CN104115478B - 发光成像扫描仪 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于准确地成像化学发光和其他发光的系统、装置和方法。具有不透光的壳体、一个或多个线性电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)成像芯片的检测器条以及高工作数值孔径(NA)光学元件的紧凑型平板扫描仪在一个方向上并且随后在相反的方向上近距离扫描样本。将对于两遍或更多遍之间的每一个像素位置(x，y)的强度读数的平均值和其他组合一起求平均以便补偿随时间变化的发光。片上像素分区和多个时钟频率可以用来最大化基于CCD的扫描仪的信噪比。

Description

发光成像扫描仪
相关申请的交叉引用
本申请是于2012年3月28日提交的美国专利申请第13/432,410号的继续并且要求其权益，该美国专利申请第13/432,410号要求于2011年12月16日提交的美国临时专利申请第61/576,941号的权益，它们的内容出于所有目的通过引用整体合并于此。
关于在联邦政府资助的研究或开发下进行的发明的权利的陈述
不适用
版权声明
本专利文件的公开的一部分包含受版权保护的材料。版权所有人不反对本专利文件或本专利公开的任何人的拓制(facsimilereproduction)，因为其发表在专利和商标局专利文件或记录中，但是以其他方式保留任何全部版权权利。
技术领域
总地，本申请涉及一种分子生物学和微生物化学处理以及包括光学测量或测试部件的设备。特定实施例涉及一种用于呈现化学发光或其他发光的成像试验的装置、系统和方法。
背景技术
检测并识别特定生物分子在研究例如植物和动物的生物系统中是重要的。这样的系统可能仅呈现少量生物分子，例如蛋白质，在一些实例中，该生物分子可能仅在高端实验室级的装备和处理中得以准确测量。许多试验技术在过去数十年已经发展，用于准确地获取这样的测量。
各种试验使用增强的化学发光(CL)来检测少量生物分子。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)或蛋白质印迹的技术通常用来检测低丰度(lowabundance)蛋白质。
化学发光技术与荧光的不同在于不需要外部激发光。因此，实际上不存在来自不发生化学发光反应的试验区域的光发射，并且因此存在非常低的光学背景。这是在CL试验中检测少量光学发射的能力的主要原因之一。
化学发光发射的光学信号的特征通常在于：1)微弱，以及2)在时间上不恒定(non-constantovertime)。光学信号的微弱性驱动了对于高信噪比检测方法的需要。在测量化学发光的领域中教导了高效成像光学元件以及极低噪声检测器的使用。典型化学发光基底的光发射的不恒定性质自然地暗示了使用完整图像(whole-image)捕获方法。这样的成像允许在相同时间以及在长积分时间(integrationtime)内从试验的全部发射区域收集等量光。
过去，从CL试验捕获光学发射的最常见方法之一是使用照相胶片。例如，紧邻光发射蛋白质印迹曝光照相胶片。然而，存在使用胶片的许多限制。通常，胶片呈现出对于碰撞光子的非线性响应并且具有有限的动态范围。还存在仔细处理未显影胶片以及特殊暗室设施及化学物品以显影并处理胶片的需要。
此外，通常存在数字地捕获试验图像以便将其存储用于未来的参考的需要。为了将其完成，胶片用户通常使用数字相机或平板扫描仪来捕获已显影胶片的图像。该方式要求额外的成像装备，可以是非量化的并且在图像捕获和再现中易出差错。
使用数字的电荷耦合器件(CCD)相机直接成像CL试验的光学发射可以克服与使用照相胶片相关联的许多困难。CCD相机在宽动态范围上对碰撞光子提供线性响应，不需要化学物品用于显影，并且数字数据可以从数字相机直接读取并轻易地存储用于未来的分析和量化。在本领域中已经教导了在极暗室中长时间地将高质量、低温冷却的CCD阵列曝光于蛋白质印迹。现在，在市场上存在许多这样的基于CCD的成像器，其实现了与胶片可比较的敏感度。基于CCD的成像器的示例是LI-CORFc成像器。基于CCD的成像器具有对于光高度敏感的深度冷却芯片。
互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器已经与CCD传感器并行地开发。不像CCD中的像素，CMOS图像传感器中的每一个像素具有其自身的电荷至电压转换组件。这可以导致比CCD图像传感器低的均匀性。然而，随着光刻工艺和其他制造工艺改进，CMOS图像传感器的均匀性已经不再那么是个问题。随着技术改进，CMOS图像传感器阵列可以在许多市场中取代CCD图像传感器阵列使用。
在本领域中存在对于通过胶片的CL成像的小型、廉价的数字替代品的需要，该数字替代品达到相同或更好的敏感度。
发明内容
本申请涉及用于捕获来自试验的非常昏暗的化学发光或其他发光的图像而无需深度冷却CCD的紧凑型、平板扫描仪。在实施例中的不透光的遮盖物之下，具有线性CCD和高工作数值孔径(NA)光学元件的检测器条在呈现化学发光的样本的附近扫过以便捕获光。检测器条随后在相反方向上扫回以捕获更多的光。因为来自化学发光的极少光和CCD要采集同样缺乏的光子，所以每一次扫动或每一遍(pass)可能花费若干分钟。通过将在来自第一和第二遍中的每一个点的两个(或更多)像素读数求平均或以其他方式组合而构成最终图像，以补偿在扫描花费的若干分钟内不断改变的发光。也可以使用更多遍。
检测器条可以具有低成本未冷却线性CCD集成电路(IC)的交错的列。多个检测器条可以用来扫过样本，这可以缩短扫描时间，最小化样本在时间上不断改变的发光的效果。片上分区(binning)可以在从CCD芯片上读取多个像素读数之前将它们组合在一起，并且新颖的时钟机制可以促进纯净的数据收集。在一些实施例中，检测器条移动而样本保持不动，但是在其他实施例中出现相反的情况。
本发明的一些实施例涉及发光扫描仪设备。该设备包括样本床，配置为保持发光样本介质；检测器条，包括一个或多个图像传感器阵列，每一个传感器阵列具有多个像素元件，每一个传感器阵列的像素元件适配为彼此同时检测光子，该检测器条配置为关于样本床移动；电机，配置为在第一方向上在第一遍中关于样本床移动检测器条并且随后在与第一方向相反的第二方向上在第二遍中关于样本床移动检测器条；电路，适配为将来自第一遍中的位置的像素读数与来自第二遍中的位置的像素读数组合；以及电路，适配为根据所组合的像素读数构成二维图像。
实施例可以通过将来自第一和第二(或更多)遍的每一个位置处的像素读数求平均以组合像素读数。一个或多个图像传感器阵列可以包括沿着检测器条关于彼此交错的线性CCD集成电路(IC)，并使得它们纵向地重叠。
实施例可以包括第二检测器条，其包括一个或多个图像传感器阵列，该第二检测器条配置为关于样本床移动，其中检测器条配置为主要扫描样本床的不同的非重叠区域；以及电路，配置为根据来自两个检测器条的像素读数构成二维图像。可以采用最小重叠以促进图像配准(registration)和重构。
梯度折射率(GRIN)透镜阵列可以布置在样本床和一个或多个线性图像传感器阵列之间，该GRIN透镜阵列具有大于或等于0.10、0.20、0.25或更多的工作数值孔径(NA)。该GRIN透镜阵列可以布置在位于样本床的样本的1和100毫米之间。
一些实施例针对发光扫描仪设备。该设备包括样本床，配置为保持发光样本介质；集成电路(IC)电荷耦合器件(CCD)图像传感器阵列，具有多个像素元件，该像素元件适配为彼此同时地存储光子诱发的电荷，该图像传感器阵列配置为关于样本床移动；电机，配置为关于样本床移动图像传感器阵列；电路，适配为将来自相邻CCD像素元件的多个光电荷集中到CCD图像传感器阵列的读出电容器中；以及电路，适配为从读出电容器读取所集中光电荷并且使用该所集中光电荷构成图像。
该方法设备可以进一步包括电路，适配为将两个或更多不同的CCD时钟频率施加到一个或多个集成电路CCD图像传感器阵列的每一个的输入，该输入适配为将来自像素元件的光子诱发的电荷平移到集成电路CCD图像传感器阵列的输出。
一些实施例针对发光扫描仪设备。该设备包括样本床，配置为保持发光样本介质；集成电路(IC)电荷耦合器件(CCD)图像传感器阵列，具有多个像素元件，该像素元件适配为彼此同时地存储光子诱发的电荷，该图像传感器阵列配置为关于样本床移动；电机，配置为关于样本床移动图像传感器阵列；电路，适配为将两个或更多不同的CCD时钟频率施加到集成电路CCD图像传感器阵列的输入，例如引脚，该输入适配为将来自像素元件的光子诱发的电荷平移到集成电路CCD图像传感器阵列的输出；以及电路，适配为根据集成电路CCD图像传感器阵列的输出构成图像。
一些实施例针对用于获取发光介质的图像的方法。该方法包括将发光介质放置在扫描装置的壳体内；在穿过发光介质的第一遍中关于发光介质在第一方向上移动图像传感器阵列，该图像传感器阵列具有适配为彼此同时检测光子的多个像素元件；在第一遍期间使用像素元件检测发光；在穿过发光介质的第二遍中关于发光介质在第二方向上移动图像传感器阵列，该第二方向与第一方向相反；将来自第一遍中的位置的像素读数与来自第二遍中的位置的像素读数组合；以及根据来自第一和第二遍的所组合的像素读数构成图像。
一些实施例针对用于从发光介质获取图像的方法。该方法可以包括以空间模式(pattern)固定目标生物分子到样本介质，该模式包括关于目标生物分子的标识的信息；以具有针对目标生物分子的结合亲和性(bindingaffinity)的主探测生物分子来探测目标生物分子；以及以具有针对主探测生物分子的结合亲和性的次级探测生物分子来探测主探测生物分子，该次级探测生物分子具有通过基底生物分子的改变来触发生成可检测到的能量的酶活性，其中基底生物分子是用于次级探测生物分子的酶活性的基底。该方法进一步包括在第一遍中在至少一个空间维度上移动图像传感器阵列穿过样本介质，在第一遍期间通过图像传感器阵列读取发光，以及根据通过图像传感器阵列读取的发光构成图像。
该方法可以进一步包括在第二遍中在至少一个空间维度上移动图像传感器阵列穿过样本介质，在第二遍期间通过图像传感器阵列读取发光，组合在来自第一和第二遍的位置处采集的发光读数，以及根据在来自第一和第二遍的位置处采集的所组合的读数构成图像。
实施例可以使用各种样本介质，包括膜(membrane)(例如，尼龙或硝化纤维素)、平板(plate)、玻璃或塑料表面等。
参考说明书的剩余部分，包括附图和权利要求，本领域普通技术人员将认识到本发明的其他特征和优势。以下关于附图详细描述本发明的进一步特征和优势以及本发明的各种实施例的构造和操作。在附图中，相同的附图标记指示相同或功能类似的元素。
附图说明
图1A图示根据实施例的紧凑型成像扫描仪。
图1B图示其盖子关闭的图1A的扫描仪。
图2是根据实施例的检测器条的分解图。
图3图示根据实施例的具有单个检测器条的样本床的顶视图。
图4图示根据实施例的具有多个检测器条的样本床的顶视图。
图5是关于多次扫动(sweep)的时间的化学发光图。
图6图示根据实施例的高NA光学元件布置的立面(elevation)横截面图。
图7图示根据实施例的简化线性CCD阵列像素的顶视图。
图8是根据实施例的处理的流程图。
图9是根据实施例的处理的流程图。
具体实施方式
这里呈现的是一种新颖的成像方法和设备，其实现了高端CCD成像器的敏感度但是具有明显更小的尺寸并且无需冷却。成像设备可以因此以比过去低许多的成本生产和维护。
在现有技术的化学发光成像器中，CCD的选择、其封装以及其电子元件通常主要受低总噪声的需要驱动。这通常要求使用高端科研CCD。这些科研CCD通常尺寸较小，在1厘米(cm)x1cm的范围内。典型的蛋白质印迹的尺寸在10cmx10cm的量级上。因此，需要低NA透镜和其他成像光学元件来在适当的焦距上将样本区域投影到较小的CCD区域。这样的成像要求几百毫米(mm)的总光路(opticalpath)，这导致物理上较大的成像器。
样本越大，工作距离越长。工作距离越长，透镜的收集效率越低。这引起在更长时间段收集光的需要，并且这转而不变地要求冷却甚至低噪声科研CCD以便控制内部暗(热)噪声。这些条件是本领域的基于CCD的化学发光成像器的相对高成本的原因。
术语
“检测极限(LOD)”包括可以可靠地检测的样本的最小浓度，产生是系统噪声水平的标准偏差三倍大的信号，或以本领域公知的其他方式的信号。
“图像传感器阵列”包括CCD、CMOS以及可以在多个像素中同时检测光或其他电磁辐射的其他技术的传感器，该传感器的像素以一维、二维或其他阵列以及以本领域公知的其他方式排列。例如，其中像素以一维(即，行)排列的图像传感器阵列可以包括线性CCD或线性CMOS传感器。
“线性CCD”包括在一个方向上比在另一正交方向上实质上更长且具有更多元件的电荷耦合器件或以本领域公知的其他方式的电荷耦合器件。广泛可用的线性CCD的示例是ToshibaCCD线性图像传感器型号TCD1205DG。它具有2,048个像素，每一个像素是14μm长(沿着阵列的纵向长度，y轴)且200μm宽(沿着阵列的横向宽度，x轴)。
“发光”包括不是由于白热或以本领域公知的其他方式引起的光的发射。发光包括化学发光、生物发光、电致发光、磷光和在成像期间不要求光学照明的其他发射。化学发光是由于化学反应并且是用来检测低丰度蛋白质的最常见类型的发光之一。生物发光是由活的生物体自然激发(stimulate)的。电致发光是电性诱发的光发射。磷光由光发射之前的光学充电诱发。
“发光样本介质”包括适配为支持或包含发光样本的介质或以本领域公知的其他方式的介质。这样的介质包括膜，例如尼龙膜或硝化纤维素膜，其通常用于蛋白质印迹试验。这样的介质可以包括孔，例如微孔板和微板或不同形状及尺寸的其他孔板，其通常用于ELISA试验。这样的介质还可以包括例如玻璃、塑料等的平坦表面。
“深度冷却”包括低于10摄氏度(℃)、0℃或包括冷冻和非冷冻温度的其他低温的主动冷却。
像素的“分区”包括将两个或更多像素组合为一个实际上更大的像素。例如，可以组合三个14μm长的像素以创建大约3x14μm＝42μm长的一个有效像素。像素越大，它收集的光越多。更大的像素通常要求更多的冷却用于长曝光(例如，大于100秒)。“片上分区”在下面描述。
“梯度折射率(GRIN)透镜”包括具有可变折射率的透镜。GRIN透镜的示例是NipponSheetGlass有限公司(NSG集团)微透镜阵列型号SLA-20BG-138-570-2R，在美国由新泽西Somerset的Go！Foton公司发售。微透镜是成像透镜杆(rod)。它们与光传输光纤(例如，光纤电缆)相比通常在长度上更短并且在直径上更大。它们通常具有纤维光导装置(fiberguide)不具有的属性，例如快速改变折射率。型号SLA-20BG微透镜具有有助于光收集的高NA，并且在长度上较短。它具有6.89mm长、3.46mm工作距离并且在570纳米(nm)光波长处大约0.5的有效线成像NA的两行1：+1成像GRIN杆透镜。每一个SLA透镜的直径是大约1mm。
“样本床”包括用于容纳样本以及以本领域公知的其他方式的区域。样本床的示例包括在扫描样本时支持样本的玻璃或塑料板直接上方的区域、微孔板或微板被配置为通过托盘槽或抽屉轴滑入的空间或本领域公知的其他样本区域。
技术优势
存在本发明实施例对现有技术的若干技术优势。近距离(closely)扫描样本而非通过透镜一次性成像整个样本允许从昏暗的发光收集更多的光。高NA光学元件和大的有效像素尺寸可以用来最大化所收集的光子量。针对成像具有距其一些深度的孔的板，近距离扫描样本与广域成像器相比提供了额外的有益效果。区域成像器公知为具有已知为视差的失真伪影(distortionartifact)，这源自于成像光学元件从不同角度看孔的事实。近距离扫描避免了视差问题并且在最小失真的情况下以相同方式产生全部孔的图像。
即使当用CCD中近乎完美的感光器(photoreceptor)非常近距离地扫描样本时，对于快速扫描来自典型化学发光的光子仍然太少。这可能花费数分钟来扫描10cm并且收集充足的光。然而，此时，化学发光的强度改变。在扫描的开始和结束之间将收集不同基线的光子，并且产生的图像将错误地在一端比另一端更昏暗。至少出于这个原因，长时间扫描对于成像化学发光将不是一个显然的选择。无论如何，发明人已经确定，两遍扫描(即，在一个方向上扫描并且随后在另一方向上扫描)并且随后将来自扫描的点求平均或以其他方式组合可以充分地补偿典型化学发光的易变性。
关于CCD的冷却，通常使得低光CCD传感器的设计复杂化的就是深度冷却。CCD的深度冷却可以是处于远低于0℃的温度。为了实现那种温度而无冷凝，CCD应当用密封机构来封装。该密封机构可以抬高相机成本和尺寸以及增加维护和耐用性问题。对于需要收集光超过100秒的相机或广域成像器，实际上任何CCD，天文的、科研的或其他类型的，都需要冷却到远低于0℃以便保持其噪声水平在合理范围内。然而，发明人已经发现未冷却的CCD或未深度冷却的CCD可以在实际的室温实施例中使用，保持成本下降以及维护简单。
附图
图1A-1B图示根据实施例的紧凑型成像扫描仪。发光扫描仪设备100形似平板、纸件型扫描仪，并且包括盖子101、底座102、和样本床103。样本床103包括透明玻璃或塑料作为支持并且能够保持湿润的膜。两个成像扫描条，检测器条104和检测器条105，可用于扫描。检测器条104置于样本区域的上侧而检测器条105置于样本区域的中心。
可以实现其中技术员可以将托盘滑动或小心地放置到扫描区域上方的地方的托盘系统。为了最小化敏感扫描条和发光材料之间的距离和玻璃或塑料的量，板可以由在其下方不具有玻璃的侧面上的轴承表面支持。孔板可以正好悬空在一个或多个检测器条上的焦距/工作距离处。
图2图示根据实施例的检测器条。检测器条204包括没有照例环绕它们的适形块(conformalblock)地示出的GRIN透镜212以及封装为集成电路(IC)芯片的线性CCD图像传感器213。在扫描仪的组装期间，线性CCD图像传感器213被焊接到印刷电路板(PCB)214中并且通过带状电缆218与其他电路电性连接。IC容纳(house)由玻璃窗216保护的CCD像素元件217。CCD像素元件包括CCD光电二极管、与CCD转移阵列(transferarray)连接的导体矩阵(conductormatrix)以及在CCD中发现的其他元件。
导向装置215允许检测器条204在横向x方向上前后行进以便扫描样本。保护性窗211将GRIN透镜212与湿润的膜隔离并且将样本固定在GRIN透镜的工作焦距处。
检测器条204包括多个CCD图像传感器IC213。多个CCD图像传感器213在两个方向上交错以实现覆盖期望的整个扫描宽度的更长的连续成像线。例如，每一个都成像28.67mm长的线的4个线性CCD芯片可以沿着它们的长度交错27.5mm以及沿着垂直方向交错10mm以允许扫描4x27.5＝110mm宽。每一个IC芯片的封装总是大于其CCD光电二极管感测阵列。横向方向上的10mm偏移允许放置线成像器以使得它们的传感器阵列沿着纵向方向具有一些重叠。
线性CCD图像传感器IC213沿着检测器条纵向地关于彼此以交错方式221排列。它们以距离220纵向地(在y方向上)彼此重叠以使得来自一个芯片的像素217的线的一端与来自下一芯片的像素217的线的开始对准或轻微重叠。对于当前指定的ToshibaTCD1205DG线性CCD芯片，距离220应当是至少6.46±0.8mm。
图3图示根据实施例的具有单个检测器条的样本床的顶视图。单个检测器条扫描系统300包括样本床303、检测器条304(具有图中所示的GRIN透镜312的顶部)以及与检测器条304耦接以将其沿着x方向准确且精确地移动的步进电机324。可选的光学编码器327可以用来在任何点处确定检测器条的精确位置。
对于扫描，检测器条304从端325开始，在检测像素的同时移动到相对的端326，并且随后在检测像素的同时移动回到端325。从端325到端326的移动(以及其间的任何停止)可以称为“第一遍”，而从端326到端325的移动(以及其间的任何停止)可以称为“第二遍”。第一和第二遍的组合可以称为“相反方向扫描”。
在检测器条实际上处于运动或在一遍期间的连续运动之间的微小步进停止处时，可以发生该遍期间的像素检测。
在第一遍期间的每一个特定(x，y)位置，检测并存储光量ax，y。来自第一遍的全部(x，y)位置的总图像可以存储为矩阵A(例如，二维阵列)。在第二遍期间的每一个特定(x，y)位置处，检测并存储光量bx，y。来自第二遍的全部(x，y)位置的总图像可以存储为矩阵B。最终图像可以通过将A矩阵的每一个点和B矩阵的每一个点求平均(即，矩阵符号中C＝(A+B)/2)来准备。求平均可以在两个图像均完全采集之后完成或随着进行每一次第二测量而以小的步进完成。
“组合”来自不同遍的每一个点可以通过求平均、求和(即，不除以遍数)或以其他方式服从取决于来自多遍的点的读数的函数来完成。数学上，在1到N遍上的每一个位置(x，y)的强度I可以以通用函数关系来组合：Ix，y combined＝f(Ix，y pass1，...，Ix.y passN)。
组合可以在电路328中完成。电路可以是专用硬件或固件电路，或可以是用于与装置的其他功能一起使用的更通用目的的存储器和处理器。电路328被编程或以其他方式适配为将来自第一遍中的位置的像素读数和来自第二遍中的位置的像素读数组合。还可以是运行软件的通用处理电路或更专用的电路的电路329被编程为根据所组合的像素读数来构成二维图像。输出图像可以是能够由个人计算机或其他计算装置读取的格式。
可以进行多次相反方向扫描以便进一步改善(refine)图像。即，可以使用4、6、8或更多遍并且它们的(x，y)像素被平均或以其他方式组合。来自较后的相反方向扫描的图像可以与来自之前的相反方向扫描的图像不同地加权，以统计地补偿从随着时间变暗的样本较后收集的较少光子。也可以使用奇数遍，即，3、5、7或更多遍。例如，在3遍系统中，第一和第三遍可以一起求平均，并且随后将平均值与第二遍组合。
图4图示根据实施例的具有多个检测器条的样本床的顶视图。
双检测器条扫描系统400包括样本床403、检测器条404和405以及与线成像器404和405耦接以将其沿着x方向准确且精确地移动的步进电机424。可以包含在电机中的光学编码器427可以用来在任何点处确定线成像器的精确位置。
对于第一遍，线成像器404从端425开始，在检测像素的同时略微移动超过样本床403的中间，并且随后在检测像素的同时移动回到端425。类似地，线成像器405从略微不到样本床403的中间处开始，在检测像素的同时移动到端426，并且随后在检测像素的同时移动回到它来自的中间。
两个线成像器可以沿着x轴机械地一起扫描。为了覆盖10cm的扫描长度，扫描仪可以使得线成像器分开5cm并且均沿着x方向扫描5cm+10mm。额外的10mm可以是为了考虑在线成像器的定位中的x偏移。这样，扫描头两者均覆盖共同的5cm长度。
对于每次线读取的给定曝光时间，使用两个扫描头而非一个扫描头允许扫描一半距离，并且因此是使用单个扫描头将可实现的两倍快地覆盖相同区域。为了速度的多个扫描条对于文档或书籍扫描或其他外部照明的扫描来说是不需要的，因为可以控制并且保持照明目标的光量的稳定。为了随着时间改变的化学发光和其他昏暗发光，多个扫描条可以减少由于非线性昏暗引起的误差。
通过沿着x轴增加甚至更多扫描头可以获得更快的成像。例如，3、4、5或更多线扫描仪可以扫描样本。成像器上的CCD可以在扫描之前和之后彼此校准。沿着y轴增加更多的CCD允许扫描更宽广的扫描区域。
实现扫描的替代方式是相对于惯性坐标系(inertialframe)(例如，地面)移动样本而非扫描头。即，在检测器条保持不动的同时电机可以前后移动样本介质。在其他实施例中，样本和扫描头两者均可以彼此相对地移动。
图5是关于两次扫动的时间的化学发光图。在扫描仪从位置0到位置10(从0到225秒)的第一机械遍530上，信号随时间下降。在扫描仪从位置10回到位置0(从225到450秒)的第二机械遍531上，信号越发随时间下降。在每一个时间点处将两遍求平均，或更准确地，在每一个x位置，产生相对平坦、水平的平均信号532，其比单个信号更恒定。
与现在在蛋白质印迹化学发光市场中使用的许多CL基底的时间过程改变相比，每遍若干分钟量级的扫描时间是相对短的。化学发光在开始时迅速攀升(例如，在用第二生物分子探测之后)，在大约10分钟内攀升到其最大发光。发光强度在下一个小时开始线性回落并且在之后继续淡去。
已经发现2、3、4或5分钟扫描时间与化学发光强度的改变速率相比足够短。即使存在这样的窗口内存在一些改变，改变也是相对线性的。对两个相反方向扫描一起求平均或求和可以移除该改变的大多数，并且如图所示，在扫描位置上结果是显著恒定的(predominantlyconstant)。因此，可以使能基于样本的实际浓度而非成像器变化的量化。
可以计算在相反方向求平均之后的残差估计。假定沿着扫描方向x从位置0到位置L的恒定发射的光学功率为P0并且每遍期间缓慢变化改变，第一遍P1(x)和第二遍P2(x)的功率电平(powerlevel)可以用如下函数表示：
(等式1) P 1 ( x ) = P 0 ( 1 + a ( x L ) b )
(等式2) P 2 ( x ) = P 0 ( 1 + a ( 2 L - x L ) b )
其中，a和b是基于所涉及的CL基底的类型的常数，而L是总x方向长度。功率电平和平均值之间的差(误差ε)可以如下得出：
(等式3) ϵ ≡ [ P 1 ( L ) + P 2 ( L ) ] - [ P 1 ( 0 ) + P 2 ( 0 ) ] 2 P o = a ( 1 - 2 b - 1 )
给定值a＝0.05和b＝0.5(即，平方根关系(squarerootdependence))，相反方向求平均将误差从无校正的5％减少到小于1.5％。扫描时间越短，改变越线性，并且校正越准确。
图6图示根据实施例的高NA光学元件布置的立面横截面图。例如CL蛋白质印迹膜的样本640放置在扫描窗口611的顶部。从各种点发出的发射光由GRIN透镜阵列612收集并且投影到线性CCD像素元件617上。后者用玻璃窗616密封。不透光的壳体环绕系统600以防止环境光进入扫描仪的内部并且污染测量。
膜640在其上搁置的扫描窗口611的顶部表面放置在距GRIN透镜612距离642处以处于它们前面的工作距离。在透镜的另一侧，CCD像素元件放置在距GRIN透镜612距离643处以处于它们后面的工作距离。已经发现总工作距离641可以比使用低NA透镜的整个样本成像器小许多。
宽像素尺寸(例如，200μm)可以有助于高效地收集更多光。为了进一步增加光收集并且在两个方向上获得相等的分辨率，像素电荷可以分区在一起。
图7是根据实施例的CCD像素的俯视图。由多个相邻CCD像素717a到717c收集的光电荷在区块(bin)744中分区在一起，由像素717d到717f收集的光电荷在区块745中分区在一起。
对于具有14μm长和200μm宽的像素的ToshibaTCD1205DG(如上所述)，将14个像素分区在一行中，即，以14分区，导致14x14μm＝196μm的有效像素尺寸，其接近200μm的像素宽度尺寸。该196μmx200μm的有效像素尺寸几乎是正方形的。可以应用其他分区级别并且改变扫描步进尺寸以产生更高或更低的分辨率扫描。例如，以7分区和98μm的扫描步进导致在两个方向上98μm的扫描分辨率。
使得有效像素尺寸翻倍使得所收集光量变为4倍并且减少了一半分辨率。对于带(band)在尺寸上是若干毫米的CL蛋白质印迹，200μm分辨率的实施例产生相当良好质量的图像。
在一实施例的情况下，可比的LOD可用幅度比广域成像所需的曝光的量级小的曝光实现。例如，每次线读取的0.5秒曝光时间给出了与在2分钟曝光时间中商用广域CCD成像器可以给出的LOD类似的LOD。这个短的0.5秒曝光允许通过线性扫描读取多条线来在可比的总成像时间中获得相同区域尺寸的图像。
片上分区
典型的线性CCD具有以直线排列的成像二极管阵列。当光落到这些二极管上时，每一个二极管产生了与落到该光电二极管上的光量成比例的光电荷。在称为曝光时间的时间量之后，通常称为二极管转移的信号用来转移光电二极管中的光电荷到CCD转移阵列。CCD转移阵列移动各个光电荷到CCD转移阵列的一端。CCD转移阵列步进地移动光电荷。CCD转移阵列通常由至少一个时钟信号控制并且在许多情况下由多于一个时钟信号控制。所要求的时钟数由所涉及的CCD的设计确定。通常，对于驱动CCD转移阵列的时钟信号的每一个时钟边缘CCD转移阵列将移动光电荷一个步进。
在CCD转移阵列的端部是读出电容器。随着CCD沿着CCD转移阵列平移(shift)光电荷，它们最终到达并且移动到该读出电容器中。作为CCD的读出处理的一部分，该电容器周期性地预充电。通常，该电容器正好在CCD转移阵列从一个光电二极管平移入光电荷之前预充电。如果读出电容器正好在光电荷移动到它中之前预充电，则该读出电容器的电压的改变与由CCD转移阵列注入到它中的光电荷量成比例。读出电容器的电压通常由CCDIC上的放大器缓冲，并且呈现在输出引脚上。在输出引脚处的电压通常被进一步放大、低通滤波以及由成像系统中的其他电子元件数字化。通常，一次从线性CCD读出一个像素。因此，电子元件通常以交替方式读出光电二极管电荷，在预充电读出电容器、测量并存储预充电电荷，时钟驱动CCD转移阵列移动一个光电二极管电荷到读出电容器中，并且随后读取在线性CCD阵列IC的输出引脚处呈现的电压之间交替。在该点处，可以计算光电二极管电荷。光电电荷与读出电容器在其预充电电压和在注入光电电荷的情况下的电压之间的电压的改变成比例。
不幸地是，测量读出电容器的电压的处理是伴有噪声的处理。存在各种形式的电噪声，其将它们自己加入到被测量的电压中。该噪声可以模糊正从读出电容器中读取的期望信号。损坏从读出电容器读取的电压的这些噪声源通常称为“读出噪声”。
在存在读出噪声的情况下增加信噪比的一种方式是进行被称为“片上分区”的读出序列。在片上分区中，修改CCD阵列的读出序列。在该修改的序列中，读出电容器被预充电，并且随后CCD阵列被时钟驱动以使得来自多个相邻光电二极管的光电荷被移动到读出电容器中。读出电容器的电压的改变以及因此输出引脚与从多个光电二极管移动到读出电容器中的总光电荷成比例。因为来自多个像素的光电二极管电荷集中在一起，所以线性成像系统的空间分辨率减少，但是因为读出噪声在电压的改变通常增加的同时保持相对地恒定，所以信噪比通常得到改进。
片上分区可以通过控制CCD的读出引脚来完成。应当被控制用于片上分区的ToshibaTCD1205DG的读出引脚包括复位(RS)、升压(BT)、相位1和相位2。这可以在不显著增加1/f噪声(即，闪烁噪声)的情况下完成。
可变CCD时钟驱动
一些实施例的方面是改变线性CCD读出时钟的速度。这可以改进图像的信噪比。如上所述，存在损坏线性CCD阵列的输出放大器所呈现的电压的若干噪声源。噪声源中的两个是通常称为1/f噪声的闪烁噪声和白噪声。
许多成像CCD阵列实现了用于减少闪烁噪声的方法。该方法是将固定的预置电压施加到CCD阵列的读出电容器。成像系统将采样和存储从成像CCD阵列的输出引脚驱动出的预置电压的值。在测量预置电压之后，成像系统将操纵CCD信号来将CCD阵列中的一些光电荷移动到读出电容器中。在已经将光电荷移动到读出电容器中之后，成像系统将采样在CCDIC的输出处呈现的电压。从光电荷电压减去所测量和存储的预置电压。该减去意图移除闪烁噪声。
为了提供闪烁噪声的最大减少，有利的是在时间上尽可能一起地采样预置电压和光电荷电压。如果使用了片上分区，则分区应当尽快发生以便使得预置电压和光电荷电压在时间上尽可能接近地被采样。为了实现最大分区速度，使得CCD阵列中的光电荷移动到读出电容器的信号应当以高速率操作。在许多情况下，高速率是成像CCD阵列的数据表单中的最大推荐速率。快速分区的另一有益效果是读出时间的总体减少以及因此产生图像的总时间的总体减少。
第二读出噪声源是白噪声。白噪声具有在宽频率范围上的均匀噪声功率。减少读出噪声的一个方法是对CCD阵列的输出信号进行电性低通滤波。通过在采样之前适当地限制信号的带宽，在允许大多数信号被测量的同时可以摒弃大量白噪声。这有助于增加信噪比。低通滤波减少了来自CCDIC的向成像系统呈现的读出信号的转换速率(slewrate)。
为了准确地测量由CCD呈现的预置电压，应当操作CCD以使得它将其预置电压呈现在CCD的输出处，然后必须允许该预置电压穿过(propagatethrough)低通滤波器。在某个时间量之后，该预置电压将稳定在非常接近其最终值处。在该时间点，成像系统将采样预置电压并且将其存储以稍后移除闪烁噪声。在成像系统等待预置电压电平在白噪声移除低通滤波器的输出处稳定的同时，应当停止时钟驱动光电荷通过CCD阵列。在采样预置电压之后，成像系统将以高速率时钟驱动光电荷进入读出电容器以完成片上分区。在已经对像素进行分区之后，成像系统将停止操作CCD阵列的时钟信号。在CCD阵列的输出处的光电荷电压将被允许穿过白噪声移除低通滤波器直到电压稳定在其最终值的某一期望百分比内。在该点，成像系统将采样光电荷电压。
在一些实施例中实现的分区的方法导致至少三种CCD阵列时钟速率。存在未操作CCD时钟信号而预置电压稳定并且随后被测量的一种速率。存在以高速率操作CCD时钟信号以实现迅速片上分区的第二速率。并且存在暂停CCD时钟而已分区光电荷的光电荷电压稳定并且随后被测量的第三速率。结合像素片上分区的多个时钟输出速率可以最大化产生的图像的信噪比。
图8是根据实施例的处理的流程图。在操作801中，将发光介质放置在扫描装置的壳体内。在操作802中，在穿过发光介质的第一遍中关于发光介质在第一方向上移动图像传感器阵列，该图像传感器阵列具有适配为彼此同时检测光子的多个像素元件。在操作803中，在第一遍期间使用像素元件检测发光。在操作804中，在穿过发光介质的第二遍中关于发光介质在第二方向上移动图像传感器阵列，该第二方向与第一方向相反。在操作805中，将来自第一遍中的位置的像素读数与来自第二遍中的位置的像素读数组合。在操作806中，由来自第一和第二遍的所组合像素读数构成图像。
图9是根据实施例的处理的流程图。在操作901中，目标生物分子以空间模式(spatialpattern)固定到样本介质，该模式包括关于目标生物分子的标识的信息。在操作902中，以具有针对目标分子的结合亲和性的主探测生物分子来探测目标生物分子。在操作903中，以具有针对主探测生物分子的结合亲和性的次级探测生物分子来探测主探测生物分子，该次级探测生物分子具有通过基底生物分子的改变来触发生成可检测到的能量的酶活性，其中基底生物分子是用于次级探测生物分子的酶活性的基底。在操作904中，用电荷耦合器件(CCD)检测器在至少一个空间维度上扫描穿过样本介质，该CCD检测器在距样本介质1毫米和100毫米之间的固定距离扫描穿过样本介质。在操作905中，在第一遍中在至少一个空间维度上移动图像传感器阵列穿过样本介质。在操作906中，在第一遍期间通过图像传感器阵列读取发光。在操作907中，在第二遍中在至少一个空间维度上移动图像传感器阵列穿过样本介质。在操作908中，在第二遍期间通过图像传感器阵列读取发光。在操作909中，将在来自第一和第二遍的位置处采集的发光读数组合。在操作910中，根据在来自第一和第二遍的位置处采集的所组合读数构成图像。在操作911中，通过关联所检测的可检测到的能量与空间模式来确定目标生物分子的标识。
尽管以示例的方式并根据具体实施例描述了本发明，但是应当明白本发明不限于所公开的实施例。相反，本发明意图覆盖对于本领域技术人员显而易见的各种修改和类似布置。因此，所附权利要求的范围应当赋予最宽的解译以包含全部这样的修改和类似布置。

Claims (14)

1.一种用于扫描发光样本的发光扫描仪设备，所述设备包括：
样本床；
检测器条，配置为关于所述样本床移动，所述检测器条具有一个或多个图像传感器阵列，每一个图像传感器阵列具有多个像素元件；以及
与所述检测器条耦接的存储器装置以及处理器，其中所述处理器被编程为进行用于如下的操作：
在第一遍中关于所述样本床移动所述检测器条；
在所述第一遍期间在预定曝光时间上采集第一组像素读数，所述第一组的每一个像素读数出现在相应的x，y位置；
在第二遍中关于所述样本床移动所述检测器条，所述第二遍在与所述第一遍相反的方向上；
在所述第二遍期间在预定曝光时间上收集第二组像素读数，所述第二组的每一个像素读数出现在相应的x，y位置；以及
使用所述处理器将在所述第一和第二组像素读数之间的相应的x，y位置像素读数求和以构成图像。
2.根据权利要求1所述的设备，进一步包括：
所述样本床上的发光样本，所述发光样本具有随着时间改变的发光，将所述第一和第二组像素读数之间的相应位置像素读数求和补偿所述发光样本的改变的发光。
3.根据权利要求1所述的设备，其中所述存储器装置具有进一步指令用于：
使用求和将所述第一和第二组像素读数之间的相应位置像素读数求平均以构成所述图像。
4.根据权利要求1所述的设备，其中所述第一和第二组像素读数的预定曝光时间是0.5秒。
5.根据权利要求1所述的设备，其中所述样本床包括可移除的孔板。
6.根据权利要求1所述的设备，进一步包括：
梯度折射率GRIN透镜阵列，布置在所述样本床和所述一个或多个图像传感器阵列之间，所述GRIN透镜阵列具有大于或等于0.10的工作数值孔径NA，
其中所述GRIN透镜阵列配置为与所述检测器条一起移动。
7.根据权利要求1所述的设备，其中所述一个或多个图像传感器阵列包括电荷耦合器件CCD图像传感器阵列。
8.根据权利要求7所述的设备，其中所述CCD图像传感器阵列集成在集成电路IC中，所述设备进一步包括：
电路，适配为将来自相邻CCD光电二极管的多个光电荷集中到所述CCD图像传感器阵列的读出电容器中，
由此增加所述CCD图像传感器阵列的信噪比。
9.根据权利要求1所述的设备，其中所述检测器条包括沿着所述检测器条关于彼此交错的多个线性图像传感器阵列集成电路IC。
10.根据权利要求1所述的设备，进一步包括：
第二检测器条，包括一个或多个图像传感器阵列，所述第二检测器条配置为关于所述样本床移动，
其中所述检测器条配置为扫描所述样本床的不同的非重叠区域；以及
其中所述处理器被编程为进行用于如下的进一步操作：
根据来自所述检测器条的像素读数构成所述图像。
11.根据权利要求1所述的设备，其中所述检测器条配置为被移动并且所述样本床配置为物理地静止。
12.根据权利要求1所述的设备，其中所述检测器条配置为物理地静止并且所述样本床配置为被移动。
13.根据权利要求1所述的设备，其中所述存储器和处理器包括专用硬件或固件电路。
14.根据权利要求1所述的设备，其中所述存储器和处理器包括通用处理器。
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