Evidências indiretas recentes sugerem, no entanto, que o efeito citoprotetor potente da principal Hsp70 indutível por stress é devido à estabilização da membrana lisossomal. A depleção em Hsp70 desencadeia uma permeabilização precoce das membranas lisossómicas e morte celular mediada por catepsina em células de cancro e, a Hsp70 exógena inibe efetivamente a destabilização lisossomal induzida por vários stresses. Além disso, ratinhos deficientes em Hsp70 sofrem de pancreatite causada pela fuga de proteases lisossomais para o citosol. 158 0 mecanismo molecular subjacente ao potencial protetor do lisossoma Hsp70 permaneceu uma incógnita, mas as pistas para o seu mecanismo de ação podem estar na translocação associada ao stress e ao cancro de uma pequena porção da Hsp70 para o compartimento endo-lisossomal. 0 objetivo principal deste estudo foi definir se a localização dos lisossomas, de fato, é crucial para o efeito citoprotetor da Hsp70. Notavelmente, os dados aqui apresentados demonstram que a Hsp70 se liga com elevada afinidade a um BMP lipidico especifico dos lisossomas e que esta interação proteína-lípido estabiliza os lisossomas. De um modo importante, este novo mecanismo citoprotetor pode ser explorado pela administração extracelular de qualquer citoprotetor. A própria Hsp70 ou compostos que interferem com a ligação Hsp70-BMP ou com a função Hsp70 especificamente no compartimento lisossomal.

Resultados e Discussão A fim de testar se a localização lisossomal é crucial para o efeito citoprotetor da Hsp70, os presentes inventores produziram Hsp70 recombinante (rHsp70) e aproveitaram a maquinaria endocitica das células para direcionar a rHsp70 para dentro do lúmen lisossomal. A análise imunocitoquimica de células U-2-0S de osteossarcoma incubadas com rHsp70 marcadas com Alexa Fluor 488 revelou uma clara co-localização da rHsp70 endocitosada com proteinas marcadoras endossomais e lisossomais tardias (proteinas 1 e 2 de membrana associadas ao lisossoma e proteina de membrana integral 1 lisossomal (LIMP-1)) e um lípido endo-lisossoma-específico (BMP) , ao passo que não foi observada uma co-localização com marcadores para o retículo endoplasmático (Retículo endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA)), aparelho de Golgi (golgina-97) ou mitocôndrias (citocromo C (cyt c)). A localização lisossomal também foi observada em células vivas, onde a rHsp70 endocitosada co-localizada com o 159

Vermelho LysoTracker® mas não com o Vermelho Mitotracker®. A fim de determinar a quantidade de Hsp70 endocitosada, o sinal fluorescente das células carregadas com a rHsp70 * foi quantificado, o que revelou que uma média de 70 ng de rHsp70* é captada pr. 1 * 105 células. Para determinar se a rHsp70* endocitosada ficou meramente localizada no lúmen ou se teria uma ligação direta com as membranas endo-lisossomais, as células U-2-OS carregadas com rHsp70* foram sub-fracionadas e a quantidade de rHsp70* presente na fração de membrana de luz (LMF) medida (organelos celulares, incluindo os endossomas precoce e tardio e lisossomas). A quebra dos organelos congelados na LMF através de ciclos repetidos de congelamento/descongelamento em nitrogénio liquido, resultou na libertação total de catepsina B no sobrenadante, enquanto que a proteina da membrana lisossomal LAMP-2 foi mantida na fração sedimentada da membrana, fraturada. A quantificação da rHsp70* endocitosada revelou que aprox. 1/3 da rHsp70* total permaneceu no sedimento, sugerindo fortemente que se ligou as membranas endo-lisossomais. De modo a avaliar se a rHsp70 endocitosada pode estabilizar as membranas lisossómicas, as células foram carregadas com laranja de acridina, uma base fraca metacromática que se acumula no compartimento acidico das células, i.e., endossomas e lisossomas tardios e as sensibiliza à foto-oxidação por exposição a luz azul (Brunk et al, 1997;. Nylandsted et al,.2004). A foto-oxidação resulta na perda do gradiente de pH lisossomal e no vazamento do laranja de acridina para o citosol. Isto pode ser facilmente visualizado e quantificado à medida que o laranja de acridina exibe uma fluorescência vermelha quando concentrado no compartimento acidico da célula e uma fluorescência verde quando em concentração mais baixa no citosol. Surpreendentemente, a rHsp70 endocitosada protegeu os lisossomas contra a foto-oxidação induzida pela luz azul, ao passo que nenhuma 160 proteção foi observada em células carregadas com Hsc70 recombinante e Hsp70-2, que partilham 86% e 84% de homologia na sequência de aminoácidos com a Hsp70, respetivamente. Além disso, um ARN de interferência (siRNA) curto especifico para os lisossomas sensibilizados para a Hsp70 de células U-2-OS pela foto-oxidação, e este efeito foi totalmente revertido pela rHsp70 endocitosada apropriadamente demonstrando que o efeito protetor da Hsp70 endógena é mediado pela pequena fração da proteína localizada no lúmen lisossomal em vez de o ser pelo grande reservatório residente no citosol. O descrito acima demonstra uma captação eficaz endocítica da Hsp70 e a estabilização dos lisossomas pode explicar os efeitos neuroprotetores surpreendentes e recentemente reportados da Hsp70 extracelular administrada nos locais de lesão na sequência de uma variedade de tratamentos conhecidos por desencadear a via de morte celular lisossomal, i.e., danos na luz da retina e na axotomia do nervo ciático. A fim de testar se o efeito protetor da Hsp70 pode ser uma consequência de uma associação direta da Hsp70 com as membranas lisossómicas, os inventores investigaram a sua interação com grandes vesículas unilamelares (LUV) de palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), contendo uma variedade de lípidos aniónicos associados à membrana , i.e., palmitoiloleoil-fosfatidilserina (POPS; principalmente no folheto interno da membrana plasmática), cardiolipina (primariamente mitocondrial) e BMP (primariamente em endossomas e lisossomas tardios). Tendo em conta o meio cada vez mais ácido do compartimento endolisossomal aquando da maturação dos lisossomas, as interações proteína-lípido em condições neutras (pH 7,4) e ácidas (pH 6,0) foram comparadas. A pH 7,4, a rHsp70 causou uma pequena mudança relativa na dispersão da luz a 90° em lipossomas POPC, indicando uma ligação muito fraca à bicamada POPC. Conforme descrito anteriormente para POPS, 161 todos os lípidos carregados negativamente potenciaram a ligação da rHsp70 para os lipossomas a pH neutro. Este reforço foi de aproximadamente 4 vezes independentemente do lipido negativo ou da densidade de carga sobre a superfície do lipossoma (POPS tem uma rede de carga de -1 e a cardiolipina e o BMP têm uma rede de carga de -2). Notavelmente, o abaixamento do pH desde 7,4 para 6,0 mudou dramaticamente o perfil da associação de lipidos da rHsp70. Considerando que a ligação para POPS foi apenas ligeiramente aumentada aquando da acidificação, a ligação ao BMP foi quase 20 vezes mais forte no pH ácido, em comparação com o pH neutro. A ligação de alta afinidade dependente do pH da Hsp7 0 ao BMP foi confirmada em um conjunto independente de ensaios BIAcore. A fim de testar se a interação de alta afinidade dependente do pH entre as proteínas Hsp70 e BMP observada in vitro foi necessária para a estabilização dos lisossomas, mediada pela Hsp70, em células vivas, os inventores direcionaram o BMP celular carregando o compartimento endolisossomal de células U-2-OS com anticorpos BMP tal como demonstrado anteriormente (Kobayashi et ai., 1998). Notavelmente, os anticorpos BMP inibiram eficazmente a capacidade da rHsp70 para conferir proteção contra o vazamento lisossomal induzido por foto-oxidação. Ainda mais importante, os anticorpos para o BMP sensibilizaram significativamente as células do osteossarcoma U-2-OS à cisplatina, o que induz uma permeabilização da membrana lisossomal precoce em células U-2-OS, bem como outros linhas celulares sensíveis à cisplatina, utilizadas neste estudo. De um modo concordante, também as células de carcinoma da próstata PC-3 e DU-145 foram significativamente sensibilizadas para a morte celular induzida por cisplatina após o tratamento com anticorpos anti-BMP. 162

Tendo confirmado que a interação lisossomal Hsp70 - BMP é essencial para o efeito citoprotetor da Hsp70, os inventores investigaram a seguir qual a parte da proteína Hsp70 que é responsável pela ligação aos lípidos. Para determinar isso, foi medido o desvio de fluorescência dos triptofanos (W90 e W580) aquando do acoplamento da rHsp70 aos lipossomas contendo BMP a pH 6,0. Os inventores produziram proteínas mutantes rHsp70 com deleções dos dois principais domínios funcionais da proteína, isto é, o domínio ATPase amino-terminal (rHsp70-AATP; deleção de aminoácidos 119-426) e o domínio de ligação ao péptido carboxiterminal (rHsp70-A PBD; deleção de aminoácidos 437-617) . A perda de sinal na intensidade da fluorescência do pico relativa à Hsp70-AATP indicou que o domínio ATPase é necessário para a ligação de alta afinidade da Hsp70 à bicamada POPC/BMP. Em seguida, os dois triptofanos em Hsp70 foram substituídos com fenilalaninas (W90F e W580F) a fim de estudar qual o triptofano é responsável pelo desvio da ligação aos lípidos e da fluorescência. A redução do sinal com rHsp70-W90F que carece do triptofano no domínio ATPase (rHsp70-W90F) e o sinal inalterado com rHsp70-W580F que carece do triptofano no domínio de ligação ao péptido indicou que o triptofano na posição 90 ancorou na camada lipídica. Dado que o método utilizado acima apenas mediu o deslocamento relativo na fluorescência após o embebimento do triptofano no ambiente lipofílico, os inventores também analisaram a associação lipídica da rHsp70 e seus mutantes de um modo mais quantitativo, empregando um sistema BIAcore 2000 com LUVs contendo BMP imobilizado na superfície de um chip sensor LI a pH 4,5. Ambas rHsp70 e rHsp70-A PBD apresentaram uma forte interação com o BMP, enquanto a ligação de rHsp70-AATP foi significativamente reduzida, confirmando que a Hsp70 interatua com o BMP, principalmente através do seu domínio ATPase. Surpreendentemente, os mutantes de triptofano apresentaram uma diferença marcante 163 na sua capacidade para interagir com o BMP. Enquanto que a mutante rHsp70-W580F tinha essencialmente o mesmo perfil de interação com a rHsp70, a ligação da rHsp70-W90F mutante foi drasticamente diminuída. Como a rHsp70-W90F foi devidamente dobrada quando analisada, à distância e perto por dicroismo circular UV e capaz de dobrar a luciferace e hidrolisando o ATP, a mutação W90F aboliu especificamente a interação entre a Hsp70 e o BMP, mantendo os aspetos estruturais e funcionais da chaperona Hsp70. Assim, o mutante rHsp70-W90F forneceu inesperadamente uma valiosa ferramenta para testes adicionais sempre que a interação direta entre a Hsp70 e o BMP dota a Hsp70 com seus atributos de proteção lisossomal. Na verdade, o mutante rHsp70-W90F tinha perdido completamente a sua capacidade de proteger as membranas lisossómicas contra a foto-oxidação e as células contra a morte celular lisossomal induzida por cisplatina, enquanto que o mutante rHsp70-W580F mostrou a mesma eficácia que a proteina do tipo selvagem. Além disso, o mutante rHsp70 APBD que mostrou uma capacidade inalterada para se ligar a membranas ricas em BMP tinham perdido a sua capacidade para proteger contra a foto-oxidação e cisplatina. Estas descobertas demonstram que a ligação da Hsp70 ao BMP é necessária, mas não é suficiente para dotar as membranas lisosso mais com proteção. Além disso, um domínio de ligação ao péptido carboxi-terminal é necessário para a estabilização das membranas lisossómicas em células vivas.

Os inibidores da Hsp70 são considerados há muito tempo como sendo interessantes fármacos anti-cancerígenos.A atenção tem, no entanto, sido concentrada em inibir a Hsp70 citosólica e os problemas relativos à distribuição de fármacos e à falta de especificidade entre os membros da família Hsp70 apresentaram barreiras intransponíveis para o desenvolvimento de antagonistas adequados para a Hsp70. 164

Tendo estabelecido que tanto a ligação ao BMP e a um domínio de ligação ao péptido intacto são necessárias para o efeito citoprotetor da Hsp70 e após ter verificado o potencial no direcionamento da interação Hsp70 - BMP, os inventores testaram de seguida se o efeito protetor da Hsp70 endolisossomal também poderia ser neutralizado por inibidores da atividade de chaperona da Hsp70. Isto foi conseguido por incubação das células com um péptido derivado do fator indutor da apoptose (ADD70), que inibe a função de chaperona da Hsp70 por ligação ao seu domínio de ligação ao péptido. Deve notar-se que este péptido grande (388 aminoácidos) não atravessa a membrana plasmática e, assim, forneceu-nos outra ferramenta para direcionar especificamente a Hsp70 endolisossomal. Notavelmente, a incubação de células com péptidos ADD70 bloqueou completamente o efeito protetor do lisossoma da rHsp70 endocitosada em células U-2-0S. A fim de testar se os ADD70 também poderiam neutralizar o efeito citoprotetor das células da própria Hsp70, os inventores investigaram o seu efeito sobre a citotoxicidade induzida por cisplatina em fibroblastos embrionários murínicos imortalizados trangénicos com Hsp70 (iMEFs), em que a Hsp70 transgénica confere resistência quase completa contra a morte celular induzida por cisplatina. Notavelmente, o tratamento com ADD70 dos iMEFs transgénicos com Hsp70 efetivamente aboliu o efeito protetor mediado pela Hsp70, tornando-os sensíveis à cisplatina como os iMEFs do tipo selvagem. Os iMEFs do tipo selvagem expressam níveis muito baixos da Hsp70 e, assim, a incapacidade dos ADD70 para continuar a sensibilizá-los à cisplatina suporta a ideia de que a sensibilização mediada pelos ADD70 é, de facto, devida à inibição da Hsp70. Semelhante ao tratamento anti-BMP, também o tratamento com ADD70 sensibilizou as células de carcinoma da próstata PC-3 e DU-145 à citotoxicidade induzida por cisplatina. 165

Os dados apresentados aqui mostram que a Hsp70 interatua diretamente com o fosfolipido aniónico endo-lisossomal BMP e que esta interação estabiliza membranas endo-lisossómicas. Como a concentração de BMP aumenta nas vesículas endocíticas como os endossomos amadurecem para formar corpos multivesiculares, os endossomas tardios e os lisossomas, a regulação do pH pode ser o caminho pelo qual a Hsp70 é direcionada para o BMP e lisossomas. Os subdomínios da Hsp70 diferem acentuadamente nos seus valores pl, o domínio ATPase contendo um pl 1,72 unidades maior do que o domínio de ligação ao péptido. Esta característica sugere que para um pH ácido, o domínio ATPase é preferencialmente carregado positivamente, o que pode facilitar a sua interacção com lípidos aniónicos. À medida que o pH é reduzido durante a maturação endocítica, a carga positiva iria construir-se e qualquer interação aniónica seria reforçada ainda mais. Os dados aqui apresentados demonstram a dependência da interação Hsp70 -BMP em pH ácido e o domínio ATPase suporta esta teoria. Além disso, a modelação molecular da superfície electrostática do domínio ATPase da Hsp70 revelou que ela forma uma estrutura quase semelhante a cunha com uma carga predominantemente positiva na parte inferior da cunha mesmo a pH 7,0. Curiosamente, W90 encontra-se dentro deste domínio carregado positivamente, o que pode dar pistas sobre por que a mutação Hsp70-W90F tem um impacto tão profundo sobre a capacidade da Hsp70 para interagir com o BMP e estabilizar os lisossomas. BMP está localizado exclusivamente nas membranas internas do compartimento endolisossomal, onde suporta desintegração e extração de lípidos a partir de vesículas lipídicas por esfingomielinase ácida e proteínas ativadoras dos esfingolípidos dando origem a metabolitos, tais como a ceramida e a esfingosina-l-fosfato, os quais têm sido implicados na destabilização das membranas e morte celular. 166

Deve notar-se que as membranas internas lisossómicas podem ser alcançadas por invaginação das membranas do perímetro ao nível dos endossomas precoces e tardios e, portanto, as vesículas respetivas são suscetíveis de conter também a Hsp70. De um modo concordante, a Hsp70 pode interferir com o papel do BMP como um cofator para a hidrólise dos esfingolípidos e assim alterar a composição lipídica dos lisossomas. Para testar esta hipótese, os inventores estão atualmente a desenvolver uma tecnologia baseada na espetroscopia de massa para a quantificação dos metabolitos esfingolípidos lisossomais.

Os dados acumulados sugerem que a expressão aumentada e o tráfego alterado de proteases lisossomais podem formar um "calcanhar de Aquiles" para as células tumorais, sensibilizando-as à permeabilização da membrana lisossomal. Portanto, a interação BMP-Hsp70 nas membranas endo-lisossómicas e a estabilização resultante do compartimento endo-lisossomal proporciona as células cancerosas com proteção contra esta via de outro modo direta para a morte celular. 0 mecanismo molecular subjacente a este efeito citoprotetor agora abre novas possibilidades para a sensibilização das células cancerosas aos agentes que induzem vias de morte celular lisossómica via inibição específica da função estabilizadora do lisossoma pela Hsp70. Vice-versa, a interação entre a Hsp70 e o BMP podem fornecer novas estratégias de tratamento dependendo da citoproteção oferecida pela função estabilizadora do lisossoma da Hsp70, exogenamente administrada para ataques tão diversos como pancreatite, lesões nervosas motoras e sensoriais e danos na retina induzidos pela luz.

Materiais e métodos

Cultura de Células e reagentes 167

As linhas de células de osteossarcoma humanas U-2-0S foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementadas com 6% de soro de vitela ativado por calor e penicilina-estreptomicina. A Hsp70 transgénica e um controlo dos iMEFs apropriado foram gerados e mantidos como descritos anteriormente (Nylandsted et al., 2004). Todas as células foram crescidas a 37° C em uma atmosfera de ar humidificado com CO2 5% e repetidamente testadas e consideradas negativas para o micoplasma.

Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos foram adquiridos à Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Dinamarca A/S) .

Proteínas Recombinantes A Hsp70 recombinante e os seus mutantes foram gerados utilizando o sistema do vetor pET-16b (Novagen) com a indução de expressão da proteína e da subsequente purificação-afinidade-Ni2+ de acordo com o protocolo do fabricante. A rotulagem da rHsp70 com Alexa Fluor 488 foi feita de acordo com o protocolo dos fabricantes (Molecular Probes).

Captação celular de proteínas e anticorpos recombinantes:

As células sub-confluentes foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementadas com 6% de soro de vitelo inativado pelo calor e penicilina-estreptomicina. As proteínas recombinantes ou lisados de reticulócitos foram adicionados diretamente ao meio para obter a concentração final. As células foram então cultivadas durante mais 20h na presença de proteína / lisado. 168 0 carregamento de células com um anticorpo direcionado ao BMP (LBPA) (6C4) foi feito de acordo com as técnicas na arte. A quantificação da rHsp70* endocitosada foi feita através do crescimento de células 20h na presença de rHsp70* após o que as células foram colhidas, lavadas 3 vezes em PBS e contadas. Para a absorção de células inteiras 1 * 105, células foram utilizadas. As células foram lisadas por incubação durante 30 min em gelo em 100 pL de digitonina-PBS (200 pg/mL) . A fluorescência foi medida num leitor de placas Spectramax Gemini (Molecular Devices). Para frações de membrana de luz (LMF) , um total de 10 * 106 células foram colhidas, lavadas 3 vezes em PBS e Dounce-homogeneizada até a quebra da membrana quebra atingir 90%, conforme determinado por coloração com azul tripano. As células foram então submetidas ao fracionamento da membrana, primeiro limpando a membrana plasmática, frações do núcleo e da membrana pesada, após o que a LMF foi colhida por centrifugação a 17.000 g durante 20 min. A LMF foi então dividida em dois - o primeiro sendo mantido como o LMF "cheio". A segunda fração foi de congelamento / descongelamento durante 5 ciclos em nitrogénio liquido para quebrar as membranas e subsequentemente centrifugar a 20.000 * g durante 20 min, a fim de separar as membranas do conteúdo luminal. Todo o trabalho de células após a colheita foi feito no max. 4o C.

Ensaios para a integridade lisossomal e viabilidade celular Células sub-confluentes U-2-OS incubadas com 2 pg/mL de laranja de acridina durante 15 min a 37° C, foram lavadas, irradiadas e analisadas em solução salina equilibrada Hanks complementada com FCS a 3%. As células para imagiamento de células unitárias foram seleccionadas a partir de 8 áreas pré-definidas de cada poço no modo de transmissão de luz, 169 após o que as mesmas células foram imediatamente visualizadas e expostas à luz azul do arco de mercúrio queimador USH102 100W (Ushio electric) instalado num encaixe U-ULS100HG (Olympus) durante 20 seg. A microscopia de fluorescência foi realizada em um microscópio invertido Olympus IX-70 com uma objetiva LCPlanFl x20 com NA = 0,40. A perda do gradiente de pH lisossomal foi quantificada por contagem da perda de coloração vermelho intenso. A morte celular semelhante à apoptose foi avaliada por coloração das células com 0,05 pg/ mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) e contagem das células com núcleos condensados em um Microscópio de fluorescência invertido Olympus IX-70 (filtro U-UTH 330-385 nm) . Para cada ensaio no minimo oito áreas escolhidas aleatoriamente foram contadas. A viabilidade das células foi analisada pelo ensaio de redução do brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) tal como descrito anteriormente. As células necróticas, onde quantificadas por citometria de fluxo por coloração das células durante 10 min a 37° C com 2,5 μΜ SYTOX Green (Molecular Probes) e daqui em diante medir células coradas positivamente pela sua intensidade de fluorescência no canal de FL1 de um citómetro de fluxo (FACSCalibur ™; Becton Dickinson).

As células foram tratadas com cisplatina, tal como indicado, as frações citosólicas foram obtidas por tratamento com digitonina e a catepsina da cisterna citosólica (zFRase) e as atividades idênticas à caspase-3 (DEVDase) foram determinadas.

Interferência do ARN 170

Os siRNAs utilizados incluíram um alvo para os dois genes que codificam contra Hsp70 (HSPA1A e HSPA1B); 5'- GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3'(Invitrogen) e um controlo de siRNA Hsp70 descrito anteriormente. A oligofectamina (Invitrogen) foi utilizada como um agente de transfeção.

Imunodeteção

Os anticorpos primários utilizados incluíram anticorpos monoclonais contra a Hsp70 (2H9, gentilmente cedidos por Boris Margulis, Academia Russa de Ciências, São Petersburgo, Rússia) , gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; Biogenesis) , BMP (6C4;. (Kobayashi et al, 1998)), LIMP-1 (H5C6; desenvolvido por J. Thomas August e James E.K. Hildreth e obtidos do Banco de Estudos do

Desenvolvimento do Hibridoma sob os auspícios do NICHD e mantidos pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Iowa City, EUA), cit c (clone 6H2.B4, BD PharMingen), SERCA (IID8, Calbiochem) e golgina-97 (CDF4, Molecular Probes). As proteínas separadas por SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose foram detetadas usando os anticorpos primários indicados, anticorpos secundários adequados conjugados com peroxidase da Dako, ECL Western blotting Reagents (Amersham) , e um Leitor de Imagem Luminescente (LAS-lOOOPlus, Fujifilm).

Espetro de Fluorescência do Triptofano e Dispersão da Luz a 90° do lipossoma O espetro de fluorescência do triptofano (RFI) e dispersão da luz a 90 ° no lipossoma (RSI) foram analisados em um tampão HEPES (HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4 ou 6,0 como é indicado) empregando LUVs constituídos por lípidos indicados essencialmente tal como descritos anteriormente. Para o RFI, as LUVs foram adicionadas em alíquotas de 10 μΜ e os espetros registados após um período de estabilização 171 de 20 minutos. Para o RSI, as proteínas recombinantes foram adicionadas em alíquotas de 0,12 nmol.

Ressonância do plasmão de superfície (BIAcore)

Para a preparação de uma mistura lipídica LUVs consistindo em esfingomielina 10 mol%, fosfatidilcolina 50 mol%, colesterol 20mol% e BMP 20mol% dissolvidos em solventes orgânicos, secou-se sob uma corrente de árgon e reidratou-se em tampão Tris / HCl (pH 7,4) (Kolzer et al., 2004) . A mistura foi congelada/descongelada nove vezes em nitrogénio líquido e, em seguida, em uma incubadora a 37° C. Após o banho de ultra-sons durante 15 min a mistura foi passada 21 vezes através de uma membrana de policarbonato com um diâmetro de poro de 100 nm. As medições de ressonância do plasmão de superfície foram realizadas utilizando um sistema BIAcore 2000 a 25° C. As LUVs (concentração total de lípidos 0,1 mM) foram imobilizadas sobre a superfície de um chip do sensor LI (BIAcore) em PBS (tampão de carga). O tampão de corrida usado foi o tampão acetato de sódio (50 mM, pH 4,5) . Como um controlo, a esfingomielinase ácida (0,2 μΜ, 60 1 P em tampão de corrida) foi injetada diretamente na superfície do lipossoma.Unidades de Resposta entre 4100 RU - 5250 RU foram obtidas. A proteína de interesse foi injetada em tampão de corrida com uma taxa de fluxo de 20 pL / min nas concentrações indicadas. Após a injeção, foi anexada uma fase de dissociação de 10 min.

Modelagem molecular A análise da estrutura primária, bem como a modelagem molecular foram realizadas com software disponível a partir do Expert/1 Protein Analysis System (ExPASy) servidor de proteómica do Instituto Suíço de Bioinformática (http://expasy.org/). A modelagem molecular foi feita com base na estrutura cristalina do domínio ATPase Hsp70 humano 172 (código pdb: 1S3X) e o domínio de ligação ao substrato humano Hsc70 (código pdb: 7HSC) com DeepView-Swiss PDB Viewer. Os modelos de superfície foram baseados na interação coulomb em pH 7,0 utilizando uma constante dieléctrica do solvente de 80 (H20).

Análise estatística A análise estatística foi realizada utilizando um Teste T Student com uma bicaudal de modo a avaliar a hipótese nula. O nível de corte para a significância estatística foi estabelecido em 5% e todos os grupos de dados testados para a comparabilidade de suas variâncias usando um F-teste. Todas as estatísticas foram feitas com um mínimo de n = 3 experiências independentes.

Discussão A bibliografia forneceu evidências de que a Hsp70 pode estar presente em membranas plasmáticas de células tumorais, assim como no sistema endolisossomal. Foi, além disso, sabido que a Hsp70 pode ser libertada para a corrente sanguínea durante diferentes eventos indutores de stress, sendo o mais típico a febre e o exercício extenuante, o mais intrigante, provavelmente, sendo o stress psicológico, embora este trabalho tenha sido realizado principalmente no domínio da imunologia. A presença de espécies com Hsp70 dentro do compartimento endolisossomal também tem sido descrita para um outro membro da família Hsp70; a Hsc70 expressa constitutivamente. A função da Hsc70 neste local deu realmente o nome ao processo conhecido como autofagia mediada por chaperona.

No entanto, a partir da bibliografia nada era conhecido sobre a base molecular para a associação da Hsp70 com as 173 membranas plasmática e endolisossomal, que levam os inventores à formulação deste projeto.

Os dados apresentados no Exemplo 1 mostram que a Hsp70 é capaz de interagir com os lipidos da membrana carregados negativamente, tais como a fosfatidilserina (PS), cardiolipina e bis(monoacilglicero) fosfato (BMP) a um pH neutro. Ao mimetizar a acidez que pode ser esperada no sistema precoce endolisossomal (pH 6,0), no entanto, o perfil de interacção muda drasticamente e a afinidade da Hsp70 para o BMP torna-se 20 vezes mais elevada do que a pH neutro e quase 9-vezes maior do que para PS. Esta interação Hsp70-BMP foi verificada em um sistema BIAcore mais elaborado, em que o pH era agora definido de acordo com o esperado em endossomas e lisossomas tardios (pH 4,5), os locais principais para a maioria dos BMP celulares. Curiosamente, a conhecido proteína de interação com o BMP; esfingomielinase ácida (aSMase), que depende do BMP como um cofator, apresenta apenas metade da afinidade para o BMP em comparação com a da Hsp70, ilustrando a elevada afinidade relativa da Hsp70 para o BMP. A interação da Hsp70 com PS também foi descrita por outros, como tem uma interação entre a Hsp70 de ratinho e glicoceramidas acídicas, em que a interação dependia do domínio ATPase N-terminal e, em alguns casos, também no domínio de ligação ao péptido (PBD). No entanto, ao contrário dos sistemas aqui utilizados, estas.verificações foram feitas em sistemas que consistem basicamente apenas em um lípido (90-100% e 100% de lípido puro, está em respetivamente), não susceptíveis de se assemelhar a qualquer ambiente lipídico marginalmente complexo, que é esperado na célula eucariótica. Contudo, a importância da região N-terminal da Hsp70 para a associação de lipidos acídicos, como mostrado por Harada et ai. 174 conformidade com as verificações dos inventores, que a interação da Hsp70 com o BMP depende do seu domínio ATPase N-terminal. Os inventores ainda mostram que o triptofano 90 (W90) da Hsp70 é um aminoácido crítico como a sua mutação reduz significativamente a interação Hsp70-BMP. Um modelo hipotético argumenta que a Hsp70 contém locais de ligação específicos para as partes hidrofílica e hidrofóbica dos gi icolípidos acídicos, tanto na ATPase como no domínio de ligação ao péptido (PBD).

Embora este modelo possa ser aplicável para ligação da Hsp70 a glicolípidos ácidos, os inventores preferem sugerir um outro modelo para a interação Hsp70-BMP. Com base nos dados aqui apresentados que; I) o PBD é apenas capaz de interações mais fracas com o BMP; ii) a importância de W90, iii) as propriedades de ligação do domínio ATPase; e IV) a modelagem molecular do potencial electrostático de superfície da Hsp70, os inventores sugerem que a Hsp70 interatua com o BMP através de um sub-domínio em forma de cunha electrostaticamente e positivamente carregado, na parte inferior da fenda ATPase. Como mutação conservada de W90 para a fenilalanina reduz significativamente a interação Hsp70-BMP sem afetar o rearranjo conformacional -ou actividades da ATPase das proteínas Hsp70 e uma vez que esta mutação de um único aminoácido não altera o perfil eletrostático, é possível, no entanto, que um intermediário dos dois modelos seja mais apropriado para explicar a interação da Hsp70 com um motivo lipídico aniónica mais comum. Em tal modelo, a carga de superfície positiva poderia facilitar as interações electrostáticas e resíduos específicos, tais como W90 podem estar envolvidos na determinação da especificidade de ligação dos parceiros de ligação ao lípido aniónico - neste caso, o BMP. Curiosamente, este poderia potencialmente implicar a Hsp70 como um regulador mais geral da homeostase lipídica na 175 célula. Os dados que demonstram que as membranas lipídicas de células podem servir como os sensores primários de stress, tais como febre e o stress oxidativo e, portanto, como os indutores iniciais da resposta ao stress, reforçam a informação acima. Diante do stress, pode-se argumentar que as membranas lipídicas da célula seriam compartimentos cruciais para manter a homeostase ou mesmo modificar a fim de desencadear eventos específicos de sinalização como uma resposta ao desafio celular. A ligação da Hsp70 a lípidos tais como BMP e a estabilidade aumentada seguinte das membranas lisossómicas e talvez outros eventos de lípidos celulares poderiam, portanto, representar uma parte da resposta ao stress celular em geral. No caso de cancro uma tal resposta poderia ter sido manipulada para servir o propósito do cancro, mas também de uma ampla perspetiva evolutiva, uma resposta proteína-lípido coordenada em face do stress celular faria todo o sentido.

Os dados aqui apresentados, demonstrando que apenas a Hsp70, não a Hsc70 e a Hsp70-2, são capazes de proteger directamente membranas lisossómicas argumentam que uma resposta potencial ao stress de lípidos pode ser especificamente regulada pela própria Hsp70 principal induzida por stress e não outras espécies de Hsp70. No entanto, como é também mostrado, a depleção de Hsp70-2 também leva à permeabilização da membrana lisossomal e à morte celular, embora neste caso a via seja indireta porque depende de LEDGF. 0 mecanismo de como a LEDGF afeta as membranas lisossómicas continua por resolver, no entanto. A fim de validar a relevância in vivo da interação Hsp70-BMP, os inventores direcionam ao BMP anticorpos endocitosados e Hsp70 lisossómicos por endocitose do polipéptido ADD70 derivado do AIF, de outro modo impermeável às células. Isto verificou que a interação 176 entre as proteínas Hsp70 e BMP serve para estabilizar as membranas lisossómicas à medida que as células ficam subsequentemente e significativamente sensibilizadas para os efeitos diretos dos estímulos disruptivos da membrana lisossomal, bem como o agente quimioterapêutico indutor da LMP, a cisplatina, cujo perfil de morte celular programada foi caracterizado como parte deste projeto. A expressão do ADD70 foi formalmente apresentada para sensibilizar células cancerosas a uma variedade de estímulos de morte e diminuir a tumorigenicidade do carcinoma do cólon em rato e células de melanoma de rato em animais singénicos. A principal diferença entre esta abordagem e a abordagem aqui apresentada é que os presentes inventores procuraram especificamente atingir a Hsp70 lisossomal através de endocitose do ADD70, enquanto que os estudos anteriores utilizaram a expressão citosólica do ADD70 para atingir a Hsp70 citoplasmática mais abundante. 0 sucesso no alvejamento da interação Hsp70-BMP endolisossomal também forneceu uma certa prova de conceito da ideia de alvejamento dos componentes lisossómicos através da endocitose para meios terapêuticos, um conceito que poderia ter grandes implicações terapêuticas, como se poderia imaginar, por exemplo, sensibilizando células cancerosas a agentes que induzem as vias de morte celular lisossómicas através da inibição especifica da função de estabilização do lisossoma da Hsp70. Vice-versa, a interação entre Hsp70 e BMP pode fornecer novas estratégias de tratamento que dependem da citoproteção oferecida pela função lisossoma-estabilizadora da Hsp70 exogenamente administrada para combater ataques tão diversos como a motor, pancreatite e lesões nervosas sensoriais e danos na retina induzidos pela luz. Com efeito, o conceito de utilizar a maquinaria endocítica para a introdução de compostos citotóxicos específicos já foi explorado, como a entrega endocítica de uma hélice BH3-hidrocarboneto grampeada com base no domínio 177 de interação do BH3 pró-apoptótico do agonista da morte, Bid, foi mostrado como induzindo a apoptose em células de leucemia. Este processo dependia da hélice BH3 sair do compartimento endocitico intacta e activar o Bax e o Bak, a fim de induzir a libertação do citocromo C e ativar um programa mitocondrial de apoptose. No entanto, o mecanismo de escape do sistema endocitico infelizmente, não foi abordado neste artigo.

Como mostrado aqui, a interação entre as proteínas Hsp70 e BMP depende do domínio ATPase da Hsp70. Curiosamente, relatórios recentes da co-chaperona da Hsp70, a proteína de ligação 1 à Hsp70 (HspBPl), podem enfatizar a importância desta área de carga positiva da Hsp70. Um estudo da estrutura cristalina da HspBPl complexada com uma parte do domínio ATPase da Hsp70 revelou que a interação entre estes dois era mediada por uma curva, toda dobrada a-helicoidal em HspBPl contendo quatro repetições semelhantes a armadillo. A face côncava desta dobra curvada abraça o lóbulo II do domínio ATPase, o mesmo lóbulo que constitui a parte principal do volume carregado eletroestaticamente e positivamente do domínio ATPase das Hsp70s, que os inventores afirmam mediar a interação entre a Hsp70 e um BMP. Uma outra perspetiva sobre isso é fornecida por um outro estudo, no qual 14 linhas celulares de cancro foram caracterizadas quanto aos seus níveis relativos de Hsp70/HspBPl. Este outro estudo verificou que as linhas celulares, com uma razão molar HspBPl/Hsp70 elevada são mais susceptíveis a fármacos anti-cancro do que aqueles com razão baixa e que a sobre-expressão da HspBPl promovia a permeabilização da membrana lisossomal. Com base nestes relatórios e os dados apresentados neste Exemplo, pode -se argumentar a favor de um modelo no qual a HspBPl por ligação à área de carga positiva do domínio ATPase da

Hsp70, perturba a sua interação com o BMP e 178 consequentemente o seu efeito estabilizador sobre membranas endo-lisossómicas, resultando em um aumento da sensibilidade aos estímulos induzidos pela LMP. Como tal, o domínio de repetições armadillo da HspBPl poderia potencialmente formar a base de uma conceção de medicamentos inteligentes, tanto quanto é o caso para o ADD70. A eficácia de tais moléculas derivadas de HspBPl seria fácil para testar nos sistemas descritos aqui e apresenta um caminho interessante para aplicações adicionais do mecanismo molecular aqui descrito.

Tal como mostram os inventores aqui, a Hsp70 liga-se com elevada afinidade ao BMP a um pH ácido de 4,5, mesmo quase duas vezes superior ao que é o caso do BMP "clássico" parceiro de ligação da esfingomielinase ácida (aSMase). Curiosamente, o BMP serve como um cofator estimulatório para a hidrólise enzimática não só da esfingomielina através da aSMase, mas da maioria dos esfingolípidos ligados à membrana pois também funciona como um co-fator para as proteínas ativadoras de esfingolípidos (SAPs / saposinas) A-D. Uma questão óbvia seria assim, se a Hsp70 pela sua ligação ao BMP de alguma forma alteraria as propriedades de ligação da aSMase e das saposinas, por este meio modificando o catabolismo dos esfingolípidos da membrana e dos glicoesfingolípidos e a geração de moléculas efetoras a jusante, tais como a ceramida e os seus metabolitos, ceramide-l-fosfato, esfingosina e esfingosina-1-fosfato, todos os quais têm sido implicados em ambas sobrevivência celular e morte. Com efeito, os inventores descobriram que a Hsp70 é capaz de modular a ligação da aSMase aos lipossomas contendo BMP a pH 4,5, dependendo da concentração da Hsp70. Como pode ser visto, as baixas concentrações (3-150 nM) da Hsp70 facilitam a interação da aSMase com os lipossomas BMP-Hsp70, enquanto que concentrações mais elevadas da Hsp70 (300-1500 nM) têm o 179 efeito oposto. Embora a nossa concentração de trabalho no meio quando a Hsp70 é adicionada para endocitose seja de 300 nM, seria difícil estimar uma dada concentração intralisossomal nesta base e quaisquer conclusões sobre o efeito que pode ter a Hsp70 na atividade da aSMase in vivo permaneceriam especulativas. No entanto, a coloração da Hsp70-transgénica (Hsp70-TG) e das iMEFs do tipo selvagem (WT) com um anticorpo monoclonal contra a ceramida revelou que os ratinhos transgénicos Hsp70 apresentam uma clara sobreregulação da ceramida, que está presente em um padrão característico de grânulos-em-rosário na periferia das células, bem como perto do núcleo. Uma análise mais aprofundada do perfil de ceramida dos iMEFs via extração de lípidos e espectroscopia de massa posterior lipídica confirmou estes resultados, tal como os níveis cumulativos de ceramida foram aumentando desde uma média de 10,2 ng ceramida / mg de proteína para o IMEF-WT a 14,9 ng / mg para os iMEFs da Hsp70 transgénica. Os inventores fundamentaram adicionalmente que este efeito pode ser atribuído à ação da Hsp70, como os inventores também definiram o perfil das nossas células U-2-OS carregadas com rHsp70 (isto é, 300 nM de rHsp70 em meios completos durante 24h, análogos a todas as outras experiências de Hsp70-endocitose aqui apresentadas). A quantificação da ceramida em células U-2-OS carregadas com Hsp70 mostraram um aumento nos níveis cumulativos de ceramida a partir de 2,99 ng de ceramida/mg de proteína para as células de controlo para 5,10 ng/mg das células carregadas com Hsp70 (a experiência só foi feito uma vez no momento da redação) . No entanto, tomados em conjunto todos eles suportam um papel para Hsp70 na modulação dos níveis de ceramida em células, embora seja necessária uma validação adicional do curso. No entanto, se estes dados podem ser verificados, uma série de perguntas apresentam-se, tal como a compartimentalização da espécie de ceramida, a quantificação da espécie de ceramida 180 específica (da qual existe pelo menos 50 espécies moleculares distintas), perfil dos níveis de ceramida quando perante várias tensões, estado de transformação das células, etc.

Curiosamente, um estudo anterior abordou uma destas perguntas, que mostram que o choque térmico (42,5° C durante 2 h) faz com que a acumulação de ceramida em linfócitos leucémicos MOLT-4 agudos . Esta acumulação pode ser bloqueada pelos inibidores farmacológicos fumonisina Bl e miriocina, o último dos quais é considerado como um inibidor especifico da via de sintese de novo da ceramida em que bloqueia a ação de serina palmitoiltransferase, a enzima que inicia a sintese de novo de esfingolipidos novos a partir da serina e palmitoil-CoA. Um mecanismo parcial para este aumento na sintese de novo da ceramida foi descrito para levedura, em que o stress térmico induz um influxo agudo da serina no RE que conduz à sintese de novo. Será interessante testar se o aumento dos níveis de ceramida observado sobre a endocitose da rHsp70 pode ser modulada por estes inibidores farmacológicos ou se os aumentos observados derivam das vias catabólicas da degradação dos esfingolipidos e a estimulação desses lpor ligação da Hsp70 ao BMP. Claro que um composto modelo pode também ser formulado como hipótese. Neste modelo, um stress térmico inicial poderia conduzir à fluidização da membrana, influxo de serina e iniciação rápida da síntese de esfingolipidos de novo. Subsequentemente, a indução da Hsp70, como uma consequência do stress térmico, levaria ao aumento dos níveis da Hsp70 na célula, interação da Hsp70 com o BMP, aumento da atividade da aSMase e, possivelmente, também a atividade SAP - resultando na geração de ceramida pelas vias catabólicas. Esta resposta secundária poderia complementar a indução inicial de novo ou talvez assumir em seu lugar a resposta contínua de novo baseando-se em um 181 fornecimento contínuo de serina e palmitioyl-CoA. Não obstante, continua por ser testado se a proteção celular é uma consequência do aumento na própria ceramida ou talvez deva ser contabilizada para níveis alterados dos seus metabolitos a montante e a jusante.

Neste ponto, algumas questões importantes ainda precisam ser respondidas - Como é que a Hsp7 0 termina no meio extracelular e no interior do compartimento endolisossomal? É a Hsp70 secretada e, em seguida, retomada por endocitose? Ou está presente dentro dos lisossomas ou nos lisossomas secretores mais especializados, esperando por um sinal de libertação na forma de stress? E, talvez, mais importante -qual é o significado biológico da presença da Hsp70 no ambiente extracelular?

Embora o trabalho apresentado neste trabalho não seja capaz de responder a estas questões complexas, algumas deduções pode, contudo, ser feitas. Primeiro, a Hsp70 pode ser endocitosada em todas as linhagens celulares testadas neste projeto, argumentando a favor de uma via comum de reconhecer a Hsp70 extracelular (eHsp70). Isto está de acordo com dados que mostram que a eHsp70 pode vincular um número de recetores nas sub-populações de leucócitos diferentes. Os recetores envolvidos no reconhecimento extracelular da Hsp70 (eHsp70) incluem principalmente os recetores de reconhecimento de padrões (PRRS) e consistem em uma variedade de recetores de diferentes famílias de recetores tais como os recetores tipo portagem (TLR) , recetores de captação e lectinas do tipo c. Como o trabalho neste projeto não foi endereçado pelo qual o mecanismo inicial Hsp70 é endocitosado (mediado pelo recetor, jangada-dependente, clatrina-dependente etc), não pode ser referido se os PRRs são responsáveis pela endocitose da eHsp70 observada nos nossos sistemas. No entanto, um 182 excesso de 10 vezes da Hsp70 não marcada não poderia competir com a captação de Hsp70 marcada com AF488 em nenhuma das células U-2-OS não iMEFs - ao contrário, a endocitose foi significativamente reforçada na presença de excesso de Hsp70 não marcada, que, em certa medida argumenta contra um mecanismo saturável de absorção. O foco do campo imunológico tem sido principalmente sobre a resposta de citocinas e ativação da defesa imune inata elicitada por ligação da eHsp70 às PRRs e, portanto, não tem sido dada muita atenção ao efeito da eHsp70 após ligação ao recetor e iniciação de sinalização.

Os mecanismos de libertação da Hsp70 para o meio extracelular e os efeitos da Hsp70 têm sido aqui endereçados em extensão considerável, embora ainda falte uma visão molecular satisfatória nesses mecanismos interessantes. Não obstante, existe muita evidência para a presença da Hsp70 no sistema circulatório, após o stress e os dados acumulados suportam um papel para a eHsp70, quer seja induzida por stress ou exogenamente entregue, em neuroproteção, bem como no âmbito do sistema de defesa imunitária primária. No que diz respeito à libertação da Hsp70, a primeira evidência para a transferência da Hsp70 de uma célula para outra veio de estudos no axónio gigante de lula, e durante a reprodução destes resultados em células cultivadas de embrião de rato, foram apresentadas evidências de que uma via não-clássica de exocitose poderia ser responsável pela libertação da Hsp70.

Foi sugerido que a Hsp70, juntamente com outras proteínas de choque térmico são apenas libertadas em circunstâncias patológicas, resultando na morte necrótica e não durante a morte celular programada. Estudos recentes no entanto, têm demonstrado que a Hsp7 0 pode ser libertada a partir de 183 células intactas por mecanismos ativos e que o grau de estimulo determina o modo de libertação. É importante ressaltar que não há estudos conhecidos a descrever uma correlação direta entre a eHsp70 e marcadores de danos musculares embora grandes aumentos da eHsp70 possam ser detetados na corrente sanguínea periférica aquando do exercício físico. De um modo mais convincente e talvez também mais intrigante, são as descobertas que demonstram que o stress psicológico, tal como o medo predatório e o choque elétrico pode provocar uma libertação de eHsp70 induzida por stress, um processo que foi sugerido como sendo dependente da sinalização por catecolamina. Isto é particularmente interessante pois as catecolaminas através do recetor de αΐ-adrenérgico podem levar a fluxos de cálcio intracelulares e os fluxos de cálcio podem causar exocitose de exossomas, corpos multivesiculares e lisossomas. Como tal, durante períodos de stress, o aumento da noradrenalina atuando sobre recetores αΐ-adrenérgicos poderia resultar em um fluxo de cálcio dentro da célula com a libertação subsequente da Hsp70 dentro dos exossomas. A evidência para esta hipótese vem de demonstrações que a eHsp70 pode ser liberada em vesículas caracterizadas como exossomas, mas também têm sido apresentadas evidências de que a eHsp70 pode ser libertada como eHsp70 livre, tanto em sistemas celulares, bem como in vivo. Tem também sido sugerido que jangadas lipídicas são necessárias para a libertação de eHsp70 embora esta também tem sido discutida. Além disso, tem foi demonstrado que um compartimento lisossomal funcional é necessário para a libertação de eHsp70 e que esta libertação é acompanhada pela presença de proteínas marcadoras lisossómicas na superfície das células, sugerindo uma secreção dependente da fusão das membranas plasmática e lisossomal. 184

Independentemente da Hsp70 libertado estar presente em exossomas ou como eHsp70 livre, é interessante notar que alguns tipos de MVB /endossomal tardio/compartimento lisossomal secretórios estão aparentemente envolvidos em todos os modos de libertação. Com base nestes dados e nos resultados obtidos neste documento, uma hipótese mais complexa para como a Hsp70 escapa do citosol para o ambiente extracelular pode ser formulada. A libertação da Hsp70 ainda dependeria de aumentos no cálcio intracelular, pois estes serviriam como o sinal para exocitose de endolisossomas. A presença da Hsp70 dentro desse compartimento seria, no entanto, dependente da interação da Hsp70 e BMP como aqui descrito, poia a Hsp70 seria eficazmente agregada em membranas internas contendo BMP nos endossomas tardios/ MVBs / lisossomas. A Hsp70 poderia chegar aos endossomas tardios e lisossomas por absorção extracelular, tal como endocitose como também aqui descrito, ou através de invaginações das membranas do perímetro de endossomas precoces e tardios, bem como dos lisossomas, o que iria trazer Hsp70 e BMP intracelulares na proximidade. A acidez do compartimento iria manter uma forte preferência por Hsp70s localizadas em membranas contendo BMP. Aquando da exocitose, algumas Hsp70 ainda se encontram ligadas a exossomas contendo BMP, mas o pH neutro encontrado no ambiente extracelular iria agora favorecer um equilíbrio BMP-Hsp70 significativamente desviado no sentido da Hsp70 mais desacoplada, resultando em ambas as formas de Hsp70, livre e acoplada ao exossoma, as quais poderiam então exercer as suas funções extracelulares.

Em resumo, os dados aqui apresentados mostram que a Hsp7 0 interatua, diretamente e de um modo dependente do pH, com o fosfolípido aniónico endolisossomal BMP. Os inventores demonstraram que a ligação da Hsp7 0 ao BMP é mediada via Hsp70s, pelo domínio ATPase, envolvendo o triptofano 90 e 185 que esta interação resulta na estabilização das membranas endolisossomais, possivelmente por influenciar a atividade de outras proteinas de ligação ao BMP. Os inventores também mostram que a elucidação deste mecanismo molecular abre novas possibilidades para a sensibilização das células de cancro a agentes que induzem vias de morte celular lisossomal através da inibição especifica da função estabilizadora do lisossoma da Hsp70. Vice-versa, a interação entre Hsp70 e BMP pode fornecer novas estratégias de tratamento com base na citoproteção oferecida pela função estabilizadora do lisossoma da Hsp70 exogenamente administrada.

Exemplo 2: Interação entre a Hsp70 e o Bis (monoacilglicero)fosfato Ativa a Esfingomielinase Ácida, Estabiliza as Membranas Lisossómicas e Promove a Sobrevivência Celular A proteina de choque térmico 70 (Hsp70) é uma chaperona molecular altamente conservada em termos evolutivos, que promove a sobrevivência de células submetidas a stress por inibição da permeabilização da membrana lisossomal, um marco da morte celular induzida por stress. As pistas para o seu mecanismo molecular de ação pode assentar no stress recentemente descrito e na translocação associada ao cancro de uma pequena porção da Hsp70 para o compartimento lisossomal. Aqui, nós mostramos que a Hsp70 estabiliza os lisossomas, melhorando a atividade da esfingomielinase ácida (ASM), uma lipase lisossomal que hidrolisa a esfingomielina a ceramida e fosforilcolina. Em ambiente acidico, a Hsp70 liga-se com elevada afinidade e especificidade a um fosfolipido endo-lisossomal aniónico o bis(monoacilglicero)fosfato (BMP), um cofactor essencial para a ASM, facilitando assim a ligação da ASM ao BMP e estimulando a atividade da ASM. A inibição da interação 186

Hsp7 0 - BMP por anticorpos BMP ou uma mutação pontual (W90A) em Hsp70, bem como a inibição da atividade ASM por desipramina eficazmente reverte a estabilização mediada pela Hsp70 dos lisossomas. Notavelmente, a atividade reduzida da ASM em células de pacientes com doença de Niemann-Pick A (NPDA), um distúrbio grave do armazenamento lisossomal causado por mutações no gene ASM, também está associada a uma diminuição dramática na estabilidade lisossomal e este fenótipo pode ser eficazmente corrigido, restaurando a atividade lisossomal da ASM por tratamento com Hsp70 ou ASM recombinantes. Quando tomados em conjunto, estes dados abrem possibilidades interessantes para o tratamento dos distúrbios do armazenamento lisossomal e do cancro com compostos não permeáveis nas células que entram no lúmen lisossomal através da via endocitica de entrega. As proteases lisossomais, as catepsinas, são importantes efetores em programas de morte celular evolutivamente conservada induzidos por uma grande variedade de tensões. A morte celular dependente da catepsina é caracterizada por uma permeabilização precoce da membrana lisossomal e translocação subsequente das catepsinas para o citosol, onde podem iniciar vias de morte celular dependentes e independentes da caspase. A fim de testar se a localização lisossomal é crucial para a capacidade descrita da Hsp70 para estabilizar as membranas lisossómicas e proteger as células contra o stress induzido pela morte celular, foi aproveitada a maquinaria endocitica das células para alvejar Hsp70 recombinantes (rHsp70) nos lisossomas. A análise imunocitoquímica e bioquímica das células osteocarcoma U-2-0S incubadas com rHsp70 marcada com fluorocromo revelou uma absorção eficaz de rHsp70, a sua co-localização específica com marcadores endossomais e lisossomais tardios e a ligação a membranas lisossomais (Fig. 5a, b e Fig. 9) . Usando imageamento em tempo real para monitorizar a integridade da membrana lisossomal (Fig. 187 5c), foi demonstrado que a rHsp70 endocitosada protegia os lisossomas contra a foto-oxidação (Fig. 5d). Além disso, um ARN interferente pequeno (siRNA) especifico para a Hsp70 sensibilizou os lisossomas à foto-oxidação e este efeito foi integralmente revertido pela rHsp70 endocitosada, apropriadamente demonstrando que o efeito protetor da Hsp70 endógena é mediado pela pequena fração da proteína no lúmen lisossomal (Fig. 5e). Apesar de absorção semelhante (dados não apresentados), não foi observada estabilização lisossomal com a Hsc70 e Hsp70-2 recombinantes, que partilham 86% e 84% da homologia de sequência de aminoácidos com a Hsp70, respetivamente (Fig. 5d). A presença da Hsp70 nas membranas lisossómicas e sua capacidade de sobreviver no ambiente hidrolitico lisossomal sugere que se liga aos lípidos da membrana lisossomal. Assim, foi investigada a interação da Hsp70 com grandes vesículas unilamelares (LUV) de palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), contendo vários lípidos aniónicos associados à membrana, i.e., palmitoil-oleoil-fosfatidilserina (POP; principalmente na membrana plasmática) , cardiolipina (principalmente mitocondrial) e BMP (principalmente nos endossomas/lisossomas tardios). Tendo em conta o meio cada vez mais ácido do compartimento endolisossomal aquando da maturação dos lisossomas, foram comparadas as interações proteína-lípido em condições neutras (pH 7,4) e ácidas (pH 6,0) (Fig. 6a). A pH 7,4, rHsp70 causou uma pequena mudança relativa na dispersão de luz a 90° em lipossomas POPC indicando uma ligação muito fraca. Conforme descrito anteriormente para POPS, todos os líp idos carregados negativamente reforçaram a ligação da rHsp70 aos lipossomas a pH neutro, aproximadamente 4 vezes, independentemente da densidade de carga na superfície do lipossoma (variando desde -1 a -2) (Fig. 6a). Notavelmente, a ligação ao BMP foi quase 20 vezes mais forte no pH ácido, em comparação com o pH neutro, enquanto que a ligação ao POP foi apenas ligeiramente aumentada após a acidificação (Fig. 6a) . A ligação de alta afinidade da Hsp70 ao BMP em pH ácido foi confirmada em um conjunto independente de ensaios BIAcore (Fig. 6e e 7) . De um modo importante, os anticorpos do BMP libertados no compartimento endolisossomal por endocitose inibiu eficazmente a capacidade da rHsp70 para estabilizar os lisossomas em células vivas (Fig. 6b), e sensibilizou as células à cisplatina (Fig. 6c), um fármaco anti-cancro que induz o vazamento lisossomal. A fim de investigar qual a parte da proteína Hsp7 0 que é responsável pela ligação ao BMP, foi medido o desvio da fluorescência dos triptofanos aquando da ancoragem da rHsp70 e seus mutantes em lipossomas contendo BMP. A perda do sinal em termos do pico de intensidade da fluorescência relativa para o mutante da Hsp70 carecendo dos aminoácidos 119-426 no dominio ATPase amino-terminal (rHsp70-AATP), mas não para os que carecem dos aminoácidos 437-617 no dominio de ligação ao péptido carboxi-terminal (rHsp70-APBD), indicou que o dominio ATPase foi necessário para a ligação de alta afinidade da Hsp70 ao BMP (Fig. 6d) . Em seguida, substituímos os dois triptofanos em Hsp70 com fenilalaninas (W90F e W580F) e estudámos que o triptofano é responsável pelo desvio da fluorescência induzido por ligação aos lipidos. A redução do sinal apenas com rHsp70-W90F indicara que o NH 2-terminal da proteína ancorou na camada lipídica (Fig. 6d) . Uma análise BIAcore mais quantitativa da interação rHsp70-BMP confirmou que a Hsp70 interagiu com o BMP principalmente através do seu domínio ATPase (Fig. 6e). Surpreendentemente, a mutação W90F especificamente aboliu a interação entre a rHsp70 e o BMP mantendo simultaneamente a os aspetos estrutural (arranjo conformacional, tal como analisado por dicrolsmo circular UV distai e próximo) e 189 funcional (arranjo conformacional da luciferace e hidrólise do ATP) da chaperona Hsp7 0 (Fig. 6e e dados não apresentados). Assim, o mutante rHsp70-W90F forneceu-nos uma valiosa ferramenta para testar ainda mais se a interação direta entre a Hsp70 e o BMP dota a Hsp70 com os seus atributos de proteção lisossomal. De facto, o mutante rHsp70-W90F tinha perdido completamente a sua capacidade de proteger as membranas lisossomais contra a foto-oxidação e as células contra a morte celular lisossomal induzida por cisplatina, enquanto que o mutante rHsp70-W580F apresentou o mesmo efeito de proteção tal como a proteína de tipo selvagem (Fig. 6f e g). De um modo importante, as proteínas Hsp70 mutantes foram endocitosadas essencialmente de forma tão eficaz como o tipo selvagem da Hsp70 (dados não apresentados). Assim, podemos concluir que a ligação da Hsp70 ao BMP é essencial para o efeito estabilizante do lisossoma pela Hsp70.

Como a concentração do BMP aumenta em vesículas endocíticas à medida que os endossomas amadurecem para formar lisossomas, a regulação do pH pode ser o caminho pelo qual a Hsp70 é direcionada aos lisossomas. Os cálculos (PROTPARAM, EXPaSy, servidor de proteómica, Instituto Suíço de Bioinformática) revelaram que o domínio ATPase da Hsp70 tem 1,72 unidades de maior pl teórico do que o domínio de ligação ao péptido (6,62 vs 4,9). Esta característica sugere que a pH ácido, o domínio ATPase é preferencialmente carregado positivamente, o que poderia facilitar sua interação com lípidos aniónicos. Os nossos dados demonstram a dependência da interação Hsp70-BMP em pH ácido e o domínio ATPase suporta esta teoria. Além disso, a modelagem molecular da superfície electrostática do domínio ATPase da Hsp70 revelou que ela forma uma estrutura quase em forma de cunha com uma carga predominantemente positiva na parte inferior da cunha contendo W90, possivelmente explicando o 190 profundo impacto da mutação W90F sobre a capacidade da Hsp70 para interagir com o BMP e estabilizar lisossomas (Fig. 6h). A BMP liga-se à ASM com elevada afinidade e estimula a sua capacidade para hidrolisar a esfingomielina a ceramida e fosforilcolina. A análise BIAcore revelou que o pré-tratamento dos LUVs contendo BMP com rHsp70 em concentrações sub-equimolares facilitou a subsequente ligação do ASM, enquanto que concentrações mais elevadas de rHsp70 apresentaram um efeito inibitório (Fig. 7a e 10). Surpreendentemente, os fibroblastos embrionários murinicos com Hsp70 transgénicos (Hsp70-MEFs), os quais estão protegidos contra os danos lisossomais induzidos por stress (Fig. 7e) , apresentaram uma atividade significativamente maior de ASM do que o tipo selvagem de MEFs (WT-MEFs) e no tratamento de WT-MEFs com rHsp70 a uma concentração citoprotetora (300 nM) aumentou a atividade ASM a um nivel comparável ao de Hsp70-MEFs (Fig. 7b) . A fim de testar se ASM é responsável pelo efeito estabilizador do lisossoma foram tratadas as células com desipramina, um inibidor ASM farmacológico bem caracterizado. A desipramina reduziu a viabilidade dos MEFs de uma forma dependente da dose e a morte celular foi associada a uma permeabilização massiva de lisossomas, tal como demonstrado pela fuga de catepsinas lisossomais para o citosol (Fig. 7c e d) . Notavelmente, a morte celular induzida por desipramina e o vazamento lisossomal foram significativamente reduzidos em Hsp70-MEFs, em comparação com WT-MEFs. Além disso, a inibição da ASM com uma concentração sub-tóxica de desipramina reverteu a resistência ao stress lisossomal dos Hsp70-MEFs ao nivel dos WT-MEFs como evidenciado pela perda acelerada da integridade da membrana lisossomal aquando da foto-oxidação (Fig. 7e). O papel protetor do lisossoma em ASM foi adicionalmente suportado por dados apresentando que os 191 lisossomas em fibroblastos de pacientes com NPDA, um distúrbio do armazenamento lisossomal fatal causado por mutações no gene ASM, exibindo sensibilidade extrema aos danos induzidos por foto-oxidação (Fig. 8a). Surpreendentemente, a rHsp70 também foi capaz de aumentar a atividade enzimática da ASM endógena mutada, bem como da rASM simultaneamente carregada nas células do paciente (Fig. 8b) . 0 aumento da atividade ASM obtido por carregamento dos lisossomas com rHsp70, rASM ou a combinação dos dois correlacionou-se com a sua capacidade de estabilizar os lisossomas e para normalizar o volume do compartimento lisossomal dramaticamente alargado em células NPDA (Fig. 8b-d) . Deve notar-se que, de um modo semelhante a rHsp70, também a rASM é localizada para os lisossomas (Fig. 8b).

Tomados em conjunto os nossos dados indicam que a interação Hsp70-BMP estabiliza lisossomas através de um mecanismo envolvendo a regulação do metabolismo da esfingomielina, em vez da estabilização física direta da membrana. Tal efeito indirecto é suportado pelo facto de que o BMP está localizado exclusivamente nas membranas internas do compartimento endo-lisossomal, onde a sua função principal é apoiar a desintegração e a extração de lipidos a partir de vesículas lipídicas por ASM e proteínas ativadoras dos esfingolípidos. Curiosamente, o aumento mediado pela ASM na concentração de ceramida lisossomal modifica a conformação estéreo das membranas lisossómicas e facilita assim a sua fusão com outras vesículas intracelulares e da membrana plasmática. Assim, as alterações na composição da membrana lisossomal e volume como um resultado do aumento da capacidade de fusão induzido pela ceramida podem contribuir para o aumento da estabilidade lisossomal mediado pela Hsp70. Por outro lado, vários estímulos apoptóticos induzem a translocação de ASM para o folheto externo da membrana 192 plasmática, onde a ceramida pode formar microdominios lipídicos que funcionam como locais para a ativação de moléculas de sinalização associadas à membrana, envolvidas na sinalização apoptótica. Assim, a ceramida pode ter efeitos opostos na sobrevivência das células, dependendo se é produzida no interior do lisossoma ou na membrana plasmática. 0 mecanismo molecular acima descrito subjacente ao efeito citoprotetor da Hsp70 abre novas possibilidades para a sensibilização das células cancerosas aos agentes que induzem as vias de morte celular lisossomal através da inibição especifica da função estabilizadora do lisossoma da Hsp70. Vice-versa, a capacidade da Hsp70 administrada exogenamente isolada ou em combinação com rASM pode ser diretamente desafiada como um novo tratamento para pacientes NPD, cujas opções terapêuticas estão atualmente limitadas a terapias genéticas e de células estaminais.

Resumo dos Métodos

Os WT-e Hsp70-MEFs foram gerados, imortalizados e mantidos tal como descrito na arte.Os fibroblastos da NPDA humana (83/24) provêm de uma biópsia da pele de um paciente de 5 meses com hepatoesplenomegalia. As proteínas recombinantes , 2 foram geradas utilizando o sistema de vetor pET-16b e a Ni +-afinidade de purificação-(Novagen), e marcadas com Alexa Fluor 488 de acordo com o protocolo dos fabricantes (Molecular Probes). Para analisar a integridade lisossomal, desenvolvemos um verdadeiro método de imageamento do tempo de células coradas com laranja de acridina, uma base fraca metacromática que se acumula no compartimento ácido células corando-as com vermelho e sensibilizando-as para a foto-oxidação. A perda induzida por foto-oxidação do gradiente de pH lisossomal e o vazamento de laranja de acridina para o citosol a partir de lisossomas individuais foi quantificada visualmente como "perda de pontos vermelhos" em células U2-0-S e como uma diminuição da fluorescência 193 vermelha e um aumento na fluorescência verde por Software Zeiss LSM DUO em fibroblastos. As atividades totais e citoplasmática (digitonina extraído) da catepsina foram medidas em amostras tratadas com digitonina usando a sonda zFR-AFC (Produtos do Sistema Enzimático), tal como descrito na arte. Os espectros de fluorescência do triptofano e a dispersão de luz a 90° no lipossomoa foram analisados em tampão HEPES (HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH como indicado) essencialmente como descrito na arte. Medições de ressonância de superfície do plasmão foram realizadas com LUVs imobilizadas utilizando um sistema BIAcore 2000 como descrito na arte. 0 siRNA da Hsp70 (5'— GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3') e um controlo do siRNA da Hsp70 foram transfetados com Oligofectamina (Invitrogen). A imunodeteção foi realizada com protocolos padrão. A morte celular semelhante a apoptose e a permeabilização da membrana lisossomal foram analisadas essencialmente como descrito na arte. A atividade ASM foi analisada pelo Kit de

Ensaio da Esfingomielinase Vermelho Amplex (A12220) a partir de Sondas Moleculares com modificações descritas na arte. A análise estatística foi realizada utilizando um

Teste T Student bicaudal emparelhado e todos os grupos de dados foram testados para a comparabilidade das suas variâncias usando um F-teste. Métodos

Cultura de Células e reagentes. Células de osteossarcoma humano U-2-0S foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com soro de vitelo 6% inativado pelo calor e penicilina-estreptomicina. A Hsp70 transgénica e os MEFs de controlo apropriado foram gerados e mantidos como descrito na arte. Os fibroblastos humanos primários NPDA foram cultivados em meio MEF adicionalmente suplementado com Na-piruvato 1%, HEPES 1%, L-Glutamina 1%. 194

Todas as células foram crescidas a 37° C em uma atmosfera de ar humidificado com CO2 5% e repetidamente testado e considerado negativo para micoplasma. Salvo indicação em contrário mencionada, todos os produtos químicos foram adquiridos à Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Dinamarca A / S).

Ensaios para a integridade lisossomal. As células sub-confluentes incubadas com 2 yg/mL de laranja de acridina durante 15 min a 37° C foram lavadas, irradiadas e analisadas em solução salina equilibrada de Hanks, complementada com soro de vitela fetal a 3%. As células para imagiologia de células únicas foram selecionadas a partir de 8 áreas pré-definidas de cada poço em modo de luz transmitida após o que as mesmas células foram imediatamente visualizadas e expostas à luz azul do arco de mercúrio queimador USH102 100W (Ushio electric) instalado num encaixe U-ULS100HG (Olympus) durante 20 seg. A microscopia de fluorescência foi realizada em um microscópio invertido Olympus IX-70 com uma objetiva LCPlanFl x20 com NA = 0,40. A perda do gradiente de pH lisossomal foi quantificada por contagem da perda de coloração vermelho intenso Um método mais elaborado para ensaiar a integridade lisossomal foi desenvolvido para manipular o maior compartimento lisossomal dos vários fibroblastos utilizados neste estudo. Células para o imageamento de células únicas foram selecionadas a partir de 8 áreas pré-definidas de cada poço em modo luz transmitida, após o que as mesmas células foram imediatamente e continuamente expostas à luz a 489 nm de um laser de diodo 100 mW, enquanto as micrografias de varrimento por laser foram capturadas a cada 330 ms em um sistema confocal Zeiss LSM LIVE DUO em dois canais definidos por filtros de banda para 495-555 nm (Verde) e LP650 nm de luz (vermelho) . Os filmes resultantes dos 195 desvios foram subsequentemente analisados pelo software integrado Zeiss LSM DUO. As atividades total e citoplasmática (digitonina extraído) da catepsina foram medidas em amostras tratadas com digitonina, utilizando sonda zFR-AFC (Produtos do sistema enzimático), tal como descrito na arte.

Ensaios para a viabilidade celular. A densidade celular foi avaliada através do ensaio de redução do brometo de 3 -(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrasodico (MTT, Sigma-Aldrich) essencialmente como descrito na arte. A morte celular semelhante a apoptose foi avaliada por coloração das células com 0,05 pg/mL de Hoechst 33342 (Molecular Probes) e contagem de células com núcleos condensados em um Microscópio invertido Olympus IX-70 fluorescente (Filtro de U-Mwu 330-385 nm). Para cada ensaio um mínimo de oito áreas escolhidas aleatoriamente foram contadas.

Imunodeteção e microscopia. Os anticorpos primários utilizados incluíram anticorpos de ratinho monoclonais contra Hsp70 (2H9, gentilmente cedidos por Boris Margulis, Academia Russa de Ciências, São Petersburgo, Rússia), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; Biogenesis), BMP (6C4), proteína-1 integral de membrana lisossomal (H5C6; desenvolvido por J. Thomas August e James E.K. Hildreth e obtido a partir do Banco de Estudos de Desenvolvimento do Hibridoma, desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Cidade de Iowa, EUA). As proteínas separadas por SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose foram detectadas usando anticorpos primários indicados, anticorpos secundários adequados conjugados com peroxidase, de Dako, reagentes ECL Western 196 blotting (Amersham), e Leitor de Imagem Luminescente (LAS-lOOOPlus, Fujifilm). Para imunocitoquímica foram utilizados anticorpos Alexa Fluor®-576 - ou Alexa Fluor®-488 secundários conjugados. 0 LysoTracker Red ® foi utilizado para a visualização ao vivo do compartimento lisossomal. As imagens de fluorescência foram realizadas utilizando um microscópio de varrimento laser Zeiss Axiovert 100M. A quantificação LysoTracker e os filmes dos desvios para a integridade lisossomal foram feitos em um sistema Zeiss LSM LIVE DUO. O espetro de fluorescência do triptofano e a dispersão de luz a 90° no lipossoma. Os espetros de fluorescência do triptofano (RFI) e a dispersão de luz a 90 ° no lipossoma (RSI) foram analisados num tampão HEPES (HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4 ou 6,0 como é indicado) empregando LUVs constituídos pelos lípidos indicados essencialmente como descrito na arte. Para a RFI, as LUVs foram adicionadas em alíquotas de 10 μΜ e espetros registados após um período de estabilização de 20 min. Para o RSI, proteínas recombinantes foram adicionadas em alíquotas de 0,12 nmol.

Ressonância do Plasmão de Superfície (BIAcore). Para a preparação de LUVs, uma mistura lipídica consistindo em esfingomielina 10 mol%, fosfatidilcolina 50 mol%, colesterol 20 mol% e BMP 20 mol% dissolvidos em solventes orgânicos, foi desidratada sob uma corrente de árgon e re-hidratada em tampão Tris / HCl (pH 7,4) . A mistura foi congelada-descongelada nove vezes em nitrogénio líquido e depois em uma incubadora a 37° C. Após o banho de ultrasons durante 15 min a mistura foi passada 21 vezes através de uma membrana de policarbonato com um diâmetro de poro de 100 nm. As medições da ressonância do plasmão de superfície foram realizadas usando um sistema BIAcore 2000 a 25° C. As 197 LUVs (concentração total de lípidos 0,1 mM) foram imobilizadas sobre a superfície de um chip sensor LI (BIAcore) em PBS (tampão de carga). 0 tampão de corrida usado foi tampão acetato de sódio (50 mM, pH 4,5). Como um controlo, a esfingomielinase ácida (0,2 μΜ, 60 μΐ em tampão de corrida) foi injetada diretamente na superfície do lipossoma. Foram obtidas unidades de resposta entre 4100 RU - 5250 RU. A proteína de interesse foi injetada em tampão de corrida a uma taxa de fluxo de 2 0 pL / min nas concentrações indicadas. Após a injeção, seguiu-se uma fase de dissociação de 10 min. No caso em que a rASM se seguiu à rHsp70, a rASM foi adicionada 180 segundos após a fase de dissociação de 10 min da rHsp70 seguida ainda por uma fase de dissociação de 10 min.

Modelagem molecular. A análise da estrutura primária, bem como a modelagem molecular, foram realizadas com o software disponível através do servidor de proteómica Sistema de Análise de Proteínas Especializadas (ExPASy) do Instituto Suíço de Bioinformática (http://expasy.org/). A modelagem molecular foi feita com base na estrutura cristalina do domínio ATPase da Hsp70 humana (código pbd:lS3X) e o domínio de ligação ao substrato da Hsc70 humana (código pdb: 7HSC) com Visualizador DeepView-Swiss PDB. Os modelos de superfície foram baseados na interação de coulomb em pH 7,0 utilizando uma constante de solvente dielétrica de 80 (H 2 0) .

Análise estatística. A análise estatística foi realizada utilizando um teste T Student bicaudal emparelhado de modo a avaliar a hipótese nula. 0 nível de corte para a significância estatística foi estabelecido em 5% e todos os grupos de dados foram testados para a comparabilidade das suas variâncias, usando um F-teste. Todas as estatísticas 198 foram feitas com um mínimo de n = 3 experiências independentes.

Exemplo 3: Efeito do álcool benzílico sobre a doença do armazenamento lisossomal É apresentado nos Exemplos 2 e 3 que a Hsp70 tem um efeito estabilizante no lisossoma através de uma interação com o BMP. De modo a avaliar se este efeito também é observado quando expondo as células a um indutor químico da Hsp70, os fibroblastos de um paciente com Niemann-Pick Tipo A (NPDA) foram tratados com a pequena molécula indutora da Hsp70; álcool benzílico (BA) . Os resultados são apresentados na figura 11. Primeiro, as células NPDA foram tratadas com doses crescentes de BA (0, 20, 30, 35, 40, 45 mM), lisadas, e analisadas por western blotting. A mesma quantidade de proteína foi carregada em cada poço. A expressão da proteína Hsp70 foi avaliados para cada condição e mostra que o BA induzia a expressão da Hsp70 de um modo dose-dependente (anticorpo primário: StressGen SPA-810, específico para a Hsp70). Em seguida, a estabilidade dos lisossomas NPDA Gõtz após o tratamento com BA 40 mM foi avaliada, utilizando os mesmos métodos descritos no Exemplo 2, uma maior estabilidade lisossomal foi observado em resposta ao BA. Finalmente, a área da secção transversal lisossomal em células NPDA Gõtz após o tratamento com BA 40 mM foi avaliada, utilizando os mesmos métodos descritos no Exemplo 2. É observada uma diminuição da patologia diminuição.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Jensen, Thomas Kirkegaard Jaattela, Marja Helena 199 <12Ο> Uso da Hsp70 como regulador da actividade enzimática <130> P2146PC00 <150> PA 2008 00885 <151> 2008-06-26 <160> 4 <170> FastSEQ para a Versão 4.0 do Windows <210> 1 <211 >641

<212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1

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<212> ADN <2i3> Horao Saptens <4Ô0> 2 201 gçeatggcea gtgttccsãc aqctacgtgg gcgctg&aec gaceeggfcqg aagc.ccàagg tcçtccatgg accaacgcgg gacgcgggtg gce&tegcct ctggqcgggg aaggeeaegg cacttcgtgg gtgaggcggc gce&gcctgg gcgaggfctcg gcrctqcçcg tccacccgca aaeaagsgca ctgatggggg tcgctggggc efcccccacca atceaggtgt gagctgagcg atcgatgcca aagatcscca caggaggcgg aaegccctgg ggeaagatea tggctgg&cg gagcaggtgt gggggcttcg g Cagatt&gg tcctagtatt gtgsagtact acctcacgae efctcaaaqta aagecgcggc acggcaaggt CCttcacgga cgcagsscac tgeagtcggã tgfiaggtgag tgctgaosaa tgatcacegt tgstcgcggg aeggcctgga gcaeettcga ecggggacac aggagttcaa tgcgcaccge agatcgacts aggagctgtg acgccaagct tceccaaggt KCaseecsga aeaaçteega tçjqagacggc agcagacgc» acgagggcga gcatccctçc acggcatcet tcaecaacgs agasgracaa agtcctacgc gegaggcgga ccaacacctt gtaaccceat gggctssggg ggCCtttCCa tctgtttgtc gaacttgctt tatrtcttct aataaacttt gatcggcatc gg&gafccatc caccgagcgg cgtgttfcgac catgaagreae ctacaagggg gatgaaggag gccggoetac: gcteaacgeg eagaacgggc çgtgtççatc ccacctgggt gagaaaaeac ctgcgagagg eetgtttgag ctccgacetg ggacaaggcc gçagasgcrg cgaggcfcgtg gaacgtgcag eggaggcgtg gaicttcace gaçggccatg ggcccccagg g&ôcetcacg

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<2T2> PRT <213> Hmjo Saplms •·400> 3

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Lisboa, 8 de Junho de 2012

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. A Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, em que a referida Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante é capaz de interatuar com o BMP (Bis(monoacilglicero)fosfato) , para uso no tratamento de um distúrbio do armazenamento lisossomal.

2. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida Hsp7 0 ou um seu fragmento funcional ou variante tem 100% de homologia com a proteína Hsp70 do tipo selvagem.

3. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida Hsp7 0 ou um seu fragmento funcional ou variante tem entre 99, 9 a 95% de homologia, por exemplo, 95 a 90% de homologia, tal como 90 a 85% de homologia, por exemplo 85 a 80% de homologia, tal como 80 a 75% de homologia, por exemplo, 75 a 60% de homologia com a proteína do tipo selvagem.

4. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante é a Hsp7 0 .

5. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 4, em que a referida Hsp70 é a Hsp70 de comprimento completo.

6. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida HSP70 ou um fragmento funcional ou variante da Hsp70 2 compreende a totalidade ou parte do domínio ATPase da Hsp7 0.

7. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida HSP70 ou um fragmento funcional ou variante da Hsp70 compreende o triptofano na posição de aminoácido 90 do domínio ATPase da Hsp70.

8. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é seleccionado do grupo consistindo nos distúrbios de Niemann-Pick, Farber, Krabbe, Fabry, Gaucher, Sialidose, Leucodistrofia Metacromática e deficiência em saposina.

9. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é a doença de Niemann-Pick do tipo A ou do tipo B.

10. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida doença de armazenamento lisossomal é caracterizada por ter actividade enzimática residual da enzima defeituosa envolvida na patologia da doença.

11. Hsp70 ou um seu fragmento funcional ou variante, para uso de acordo com a reivindicação 10, em que a referida atividade enzimática residual está por exemplo compreendida desde 0,1% a 50%, tal como no intervalo de 0,1 a 1%, por exemplo 1 a 2%, tal como 2 a 3%, por exemplo 3 a 4%, tal como 4 a 5%, por exemplo 5 a 6%, tal como 6 a 7%, por exemplo 7 a 8%, tal como 8 a 9%, por exemplo 9 a 10%, tal como 10 a 11 %, 3 11 a 12%, tal como 12 a 13%, por exemplo 13 a 14%, tal como 14 a 15%, por exemplo 15 a 20%, tal como 20 a 25%, por exemplo 25 a 30%, tal como 30 a 35%, por exemplo 35 a 40%, tal como 40 a 45%, por exemplo no intervalo de 45 a 50% da actividade enzimática residual.

12. Hsp7 0 ou um seu fragmento funcional para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11.

13. Fragemnto funcional da Hsp70 para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 6-11.

14. Variante funcional da Hsp70 para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 6-11. Lisboa, 8 de Junho de 2012