SE433169B - Forfarande for framstellning av vattenlosningar eller suspensioner av liposomer - Google Patents

Description

l0 40 vsoszss-5 oz Den vattenfas, i vilken liposomerna är i lösning eller i suspension, skiljer sig vanligtvis från den vattenfas, som befinner sig på insidan därav. Således repre- senterar framställningen av liposomer en mycket praktisk inkapslingsmetod för in- fångning av en vattenhaltig vätska och dessa kulor eller blåsor är särskilt använd- bara för införande av biologiskt aktiva substanser i levande organismer, särskilt läkemedel, varvid en tidig nedbrytning därav undvikes (exempelvis av magsaften) innan dessa substanser har möjlighet att nå det specifika organ, som skall behand- las. Genom ett riktigt val av föreningen eller föreningarna ensamma eller tillsam- mans med andra ytaktiva medel ZW där Z har samma betydelse som X och N har samma betydelse som Y, XY för erhållande av liposomväggarna, är det på ett effektivt sätt möjligt att bilda liposomer med väggar, som motstâr inverkan av specifika katego- rier av organiska fluider och som upplöses endast av de medier, som förekommer i . organen, där de biologiskt aktiva substanserna mäste frigöras. Följaktligen inne- håller i allmänhet liposomerna i sitt inre en vattenlösning av den inkapslade pro- dukten och för att bilda själva liposomlösningen upplöses dessa eller dispergeras i vatten eller i någon annan vätskefas, exempelvis i en vattenlösning av natriumklo- rid av isotonisk koncentration.

Det må även beaktas, att innehållet i liposomerna enligt föreliggande upp- finning icke är begränsad till läkemedel och andra biologiskt aktiva föreningar, utan omfattar även andra vattenlösliga material. Som exempel på sådana andra material kan följande nämnas: färgämnen, parfymer, smak- eller aromämnen, eller allmänt be- ståndsdelar, som skall användas vid specifika industriella processer eller i kompo- sitioner, men vilka skall frigöras med viss fördröjning relativt deras ursprungliga tillsats, eller användas progressivt under tidens lopp. Det skulle därför vara fel- aktigt att ange, att liposomer endast är farmaceutiska produkter per se, fastän de, såsom nämnts ovan, kan utgöra bärare för läkemedel eller liknande.

Det skall även observeras, att uttrycket "lipid", såsom det häri används, skall tolkas i sin bredaste betydelse, dvs. uttrycket omfattar de flesta föreningar, som uppfyller den ovan angivna definitionen av XY eller ZW, och omfattar antingen naturliga eller syntetiska föreningar, såsom exempelvis många typer av ytaktiva medel, som används inom den farmaceutiska industrin, den kosmetiska industrin, textilindust~ rin, tvättmedelsindustrin och livsmedelsindustrin, etc.

Det förefinns redan åtskilliga förfaranden för framställning av liposomlös- ningar av den ovan angivna typen, vilka förfaranden finns beskrivna i publikationen "New Aspects of liposomes", D.A. Tyrrell, T.D. Heath, C.M. Colley & B.E. Ryman, Bio- chmica & Biophysica Acta, 457 (l976), 259-302. Ett av dessa förfarandena innebär _ att en heterogen blandning av en lipid och den vattenhaltiga vätska, som skall in- kapslas, upphettas till en temperatur överskridande rumstemperatur, varefter bland- ningen utsättes för kraftig omröring följt av vibrationer eldar svängningar med hör- bar frekvens eller övefljudsfrekvens. l0 l5 40 3 7808556-5 Ett annat förfarande innebär att en förening med formeln XY (X och Y har ovan angivna betydelser) exempelvis en lipid, upplöses i ett flyktigt lösningsmedel, den i ett kärl ingående lösningen indunstas under bildning av en film av lipiden på kärlets väggar, och den vätska, som skall inkapslas, införes i kärlet och slutligen det senare utsättes för hörbara frekvenser eller överljudsfrekvenser, varvid en del av vätskan uppdelas i droppar omgivna av lipidhöljen. Ju längre behandlingen är, desto mera tenderar liposomerna att erhålla ett monolamellärt skal eller hölje.

Det inses, att båda av de ovan beskrivna förfarandena leder till en lösning av liposomer suspenderade i den vätska, som skall inkapslas, vilket, i allmänhet, icke är det slutgiltiga ändamålet. Det är följaktligen nödvändigt att i efterhand separera liposomkulorna från bärarvätskan, och följaktligen återdispergera dessa i en annan vätskefas. En sådan framställning av liposomerna utgående från deras ur- sprungliga, vätskeformiga bärare, kan genomföras exempelvis genom kromatografi med användning av molekylsiktar, olika typer av silikagel eller olika typer av granule~ rade polymerer, som säljes under varumärket Sephadex , eller genom upprepad centri- fugering, vilka samtliga metoder är tidskrävande och kostnadskrävande. Det är även möjligt, i enlighet ned ett annat förfarande för framställning av liposomlösningar, att injicera en etanol-lipidlösning i den lösning, som skall inkapslas, vilket leder till bildningen av liposomkulor med den ungefärliga dimensionen 25 nm. Emeller- tid är detta förfarande endast tillämpbart då den produkt, som skall inkapslas, icke denatureras i närvaro av alkohol, och, å andra sidan, har separeringen av de erhållna kulorna från överskottet av icke-inkapslad vätska och efterföljande återdispersion i en annan vattenhaltig bärare samma nackdelar som de ovan angivna.

Man har även använt ett förfarande, som innebär att en lipid och en detergent blandas med den vätska, som skall inkapslas, varefter blandningen emulgeras. Därefter elimineras detergenten genom dialys. Följaktligen erhåller man återigen liposomerna dispergerade i överskottet av den vätska, som skall inkapslas, varifrån de måste separeras och renas.

Det inses vidare, att de förut kända förfaringssätten, som beskrivits ovan, samtliga erfordrar närvaron av en viss volymmängd av den som utgångsmaterial använda, vattenhaltiga vätskan, vilken mängd är mycket större än den mängd, som slutligen inkapslas i liposomerna. Såsom förklarats ovan utbildas vid dessa förfaranden lipo- somerna som ihåliga pärlor i lösning eller kolloidal suspension i en vätskeformig bärare, som utgöres av den del av den ursprungliga vätskan, som skall inkapslas, och som icke kvarhållits inuti pärlorna. Förhållandet mellan den i liposomerna inkapslade vätskan och den totala volymmängden vätska är i allmänhet endast l-l0 %.

Följaktligen, om den vätska, som skall inkapslas, är dyr och så är i allmänhet fallet med biologiskt aktiva lösningar, blir det nödvändigt att återvinna den icke inkapslade vätskan för vidare återcirkulering. Denna återvinning sker parallellt med separaringen av liposomerna fràn nämnda vätska. Efter separering måste vätskan befrias från oönsk- lO 40 7808356-5 värda föroreningar och dess koncentration av aktiva substanser måste upprätthâllas, eftersom separering och rening kan erfordra stora volymmängder lösningsmedel, vilket leder till oacceptabel utspädning av de aktiva beståndsdelarna. Det är följaktligen svårt och dyrt att anpassa de ovan beskrivna förfarandena för framställning av lipo- somlösningarna till industriell skala pä grund av de mycket stora volymmängderna vätska, som skall handhas, jämfört med det relativt dåliga utbyte, som erhållits.

Nyligen har beskrivits ett förfarande för framställning av liposomer i vatten- lösning (tyska offentliggörandeskriften 25 32 3l7), vilket i väsentlig utsträckning eliminerar de ovan beskrivna nackdelarna. I enlighet med detta förfarande tillsättes en lösning, som skall inkapslas, helt enkelt till en lösning av det ytaktiva medlet i ett organiskt lösningsmedel, som är olösligt i vatten, och som har en densitet understigande l, och blandningen utsättes för vibrationer på känt sätt. Efter detta steg erhålles i den organiska vätskan en suspension av mikroskopiska vattenhaltiga kulor, som nedan benämns “liposomkursorer" vilket är en följd av dispersionen av den lösning, som skall inkapslas, i det organiska lösningsmedlet, vilka kulor är omgivna av ett monoskikt av lipidmolekyler, av vilka var och en är orienterad på följande sätt: X-gruppen berör vattenfasen och följaktligen är den riktad mot insidan av varje droppe, medan Y-gruppen är vriden mot dess utsida, dvs. den utskjuter från höljet och doppar ned i det organiska medium, som fortfarande innehåller, i upplöst till- stånd, ett överskott av lipiden. Därefter centrifugeras suspensionen av "prekursorer" i närvaro av det vattenhaltiga mediet, i vilket det är önskvärt att åstadkomma lipo- somlösningen. Eftersom detta vattenhaltiga medium har en större täthet än nämnda organiska lösningsmedel bildar mediet bottenfasen i centrifugrören. Under centrifuge- ring lämnar "liposomprekursorerna" den övre organiska fasen och då de utsättes för centrifugalkraften kommer de att intränga i vattenfasen. Vid denna inträngning kommer de att passera genom skiljeytan mellan den organiska fasen och vattenfasen, vilken naturligtvis omfattar en lipidbarriär som en följd av närvaron av överskott av sådan lipid upplöst i det organiska lösningsmedlet. Molekylerna av lipiden i denn skilje- yta kommer att på ett naturligt sätt ha orienterat sig själva i enlighet med de rela- tiva lägena för de båda faserna, dvs. X-gruppen vätes av vattnet och Y-gruppen vätes av lösningsmedlet. Vid överskridande av barriären kommer således "prekursorerna" att bilda ett andra skikt av det ytaktiva medlet, vars molekyler kommer att vara uppåt- vända relativt molekylerna i det första skiktet, varvid de båda skikten_utgör en normal liposomlamell eller ett normalt liposomskikt med strukturen XY-YX. Följaktli- gen ger förfarandet direkt liposomlösningen i det önskade, vattenhaltiga mediet. Med andra ord innefattar detta förfarande således två faser: i den första fasen bildar man under inverkan av vibrationer eller svängningar en dispersion av blåsor eller kulor av den vätska, som skall inkapslas, i en annan vätska, som är olöslig eller i det närmaste olöslig i vatten (dessa kulor har kolloidala dimensioner, dvs. 20-l0D nm). Dessa kulor är åtskilda medelst en monomolekylär hinna av föreningen XY, vars l0 l5 40 i 7808356-5 hydrofila del X är-böjd mot insidan av kulorna, som innehåller den inkapslade vätskan, och vars hydrofoba del Y är vänd mot utsidan av kulorna, vilken utsida omfattar den icke vattenhaltiga fasen. Dessa kulor, fastän de icke är verkliga liposomer, eftersom de icke är begränsade av ett dubbelt molekylärskikt av XY~för- eningen, kan fortfarande betraktas som skelettet för liposomerna, eftersom var och en av dessa innehåller samma volymmängd av den vattenhaltiga vätska, som kommer att ingå i de slutligen bildade liposomerna. Det är därför motiverat att benämna dessa kulor "liposomprekursorer".

Genom att pâ ett riktigt sätt reglera resp. mängder av den vattenhaltiga vätska, som skall inkapslas, det organiska lösningsmedlet och föreningen med formeln XY, är det möjligt att inkapsla inom nämnda liposomprekusorer i det närmaste den totala mängden av den ursprungliga vattenhaltiga vätskan. Utbytet för det full- ständiga förfarandet är följaktligen i närheten av det teoretiska utbytet, exempel- vis omkring 80 %, vilket utgör en väsentlig förbättring jämfört med klassiska, förut kända metoder, där utbytena är inom omrâdet l-20 %.

Den andra fasen eller det andra steget i det i ovannämnda tyska publikation beskrivna förfarandet innebär bildandet av själva liposomerna. Som en teori kan framhållas att denna bildning är förbunden med att prekursorerna korsar det mono- molekylära skiktet av föreningen XY vid skiljelinjen mellan det icke vattenhaltiga ovanskiktet och det vattenhaltiga underskiktet. Det bör framhållas, att närvaron av en sådan monomolekylär hinna är i och för sig känd eftersom den är en följd av egen- skaperna hos det ytaktiva medlet XY, varvid de hydrofila grupperna X attraheras av vatten medan de lipofila Y-grupperna förblir i beröring med den organiska fasen.

Då följaktligen varje prekursor förflyttar sig förbi gränsskiktet kommer denna att infânga en del av sin hinna, som kommer att bindas med den första monomolekylära filmen, som omger prekursorn och således bilda de karakteristiska, huvud mot huvud orienterade, bimolekylära skikten hos liposomerna.

Detta förfarande är följaktligen lämpligt eftersom det undviker de normala utvinningsoperationerna och minskning av koncentrationen av aktiva beståndsdelar i den initiala vattenhaltiga vätskan, vilka, såsom ovan nämnts, är nödvändiga vid genom- förande av de konventionella metoderna för framställningen av liposomlösningar.

Det inses även utan svårighet att förfarandet enligt den ovan angivna tyska publika- tionen medger inkapslingen i liposomform av mycket små vätskemängder, exempelvis 0,05-D,l ml, vilka volymmängder skulle vara otillräckliga vid tillämpning av de äld- re förfarandena. Följaktligen kan förfarandet enligt ovannämnda tyska publikation, som medger den direkta framställningen av liposomlösningar utan något behov av att först separera liposomerna från resten av den initiala, vattenhaltiga vätskan, och därefter återdispergera dessa liposomerna i ett annat önskvärt vattenhaltigt medium, användas vid många tillämpningar, där de konventionella förfaranden icke skulle vara lämpliga, såsom vid biologiskt och medicinskt arbete och vid analyser. 40 7808356-5 Emellertid bör anmärkas att trots de väsentliga fördelarna hos det ovan beskrivna förfarandet detta fortfarande har två nackdelar. För det första måste det organiska, vattenolösliga lösningsmedlet nödvändigtvis vara lättare än vatten (för att säkerstäl- la bildningen av ett vattenhaltigt underskikt i centrifugeringsrören), vilket ger upp- hov till begränsningar vid val av specifikt lösningsmedel. För det andra är själva centrifugeringsoperationen oönskvärd eftersom konventionella centrifuger av höghastig- hetstyp icke medger behandling av stora mängder vätska i en enda operation. Följakt- ligen är centrifugering tidskrävande och dyr. Vidare motstår vissa känsliga biologiska produkter mycket dåligt de enorma accelerationer (av storleksordningen ungefär 103-1059) som förefinns vid ultracentrifugering.

Således åstadkommas ett förfarande för framställning av vattenlösningar eller suspensioner av liposomer, vars väggar består minst av ett dubbelt ytaktigt lager.

Uppfinningen innebär att en första vattenfas av en upplöst produkt som skall inkapslas dispergeras i ett organiskt, vatten-olösligt lösningsmedel innehållande, i upplöst form: ett första ytaktivt medel med en hydrofil, inåtvänd funktion och en hydrofob, utåtvänd funktion och/eller: ett andra ytaktivt medel med en hydrofil, inåtvänd funk- tion och en hydrofob, utåtvänd funktion, varvid formas vesiklar av den första vatten- fasen, där väggarna består av ett ytaktivt lager med de hydrofila funktionerna vända inåt och de hydrofoba funktionerna vända utåt, dispergerat i det organiska lösnings- medlet, vilket fortfarande innehåller, i upplöst form, ett överskott av ytaktiva medel; och att vesiklarna i en andra vattenfas i närvaro av nämnda överskott av ytaktivt medel , varvid det organiska lösningsmedlet avlägsnas genom förångning före eller efter emulgeringen för att på så sätt erhålla de önskade liposomerna, vars väg- gar av dubbla lager består av huvud-mot-huvud-orienterade ytaktiva molekyler.

För dispergering av den första vattenfasen i det vattenolösliga lösningsmedlet kan konventionella åtgärder, såsom vibrering medelst ljudvågor, kraftig blandning, homogenisering, gasblåsning, sprutning, etc. användas. Vibrering medelst ljudvågor fö- redras av lämplighetsskäl. Vid separering av det vattenolösliga lösningsmedlet före emulgering kan konventionella metoder, såsom destillation, förångning eller indunst- ning och centrifugering användas. Emellertid kan detta avlägsnande av lösningsmedlet före emulgering leda till oönskvärd, partiell agglomerering av "prekursorerna". Det är därför att föredra att genomföra avlägsnandet av lösningsmedlet efter emulgering av de lösningsmedel innehållande prekursorerna i nämnda vattenhaltiga medium. Detta avlägs- nande kan genomföras exempelvis genom selektiv destillation eller indunstning. En före- dragen metod innebär att de båda faserna emulgeras tillsammans och att emulsionen ut- sättes för förångningsbetingelser, som medför att det icke vattenhaltiga lösningsmed- let indunstas, varvid en lösningsmedelsfri lösning eller suspension av liposomer er- hålles i nämnda vattenhaltiga medium.

För att praktiskt genomföra denna utföringsform av uppfinningen kan man införa l0 7 7808356~5 ett icke vattenlösligt organiskt lösningsmedel i ett reaktorkärl, tillsätta en lipid eller en blandning av produkter med formeln XY, som utgör en lipidisk frak- tion, därefter tillsätta den vattenlösning, som skall inkapslas, homogenisera blandningen och genom vibrering medelst ljudvâgor av hörbar eller ultrahörbar frekvens däri bilda kulorna av infångad vattenhaltig vätska benämnda "liposompre- kursorer". Därefter tillsätter man den önskade mängden vattenhaltigt medium, exempel- vis en utspädd lösning av en eller flera salter upplösta i vatten, eller enklare rent vatten, och, om så är nödvändigt, en ytterligare mängd förening XY eller en annan förening ZW, såsom beskrivits ovan, varefter man utsätter blandningen för inverkan av en omrörare-emulgeranordning tills en homogen emulsion bildats. Denna emulsion omfattar mikrodroppar av lösningsmedel dispergerade i den vattenhaltiga fasen och varje mikrodroppe av lösningsmedel innehåller, i upplöst tillstånd, ett överskott av lipidfraktionen och, i suspension ett varierbart antal liposomprekur- sorer. Medan emulsionen hålles i ett stabilt tillstånd genom omröring (eller även sedan omröraren avstannats om emulsionen är stabil) utsätter man därefter innehållet i reaktorkärlet för förångningsbetingelser. Exempelvis kan man vid atmosfärstryck blåsa luft (eller någon annan gas) vid ytan av vätskan (eller tangentiellt med ytan), uppsamla luften innehållande lösningsmedelsängorna och cirkulera denna luft in i en kondensor, som kyles till lag temperatur, vilket åstadkommer kondensation av ängorna.

Under förångning och på grund av den ständigt minskande storleken hos lösningsmedels- dropparna, avdrives liposomprekursorerna successivt från dropparna och dispergeras genom gränsfilmen mellan lösningsmedlet och vattnet och följaktligen genom det lipidskikt, som àtskiljer faserna, varvid det komplementära lipidskiktet bildas, vilket omvandlar liposomerna från prekursortillständet till det verkliga liposom- tillståndet. Den erhàllna vattenhaltiga liposomlösningen innehåller därför kulorna i den upplösta eller dispergerade formen i nämnda tillsatta vattenhaltiga medium.

Det kan vara fördelaktigt att i det sista steget i förfarandet använda en lipid eller ett ytaktivt medel ZW, som skiljer sig från XY, särskilt i det fall, då den inbördes affiniteten för de hydrofoba, lipofila molekyldelarna Y och Z är större än affiniteten mellan två Y~grupper tillsammans eller två W-grupper tillsammans.

I detta fall (exempelvis dä XY i stället är ett bra, lipofilt dispergeringsmedel och ZW i stället är ett bra, hydrofilt dispergeringsmedel) erhålles liposomer med ett skal eller ett hölje med strukturen N-i- -- -<->< N-z -- -<->< N-z --<->< vilka är särskilt stabila.

TO fw 40 7808356-5 s Detta förfarande, vars utbyte är mycket högt (ungefär 50-80 %) är följaktligen mycket enkelt att genomföra jämfört med de förut kända förfarandena. Stora mängder material kan upparbetas samtidigt och, om så är önskvärt, kan lösningsmedel, som är tyngre än vatten, användas. Möjligheten att välja lösningsmedel är därför större än i fall av förfarandet enligt den tyska offentliggörandeskriften 25 32 3l7, vilket medför, att det är möjligt att använda ett stort flertal ytaktiva medel innefattande exempelvis vissa lipider, som är fasta vid rumstemperatur och som normalt man varit tvungen att upphetta och smälta, då de används i samband med de äldre metoderna, vid temperaturer, som ofta är skadliga för de produkter, som skall inkapslas.

Denna stora möjlighet till val av lösningsmedel underlättar vidare ett riktigt val då man mäste finna lösningsmedel, som är inerta i förhållande till de aktiva bestånds- delar, som skall inkapslas.

Det bör noteras, att andra åtgärder än de ovan beskrivna kan vidtas för fram- ställning av den ovan beskrivna emulsionen och för att i efterhand indunsta lösnings- medel. Exempelvis kan emulgeringen åstadkommas genom ensskakningsbehandling och indunstningen ske under förminskat tryck.-Oavsett metod bör emellertid det partiella ángtrycket för lösningsmedlet vara markant högre än det partiella ångtrycket för vatten, ty annars erfordras upprepat avlägsnande av vatten under indunstningen för att förhindra vattenångbildning.

Som lösningsmedel kan man använda kolväten, såsom bensen, toluen, cyklohexan, petroleumeter, oktan, etc., etrar, såsom dietyleter, diisopropyleter och dibutyl- eter, etc., estrar, såsom etylester, propylester eller butyl-acetatester, etylkarbo- natester, etc., halogenerade lösningsmedel, exempelvis CCl4, CHCl2, kloroform, bensylklorid, etc. D g Som ytaktiva medel med formeln XY eller ZN kan man exempelvis använda ternära eller komplexa lipider, glycerider, cerider, etolider och sterider, närmare bestämt en eller flera föreningar, där den hydrofila X-gruppen resp. Z-gruppen omfattar följande: fosfat, karboxyl, sulfat, amino- hydroxyl och kolin, och den hydrofoba Y- resp. M-gruppen är en av följande: alifatiska, mättade eller omättade grupper (exempelvis alkyl eller alkylen), polyoxialkylen och alifatiska kolvätegrupper sub- stituerade med minst en aromatisk eller cykloalifatisk rest.

Det bör noteras, att då XY- eller ZW-föreningar används med sura, hydrofila grupper (fosfat, sulfat, etc.) kommer de erhållna liposomerna att vara anjoniska (benämnda a(-)liposomer), med basiska grupper, såsom amono, kommer katjoniska (+)-liposomer att erhållas och med polyetylenoxi- eller glykolgrupper kommer neutrala liposomer att erhållas. Man kan finna många föreningar, som är lämpliga enligt uppfinningen, i följande publikationer: Mc Cutcheon's Detergent & Emulsifiers och Mc Cutcheon's Functional Materials, Allured Publ. Company, Ridgewood, N.J. U.S.A.

Företrädesvis använder man, som föreningar XY eller ZW, substanser, som är besläktade med fosfolipider, nämligen följande föreningar: lecitin, fosfatidyl-etanolamin, l0 l5 40 9 7soezs6~s lysolecitin, lysofofatidyl-etanolamin, fosfatidylserin, fosfatidyl-inositol-, sfingomyelin, cefalin, cadiolipin, fosfatidinsyra, cerebrosider, dicetylfosfat, fosfatidyl-cholin och dipalmitoyl-fosfatidylcholin. Som icke fosforhaltiga lipider kan man exempelvis använda stearylamin, dodecylamin, hexadecylamin (Kodal Ltd.), cetylpalmitat, glycerylricinoleat, hexadecylstearat, isopropylmyristat, amfoterad akrylpolymer, trietanolamin-laurylsulfat, alcoyl-arylsulfonater, polyetoxilerade fettsyraamider, etc. Lipidfraktionen kan vidare innehålla, upplöst däri, andra substanser för reglering av stabiliteten och permeabiliteten för liposommembranet.

Som sådana kan följande nämnas: steroler, exempelvis cholesterol, tocoferol, fyto- steroler och lanolinextrakt, etc.

Genom förfarandet enligt uppfinningen kan man inkapsla praktiskt taget samtliga vattenlösliga substanser, som icke har en alltför stark affinitet till föreningarna i liposomhöljena eller som skulle intränga i dessa höljen. I detta avseende kan man nämna, förutom de redan ovan angivna, vattenlösningar av biologiska aktiva substanser, exempelvis tungmetallkelatbildande medel, enzymer, läkemedel innefattande antibio- tika, etc. Exempel pä lämpliga substanser återfinns i följande hänvisning: “Targetting of Drugs", G. Gregoriadis, Nature 265, 2, (l967), 407.

Som vattenhaltigt dispergerande medium, i vilket liposomerna slutligen upp- löses, kan man använda rent vatten eller någon annan lämplig vattenhaltig vätska.

Företrädesvis använder man en vätska, som är avsedd som det slutliga dispergerande mediet för de använda liposomerna, exempelvis en utspädd NaCl-lösning. Särskilt kan man använda en vattenlösning av NaCl i en koncentration av 0,l5 mol NaCl/lit. (0,9 vikts-%) som benämns fysiologiskt serum för att direkt erhålla, i det andra steget i förfarandet, en liposomlösning i ett medium, som direkt kan injiceras i kroppen.

En annan fördel med förfarandet enligt uppfinningen blir således uppenbar, nämligen möjligheten att direkt erhålla en liposomsuspension i ett medium, som är utvalt i enlighet med den slutliga användningen för dessa liposomer. Naturligtvis är det all- tid möjligt att separera de liposomer, som framställts medelst förfarandet enligt uppfinningen, från sitt vattenhaltiga dispersionsmedium, exempelvis då det är önsk- värt att undvika samtliga spâr av icke inkapslad aktiv förening, som är upplöst i mediet. Denna separation kan genomföras ëš konventionellt sätt, exempelvis medelst kromatografi under användning av Sefadex . Följande exempel åskådliggör uppfinningen i detalj.

Exempel l g I en l0 ml "Pyrex"~kolv infördes 2 ml dibutyleter och l ml cyklohexan, och därefter tillsattes 0,2 ml av en l0 mg/l insulinlösning i en vattenhaltig 0,9 %-ig NaCl-lösning vid pH 3 (HCl N/l0). Därefter tillsattes l50 mg dipalmitoylfosfatidyl- cholin (hydrofil-lipofil förening) och vid rumstemperatur utsattes den heterogena blandningen för vibreringar av ultraljudsfrekvens under l min. med hjälp av en gene- rator av typen "BRANSON"(modell B-l2, 20 kHz, l50 W). Man erhöll en klar lösning innehållande liposomprekursorerna i form av mikrokulor av insulinlösningen, vars l0 - 40 7808356-5 väggar bestod av ett skikt av ytaktivt medel och vars molekyler var orienterade i en sådan riktning att den hydrofila gruppen därav (fosfatidylcholin) pekade mot insidan av kulorna och de hydrofoba grupperna (kolvätekedjor) var vridna utåt mot det organiska lösningsmedlet. Dessa mikrokulor suspenderades i kolloidal form i det organiska lösningsmedlet innehållande, i upplöst tillstånd, ett överskott av det ytaktiva medlet.

Därefter infördes den organiska lösningen i en annan kolv innehållande 30 ml av en neutral vattenlösning av NaCl i en koncentration av 0,9_% och blandningen emulgerades vid 3000 medelst en omrörare, som roterade med hög hastighet. Efter detta steg bestod blandningen följaktligen av en dispersion av fina droppar av det organiska lösningsmedlet i vattenfasen. Varje droppe innehöll, i suspension, de ovan beskrivna liposomprekursorerna och ett överskott av lipider.

Med hjälp av ett lämpligt rör infördes en luftström i kolven och fick svepa mot emulsionen mycket nära dess yta under omröring vid 30°C. Blandningen av luft och lösningsmedelsångor kyldes i en kondensor vid -l0°C, varvid ångorna kondenserade under bildning av vätska. Denna operation fortsatte tills kondensationen upphört (ungefär 20430 min.).

Efter detta steg kvarstod i kolven ungefär 20 ml klar lösning (0,9 % NaCl), i vilken liposomkapslarna var suspenderade i form av kulor, vars hölje bestod av ett dubbelt molekylskikt av ytaktivt medel, varvid molekylerna var orienterade huvud mot huvud och vars svansar var riktade mot insidan såväl som mot utsidan.

Det yttersta skiktet av detta hölje erhölls från överskottet av lipid, som var upp- löst i det organiska lösningsmedlet och gjordes tillgängligt medelst förângning. 2 ml av liposomlösningen kromatograferades på en kolonn innehållande 2,5 g "Sephadex G-50" (elueringsmedel: 0,15 M vattenhaltig NaCl + 0,05 M fosfatbuffert, pH 7,5) och genom analys av eluatet (spektrometriskt) fastställdes att endast 20-25 % av eden ursprungliga insulinlösningen verkligen undgick inkapsling. Följaktligen, i de flesta fall, kan den liposomlösning, som erhållits i enlighet med detta exempel användas direkt terapeutiskt utan ytterligare rening.

Exempel 2 _ En vattenlösning av l0 g/l amyloglykosidas inkapslades och dispergerades i 0,l5 M NaCl-lösning på följande sätt: en blandning av lecitin (74 mg), 0,l ml av emyloglykosidaslösningen och diisopropyleter (3 ml) vibrerades medelst ljudvâgor under 2 min. (20 kHz, l50 W) under kylning vid en lägre temperatur av 3000 med hjälp av ett kylbad. Man erhöll en klar, homogen, blâaktig vätska, som försattes med l5 ml av en 0,15 M vattenlösning av NaCl. Blandningen emulgerades på det sätt, som beskri- vits i exempel l, varefter den fina emulsionen sveptes med en kvävgasström, som förângade det organiska lösningsmedlet. Denna blâsning fortsatte till fullständig förângning (20-30 min.). Man erhöll en klar suspension av.kolloidala liposomer, i vilken amyloglykosidaslösningen infângades, i vattenhaltig 0,l5 M NaCl-lösning och vilken innehöll en mycket liten mängd (ungefär 5 %) icke infângat enzym. 40 7808356-5 Beroende på den önskade användningen kan denna 1ösning användas som sådan e11er sedan den icke inkaps1ade amy1og1ykosidasen separerats (exempe1vis genom ge1- kromatografi pá "Sepharose").

Exempe1 3 förfarandet en1igt exempe1 1 upprepades men under användning av, som den 1ösning, som ska11 inkaps1as, 0,5 m1 av en vattenha1tig, buffrad 1ösning (fosfat- buffert 10 mM, pH 7,2) av 0,5 mg/m1 arabinoscitosin. Den disperserande fasen ut- gjordes av 0,15 M NaC1 (10 m1), 1ipiden utgjordes av kardio1ipin (47 mg) och det organiska 1ösningsmed1et utgjordes av dibuty1eter (2,4 m1) och CHC13 (0,6 m1).

Eßfßsfl Förfarandet en1igt Exempe1 1 upprepades men med användning av fö1jande produkter: penici11amin, som ska11 inkaps1as, vid 100 mg/m1 (0,1 m1); disperserande medium 0,15 M vattenha1tig NaC1-1ösning; ytaktiva mede1 1ecitin (105 mg) och ko1esto- ro1 (35 m9); 1ösningsmede1 buty1acetat (3 m1).

Exempe1 5 Förfarandet en1igt exempe1 1 upprepades med användning av fö1jande bestånds- de1ar: betametason, som ska11 inkaps1as, 150 mg/1 i vattenha1tig dinatriumfosfat- 1ösning (D,05 m1); disperserande fas 0,15 M vattenha1tig NaC1-1ösning; 1ipid 1eci- tin (85 mg) och fosfatidy1-etano1amin (45 mg); 1ösningsmede1 3-heptanon (3 m1).

Exempe1 6 Förfarandet en1igt exempe1 1 upprepades med användning av fö1jande bestånds- de1ar: 0,1 m1 av en vatten1ösning av syrakompïexet po1yinosinin-po1ycytidi1insyror (poïy (I)-po1y(C)) i en koncentration av 1 mg/m1, som ska11 inkaps1as; disperserande fas 0,15 M NaC1; ytaktivt mede1 1ecitin (60 mg), steary1amin (20 mg) och ko1estäro1 (15 m9); 1ösningsmede1: en b1andning av diisopropy1eter och buty1acetat (3 m1) i vo1ymsförhä11andet 1:1.

Exempe1 7 Ti11 20 m1 diisopropy1eter sattes 1,5 g 1ecitin, 0,4 g fosfatidy1serin och 0,5 g ko1estoro1, och därefter en 1ösning av 1,8 mg actinomycin D i 3 m1 fosfat- buffert (0,1 M, pH 7). B1andningen utsattes för vibreringar mede1st ïjudvágor under min, såsom beskrivits i exempe1 1. Därefter ti11sattes 100 m1 av en vattenha1tig fosfatbuffert1ösning (0,1 M, pH 7) och emu1gering genomfördes såsom beskrivits i exempe1 1. Utan att avstanna omröraren ans1öts ko1ven ti11 en vakuum1edning och trycket reducerades successivt ti11 10 Torr medan temperaturen reg1erades ti11 -2200. Efter ungefär 45 min. hade diisopropy1etern fu11ständigt av1ägsnats och den kvarvarande b1andningen före1àg i form av en k1ar 1iposom 1ösning. Genom kroma- tografi av ett prov på "Sephadex" faststä11des att 88 % av den ursprung1iga substan- sen actinomycin D hade infàngats.

Exempe1 8 1 g trypsin i 30 m1 av en 0,1 M (pH 7) fosfatbuffert1ösning vibrerades mede1st 40 7808356-5 12 1judvâgor i närvaro av en 1ösning av 30 g fosfatidy1inosito1 i 100 m1 dipropy1- g eter. Därefter ti11sattes 460 m1 av en vatten1ösning av 0,5 % NaC1 och emu1gering genomfördes. Den fina emu1sionen indunstades under 3 h vid 1500 under 10 Torr, vi1- ket gav en k1ar 1iposonflösning. Genom ana1ys av ett prov (kromatografi på “Sephadex G-50") faststä11des, att inkaps1ingsutbytet var ungefär 85 %.

Exempe1 9 I detta exempe1 beskrives biïdningen av 1iposomer med ett asymmetriskt hölje.

Detta hö1je har ett inre fosfo1ipidskikt bestående av dipa1mitoy1-fosfatidy1cho1in ochzett ytterskikt bestående av en b1andning av ägg1ecitin och fosfatidy1serin.

Fö1jande metod användes: _ Ti11 3 m1 dibuty1eter sattes 0,1 m1 av en vatten1ösning innehå11ande 0,001 M 3,9-bisdimety1aminofenazotioniumk1orid och 0,015 M NaC1 och 55 mg dipa1mitoy1fosfa- tidy1cho1in; denna b1andning vibrerades såsom beskrivits i exempe1 1 och man erhö11 en transparent, organisk 1ösning innehå11ande mikroku1or (1iposomprekursorer) av den ovannämnda, färgade vatten1ösningen omgivna av ett skikt av dipa1mitoy1fosfatidy1- cho1in. Denna organiska 1ösning centrifugerades därefter under 20 min. vid 8000 g.

Därefter erhö11s en k1ar, över1iggande fas och en genomskiniig, b1â bottenfas inn- hä11ande mikroku1orna agg1omererade ti11sammans under inverkan av centrifuga1kraf- ten. Denna fas, som före1âg i form av en ganska stabi1 ge1, överfördes ti11 en 10 m1 behâ11are, där den b1andades med hjä1p av en spate1 med 0,3 m1 av en 200 mg/m1 1ös- ning av en b1andning av ägg1ecitin och fosfatidy1serin (i ett mo1förhâ11ande av :1) i dibutyleter. Därefter ti11sattes den gummiartade massan 5 m1 av en vatten- 1ösning av 0,15 M NaC1 och b1andningen utsattes för kraftig omröring mede1st en magnetisk omrörare. Massan dispergerade sig sjä1v successivt och efter 10-15 min. erhö11s en mycket homogen, transparent 1ösning innehâ11ande, i suspension, 1iposomer- na med ett b1andat hö1je. Det yttre skiktet av detta hölje bestod av b1andningen av äggïecitin och fosfatidy1serin och det inre skiktet därav bestod av dipa1mitoy1- fosfatidy1cho1in. 1 Exempe1 10 Liposomprekursorer innehâ11ande insu1in framstä11des såsom beskrivits i exempe1 1. I stä11et för att fortsätta att förfara såsom beskrivits i exempe1 1, dvs. direkt emuïgering av den organiska iösningen innehä11ande mikroku1orna i en vatten1ösning av 0,9 % NaC1, koncentrerades den organiska 1ösningen först genom att denna utsattes för förminskat tryck (20 Torr) vid rumstemperatur. Efter indunstning av de organiska 1ösningsmed1en erhö11s vid bottnen av hâ11aren ett o1jigt, genom- skin1igt skikt bestående av agg1omererade mikroku1or. Ti11 ko1ven sattes därefter 7 m1 av en vatten1ösning av 0,9 % NaC1 och med hjä1p av en magnetisk omrörare disper- gerades denna o1jiga fas in i det vattenha1tiga mediet. Denna o1jiga fas försvann successivt och efter 10-15 min. erhö11s en transparent, homogen 1ösning innehâ11ande i suspension, de önskade 1iposomerna. Efter kromatografering av denna 1ösning pâ "Sephadex 4B" (Pharmacia, Sverige), visade ana1ys av den icke inkaps1ade fasen l0 13 vsoszse-s att 52 % av utgängsinsulinen effektivt inkapslats i liposomerna.

Exempel ll En blandning av lecitin (40 g) dibutyleter (600 ml) och en vattenlösning av 0,9 % NaCl innehållande l0 g/l insulin (400 ml) homogeniserades med hjälp av en homogenisator av typen "MINISONIC" (ULTRASONICS Ltd., Great-Britain). Man erhöll en stabil mjölkartad lösning, som infördes i en 4 lit. kolv innehållande 2 lit. av en vattenlösning av 0,9 % NaCl; därefter emulgerades, med hjälp av en omrörare, den organiska suspensionen och det vattenhaltiga mediet (l5 min.). Därefter avlägs- nades det organiska lösningsmedlet genom luftavdrivning, dvs. blandningen cirkule- rades nedför en kolonn, som genomströmmades av en uppâtgáende luftström, varvid den senare uppsamlades, då den mättats med lösningsmedelsângorna, vid toppartiet av kolonnen. Pâ detta sätt erhölls en homogen, genomskinlig lösning av liposomer inne- hållande insulinet.

Exempel l2 Dibutyleter (3 ml) en vattenlösning av 0,9 % NaCl innehållande l0 mg/ml insulin (l ml) och lecitin (l25 mg) infördes i ett starkt l0 ml "Pyrex"-rör, till- sammans med 2 g glaspärlor med en diameter av l mm. Röret igenpluggades, anordnades på en skakanordning och skakades under 30 min. med en hastighet av l00 perioder/min.

Pâ detta sätt erhölls en tämligen homogen, mjölkartad lösning, som hälldes i en 100 ml kolv innehållande en vattenlösning av 0,9 % Naßl. Därefter indunstades det orga- niska lösningsmedlet såsom beskrivits i exempel 2 under användning av en kvävgas- ström. Efter blàsning under 20-30 min. erhölls en klar lösning av liposomer inne- hållande insulinet i inkapslad form.

Claims (9)

1. lO l5 20 25 30 35 40 7 3 Û 8 3 5 6 't 5 m i P/xitnikruxi' g l. Förfarande för framställning av vattenlösningar eller suspensioner av liposomer, vars väggar består minst av ett dubbelt ytaktivt lager, k ä n n e - t e c k n a t av att: a) en första vattenfas av en upplöst produkt som skall inkapslas dispergeras i ett organiskt, vatten-olösligt lösningsmedel innehållande, i upplöst form, i) ett första ytaktivt medel (XY) med en hydrofil, inåtvänd funktion (X) ochgen hydrofob, utåtvänd funktion (Y) och/eller ii) ett andra ytaktivt medel (ZW) med en hydrofil, inåtvänd funktion (Z) och en hydrofob, utåtvänd funktion (N), varvid formas vesiklar av den första vattenfasen, där väggarna består av ett ytaktivt lager med de hydrofila funk- tionerna vända inåt och de hydrofoba funktionerna vända utåt,-dispergerat i det organiska lösningsmedlet, vilket fortfarande innehåller, i upplöst form, ett överskott av ytaktiva medel (XY och/eller ZW), och b) att vesiklarna emulgeras i en andra vattenfas i närvaro av nämnda över- skott av ytaktivt medel (XY) och/eller (ZW), varvid det organiska lösningsmedlet avlägsnas genom förângning innan eller efter emulgeringen för att på så sätt erhålla de önskade liposomerna, vars väggar av dubbla lager består av huvud-mot- -huvud-orienterade ytaktiva molekyler. _
2. 2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t-e c k n a t av att dispersionen av den.första vattenhaltiga fasen i det vattenolösliga lösningsmedlet genomföres genom användning av vibreringar av ljudfrekvens eller ultraljudsfrekvens.
3. 3. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att det ytaktiva medlet är en fosfolipid och är en av följande: lecitin,, fosfatidyletanolamin, lysolecitifla lysofosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol, svingomyelin, kardiolipin, fosfatidinsyra, cerebrosider, dipalmitoyl-fosfat- idylcholin.
4. 4. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att det ytaktiva medlet är stearylamin, dodekylamin, hexadekylamin, cetylpalmitat, glycerylricin- oleat, hexadekylstearat, isopropylmyristat, amfotera akrylpolymerer, trietanol- aminlaurylsulfat,alkoyl-arylsulfonater eller polyetoxylerade fett-syraamider.
5. 5. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att man som före- ningar med formeln XY och/eller ZW använder en blandning av minst en fosfolipid och minst en annan lipoidförening, vilken är kolesterol, tokoferol eller fyto- sterol.
6. 6. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att det vatten- olösliga lösningsmedlet är bensen, alkyl- eller halogenalkylbensener, alifatiska etrar, aldehyder, estrar eller ketoner eller fria och halogenerade alifatiska och cykloalifatiska kolväten.
7. 7. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att den produkt som skall inkapslas väljes bland färgämnen, smak- eller aromämnen, välluktande 10 ,- 7808356-5 in ämnen, läkemedel, enzymer, polypeptider, kelatmedel och industriella produkter, vars verkan mäste något fördröjas från tidpunkten för deras införande i en process eller en komposition, eller vilka måste frigöras successivt under tidens lopp. - ' _
8. 8. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att det vatten- haltiga dispergerande medlet är rent vatten eller en vattenlösning av lösliga salter, såsom en 0,15 M NaCl-lösning.
9. 9. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att förângningen åstadkommas medelst en gasström som svepes över vätskan eller genom användning av förminskat tryck. 7808356-5 SAMMANDRAG I eniighet med förfarandet eniigt uppfinningen dispergeras en vattenïösning, som škaii inkapsias, i ett vattenoiösiigt eiier svâriösiigt ïösningsmedei innehâiïande- minst en lipidförening för bildning av biåsor e11er kulor av denna iösning omgivna av en fiim av nämnda iipidförening, varefter kuiorna emuigeras i ett annat vatten- haitigt medium, varvid iösningsmediet avïägsnas före eiier efter emuigeringen.