PT647137E - Antagonistas dos receptores da glicina e a sua utilização - Google Patents

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Eckard Weber
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Univ California
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Description

1
DESCRIÇÃO "Antagonistas dos receptores da glicina e a sua utilização"
Campo da invenção A presente invenção está no campo da química medicinal. A presente invenção refere-se a compostos que têm elevada afinidade para o local de ligação da glicina, falta de efeitos colaterais de PCP e que atravessam a barreira hematoencefálica em niveis elevados. Em particular, a presente invenção refere-se à utilização de 1,4-di-hidroquinoxali.na-2,3-dionas para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir a degeneração neuronal associada com a isquemia, condições fisiopatológicas associadas com a degeneração neuronal, convulsões, ansiedade e dor crónica para induzir a anestesia. A invenção também diz respeito à utilização de certos sais de amónio altamente solúveis de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas.
Antecedentes da Invenção
Pensa-se que o glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no cérebro. Há três subtipos principais de receptores de glutamato no SNC. Estes são vulgarmente designados por cainato, receptores de AMPA e N-metil-D-aspartato (NMDA) (Watkins e Olverman, Trends in Neurosci. 7:265-272 (1987)). Os receptores de NMDA são encontrados nas membranas de praticamente todos os neurónios no cérebro. Os receptores de NMDA são canais de catião controlados pelo ligando que permitem que Na+, K+ e Ca++ se introduzam quando são activados 2 pelo glutamato ou o aspartato (agonistas endógenos, não-selectivos) ou por NMDA (um agonista sintético, selectivo) (Wong e Kemp, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 31:401-425 (1991)). O glutamato por si só, não pode activar o receptor de NMDA. De modo a tornar-se activado pelo glutamato, o canal receptor de NMDA deve primeiramente ligar a glicina a um logal de ligação da glicina, especifico, com elevada afinidade, que é separado do local de ligação de glutamato/NMDA na proteina receptora (Johnson e Ascher, Nature 325:329-331 (1987)). A glicina, portanto, é um co-agonista obrigatório no receptor de NMDA/complexo de canal (Kemp, J.A., et al.f Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85:6547-6550 (1988)).
Além dos locais de ligação para o glutamato/NMDA e a glicina, o receptor de NMDA transporta uma série de outros locais de ligação funcionalmente importantes. Estes incluem locais de ligação para o Mg++, Zn++, poliaminas, ácido araquidónico e fenciclidina (PCP) (Reynolds e Miller, Adv. in Pharmacol. 21:101-126 (1990); Miller, B., et al.f Nature 355:722-725 (1992). 0 local de ligação de PCP, agora comummente designado como receptor de PCP, está localizado no interior dos poros do ionóforo do receptor de NMDA/complexo de canal (Wong, E.H.F., et al., Proc. Natl. Acad.· Scí. E.U.A. 83: 7104-7108 (1986); Huettner e Bean, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85:1307-1311 (1988); MacDonald, J.F., et al., Neurophysiol. 58:251-266 (1987)) . Para que o PCP. ganhe acesso ao receptor de PCP, o canal deve primeiramente ser aberto pelo glutamato e a glicina. Na ausência de glutamato e de glicina, o PCP não se pode ligar ao receptor de PCP embora alguns estudos tenham sugerido que uma pequena quantidade da ligação de PCP pode ocorrer mesmo na ausência de glutamato e de glicina (Sircar e Zukin, Brain Res. 556:280-284 (1991)). Depois do PCP se ligar ao receptor de PCP, ele bloqueia o 3 fluxo de iões através do canal aberto. Portanto, o PCP é um bloqueador de canal aberto e um antagonista de glutamato não competitivo no receptor de NMDA/complexo de canal.
Um dos mais potentes e selectivos fármacos que se ligam ao receptor do PCP é o fármaco anticonvulsivo MK801. Este fármaco tem um Kd de aproximadamente 3nM no receptor de PCP (Wong, E.H.F., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 83:7104-7108 (1986)).
Tanto o PCP e ο MK8 01, bem como outros ligandos doreceptor de PCP [por exemplo: dextrometorfano, cetamina e guanidinas de N,N'-disubstituídas] têm eficácia neuroprotetora tanto in vitro como in vivo (Gill, R. , et al., J. Neurosci. 7:3343-3349 (1987); Keana, J.F.W., et al.f Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 86:5631-5635 (1989); Steinberg, G.K., et al.r Neuroscience Lett. 89:193-197 (1988); Church, J., et ai., Em: Sigma and Phencyclidine-Like Compounds as Molecular Probes in Biology, Domino e Kamenka, editores, Ann Arbor: NPP Books, páginas 747-756 (1988)). A eficácia neuroprotectora bem caracterizada destes medicamentos é em grande parte devido à sua capacidade para bloquear o influxo de Ca++ excessivo em neurónios através de canais receptores de NMDA, que se tornam mais activados por libertação excessiva de glutamato em condições de isquemia cerebral (por exemplo, no acidente vascular cerebral, isquemia de paragem cardíaca, etc.) (Collins, R.C., Metabol. Br. Dis. 1:231-240 (1986); Collins, R.C., et ai., Annals Int. Med. 110:992-1000 (1989)).
No entanto, o potencial terapêutico destes fármacos receptores de PCP como os agentes de salvamento de isquemia no acidente vascular cerebral tem sido severamente dificultada pelo facto destes fármacos terem fortes efeitos colaterais comportamentais como PCP 4 (efeitos comportamentais psicotomiméticos) , que parece ser devido à interacção destes fármacos com o receptor de PCP (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Phamacol. 167:127-135 (1989); Koek, W., et al., 167:127-135 (1989); J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets e Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988)). Estes efeitos secundários comportamentais como PCP, parecem ter causado a retirada do MK801 do desenvolvimento clinico como um agente de salvamento da isquemia. Além disso, esses ligandos receptores de PCP parecem ter considerável potencial de abuso como ficou demonstrado pela responsabilidade do abuso do prórpio PCP.
Os efeitos comportamentais como PCP dos ligandos receptores do PCP podem ser demonstrados em modelos animais: o PCP e os ligandos receptores do PCP relacionados causam uma excitação comportamental (hiperlocomoção) em roedores (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)) e uma catalepsia caracteristica em pombos (Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets e Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988)); em paradigmas de discriminação do fármaco, existe uma forte correlação entre a afinidade do receptor de PCP destes fármacos e a sua potência para induzir um comportamento de resposta adequada de PCP (Zukin, S.R., et al., Brain Res. 294:174 (1984); Brady, K.T., et al., Science 215:178 (1982); Tricklebank, M.D., Eur. J. Pharmacol. 141:497 (1987) )'.
Os fármacos que actuam como antagonistas competitivos no local de ligação de glutamato do receptor de NMDA, tal como CGS 19755 e LY274614 também têm eficácia neuroprotectora porque estes fármacos, como os ligandos- do receptor de PCP podem prevenir o fluxo de Ca++ excessivo através do receptor de NMDA/canais na isquemia (Boast, C.A., et al. Brain Res. 442:345-348 (1988); Schoepp, D.D., et al., 5 J. Neural. Trans. 85:131-143 (1991)). No entanto, os antagonistas do receptor de NMDA competitivos também têm efeitos colaterais comportamentais como PCP em modelos animais (excitação comportamental, actividade nos testes de discriminação de fármaco de PCP), embora não tão potentemente como ο MK801 e o PCP (Tricklebank, M.D., et al.r Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)).
Uma maneira alternativa de inibir a activação do canal receptor de NMDA é usando antagonistas no local de ligação da glicina do receptor de NMDA. Uma vez que a glicina deve ligar-se ao local da glicina, a fim do glutamato efectuar a abertura do canal (Johnson e Ascher, Nature 325:329-331 (1987); Kemp, J.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85: 6547-6550 (1988)), um antagonista da glicina pode impedir completamente o fluxo de ião através do canal receptor de NMDA - mesmo na presença de uma grande quantidade de glutamato.
Os estudos recentes de microdialise in vivo têm demonstrado que, no modelo de isquemia focal no rato, há um grande aumento na libertação do glutamato na região cerebral isquêmica sem aumento significativo da libertação da glicina (Globus, M.Y.T., et al., J. Neurochem. 57:470-478 (1991)). Assim, teoricamente, os antagonistas da glicina devem ser agentes neuroprotectores muito poderosos, porque podem impedir a abertura de canais de NMDA por glutamato não competitivamente e, por isso - ao contrário, os antagonistas de NMDA competitivos - não têm de superar as grandes concentrações de glutamato endógeno que são libertadas na região cerebral isquêmica.
Por outro lado, porque os antagonistas da glicina não actuam nem no glutamato/NMDA, nem nos locais de ligação de PCP para prevenir a abertura do canal de NMDA, estes fármacos não devem causar o efeito colateral como PCP - visto tanto com os ligandos do receptor de PCP 6 e com os antagonistas do receptor de NMDA competitivo (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989); Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets e Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988); Tricklebank, M.D., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989); Zukin, S.R., et al., Brain Res. 294:174 (1984); Brady, K.T., et al., Science 215:178 (1982); Tricklebank, M.D., et al., Eur. . J. Pharmacol. 141:497 (1987))) Que os antagonistas da glicina podem efectivamente ser destituídos de efeitos colaterais comportamentais como PCP foi sugerido por estudos recentes em que os antagonistas da glicina disponíveis foram injectados directamente nos cérebros dos roedores sem resultar em comportamentos como PCP (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (19.89)).
No entanto, registaram-se dois grandes problemas que têm impedido o desenvolvimento de antagonistas da glicina como agentes neuroprotectores clinicamente úteis: A. A maioria dos antagonistas da glicina disponíveis com afinidade de ligação do. receptor relativamente elevada in vitro, tal como o ácido 7-Cl-quinurénico (Kemp, J.A. , et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85:6547-6550 (1988)), ácido 5,7-dicloroquinurénico (McNamara, D., et al., Neuroscience Lett. 120:17-20 .(1990)) e ácido indole-2-carboxílico (Gray, N.M., et al., J. Med. Chem. 34:1283-1292 (1991)) não podem penetrar na barreira de sangue/cérebro e, portanto, não têm utilidade como agentes terapêuticos; B. 0 único antagonista da glicina disponível que penetra suficientemente na barreira sangue/cérebro - o fármaco HA-966 (Fletcher e Lodge, Eur. J. Pharmacol. 151:161-162 (1988)) - é um agonista parcial apenas com afinidade micromolar para o local de ligação da glicina. Uma eficácia neuroprotectora para HA-966, in 7 vivo, portanto, não tem sido demonstrada nem foi demonstrada para os outros antagonistas da glicina disponíveis, porque lhes falta biodisponibilidade in vivo.
Tem havido um grande número de relatos na literatura de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas substituídas que são úteis para tratar condições fisiopatológicos mediadas pelos, receptores de não-NMDA, glicina e NMDA. Por exemplo, a patente norte-americana No. 4,975,430 (1990), divulga compostos de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona da fórmula:
em que cada X é independentemente nitro ou ciano e em que cada Y é independentemente H, alquilo inferior, alcoxilo inferior, ou CF3. Estes compostos são declaradamente úteis para o tratamento de condições neuronais associadas com a estimulação do receptor de NMDA. A patente norte-americana No. 3,962,440 (1976), divulga compostos de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona da fórmula:
H
Rn em que, R1 pode ser hidrogénio ou metilo, Rn, pode ser alquilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, ciclopropilo, nitro, ciano, halogéneo, fluoroalquilo de Ca-C2 (trifluorometil) 8 amino ou amino substituído, e n pode ser 0, 1 ou 2. Estes compostos relatadamente úteis são como agentes hipnóticos. A patente norte-americana No. 4,812,458 (1989), divulga compostos de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona da fórmula:
em que R1 é halogénio, ciano, trifluorometil, etinilo ou N3 e R2 é S02Ci-3-alquilo, trifluorometilo, nitro, etinilo ou ciano. Estes compostos são alegadamente úteis para o tratamento de indicações causadas por hiperactividade dos neurotransmissores excitatórios, particularmente os receptores de quisqualato, e como neurolépticos. A patente norte-americana No. 4,659,713 (1987), divulga compostos de 1, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona da fórmula:
H
em que X representa hidrogénio, cloro, bromo, flúor, iodo, triclorometilo, diclorofluorometilo, difluorometilo ou trifluorometilo, e n representa 1 ou 2. Estes compostos são declaradamente úteis para o controlo de coccidiose em animais. A patente norte-americana No. 4,948,794 (1990), divulga compostos de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona da fórmula: 9 9 R8 R1 r7\ O ^Y° r6/ Vto RS H em que R1 é Ci-12-alquilo, que pode ser opcionalmente substituído por hidroxilo, formilo, carboxilo, ésteres carboxílicos, araidas ou aminas, C3_s-cicloalquilo, arilo, aralquilo; e em que R6 é hidrogénio, halogénio, CN, CF3, NO2, ou OR', em que R' é Ci-4- alquilo e R5, R7 e R8 é hidrogénio, desde que R6 não seja CF3, OCH3, N02, C1 ou Br quando R1 é CH3; ou R6 e R7 são independentemente N02, halogéneo, CN, CF3, ou OR', em que R' é Ci-4-alquilo, e R5 e R8 são cada um hidrogénio; ou R5 e R6 em conjunto formam um anel aromático fundido adicional, o qual pode ser substituído com halogéneo, N02, CN, CF3 ou OR', em que R' é Ci-4-alquilo; ou R7 e R8 em conjunto formam um anel aromático fundido adicional, o qual pode ser substituído com halogéneo, NO2, CN, CF3 ou OR', em que R1 é Ci-4-alquilo, e R5 e R6 sãò independentemente hidrogénio, halogéneo, CN, CF3, N02 ou OR', em que R' é Ci-4-alquilo. Estes compostos são declaradamente úteis para o tratamento de indicações causadas pela hiperactividade dos neurotransmissores excitatórios, particularmente os receptores de quisqualato, bem como neurolépticos.
Res. Commun. 164:841-849 (1989), 1,4-di-hidroquinoxalina-l,2-dionas ligação insensível à itive insensível
Yoneda e Ogita, Biochem. Biophys. divulgam que as seguintes deslocaram competitivamente a 10 estricnina de [3H] glicina, sem afectar os outros locais de ligação no complexo receptor de NMDA:
H I R1 R2 γ^ rV° H H QX R/ 1 Cl H CQX 1 H Cl Cl DCQX N02 ΟΝ CNQX no2 no2 DNQX
De acordo com os autores, as relações de estrutura-actividade entre as quinoxalinas indica claramente que ambos os grupos de cloreto das posições 6 e 7 no anel de benzeno são cruciais para a potência antagonista contra os locais Gly. A remoção de um cloreto a partir da molécula resulta em uma redução de 10 vezes na afinidade para os locais Gly.
Kleckner e Dingledine, Mol. Pharm. 36:430-436 (1989), divulgam que 6,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6-ciano-7-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona são antagonistas mais potentes de cainato do que a glicina, mas a substituição de Cl na posição 6 e especialmente, nas posições 6 e 7 aumenta a potência no local da glicina. Além disso, os autores sugerem que os antagonistas do local da glicina poderá ser eficaz contra neuropatologias mediadas pelo receptor de NMDA.
Rao, T.S. et al., Neurcpharmacology 29:1031-1035 (1990), divulgam que 6,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 7-cíano-6-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona antagonizam as respostas mediadas pelos locais de reconhecimento da glicina associados ao NMDA in vivo. 11
Pellegrini-Giampietro, D.E. et al., Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286 (1989), divulgam, que 6-ciano-7-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona podem antagonizar as respostas para o L-glutamato através da interacçâo com os locais de reconhecimento da glicina do complexo do canal iónico do receptor de NMDA.
Ogita e Yoneda, J. Neurochem. 54:699-702 (1990), divulgam que 6,7-dicloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é um antagonista competitivo específico para os locais de ligação da [3H]glicina insensitiva por estricnina no complexo do receptor de NMDA. De acordo dom os autores, os dois radicais de cloreto nas posições 6 e 7 no anel de benzeno da quinoxalina são cruciais para a potência antagonística contra os locais de ligação da glicina.
Kessler, M. et al., Brain Res. 489:377-382 (1989), divulgam que 6,7 dinitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6-ciano-7-nitro-l, 4-di-hídroquínoxalina-2,3-diona inibem a ligação de [3H]glicina para os locais de ligação da glicina insensitiva pór estricnina associados com os receptores de NMDA. O Pedido de Publicação da Patente Europeia No. 0 377 112, publicada a 11 de Julho de 1990, divulga os compostos de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona com a fórmula:
em que, entre outros, R1 pode ser hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, aralquiloxilo, cicloalquilalcoxilo, cicloalcoxilo ou aciloxilo; e 12 R5, R5, R7 e R8 podem ser independentemente hidrogénio, nitro, halogéneo, ciano, trifluorometilo, S023SfR'R', S02R' ou OR', em que R' é hidrogénio ou C1-4 alquilo. Estes compostos são declaradamente úteis para o tratamento de indicações causadas por hiperactividade dos neurotransmissores excitatórios, particularmente os receptores de quisqualato, bem como os neurolépticos.
Lester, R.A. et al., Mol.Pharm. 35:565-570 (1989), divulgam que 6 -ciano-7-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona antagoniza as respostas mediadas pelo receptor de NMDA, através de uma interacção competitiva do local de ligação da glicina.
Patel, J. et al., J. Neurochem. 55:114-121 (1990), revelam que a actividade de neuroprotecção de 6,7-dinitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona é devida ao antagonismo da actividade co-agonista da glicina, no complexo de canal do receptor de NMDA.
Horner, L. et al., Chem. Abstracts 48:2692 (1953) divulgam 6,8-dinitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona.
Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc.x 1170-1176 (1962), divulgam 6,7-dibromo-2,3-di-hidroquinoxalina (também conhecido como 6,7-dibromo-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona).
Honore, T. et al. , Science 241:701-703 (1988), divulgam que 6,7-dinitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 7-ciano-6-nitro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona são potentes antagonistas do receptor de glutamato não NMDA.
Sheardown, M.J. et al., Eur. J. Phamracol. 174:197-204 (1989), divulgam que 5, 7-dinitro-l, 4-di-hidroquihoxal'ina-2, 3-“dÍõna ‘ é um 13 potente antagonista do receptor da glicina insensível à estricnina e tem propriedades anticonvulsivas. No entanto, Sheardown et al. também divulgam que 5,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona bem como DNQX e CNQX têm um pobre acesso ao sistema nervoso central. 0 Pedido de Publicação da Patente Europeia No. W091/13878, divulga as seguintes 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas N-substituidas as quais se ligam ao receptor da glicina:
em que R representa hidrogénio, Ci_g alquilo or aralquilo e n é um número inteiro de 0 a 5; R4 representa hidrogénio ou hidroxílo; R5, R6, R7 e R8 representam independentemente hidrogénio, nitro, halogéneo, alcoxilo, ariloxilo, aralcoxilo, Ci-g alquilo ou arilo; Rs representa hidrogénio, alquilo inferior, ou arilo; R10 representa hidrogénio, ou alquilo, e os seus sais f armaceuticamente aceitáveis.
Leeson et al., J. Med. Chem. 34: 1243-1252 (1991), divulgam um. número de derivados do ácido quinurénico do antagonista do aminoácido excitatório não selectivo. Também divulgados são um número de quinoxalina-2,3-dionas estruturalmente relacionadas, que também são antagonistas de glicina/NMDA, mas que não são selectivas 14 e são muito menos potentes do que os derivados do ácido quinurénico. As quinoxalina-2,3-dionas têm a estrutura:
14 H
em que R é H, 5-C1, 7-C1, 5,7-03-2, 6,7-Cl2, 6,7-(CH3)2, 6-N02 ou 6,7-(N02)2. Também são divulgados um número de derivados de N-metilo.
Swartz et al.r Mol. Pharmacol. 41:1130-1141 (1992), revelam que certas benzazapinas substituídas e não substituídas são antagonistas competitivos dos canais do receptor de glutamato em neurónios corticais cultivados. Ver também, o pedido de publicação internacional No. W092/11854 que divulga que os compostos de fórmula
r' O
ORs em que R1-R4 podem ser hidrogénio, Ci_3 perf luoroalquilo, halo, nitro ou ciano e R5 pode ser hidrogénio ou um grupo de Cj-s alquilo, são antagonistas do local de ligação no complexo do receptor de NMDA.
Continua a existir uma necessidade para antagonistas de glicina/NMDA potentes e selectivos aos quais: 15 faltam os efeitos colaterais comportameiitais como PCP comuns para os bloqueadores do canal de NMDA como PCP tais como MK801 ou para os antagonistas do receptor de NMDA competitivos, tal como CGS19755; mostram potente eficácia anti-isquémica devido à natureza não competitiva do seu antagonismo de glutamato no receptor NMDA; atravessam a barreira do sangue do cérebro, em níveis suficientes de eficácia; têm utilidade, como novos anticonvulsivos com menos efeitos colaterais do que os bloqueadores do canal de NMDA como PCP ou os antagonistas de NMDA competitivos; ajudam a definir o significado funcional do local de ligação da glicina do receptor de NMDA in vivo.
Sumário da Invenção A invenção diz respeito à descoberta de uma classe de compostos que apresentam uma elevada afinidade para o local de ligação da glicina insensível à estricnina, que não apresenta efeitos colaterais de PCP e que atravessa'a barreira hematoencefálíca em níveis elevados. Isto está em contraste com relatos na literatura de que outros compostos, como por exemplo as 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas particulares e HA-966, quer não atravesse a barreira de sangue no cérebro ou fazê-lo em níveis baixos. Além disso, muitos destes compostos apresentam baixa afinidade de ligação para outros locais receptores. Assim, aqui são descritos compostos que têm elevada afinidade para o local de ligação da’ glicina, falta de efeitos colaterais de PCP e que atravessam a barreira hematoencefálíca em níveis elevados, Assim, os compostos da presente invenção são extremamente úteis para o tratamento de condições fisiopatológicas, sem efeitos colaterais significativos ou toxicidade. 16 A invenção refere-se à utilização de tais compostos para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de perda neuronal associada a acidente vascular cerebral, isquemia, trauma de CNS, cirurgia e hipoglícemia, bem como para tratar doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica, a doença de Huntington e a síndroma de Down, tratar ou prevenir as consequências adversas da sobrestimulação dos aminoácidos excitatórios, bem como tratar a ansiedade, as convulsões, a dor crónica, a psicose e- induzir a anestesia.
Tais compostos têm a fórmula descrita na reivindicação 1.
Descrição da.s Figuras A Figura 1 de referência mostra um gráfico de barras demonstrando a actividade locomotora de controlo normal, em roedores pré tratados com soro fisiológico. Aos roedores de controlo normais, foram dadas injecções intraperitoneais imediatamente antes do período de avaliação de seis horas de actividade locomotora. Os grupos de 6 roedores cada foram utilizados e os dados são apresentados como uma média ± de desvio padrão. A Figura 2 de referência mostra um gráfico de barras que demonstra os efeitos do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na actividade locomotora dos roedores de controlo normal (barras abertas) e de animais aos quais foi dado 1,0 mg/kg do composto (barras sólidas). Aos roedores foram dadas injecções intraperitoneais do composto imediatamente antes ao período de avaliação de seis horas de actividade locomotora. Aos animais de controlo foram dadas injecções de solução salina. Os 17 grupos de 6 roedores cada foram utilizados e os dados são apresentados como uma média ± de desvio padrão. A Figura 3 de referência mostra um gráfico de barras que demonstra os efeitos do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na actividade locomotora dos roedores de controlo normais (barras abertas) e de animais aos quais foi dado 3,2 mg/kg do composto (barras sólidas). Aos roedores foram dadas injecções intraperitoneais do composto imediatamente antes ao período de avaliação de seis horas .de actividade locomotora. Aos animais de controlo foram dadas injecções de solução salina. Os grupos de 6 roedores cada foram utilizados e os dados são apresentados como uma média + de desvio padrão. A Figura 4 de referência mostra um gráfico de barras que demonstra os efeitos do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na actividade locomotora dos roedores de controlo normais (barras abertas) e de animais aos quais foi dado 10 mg/kg do composto (barras sólidas). Aos roedores foram dadas injecções intraperitoneais do composto imediatamente antes ao período de avaliação de seis horas de actividade locomotora. Aos animais de controlo foram dadas injecções de solução salina. Os grupos de 6 roedores cada foram utilizados e os dados são apresentados como uma média ± de desvio padrão. A Figura 5 de referência mostra um gráfico de barras que demonstra os efeitos do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-d.i-hidroquinoxalina-2,3-diona na actividade locomotora dos roedores de controlo normais (barras abertas) e de animais aos quais foi dado 32 mg/kg do composto (barras sólidas). Aos roedores foram dadas injecções intraperitoneais do composto imediatamente antes ao 18 período de avaliação de seis horas de actividade locomotora. Aos animais de controlo foram dadas injecções de solução salina. Os grupos de 6 roedores cada foram utilizados e os dados são apresentados como uma média ± de desvio padrão. A Figura 6 de referência mostra um gráfico que demostra os efeitos do pré-tratamento com soro fisiológico imediatamente antes do início de um período de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Os animais foram testados para mudanças na actividade locomotora durante 4 horas sucessivas a seguir a lesões de reperfusão de isquemia, em comparação com os animais de controlo que não receberam nenhuma oclusão da artéria carótida. Os dados são expressos como o valor médio para cada grupo de 6 roedores aos quais foi dado 5 minutos de oclusão de carótida bilateral com tratamento prévio com solução salina (símbolo fechado) ou com tratamento prévio com salina, mas sem oclusão da carótida bilateral (símbolo aberto). Os animais foram . colocados em câmaras de actividade locomotora durante as 4 horas sucessivas, como indicado. A Figura 7 de referência mostra um gráfico demonstrando os efeitos do tratamento prévio com o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (0,32 mg/kg) imediatamente antes do início de um período de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Os animais foram testados para mudanças na actividade locomotora durante 4 horas sucessivas a seguir a lesões de reperfusão de isquemia. Os dados são expressos como o valor médio para cada grupo de S roedores aos quais foi dado 5 minutos de oclusão da carótida bilateral com pré-tratamento de fármaco (símbolo fechado) ou com com pré-tratamento de soro fisiológico, mas sem oclusão da artéria carótida bilateral (símbolo aberto). Os 19 animais foram colocados em câmaras de actividade locomotora durante 4 horas sucessivas, como indicado. A figura 8 de referência mostra um gráfico demonstrando os efeitos do tratamento prévio com o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroguinoxalina-2,3-diona (3,2 mg/kg) imediatamente antes do inicio de um periodo de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Os animais foram testados para mudanças na actividade locomotora durante 4 horas sucessivas após lesões de reperfusão de isquemia. Os dados são expressos como o valor médio para cada grupo de 6 roedores aos quais foi dado 5 minutos de oclusão da carótida bilateral com pré-tratamento de fármaco (simbolo fechado) ou com com pré-tratamento de soro fisiológico, mas sem oclusão da artéria carótida bilateral (simbolo aberto). Os animais foram colocados em câmaras de actividade locomotora durante 4 horas sucessivas, como indicado. A figura 9 de referência mostra um gráfico mostrando os efeitos do tratamento prévio com o composto de referência 5-cloro-7-trifluo-rometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (10 mg/kg) imediatamente antes do inicio de um período de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Os animais foram testados para mudanças na actividade locomotora durante 4 horas sucessivas após lesões de reperfusão de isquemia. Os dados são expressos como o valor médio para cada grupo de 6 roedores aos quais foi dado 5 minutos de oclusão da carótida bilateral com pré-tratamento de fármaco (símbolo fechado) ou com com pré-tratamento de soro fisiológico, mas sem oclusão da artéria carótida bilateral (simbolo aberto). Os animais foram colocados em câmaras de actividade locomotora durante 4 horas sucessivas, como indicado. 20 A figura 10 de referência mostra um gráfico mostrando os efeitos do tratamento prévio com o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (32 mg/kg) imediatamente antes do início de um período de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Os animais foram testados para mudanças na actividade locomotora durante 4 horas sucessivas após lesões de reperfusão de isquemia. Os dados são expressos como o valor médio para cada grupo de 6 roedores aos quais foi dado 5 minutos de oclusão da carótida bilateral com pré-tratamento de fármaco (símbolo fechado) ou com com pré-tratamento de soro fisiológico, mas sem oclusão da artéria carótida bilateral (símbolo aberto) . Os animais foram colocados em câmaras de actividade locomotora durante 4 horas sucessivas, como indicado. Ά figura 11 de referência mostra um gráfico de barras mostrando que os efeitos do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na primeira hora de actividade locomotora altera em comparação com os valores de controlo do soro fisiológico e de não isquémia. Estes dados estão sintetizados a partir das figuras anteriores e indicam que existe uma melhoria significativa na actividade locomotora espontânea dos animais aos quais foi dado 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em doses superiores a 0,32 mg/kg na primeira hora após a isquemia. Em contrapartida, os animais de controlo que não foram expostos à lesão de reperfusão de isquemia demonstraram um nível significativamente elevado de actividade locomotora na primeira hora de exploração, em comparação com os roedores isquémicos. A figura 12 de referência mostra um gráfico de barras mostrando os efeitos do tratamento prévio com o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na actividade 21 locomotora na 4 a hora de teste seguindo 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Todas as doses do composto protegidas significativamente contra a actividade locomotora aumenta rotineiramente produzida por oclusões da carótida bilateral por 5 minutos ou rnais. Os animais de controlo não expostos à isquemia mostrou uma baixa actividade exploratória que é normal para os animais saudáveis colocados na câmara da actividade locomotora durante 4 horas. 0 pré-tratamento com salina falhou aó interferir com o reforço pós-ísquémíco da actividade locomotora que é observada rotineiramente. 0,32-32 mg/kg do composto reduziu significativamente o aumento extraído da isquemia na actividade exploratória no interior da arena circular da câmara da actividade locomotora. Os dados estão expressos como a média dr 6 sujeitos ± de desvio padrão. A Figura 13 mostra um gráfico de barras mostrando mudanças na actividade locomotora como um resultado do tratamento com o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l, 4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (AGI), 24 horas depois da isquémia durante 1 hora de sessão de ensaio. Os animais foram colocados em câmaras de actividade locomotora, 24 horas depois da lesão de reperfusão de isquémia e avaliados para mudanças na actividade locomotora. Os animais de controlo foram animais não isquémicos de controlo de salina ou não isquémicos de controlo de fármaco colocados na câmara 24 horas depois da injecção de salina/fármaco. Os animais isquémicos (ISC) representam animais. aos quais foram dados pré-tratamentos de salina e colocados na câmara de actividade locomotora 24 horas depois do início da reperfusão da isquemia. Estes animais também foram aqueles que foram testados para as alterações horárias pós isquémicas na actividade locomotora representada nas figuras anteriores. Os animais aos quais foi dado 22 o pré-tratamento com o composto foram animais representados nas figuras anteriores para as mudanças pós reperfusão imediatas no comportamento. Todos os animais foram testados, às 24 horas, durante uma sessão de 1 hora.
Figura 14 de referência mostra um gráfico de barras mostrando os efeitos de pré e pós tratamento com o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona a 32 mg/kg. Os animais de controlo (CON) mão receberam isquémia, os animais de controlo de salina (SAL) receberam múltiplas injecções de 32 mg/kg, às 6, 4, e 2 horas e 30 minutos antes do inicio de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral. Os animais de pós-tratamento receberam doses a 30 minutos, 2 horas, 4 horas e 6 horas após a reperfusão. O ensaio foi realizado a 24 horas depois da reperfusão. Cada grupo representa a média + de desvio-padrão para 6 animais por grupo de tratamento. Como se pode ver, ambos os pré e pós-tratamento produziram um efeito protector comportamental significativo. Uma indicação clara de protecção ocorreu a 32 mg/kg.
A Figura 15 de referência mostra um gráfico de barras que mostra as mudanças pós-isquémicas no desempenho do labirinto do braço radial de roedores expostos a 5 minutos de oclusão da carótida bilateral 24 horas antes e pré-tratados com doses indicadas do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Os animais foram testados imediatamente após os testes da actividade locomotora para patrulhamento do comportamento em um labirinto de .8 braços. Este labirinto de 8 braços está localizado em um alojamento no qual nenhuma outra investigação foi conduzida. Todos os 8 braços foram idênticos em dimensões e na figuração. Nenhuns braços foram iscados com o alimento. Os animais foram testados até terem entrado e explorado cada um dos 8 braços. A 23 entrada de ura braço entrado previamente definiu um erro. Todos os animais completaram toda a tarefa exploratória antes de serem removidos. Cada coluna representa a média ± de desvio-padrão para 6 animais por condição de tratamento. Os animais de controlo não receberam isquémia, os animais de salina (SAL) receberam isquémia mas nenhum fármaco. Os animais que receberam isquémia mais tratamento com 0,32-32 mg/kg de fármaco mostraram uma protecção comportamental significativa de mudanças induzidas por isquémia no patrulhamento do comportamento. A Figura 16 de referência mostra um gráfico de barras mostrando os efeitos das doses de pré-tratamento do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona sobre a densidade de células neuronais no hipocampo dorsal (CA-1) ' dos roedores. Os roedores foram pré-tratados com doses de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona conforme descrito nas figuras anteriores e permitiu a recuperação para a lesão de reperfusão de isquémia durante 7 dias antes da anestesia e fixação do tecido. O tecido foi congelado, seccionado e corado, os núcleos neuronais foram contados em áreas discretas da região de CA-1 do hipocampo. Os dados são apresentados como a média ± de disvio-padrão para 6 sujeitos (cada sujeito foi avaliado durante um mínimo de 3 secções sucessivas do hipocampo dorsal para a perda neuronal). 0 pré-tratamento com 0,32-32 mg/kg de fármaco forneceu uma protecção significativa para a perda de células neuronais induzida por isquémia. A Figura 17 de referência mostra um gráfico de barras mostrando os efeitos do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na densidade neuronal no hipocampo dorsal (CA-1) do roedor. Os oredores foram pré-tratados e pós- 24 tratados com 3,2 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona e deixados a recuper para a lesão da reperfusão de isquemia 7 dias antes da anestesia e fixação do tecido. 0 tecido foi congelado, seccionado e corado, os núcleos neuronais foram contados em áreas discreta de CA-1. Os dados são apresentados como a média ± de desvio padrão de 6 sujeitos (cada sujeito foi avaliado durante um mínimo de 3 secções sucessivas do hipocampo dorsal para a perda neuronal) . Ambos os pré- e pós-tratados com 3,2 mg/kg da fármaco forneceram uma protecção significativa de perda de células neuronais induzida por isquémia. A Figura 18 mostra um gráfico de barras que mostra a inibição da dor induzida por formalina em ratos de 1, 5, 10, 20, 30 e 40 mg/kg do composto de referência de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona. Os ratos foram' injectados intra-peritonealmente quer com DMSO (veículo de controlo) ou com o fármaco em DMSO, 30 minutos antes da injecção subcutânea de 20 pL de 5 % de formalina na superfície plantar da pata traseira. Os ratos foram observados e o tempo gasto pelos ratos lambendo a pata traseira injectada em intervalos de cinco minutos, durante os períodos de tempo indicados foi gravado. 0 tempo despendido lambendo a pata traseira injectada é um indicador da dor experimentada pelo animal. Como mostrado na Figura 18, 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-díona inibiu o acto de lamber induzido pela formalina em uma maneira dependente da dose indicando uma potente eficácia antí-nociceptiva neste.modelo animal de dor crónica. A Figura 19 mostra um gráfico de barras mostrando a inibição da dor induzida pela formalina nos ratos por 5, 10, 20 e 40 mg/kg de 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Os ratos foram 25 injectados intraperitonealmente quer com DMSO (veiculo de controlo) ou com o fármaco em DMSO, 30 minutos antes da injecção subcutânea de 20 mL de 5% de formalina n a superfície plana da pata traseira. Os ratos foram depois observados e, o tempo gasto pelos ratos lambendo a pata traseira injectada em intervalos de cinco minutos, durante os períodos indicados, foi gravado, 0 tempo despendido lambendo a pata traseira injectada é um indicador da dor experienciada pelo animal. Como mostrado na Figura 19, 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona inibiu o acto de lamber induzido pela formalina de uma maneira dependente da dose indicando a potente eficácia anti-nociceptiva neste modelo animal de dor crónica.
As Figuras 20A e 20B retratam gráficos em linhas que mostram a inibição da dor induzida por formalina em ratos por 1, 5, 10, 20 e 40 mg/kg de 6, 7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Oa ratos foram injectados intraperitonealmente quer com DMSO (veiculo de controlo) ou com o fármaco em DMSO, 30 minutos antes da injecção subcutânea de 20 mL de 5% de formalina n a superfície plana da pata traseira. Os ratos foram depois observados e o tempo gasto pelos ratos a lamber a pata traseira injectada em intervalos de cinco minutos, durante os períodos de tempo indicados, foi gravado. 0 tempo despendido a lamber a pata traseira injectada é um indicador da dor experienciada pelo animal. Como mostrado nas figuras 20A e 20B, 6,7-dibromo-S-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona inibiu o acto de lamber induzido pela formalina em uma maneira dependente da dose tanto na fase inicial (0-5 minutos; Fig. 20A) da resposta da dor (lamber) e na fase tardia (15-50 minutos; Fig. 20B), da resposta da dor lambendo indicando potente antinociceptivo eficácia neste modelo animal de dor crónica. 26 A figura 21 mostra um diagrama que mostra as solubilidades do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona, o sal de colina, o sal monopotássico e o seu sal de di-potássio. A Figura 22A mostra um gráfico mostrando a actividade sedativa (perda do reflexo de retificação) de ratos ao longo do tempo após a injecção do composto de referência de 5,7-dicloro-l,4 di-hidroquinoxalina-2,3-diona (composto no. 1; ver a Fig. 22B) , em comparação com o composto de referência de 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (composto no. 2; ver a Fig. 22B; inactiva) e cetamina (composto no. 3, ver a Fig. 22B).
As Figuras 23A e 23B retratam gráficos que mostram os efeitos de diferentes doses do PCP, o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5-nitro-6,7-di-cloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em ratos treinados para discriminar 2 mg/kg de solução salina de PCP. A Figura 23A mostra o grau dos efeitos como PCP como mostrado na percentagem média da selecção da alavanca de PCP. A Figura 23B mostra os efeitos nas taxas globais de resposta. Os valores acima de SAL, PCP e DMSO mostram os resultados de testes de controlo com solução salina, 2 mg/kg de PCP e 0,5 mL/kg de DMSO realizados antes do ensaio de PCP, 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5-nitro-β,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Os valores representam a média de seis ratos. A Figura 24 mostra um gráfico de barras mostrando a actividade locomotora de ratos Suiços/Webster após a injecção interperitoneal de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em DMSO ou MK801 em solução salina. Os grupos de pelo menos seis ratos cada 27 foram injectados com veículo ou com doses crescentes de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em DMSO ou MK801 em solução salina. A actividade locomotora, em seguida, foi gravada durante quatro períodos sucessivos de 15 minutos. A actividade locomotora no segundo intervalo de quinze minutos, é mostrada.
Descrição das formas de realização preferidas A presente invenção refere-se à utilização de compostos que têm elevada afinidade para o local de ligação da glicina, a que faltam efeitos colaterais de PCP e que atravessam a barreira hematoencefálica . em níveis elevados para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou para a prevenção das condições fisiopatológicas acima mencionadas. Tais compostos são 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas que são altamente selectivas, antagonistas competitivos do local de ligação da glicina do receptor de NMDA. As 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas da invenção têm a seguinte fórmula (I):
I ou um seu tautómero; em que R1, R2, R3 e R4 são como definido na reivindicação 1 ou 3.
Os grupos típicos de Ci-6 alquilo incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, 2- 28 pentilo, 3-pentilo, neopentilo, hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-l-pentilo, 3-metil-l-pentilo, 4-metil-l-pentilo.
Os grupos halo típicos incluem flúor, cloro, bromo e iodo.
Os grupos de haloalquilo típicos incluem grupos de alquílicos Ci_6 alquilo substituídos por um ou mais átomos de de flúor, cloro, bromo ou iodo, por exemplo, grupos de fluormetilo, difluorometilo, trifluorometilo, pentafluoroetilo, 1,1-difluoroetílo e triclorometilo.
Os grupos amino típicos incluem -NH2, NHR9 e -NR9R10, em que Ra e R10 são um dos grupos de Ci-e alquilo mencionados acima.
Os grupos acilamino típicos incluem um grupo amino substituído por um grupo de C2-6 acilo, por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo e hexanoílo.
As quinoxalina-2,3-dionas particularmente preferidas da presente invenção incluem, 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-difluoro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6-cloro-5-nitro-7-bromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-di-cloro-5-bromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6-cloro-5-nitro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 5-bromo-6,7-di-fluoro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 5,6,7,8-tetrafluoro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 5,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina- 2.3- diona, 5-bromo-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 5-bromo-7-fluoro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-di-bromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 4-carboximetil- 1.4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 5-amino-6,7-dibromo-l,4-di- hidroquinoxalina-2,3-diona, 5-amino-6,7-dicloro-l,4-di-hidro- 29 quinoxalina-2,3-diona, 7-cloro-6-nitro-5-trifluorometil-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 5-amino-7-cloro-5-trifluorometil-l, 4-di-hidroquinoxalina-2, 3-diona, 7-cloro-5-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 7-bromo-6-nitro-5-trifluorometil-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6-amino-7-bromo-5-trifluorometil- 1.4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 7-bromo-5-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 7-fluoro-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6-amino-7-fluoro-5-trifluorometil- 1.4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 7-fluoro-5-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7“dicloro-5-hidroxilamino-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, e 6,7-dibromo-5-hidroxilamino-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona.
Os compostos especialmente preferidos são 6,7-dicloro-5-nitro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona, 6,7-difluoro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina -2,3-diona, 6-cloro-5-nitro-7-trifluorometil-1,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona e 7-bromo-6-cloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2 ,3-diona. 6,7-Dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina -2,3-diona e o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hídroquinoxalina-2,3-diona previnem a morte celular do nerco induzida por isquémia - no modelo de isquémia global dos roedores depois da administração interperitoneal. 6,7-Dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona, e o composto' de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona são potentes anti-convulsivos em pelo menos dois dos três modelos animais, depois da administração interperitoneal do composto de referência. 5-Cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-dicloro-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona também foram verificados como 30 exibindo eficácia analgésica depois da administração interperitoneal em um animal com dor crónica (induzida pela formalina).
Os compostos da presente invenção apresentam baixa reactividade transversal com o cainato, AMPA, e receptores do quisqualato e o glutamato e os locais de ligação de PCP dos receptores de NMDA e são, portanto, distintos de quaisquer 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas anteriormente descritas, em particular, 6-ciano-7-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina -2,3-diona conforme divulgado na patente norte-americana No. ') O i) 4,975,430. j - · -
Os compostos da presente invenção são activçs no tratamento ou na prevenção da perda neuronal, doenças neurodegenerativas, dor crónica, são activos como anticonvulsivos e induzem a anestesia sem efeitos colaterais fatídicos causado^ por ligações não selectivas com outros receptores, particularmente, o cainato, AMPA, e os receptores de quisqualato e o PCP e os receptores de glutamato e associados com o receptor de NMDA. Além disso, os compostos da presente invenção são eficazes para tratar ou prevenir as consequências nefastas da hiperactividade dos aminoácidos excitatórios, por exemplo, aqueles que estão envolvidos no sistema receptor de NMDA, por bloquearem os receptores da glicina e prevenirem os canais de catião controlados pelo ligando de abertura e permitindo o afluxo excessivo de Ca++ em neurónios, como ocorre durante a isquémia.
As doenças neurodegenerativas que podem ser tratadas com os compostos da presente invenção, incluem aqueles que foram seleccionados a partir do grupo que consiste da doença de 31
Alzheimer, da esclerose lateral amiotrófica, da doença de Huntington e da síndroma de Down.
Os compostos da presente invenção encontram particular utilidade no tratamento ou na prevenção da perda neuronal associada a múltiplos acidentes vasculares cerebrais, que dão origem à demência. Depois de um paciente ter sido diagnosticado como sofrendo de um acidente vascular cerebral, os compostos da presente invenção podem ser administrados para melhorar a isquémia imediata e prevenirem mais danos neuronais que podem ocorrer ataques recorrentes.
Além disso, os compostos da presente invenção são capazes de atravessar a barreira do sangue do cérebro, em contraste com 6-ciano-7-nitro-l,4-di-hidroquinòxalina-2,3-diona e 6,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e outras 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas 6,7-disubstituídas que são incapazes de atravessar a barreira do sangue do cérebro depois de administração interperitoneal (ver Turski, L. et al. , J. Pharm. Exp. Ther. 260: 742-747 (1992)). Ver também, Sheardown et al., Eur. J. Pharmacol, 174:197-204 (1989), que divulgam que a 5,7-dinitro-l,4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-dinitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6-ciano-7-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona têm um acesso pobre ao sistema nervoso central.
Para um composto começar a mostrar eficácia in vivo e, deste modo, a capacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica, o composto deve apresentar um ED5o de menos de cerca de 100 mg/kg de peso corporal do animal. Preferivelmente, os compostos da presente invenção exibem um ED50 de menos de cerca de 2 0 mg/kg e, mais preferivelmente, inferior a cerca de 10 mg/kg. 32
Os compostos da invenção encontram particular utilidade no tratamento ou na prevenção de consequências neurológicas adversas da cirurgia. Por exemplo, a cirurgia de bypass coronário necessita da utilização de máquinas de coração-pulmão, que tendem a introduzir bolhas de ar no sistema circulatório que podem alojar-se no cérebro. A presença dessas bolhas de ar rouba tecido neuronal de oxigénio, resultando em anóxia e isquémia. A administração pré- ou pós-cirúrgica das 1,4-di-hidroquinoxalinas da presente invenção permitirá tratar ou prevenir a consequente isquémia. Em uma forma de realização preferida, os compostos da invenção são administrados a pacientes submetidos a cirurgia de bypass cardiopulmonar ou a cirurgia de endarterectomia da carótida.
Os compostos da presente invenção também encontram utilidade no tratamento ou na prevenção da dor crónica. Essa dor crónica pode ser o resultado da cirurgia, trauma, dor de cabeça, artrite, ou outra doença degenerativa. Os compostos da presente invenção encontram particular utilidade no tratamento da dor fantasma que resulta de uma amputação de uma extremidade. Além do tratamento da dor, os compostos da invenção também são úteis na indução anestésica, quer a anestesia geral ou local, por exemplo, durante a cirurgia.
Um total de mais de 30 derivados de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foram sintetizados e testados para a actividade antagonista da glicina in vivo. De entre estes novos medicamentos, vários compostos com uma afinidade particularmente elevada para os receptores de glicina/NMDA, foram identificados. A partir da inspecção da estrutura dos mais potentes análogos, parece que a combinação de um grupo de NO2 com dois átomos de halogéneo, por exemplo, cloro ou bromo, ou com um grupo de Cl e um de CF3 no 33 sistema de anel de 1,4-di-hidroquinoxalina-2, 3-diona dá antagonistas da glicina particularmente potentes. Na verdade, 6,7-dibroino-5-nitro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6, 7-dicloro-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, com afinidades de 6 nM e 8 nM, respectivamente, para o local de ligação da glicina, são os antagonistas mais potentes da glicina/NMDA descobertos até à data. É de salientar, que o grupo de NO2 no composto de 6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dí-hídroquínoxalina-2,3-diona tem aumentado, por várias centenas de vezes, a afinidade do receptor de glicina do seu composto relacionado, 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (DCQX) , que tem sido descrito por outros como um antagonista da glicina potente e selectivo (Yoneda e Ogita, Biochem. Biophy. Res. Commun. 164:841-849 (1989). Surpreendentemente, é possível reduzir o grupo de nitro de 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona para se obterem tituidos 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas amino-substituídas as quais também têm elevada afinidade de ligação para ò local de ligação da glicina.
Porque as 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas, especialmente CNQX e DNQX, são conhecidas por serem potentes antagonistas de cainato e de AMPA, os compostos da presente invenção foram testados em ensaios de ligação de cainato e de AMPA para determinar a reactividade transversal nestes receptores não-NMDA. Os antagonistas potentes da glicina foram verificados como não tendo reactividade transversal significativa nos locais de cainato e de AMPA ou somente uma pequena reactividade transversal. Assim, os compostos da presente invenção são potentes antagonistas da glicina, mas apresentam pouca ou nenhuma' reactividade.transversal nos locais de cainato e de AMPA. 34
Preferivelmente, os compostos da invenção apresentam uma afinidade de ligação para o local de ligação da glicina de Ki=10 μΜ ou menos, mais preferivelmente de 1 μΜ ou menos, e mais preferivelmente, 500 nM ou menos e mais preferivelmente, 100 nM ou menos e mais preferivelmente, 10 nM ou menos. Também preferivelmente são os compostos que apresentam ligação nos locais de cainato e AMPA de não menos do que Κι=1μΜ e, mais preferivelmente, não menos de 10 μΜ. para
Os novos antagonistas da glicina foram depois testados para a actividade in vivo depois da injecção intraperitoneal usando uma série de testes anticonvulsivos em ratos (modelo de ataque audiogénico em ratos DBA-2, convulsões induzidas por pentilenotetrazol em ratos, morte induzida por NMDA em ratos). Todos os compostos testados apresentaram actividade em um ou mais dos três modelos. 6, 7-Dicloro-5-nitro-l, 4-d'i-hidroquinoxalina-2,3-diona (composto No. 1, Tabela IV) foi o mais potente de um dos cinco, particularmente no modelo de ataque audiogénico (ED5o=5mg/kg) e o modelo de morte induzida por NMDA, (ED50= 20mg/kg). 6,7-Dibromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (composto No. 13, Tabela IV) foi também muito potente, particularmente no modelo de ataque audiogénico (EDso=10mg/kg). No entanto, estes dois compostos apresentaram diferentes propensões para causar efeitos colaterais de ataxia, como estipulado pelo teste de ataxia giratório no rato. Em particular, 6,7-dibromo-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona apresentou um TD5O=200 mg/kg neste teste. Assim, este composto é eficaz para prevenir convulsões em doses que são muito inferiores às que causam efeitos colaterais de ataxia. Isto compara-se a um TD50=27 mg/kg no teste de ataxia giratório para 6,7-Dicloro-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona. 35
Assim, os compostos da presente apresentam efeitos colaterais de ataxia ataxia no teste de ataxia giratório a níveis de dosagens superiores a cerca de 100 mg/kg, mais preferivelmente, superiores a 200 mg/kg.
Dois compostos (No.l (Tabela IV) e o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (composto No. 2 (Tabela IV)) foram também testados para a eficácia neuroprotectora depois de injecção intraperitoneal no modelo de isquémia global do rato e foram verificados como tendo potente eficácia neuroprotectora neste paradigma. Os mesmos compostos também foram testados em ensaios de discriminação de fármacos em ratos treinados para discriminar o PCP da salina. Nenhum dos dois compostos generalizou para o PCP, em qualquer dose nestes estudos de discriminação de · fármaco. Além disso, nenhum dos compostos produziu uma excitação comportamental nos testes da actividade locomotora- no rato. Os resultados destes estudos sugerem que os novos antagonistas' da glicina da presente invenção não mostram os efeitos secundários comportamentais como PCP, que são comuns aos bloqueadores do canal de NMDA tal como ο MK801 e o PCP ou para antagonistas de NMDA competitivos tais como os CGS19755. É importante que os novos antagonistas da glicina tenham mostrado potente actividade in vivo depois da injecção intraperitoneal sugerindo que estes compostos podem penetrar a barreira do sangue do cérebro. Outros investigadores relataram que os análogos CNQX e DNQX de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não podem penetrar na barreira do sangue do cérebro (Turski, L., e£ ai., J. Pharm. Exp. Ther. 260:742-747 (1992)), um achado que foi confirmado pelos inventores. Aparentemente, as alterações nos substituintes do anel de benzeno de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas não só resultam em 36 um aumento dramático na afinidade dos receptores de glicina e a perda na afinidade do receptor de- AMPA/caínato, . mas também pode produzir compostos com uma capacidade bastante satisfatória para penetrar na barreira sanguínea do cérebro (ver Turski, L. et ai., J. Pharm. Exp. Ther. 260: 742-747 (1992)).
Antes da presente invenção, um dos principais farmacoporos para o antagonismo da glicina foi pensado ser o grupo de amida na 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona com reforço da potência ocorrendo com a substituição de substituintes que retiram o electrão no anel aromático, baixando assim o pKa do hidrogénio da amida (Gray et al., J. Med. Chem. 34:1283 (1991); Leeson, P.D., et al.r J. Med. Chem. 34:1243 (1991)). Embora os estudos descritos na invenção tenham geralmente corroborado esta proposta, foi agora descoberto que as posições relativas dos substituintes sobre o anel,. assim como a identidade dos grupos que retiram o electrão são igualmente importantes. A presente invenção é direccionada a esta descoberta.
Foi adicionalmente descoberto que um ou ambos os hidrogénios da amida podem ser substituídos por grupos de amina, hidroxilo, carboxialquílo, e carboxiaralquilo e que os compostos resultantes retêm elevada.ligação ao receptor da glicina. 0 novo antagonista mais potente que é uma parte desta invenção é 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalína-2,3-diona (Ki^SnM). 0 segundo antagonista mais potente é 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (Ki=8nM). Outros antagonistas potentes incluem uma mistura de 5-cloro-7-trífluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona nitrada (os compostos de referência 3x e 3y Tabela I, e os compostos de referência No. 3 e 4, Tabela IV) . Um outro antagonista potente sintetizado na série 1,4-di-hidro-2,3- 37 quinoxalinadiona é o composto de referência 5-cloro-7-trifluoro-metil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (3h, Tabela I e o composto No. 2, Tabela IV) . Um outro derivado com potência apreciável, mas muito mais baixa é o composto de referência -nitro-7-(trifluorometil)-1,4-di-hidro-2,3-quinoxaiinediona (3k, Tabela I) . A colocação e o tipo de grupo de retirada do electrão sobre o anel parece ser importante, uma vez que as substituições nas posições -5 e -7 do anel de 1,4-dihidro-2,3-quinoxalinadiona parecem reforçar a potência do local de ligação da glicina. A substituição na posição 6 por grupos ionizáveis, tais como sulfonatos, sulfonamidas primárias (31-n, Tabela I) e ácidos carboxílicos destrói a capacidade de ligação dos compostos para ó receptor da glicina. Nem a alquilação da sulfonamida (3o-p, Tabela I), nem a metílação do ácido conduz a um aumento da actividade. A metilação do azoto de amida no anel de quinoxalina também destrói a capacidade de ligação do composto, como evidenciado pela falta de actividade da 6,7-dinitro-N-metil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalina-diona. A síntese do análogo da piridina (Exemplo 26) e um análogo da pteridina (Exemplo 27) de 1,4-dihidro-2,3-quinoxalinadiona renderam compostos inactivos.
Um outro aspecto importante da presente invenção refere-se á descoberta de que 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas amino-substituídas também têm elevada afinidade de ligação para o local de ligação da glicina. Isto foi inesperado, tendo em conta o facto de que ois grupos de amino são dadores de eletrões e com a expectativa de que os grupos de retirada do electrão são importantes para a elevada afinidade de ligação.
Os compostos sintetizados para testes como potenciais antagonistas da glicina são resumidos a seguir (Tabela I) . a maioria ficou 38 disponível por simples condensação de oxalato de dietilo com o diaminobenzeno correspondente de acordo com Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962). Também foi descoberto que as 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadionas podem ser facilmente preparadas em elevado rendimento através do aquecimento do ácido oxálico e da o-diamina correspondente de cerca de 100 a cerca de 140 °C durante 1 a 10 horas, na presença de um ácido mineral forte tal como o HC1, H2SO4, H3PO4. Em uma forma de realização preferids, o ácido oxálico e a o-diamina são aquecidos a 125 °C em 2N de HC1 durante 2,5 horas para dar a correspondente 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona em elevado rendimento. A presente invenção é também dirigida a este processo melhorado para a preparação das 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadionas.
Os o-diaminobenzenos de partida estão disponíveis, quer directamente a partir do fabricante ou foram facilmente acessíveis através da redução da o-nitroanilina correspondente.(Esquema I, eq. 1) , de acordo com Bellamy, F.D. e Ou, K., Tetr. Lett. 25:839 (1984). As nitrações foram realizadas pelo tratamento da 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona com KNO3 no concentrado de H2SO4 (Esquema III, eq. 2). As 5-halo-6,7-fluoro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadionas foram preparadas pelo tratamento da 4,5-difluoro-2-nitro-anilina com N-bromosuccinirnida ou N-clorosuccinimida (Mitchell, R.H., et al.t J. Org. Chem. 44:4733 (1979)), seguido pela redução e condensação com oxalato de dietilo. Os compostos foram testados para a potencial actividade antagonista da glicina, por se observar a inibição da ligação de ΙμΜ de [3H]-MK-801 estimulado pela glicina nos homogeneizados da membrana do cérebro do rato ou do porco da guiné. Quanto mais potente é o antagonista da glicina, menos o [3H]-MK-801 se pode ligar uma vez que o local de ligação de [3H] -MK801 (receptor de PCP) é acessível apenas mediante a abertura do canal de ião pelo glutamato e a glicina (Fletcher, E.L., et al., em 39
Glycine Neurotransmission, Otterson, P. , et al. (editores), John Wiley and Sons (1990); Johnson, J.W., et al., Nature 325:529 (1987)}.
Esquema I
40
Tabela I
1 2 3
Ri r2 *3 r4 la H F H H b ' H CN H H c H CFj H H d H F F H e F F F F f Br H F H iq Cl H F H r Cl F F H s Br F F H t H Br F H 2a H F H H b H CN H H c H cf3 H H d H F F H e F F F F f Br H F H g E Cl F H h Cl H cf3 H i Br H cf3 H 2q Cl H F H r Cl F F H s Br F F H t H Br F H u Cl H Cl H V Br H Br H w Cl Cl Cl Cl 3a H F H ' H. b H CN H H 41 c H cf3 H H d H F F H e F F F F f Br H F H g H Cl F H h Cl H cf3 H i Br H cf3 H j H F no2 H k H F C3 no2 H 1 H S0C12 H H m H so2h H H n H so2nh2 H H o H S02N-n-Pr H H P H SOz$ í CH3 í 2 fí H 3q Cl H F H r Cl F F K s Br F F H t H Br F H u Cl H Cl H V Br H Br H w Cl Cl Cl Cl y Cl H cf3 no2 X Cl N02 cf3 H z H Br Br no2
Os sulfonatos e os derivados foram preparados pelo tratamento da 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona progenitora com ácido clorôssulfóníco e tratamento subsequente com a amina desejada para formar a sulfonamida (Esquema I, eq. 3). Ver Mitchell et al., J. Org. Chem. 44: 4733 (1979). A 5-bromo-7-fluoro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona foi preparada por tratamento da 4-fluoro-2-nitroanilina com N-bromosuccinimida seguido pela redução e condensação com oxalato de dietilo. 42 A actividade ansiolitica de qualquer composto particular da presente invenção pode ser determinada pela utilização de qualquer um dos modelos animais reconhecidos para a ansiedade. Um modelo preferido é descrito por Jones, B.J. et al,, Br. J. Pharmacol. 93:985-993 (1988). Este modelo envolve a administração do composto em questão aos ratos que possuem um elevado nível basal de ansiedade. 0 teste é baseado na constatação de que esses ratos ficam aversivos quando retirados de um ambiente caseiro escuro, em uma sala de ensaio escura e colocados em uma área que está pintada de branco e brilhantemente iluminada. A caixa de teste tem dois compartimentos, um branco e iluminado brilhantemente e um negro e não iluminado. 0 rato tem acesso a ambos os compartimentos através de uma abertura ao nível do chão na divisória entre os dois compartimentos. Os ratos são colocados no centro, da área brilhantemente iluminada. Após localizar a abertura para a área escura, os ratos são livres de passar para a frente e para trás entre os dois compartimentos. Os taos de controlo tendem a dispender uma proporção maior de tempo no compartimento escuro. Quando um determinado agente ansiolítico lhes é dado, os ratos passam mais tempo a explorar o compartimento brilhantemente iluminado mais novo e apresentam uma latência mais demorada para se moverem para o compartimento escuro. Além disso, os ratos tratados com este agente ansiolítico apresentam mais comportamento no compartimento branco, conforme medido pelas criações exploratórias e travessias de linha. Uma vez que os ratos podem habituar-se às condições do teste, os ratos ingénuos deverão sempre ser utilizados no teste. Cinco parâmetros podem ser medidos: a latência para a entrada no compartimento escuro, o tempo gasto em cada área, o número de transições entre os compartimentos, o número de linhas atravessadas em cada um compartimento, bem como o número de levantamentos em cada compartimento. A administração dos·compostos 43 é esperada resultar em ratos que gastam mais tempo na área brilhantemente iluminada, maior, da câmara de ensaio.
No modelo de exploração luz/escuro, a actividade ansiolitica de um agente putativo pode ser identificada pelo aumento do número de atravessamentos da linha e os levantamentos no compartimento com luz, a expensas do número de travessias da linha e levantamentos no compartimento escuro, em comparação com os ratos de controlo.
Um segundo modelo animal preferido é o teste de interacção do rato social, descrito por Jones, B.J. et al., supra, em que o tempo que dois ratos gastam em interacção social, é quantificado. A actividade ansiolitica de um agente putativo pode ser identificada através do aumento do tempo em que os pares de ratos machos gastam em interacção social activa (90% dos comportamentos são de averiguação em natureza). Tanto a familiaridade e o nível luz do teste de arena podem ser manipulados. Os ratos não medicamentados mostram o nível mais elevado de interacção social quando o teste de arena é familiarizado e é iluminado por luz baixa. A interacção social diminui se a arena não é familiarizada aos rats ou é iluminada por luz brilhante. Os agentes ansioliticos evitam esse declínio. O nível geral da actividade motora pode também ser medida para permitir a detecção de fármacos específicos para comportamentos sociais. A presente invenção diz respeito à utilização dos compostos aqui divulgados na fabricação de sedativos, hipnóticos. Verificou-se que o antagonista da glicina/NMDA, 5,7-dicloro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (composto de referência) tem potente actividade sedativa/hipnótica depois da injecção intravenosa nos ratos. Em contrapartida, 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3- 44 diona (composto de referência) é completamente desprovida de capacidade sedativa, hipnótica (ver a figura 22A). 5,7-Dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é consideravelmente mais potente e de longa duração como um sedativo-hipnótico do que a cetamina, um bloqueador do canal de NMDA utilizado como um anestésico em seres humanos. A afinidade de ligação de 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (Κί=0,9μΜ) no receptor da glicina não é substancialmente diferente da de 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (Κί=0,33μΜ). Igualmente, o cainato e a afinidade de ligação de AMPA de 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não são substancialmente diferentes. Assim, é provável que a diferença na actividade sedativa/hipnótica entre os dois compostos seja devida ao facto de que 5,7-dicloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona penetra facilmente na barreira sanguínea, enquanto que o 6,7-Dicloro-l, 4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona, não. A mesma diferença na eficácia in vivo entre esses dois compostos também tem sido observada nos testes de eficácia anti-convulsivos.
Também divulgadas são as composições em que os compostos da presente invenção estão contidos em uma quantidae que é eficaz para conseguir a sua finalidade. Embora as necessidades individuais variem, a determinação de variações óptimas de quantidades de eficácia de cada componente está com a especialidade da técnica. Tipicamente, os compostos podem ser administrados aos mamíferos, por exemplo, seres humanos, oralmente, a uma dose de 0,0025 a 50 mg/kg, ou uma quantidade equivalente do seu sal farmaceuticamente aceitável, por dia do peso corporal do mamífero a ser tratado para perturbações de ansiedade, por exemplo, perturbações de ansiedade 45 generalizada, perturbações fóbicas, perturbações compulsivas obsessivas, perturbações de pânico, e perturbações de estresse pós-traumático. Preferivelmente, 0,01 a 10 mg/kg, deve ser administrado por via oral para tratar ou prevenir essas perturbações. Para a injecção intramuscular, a dose é de um modo geral de cerca de metade da dose oral. Por exemplo, para o tratamento ou a prevenção da ansiedade, uma dose intramuscular adequada deverá ser de 0,0025 a 15 mg/kg, e mais preferivelmente, de 0,01 a 10 mg/kg.
No tratamento ou prevenção de perda neuronal na isquémia, no trauma do cérebro e da medula espinhal, hipóxia, hipoglicémia, e cirurgia, bem como para o tratamento da doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington e síndroma de Down, ou para tratar uma doença em que a fisiopatologia da doença envolve hiperactividade dos aminoácidos excitatórios. ou do canal iónico do receptor de NMDA relacionado com a neurotoxicidade, as composições farmacêuticas da invenção podem compreender os compostos da presente invenção a um nível de dose unitária de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal, ou a uma quantidade equivalente do seu sal farmaceuticamente aceitável, num regime de 1-4 vezes por dia. Quando usados para tratar a dor crónica ou para a indução anestésica, os compostos da invenção podem ser administrados a um nível de dose unitária de 0,01 a 50mg/kg de peso corporal, ou a uma quantidade equivalente do seu sal farmaceuticamente aceitável, num regime de 1-4 vezes por dia. Evidentemente, entende-se que o nível exacto do tratamento vai depender do caso histórico do animal, por exemplo, do ser humano, a ser tratado. O nível exacto do tratamento pode ser determinado por um especialista na técnica sem experimentação. 46 A dose oral unitária pode compreender de 0,01 a 50 mg, preferivelmente de 0,1 a 10 mg do composto. A dose unitária pode ser administrada uma ou mais vezes por dia, como um ou mais comprimidos contendo cada um entre 0,1 a 10, convenientemente de 0,25 a 50 mg do composto ou os seus solvatos.
Além de administrar o composto como uma matéria-prima química, os compostos da invenção podem ser administrados como parte de uma preparação farmacêutica contendo portadores farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos compostos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Preferivelmente, as preparações, particularmente aquelas preparações que podem ser administradas oralmente e que podem ser utilizadas para o tipo preferido de administração, tais como comprimidos, drageias e cápsulas, e também as preparações que podem ser administradas retalmente, tais como supositórios, bem como as soluções adequadas para administração por via oral ou injectável, contêm de 0,01 a 99 por cento, preferivelmente de 0,25 a 75 por cento do composto(s) activo(s), juntamente com o excipiente.
Também incluída no âmbito da presente invenção está a utilização de sais não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção das condições patológicas reivindicadas. Os sais de adição ácidos são formados por se . misturar uma solução do composto com uma solução de um ácido farmaceuticamente aceitável não tóxico, tal como o ácido clorídrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico, ácido fosfórico e ácido oxálico. Por exemplo, os sais básicos são formados por se misturar uma solução de 1,4-di- 47 hidroquinoxalina-2,3-diona com uma solução de uma base farmaceuticamente aceitável não-tóxica, tal como o hidróxido de sódio e o carbonato de sódio.
Os sais referidos das 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas da invenção são os sais altamente solúveis que compreendem um contra-ião de amónio C3-24, em que um dos grupos de alquilo pode ser substituído com um grupo de hidroxilo. A maioria das 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas são altamente solúveis em solução aquosa. Assim, a administração intravenosa das 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas é limitada pela insolubilidade relativa do agente activo. Os sais de amónio altamente solúveis podem ser preparados, por exemplo, pela dissolução da 1,4-hidroquinoxalina-2,3-diona em uma solução de um equivalente molar do hidróxido de amónio ou composto de amino correspondentes.
Os contra-iões de amónio podem ser catiões de amónio quaternários ou aminas mono, di ou tri-substituídas, que formam sais de amónio protonados quando misturados com uma 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em solução. 0 sal de mono-colina das 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas tem um pH de cerca de 7,8-9,8, dependendo da 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona utilizada. Alternativamente, a 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pode, primeiro, ser dissolvida em uma solução contendo 2 equivalentes molares do hidróxido de amónio. 0 sal de di-colina pode ser isolado ou o pH da solução pode ser ajustado para cerca de 7,8-9,8 com 1 equivalente de ácido acético. 0 . sal de amónio das 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas pode facilmente ser isolado na forma pura através da liofilização da 48 solução para dar um pó seco que é altamente solúvel em água. Até 90 mg/mL ou mais do sal de mono-colina de uma 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona irá dissolver em água para dar uma solução clara. O sal pode também ser dissolvido em uma solução isotónica de glicose adequada para injecção intravenosa.
Exemplos de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas que podem ser solubilizadas, de acordo com a presente invenção incluem aquelas divulgadas aqui, bem como aquelas divulgadas nas patentes norte-americanas Nos. 5,109,001, 5,081,123, 5,079,250, 5,075,306, 5,057,516, 5,026,704, 5,061,706, 4,977,155, 4,975,430, 4,889,855, 4,812,458, 3,992,378, 3,962,440, 4,812,458, 4,659,713, 4,948,794, o pedido da publicação internacional No. W091/13878, Yoneda e Ogita, Biochem. Biophys. Res. Comiaun. 164:841-849(198 9), Kleckner e Dingledine, Mol. Pharm. 36:430-436(1989), Rao, T.S. et al.r Neuropharmacology 29:1031-1035 (1990), Pellegrini-Giampietro, D.E. et al., Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286 (1989), Ogita e Yoneda, J. Neurochem. 54:699-702 (1990), Kessler, M. et ai., Brain Res. 489:377-382 (1989), os pedidos da publicação das patentes europeias nos. 0 377 112, 0 315 959, e 260,467, Lester, R.A. et al., Mol. Pharm. 35:565-570 (1989), Patel, J. et al., J. Neurochem. 55:114-121 (1990), Horner, L. et al., Chem. Abstracts 48:2692 (1953), Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc.:1170-1176 (1962), Honore, T. et al., Science 241:701-703 (1988), e Sheardown, M.J. et al., Eur. J. Pharmacol. 174:197-204 (1989), cujas divulgações são aqui totalmente incorporadas por referência.
Exemplos de hidróxidos de amónio, que podem ser usados para preparar os sais de amónio da presente invenção incluem qualquer hidróxido de amónio tetra-Ci-6 alquilo, por exemplo, hidróxido de tetrametilamónio, hidróxido de tetraetilamónio, tetrabutilamónio, 49 hidróxido de tetrapentilamónio, hidróxido de tetra-hexilamónio, bem como quaisquer hidróxido de amónio tri Ci,6-alquil-Ci.6 alcanol, por exemplo, hidróxido de colina (3-hidroxipropil)trimetil-hidróxido de amónio, (4-hidroxibutil)hidróxido, de trimetilamónio (2-hidroxietil) hidróxido de trietilamónio, (2-hidroxietil)hidróxido de tripropilamónio, e (2-hidroxietil)hidróxido de tributilamónio. Preferivelmente, o hidróxido de amónio é hidróxido de colina. Além disso, qualquer mg/mL). Assim, este aspecto da invenção é um grande avanço na tecnologia, uma vez que permite a preparação de soluções aquosas concentradas de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas para administração intravenosa.
Alguns dos contra-iões de amónio úteis para solubilizarem as 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas podem mostrar toxicidade após a administração intravenosa, por exemplo, hidróxido de tetrametilamónio e hidróxido de tetraetilamónio. Foi descoberto que muitas as 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas podem facilmente ser solubilizadas em soluções de 0,05M-0,5M de tris-hidroximetilamino-metano (Tris, trometamina USP). A trometamina é virtualmente não tóxica quando administrada por via intravenosa em seres humanos. Assim, uma solução de trometamina de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas é extremamente útil para a administração intravenosa para os seres humanos e supera o principal obstáculo para alcançar uma solução de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas para utilização intravenosa para os seres humanos. A presente invenção é direccionada em parte para esta descoberta. Como uma alternativa para a trometamina, pode-se utilizar bis-tris-propano (1,3-bis [tris-(hidroximetil)metilamino]-propano), um análogo da trometamina que também apresenta baixa toxicidade em mamíferos. 0 bis-tris-propano possui um pK maior do que a trometamina e, portanto, é útil 50 para dissolver algumas 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas que não são tão facilmente solúveis na trometamina.
As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas a qualquer animal que pode experimentar os efeitos benéficos dos compostos da invenção. De entre esses animais estão os seres humanos.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas através de quaisquer meios que permitam atingir a sua finalidade. Por exemplo, a administração pode ser por via parentérica, subcutânea,- intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, vestibular ou ocular. Alternativamente, ou concomitantemente, a administração pode ser por via oral. A dose administrada será dependente da idade, saúde, e peso do recipiente, tipo de tratamento concomitante, se for o caso, a frequência de tratamento, bem como a natureza do efeito desejado. O hidróxido Ce.^aralquil Ci.e trialquilamónio pode ser empregue, por exemplo, o hidróxido de benziltrimetil amónio.
Exemplos de compostos de amino, que podem ser utilizados para preparar os sais das 1,4~quinoxalinas-2,3-dionas incluem, mas não estão limitados a etilenodiamina, dietilenotriamina, N-metiletanolamina, di-(2-etanol)amina, tri-(2-etanolamina), espermidina, espermina, e aminocarbo-hidratós como a glucosamina, N-metil-glucamina, galactosamina, manosamina, xilosamina, celobiosamina, e maltosamina. Outros compostos de amino, que podem ser usados para preparar os sais de amónio das 1,4-di-hidroquionoxalina-2,3-dionas da presente invenção incluem mono-N-, di-(N,N e N,N') , tri-(Ν,Ν,Ν’) e tetra- (N, N, N', N') Ci.6 alquil-guanidinas bem como biguanidina, biguanidinas poli Ci.ealquil- 51 substituídas, amidina, arginina, N-Ci.6alquil amidinas, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), tris(hidroximetil) amino-metano (tris, trometamina) e bis-tris-propano.
Como mostrado na figura 21, quando o sal de mono-potássio do composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l, 4-di-hidro-guinoxalina-2,3-diona é preparado, é insolúvel em água. No entanto, o sal de di-potássio ' de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é solúvel em água, mas exige a adição de 4 equivalentes de KOH para dar uma solução que tem um pH de 12,7. A 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona vai ficar solúvel quando o pH é reduzido para 11,9 pela adição de 1 equivalente de ácido acético. No entanto, a adição de um segundo equivalente de ácido acético causa a formação de um· precipitado. Quando o pH atinje 11, a. precipitação está completa. Foi descoberto inesperadamente que 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona dissolve-se facilmente em apenas 1 equivalente de hidróxido de colina. Quando é adicionado ácido acético, um precipitado não começa a formar-se até que o pH atinja cerca de 9,2. Do mesmo modo, 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pode ser dissolvida em 1 equivalente de hidróxido de colina em água. O pH pode ser ajustado para cerca de 8 sem aparência de um precipitado. 0 sal de mono-colina seco pode ser isolado em forma pura, por exemplo, por liofilização de uma solução aquosa, e é solúvel em concentrações muito elevadas (pelo menos 90 quando as composições da invenção são administradas ocularmente, pode-se conseguir uma administração quer local ou sistémica. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser administradas na forma de colírio que são substancialmente isotónicas com o fluido da lágrima para alcançar a administração sistémica. Preferivelmente, essas composições também compreendem um agente que promove a permeação 52 que ajuda absorção sistémica dos compostos da presente invenção. Veja, a patente norte-americana No. 5,182,258..Alternativamente, as composições da invenção podem ser administradas ocularmente para tratar ou prevenir a degeneração do nervo óptico. Nesta forma de realização, os compostos da presente invenção são administrados na forma de colirio, como divulgado anteriormente, ou podem ser injectados na vizinhança do nervo óptico. Na alternativa, os implantes oculares finos podem ser empregues, os quais libertam lentamente dos compostos da presente invenção.
Para além dos compostos farmacologicamente activos, as novas preparações farmacêuticas podem conter portadores faririaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser usados farmaceuticamente. Preferivelmente, as preparações, particularmente aquelas preparações que podem ser administradas oralmente e que podem ser utilizadas para o tipo preferido de administração, tais como comprimidos, drageias e cápsulas, e também preparações que podem ser administradas retalmente, tais como supositórios, bem como soluções adequadas para administração por via oral ou injectável, estão presentes numa concentração de 0,01 a 99 por cento, juntamente com o excipiente.
As preparações farmacêuticas da presente invenção são fabricadas de uma maneira que é conhecida por si própria, por exemplo, pelos meios convencionais de processos de mistura, granulação, fabricação de drageia, dissolução, ou liofilização. Assim, as preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas por combinação dos compostos activos com excipientes sólidos, triturando opcionalmente a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, depois de 53 se adicionarem auxiliares adequados, se desejado ou necessário, para a obtenção de comprimidos ou núcleos de drageias.
Os excipientes adequadas são, em particular, enchedores, tais como sacáridos, por exemplo, lactose ou sacarose, sorbítol ou manitol, preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo fosfato de tricálcico ou hidrogenofosfato de cálcio, assim como ligantes tais como pasta de amido, usando, por exemplo, o amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, fécula de batata, gelatina, goma adragante, celulose de metilo, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou de pirrolidona de polivinilo. Se desejado, os agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como os amidos acima mencionados e também o carboximetil-amido, pirrolidona polivinilo ligada transversalmente, agar, ou ácido algínico ou um seu sal, tal como o alginato de sódio. Os auxiliares são, acima de tudo, agentes de regulação de fluxo e lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico ou os seus sais, tal como o estearato de magnésio ou o estearato de cálcio, e/ou o polietileno glicol. Os núcleos de drageias são fornecidos com revestimentos adequados, que, se desejado, são resistentes aos sucos gástricos. Para este efeito, as soluções de sacárido concentradas podem ser utilizadas, as quais podem opcionalmente conter goma arábica, talco, pirrolidona de polivinilo, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequadas. Com o objectivo de produzir revestimentos resistentes aos sucos gástricos, as soluções de preparações de celulose adequadas, tais como o ftalato de acetilcelulose ou o ftalato de hidroxipropimetil-celulose, são utilizadas. Os corantes e os pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drageias, .por 54 exemplo, para a identificação, a fim de caracterizar as combinações de doses de compostos activos.
Outras preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas por via oral incluem cápsulas de pressão ajustada feitas de gelatina, bem como cápsulas moles, fechadas feitas de gelatina e um plastificante, tal como o glicerol ou sorbitol. As cápsulas de pressão ajustada podem conter os compostos activos na forma de grânulos, que podem ser misturados com enchedores tais como a lactose, ligantes tais como os amidos, e/ou os lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos activos são preferivelmente dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, ou parafina líquida. Além disso, os estabilizadores podem ser adicionados.
Possíveis preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas retalmente incluem, por exemplo, supositórios, que consistem em uma combinação de um ou mais dos compostos activos com uma base de supositório. As bases de supositório adequadas são, por exemplo, triglicéridos naturais ou sintéticos, ou hidrocarbonetos de parafina. Além disso, também é possível utilizar cápsulas rectais de gelatina, que consistem em uma combinação de compostos·activos com uma base. Os materiais de base ossíveis incluem, por exemplo, triglicéridos líquidos, polietilenoglicóis, ou hidrocarbonetos de parafina.
As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos na forma solúvel em água, por exemplo, sais de amónio solúveis em água (especialmente tris, bis-tris-propano e colina) e soluções alcalinas. Além disso, as 55 suspensões de compostos activos como suspensões para injecção oleosas apropriadas podem ser administradas. Os solventes lipofilicos ou veículos adequados incluem óleos gordos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo, oleato de etilo ou triglicéridos ou polietileno glicol-400 (os compostos são solúveis em PEG-400). As suspensões para injecção aquosas que podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluem, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter os estabilizadores. A caracterização dos locais de ligação da glicina in vitro tem sido difícil devido à falta de ligandos de fármaco selectivos. Assim, os ligandos da glicina da presente invenção pode ser usados para caracterizar os dos locais de ligação da glicina. Particularmente preferidas as 1,4-di-hidroquinoxalina-2, 3-dionas substituídas que podem ser utilizadas para esta finalidade são derivados isotopicamente radiomarcados, por exemplo, quando um ou mais dos átomos são substituídos por 3H, 1:LC' 14C' 15N, ou 18F. Além disso, os emissores de positrões,tais como nC e 1SF podem ser incorporados na 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona para uso na tomografia de emissão de positrões (PET) para a localização de locais de ligação da glicina. Além disso, as 1,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-dionas 123I-substituídas podem ser utilizadas para a tomografia computadorizada de emissão de fotão singular (SPECT) imageamento local de ligação da glicina. Além disso, podem-se preparar compostos isotopicamente marcados que não são radioactivos para uso em estudos metabólicos, por exemplo, em que um ou mais dos hidrogénios e/ou carbonos são. enriquecidas em 2H ou 13C.
Exemplos 56 Métodos e Materiais
Nos seguintes exemplos 1-27, todos os 1H RMN foram executados a 300 MHz e 13C RMN a 75 MHz num instrumento QE-300 e são referenciados ao solvente protio residual. 19F RMN foram executados a 339 MHz em um instrumento NT-360 e que são referenciados ao exterior Cg Fç, Os pontos de ebulição foram tomados em um aparelho de ponto de fusão Mel-Temp e são não corrigidos. As amostras foram colocadas no bloco quando a temperatura foi > 250 °C, de modo a minimizar a decomposição antes da fusão. O DMF foi destilado antes da utilização. Todos os outros reagentes foram utilizados como recebidos do fabricante. Os compostos foram adquiridos à firma Aldrich Chemical Co., a menos que indicado de outra maneira abaixo. 1.2- Dinitro-3,4,5,6-tetraclorobenzeno, hidratado de 5,6-diamino- 1.3- dimetiluracilo e 1,2-diamino-3-cloro-5-trifluorometilbenzeno foram adquiridos à firma Maybridge Chemical. 3-Fluoro-6- nitroanilina foi obtida a partir da firma de Dr. Michael Scherz. 1,2-diamino-4-cloro-5-fluorobenzeno, 1,2-diamino-3-cloro-5-tri- fluorometilbenzeno e 1,2-diamino-3-bromo-5-trifluorometilbenzeno foram adquiridos a partir da firma PCR Chemical.
Exemplo 1. Preparação de 6f7-Dicloro-5-Tiitro-lf4-di-hidro-2r3-quinoxalinadiona Método A: 6,7-Dicloro-l,4-dihidro-2,3-quiiioxalinadiona. (1) Uma mistura de 422 mg (2,5 mmol) de 4,5-dicloro-o-fenilenodiamina (Pfaltz & Bauer, Inc., usado como recebido) e 1,10 g (7,5 mmol) de oxalato dietilico (Sigma, usado como recebido) foi agitada no sob Ar a 160 °C durante 2 horas, depois a 180 °C durante 7 horas. A mistura de reacçâo foi 57 deixada a arrefecer à temperatura ambiente (22 °C) , diluida com hexanos (10 mL) , o precipitado foi colectado por centrifugação e lavado com hexanos (2 x 10 mL) . O sólido cinzento foi agitado com 40 mL de aq. NaOH (cerca de 1 N) e carvão activado (0,4 g) à temperatura ambiente durante 30 minutos, o carvão foi removido por filtração a vácuo, lavado com H20 destilada (6 x 10 mL) , que foram combinados com o filtrado original, acidificados com cerca de 4N aq HC1 (cerca de 20 mL) . 0 precipitado branco foi colectado por filtração sob vácuo, lavado com H20 destilada (5 x 10 mL) , EtOH (3 x 5 mL), em seguida, seco a 60 °C sob 0,1 mmHg durante 8 horas para proporcionar 426 mg (73,8%) de 1 como um creme sólido. mp.> 400 6C RMN (DMS0-d6) 12,010 (s, 2H) 7,226 (s, 2H) ppm.
5-Nitro-6, 7-d±cloro-l, 4-dl-hidro-2,3-qiiinoxa.lina,d±ona. (2) O composto 1 {416 mg, 1,80 mmol) foi dissolvido em 5,5 mL de H2SO4 concentrado a 0 °C com agitação. A esta solução cinzenta profunda resultante foi adicionado 202 mg (2,22 mmol) de KN03 finamente triturado (Baker, usado como recebido) a 0 °C com agitação. A mistura foi agitada a 0 °C durante 3 horas, depois à temperatura ambiente (22 °C) durante 30 horas. A mistura de reacção foi adicionada a H20 em gelo (60 g) , o precipitado foi colectado por filtração sob vácuo, lavado com H20 destilada (5 x 10 mL), EtOH (3 x 5 mL), em seguida, seco sob 0,1 mm Hg a 80 °C durante 2 horas rendendo 443,5 mg (89,6%) do produto bruto 2 como um creme sólido amorfo (0 1H RMN indicou que se tratava de 95-98% puro). A purificação suplementar foi.como se segue: 443 mg do produto bruto 2 (obtido acima) foi dissolvido em cerca de IN aq. De NaOH (120 MI) è temperatura ambiente, carvão activado (1 g) foi adicionado, em seguida agitado à temperatura ambiente 58 durante 15 minutos. 0 carvão foi removido por filtração sob vácuo, lavado com H20 destilada (2 x 10 mL) . 0 filtrado combinado foi
acidificado para pH 2, com cerca de 4N aq. HC1 (cerca de 50 mL) . O precipitado foi colectado por filtração sob vácuo, lavado com H20 destilada (5 x 10 mL), EtOH (2x5 mL), seco sob 0,1 mmHg a 80 °C durante 2 horas proporcionando 327 mg (74% de valorização) do produto essencialmente puro 2, mp. 350-4 °C (dec) . (0 1H RMN indicou que não houve praticamente nenhumas impurezas presentes).
Recristalização: 315 mg do produto mais puro 2 (obtido acima) foi dissolvido em 45 mL de DMSO, a esta solução foi adicionada H20 (cerca de 1 mL) gota a gota até ter sido produzido um precipitado. A mistura foi aquecida (100-105 °C num banho de óleo), com agitação (utilizando uma pequena barra magnética) , H20 cerca de 1 mL) foi adicionado gota a gota até ter sido formada uma mistura turva, e DMSO foi adicionado gota a gota para produzir uma solução clara. Depois de permanecer à temperatuta ambiente durante 8 horas, os microcristais amarelos foram colectados· por filtração sob vácuo, lavados com H20 (5 x 10 mL) , EtOH (2 x 3 mL) , secos sob 0,1 mm Hg a 80 °C durante 3 horas rendendo 286 mg (90,8% de valorização) do produto puro 2, mp. 354-7 °C. Método B: 4,5-Dlclozo-l,2~f&níl&nodiami.na (1) . A uma suspensão, de 6,21 g (30,0 mmol) de 4,5-dicloro-2-nitroanilina (Aldrich, usado como recebido), em EtOH (100 mL) foram adicionados 310 mg de 5% Pd/C, a mistura foi hidrogenada a 30-20 Parr de H2 durante 4 horas, em seguida filtrada. 0 filtrado foi roto-evaporado à secura. 0 resíduo sólido negro foi agitado com 250 mL de 2 N aq. HC1 durante 20 miutos e, em seguida, filtrado. 0 filtrado foi basificado a pH 13 59 com 4N aq. NaOH (125 mL) . O precipitado foi recolhido em um funil sinterizado por filtração sob vácuo, lavado com H20 (5 x 10 mL) , seco a 40 °C sob 0,1 mmHg durante 16 horas dando 3,72 g (70%) do produto bruto como um pó colorido de café. 0 produto bruto (3,70 g) obtido anteriormente foi purificado por cristalização de benzeno (60 mL) rendendo 3,17 g (85% de valorização), como escalas ligeiramente roxas, que foi puro por TLC (CHC13: EtOH = 9:1). Mp 159-60 °C (Aldrich: 159-62 °C). 6, 7-Dlclom-l, 4-di~hJ.droqTiinoxalina.-2^ 3-diona.: Uma suspensão de 2,655 g (15,0 mmol) de 4,5-diclorofenileno-l,2-diamina e 1,986 g (15,75 mmol) de di-hidrato de ácido oxálico (Fisher Scientific Co., usado como recebido) em 22,5 mL de 2 N aq. HC1 foi refluxado, com agitação a 125 °C (temperatura de banho) durante 2,5 horas, (durante os primeiros 5 minutos de aquecimento, a suspensão quase virou uma solução, depois começou a formar um precipitado). A mistura de reacção foi deixada a arrefecer a 22 °C, e H2O (50 mL) foi adicionado. 0 precipitado foi recolhido em um funil Hirsh por filtração sob vácuo, lavado com H20 (6 x 25 mL) e seco a 60 °C sob 0,1 mmHg durante 12 horas proporcionando 3,39 g (98%) de 6,7-dicloroquinoxalina-2,3-diona como um pó rosa carregado. Mp. > 400 °C. ΧΗ RMN (DMS0-d6): δ 12,016 (s, 2H) , 7,234 (s, 2H) . Este produto foi utilizado na reacção seguinte sem purificação suplementar. 6, 7-Dlcloro~5~nltro“l, 4-di-hidx:oguíaoxalíxia.-2,3-diona.: 3,335 g (14,5 mmol) de 6,7-dicloro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foi dissolvido em 65 mL de H2SO4 concentrado, com agitação e refrigeração em um banho de H20 em gelo, em seguida, 2,20 g (21,76 mmol) de KN03 (Baker, usado como recebido) foi adicionado em porções durante 10 minutos com agitação. A mistura resultante foi 60 agitada a 22 °C sob N2 durante 20 horas, em seguida, foi lentamente vertida em H2O em gelo (400 mL) , com agitação. 0 precipitado foi recolhido em um funil sinterizado por filtração sob vácuo, lavado com H20 (5 x 10 mL) , e seco a 60 °C sob 0,1 mmHg durante 12 horas, proporcionando a 3,39 g (85%) do produto bruto 6,7-dicloro-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona como um pó cinzento-amarelo. Pureza: > 98,5% baseada na análise por HPLC. 0 composto foi purificado como se segue. 3,365 g de 6,7-dicloro-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona obtidos acima foi adicionado a 550 mL de IN aq. De NaOH e agitado vigorosamente durante 20 minutos. A mistura resultante, foi filtrada por filtração por vácuo através de um funil sinterizado para remover uma pequena quantidade de matéria insolúvel. Ao filtrado foi adicionado lentamente concentrado de HC1 (cerca de 43 mL) (gota a gota) , com uma agitação vigorosa, para ajustar o pH de 13 para 11 (usando o medidor de pH para monitorizar). (Uma experiência em branco mostrou que 6,7-dicloroquinoxalina-2,3-diona, o material de partida para a reacção de nitração, poderia ser precipitado a partir da sua solução de IN aq. De NaOH apenas numa condição em que o pH estava no intervalo de 9,5-8). O precipitado foi recolhido em um funil sinterizado por filtração sob vácuo e lavado com H20 (5 x 50 mL). O produto húmido foi adicionado a 200 mL de H20, e a esta suspensão resultante foi adicionado lentamente concentrado de HC1 (gota a gota) para ajustar o pH para 5. O precipitado foi recolhido em um funil Hirsh por filtração sob vácuo, lavado com H20 (8 x 50 mL) , e seco a 60 °C sob 0,1 mmHg durante 16 horas proporcionando a 3,12 g (92,9% de valorização) do produto mais puro 6,7-dicloro-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Mp. 347-8 °C. 1H RMN (DMSO-dg) : 12,265 (bs, 2H), 7,379 (s, 1H) . Pureza: > 99,2% baseada na análise por HPLC. 61
Exemplo 2. Preparação de 5-cloro-7-tri.fluorametll-lf4-d±-h±dro-qulnoxalina-2r3-diona (composto de referência)
439,0 mg (3,0 mmol) de oxalato dietílíco (da firma Sigma, usado como recebido) foi adicionado a 210,6 mg (1,0 mmol) de 1,2-diamino-3-cloro-5"trifluorometilbenzeno (da firma PCR Inc., usado como recebido), e a solução amarela resultante foi aquecida a 180 °C (temperatura de banho) sob Ar com agitação durante 3,5 horas, a solução tornou-se espessa com formação de precipitado creme e de difícil agitação. A mistura reacção foi deixada a arrefecr à temperatura ambiente, e triturada com hexano (10 mL) . O precipitado foi colectado por filtração sob vácuo, lavado com hexano (2 x 10 mL) (o filtrado de hexano combinado foi guardado), seco sob 0,1 mmHg durante 4' horas rendendo 134,6 mg (58%) do produto bruto desejado como um pó amarelo (95-98% puro por RMN) , mp. 330-2 °C (dez) (bloco pré-aquecido).
Uma porção (125,5 mg) do produto bruto obtido acima foi agitado com 1 N aq. NaOH (10 mL) à temperatura ambiente, a solução básica amarela clara resultante foi acidificada para pH 2 por meio da adição de 5 N aq. HC1 (cerca de 1,2 mL) gota a gota com agitação à temperatura ambiente. O precipitado branco foi colectado por centrifugação, lavado com H2O (5 x 10 mL) , em seguida, seco por co-evaporação com EtOH (2 x 10 mL) a 40 °C dando 118,8 mg (94,6% de valorização) de composto puro (por RMN) como um pó branco creme, mp. 334-6 °C (dez) (bloco pré-aquecido). Tentativas para recristalizar de EtOH, EtOH-H20 e DMSO-H2O falharam (essas soluções, deram apenas quer um precipitado ou não). 1H RMN (DMSO-d6) δ: 7,349 (s, 1H) , 7,604 (s , 1H) , 11,724 (s, 1H) , 12,222 (s, 1H) ppm. 62 O filtrado de hexano combinado obtido acima foi evaporado por rotação a 40 °C até à secura, o resíduo (óleo cor de laranja viscoso) foi aquecido a 180 °C durante 5 horas. O sólido volumoso castanho resultante foi triturado com hexano (5 mL) , o precipitado foi colectado por centrifugação, lavado com hexano (4 x 5 mL) , agitado com 1 N aq. NaOH (4,5 mL) , centrifugado para remover uma pequena quantidade de sólido preto, o sobrenadante foi acidificado para pH 2 por meio da adição de 5 N aq. HC1 (cerca de 1 mL) gota a gota com agitação à temperatura ambiente. O precipitado amarelado foi colectado por centrifugação, lavado com H2O (5 x 5 mL) , em seguida, seco por co-evaporação com EtOH (3 x 5 mL) a 40 °C rendendo 51,8 mg (22,3%, com base na diamina de partida na primeira reacção) do composto de título como um pó amarelado (essencialmente puro por RMN), mp 334-6 °C (bloco pré-aquecido).
Depois da recuperação, o material misturado foi reaproveitado, o rendimento total foi de cerca de 77%. O resultado relatado por este meio foi de uma dos três experiências e foi reprodutível. A reação com uma proporção de 1:2 de diamina para o oxalato utilizando o mesmo procedimento como aquele para a proporção de 1:3 foi também tentado, mas o produto foi complicado.
Alternativamente, o composto de título foi preparado utilizando uma adaptação do método de Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962). Uma mistura de oxalato dietílico (1,34 g, 9,60 mmol) e 1,2-diamino-3-cloro-5-trifluorometilbenzeno (200 mg, 0,95 mmol) foi aquecido a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e os sólidos recolhidos por filtração sob vácuo e lavados com gelo frio EtOH (10 mL) . Este sólido branco amarelo foi dissolvido em IN de NaOH (15 mL) e 63 algumas partículas insolúveis foram removidas por filtração de gravidade. A solução foi tratada com descoloração de carbono e a mistura foi filtrada através de uma almofada de celite e a solução resultante, acidificada com 4N HC1. Um precipitado formou-se, o qul foi isolado por filtração sob vácuo, lavado com água (20 ml). Este sólido branco foi seco em pistola secagem (0,05 torr, 78 °C) para render 91,9 mg (36,0%), mp 346-348 °C (dez). ΧΗ RMN (d6-DMS0) δ 7,30 (s, 1H , ArH), 7,53 (s, 1H, ArH) , 11,9 (br s, 2H, NH) . 19F RMN (C6 Fg padrão externo, δ -162,9) δ -58,43 (s). EIHRMS calculado para C9H4CIF3 N202 263.9912, encontrado 263,9891.
Exemplo 3. Preparação de 5-cloro-7-flnoro-l,4~d±-hidroqulnoxalina-2r3-d±ona {composto de referência) 2 - cloro-4-fluoro-6-nitroanilina 2-cloro-4-fluoro-6-nitroanilina foi preparado usando uma adaptação do método de Mitchell, et al. (Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A uma solução de 4-fluoro-2-nitroanilina (500 mg, 3,2 mmol) em DMF seco (10 ml) sob N2 foi adicionado gota a gota uma solução de N-clorosuccinimida (426 mg, 3,2 mmol) em DMF seco (16 mL). A reacção foi deixada a agitar durante a noite. A solução foi depois vertida em 100 ml de H20 e a suspensão turva resultante extraída com 4 x 25 ml de acetato de etilo. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 4 x 25 mL de H20 e 25 mL de solução de NaCl saturada e secas (MgS04) . O MgS04 foi filtrado por vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um sólido cristalino castanho, que foi purificado adicionalmente por cromatografia de flash (2:1 hexanos: acetato de etilo) para produzir 424 mg de um sólido cristalino cor de laranja (69,5%) ’Ή RMN (CDCI3) δ 6,46 (br 64 s, 2H, mia), 7,42 (dd, J H5-3 = 3 Hz, J-h3-f = 7,2 Hz, H-4) , 7,85 (dd, Jhs-3 = 3 Hz, J„H5_F = 8,7 Hz, H—5) 1.2- d±aiaino-3-cloro-5-£luorobenzeno 1.2- diamino-3-cloro-5-fluorobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy, et al.., (Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 2-cloro-4-fluoro-6-nitroanilina (424 mg, 2,22 mmol) e SnCl2 2H2O (2,50 g, 11,1 mmol) dissolvido em 7 mL de acetato de etilo e 3 mL de- etanol absoluto sob N2 foi aquecida a 70 °C durante 2,5 horas. Todos os materiais de partida foram feitos reagir como evidenciado por TLC (gel de sílica, 2:1 hexanos:acetato de etilo). A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 20 mL de gelo esmagado. NaHC03 suficientemente sólido foi adicionado (espuma!) para levar o pH a 6. A emulsão branco amarela espessa, em seguida, foi extraída com 3 x 25 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados, lavados com solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgSCu), filtrado por vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um óleo castanho escuro, que cristalizou em repouso para produzir 290 mg (82%). 1H RMN (CDC13) δ 3,59 (br s, 4H , 2 (NH2) ) ; 6,37 (dd, 1H, H5, J4-5 = 2,7, JH-F = 9,3); 6,55 (dd, 1H, H4, J4-5 = 2,7, JHF = 8,4). 5-Cloro~7-fluoro-l,4-di-hidro-2,3-qTiinoxalinad±ona 5-Cloro-7-fluoro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílíco (2,64 g, 18,1 mmol) e 1,2-diamino-3-cloro-5-fluorobenzeno (290 mg, 1,81 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 10 horas. A reacção foi 65 deixada a arrefecer à temperatura ambiente e os cristais amarelo-torrado brilhantes recolhidos por filtração sob vácuo e lavados com EtOH (10 mL) e secos ao ar para dar 164,1 mg (42%). Uma parte deste sólido foi tomada e dissolvida em 10 mL de IN de NaOH. A solução foi tratada com carvão activado e filtrada através de uma almofada de celite. A solução resultante foi cuidadosamente acidificada com IN de HC1 (pH = 6). Agulhas mareias pálidas formaram-se lentamente na solução e foram recolhidas por filtração'sob vácuo, lavadas com 20 mL de B2O e secas adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 78 °C) para renderem 67,8 de cristais amarelos pálidos pulverulentos. mp 306-308 °C (dez), ^ RMN (d6-DMS0) δ 7,28 (s, 1H, ArH) , 7,56 {s, 1H, ArH), 11,7 (br s, 2H, NH) , EIMS m/z 216 (M+2,34, 214 (M+, pb) , 188 (21), 186 (68), 123 (61), 131 (62). EIHRMS calculado, para C8H4CIFN2 02 213.9945, Encontrado 213,9961.
Exezaplo 4. Preparação de 5-cloro-6f7-dl£luoro-l,4-di-hidro-quinoxal±na~2f3-d±ona (composto de referência) 2-cloro-3,4-d±fluoro-6-n±troanllína 2-cloro-3,4-difluoro-6-nitroanilina foi preparada usando uma adaptação do método de Mitchell et al. ('Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A uma solução de 4,5-difluoro-2-nitroanilina (500 mg, 2,87 mmol) em DMF sob N2 (16 mL) foi adicionado N-clorosuccinimida (401 mg, 3,00 mmol) em DMF. A reacção foi deixada a agitar durante 48 horas. A solução foi depois vertida em 75 mL de H20. A suspensão cor de laranja, nublada que se formou, foi em seguida extraida com 4 x 25 mL de cloreto de metileno. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com 5 x 20 mL de H20 e 25 mL de solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04) e o agente de secagem removido por filtração sob vácuo. O solvente 66 foi evaporado por rotação para produzir um óleo amarelo alaranjado que cristalizou em repouso. 1H RMN mostrou este sólido como sendo uma mistura de produto clorinado e material de partida. A mistura foi separada por cromatografia de flash (gel de sílica, 3:1 hexanos:acetato de etilo) para produzir 162 mg de um sólido cristalino amarelo (27%). 1H RMN (CDCI3) δ 6,60 (br s, 2H, NH2), 8,00 (m, 1H, H-5) . Houve umacontaminação de 17% de material de partida por RMN. 3-Cloro-4,5-difluoro-l,2-ãlaminobenzeno 3-Cloro-4,5-difluoro-1,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy et al. (Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 2-cloro-3,4- difluoro-6-nitroanilina (160 mg, 0,767 mmol) e SnCl22H20 (0, 863 g, 3,84 mmol) foi dissolvida em 5 mL de acetato de etilo e 2 mL de etanol absoluto sob N2 e aquecida a 75 °C durante 5 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 50 mL de H20. Uma solução de NaHC03 suficientemente saturada foi adicionada (espuma!) para levar o pH a 7. A mistura resultante foi extraída com 3 x 20 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados lavadas com 20 mL de solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04)f filtrada sob vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um sólido castanho, 124 mg (91%). 1H RMN (CDCI3) δ 3,52 (br s, 4H, 2 (NH2) ) , 6,49 (dd, 1H, JHF = 7,5, 10,8
Hz, H-6). Houve 13% de 4,5-difluoro-l,2-diaminobenzeno presente por RMN. 5-Cloro-6, 7-difluoro-1 r 4-di-hidro-2,3-qulnoxallnadlona. 67 0 composto de título foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (981 mg, 6,72 mmol) e 3-cloro-4,5-difluoro-1,2-diaminobenzeno (120 mg, 0,670 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 15 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido cinzento recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH arrefecido em gelo (10 mL) e seco ao ar. 0 sólido foi tomado e dissolvido em 5 ml de IN de NaOH com aquecimento. A solução foi tratada com carvão activado e filtrada através de uma almofada de celite. A solução resultante foi cuidadosamente acidificada com IN de HC1 (pH = 1) . Um pó branco formado na solução com pH = 6, mas algumas gotas de IN de NaOH limparam a solução e após a adição de algumas gotas de agulhas brancas de IN de HC1 formadas lentamente na solução. Estas foram colectadas por filtração sob vácuo, lavadas com 20 mL de H20 e secas sob vácuo (0,1 torr, 78 °C) para produzir 24,9 (16%) de agulhas amarelas pálidas. RMM (dg - DMSO) δ 7,05 (dd, 1H, J = 10,5, H-8), 11,6 (br s, 1H, NH), 12,0 (br s, 1H, NH). Houve 13% de 6,7-difluoro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona presente por RMN.
Exemplo 5. Preparação de 5-bromo-6,7-dl£luoro-l,4-dí-h±dro-2,3-quinoxalinadlona 2-Brcmo~3,4-dlflúoro-6-nitroanilína 2-Bromo-3,4-difluoro-6-nitroanilina foi preparado usando uma adaptação do método de Mitchell et al. (Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A uma solução de 4,5-difluoro-2-
nitroanilina (500 mg, 2,87 mmol) em DMF (25 mL) sob N2 foi adicionado de uma vez N-bromosuccinimida (511 mg, 2,87 mmol) em DMF seco (16 mL) . A reacção foi deixada a agitar durante a noite. TLC 68 (1:1 hexanos:acetato de etilo) mostrou ainda algum material de partida presente. N-bromosuccinimida dicional (100 mg) foi adicionada e a reacção agitada por mais 12 horas. A solução foi depois vertida em 100 ml de H20 e a suspensão turva resultante extraída com 3 x 20 ml de cloreto de metileno. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 4 x 25 mL de H20 e 25 mL de solução de NaCl saturada e seca (MgS04) . O MgSCu foi filtrado sob vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um óleo castanho amarelo que cristalizou lentamente para render 700 mg (96%). 1H RMN (CDC13) δ 6,70 (br s, 2H, NH2) , 7,99 (m, 1H, H-5) . 3-Bxomo-4,5-difluoro-l,2-diaminobenzeno 3-Bromo-4,5-difluoro-l,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy et al. (Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 2-bromo-3,4- difluoro-6-nitroanilina (700 mg, 2,78 mmol) e SnCl2 2H2O (3,14 g, 13,9 mmol) dissolvido em 7 mL de acetato de etilo e 3 mL de etanol absoluto sob N2 foi aquecida a 75 °C durante 2 horas. Todo o material de partida reagiu como evidenciado por TLC (gel de sílica, 2:1 hexanos:acetato de etilo). A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 20 mL de gelo esmagado. Uma solução de NaHC03 uficientemente saturada foi adicionada (espuma!) para levar o pH a 5. A emulsão branca amarela espessa, em seguida, foi extraída com 3 x 25 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados, lavados com solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgSCL) , filtrado sob vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um óleo castanho escuro, que cristalizou em repouso para produzir 410 mg (66%). 1H RMN (CDCI3) δ 3,59 (br s, 4H , 2 (NH2) ) ; 6,52 (m, 1H, H-6) . 69 5-bromo- 6, 7-difluoro-l, 4 -di -hidro-2,3-quinoxa.linad.iona. 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietilico (2,70 g, 18,5 mmol) e 3-bromo-4,5-difluoro-1,2-diaminobenzeno (410 mg, 1,85 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 15 horas. A reação foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido castanho-escuro recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (20 mL) e seco ao ar para dar 215 mg (42%) . Uma parte deste sólido (150 mg) foi retomada e dissolvida em 20 mL de IN de NaOH com aquecimento. A solução foi tratada com carvão activado e filtrada através de uma almofada de celite. A solução resultante foi cuidadosamente acidificada com IN de HC1 (pH = 1). Agulhas amarelas pálidas formaram-se lentamente na solução e foram recolhidas por filtração sob vácuo, lavadas com 20 mL de H2O e secas sob vácuo (0,1 torr, 78 °C) para produzirem 67,8 mg de cristais amarelos pálidos pulverulentos, mp 306-310 °C (dez). 1H RMN (dg-DMSO) δ 7,09 (dd, 1H, J = 7,5, H-8), 11,3 (br s, 1H, NH) , 12,1 (br s, 1H, NH) . EIMS m/z 278 (M +2,75), 276 (M+, 77), 250 (56), 248 (57), 141 (pto) . EIHRMS calculado para C8H4BRF2N202 275.9346, encontrado 275,9331.
Exemplo 6. Preparação de 6-Bromo-7-fluoro-1,4-di-hidroqu±noxalina- 2,3-diona (composto de referência) 4-Bromo-3-fluoro-6-n±troanilina 4-Bromo-3-fluoro-6-nitroanilina foi preparado usando uma adaptação do método de Mitchell et al. (Mitchell, R.H. et al.r J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A uma solução de 3-fluoro-6-nitroanilina (500 mg, 3,2 mmol) em DMF seco (15 mL) sob N2 foi adicionado gota a gota uma 70 solução de N-bromosuccinimida (62 6 mg, 3,2 mmol} em DMF seco. A reacção foi deixada a agitar 48 horas. A solução foi depois vertida em 100 mL de H2O. A suspensão amarela turva que se formou foi em seguida extraída com 4 x 25 mL de cloreto de metileno. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com 4 x 25 mL de H2O e 25 mL de solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgSCU) e o agente de secagem removido por filtração sob vácuo. O solvente foi evaporado por rotação para produzir um óleo amarelo alaranjado que cristalizou em repouso. 1H RMN mostrou este sólido como sendo uma mistura de produtos mono e dibrominados em uma proporção de 3,8:1. A mistura foi separada por cromatografia de flash (2:1 hexanos: acetato de etilo) para produzir 324 mg de um sólido amarelo (43%). RMN (CDC13} δ 6,19 (br s, 2H, NH2) ; 6,58 (d, 1H, JHF = 9,6, ArH) , 8,39 (d, 1H, JHF = 6,9, ArH). 4-Bromo-5-£lTioro-l, 2-ã±amlnóbenzeno 4“Bromo-5-fluoro-1,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy et al. (Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 4-bromo-3-fluoro-6-nitroanilina (320 mg, 1,36 mmol) e SnCl2 2N20 (1,53 g, 6,81 mmol) dissolvida em 7 mL de acetato de etilo e 3 mL de etanol absoluto sob N2 foi aquecida a 75 °C durante 8 horas. Alguns materiais de partida permaneceram (por TLC) depois de apenas 1 hora de aquecimento. Todos os materiais de partida tinham reagido após 8 horas, como evidenciado por TLC (gel de sílica, 3:1 hexanos: acetato de etilo). A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 50 mL de H20. Uma solução de NaHC03 suficientemente saturada foi adicionada (espuma!) para levar o pH a 5. A mistura resultante foi extraída com 3 x 25 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados lavados com 20 mL de 71 solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04), filtrada por vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um pó branco 277 mg {99%). 1H RMN (CDC13) 5 3,22 (br s, 2H, NH2) ; 3,60 {br s, 2H, NH2>; 6,50 (d, 1H, JHF =9,6 Hz, H-6) ; 6,83 (d, 1H, Jhf = 6, 6 Hz, H-3) . 6-Bromo-7-fluoro-l , 4-di-hidro-2,3-quinoxa.lin.a.dlona. 0 composto de título foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Cheia. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (1,97 mL, 13,5 mmol) e 4-bromo-5-fluoro-1,2-diaminobenzeno (277 mg, 1,35 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 12 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido castanho-escuro recolhido por filtração sob vácuo e lavado com etanol (20 mL) e seco ao ar para dar 233 mg (67%) de um sólido castanho pulverulento. Uma parte deste sólido {100 mg) foi retomado e dissolvido em 5 mL de IN de NaOH. A solução foi tratada com carvão activado e filtrada através de uma almofada de celite. A celite foi lavada com 10 mL de solução de NaOH adicional. A solução resultante foi cuidadosamente acidificada com IN de HC1 (pH = 5} . Agulhas amarelas formaram-se lentamente na solução e foram recolhidas por filtração sob vácuo, lavadas com 15 mL de H20 e secas sob vácuo (0,1 torr, 78 °C) para produzir 40,0 mg de cristais amarelos. 1H RMN (d6-DMSO) δ 6,99 (d, 1H, J = 9,3, H-8), 7,29 (d, 1H, J = 6,3, H-6), 11,95 (br s, 2H, 2 (NH)). EIMS m/z 260 (M+2,96), 258 (M+ (pb) ) , 232 (51), 230 (52), 123 (83). EIHRMS calculado para CeH<jBrFN202 256.9941, encontrado 257,9441.
Exemplo 7. Preparação de 5,7-D±cloro~l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dxona (composto de referência) 72 3.5- Dicloro-l,2-diaminobenzeno 3.5- Dicloro-l,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy, et ai. (Bellamy, F.D. et ai., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 2,4-dicloro-6-nitroanilina (1,00 g, 4,8 mmol) e SnCl2 2H2O (5,41 g, 24,1 nunol) dissolvida em 10 mL de acetato etílico e 5 mL de etanol absoluto sob N2 foi aquecida a 70 °C durante 1 hora. Todos os materiais de partida tinham reagido como evidenciado por TLC (gel de sílica, 3:1 hexanos: acetato de etilo). A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 40 mL de gelo esmagado. Uma solução de NaHC03 suficientemente saturada foi adicionada (espuma!) para levar o pH a 5. A emulsão branca espessa/óleo cor de laranja foi extraída com 3 x 25 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados lavados com solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04) , filtrada por vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um óleo cor de laranja pálido que cristalizou em repouso para produzir 789 mg (93%). 1H RMN (CDC13) δ 3,69 (br s, 4H , 2 (NH2) ) ; 6,61 (s, 1H, H-6); 6,82 (s, 1H, H-4). 5, 7-Dicloro-l, 4-dl-h±dx:o-2,3-qninoxalina.diona O composto de título (Leeson, P.D. et al., J. Med. Chem 34:1243 (1991)) foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (4,12 g, 28,2 mmol) e 3,5-dicloro-l,2-diamínobenzeno (500 mg, 2,82 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 6· horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido brilhante amarelo pálido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (20 mL) e seco ao ar para dar 73 286 mg (44%). mp 326-328 °C (dez) Lit 337-340 °C) . XH RMN (d6-DMSO) δ 7,05 (d, 1H, J = 1,8, H-8), 7,32 (d, 1H, J = 1,8, H-6) , 11,5 (br s, 1H, NH), 12,1 (br s, 1H, NH). EIMS m/e 234 (M+4, 12), 232 (M+2,67), 230 (M+, pb), 204 (52), 202 (77), 141 (19), 142 (59) EIHRMS calculado para C8H4CI2N2O2 229,9650, encontrado 229,9646.
Exemplo Θ. Preparação de 5,7~Dlhrmno-l, 4-dl-hidroçp2Ínoxal±na-2,3-diona (composto de referência) 3.5- dibromo-l,2-diaminobenzeno 3.5- dibromo-l,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy, et al. (Bellamy, F.D. et al.f Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 2,4-dibromo-6-nitroanilina (500 mg, 1,69 mmol) e SnCl2 2H2O (1,90 g, 8,45 mmol) dissolvida em 5 mL de acetato de etilo e 2 mL de etanol absoluto sob N2 foi aquecida a 70 °C durante 1 hora. Todos os materiais de partida tinham reagido como evidenciado por TLC (gel de silica, 3:1 hexanos: acetato de etilo). A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 20 mL de gelo esmagado. Uma solução de NaHC03 suficientemente saturada foi adicionada (espuma!) para levar o pH a 5. A emulsão branca amarela espessa foi filtrada sob vácuo e o filtrado extraído com 3 x 25 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados lavados com solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgSCL) , filtrada sob vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um óleo amarelo claro que cristalizou em repouso para produzir 400 mg (89%) . XH RMN (CDCI3) δ 3,62 (br s, 4H , 2 (NH2) ) ; 6,78 (d, J = 1,8, 1H, H-6) ; 7,01 (d, J = 1,8, 1H, H-4). 5,7-dibromo-l,4-dl-hldro-2,3 - qninoxalinadiona 74 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietilico (2,19 g, 15,0 mmol) e 3,5-dibromo-l,2-diaminobenzeno (400 mg, 1,50 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 6 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido brilhante castanho pálido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (20 mL) e seco ao ar para dar 264 mg (55%) . Uma parte deste sólido (150 mg) foi retomado e dissolvido em 20 mL de IN de NaOH com' aquecimento. A solução foi tratada com carvão activado e filtrada através de uma almofada de celite. A solução resultante foi cuidadosamente acidificada com 2N de HC1 (pH = 1). Agulhas amarelas pálidas formaram-se lentamente na solução e foram recolhidas por filtração sob vácuo, lavadas com 20 mL de H20 e secas sob vácuo (0,1 torr, 78 °C) para .um rendimento de 50.0 mg de sólido branco pulverulento, mp 356-358 °C (dez). 1H RMN (d6-DMSO) δ 7,21 (d, 1H, J - 2,1, H-8) , 7,53 (d, 1H, J = 2,1, H-6), 11.1 (s br, 1H , NH) , 12,1 (br s, 1H, NH) . EIMS m/z 322 (M+4, 51,3), 320 (M+2, pb) , 318 (M+, 53, 9), 294 (32,2), 292 (62,6), 290 (28,7), 185 (24,3), 183 (25,2). EIHRMS calculado para C8H4Br2N202 317.8641, encontrado 317.8642.
Exemplo 9. Preparação de 5/6,7/8-tetracloro-l,4-di-bddro~2,3-qainoxalinadiona (composto de referência) 1,2-diamino-3,4,5,6-tetraclorobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy et al. (Bellaray, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Uma mistura de 1,2-dinitro- 3,4,5,6-tetraclorobenzeno (1,00 g, 3,27 mmol) e SnCl2 2H20 (3,69 g, 16,4 mmol) dissolvida em 10 mL de acetato etilico e 5 mL de etanol absoluto sob N2 foi aquecida a 80 °C durante 1 hora. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 20 mL de 75 gelo esmagado. Uma solução de NaHC03 suficientemente saturada foi adicionada (espuma!) para levar o pH a 6. A emulsão branca espessa foi extraída com 3 x 25 mL de acetato de etilo e os extractos orgânicos combinados lavados com solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04) , filtrada sob vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um sólido castanho 569 mg (71%). RMN (CDC13) δ 3,96 (br s, 2 (NH2) ) 13C RMN (CDC13) δ 118,2, 127.0, 132,0. 5, 6, 7 r 8-tetracloro-l, 4-d±-hi<iz:o-2,3-qulnoxa.linadiona (Barton, D.E. ; Lamb, A.J.; Lane, D.L.J.; Newbold, G.T.; Percival, D., J. Chem. Soc. (C), 1268 (1968). 5,6,7,8-tetracloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (2,97 g, 20,0 mmol) e 1,2-diamino-3,4,5,6-tetraclorobenzeno (500 mg, 2,03 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 6 horas.. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido cor de laranja recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH frio (10 mL) e seco ao ar. Este sólido foi recristalizado a partir de etanol absoluto para um rendimento de 97,0 mg (16%) de um sólido cor de laranja mp 326-328 °C (dez). (Lit., > 360°). FT-IR: 3198, 3135 cm"1 (N-H), 1750, 1623 cm'1 (C=0) . ^ RMN δ (d6-DMSO) δ 11,7 (br s, 2H, NH) EIMS m/z 306 (M+8, 1, 7), 304 (M+6, 11, 5), 302 (M+4, 47,4), 300 (M+2, 93,9), 288 (M+, 76,7), 274 (50,0), 272 (pb), 270 (79,0), 209 (61,0), 207 (64,0). EIHRMS calculado para C8H2Cl4N202 297.8870., encontrado 297,8864 .
Exemplo 10. Preparação de 5-cloro-6-nitro-7-triflTioromet±l-l,4-di-hldroquxnoxalina-2,3-diona e 5-cloro-8-nitxo-7-tr±£luorometil-l,4-d±-h±droqiiinoxalina-2,3-díona {composto de referência)
Os compostos de título foram preparados utilizando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). 6-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidro-2, 3-quinoxalinadiona (500 mg, 1,89 mmol) foi dissolvido em 15 mL de Η2Ξ04 concentrado e a solução clara foi arrefecida a 0 °C com agitação. Para isso foi adicionado em pequenas porções KN03 (191 mg, 1,89 mmol). A reacção foi deixada a agitar 1 hora a 0 °C e, em seguida, foi deixada à temperatura ambiente e a agitar durante a noite. A mistura de reacção amarela pálida foi depois vertida em 50 mL de H20 em gelo. 0 produto foi isolado por filtração sob vácuo como um sólido branco, que foi lavado com uma pequena quantidade de H20 frio e seco ao ar. 0 sólido branco foi dissolvido em uma quantidade mínima de DMSO quente. 0 H20 em ebulição foi adicionado gota a gota, com aquecimento após cada adição, até o precipitado não poder ser dissolvido. Umas gotas de DMSO foram adicionadas até a solução se tornar clara, e a solução foi deixada a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. O sólido branco foi isolado por filtração sob vácuo e deixado a secar ao ar. 0 sólido foi seco adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para um rendimento de 241,6 mg de uma mistura de produtos 6-nitro e 8-nitro em uma proporção de 3,3:1 por 1H RMN. 0 precipitado que se formou no filtrado acima foi isolado por filtração sob vácuo, lavado com 50 mL de H20 e seco como acima para um rendimento de um pó branco (80,7 mg), que foi uma mistura dos produtos de 6-nitro e 8-nitro em uma proporção de 12,6:1. A combinação das amostras acima resultou em um rendimento de 55%, corrigindo para o material de partida não tratado. Uma porção da mistura de 3,3:1 foi tomada e recristalizada a partir de DMS0:H20, 77 conforme descrito acima, para dar pequenos cristais, semelhantes a agulhas, que foram isolados por filtração sob vácuo para produzir 21,1 mg de uma mistura de produtos 6-nitro e 8-nitro em uma proporção de 1:1,76. As proporções das misturas do produto foram determinadas por 1H RMN, observando-se a integração dos hidrogénios aromáticos em δ 7,45 e 7,84. As posições de substituição são indicativos e baseiam-se em trocas químicas relativas dos hidrogénios aromáticos. 1H RMN (dg-DMSO) δ 7,45 (s, 8-H, produto 6-nitro) , (s, 6-H, produto 8-nitro), 12,18 (s, NH) , 12,41 (s, NH) .
EIMS m/z 311 (M+2,35), 309 (M+, pb) , 251 (60), 235 (95). EIHRMS calculado para C9H3CIF3N3O4: 308,9733, encontrado 308,9768.
Os principais isómeros, 5-cloro-6-nitro-7-trifluorometil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona, foram isolados em forma pura em 64% de rendimento por cristalização de DMSO em água. Mp 343-347 °C. A estrutura foi confirmada pela análise de raios-X.
Exemplo 11. Preparação de 6-fluoro-l, 4-di-hidro-2,3-qrij.zioxaHna~ diona (composto de referência) 3-Fluoro-lf2-diaminobenzeno 3-Fluoro-l,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Tsuji et al. (Tsuji, Y. et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Uma suspensão de Zn em pó (10,5 g, 0,160 mol), CaCl2 (1,05 g) e H2O em 40 mL de EtOH foi aquecida a refluxo com agitação sob N2. A isto foi adicionado lentamente gota a gota uma solução de 4-fluoro-2-nitroanilina (2,00 g, 12,8 mmol) em 10 mL de EtOH. A mistura de reacção foi refluxada durante 8 horas. A análise de TLC (gel de sílica, benzeno 2:l:EtOAc) indicou completo desaparecimento do material de partida. O Zn foi removido por filtração sob vácuo, 78 e o solvente evaporado por rotação. 0 resíduo foi dissolvido em 50 mL de Et20, e a solução extraída com 3 x 25 ml de IN de HCl. As camadas aquosas foram combinadas e basificadas cora 50% aq. de NaOH (6 g) e a solução resultante extraída com 3 x 25 mL de Et20. As camadas de Et2<0 foram combinadas e secas (MgSCU) . O solvente foi evaporado por rotação para um rendimento de 1,36 g (84%) de um sólido castanho. mp 90-92 °C. RMN (CDC13) δ 3,18 (BRS, 2H, NH2) ; 3,58 (BRS, 2H, NH2) ; 6,44 (m, 2H, ArH) , 6,61 (m, 1H, ArH) . 6-flTioro-l,4-dl-hldro-2/3-qulnoxa.llna.dlona O composto de título (Sarges, R. et al. , J. Med. Chem. 33:2240 (1990)) foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (17,4 g, 0,100 mol) e 3-fluoro-l,2-diaminobenzeno (1,00 g, 7,93 rnmol) foi aquecida a refluxo com agitação sob N2 durante 2 horas. A reacção foi arrefecida à temperatura ambiente e o sólido foi colectado por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (50 mL) para dar um sólido cinzento-castanho, que foi adicionalmente seco sob vácuo (0,1 torr, 25 0C) para um rendimento de 1,06 g (74,4 %), que foi > 98% puro por RMN. Uma amostra analiticamente pura foi preparada pela dissolução de 60 mg do sólido em 1,0N de NaOH e o tratamento desta solução com carvão activado. A filtração desta mistura através de uma almofada de celite e acidificação com IN de HCl deu agulhas brancas finas que foram recolhidas por filtração sob vácuo, lavadas com H20 e secas adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para dar 25,5 mg de agulhas brancas, mp 375-380 °C (dez) (lit. > 300 °C (Sarges, R., et al.r J. Med. Chem. 33:2240 (1990)). ΧΗ RMN (d6-DMSO) δ 6,90 (m, 2H, ArH), 7,09 (dd, J = 9, J = 5,4), 11,9 (s, 1H, NH) , 11,96 (s, 1H, NH) . EIMS m/z 180 (100, M+) , 152 (44), 124 (63), 97 (43), 28 79 (53). EIHRMS calculado para C8H5FN2N2O2 180.0334, encontrado 180,0337.
Exemplo 12. Preparação de 6-clano-l,4-d±-h±droqu±noxalina-2,3-d±ona (composto de referência) 3.4- Diaminobenzonltrilo 3.4- Diaminobenzonitrilo foi preparado usando uma adaptação do método de Tsuji et al. (Tsuji, Y. et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Zn em pó (2,51 g, 38,3 mmol) , CaCl2 (251 mg), H2O (3,0 mL) e 9,0 mL de EtOH foram combinados e levados a refluxo, como descrito para 3-fluoro-1,2-diaminobenzeno (Exemplo 10) e a esta mistura foi adicionada lentamente gota a gota uma solução de 4-amino-3-nitrobenzonitrilo (500 mg, 3,06 mmol) em 20 mL de EtOH. Análise e a elaboração foram descritas para 3-fluoro-l,2-diaminobenzeno excepto que o residuo da reacção foi dissolvido em 20 mL de IN de HC1. Esta solução foi depois tornada básica pela adição de 20 mL de 1,5 M de NaOH. Um precipitado separado como agulhas castanhas amareladas finas que foram colectadas por filtração sob vácuo, lavadas com H2O frio e secas em um dessecador sob vácuo (0,5 torr, 25 °C) sobre CaSC>4 para render 275 mg (67%) de cristais castanhos amarelados. 1H RMN (CDC13) õ 3,42 (br s, 2H, NH2) , 3,86 (br s, 2H, NH2) , 6,70 (d, J = 8, 1H, ArH) , 6,96 (d, J = 1, 1H, ArH), 7,06 (dd, J = 8, J = 1, 1H, ArH). 6-clano-l,4-dl-hidro-2,3-qainoxallnadlona O composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (3,90 g, 27,6 mmol) e 3,4- 80 diaminobenzonitrilo (275 mg, 2,06 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH. 0 sólido castanho amarelado foi seco ao ar para um rendimento de 156,6 mg (40,8%), que foi > 98% puro por ‘ή RMN. Uma amostra analiticamente pura foi preparada por recristalização de 100 mg em 10 mL de ácido acético glacial para dar 21,2 mg de cristais brancos finos. *Η RMN (d6-DMS0) õ 7,20 (d, J = 8,1, 1H, ArH) , 7,39 (d, J = 1,2, 1H, ArH), 7,50 (dd, J = 1,2, J = 8,4, 1H, ArH), 12,09 (s, 1H, NH), 12,22 (s, 1H, NH) . EIMS m/z 187 (87, M+), 159 (100, pb) , 131 (83), 104 (77), 77 (65), 53 (43), 28 (30). EIHRMS calculado para C9H5N3O2 187,0381, encontrado 187,0377.
Exemplo 13. Preparação de 6-trifluorometll-1,4-d±"hidroqplnoxalína-2f3-dlona (composto de referência) 1.2- diamino-3-benzotr±£lúor 1.2- diamino-3-benzotriflúor foi preparado usando uma adaptação do método de Tsuji et al. (Tsuji, Y. et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990)}. Zn em pó (3,93 g, 60,1 mmol), CaCl2 (393 mg), H20 (4,65 mL) e 14,1 mL de EtOH foram combinados e levados a refluxo, como descrito para 3-fluoro-l,2-díaminobenzeno (ver Exemplo 10) e a esta mistura foi adicionada lentamente gota a gota uma solução de 4-amino-3-nitrobenzotrif lúor em 5 mL de EtOH. A análise e a elaboração foram descritas para 3-fluoro-l,2-diaminobenzeno (ver Exemplo 10), excepto que o resíduo de reacção foi dissolvido em 30 mL de IN de HC1. Esta solução foi depois lavada com 3 x 35 mL de Et20. A camada aquosa foi depois basificada com 50% de NaOH e a solução resultante extraída com 3 x 25 mL de Et20. As camadas orgânicas foram combinadas e secas (MgSCu) e o solvente evaporado a 81 pressão reduzida para um de rendimento 641 mg (75,9%) de um sólido castanho escuro. 1H RMN (CDCI3} δ 3,54 (br s, 4H, NH2) , 6,73 (m, 1H, ArH), 6,93 (m, 2H, ArH). 6-trifluorometil-lr 4-dl-h±cLro-2,3-quinoxalinadlona 0 composto de titulo foi preparado usando Uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietilico (3,72 g, 25,5 mmol) e 1,2-diamino-3-benzotrif lúor (300 mg, 1,70 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi arrefecido à temperatura ambiente e 0 sólido recolhido por filtração sob vácuo. Este sólido castanho amarelado foi lavado com hexanos e seco ao ar. Uma secagem adicional sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) produziu 240,1 mg (61,4%), que foi > 95% puro por 1H RMN. Uma amostra analítica foi obtida por recristalização de acetona-éter de dar um sólido branco-amarelado. % RMN (de-DMSO) δ 7,44 (t, 2H, ArH), 7,56 (s, 1H, ArH), 10,98 (br s, NH 1H) , 11,08 (s br, 1H, NH) . EIMS m/z 230 (100, pb, M+) , 202 (46) .
Exemplo 14. Preparação de 6,7-Difluoro-l,4-d±-hidro-2,3- qalnoxali.nadj.ona (composto de referência) 3, 4-Difluoro-1,2-d£amlnobenzeno 3,4-Difluoro-l, 2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Tsuji et al.r (Tsuji, Y. et al. , J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Zn em pó (942 mg, 14,4 mmol), CaCl2 (94,4 mg), Η20 (1,0 mL) e 4,0 mL de EtOH foram combinados e levados a refluxo, como descrito para 3-fluoro-1,2-diaminobenzeno (ver Exemplo 11) e a esta mistura foi adicionada lentamente gota a gota uma solução de 4,5- 82 difluoro-2-nitroanilina (200 mg, 1,15 mmol) em 2 mL de EtOH. A Análise e a elaboração foram descritos como para 3-fluoro-l,2-diaminobenzeno (Exemplo 11) , excepto que a reacção foi dissolvida em 5 mL de H20, e a solução extraída com 3x10 mL de Et20. As camadas orgânicas foram combinadas e tratadas com carvão activado, secas (MgS04) e filtradas através de uma almofada de celite. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, a fim de produzir 111,5 mg (67,3%) de um sólido cristalino castanho. 1H RMN (CDC13) õ 3,34 (br s, 4H, NH2) , 6,53 (t, 2H, ArH) . 6, 7-Difluoro-l, 4-d±-h±dro-2,3-qainoxallnadlona O composto de título (Sarges, R. et al.r J. Med. Chem; 33:2240 (1990)) foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (1,11 g, 7,63 mmol) e 3,4-difluoro-1,2- diaminobenzeno (110 mg, 0,763 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com hexanos e seco ao ar. Este sólido cinzento acastanhado foi recristalizado de 20 mL de EtOH e os cristais brancos acastanhados recolhidos por filtração sob vácuo e os cristais secos adícionalmente sob vácuo (0,5 torr, 25 °C) para um rendimento de 45,3 mg (30,0%) mp > 360 °C (lit. > 310 °C) . 1H RMN (d6-acetona) δ 7,19 (t, 2H, ArH, JH-F = 9,3), 10,9 (br s, 2Η, NH) .
Exemplo 15. Preparação de 5, 6, 7, 8-Tetrafluoro-1 r 4-di-hidro- quinoxal±na-2,3-díona (composto de referência) 2-Nltro-3, 4,5, 6-tetrafluoroanilzjia 83 2-Nitro-3,4,5,6-tetrafluoroanilina foi preparado usando uma adaptação do método de Brooke et al.r J. Chem. Soc, 802 (1961). 0 gás de amónia foi borbulhado atravaés de uma solução de pentafluoronitrobenzeno (3,00 g, 114,1 mmol) em 200 mL de éter etilico anidro durante 4 horas. Durante este tempo a cor mudou de branca clara para um amarelo carregado e um precipitado branco formado. O precipitado (fluoreto de amónio) foi separado por filtração sob vácuo e lavado com éter (30 mL) . O filtrado foi evaporado por rotação e os cristais cor de laranja resultantes deram 3 manchas em TLC (alumina, benzeno) . A purificação desta amostra foi realizada por cromatografia de coluna (base de alumina, benzeno). A purificação da amostra foi realizada por cromatografia de coluna (base de alumina, actividade II) sobre uma coluna de 1,5" x 20". A primeira banda foi colectada e concentrada para produzir um sólido amarelo 1,88 g (63,0%), mp 44,5-45 (lit. 42,5 a 43,5 °C). 19F RMN (Cg Fg padrão externo, δ-162,9) δ-149,9 (m) , -1.56.6' (m) , 162,0 (m), -178,3 (m). 3,4,5, 6-Tetrafluoro-l,2-diamlnobeiizeno 3,4,5,6-Tetrafluoro-1,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Tsuji et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990). Uma suspensão de Zn em pó (1,95 g, 29,8 mmol), CaCl2 (195 mg) e H20 (2,3 mL) em 7 mL de EtOH foi aquecida a refluxo com agitação sob N2. A isto foi adicionada lentamente gota a gota uma solução de 2-nitro-3,4,5,6-tetrafluoroanalina (2 g, 12,8 mmol) em 5 mL de EtOH. A mistura de reacção foi refluxada durante.5 horas. A análise de TLC (gel de sílica, benzeno 2:l:EtOAc) indicou o desaparecimento completo do material de partida. 0 Zn foi removido por filtração sob vácuo, e o Zn lavado com EtOH (30 mL). O solvente foi evaporado por rotação e o resíduo foi dissolvido em 20 mL de Et20 e a solução 84 foi lavada com 2 x 15 mL de H2O e 15 mL de NaCl saturada. A camada orgânica foi seca (MgS04) e filtrada por vácuo. 0 solvente foi evaporado por rotação para render 396,6 mg (92,5%) de um sólido roxo acastanhado, mp 120-125 °C, que foi utilizado sem purificação suplementar. 5, 6f 7, 8-Tetrafluoro-1r 4-d±-hldro-2, 3-çpilnoxalinadiona. 0 composto de titulo (Allison, et al., J. Fluorlne Chem. 1:59 (1971)) foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietilico (2,86 mL, 4,1 mmol) e 3,4,5, 6-tetrafluoro-1,2-diaminobenzeno (380 mg, 2,11 mmol) foi aquecida a refluxo com agitação sob N2 durante 8 horas. A reacção foi arrefecida à temperatura ambiente e uma pequena quantidade de precipitado roxo foi observado. O excesso de oxalato de dietilo foi evaporado e o sólido resultante foi suspenso em 20 mL de hexanos, filtrado sob vácuo e o sólido lavado com hexanos (20 mL) e acetato de etilo (10 mL). 0 sólido foi seco ao ar para render 244,8 mg (49,9%). mp 330-331 °C (lit. ca. 300 °C dez). ΧΗ RMN (d6-DMSO) δ 12,33 (br s, NH) . 1SF RMN (C6Fg padrão externo, δ-162,9), 5-157,7 (m) , -167,9 (m) .
Exemplo 16. Preparação de 5~bromo-7-fluoro-1,4-d±-hidroquinoxal±na-2 f 3-diona (composto de referência) 6-Bromo-4-fluoro-2-nitroanllina 6-Bromo-4-fluoro-2-nitroanilina foi preparado usando uma adaptação do método de Mitchell et al.r J. Org. Chem. 44:4733 (1979). A uma solução de 4-fluoro-2-nitroanilina (500 mg, 3,2 mmol) em DMF seco (16 mL) sob N2 foi adicionado gota a gota uma solução de N- 85 bromosuecinimida {570 mg, 3,2 mmol) em DMF seco (16 mL) . A reacção foi deixada a agitar durante 24 horas· A solução foi depois vertida em 100 mL de H2O e esta fase aquosa extraída com 4 x 25 mL de CH2CI2. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 3x4 mL de H2O e secas (MgS04) . 0 MgSOí foi filtrado sob vácuo e o solvente evaporado por rotação para produzir um óleo castanho que cristalizou em repouso. 642 mg (85,4%). RMN (CDCI3) δ 6,51 (br s, 2H NH2), 7,58 (dd, JH4-3 = 3Hz, JH4-F =6,5 Hz, H-4) , 7,92 (dd, JH3-4 = 3 Hz, Jh3-f =8,7 Hz, H-3) . 1.2- d±amlno-3-bromo-5-fluorobenzeno 1.2- diamino-3-bromo-5-fluorobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Bellamy et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984). Uma mistura de 6-bromo-4-fluoro-2-nitroanilina (673 mg, 2,87 mmol) e SnCl2 2H20 (3,23 g, 14,3 mmol) dissolvido em 6 mL de acetato de etilo e 3 mL de etanol absoluto foi aquecido a 70 °C durante 30 minutos. Todos os materiais de partida tinham reagido como evidenciado por TLC (gel de sílica, 2:1 hexanos: acetato de etilo). A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e vertida em 20 mL de gelo esmagado. NaHC03 suficientemente sólido foi acrescentado para levar o pH a 7,5. A mistura de reacção foi depois extraída com 3 x 20 mL de acetato de etilo e as fases orgânicas combinadas lavadas com solução de NaCl saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04) , filtrada por vácuo e o solvente evaporado por rotação para um rendimento de líquido castanho escuro de 510 mg (86,7%). RMN (CDC13) δ 3,64 (br s, 4H, 2 (NH2) ) , 6,44 (dd, 1H, H5, J4-5 = 2,7, JH-F = 9,8), 6,72 (dd, 1H, H4, J4_5 = 2,7, JHF = 8,4). 5-bromo-7-fluoro-l, 4-di -bidro-2 , 3-quinoxa.lina.diona 86 0 composto de título foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato. dietílico (3,31 mL, 24,4 mmol) e 1,2-diamino-3-bromo-5-fluorobenzeno (500 mg, 2,44 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 5 horas. A mistura de reacção foi castanha escura. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (30 mL) . O sólido castanho foi seco ao ar durante 1 hora para dar 250 mg (39,6% de rendimento bruto). Uma parte deste sólido foi removido e dissolvido em IN de NaOH (10 mL) e algumas partículas insolúveis foram removidas por filtração de gravidade. A solução foi tratada com carbono de descoloração e a mistura foi filtrada através de uma almofada de celite e a solução resultante acidificada com IN de HC1. Formaram-se cristais brancos que foram isolados por filtração sob vácuo e lavados com água (20 mL) . Os cristais foram secos por pistola de secagem (0,05 torr, 78 °C) para um de rendimento 54,1 mg, mp 308-310 °C (dez). ^ RMN (d6-DMSO) δ 6,2 (dd, 1H, JK6-8 = 2,7, Jh-f = 9,3, ArH) , 7,35 (dd, 1H, Jh6-8 = 2,4, JHF = 8,4 Hz), 11,1 (br s, 1H, NH) , 12,1 (brs, 1H, NH) . EIHRMS calculado para 08Η4 BrFN202·: 257,9440, encontrado 257,9455.
Exemplo 17. Preparação de 6-cloro-7-fluoro-l,4-di-hi.çíroqulnoxalina-2,3-dlona (composto de referência) 0 composto de título foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962). Uma mistura de oxalato dietílico (1.8 3 g, 12,5 mmol) e 1,2-diamino-4-cloro-5- fluorobenzeno (200 mg, 1,25 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH. Este sólido foi dissolvido em IN de NaOH (20 mL) e a solução 87 tratada com carbono de descoloração. Esta mistura foi filtrada através de uma almofada de celite e a solução cor de laranja pálido resultante acidificada com 4N de HC1. Formou-se um precipitado que foi isolado por filtração sob vácuo e lavado com água. Este sólido amarelo acastanhado foi seco em uma pistola de secagem (0,05 torr, 78 °C) para render 121,7 mg (45,5%). mp 344-348 °C (dez) 1H RMN (dg-DMSO) δ 6,93 (d, 1H, Jh8-f = 10,2 Hz, H-8), 7,08 (d, 1H, Jh4-f = 7,2 Hz, H-4) . 19F RMN (C6F6 padrão externo, δ -162,9) δ -124,7 (s) . EIHRMS calculado para C8H4CIFN2O2 213,9945, encontrado 213,9961.
Exemplo 18. Preparação de 5-bromo-7-trlfluoromet±l-l f 4.-d±-hidro-2,3-qulnoxallnadlona (composto de referência) O composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soe. 1171 (1962). Uma mistura de oxalato dietilico (1,15, 7,91 mmol) e 1,2-diamino-3-bromo-5- trifluorometilbenzeno (200 mg, 0,95 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (15 mL). Este sólido branco foi seco em pistola de secagem (0,05 torr, 78 °C) para render 148,3 mg (60,7%). mp 301-304 (dez). RMN (d6-DMSO) δ 7,28 (s, 1H, ArH) , 7,56 (s, 1H, ArH) , 11,7 (br s, 2H, NH) . 19F RMN (CgF6 padrão externo, δ -162,9) δ - 57,97 (s) . EIHRMS calculado para C9H4BRF3N2O2 307,9408, encontrado 307,9411.
Exemplo 19. Preparação de 6-fluoro-7-nltro-l,4-dí-hídro-2,3- quinoxalinadiona (composto de referência) O composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). 6- 88 fluoro-1,4-d-hidroquinoxalina-2,3-diona (200 mg, 1,10 mmol) foi dissolvido em 3 mL de H2SO4 concentrado e a solução verde azul foi arrefecida a 0 °C com agitação- Isto foi adicionado em pequenas porções KNO3 (110 mg, 1,10 mmol) . A reacção foi deixada durante 1 hora a agitar a 0 °C e, em seguida, foi deixada a atingir a temperatura ambiente e a agitação durante a noite. A mistura de reacção castanha-laranja foi depois vertida em 10 mL de gelo/H20. O produto foi isolado por filtração sob vácuo como cristais castanhos que foram lavados com uma pequena quantidade de H20 frio e seco ao ar. Os cristais foram secos adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para render 173,4 mg (70,0% de rendimento).
Uma amostra analitica foi preparada pela dissolução de 75 mg do produto bruto em 5 mL de 1 N de NaOH e tratamento desta solução com carvão activado. Esta suspensão foi filtrada por vácuo através de uma almofada de celite e a solução cuidadosamente acidificada com HC1 concentrado para dar cristais amarelos como o precipitado. Os cristais foram isolados por filtração sob vácuo e secos, como descrito acima para dar 38,9 de cristais amarelos brilhantes. mp 348-350 (dez) 1H RMN (d6-DMSO) δ 12,4 (s, 1H, NH) , 12,1 (s, 1H, NH) , 7,8 (d, Jh-f meta = 7,2, 1H, ArH) , 7,0 (d, JH-F = 12, 1H, ArH) . EIMS m/z 225 (100, M+, 167 (10), 45 (41), 28 (96). EIHRMS calculado para C8H4FN3O4 225,0185, encontrado 225,0196.
Exemplo 20. Preparação de 6-A trifluorometil-7-nítro-l,4~dl-h±dro-2 r3~<p^inoxalinadiona (composto de referência) 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). 6- trifluorometil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (200 mg, 0,869 mmol) foi dissolvido em 8 mL de H2SO4 concentrado e a solução 89 amarela-esverdeada foi arrefecida a 0 °C com agitação. A isto foi adicionado em pequenas porções, KNO3 (87,8 mg, 1,10 mmol). A reacção foi deixada a agitar durante 1 hora a, 0 °C e, em seguida, foi deixada a atingir a temperatura ambiente e a agitar durante a noite. A mistura de reacção laranja-acastanhada foi depois vertida em 10 mL de H20 em gelo. O produto foi isolado por filtração sob vácuo como cristais, amarelos pálidos, que foram lavados com uma pequena quantidade de H20 frio e seco ao ar. Os cristais foram secos adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para render 121,1 mg (50,6% de rendimento). 1H RMN (d6-DMSO) δ 7,53 (s, 1H, ArH) , 7,80 (s, 1H, ArH), 12,4 (s, 2H, NH) . EIMS m/z 275 (81, M+) , 217 (36), 201 (100, pb) , EIHRMS calculado para C9H4N3O4F3 275, 0153, encontrado 275,0170.
Exemplo 21. Preparação de 6~sulfonil~l,4-d±-hidro-2,3-qalnoxal±na-diona (composto de referência) 6-Clorosulfonil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi preparada usando uma adaptação do método de Keana et al. (J. Org. Chem. 48:3654 (1983)). A 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (1,0 g, 6,2 mmol) foi adicionado 3,0 mL de uma só vez de ácido clorossulfónico. A mistura foi agitada sob N2 a 60 °C durante 2 horas, deixada chegar à temperatura ambiente e a solução adicionada lentamente gota a gota para 25 mL de gelo esmagado. O sólido resultante foi filtrado sob vácuo e lavado com gelo/H20. 0 sólido branco foi seco adicionalmente em 0,5 torr (25 °C) sobre CaS04 para render 1,1 g (68%). RMN (dg-DMSO) δ 7,07 (d, J7-a = 8,1, 1H, H8) , 7,29 (dd, J7_8 = 8,1, J6-7 = 1,0, 1H, H7), 7,40 (d, J5-7 = 1,0, 1H, Hs) . EIMS m/z 262 (M+2, 15), 260 (M+, 40), 225 (35), 105 (43), 36 (100, pb) . EIHRMS calculado para C8H5CLN2O4S 259,9687, encontrado 259,9645. 90 6-sv.lfoníl-l, 4-dl-h±dro-2, 3-qainoxalinadlona 6-sulfonil-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi preparado usando uma adaptação do método de Keana et al. (J. Org. Chem. 48:3654 (1983)). Uma suspensão de 6-clorossulfonil-1,4-di-hidro-2,3- quinoxalinas (142,7 mg, 0,546 mmol) em 5,0 mL de H2O foi agitada a 50 °C durante 8 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o sólido resultants seco adicionalmente sob vácuo (0,5 torr, 50 °C) para dar um sólido cor de laranja pálida.pulverulento 121,6 mg (91,8%). XR RMN (D20) 7,2 (br m, 2H, ArH) , 7,5 (br m, 1H, ArH). EIMS m/z 242 (M+, 5), 162 (37), 106 (100), 80 (89).
Exemplo 22. Preparação de 6-su.lfonamida-l, 4-di-h.idro~2,3~ qruinoxalinadiona (composto de referência) A 6-clorossulfonil-l,4-di-hidro-2,3-guinoxalinadiona (200 mg, 0,770 mmol) foi adicionado de uma só vez 2 mL de NH4OH concentrado. A mistura foi levemente aquecida num banho de vapor com agitação ocasional. À medida que a solução aqueceu, formou-se um precipitado branco. A solução foi aquecida durante 20 minutos e arrefecida à temperatura ambiente e a mistura acidificada com IN de HC1. O sólido foi colectado por filtração sob vácuo e, em seguida, lavado com H20 frio. O sólido foi seco adicionalmente sob vácuo (0,5 torr, 25 °C) para um rendimento de 98,2 mg (53,0%), que foi > 95% puro por 1H RMN. Uma amostra analítica foi preparada pela dissolução de 4 5 mg do sólido em 1 mL de IN de NaOH seguido por acidificação da solução com IN de HC1. A sulfonamida precipitou como agulhas amarelas pálidas que foram isoladas por filtração ·sob vácuo, lavadas com H20 frio e secas sob vácuo (0,5 torr, 25 °C) para um rendimento de 28,9 mg. 1H RMN (dg-DMSO) 7,20 (d, J7-g = 8,4, 1H, Hs) , 7,34 (s, 2H, NH2), 7,50 (dd, J7-5 = 1,8, J7-S = 8,4, 1H, H7) , 7,56 (d, 91 J5-7 ” 1,8, 1Η, H5) , 12,14 (s, 1H, NH) , 12,11 (s, 1H, NH) . EIMS m/z 241 (M+, 83), 133 (63), 105 (pb, 100), 64 (75), 28 (80). EIHRMS calculado para Ce H7N3O4S 241,0156, encontrado 241,0139.
Exemplo 23. Preparação de 6- (N-propilsulfonil) -1,4-dl-hldro-2,3-quinoxalinadiona (composto de referência) 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Adains et al. (J. Am. Chem. Soc. 73:1147 (1951)). A uma mistura
de n-propylamine (50 mg, 0,846 mmol) em 0,5 mL de piridina a 0 °C foi adicionado em pequenas porções 6-clorossulfonil-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (100 mg, 0,385 mmol). A solução foi deixada a aquecer à temperatura ambiente e agitada durante 8 horas sob N2. A mistura de reacção foi vertida em uma mistura de 5 mL 1:1 de H20: HC1 concentrado e 3 g de gelo. Os cristais começaram a formar-se depois de 1 hora, e a solução foi deixada a repousar durante a noite. Os cristais foram isolados por filtração sob vácuo como agulhas amarelas pálidas, lavadas com H20 frio e secos adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para um rendimento de 47,5 mg (44,1%). ΧΗ RMN (ds-DMSO) δ 0,74 (t, 3H, CH3) , 1,32 (m, 2H, CH2) , 2,62 (m, 2H, CH2) , 7,20 (d, J = 8,4, 1H, H7) , 7,42 (d, J = 7,4, 1H, H5), 7,50 (m, 2H, NH, Hs) , 12,07 (s, 1H, NH) , 12,14 (s, 1H, NH).
Exemplo 24. Preparação de 6- (N,N-Dimetilsulfonil) -l,4-di~hJ.dro-2,3-qulnoxalinadiona (composto de referência) 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Adams et al. (J. Am. Chem. Soc. 73:1147 (1951)). A uma mistura de dimetilamina (40% desoluçâo, 52,2 mg, 131 pL, 1,16 mmol) e 0,5 mL de piridina a 0 °C foi adicionado em pequenas porções 6- 92 clorossulfonil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (100 mg, 0,385 mmol) . A solução foi deixada a aquecer à temperatura ambiente e agitada durante 8 horas sob N2. A mistura de reacção foi vertida em uma mistura de 5 mL 1:1 de H20:HC1 concentrado e 3 g de gelo. Os cristais começaram a formar-se depois de 1 hora, e a solução foi deixada a repousar durante a noite. Os cristais foram isolados por filtração sob vácuo como agulhas brancas, lavados com H2Q fria e secos adicionalmente no vácuo (0,1 torr, 25 °C) para um rendimento de 44,2 mg (42,6%). RMN (d6-DMSO) δ 2,57 (s, 6H, CH3) , 7,28 (d, J7-a = 8,4, 1H, HB) , 7,44 (dd, J = 8,7, J = 1,8, 2H Hs, H7) , 12,03 (s, 1H, NH) , 12,22 (s, 1H, NH) . EIMS m/z 269 (M+, 83), 225 (26), 161 (pb, 100), 106 (94).
Exemplo 25. Preparação de N-metil-6, 7-dln±tro-l, 4-di-h.±dro-2,3-qainoxalinadlona (composto de referência) N-metil-l,2-diamlnobenzeno N-metil-1,2-diaminobenzeno foi preparado usando uma adaptação do método de Tsuji et al. (J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Zn em pó
(8,07 g, 0,123 mol) , CaCl2 (807 mg), H20 (9,9 mL) e 30 mL de EtOH foram' combinados e levados a refluxo, como descrito para 3-fluoro-1,2-diaminobenzeno (ver Exemplo 10), e a esta mistura foi adicionado lentamente gota a gota uma solução de N-metil-2-nitroanilina (1,50 g, 9,86 mmol) em 15 mL de EtOH. A análise e a elaboração foram descritos como para 3-fluoro-l,2-diaminobenzeno excepto o fcato de que o resíduo de reacção foi dissolvido em 50 mL de Et20. Esta solução de Et20, em seguida, foi extraída com 3 x 25 mL de IN de HC1 e as camadas aquosas combinadas e basificadas com 5 g de 50% de solução de NaOH. Esta solução foi, depois, extraída com 3 x 25 mL de Et20. Estas camadas de Et20 foram, em seguida, 93 combinadas, secas (MgSCu) e o solvente evaporado a pressão reduzida para um rendimento de 911,1 mg (76,1%) de um óleo castanho escuro. XH RMN (CDC13) δ 2,87 (s, 3H, CH3) , 3,31 (br s, 3H, NH) , 6,67 (m, 3H, ArH), 6,86 (m, 1H, ArH). N-metíl-1, 4-dl-hidro-2,3-quinoxalinadl012a N-metil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietilico (3,23 g, 22,1 mmol) e N-metil-1,2-diaminobenzeno (332 mg, 2,72 mmol) foi aquecida a refluxo sob N2 durante 2 horas. A reacção foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente e o sólido recolhido por filtração sob vácuo e lavado com EtOH. 0 sólido castanha acinzentado foi seco adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para dar 274,3 mg (57,2%). Uma parte deste sólido foi purificada adicionalmente por recristalização de 50 mL de EtOH e tratamento com carvão activado para dar cristais amarelos pálidos fofos, que foram colectados por filtração sob vácuo e lavados com EtOH frio para um rendimento de 104,9 mg. 1H RMN (d6~ DMSO) δ 3,50 (s, 3H, CH3) , 7,16 (m, 3H, ArH), 7,36 (m, 1H, ArH), 12,01 (s, 1H, NH). EIMS 176 (M+, 52), 148 (33), 119 (100, pb). N-metil-6,7-dinitro-l,4~d±-h±dro-2 r 3-quiuoxallnadlona 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (J. Chem. Soc, 1171 (1962)), N-metil-1,4-di-hidro- 2,3-quinoxalinadiona (200 mg, 1,13 mmol) foi dissolvido em 3 mL de H2SO4 concentrado e a solução azul esverdeada foi arrefecida a 0 °C com agitação. A isto foi adicionado em pequenas porções KNO3 (228 mg, 2,26 mmol). A solução cor de laranja escuro foi deixada durante 1 hora a agitar a 0 °C e, em seguida, foi deixada a atingir a 94 temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de rea.cção cor de laranja acastanhada foi depois vertida em 10 mL de H20 em gelo. O produto foi isolado por filtração sob vácuo como um sólido branco amarelado, que foi lavada com 10 mL de H20 frio e seco ao ar. Os cristais foram secos adiciónalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para produzir 220 mg (72,0%). Uma amostra analítica foi preparada por recristalização de 120 mg da amostra em bruto a partir de ácido acético glacial. Os cristais resultantes foram reunidos por filtração sob vácuo e lavados com H20 e secos sob vácuo vacuum (0,1 torr, 60 °C) para um rendimento de 34,2 mg de cristais amarelos. 1H NMR (d6-DMS0) δ 3.52 (s, 3H, CH3) , 7,80 (s, 1H, ArH), 8,10 (s, 1H, ArH), 12,6 (s, 1H, NH).
Exemplo 26. Preparação de 2,3- (4N) -1,4~d£-h±dro-2,3-qulnoxallna-diona (composto de referência) 0 composto de título foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171 (1962)}. Uma mistura de oxalato dietílico (6,22 mL, 45,5 mmol) e 1,2-diaminopiridina (500 mg, 4,58 mmol) foi aquecida a refluxo com agitação sob N2 durante 2 horas. A reacção foi arrefecida à temperatura ambiente e o sólido foi colectado por filtração sob vácuo e lavado com EtOH (20 mL) para dar um sólido branco^amarelado, que foi seco adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para um rendimento de 693 mg (93,0 %). 1H RMN (de-DMSO) δ 7,11 (dd, 1H, H-7), 7,43 (dd, 1H, J = 8,1 Hz, 1,2 Hz, H-8), 8,05 (dd, 1H, J = 5,1 Hz, J = 1,2 Hz, H-6).
Exemplo 27. Preparação de 2,3,6,8-Tetraceto-5,6-dimetilpteridína (composto de referência) 95 0 composto de titulo foi preparado usando uma adaptação do método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Uma mistura de oxalato dietílico (1,75 ml, 12,8 mmol) e 5,6-diamino-l,3-dimetiluracilo hidratado (200 mg, 1,18 mmol) foi aquecida a refluxo com agitação sob N2 durante 8 horas. A reacção foi arrefecida à temperatura ambiente e o sólido foi colectado porfiltração sob vácuo e lavado com EtOH (10 mL) para dar um sólido amarelo, que foi seco ao ar para um rendimento de 76,0 mg (66,6%) seco adicionalmente sob vácuo (0,1 torr, 25 °C) para produzir 1,06 g (74,4%), que foi > 98% puro por RMN. Uma parte deste sólido (100 mg) foi dissolvido em 1,0 N de NaOH (5 mL) . A acidificação desta solução com. 6N de HC1 deu um sólido amarelo vivo que foi colectado por filtração sob vácuo, lavado com H20 (10 mL) e seco em uma pistola de secagem (0,05 torr, 78 °C) para fornecer 42,4 mg. 1H RMN (dê-DMSO) δ 3,20 (s, 6H, CH3) , 11,59 (br s, 2H, NH). mp 370-372 (dez), EIMS m/z 224 (100, M+), 196 (80) .
Nos seguintes exemplos 28-44, foram utilizados reagentes como recebidos, a menos que indicado de outra maneira. Os pontos de derretimento foram tomados num aparelho de ponto de derretimento Mel-Temp e são não corrigidos. As amostras foram colocadas no bloco quando a temperatura foi > 250 °C, de modo a minimizar a decomposição antes do derretimento. A cromatografia de coluna foi realizada na forma de flash em gel de sílica Davisil (200-425 de malha), a menos que indicado de outra maneira. A cromatografia de camada fina analítica foi executada em placas 60 F254 de gel de sílica cobertas de alumínio e a visualização foi efectuada com uma lâmpada de luz ultravioleta. OS espectros de 1H RMN foram gravados em um aparelho de 300 MHz General Electric QE-300; as trocas químicas são relatadas em unidades delta referenciadas aos sinais de protão residual dos solventes deuterados (CHCI3, δ 7,26; CHD20D, 96 δ 3,30; CD3SOCD2H, δ 2,49; CD3COCD2H, δ 2,04. Os espectros de 13c RMN foram executados a 75 MHz. Os espectros infravermelhos foram obtidos em um espectrómetro Nicolet 5DXB FT-IR. As absorções gravadas em números d onda (cm-1) e a intensidade das absorções são indicadas pelas letras s (forte), m (médio) e w (fraco). Os espectros de massa foram gravadas em um espectrómetro de massa VG ZAB-2-HF com um sistema de dados VG-11-250, na modalidade de ionização de eletrões (70 eV) , a menos que indicado de outra maneira. As microanálises foram realizadas por Desert Analytics de Tucson, Arizona.
Exemplo 28. Preparação de l~am±no-l. 4-rfi-?i7r?rn-P _ na-x-aUnari-i r>na (composto de referência) O processo de Wallace, R.G., Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982) foi adaptado. A uma suspensão agitada de 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (162 mg, 1,00 mmol, Aldrich) em água destilada (4 mL) a 25 °C foi adicionado NaOH (100 mg, 2,5 mmol). Após 5 minutos, a solução resultante foi tratada em porções sucessivas durante 10 minutos com ácido hidroxilamino-o-sulfónico (113 mg, 1,00 mmol, Aldrich). A reacção foi realizada à temperatura ambiente. Um precipitado branco surgiu depois de 1 hora, continuamente agitado por mais 1 hora, foi colectado para se obter 70 mg (40%) do 1-amino-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona bruta (base livre Na+, proporção do material de partida do produto = 5:95 por RMN, D20) . O filtrado foi acidificado para pH = 2 por IN de HC1 (~ 1,5 mL) , dando um precipitado branco 50 mg, que foi uma mistura 1:1 de 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona e o sal de cloridrato de l-amino-2,3-quinoxalinedione (por RMN, DMSO). 0 rendimento total de 1-amino-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é de 51%. 97
Uma amostra de 70 mg da l-amino-2,3-quinoxalinadiona bruta foi dissolvido em água destilada (5 mL) e, em seguida, acidificada para pH = 5 com AcOH e, em seguida, a solução foi deixada em repouso a 25 °C, um dia, dando agulhas brancas. Os cristais foram colectados através de filtração e, em seguida, lavados com água destilada (2 x 2 mL) , seguido por etanol (2x1 mL) dando 61 mg (34,5%) de 1-amino-2,3-quinoxalinadiona pura (base livre H) como agulhas brancas; mp:226-8 °C (sublimes), 260-2 °C (dez) (lit., Shin, S.C. e Lee, Y.Y. Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4 (1983), 228 °C sublime). IR (KBr, cm~1): 3306, 1687, 1631, 1587. RMN (1H, DMSO-ds) : δ 5,880 (s, 2H); 7,143 (m, 3H) ; 7,601 (d, 1H) ; 12,061 (s, 1H) . HRMS, calculado para C8H7N3O2 (M+) m/z: 177,0537; encontrado: 177,0536.
Exemplo 29. Preparação de l-amlno-6, 7-dicloro-lr4-dl-hldro-2,3-qulnoxallnadiona (composto de referência) O processo de Wallace, R.G., Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982) foi adaptado. A uma suspensão agitada de 6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (189 mg, 0,82 mmol) em água destilada (15 mL) a 60 °C foi adicionado NaOH (335 mg, 8,37 mmol). Após 30 minutos a solução resultante foi tratada em porções sucessivas durante 10 minutos com ácido hidroxilamino-o-sulfónico (111 mg, 0,98 mmol, Aldrich). A reacção foi conduzida a 60 °C. Um precipitado branco surgiu após 10 minutos. A mistura foi agitada a 25 °C durante 8 horas, foi recolhida por filtração, a 50 °C, rendendo 180 mg (90%) da l-amino-β,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta, como um sólido branco amorfo (proporção de material de partida para o produto = 10:90 por RMN, D20) . O rendimento é de 81%. Uma amostra de 109 mg da l-amino-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadion bruta (base livre Na+, 0,445 mMol) foi suspensa em IN de NaOH (10 mL) a 50 °C durante 30 minutos e recolhida por 98 filtração. 0 precipitado (87 mg) foi dissolvido em água destilada quente (80 mL) e o material insolúvel foi removido por filtração. j O filtrado foi depois acidificado com AcOH para pH = 5. A suspensão resultante foi aquecida a 60-70 °C para efectuar uma solução clara e, em seguida, foi arrefecida lentamente a 25 °C, dando agulhas brancas. Os cristais foram colectados através de filtração e, em seguida, lavados com água destilada (2x2 mL) , seguido por etanol (2x1 mL) , secos por rotação a vapor a 60 °C durante 4 horas, dando 73 mg (84%) de l-amino-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (base livre H). O mp foi depois medido. A cor da l-amino-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona mudou para amarelo a 335 °C; a decomposição de l-amino-6,7-dicloro-l,4-di- hidro-2,3-quinoxalinadiona é óbvia a 340 °C e o fundido para um líquido negro a 343-5 °C. IR (KBr, cm"1): 3337; 3225; 3056; 1706; 1668; 1581. RMN' (% DMSO-d6) : δ 5,791 (s, 2H) , 7,271 (s, 1H) , 7,721 (s, 1H); 12,115 (s, 1H). HRMS: calculado para C8H5N3O2CI2 (M +) m/z: 244,9756; encontrado: 244,9767.
Exemplo 30. Prepaxração de 1-acetamido-l, 4-d±-h±dro-2 ,3- quinoxalinadiona (composto de referência)
Uma mistura de 1-amino-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (53 mg, 0,30 mmol) e piridina (1 mL, destilado fresco a partir de KOH antes da utilização) e anidrido acético (1 mL, Aldrich) foi agitada sob azoto a 60 °C durante 4 horas. A mistura reacção tornou-se uma solução clara. Todos os solventes e reagentes foram, depois, evaporados sob pressão reduzida e lavados com benzina:ciclo-hexano = 1:1 (2x2 mL) , éter (2x2 mL) , secos a 60 °C durante 2 horas com rotação a vapor, rendendo 57 mg (86%) de 1-acetamido-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadíona pura como um pó branco; mp :211-213 °C. IR (KBr, cm'1): 3430; 3127; 1741; 1717; 1668. RMN (XH, DMSO-d6) δ: 99 2,326 (s, 3H); 7,121-7,287 . (m, 4H); 12,345 (s, 1H). Massa: calculada para C9H10N3O3 (M +) m/z: 219,0641; encontrado: 219,0651.
Exemplo 31. Preparação de 1-[[(o-Tolilamino)carbonil] amino]-1,4-di-h±dro-2r3-quinoxalinadiona (composto de referência) 0 processo de Leeson, P.D. et al. , J. Med. Chem 35:1954-68 (1992) foi adaptado. Uma suspensão de 1-amino-l,4-di~hidro-2,3- quinoxalinadiona (37 mg, 0,21 mmol) em piridina (2,5 mL) foi agitada a 70 °C até a dissolução estar concluída. À solução foi depois adicionado o isocianato de o-tolil (27,8 mg, 0,21 mmol, Aldrich), que foi agitado a 60 °C durante 2 horas, em seguida, durante a noite à temperatura ambiente. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi lavado por éter (2x2 mL) para dar 59 mg de 1-[[(o-tolilamino)carbonil]amino]-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (66% de produto; 30% de subproduto de tolil; 4% de 1-amino-l,4-di-hidro-2,3-quínoxalinadiona por 1H RMN). Separado por cromatograf ia por coluna de gel de silica (2 g) , eluído com 100% de benzeno (20 mL) e benzeno: acetona = 1:1 (20 mL) e 100% de acetona (20 mL) para remover a maior parte das impurezas. 0 residuo (43 mg de 1-[[(o-tolilamino)carbonil]amino]-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona) foi lavada com etanol (2x2 mL) e éter (2 x 1 mL) para fornecer 38 mg de 1-[[ (o-tolilamino)carbonil]amino]-1,4- di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura como um pó branco (60%). Mp: decomposto a partir de 265 °C. IR (KBr, cm-1): 3375; 3237; 1718; 1693; 1675. RMN (% DMSO-d6) δ 2,161 (s, 3H) ; 6, 996-7,380 (m, 8H), 8,530 (s, 1H), 9,343 (s, 1H); 12,155 (s, 1H).
Exemplo 32. Preparação de 1-Amino-6, 7-dibromo-l, 4-d±-hidro-2,3-quinoxalinadiona (composto de referência) 100 6.7- dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona' (Método A): 0 processo de Jorgenson, A.K. et alpedido de publicação da patente internacional No. W091/13878 e Chem. Abstr. 115 (25): 280059 u (1991), foi adaptado. A uma suspensão agitada de 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (1,62 g, 10,00 mMol, Aldrich) e Ag2S04 (3,43 g, 11,00 mMol) concentrada em H2SO4 (10 mL) à temperatura ambiente foi adicionado bromo (3,52 g, ~ 1,13 mL, 22,00 mmol} durante 30 minutos. A mistura foi depois agitada, à temperatura ambiente durante 24 horas. Tetraclorometano (10 mL) foi depois adicionado e, a mistura de reacção foi agitada a 50 °C durante 2 horas. O material insolúvel foi removido por filtração, o filtrado foi vertido em água gelada (200 mL) , e o sólido amarelo separado foi colectado por filtração e seco ao ar. A 6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona bruta foi dissolvida em IN de NaOH (20 mL) e água (20 mL) , e o precipitado amarelo foi removido por filtração. O filtrado foi acidificado com 4N de HC1 pH = 2 para dar um precipitado branco, que foi lavado com água destilada (2x2 mL) e etanol (2x1 mL), rendendo 1,082 de 6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona como um pó fino cinza (95% de pureza por RMN) . A segunda colheita do precipitado amarelo com o procedimento acima, para dar 927 mg de 6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. O rendimento total é de 65%. A cristalização de DMSO/H2O forneceu microcristais brancos (85% recuperados). Mp: decomposto a partir de 335 °C. IR (KBr, cm-1): 3200; 1718; 1693. RMN (% DMSO-d6) : δ 7,336 (s, 2H) ; 11, 962 (s, 2H) . HRMS: calculado para CsH4N202Br2 (M+) m/z: 317,8639, encontrado: 317,8619. 6.7- dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (Método B) : 0 processo de Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44 (25):4733 (1979) foi adaptado. A uma suspensão agitada de 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (3,24 g, 20,00 mMol, Aldrich), em DMF seco (100 101 mL) foi adicionado N-bromossuccinimida (14,24 g, 80,00 mMol, Aldrich) e a mistura foi agitada a 25 °C durante 0,5 horas para dar uma solução amarela clara. A reacção foi realizada continuamente, a 25 °C durante 24 horas para dar um precipitado branco, que foi colectado por filtração e, em seguida, lavado com água destilada (2 x 1 mL), seguido por 95% de etanol (2x2 mL) para produzir 2,216 g de 6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (por RMN) como um pó branco. O filtrado foi vertido em 200 mL de água gelada e o precipitado foi colectado por filtração e, em seguida, lavado com água destilada (2x2 mL), seguido por 95% de etanol (2x2 mL) para produzir 3,627 g de 6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (com 1% impureza por RMN), que foi dissolvido em IN de NaOH (50 mL) e, em seguida, acidificado com pH - 2 com 4N de HC1 para dar um precipitado branco creme. O precipitado foi colectado por filtração e lavado com água destilada (2x2 mL) , seguido por 95% de etanol (2x2 mL) e seco ao ar, a 50 °C durante 8 horas, dando 3,517 g (rendimento total de 89%) de 6,7-dibromo-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (por RMN) como um pó branco. A recristalização de DMSO/H2O} forneceu microcristais brancos. O Mp de 5,6-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi ' medido: decomposto a partir de 335 °C. IR (KBr, cm-1) : 3200, 1718, 1693. RMN (XH, DMSO-ds) : δ 7,336 (s, 2H) ; 11,962 (s, 2H) . HRMS: calculado para C4HgBr2N202 (M+) m/z: 317,8639 encontrado: 317,8619. 6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (Método C): A uma suspensão agitada de 1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (550 mg, 3,39 mmol, Aldrich), em DMF seco (10 mL) foi adicionada gota a gota uma solução de bromo (1,07 g, 6,77 mmol, Aldrich), em DMF seco (0,5 mL) durante 1 hora e, em seguida, a reacção foi agitada a 25 °C durante 30 horas. Em seguida, tetraclorometano (10 mL) foi adicionado e a mistura de reacção foi agitada a 50 °C durante 2 102 horas. A mistura de reacção foi vertida em água gelada (50 mL) e o precipitado foi colectado por filtração e lavado com água destilada (2x1 mL), seguido por 95% de etanol (2x1 mL) para produzir 6,7-dibromo-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (com 1% de impureza por RMN) como um pó branco. 0 produto bruto foi dissolvido em IN de NaOH (10 mL) e, em seguida, acidificado com pH = 2 com 4N de HC1 para dar um precipitado branco creme. O precipitado foi colectado por filtração e lavado com água destilada (2x1 mL) , seguido por 95% de etanol (2 x 1 mL) e seco ao ar, a 50 °C durante 8 horas, para dar 770 mg (rendimento de 72%) de 6,7-dibromo-l, 4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (por RMN) como um pó branco. A recristalização de DMSO/H2O) forneceu microcristais brancos. 0 Mp de 6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona foi medido: decomposto a partir de 335 °C. IR (KBr, cm-1): 3200, 1718, 1693. RMN (XH, DMSO-de) : δ 7,336 (s, 2H); 11, 962 (s, 2H) . HRMS: calculado para C8H4Br2N202 (M+) m/z: 317,8639 encontrado: 317,8619. l-Amino-6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. O processo de Wallace, R.G., Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982) foi adaptado. A uma suspensão agitada de 6, 7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (100 mg, 0,312 mmol) em água destilada (10 ml) a 60 °C foi adicionado NaOH (400 mg, 10 mMol) . Após 30 minutos, a solução resultante foi tratada gota a gota durante 10 minutos com ácido hidroxilamino-o-sulfónico (40 mg, 0,35 mmol, Aldrich) em água (0,5 mL) . A reacção foi conduzida a 60 °C. Um precipitado branco surgiu depois de 15 minutos. A mistura foi agitada a 60 °C durante 1 hora. O precipitado branco foi colectado por filtração e lavado com água destilada (2x2 mL) e etanol (2 x 1 mL) , rendendo 72 mg (68%) de l-amino-6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona como um pó branco depois de secagem a 60 °C durante 2 horas. A acidificação do filtrado com 4N de HC1 deu 35 103 mg de uma mistura constituída por 25% de l-amino-6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 75% de 6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona por RMN. A amostra de 72 mg de 6,7-dibromo-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona bruta foi dissolvida em água destilada (15 mL) a 60 °C, filtrada para remover o material insolúvel, e o filtrado foi acidificado com AcOH a pH = 5 dando um precipitado branco, que foi colectado por filtração e lavado com água destilada (2x2 mL), seguido pelo etanol (2x1 mL). O sólido foi seco em um aparelho de rotação a vapor a 60 °C durante 2 horas rendendo 43 mg de l-amino-6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pura como um pó branco; mp :335-338 °C (dez). IR (KBr, cm-1): 3337; 3212; 3062; 1706; 1668; 1575. RMN ^H, DMSO-d6) : δ 5, 784 (s, 2H), 7,391 (s, 1H), 7,841 (s, 1H); 12,158 (s, 1H). HRMS: calculado para 0βΗ5Ν203Β^ (M+) m/z: 332,8746; encontrado: 332,8741.
Exemplo 33. Preparação de 5-Nitro-6, 7-dibromo-l, 4-di-hidro~2,3-quinoxalínadiona 0 processo de Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1170 (1962) foi adaptado. A uma suspensão agitada de 6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (576 mg, 1,8 mmol) em H2SO4 (6 mL) concentrado a 0 °C durante 30 minutos, foi adicionado KN03 (220 mg, 2,18 mmol, Baker), em uma parcela. A mistura foi agitada a 0 °C durante 3 horas, em seguida, à temperatura ambiente durante um dia. A cor da mistura foi alterada de vermelho para amarelo acastanhado. Depois foi vertida em gelo (60 g) resultando na separação de um precipitado amarelo vivo, o qual foi recolhido por filtração e lavado com água destilada (2x2 mL) , seguido pelo etanol (2x1 mL) para se obter 498 mg de 5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (76%, contém menos impurezas por RMN). A cristalização de DMS0/H2O deu 5-nitro-5,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3- 104 quinoxalinadiona pura como microcristais amarelos; mp: 352-354 °C (dez). IR (KBr, cm-1): 3387; 3256; 1756; 1700; 1537. RMN (1 H, DMSO-d6); δ 7,475 (s, 1H) ; 12,217 (s, 1H) ; 12,265 (s, 1H) . HRMS: calculado para C8H3N304Br2 (M+) m/z: 362,8489; encontrado: 362,8509. TZx&mplo 34. Preparação do l-amino-5~nitro-6, 7-dicloro-l, 4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (composto de referência) O processo de Shín, S.C. e Lee, Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4 (1983) foi adaptado. Uma solução vermelha de 6,7- dicloro-5-nitro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (100 mg, 0,36 mmol, Cheeseman, supra) e 3N de KOH (2 mL) em água destilada (5 mL) a 65 °C foi adicionada gota a gota a uma solução incolor de NH2OSO3H (75 mg, 0,66 mmol, Aldrich) em água destilada (0,5 mL) , com agitação. Um precipitado amarelo surgiu após 10 minutos. A mistura foi agitada a 65 °C durante 1 hora e deixada a repousar à temperatura ambiente durante a noite, em seguida, o precipitado foi colectado por filtração, a 50 °C e foi lavado com água destilada (2 ml) e, em seguida, seco a 50 °C durante a noite, rendendo 85 mg (80%) de l-amino-5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta, como um sólido amarelo amorfo (80% de l-amino-5-nitro- 6.7- dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadionà desejada com 20% de material de partida por RMN). Uma amostra de 85 mg l-amino-5-nitro- 6.7- dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta' (base livre Na4, 0,293 mmol) foi dissolvida em água destilada (10 mL) a 50 °C, em seguida, foi acidificada com AcOH a pH = 5. Após a remoção do material insolúvel por filtração, a mistura foi aquecida a. 60-70 °C até ter sido obtida uma solução clara, que foi arrefecida lentamente, a partir do que surgiu um precipitado amarelo. 0 precipitado foi cristalizado a partir de EtOH quente e os microcristais amarelos foram colectados por filtração, lavados com 105 etanol frio (2 mL), e secos ao ar a 60 °C durante 4 horas, rendendo 31 mg (29%) de l-amino-5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura. O mp foi medido: a cor do l-amino-5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona mudou para amarelo escuro a 275 °C; a decomposição de l-amino-5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona é óbvia a 280 °C e derreteu para um liquido negro, 290-1 °C. IR (KBr, cm-1): 3442; 3315; 3231; 1747; 1723; 1680; 1632; 1547. RMN (^, DMS0-d6) : δ 5,848 (s, 2H) , 7,951 (s, 1H) ; 12,595 (s, 1H) . HRMS: calculado para C8H4N4O4CI2 (M+) m/z: 289,9623; encontrado 289,9616.
Exemplo 35. Preparação de 1 (ou 4-) -Am±no-5~n±tiro-6r 7-dibromo-l, 4-dl-hií2ro-2,3-qu±noxalinad±ona. (composto de referência) 0 processo de Shin, S.C. e Lee. Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4 (1983) foi adaptado. A uma solução vermelha agitada de 5-nitro~6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (120 mg, 0,33 mrtiol) e 3N de KOH (2 mL) em água destilada (5 mL) a 65 °C foi adicionado gota a gota uma solução incolor de NH2OSO3H (56 mg, 0,50 mmol) em água destilada (0,5 mL) , com agitação, surgindo a partir daqui um precipitado amarelo após 5 minutos. A mistura foi agitada a 65 °C durante 1 hora e deixada a repousar à temperatura ambiente durante a noite, em seguida, o precipitado foi colectado por filtração, a 50 °C, lavado com água destilada (2 mL) , depois seco ao ar a 50 °C durante a noite, rendendo 80 mg (64%) de l-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (base livre Na+ por RMN, D2O) , como um sólido amarelo amorfo (80% de 1-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona desejada com 20% de material de partida por RMN) . (Não se sabe se a reacção realmente deu o isómero de 1-amino ou 4-amino). Uma amostra de 80 mg de 1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3- 106 quinoxalinadiona bruta (0,211 mmol) foi dissolvida em água destilada (10 mL) a 50 °C, em seguida, acidificada com AcOH a pH = 5. Depois do material insolúvel ter sido removido por filtração, foi aquecida a 60-70 °C até se obter uma solução clara, depois lentamente arrefecida, e um precipitado amarelo surgiu. 0 precipitado foi cristalizado a' partir de EtOH quente, colectado por filtração, lavado com etanol frio (2 mL) e, em seguida, seco ao ar a 60 °C durante 4 horas, rendendo 57 mg (45,6%) de 1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2, 3-quinoxalinadiona pura (base livre H) . NH20S03H (40 mg, 0,35 mmol) foi adicionado ao liquido mãe, e deixado a reagir a 65-70 SC durante 30 minutos para dar uma segunda colheita de 1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro- 2.3- quinoxalinadiona pura (26 mg, 21%), utilizando o mesmo procedimento como descrito acima. A produção total é de 66%. O mp foi medido: a cor de 1 (4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro- 2.3- quinoxalinadiona mudou para amarelo escuro a 301 °C, a decomposição de 1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona é óbvia a 310 °C e é derretida para um liquido negro, 320-1 °C. IR (KBr, cm-1) : 3414; 3211; 1745; 1728; 1682; 1631; 1546. RMN (V DMSO-d6) : δ 5, 832 (s, 2H) , 8,047 (s, 1H) ; 12,565 (s, 1H) . HRMS: calculado para Ca^N^B^ (M+) m/z: 377,8613; encontrado: 377,8583.
Exemplo 36. Preparação de 6-Nitro-5f7-d±cloro-lr4-dl-hidro-2,3-qulnoxallaadlona (composto de referência) 0 método de Cheeseman, supra -foi adaptado. 5,7-Dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (239 mg, 1,03 mmol) foi dissolvido em H2S04 (3 mL) concentrado a 0 °C durante 30 minutos, e KN03 (125,3 mg, 1,24 inmol, Baker) foi adicionado a esta solução. A mistura foi agitada a 0 °C durante 3 horas, e, em seguida, foi agitada à 107 temperatura ambiente durante 30 horas. Em seguida, foi vertida em água gelada (15 g} . Um precipitado surgiu e foi recolhido por filtração, foi dissolvido em IN de KOH (10 mL) e o precipitado vermelho foi removido por filtração. A solução foi depois acidificada para pH = 2 com 4N de HC1 para dar um precipitado creme, que foi colectado por filtração e, em seguida, foi seco ao ar, a 50 °C durante 4 horas, para produzir a 6-nitro-5,7-dicloro-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (231mg, 80%), como microcristais amarelos. mp: 320-25 °C (dec. de 290 °C) . IR (KBr, cm"1): 3467, 3140, 3055, 2946, 1717, 1693, 1541. RMN (ΧΗ, DMS0-d6) : δ 7,221 (s, 1H) , 11, 932 (s, 1H) , 12,312 (s, 1H) . HRMS: calculado para C8H3N3O4CI2 (M+) m/z274,9499, encontrado: 274,9509.
Exemplo 37. Preparação de 6-Nitro-5,7-dibromo-lr 4-d±-hidro-2,3-quinaxalinadiona O método de Cheeseman, supra foi adaptado. 5,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (74 mg, 0,23 mmol) foi dissolvida em H2SO4 (1 mL) concentrado a 0 °C durante 30 minutos e, em seguida, KNO3 (28 mg, 0,27 mmol, Baker) foi adicionado a esta solução. A mistura foi agitada a 0 °C durante 3 horas, e, em seguida, à temperatura ambiente durante 30 horas. Ela foi vertida em água gelada (8 g) e o precipitado foi colectado por filtração, foi dissolvido em IN de KOH (5 mL) , e o precipitado vermelho foi removido por- filtração. A solução foi depois acidificada para pH = 2 com 4N de HC1 para se obter um precipitado creme, que foi
colectado por filtração e, em seguida, foi seco ao ar, a 50 °C durante 4 horas, rendendo 6-nitro-5,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (71 mg, 84,5%), como um pó amarelo; mp: 318-20 °C (dez). IR (KBr, cm-1): 3468, 3131, 3062, 2931, 1712, 1593, 1537. RMN ^H, DMSO-d6) : δ 7,392 (s, 1H) , 11,566 (s, 1H) , 12,274 108 (s, 1H) . HRMS: calculado para CsH3N304Br2 m/z: 362.8489, encontrado: 362,8478.
Exemplo 38. Preparação de 5-cloro-6-nltro-7-fluoro-1,4-dl-hídro-2f3-qulnoxaliaadlona (composto de referência)
O Método de Cheeseman, supra foi adaptado. 5-Cloro-7-fluoro-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (30 mg, 0,14 mmol) foi dissolvida em H2SO4 (0,5 mL) concentrado a 0 °C durante 30 minutos e KNO3 (17 mg, 0,17 mmole, Baker), foi adicionado em uma porção a esta solução. A mistura foi agitada a 0 °C durante 3 horas, em seguida, à temperatura ambiente durante 30 horas. Ela foi vertida em água gelada (5 g) e o precipitado foi colectado por filtração. O precipitado foi dissolvido em IN de NaOH (5 mL) , em seguida, foi acidificado a pH = 2 com 4N de HC1 para dar um precipitado creme, que foi colectado por filtração e, em seguida, foi seco ao ar, a 50 °C durante 4 horas, rendendo o composto de titulo puro (por RMN) 5-cloro-6-nitro-7-fluoro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (31 mg, 85,4%), como um sólido branco amorfo. mp: decomposto a partir de 280 °C. IR (KBr, cm-1) : 3600, 3462, 3131, 1712, 1612, 1550 . RMN ^H, DMSO-de) : δ 7,106 {d, J = 10,2 Hz, 1H) , 11,800 (s, 1H) , 12,371 (s. 1H) . HRMS: calculado para G8H3N304CIF (M+) m/z: 258,9795, encontrado: 258,9790.
Exemplo 39. Preparação de 5-bromn-6-nitro- 7-fluoro-1, 4-dl-hldro-2,3-qirinoxalinadiona O método de Cheeseman, supra foi adaptado. 5-bromo-7-fluoro-1, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (77 mg, 0,30 mmol) foi dissolvida em H2SO4 (1 mL) concentrado a 0 °C durante 30 minutos, e KN03 (35 mg, 0,346 mMol, Baker) foi adicionado a esta solução. A mistura foi 109
agitada a 0 °C durante 3 horas, e, em seguida, à temperatura ambiente durante 30 horas. A mistura foi vertida em água gelada (10 g) e o precipitado foi colectado por filtração. 0 precipitado foi dissolvido em IN de NaOH (10 mL) , em seguida, foi acidificado a pH = 2 com 4N de HC1 para dar um precipitado creme, o qual foi recolhido por filtração, e foi seco ao ar, a 50 °C durante 4 horas rendendo (por NMR) 5-bromo-6-nitro-7-fluoro-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (81 mg, 90%), como um sólido branco amorfo; mp: 320-25 °C (dec. 290 °C) . IR (KBr, cm'1): 3416, 3071, 2952, 1721, 1609, 1546. RMN (% DMSO-d6) : δ 7,146 (d, J = 10,2 Hz, 1H) , 11,432 (s, 1H) , 12,340 (s, 1H) . HRMS: calculado para C8H3N304BrF (M+) m/z: 302,9290, encontrado: 302,9290.
Exemplo 40. Preparação de 5-bromo-6(8)-nltro-7-trifluorometil-l,4-di-hldro-2r3-quinoxallnadiona O processo de Cheeseman, supra foi adaptado. 5-bromo-7-trifluoro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (75 mg, 0,24 mmole) foi dissolvida em H2SO4 (1 mL) concentrado a 0 °C, com agitação, ao qual foi adicionado KNO3 (30 mg, 0,28 itimol, Baker) a 0 °C com agitação. A mistura foi agitada a 0 °C durante 2 horas, em seguida, à temperatura ambiente durante 1 dia. A cor da mistura foi alterada para amarelo acastanhado. Depois foi vertida em água gelada (10 g) para separar o precipitado amarelo claro. O precipitado foi colectado por filtração e lavado com água destilada (1 mL), seguido pelo etanol (2x1 mL) para dar 5-bromo-6 (8) -nitro-7-trifluorometil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (78 mg, 92%) , que contém algumns isómeros por RMN. A cristalização de DMS0/H20 deu um produto puro como um microcristal branco. mp: 290-2 °C. IR (KBr, cm'1) : 3435; 3143; 1713; 1613; 1555. RMN (ΧΗ, DMSO-dg): δ. 7,519 (s, 1H) para 6-nitro; 7,960 (s, 1H) para 8-nitro (6:8 110 = 70:30); 11,811 (s, 1H) ; 12,391 (s, 1H) . HRMS: calculado para C9H3N30aF3Br (M+) m/z: 352,9258; encontrado: 352,9270
Exemplo 41. Preparação de 1 (4)-Am±no-5,7-díbromo-l,4-d±-h±dro-2,3-qalnoxalinadiona (composto de referência) 0 processo de Shin, S.C. e Lee. Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4 (1983) foi adaptado. 5,7-dibromo-l,4-di-hidro- quinoxalina-2,3-diona (46 mg, 0,144 mmole) foi dissolvido em 3N de KOH (2 ml) a 60 °C durante 1 hora, e NH2OSO3H (20 mg, 0,172 mmole, Aldrich) em água destilada (0,5 mL) foi adicionado gota a gota na solução acima com agitação a 60 °C. Algum precipitado surgiu depois de 15 minutos, em seguida, uma segunda porção de 20 mg de NH20S03H foi adicionada. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 precipitado branco foi colectado por filtração, lavado com água destilada fria (0,5 mL) , rendendo a l-amino-5,7-dibromo-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (38 mg, 79%), depois de secagem ao ar a 60 °C durante 2 horas (contém a 4-amino-5,7-dibromo-2,3-quinoxalinadiona isomérica, por RMN, mas não se sabe'o que é produzido em maior quantidade). Uma amostra de 38 mg de l-amino-5,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta foi dissolvida em água destilada (4 mL) a 60 °C, o material insolúvel foi removido por filtração, e o filtrado foi acidificado com AcOH para pH = 5 para dar um precipitado branco, que foi colectado por filtração e lavado com água destilada fria (2x1 mL). O precipitado foi seco a 60 °C durante 2 horas rendendo l-amino-5,7-dibromo-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (28 mg, 58,5%) como um pó branco com algum isómero. Mp: 273-5 °C (dec. a partir de 270 °C) . IR (KBr, cm-1): 3435; 3289; 3190; 1719; 1672; 1625; 1584. RMN (% DMSO-d6) : õ 5,831 ( (s, 2H) ; 7,672 (d, J = 15Hz, 1H) ; 7,810 (d, J = 111 15Hz, 1Η); 11,275 (s, 1Η). HRMS: Calculado para C8H5N203Br2 (M+) m/z: 332,8746; Encontrado: 332,8744.
Exemplo 42. Preparação de 1(4)-Amlno-5, 7-dicloro-l,4-dl-h±dro-2,3-çpiinoxalinadiona (composto de referência) 0 processo de Wallace, R.G., Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982) foi adaptado. 5,7-Dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (52 mg, 0,225 mmole) foi dissolvido em 3N de KOH (1 mL) a 60 °C durante 0,5 hora, e NH20S03H (30 mg, 0,2 65 mniole, Aldrich) em água destilada (0,5 mL) foi adicionado gota a gota na solução acima com agitação 60 °C. Algum precipitado surgiu após 15 minutos. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O precipitado branco foi colectado por filtração, lavado com água destilada fria (0,5 mL) e seco em um aparelho de rotação por vapor a 60 °C durante 2 horas rendendo l-amino-5,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3—quinoxalina-diona bruta (38 mg, 69%), que incluía um pouco do isómero (4-amino-5,7-dicloro-2,3-quinoxalinadiona) por 1H RMN (não se sabe qual o isómero que está presente em maior quantidade).
Uma amostra de 38 mg de 1(4)-amino-5,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta foi dissolvida em água destilada (4 mL) a 60 °C, o material insolúvel foi removido por filtração, o filtrado foi acidificado com AcOH para pH = 5 para dar um precipitado branco, que foi colectado por filtração e lavado com água destilada fria (2 x 1 mL). O precipitado foi seco em um aparelho de rotação por vapor a 60 °C durante 2 horas, rendendo 1(4)-amino-5,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (29 mg, 53,5%) como um pó branco, mp: 294-6 °C (com dec.) IR (KBr, cm-1): 3450; 3325; 3200; 3075; 1693; 1625; 1593; 1500; 1368. NMR (ΧΝ, DMSO-d6) : δ 5, 838 (s, 2H) ; 7,454 (d, J = 2,1 Hz, 1H) ; 7, 639 (d, J= 2,1 Hz, 1H) ; 11,691 ( (s, 1H) . 112 BRMS: calculado para C8N5CI2N3O2 (M+) m/z: 244, 9757; encontrado: 244,9769.
Exemplo 43. Preparação do 1 -amino - 5 -bromo - 7 - fluoro-1,4- dl -hi dro -2f3-qulnoxal±nadj-ona (composto de referência) 0 procedimento de Shin, S.C. e Lee, Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4 (1983) foi adaptado. 5-bromo-7-fluoro-l,4-di-hidro- quinoxalina-2,3-diona (85 mg, 0,33 mmole) foi dissolvido em 3N de KOH (1,5 mL) a 60 °C durante 0,5 hora para dar uma solução castanha claro, e NH2OSO3H (45 mg, 0,396 mmole, Aldrich) em água destilada (0,5 mL) foi adicionado gota a gota à solução acima com agitação a 60 °C. Algum precipitado surgiu depois de 15 minutos. A mistura foi agitada, em seguida, à temperatura ambiente durante a noite. O precipitado castanho foi colectado por filtração, lavado com água destilada fria (0,5 mL) e seco em um aparelho de rotação por vapor a 60 °C durante 2 horas, dando l-amino-5-bromo-7-fluoro-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta (59 mg, 65,5%, 5% do isómero de 4-amino-5-bromo-7-fluoro-2,3-quinoxalinadiona por RMN).
Uma amostra de 59 mg de l-amino-5-bromo-7-fluoro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona bruta foi dissolvida em água destilada (5 mL) a 60 °C, o material insolúvel foi removido por filtração, e o filtrado foi acidificado com AcOH para pH = 5 para dar um precipitado castanho, que foi colectado por filtração e lavado com água destilada fria (2x1 mL). 0 precipitado foi seco em um aparelho de rotação por vapor a 60 °C durante 2 horas, rendendo l-amino-5-bromo-7-fluoro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona pura (49 mg, 54,5%) como um pó castanho; mp: 293-5 °C (com dec.) IR (KBr, cm-1): 3443; 3318; 3206; 3081; 1731; 1668; 1612; 1600; 1506; 1343. RMN (% DMSO-de) : δ 5,832 (s, 2H) ; 7,439-7,519 (m, 2H) ; 11,207 (s, 113 1Η) . HRMS: calculado para C8H5BrFN3C>2 (M+) m/z: 272,9548; encontrado: 272,9569.
Exemplo 44. Preparação de 5, 6-Di cl oro -2 -mercap tobenz±m±da.zole (composto de referência) 0 processo de Van Allan, J.A.V. e Deacon, B.D., Organic Synthesis. IV: 569 foi adaptado. Uma mistura de 1,2-diamino-4,5-diclorobenzeno (510 mg, 2,88 mmol, Aldrich) , hidróxido de potássio (190 mg, 3,40 mmol) , dissulfureto de carbono (260 mg, 3,40 mmol), 95% de etanol (3 mi) e água (0,45 mL) foi aquecida sob refluxo durante 3 horas. 0 carvão activado (120 mg) foi depois adicionado cautelosamente, e depois da mistura ter sido aquecida à temperatura de refluxo durante 10 minutos o carvão activado foi removido por filtração. 0 filtrado foi aquecido a 60-70 °C, água morna (3 mL) foi adicionada e, em seguida, ácido acético (0,25 mL) em água (0,5 mL) foi adicionado com boa agitação durante a noite. A mistura foi colocada no frigorifico durante 3 horas para se obterem dois cristais (castanho e branco). Os cristais castanhos foram removidos por lavagem com clorofórmio (5 mL) . A recristalização de EtOH/H20 quente deu 5,6-dicloro-2-mercaptobenzimidazole puro (545 mg, 86%) como agulhas brancas longas. 0 mp foi medido: a cor do 5,6-dicloro-2-mercaptobenzimidazole mudou para amarelo a 303 °C, a decomposição de 5,6-dicloro-2-mercaptobenzimidazole é óbvia a 305 °C e derreteu para um liquido negro, 308-10 °C. IR (KBr, cm-1) : 3447; 3107; 3043; 1607; 1496; 1461. RMN (% DMSO-dg) : δ 7,305 (s, 2H) ; 12,781 (s, 2H) . HRMS: calculado para C7H4CI2N2S (M+) m/z: 217,9425, Encontrado: 217,9482.
Nos seguintes exemplos 45-55, os pontos de derretimento são determinados em tubos capilares abertos em aparelhos de Thomas 114
Hoover e Mel-Temp e são não corrigidos. Os espectros de IR e 1H RMN de todos os compostos foram consistentes com a estrutura afectada e corresponderam com os dados relatados anteriormente se disponíveis. Os espectros de 1H RMN foram gravados em um aparelho de 300 MHz General Electric QE-300; os números químicos são relatados em unidades delta referenciadas para o sinal de protão residual do solvente deuterado (CH3SOCH2D, d 2,49). Os espectros infravermelhos foram registados em um espectrómetro 5DXB Nicolet FT-IR. As absorções gravadas em números de onda (cm-1) . Os espectros de massa foram registados em um espectrómetro de massa VG ZAB-2-HF com um sistema VG-11-250 DATA, na modalidade de ionização de electrão (70 eV) , a menos que indicado de outra maneira. Todos os solventes foram de grau reagente. Os reagentes foram utilizados como recebidos, a menos que indicado de outra maneira.
Exemplo 45. Preparação de l-carbox±metll-l,4-dí-h±dro-2,3-quinoxalinadlona (composto de referência) 1-carboximetil-l,2,3,4-tetra-hidroquinoxalina-3-ona. 0 procedimento de Borthakur, N. et ai., Ind. J. Chem. 20B:822 (1981) foi adaptado. A solução agitada de ácido cloroacético (19,000 g, 0,200 mol) em água (100 mL) foi neutralizada com carbonato de sódio (10,600 g, 0,100 mol) e o-fenilenodiamina (10,800 g, 0,100 mol, Aldrich) foi a ela adicionado. A solução clara foi refluxada durante 4 horas, arrefecida e tornada alcalina (pH ~ 10) com 0,3 M de solução de carbonato de sódio aquosa (150 mL) . Uma pequena quantidade de sólido residual foi removido por filtração. O filtrado límpido foi acidificado (pH ~ 2) com HC1 concentrado. O sólido colorido de cinza, precipitado. Ele foi filtrado e seco sob vácuo (aspirador a água), obtendo-se 17,2 g (83%, puro, por 1HNMR) do produto como um pó cinzento claro, mp 227-230 °C (lit m.p. 228-230 °C, Cheeseman, 115 supra). Foi suficientemente puro para ser utilizado na próxima reacção. 1-carboximetil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. 0 procedimento de Borthakur, N. et al. , Ind. J. Chem. 20B:822 (1981) foi adaptado. A uma solução agitada de 1-carboximetil-l,2,3,4-tetra-hidro-quinoxalina-3-ona (15,400 g, 0,075 mol) e hidróxido de sódio (5,20 g, 0,13 mol) em água (250 mL) , foi introduzido de forma gradual, uma solução de KMn04 (20,800 g 0,132 mol) em NaOH aquoso (4% p/v, 120 mL) e a solução colorida de roxo escuro foi refluída durante 4 horas, arrefecida e filtrada. 0 filtrado límpido foi acidificado (pH ~ 2) com HC1 concentrado. A filtração sob vácuo (aspirador a água) rendeu 9,200 g (56%, puro, por RMN) de 1-carboximetil-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona como um pó colorido creme, mp > 300 °C (decompõe) (lit. Mp > 300 °C, Borthakur et al., supra). Foi sufícientemente puro para ser utilizado na próxima reacção; 1H RMN: δ 4,84 (s, 2H) , 7,13-7,27 (m, 4H) , 12,16 (s, 1H) , IV (KBr, cm"1): 3431, 1743, 1687, 1481, 1406, 1393, 1250.
Exemplo 46. Preparação de l-carboximetil-6,7-dibromo-l,4-dl-hidro-2f3~qud.noxalinadj.oxia (composto de referência) 0 processo de Jorgensen et al., supra foi adaptado. 1-carboximetil-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (1,500 g, 0,068 mol) e Ag2S04 (2,232 g, 0,071 mol) foram suspensos em H2S04 concentrado (7,5 mL). Bromo (0,75 mL, 0,014 mol, Aldrích) foi adicionado a ele a 28 °C e a suspensão foi agitada a 28 °C durante 24 horas. Tetracloreto de carbono (7,5 mL) foi depois adicionado à suspensão e aquecido a 50 °C durante 2 horas. Foi depois vertida em água de gelo (75 g) . O sólido branco precipitado foi filtrado e lavado com água (10 mL) e seco sob vácuo (aspirador a água) . Foi depois tratado com 4M de 116
NaOH aquoso (60 mL) . 0 resíduo foi filtrado fora e o filtrado límpido foi acidificado (pH ~ 3) com HC1 concentrado. O sólido branco precipitado foi filtrado e seco para um rendimento de 1,81 g (70%, puro, por RMN 1H) de ácido l-carboximetil-67-dibromo-l, 4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona como um pó branco, mp > 300 °C (decompõe) (mp lit> 300 °C, Jorgesen et al., supra); 1H RMN: δ 4,85 (s, 2H) , 7,44 (s, 1H) , 7,73 (s, 1H) , 12,28 (s, 1H) , IV (KBr, cm-1): 3437, 1687, 1481, 1406, 1393, 1250.
Exexqplo 47. Preparação de l-carboxlmatil-6, 7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (composto de referência) 6.7- Dicloroquinoxalina-2(1H)-ona, 0 processo de Kazimierczuk, Z. et al., Liebigs Ann. Chem 75 (1982) foi adaptado. Uma solução de 4,5-dicloro-l,2-fenilenodiamina (500 .mg, 2,82 mmol, Pfaltz e Bauer), ácido glioxálico hidratado (389 mg, 4,23 mmol, Aldrich) em etanol (8 mL) foi refluxado durante 12 horas. Depois de arrefecimento a 28 °C, .um sólido com uma coloração roxa precipitou, que foi filtrado sob vácuo (aspirador a água), lavado com etanol frio (20 mL) e seco sob vácuo para se obter 575 mg (94%, puro, por 1H RMN) de 6, 7-dicloroquinoxalina-2(1H)-ona como um pó colorido de roxo claro, mp 325-328 °C (lit. Mp > 300 °C; Kazimierczuk, et al., supra). Foi suficientemente puro para ser utilizado na próxima reacção. 1H RMN: δ 7,40 (s, 1H) , 8,02 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 12,52 (s, 1H) . IR (KBr, cm"1): 1668, 1606, 1468, 1387. 6.7- Dicloro-l-etoxicarbonilmetilquinoxalina-2(1H) -ona.O processo de Jorgensen et al., supra foi adaptado. Sob uma atmosfera de azoto, sódio (60 mg, 2,60 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (20 mL) e 6,7-dicloroquinoxalina-2(1H)-ona (520 mg, 2,420 mmol) foi adicionado a ele. A solução colorida de roxo escuro foi refluxada 117 durante 30 minutos, arrefecida a 28 °C e bromoacetato de etilo (485 mg, 2,900 mmol, Aldrich) foi adicionado a ele e refluxado adicionalmente durante 2 horas. Durante este tempo, um sólido colorido de roxo, separado, o qual foi filtrado, lavado com etanol absoluto (10 mL) e seco ao ar durante a noite para redner 636 mg (91%, puro, por RMN) de 6,7-dicloro-l-etoxicarbonilmetil- quinoxalina-2(1H)-ona como um pó colorido roxo claro, mp 207-210 °C (mp lit. não relatado). Foi suficientemente puro para ser utilizado na próxima reacção. 1H RMN: δ 1,18 (t, 3H, J = 6, 9 Hz), 4,14 (q, 2H, J = 6,9 Hz), 5,04 (s, 2H) , 8,01 (s , 1H) , 8,13 (s, 1H) , 8,33 (s, 1H) . IR (KBr, cm-1) : .1737, 1662, 1400, 1231.
l-carboximetil-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. O processo de Jorgensen et al., supra foi adaptado. 6,7-Dicloro-l-etoxicarbonilmetilquinoxalina-2(1H)-ona (528 mg, 1,840 mmol) foi suspenso em 0,63 M de solução de NaOH aquosa (25 mL) e 30% de H202 (0,700 mL) foi adicionado a ele. A suspensão foi agitada a 70-80 °C durante 5 horas, e durante este tempo, formou-se uma solução colorida de vermelho escuro. Foi, depois, a arrefecida em um banho de gelo e acidificada (pH ~ 2) com HCl concentrado. O sólido precipitado foi filtrado para produzir 484 mg de pó colorido de violeta claro. A cristalização de DMF-água forneceu 457 mg (85%, puro, por 1H RMN) de ácido l-carboximetil-6,7-dicloroquinoxalina-2,3(1H,4H)-diona como um pó colorido cinzento; mp 317-320 °C (lit mp 317-319 °C, Jorgesen et al.r supra!/ 1H RMN: δ 4,85 (s, 2H) , 7,31 (s, 1H), 7,67 (s, 1H) , 12,28 (s, 1H) ; IR (KBr, cm-1): 3428, 3129, 1694, 1489, 1396.
Exemplo 48. Preparação de 6,7-D±cloro-8-n±troqu±noxal±na-2 (1B) -ona (composto de referência) 118 A uma suspensão agitada de 6,7-dicloroquinoxalina-2(1H)-ona (100 mg, 0,465 mmol) em H2S04 (1,5 mL) concentrado, (1,0 mL) de água foi adicionado para formar uma solução. Foi depois arrefecida a 5-10 °C e KNO3 (50 mg, 0,46 mmol) foi acrescentado em uma porção. A adição de KNO3 resulta em uma solução de coloração verde escuro que foi agitada a 5-10 °C durante 3 horas, e, em seguida, a 28 °C durante 60 horas. A suspensão amarela assim obtida foi vertida em água de gelo (15 g) e o sólido amarelo resultante foi filtrado e seco ao ar. durante a noite para se obter 7 8 mg de produto bruto como um pó amarelo. A cristalização de DMF - água forneceu 45 mg (37%, puro, por 1H RMN) de 6,7-dicloro-8-nitroquinoxalina-2(1H)-ona como um pó amarelo; mp 330-332 °C (decompõe); 1H RMN: δ 7,59 (s, 1H), 8,28 (s, 1H) , IV (KBr, cm”1): 1695, 1654, 1555, 1367; HRMS calculado para C8H2CI2N3O3 (M+) m/z 258,9551, encontrado m/z 258,9550.
Exemplo 49. Preparação de l-carboximetil-6, 7-di.hromo-5-nitro-l, 4-di-hldro-2/3-qalnoxalinadiona (composto de referência) A uma solução agitada de l-carboximetil-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (100 mg, 0,264 mmol) em H2 S04 (1,5 mL) concentrado a 5-10 °C , KN03 (28 mg, 0,28 mmol) foi acrescentado em uma porção. A solução resultante verde escura foi agitada a 5-10 °C durante 30 minutos e a 28 °C durante a noite. A suspensão colorido de amarelo assim obtida foi vertida em água de gelo (15 g) e o sólido amarelo brilhante resultante foi filtrado e seco sob vácuo para se obter 53 mg' (47%, puro, por 1H RMN) de l-carboximetil-6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona como um pó amarelo brilhante; Mp 260-264 °C. 1H RMN: δ 4,91 (s, 1H), 7,98 (s, 1H) . IR (KBr, cm”1): 1701, 1543, 1391, 1244. HRMS calculado para C10H5Br3N2O6 (M+) m/z 420,8546, encontrado m/z 420,8559. 119
Exemplo 50. Preparação de 6r 7-Dicloro-N-hidrox±-l, 4-d±-h±dro-2,3-qainoxallnadiona (composto de referência)
Todas as reacções foram executadas sob uma atmosfera de azoto. Os reagentes foram utilizados como recebidos, a menos que indicado de outra maneira. Os pontos de derretimento foram tomados em um aparelho de pontos de fusão Mel-Temp e são não corrigidos. As amostras foram colocadas no bloco quando a temperatura foi > 250 °C, de modo a minimizar a decomposição antes da fusão. Tetra-hidrofurano (THF) foi destilado a partir de solução de cetilo de benzofenona de sódio azul. O DMF foi seco em peneiras moleculares. Os espectros 1H RMN foram gravados em um aparelho de 300 MHz General Electric QE-300; os números químicos são relatados em unidades delta referenciados aos sinais de protões residuais dos solventes deuterados (CDC13í δ 7,26; CH3SOCH2D, δ 2,49). Os espectros de infravermelhos foram obtidos em um espectrómetro 5DXB Nicolet FT-IR.
Etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro~fenil)oxamato. Etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenil)oxamato foi preparado usando uma adaptação do método de Loev, et al., J. Med. Chem. 28:363 (1985). A uma solução agitada de 4,5-dicloro-2-nitroanilina (2,07 g, 0,01 mol) seca em THF (15 mL) e trietilamina (1,5 mL, 0,011 mol) a 0 °C foi adicionado gota a gota cloreto de oxalilo de etilo (4,6 g, 0,015 mol). A suspensão amarela resultante foi deixada a aquecer a 25 °C no banho e, em seguida agitada durante 3 horas. A suspensão castanha resultante foi vertida em 75 mL de água gelada. Um precipitado castanho formou-se. A mistura foi filtrada sob vácuo, e o sólido foi seco ao ar durante 1 hora para render 3,27 g de um sólido castanho escuro, que foi dissolvido em etanol (38 mL), com aquecimento a 70 °C. Água (6 mL) foi adicionada até a precipitação ter aparecido. A mistura foi 120 aquecida novamente até que o precipitado se redissolveu. A solução castanha foi deixada a arrefecer lentamente, dando cristais como agulhas amarelss. A mistura foi filtrada sob vácuo e os cristais foram secos ao ar durante 2 horas para produzir 1,7322 g (5,64 mmol) de etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenil)oxamato como agulhas amarelas pálidas (56,4%): mp 95-97 °C. 1H RMN (300 MHz, CDC13) δ 11,897 (BRS, 1H, NH), 9,067 (s, 1H, H-3), 8,412 (s, 1H, H-6), 4,463 (q, 2H CH2), 1, 435 (t, 3H, CH3) - 6,7-Dicloro-N-hidroxi-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Este composto foi preparado usando uma adaptação do método de Loev, et al., supra. Uma mistura de etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenil) oxamato (0,307 g, 1 mmol) e 0,04 g de 5% de Pd-C em 5 mL de DMF foi hidrogenada a 45 psi durante 1,5 hora. A mistura de reacçao foi filtrada e o liquido foi adicionado à água (18 mL) . Um precipitado branco formou-se. A mistura foi filtrada sob vácuo. O sólido foi lavado com água (5 x 2 mL) , e seco ao ar durante 1 hora para produzir 215,14 mg (0,87 mmol) de 6,7-dicloro-N-hidroxi-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona como um sólido amarelo pálido (87%). O sólido amarelo (215 mg, 0,87 mmol) foi dissolvido em 4 mL de DMSO com aquecimento. Água (0,8 mL) foi adicionada até a precipitação ter aparecido. A mistura foi aquecida novamente para redissolver o precipitado. A solução amarela foi arrefecida. Cristais amarelos pálidos surgiram, os quais, foram colectados por filtração sob vácuo e lavados com água (5x 2 mL) e secos em vácuo para produzir 173 mg . (0,70 mmol) de 6,7-dicloro-N-hidroxi-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona como cristais amarelos pálidos. Mp > 300 °C (dez). RMN (300 MHz, DMS0-d6) δ 12,244 (br s, 1H, NH) , 11,953
(br s, 1H, N-OH), 7,562 (s, 1H, H-8), 7,318 (s, 1H, H-5) . HRMS calculado para C8H4CI2N2O3, 245, 9599; encontrados, 245,9600. 121
Exemplo 51. Preparação de N- (N' -Fenil carboxami dil) me til -1,4-di-hídroqainoxalina-2, 3-diona (composto de referência) A uma solução agitada de 1-carboximetil-l,4-di-hidroquinoxalina-
2.3- diona (100 mg, 0,450 mmol) e anilina (62 mg, 0,66 mmol) em DMF seco (2 mL) sob N2 a 28 °C, DCC (95 mg, 0,46 mmol, Aldrich) , foi acrescentado em uma porção. A solução foi agitada durante 4 horas a 28 °C. Os sólidos insolúveis foram filtrados e lavados com DMF (1 mL) . 0 filtrado límpido foi vertido em água (30 mL) . Os sólidos assim obtidos foram filtrados e secos sob vácuo (aspirador a água) para um rendimento de 133 mg de produto bruto como um pó cinzento. Ele foi purificado por extracção Soxhlet por etanol em ebulição (20 mL) , mantendo-se o banho de óleo a uma temperatura a 120 °C, durante.4 horas. 0 material insolúvel (no dedal) foi seco sob vácuo para se obter 55 mg de (1H RMN) N-(N'-fenilcarbox-amidil) metil- 1.4- di-hidroquinoxalina-2,3-diona pura como um sólido branco (algum, do produto também acaba sendo extraído através de etanol quente que conta para o baixo rendimento do produto puro). Mp > 300 °C (decompõe). RMN: δ 4,92 (s, 2H) , 7,01 - 7,30 (m, 7H) , 7,51 (d, 2H, J = 6,9 Hz), 10,26 (s, 1H) , 12,13 (s, 1H) . IR (KBr, cm”1): 3148, 1715,, 1671, 1600, 1557. HRMS: calculado para C15H13N3O3, 295,0951; observável, 296,1033.
Exemplo 52. Preparação de N-(Nr-(p-ni trofenil)carboxamidil)metil- 1.4- di-hidroquinoxallna-2,3-diona (composto de referência) A uma solução agitada de N-carboximetil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (250 mg, 1,140 mmol) e p-nitroanilina (156 mg, 1,140 mmol) em DMF (3 mL) , sob N2 a 0 °C, DCC (233 mg/ 1,140 mmol) foi acrescentado em uma porção. A solução foi deixada a aquecer a 28 °C e agitada a essa temperatura durante a noite. O sólido precipitado 122 foi filtrado e o filtrado límpido foi vertido na água (30 mL) . Os sólidos assim obtidos foram filtrados e secos sob vácuo (aspirador a água), obtendo-se 100 mg de produto bruto como um pó amarelo. 0 produto bruto foi purificado por extracção Soxhlet em etanol em ebulição (20 mL) , mantendo-se a temperatura do banho de óleo a 120 °C, durante 4 horas. 0 material insolúvel (no dedal) foi seco sob vácuo para se obter 23 mg de (¾ RMN) N-(N"- (p-nítrofenil) carboxamidil)metil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pura como um pó amarelo brilhante (algum do produto também acaba sendo extraído através de etanol quente que conta para o baixo rendimento do produto puro). Mp > 300 °C (decompõe). 1H RMN: δ 5,02 (s, 1H), 7,13 - 7,3 (m, 4H) , 7,78 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,21 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 10,92 (s, 1H) , 12,16 (s, 1H) . IR (KBr, cm'1): 3453, 1701, 1684, 1625, 1572, 1509. HRMS: Calculado para C16H12N4O5, 340, 0808; observável, 340,0811.
Exemplo 53. Preparação de N- (N' - (p-aminaf&nil) narhoxamiriH 7 ) TTH>f--i 7 -lr4-di-hidroqn±noxalina-2f3-diona (composto de referência) A uma solução agitada de ácido N-carboximetil-1,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (200 mg, 0,910 mmol) e p-fenilenodiamina (98 mg, 0,91 rrmol) em DMF (2 mL) sob N2 a 0 °C, DCC (190 mg, 0,910 mmol) foi acrescentado em uma porção. A solução foi deixada a aquecer a 28 °C e agitada a essa temperatura durante a noite. 0 sólido precipitado foi filtrado e o filtrado límpido foi vertido em água (10 mL). Os sólidos assim obtidos foram filtrados e secos sob vácuo (aspirador a água), obtendo-se 180 mg de produto bruto como um pó castanho. O produto foi purificado por extracção Soxhlet em etanol em ebulição (20 mL), mantendo-se a temperatura do banho de óleo a 120 °C, durante 4 horas. O material insolúvel (no dedal) foi seco sob vácuo para se obter 135 mg puro (1H RMN) de N-(N'-(p- 123 aminofen.il) carboxamidil) metil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona como um pó branco. Mp > 300 °C (decompõe). 1H RMN: δ 4,84 (s, 2H) , 4,93 (s, 2H) , 6,5 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,15 - 7,25 (m, 6H) , 9,83 (s, 1H) , 12,15 (s, 1H) . IR (KBr, cm"1): 3462, 3143, 1793, 1693, 1593, 1443. HRMS: Calculado para Ci6Hi4N403, 310,1066; observável, 310,1071.
Exemplo 54. Preparação de N- (Nr-Fen±lcarboxaia±dil)inet±l-6,7- dlbromo-l,4-di-hidroqaínoxalina-2r3-diona (composto de referência) A uma solução agitada de N-carboximetil-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (100 mg, 0,250 mmol) e anilina (25 mg, 0,25 mmol) em DMF seco (1,5 mL), sob N2 a 28 °C, DCC (55 mg, 0,25 mmol) foi acrescentado em uma porção. A solução foi agitada a 28 °C durante 18 horas. 0 sólido insolúvel branco foi filtrado e o filtrado límpido foi vertido em água (6 mL). 0 sólido precipitado foi filtrado e seco ao ar para se obter 113 mg de produto bruto como um pó cinzento. O produto bruto foi depois purificado por extração Soxhlet em etanol em ebulição (20 mL) , mantendo-se a temperatura do banho de óleo a 120 °C, durante 5 horas. O resíduo (no dedal) foi seco na estufa (aproximadamente 70-80 °C) durante a noite para fornecer 35 mg de (¾ RMN) N-(N'-fenilcarboxamidil) metil-6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pura como um pó cinzento claro; mp > 300 °C (decompõe). ‘•H RMN: δ 4,97 (s, 1H) , 6,99 - 7,11 (m, 1H) , 7,23 — 7,37 (m, 2H) , 7,44 (s, 1H) , 7,52 (d,
2H, J = 8,4 Hz), 7,73 (s, 1H) , 10,25 (s, 1H) , 12,25 (s, 1H) . IR (KBr, cm'1): 3620, 3468, 1714, 1694, 1595, 1542. HRMS: Calculado para Ci6HnBr3N203, 450,9168; observável, 450, 9177. 124
Exeaqplo 55. Preparação de N- (Ν' - (m-nitrofenll) carboxamidll)metil-6, 7-dibromo~l, 4-dd.-hidroçnaxnoxal±na-2 r 3-diona (composto de referência) A uma solução agitada de N-carboximetil-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (100 mg, 0,260 mmol) e m-nitroanilina (40 mg, 0,29 mmol) em DMF seco (2 ml) sob N2 a 28 °C, DCC (60 mg, 0,29
mmol) foi acrescentado em uma porção. A solução foi agitada durante 4 horas a 28 °C. O sólido insolúvel foi filtrado e lavado com DMF (1 mL) . O filtrado límpido, em seguida, foi vertido em água (30 mL). O sólido precipitado foi filtrado e seco sob vácuo (aspirador a água) , para se obter 65 mg de produto bruto como um pó amarelo. 0 produto foi purificado por extracção Soxhlet em etanol em ebulição (20 mL), mantendo-se a temperatura do banho de óleo a 120 °C, durante 4 horas. O material insolúvel (no dedal) foi seco sob vácuo para a obtenção de 30 mg de (¾ RMN) N-(N' - (m-nitrofenil) carboxamidil)-metil-6,7-dibromo-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pura como um sólido branco (algum do produto também acaba sendo extraído através de etanol quente que conta para o baixo rendimento do produto puro). Mp > 300 °C (decompõe), ’ή RMN: δ 4,98 (s, 1H) , 7,45 (s, 1H), 7,61 (d de d visto como em, J = 8,1 Hz) 7,79 (s, 1H), 7,86 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,91 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,54 (s, 1H) , 10,76 (s, 1H), 12,28 (s, 1H) . IR (KBr, cm’1): 3444, 3289, 1707, 1686, 1672, 1602. HRMS: Calculado para C16H10Br4N2O5, 495,9018; observável, 495,9008.
Geral
Na síntese seguinte, foram utilizados reagentes como recebidos, a menos que indicado de outra maneira. Os pontos de derretimento foram tomados em um aparelho de ponto de fusão Mel-Temp e são não 125 corrigidos. As amostras foram colocadas no bloco quando a temperatura foi > 250 °C, de modo a minimizar a decomposição antes da fusão. A cromatografia de coluna foi realizada na forma de flash em gel de sílica Davisil (200-425 de malha) , a menos que indicado de outra maneira. A cromatografia de camada fina analítica foi efectuada em placas 60 F254 de gel de sílica cobertas de alumínio e a visualização foi efectuada com uma lâmpada de luz ultravioleta. Os espectros de 1H RMN foram gravados em um aparelho de 300 MHz General Electric QE-300; os números químicos são relatados em unidades delta referenciadas aos sinais de protão residual dos solventes deuterados (CHCH3, d 7,26; CHD2OD, d 3,30; CD3SOCD2H, d 2,49; CD3COCD2H, d 2,04). Os espectros de 13C RMN foram executados a 75 MHz. Os espectros de infravermelhos foram obtidos em um espectrómetro 5DXB Nicolet FT-IR. As absorções gravadas em números de onda (cm-1) e a intensidade das absorções são indicadas pelas letras s (forte) , m (médio) e w (fraco) . Os espectros de massa foram registados em um espectrómetro de massa VG ZAB-2-HF com um sistema de dados VG-11-250, na modalidade de ionização de eletrão (70 eV) , a menos queindicado de outra maneira. As microanálises foram realizadas pela firma Desert Analytics de Tucson, Arizona.
Exemplo 56. Preparação de 5~Amino~6,7-d±bromo-l,4-d±-hldro-2,3-qainoxalinadiona A uma mistura agitada de 5-nítro-6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (327 mg, 0,89 mmol) em etanol (10 mL) foi adicionado SnCl2.2H20 (1,0 g, 4,45 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) com agitação durante 4 horas. A mistura foi depois arrefecida à temperatura ambiente e o precipitado amarelo foi colectado por filtração, seguido de lavagem com etanol frio (2x1 mL), para produzir 227 mg (76%) do produto 126
de título bruto (contém pequenas impurezas por RMN) . A cristalização de DMS0/H20 deu 193 mg de produto de título puro como agulhas amarelas; mp: 324-6 °C (dez), mudança de cor a 270 °C. IR (KBr, cm"1); 3456; 3281; 1700; 1643. RMN (^, DMSO-d6) : d 5,844 (s, 2H), 6,732 (s, 1H) ; 11,257 (s, 1H) ; 11,810 (s, 1H) . Pureza: > 96,96% por HPLC. HRMS: calculado para CsHsNaOsB^ (M+) m/z 332, 8747; encontrado: 332,8754. Potência em relação a DCK: 341%.
Exemplo 57. Preparação de 5-Am±no-6,7-dlcloro-lf4-dl-'h.idro-2,3-quinoxallnadiona A uma mistura agitada de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (110 mg, 0,40 mmol) em etanol (6 mL) foi adicionado SnCl2.2H20 (448 mg, 2,0 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) com agitação durante 1 hora para formar uma solução clara e continuamente refluxada por mais 3 horas. A mistura foi depois arrefecida à temperatura ambiente e o precipitado amarelo foi colectado por filtração e lavado com etanol frio (2x1 mL) para fornecer 61 mg (62%) do composto de título bruto (contém pequenas impurezas por RMN). A cristalização de DMSO/H2O forneceu 43 mg de composto de título puro como agulhas amarelas brilhantes, mp > 350 °C (dez), a cor mudada a 320 °C. IR (KBr, cm'1): 3468; 3389; 3057; 1695; 1636; 1596; 1397. RMN ^H, DMSO-dg) : δ 5,935 (s, 2H) , 6, 595 (s, 1H) ; 11,317 (s, 1H) ; 11, 868 (s, 1H) . Pureza > 98,95% por HPLC. HRMS: calculado para C8H5N203Br2 (M+) m/z: 244,9757; encontrado 244,9740. Potência em relação a DCK: 323%.
Exemplo 58. Preparação de 5-Amido-6,7-d±cloro-l,4-dl~hidro-2,3-qninoxallnadlona 127 A uma solução agitada de 5-amino-6,7-dicloro-l, 4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (61,5 mg, 0,2 5 mmol) em DMF seco (7 mL) foi adicionado trietilamina (33 mg, 32 mMol, destilada antes, da utilização) e cloreto de acetilo (20 mg, 0,255 mMol, destilado antes da utilização). A mistura tornou-se uma solução amarela após 2 minutos. Depois de 2 horas a 25 °C, um precipitado apareceu e a agitação foi continuada durante a noite, durante cujo período surgiu mais precipitado branco. O precipitado foi colectado por filtração e lavado com água (2x1 mL) , rendendo um pó branco, que foi de 34 mg de composto de título bruto (contém alguma impureza por RMN). 0 filtrado foi adicionado à água (15 mL) para se obter um precipitado e este foi colectado por filtração e lavado com água (2 x 1 mL) , rendendo 29 mg de produto puro (por RMN) . O rendimento total foi de 88%. A cristalização de DMSO/H2O deu 25 mg de composto de título puro como microcristais brancos; mp: 320-2 °C (dec. a partir de 315 0 O H (KBr, cm-1) : 3500, 3162, 3056, 1706, 1606, 1531. RMN (1H, DMSO-dg) : d 2,065 (s, 3H), 7, 236 (s, 1H) , 9,621 (s, 1H); 11,655 ( S, 1H); 12,096 (s, 1H). HRMS : calculado para CioH7N303CÍ2 (M+) m/z: 286,9863; encontrado: 286, 9859. Potência em relação a DCK: 44%.
Exeznplo 59. Preparação de 6-Am±no-5, 7-dícloro-l, 4-dl-hldro-2,3-cpiinoxalinadlona (composto de referência) A uma mistura agitada de 6-nitro-5,7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (81 mg, 0,295 mmol) em etanol (3 mL) foi adicionado SnCl2.2H20 (331 mg, 1,47 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) , com agitação a 0,5 hora, para formar uma solução clara e refluxada continuamente por mais 0,5 hora. Foi depois arrefecida à temperatura ambiente e o precipitado amarelo foi colectado por filtração, seguido de lavagem 128 com etanol frio (2x1 mL) para fornecer 70 mg (97%) do composto de título bruto (contém pequenas impurezas por RMN). A cristalização de DMS0/H20 deu 32 mg de composto de título puro como agulhas amarelas; mp: 342-5 °C (dec. a partir de 335 °C) , a cor mudou a 325 °C. IR (KBr, cm-1): 3468, 3362, 3193, 1693, 1631, 1493, 1375; RMN (aH, DMSO-d6) : õ 5,418 (s, 2H) , 6, 999 (s, 1H) ; 11,238 (s, 1H) ; 11,776 (s, 1H) . HRMS: calculado para C8H5N3O2CI2 (M+) m/z: 244,9757; encontrado 244,9769. Potência em relação a DCK: 8,6%.
Exemplo 60. Preparação de 6-Amino-7-cloro-l/4-di-hidro-2,3-qalnoxalinadíona (composto de referência) A uma mistura agitada de 6-nitro-7-cloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (35 mg, 0,145 mmol) em etanol (2 mL) foi adicionado SnCl2.2H20 (163 mg, 0,724 mMol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C), com agitação durante 0,5 hora para formar uma solução clara e continuamente refluuxada por mais 0,5 hora. Foi depois arrefecida à temperatura ambiente e o precipitado amarelo foi colectado por filtração, seguido de lavagem com etanol frio (1X1 mL) para fornecer 25 mg (82%) do composto de título bruto (contém pequenas impurezas por RMN) . A cristalização de DMS0/H20 deu 14 mg de composto de título puro como agulhas amarelas, mp; 350 °C (dec. a partir de 335 °C) . IR (KBr, cm'1): 3406, 3356, 3212, 1668, 1637, 1518, 1437. RMN ^H, DMSO-de) : d 5,306 (s, 2H) , 6,551 (s, 1H) , 6, 940 (s, 1H) ; 11, 606 (s, 1H) ; 11, 788 (s, 1H) . HRMS: calculado para C6H8N203C1 (M+) m/z: 211,0147; encontrado 211,0159. Potência em relação a DCK: 28,0%.
Exemplo 61. Preparação de 6-Amlno-7-bxomo-lf4-dl-hldro-2,3- qainoxalinadiona (composto de referência) 129 A uma mistura agitada de 6-nitro-7-bromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (87 mg, 0,30 mmol) em etanol (3 mL) e DMSO (0,5 mL) foi adicionado SnCl2.2H20 (343 mg, 1,50 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) com agitação durante 1 hora, de modo a formar uma solução clara a qual foi reflxada por mais outra 1 hora. Foi depois arrefecida à temperatura ambiente e o precipitado amarelo foi colectado por filtração, seguido de lavagem com etanol frio (2x1 mL) para fornecer 50 mg (67%) do composto de titulo bruto (contém pequenas impurezas por RMN) . A cristalização de DMSO/H2O deu 21 mg de produto puro como agulhas amarelas, mp: > 300 °C (dec. a partir de 315 °C) , cor mudada a 300 °C. RMN (% DMSO~d6) : d 5,257 (s, 2H) , 6, 558 (s, 1H) , 7,087 (s, 1H); 11,599 (s, 1H}; 11,792 (s, 1H). HRMS: calculado para
CeHgNjOaBr (M+) m/z: 254,9642; encontrado 254,9630. Potência em relação a DCK: 7,1%.
Exemplo 62. Preparação de 5-Iodo-7-cloro~l, 4-cLL-hldro-2,3- qnlnoxallnadlona (composto de referência) A. Síntese de 4-cloro-2-iodo-6-nitroanlllna: O processo de Leeson, P.D. et al. (J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991)) foi adoptado. A uma solução de 4-cloro-2-nitroanilina (2,15 g, 12,45 mMol, Aldrich, usado como recebido), em AcOH glacial (16 mL) foi adicionado monocloreto de iodo (2,114 g, 12,90 mMol, Aldrich). A mistura foi aquecida a 120 °C durante 5 horas, em seguida, arrefecida e vertida em água gelada (30 g). O precipitado foi colectado e lavado com 10% de solução de sulfito de sódio (20 mL), depois ele foi cristalizado a partir de MeOH para dar 4-cloro-2-iodo-6-nitroanilina (1,05 g, 28%), como agulhas castanhas longas, mp 134-5 °C. RMN (1H, CDC13) : δ 6,660 (s, 2H); 7,906 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 8,188 (d, 1H, J = 1,8 Hz) . 130 B. Síntese de 2-Amino-4-cloro-6-±odoanillna.: A uma mistura agitada de 4-cloro-2-iodo-6-nitroanilina (389 mg, 1,305 mmol) em etanol (10 mL) foi adicionado SnCl2-2H20 {1,468 g, 6,526 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) , com agitação durante 0,5 hora para formar uma solução clara e, em seguida, o refluxo foi continuado por mais 0,5 hora, A solução foi arrefecida à temperatura ambiente e água gelada (20 g) foi adicionada. O pH foi ajustado para pH ~ 7 e a mistura foi extraída com acetato de etilo. O extracto foi seco sobre MgS04, e evaporado à secura para dar. 336 mg (96%) de 2-amino-4-cloro-6-iodoanilina, como um sólido castanho. RMN (LH, CDC13) : δ 3,536 (s, 2H) , 3,763 (s, 2H) ; 7,165 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 6,671 (d, 1H, J = 1,8 Hz). ' C. Síntese de 5-Iodo-7-cloxo-l, 4-dl-hldro-2,3-qulnoxalinadiona.: 0 processo de Foged, C. e Journal, P. (J. of Lab. Compd. and
Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)) foi adaptado. A uma mistura agitada de 2-amino-4-cloro-6-iodoanilina (366 mg, 1,253 mmol) em 2N de HC1 (30 mL) foi adicionado ácido oxálico (160 mg, 1,269 mMol, usado como recebido), em uma parcela. A mistura foi refluxasa a 120-5 °C durante 3 horas, em seguida, arrefecida à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi centrifugada e a camada líquida foi removida. 0 sólido vermelho foi lavado duas vezes com água fria (2x2 mL) , colectado por filtração, e seco a 60 °C, com pressão reduzida durante 2 horas, fornecendo 300 mg de 5-iodo-7-cloro-1,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (74%) bruta, como um pó vermelho contendo algumas impurezas (por RMN) . Uma amostra de 300 mg de produto bruto foi dissolvido em IN de NaOH (10 mL) . Algum material insolúvel foi removido por filtração e, em seguida, o filtrado foi acidificado com pH = 6, fornecendo 260 mg de produto puro. A cristalização de DMSO/H2O, deu 169 mg de produto puro 131 (42%), como microcristais vermelhos, mp: > 350 °C (dec. a partir de 295 °C) . IR (KBr, cm-1) 3443, 3212, 1750, 1706, 1606, 1587, 1393. RMN (1H, DMSO-dg) : δ 7,133 (d, 1H, J = 1,5 Hz}, 7, 628 (d, 1H, J -1,5 Hz); 10,386 (d, 1H, J = 1,5 Hz); 12,015 ( d, 1H, J = 1,8 Hz). HRMS: calculado para C8H4N2O2CII (M+) m/z: 321, 9004; encontrado: 321,8995. Potência em relação a DCK: 28,4%. EXEMPLO 63. Preparação de 5-iodo-7-fluoro-l,4-di-hidro-2r3- quinoxalinadiona (composto de referência) A. Síntese de 4-Fluoro-6-±odo-2-nitroanil±na: O processo de Sy, W.W.(Synthetíc Communications 22 (22):3215-19 (1992)) foi adaptado. A uma solução de 4-fluoro-2-nitroanilina (312 mg, 2,0 mmol, Aldrich, usado como recebido) , em EtOH (40 rnL) foi adicionado iodo (0, 508 g, 2,0 mmol, usado como recebido) e Ag2S04 (622 mg, 2,0 mmol, usado como recebido). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante um dia. O TLC (CHCI3) da mistura mostrou que consistiu de 40% de material de partida e de 60% de produto. Iodo adicional (127 mg, 0,5 mmol) e Ag2SC>4 (311 mg, 1 iriMol) foi adicionado. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais um dia e, em seguida, o precipitado amarelo que se formou foi removido por filtração o filtrado foi evaporado à secura sob pressão reduzida, fornecendo 774 mg de 4-fluoro-6-iodo-2-nitroanilina bruta. Esta foi dissolvida em diclorometano e lavada com 5% de solução de hidróxido de sódio (20 mL), seguido pela água. Depois da separação das camadas, a camada orgânica foi seca sobre MgSC>4 e evaporada à secura. O resíduo foi cromatografado em gel sílica e eluido com clorofórmio, dando 4-fluoro-6-iodo-2-nitroanilina bruta. A amostra foi purificada por TLC preparativo (eluida com clorofórmio) para dar 4-fluoro-6-iodo-2-nitroanilina pura (466 mg, 83%), como um pó amarelo. RMN (1H, CDCI3) : δ 6,538 132 (σ, 2Η); 7,768 (q, J 1 = 3 Hz, J 2 = 6,9 Hz, 1H); 7,939 (q, J 1 = 3
Hz, J 2 = 6,9 Hz, 1H) . B. Síntese de 2-Amino-4-£luoro-6-lodoan.ílina: A uma mistura agitada de 4-fluoro-6-iodo-2-nitroanilina (359 mg, 1,273 mmol) em etanol (10 mL) foi adicionado SnCl2-2H20 (1,432 g, 6,365 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) , com agitação durante 0,5 hora para formar uma solução clara e, em seguida, o refluxo foi continuado por maís 0,5 hora. A solução foi arrefecida à temperatura ambiente e água gelada (20 g) foi adicionada. 0 pH foi ajustado para pH ~ 7 e a mistura foi extraída com acetato de etilo. 0 extracto foi seco sobre MgSO^ e evaporado à secura para dar 232 mg (73%) do 2-amino-4-fluoro-6-iodoaniline como um sólido castanho. RMN (1H, CDC13) : δ 4,366 (s, 2H) , 5,149 (s, 2H) ; 6,368 (tetra, 1H, J± = 3 Hz, J2 = 6,9 Hz), 6, 655 (tetra, Jx = 3,0 Hz, J2 = 6,9 Hz, 1H) .
C. Síntese de 5-Iodo-7-fluoi:o-lr 4-dí-hídro-2,3-quínoxa.línadíona: O processo de Foged, C. e Journal, P. (J. of Lab. Compd. and
Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)) foi adaptado. A uma mistura agitada de 2-amino-4-fluoro-6-iodoanilina (232 mg, 0,92 mmol) em 2N de HC1 (10 mL) foi adicionado ácido oxálico (126 mg, 1,0 mmol, usado como recebido), em uma parcela. A mistura foi refluxada a 120-5 °C durante 3 horas, em seguida, areefecida à a temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi centrifugada e a camada líquida foi removida. O precipitado vermelho foi lavado com água fria (2x2 mL) , colectado por filtração, e seco a 60 °C, com pressão reduzida durante 2 horas, fornecendo 160 mg de composto de título bruto (57%), como um pó vermelho contendo algumas impurezas (NMR) . A amostra do produto bruto foi dissolvida em IN de NaOH (10
mL) e algum material insolúvel foi removido por filtração. O 133 filtrado foi acidificado para pH = 6, fornecendo 156 mg de produto purificado. A cristalização de DMSO/H2O deu 149 mg de composto de título puro (51%) como microcristais vermelhos, mp: 310-2 °C (mudou de cor, a partir de 242 °C). IR (KBr, cm-1) 3431, 3350, 3062, 1743, 1718, 1606, 1518, 1400. RMN (ΧΗ, DMSO-d6) : δ 6,947 (g, 1H, Ji = 2,7 Hz, J2 = 9,3 Hz), 6, 963 (q, 1H, Ji = 2,7 Hz, J2 = 9,3 Hz); 10,313 (s, 1H) ; 12,054 (s, 1H) . HRMS calculado para C8H4N2O2 FI (M+) m/z: 305,9301; encontrado: 305,9288. Potência em relação a DCK: parcialmente activa.
Exemplo 64. Preparação de S-Iodo-6,7-dicloro-lf4-di-hidro-2,3-qninoxalinadiona A. Síntese de 4,5-d±cloro~6-±odo-2-n±troanil±na: O processo de Sy, W.W. (Synthetic Communications 22 (22):3215-19 (1992)) foi adaptado. A uma solução de 4,5-dicloro-2-nitroanilina (4,14 g, 2,0 mmol, usado como recebido) , em EtOH (40 mL) foi adicionado iodo (521 g, 2,05 mmol, usado como recebido) e Ag2S04 (622 mg, 2,0 mmol, usado como recebido). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante um dia (controlado por TLC), em seguida, o precipitado amarelo que se formou foi removido por filtração. O filtrado foi evaporado à secura sob pressão reduzida, fornecendo 600 mg de 4,5-dicloro-6-iodo-2-nitroanílina bruto. Este foi dissolvido em diclorometano e lavado com 5% de solução de hidróxido de sódio (20 mL) , seguido pela água. A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e evaporada à secura. O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica e eluído com clorofórmio, dando o produto bruto. Este foi purificado por TLC preparativo (eluição com clorofórmio) para dar 4,5-dicloro-2-iodo-6-nitroanilina pura (356 mg, 53%), como um pó amarelo. RMN (ΧΗ, CDC13) ; δ 6, 940 (s, 2H) , 8,378 (s, 1H) . 134 B. Síntese de 1,2-diamino-4,5-dlcloro-6-lodobenzeno: A uma mistura
agitada de 2-nitro-4,5-dicloro-6-iodoanilina (216 mg, 0,648 mmol) em etanol (5 ml} foi adicionado SnCl2.2H20 (730 mg, 3,24 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C) , com agitação durante 0,5 hora para se formar uma solução clara e, em seguida, o refluxo foi continuado por mais 0,5 hora. A
solução foi arrefecida à temperatura ambiente e água gelada (10 g) foi adicionada. O pH foi ajustado para pH ~ 7 com 5% de solução de NaHC03 aquosa e a mistura foi extraída com acetato de etilo. O extracto foi seco sobre MgSCh e concentrado à secura para dar 156 mg (80%) de l,2-diamino-4,5-dicloro-6-iodobenzeno como um sólido castanho. RMN (% DMSO-d6) : δ 4,954 (s, 2H) , 5,162.(s, 2H) , 6,722 (s, 1H). C. Síntese de 5-Iodo-6, 7-dicloro-l,4-dl~hidro"2,3-quinoxal±nadlona: O processo de Foged, C. e Journal, P. (J. of Lab. Compd. and Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)) foi adaptado. A uma mistura agitada de 1,2-diamino-4,5-dicloro-6-iodobenzeno (70 mg, 0,23 mmol) em 2N de HC1 (10 mL) foi adicionado ácido oxálico (32 mg, 0,25 mmol, usado como recebido), em uma porção. A mistura foi refluxada a 120-5 °C durante 3 horas, em seguida, arrefecida à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi centrifugada e o sólido vermelho foi lavado duas vezes com água fria (2x1 mL), colectado por filtração, e seco a 60 °C, com · pressão reduzida durante 2 horas, dando 60 mg de composto de titulo bruto (73%), como um pó vermelho. A mistura foi centrifugada e o sólido vermelho foi lavado duas vezes com água fria (2x1 mL) , colectado por filtração, e seco a 60 °C, com pressão reduzida durante 2 horas, dando 60 mg de composto de título bruto (73%), como um pó vermelho. A amostra foi dissolvida em IN de NaOH (8 mL) e o material insolúvel foi removido por filtração. O filtrado foi acidificado para pH = 6, dando 46 mg 135 do composto de título. A cristalização de DMS0/H20 deu 19 mg de produto puro (23%) como microcristais vermelhos, mp: 335-8 °C (dec. começou a 330 O O H (KBr, cm 1 ) : 3437, 3325, 1750, ' 1712, 1475, 1393. RMN ^H, DMSO-d6) : δ 7,273 (s, 1H); 10,282 (s, 1H) ; 12,038 (s, 1H) . HRMS , calculado para C8H3N202Cl2l (M+) m/z: 355 ,8614; encontrado: 355,8603. Potência em relação a DCK: 152%.
Exemplo 65. Preparação de 5-Iodo-6-nitro-7-cloro-1,4-di-hldxo-2,3-quinoxalinadxona O método de Cheeseman, G.W.H. (J. Chem. Soc. 1170 (1962)) foi adaptado. 5-Iodo-7-cloro~l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (96 mg, 0,33 mmol) foi dissolvida em H2SO4 concentrado (1,0 mL) a 0 °C durante 30 minutos e, em seguida, KNO3 (36 mg, 0,36 mmol, Baker) foi adicionado a esta solução. A mistura foi agitada a 0 °C durante 0,5 hora e, em seguida, à temperatura ambiente durante 30 horas. Ela foi vertida em água gelada (5 g) . Um precipitado surgiu e foi recolhido por filtração fornecendo 101 mg de composto de título bruto. A amostra foi dissolvida em IN de KOH (5 mL) e, em seguida, o precipitado vermelho foi removido por filtração. O filtrado foi acidificado para pH = 2 com 4N de HCl para dar um precipitado castanho que foi colectado por filtração e, em seguida, seco ao ar a 50 °C durante 4 horas. 0 composto de título (75 mg, 67%) foi obtido como um pó castanho. A cristalização de DMS0/H20 forneceu o composto puro (34 mg), como microcristais castanhos, mp: 388-90 °C. IR (KBr, cm"1): 3462, 3200, 3050, 1712, 1587, 1537. RMN (ΧΗ, DMSO-d6) : δ 7,289 (s, 1H) , 10, 846 (s, 1H) , 12,225 (s, 1H) . HRMS: calculado para C8H3N304CII (M+) m/z: 366,8855, encontrado pendente. Potência em relação a DCK: parcialmente activa. 136
Exemplo 66. Preparação de 5-Iodo-7-cloro-6,8-di.nítro-l, 4-dl-hidro-2,3-quinoxalinadiona (composto de referência) 0 método de Cheeseman, G.W.H. (J. Chem. Soc. 1170 (1962)) foi adaptado. 5-Iodo-7-cloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (74 mg, 0,23 mmol) foi dissolvida em H2SO4 concentrado (1,0 rtiL) a 25 °C durante 30 minutos e, em seguida, KN03 (116 mg, 1,17 mmol, Baker) foi adicionado na solução. A mistura foi agitada a 25 °C durante 12 horas, e a 100 °C durante 4 horas. Depois da mistura ter arrefecido à temperatura ambiente, foi vertida em água gelada (5 g) . Um precipitado surgiu e foi recolhido por filtração. Foi dissolvido em IN de KOH (10 mL), filtrado, e o filtrado foi acidificado para pH = 5 com 4N de HC1 para dar um precipitado vermelho. Este foi seco ao ar a 50 °C durante 4 horas produzindo o composto de titulo (27 mg, 28%) como um pó vermelho escuro, mp: 240-2 °C (com dec., mudança de cor a 180-5 °C) . IR (KBr, cm"1) : 3431, 3218, 3143, 1712, 1550, 1400, 559. HRMS: calculado para C8H4N206CII (M+) m/z: 411, 8705, encontrado: 411,8713. Potência em relação a DCK: pendente.
Exemplo 67. Preparação de 5,8-diiocLo-6/ 7-dicloro-l,4-di-hidro-2,3-çpiinoxalinadiona (composto de referência) O método de Leeson, P.D. et al. (J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991)) foi adotado. 6,7-Dicloro-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (92 mg, 0,40 mmol) foi dissolvida em H2S04 concentrado (2,0 mL) à temperatura ambiente durante 30 minutos e, em seguida, ICI (383 mg, 2,16 mMol, Aldrich) foi adicionado a esta solução. A mistura foi agitada a 115-20 °C durante 14 horas. Foi arrefecida à temperatura ambiente e vertida em água gelada (10 g) . Um precipitado surgiu e foi recolhido por filtração. 0 precipitado foi dissolvido em IN de KOH (10 mL), filtrado, e o filtrado foi acidificado para pH = 5 com 137
4Ν de HCl para dar um precipitado vermelho. Este foi colectado por filtração e seco ao ar a 50 °C durante 4 horas produzindo o composto de titulo (147 mg,: 75%) como um pó branco. A cristalização de DMSO/H2O deu microcristais brancos (96 mg, 50%), mp: 353-4 “C (dec. a partir de 315 °C) . IR (KBr, cm”1) : 3428, 3189, 3142, 1741, 1688, 1462, 1396, 579 . HRMS: calclado para C8H2N202C12I2 (M+) m/z: 481,7579, 481,7575 encontrado. Potência em relação a DCK: pendente.
Exemplo 68. Preparação de 6-iodo-l,4-dí-h±dro-2,3-quinoxalínadiona (composto de referência) A. Síntese de 4-±odo-2~nitroanílina·. 0 processo de Sy, W.W.
(Synthetic Communications 22 (22):3215-19 (1992)) foi adaptado. A uma solução de 2-nitroanilina (1,38 g, 10,0 mMol, Aldrich, usado como recebido), em EtOH (100 mL) foi adicionado iodo (2,54 g, 10,0 mMol, usado como recebido) e Ag2S04 (3,11 g, 10,0 mMol, usado como recebido). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora (controlada por TLC). 0 precipitado amarelo que se formou foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado à secura sob pressão reduzida, fornecendo 2,74 g de produto bruto. A amostra foi dissolvida em diclorometano e lavada com 5% de solução de hidróxido de sódio (40 mL) , seguido pela água. A camada orgânica foi seca sobre MgSC>4 e evaporada à secura. O resíduo foi cromatografado sobre gel de silica e eluído com clorofórmio. O TLC preparativo (eluição com clorofórmio) deu 4-iodo-2-nitroanilina pura (1,8 g, 68,0%) como um pó amarelo. RMN (•‘ή, CDC13) : δ 4,832 (s, 2H) ; 6,658 (d, J = 8,7 Hz, 1H) ; 7,595 (tetra, Ji = 1,5 Hz, J2 = 8,7 Hz, 1H) ; 8,442 (d, J = 1,5 Hz, 1H). 138 B. Síntese de 6-±odo-lf4-dl-hldj:o-2f3-qru.ln.ox.a.llna.diona.·. 0 processo de Foged, C. e Journal, P. (J. Lab. Compd. and Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)) foi adaptado. A uma mistura agitada de 2-nitro-4-iodoanílína (1,8 g, 6,9 mmol) em etanol (40 mL) foi adicionado SnCl2.2H20 (7,8 g, 34,6 mmol) em uma parcela. A mistura foi refluxada a 80 °C (banho de óleo a 90 °C), com agitação durante 0,5 hora para formar uma solução clara e o refluxo foi continuado por mais 1,5 hora. A solução foi arrefecida à temperatura ambiente e água gelada (100 g) foi adicionada. 0 pH foi ajustado para pH ~ 7 e a mistura foi extraída com acetato de etilo. O extracto foi seco sobre MgS04 e concentrado à secura para dar 1,235 g (78%) do composto de título como um sólido castanho. A uma mistura agitada deste produto (450 mg, 1,92 mmol) em 4N de HC1 (20 mL) foi adicionado ácido oxálico (267 mg, 2,115 mMol, usado como recebido), em uma parcela. A mistura foi refluxada a 120-5 °C durante 3 horas, em seguida, arrefecida à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi centrifugada e o precipitado vermelho foi lavado com água fria (2x2 mL) , colectado por filtração e seco a 60 °C sob pressão reduzida durante 2 horas, priduzindo 140 mg (25%) do produto bruto como um pó branco. A amostra foi dissolvida em IN de NaOH (10 mL) , filtrada, e o filtrado foi acidificado para pH = 6, rendendo 130 mg de produto que foi lavado com EtOH (2 mL) . A cristalização de DMS0/H20 deu 19 mg de composto de título puro como microcristais brancos, mp: 355-7 °C. IR (KBr, cm-1) 3459, 3148, 1750, 1704, 1392. RMN ^H, DMSO-d6) : δ 6,727 (d, J = 8,1 Hz, 1H) , 7,053 (q, J 1 = 1,8 Hz, J 2 = 8,4 Hz, 1H) , 11, 952 (s, 1H) , 11,998 (s, 1H) . HRMS: calculado para CgH5N202l (M+) m/z 287,9393.
Encontrado: 287,9390. Potência em relação a DCK: 4,7%.
Exemplo 69. Preparação de 6, 7-di,hromo-5, 8-di~±odo-l, 4-di-hidro-2,3-çpiinoxalínadiona (composto de referência) 139 O método de Leeson, P.D. et al. (J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991)) foi adoptado. 6,7-dibromo-l,4-di-hidro-2,3-quinoxalinadiona (105 mg, 0,33 mmol) foi dissolvida em H2SO4 concentrado (2,0 mL) a 0 °C durante 30 minutos. Em seguida, ICI (358 mg, 2,19 mmol, Baker) foi adicionado. A mistura foi agitada a 120 °C durante 14 horas, e, em seguida, arrefecida à temperatura ambiente e vertida em água gelada (5 g). 0 precipitado foi colectado por filtração e dissolvido em IN de KOH (10 mL). Um precipitado vermelho foi removido por filtração e o filtrado foi acidificado para pH = 2 com 4N de HC1 para dar um precipitado branco. Este foi colectado por filtração e seco ao ar a 50 °C durante 4 horas rendendo o composto de titulo (240 mg, > 100%), como um pó branco. A cristalização de EtOH deu o composto de titulo puro (140 mg, 75%), mp: > 350 °C. IR (KBr, cm-1): 3437, 3287, 1718, 1593, 1550. RMN (ΧΗ, DMSO-d6) δ 12,297 (s, 2H) . HRMS: calculado para CaH2N202Br2l2 (M+), m/z 569, 6569. Encontrado: pendente. Potência em relação a DCK: pendente.
Exemplo 70. Ensaios de Ligação e Modelos Animais a que se aplicam -1,4-Di-hidroquinoxalina-2,3-dionas Métodos A. Ensaio de Ligação de [3H] -MK801 estimulado por lpM de glicina. A potência antagonista da glicina in vítro foi determinada por meio de um ensaio de ligação de [3H]-MK801 estimulado por ΙμΜ de glicina. Este ensaio tira vantagem do facto de que a ligação de [3H]-MK801 ao receptor de PCP no interior do poro do canal de NMDA é dependente da presença de ambos o glutamato e a glicina. Na ausência de glicina, mas na presença de glutamato, [3H]-M801 não pode ligar-se de forma eficaz ao receptor de PCP, porque o canal de 140 NMDA permanece fechado e o acesso de [3H]-MK801 para o receptor de PCP dentro do poro do canal fechado é severamente restricto. O ensaio foi conduzido utilizando membranas do cérebro de ratos homogeneizadas que são enriquecidas com os receptores de NMDA. As membranas foram preparadas como se segue. Cérebros de ratos congelados (obtidos a partir da firma Freez-Pel, Rogers, Arcansas) foram homogeneizados em 15 volumes (p/v) de 0,32 M de sacarose em gelo frio. 0 homogenato foi girado a 1,000 x g durante dez minutos. 0 sobrenadante foi colectado e girado durante 20 minutos a 44,000 x g. 0 sedimento foi suspenso em 15 volumes de água (em relação ao peso inicial do cérebro). O homogenato foi novamente girado a 44,000 x g durante vinte minutos. O sedimento foi ressuspenso em 5 volumes de água e a suspensão foi descongelada 2 vezes. Após o final do ciclo de degelo, a suspensão foi trazida para 15 volumes com água e girada a 44,000 x g durante vinte minutos. O sedimento foi ressuspenso em 5 volumes de 10 mM de HEPES gelado, ajustado para pH 7,4 com KOH contendo 0,04% de Triton X-100. As membranas foram incubadas com o tampão de Triton/HEPES a 37 °C durante 15 minutos. 0 volume foi depois levado para 15 com 10 mM de HEPES gelado, pH 7,4, e girado/lavado três vezes com rotações de 44,000 x g entre as lavagens. 0 sedimento final foi suspenso em três volumes de 50 mM de HEPES, pH 7,4 e a. concentração da proteína foi determinada com um ensaio de proteína de ligação corante padrão (Bio-Rad, Richmond, Califórnia}. A suspensão foi armazenada a -80 °C até ser utilizada. Apenas a água de grau de HPLC foi utilizada para todos os tampões e suspensões/lavagem. As lavagens extensas foram necessárias para remover tanto quanto possível a glicina endógena a partir da preparação da membrana. 141
No dia do ensaio, as membranas previamente preparadas foram descongeladas e 5 mM de tampão Tris/HCl, pH 7,4, foi adicionado a fim de produzir uma concentração de proteína final de 0,156 mg/mL. Para ensaio de ligação, 0,8 mL de membranas foram pipetadas em tubos de polipropileno seguido por 0,033 mL de 15,1 μΜ de ácido 5,7-dicloroquinurénico (DCK), 0,033 mL de 30,3 μΜ de glicina em tampão (ou tampão sozinho), 0,033 mL de 303 μΜ de glutamato em tampão (ou para os controlos, 0,1 mL de lmM de PCP vez de DCK/gly/glu), 0,033 mL de antagonista da glicina em tampão (ou tampão sozinho) e 0,1 mL de tampão contendo 200,000 cpm de [3H]-MK801. Uma ligação não especifica foi definida como a diferença na ligação que ocorre na ausência ou na presença de PCP (concentração final: 100 μΜ). Para determinar o efeito de 1 μΜ de glicina.sobre a ligação de [3H]-MK801, a radioactividade ligada na presença de 10 μΜ de glutamato sozinho (concentração final) foi subtraída da radioactividade ligada na presença de ambos os 10 μΜ de glutamato e 1 μΜ de glicina (concentração final). Uma concentração de 500 nM (final) de ácido 5,7-dicloroquinurénico (DCK) foi adicionada a todos os tubos de ensaio. Esta concentração do antagonista da glicina DCK "tamponou" a maior parte da glicina endógena residual que não havia sido removida pelos passos de lavagens extensas que tinham sido realizados durante o procedimento da preparação da membrana. Os 500 nM de DCK não interferiram com a estimulação da ligação de [3H]-MK801 que foi efectuada através da adição de 1 μΜ de glicina exógena.
Os ensaios foram incubados durante 120 minutos, à temperatura ambiente, ao fim de cujo período a radioactividade ligada à membrana foi isolada a partir da radioactividade livre através de filtração por vácuo por filtros de fibra de vidro Whatman que tinham sido pré-tratados com 0,3% de polietileno-imina. A filtração 142 foi realizada utilizando um aparelho Brandel de colheita de células de 48 cavidades. As membranas filtradas foram lavadas três vezes com 3 mL cada uma de tampão gelado. Os filtros foram transferidos para frascos de cintilação e 5 mL de coquetel de cintilação foram adicionados. Os frascos foram agitados durante a noite e a radioactividade foi contada por espectroscopia de cintilação liquida. Os ensaios foram feitos em triplicado, e todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes.
As curvas de resposta da dose de inibição foram construídas utilizando concentrações crescentes de antagonistas da glicina de 5 nM a 330 μΜ. Os valores de IC50 foram determinados para compostos activos na inibição da ligação de [3H]-MK801 estimulada por 1 μΜ de glicina, através de plotagem assistida por computador, das curvas de inibição e interpolação. Quando os compostos foram verificados como inibindo a ligação de [3H]-MK801 estimulada pela glicina, as experiências foram conduzidas para determinar se a inibição da ligação de [3H]-MK801 estimulada pela glicina, foi efectívamente mediada no local de ligação da glicina do receptor de NMDA. Nestas experiências, uma concentração fixada de antagonista suficiente para produzir uma inibição > 95% da ligação de [3H]-MK801 estimulada por 1 μΜ de glicina, foi incubada com as membranas, sem qualquer acréscimo de glicina (acima de 1 μΜ} e na presença de concentrações crescentes de glicina adicional (2 μΜ a 1 μΜ) . Se a inibição da ligação de [3H]-MK801 pelo fármaco na presença de 1 mM de glicina foi totalmente revertida pela adição de concentrações crescentes de glicina, então a inibição da ligação de [3H]-MK801, foi mediada pela actuação do fármaco como um antagonista no local de ligação da glicina do receptor de NMDA. 143 A partir da construção das curvas de resposta da dose de inibição e a determinação da reversibilidade da glicina, valores de Ki para os antagonistas da glicina foram calculados com base na equação Prusoff Cheng e empregando os valores de IC50 experimentalmente determinados, a concentração de glicina conhecida no ensaio (1 μΜ) e a afinidade de glicina conhecida para o local de ligação da glicina do receptor de NMDA (100 nM). B. Ensaio de Ligação do radioligando [3H] -ΆΜΒΑ..
As mesmas membranas de cérebro de ratos homogeneizadas utilizadas para o ensaio de ligação de [3H]-MK801 estimulado por 1 μΜ de glicina foram utilizadas para este ensaio. No dia do ensaio as membranas congeladas (preparadas conforme descrito acima), foram descongeladas e diluídas com 30 mM de tampão Tris/HCl contendo 2,5 mM de CaCl2 e 100 mM de KSCN, pH 7,4, para render uma concentração final de membrana de 1,25 mg/mL de proteína de membrana. Para o ensaio de ligação, 0,8 mL de membrana homogenada foi adicionado a tubos de polipropileno seguido por 0,033 mL de fármaco e de 0,067 mL de tampão (ou para os controlos, por 0,1 mL de tampão sozinho) e 0,1 mL de tampão contendo 200,000 cpm de [3H]-AMPA. O ensaio foi incubado durante 30 minutos em gelo. A radioactividade ligada foi separada da radioactividade livre por filtração com filtros de fibra de vidro Whatman (pré-tratados com 0,3% de polietileno-imina), utilizando um aparelho Brandel de colheita de células com 48 cavidades.
As membranas filtradas foram lavadas três vezes com 3 mL cada de tampão gelado. Os filtros foram transferidos para frascos de cintilação e 5 mL de coquetel de cintilação foi adicionado. Os frascos foram agitados durante a noite e a radioactividade foi 144 contada por espectroscopia de cintilação liquida. A ligação não específica, foi determinada pela radioactividade que permaneceu ligada às membranas na presença de 10 mM de glutamato. As curvas de resposta da dose de inibição foram construídas, por se adicionarem concentrações crescentes de fãrmaco de 10 nM a 100 M. C. Ensaio de ligação do radioligando de [3H]-cainato. A mesma preparação de membrana que foi utilizada para o ensaio de ligação de [3H]-AMPA foi utilizada. No dia do ensaio as membranas do cérebro de rato congeladas foram descongeladas e 5 mM de tampão Tris/HCl, pH 7,4, foi adicionado a fim de produzir uma concentração final de 0,5 mg/mL da proteína da membrana. Para o ensaio de ligação, 0,8 mL de membrana homogenada foi adicionado a tubos de polipropileno seguido por 0,033 mL de fármaco e de 0,067 mL de tampão (ou para os controlos, por 0,1 mL de tampão sozinho) e 0,1 mL de tampão contendo 200,000 cpm de [3H]-cainato. O ensaio foi incubado durante 2 horas em gelo. A radioactividade ligada foi separada da radioactividade livre por filtração sobre filtros de fibra de vidro Whatman (pré-tratados com 0,3% de polietileno-imina), utilizando um aparelho Brandel de colheita de células de 48 cavidades. As membranas filtradas foram lavadas três vezes com 3 mL cada de tampão gelado. .Os filtros foram transferidos para frascos de cintilação e 5 mL de coquetel de cintilação foi adicionado. Os frascos foram agitados durante a noite e a radioactividade foi contada por espectroscopia de cintilação líquida. A ligação não específica foi determinada pela radioactividade que permaneceu ligada às membranas na presença de 10 mM de glutamato. As curvas de resposta da dose de inibição foram construídas, acrescentando concentrações crescentes de fármaco de 250 nM a 330 μΜ. 145 D. Avaliação da eficácia de antagonistas da glicina para inibir a neurotoxicidade do glutamato no sistema de cultura de células neuronais do córtex cerebral em ratos.
Um modelo de excitotoxicidade modificado depois daquele desenvolvido por Choi (Choi, D.W., J. Neuroscience 7:357 (1987)) foi usado para testar a eficácia anti-excitotóxica de novos antagonistas da glicina. Fetos de ratos embrionários no 19° dia foram retirados dos ratos fêmeas grávidas no periodo de acasalamento. Os cérebros foram retirados dos fetos e o córtex cerebral foi dissecado. As células do córtex dissecado foram dissociadas por uma combinação de agitação mecânica e digestão enzimática de acordo com o método de Landon e Robbins (Methods in Enzymology 124:412 (1986)). As células dissociadas foram passadas através de uma tela nitex de 80 mícrons e a viabilidade das células foi avaliada por triptano azul. As células foram colocadas em placas, em placas revestidas de poli-D-lisina e incubadas a 37 °C em uma atmosfera contendo 91% de 02/9% de C02. Seis dias depois, foi acrescentado fluoro-d-uracilo durante dois dias para suprimir o crescimento de células não neuronais. No 12° dia de cultura, as culturas de neurónios primárias foram expostas a 100 μΜ de glutamato durante 5 minutos, com ou sem doses crescentes de antagonista da glicina ou outros fármacos. Após 5 minutos, as culturas foram lavadas e incubadas durante 24 horas a 37 °C. 0 dano das células neuronais foi quantificado pela medição da actividade da desidrogenase de lactato (LDH) que tinha sido introduzida no meio de cultura. A actividade de LDH foi medida de acordo com o método de Decker et al. (Decker et al., J. Immunol. Methods 15:16 (1988)). 146 E. Avaliação da actividade anticonvulsiva de antagonistas da glicina no modelo de ataque audiogénico em murganhos DBA-2.
Os murganhos DBA-2 foram obtidos a partir da firma Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Estes murganhos com < de 27 dias de idade desenvolvem um ataque tónico dentro de 5-10 segundos, e morrem quando eles são expostos a um som de 14 kHz (onda sinusoidal) a 110 dB (Lonsdale, D., Dev. Pharmacol. Ther. 4:28 (1982)). A proteção do ataque foi definido quando os animais injectados com fármaco, 30 minutos antes da exposição sonora não desenvolveram uma convulsão e não morreram durante 1 minuto de exposição ao som. Os murganhos DBA-2 com 21 dias de idade foram usados para todos as experiências. Os compostos foram sempre dados intraperitonealmente quer em solução salina, DMSO ou polietilenoglicol 400. Os controlos de solvente apropriados foram sistematicamente incluídos em cada experiência. As curvas de resposta da dose roram construídas, dando doses cada vez maiores de fármaco de 1 mg/kg a 100 mg/kg. Cada grupo de dose (ou controlo de solvente) consistiu de pelo menos seis animais. F. Avaliação da eficácia anticonvulsiva de novos medicamentos no teste de ataque induzido por pentilenotetrazol (PTZ). OS murganhos Swiss/Webster, quando injectados com 50 mg/kg de PTZ (intraperitonealmente) desenvolvem um mínimo de ataques clónicos de aproximadamente 5 segundos em comprimento dentro de 5-15 minutos após a injecção do fármaco. A eficácia anticonvulsiva de fármaco de antagonista da glicina (ou outro) foi definida como a ausência de um ataque quando um medicamento foi administrado 30 minutos antes da aplicação de PTZ e um ataque não se desenvolveu até 45 minutos após a administração de PTZ. O antagonista da glicina ou outros 147 fármacos foram sempre dados intraperitonealmente, quer em solução salina, DMSO ou polietilenoglicol 400. Os controlos de solvente apropriados foram sempre incluídos em cada experiência. As curvas da resposta da dose foram construídas, dando doses cada vez maiores de fármaco de 1 mg/kg a 100 mg/kg. Cada grupo de dose (ou controlo de solvente) consistiu de pelo menos seis animais. G. Avaliação da eficácia de antagonistas da glicina para proteger os murganhos da morte induzida por NMDA.
Quando os ratos são injectados com 200 mg/kg de N-metil-D-aspartato (NMDA) intraperitonealmente, os animais vão desenvolver ataques seguidos de morte dentro de 5-10 minutos. Os antagonistas da glicina foram testados quanto à sua capacidade de impedir a morte induzida por NMDA, dando os fármacos intraperitonealmente 30 minutos antes da aplicação do NMDA. 0 antagonista da glicina ou outras fármacos foram sempre dados intraperitonealmente, quer em solução salina, DMSO ou polietilenoglicol 400. Os controlos de solvente apropriados foram sempre incluídos em cada experiência. Foram construídas curvas de resposta de dose, dando doses cada' vez maiores de fármaco de 1 mg/kg a 100 mg/kg. Cada grupo de dose (ou controlo de solvente) consistiu de pelo menos seis animais. H. Avaliação de efeitos colaterais atáxicos em murganhos pelo Teste de Ataxia Rotorod, 0 grau de incoordenação motora foi avaliada mediante a utilização de um tapete rolante padrão para ratos (Hugo Basile, Varese, Itália). Os murganhos são climatizados ao tapete rolante, colocando-os sobre ele antes de se iniciar a experiência propriamente dita. A coordenação motora normal é definida como a 148 capacidade de cada rato permanecer no tapeta rolante consecutivamente durante um período definido arbitrariamente (1 minuto). Isto serve como a base para a avaliação do efeito de cada fármaco na descoordenação motora. Ver, Dar, M.S., J. Pharm. Pharmacol. 40:482-487 (1988); Dar, E.M. et al. , Life Sei. 33:1363-1374 (1983); e Dar e Wooles, Life Sei 39:1429-1437 (1986). Os murganhos foram injectados com qualquer veiculo (DMSO), 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona ou 6,7-dibromo-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona dissolvido em DMSO a doses de 1-300 mg/kg (intraperitonealmente; 6 animais por dose de fármaco ou veículo de controlo). Trinta minutos depois da injecção, os murganhos foram colocados no tapete rolante. O tapete foi operado a uma velocidade de 6 rpm. Os animais capazes de permanecerem no tapete durante 60 segundos foram considerados como não tendo qualquer descoordenação motora significativa. A doseso tóxica (TD50) , foi designada como a dose de fármaco à qual 50% dos animais caíram do tapete rolante dentro de menos de 60 segundos.
Resultados A tabela II apresenta os resultados dos ensaios de ligação no local de ligação da glicina, o cainato e os receptores de AMPA com 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (#1) e o composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidro-quinoxaline-2,3-diona (# 2). TABELA II Fármaco (glicina) (P·^) Kkmpa) (μΜ) ^i (cainato) # 1 Rato Porco da guiné # 2* 0, 008 - 20 92 # 13 0,8 0,4 21 218 149 0, 006 - 3 20 * Composto de referência A tabela III apresenta os resultados dos modelos animais anticonvulsivos in vivo, empregando os compostos #1, # 2 e # 13, (ataques audiogénicos em murganhos DBA-2; ataques induzidos por pentilenotetrazol em murganhos Swiss/Webster; e convulsões induzidas por NMDA/morte em murganhos Swiss/Webster). TABELA III Fármaco EDso/DBA (mg/kg) (intraperitoealmente) ED50/PTZ (mg/kg) (intraperitoealmente) ED50/NMDA (mg/kg) (intraperitoealmente) # 1 5 Não activo 20 # 2* 17 17 Não activo # 13 10 — “* * Composto de referência A Tabela IV apresenta os dados de ligação, os resultados do modelo animal anticonvulsivo in vivo e os resultados do teste de eficácia neuroprotectora (in .vitro) de outras 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas:
Tabela IV Fármaco RI R2 R3 R4 Ki (Gly) (μΜ) Ki (*MP) (μΜ) Ki (Kai) (μΜ) SDso (DBA-2) mg/kg IC5o cultura de células (μΜ) *1 no2 Cl Cl H 0,008 20 92 5 0, 3 #2** Cl H CF3 H 0,8/0,4 21 218 17 15 #3** Cl no2 CF3 H 0,2 2,2 35 inactivo n. t - 150 #4** Cl H CF3 no2 0,4 2,2 35 inactivo n.t. #5*,** Cl H Cl H 1 34 148 9 12 #6** Cl F F H 2,3 84 200 n. t. Inactivo #7 Br F F H 2,5 >330 44 30 27 #8** F F F F 2,8 92 >330 9 29 Cl H F H 9 >330 225 14 38 #10** Br H Br H 9 46 130 30 22 #11** Br H cf3 H 12 26 55 70 13 #12*,** Br H F H 6 290 196 21 12 #13 no2 Br Br H 0,006 3 22 10 0, 3 * 67-isómeros respectivos são inactivos como anticonvulsivos in vivo e, portanto, nâo penetram na barreira sanguínea do cérebro. ** Composto de Referência. A bela V mostra os resultados de um ensaio in vitro empregando um modelo de excitotoxicidade que envolve culturas de células cerebrais o que demonstra que os compostos # 1 e # 2 impedem aorte de células nervosas.
Tabela V Fármaco IC50 (μΜ) #1 0,3 #2* 15 #13 0,3 * Composto de referência A tabela VI mostra os resultados de testes in vivo de 1,4-di-hidroquinoxalina-2, 3-dionas 6,7-disubstituídas <1> no modelo de ataque audiogénico de DBA-2. R1
151
Tabela VI Fãrmaco RI R2 R3 R4 ED50 mg/kg #5 H Cl Cl H > 100 #9 H Cl F H > 100 #12 H Br F H > 100 #14 H no2 cf3 H > 100 #15 H no2 no2 H > 100 #16 H F F H > 100 #17 H CN no2 H > 100 A Tabela VII mostra os resultados de algumas das 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-dionas N-substituidas 6,7-disubstituidas (todos compostos de referência) no ensaio de ligação de [3H]-MK801 estimulado por glicina.
Rl
Tabela VII Fármaco R RI R2 R3 R4 (glicina) (nM) #18 ch2cooh H H H H 450 #19 ch2cooh H Br Br H 250 #20 ch2cooh H Cl Cl H 180 #21 nh2 H Br Br' H 530 22 nh2 H Cl Cl H 2000
Exemplo 71. Pxotecção Isquémlca. Global Com 5-cloro- 7-trifluorometil-l,4-di-hldx:oqulnoxal±na-2,3-diona (composto de referência) 152
Uma série de avaliações diferentes foram realizadas em doses de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2, 3-diona para determinar a actividade biológica deste composto tanto em roedores normais e em animais expostos a 5 minutos de oclusão bilateral da carótida. Ver o esquema VII.
Esquema VTI
Modelo de isquémia em roedores
Teste de comportamento locomotor ! 1. Cirurgia para expor as artérias carótidas 2. Recuperação durante 48 horas 3. Oclusão da artéria carótida {5 minutos, em animais não anesteziados 1
Estes estudos foram realizados em animais que estavam conscientes e não teve outros agentes farmacológicos a eles administrados. Os gerbis foram pré-instrumentados 48-horas antes da isquémia para permitir a eliminação completa do anestésico pentobarbital que é 153 empregue. Quando testados com fármacos, aos animais foram dadas injecções IP de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona ou veiculo. No caso de múltiplas injecções, aos animais foram dadas injecções IP 2 horas aparte, e no final foi administrada uma injecção 30 minutos antes do período isquémico ou no caso de pós-tratamento, aos animais foram dadas injecções aos 30 minutos, 2 horas, 4 horas e 6 horas de reperfusão pós-isquémica. A fim de avaliar a actividade farmacológica directa ou a actividade potencial deste composto, gerbis ingénuos foram injectados quer com solução salina ou doses diferentes de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. As mudanças comportamentais foram avaliadas utilizando uma câmara de actividade locomotora fotoeléctrica, que é uma arena de diâmetro circular de dois pés com detecção fotoeléctrica. Os animais são colocados individualmente em câmaras a 2 pés de diâmetro. As câmaras estão alojadas em um armário que está fechado e o ruído é apaziguado utilizando tanto um gerador barulho de fundo branco e um ventilador. Estes animais são colocados nestas câmaras, no caso da primeira avaliação farmacológica durante um período de 6 horas e a actividade total durante cada hora sucessiva é acumulada usando os sistemas de controlo de computador. A salina resultou em uma elevada taxa inicial de actividade como é demonstrado na Figura 1, com os animais de controlo apresentando um nível de actividade na primeira hora de cerca de 1600 contagens. Este nível de actividade de controlo é típico para os gerbis sob essas condições experimentais. À medida que a sessão evoluiu, os animais diminuíram a sua actividade exploratória e no período terminal a· actividade diminuiu para cerca de 250 contagens por hora. 154
Em toda a gama de doses testadas (1,0-32 mg/kg) 5“doro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não produziu nenhuma mudança consistente na actividade locomotora espontânea. O comportamento de controlo foi caracterizado por um elevado indice de actividade locomotora na primeira hora da sessão e de uma acentuada taxa de redução de actividade na última hora da sessão de 6 horas. A observação dos gerbis, além dos testes da actividade locomotora, indicou que doses tão elevadas como 32 mg/kg não alteraram o comportamento normal. 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em 1,0 mg, 3,2 mg/kg, 10 mg/kg e 32 mg/kg (Figuras 2-5) não teve qualquer efeito significativo tanto na taxa exploratório inicial ou na taxa de exploração terminal. Houve algumas pequenas diferenças que indicaram que, se a dose foi aumentada adicionalmente, podem na verdade existir alguns efeitos depressores comportamentais. Na dose de 32 mg/kg, a actividade exploratória inicial foi de cerca de 850 a 900 contagens em comparação com as 1200 contagens no grupo de solução salina de controlo (Fig. 5). Â medida que o tempo avançou, a actividade declinou de forma semelhante à solução salina de controlo e eventualmente declinou significativamente para um nível baixo (em comparação com a primeira hora), que foi semelhante em toda uma variedade de diferentes doses. Assim, 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não parece ter quaisquer efeitos comportamentais significativos estimulantes (como PCP) ou depressores como é visto com os antagonistas MK801 do receptor de NMDA (Veja a patente norte-americana No. 4,888,347) e CGS-19755 (cis-4-fosfono-metil-2-piperidina-carboxilato) . Todos os animais parecem tolerar as injecções de até 32 mg/kg muito bem e não mostram qualquer evidência de toxicidade grave. Todos os animais sobreviveram durante um período de 7 dias a seguir a estas doses. 155
Na próxima fase da avaliação de 5-cloro-7-trífluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, os gerbis foram pré-tratados com diferentes doses do composto e, em seguida, expostos a um período de cinco minutos de oclusão da carótida bilateral. Após o início da reperfusão, os animais foram colocados no aparelho de testes da actividade locomotora circular, e a atividade no início da primeira hora após a reperfusão foi monitorada nas quatro horas subsequentes.
Os nimais de controlo não expostos à isquémia e aos quais foram dadas injecções de soro fisiológico antes de serem colocados na câmara de actividade locomotora mostraram um padrão característico de actividade, que na primeira hora de actividade locomotora foi substancialmente mais elevada do que durante todas as outras horas e diminuiu progressivamente ao longo das quatro horas para um valor muito baixo. A Figura 6 (símbolos abertos) demonstra este padrão de controlo de actividade que é tipico da maior parte dos roedores quando colocados em um novo ambiente de teste da actividade locomotora. Em contraste com o declínio progressivo da actividade ao longo do período de ensaio de quatro horas, os animais de controlo que foram expostos a cinco minutos de isquémia cortical demonstraram um padrão completamente diferente da actividade locomotora. Durante a primeira hora, houve um declínio significativo na actividade, que foi seguido por um aumento gradual em que a actividade durante a quarta hora foi dez vezes mais elevada do que a demonstrada pelos animais não expostos a oclusão da carótida (Figura 6, símbolos fechados). Estes resultados são típicos e são um resultado fiável das alterações causadas por cinco minutos de oclusão da carótida bilateral nos gerbis. 156 OS grupos separados de gerbis foram pré-tratados com 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona 30 minutos antes do início da oclusão da carótida e, em seguida, colocados na actividade locomotora a seguir a uma hora de reperfusão. 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona prveniu tanto o decréscimo pós-isquémico e o aumento da actividade (figuras 7-10, símbolos fechados). Os decréscimos pós-isquémicos na actividade foram perto de zero durante a primeira hora após a reperfusão. O pré-tratamento com 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalína-2,3-diona reduziu com fiabilidade ou preveniu este comportamento precoce de depressão. Além disso, 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona impediu a estimulação do comportamento pós-isquémico. Todas as doses impediram a estimulação da actividade que ocorre com- fiabilidade durante a 3a e 4a horas após a reperfusão (ver as figuras 7-10) . Essas mudanças no padrão de comportamento pós-isquémico durante a primeira e quarta horas de avaliação do período pós-isquémico são apresentadas nas figuras 11 e 12. Em particular, a Figura 12, demonstrou claramente a redução drástica da hiperatividade pós-isquémica durante a quarta hora de avaliação, por doses de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona de 0,32-32 mg/kg.
Para efeitos de comparação, também se avaliaram os efeitos de uma série de pré-tratamentos IP com o antagonista da glicina não-sstricnina 3-amino-l-hidroxipirrolid-2-ona (HA966). Quando as doses de HA966 foram administradas 1 hora antes do inicio da isquémia, houve uma clara separação entre as doses activas e inactivas. 1 mg/kg de HA966 pareceu não ter qualquer efeito ou exacerbar as mudanças comportamentais que ocorreram após a reperfusão, quando os animais foram testados para a actividade locomotora 24 horas após a 157 reperfusão. Do mesmo modo, quando 3,2 mg/kg de HA966 foi testado, houve uma mudança ainda maior na actividade locomotora em que os animais de controlo demonstraram um nível de actividade total de cerca de 3361 contagens/hora. Quando a dose foi ligeiramente aumentada, uma protecção significativa contra as alterações comportamentais induzidas por oclusão da carótida bilateral, foram observadas. Ambos 5,6 mg/kg e 10 mg/kg de HA966 pareceram eficazes na prevenção dos aumentos pós-isquémicos na actividade, às 24 horas. Assim, parece que ambos os 5-cloro-7-trifluorometil-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e HA966 são eficazes na redução desta mudança comportamental particular que é característica da resposta isquemia cerebral nos gerbis.
Subsequente à conclusão das avaliações do pré-tratamento de dose única, os gerbis foram avaliados com múltiplas injecções de 32 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. As doses foram administradas intraperitonealmente a 6 horas, 4 horas, 2 horas e 30 minutos antes do início de - 5 minutos da isquémia. Na modalidade de pós-tratamento, as doses de 32 e 100 mg/kg foram administradas 30 minutos, 2 horas, 4 horas e 6 horas após o início da reperfusão.
Ao contrário, os compostos de referência 6-trifluorometil-7-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5,7-dinitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (MNQX), um efeito significativo de pós-tratamento de dose única com 5-cloro-7-trifluorometíl-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. foi observado. O tratamento pós isquémico com 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona impediu um aumento dependente da dose na actividade locomotora (Fig. 13) . Além disso, múltiplos pós-tratamentos resultaram em uma diminuição significativa na hiperactividade de 158 pós reperfusão {Fig. 14). Este nível de actividade foi significativamente diferente do pós-tratamento de dose única com a mesma dose. Às 24 horas todos os animais foram avaliados para as diferenças no comportamento de patrulha usando um labirinto radial de 8 braços. Neste procedimento, os animais foram colocados no início do centro da câmara do labirinto, a barreira removida e a quantidade de tempo e o número de vezes que o animal faz um erro registados antes da conclusão da exploração em todos os 8 braços do labirinto. Um erro foi definido como a revisita de um braço, pela entrada de toda a extensão do corpo, sem incluir a cauda, pelo animal. Se o animal perseverou ou falhou ao deixar o braço durante mais de cinco minutos, a sessão foi terminada. Nos casos de todas estas avaliações, os animais nunca excederam os cinco minutos de ponto de corte e todas os 8 braços foram explorados com sucesso com diferentes graus de erros. Na população de controlo dos animais, o número de erros e de exploração do labirinto sem nenhuma experiência anterior (ingénuo) foi aproximadamente de 6 erros. Este é um valor médio para um N, de 28 gerbis. Após 5 minutos de oclusão da carótida bilateral e ensaio, às 24 horas, os gerbis fizeram um número médio de erros de 21. Quando os animais foram pré-tratados com 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, houve uma redução significativa no número de erros cometidos. (X = 14) . Estes dados são apresentados na fig. 15 e indicam que não somente existe uma alteração na actividade locomotora nas 24 horas, produzida pelo 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona quando administrado como um pré-tratamento prévio antes de 5 minutos de isquémia, mas também parece ser limitado significativo das mudanças comportamentais que são induzidas no desempenho do braço radial dò labirinto. 159 0 pós-tratamento com 32 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona também reduziu o prejuízo de memória a curto prazo, 24 horas pós reperfusão/isquémica. Este é um achado único entre os compostos que têm sido testados neste modelo. Além disso, a falta de efeito comportamental notório, sugere que testes mais agressivos nestes e em outros modelos in vivo são justificados. A falta de resposta tóxica ostensiva, com altas doses de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona sugere que poderia haver uma margem de segurança que faria dele um bom candidato terapêutico.
Os efeitos de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral na morte de células neuronais no hipocampo dorsal foi avaliada em animais, 7 dias após a lesão da reperfusão por isquémia. Estudos anteriores demonstraram que a degeneração neuronal começa.a ocorrer em torno dos 3 dias a seguir à isquémia cerebral. Aos 7 dias aqueles neurónios que foram afectados e vão sofrer citólise e têm quer uma degeneração concluída ou são facilmente perceptíveis como núcleos escuros e núcleos deslocados com citoplasma eosinofílico com núcleos picnóticos. A lesão com 5 minutos de isquémia é essencialmente restrita dentro do hipocampo para a região de CAI do hipocampo dorsal. A zona intermédia lateral do braço não é afectada e a circunvolução dentada e/ou em CA3 não monstrou patologia. Os gerbis foram anestesiados no dia 7 a seguir à isquémia com 60 mg/kg de pentobarbital. Os cérebros foram perfundidos transcardiacamente com soro fisiológico gelado seguido de paraformaldeído tamponado (10%). Os cérebros foram retirados, embutidos e feitas secções. As secções foram coradas com hematoxilina-eosina e contagens de células neuronais foram determinadas em termos do número de núcleos neuronais/100 micrómetros. A Figura 16 indica que os animais de controlo normais (não expostos ao dano de reperfusão por isquémia) 160 não' demonstraram qualquer alteração significativa na densidade normal dos núcleos dentro dessa região. A exposição a cinco minutos de oclusão da carótida bilateral resultou em uma redução significativa do número de núcleos presentes na região de CAI. Em geral, essa lesão resulta em uma necrose improvisada, em vez de uma necrose confluente, que é vista se 10 minutos de isquémia for empregue. O tratamento prévio com 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, a de 0,32-32 mg/kg produz uma protecção significativa da degeneração neuronal hipocampal (Fig. 16). O pós-tratamento com 3,2 mg/kg reduziu significativamente o grau de perda celular na CA-1 a seguir à lesão de reperfusão por isquémia (Figura 17) .
Sumário dos Resultados 1. Composto de referência 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalína-2,3-diona não demonstrou efeitos colaterais comportamentais significativos em controlos normais. 2. Pré-tratamento com doses de 0,32 a 32 mg/kg 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona produziu protecção associada à dose, contra os efeitos comportamentais de 5 minutos de isquémia cerebral. 3. Uma dose de 3,2 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona aplicada pós-isquémia preveniu a lesão pós-isquémica das células CA-1 hipocampais. Quatro doses de 0,32-32 mg/kg aplicadas pré-isquémia preveniram a lesão pós-isquémica para as células hipocampais na região de CA-1. 161 4, A proteção comportamental foi mais sensível do que a protecção contra a lesão celular hipocampal. 5. 0 pós-tratamento com 32 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hídroquinoxalina-2,3-diona reduziu os efeitos comportamentais, e reduziu ou preveniu as consequências hístopatológicas de 5 minutos de oclusão da carótida bilateral.
Conclusão:
Dos três compostos de referência testados (6-Nitro, 7CF3-QX; 5,7-dinitro-QX, 5~Cl-7-CF3“QX) , 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona é de longe o melhor composto para a protecção da isquémia nos gerbis. Este composto foi desprovido de efeitos directos significativos no comportamento. No entanto, foi um potente protector quando administrado antes da isquémia. Além disso, múltiplas doses de pré-tratamento e pós-tratamento forneceram uma protecção significativa. A protecção comportamental estendeu-se tanto à actividade locomotora como ao desempenho do braço radial do labirinto. Consistente com esta protecção comportamental robusta, 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona também protegeu contra a lesão neuronal.
Exemplo 72. Efeitos de 5-cloro-7-tri£luorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2f3-diona (composto de referência), 6f 7-dicloro-5- nitxro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2, 3-diona e 6, 7-dibromo-5-ni tro-1,4-di-hidroqainoxalina-2,3-diona na dor crónica.
Sabe-se que os receptores de NMDA estão criticamente envolvidos no desenvolvimento da dor persistente após a lesão do nervo e do tecido. A lesão do tecido, tal como a causada por se injectar uma 162 pequena quantidade de formol por via subcutânea na pata traseira de um animal teste tem sido mostrada como produzindo um aumento imediato de glutamato e aspartato na medula espinal (Skilling, S.R., et al.r J. Neurosci. 10:1309-1318 (1990)). A administração de bloqueadores dos receptores de NMDA reduz a resposta dos neurónios do braço dorsal da medula espinal após a injecção de formalina (Dickenson e Aydar, Neuroscience Lett. 121:263-266 (1991); Haley, J.E., et al.r Brain Res. 518:218-226 (1990)). Esses neurónios do braço dorsal são críticos no transporte do sinal da dor da espinal medula ao cérebro e a resposta reduzida desses neurónios é indicativa de uma redução na dor sentida pelo animal de teste ao qual a dor tenha sido infligida por injecção subcutânea de formol.
Devido à observação de que os antagonistas do receptor de NMDA podem bloquear a resposta neuronal do braço dorsal induzida pela injecção subcutânea de formalina, os antagonistas do receptor de NMDA têm potencial para o tratamento da dor crónica tal como a dor que é causada por cirurgia ou por amputação {dor fantasma) ou pela inflição de outros ferimentos (dor de feridas). No entanto, a utilização de antagonistas de NMDA convencionais, tais como ο MK801 ou o CGS 19755, na prevenção ou no tratamento da dor crónica, está severamente limitada pelos efeitos secundários comportamentais adversos como PCP, que são causados por estes fármacos. Verificou-se que os antagonistas baseados em 1,4-di-hídroquinoxalina-2,3-diona do local de ligação da glicina do receptor de NMDA que são o objecto desta invenção são altamente eficazes na prevenção da dor crónica em murganhos induzidos por se injectar formalina subcutaneamente na pata traseira dos animais. Porque os antagonistas da glicina baseados em 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona desta invenção são livres de efeitos colaterais como PCP, estes fármacos são muito úteis na prevenção ou tratamento da dor 163 crónica sem causar efeitos colaterais comportamentais adversos como PCP.
Os murganhos machos Swiss/Webster pesando 25-35 gramas foram alojados cinco para uma gaiola cora livre acesso à alimentação e à água e foram mantidos em um ciclo de luz de 12 horas (inicio da luz às 0800h). 5-Cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (1-40 mg/mL) , 6, 7-dicloro-5-nitro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (5-40 mg/mL) ou 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona (1-40 mg/mL) foram dissolvidos em DMSO. 0 DMSO foi utilizado como veiculo de controlo. Todos os fármacos foram injectados intraperitonealmente (1 pL/g). O teste de formol foi realizado conforme descrito (Dubuisson e Dennis, Pain 4:H161-174 (1977)). Os murganhos foram observados em um cilindro de plexiglas, 25 cm de diâmetro e 30 cm de altura. A superfície plantar de uma pata traseira foi injectada com 20 μΐ de 5% de formalina. O grau de dor foi determinado pela medição da quantidade de tempo que o animal gastou a lamber a pata injectada com o formol durante os intervalos de tempo seguintes: 0-5' (fase inicial); 5'-10', 10'-15' e 15'-50' (fase tardia). Para testar se os dois antagonistas da glicina preveniram a dor crónica nos animais de teste, o veículo (DMSO) ou os fármacos dissolvidos em veículo, com as doses de 1 mg/kg a 40 mg/kg foram injectados intraperitonealmente, 30 minutos antes da injecção de formalina. Para cada dose de medicamento ou veiculo de controlo, pelo menos, seis animais foram utilizados. A Figura 18 mostra que, comparado ao controlo de veículo, a injecção intraperitoneal de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 30 minutos antes da injecção de formalina na pata traseira inibiu significativamente a dor crónica 164 induzida pela formalina em uma maneira dependente da dose, tal como determinado pela redução do tempo gasto a lamber pelo rato da pata traseira injectada com formalina causadas por doses crescentes de antagonista da glicina. 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona inibiu o acto de lamber induzido pela formalina em todas as doses (1-40 mg/kg), em ambas as fases precoce e tardia. A figura 19 mostra que, comparado com o controlo de veiculo, a injecção intraperitoneal de 6,7-di-cloro-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona também inibiu a dor induzida pela formalina como julgado pela inibição do tempo despendido pelo animal a lamber a pata traseira injectada com a formalina. 6,7-Dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona inibiu o acto de lamber induzido pela formalina a doses de 5-40 mg/kg nas fases tardias pelo que a fase precoce foi inibida por doses de 10-40 mg/kg. 6,7-dibromo-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona apresentou um ED50, de 5 mg/kg na prevenção da dor induzida pela formalina, no rato.
Como mostrado nas figuras 20A e 20B, 6,7-dibromo-5-nitro-di-hidroquinoxalina-2,3-diona inibiu o acto de lamber induzido pela formalina em uma maneira dependente da dose tanto na fase inicial (0-5 minutos; Fig. 20A) da resposta à dor (lamber) como na fase tardia (15-50 minutos; Fig. 20B) da resposta do acto de lamber, à dor, indicando potente eficácia antimociceptiva neste modelo animal, da dor crónica.
Estes resultados demonstram que a 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-di-çloro-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-diona e 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona são eficazes no tratamento da dor crónica induzida pela 165 injecção de formalina subcutânea. Uma vez que ambos os compostos são antagonistas no local da glicina do receptor de NMDA, os resultados sugerem que o bloqueio do local da glicina do receptor de NMDA por antagonistas da glicina representa um método inovador de tratamento da dor crónica em um mamífero. Uma vez que os antagonistas da glicina da presente invenção não têm efeitos colaterais comportamentais adversos (como PCP) comuns aos outros bloqueadores dos receptores de NMDA, esta invenção fornece novos e grademente melhorados medicamentos para tratar a dor crónica em mamíferos, incluindo (e preferivelmente) os seres humanos.
Exemplo 73. A solubilidade de Sais de Colina Comparada com os Sais de Potássio de 1, 4-Di-hidroç[uinoxalina-2,3-dionas. 5-Cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (composto de referência) é insolúvel em água, mas dissolve-se na presença de 4 equivalentes de KOH (ou 5 equivalentes de NaOH).. O pH da solução é de 12,7. Este sal permanece solúvel quando o pH é reduzido para 11,9 por adição de 1 equivalente de ácido acético. A adição adicional de 1 equivalente de ácido acético causa a formação de um precipitado. A pH 11, a precipitação está essencialmente completa.
Observações espectroscópicas (300 MHz 1 RMN, FTIR) e as determinações do ponto de fusão sugerem que o pH precipitado é o sal mono-K ou mono-Na+ de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona, sugerindo que os mono-sais são muito insolúveis em água.
Inesperadamente, foi descoberto que 5-cloro-7-trifluorometil-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pode ser facilmente dissolvido em 1 166 ou 2 equivalentes de hidróxido de colina. Quando 5-cloro-7-trifluorometil-1, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é dissolvido em 1 equivalente de colina hidróxido seguido pela adição de ácido acético, não se forma um precipitado até o pH ser de 9,4. Assim, a dissolução do 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em 1 equivalente de hidróxido colina leva ao sal de mono-colina, que, ao contrário dos sais de sódio e de potássio, é muito solúvel em água. Veja a figura 21. 0 mono-sal colina foi isolado por liofilização da solução. Um pó seco castanho aclarado, foi obtido. A água pode ser adicionada para dar uma solução solúvel de 90 mg/1 mL de água. O pó instantaneamente dissolvido na água para dar uma solução levemente castanha, clara. Assim, o sal de mono-colina de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pode ser isolado em forma pura.
Em uma segunda experiência, foi determinado que o sal de mono-colina de 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona também é altamente solúvel em água. Após a dissolução deste composto em 1 equivalente de hidróxido de colina, a adição de ácido acético, não provoca a ocorrência de um precipitado até o pH alcançar cerca de 8.
Assim, os sais de amónio altamente solúveis em água de dionas de quinoxalina podem ser preparados. Uma vez que a solubilidade da água é uma condição prévia para a utilização terapêutica humana, esta descoberta representa um avanço significativo na tecnologia.
Exemplo 74. Eormalação de 5-Nibro~6,7-dicloro-l,4-di-hidro-qainoxalina-2 r 3-dion.a em Tris (Trometamina) . 167
Uma solução de 5 mg/mL de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foi preparada pela dissolução de 5-nitro-6,7-quinoxalina-2,3-diona em um solução aquosa contendo 10% de polietilenoglicol 400 (PEG-400), 0,45% de Tween-80 e 0,18 M de Tris (trometamina) para dar uma concentração final de 5 mg/mL de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. A 5-nitro-6,7-dicloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona facilmente dissolvida nesta formulação. A solução foi esterilizada em autoclave e foi verificada como sendo estável durante pelo menos dois meses. Espera-se que esta solução seja estável durante pelo menos 1-2 anos. Uma solução de 10 mg/mL de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foi preparada pela dissolução do composto em uma solução contendo 50% de PEG-400, 0,5% de Tween-80 e 0,1 M de Tris (trometamina). A 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona dissolveu-se prontamente nesta solução por aquecimento a 60-100 °C. A solução foi autoclavada e foi verificada como sendo estável pelo menos durante 2 meses. Espera-se que esta solução seja estável durante pelo menos 1-2 anos. Uma solução de 5 mg/mL de S-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona também foi preparada sem PEG-400, por se dissolver o composto em uma solução contendo 0,05 de Tris (trometamina), 0,5% de Tween-80 e 5% de glicose. A solução foi esterilizada e verificou-se ser estável durante pelo menos dois meses. Espera-se que esta solução seja estável durante pelo menos 1-2 anos.
Exemplo 75. Formulação de 5-cloro-7-tr±£luorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em bis-tris-propano (composto de referência).
Uma solução de 10 mg/mL de 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foi preparada pela dissolução do 168 composto em 0,1 M de bis-tris-propano, 50% de PEG-400 ou propilenoglícol, 0,75 % de Tween-80. O composto dissolvido facilmente por aquecimento em um banho de água fervente. A solução foi autoclavada, e verificou-se como sendo estável durante pelo menos 2 meses. O composto na solução de bis-tris-propano é esperado como sendo estável durante pelo menos 1-2 anos.
Exemplo 76. Atividade sedativa/hipnótica de (composto de referência) 5, 7-dicloro-l, 4-d±-h±droqTi±noxalxna-2,3-diona e 6,7-dicloro-1,4-di-hidroqu£aoxalíaa-2,3-dioaa ao ao teste de reflexo correcto no rato.
Quando os ratos são virados sobre as suas costas, vão voltar para trás eles próprios pelos os seus pés imediatamente. Os fármacos hipnóticos sedativos ou fármacos anestésicos, em doses baixas, vão causar um atraso no reflexo correcto ou, em doses mais elevadas, eles farão com que o animal possa permanecer nas suas costas por um período prolongado de tempo. As experiências foram conduzidas para determinar o efeito do 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e o seu análogo 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona sobre o reflexo correcto nos murganhos depois de injecçâo intraperitoneal. As duas quinoxalinadionas foram comparadas com a cetamina, um conhecido bloqueador de canal de NMDA com actividade anestésica.
Os ratos machos Swiss/Webster (25-30g) foram injectados intraperitonealmente com 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona ou 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona em DMSO (1 μΐ/g) , ambas em uma dose de 50 mg/kg, ou com 50 mg/kg de cetamina em solução salina (1 μΐ/g)- O reflexo correcto foi testado por se voltarem os animais para as suas costas, a intervalos de 5 minutos. 169 0 efeito do fármaco sobre o reflexo correcto foi classificado como se segue: Os próprios animais correctos imediatamente depois de se voltarem foram classificados como 0; Os próprios animais correctos entre 1 e 2 segundos foram classificados como 1; Os próprios animais correctos entre 2 e 10 segundos foram pontuados como 2; e os próprios animais não correctos depois de 10 segundos foram classificados como 3. Treze animais foram testados no grupo de 5,7-dicloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 10 animais foram testados no grupo de 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 10 animais foram testados no grupo de cetamina. A Figura 22A mostra os efeitos dos três fármacos no reflexo correcto. Cinquenta mg/kg de 5r7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina- 2.3- diona mostrou uma forte e duradoura inibição do reflexo correcto. Em contrapartida, 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina- 2.3- diona foi completamente inactiva com a mesma dose (50 mg/kg). A cetamina, a 50 mg/kg apresentou uma curta inibição de actuação do reflexo correcto ao longo de aproximadamente de 15 minutos. A cetamina não atingiu o grau de inibição do reflexo correcto visto com 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Assim, o antagonista da glicina/NMDA 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina- 2.3- diona é um composto sedativo/hipnótico e anestésico com uma potência consideravelmente mais elevada do que a cetamina, um agente anestésico usado clinicamente. Uma vez que a cetamina actua no local de PCP do receptor de NMDA, tem efeitos colaterais comportamentais como PCP. 5,7-Dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é um antagonista da glicina e portanto não tem efeitos colaterais como PCP.
Uma vez que as afinidades de ligação de 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina -2,3-diona e 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina- 2.3- diona nos receptores de glicina, cainato e AMPA não são substancialmente diferentes entre os dois compostos, concluiu-se que a diferença entre os compostos em relação ao seu efeito sedativo/hipnótico se deve ao facto de que a 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pode penetrar na barreira do sangue/cérebro, enquanto que a 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina- 2.3- diona não pode. Estes achados estendem-se a observações anteriores de que 5,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é altamente activa na prevenção de convulsões induzidas pelo som, em murganhos DBA-2, enquanto que a 6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona é completamente inactiva.
Conclui-se que uma substituição na posição 5 no sistema de anel da quinoxalinadiona é fundamental para concretizar a actividade in vivo depois da administração sistémica incluindo a actividade sedativa/hipnótica e anticonvulsiva. A presente invenção é dirigida a esta descoberta.
Exemplo 77. Discriminação de PCP no Ratos com 5-cloro-7-trifluoremetil-1f 4-di-hidro<piinoxalina-2 ,3-diona (composto de referência) e 5-nitro-6,7-decloro-l,4-di-h±droqninoxalina-2,3-diona. A fenciclidina (PCP) é um importante fármaco de abuso e produz uma intoxicação inquietante, mesmo quando tomado em doses sub-anestésicas (Balster, R.L., "The behavioral pharmacology of phencyclidine," em Psychopharmacology: The Third Generation of Progress, Meltzer, H.Y., editor, Raven Press, Nova Iorque, páginas 1573-1579 (1987)}. Um modelo animal tem sido desenvolvido, que é vaticinador da capacidade dos fármacos de produzirem uma intoxicação como PCP em seres humanos. 0 modelo utiliza processos 171 de terino da discriminação do fármaco para ensinar os animais a perceberem a intoxicação por PCP. Todos os dias, os ratos que foram treinados para erguerem a alavanca para o reforço de alimentos devem seleccionar quais das duas alavancas nas suas gaiolas está correcta. Os únicos estímulos que têm para seleccionar a alavanca correcta é a sua capacidade para detectar se eles receberam uma injecçâo de PCP ou do veículo. Após cerca de dois meses de treinamento, os ratos tornaram-se muito bons em discriminar o PCP das injecções de veículo e podem depois ser testados com outros fármacos para determinar se eles são discriminados como PCP.
Quando testados neste procedimento, outros fármacos que são conhecidos para produzir uma intoxicação como PCP substituída por PCP. Esses fármacos incluem vários análogos de PCP, tais como a cetamina, fármaco agonista de sigmaN-alilnormetazocina e os dioxolanos 1,3-substituídos, dexoxadrol e etoxadrol (Brady et al. , Pharm. Biochem. Behav. 17:291-295 (1982); Brady et al.r Science 212:178-180 (1982); Brady et al. , J. Pharm. Desp. Ther. 220:56-62 (1982); Slifer e Balster, Subst. Alcohol Actions/Misuse 5:273-280 (1984) ; Balster e Willetts, "Receptor mediation of the discriminative stimulus properties of phencycl id ine and sigma-opioid agonists," em Mecanismos de Transdução de Estímulos de Fármacos, Colpaert e Balster, editores, Springer, Berlim, páginas 122-135 (1988)) .
Para este estudo, os ratos treinados para discriminarem 2 mg/kg de veículos de solução salina de PCP foram testados com 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hídroquinoxaIina-2,3-diona e 5-nitro-6,7-dicloro-1,4-di-hi.dr.Qquinoxalina-2,3-diona. A variação da dose de cada composto foi cuidadosamente seleccionada para assegurar que 172 uma dose suficientemente elevada para produzir efeitos sobre o cérebro e o comportamento fosse testada. Métodos
Os sujeitos foram seis ratos adultos machos Sprague-Dawley (COBS CD, Charles River Farms, Wilmington, DE), alojados individualmente, e mantidos em um regime alimentar restrito.
Aparelho. Sessões experimentais foram conduzidas em câmaras operantes de 2 alavancas, comerciais, de ratos contidas com cubículos de atenuação de som e luz. As câmaras foram equipados com dispensadores de granulado para 45 mg de granulado. Um estímulo de luz sinalizou quando as sessões estavam em andamento.
Treinamento. Antes de iniciar este estudo, os ratos foram treinados para pressionar a alavanca para o reforço alimentar sob um horário de 32 de rácio fixado durante as sessões de 30 minutos diárias (segunda a sexta-feira). Em sessões de formação, a resposta a apenas uma das alavancas foi reforçada; as respostas sobre a alavanca incorrecta repõem o requisito de rácio fixado para a alavanca boa. Durante a formação, cada alavanca foi associada tanto a 2 mg/kg de PCP ou de injecção de salina. As sessões de treinamento de PCP e de salina ocorreram em uma sequência de dupla alternância. O treinamento foi continuado até os sujeiros começarem cada sessão sobre a alavanca correcta durante quatro sessões consecutivas. Após o treino estar completo (2-3 meses), foi iniciada a fase de ensaios.
Testes. Os testes de generalização foram realizados duas vezes por semana (terça-feira e sexta-feira). Entre as sessões de teste, os 173 animais foram fornecidos de formação continuada com PCP e ínjecções de salina. Os testes foram conduzidos, se na sessão de treinos anterior, o primeiro rácio fixado foi na alavanca correcta e globalmente, houve 85% mais de respostas na alavanca correcta. Nas sessões de ensaio, as respostas em ambas as alavancas foi reforçada. Os testes com 2,0 mg/kg de PCP e salina foram realizados no inicio de cada determinação de curva de efeito da dose. Os testes foram conduzidos com PCP (0,5, 1,0, 2,0, 4,0, e 8,0 mg/kg) , 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (6,0, 12,5 e 25 mg/kg) e 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona (2,0, 4,0, 6,0, 8,0 e 16,0 mg/kg). Os testes com 0,5 mL/kg de veiculo de DMSO foram também realizados antes dos testes de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona. Fánaacos. Fencyclidina HC1 foi obtida a partir do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas. Foi dissolvido em solução salina e administrado em 1,0 mL/kg intraperitonealmente, 15 minutos antes das sessões de formação e de ensaio. As doses referem-se ao sal de HC1. 5-Cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foram dissolvidos em DMSO tal que o volume de injecção para todas as doses foi de 0,5 mL/kg. Ambos os 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2, 3-diona e 5-nitro-6,7-dicloro-l, 4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona foram injectados intraperitonealmente, 40 minutos antes das sessões de teste.
Análises de dados. O grau de similaridade do fármaco de teste para 2,0 mg/kg de PCP é reflectido na percentagem média de respostas sobre a alavanca de PCP. Efeitos não específicos no comportamento são revelados em diferenças nas taxas médias de resposta dos testes 174 de controlo de salina. Quando as taxas de resposta durante os testes com elevadas doses de fármaco foram reduzidas para menos de 0,05/segundo, a percentagem de resposta da alavanca de PCP para esse sujeito para esse teste não foi incluída no meio do grupo. Isso foi feito, uma vez que é difícil interpretar os dados de selecção da alavanca quando os sujeitos são severamente comprometidos.
Resultados
Os resultados para ambas as 5-cloro-7-trifluorometil-l, 4-di-hidroquinoxalina-2, 3-diona e 5-nitro-6,7-dicloro-l, 4-di-hidro-quinoxalina-2,3-diona são mostrados nas figuras 23A e 23B. Nas porções esquerdas das figuras estão os resultados dos testes de controlo com 1,0 mL/kg de salina, 2 mg/kg de PCP e 0,5 mL/kg de DMSO. Ambos a salina e o DMSO produziram 0% de resposta à alavanca de PCP em cada ocasião na qual foram testados (parte superior do painel). 0 PCP, quando testado antes de cada uma das determinações da curva de resposta da dose, rendeu 100% de resposta à alavanca de PCP. Esta precisão consistente é típica deste procedimento de discriminação. As taxas de resposta depois da salina, PCP e DMSO (painel inferior) foram um pouco rnais variáveis, mas não houve efeito claro quer de PCP ou de DMSO para produzir taxas de resposta diferentes daquelas nos testes de controlo de salina.
Quando doses diferentes de PCP foram testadas, um aumento relacionado com a dose na resposta à alavanca de PCP foi produzida. A 2 mg/kg e superior, ocorreu 100% de generalização. Apenas a dose de 8 mg/kg de PCP diminuiu as taxas de resposta, mostrando a especificidade deste procedimento para efeitos de estímulo discriminativos como PCP de doses baixas. 175
Nem 5-cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona nem 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-díona produziu qualquer resposta à alavanca de PCP a qualquer dose testada. 5-Cloro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona produziu, efeitos diminuidos na taxa de resposta associados a doses de 12,5 e 25 mg/kg. 5-Nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona produziu efeitos decrescentes na taxa de resposta a doses de 6,8 e 16 mg/kg. Considerando a variabilidade nestes dados, não se pode concluir que a 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foi confiantemente mais potente do que a 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona para efeitos de taxa de resposta. No entanto, é evidente que uma variação na dosagem comportamentalmente activa de ambos os compostos, foi avaliada.
Discussão e conclusões
Ambas as 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona foram completamente desprovidos de efeitos de estímulos discriminativos como PCP. Neste aspecto eles diferem radicalmente a partir dos antagonistas de NMDA não competitivos no local de PCP, tal como PCP, dizocilpina, e cetamina (+)-N-alilnormetazocina, que substitui completamente para o PCP neste procediemnto (Brady et ai., Pharm. Biochem. Behav. 17:291-295 (1982); Brady et al., Science 212:178-180 (1982); Willetts e Balster, Eur. J. Pharm. 146:167-169 (198.8)). A capacidade dos compostos de teste para produzir efeitos como PCP em ratos é preditiva da sua capacidade de produzir efeitos psicotomiméticos como PCP e responsabilidade de abuso nos seres humanos. Assim, estes dados poderiam apoiar a conclusão de que a 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e a 5- 176 nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona são desprovidos destes efeitos secundários como PCP. Por outro lado, não se pode concluir a partir desses dados que estes compostos podem não ter outros efeitos colaterais, só que não será de esperar que sejam muito semelhantes aos produzidos pelo PCP.
Exemplo 78. Ausência de Estimulação Motora como PCP por 5-Nitro-6, 7-dicloro-l, 4-di-hidroç[u±noxalina-2,3-diona em Murganhos
Introdução OS antagonistas do receptor de NMDA, em particular os bloqueadores do canal de NMDA, provocam uma estimulação comportamental em roedores (Koek et al., J. Pharmacol. Exptl. Ther. 245:969 (1988)). Pensa-se que a estimulação comportamental sustenta os efeitos colaterais psicotomiméticos de PCP no homem (Koek et al., J. Pharmacol. Exptl. Ther. 245:969 (1988))/ Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)). A estimulação comportamental é particularmente acentuada, com os bloqueadores do canal de NMDA, tal como MK801 e PCP, mas também é causada pelos antagonistas de NMDA competitivos, tais como CGS19755 (Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)). A fim de testar se 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona tem efeitos estimulantes comportamentais em roedores, o composto foi testado em um ensaio de actividade locomotora. Verificou-se que a 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, com doses até níveis anestésicos, não induziu a estimulação comportamental, como se pensava pela actividade locomotora. Em contrapartida, MK081, em doses sub-anestésicas, causou um forte estimulo ao comportamento locomotor. Estes resultados sugerem que a 177 5-nitro-6, 7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona pode não ter efeitos estimulantes comportamentais como PCP. Má todos e Materiais
Os murganhosmachos Swiss/Webster (25-30 g) foram obtidos a partir de Simonsen e .alojados em grupos de 8-10, em uma sala com temperatura controlada e em um ciclo de 12 horas claro/escuro. Comida e água foram fornecidas à vontade. A actividade locomotora foi testada usando um aparelho de actividade locomotora Omnitech. Os animais foram injectados intraperitonealmente (i.p.), quer com DMSO ou 5-nitro-6,7-dicloro-1,4-di-hidroquínoxalina-2,3-diona dissolvido em DMSO em doses de 0,1, 0,25, 0,5, 1 e 5 mg/kg. 0 volume da injecção foi de 1 mL/kg. Os animais foram depois colocados na câmara de actividade locomotora e o seu comportamento locomotor foi registado durante 4 sucessivos 15 minutos. Outros animais foram injectados (i.p.) quer com soro fisiológico ou MK801 em soro fisiológico em doses de 0,1, 0,25, 0,5, 1 e 5 mg/kg seguido pela gravação da actividade locomotora.
Resultados A injecção de MK801 (i.p.) nos murganhos Swiss/Webster produziu um aumento dependente da dose na actividade locomotora (figura 24). 0 nivel mais elevado de actividade locomotora foi registado no segundo intervalo de quinze minutos. Portanto, a actividade locomotora, no segundo intervalo de quinze minutos após a injecção de fármaco é apresentada na Figura 24. O pico da actividade locomotora foi produzido por uma dose de 0,25 mg/kg de MK801. Um 178 aumento adicional da dose de MK801 resultou em menor actividade locomotora em relação à dose de 0,25 mg/kg. Uma dose de 5 mg/kg de MK801 resultou na supressão da actividade locomotora abaixo dos níveis basais. Em contrapartida, 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não causou qualquer estimulação da actividade locomotora acima dos níveis basais (Figura 24). Uma dose de 5 mg/kg de 5-nítro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona baixou a actividade locomotora para níveis basais inferiores. As doses mais elevadas de 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona também foram testadas (10, 20 e 50 mg/kg). Em nenhuma dose houve estimulação da actividade locomotora. Na dose de 50 mg/kg, os animais tiveram uma perda total do reflexo correcto, 30 minutos após a injecção i.p.. Houve também uma notável perda de resposta à dor sugerindo actividade anestésica de 5-nitro-6,7-dicloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona na dose de 50 mg/kg.
Conclusão 5-Nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não produziu estimulação da actividade locomotora em murganhos. Em contrapartida, o bloqueador de canal de NMDA, MK-801, produziu uma forte estimulação da actividade locomotora consistente com os efeitos comportamentais como PCP causados por este composto. A ausência dos efeitos estimulantes comportamentais como PCP sugere que o antagonista de NMDA/glicina, 5-nitro-6,7-dicloro-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona não tem os efeitos estimulantes comportamentais adversos que têm atormentado o desenvolvimento clínico de outras classes de antagonistas de NMDA.
Lisboa, 12 de Novembro de 2008

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição farmacêutica compreendendo um composto que tem a Fórmula H
/ ou um tautómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; em que R1 é flúor, bromo, iodo, amino, hidroxilamino, um grupo amino substituído por um grupo acilo C2-6, (por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo, e hexanoílo), um grupo alquilo C1-6 substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo, ou nitro; R2 é amino, hidroxilamino, um grupo amino substituído por um grupo acilo C2-6, (por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo, e hexanoílo), nitro, alquilo C1-6 substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo, ou halo; R3 é halo, amino, hidroxilamino, um grupo amino substituído por um grupo acilo C2-e, (por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo, e hexanoílo) ou um alquilo C1-6 substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo; e R4 é hidrogénio; e um portador farmaceuticamente aceitável 2 para 'o fabrico de um medicamento para o tratamento' e/ou a prevenção de: (a) perda neuronal associada a acidente vascular cerebral, isquémia, trauma de CNS, hipoglicémia ou cirurgia; (b) uma doença neurodegenerativa seleccionada da doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, doença de Buntington e doença de Down; (c) dor crónica; (d) ansiedade; (e) convulsões, ou (f) psicose.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida perda neuronal ocorre como um resultado de: (a) bolhas de ar que se alojam no cérebro durante ou imediatamente depois da cirurgia . (b) cirurgia de bypass cardiopulmonar; (c) cirurgia endarterectomia da catótida; ou (d) múltiplos acidentes vasculares cerebrais, resultando em demência.
3. Utilização de uma composição farmacêutica compreendendo um composto com a Fórmula R1
ou um tautómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; em que 3 R1 é flúor, bromo, iodo, amino, hidroxilamino, um grupo amino substituído por um grupo acilo C2-6, (por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoilo, pentanoílo, e hexanoílo), um grupo alquilo C1-6 substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo, ou nitro; R2 é amino, hidroxilamino, um grupo amino substituído por um grupo acilo C2-6, (por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoilo, pentanoílo, e hexanoílo), nitro, alquilo Ci-e substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo, ou halo; R3 é halo, amino, hidroxilamino, um grupo amino substituído por um grupo acilo C2-e, (por exemplo, grupos de acetilo, propionilo, butanoilo, pentanoílo, e hexanoílo) ou um alquilo C1-6 substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo; e R1 é hidrogénio; e um portador farmaceuticamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de: (a) indução anestésica, ou (b) indução der um efeito hipnótico. 1 Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida composição compreende um composto, em que R1 é flúor, bromo, iodo ou nitro, R2 é halo e R3 é halo ou alquilo C1-6 substituído por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo. 4
5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, a referida composição compreendendo um composto em que pelo menos um de R1 - R3 é amino ou C2-e acilamino.
6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a referida composição compreende um composto que é seleccionado a partir de 6,7-dicloro-5-nitro-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3,-diona, 6,7-difluoro-5-nitro~l,4-di-hidro- quinoxalina-2,3,-diona, 6-cloro-5-nitro-7-bromo-l,4-di-hidro-quinoxalina-2,3,-diona, 6-cloro-5-nitro-7-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, 5-bromo-6,7-difluoro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, 6,7-dibromo-5-nitro-l, 4-di-hidro-quinoxalina-2,3,-diona, 5-amino-6,7-dibromo-l,4-di-hidro- quinoxalina-2,3,-diona, 5-amino-6,7-dicloro-l,4-di-hidro- quinoxalina-2,3,-diona, 7-cloro-6-nitro-5-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, 6-amino-7-cloro-5-trifluoro-metil-1,4-di-hidroquinoxaline-2,3,-diona, 7-bromo-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, 6-amino-7-bromo-5-trifluorometil-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3, -diona, 7-fluoro-6-nitro-5-trifluorometil-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, 6-amino-7-fluoro-5-trifluorometil-l,4-di- hidroquinoxalina-2,3,-diona, 6,7-dicloro-5-hidroxilamino-l,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, e 6,7-dibromo-5-hidroxilamino-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3,-diona, ou um tautómero ou um seu salfarmaceuticamente aceitável.
7. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a referida composição compreende um composto que é seleccionado a partir do grupo composto de: 6,7-dibromo-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6,7-dicloro-5-nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 7-bromo-6-cloro-5-nitro-l,4- 5 di-hidroquinoxalina-2,3-diona, 6-cloro-7-trifluorometil-5- nitro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona e 5-bromo-6,7-difluoro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona,. ou um tautómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
8. Utilização de acordo cóm a reivindicação 7, em que a referida composição compreende 6,7-dicloro-5-nitro-l, 4-di-hidro- quinoxalina-2,3-diona, ou um tautómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
9. . Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida composição compreende 6,7-dibromo-5-nitro-l,4-di-hidro- quinoxalína-2,3-diona, ou um tautómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1-9, em que a referida composição compreende um sal de amónio de um composto de 1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona, tal como definido na referida reivindicação.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida composição compreende um sal de amónio, que é o sal de um composto amino seleccionado a partir do grupo composto de: tetra-Ci-s alquilamina, uma alcanolamina tri-Ci-g alquilo-Ci-g, uma trialquilamina C6~i2 aralquilo-Ci_s, etilenodiamina, dietilenotriamina, N-metiletanolamina, di-(2-etanol)amina, tri-(2-etanolamina), espermidina, espermina, um aminocarbo-hidrato, N-metilglucamína, arginina, uma N-Ci_6 alquilguanidina, uma N,N-di-Ci_6 alquilguanidina, uma N, NT-di-Ci_6 alquilguanidina, uma N, N, N' -tri-Ci-g alquilguanidina, uma Ν,Ν, N ' , N ’-tetra-Ci-é alquilguanidina, biguanidina, N-Ci-g alquilbiguanidina, uma N, 6 N-Ci-6 dialquilbiguanidina, uma N,N'-Ci-S dialquilbiguanidina, amidina, uma N-C1-4 alquilamidina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0 ] undec-7-eno e Tris.
12. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida composição compreende um sal de amónio, que é um de um sal de-colina, um sal tris; um sal bis-tris-propano,. um sal N-metilglucamina ou um sal de arginiha.
13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a referida composição compreende um sal tris de 5-nitro-6,7-dicloro-l, 4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a referida composição compreende o sal de N-metilglucamina de 5-nitro-6,7-dicloro-1,4-di-hidroquinoxalina-2,3-diona.
15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, em que a referida composição é adaptada para a administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica ou bucal. Lisboa, 12 de Novembro de 2008
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