JP6161072B2 - 多チャンネル式化学発光計測システム - Google Patents

Description

本発明は、多数の生体由来の体液や環境サンプル中におけるホルモンや化学物質の分析を行う際に便利に使える多チャンネル式化学発光計測システムに関するものであり、特に多様な化学発光サンプルチューブに対応可能としたものである。

体液や環境サンプル中におけるホルモンや化学物質の分析のために様々なバイオアッセイ技術が開発されている。例えば、レポータージーンアッセイ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）、ツーハイブリットアッセイ（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ）、酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射免疫アッセイ（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）等が知られている（非特許文献１、２参照）。
また、その他のバイオアッセイとして、通常「分子イメージングプローブ」を用いるアッセイ法が広く使われている。例えば、細胞内での蛋白質−蛋白質相互作用を発色でイメージングする方法であり、非特許文献３等の蛍光蛋白質間蛍光共鳴エネルギー転移を利用したフレート法（ＦＲＥＴ）、非特許文献４等の蛍光蛋白質や発光蛋白質を２分割し、その蛋白質断片間の再結合による発光回復を特徴とする２分子型自己相補法（２−ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｆｏｒｍａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ-ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＰＣＡ））等が知られている。
一方、本発明者らは、既に、非特許文献５等の蛋白質組継ぎ反応を用いたアッセイ法（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓｓａｙ （ＰＳＡ））以外にも非特許文献６及び特許文献１等の一分子型生物発光プローブ（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｆｏｒｍａｔ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ；又は簡単にｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｐｒｏｂｅ）のような単一分子内蛋白質−蛋白質間の相互作用の検出法を開発している。更にその派生手法として、非特許文献７及び特許文献２等の発光酵素の遺伝子配列を円順列置換（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）したことを特徴とする生物発光プローブも開発している。更に、非特許文献８及び特許文献３等の発光酵素に人為的な歪みをかけることによって起こる酵素活性の相違を指標とした分子歪みセンサー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｎｓｉｏｎ−ｉｎｄｅｘｅｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ）も開発している。更に最近では、非特許文献９等のレポータージーンアッセイと一分子型生物発光プローブを合体した多重リガンド認識型生物発光プローブ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−ｔｙｐｅ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ）を開発し、このプローブは、一つの検量物質に対して２回センシングすることを特徴とする。更に、特許文献４等の２色の一分子型生物発光プローブを組み合わせることによって「マルチカラー生物発光イメージングプローブセット」を開発し、このプローブは、検体の多面的な生理活性の多色イメージングできることを特徴としている。

国際公開ＷＯ２００８／０８４８６９号公報 米国特許公開２００９−０２６９７８１号公報 特開２０１１−０６７１９０号公報 米国特許公開２００９−０１２３９５４号公報 特開２０１２−４７７１９号公報 特開２０１０−４４００１号公報 特開平１１−２７１２２７号公報 特願２０１２−１７９５９７号

Ｓ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｔａｏ，ａｎｄ Ｙ．Ｕｍｅｚａｗａ ｅｄｓ．，"Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ"，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒ．Ｊｅｌｉｎｅｋ，ｐ．２９９．（（２００９）（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））． Ｗ．Ｌｉ ａｎｄ Ｎ．Ｂ．Ｃａｂｅｒｏｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８５（４），９０９（２０１０） Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ｔ．Ｎａｇａｉ，ａｎｄ Ｈ．Ｍｉｚｕｎｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ． ７（５），５５７（２００３）． Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｐ．Ｈ．Ｅａｒ，Ｃ．Ｌａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７０，３３５（２０１０）． Ｓ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １０１（３２），１１５４２ （２００４）． Ｓ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｏｔａｎｉ，Ｙ．Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７９（１３），４８２０（２００７）． Ｓ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓａｔｏ，ａｎｄ Ｈ．Ｔａｏ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １９（１２），２４８０（２００８）． Ｓ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓａｔｏ，ａｎｄ Ｈ．Ｔａｏ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２０（１２），２３２４（２００９）． Ｓ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｔａｋｅｎａｋａ，ａｎｄ Ｍ．Ｔｏｒｉｍｕｒａ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２２（９），１８３５（２０１１）．

上記のバイオアッセイは、その発光信号によって、（１）蛍光物質（蛍光蛋白質を含む）を用いる方式と、（２）化学発光（ルシフェラーゼなどの生物発光を含む）を用いる手法の２種類に大別される。（１）の蛍光物質（蛍光蛋白質を含む）を利用する場合には、自己蛍光が酷いためバックグラウンドが非常に高くなることに加え、外部光源が必要である（特許文献５〜７等参照）。従って蛍光を測定するためには精密な分光フィルターを取り付ける必要があり、比較的大型の発光検出器（例、蛍光顕微鏡等）が必要であるなど（非特許文献５参照）、簡易診断やオンサイト分析に不向きであった。
一方、（２）の化学発光を用いる手法は、前述した問題はないが、蛍光に比べて微弱光であり、光を発するためには基質を要する問題点があった。特に、化学発光の一種である生物発光の場合には「酵素」に依存するため、塩濃度、温度、ｐＨ、重金属イオンの濃度等によっても発光強度が容易に変動する問題がある。また、化学発光は基質導入後、直ちに輝度を落としてしまうため（発光安定性が悪いため）、多数のサンプルを計測する場合に最初のサンプルの測定時と最後のサンプル測定時に時差が生じるため、正確な測定が不可能であった。
また、多数のサンプルを測定する際、従来法では個々のサンプルの取り扱いが難しく、各サンプルを毎度受光部に差し込まなければならないなど、人為的な操作ミスの可能性と測定の煩雑さが問題であった。
従来のルミノメーターを用いた発光サンプルの測定は、光点という概念が用いられていた。即ち、発光サンプルを一つの光点だと想定し、その光点に合わせて機械的な設計がなされてきた。ところが、発光サンプルの実態は溶液であり、溶液量もサンプルによってまちまちであるため起こる機械設計と実態のミスマッチも無視できない問題点である。
既製の多チャンネル理化学装置や製品（例、９６穴プレート（８×１２）、８チャンネルピペット、ＰＣＲチューブ、６チャンネルマイクロスライド（特許文献８参照）など）は、サンプルチューブ間距離が全て９ｍｍのピッチに規格統一されている。しかしながら市販の何れの分光装置もこのような規格に対応しながら多サンプル同時測定ができるものはなかった。したがって、従来の化学発光測定において、多サンプル同時計測のニーズがあった場合、１サンプルの発光顕微鏡観察、ルミノメーターによる１サンプルずつの計測、マイクロプレートリーダーによる順次１サンプル測定（即ち、９６穴プレートを少しずつ動かして順次に１回・１サンプル測定を行う）を行うほかなく、この光計測手段の不備により、多数のサンプルを計測する場合に最初のサンプルの測定時と最後のサンプル測定時に時差が生じるため正確な測定が不可能であった問題点、多サンプルを取り扱う人為的ミスや煩雑さの問題、従来の計測械は発光サンプルを光点と見做したために起こる不正確さ（従って、１サンプルに付き多点集光が理想的）、多チャンネル規格に対応できる分光器が不在だった。
また、従来の二大発光測定装置であるルミノメーターの問題点（感度は良いが、サンプル処理能が悪い）とマイクロプレートの問題点（サンプル処理能が良いが、感度が悪い）も解決する必要がある。
また、最近では９６穴プレート上の発光を「カメラ撮影技術」により同時計測する手法が開発されており、多数の蛍光や発光サンプルの同時計測ができるようになった（ＦＤＳＳ／μＣＥＬＬ、浜松ホトニクス社製）。ところが、このシステムは効率的な集光システムが不在のままカメラ撮影をするものであり、本発明でいうサンプルのキャップ側面保持・同時ハンドリングシステムとは大きく異なり、大型装置で装置価格も高額である。
本発明は、従来の化学発光における前述した様々な問題点を解決または軽減しつつ、高い感度で使用上の便利性、高速サンプル処理能、分光能を持ち合わせた発光測定装置の開発とともにそれを実現するための効率的な集光光学系、クロストークを遮断する壁面とミラー状の内面を持つキャップを含むサンプル導入システム、その装置を統合的に制御するソフトウェアシステムの構築を実現することを目的とする。

上記問題点を解決するために、本発明の多チャンネル式化学発光計測システムは、化学発光（生物発光を含む）の高いシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の利点を生かしつつ、光ファイバーを用いて多点・多サンプル同時計測するとともに、多チャンネルマイクロスライドに対しては各チャンネル間の光干渉を遮断しかつ集光部に反射するミラー式蓋となり、サンプルチューブに対してはミラー式蓋の横からの穿孔に多連あるいは単独のサンプルチューブを挿入・保持する独特なサンプル導入部を有するミラー式穿孔キャップを核心技術要素としつつ、それを支える便利なデータ制御システム（加電圧制御、網羅的信号処理など）により構成される。この構成により多サンプルの光を高感度・高速（高サンプル処理能）で同時計測を実現したものである。
詳述すれば、多数の化学発光サンプル（８連チューブ等）の化学発光信号を最大限高感度に測定するために、まずミラー式穿孔キャップの穿孔に８連チューブを差し込み、そのキャップを光検出部に載せる方式を採用しているため、化学発光信号が逃されずミラー式穿孔キャップに反射されて下部の光検出部に集光される特徴があり、キャップの穿孔に横からの挿し込みによるサンプルの取り扱いの便利さと精度の向上を実現した。
また、サンプルから出る発光を、一サンプルあたり３地点から集光し平均化するように集光用の光ファイバーを構成すれば、サンプルの３回同時測定の効果も実現できた。
また、化学発光受光部と多チャンネルホトマルの受光部の両者間を、光ファイバーを用いて連結することにより、化学発光受光部を囲碁盤様に羅列し、その間隔が多様な化学発光サンプルチューブ（汎用の８連ＰＣＲチューブ、マイクロチューブ、多チャンネルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製の６チャンネルマイクロスライドなど）に対応できるように工夫した。
また、多チャンネル・複数地点の化学発光信号に対してホトマルが同一感度で応答できるように、まずそれぞれのチャンネルごとの加電圧の微調整が独立してできるように構成するとともに、さらに網羅的な電圧調製・データ処理ができるように制御システムを構築した。

すなわち、本発明は、化学発光サンプル測定基盤に設けた多チャンネルの受光部と、多チャンネルの受光部毎に光ファイバーで接続された多チャンネルホトマルと、多チャンネルホトマルを統括的に制御する制御手段と、前記化学発光サンプル測定基盤の上部に設けた多チャンネルの受光部を覆う多チャンネルミラー式穿孔キャップを備えた多チャンネル化学発光計測システムであって、前記多チャンネルミラー式穿孔キャップには前記化学発光サンプル測定基盤の多チャンネルの受光部それぞれに対向する空洞が穿たれるとともに空洞間には隔壁が設けられており、前記多チャンネルミラー式穿孔キャップの横面から各空洞に貫通する穿孔が設けてあり、前記多チャンネルの受光部のピッチと前記空洞のピッチと前記穿孔のピッチは、多連ＰＣＲサンプルチューブ及び多チャンネルマイクロスライドの共通のピッチに設計されており、前記空洞は多チャンネルマイクロスライドをチャンネル毎に収容可能に形成され、前記穿孔は多連ＰＣＲサンプルチューブを挿入保持可能に形成されていることを特徴とする。
また、本発明は上記多チャンネル化学発光計測システムにおいて、前記隔壁及び前記穿孔の壁面はミラー状であることを特徴とする。
また、本発明は上記多チャンネル化学発光計測システムにおいて、前記多チャンネルミラー式穿孔キャップの前記穿孔を設けた横面と対向する横面を平面に形成し、当該対向する横面が底となるようにミラー式穿孔キャップを水平面上に載置した状態でも前記穿孔で多連または単独のＰＣＲサンプルチューブを挿入保持できるようにしたことを特徴とする。
また、本発明は上記多チャンネル化学発光計測システムにおいて、前記受光部はチャンネル毎に複数地点で測定することを特徴とする。
また、本発明は上記多チャンネル化学発光計測システムにおいて、前記制御手段はパソコンであることを特徴とする。

本発明の多チャンネル式化学発光計測システムによれば、従来のルミノメーターや分光光度計がもつサンプル処理能の問題点を克服し、従来の９６穴プレートリーダーではできない多点集光・多サンプル同時測定ができ、それから出る多数の信号の同時取得・制御・処理ができ、かつ、多サンプルの取り扱いの便利さを極めたミラー式穿孔キャップによりＰＣＲサンプルチューブ及び多チャンネルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製６チャンネルマイクロスライド）や８チャンネルピペット等のチャンネル間のピッチは全て９ｍｍのピッチに規格統一されているので、多連及び単独のサンプルチューブと多チャンネルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製の６チャンネルマイクロスライド等）とに兼用できる化学発光計測用の光検出システムを提供できる。
また、本発明によれば、各チャンネル間の時差なしに信頼性の高い化学発光の同時計測ができ化学発光信号の経時減少も最小限に抑えることができ、従来にない簡便で、高感度、高サンプル処理能を持ち、高集光能を持つものであって、そのため、従来の発光計測装置にない高いサンプル処理能、利便性、精密な化学発光測定手段を提供できる。また本発明によれば、ミラー式穿孔キャップにより多様なサンプルチューブをそのまま使用可能な許容範囲の広いサンプル導入部を実現したので、幅広い光計測ニーズに対応でき、簡便で信頼性が高く、アッセイ準備・操作時間の短縮、高感度測定によるサンプル量の少量化、高いサンプル処理能を実現できた。

図１は本発明の多チャンネル式化学発光計測システムで用いるミラー式穿孔キャップの構造の一例（８チャンネル式）を示した図である。 図２は図１で示した８チャンネル式のミラー式穿孔キャップの使用例を説明した図であり、（ａ）は、８チャンネル式のミラー式穿孔キャップに単独のマイクロチューブ（２００μＬ）を挿入した例、（ｂ）は８チャンネル式のミラー式穿孔キャップに８連ＰＣＲチューブを挿入した例、（ｃ）は８チャンネル式のミラー式穿孔キャップを６チャンネルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製）にかぶせる例を説明した図である。 図３は本発明の多チャンネル式化学発光計測システム本体の一例を示した図であり、（Ａ）は発光サンプル測定基盤（図は８チャンネル式で８つのチャンネル毎に３地点で集光）を示した図であり、（Ｂ）は発光サンプル測定基盤（裏面）とホトマル受光面側とを光ファイバーで連結固定する構造を示した図であり、（Ｃ）は本発明の多チャンネル式化学発光計測システム本体の外観を示した図である。 図４は多点同時計測による発光強度と変動係数（ＣＶ値）の相違を説明するための図である。（Ａ）は光源に対して１点、２点、３点集光する場合の概念説明図。（Ｂ）はチャンネル１における１点、２点、３点集光測定による輝度の相違。（Ｃ）はチャンネル１と２におけるＣＶ値の相違。１点、２点、３点集光することによりＣＶ値が減少する傾向があり、「sat」は上限値を意味する。 図５は本発明の発光サンプルに対する８チャンネル式化学発光計測システムの統括制御のためのソフトウェア画面を示した図である。 図６は本発明の発光サンプルに対する８チャンネル式化学発光計測システムの応答を検証した図であり、（Ａ）は選択的な光の反復照射による発光信号の変動例（ＣＨ８参照）、（Ｂ）はパルスゼネレーターによる光照射に対する発光信号の選択的な変動例（ＣＨ５参照）である。 図７は同一発光サンプルに対する測定時間と精度の比較を示した図であり、同一発光サンプル（７２個）の発光に対して、それぞれルミノメーター、９６穴プレートリーダー、本発明の８チャンネル式化学発光計測システム（８連チューブを８チャンネルのミラー式穿孔キャップの穿孔に挿入保持）で測定を行った結果である。 図８は本発明の８チャンネル式化学発光計測システム（６チャンネルマイクロスライドの上を８チャンネルのミラー式穿孔キャップで覆う）を用いることによる生細胞発光の測定例を説明するための図であり、（Ａ）は発光カプセルの分子構造を示し、ＳＰは分泌シグナル、ＤＥＶＤはカスパーゼ３の基質ペプチド、ＭＬＳは膜局在シグナルをそれぞれ意味しており、（Ｂ）は発光カプセルの作動メカニズムを示しており、（Ｃ）はスタウロスポリン（ＳＴＳ）無し（灰色バー）に比べて有り（黒バー）の条件で発光輝度の相違が確認できた測定結果を示すものである。

本発明の多チャンネル式化学発光計測システムは、従来のルミノメーターや分光器では今までできなかった、多サンプルから出る化学発光を多点で同時測定するものであり、この目的を達成するために多チャンネルミラー仕様の穿孔キャップを用いて多サンプルの保持・同時操作と反射面による効率的な集光、一サンプルに対する光ファイバーを用いた多点受光式光学系と網羅的な同時データ処理が可能なソフトシステムを組み合わせたことを特徴としている。多チャンネルミラー式穿孔キャップの採用により多連或いは単独のサンプルチューブと多チャンネルマイクロスライドとに兼用とすることができる。
本発明の多チャンネル式化学発光計測システムは以下のような化学発光、生物発光を出すバイオアッセイへの応用が想定できる。昆虫由来の発光酵素からの生物発光を用いたＡＴＰ測定法（雑菌測定）、酸化ラジカルの発光測定法、ルミノールの酸化を含む化学発光サンプルの測定法、レポータージーンアッセイ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）、ツーハイブリットアッセイ（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ）、タンパク質相補法（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、インテインを介したタンパク質スプライシング法（ｉｎｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓｓａｙ）、一分子型生物発光プローブ法（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｐｒｏｂｅ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）、二分子型生物発光プローブ法（ｔｗｏ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｆｏｒｍａｔ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）を行う際に利用できる。
例えば、レポータージーンアッセイを行う際、市販の６チャンネルのマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製）上のレポーター発現ベクターを持つ真核細胞を培養しリガンド刺激を行い、レポーター蛋白質の細胞内蓄積を待つ。その後、基質を添加することによって生細胞が発光することから、本発明の多チャンネル式化学発光計測システムのミラー式穿孔キャップを用いて生きた細胞のままで効率的に光測定すればよい。
また、前記細胞を細胞溶解液で溶解した後、細胞ライセットを市販の２００μＬチューブやＰＣＲチューブに入れて測定すればよい。
また、一分子型生物発光プローブを用いる場合、市販の６チャンネルのマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製）上の細胞を培養し一分子型生物発光プローブを発現させ、当該細胞にリガンド刺激を行う。リガンド刺激後、基質を添加することによって細胞を発光させ、本発明の多チャンネル式化学発光計測システムを用いることにより多数のサンプルからの発光を多点・同時で光測定すればよい。

本発明の多チャンネル式化学発光計測システムとミラー式穿孔キャップを用いた多数の化学物質やホルモン、薬剤候補物質、毒性物質などのスクリーニングについて以下に説明する。
多数のリガンド活性の測定は、通常の生物発光アッセイに準じて実施すればよく、特に制限なく従来のプロトコルが適用できる。
ＰＣＲチューブやマイクロスライド上で培養した多数の細胞にそれぞれ化学物質やホルモン、薬剤候補物質、毒性物質などをマルチチャンネルピペットを用いて操作すればよくて、それから出る発光値を本発明の多チャンネル式発光測定システムとミラー式穿孔キャップを用いることにより寸時に計測すれば良い。
また、発光の分別のためには、それぞれの目的に合致する光学フィルターを検出部に構えることにより、発光の中でも特に関心のある波長の光を選別して測定することも可能である。このような光学フィルターを用いることにより、発光サンプルのマルチカラー測定を行えば良い。

これらのバイオアッセイの対象となる被検物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、生物活性を持つホルモンやホルモン様化学物質、生理活性を持つ重金属イオン、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被検物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６００４６１７号；５９８５３６５号を参照）。さらには、市販のライブラリー（例えば、米国ＣｏｍＧｅｎｅｘ社製、ロシアＡｓｉｎｅｘ社製、米国Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．社製、ロシアＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ社製、米国３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製などのライブラリー）を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、本プローブを発現する細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。

次に、本明細書で用いる用語、概念について説明する。
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ， "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ｔｏ４，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ ｅｄ．，"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．，"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｂ）＆１０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）； Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．，"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"， Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｅ）＆１５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース
（ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）
から入手することができる。

図１、２は本発明の多チャンネル式化学発光計測システムで用いる多チャンネルのミラー式穿孔キャップの一例を説明した図であり、図３に示した本発明の多チャンネル式化学発光計測システム本体の発光サンプル測定基盤の上に蓋をした状態で多チャンネル同時計測を実施するものである。図１〜３で図示したものは８チャンネル式の例であるが、汎用の８連チューブ、市販の６連マイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製等）、汎用の２００・Ｌマイクロチューブなどに対応させるのに好適なように８チャンネルとしたものであり、必ずしも８チャンネルである必要はなく、チャンネル間のピッチを市販の多連チューブ、市販の多チャンネルマイクロスライド等に共通のピッチで構成しておけば汎用性が保たれる。したがって、本明細書中で用いる用語「多チャンネル」とは、「Ｎチャンネル（Ｎは２以上の自然数）」を意味するものである。
図１に、本発明の多チャンネルミラー式穿孔キャップの一例として８チャンネル式の構造を示す。図において、８チャンネルのミラー式穿孔キャップには８個の空洞が設けられ、各空洞は、図３の多チャンネル式化学発光計測システム（図では８チャンネル式）の発光サンプル測定基盤に蓋をしたとき、発光サンプル測定基盤側の各チャンネル（Ｃｈ１〜Ｃｈ８）に対向するように形成され、各空洞間のピッチと発光サンプル測定基盤側の各チャンネル間のピッチとは何れも、汎用のＰＣＲサンプルチューブ及び多チャンネルマイクロスライドや８チャンネルピペット等のチャンネル間のピッチと共通の９ｍｍのピッチで形成されている。各空洞間には隔壁を設けてチャンネル間でのクロストークを防止し、空洞内壁はミラー状で上部に逃げようとする化学発光の光を下部に集光させる構造を備えている。さらに、ミラー式穿孔キャップには横面から穿孔が設けてあり、各穿孔のピッチは前記空洞のピッチと同じであり、各穿孔は発光サンプル測定基盤に蓋をしたときにやや下向きになるように穿たれ（図では１５°の先下り傾斜）、穿孔の先は空洞に貫通しており、穿孔にサンプルチューブを挿入保持したとき、サンプルチューブの発光部が空洞内に位置する構造であり、また、穿孔内壁はミラー状に形成されており空洞内壁と同様に上部に逃げようとする化学発光の光を下部に集光させる構造である。
図２は８チャンネルのミラー式穿孔キャップの使用例を説明するための図で、（ａ）は８チャンネルのミラー式穿孔キャップの穿孔に単独のマイクロチューブを２個挿入した例、（ｂ）は８チャンネルのミラー式穿孔キャップの穿孔に８連ＰＣＲチューブを挿入した例、（ｃ）は８チャンネルのミラー式穿孔キャップの空洞に６チャンネルマイクロスライドを挿入した例を示している（６チャンネルマイクロスライドに対しては両端の２つを除いた中寄りの６つの空洞が対応する）。このように、８チャンネルのミラー式穿孔キャップを用いることにより、単独のマイクロチューブ・８連ＰＣＲチューブ・６チャンネルマイクロスライドに対して対応することができ、さらに、その各チャンネル間は壁面により隔たれているため、相互サンプル間のクロストークが殆どなく、ミラー状の壁面によりサンプルから出る発光を効率的に集光できるものである。
また、８チャンネルのミラー式穿孔キャップにおいて穿孔を設けた横面と対向する横面を図１のごとく平面にしておけば、当該対向する横面が底となるようにミラー式穿孔キャップを水平面上に載置した状態でも穿孔で単独のマイクロチューブ及び８連ＰＣＲチューブを挿入保持することができ、例えばこの状態での８チャンネルピペットによる注液等の操作も可能となる。

図３は本発明の多チャンネル式化学発光計測システム本体の構成の一例を示したものであり、（Ａ）は発光サンプル測定基盤（図は８チャンネル式でチャンネル毎に３地点で集光）の構造を示したものであり、（Ｂ）は発光サンプル測定基盤の裏側とホトマル受光部側とを連結する光ファイバーを示したものであり、図示の例では、各サンプルに対して３地点集光ができるように、８つのチャンネル毎に発光サンプル測定基盤とホトマル受光部間を３本の光ファイバーで連結した構成となっており、（Ｃ）は本発明の一例である８チャンネル式化学発光計測システム本体の全体を外観した図である。
発光サンプル測定基盤の８つのチャンネルのピッチは、ミラー式穿孔キャップの空洞及び穿孔と同じく、汎用のＰＣＲサンプルチューブ及び多チャンネルマイクロスライドや８チャンネルピペット等のチャンネル間のピッチと共通の９ｍｍのピッチで形成されており、化学発光計測時には発光サンプル測定基盤の上は８チャンネルのミラー式穿孔キャップで覆われ、各チャンネル間はミラー式穿孔キャップの壁面により隔たれているため、相互サンプル間のクロストークが防止できる。また８つのチャンネル毎に３地点集光のできるように光ファイバーを設置したため、単一サンプルに対して３地点集光による平均値などが反映できるように工夫されている。このような構成により発光サンプル測定基盤の上に多数サンプルの同時・多点計測が実現できる。
図４に、多点同時計測の利点を示すために、発光サンプル測定基盤とホトマルの受光部を繋げる光ファイバーの本数を１本（一点集光）、２本（２点集光）、３本（３点集光）に変えることによる発光値の相違とその変動係数（ＣＶ）を測定した結果を示す。まず光源（ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ）として発光パルスゼネレーター用いたパルス光を産生し、図４（Ａ）に示すように、その光パルスに対して１点集光した場合（他の２点は遮光する）、２点集光した場合（他の１点は遮光する）、３点集光（全部開光する）した場合において、ホトマル側で受けたそれぞれの光の強度（図４（Ｂ）参照）とＣＶ値（図４（Ｃ）参照）を計測した。その結果、図４（Ｂ）によれば、チャンネル１位置（Ｃｈ１）における発光輝度は１、２、３点集光順に上がることが分かった。また、図４（Ｃ）によれば、ＣＶ値も３点集光の場合が少ないこと（精度が良い）が分かった。隣のチャンネル２位置（Ｃｈ２）においても同様の傾向が観察できた。ここでＣＶ値は、変動係数（ＣＶ）＝標準偏差／平均値として求めた。
なお、上記説明では光ファイバーによるものを例示したが、光ファイバーの束ともいえるファイバーオプティックプレート（ＦＯＰ）を用いても同様の装置を構築することができ、例えば、ＦＯＰを加工して発光サンプル測定基盤とホトマルの受光部を繋げることによっても同様に多チャンネル同時光計測が感度良く実現できる

図５、図６は、本発明の多サンプル・多点同時計測を支える信号処理系として、８チャンネル式ホトマルとそれに対応する独自の信号処理システムを説明するための図である。
まず、図５は、同じ発光サンプルに対して同一信号が得られるように各チャンネルの加電圧を統括して調整ができるようにしたソフトウェア画面の一例を示したものである。８チャンネルの化学発光計測システムで得られた測定結果をＡ／Ｄコンバーターで同時処理しパソコンにオンライン転送する構成とし、また、携帯性と省エネ性を実現するためにパソコンのＵＳＢ３．０電源で全て作動できるように電源ラインを調製した。また多用な発光サンプルに対して光検出ができるように発光サンプリング速度を１万回−１００万回に幅広く調整できる構成とした。
次に、図６は、このように構築された８チャンネル式化学発光計測システムが正常に作動することを確認するために、任意の光源に対する各発光チャンネルの応答を確認した結果を示したものである。まず、チャンネル８位置のみに光を加える操作で反復的に発光信号が上下することが図６（Ａ）で確認でき、また、チャンネル５に対してパルスゼネレーターを照射したところ、チャンネル５だけが反復して強く反応していることが図６（Ｂ）で確認できた。なお、このような８チャンネル間の発光測定値の統括は、上記した図５のソフトウェア画面上での加電圧調整により行うことができる。

（測定例１：８連ＰＣＲサンプルチューブの測定例）
図７は、本発明の多チャンネル化学発光計測システムを用いた場合と、従来のルミノメーターによる場合及び９６穴プレートリーダーを用いた場合とで、発光サンプルの測定時間等を比較した図である。
まずＣＯＳ−７細胞を９６穴プレートに培養し、各ウェル上の細胞に本発明者の既開発のストレスホルモン感受性を持つ一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを、脂質導入試薬（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１）を用いて導入した。プラスミドを導入した２４時間後に市販の細胞溶バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞ライセットを作った。８チャンネル式マイクロピペットを用いて各ウェル上の細胞ライセット１０μＬを８連チューブに入れ、８チャンネル式マイクロピペットを用いて４０μＬのセレンテラジン入りの基質溶液を同時に付加し発光させ、本発明の８チャンネル化学発光計測システムで光測定を行った（８連チューブを８チャンネルのミラー式穿孔キャップの穿孔に挿入保持）。
一方、同様の条件で光測定時間を比較するために前記同様の細胞ライセットを９６穴プレートに１０μＬずつ移し、基質導入インジェクターが付いているコロナ電気のマイクロプレートリーダー（ＳＨ−９０００ｌａｂ）を用いて自動基質導入モードで光測定を行った。
また、同様の条件で光測定時間を比較するために、既存のルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ２０／２０ｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、同じ発光サンプル１０μＬの光測定を行った。
それらの結果をまとめたものが図７である。同一発光サンプルに対する測定時間は、ルミノメーターでは２１分、９６穴プレートリーダーでは５分、本発明のシステムでは３分が所要された。また発光測定値の標準偏差値（ＳＤ）は、ルミノメーターでは０．３４、９６穴プレートリーダーでは０．５３、本発明のシステムでは０．１１を示した。この結果によれば、本発明のシステムではルミノメーターの３倍の精度、９６穴プレートリーダーの５倍の精度で発光測定が可能であることを示しており、また、測定時間も本発明のシステムではルミノメーターの１／６、９６穴プレートリーダーの約１／２の測定時間で測定できることが確認できた。

（測定例２：６チャンネルマイクロスライドの測定例）
図８に、本発明の多チャンネル化学発光計測システムを用いた測定例を示す。
まず、市販の細胞培養用の６チャンネルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ社製）にサル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞を植え、６チャンネルマイクロスライド面積の９割が細胞に埋まるまで細胞を培養した。その細胞に図８（Ａ）で示す生物発光カプセルをコードするプラスミドを遺伝子導入し、更に２４時間培養した。その後、培地を除き、このバッファーには、スタウロスポリン（ＳＴＳ；最終濃度：１０μＭ）有り又は無しのＨＢＳＳバッファー（基質（セレンテラジン）は同量含有）に交換した。このバッファー交換後の２分、１０分、１５分時点で６チャンネルマイクロスライドからでる生物発光を、本発明の８チャンネル化学発光計測システムで測定した（６チャンネルマイクロスライドの上は８チャンネルのミラー式穿孔キャップで覆う）。
ＳＴＳ無しの条件では、発光カプセルが細胞膜に局在し、ＳＴＳ刺激有りの条件では発光酵素がカスパーゼ３により切り出される（図８（Ｂ）参照）。このメカニズムによりＳＴＳ有り無しの条件に依存して発光輝度の相違が発生する。
その結果、図８（Ｃ）で示すようにＳＴＳ依存的は発光輝度の相違が観察できた。

Claims (5)

1. 化学発光サンプル測定基盤に設けた多チャンネルの受光部と、多チャンネルの受光部毎に光ファイバーで接続された多チャンネルホトマルと、多チャンネルホトマルを統括的に制御する制御手段と、前記化学発光サンプル測定基盤の上部に設けた多チャンネルの受光部を覆う多チャンネルミラー式穿孔キャップを備えた多チャンネル化学発光計測システムであって、
   前記多チャンネルミラー式穿孔キャップには前記化学発光サンプル測定基盤の多チャンネルの受光部それぞれに対向する空洞が穿たれるとともに空洞間には隔壁が設けられており、前記多チャンネルミラー式穿孔キャップの横面から各空洞に貫通する穿孔が設けてあり、
   前記多チャンネルの受光部のピッチと前記空洞のピッチと前記穿孔のピッチは、多連ＰＣＲサンプルチューブ及び多チャンネルマイクロスライドの共通のピッチに設計されており、前記空洞は多チャンネルマイクロスライドをチャンネル毎に収容可能に形成され、前記穿孔は多連ＰＣＲサンプルチューブを挿入保持可能に形成されていることを特徴とする多チャンネル化学発光計測システム。
2. 前記隔壁及び前記穿孔の壁面はミラー状であることを特徴とする請求項１記載の多チャンネル化学発光計測システム。
3. 前記多チャンネルミラー式穿孔キャップの前記穿孔を設けた横面と対向する横面を平面に形成し、当該対向する横面が底となるようにミラー式穿孔キャップを水平面上に載置した状態でも前記穿孔で多連または単独のＰＣＲサンプルチューブを挿入保持できるようにしたことを特徴とする請求項１または２記載の多チャンネル化学発光計測システム。
4. 前記受光部はチャンネル毎に複数地点で測定することを特徴とする請求項１ないし３の何れかに記載の多チャンネル化学発光計測システム。
5. 前記制御手段はパソコンであることを特徴とする請求項１ないし４の何れかに記載の多チャンネル化学発光計測システム。
   
   

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