ES2313714T3 - Antagonistas de receptores de glicina y uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN METODOS PARA EL TRATAMIENTO O LA PREVENCION DE LA PERDIDA NEURONAL ASOCIADA CON LA ISQUEMIA, TRAUMAS DEL CNS, HIPOGLICEMIA Y CIRUGIA, ASI COMO EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS INCLUYENDO LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, LA ESCLEROSIS LATERAL AMITROFICA, LA ENFERMEDAD DE HUNTINGTON, EL SINDROME DE DOWN, EL TRATAMIENTO O LA PREVENCION DE LAS CONSECUENCIAS ADVERSAS DE LA HIPEROACTIVIDAD DE LOS AMINOACIDOS EXCITATORIOS, ASI COMO EL TRATAMIENTO DE LA ANSIEDAD, EL DOLOR CRONICO, LAS CONVULSIONES, LA INDUCCION DE ANESTESIA Y EL TRATAMIENTO DE LA PSICOSIS, MEDIANTE LA ADMINISTRACION A UN ANIMAL QUE NECESITE DE DICHO TRATAMIENTO, DE UN COMPUESTO QUE TIENE UNA ALTA AFINIDAD PARA LA ZONA DE UNION DE LA GLICINA, CARECIENDO DE EFECTOS COLATERALES Y QUE CRUZA LA BARRERA DEL CEREBRO PARA LA SANGRE DEL ANIMAL. TAMBIEN SE PRESENTAN NUEVAS 1,4-DIHIDROQUINOXALINA-2,3-DIONAS, Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS DE LAS MISMAS. TAMBIEN SE PRESENTAN SALES DE AMONIO ALTAMENTE SOLUBLES DE 1,4-DIHIDROXIQUINOXALINA-2,3DIONAS.
Description
Antagonistas de receptores de glicina y uso de
los mismos.
La presente invención está en el campo de la
química médica. La presente invención se refiere a compuestos que
tienen alta afinidad por el sitio de unión a glicina, que carecen de
efectos secundarios de PCP y que atraviesan la barrera
hematoencefálica a altos niveles. En particular, la presente
invención se refiere al uso de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la
degeneración neuronal asociada a isquemia, estados fisiopatológicos
asociados a degeneración neuronal, convulsiones, ansiedad, dolor
crónico e inducir anestesia. La invención también se refiere al uso
de ciertas sales de amonio sumamente solubles de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas.
Se cree que el glutamato es el principal
neurotransmisor excitador en el cerebro. Hay tres subtipos
principales de receptores de glutamato en el SNC. Éstos se
denominan comúnmente receptores de cainato, AMPA y
N-metil-D-aspartato
(NMDA) (Watkins y Olverman, Trends in Neurosci.
7:265-272 (1987)). Se encuentran receptores de NMDA
en las membranas de prácticamente todas las neuronas en el cerebro.
Los receptores de NMDA son canales catiónicos activados por ligando
que permiten que permeen Na^{+}, K^{+} y Ca^{++} cuando se
activan mediante glutamato o aspartato (agonistas no selectivos,
endógenos) o mediante NMDA (un agonista selectivo, sintético) (Wong
y Kemp, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 31:401-425
(1991)).
El glutamato solo no puede activar el receptor
de NMDA. Con el fin de activarse mediante glutamato, el canal del
receptor de NMDA debe unirse en primer lugar a glicina en un sitio
de unión a glicina específico, de alta afinidad que está separado
del sitio de unión a glutamato/NMDA en la proteína receptora
(Johnson y Ascher, Nature 325:329-331 (1987)). Por
tanto, la glicina es un coagonista obligatorio en el complejo
receptor/canal de NMDA (Kemp, J.A., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:6547-6550 (1988)).
Además de los sitios de unión para
glutamato/NMDA y glicina, el receptor de NMDA porta otros varios
sitios de unión funcionalmente importantes. Éstos incluyen sitios
de unión para Mg^{++}, Zn^{++}, poliaminas, ácido araquidónico
y fenciclidina (PCP) (Reynolds y Miller, Adv. in Pharmacol.
21:101-126 (1990); Miller, B., et al.,
Nature 355:722-725 (1992)). El sitio de unión de PCP
(denominado ahora comúnmente receptor de PCP) está situado en el
interior del poro del ionóforo del complejo receptor/canal de NMDA
(Wong, E.H.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:7104-7108 (1986); Huettner y Bean, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:1307-1311 (1988); MacDonald,
J.F., et al., Neurophysiol. 58:251-266
(1987)). Con el fin de que PCP tenga acceso al receptor de PCP, en
primer lugar el canal debe abrirse mediante glutamato y glicina. En
ausencia de glutamato y glicina, PCP no puede unirse al receptor de
PCP aunque algunos estudios han sugerido que puede producirse una
pequeña cantidad de unión de PCP incluso en ausencia de glutamato y
glicina (Sircar y Zukin, Brain Res. 556:280-284
(1991)). Una vez que PCP se une al receptor de PCP, bloquea el flujo
iónico a través del canal abierto. Por tanto, PCP es un bloqueante
de canal abierto y un antagonista no competitivo de glutamato en el
complejo receptor/canal de NMDA.
Uno de los fármacos más potentes y selectivos
que se unen al receptor de PCP es el fármaco anticonvulsivo MK801.
Este fármaco tiene una K_{d} de aproximadamente 3 nM en el
receptor de PCP (Wong, E.H.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83: 7104-7108 (1986)).
Tanto PCP como MK801 así como otros ligandos del
receptor de PCP [por ejemplo dextrometorfano, ketamina y
N,N'-guanidinas disustituidas] tienen eficacia
neuroprotectora tanto in vitro como in vivo (Gill,
R., et al., J. Neurosci. 7:3343-3349 (1987);
Keana, J.F.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5631-5635 (1989); Steinberg, G.K., et
al., Neuroscience Lett. 89: 193-197 (1988);
Church, J., et al., en: Sigma and
Phencyclidine-Like Compounds as Molecular Probes in
Biology, Domino y Kamenka, eds., Ann Arbor: NPP Books, págs.
747-756 (1988)). La eficacia neuroprotectora bien
caracterizada de estos fármacos se debe en gran parte a su
capacidad para bloquear la entrada excesiva de Ca^{++} en las
neuronas a través de los canales del receptor de NMDA que se
sobreactivan mediante la liberación excesiva de glutamato en
condiciones de isquemia cerebral (por ejemplo en accidente
cerebrovascular, isquemia por paro cardiaco, etc.) (Collins, R.C.,
Metabol. Br. Dis. 1:231-240 (1986); Collins, R.C.,
et al., Annals Int. Med. 110:992-1000
(1989)).
Sin embargo, el potencial terapéutico de estos
fármacos de receptor de PCP como agentes de rescate de la isquemia
en accidente cerebrovascular se ha dificultado gravemente por el
hecho de que estos fármacos tienen fuertes efectos secundarios de
comportamiento de tipo PCP (efectos de comportamiento
psicotomiméticos) que parecen deberse a la interacción de estos
fármacos con el receptor de PCP (Tricklebank, M.D., et al.,
Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989); Koek, W.,
et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets y
Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988)). Estos efectos
secundarios de comportamiento de tipo PCP parecen haber producido
la retirada de MK801 del desarrollo clínico como agente de rescate
de la isquemia. Además, estos ligandos del receptor de PCP parecen
tener potencial de riesgo de drogadicción considerable tal como se
demostró mediante la propensión a dar lugar a drogadicción del
propio PCP.
Los efectos de comportamiento de tipo PCP de los
ligandos del receptor de PCP pueden demostrarse en modelos
animales: PCP y ligandos del receptor de PCP relacionados producen
una excitación del comportamiento (hiperlocomoción) en roedores
(Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol.
167:127-135 (1989)) y una catalepsia característica
en palomas (Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.
245:969 (1989); Willets y Balster, Neuropharmacology 27:1249
(1988)); en paradigmas de discriminación de fármacos, hay una fuerte
correlación entre la afinidad por el receptor de PCP de estos
fármacos y su potencia para inducir un comportamiento de respuesta
apropiado de PCP (Zukin, S.R., et al., Brain Res. 294:174
(1984); Brady, K.T., et al., Science 215:178 (1982);
Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 141:497
(1987)).
Los fármacos que actúan como antagonistas
competitivos en el sitio de unión a glutamato del receptor de NMDA
tales como CGS 19755 y LY274614 tienen también eficacia
neuroprotectora debido a que estos fármacos (como los ligandos del
receptor de PCP) pueden impedir el flujo excesivo de Ca^{++} a
través de receptor/canales de NMDA en la isquemia (Boast, C.A.,
et al., Brain Res. 442:345-348 (1988);
Schoepp, D.D., et al., J. Neural. Trans.
85:131-143 (1991)). Sin embargo, los antagonistas
competitivos del receptor de NMDA tienen también efectos
secundarios de comportamiento de tipo PCP en modelos animales
(excitación del comportamiento, actividad en pruebas de
discriminación de fármacos tipo PCP) aunque de manera no tan potente
como MK801 y PCP (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J.
Pharmacol. 167:127-135 (1989)).
Una forma alternativa de inhibir la activación
del canal del receptor de NMDA es usando antagonistas en el sitio
de unión a glicina del receptor de NMDA. Dado que la glicina debe
unirse al sitio de glicina con el fin de que el glutamato efectúe
la apertura del canal (Johnson y Ascher, Nature
325:329-331 (1987); Kemp, J.A., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6547-6550 (1988)), un
antagonista de glicina puede impedir completamente el flujo iónico
a través del canal del receptor de NMDA (incluso en presencia de una
gran cantidad de glutamato).
Estudios de microdiálisis in vivo
recientes han demostrado que en el modelo de isquemia focal de la
rata, hay un gran aumento en la liberación de glutamato en la
región isquémica del cerebro sin aumento significativo en la
liberación de glicina (Globus, M.Y.T., et al., J. Neurochem.
57:470-478 (1991)). Por tanto, teóricamente, los
antagonistas de glicina deben ser agentes neuroprotectores muy
poderosos, debido a que pueden impedir la apertura de los canales
de NMDA mediante el glutamato de manera no competitiva y por tanto
(a diferencia de los antagonistas competitivos de NMDA), no han de
superar las grandes concentraciones de glutamato endógeno que se
liberan en la región isquémica del cerebro.
Además, debido a que los antagonistas de glicina
no actúan ni en los sitios de unión de glutamato/NMDA ni de PCP
para impedir la apertura del canal de NMDA, estos fármacos podrían
no producir el efecto secundario de comportamiento de tipo PCP
observado tanto con ligandos del receptor de PCP como con
antagonistas competitivos del receptor de NMDA (Tricklebank, M.D.,
et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135
(1989); Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969
(1989); Willets y Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988);
Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol.
167:127-135 (1989); Zukin, S.R., et al.,
Brain Res. 294:174 (1984); Brady, K.T., et al., Science
215:178 (1982); Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol.
141:497 (1987)). Recientes estudios han sugerido que los
antagonistas de glicina pueden carecer de hecho de efectos
secundarios de comportamiento de tipo PCP, en los que se inyectaron
antagonistas de glicina directamente en los cerebros de roedores
sin dar como resultado comportamientos de tipo PCP (Tricklebank,
M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135
(1989)).
Sin embargo, ha habido dos problemas principales
que han impedido el desarrollo de antagonistas de glicina como
agentes neuroprotectores clínicamente útiles:
- A.
- la mayoría de los antagonistas de glicina disponibles con afinidad de unión al receptor relativamente alta in vitro tal como el ácido 7-Cl-quinurénico (Kemp, J.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6547-6550 (1988)), el ácido 5,7-dicloroquinurénico (McNamara, D., et al., Neuroscience Lett. 120:17-20 (1990)) y el ácido indol-2-carboxílico (Gray, N.M., et al., J. Med. Chem. 34: 1283-1292 (1991)) no pueden atravesar la barrera hematoencefálica y por tanto no tienen utilidad como agentes terapéuticos;
- B.
- el único antagonista de glicina disponible que penetra suficientemente en la barrera hematoencefálica, el fármaco HA-966 (Fletcher y Lodge, Eur. J. Pharmacol. 151:161-162 (1988)), es un agonista parcial con una afinidad sólo micromolar por el sitio de unión a glicina. La eficacia neuroprotectora para HA-966 in vivo no se ha demostrado por tanto ni se ha demostrado para los otros antagonistas de glicina disponibles debido a que carecen de biodisponibilidad in vivo.
Ha habido varios informes en la bibliografía de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
sustituidas que son útiles para tratar estados fisiopatológicos
mediados por los receptores de glicina, NMDA y que no son de NMDA.
Por ejemplo, la patente estadounidense número 4.975.430 (1990), da
a conocer compuestos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada X es
independientemente nitro o ciano y en la que cada Y es
independientemente H, alquilo inferior, alcoxilo inferior o
CF_{3}. Según se informa, estos compuestos son útiles para el
tratamiento de estados neuronales asociados a la estimulación del
receptor de
NMDA.
\vskip1.000000\baselineskip
La patente estadounidense número 3.962.440
(1976), da a conocer compuestos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
que tienen la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} puede ser
hidrógeno o metilo, R_{n} puede ser alquilo inferior, alcoxilo
inferior, alquiltio inferior, ciclopropilo, nitro, ciano, halógeno,
fluoroalquilo de C_{1}-C_{2}
(trifluorometil)amino o amino sustituido y n puede ser 0, 1 ó
2. Según se informa, estos compuestos son útiles como agentes
hipnóticos.
\vskip1.000000\baselineskip
La patente estadounidense número 4.812.458
(1989) da a conocer compuestos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
que tienen la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} es halógeno,
ciano, trifluorometilo, etinilo o N_{3} y R^{2} es
SO_{2}-alquilo C_{1-3},
trifluorometilo, nitro, etinilo o ciano. Según se informa, estos
compuestos son útiles para el tratamiento de indicaciones
producidas por hiperactividad de los neurotransmisores excitadores,
particularmente los receptores de quiscualato, y como
neurolépticos.
\newpage
La patente estadounidense número 4.659.713
(1987) da a conocer compuestos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
que tienen la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X representa hidrógeno,
cloro, bromo, fluoro, yodo, triclorometilo, diclorofluorometilo,
difluorometilo o trifluorometilo, y n representa 1 ó 2. Según se
informa, estos compuestos son útiles para el control de la
coccidiosis en
animales.
\vskip1.000000\baselineskip
La patente estadounidense número 4.948.794
(1990) da a conocer compuestos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
que tienen la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R^{1} es alquilo C_{1-12},
que puede estar opcionalmente sustituido con hidroxilo, formilo,
carboxilo, ésteres carboxílicos, amidas o aminas, cicloalquilo
C_{3-8}, arilo, aralquilo; y en la que R^{6} es
hidrógeno, halógeno, CN, CF_{3}, NO_{2} u OR', en el que R' es
alquilo C_{1-4} y R^{5}, R^{7} y R^{8} es
hidrógeno, siempre que R^{6} no sea CF_{3}, OCH_{3}, NO_{2},
C^{1} o Br cuando R^{1} es CH_{3}; o
R^{6} y R^{7} son independientemente
NO_{2}, halógeno, CN, CF_{3} u OR', en el que R' es alquilo
C_{1-4} y R^{5} y R^{8} son cada uno
hidrógeno; o
R^{5} y R^{6} forman juntos un anillo
aromático condensado adicional, que puede estar sustituido con
halógeno, NO_{2}, CN, CF_{3} u OR', en el que R' es alquilo
C_{1-4}; o
R^{7} y R^{8} forman juntos un anillo
aromático condensado adicional, que puede estar sustituido con
halógeno, NO_{2}, CN, CF_{3} u OR', en el que R' es alquilo
C_{1-4} y R^{5} y R^{6} son independientemente
hidrógeno, halógeno, CN, CF_{3}, NO_{2} u OR', en el que R' es
alquilo C_{1-4}. Según se informa, estos
compuestos son útiles para el tratamiento de indicaciones producidas
por hiperactividad de los neurotransmisores excitadores,
particularmente los receptores de quiscualato, y como
neurolépticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Yoneda y Ogita, Biochem. Biophys. Res. Commun.
164:841-849 (1989), dan a conocer que las siguientes
1,4-dihidroquinoxalin-1,2-dionas
desplazan de manera competitiva la unión insensible a estricnina de
[^{3}H]glicina, sin afectar a los otros sitios de unión del
complejo del receptor de NMDA:
Según los autores, las relaciones de
estructura-actividad entre quinoxalinas indican
claramente que ambos grupos cloruro de las posiciones 6 y 7 en el
anillo de benceno son cruciales para la potencia de antagonista
contra los sitios de Gly. La eliminación de un cloruro de la
molécula da como resultado una reducción de 10 veces en la afinidad
por los sitios de Gly.
Kleckner y Dingledine, Mol. Pharm.
36:430-436 (1989) dan a conocer que la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
son antagonistas más potentes de cainato que la glicina, pero la
sustitución del Cl en la posición 6 y especialmente en las
posiciones 6 y 7 aumenta la potencia en el sitio de glicina.
Además, los autores sugieren que los antagonistas del sitio de
glicina podrían ser eficaces contra neuropatologías mediadas por el
receptor de NMDA.
Rao, T.S. et al., Neuropharmacology
29:1031-1035 (1990), dan a conocer que la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
7-ciano-6-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
antagonizan respuestas mediadas por sitios de reconocimiento de
glicina asociados a NMDA in vivo.
Pellegrini-Giampietro, D.E.
et al., Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286
(1989), dan a conocer que la
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pueden antagonizar las respuestas a L-glutamato
interaccionando con los sitios de reconocimiento de glicina del
complejo de canal iónico de receptor de NMDA.
Ogita y Yoneda, J. Neurochem.
54:699-702 (1990) dan a conocer que la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es un antagonista competitivo específico para los sitios de unión a
[^{3}H]glicina insensibles a estricnina en el complejo del
receptor de NMDA. Según los autores, los dos radicales cloruro en
las posiciones 6 y 7 en el anillo de benceno de la quinoxalina son
cruciales para la potencia antagonística contra los sitios de unión
a glicina.
Kessler, M. et al., Brain Res.
489:377-382 (1989) dan a conocer que la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhiben la unión de [^{3}H]glicina a los sitios de unión a
glicina insensibles a estricnina asociados a los receptores de
NMDA.
La publicación de solicitud de patente europea
número 0 377 112, publicada el 11 de julio de 1990, da a conocer
compuestos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
que tienen la fórmula:
en la que, entre otros, R^{1}
puede ser hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, aralquiloxilo,
cicloalquilalcoxilo, cicloalcoxilo o aciloxilo; y R^{5}, R^{6},
R^{7} y R^{8} pueden ser independientemente hidrógeno, nitro,
halógeno, ciano, trifluorometilo, SO_{2}NR'R', SO_{2}R' u OR',
en el que R' es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.
Según se informa, estos compuestos son útiles para el tratamiento de
indicaciones producidas por hiperactividad de los neurotransmisores
excitadores, particularmente los receptores de quiscualato, y como
neurolépticos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Lester, R.A. et al., Mol. Pharm.
35:565-570 (1989) dan a conocer que la
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
antagoniza respuestas mediadas por receptores de NMDA, mediante una
interacción competitiva del sitio de unión a glicina.
Patel, J. et al., J. Neurochem.
55:114-121 (1990) dan a conocer que la actividad
neuroprotectora de la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
se debe al antagonismo de la actividad de coagonista de la glicina
en el complejo receptor-canal de NMDA.
Horner, L. et al., Chem. Abstracts
48:2692 (1953) dan a conocer la
6,8-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc.:
1170-1176 (1962), dan a conocer la
6,7-dibromo-2,3-dihidroxiquinoxalina
(también conocida como
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona).
Honore, T. et al., Science
241:701-703 (1988), dan a conocer que la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
7-ciano-6-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
son potentes antagonistas del receptor de glutamato que no es de
NMDA.
Sheardown, M.J. et al., Eur. J.
Pharmacol. 174:197-204 (1989), dan a conocer que la
5,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es un potente antagonista del receptor de glicina insensible a
estricnina y que tiene propiedades anticonvulsivas. Sin embargo,
Sheardown et al. también dan a conocer que la
5,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
así como DNQX y CNQX tienen un mal acceso al sistema nervioso
central.
La publicación de solicitud internacional número
WO91/13878 da a conocer las siguientes
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
N-sustituidas que se unen al receptor de
glicina:
en la que R representa hidrógeno,
alquilo C_{1-6} o aralquilo y n es un número
entero desde 0 hasta 5; R^{4} representa hidrógeno o hidroxilo;
R^{5}, R^{6}, R^{7} y R^{8} representan independientemente
hidrógeno, nitro, halógeno, alcoxilo, ariloxilo, aralcoxilo,
alquilo C_{1-6} o arilo; R^{9} representa
hidrógeno, alquilo inferior o arilo; R^{10} representa hidrógeno
o alquilo, y sales farmacéuticamente aceptables de las
mismas.
Leeson et al., J. Med. Chem.
34:1243-1252 (1991) dan a conocer varios derivados
del antagonista de aminoácido excitador no selectivo ácido
quinurénico. También dan a conocer varias
quinoxalin-2,3-dionas
estructuralmente relacionadas que también son antagonistas de
glicina/NMDA pero que no son selectivos y son mucho menos potentes
que los derivados de ácido quinurénico. Las
quinoxalin-2,3-dionas tienen la
estructura:
en la que R es H,
5-Cl, 7-Cl,
5,7-Cl_{2}, 6,7-Cl_{2},
6,7-(CH_{3})_{2}, 6-NO_{2} o
6,7-(NO_{2})_{2}. También dan a conocer varios derivados
de
N-metilo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Swartz et al., Mol. Pharmacol.
41:1130-1141 (1992) dan a conocer que ciertas
benzapinas sustituidas y no sustituidas son antagonistas
competitivos de los canales del receptor de glutamato en neuronas
corticales en cultivo. Véase también la publicación de solicitud
internacional número WO92/11854 que da a conocer que los compuestos
de fórmula
en la que
R^{1}-R^{4} pueden ser hidrógeno,
perfluoroalquilo C_{1-3}, halógeno, nitro o ciano
y R^{5} puede ser hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-5}, son antagonistas del sitio de unión a
glicina en el complejo del receptor de
NMDA.
Sigue habiendo una necesidad de antagonistas de
glicina/NMDA potentes y selectivos, que
- \bullet
- carezcan de los efectos secundarios de comportamiento de tipo PCP comunes para los bloqueantes de canales de NMDA de tipo PCP tales como MK801 o para los antagonistas competitivos de los receptores de NMDA tales como CGS19755;
- \bullet
- muestren una eficacia antiisquémica potente debido a la naturaleza no competitiva de su antagonismo del glutamato en el receptor de NMDA;
- \bullet
- atraviesen la barrera hematoencefálica a niveles suficientes para la eficacia;
- \bullet
- tengan utilidad como anticonvulsivos novedosos con menos efectos secundarios que los bloqueantes de los canales de NMDA de tipo PCP o los antagonistas competitivos de NMDA;
- \bullet
- ayuden en la definición de la significación funcional del sitio de unión a glicina del receptor de NMDA in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere al descubrimiento de una
clase de compuestos que presentan alta afinidad por el sitio de
unión a glicina insensible a estricnina, que no presentan efectos
secundarios de PCP y que atraviesan la barrera hematoencefálica a
altos niveles. Esto es a diferencia de los informes en la
bibliografía de que otros compuestos, por ejemplo
HA-966 y
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
particulares, que o bien no atraviesan la barrera hematoencefálica
o bien lo hacen a bajos niveles. Además, muchos de estos compuestos
presentan baja afinidad de unión a otros sitios del receptor. Por
tanto, se dan a conocer en el presente documento compuestos que
tienen alta afinidad por el sitio de unión a glicina, que carecen de
efectos secundarios de PCP y que atraviesan la barrera
hematoencefálica a altos niveles. Por tanto, los compuestos de la
presente invención son extremadamente útiles para tratar estados
fisiopatológicos, sin toxicidad o efectos secundarios
significativos.
La invención se refiere al uso de tales
compuestos para la fabricación de un medicamento para tratar o
prevenir la pérdida neuronal asociada con accidente
cerebrovascular, isquemia, traumatismo del SNC, hipoglucemia y
cirugía, así como el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
incluyendo enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica,
enfermedad de Huntington y síndrome de Down, el tratamiento o la
prevención de las consecuencias adversas de la sobreestimulación de
los aminoácidos excitadores, así como el tratamiento de la ansiedad,
convulsiones, dolor crónico, psicosis y la inducción de
anestesia.
Tales compuestos tienen la fórmula representada
en la reivindicación 1.
La figura 1 de referencia representa un gráfico
de barras que demuestra la actividad locomotriz normal, control en
jerbos pretratados con solución salina. Se administraron inyecciones
intraperitoneales a jerbos control normales inmediatamente antes del
periodo de evaluación de la actividad locomotriz de seis horas. Se
utilizaron grupos de 6 jerbos cada uno y los datos se presentan como
la media \pm el error estándar.
La figura 2 de referencia representa un gráfico
de barras que demuestra los efectos del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la actividad locomotriz en jerbos control normales (barras en
blanco) y animales a los que se les administró 1,0 mg/kg del
compuesto (barras en negro). Se administraron inyecciones
intraperitoneales del compuesto a los jerbos inmediatamente antes
del periodo de evaluación de la actividad locomotriz de seis horas.
Se administraron inyecciones de solución salina a los animales
control. Se utilizaron grupos de 6 jerbos cada uno y los datos se
presentan como la media \pm el error estándar.
La figura 3 de referencia representa un gráfico
de barras que demuestra los efectos del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la actividad locomotriz en jerbos control normales (barras en
blanco) y animales a los que se les administraron 3,2 mg/kg del
compuesto (barras en negro). Se administraron inyecciones
intraperitoneales del compuesto a los jerbos inmediatamente antes
del periodo de evaluación de la actividad locomotriz de seis horas.
Se administraron inyecciones de solución salina a los animales
control. Se utilizaron grupos de 6 jerbos cada uno y los datos se
presentan como la media \pm el error estándar.
La figura 4 de referencia representa un gráfico
de barras que demuestra los efectos del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la actividad locomotriz en jerbos control normales (barras en
blanco) y animales a los que se les administraron 10 mg/kg del
compuesto. Se administraron inyecciones intraperitoneales del
compuesto a los jerbos inmediatamente antes del periodo de
evaluación de la actividad locomotriz de seis horas. Se
administraron inyecciones de solución salina a los animales control.
Se utilizaron grupos de 6 jerbos cada uno y los datos se presentan
como la media \pm el error estándar.
La figura 5 de referencia representa un gráfico
de barras que demuestra los efectos del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la actividad locomotriz en jerbos control normales (barras en
blanco) y animales a los que se les administraron 32 mg/kg del
compuesto (barras en negro). Se administraron inyecciones
intraperitoneales del compuesto a los jerbos inmediatamente antes
del periodo de evaluación de la actividad locomotriz de seis horas.
Se administraron inyecciones de solución salina a los animales
control. Se utilizaron grupos de 6 jerbos cada uno y los datos se
presentan como la media \pm el error estándar.
La figura 6 de referencia representa un gráfico
que demuestra los efectos del pretratamiento con solución salina
inmediatamente antes del comienzo de un periodo de 5 minutos de
oclusión de la carótida bilateral. Se sometieron a prueba los
animales para detectar cambios en la actividad locomotriz durante 4
horas consecutivas tras la lesión por isquemia y reperfusión en
comparación con animales control que no recibieron oclusión de la
arteria carótida. Los datos se expresan como el valor medio para
cada grupo de 6 jerbos a los que se administraron 5 minutos de
oclusión de la carótida bilateral con pretratamiento con solución
salina (símbolo en negro) o se pretrataron con solución salina pero
sin oclusión de la carótida bilateral (símbolo en blanco). Los
animales se colocaron en las cámaras de actividad locomotriz durante
las 4 horas consecutivas tal como se indica.
La figura 7 de referencia representa un gráfico
que demuestra los efectos del pretratamiento con el compuesto de
referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(0,32 mg/kg) inmediatamente antes del comienzo de un periodo de 5
minutos de oclusión de la carótida bilateral. Se sometieron a prueba
los animales para detectar cambios en la actividad locomotriz
durante 4 horas consecutivas tras la lesión por isquemia y
reperfusión. Los datos se expresan como el valor medio para cada
grupo de 6 jerbos a los que se administraron 5 minutos de oclusión
de la carótida bilateral con pretratamiento con el fármaco (símbolo
en negro) o se pretrataron con solución salina pero sin oclusión de
la carótida bilateral (símbolo en blanco). Los animales se colocaron
en las cámaras de actividad locomotriz durante las 4 horas
consecutivas tal como se indica.
La figura 8 de referencia representa un gráfico
que demuestra los efectos del pretratamiento con el compuesto de
referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(3,2 mg/kg) inmediatamente antes del comienzo de un periodo de 5
minutos de oclusión de la carótida bilateral. Se sometieron a prueba
los animales para detectar cambios en la actividad locomotriz
durante 4 horas consecutivas tras la lesión por isquemia y
reperfusión. Los datos se expresan como el valor medio para cada
grupo de 6 jerbos a los que se administraron 5 minutos de oclusión
de la carótida bilateral con pretratamiento con el fármaco (símbolo
en negro) o se pretrataron con solución salina pero sin oclusión de
la carótida bilateral (símbolo en blanco). Los animales se colocaron
en las cámaras de actividad locomotriz durante las 4 horas
consecutivas tal como se indica.
La figura 9 de referencia representa un gráfico
que muestra los efecto del pretratamiento con el compuesto de
referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(10 mg/kg) inmediatamente antes del comienzo de un periodo de 5
minutos de oclusión de la carótida bilateral. Se sometieron a prueba
los animales para detectar cambios en la actividad locomotriz
durante 4 horas consecutivas tras la lesión por isquemia y
reperfusión. Los datos se expresan como el valor medio para cada
grupo de 6 jerbos a los que se administraron 5 minutos de oclusión
de la carótida bilateral con pretratamiento con el fármaco (símbolo
en negro) o se pretrataron con solución salina pero sin oclusión de
la carótida bilateral (símbolo en blanco). Los animales se colocaron
en las cámaras de actividad locomotriz durante las 4 horas
consecutivas tal como se indica.
La figura 10 de referencia representa un gráfico
que muestra los efectos del pretratamiento con el compuesto de
referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(32 mg/kg) inmediatamente antes del comienzo de un periodo de 5
minutos de oclusión de la carótida bilateral. Se sometieron a prueba
los animales para detectar cambios en la actividad locomotriz
durante 4 horas consecutivas tras la lesión por isquemia y
reperfusión. Los datos se expresan como el valor medio para cada
grupo de 6 jerbos a los que se administraron 5 minutos de oclusión
de la carótida bilateral sin pretratamiento (símbolo en negro) o se
pretrataron con solución salina pero sin oclusión de la carótida
bilateral (símbolo en blanco). Los animales se colocaron en las
cámaras de actividad locomotriz durante las 4 horas consecutivas tal
como se indica.
La figura 11 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra los efectos del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre los cambios en la actividad locomotriz de la primera hora en
comparación con solución salina y los valores control no isquémicos.
Estos datos se resumen a partir de las figuras anteriores e indican
que hay una mejora significativa en la actividad locomotriz
espontánea de los animales a los que se administró
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a dosis superiores a 0,32 mg/kg en la primera hora tras la isquemia.
En cambio, los animales control que no se expusieron a lesión por
isquemia y reperfusión demostraron un nivel significativamente alto
de actividad locomotriz en la primera hora de exploración en
comparación con los jerbos isquémicos.
La figura 12 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra los efecto del pretratamiento con el compuesto
de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la actividad locomotriz en la 4ª hora de pruebas tras 5 min.
de oclusión de la carótida bilateral. Todas las dosis del compuesto
protegieron significativamente contra los aumentos de actividad
locomotriz producidos de manera rutinaria mediante oclusiones de la
carótida bilateral de 5 minutos o más largas. Animales control no
expuestos a isquemia demostraron una baja actividad exploratoria que
es normal para animales sanos colocados en la cámara de actividad
locomotriz durante 4 horas. El pretratamiento con solución salina no
pudo interferir con la potenciación posisquémica de la actividad
locomotriz que se observa de manera rutinaria.
0,32-32 mg/kg del compuesto redujeron
significativamente el aumento provocado por la isquemia de la
actividad exploratoria dentro de la área circular de la cámara de
actividad locomotriz. Los datos se expresan como la media de 6
sujetos \pm el error estándar.
La figura 13 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra cambios en la actividad locomotriz como
resultado del tratamiento con el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(AG1) 24 horas tras la isquemia durante una sesión de pruebas de 1
hora. Se colocaron los animales en las cámaras de actividad
locomotriz 24 horas tras la lesión por isquemia y reperfusión y se
evaluaron para detectar cambios en la actividad locomotriz. Los
animales control eran animales no isquémicos control tratados con
solución salina o animales no isquémicos control tratados con
fármaco colocados en la cámara 24 horas tras la inyección de
solución salina/fármaco. Los animales isquémicos (ISC) representan
animales a los que se administraron pretratamientos con solución
salina y se colocaron en la cámara de actividad locomotriz 24 horas
tras el comienzo de la isquemia y reperfusión. Estos animales eran
también los que se sometieron a prueba para detectar cambios
posisquémicos cada hora en la actividad locomotriz representada en
las figuras anteriores. Los animales a los que se administró
pretratamiento con el compuesto eran animales representados en
figuras anteriores para determinar los cambios inmediatos tras la
reperfusión en el comportamiento. Todos los animales se sometieron
a prueba a las 24 horas durante una sesión de 1 hora.
La figura 14 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra los efectos del pretratamiento y el
postratramiento con el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a 32 mg/kg. Los animales control (CON) no recibieron isquemia, los
animales control tratados con solución salina (SAL) recibieron
isquemia pero con pretratamiento con solución salina en lugar de
fármaco. Los animales con pretratamiento recibieron múltiples
inyecciones de 32 mg/kg a 6, 4 y 2 horas y 30 minutos antes del
comienzo de los 5 minutos de oclusión de la carótida bilateral. Los
animales con postratamiento recibieron dosis a 30 minutos tras la
reperfusión, 2 horas, 4 horas y 6 horas. Las pruebas se realizaron a
las 24 horas tras la reperfusión. Cada grupo representa la media
\pm el error estándar para 6 animales por grupo de tratamiento.
Tal como puede observarse, tanto el pretratamiento como el
postratamiento produjeron un efecto protector del comportamiento
significativo. Se produjo una clara indicación de protección a 32
mg/kg.
La figura 15 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra los cambios postisquémicos en el resultado en
el laberinto de brazos radiales de jerbos expuestos a 5 minutos de
oclusión de la carótida bilateral 24 horas antes y pretratados con
las dosis indicadas del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se sometieron a prueba los animales inmediatamente tras someter a
prueba la actividad locomotriz para detectar comportamiento de
patrulla en un laberinto de 8 brazos. Este laberinto de 8 brazos se
ubica en una habitación en la que no se realiza otra investigación.
Los 8 brazos eran idénticos en dimensiones y en figuración. No se
cebaron los brazos con alimento. Se sometieron a prueba los animales
hasta que habían entrado en y explorado cada uno de los 8 brazos. La
entrada en un brazo en el que habían entrado anteriormente definió
un error. Todos los animales completaron la tarea exploratoria
completa antes de sacarlos. Cada columna representa la media \pm
el error estándar para 6 animales por condición de tratamiento. Los
animales control no recibieron isquemia, los animales tratados con
solución salina (SAL) recibieron isquemia pero no fármaco. Los
animales que recibieron isquemia más tratamiento con
0,32-32 mg/kg de fármaco mostraron una protección
del comportamiento significativa respecto a los cambios inducidos
por la isquemia en el comportamiento de patrulla.
La figura 16 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra los efectos de dosis de pretratamiento del
compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la densidad de neuronas en el hipocampo dorsal
(CA-1) del jerbo. Se pretrataron los jerbos con
dosis de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
tal como se describió en las figuras anteriores y se permitió que se
recuperaran de la lesión por isquemia y reperfusión durante 7 días
antes de la anestesia y la fijación del tejido. Se congeló el
tejido, se practicaron cortes y se tiñeron, se contaron los núcleos
neuronales en zonas discretas de la región CA-1 del
hipocampo. Los datos se presentan como la media \pm el error
estándar para 6 sujetos (se evaluó cada sujeto para un mínimo de 3
cortes consecutivos del hipocampo dorsal para detectar pérdida
neuronal). El pretratamiento con 0,32-32 mg/kg del
fármaco proporcionó una protección significativa respecto a la
pérdida de neuronas inducida por la isquemia.
La figura 17 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra los efectos del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre la densidad neuronal en el hipocampo dorsal
(CA-1) del jerbo. Los jerbos se pretrataron y
postrataron con 3,2 mg/kg del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y se permitió que se recuperaran de la lesión por isquemia y
reperfusión durante 7 días antes de la anestesia y fijación del
tejido. Se congeló el tejido, se practicaron cortes y se tiñeron, se
contaron los núcleos neuronales en zonas discretas de la
CA-1. Los datos se presentan como la media \pm el
error estándar para 6 sujetos (se evaluó cada sujeto para un mínimo
de 3 cortes consecutivos del hipocampo dorsal para detectar pérdida
neuronal). Tanto el pretratamiento como el postratamiento con 3,2
mg/kg de fármaco proporcionaron una protección significativa con
respecto a la pérdida de neuronas inducida por la isquemia.
La figura 18 de referencia representa un gráfico
de barras que muestra la inhibición del dolor inducido por formalina
en ratones mediante 1, 5, 10, 20, 30 y 40 mg/kg del compuesto de
referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal o bien DMSO
(control de vehículo) o bien el fármaco en DMSO 30 minutos antes de
la inyección subcutánea de 20 \mul de formalina al 5% en la
superficie de la planta de la pata trasera. Entonces se observaron
los ratones y se registró el tiempo que pasaron los ratones lamiendo
la pata trasera inyectada en intervalos de cinco minutos durante los
periodos de tiempo indicados. El tiempo que pasaron lamiendo la pata
trasera inyectada es un indicador del dolor experimentado por el
animal. Tal como se muestra en la figura 18, la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhibió el lamido inducido por formalina de una manera dependiente
de la dosis indicando una eficacia antinociceptiva potente en este
modelo animal de dolor crónico.
La figura 19 representa un gráfico de barras que
muestra la inhibición del dolor inducido por formalina en ratones
mediante 5, 10, 20 y 40 mg/kg de
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal o bien DMSO
(control de vehículo) o bien el fármaco en DMSO 30 minutos antes de
la inyección subcutánea de 20 ml de formalina al 5% en la superficie
de la planta de la pata trasera. Entonces se observaron los ratones
y se registró el tiempo que pasaron los ratones lamiendo la pata
trasera inyectada en intervalos de cinco minutos durante los
periodos de tiempo indicados. El tiempo que pasaron lamiendo la pata
trasera inyectada es un indicador del dolor experimentado por el
animal. Tal como se muestra en la figura 19, la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhibió el lamido inducido por formalina de una manera dependiente
de la dosis indicando una eficacia antinociceptiva potente en este
modelo animal de dolor crónico.
Las figuras 20A y 20B representan gráficos de
líneas que muestran la inhibición del dolor inducido por formalina
en ratones mediante 1, 5, 10, 20 y 40 mg/kg de
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal o bien DMSO
(control de vehículo) o bien el fármaco en DMSO 30 minutos antes de
la inyección subcutánea de 20 ml de formalina al 5% en la superficie
de la planta de la pata trasera. Entonces se observaron los ratones
y se registró el tiempo que pasaron los ratones lamiendo la pata
trasera inyectada en intervalos de cinco minutos durante los
periodos de tiempo indicados. El tiempo que pasaron lamiendo la pata
trasera inyectada es un indicador del dolor experimentado por el
animal. Tal como se muestra en las figuras 20A y 20B, la
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhibió el lamido inducido por formalina de una manera dependiente
de la dosis tanto en la fase temprana (0,5 minutos; figura 20A) de
la respuesta de dolor (lamido) como en la fase tardía
(15-50 minutos; figura 20B) de la respuesta de
lamido de dolor indicando una eficacia antinociceptiva potente en
este modelo animal de dolor crónico.
La figura 21 de referencia representa un
diagrama que muestra las solubilidades del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
la sal de colina, la sal de monopotasio y la sal de dipotasio del
mismo.
La figura 22A de referencia representa un
gráfico que muestra la actividad sedante (pérdida del reflejo de
enderezamiento) de los ratones a lo largo del tiempo tras la
inyección i.p. del compuesto de referencia
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto número 1; véase la figura 22B), en comparación con el
compuesto de referencia
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto número 2; véase la figura 22B; inactivo) y ketamina
(compuesto número 3; véase la figura 22B).
Las figuras 23A y 23B representan gráficos de
barras que muestran los efectos de diversas dosis de PCP, el
compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en ratas entrenadas para diferenciar 2 mg/kg de PCP de solución
salina. La figura 23A muestra el grado de efectos de tipo PCP en el
porcentaje medio de selección de palanca de PCP. La figura 23B
muestra efectos sobre las tasas globales de respuesta. Los valores
por encima de SAL, PCP y DMSO muestran los resultados de pruebas de
control con solución salina, PCP 2 mg/kg y DMSO 0,5 ml/kg realizados
antes de las pruebas de PCP,
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Los valores representan la media de seis ratas.
La figura 24 muestra un gráfico de barras que
muestra la actividad locomotriz de ratones Swiss/Webster tras la
inyección intraperitoneal de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en DMSO o MK801 en solución salina. Se inyectó a grupos de al menos
seis ratones vehículo o dosis crecientes de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en DMSO o MK801 en solución salina. Entonces se registró la
actividad locomotriz durante cuatro periodos de 15 minutos
consecutivos. Se muestra la actividad locomotriz en el segundo
intervalo de quince minutos.
La presente invención se refiere al uso de
compuestos que tienen alta afinidad por el sitio de unión a glicina,
que carecen de efectos secundarios de PCP y que atraviesan la
barrera hematoencefálica a altos niveles para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de los estados
patológicos mencionados anteriormente. Tales compuestos son
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
que son antagonistas competitivos sumamente selectivos del sitio de
unión a glicina del receptor de NMDA. Las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
de la invención tienen la siguiente fórmula (I):
o un tautómero de la
misma;
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}
y R^{4} son tal como se define en la reivindicación 1 ó
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos alquilo C_{1-6}
típicos incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,
isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo,
2-pentilo, 3-pentilo, neopentilo,
hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo,
2-metil-1-pentilo,
3-metil-1-pentilo,
4-metil-1-pentilo.
Los grupos halógeno típicos incluyen flúor,
cloro, bromo y yodo.
Los grupos haloalquilo típicos incluyen grupos
alquilo C_{1-6} sustituidos con uno o más átomos
de flúor, cloro, bromo o yodo, por ejemplo grupos fluorometilo,
difluorometilo, trifluorometilo, pentafluoroetilo,
1,1-difluoroetilo y triclorometilo.
Los grupos amino típicos incluyen -NH_{2},
NHR^{9} y -NR^{9}R^{10}, en los que R^{9} y R^{10} son uno
de los grupos alquilo C_{1-6} mencionados
anteriormente.
Los grupos amino típicos incluyen un grupo amino
sustituido con un grupo acilo C_{2-6}, por ejemplo
grupos acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y hexanoílo.
Las
quinoxalin-2,3-dionas
particularmente preferidas de la presente invención incluyen
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-difluoro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6-cloro-5-nitro-7-bromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dicloro-5-bromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6-cloro-5-nitro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5-bromo-6,7-difluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5,6,7,8-tetrafluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5-bromo-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
4-carboximetil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5-amino-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-cloro-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
5-amino-7-cloro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-cloro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-bromo-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6-amino-7-bromo-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-bromo-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-fluoro-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6-amino-7-fluoro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-fluoro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dicloro-5-hidroxilamino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
6,7-dibromo-5-hidroxilamino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Compuestos especialmente preferidos son
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-difluoro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6-cloro-5-nitro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
7-bromo-6-cloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
La
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
previenen la muerte de células nerviosas inducida por la isquemia
en el modelo de isquemia global del jerbo tras la administración
i.p. La
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
son potentes anticonvulsivos en al menos dos de los tres modelos
animales tras la administración i.p. del compuesto de referencia. Se
encontró también que la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
presentaban también eficacia analgésica tras la administración i.p.
en un animal con dolor crónico (inducido por formalina).
Los compuestos de la presente invención muestran
baja reactividad cruzada con receptores de cainato, AMPA y
quiscualato y los sitios de unión a glutamato y PCP de los
receptores de NMDA y por tanto son distintos de cualquiera de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
descritas previamente, en particular,
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
tal como se dan a conocer en la patente estadounidense número
4.975.430.
Los compuestos de la presente invención son
activos en el tratamiento o la prevención de la pérdida neuronal,
enfermedades neurodegenerativas, dolor crónico, son activos como
anticonvulsivos y en la inducción de anestesia sin efectos
secundarios perjudiciales producidos por la unión no selectiva con
otros receptores, particularmente receptores de cainato, AMPA y
quiscualato y los receptores de glutamato y PCP asociados con el
receptor de NMDA. Además, los compuestos de la presente invención
son eficaces en el tratamiento o la prevención de consecuencias
adversas de la hiperactividad de los aminoácidos excitadores, por
ejemplo, los que están implicados en el sistema del receptor de
NMDA, bloqueando los receptores de glicina e impidiendo que los
canales catiónicos activados por ligando se abran y permitan una
entrada excesiva de Ca^{++} en las neuronas, tal como se produce
durante la isquemia.
Las enfermedades neurodegenerativas que pueden
tratarse con los compuestos de la presente invención incluyen las
seleccionadas del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer,
esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington y síndrome
de Down.
Los compuestos de la presente invención
encuentran utilidad particular en el tratamiento o la prevención de
la pérdida neuronal asociada con accidentes cerebrovasculares
múltiples que dan lugar a demencia. Tras haber diagnosticado a un
paciente que padece un accidente cerebrovascular, pueden
administrarse los compuestos de la presente invención para mejorar
la isquemia inmediata y prevenir el daño neuronal adicional que
puede producirse a partir de accidentes cerebrovasculares
recurrentes.
Además, los compuestos de la presente invención
pueden atravesar la barrera hematoencefálica, a diferencia de la
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y otras
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
6,7-disustituidas que no pueden atravesar la barrera
hematoencefálica tras la administración i.p. (véase Turski, L.
et al., J. Pharm. Exp. Ther. 260: 742-747
(1992)). Véase también Sheardown et al., Eur. J. Pharmacol.
174: 197-204 (1989), que dan a conocer que la
5,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
6-ciano-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
tienen poco acceso al sistema nervioso central.
Para que un compuesto comience a mostrar
eficacia in vivo y, por tanto, la capacidad de atravesar la
barrera hematoencefálica, el compuesto debe presentar una DE_{50}
inferior a 100 mg/kg de peso corporal del animal. Preferiblemente,
los compuestos de la presente invención presentan una DE_{50}
inferior a 20 mg/kg y, más preferiblemente; inferior a 10 mg/kg.
Los compuestos de la invención encuentran
utilidad particular en el tratamiento o la prevención de
consecuencias neurológicas adversas de la cirugía. Por ejemplo, la
cirugía de revascularización coronaria requiere el uso de máquinas
de circulación extracorpórea que tienden a introducir burbujas de
aire en el sistema circulatorio que pueden depositarse en el
cerebro. La presencia de tales burbujas de aire priva de oxígeno al
tejido neuronal, dando como resultado anoxia e isquemia. La
administración pre o posquirúrgica de las
1,4-dihidroquinoxalinas de la presente invención
tratará o prevendrá la isquemia resultante. En una realización
preferida, los compuestos de la invención van a administrarse a
pacientes que se someten a cirugía de derivación cardiopulmonar o
cirugía de endoarterioctomía carotídea.
Los compuestos de la presente invención también
encuentran utilidad en el tratamiento o la prevención del dolor
crónico. Tal dolor crónico puede ser el resultado de cirugía,
traumatismos, cefalea, artritis u otra enfermedad degenerativa. Los
compuestos de la presente invención encuentran utilidad particular
en el tratamiento del dolor fantasma que resulta de la amputación
de una extremidad. Además del tratamiento del dolor, los compuestos
de la presente invención también son útiles en la inducción de
anestesia, o bien anestesia general o bien local, por ejemplo,
durante la cirugía.
Se ha sintetizado un total de más de 30
derivados de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y se han sometido a prueba para determinar la actividad antagonista
de glicina in vivo. De entre estos fármacos novedosos, se han
identificado varios compuestos con una afinidad particularmente
alta por los receptores de glicina/NMDA. A partir de la inspección
de la estructura de los análogos más potentes, parece que la
combinación de un grupo NO_{2} con dos átomos de halógeno, por
ejemplo cloro o bromo; o con un grupo Cl y un grupo CF_{3} en el
sistema de anillo de la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
proporciona antagonistas de glicina particularmente potentes. De
hecho, la
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
con afinidades de 6 nM y 8 nM, respectivamente, por el sitio de
unión a glicina, son los antagonistas de glicina/NMDA más potentes
descubiertos hasta la fecha. Es de interés que el grupo NO_{2} en
el compuesto
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
ha aumentado, en varios cientos de veces, la afinidad por el
receptor de glicina de su compuesto original, la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(DCQX), que otros han descrito como un antagonista de glicina
potente y selectivo (Yoneda y Ogita, Biochem. Biophy. Res. Commun.
164:841-849 (1989). De manera sorprendente, es
posible reducir el grupo nitro de la
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
para obtener
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
sustituidas con amino que también tienen alta afinidad de unión por
el sitio de unión a glicina.
Debido a que se sabe que las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas,
especialmente CNQX y DNQX, son potentes antagonistas de AMPA y
cainato, se sometieron a prueba los compuestos de la presente
invención en ensayos de unión a AMPA y cainato para determinar la
reactividad cruzada en estos receptores que no son de NMDA. Se
encontró que los antagonistas de glicina potentes no tenían
reactividad cruzada significativa en los sitios de AMPA y cainato o
sólo reactividad cruzada minoritaria. Por tanto, los compuestos de
la presente invención son antagonistas de glicina potentes pero
presentan poca o ninguna reactividad cruzada en los sitios de AMPA y
cainato.
Preferiblemente, los compuestos de la invención
presentan una afinidad de unión al sitio de unión a glicina de
K_{i} = 10 mM o inferior, más preferiblemente, 1 mM o inferior y
más preferiblemente, 500 nM o inferior y más preferiblemente, 100
nM o inferior y lo más preferiblemente, 10 nM o inferior. También
preferiblemente son compuestos que presentan unión en los sitios de
AMPA y cainato no inferior a K_{i} = 1 mM y, más preferiblemente,
no inferior a 10 mM.
Entonces se sometieron a prueba los antagonistas
de glicina novedosos para determinar la actividad in vivo
tras la inyección intraperitoneal usando varias pruebas
anticonvulsivas en ratones (modelo de convulsión audiogénica en
ratones DBA-2, convulsiones inducidas por
pentilentetrazol en ratones, muerte inducida por NMDA en ratones).
Todos los compuestos sometidos a prueba mostraron actividad en uno o
más de los tres modelos. La
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto nº 1, tabla IV) era el más potente de los cinco,
particularmente en el modelo de convulsión audiogénica (DE_{50} =
5 mg/kg) y el modelo de muerte inducida por NMDA (DE_{50} = 20
mg/kg). La
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto nº 13, tabla IV) también era muy potente,
particularmente en el modelo de convulsión audiogénica (DE_{50} =
10 mg/kg). Sin embargo, estos dos compuestos presentaron diferente
propensión a producir efectos secundarios de ataxia tal como se
determinó mediante la prueba de ataxia con Rotorod en el ratón. En
particular, la
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
presentó una TD_{50} = 200 mg/kg en esta prueba. Por tanto, este
compuesto es eficaz en la prevención de las convulsiones a dosis que
son muy inferiores a las que producen efectos secundarios de
ataxia. Esto es en comparación con una TD_{50} = 27 mg/kg en la
prueba de ataxia con Rotorod para la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Por tanto, los compuestos de la presente
invención presentan efectos secundarios de ataxia en la prueba de
ataxia con Rotorod a niveles de dosificación superiores a
aproximadamente 100 mg/kg, más preferiblemente, superiores a
aproximadamente 200 mg/kg.
También se sometieron a prueba dos compuestos
(nº 1 (tabla IV) y el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto nº 2 (tabla IV)) para determinar la eficacia
neuroprotectora tras la inyección intraperitoneal en el modelo de
isquemia global de jerbo y se encontró que tenían eficacia
neuroprotectora potente en este paradigma. También se sometieron a
prueba los mismos compuestos en pruebas de discriminación de
fármacos en ratas entrenadas para diferenciar PCP de solución
salina. Ninguno de los dos compuestos se generalizó a PCP a ninguna
dosis en estos estudios de discriminación de fármacos. Además,
ninguno de los compuestos produjo una excitación del comportamiento
en pruebas de actividad locomotriz en el ratón. Los resultados de
estos estudios sugieren que los antagonistas de glicina novedosos
de la presente invención no muestran los efectos secundarios de
comportamiento de tipo PCP que son comunes para bloqueantes del
canal de NMDA tales como MK801 y PCP o para antagonistas
competitivos de NMDA tales como CGS19755.
Es importante que los antagonistas de glicina
novedosos mostraban actividad potente in vivo tras la
inyección intraperitoneal, lo que sugiere que estos compuestos
pueden atravesar la barrera hematoencefálica. Otros investigadores
han notificado que los análogos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
CNQX y DNQX no pueden atravesar la barrera hematoencefálica
(Turski, L., et al., J. Pharm. Exp. Ther.
260:742-747 (1992)), un hallazgo que han confirmado
los inventores. Aparentemente, las alteraciones en los sustituyentes
del anillo de benceno de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
no sólo dan como resultado un aumento drástico en la afinidad por
el receptor de glicina y una pérdida en la afinidad por el receptor
de AMPA/cainato, sino que también pueden producir compuestos con una
capacidad bastante satisfactoria para atravesar la barrera
hematoencefálica (véase Turski, L. et al., J. Pharm. Exp.
Ther. 260: 742-747 (1992)).
Antes de la presente invención, se creía que uno
de los farmacóforos primarios para el antagonismo de la glicina era
el grupo amida en la
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
produciendo una mejora de la potencia con la sustitución de
sustituyentes extractores de electrones en el anillo aromático,
disminuyendo así la pKa del hidrógeno de amida (Gray et al.,
J. Med. Chem. 34:1283 (1991); Leeson, P.D., et al., J. Med.
Chem. 34:1243 (1991)). Aunque los estudios descritos en esta
invención han confirmado generalmente esta propuesta, se ha
descubierto ahora que las posiciones relativas de los sustituyentes
en el anillo así como la identidad de los grupos extractores de
electrones son también importantes. La presente invención se refiere
a este descubrimiento.
Se ha descubierto adicionalmente que uno o ambos
de los hidrógenos de amida pueden sustituirse por grupos amina,
hidroxilo, carboxialquilo y carboxiaralquilo y que los compuestos
resultantes conservan una unión alta al receptor de glicina.
El antagonista novedoso más potente que es parte
de esta invención en la
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(K_{i} = 6 nM). El segundo antagonista más potente es la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(K_{i} = 8 nM). Otros antagonistas potentes incluyen una mezcla
de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
nitrada (los compuestos de referencia 3x y 3y, tabla I y los
compuestos de referencia nº 3 y 4, tabla IV). Otro antagonista
potente sintetizado en la serie de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
es el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(3h, tabla I y el compuesto nº 2, tabla IV). Otro derivado con
potencia apreciable pero muy inferior es el compuesto de referencia
6-nitro-7-(trifluorometil)-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(3k, tabla I). La colocación y el tipo del grupo extractor de
electrones en el anillo parecen ser importantes, ya que las
sustituciones en las posiciones 5 y 7 del anillo de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
parecen mejorar la potencia del sitio de unión a glicina. La
sustitución en la posición 6 con grupos ionizables tales como
sulfonatos, sulfonamidas primarias (31-n, tabla I) y
ácidos carboxílicos destruye la capacidad de unión de los
compuestos al receptor de glicina. Ni la alquilación de la
sulfonamida (30-p, tabla I) ni la metilación del
ácido conducen a un aumento de la actividad. La metilación del
nitrógeno de amida en el anillo de quinoxalina también destruye la
capacidad de unión del compuesto, tal como se evidencia mediante la
carencia de actividad de la
6,7-dinitro-N-metil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona.
La síntesis del análogo de piridina (ejemplo 26) y un análogo de
pteridina (ejemplo 27) de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
produjo compuestos inactivos.
Otro aspecto importante de la presente invención
se refiere al descubrimiento de que las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
sustituidas con amino también tienen alta afinidad de unión al
sitio de unión a glicina. Esto era inesperado en vista del hecho de
que los grupos amino con donadores de electrones y la expectativa de
que los grupos extractores de electrones son importantes para una
alta afinidad de unión.
Los compuestos sintetizados para someterlos a
prueba como antagonistas de glicina potenciales se resumen a
continuación (tabla I). La mayoría estaban disponibles mediante
condensación simple de oxalato de dietilo con el diaminobenceno
correspondiente según Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962).
También se descubrió que las
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindionas
pueden prepararse fácilmente con alto rendimiento calentando ácido
oxálico y la o-diamina correspondiente hasta de 100 a 140ºC
durante de 1 a 10 h en presencia de un ácido mineral fuerte tal
como HCl, H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4}. En una realización
preferida, se calientan ácido oxálico y la o-diamina hasta
125ºC en HCl 2 N durante 2,5 horas para dar la
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
en alto rendimiento. La presente invención también da a conocer
este procedimiento mejorado para preparar
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindionas.
Los o-diaminobencenos de partida o bien
están directamente disponibles del fabricante o bien se accedió a
ellos fácilmente mediante la reducción de la o-nitroanilina
correspondiente (esquema I, eq. 1), según Bellamy, F.D. y Ou, K.,
Tetr. Lett. 25:839 (1984). Se realizaron nitraciones mediante
tratamiento de la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
con KNO_{3} en H_{2S}O_{4} conc. (esquema III, eq. 2). Se
prepararon las
5-halo-6,7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindionas
mediante el tratamiento de la
4,5-difluoro-2-nitroanilina
con N-bromosuccinimida o
N-clorosuccinimida (Mitchell, R.H., et al.,
J. Org. Chem. 44:4733 (1979)), seguido por reducción y condensación
con oxalato de dietilo. Se sometieron a prueba los compuestos para
determinar la actividad antagonista de glicina potencial observando
la inhibición de la unión de
[^{3}H]-MK-801 estimulado con
glicina 1 \muM en homogeneizados de membrana de cerebro de rata o
cobaya. Cuanto más potente sea el antagonista de glicina, menos
[^{3}H]-MK-801 puede unirse dado
que el sitio de unión a [^{3}H]-MK801 (receptor de
PCP) es accesible sólo tras la apertura del canal iónico mediante
el glutamato y la glicina (Fletcher, E.L., et al., en Glycine
Neurotransmission, Otterson, P., et al. (eds.), John Wiley y
Sons (1990); Johnson, J.W., et al., Nature 325:529
(1987)).
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema
I
Los sulfonatos y derivados se prepararon
mediante tratamiento de la
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
original con ácido clorosulfónico y tratamiento posterior con la
amina deseada para formar la sulfonamida (esquema I, eq. 3). Véase
Mitchell et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979). Se preparó la
5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
mediante tratamiento de la
4-fluoro-2-nitroanilina
con N-bromosuccinimida seguido por reducción y
condensación con oxalato de dietilo.
La actividad ansiolítica de cualquier compuesto
particular de la presente invención puede determinarse mediante el
uso de cualquiera de los modelos animales reconocidos para la
ansiedad. Se describe un modelo preferido por Jones, B.J. et
al., Br. J. Pharmacol. 93: 985-993 (1988). Este
modelo implica administrar el compuesto en cuestión a ratones que
tienen un alto nivel basal de ansiedad. La prueba se basa en el
hallazgo de que tales ratones encuentran aversivo que se les saque
de un entorno de hábitat oscuro en una habitación de prueba oscura
y se les coloque en una zona que está pintada de blanco e iluminada
de manera intensa. La caja de prueba tiene dos compartimentos, uno
blanco e iluminado de manera intensa y otro negro y no iluminado. El
ratón tiene acceso a ambos compartimentos mediante una abertura a
nivel del suelo en la mampara entre los dos compartimentos. Los
ratones se colocan en el centro de la zona iluminada de manera
intensa. Tras ubicar la abertura en la zona oscura, los ratones son
libres de pasar por debajo y hacia delante entre los dos
compartimentos. Los ratones control tienden a pasar una mayor
proporción de tiempo en el compartimento oscuro. Cuando se les
administra un agente ansiolítico, los ratones pasan más tiempo
explorando el compartimento iluminado de manera más intensa más
novedoso y presentan una latencia retardada a moverse hacia el
compartimento oscuro. Además, los ratones tratados con el agente
ansiolítico presentan más comportamiento en el compartimento blanco,
tal como se mide mediante cruces de líneas y erguimientos
exploratorios. Dado que los ratones pueden habituarse a esta
situación de prueba, deben usarse siempre en la prueba ratones no
sometidos a prueba anteriormente. Pueden medirse cinco parámetros:
latencia a entrar en el compartimento oscuro, el tiempo pasado en
cada zona, el número de transiciones entre compartimentos, el
número de líneas cruzadas en cada experimento y el número de
erguimientos en cada compartimento. Se espera que la administración
de los compuestos de como resultado que los ratones pasen más tiempo
en la zona iluminada de manera intensa, más grande de la cámara de
prueba.
En el modelo de exploración de luz/oscuridad,
puede identificarse la actividad ansiolítica de un agente supuesto
mediante el aumento del número de cruces de líneas y erguimientos en
el compartimento iluminado a expensas del número de cruces de
líneas y erguimientos en el compartimento oscuro, en comparación con
ratones control.
Un segundo modelo animal preferido es la prueba
de interacción social de la rata descrito por Jones, B.J. et
al., citado anteriormente, en el que se cuantifica el tiempo que
pasan dos ratones en interacción social. La actividad ansiolítica
de un agente supuesto puede identificarse mediante el aumento en el
tiempo que dos parejas de ratas macho pasan en interacción social
activa (el 90% de los comportamientos son de naturaleza
investigadora). Pueden manipularse tanto el nivel de luz como el de
familiaridad de la área de prueba. Las ratas a las que no se les
administró fármaco muestran el nivel más alto de interacción social
cuando la área de prueba es familiar y está iluminada mediante luz
baja. La interacción social disminuye si la área no es familiar
para las ratas o está iluminada mediante luz brillante. Los agentes
ansiolíticos previenen esta disminución. El nivel global de
actividad motora también puede medirse para permitir la detección de
efectos farmacológicos específicos para comportamientos
sociales.
La presente invención se refiere al uso de los
compuestos dados a conocer en el presente documento en la
fabricación de sedantes-hipnóticos. Se encontró que
el antagonista de glicina/NMDA
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto de referencia) tiene actividad sedante/hipnótica tras la
inyección i.v. en ratones. En cambio, la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto de referencia) carece completamente de actividad
sedante-hipnótica (véase la figura22A). La
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es considerablemente más potente y de larga duración como
sedante-hipnótico que la ketamina, un bloqueante de
canal de NMDA usado como anestésico en seres humanos.
La afinidad de unión de la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(Ki=0,9 \muM) en el receptor de glicina no es sustancialmente
diferente de la de la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(Ki=0,33 \muM). Además, la afinidad de unión a AMPA y cainato de
la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no son sustancialmente diferentes. Por tanto, es probable que la
diferencia en la actividad sedante/hipnótica entre los dos
compuestos se deba al hecho de que la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
penetra fácilmente la barrera hematoencefálica, mientras que la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no. También se ha observado la misma diferencia en la eficacia
in vivo entre estos dos compuestos en las pruebas de eficacia
anticonvulsiva.
También se dan a conocer composiciones en las
que los compuestos de la presente invención están contenidos en una
cantidad que es eficaz para lograr su fin deseado. Mientras que las
necesidades individuales pueden variar, la determinación de los
intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente está
dentro de la experiencia de la técnica. Normalmente, los compuestos
pueden administrarse a mamíferos, por ejemplo seres humanos, por
vía oral a una dosis de 0,0025 a 50 mg/kg, o una cantidad
equivalente de la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos,
por día del peso corporal del mamífero que está tratándose para
trastornos de ansiedad, por ejemplo, trastorno de ansiedad
generalizada, trastornos fóbicos, trastorno
obsesivo-compulsivo, trastorno de pánico y
trastornos de estrés postraumático. Preferiblemente, van a
administrarse por vía oral de 0,01 a 10 mg/kg para tratar o
prevenir tales trastornos. Para inyección intramuscular,
generalmente la dosis es aproximadamente la mitad de la dosis oral.
Por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de la ansiedad,
una dosis intramuscular adecuada debería ser de 0,0025 a 15 mg/kg, y
lo más preferiblemente, desde 0,01 hasta 10 mg/kg.
En el tratamiento o prevención de la pérdida
neuronal en la isquemia, traumatismos de la médula espinal y
cerebro, hipoxia, hipoglucemia y cirugía, así como para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral
amiotrófica, enfermedad de Huntington y síndrome de Down, o para
tratar una enfermedad en la que la fisiopatología del trastorno
implica hiperactividad de los aminoácidos excitadores o
neurotoxicidad relacionada con el canal iónico del receptor de
NMDA, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden
comprender los compuestos de la presente invención a un nivel de
dosis unitaria de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal, o una cantidad
equivalente de la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o
un régimen de 1-4 veces al día. Cuando se usan para
tratar dolor crónico o para inducir anestesia, los compuestos de la
invención pueden administrarse a un nivel de dosificación unitaria
de desde 0,01 hasta 50 mg/kg de peso corporal, o una cantidad
equivalente de la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en
un régimen de 1-4 veces al día. Por supuesto, se
entiende que el nivel de tratamiento exacto dependerá de la historia
clínica del animal, por ejemplo el ser humano, que se trata. El
nivel de tratamiento preciso puede determinarlo un experto habitual
en la técnica sin experimentación excesiva.
La dosis oral unitaria puede comprender desde
0,01 hasta 50 mg, preferiblemente de 0,1 a 10 mg del compuesto. La
dosis unitaria puede administrarse una o más veces al día como uno o
más comprimidos que contienen cada uno desde 0,1 hasta 10, de
manera conveniente de 0,25 a 50 mg del compuesto o sus solvatos.
Además de administrar el compuesto como un
producto químico sin procesar, los compuestos de la invención pueden
administarse como parte de una preparación farmacéutica que
contiene vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que
comprenden excipientes y productos auxiliares que facilitan el
procesamiento de los compuestos en preparaciones que pueden usarse
farmacéuticamente. Preferiblemente, las preparaciones,
particularmente las preparaciones que pueden administrarse por vía
oral y que pueden usarse para el tipo preferido de administración,
tales como comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar y
cápsulas, y también preparaciones que pueden administrarse por vía
rectal, tales como supositorios, así como disoluciones adecuadas
para administración mediante inyección o por vía oral, contienen
desde el 0,01 hasta el 99 por ciento, preferiblemente desde el 0,25
hasta el 75 por ciento del/de los compuesto(s)
activo(s), junto con el excipiente.
También se incluye dentro del alcance de la
presente invención el uso de sales no tóxicas farmacéuticamente
aceptables de los compuestos de la invención para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de los estados
patológicos reivindicados. Las sales de adición de ácido se forman
mezclando una disolución del compuesto con una disolución de un
ácido no tóxico farmacéuticamente aceptable tal como ácido
clorhídrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido
acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico, ácido
fosfórico y ácido oxálico. Por ejemplo, se forman sales básicas
mezclando una disolución de la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
con una disolución de una base no tóxica farmacéuticamente aceptable
tal como hidróxido de sodio y carbonato de sodio.
Sales preferidas de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
de la invención son las sales sumamente solubles que comprenden un
contraión amonio C_{3-24}, en las que uno de los
grupos alquilo puede estar sustituido con un grupo hidroxilo. La
mayoría de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
son sumamente insolubles en disolución acuosa. Por tanto, la
administración i.v. de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
está limitada por la insolubilidad relativa del principio activo.
Pueden prepararse las sales de amonio sumamente solubles, por
ejemplo, mediante disolución de la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en una disolución de un equivalente molar del hidróxido de amonio o
compuesto de amino correspondiente.
Los contraiones amonio pueden ser cationes de
amonio cuaternario o aminas mono, di o trisustituidas que forman
sales de amonio protonadas cuando se mezclan con una
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en disolución.
La sal de monocolina de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
tiene un pH de aproximadamente 7,8-9,8, dependiendo
de la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
usada. Alternativamente, la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
puede disolverse en primer lugar en una disolución que contiene 2
equivalentes molares del hidróxido de amonio. La sal de dicolina
puede aislarse o el pH de la disolución puede ajustare hasta
aproximadamente 7,8-9,8 con 1 equivalente de ácido
acético.
La sal de amonio de las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
puede aislarse fácilmente en forma pura liofilizando la disolución
para dar un polvo seco que es sumamente soluble en agua. Hasta 90
mg/ml o más de la sal de monocolina de una
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
se disolverán en agua para dar una disolución clara. La sal también
puede disolverse en una disolución de glucosa isotónica adecuada
para inyección i.v.
Los ejemplos de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
que pueden solubilizarse según la presente invención incluyen las
dadas a conocer en el presente documento así como las dadas a
conocer en las patentes estadounidenses número 5.109.001,
5.081.123, 5.079.250, 5.075.306, 5.057.516, 5.026.704, 5.061.706,
4.977.155, 4.975.430, 4.889.855, 4.812.458, 3.992.378, 3.962.440,
4.812.458, 4.659.713, 4.948.794, la publicación de solicitud
internacional número WO91/13878, Yoneda y Ogita, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 164:841-849 (1989), Kleckner y
Dingledine, Mol. Pharm. 36:430-436 (1989), Rao,
T.S. et al., Neuropharmacology 29:1031-1035
(1990), Pellegrini-Giampietro, D.E. et al.,
Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286 (1989), Ogita y
Yoneda, J. Neurochem. 54:699-702 (1990), Kessler,
M. et al., Brain Res. 489:377-382 (1989),
publicación de solicitud de patente europea número 0 377 112, 0
315 959 y 260,467, Lester, R.A. et al., Mol. Pharm.
35:565-570 (1989), Patel, J. et al., J.
Neurochem. 55:114-121 (1990), Horner, L. et
al., Chem. Abstracts 48:2692 (1953), Cheeseman, G.W.H., J. Chem.
Soc.: 1170-1176 (1962), Honore, T. et al.,
Science 241:701-703 (1988) y Sheardown, M.J. et
al., Eur. J. Pharmacol. 174:197-204 (1989), las
descripciones de los cuales se incorporan completamente como
referencia en el presente documento.
Los ejemplos de hidróxidos de amonio que pueden
usarse para preparar las sales de amonio de la presente invención
incluyen cualquier hidróxido de amonio de tetraalquilo
C_{1-6}, por ejemplo hidróxido de
tetrametilamonio, hidróxido de tetraetilamonio, hidróxido de
tetrabutilamonio, hidróxido de tetrapentilamonio, hidróxido de
tetrahexilamonio, así como cualquier hidróxido de amonio de
trialquil C_{1-6}-alcanol
C_{1-6}, por ejemplo hidróxido de colina,
hidróxido de
(3-hidroxipropil)trimetil-amonio,
hidróxido de (4-hidroxibutil)trimetilamonio,
hidróxido de (2-hidroxietil)trietilamonio,
hidróxido de (2-hidroxietil)tripropilamonio e
hidróxido de (2-hidroxietil)tributilamonio.
Preferiblemente, el hidróxido de amonio es hidróxido de colina.
Además, puede emplearse cualquier hidróxido de aralquil
C_{6-12}-trialquil
C_{1-6}-amonio, por ejemplo
hidróxido de benciltrimetilamonio.
Los ejemplos de compuestos de amino que pueden
usarse para preparar sales de las
1,4-quinoxalin-2,3-dionas
incluyen, pero no se limitan a etilendiamina, dietilentriamina,
N-metiletanolamina,
di-(2-etanol)amina,
tri-(2-etanol)amina, espermidina, espermina
y aminocarbohidratos tales como glucosamina,
N-metil-glucamina, galactosamina,
manosamina, xilosamina, celobiosamina y maltosamina. Otros
compuestos de amino que pueden usarse para preparar sales de amonio
de las
1,4-dihidroquionoxalina-2,3-dionas
de la presente invención incluyen mono-N-, di-(N,N y
N,N'), tri-(N,N,N') y tetra-(N,N,N',N') alquil
C_{1-6}-guanidinas así como
biguanidina, biguanidinas polialquil
C_{1-6}-sustituidas, amidina,
arginina, N-alquil
C_{1-6}-amidinas,
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU), tris(hidroximetil)aminometano (Tris,
trometamina) y bis-tris-propano.
Tal como se muestra en la figura 21, cuando se
prepara la sal de monopotasio del compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
es insoluble en agua. Sin embargo, la sal de dipotasio de la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es soluble en agua, pero requiere la adición de 4 equivalentes de
KOH para dar una disolución que tiene un pH de 12,7. La
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
permanecerá soluble cuando el pH se disminuye hasta 11,9 mediante
la adición de un equivalente de ácido acético. Sin embargo, la
adición de un segundo equivalente de ácido acético produce que se
forme un precipitado. En el tiempo en el que el pH alcanza 11, se
completa la precipitación. Se ha descubierto inesperadamente que la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
se disuelve fácilmente en sólo 1 equivalente de hidróxido de
colina. Cuando se añade ácido acético, no comienza a formarse un
precipitado hasta que el pH alcanza aproximadamente 9,2. De manera
similar la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
puede disolverse en 1 equivalente de hidróxido de colina en agua.
El pH puede ajustarse hasta aproximadamente 8 sin aparición de un
precipitado. La sal de monocolina seca puede aislarse en forma pura,
por ejemplo, mediante liofilización de una disolución acuosa, y es
soluble a concentraciones muy altas (al menos de 90 mg/ml). Por
tanto, este aspecto de la invención es un gran avance en la técnica
ya que permite la preparación de disoluciones acuosas concentradas
de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
para administración
intravenosa.
intravenosa.
Algunos de los contraiones amonio útiles para
solubilizar
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
pueden mostrar toxicidad tras la administración i.v., por ejemplo,
hidróxido de tetrametilamonio e hidróxido de tetraetilamonio. Se ha
descubierto que muchas
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
pueden solubilizarse fácilmente en disoluciones 0,05
M-0,5 M de
trishidroximetilamino-metano (Tris, trometamina
USP). La trometamina es prácticamente no tóxica cuando se
administra por vía intravenosa en seres humanos. Por tanto, una
disolución en trometamina de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
es sumamente útil para la administración i.v. a seres humanos y
supera el obstáculo principal para lograr una disolución de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
para uso i.v. en seres humanos. La presente invención se refiere en
parte a este descubrimiento. Como alternativa a la trometamina,
puede usarse bis-tris-propano
(1,3-bis[tris-(hidroximetil)metilamino]-propano),
un análogo de trometamina que también muestra baja toxicidad en
mamíferos. El bis-tris-propano tiene
una pK superior a la trometamina y por tanto es útil para disolver
algunas
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
que no son fácilmente solubles en trometamina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden administrarse a cualquier animal que puede experimentar los
efectos beneficiosos de los compuestos de la invención. En primer
lugar entre tales animales están los seres humanos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden administrarse por cualquier medio que logre su fin
deseado. Por ejemplo, la administración puede ser mediante las vías
parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular,
intraperitoneal, transdérmica, bucal u ocular. Alternativa o
simultáneamente, la administración puede ser mediante la vía oral.
La dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del
receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, si hay alguno, la
frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Cuando las composiciones de la invención se
administran por vía ocular, puede lograrse o bien administración
local o bien sistémica. Por ejemplo, las composiciones de la
presente invención pueden administrarse en forma de gotas oculares
que son sustancialmente isotónicas con el líquido lagrimal para
lograr la administración sistémica. Preferiblemente, tales
composiciones comprenderán también un agente de mejora de la
permeación que ayuda a la absorción sistémica de los compuestos de
la presente invención. Véase, por ejemplo, la patente
estadounidense número 5.182.258. Alternativamente, las composiciones
de la invención pueden administrarse por vía ocular para tratar o
prevenir la degeneración del nervio óptico. En esta realización, los
compuestos de la presente invención se administran en forma de
gotas oculares, tal como se dio a conocer anteriormente, o pueden
inyectarse en las proximidades del nervio óptico. Como alternativa,
pueden emplearse implantes oculares finos que liberan lentamente los
compuestos de la presente invención.
Además de los compuestos farmacológicamente
activos, las nuevas preparaciones farmacéuticas pueden contener
vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden
excipientes y productos auxiliares que facilitan el procesamiento
de los compuestos activos para dar preparaciones que pueden usarse
farmacéuticamente. Preferiblemente, las preparaciones,
particularmente las preparaciones que pueden administrarse por vía
oral y que pueden usarse para el tipo preferido de administración,
tales como comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar y
cápsulas, y también preparaciones que pueden administrarse por vía
rectal, tales como supositorios, así como disoluciones adecuadas
para administración mediante inyección o por vía oral, están
presentes a una concentración de desde el 0,01 hasta el 99 por
ciento, junto con el excipiente.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente
invención se fabrican de una manera que se conoce por sí misma, por
ejemplo, por medio de procedimientos de mezclado, granulación,
preparación de comprimidos recubiertos de azúcar, disolución o
liofilización convencionales. Por tanto, las preparaciones
farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando compuestos
activos con excipientes sólidos, moliendo opcionalmente la mezcla
resultante y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir productos
auxiliares adecuados, si se desea o es necesario, para obtener
comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar.
Excipientes adecuados son, en particular, cargas
tales como sacáridos, por ejemplo lactosa o sacarosa, manitol o
sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por
ejemplo fosfato de tricalcio o hidrogenofosfato de calcio, así como
aglutinantes tales como pasta de almidón, usando, por ejemplo,
almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de
patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o
polivinilpirrolidona. Si se desea, pueden añadirse agentes
disgregantes tales como los almidones mencionados anteriormente y
también carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar
o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.
Los productos auxiliares son, sobre todo, agentes reguladores del
flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o
sales del mismo, tales como estearato de magnesio o estearato de
calcio, y/o polietilenglicol. Los núcleos de comprimidos
recubiertos de azúcar se proporcionan con recubrimientos adecuados
que, si se desea, son resistentes a los jugos gástricos. Para este
fin, pueden usarse disoluciones concentradas de sacárido, que
opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio,
disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de
disolventes. Con el fin de producir recubrimientos resistentes a
los jugos gástricos, se usan disoluciones de preparaciones de
celulosa adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato
de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse colorantes o
pigmentos a los recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar
o comprimidos, por ejemplo, para la identificación o con el fin de
caracterizar combinaciones de dosis de compuesto activo.
Otras preparaciones farmacéuticas que pueden
usarse por vía oral incluyen cápsulas duras compuestas por gelatina,
así como cápsulas blandas, selladas compuestas por gelatina y un
plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras
pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que
pueden mezclarse con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales
como almidones y/o lubricantes tales como talco y estearato de
magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los
compuestos activos se disuelven o suspenden preferiblemente en
líquidos adecuados, tales como aceites grasos, o parafina líquida.
Además, pueden añadirse estabilizantes.
Las posibles preparaciones farmacéuticas que
pueden usarse por vía rectal incluyen, por ejemplo, supositorios,
que consisten en una combinación de uno o más de los compuestos
activos con una base de supositorio. Bases de supositorio adecuadas
son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, o
hidrocarburos de parafina. Además, también es posible usar cápsulas
rectales de gelatina que consisten en una combinación de los
compuestos activos con una base. Los materiales de base posibles
incluyen, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles o
hidrocarburos de parafina.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos
en forma soluble en agua, por ejemplo, sales de amonio solubles en
agua (especialmente tris,
bis-tris-propano y colina) y
disoluciones alcalinas. Además, pueden administrarse suspensiones de
los compuestos activos como suspensiones de inyección aceitosas
apropiadas. Los vehículos o disolventes lipófilos adecuados incluyen
ácidos grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos
grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos o
polietilenglicol-400 (los compuestos son solubles en
PEG-400). Las suspensiones de inyección acuosas
pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la
suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio,
sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede
contener estabilizantes.
La caracterización de los sitios de unión a
glicina in vitro ha sido difícil debido a la carencia de
ligandos de fármaco selectivos. Por tanto, pueden usarse ligandos
de glicina de la presente invención para caracterizar el sitio de
unión a glicina. Las
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
sustituidas particularmente preferidas que pueden usarse para este
fin son derivados radiomarcados isotópicamente, por ejemplo en los
que uno o más de los átomos se sustituyen por ^{3}H, ^{11}C,
^{14}C, ^{15}N o ^{18}F. Además, pueden incorporarse emisores
de positrones tales como ^{11}C y ^{18}F en la
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
para su uso en la tomografía de emisión de positrones (PET) para la
localización de los sitios de unión a glicina. Además, pueden
usarse
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
sustituidas con ^{123}I para la obtención de imágenes mediante
tomografía computerizada por emisión de fotón único (SPECT) del
sitio de unión a glicina. Además, pueden prepararse compuestos
marcados isotópicamente que no son radiactivos para su uso en
estudios metabólicos, por ejemplo en los que uno o más de los
hidrógenos y/o carbonos se enriquecen en ^{2}H o ^{13}C.
\vskip1.000000\baselineskip
En los siguientes ejemplos 1-27,
todos los ^{1}H RMN se ejecutaron a 300 MHz y los ^{13}C RMN a
75 MHz en un instrumento QE-300 y en referencia al
disolvente de protio residual. Se ejecutaron los ^{19}F RMN a 339
MHz en un instrumento NT-360 y en referencia a
C_{6}F_{6} externo. Se tomaron los puntos de fusión en un
aparato de punto de fusión Mel-Temp y no están
corregidos. Se colocaron las muestras en el bloque cuando la
temperatura era >250ºC con el fin de minimizar la descomposición
antes de la fusión. Se destiló DMF antes de su uso. Todos los demás
reactivos se usaron tal como se recibieron del fabricante. Los
compuestos se adquirieron de Aldrich Chemical Co. a menos que se
indique lo contrario a continuación.
1,2-Dinitro-3,4,5,6-tetraclorobenceno,
5,6-diamino-1,3-dimetiluracilo
hidratado y
1,2-diamino-3-cloro-5-trifluorometilbenceno
se adquirieron de Maybridge Chemical.
3-Fluoro-6-nitroanilina
se obtuvo del Dr. Michael Scherz.
1,2-Diamino-4-cloro-5-fluorobenceno,
1,2-diamino-3-cloro-5-trifluorometilbenceno
y
1,2-diamino-3-bromo-5-trifluorometilbenceno
se adquirieron de PCR Chemical.
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Método
A
6,7-Dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona.
(1) Se agitó una mezcla de 422 mg (2,5 mmol) de
4,5-dicloro-o-fenilendiamina
(Pfaltz & Bauer, Inc., usada tal como se recibió) y 1,10 g (7,5
mmol) de oxalato de dietilo (Sigma, usado tal como se recibió) bajo
Ar a 160ºC durante 2 h, luego a 180ºC durante 7 h. Se permitió que
la mezcla de reacción se enfriase hasta t.a. (22ºC), se diluyó con
hexanos (10 ml), se recogió el precipitado mediante centrifugación
y se lavó con hexanos (2 x 10 ml). Se agitó el sólido gris con 40 ml
de NaOH ac. (aproximadamente 1 N) y carbón activado (0,4 g) a t.a.
durante 30 min., se eliminó el carbón mediante filtración a vacío y
se lavó con H_{2}O destilada (6 x 10 ml), que se combinaron con el
filtrado original, se acidificaron sin HCl ac. aproximadamente 4 N
(aproximadamente 20 ml). Se recogió el precipitado blanco mediante
filtración a vacío, se lavó con H_{2}O destilada (5 x 10 ml),
EtOH (3 x 5 ml), entonces se secó a 60ºC bajo 0,1 mmHg durante 8 h
produciendo 426 mg (73,8%) de 1 como un sólido color crema.
p.f.>400ºC ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) 12,010 (s,
2H) 7,226 (s, 2H) ppm.
5-Nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona.
(2) Se disolvió compuesto 1 (416 mg, 1,80 mmol) en 5,5 ml de
H_{2}SO_{4} conc. a 0ºC con agitación. A esta disolución gris
intenso resultante se le añadieron 202 mg (2,22 mmol) de KNO_{3}
finamente molido (Baker, usado tal como se recibió) a 0ºC con
agitación. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 h, luego a t.a.
(22ºC) durante 30 h. Se añadió la mezcla de reacción a
hielo-H_{2}O (60 g), se recogió el precipitado
mediante filtración a vacío, se lavó con H_{2}O destilada (5 x 10
ml), EtOH (3 x 5 ml), luego se secó bajo 0,1 mm Hg a 80ºC durante 2
h produciendo 443,5 mg (89,6%) de 2 bruto como un sólido amorfo
color crema (el ^{1}H RMN indicó que era puro al
95-98%).
La purificación adicional fue tal como
sigue:
Se disolvieron 443 mg de 2 bruto (obtenido
anteriormente) en NaOH ac. aproximadamente 1 N (120 ml) a t.a., se
añadió carbón activado (1 g), luego se agitó a t.a. durante 15 min.
Se eliminó el carbón mediante filtración a vacío, se lavó con
H_{2}O destilada (2 x 10 ml). Se acidificó el filtrado combinado
hasta pH 2 con HCl ac. aproximadamente 4 N (aproximadamente 50 ml).
Se recogió el precipitado mediante filtración a vacío, se lavó con
H_{2}O destilada (5 x 10 ml), EtOH (2 x 5 ml), se secó bajo 0,1
mmHg a 80ºC durante 2 h produciendo 327 mg (recuperación del 74%)
de 2 esencialmente puro, p.f. 350-4ºC (desc.). (El
^{1}H RMN indicó que casi no había impurezas presentes).
Recristalización: se disolvieron 315 mg de 2 más
puro (obtenido anteriormente) en 45 ml de DMSO, a esta disolución
se le añadió H_{2}O (aproximadamente 1 ml) gota a gota hasta que
se produjo un precipitado. Se calentó la mezcla (en un baño de
aceite a 100-105ºC) con agitación (usando una barra
magnética pequeña), se añadió gota a gota H_{2}O (aproximadamente
1 ml) hasta que se formó una mezcla turbia y se añadió gota a gota
DMSO para producir una disolución transparente. Tras permanecer en
reposo a t.a. durante 8 h, se recogieron los microcristales
amarillos mediante filtración a vacío, se lavaron con H_{2}O (5 x
10 ml), EtOH (2 x 3 ml), se secaron bajo 0,1 mm Hg a 80ºC durante 3
h produciendo 286 mg (recuperación del 90,8%) de 2 puro, p.f.
354-7ºC.
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Método
B
4,5-Dicloro-1,2-fenilendiamina
(1) A una suspensión de 6,21 g (30,0 mmol) de
4,5-dicloro-2-nitroanilina
(Aldrich, usado tal como se recibió) en EtOH (100 ml) se le
añadieron 310 mg de Pd al 5%/C, se hidrogenó la mezcla a
30-20 parr de H_{2} durante 4 h, luego se filtró.
Se evaporó por rotación el filtrado hasta sequedad. Se agitó el
residuo sólido negro con 250 ml de HCl ac. 2 N durante 20 min.,
luego se filtró. Se basificó el filtrado hasta pH 13 con NaOH ac. 4
N (125 ml). Se recogió el precipitado en un embudo sinterizado
mediante filtración a vacío, se lavó con H_{2}O (5 x 10 ml), se
secó a 40ºC bajo 0,1 mmHg durante 16 h dando 3,72 g (70%) del
producto bruto como un polvo de color café.
Se purificó el producto bruto (3,70 g) obtenido
anteriormente mediante cristalización en benceno (60 ml) produciendo
3,17 g (recuperación del 85%) como escamas ligeramente púrpuras, que
eran puras mediante CCF (CHCl_{3}:
EtOH = 9:1). P.f. 159-60ºC (Aldrich: 159-62ºC).
EtOH = 9:1). P.f. 159-60ºC (Aldrich: 159-62ºC).
6,7-Dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona:
se sometió a reflujo una suspensión de 2,655 g (15,0 mmol) de
4,5-diclorofenilen-1,2-diamina
y 1,986 g (15,75 mmol) de ácido oxálico dihidratado (Fisher
Scientific Co., usado tal como se recibió) en 22,5 ml de HCl ac. 2
N con agitación a 125ºC (temperatura del baño) durante 2,5 h,
(durante los primeros 5 min. de calentamiento, la suspensión casi se
volvió una disolución, luego comenzó a formar un precipitado). Se
permitió que la mezcla de reacción se enfriase hasta 22ºC, y se
añadió H_{2}O (50 ml). Se recogió el precipitado en un embudo
Hirsh mediante filtración a vacío, se lavó con H_{2}O (6 x 25 ml)
y se secó a 60ºC bajo 0,1 mmHg durante 12 h produciendo 3,39 g (98%)
de
6,7-dicloroquinoxalin-2,3-diona
como un polvo rosa intenso. P.f. > 400ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 12,016 (s, 2H), 7,234 (s,
2H). Este producto se usó en la siguiente reacción sin purificación
adicional.
6,7-Dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona:
se disolvieron 3,335 g (14,5 mmol) de
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en 65 ml de H_{2}SO_{4} conc. con agitación y enfriamiento en
un baño de hielo-H_{2}O, luego se añadieron 2,20
g (21,76 mmol) de KNO_{3} (Baker, usado tal como se recibió) en
porciones a lo largo de 10 min. con agitación. Se agitó la mezcla
resultante a 22ºC bajo N_{2} durante 20 h. entonces se vertió
lentamente en hielo-H_{2}O (400 ml) con
agitación. Se recogió el precipitado en un embudo sinterizado
mediante filtración a vacío, se lavó con H_{2}O (5 x 10 ml) y se
secó a 60ºC bajo 0,1 mmHg durante 12 h produciendo 3,39 g (85%) de
la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
bruta como un polvo gris amarillo. Pureza: > 98,5% basándose en
el análisis por HPLC.
Se purificó el compuesto tal como sigue. Se
añadieron 3,365 g de
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
obtenida anteriormente a 550 ml de NaOH ac. 1 N y se agitó
vigorosamente durante 20 min. Se filtró la mezcla resultante
mediante filtración a vacío a través de un embudo sinterizado para
eliminar una pequeña cantidad de material insoluble. Al filtrado se
le añadió lentamente HCl conc. (aproximadamente 43 ml) (gota a gota)
con agitación vigorosa para ajustar el pH desde 13 hasta 11 (usando
un pH-metro para monitorizar). (Un experimento de
blanco mostró que la
6,7-dicloroquinoxalin-2,3-diona,
el material de partida para la reacción de nitración, podría
precipitarse a partir de su disolución en NaOH ac. 1 N sólo en la
condición tal que el pH estuviese dentro de 9,5-8.)
Se recogió el precipitado en un embudo sinterizado mediante
filtración a vacío y se lavó con H_{2}O (5 x 50 ml). Se añadió el
producto húmedo a 200 ml de H_{2}O, y a esta disolución resultante
se le añadió lentamente HCl conc. (gota a gota) para ajustar el pH
hasta 5. Se recogió el precipitado en un embudo Hirsh mediante
filtración a vacío, se lavó con H_{2}O (8 x 50 ml) y se secó a
60ºC bajo 0,1 mmHg durante 16 h produciendo 3,12 g (recuperación
del 92,9%) de la
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
más pura. P.f. 347-8ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): 12,265 (sa, 2H), 7,379 (s, 1H).
Pureza: > 99,2% basándose en el análisis por HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 439,0 mg (3,0 mmol) de oxalato de
dietilo (de Sigma, usado tal como se recibió) a 210,6 mg (1,0 mmol)
de
1,2-diamino-3-cloro-5-trifluorometilbenceno
(de PCR Inc., usado tal como se recibió), y se calentó la
disolución amarilla resultante a 180ºC (temperatura del baño) bajo
Ar con agitación durante 3,5 h, la disolución se volvió espesa con
formación de un precipitado color crema y difícil de agitar. Se
permitió que la mezcla de reacción se enfriase hasta t.a. y se
trituró con hexano (10 ml). Se recogió el precipitado mediante
filtración a vacío, se lavó con hexano (2 x 10 ml) (se guardó el
filtrado de hexano combinado), se secó bajo 0,1 mmHg durante 4 h
produciendo 134,6 mg (58%) del producto bruto deseado como un polvo
amarillo (puro al 95-98% mediante RMN), p.f.
330-2ºC (desc.) (bloque precalentado).
Se agitó una porción (125,5 mg) del producto
bruto obtenido anteriormente con NaOH ac. 1 N (10 ml) a t.a., se
acidificó la disolución básica amarilla transparente resultante
hasta pH 2 mediante la adición de HCl ac. 5 N (aproximadamente 1,2
ml) gota a gota con agitación a t.a. Se recogió el precipitado
blanco mediante centrifugación, se lavó con H_{2}O (5 x 10 ml),
luego se secó mediante evaporación conjunta con EtOH (2 x 10 ml) a
40ºC dando 118,8 mg (recuperación del 94,6%) de compuesto puro
(mediante RMN) como un polvo blanquecino, p.f.
334-6ºC (desc.) (bloque precalentado). Los intentos
de recristalizar en EtOH, EtOH-H_{2}O y
DMSO-H_{2}O fallaron (esas disoluciones sólo
dieron o bien un precipitado o bien no). ^{1}HRMN
(DMSO-d_{6}) \delta: 7,349(s, 1H),
7,604(s, 1H), 11,724(s, 1H), 12,222(s, 1H)
ppm.
El filtrado de hexano combinado obtenido
anteriormente se evaporó por rotación a 40ºC hasta sequedad, se
calentó el residuo (aceite naranja viscoso) a 180ºC durante 5 h. Se
trituró el sólido a granel marrón resultante con hexano (5 ml), se
recogió el precipitado mediante centrifugación, se lavó con hexano
(4 x 5 ml), luego se agitó con NaOH ac. 1 N (4,5 ml), se centrifugó
para eliminar una pequeña cantidad de sólido negro, se acidificó el
sobrenadante hasta pH 2 mediante la adición de HCl ac. 5 N
(aproximadamente 1 ml) gota a gota con agitación a t.a. Se recogió
el precipitado amarillento mediante centrifugación, se lavó con
H_{2}O (5 x 5 ml), luego se secó mediante evaporación conjunta
con EtOH (3 x 5 ml) a 40ºC produciendo 51,8 mg (22,3%, basándose en
la diamina de partida de la primera reacción) del compuesto del
título como un polvo amarillento (esencialmente puro mediante RMN),
p.f. 334-6ºC (bloque precalentado).
Tras la recuperación se volvió a usar el
material mixto, el rendimiento total fue de aproximadamente el
77%.
El resultado notificado por el presente
documento era a partir de uno de tres experimentos y era
reproducible. También se intentó la reacción con una razón 1:2 de la
diamina con respecto al oxalato usando el mismo procedimiento que
para la razón 1:3, pero el producto era complicado.
Alternativamente, se preparó el compuesto del
título usando una adaptación del método de Cheeseman, G.W.H., J.
Chem. Soc. 1171 (1962). Se calentó hasta reflujo una mezcla de
oxalato de dietilo (1,34 g, 9,60 mmol) y
1,2-diamino-3-cloro-5-trifluorometilbenceno
(200 mg, 0,95 mmol) bajo N_{2} durante 2 h. Se permitió que la
reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y se recogió el
sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con EtOH helado (10
ml). Se disolvió este sólido amarillo blanco en NaOH 1 N (15 ml) y
se eliminaron unas pocas partículas insolubles mediante filtración
por gravedad. Se trató la disolución con carbón decolorante y la
mezcla se filtró a través de un lecho de Celite y la disolución
resultante se acidificó con HCl 4 N. Se formó un precipitado que se
aisló mediante filtración a vacío y se lavó con agua (20 ml). Se
secó este sólido blanco en una pistola de secado (0,05 torr, 78ºC)
dando 91,9 mg (36,0%), p.f. 346-348ºC (desc.).
^{1}H RMN (d_{6}-dmso) \delta 7,30 (s, 1H,
ArH), 7,53 (s, 1H, ArH), 11,9 (s a, 2H, NH). ^{19}F RMN (patrón
externo C6F6, \delta -162,9) \delta -58,43 (s).
EI-HRMS calc. para
C_{9}H_{4}ClF_{3}N_{2}O_{2} 263,9912, hallado
263,9891.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
2-cloro-4-fluoro-6-nitroanilina
usando una adaptación del método de Mitchell, et al.
(Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A una
disolución de
4-fluoro-2-nitroanilina
(500 mg, 3,2 mmol) en DMF seca (10 ml) bajo N_{2} se añadió gota
a gota una disolución de N-clorosuccinimida (426 mg,
3,2 mmol) en DMF seca (16 ml). Se permitió que la reacción se
agitase durante la noche. Entonces se vertió la disolución en 100
ml de H_{2}O y se extrajo la suspensión turbia resultante con 4 x
25 ml de acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas
combinadas con 4 x 25 ml de H_{2}O y 25 ml de de disolución
saturada de NaCl y se secaron (MgSO_{4}). Se filtró a vacío el
MgSO_{4} y se evaporó por rotación el disolvente dando un sólido
cristalino marrón que se purificó adicionalmente mediante
cromatografía ultrarrápida (hexanos:acetato de etilo 2:1) dando 424
mg de un sólido cristalino naranja (69,5%) ^{1}H RMN (CDCl_{3})
\delta 6,46 (s a, 2H, NH_{2}), 7,42 (dd,
J_{H5-3} = 3 Hz, J_{H3-F} = 7,2
Hz, H-4), 7,85 (dd, J_{H5-3} = 3
Hz, J_{H5-F} = 8,7 Hz, H-5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
1,2-diamino-3-cloro-5-fluorobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy, et al.,
(Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se
calentó una mezcla de
2-cloro-4-fluoro-6-nitroanilina
(424 mg, 2,22 mmol) y SnCl_{2} 2H_{2}O (2,50 g, 11,1 mmol)
disuelta en 7 ml de acetato de etilo y 3 ml de etanol absoluto bajo
N_{2} a 70ºC durante 2,5 h. Todo el material de partida había
reaccionado tal como se comprobó mediante CCF (gel de sílice,
hexanos:acetato de etilo 2:1). Se permitió que la reacción se
enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en 20 ml de hielo
triturado. Se añadió suficiente NaHCO_{3} sólido (¡formación de
espuma!) para llevar el pH hasta 6. Entonces se extrajo la emulsión
amarilla blanca espesa con 3 x 25 ml de acetato de etilo y se
lavaron los extractos orgánicos combinados con disolución saturada
de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4}), se filtró a vacío y
se evaporó el disolvente por rotación dando un aceite marrón oscuro
que cristalizó en reposo dando 290 mg (82%). ^{1}H RMN
(CDCl_{3}) \delta 3,59 (s a, 4H, 2(NH_{2})); 6,37 (dd,
1H, H5, J_{4-5} = 2,7, J_{H-F} =
9,3); 6,55 (dd, 1H, H4, J_{4-5} = 2,7, J_{HF} =
8,4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
5-cloro-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
usando una adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H.
J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de
dietilo (2,64 g, 18,1 mmol) y
1,2-diamino-3-cloro-5-fluorobenceno
(290 mg, 1,81 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 10 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogieron los cristales amarillo-marrón
brillantes mediante filtración a vacío y se aclararon con EtOH (10
ml) y se secaron al aire dando 164,1 mg (42%). Se tomó una parte de
este sólido y se disolvió en 10 ml de NaOH 1 N. Se trató la
disolución con carbón activado y se filtró a través de un lecho de
Celite. Se acidificó cuidadosamente la disolución resultante con HCl
1 N (pH = 6). Se formaron lentamente agujas amarillo pálido en la
disolución y se recogieron mediante filtración a vacío, se
aclararon con 20 ml de H_{2}O y se secaron adicionalmente a vacío
(0,1 torr, 78ºC) dando 67,8 de cristales amarillo pálido
pulverulentos. P.f. 306-308ºC (desc.), ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,28 (s, 1H, ArH), 7,56 (s,
1H, ArH), 11,7 (s a, 2H, NH), EI-EM m/z 216 (M+2,34,
214 (M+, pb), 188 (21), 186 (68), 123 (61), 131 (62).
EI-HRMS calc. para C_{8}H_{4}ClFN_{2}O_{2}
213,9945, hallado 213,9961.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se preparó
2-cloro-3,4-difluoro-6-nitroanilina
usando una adaptación del método de Mitchell et al.
(Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A una
disolución de
4,5-difluoro-2-nitroanilina
(500 mg, 2,87 mmol) en DMF (16 ml) bajo N_{2} se le añadió
N-clorosuccinimida (401 mg, 3,00 mmol) en DMF. Se
permitió que la reacción se agitase durante 48 h. Entonces se
vertió la disolución en 75 ml de H_{2}O. Entonces se extrajo la
suspensión naranja turbia que se formó con 4 x 25 ml de cloruro de
metileno. Se lavaron los extractos orgánicos combinados con 5 x 20
ml de H_{2}O y 25 ml de disolución saturada de NaCl. Se secó la
fase orgánica (MgSO_{4}) y se eliminó el agente de secado
mediante filtración a vacío. Se evaporó el disolvente por rotación
dando un aceite amarillo naranja que cristalizó en reposo. El
^{1}H RMN mostró que este sólido era una mezcla de producto
clorado y material de partida. Se separó la mezcla mediante
cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, hexanos: acetato de
etilo 3:1) dando 162 mg de un sólido cristalino amarillo (27%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 6,60 (s a, 2H, NH_{2}), 8,00
(m, ^{1}H, H-5). Había una contaminación con
material de partida del 17% mediante RMN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3-cloro-4,5-difluoro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy et al. (Bellamy,
F. D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se disolvió
una mezcla de
2-cloro-3,4-difluoro-6-nitroanilina
(160 mg, 0,767 mmol) y SnCl_{2} 2H_{2}O (0,863 g, 3,84 mmol) en
5 ml de acetato de etilo y 2 ml de etanol absoluto bajo N_{2} y
se calentó a 75ºC durante 5 h. Se permitió que la reacción se
enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en 50 ml de
H_{2}O. Se añadió suficiente disolución saturada de NaHCO_{3}
(¡formación de espuma!) para llevar el pH hasta 7. Se extrajo la
mezcla resultante con 3 x 20 ml de acetato de etilo y se lavaron
los extractos orgánicos combinados con 20 ml de disolución saturada
de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4}), se filtró a vacío y
se evaporó el disolvente por rotación dando un sólido marrón, 124 mg
(91%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,52 (s a, 4H,
2(NH_{2})); 6,49 (dd, 1H, J_{HF} = 7,5, 10,8 Hz,
H-6). Estaba presente un 13% de
4,5-difluoro-1,2-diaminobenceno
mediante RMN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.Soc.
1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (981 mg,
6,72 mmol) y
3-cloro-4,5-difluoro-1,2-diaminobenceno
(120 mg, 0,670 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 15 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido gris mediante filtración a vacío y se aclaró
con EtOH helado (10 ml) y se secó al aire. Se tomó el sólido y se
disolvió en 5 ml de NaOH 1 N con calentamiento. Se trató la
disolución con carbón activado y se filtró a través de un lecho de
Celite. Se acidificó cuidadosamente la disolución resultante con
HCl 1 N (pH = 1). Se formó un polvo blanco en la disolución a pH =
6, pero unas pocas gotas de NaOH 1 N aclararon la disolución y tras
la adición de una pocas gotas de HCl 1 N se formaron lentamente
agujas blancas en la disolución. Estas se recogieron mediante
filtración a vacío, se aclararon con 20 ml de H_{2}O y se secaron
a vacío (0,1 torr, 78ºC) dando 24,9 (16%) de agujas amarillo pálido.
^{1}H RMN (d_{6}-DMSO) \delta 7,05 (dd, 1H, J
= 10,5, H-8), 11,6 (s a, 1H, NH), 12,0 (s a, 1H,
NH). Estaba presente un 13% de
6,7-difluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
mediante RMN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
2-bromo-3,4-difluoro-6-nitroanilina
usando una adaptación del método de Mitchell et al.
(Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A una
disolución de
4,5-difluoro-2-nitroanilina
(500 mg, 2,87 mmol) en DMF (25 ml) bajo N_{2} se le añadió toda
de una vez N-bromosuccinimida (511 mg, 2,87 mmol) en
DMF seca (16 ml). Se permitió que la reacción se agitase durante la
noche. La CCF (hexanos:acetato de etilo 1:1) mostró todavía algo de
material de partida presente. Se añadió
N-bromosuccinimida adicional (100 mg) y se agitó la
reacción otras 12 h. Entonces se vertió la disolución en 100 ml
H_{2}O y se extrajo la suspensión turbia resultante con 3 x 20 ml
de cloruro de metileno. Se lavaron las fases orgánicas combinadas
con 4 x 25 ml de H_{2}O y 25 ml de disolución saturada de NaCl y
se secaron (MgSO_{4}). Se filtró el MgSO_{4} a vacío y se
evaporó el disolvente por rotación dando un aceite amarillo marrón
que cristalizó lentamente dando 700 mg (96%). ^{1}H RMN
(CDCl_{3}) \delta 6,70 (s a, 2H, NH_{2}), 7,99 (m, 1H,
H-5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3-bromo-4,5-difluoro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy et al. (Bellamy,
F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se calentó una
mezcla de
2-bromo-3,4-difluoro-6-nitroanilina
(700 mg, 2,78 mmol) y SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (3,14 g, 13,9
mmol) disuelta en 7 ml de acetato de etilo y 3 ml de etanol
absoluto bajo N_{2} a 75ºC durante 2 h. Todo el material de
partida había reaccionado tal como se comprobó mediante CCF (gel de
sílice, hexanos:acetato de etilo 2:1). Se permitió que la reacción
se enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en 20 ml de
hielo triturado. Se añadió suficiente disolución saturada de
NaHCO_{3} (¡formación de espuma!) para llevar el pH hasta 5.
Entonces se extrajo la emulsión amarilla blanca espesa con 3 x 25
ml de acetato de etilo y se lavaron los extractos orgánicos
combinados con disolución saturada de NaCl. Se secó la fase
orgánica (MgSO_{4}), se filtró a vacío y se evaporó el disolvente
por rotación dando un aceite marrón oscuro que cristalizó en reposo
dando 410 mg (66%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,59 (s a, 4H,
2(NH_{2})); 6,52 (m, 1H, H-6).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (2,70
g, 18,5 mmol) y
3-bromo-4,5-difluoro-1,2-diaminobenceno
(410 mg, 1,85 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 15 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido marrón oscuro mediante filtración a vacío y se
aclaró con EtOH (20 ml) y se secó al aire dando 215 mg (42%). Se
tomó una parte de este sólido (150 mg) y se disolvió en 20 ml de
NaOH 1 N con calentamiento. Se trató la disolución con carbón
activado y se filtró a través de un lecho de Celite. Se acidificó
cuidadosamente la disolución resultante con HCl 1 N (pH = 1). Se
formaron lentamente agujas amarillo pálido en la disolución y se
recogieron mediante filtración a vacío, se aclararon con 20 ml de
H_{2}O y se secaron a vacío (0,1 torr, 78ºC) dando 67,8 mg de
cristales amarillo pálido pulverulentos, p.f.
306-310ºC (desc.). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,09 (dd, 1H, J = 7,5,
H-8), 11,3 (s a, 1H, NH), 12,1 (s a, 1H, NH).
EI-EM m/z 278 (M+2, 75), 276 (M+, 77), 250 (56), 248
(57), 141 (pb). EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{4}BrF_{2}N_{2}O_{2} 275,9346, hallado
275,9331.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
4-bromo-3-fluoro-6-nitroanilina
usando una adaptación del método de Mitchell et al.
(Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). A una
disolución de
3-fluoro-6-nitroanilina
(500 mg, 3,2 mmol) en DMF seca (15 ml) bajo N_{2} se le añadió
gota a gota una disolución de N-bromosuccinimida
(626 mg, 3,2 mmol) en DMF seca. Se permitió que la reacción se
agitase durante 48 h. Entonces se vertió la disolución en 100 ml de
H_{2}O. Entonces se extrajo la suspensión amarilla turbia que se
formó con 4 x 25 ml de cloruro de metileno. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con 4 x 25 ml de H_{2}O y 25 ml
disolución saturada de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4})
y se eliminó el agente de secado mediante filtración a vacío. Se
evaporó por rotación el disolvente dando un aceite amarillo naranja
que cristalizó en reposo. El ^{1}H RMN mostró que este sólido era
una mezcla de productos mono y dibromados en una razón de 3,8:1. Se
separó la mezcla mediante cromatografía ultrarrápida
(hexanos:acetato de etilo 2:1) dando 324 mg de un sólido amarillo
(43%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 6,19(s a, 2H,
NH_{2}); 6,58(d, 1H, J_{HF} = 9,6, ArH); 8,39(d,
1H, J_{HF} = 6,9, ArH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
4-bromo-5-fluoro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy et al. (Bellamy,
F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se calentó una
mezcla de
4-bromo-3-fluoro-6-nitroanilina
(320 mg, 1,36 mmol) y SnCl_{2} 2H_{2}O (1,53 g, 6,81 mmol)
disuelta en 7 ml de acetato de etilo y 3 ml de etanol absoluto bajo
N_{2} a 75ºC durante 8 h. Permanecía algo de material de partida
(mediante CCF) tras sólo una 1 h de calentamiento. Todo el material
de partida había reaccionado tras 8 h tal como se comprobó mediante
CCF (gel de sílice, hexanos:acetato de etilo 3:1). Se permitió que
la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en
50 ml de H_{2}O. Se añadió suficiente disolución saturada de
NaHCO_{3} (¡formación de espuma!) para llevar el pH hasta 5. Se
extrajo la mezcla resultante con 3 x 25 ml de acetato de etilo y se
lavaron los extractos orgánicos combinados con 20 ml de disolución
saturada de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4}), se filtró
a vacío y se evaporó el disolvente por rotación dando un polvo
blanco 277 mg (99%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,22 (s a,
2H, NH_{2}); 3,60 (s a, 2H, NH_{2}); 6,50 (d, 1H, J_{HF} = 9,6
Hz, H-6); 6,83 (d, 1H, J_{HF} = 6,6 Hz,
H-3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (1,97
ml, 13,5 mmol) y
4-bromo-5-fluoro-1,2-diaminobenceno
(277 mg, 1,35 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 12 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido marrón oscuro mediante filtración a vacío y se
aclaró con etanol (20 ml) y se secó al aire dando 233 mg (67%) de
un sólido marrón pulverulento. Se tomó una porción de este sólido
(100 mg) y se disolvió en 5 ml de NaOH 1 N. Se trató la disolución
con carbón activado y se filtró a través de un lecho de Celite. Se
aclaró el Celite con 10 ml de disolución de NaOH adicional. Se
acidificó cuidadosamente la disolución resultante con HCl 1 N (pH =
5). Se formaron lentamente agujas amarillo brillante en la
disolución y se recogieron mediante filtración a vacío, se aclararon
con 15 ml de H_{2}O y se secaron a vacío (0,1 torr, 78ºC) dando
40,0 mg de cristales amarillos. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 6,99 (d, 1H, J = 9,3,
H-8), 7,29 (d, 1H, J=6,3, H-6),
11,95 (s a, 2H, 2(NH)). EI-EM m/z 260 (M+2,
96), 258 (M+ (pb)), 232 (51), 230 (52), 123 (83).
EI-HRMS calc. para C_{8}H_{4}BrFN_{2}O_{2}
256,9941, hallado 257,9441.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3,5-dicloro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy, et al. (Bellamy,
F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se calentó
una mezcla de
2,4-dicloro-6-nitroanilina
(1,00 g, 4,8 mmol) y SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (5,41 g, 24,1 mmol)
disuelta en 10 ml de acetato de etilo y 5 ml de etanol absoluto
bajo N_{2} a 70ºC durante 1 h. Todo el material de partida había
reaccionado tal como se comprobó mediante CCF (gel de sílice,
hexanos:acetato de etilo 3:1). Se permitió que la reacción se
enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en 40 ml de hielo
triturado. Se añadió suficiente disolución saturada de NaHCO_{3}
(¡formación de espuma!) para llevar el pH hasta 5. Se extrajo la
emulsión blanca espesa/de aceite naranja con 3 x 25 ml de acetato
de etilo y se lavaron los extractos orgánicos combinados con
disolución saturada de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4}),
se filtró a vacío y se evaporó el disolvente por rotación dando a
aceite naranja pálido que cristalizó en reposo dando 789 mg (93%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,69 (s a, 4H,
2(NH_{2})); 6,61 (s, 1H, H-6); 6,82 (s, 1H,
H-4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título (Leeson, P.D.
et al., J. Med. Chem 34:1243 (1991)) usando una adaptación
del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem. Soc. 1171
(1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (4,12 g, 28,2
mmol) y
3,5-dicloro-1,2-diaminobenceno
(500 mg, 2,82 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 6 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y se
recogió el sólido brillante amarillo pálido mediante filtración a
vacío y se aclaró con EtOH (20 ml) y se secó al aire dando 286 mg
(44%). P.f. 326-328ºC (desc.) véase la bibliografía
337-340ºC). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,05 (d, 1H, J = 1,8,
H-8), 7,32 (d, 1H, J = 1,8, H-6),
11,5 (s a, 1H, NH), 12,1 (s a, 1H, NH). EI-EM m/e
234 (M+4, 12), 232 (M+2, 67), 230 (M+, pb), 204 (52), 202 (77), 141
(19), 142 (59) EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{4}Cl_{2}N_{2}O_{2} 229,9650, hallado 229,9646.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3,5-dibromo-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy, et al. (Bellamy,
F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se calentó
una mezcla de
2,4-dibromo-6-nitroanilina
(500 mg, 1,69 mmol) y SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (1,90 g, 8,45
mmol) en 5 ml de acetato de etilo y 2 ml de etanol absoluto bajo
N_{2} a 70ºC durante 1 h. Todo el material de partida había
reaccionado tal como se comprobó mediante CCF (gel de sílice,
hexanos:acetato de etilo 3:1). Se permitió que la reacción se
enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en 20 ml de hielo
triturado. Se añadió suficiente disolución saturada de NaHCO_{3}
(¡formación de espuma!) para llevar el pH hasta 5. Se filtró a vacío
la emulsión amarilla blanca espesa y se extrajo el filtrado con 3 x
25 ml de acetato de etilo y se lavaron los extractos orgánicos
combinados con disolución saturada de NaCl. Se secó la fase orgánica
(MgSO_{4}), se filtró a vacío y se evaporó el disolvente por
rotación dando un aceite amarillo pálido que cristalizó en reposo
dando 400 mg (89%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,62 (s a,
4H, 2(NH_{2})); 6,78 (d, J = 1,8, 1H, H-6);
7,01 (d, J = 1,8, 1H, H-4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (2,19
g, 15,0 mmol) y
3,5-dibromo-1,2-diaminobenceno
(400 mg, 1,50 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 6 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido brillante marrón pálido mediante filtración a
vacío y se aclaró con EtOH (20 ml) y se secó al aire dando 264 mg
(55%). Se tomó una porción de este sólido (150 mg) y se disolvió en
20 ml de NaOH 1 N con calentamiento. Se trató la disolución con
carbón activado y se filtró a través de un lecho de Celite. Se
acidificó cuidadosamente la disolución resultante con HCl 2 N (pH =
1). Se formaron lentamente agujas amarillo pálido en la disolución
y se recogieron mediante filtración a vacío, se aclararon con 20 ml
de H_{2}O y se secaron a vacío (0,1 torr, 78ºC) dando 50,0 mg de
sólido blanco pulverulento, p.f. 356-358ºC (desc.).
^{1}HRMN (d_{6}-DMSO) \delta 7,21 (d, 1H, J =
2,1, H-8), 7,53 (d, 1H, J = 2,1,
H-6), 11,1 (s a, 1H, NH), 12,1 (s a, 1H, NH).
EI-EM m/z 322 (M+4, 51,3), 320 (M+2, pb), 318 (M+,
53,9), 294 (32,2), 292 (62,6), 290 (28,7), 185 (24,3), 183 (25,2).
EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{4}Br_{2}N_{2}O_{2} 317,8641, hallado 317,8642.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
1,2-diamino-3,4,5,6-tetraclorobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy et al. (Bellamy,
F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). Se calentó una
mezcla de
1,2-dinitro-3,4,5,6-tetraclorobenceno
(1,00 g, 3,27 mmol) y SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (3,69 g, 16,4
mmol) disuelta en 10 ml de acetato de etilo y 5 ml de etanol
absoluto bajo N_{2} a 80ºC durante 1 h. Se permitió que la
reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y se vertió en 20
ml de hielo triturado. Se añadió suficiente disolución saturada de
NaHCO_{3} (¡formación de espuma!) para llevar el pH hasta 6. Se
extrajo la emulsión blanca espesa con 3 x 25 ml de acetato de etilo
y se lavaron los extractos orgánicos combinados con disolución
saturada de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4}), se filtró
a vacío y se evaporó el disolvente por rotación dando 569 mg de un
sólido marrón (71%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,96 (s a,
2(NH_{2})). ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta 118,2,
127,0, 132,0.
\vskip1.000000\baselineskip
5,6,7,8-Tetracloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(Barton, D.E.; Lamb, A.J.; Lane, D.L.J.; Newbold, G.T.; Percival,
D., J. Chem. Soc. (C), 1268 (1968).
Se preparó
5,6,7,8-tetracloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
usando una adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H.
J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de
dietilo (2,97 g, 20,0 mmol) y
1,2-diamino-3,4,5,6-tetraclorobenceno
(500 mg, 2,03 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 6 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido naranja mediante filtración a vacío y se
aclaró con EtOH frío (10 ml) y se secó al aire. Se recristalizó este
sólido en etanol abs. dando 97,0 mg (16%) de de un sólido naranja,
p.f. 326-328ºC (desc.). (véase la bibliografía,
>360º). FT-IR: 3198, 3135
cm^{-1}(N-H), 1750, 1623 cm^{-1} (C=O).
^{1}H RMN \delta (d_{6}-DMSO) \delta 11,7 (s
a, 2H, N-H) EI-EM m/z 306 (M +8,
1,7), 304 (M+6, 11,5), 302 (M+4, 47,4), 300 (M+2, 93,9), 288 (M+,
76,7), 274 (50,0), 272 (pb), 270 (79,0), 209 (61,0), 207 (64,0).
EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{2}Cl_{4}N_{2}O_{2} 297,8870, hallado 297,8864.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los compuestos del título usando
una adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se disolvió
6-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(500 mg, 1,89 mmol) en 15 ml de H_{2}SO_{4} concentrado y se
enfrió la disolución transparente hasta 0ºC con agitación. A esto
se le añadió KNO_{3} en pequeñas porciones (191 mg, 1,89 mmol). Se
permitió que la reacción se agitase durante 1 h a 0ºC y luego se
permitió que llegase hasta la temperatura ambiente y se agitó
durante la noche. Entonces se vertió la mezcla de reacción amarillo
pálido en 50 ml de hielo-H_{2}O. Se aisló el
producto mediante filtración a vacío como un sólido blanco que se
aclaró con una pequeña cantidad de H_{2}O fría y se secó al aire.
Se disolvió el sólido blanco en una cantidad mínima de DMSO
caliente. Se añadió gota a gota H_{2}O en ebullición, con
calentamiento tras cada adición, hasta que el precipitado no podía
disolverse. Se añadieron unas pocas gotas de DMSO hasta que la
disolución era transparente, y se permitió que la disolución se
enfriase lentamente hasta temperatura ambiente. Se aisló el sólido
blanco mediante filtración a vacío y se permitió que se secase al
aire. Se secó adicionalmente el sólido a vacío (0,1 torr, 25ºC)
dando 241,6 mg de una mezcla de los productos de
6-nitro y 8-nitro en una razón de
3,3:1 mediante ^{1}H RMN. Se aisló el precipitado que se formó en
el filtrado anterior mediante filtración a vacío, se aclaró con 50
ml de H_{2}O y se secó como anteriormente dando un polvo blanco
(80,7 mg) que era una mezcla de los productos de
6-nitro y 8-nitro en una razón de
12,6:1. La combinación de las muestras anteriores dio como resultado
un rendimiento del 55%, que se corrige para el material de partida
sin reaccionar. Se tomó una parte de la mezcla 3,3:1 y se
recristalizó en DMSO:H_{2}O tal como se describió anteriormente,
dando cristales pequeños, similares a agujas que se aislaron
mediante filtración a vacío dando 21,1 mg de una mezcla de los
productos de 6-nitro y 8-nitro en
una razón de 1:1,76. Se determinaron las razones de mezclas de
producto mediante ^{1}H RMN, observando la integración de los
hidrógenos aromáticos a \delta 7,45 y 7,84. Las posiciones de
sustitución son provisionales y se basan en desplazamientos
químicos relativos de los hidrógenos aromáticos. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,45 (s,
8-H, producto de 6-nitro), (s,
6-H, producto de 8-nitro), 12,18 (s,
N-H), 12,41 (s, N-H).
EI-EM m/z 311 (M+2, 35), 309 (M+, pb), 251 (60), 235
(95). EI-HRMS calc. para
C_{9}H_{3}ClF_{3}N_{3}O_{4}: 308,9733, hallado
308,9768.
Se aisló el isómero principal,
5-cloro-6-nitro-7-trifluorometil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona,
en forma pura en un rendimiento del 64% mediante cristalización en
DMSO-agua. P.f. 343-347ºC. Se
confirmó la estructura mediante análisis por rayos X.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Tsuji et al. (Tsuji, Y.
et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Se calentó una
suspensión de polvo de Zn (10,5 g, 0,160 mol), CaCl_{2} (1,05 g)
y H_{2}O en 40 ml de EtOH hasta reflujo con agitación bajo
N_{2}. A esto se le añadió lentamente gota a gota una disolución
de
4-fluoro-2-nitroanilina
(2,00 g, 12,8 mmol) en 10 ml de EtOH. Se sometió a reflujo la
mezcla de reacción durante 8 h. El análisis por CCF (gel de sílice,
benceno:EtOAc 2:1) indicó la desaparición completa del material de
partida. Se eliminó el Zn mediante filtración a vacío y se evaporó
el disolvente por rotación. Se disolvió el residuo en 50 ml de
Et_{2}O y se extrajo la disolución con 3 x 25 ml de HCl 1 N. Se
combinaron las fases acuosas y se basificaron con NaOH ac. al 50% (6
g) y se extrajo la disolución resultante con 3 x 25 ml de
Et_{2}O. Se combinaron las fases de Et_{2}O y se secaron
(MgSO_{4}). Se evaporó por rotación el disolvente dando 1,36 g
(84%) de un sólido marrón. P.f. 90-92ºC. ^{1}H RMN
(CDCl_{3}) \delta 3,18 (sa, 2H, NH_{2}); 3,58 (sa, 2H,
NH_{2}); 6,44 (m, 2H, ArH), 6,61 (m, 1H, ArH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título (Sarges, R.
et al., J. Med. Chem. 33:2240 (1990)) usando una adaptación
del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem. Soc. 1171
(1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (17,4 g, 0,100
mol) y
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(1,00 g, 7,93 mmol) hasta reflujo con agitación bajo N_{2}
durante 2 h. Se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se
recogió el sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con EtOH
(50 ml) dando un sólido gris-marrón que se secó
adicionalmente a vacío (0,1 torr, 25ºC) dando 1,06 g (74,4%) que
era puro a >98% mediante RMN. Se preparó una muestra
analíticamente pura mediante disolución de 60 mg del sólido en NaOH
1,0 N y tratamiento de esta disolución con carbón activado. La
filtración de esta mezcla a través de un lecho de Celite y la
acidificación con HCl 1 N dieron agujas blancas finas que se
recogieron mediante filtración a vacío, se aclararon con H_{2}O y
se secaron adicionalmente a vacío (0,1 torr, 25ºC) dando 25,5 mg de
agujas blancas, p.f. 375-380ºC (desc.) (véase la
bibliografía > 300ºC (Sarges, R., et al., J. Med. Chem.
33:2240 (1990)). ^{1}H RMN (d_{6}-DMSO) \delta
6,90 (m, 2H, ArH), 7,09 (dd, J=9, J=5,4), 11,9 (s, 1H, NH), 11,96
(s, 1H, NH). EI-EM m/z 180 (100, M+),
152(44), 124(63), 97(43), 28(53).
EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{5}FN_{2}N_{2}O_{2} 180,0334, hallado 180,0337.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3,4-diaminobenzonitrilo usando una adaptación del
método de Tsuji et al. (Tsuji, Y. et al., J. Org.
Chem. 55:580 (1990)). Se combinaron polvo de Zn (2,51 g, 38,3 mmol),
CaCl_{2} (251 mg), H_{2}O (3,0 ml) y 9,0 ml de EtOH y se
llevaron hasta reflujo tal como se describió para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(ejemplo 10) y a esta mezcla se le añadió lentamente gota a gota
una disolución de
4-amino-3-nitrobenzonitrilo
(500 mg, 3,06 mmol) en 20 ml de EtOH. El análisis y el tratamiento
final se describieron para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
excepto que se disolvió el residuo de la reacción en 20 ml de HCl 1
N. Entonces se basificó esta disolución mediante la adición de 20
ml de NaOH 1,5 M. Se separó un precipitado como agujas de color
tostado finas que se recogieron mediante filtración a vacío, se
aclararon con H_{2}O fría y se secaron en un desecador a vacío
(0,5 torr, 25ºC) sobre CaSO_{4} dando 275 mg (67%) de cristales de
color tostado. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,42 (s a, 2H,
NH_{2}), 3,86 (s a, 2H, NH_{2}), 6,70 (d, J=8, 1H, ArH), 6,96
(d, J=1, 1H, ArH), 7,06 (dd, J=8, J=1, 1H, ArH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (3,90
g, 27,6 mmol) y 3,4-diaminobenzonitrilo (275 mg,
2,06 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 2 h. Se permitió que
la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y se recogió el
sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con EtOH. Se secó al
aire el sólido amarillo marrón dando 156,6 mg (40,8%) que era puro
a >98% mediante ^{1}H RMN. Se preparó una muestra
analíticamente pura mediante recristalización de 100 mg en 10 ml de
ácido acético glacial dando 21,2 mg de cristales blancos finos.
^{1}H RMN (d_{6}-DMSO) \delta 7,20 (d, J=8,1,
1H, ArH), 7,39 (d, J = 1,2, 1H, ArH), 7,50 (dd, J = 1,2, J = 8,4,
1H, ArH), 12,09 (s, 1H, NH), 12,22 (s, 1H, NH).
EI-EM m/z 187(87, M+), 159 (100, pb), 131
(83), 104 (77), 77 (65), 53 (43), 28 (30). EI-HRMS
calc. para C_{9}H_{5}N_{3}O_{2} 187,0381, hallado
187,0377.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
1,2-diamino-3-benzotrifluoruro
usando una adaptación del método de Tsuji et al. (Tsuji, Y.
et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Se combinaron polvo de
Zn (3,93 g, 60,1 mmol), CaCl_{2} (393 mg), H_{2}O (4,65 ml) y
14,1 ml de EtOH y se llevaron hasta reflujo tal como se describió
para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(véase el ejemplo 10) y a esta mezcla se le añadió lentamente gota
a gota una disolución de
4-amino-3-nitrobenzotrifluoruro
en 5 ml de EtOH. El análisis y el tratamiento final se describieron
para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(véase el ejemplo 10) excepto que se disolvió el residuo de la
reacción en 30 ml de HCl 1 N. Entonces se lavó esta disolución con
3 x 35 ml de Et_{2}O. Entonces se basificó la fase acuosa con NaOH
al 50% y se extrajo la disolución resultante con 3 x 25 ml de
Et_{2}O. Se combinaron las fases orgánicas y se secaron
(MgSO_{4}) y se evaporó el disolvente a presión reducida dando
641 mg (75,9%) de un sólido marrón oscuro. ^{1}H RMN (CDCl_{3})
\delta 3,54 (s a, 4H, NH_{2}), 6,73 (m, 1H, ArH), 6,93 (m, 2H,
ArH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (3,72
g, 25,5 mmol) y
1,2-diamino-3-benzotrifluoruro
(300 mg, 1,70 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 2 h. Se
enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se recogió el
sólido mediante filtración a vacío. Se aclaró este sólido amarillo
marrón con hexanos y se secó al aire. El secado adicional a vacío
(0,1 torr, 25ºC) produjo 240,1 mg (61,4%) que era puro a >95%
mediante ^{1}H RMN. Se obtuvo una mezcla analítica mediante
recristalización en acetona-éter dando un sólido
amarillo-blanco. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,44 (t, 2H, ArH), 7,56 (s,
1H, ArH), 10,98 (sa, 1H NH), 11,08 (s a, 1H, NH).
EI-EM m/z 230 (100, pb, M+), 202(46).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3,4-difluoro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Tsuji et al., (Tsuji, Y.
et al., J. Org. Chem. 55:580 (1990)). Se combinaron polvo de
Zn (942 mg, 14,4 mmol), CaCl_{2} (94,4 mg), H_{2}O (1,0 ml) y
4,0 ml de EtOH y se llevaron hasta reflujo tal como se describió
para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(véase el ejemplo 11) y a esta mezcla se le añadió lentamente gota
a gota una disolución de
4,5-difluoro-2-nitroanilina
(200 mg, 1,15 mmol) en 2 ml de EtOH. El análisis y el tratamiento
final fueron tal como se describió para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(ejemplo 11) excepto que se disolvió la reacción en 5 ml de H_{2}O
y se extrajo la disolución con 3 x 10 ml de Et_{2}O. Se
combinaron las fases orgánicas y se trataron con carbón activado,
se secaron (MgSO_{4}) y se filtraron a través de un lecho de
Celite. Se evaporó el disolvente a presión reducida dando 111,5 mg
(67,3%) de un sólido cristalino marrón. ^{1}H RMN (CDCl_{3})
\delta 3,34 (s a, 4H, NH_{2}), 6,53 (t, 2H, ArH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título (Sarges, R.
et al., J. Med. Chem. 33:2240 (1990)) usando una adaptación
del método de Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H. J. Chem. Soc. 1171
(1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (1,11 g, 7,63
mmol) y
3,4-difluoro-1,2-diaminobenceno
(110 mg, 0,763 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 2 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y se
recogió el sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con
hexanos y se secó al aire. Se recristalizó este sólido gris marrón
en 20 ml de EtOH y se recogieron los cristales de color
marrón-blanco mediante filtración a vacío y se
secaron los cristales adicionalmente a vacío (0,5 torr, 25ºC) dando
45,3 mg (30,0%) p.f. >360ºC (véase la bibliografía >310ºC).
^{1}H RMN (d_{6}-acetona) \delta 7,19 (t, 2H,
ArH, J_{H-F} = 9,3), 10,9 (s a, 2H, NH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
2-nitro-3,4,5,6-tetrafluoroanilina
usando una adaptación del método de Brooke et al., J. Chem.
Soc. 802 (1961). Se burbujeó gas de amoniaco a través de una
disolución de pentafluoronitrobenceno (3,00 g, 114,1 mmol) en 200
ml de dietil éter anhidro durante 4 h. Durante este tiempo el color
cambió desde blanco claro hasta amarillo intenso y se formó un
precipitado blanco. Se separó el precipitado (fluoruro de amonio)
mediante filtración a vacío y se lavó con éter (30 ml). Se evaporó
el filtrado por rotación y los cristales naranjas resultantes
dieron 3 manchas en la CCF (alúmina, benceno). Se logró la
purificación de esta muestra mediante cromatografía en columna
(alúmina básica, benceno). Se logró la purificación de esta muestra
mediante cromatografía en columna (alúmina básica, actividad II) en
una columna de 1,5'' x 20''. Se recogió la primera banda y se
concentró dando 1,88 g de un sólido amarillo (63,0%), p.f.
44,5-45 (véase la bibliografía
42,5-43,5ºC). ^{19}F RMN (patrón externo
C_{6}F_{6}, \delta -162,9) \delta -149,9(m),
-156,6(m), -162,0 (m), -178,3(m).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
3,4,5,6-tetrafluoro-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Tsuji et al., J. Org.
Chem. 55:580 (1990). Se calentó una suspensión de polvo de Zn (1,95
g, 29,8 mmol), CaCl_{2} (195 mg) y H_{2}O (2,3 ml) en 7 ml de
EtOH hasta reflujo con agitación bajo N_{2}. A esto se le añadió
lentamente gota a gota una disolución de
2-nitro-3,4,5,6-tetrafluoroanalina
(2 g, 12,8 mmol) en 5 ml de EtOH. Se sometió a reflujo la mezcla de
reacción durante 5 h. El análisis por CCF (gel de sílice,
benceno:EtOAc 2:1) indicó la desaparición completa del material de
partida. Se eliminó el Zn mediante filtración a vacío y se aclaró
el Zn con EtOH (30 ml). Se evaporó por rotación el disolvente y se
disolvió el residuo en 20 ml de Et_{2}O y se lavó la disolución
con 2 x 15 ml de H_{2}O y 15 ml de NaCl saturado. Se secó la fase
orgánica (MgSO_{4}) y se filtró a vacío. Se evaporó por rotación
el disolvente dando 396,6 mg (92,5%) de un sólido púrpura marrón,
p.f. 120-125ºC, que se usó sin purificación
adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título (Allison,
et al., J. Flúor Chem. 1:59 (1971)) usando una adaptación
del método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171
(1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (2,86 ml, 4,1
mmol) y
3,4,5,6-tetrafluoro-1,2-diaminobenceno
(380 mg, 2,11 mmol) hasta reflujo con agitación bajo N_{2}
durante 8 h. Se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se
observó una pequeña cantidad de precipitado púrpura. Se evaporó el
oxalato de dietilo en exceso y se suspendió el sólido resultante en
20 ml de hexanos, se filtró a vacío y se aclaró el sólido con
hexanos (20 ml) y acetato de etilo (10 ml). Se secó al aire el
sólido dando 244,8 mg (49,9%). P.f. 330-331ºC (véase
aproximadamente 300ºC desc.). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 12,33 (s a, NH). ^{19}F
RMN (patrón externo C_{6}F_{6}, \delta -162,9), \delta
-157,7(m), -167,9(m).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
6-bromo-4-fluoro-2-nitroanilina
usando una adaptación del método de Mitchell et al., J. Org.
Chem. 44:4733 (1979). A una disolución de
4-fluoro-2-nitroanilina
(500 mg, 3,2 mmol) en DMF seca (16 ml) bajo N_{2} se le añadió
gota a gota una disolución de N-bromosuccinimida
(570 mg, 3,2 mmol) en DMF seca (16 ml). Se permitió que la reacción
se agitase durante 24 h. Entonces se vertió la disolución en 100 ml
de H_{2}O y se extrajo esta fase acuosa con 4 x 25 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con 3 x
4 ml de H_{2}O y se secaron (MgSO_{4}). Se filtró el MgSO_{4}
a vacío y se evaporó el disolvente por rotación dando un aceite
marrón que cristalizó en reposo. 642 mg (85,4%). ^{1}H RMN
(CDCl_{3}) \delta 6,51 (s a, 2H NH_{2}), 7,58 (dd,
J_{H4-3} = 3Hz, J_{H4-F} = 6,5
Hz, H-4), 7,92 (dd, J_{H3-4} = 3
Hz, J_{H3-F} = 8,7 Hz, H-3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
1,2-diamino-3-bromo-5-fluorobenceno
usando una adaptación del método de Bellamy et al.,
Tetrahedron Lett. 25:839 (1984). Se calentó una mezcla de
6-bromo-4-fluoro-2-nitroanilina
(673 mg, 2,87 mmol) y SnCl_{2} 2H_{2}O (3,23 g, 14,3 mmol)
disuelta en 6 ml de acetato de etilo y 3 ml de etanol absoluto a
70ºC durante 30 min. Todo el material de partida había reaccionado
tal como se comprobó mediante CCF (gel de sílice, hexanos:acetato
de etilo 2:1). Se permitió que la reacción se enfriase hasta
temperatura ambiente y se vertió en 20 ml de hielo triturado. Se
añadió suficiente NaHCO_{3} sólido para llevar el pH hasta 7,5.
Entonces se extrajo la mezcla de reacción con 3 x 20 ml de acetato
de etilo y se lavaron las fases orgánicas combinadas con disolución
saturada de NaCl. Se secó la fase orgánica (MgSO_{4}), se filtró a
vacío y se evaporó el disolvente por rotación dando 510 mg de un
líquido marrón oscuro (86,7%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta
3,64 (s a, 4H, 2(NH_{2})), 6,44 (dd, 1H, H5,
J_{4-5} = 2,7, J_{H-F} = 9,8),
6,72 (dd, 1H, H4, J4-5 = 2,7, J_{HF} = 8,4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (3,31
ml, 24,4 mmol) y
1,2-diamino-3-bromo-5-fluorobenceno
(500 mg, 2,44 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 5 h. La
mezcla de reacción era marrón oscuro. Se permitió que la reacción
se enfriase hasta temperatura ambiente y se recogió el sólido
mediante filtración a vacío y se aclaró con EtOH (30 ml). Se secó
al aire el sólido marrón durante 1 h dando 250 mg (rendimiento bruto
del 39,6%). Se retiró una porción de este sólido y se disolvió en
NaOH 1 N (10 ml) y se eliminaron unas pocas partículas insolubles
mediante filtración por gravedad. Se trató la disolución con carbono
decolorante y se filtró la mezcla a través de un lecho de Celite y
se acidificó la disolución resultante con HCl 1 N. Se formaron
cristales blancos que se aislaron mediante filtración a vacío y se
lavaron con agua (20 ml). Se secaron los cristales en una pistola
de secado (0,05 torr, 78ºC) dando 54,1 mg, p.f.
308-310ºC (desc.). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 6,2 (dd, 1H,
J_{H6-8} = 2,7, J_{H-F} = 9,3,
ArH), 7,35 (dd, 1H, J_{H6-8} = 2,4, J_{HF} =
8,4 Hz), 11,1 (s a, 1H, NH), 12,1 (sa, 1H, NH).
EI-HRMS calc. para C_{8}H_{4}BrFN_{2}O_{2}:
257,9440, hallado 257,9455.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171
(1962). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (1,83 g, 12,5
mmol) y
1,2-diamino-4-cloro-5-fluorobenceno
(200 mg, 1,25 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 2 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con
EtOH. Se disolvió este sólido en NaOH 1 N (20 ml) y se trató la
disolución con carbón decolorante. Se filtró esta mezcla a través
de un lecho de Celite y se acidificó la disolución naranja pálido
resultante con HCl 4 N. Se formó un precipitado que se aisló
mediante filtración a vacío y se lavó con agua. Se secó este sólido
de color tostado en una pistola de secado (0,05 torr, 78ºC) dando
121,7 mg (45,5%). P.f. 344-348ºC (desc.) ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 6,93 (d, 1H,
J_{H8-F} = 10,2 Hz, H-8), 7,08 (d,
1H, J_{H4-F} = 7,2 Hz, H-4).
^{19}F RMN (patrón externo C_{6}F_{6}, \delta -162,9)
\delta -124,7 (s). EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{4}CIFN_{2}O_{2} 213,9945, hallado 213,9961.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171
(1962). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (1,15 g, 7,91
mmol) y
1,2-diamino-3-bromo-5-trifluorometilbenceno
(200 mg, 0,95 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 2 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con
EtOH (15 ml). Se secó este sólido blanco en una pistola de secado
(0,05 torr, 78ºC) dando 148,3 mg (60,7%). P.f.
301-304 (desc.). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,28 (s, 1H, ArH), 7,56 (s,
1H, ArH), 11,7 (s a, 2H, NH). ^{19}F RMN (patrón externo
C_{6}F_{6}, \delta -162,9) \delta -57,97 (s).
EI-HRMS calc. para
C_{9}H_{4}BrF_{3}N_{2}O_{2} 307,9408, hallado
307,9411.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se disolvió
6-fluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(200 mg, 1,10 mmol) en 3 ml de H_{2}SO_{4} concentrado y se
enfrió la disolución azul verde hasta 0ºC con agitación. A esto se
le añadió KNO_{3} en pequeñas porciones (110 mg, 1,10 mmol). Se
permitió que la reacción se agitase durante 1 h a 0ºC y luego se
permitió que llegase hasta la temperatura ambiente y se agitó
durante la noche. Entonces se vertió la mezcla de reacción
marrón-naranja en 10 ml de hielo/H_{2}O. Se aisló
el producto mediante filtración a vacío como cristales marrones que
se aclararon con una pequeña cantidad de H_{2}O fría y se secaron
al aire. Se secaron adicionalmente los cristales a vacío (0,1 torr,
25ºC) dando 173,4 mg (rendimiento del 70,0%).
Se preparó una muestra analítica mediante
disolución de 75 mg del producto bruto en 5 ml de NaOH 1 N y
tratamiento de esta disolución con carbón activado. Se filtró esta
suspensión a vacío a través de un lecho de Celite y se acidificó
cuidadosamente la disolución con HCl concentrado dando cristales
amarillos como precipitado. Se aislaron los cristales mediante
filtración a vacío y se secaron tal como se describió anteriormente
dando 38,9 de cristales amarillo brillante. P.f
348-350 (desc.) ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 12,4 (s, 1H, NH), 12,1 (s,
1H, NH), 7,8 (d, J_{H-F meta} = 7,2, 1H, ArH), 7,0
(d, J_{H-Fortho} = 12, 1H, ArH).
EI-EM m/z 225 (100, M+, 167 (10), 45 (41), 28 (96).
EI-HRMS calc. para C_{8}H_{4}FN_{3}O_{4}
225,0185, hallado 225,0196.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem.
Soc. 1171 (1962)). Se disolvió
6-trifluorometil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(200 mg, 0,869 mmol) en 8 ml de H_{2}SO_{4} concentrado y se
enfrió la disolución amarilla-verde hasta 0ºC con
agitación. A esto se le añadió KNO_{3} en pequeñas porciones
(87,8 mg, 1,10 mmol). Se permitió que la reacción se agitase
durante 1 h a 0ºC y entonces se permitió que llegase hasta la
temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Entonces se
vertió la mezcla de reacción marrón-naranja en 10 ml
de H_{2}O con hielo. Se aisló el producto mediante filtración a
vacío como cristales amarillo pálido que se aclararon con una
pequeña cantidad de H_{2}O fría y se secaron al aire. Se secaron
adicionalmente los cristales a vacío (0,1 torr, 25ºC) dando 121,1 mg
(rendimiento del 50,6%). ^{1}H RMN (d_{6}-DMSO)
\delta 7,53 (s, 1H, ArH), 7,80 (s, 1H, ArH), 12,4 (s, 2H, NH).
EI-EM m/z 275 (81, M+), 217 (36), 201 (100, pb),
EI-HRMS calc. para
C_{9}H_{4}N_{3}O_{4}F_{3} 275,0153, hallado 275,0170.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
6-clorosulfonil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
usando una adaptación del método de Keana et al. (J. Org.
Chem. 48:3654 (1983)). A
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(1,0 g, 6,2 mmol) se le añadieron todo de una vez 3,0 ml de ácido
clorosulfónico. Se agitó la mezcla bajo N_{2} a 60ºC durante 2 h,
se permitió que llegase hasta la temperatura ambiente y se añadió
la disolución lentamente gota a gota a 25 ml de hielo triturado. Se
filtró el sólido resultante a vacío y se aclaró con hielo/H_{2}O.
Se secó adicionalmente el sólido blanco a 0,5 torr (25ºC) sobre
CaSO_{4} dando 1,1 g (68%). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,07 (d,
J_{7-8} = 8,1, 1H, H8), 7,29 (dd,
J_{7-8} = 8,1, J_{6-7} = 1,0,
1H, H7), 7,40 (d, J_{5-7} = 1,0, 1H, H5).
EI-EM m/z 262 (M+2, 15), 260 (M+, 40), 225 (35), 105
(43), 36 (100, pb). EI-HRMS calc. para
C_{8}H_{5}ClN_{2}O_{4}S 259,9687, hallado 259,9645.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
6-sulfonil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
usando una adaptación del método de Keana et al. (J. Org.
Chem. 48:3654 (1983)). Se agitó una suspensión de
6-clorosulfonil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalina
(142,7 mg, 0,546 mmol) en 5,0 ml de H_{2}O a 50ºC durante 8 h. Se
eliminó el disolvente a presión reducida y se secó adicionalmente
el sólido resultante a vacío (0,5 torr, 50ºC) dando 121,6 mg de un
sólido naranja pálido pulverulento (91,8%). ^{1}H RMN (D_{2}O)
7,2 (m a, 2H, ArH), 7,5 (m a, 1H, ArH). EI-EM m/z
242 (M+, 5), 162 (37), 106 (100), 80 (89).
\vskip1.000000\baselineskip
A
6-clorosulfonil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(200 mg, 0,770 mmol) se le añadieron todo de una vez 2 ml de
NH_{4}OH conc. Se calentó suavemente la mezcla en un baño de vapor
con agitación ocasional. A medida que la disolución se calentaba,
se formó un precipitado blanco. Se calentó la disolución durante 20
min. y se enfrió hasta temperatura ambiente y se acidificó la
mezcla con HCl 1 N. Se recogió el sólido mediante filtración a
vacío y luego se aclaró con H_{2}O fría. Se secó adicionalmente el
sólido a vacío (0,5 torr, 25ºC) dando 98,2 mg (53,0%) que era puro
a >95% mediante ^{1}H RMN. Se preparó una muestra analítica
mediante disolución de 45 mg del sólido en 1 ml de NaOH 1 N seguido
por acidificación de la disolución con HCl 1 N. La sulfonamida
precipitó como agujas amarillo pálido que se aislaron mediante
filtración a vacío, se aclararon con H_{2}O fría y se secaron a
vacío (0,5 torr, 25ºC) dando 28,9 mg. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) 7,20 (d, J_{7-8} =
8,4, 1H, H8), 7,34 (s, 2H, NH_{2}), 7,50 (dd,
J_{7-5} = 1,8, J_{7-8} = 8,4,
1H, H7), 7,56 (d, J_{5-7} = 1,8, 1H, H5), 12,14
(s, 1H, NH), 12,11 (s, 1H, NH). EI-EM m/z 241 (M+,
83), 133 (63), 105 (pb, 100), 64 (75), 28 (80).
EI-HRMS calc. para C_{8}H_{7}N_{3}O_{4}S
241,0156, hallado 241,0139.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Adams et al. (J. Am. Chem. Soc. 73:
1147 (1951)). A una mezcla de n-propilamina (50 mg, 0,846
mmol) en 0,5 ml de piridina a 0ºC se le añadió en pequeñas
porciones
6-clorosulfonil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(100 mg, 0,385 mmol). Se permitió que la disolución se calentase
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 8 h bajo N_{2}. Se
vertió la mezcla de reacción en una mezcla de 5 ml de H_{2}O:HCl
conc. 1:1 y 3 g de hielo. Comenzaron a formarse cristales tras 1 h
y se permitió que la disolución reposara durante la noche. Se
aislaron los cristales mediante filtración a vacío agujas amarillo
pálido, se aclararon con H_{2}O fría y se secaron adicionalmente a
vacío (0,1 torr, 25ºC) dando 47,5 mg (44,1%). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 0,74 (t, 3H, CH_{3}), 1,32
(m, 2H, CH_{2}), 2,62 (m, 2H, CH_{2}), 7,20 (d, J = 8,4, 1H,
H7), 7,42 (d, J = 7,4, 1H, H5), 7,50 (m, 2H, NH, H6), 12,07 (s, 1H,
NH), 12,14 (s, 1H, NH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Adams et al. (J. Am. Chem. Soc. 73:
1147 (1951)). A una mezcla de dimetilamina (disolución al 40%, 52,2
mg, 131 \mul, 1,16 mmol) y 0,5 ml de piridina a 0ºC se le añadió
en pequeñas porciones
6-clorosulfonil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(100 mg, 0,385 mmol). Se permitió que la disolución se calentase
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 8 h bajo N_{2}. Se
vertió la mezcla de reacción en una mezcla de 5 ml de H_{2}O:HCl
conc. 1:1 y 3 g de hielo. Comenzaron a formarse cristales tras 1 h
y se permitió que la disolución reposara durante la noche. Se
aislaron los cristales mediante filtración a vacío como agujas
blancas, se aclararon con H_{2}O fría y se secaron adicionalmente
a vacío (0,1 torr, 25ºC) dando 44,2 mg (42,6%). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 2,57 (s, 6H, CH_{3}),
7,28 (d, J7-8 = 8,4, 1H, H8), 7,44 (dd, J = 8,7, J =
1,8, 2H H5, H7), 12,03 (s, 1H, NH), 12,22 (s, 1H, NH).
EI-EM m/z 269 (M +, 83), 225 (26), 161 (pb, 100),
106 (94).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
N-metil-1,2-diaminobenceno
usando una adaptación del método de Tsuji et al. (J. Org.
Chem. 55:580 (1990)). Se combinaron polvo de Zn (8,07 g, 0,123
mol), CaCl_{2} (807 mg), H_{2}O (9,9 ml) y 30 ml de EtOH y se
llevaron hasta reflujo tal como se describió para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
(véase el ejemplo 10), y a esta mezcla se le añadió lentamente gota
a gota una disolución de
N-metil-2-nitroanilina
(1,50 g, 9,86 mmol) en 15 ml de EtOH. El análisis y el tratamiento
final fueron tal como se describió para
3-fluoro-1,2-diaminobenceno
excepto que se disolvió el residuo de la reacción en 50 ml de
Et_{2}O. Entonces se extrajo esta disolución de Et_{2}O con 3 x
25 ml de HCl 1 N y se combinaron las fases acuosas y se basificaron
con 5 g de disolución de NaOH al 50%. Entonces se extrajo esta
disolución con 3 x 25 ml de Et_{2}O. Entonces se combinaron estas
fases de Et_{2}O, se secaron (MgSO_{4}) y se evaporó el
disolvente a presión reducida dando 911,1 mg (76,1%) de un aceite
marrón oscuro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 2,87 (s, 3H,
CH_{3}), 3,31 (s a, 3H, NH), 6,67 (m, 3H, ArH), 6,86 (m, 1H,
ArH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
N-metil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
usando una adaptación del método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171
(1962)). Se calentó una mezcla de oxalato de dietilo (3,23 g, 22,1
mmol) y
N-metil-1,2-diaminobenceno
(332 mg, 2,72 mmol) hasta reflujo bajo N_{2} durante 2 h. Se
permitió que la reacción se enfriase hasta temperatura ambiente y
se recogió el sólido mediante filtración a vacío y se aclaró con
EtOH. Se secó adicionalmente el sólido gris marrón a vacío (0,1
torr, 25ºC) dando 274,3 mg (57,2%). Se purificó adicionalmente una
porción de este sólido mediante recristalización en 50 ml de EtOH y
tratamiento con carbón activado dando cristales amarillo pálido
esponjosos que se recogieron mediante filtración a vacío y se
aclararon con EtOH frío dando 104,9 mg. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 3,50 (s, 3H, CH_{3}), 7,16
(m, 3H, ArH), 7,36 (m, 1H, ArH), 12,01 (s, 1H, NH).
EI-EM 176 (M+, 52), 148 (33), 119 (100, pb).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Se
disolvió
N-metil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(200 mg, 1,13 mmol) en 3 ml de H_{2}SO_{4} concentrado y se
enfrió la disolución azul verde hasta 0ºC con agitación. A esto se
le añadió KNO_{3} en pequeñas porciones (228 mg, 2,26 mmol). Se
permitió que la disolución naranja oscuro se agitase durante 1 h a
0ºC y entonces se permitió que llegase hasta la temperatura
ambiente y se agitó durante la noche. Entonces se vertió la mezcla
de reacción marrón naranja en 10 ml de H_{2}O con hielo. Se aisló
el producto mediante filtración a vacío como un sólido amarillo
blanco que se aclaró con 10 ml de H_{2}O fría y se secó al aire.
Se secaron adicionalmente los cristales a vacío (0,1 torr, 25ºC)
dando 220 mg (72,0%). Se preparó una muestra analítica mediante
recristalización de 120 mg de la muestra bruta en ácido acético
glacial. Se recogieron los cristales resultantes mediante filtración
a vacío y se aclararon con H_{2}O y se secaron a vacío (0,1 torr,
60ºC) dando 34,2 mg de cristales amarillos. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 3,52 (s, 3H, CH_{3}), 7,80
(s, 1H, ArH), 8,10 (s, 1H, ArH), 12,6 (s, 1H, NH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Se
calentó una mezcla de oxalato de dietilo (6,22 ml, 45,5 mmol) y
1,2-diaminopiridina (500 mg, 4,58 mmol) hasta
reflujo con agitación bajo N_{2} durante 2 h. Se enfrió la
reacción hasta temperatura ambiente y se recogió el sólido mediante
filtración a vacío y se aclaró con EtOH (20 ml) dando un sólido
amarillo-blanco que se secó adicionalmente a vacío
(0,1 torr, 25ºC) dando 693 mg (93,0%). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 7,11 (dd, 1H,
H-7), 7,43 (dd, 1H, J = 8,1 Hz, 1,2 Hz,
H-8), 8,05 (dd, 1H, J = 5,1 Hz, J = 1,2 Hz,
H-6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto del título usando una
adaptación del método de Cheeseman (J. Chem. Soc. 1171 (1962)). Se
calentó una mezcla de oxalato de dietilo (1,75 ml, 12,8 mmol) y
5,6-diamino-1,3-dimetiluracilo
hidratado (200 mg, 1,18 mmol) hasta reflujo con agitación bajo
N_{2} durante 8 h. Se enfrió la reacción hasta temperatura
ambiente y se recogió el sólido mediante filtración a vacío y se
aclaró con EtOH (10 ml) dando un sólido amarillo que se secó al
aire dando 76,0 mg (66,6%) que se secaron adicionalmente a vacío
(0,1 torr, 25ºC) dando 1,06 g (74,4%) que era puro a >98%
mediante RMN. Se disolvió una porción de este sólido (100 mg) en
NaOH 1,0 N (5 ml). La acidificación de esta disolución con HCl 6 N
dio un sólido amarillo brillante que se recogió mediante filtración
a vacío, se aclaró con H_{2}O (10 ml) y se secó en una pistola de
secado (0,05 torr, 78ºC) dando 42,4 mg. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO) \delta 3,20 (s, 6H, CH_{3}),
11,59 (s a, 2H, NH). P.f. 370-372 (desc.),
EI-EM m/z 224 (100, M +), 196 (80).
En los siguientes ejemplos
28-44, se usaron los reactivos tal como se
recibieron a menos que se indique lo contrario. Se tomaron los
puntos de fusión en un aparato de punto de fusión
Mel-Temp y no están corregidos. Se colocaron las
muestras en el bloque cuando la temperatura era > 250ºC con el
fin de minimizar la descomposición antes de la fusión. Se realizó
la cromatografía en columna en el modo ultrarrápido en gel de sílice
Davisil (de 200-425 de malla), a menos que se
indique lo contrario. Se realizó la cromatografía en capa fina
analítica sobre placas de gel de sílice 60 F_{254} soportado en
aluminio y se efectuó la visualización con una lámpara
ultravioleta. Se registraron los espectros de ^{1}H RMN en un
aparato QE-300 de General Electric a 300 MHz; se
notificaron los desplazamientos químicos en unidades delta en
referencia a señales de protones residuales de los disolventes
deuterados (CHCl_{3}, \delta 7,26; CHD_{2}OD, \delta 3,30;
CD_{3}SOCD_{2}H, \delta 2,49; CD_{3}COCD_{2}H, \delta
2,04). Se ejecutaron los espectros de ^{13}C RMN a 75 MHz. Se
obtuvieron los espectros infrarrojos en un espectrómetro Nicolet
5DXB FT-IR. Se registraron las absorciones en
números de onda (cm^{-1}) y se indica la intensidad de las
absorciones mediante las letras s (fuerte), m (media)
y w (débil). Se registraron los espectros de masas en un
espectrómetro de masas VG ZAB-2-HF
con un sistema de datos VG-11-250,
en el modo de ionización electrónica (70 eV) a menos que se indique
lo contrario. Los microanálisis se realizaron por Desert Analytics
de Tuscon, Arizona.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Wallace, R.G.,
Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982). A una suspensión agitada de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(162 mg, 1,00 mmol, Aldrich) en agua destilada (4 ml) a 25ºC se le
añadió NaOH (100 mg, 2,5 mmol). Tras 5 min., se trató la disolución
resultante en porciones a lo largo de 10 min. con ácido
hidroxilamino-o-sulfónico (113 mg,
1,00 mmol, Aldrich). Se llevó a cabo la reacción a temperatura
ambiente. Apareció un precipitado tras 1 h, se agitó de manera
continua durante otra hora, se recogió para conseguir 70 mg (40%)
de
1-amino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
bruta (base libre Na^{+}, razón de material de partida con
respecto a producto = 5:95 mediante RMN, D_{2}O). Se acidificó el
filtrado hasta pH = 2 mediante HCl 1 N (\sim1,5 ml), dando 50 mg
de un precipitado blanco, que era una mezcla 1:1 de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
y la sal clorhidrato de
1-amino-2,3-quinoxalindiona
(mediante RMN, DMSO). El rendimiento total de
1-amino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es del 51%.
Se disolvió una muestra de 70 mg de la
1-amino-2,3-quinoxalindiona
bruta en agua destilada (5 ml) y entonces se acidificó hasta pH = 5
con AcOH y entonces se permitió que la disolución reposara a 25ºC
durante un día, dando agujas blancas. Se recogieron los cristales
mediante filtración y entonces se lavaron con agua destilada (2 x 2
ml) seguido por etanol (2 x 1 ml) dando 61 mg (34,5%) de
1-amino-2,3-quinoxalindiona
pura (base libre H) como agujas blancas; p.f.:
226-8ºC (sublimación); 260-2ºC
(desc.) (véase, Shin, S.C. y Lee, Y.Y. Taehan Hwahakhoe Chi
27(5):382-4 (1983), sublimación a 228ºC). IR
(KBr, cm^{-1}):3306, 1687, 1631, 1587. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 5,880 (s, 2H); 7,143 (m,
3H); 7,601 (d, 1H); 12,061 (s, 1H). HR-EM, calcd.
para C_{8}H_{7}N_{3}O_{2} (M+) m/z: 177,0537; hallado:
177,0536.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Wallace, R.G.,
Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982). A una suspensión agitada de
6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(189 mg, 0,82 mmol) en agua destilada (15 ml) a 60ºC se le añadió
NaOH (335 mg, 8,37 mmol). Tras 30 min. se trató la disolución
resultante en porciones a lo largo de 10 min. con ácido
hidroxilamino-o-sulfónico (111 mg,
0,98 mmol, Aldrich). Se llevó a cabo la reacción a 60ºC. Apareció
un precipitado blanco tras 10 min. Se agitó la mezcla a 25ºC durante
8 h, se recogió mediante filtración a 50ºC, produciendo 180 mg
(90%) de
1-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta, como un sólido amorfo blanco (razón de material de partida
con respecto a producto = 10:90 mediante ^{1}H RMN, D_{2}O). El
rendimiento es del 81%. Se suspendió una muestra de 109 mg de la
1-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (base libre Na+, 0,445 mmol) en NaOH 1 N (10 ml) a 50ºC
durante 30 min. y se recogió mediante filtración. Se disolvió el
precipitado (87 mg) en agua destilada caliente (80 ml) y se eliminó
el material insoluble mediante filtración. Entonces se acidificó el
filtrado con AcOH hasta pH = 5. Se calentó la suspensión resultante
a 60-70ºC para lograr una disolución transparente y
luego se enfrió lentamente hasta 25ºC, dando agujas blancas. Se
recogieron los cristales mediante filtración y luego se lavaron con
agua destilada (2 x 2 ml) seguido por etanol (2 x 1 ml), se secó
mediante rotavapor a 60ºC durante 4 h, dando 73 mg (84%) de
1-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (base libre H). Entonces se midió el p.f. El color de la
1-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
cambió a amarillo a 335ºC; la descomposición de la
1-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
es obvia a 340ºC y se fundió dando un líquido negro a
343-5ºC. IR (KBr, cm^{-1}):3337; 3225; 3056; 1706;
1668; 1581. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta
5,791(s, 2H); 7,271 (s, 1H); 7,721 (s, 1H); 12,115 (s, 1H).
HR-EM: calc. para
C_{8}H_{5}N_{3}O_{2}Cl_{2} (M+) m/z:244,9756;
hallado:
244,9767.
244,9767.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla de
1-amino-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(53 mg, 0,30 mmol) y piridina (1 ml, recién destilada a partir de
KOH antes de su uso) y anhídrido acético (1 ml, Aldrich) bajo
nitrógeno a 60ºC durante 4 h. La mezcla de reacción se volvió una
disolución transparente. Entonces se evaporaron todo el disolvente
y reactivo a presión reducida y se lavaron con benceno:ciclohexano =
1:1 (2 x 2 ml); éter (2 x 2 ml), se secó a 60ºC con rotavapor
durante 2 h, produciendo 57 mg (86%) de
1-acetamido-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura como un polvo blanco; p.f.:211-213ºC. IR (KBr,
cm^{-1}): 3430; 3127; 1741; 1717; 1668. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}) \delta:2,326 (s, 3H);
7,121-7,287 (m, 4H); 12,345 (s, 1H). Masa: calc.
para C_{10}H_{9}N_{3}O_{3} (M+) m/z: 219,0641; hallado:
219,0651.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Leeson, P.D. et
al., J. Med. Chem 35:1954-68 (1992). Se agitó
una suspensión de
1-amino-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(37 mg, 0,21 mmol) en piridina (2,5 ml) a 70ºC hasta que se finalizó
la disolución. Entonces se añadió a la disolución isocianato de
o-tolilo (27,8 mg, 0,21 mMol, Aldrich), que se
agitó a 60ºC durante 2 h, luego durante la noche a temperatura
ambiente. Se evaporó el disolvente a presión reducida, se lavó el
residuo con éter (2 x 2 ml) dando 59 mg de
1-[[(o-tolilamino)carbonil]amino]-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (66% de producto; 30% de subproducto de tolilo; 4% de
1-amino-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
mediante ^{1}HRMN). Se separó mediante cromatografía con columna
de gel de sílice (2 g), se eluyó con el 100% de benceno (20 ml) y
benceno:acetona = 1:1 (20 ml) y el 100% de acetona (20 ml) para
eliminar la mayor parte de la impureza. Se lavó el residuo (43 mg
de
1-[[(o-tolilamino)carbonil]amino]-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona)
con etanol (2 x 2 ml) y éter (2 x 1 ml) dando 38 mg de
1-[[(o-tolilamino)carbonil]amino]-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura como un polvo blanco (60%). P.f.: descomposición a partir de
265ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3375; 3237; 1718; 1693; 1675. RMN
(^{1}H, DMSO-d_{6}) \delta 2,161 (s, 3H);
6,996-7,380 (m, 8H); 8,530 (s, 1H), 9,343 (s, 1H);
12,155 (s, 1H).
\vskip1.000000\baselineskip
6,7-Dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(método A): Se adaptó el procedimiento de Jorgenson, A.K. et
al., publicación de solicitud de patente internacional número
WO91/13878 y Chem. Abstr. 115(25):280059u (1991). A una
suspensión agitada de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(1,62 g, 10,00 mmol, Aldrich) y Ag_{2}SO_{4} (3,43 g, 11,00
mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (10 ml) a TA se le añadió bromo
(3,52 g, \sim 1,13 ml, 22,00 mmol) a lo largo de 30 min. Entonces
se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 24 h. Entonces se
añadió tetraclorometano (10 ml) y se agitó la mezcla de reacción a
50ºC durante 2 h. Se eliminó el material insoluble mediante
filtración, se vertió el filtrado en agua con hielo (200 ml) y se
recogió el sólido amarillo separado mediante filtración y se secó
al aire. Se disolvió la
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
bruta en NaOH 1 N (20 ml) y agua (20 ml), y se eliminó el
precipitado amarillo mediante filtración. Se acidificó el filtrado
con HCl 4 N hasta pH = 2 dando un precipitado blanco, que se lavó
con agua destilada (2 x 2 ml) y etanol (2 x 1 ml), produciendo
1,082 de
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como un polvo fino gris (95% de pureza mediante RMN). Segunda
cosecha del precipitado amarillo con el procedimiento anterior,
dando 927 mg de
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
El rendimiento total es del 65%. La cristalización en DMSO/H_{2}O
proporcionó microcristales blancos (recuperado el 85%). P.f.:
descompuesto a partir de 335ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3200; 1718;
1693. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta 7,336
(s, 2H); 11,962 (s, 2H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{4}N_{2}O_{2}Br_{2} (M^{+}) m/z:317,8639,
hallado: 317,8619.
\newpage
6,7-Dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(método B): Se adaptó el procedimiento de Mitchell, R.H. et
al., J. Org. Chem. 44(25):4733 (1979). A una suspensión
agitada de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(3,24 g, 20,00 mmol, Aldrich) en DMF anhidra (100 ml) se le añadió
N-bromosuccinimida (14,24 g, 80,00 mmol, Aldrich) y
se agitó la mezcla a 25ºC durante 0,5 h dando una disolución
amarillo claro. Se llevó a cabo la reacción de manera continua a
25ºC durante 24 h dando un precipitado blanco, que se recogió
mediante filtración y luego se lavó con agua destilada (2 x 1 ml)
seguido por etanol al 95% (2 x 2 ml) produciendo 2,216 g de
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (mediante RMN) como un polvo blanco. Se vertió el filtrado en
200 ml de agua con hielo y se recogió el precipitado mediante
filtración, luego se lavó con agua destilada (2 x 2 ml) seguido por
etanol al 95% (2 x 2 ml) produciendo 3,627 g de
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(con el 1% de impureza mediante RMN) que se disolvió en NaOH 1 N
(50 ml) y luego se acidificó hasta pH = 2 con HCl 4 N dando un
precipitado color crema blanco. Se recogió el precipitado mediante
filtración y se lavó con agua destilada (2 x 2 ml) seguido por
etanol al 95% (2 x 2 ml) y se secó al aire a 50ºC durante 8 h, dando
3,517 g (rendimiento total del 89%) de
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (mediante RMN) como un polvo blanco. La recristalización en
DMSO/H_{2}O) proporcionó microcristales blancos. Se midió el p.f.
de
5,6-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona:
descompuesto a partir de 335ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3200, 1718,
1693. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta 7,336
(s, 2H); 11,962 (s, 2H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{4}Br_{2}N_{2}O_{2} (M^{+}) m/z: 317,8639
hallado: 317,8619.
6,7-Dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(método C): A una suspensión agitada de
1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(550 mg, 3,39 mmol, Aldrich) en DMF anhidra (10 ml) se le añadió
gota a gota una disolución de bromo (1,07 g, 6,77 mmol, Aldrich) en
DMF anhidra (0,5 ml) en el plazo de 1 h y luego se agitó la reacción
a 25ºC durante 30 h. Entonces, se añadió tetraclorometano (10 ml) y
se agitó la mezcla de reacción a 50ºC durante 2 h. Se vertió la
mezcla de reacción en agua con hielo (50 ml) y se recogió el
precipitado mediante filtración y se lavó con agua destilada (2 x 1
ml) seguido por etanol al 95% (2 x 1 ml) produciendo
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (con el 1% de impureza mediante RMN) como un polvo blanco. Se
disolvió el producto bruto en NaOH 1 N (10 ml) y luego se acidificó
hasta pH = 2 con HCl 4 N dando un precipitado color crema blanco. Se
recogió el precipitado mediante filtración y se lavó con agua
destilada (2 x 1 ml) seguido por etanol al 95% (2 x 1 ml) y se secó
al aire a 50ºC durante 8 h, dando 770 mg (rendimiento del 72%) de
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (mediante RMN) como un polvo blanco. La recristalización en
DMSO/H_{2}O) proporcionó microcristales blancos. Se midió el p.f.
de
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona:
descompuesto a partir de 335ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3200, 1718,
1693. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta 7,336
(s, 2H); 11,962 (s, 2H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{4}Br_{2}N_{2}O_{2} (M^{+}) m/z: 317,8639
hallado: 317,8619.
1-Amino-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se adaptó el procedimiento de Wallace, R.G., Org. Prep. Proc. Int.
14:269 (1982). A una suspensión agitada de
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(100 mg, 0,312 mmol) en agua destilada (10 ml) a 60ºC se le añadió
NaOH (400 mg, 10 mmol). Tras 30 min., se trató la disolución
resultante gota a gota a lo largo de 10 min. con ácido
hidroxilamino-o-sulfónico (40 mg,
0,35 mmol, Aldrich) en agua (0,5 ml). Se llevó a cabo la reacción a
60ºC. Apareció un precipitado blanco tras 15 min. Se agitó la
mezcla a 60ºC durante 1 h. Se recogió el precipitado blanco mediante
filtración y se lavó con agua destilada (2 x 2 ml) y etanol (2 x 1
ml), produciendo 72 mg (68%) de
1-amino-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como un polvo blanco tras secar a 60ºC durante 2 h. La
acidificación del filtrado con HCl 4 N dio 35 mg de una mezcla que
consistía en el 25% de
1-amino-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y el 75% de
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
mediante RMN. Se disolvió la muestra de 72 mg de
6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
bruta en agua destilada (15 ml) a 60ºC, se filtró para eliminar el
material insoluble y se acidificó el filtrado con AcOH hasta pH = 5
dando un precipitado blanco, que se recogió mediante filtración y se
lavó con agua destilada (2 x 2 ml) seguido por etanol (2 x 1 ml).
Se secó el sólido en un rotavapor a 60ºC durante 2 h produciendo 43
mg de
1-amino-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pura como un polvo blanco; p.f.: 335-338ºC (desc.).
IR (KBr, cm^{-1}): 3337; 3212; 3062; 1706; 1668; 1575. RMN
(^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta 5,784 (s, 2H);
7,391 (s, 1H); 7,841 (s, 1H); 12,158 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{5}N_{3}O_{2}Br_{2} (M^{+}) m/z: 332,8746;
hallado: 332,8741.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Cheeseman, G.W.H.,
J. Chem. Soc. 1170 (1962). A una suspensión agitada de
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(576 mg, 1,8 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (6 ml) a 0ºC
durante 30 min. se le añadió KNO_{3} (220 mg, 2,18 mmol, Baker)
en una porción. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 h luego a
temperatura ambiente durante un día. Se cambió el color de la
mezcla de rojo a amarillo marrón. Entonces se vertió en hielo (60 g)
dando como resultado la separación de un precipitado amarillo
brillante, que se recogió mediante filtración y se lavó con agua
destilada (2 x 2 ml) seguido por etanol (2 x 1 ml) obteniendo 498 mg
de
5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (76%, contiene impurezas secundarias mediante RMN). La
cristalización en DMSO/H_{2}O dio
5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura como microcristales amarillo brillante; p.f.:
352-354ºC (desc.). IR (KBr, cm^{-1}): 3387; 3256;
1756; 1700; 1537. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}):
\delta 7,475 (s, 1H); 12,217 (s, 1H); 12,265 (s, 1H). HRMS: calc.
para C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}Br_{2} (M^{+}) m/z: 362,8489;
hallado: 362,8509.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Shin, S.C. y Lee,
Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4
(1983). Se añadió gota a gota una disolución roja de
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(100 mg, 0,36 mmol, Cheeseman, citado anteriormente) y KOH 3 N (2
ml) en agua destilada (5 ml) a 65ºC a una disolución incolora de
NH_{2}OSO_{3}H (75 mg, 0,66 mmol, Aldrich) en agua destilada
(0,5 ml) con agitación. Apareció un precipitado amarillo tras 10
min. Se agitó la mezcla a 65ºC durante 1 h y se permitió que
reposara a temperatura ambiente durante la noche, luego se recogió
el precipitado mediante filtración a 50ºC y se lavó con agua
destilada (2 ml), luego se secó a 50ºC durante la noche,
produciendo 85 mg (80%) de
1-amino-5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta, como un sólido amorfo amarillo (el 80% de la
1-amino-5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
deseada con el 20% de material de partida mediante RMN). Se
disolvió una muestra de 85 mg de
1-amino-5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (base libre Na+, 0,293 mmol) en agua destilada (10 ml) a
50ºC, luego se acidificó con AcOH hasta pH = 5. Tras la eliminación
del material insoluble mediante filtración, se calentó la mezcla a
60-70ºC hasta que se obtuvo una disolución
transparente, que se enfrió lentamente, tras lo que apareció un
precipitado amarillo. Se cristalizó el precipitado en EtOH caliente
y se recogieron los microcristales amarillos mediante filtración,
se lavaron con etanol frío (2 ml) y se secaron al aire a 60ºC
durante 4 h, produciendo 31 mg (29%) de
1-amino-5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura. Se midió el p.f.: el color de
1-amino-5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
cambió a amarillo oscuro a 275ºC; la descomposición de
1-amino-5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
es obvia a 280ºC y fundió dando un líquido negro a
290-1ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3442; 3315; 3231;
1747; 1723; 1680; 1632; 1547. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 5,848 (s, 2H); 7,951 (s,
1H); 12,595 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{4}N_{4}O_{4}Cl_{2} (M^{+}) m/z:289,9623; hallado
289,9616.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Shin, S.C. y Lee.
Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4
(1983). A una disolución roja agitada de
5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(120 mg, 0,33 mmol) y KOH 3 N (2 ml) en agua destilada (5 ml) a
65ºC se le añadió gota a gota una disolución incolora de
NH_{2}OSO_{3}H (56 mg, 0,50 mmol) en agua destilada (0,5 ml)
con agitación, después de lo cual apareció un precipitado amarillo
tras 5 min. Se agitó la mezcla a 65ºC durante 1 h y se permitió que
reposara a temperatura ambiente durante la noche, entonces se
recogió el precipitado mediante filtración a 50ºC, se lavó con agua
destilada (2 ml), luego se secó al aire a 50ºC durante la noche,
produciendo 80 mg (64%) de
1-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (base libre Na+ mediante RMN, D_{2}O), como un sólido
amorfo amarillo (el 80% de la
1-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
deseada con el 20% de material de partida mediante RMN). (No se
sabe si la reacción realmente dio el isómero de
1-amino o 4-amino.) Se disolvió una
muestra de 80 mg de
1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (0,211 mmol) en agua destilada (10 ml) a 50ºC, luego se
acidificó con AcOH hasta pH = 5. Tras retirar el material insoluble
mediante filtración, se calentó a 60-70ºC hasta que
se obtuvo una disolución transparente, luego se enfrió lentamente y
apareció un precipitado amarillo. Se cristalizó el precipitado en
EtOH caliente, se recogió mediante filtración y se lavó con etanol
frío (2 ml), luego se secó al aire a 60ºC durante 4 h, produciendo
57 mg (45,6%) de 1
(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (base libre H). Se añadió NH_{2}OSO_{3}H (40 mg, 0,35
mmol) a la disolución madre, y se dejó reaccionar a
65-70ºC durante 30 min. dando una segunda cosecha
de
1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (26 mg, 21%), usando el mismo procedimiento que anteriormente.
El rendimiento total es del 66%. Se midió el p.f.: el color de
1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
cambió a amarillo oscuro a 301ºC; la descomposición de
1(4)-amino-5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
es obvia a 310ºC y se fundió dando un líquido negro a
320-1ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3414; 3211; 1745;
1728; 1682; 1631; 1546. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 5,832 (s, 2H); 8,047 (s,
1H); 12,565 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{4}N_{4}O_{4}Br_{2} (M^{+}) m/z: 377,8613;
hallado: 377,8583.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el método de Cheeseman, citado
anteriormente. Se disolvió
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(239 mg, 1,03 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (3 ml) a 0ºC
durante 30 min., y se añadió KNO_{3} (125,3 mg, 1,24 mmol, Baker)
a esta disolución. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 h y luego se
agitó a temperatura ambiente durante 30 h. Entonces se vertió en
agua con hielo (15 g). Apareció un precipitado y se recogió mediante
filtración, se disolvió en KOH 1 N (10 ml) y se retiró el
precipitado rojo mediante filtración. Luego se acidificó la
disolución hasta pH = 2 con HCl 4 N dando un precipitado color
crema, que se recogió mediante filtración, luego se secó al aire a
50ºC durante 4 h produciendo la
6-nitro-5,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (231 mg, 80%), como microcristales amarillos. P.f.:
320-25ºC (desc. a partir de 290ºC). IR (KBr,
cm^{-1}): 3467, 3140, 3055, 2946, 1717, 1693, 1541. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 7,221 (s, 1H), 11,932 (s,
1H), 12,312 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}Cl_{2} (M^{+}) m/z: 274,9499,
hallado: 274,9509.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el método de Cheeseman, citado
anteriormente. Se disolvió
5,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(74 mg, 0,23 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1 ml) a 0ºC
durante 30 min., y luego se añadió KNO_{3} (28 mg, 0,27 mmol,
Baker) a esta disolución. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 h y
luego a temperatura ambiente durante 30 h. Se vertió en agua con
hielo (8 g) y se recogió el precipitado mediante filtración, se
disolvió en KOH 1 N (5 ml) y se eliminó el precipitado rojo
mediante filtración. Luego se acidificó la disolución hasta pH = 2
con HCl 4 N obteniendo un precipitado color crema, que se recogió
mediante filtración, luego se secó al aire a 50ºC durante 4 h,
produciendo la
6-nitro-5,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (71 mg, 84,5%), como un polvo amarillo; p.f.:
318-20ºC (desc.). IR (KBr, cm^{-1}): 3468, 3131,
3062, 2931, 1712, 1593, 1537. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 7,392 (s, 1H), 11,566 (s,
1H), 12,274 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}Br_{2} m/z: 362,8489, hallado:
362,8478.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el método de Cheeseman, citado
anteriormente. Se disolvió
5-cloro-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(30 mg, 0,14 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (0,5 ml) a 0ºC
durante 30 min., y se añadió KNO_{3} (17 mg, 0,17 mmol, Baker) en
una porción a esta disolución. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 h,
luego a temperatura ambiente durante 30 h. Se vertió en agua con
hielo (5 g) y se recogió el precipitado mediante filtración. Se
disolvió el precipitado en NaOH 1 N (5 ml), luego se acidificó hasta
pH = 2 con HCl 4 N dando un precipitado color crema, que se recogió
mediante filtración, luego se secó al aire a 50ºC durante 4 h,
produciendo el compuesto del título puro (mediante RMN)
5-cloro-6-nitro-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(31 mg, 85,4%), como un sólido amorfo blanco. P.f.: descompuesto a
partir de 280ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3600, 3462, 3131, 1712, 1612,
1550. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta 7,106
(d, J = 10,2 Hz,
1H), 11,800 (s, 1H), 12,371 (s, 1H). HRMS: calc. para C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}ClF (M+) m/z: 258,9795, hallado: 258,9790.
1H), 11,800 (s, 1H), 12,371 (s, 1H). HRMS: calc. para C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}ClF (M+) m/z: 258,9795, hallado: 258,9790.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el método de Cheeseman, citado
anteriormente. Se disolvió
5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(77 mg, 0,30 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1 ml) a 0ºC
durante 30 min., y se añadió KNO_{3} (35 mg, 0,346 mmol, Baker) a
esta disolución. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 h y luego a
temperatura ambiente durante 30 h. Se vertió la mezcla en agua con
hielo (10 g) y se recogió el precipitado mediante filtración. Se
disolvió el precipitado en NaOH 1 N (10 ml), luego se acidificó
hasta pH = 2 con HCl 4 N dando un precipitado color crema, que se
recogió mediante filtración, y se secó al aire a 50ºC durante 4 h
produciendo
5-bromo-6-nitro-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (mediante RMN) (81 mg, 90%), como un sólido amorfo blanco;
p.f.: 320-25ºC (desc. a partir de 290ºC). IR (KBr,
cm^{-1}): 3416, 3071, 2952, 1721, 1609, 1546. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 7,146 (d, J=10,2 Hz, 1H),
11,432 (s, 1H), 12,340 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}BrF (M +) m/z: 302,9290, hallado:
302,9290.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Cheeseman, citado
anteriormente. Se disolvió
5-bromo-7-trifluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(75 mg, 0,24 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1 ml) a 0ºC con
agitación, a lo que se añadió KNO_{3} (30 mg, 0,28 mmol, Baker) a
0ºC con agitación. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 2 h. luego a
temperatura ambiente durante 1 día. Se cambió el color de la mezcla
a amarillo marrón. Luego se vertió en agua con hielo (10 g) para
separar el precipitado amarillo claro. Se recogió el precipitado
mediante filtración y se lavó con agua destilada (1 ml) seguido por
etanol (2 x 1 ml) dando
5-bromo-6(8)-nitro-7-trifluorometil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (78 mg, 92%) que contenía algo de isómero mediante RMN. La
cristalización en DMSO/H_{2}O dio el producto puro como un
microcristal blanco. P.f.: 290-2ºC. IR (KBr,
cm^{-1}): 3435; 3143; 1713; 1613; 1555. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta. 7,519 (s, 1H) para
6-nitro; 7,960 (s, 1H) para 8-nitro
(6:8=70: 30); 11,811 (s, 1H); 12,391 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{9}H_{3}N_{3}O_{4}F_{3}Br (M^{+}) m/z: 352,9258;
hallado: 352,9270.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Shin, S.C. y Lee.
Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4
(1983). Se disolvió
5,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(46 mg, 0,144 mmol) en KOH 3 N (2 ml) a 60ºC durante 1 h y se
añadió gota a gota NH_{2}OSO_{3}H (20 mg, 0,172 mmol, Aldrich)
en agua destilada (0,5 ml) en la disolución anterior con agitación
a 60ºC. Apareció algo de precipitado tras 15 min., luego se añadió
una segunda porción de NH_{2}OSO_{3}H de 20 mg. Se agitó la
mezcla a temperatura ambiente durante 1 h. Se recogió el precipitado
blanco mediante filtración, se lavó con agua destilada fría (0,5
ml), produciendo
1-amino-5,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (38 mg, 79%) tras secar al aire a 60ºC durante 2 h (contiene
la
4-amino-5,7-dibromo-2,3-quinoxalindiona
isomérica, mediante RMN, pero no se sabe cual se produce en una
mayor cantidad). Se disolvió una muestra de 38 mg de
1-amino-5,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta en agua destilada (4 ml) a 60ºC, se eliminó el material
insoluble mediante filtración y se acidificó el filtrado con AcOH
hasta pH = 5 dando un precipitado blanco, que se recogió mediante
filtración y se lavó con agua destilada fría (2 x 1 ml). Se secó el
precipitado a 60ºC durante 2 h produciendo
1-amino-5,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(28 mg, 58,5%) como un polvo blanco con algo de isómero. P.f.:
273-5ºC (desc. a partir de 270ºC). IR (KBr,
cm^{-1}): 3435; 3289; 3190; 1719; 1672; 1625; 1584. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 5,831 ((s, 2H); 7,672 (d,
J=15 Hz, 1H); 7,810 (d, J=15 Hz, 1H); 11,275 (s, 1H). HRMS: calc.
para C_{8}H_{5}N_{3}O_{2}Br_{2} (M^{+}) m/z: 332,8746;
Hallado: 332,8744.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Wallace, R.G.,
Org. Prep. Proc. Int. 14:269 (1982). Se disolvió
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(52 mg, 0,225 mmol) en KOH 3 N (1 ml) a 60ºC durante 0,5 h, y se
añadió gota a gota NH_{2}OSO_{3}H (30 mg, 0,265 mmol, Aldrich)
en agua destilada (0,5 ml) en la disolución anterior con agitación a
60ºC. Apareció algo de precipitado tras 15 min. Se agitó la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Se recogió el precipitado
blanco mediante filtración, se lavó con agua destilada fría (0,5 ml)
y se secó en rotavapor a 60ºC durante 2 h produciendo a
1-amino-5,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (38 mg, 69%), que incluía un poco del isómero
(4-amino-5,7-dicloro-2,3-quinoxalindiona)
mediante ^{1}H RMN (se sabe que el isómero está presente en una
mayor cantidad).
Se disolvió una muestra de 38 mg de
1(4)-amino-5,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta en agua destilada (4 ml) a 60ºC, se eliminó el material
insoluble mediante filtración, se acidificó el filtrado con AcOH
hasta pH = 5 dando un precipitado blanco, que se recogió mediante
filtración y se lavó con agua destilada fría (2 x 1 ml). Se secó el
precipitado en rotavapor a 60ºC durante 2 h, produciendo
1(4)-amino-5,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(29 mg, 53,5%) como un polvo blanco, p.f.: 294-6ºC
(con desc.) IR (KBr, cm^{-1}): 3450; 3325; 3200; 3075; 1693;
1625; 1593; 1500; 1368. RMN (^{1}N, DMSO-d_{6}):
\delta 5,838 (s, 2H); 7,454 (d, J=2,1 Hz, 1H); 7,639 (d,
J=2,1Hz,1H); 11,691 ((s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}N_{5}Cl_{2}N_{3}O_{2} (M^{+}) m/z: 244,9757;
hallado: 244,9769.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Shin, S.C. y Lee,
Y.Y., Taehan Hwahakhoe Chi 27(5):382-4
(1983). Se disolvió
5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(85 mg, 0,33 mmol) en KOH 3 N (1,5 ml) a 60ºC durante 0,5 h dando
una disolución marrón claro, y se añadió gota a gota
NH_{2}OSO_{3}H (45 mg, 0,396 mmol, Aldrich) en agua destilada
(0,5 ml) en la disolución anterior con agitación a 60ºC. Apareció
algo de precipitado tras 15 min. Luego se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante la noche. Se recogió el precipitado
marrón mediante filtración, se lavó con agua destilada fría (0,5
ml) y se secó en rotavapor a 60ºC durante 2 h, produciendo
1-amino-5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (59 mg, 65,5%, 5% de isómero de
4-amino-5-bromo-7-fluoro-2,3-quinoxalindiona
mediante RMN).
Se disolvió una muestra de 59 mg de
1-amino-5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta en agua destilada (5 ml) a 60ºC, se eliminó el material
insoluble mediante filtración y se acidificó el filtrado con AcOH
hasta pH = 5 dando un precipitado marrón, que se recogió mediante
filtración y se lavó con agua destilada fría (2 x 1 ml). Se secó el
precipitado en rotavapor a 60ºC durante 2 h, produciendo
1-amino-5-bromo-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
pura (49 mg, 54,5%) como un polvo marrón; p.f.:
293-5ºC (con desc.) IR (KBr, cm^{-1}): 3443; 3318;
3206; 3081; 1731; 1668; 1612; 1600; 1506; 1343. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 5,832 (s, 2H);
7,439-7,519 (m, 2H); 11,207 (s, 1H). HRMS: calc.
para C_{8}H_{5}BrFN_{3}O_{2} (M^{+}) m/z: 272,9548;
hallado: 272,9569.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Van Allan, J.A.V.
y Deacon, B.D., Organic Síntesis. IV:569. Se calentó una mezcla de
1,2-diamino-4,5-diclorobenceno
(510 mg, 2,88 mmol, Aldrich), hidróxido de potasio (190 mg, 3,40
mmol), disulfuro de carbono (260 mg, 3,40 mmol), etanol al 95% (3
ml) y agua (0,45 ml) a reflujo durante 3 h. Luego se añadió carbón
activado (120 mg) con cuidado, y tras haberse calentado la mezcla a
la temperatura de reflujo durante 10 min. se eliminó el carbón
activado mediante filtración. Se calentó el filtrado hasta
60-70ºC, se añadió agua templada (3 ml) y luego se
añadió ácido acético (0,25 ml) en agua (0,5 ml) con buena agitación
durante la noche. Se colocó la mezcla en una nevera durante 3 h
obteniendo dos cristales (marrones y blancos). Los cristales
marrones se retiraron lavando con cloroformo (5 ml). La
recristalización en EtOH caliente/H_{2}0 dio
5,6-dicloro-2-mercaptobencimidazol
puro (545 mg, 86%) como agujas largas blancas. Se midió el p.f.: el
color de
5,6-dicloro-2-mercaptobencimidazol
cambió a amarillo a 303ºC; la descomposición de
5,6-dicloro-2-mercaptobencimidazol
es obvia a 305ºC y se fundió dando un líquido negro a
308-10ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3447; 3107; 3043;
1607; 1496; 1461. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}):
\delta 7,305 (s, 2H); 12,781 (s, 2H). HRMS: calc. para
C_{7}H_{4}Cl_{2}N_{2}S (M^{+}) m/z: 217,9425, Hallado:
217,9482.
En los siguientes ejemplos
45-55, los puntos de fusión se determinan en tubos
capilares abiertos en aparatos Thomas Hoover y
Mel-Temp y no están corregidos. Los espectros de IR
y ^{1}H RMN de todos los compuestos concordaban con la estructura
asignada y coincidían con los datos notificados previamente siempre
que estuvieran disponibles. Se registraron los espectros de ^{1}H
RMN en un instrumento QE-300 de General Electric a
300 MHz; se notifican los desplazamientos químicos en unidades
delta en referencia a la señal de protón residual del disolvente
deuterado (CH_{3}SOCH_{2}D, d 2,49). Se registraron los
espectros de infrarrojo en un espectrómetro Nicolet 5DXB
FT-IR. Se registraron las absorciones en números de
onda (cm^{-1}). Se registraron los espectros de masas en un
espectrómetro de masas VG ZAB-2-HF
con un sistema de datos VG-11-250,
en el modo de ionización electrónica (70 eV) a menos que se indique
lo contrario. Todos los disolventes eran de calidad de reactivo. Los
reactivos se usaron tal como se recibieron a menos que se indique lo
contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
1-Carboximetil-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-3-ona.
Se adaptó el procedimiento de Borthakur, N. et al., Ind. J.
Chem. 20B:822 (1981). Se neutralizó la disolución agitada de ácido
cloroacético (19,000 g, 0,200 mol) en agua (100 ml) con carbonato
de sodio (10,600 g, 0,100 mol) y se le añadió
o-fenilendiamina (10,800 g, 0,100 mol, Aldrich). Se sometió
a reflujo la disolución transparente durante 4 h, se enfrió y se
hizo alcalina (pH \sim 10) con disolución acuosa de carbonato de
sodio 0,3 M (150 ml). Se eliminó una pequeña cantidad de sólido
residual mediante filtración. Se acidificó el filtrado claro (pH
\sim 2) con HCl concentrado. Precipitó el sólido de color gris.
Se filtró y se secó a vacío (aspirador de agua) obteniendo 17,2 g
(83%, puro mediante ^{1}H RMN) de producto como un polvo gris
claro, p.f. 227-230ºC (véase la bibliografía p.f.
228-230ºC, Cheeseman, citado anteriormente). Era
suficientemente puro para su uso en la siguiente reacción.
1-Carboximetil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se adaptó el procedimiento de Borthakur, N. et al., Ind. J.
Chem. 20B: 822 (1981). A una disolución con agitación de
1-carboximetil-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-3-ona
(15,400 g, 0,075 mol) e hidróxido de sodio (5,20 g, 0,13 mol) en
agua (250 ml), se le añadió gradualmente una disolución de
KMnO_{4} (20,800 g 0,132 mol) en NaOH ac. (4% p/v, 120 ml) y se
sometió a reflujo la disolución de color púrpura oscuro durante 4
h, se enfrió y se filtró. Se acidificó el filtrado claro (pH \sim
2) con HCl concentrado. La filtración a vacío (aspirador de agua)
produjo 9,200 g (56%, puro mediante ^{1}H RMN) de
1-carboximetil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
como un polvo de color crema, p.f. > 300ºC (descompone) (véase
la bibliografía, p.f. > 300ºC, Borthakur et al., citado
anteriormente). Era suficientemente puro para su uso en la
siguiente reacción; ^{1}H RMN: \delta 4,84 (s, 2H),
7,13-7,27 (m, 4H), 12,16 (s, 1H); IR (KBr,
cm^{-1}): 3431, 1743, 1687, 1481, 1406, 1393, 1250.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el procedimiento de Jorgensen et
al., citado anteriormente. Se suspendieron
1-carboximetil-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(1,500 g, 0,068 mol) y Ag_{2}SO_{4} (2,232 g, 0,071 mol) en
H_{2}SO_{4} concentrado (7,5 ml). Se le añadió bromo (0,75 ml,
0,014 mol, Aldrich) a 28ºC y se agitó la suspensión a 28ºC durante
24 h. Entonces se añadió tetracloruro de carbono (7,5 ml) a la
suspensión y se calentó a 50ºC durante 2 h. Entonces se vertió en
hielo-agua (75 g). Se filtró el sólido blanco
precipitado y se lavó con agua (10 ml) y se secó a vacío (aspirador
de agua). Luego se trató con NaOH ac. 4 M (60 ml). Se eliminó por
filtración el residuo y se acidificó el filtrado transparente (pH
\sim 3) con HCl concentrado. Se filtró el sólido blanco
precipitado y se secó produciendo 1,81 g (70%, puro mediante
^{1}H RMN) de
1-carboximetil-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
ácida como un polvo blanco, p.f. > 300ºC (descompone) (véase la
bibliografía, p.f. > 300ºC, Jorgesen et al., citado
anteriormente); ^{1}H RMN: \delta 4,85 (s, 2H), 7,44 (s, 1H),
7,73 (s, 1H), 12,28 (s, 1H); IR (KBr, cm^{-1}): 3437, 1687, 1481,
1406, 1393, 1250.
\vskip1.000000\baselineskip
6,7-Dicloroquinoxalin-2(1H)-ona.
Se adaptó el procedimiento de Kazimierczuk, Z. et al.,
Liebigs Ann. Chem 75 (1982). Se sometió a reflujo una disolución de
4,5-dicloro-1,2-fenilendiamina
(500 mg, 2,82 mmol, Pfaltz y Bauer), ácido glioxálico monohidratado
(389 mg, 4,23 mmol, Aldrich) en etanol (8 ml) durante 12 h. Con
enfriamiento hasta 28ºC, precipitó un sólido de color púrpura que
se filtró a vacío (aspirador de agua), se lavó con etanol frío (20
ml) y se secó adicionalmente a vacío obteniendo 575 mg (94%, puro
mediante ^{1}H RMN) de
6,7-dicloroquinoxalin-2(1H)-ona
como un polvo de color púrpura claro, p.f.
325-328ºC (véase la bibliografía, p.f. >300ºC;
Kazimierczuk, et al., citado anteriormente). Era
suficientemente puro para su uso en la siguiente reacción. ^{1}H
RMN: \delta 7,40 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 12,52 (s,
1H). IR (KBr, cm^{-1}): 1668, 1606, 1468, 1387.
6,7-Dicloro-1-etoxicarbonilmetilquinoxalin-2(1H)-ona.
Se adaptó el procedimiento de Jorgensen et al., citado
anteriormente. Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvió sodio
(60 mg, 2,60 mmol) en etanol absoluto (20 ml) y se le añadió
6,7-dicloroquinoxalin-2(1H)-ona
(520 mg, 2,420 mmol). Se sometió a reflujo la disolución de color
púrpura oscuro durante 30 min., se enfrió hasta 28ºC y se le añadió
bromoacetato de etilo (485 mg, 2,900 mmol, Aldrich) y se sometió a
reflujo durante 2 h más. Durante este tiempo, se separó un sólido de
color púrpura que se filtró, se lavó con etanol absoluto (10 ml) y
se secó al aire durante la noche produciendo 636 mg (91%, puro
mediante ^{1}H RMN)
6,7-dicloro-1-etoxicarbonilmetilquinoxalin-2(1H)-ona
como un polvo de color púrpura claro, p.f.
207-210ºC (véase la bibliografía, p.f. no
notificado). Era suficientemente puro para su uso en la siguiente
reacción. ^{1}H RMN: \delta 1,18 (t, 3H, J = 6,9 Hz), 4,14 (q,
2H, J = 6,9 Hz), 5,04 (s, 2H), 8,01 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,33 (s,
1H). IR (KBr, cm^{-1}): 1737, 1662, 1400, 1231.
1-Carboximetil-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se adaptó el procedimiento de Jorgensen et al., citado
anteriormente. Se suspendió
6,7-dicloro-1-etoxicarbonilmetilquinoxalin-2(1H)-ona
(528 mg, 1,840 mmol) en disolución ac. de NaOH 0,63 M (25 ml) y se
le añadió H_{2}O_{2} al 30% (0,700 ml). Se agitó la suspensión
a 70-80ºC durante 5 h, tiempo durante el que se
formó una disolución de color rojo oscuro. Luego se enfrió en un
baño de hielo y se acidificó (pH \sim 2) con HCl concentrado. Se
filtró el sólido precipitado produciendo 484 mg de polvo de color
púrpura claro. La cristalización en DMF-agua
proporcionó 457 mg (85%, puro mediante ^{1}H RMN) de
1-carboximetil-6,7-dicloroquinoxalin-2,3(1H,4H)-diona
ácida como un polvo de color gris; p.f. 317-320ºC
(véase la bibliografía, p.f. 317-319ºC, Jorgesen
et al., citado anteriormente); ^{1}H RMN: \delta 4,85
(s, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 12,28 (s, 1H); IR (KBr,
cm^{-1}): 3428, 3129, 1694, 1489, 1396.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión agitada de
6,7-dicloroquinoxalin-2(1H)-ona
(100 mg, 0,465 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1,5 ml), se le
añadió agua (1,0 ml) para formar una disolución. Entonces se enfrió
hasta 5-10ºC y se añadió KNO_{3} (50 mg, 0,46
mmol) en una porción. La adición de KNO_{3} da como resultado una
disolución de color verde oscuro que se agitó a
5-10ºC durante 3 h y luego a 28ºC durante 60 h. Se
vertió la suspensión amarilla así obtenida en
hielo-agua (15 g) y se filtró el sólido amarillo
resultante y se secó al aire durante la noche obteniendo 78 mg de
producto bruto como un polvo amarillo. La cristalización en
DMF-agua proporcionó 45 mg (37%, pura mediante
^{1}H RMN) de
6,7-dicloro-8-nitroquinoxalin-2(1H)-ona
como un polvo amarillo; p.f. 330-332ºC
(descompone); ^{1}H RMN: \delta 7,59 (s, 1H), 8,28 (s, 1H); IR
(KBr, cm^{-1}): 1695, 1654, 1555, 1367; HRMS calc. para
C_{8}H_{2}Cl_{2}N_{3}O_{3} (M^{+}) m/z 258,9551, hallado
m/z 258,9550.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución agitada de
1-carboximetil-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(100 mg, 0,264 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1,5 ml) a
5-10ºC, se le añadió KNO_{3} (28 mg, 0,28 mmol) en
una porción. Se agitó la disolución verde oscura resultante a
5-10ºC durante 30 min. y a 28ºC durante la noche. Se
vertió la suspensión de color amarillo así obtenida en
hielo-agua (15 g) y se filtró el sólido amarillo
brillante resultante y se secó a vacío obteniendo 53 mg (47%, puro
mediante ^{1}H RMN) de
1-carboximetil-6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
como un polvo amarillo brillante; p.f. 260-264ºC.
^{1}H RMN: \delta 4,91 (s, 1H), 7,98 (s, 1H). IR (KBr,
cm^{-1}): 1701, 1543, 1391, 1244. HRMS calc. para
C_{10}H_{5}Br_{2}N_{3}O_{6} (M^{+}) m/z 420,8546,
hallado m/z 420,8559.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo todas las reacciones bajo una
atmósfera de nitrógeno. Los reactivos se usaron tal como se
recibieron a menos que se indique lo contrario. Los puntos de fusión
se tomaron en un aparato de punto de fusión
Mel-Temp y están sin corregir. Se colocaron las
muestras en el bloque cuando la temperatura era de > 250ºC con
el fin de minimizar la descomposición antes de la fusión. Se destiló
tetrahidrofurano (THF) a partir de disolución de cetilo de
benzofenona de sodio azul. Se secó la DMF sobre tamices moleculares.
Se registraron los espectros deH RMN en un instrumento
QE-300 de General Electric a 300 MHz; se notifican
los desplazamientos químicos en unidades delta en referencia a
señales de protones residuales de los disolventes deuterados
(CDCl_{3}, \delta 7,26; CH_{3}SOCH_{2}D, \delta 2,49). Los
espectros de infrarrojo se obtuvieron en un espectrómetro Nicolet
5DXB FT-IR.
Oxamato de
etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenilo).
Se preparó oxamato de
etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenilo)
usando una adaptación del método de Loev, et al., J. Med.
Chem. 28:363 (1985). A una disolución agitada de
4,5-dicloro-2-nitroanilina
(2,07 g, 0,01 mol) en THF anhidro (15 ml) y trietilamina (1,5 ml,
0,011 mol) a 0ºC se le añadió gota a gota cloruro de etiloxalilo
(4,6 g, 0,015 mol). Se permitió que se calentase la suspensión
amarilla resultante hasta 25ºC en el baño y luego se agitó durante 3
h. Se vertió la suspensión marrón resultante en 75 ml de agua con
hielo. Se formó un precipitado marrón. La mezcla se filtró a vacío
y se secó el sólido al aire durante 1 h produciendo 3,27 g de un
sólido marrón oscuro que se disolvió en etanol (38 ml) con
calentamiento hasta 70ºC. Se añadió agua (6 ml) hasta que apareció
precipitación. Se calentó la mezcla de nuevo hasta que se
redisolvió el precipitado. Se dejó enfriar la disolución marrón
lentamente, dando cristales similares a agujas amarillos. Se filtró
la mezcla a vacío y se secaron al aire los cristales durante 2 h
produciendo 1,7322 g (5,64 mmol) de oxamato de
etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenilo)
como agujas amarillo pálido (56,4%): p.f. 95-97ºC.
^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,897 (sa, 1H, NH),
9,067 (s, 1H, H-3), 8,412 (s, 1H,
H-6), 4,463 (q, 2H CH_{2}), 1,435 (t, 3H,
CH_{3}).
6,7-Dicloro-N-hidroxi-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se preparó este compuesto usando una adaptación del método de Loev,
et al., citado anteriormente. Se hidrogenó una mezcla de
oxamato de
etil-N-(4,5-dicloro-2-nitro-fenilo)
(0,307 g, 1 mmol) y 0,04 g de Pd al 5%-C en 5 ml de DMF a 45 psi
durante 1,5 h. Se filtró la mezcla de reacción y se añadió el
líquido a agua (18 ml). Se formó una precipitación blanca. Se filtró
la mezcla a vacío. Se enjuagó el sólido con agua (5x2 ml) y se secó
al aire durante 1 h produciendo 215,14 mg (0,87 mmol) de
6,7-dicloro-N-hidroxi-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como un sólido amarillo pálido (87%). Se disolvió el sólido
amarillo pálido (215 mg, 0,87 mmol) en 4 ml de DMSO con
calentamiento. Se añadió agua (0,8 ml) hasta que apareció
precipitación. Se calentó la mezcla de nuevo para redisolver el
precipitado. Se enfrió la disolución amarilla. Aparecieron cristales
amarillo pálido que se recogieron mediante filtración a vacío y se
aclararon con agua (5x2 ml) y se secaron a vacío produciendo 173 mg
(0,70 mmol) de
6,7-dicloro-N-hidroxi-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como cristales amarillo pálido. p.f. > 300ºC (desc.). ^{1}H
RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,244 (sa, 1H,
NH), 11,953 (sa, 1H, N-OH), 7,562 (s, 1H,
H-8), 7,318 (s, 1H, H-5). HRMS calc.
para C_{8}H_{4}Cl_{2}N_{2}O_{3}, 245,9599; hallado,
245,9600.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución con agitación de
1-carboximetil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(100 mg, 0,450 mmol) y anilina (62 mg, 0,66 mmol) en DMF seca (2
ml) bajo N_{2} a 28ºC, se le añadió DCC (95 mg, 0,46 mmol,
Aldrich) en una porción. Se agitó la disolución durante 4 h a 28ºC.
Se filtró el sólido insoluble y se lavó con DMF (1 ml). Se vertió
el filtrado transparente en agua (30 ml). Se filtró el sólido así
obtenido y se secó a vacío (aspirador de agua) produciendo 133 mg
de producto bruto como un polvo gris. Se purificó mediante
extracción Soxhlet en etanol en ebullición (20 ml), manteniendo la
temperatura del baño de aceite a 120ºC, durante 4 h. Se secó el
material insoluble (en el manguito) a vacío obteniendo 55 mg de
N-(N'-fenilcarbox-amidil)metil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pura (^{1}H RMN) como un sólido blanco (también acabó
extrayéndose parte del producto mediante etanol caliente lo que
explica el bajo rendimiento del producto puro). p.f. > 300ºC
(descompone). ^{1}H RMN: \delta 4,92 (s, 2H),
7,01-7,30 (m, 7H), 7,51 (d, 2H, J = 6,9 Hz), 10,26
(s, 1H), 12,13 (s, 1H). IR (KBr, cm^{-1}): 3148, 1715, 1671,
1600, 1557. HRMS: calculado para C_{16} H_{13} N_{3} O_{3},
295,0951; Observado, 296,1033.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución con agitación de
N-carboximetil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(250 mg, 1,140 mmol) y p-nitroanilina (156 mg,
1,140 mmol) en DMF (3 ml) bajo N_{2} a 0ºC, se le añadió DCC (233
mg, 1,140 mmol) en una porción. Se dejó calentar la disolución
hasta 28ºC y se agitó a esa temperatura durante la noche. Se filtró
el sólido precipitado y se vertió el filtrado transparente en agua
(30 ml). Se filtró el sólido así obtenido y se secó a vacío
(aspirador de agua) obteniendo 100 mg de producto bruto como un
polvo amarillo. Se purificó el producto bruto mediante extracción
Soxhlet en etanol en ebullición (20 ml), manteniendo la temperatura
del baño de aceite a 120ºC, durante 4 h. Se secó el material
insoluble (en el manguito) a vacío obteniendo 23 mg de
N-(N'-(p-nitrofenil)carboxamidil)metil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pura (^{1}H RMN) como un polvo amarillo claro (también acabó
extrayéndose parte del producto mediante etanol caliente lo que
explica el bajo rendimiento del producto puro). p.f. > 300ºC
(descompone). ^{1}H RMN: \delta 5,02 (s, 1H),
7,13-7,3 (m, 4H), 7,78 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,21 (d,
1H, J = 8,4 Hz), 10,92 (s, 1H), 12,16 (s, 1H). IR (KBr, cm^{-1}):
3453, 1701, 1684, 1625, 1572, 1509. HRMS: calculado para C_{16}
H_{12} N_{4}O_{5}, 340,0808; Observado, 340,0811.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución con agitación de
N-carboximetil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
ácida (200 mg, 0,910 mmol) y p-fenilendiamina (98
mg, 0,91 mmol) en DMF (2 ml) bajo N_{2} a 0ºC, se le añadió DCC
(190 mg, 0,910 mmol) en una porción. Se dejó calentar la disolución
hasta 28ºC y se agitó a esa temperatura durante la noche. Se filtró
el sólido precipitado y se vertió el filtrado transparente en agua
(10 ml). Se filtró el sólido así obtenido y se secó a vacío
(aspirador de agua) obteniendo 180 mg de producto bruto como un
polvo marrón. Se purificó el producto mediante extracción Soxhlet
en etanol en ebullición (20 ml), manteniendo la temperatura del
baño de aceite a 120ºC, durante 4 h. Se secó el material insoluble
(en el manguito) a vacío obteniendo 135 mg de
N-(N'-(p-aminofenil)carboxamidil)metil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pura (^{1}H RMN) como un polvo blanco. p.f. >300ºC
(descompone). ^{1}H RMN: \delta 4,84 (s, 2H), 4,93 (s, 2H), 6,5
(d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,15-7,25 (m, 6H), 9,83 (s,
1H), 12,15 (s, 1H). IR (KBr, cm^{-1}): 3462, 3143, 1793, 1693,
1593, 1443. HRMS: calculado para C_{16}H_{14}N_{4}O_{3},
310,1066; Observado, 310,1071.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución con agitación de
N-carboximetil-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(100 mg, 0,250 mmol) y anilina (25 mg, 0,25 mmol) en DMF anhidra
(1,5 ml) bajo N_{2} a 28ºC, se le añadió DCC (55 mg, 0,25 mmol)
en una porción. Se agitó la disolución a 28ºC durante 18 h. Se
filtró el sólido blanco insoluble y se vertió el filtrado claro en
agua (6 ml). Se filtró el sólido precipitado y se secó al aire
obteniendo 113 mg de producto bruto como un polvo gris. Luego se
purificó el producto bruto mediante extracción Soxhlet en etanol en
ebullición (20 ml), manteniendo la temperatura del baño de aceite a
120ºC, durante 5 h. Se secó el residuo (en el manguito) en el horno
(aproximadamente 70-80ºC) durante la noche
proporcionando 35 mg de
N-(N'-fenilcarboxamidil)metil-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pura (^{1}H RMN) como un polvo gris claro; p.f. > 300ºC
(descompone). ^{1}H RMN: \delta 4,97 (s, 1H),
6,99-7,11 (m, 1H), 7,23-7,37 (m,
2H), 7,44 (s, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,73 (s, 1H), 10,25 (s,
1H), 12,25 (s, 1H). IR (KBr, cm^{-1}): 3620, 3468, 1714, 1694,
1595, 1542. HRMS: calculado para
C_{16}H_{11}Br_{2}N_{3}O_{3}, 450,9168; Observado,
450,9177.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución con agitación de
N-carboximetil-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(100 mg, 0,260 mmol) y m-nitroanilina (40 mg, 0,29
mmol) en DMF anhidra (2 ml) bajo N_{2} a 28ºC, se le añadió DCC
(60 mg, 0,29 mmol) en una porción. Se agitó la disolución durante 4
h a 28ºC. Se filtró el sólido insoluble y se lavó con DMF (1 ml).
Entonces se vertió el filtrado claro en agua (30 ml). Se filtró el
sólido precipitado y se secó a vacío (aspirador de agua) obteniendo
65 mg de producto bruto como un polvo amarillo. Se purificó el
producto mediante extracción Soxhlet en etanol en ebullición (20
ml), manteniendo la temperatura del baño de aceite a 120ºC, durante
4 h. Se secó el material insoluble (en el manguito) a vacío
obteniendo 30 mg de
N-(N'-(m-nitrofenil)carboxamidil)-metil-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
pura (^{1}H RMN) como un sólido blanco (también acabó
extrayéndose parte del producto mediante etanol caliente que explica
el bajo rendimiento del producto puro). p.f. > 300ºC
(descompone). ^{1}H RMN: \delta 4,98 (s, 1H), 7,45 (s, 1H),
7,61 (d de d visto como un t, J = 8,1 Hz) 7,79 (s, 1H), 7,86 (d, 1H,
J = 9 Hz), 7,91 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,54 (s, 1H), 10,76 (s, 1H),
12,28 (s, 1H). IR (KBr, cm^{-1}): 3444, 3289, 1707, 1686, 1672,
1602. HRMS: calculado para C_{16}H_{10}Br_{2}N_{4}O_{5},
495,9018; Observado, 495,9008.
\vskip1.000000\baselineskip
En las siguientes síntesis, los reactivos se
usaron tal como se recibieron a menos que se indique lo contrario.
Los puntos de fusión se tomaron en un aparato de punto de fusión
Mel-Temp y están sin corregir. Se colocaron las
muestras en el bloque cuando la temperatura era de >250ºC con el
fin de minimizar la descomposición antes de la fusión. Se realizó
cromatografía en columna en el modo ultrarrápido sobre gel de sílice
Davisil (200-425 de malla), a menos que se indique
lo contrario. Se realizó cromatografía de capa fina analítica en
placas de gel de sílice 60 F_{254} con base de aluminio y se
efectuó la visualización con una lámpara ultravioleta. Se
registraron los espectros de ^{1}H RMN en un
QE-300 de General Electric de 300 MHz; los
desplazamientos químicos se notifican en unidades de delta que
hacen referencia a señales de protón residuales de los disolventes
deuterados (CHCH_{3}, d 7,26; CHD_{2}OD, d 3,30;
CD_{3}SOCD_{2}H, d 2,49; CD_{3}COCD_{2}H, d 2,04). Se
llevaron a cabo los espectros de ^{13}C RMN a 75 MHz. Los
espectros de infrarrojo se obtuvieron en un espectrómetro
FT-IR de Nicolet 5DXB. Las absorciones se
registraron en números de onda (cm^{-1}) y la intensidad de las
absorciones se indica mediante las letras s (fuerte),
m (media), y w (débil). Se registraron los espectros
de masas en un espectrómetro de masas VG
ZAB-2-HF con un sistema de datos
VG-11-250, en el modo de ionización
electrónica (70 eV) a menos que se indique lo contrario. Se
realizaron microanálisis por Desert Analytics de Tuscon,
Arizona.
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla agitada de
5-nitro-6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(327 mg, 0,89 mmol) en etanol (10 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (1,0 g, 4,45 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 4 h. Luego se enfrió la mezcla hasta temperatura
ambiente y se recogió el precipitado amarillo mediante filtración,
seguido por lavado con etanol frío (2x1 ml), obteniendo 227 mg
(76%) del producto del título bruto (contiene impurezas secundarias
mediante RMN). La cristalización en DMSO/H_{2}O dio 193 mg del
producto del título puro como agujas amarillo brillante; p.f.:
324-6ºC (desc.), el color cambió a partir de 270ºC.
IR (KBr, cm^{-1}): 3456; 3281; 1700; 1643. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): d 5,844 (s, 2H); 6,732 (s, 1H);
11,257 (s, 1H); 11,810 (s, 1H). Pureza: >96,96% mediante HPLC.
HRMS: calc. para C_{8}H_{5}N_{3}O_{2}Br_{2} (M^{+}) m/z
332,8747; hallado: 332,8754. Potencia con respecto a DCK: 341%.
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla agitada de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(110 mg, 0,40 mmol) en etanol (6 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (448 mg, 2,0 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 1 h para formar una disolución transparente y se
sometió a reflujo de manera continua durante otras 3 h. Luego se
enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se recogió el
precipitado amarillo mediante filtración y se lavó con etanol frío
(2x1 ml) dando 61 mg (62%) del compuesto del título bruto (contiene
impurezas secundarias mediante RMN). La cristalización en
DMSO/H_{2}O dio 43 mg del compuesto del título puro como agujas
amarillo brillante, p.f. > 350ºC (desc.), el color cambió a
partir de 320ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3468; 3389; 3057; 1695; 1636;
1596; 1397. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta
5,935 (s, 2H); 6,595 (s, 1H); 11,317 (s, 1H); 11,868 (s, 1H). Pureza
>98,95% mediante HPLC. HRMS: calc. para
C_{8}H_{5}N_{3}O_{2}Br_{2} (M^{+}) m/z: 244,9757;
hallado 244,9740. Potencia con respecto a DCK: 323%.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución agitada de
5-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(61,5 mg, 0,25 mmol) en DMF anhidra (7 ml) se le añadió
trietilamina (33 mg, 32 mmol, destilada antes de su uso) y cloruro
de acetilo (20 mg, 0,255 mmol, destilado antes de su uso). La
mezcla se volvió una disolución amarilla tras 2 min. Tras 2 h a
25ºC, apareció un precipitado y se continuó la agitación durante la
noche, tiempo durante el que apareció más precipitado blanco. Se
recogió el precipitado mediante filtración y se lavó con agua (2x1
ml), produciendo un polvo blanco que eran 34 mg del compuesto del
título bruto (contiene algo de impureza mediante RMN). El filtrado
se añadió a agua (15 ml) obteniendo un precipitado y éste se recogió
mediante filtración y se lavó con agua (2x1 ml), produciendo 29 mg
de producto puro (mediante RMN). El rendimiento total fue del 88%.
La cristalización en DMSO/H_{2}O dio 25 mg del compuesto del
título puro como microcristales blancos; p.f.:
320-2ºC (desc. a partir de 315ºC). IR (KBr,
cm^{-1}): 3500, 3162, 3056, 1706, 1606, 1531. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): d 2,065 (s, 3H); 7,236 (s, 1H); 9,621
(s, 1H); 11,655 (s, 1H); 12,096 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{10}H_{7}N_{3}O_{3}Cl_{2} (M^{+}) m/z: 286,9863;
hallado: 286,9859. Potencia con respecto a DCK: 44%.
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla agitada de
6-nitro-5,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(81 mg, 0,295 mmol) en etanol (3 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (331 mg, 1,47 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación hasta 0,5 h, para formar una disolución transparente y se
sometió a reflujo de manera continua durante otras 0,5 h. Luego se
enfrió hasta temperatura ambiente y se recogió el precipitado
amarillo mediante filtración, seguido por lavado con etanol frío
(2x1 ml) dando 70 mg (97%) del compuesto del título bruto (contiene
impurezas secundarias mediante RMN). La cristalización en
DMSO/H_{2}O dio 32 mg del compuesto del título puro como agujas
amarillo brillante; p.f.: 342-5ºC (desc. a partir
de 335ºC), el color cambió a partir de 325ºC. IR (KBr, cm^{-1}):
3468, 3362, 3193, 1693, 1631, 1493, 1375; RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 5,418 (s, 2H); 6,999 (s,
1H); 11,238 (s, 1H); 11,776 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{5}N_{3}O_{2}Cl_{2} (M+) m/z: 244,9757; hallado
244,9769. Potencia con respecto a DCK: 8,6%.
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla agitada de
6-nitro-7-cloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(35 mg, 0,145 mmol) en etanol (2 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (163 mg, 0,724 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 0,5 h para formar una disolución transparente y se
sometió a reflujo de manera continua durante otras 0,5 h. Luego se
enfrió hasta temperatura ambiente y se recogió el precipitado
amarillo mediante filtración, seguido por lavado con etanol frío
(1x1 ml) dando 25 mg (82%) del compuesto del título bruto (contiene
impurezas secundarias mediante RMN). La cristalización en
DMSO/H_{2}O dio 14 mg del compuesto del título puro como agujas
amarillo brillante, p.f.: >350ºC (desc. a partir de 335ºC). IR
(KBr, cm^{-1}): 3406, 3356, 3212, 1668, 1637, 1518, 1437. RMN
(^{1}H, DMSO-d_{6}): d 5,306 (s, 2H); 6,551 (s,
1H); 6,940 (s, 1H); 11,606 (s, 1H); 11,788 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{6}N_{3}O_{2}Cl (M^{+}) m/z: 211,0147; hallado
211,0159. Potencia con respecto a DCK: 28,0%.
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla agitada de
6-nitro-7-bromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(87 mg, 0,30 mmol) en etanol (3 ml) y DMSO (0,5 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (343 mg, 1,50 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 1 h para formar una disolución transparente que
se sometió a reflujo durante otra 1 h. Luego se enfrió hasta
temperatura ambiente y se recogió el precipitado amarillo mediante
filtración, seguido por lavado con etanol frío (2x1 ml) dando 50 mg
(67%) del compuesto del título bruto (contiene impurezas
secundarias mediante RMN). La cristalización en DMSO/H_{2}O dio 21
mg de compuesto del título puro como agujas amarillo brillante,
p.f.: >300ºC (desc. a partir de 315ºC), el color cambió a partir
de 300ºC. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): d 5,257 (s,
2H); 6,558 (s, 1H); 7,087 (s, 1H); 11,599 (s, 1H); 11,792 (s, 1H).
HRMS: calc. para C_{8}H_{6}N_{3}O_{2}Br (M^{+}) m/z:
254,9642; hallado 254,9630. Potencia con respecto a DCK: 7,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Síntesis de
4-cloro-2-yodo-6-nitroanilina:
Se adoptó el procedimiento de Leeson, P.D. et al. (J. Med.
Chem. 34: 1243-1252 (1991)). A una disolución de
4-cloro-2-nitroanilina
(2,15 g, 12,45 mmol, Aldrich, usada tal como se recibió) en AcOH
glacial (16 ml) se le añadió monocloruro de yodo (2,114 g, 12,90
mmol, Aldrich). Se calentó la mezcla a 120ºC durante 5 h, luego se
enfrió y se vertió en agua con hielo (30 g). Se recogió el
precipitado y se lavó con disolución de sulfito de sodio al 10% (20
ml), luego se cristalizó en MeOH dando
4-cloro-2-yodo-6-nitroanilina
(1,05 g, 28%), como agujas marrones largas, p.f.
134-5ºC. RMN (^{1}H, CDCl_{3}): \delta 6,660
(s, 2H); 7,906 (d, 1H, J=2,1 Hz); 8,188 (d, 1H, J=1,8 Hz).
B. Síntesis de
2-amino-4-cloro-6-yodoanilina:
A una mezcla agitada de
4-cloro-2-yodo-6-nitroanilina
(389 mg, 1,305 mmol) en etanol (10 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (1,468 g, 6,526 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 0,5 h para formar una disolución transparente y
luego se continuó el reflujo durante otras 0,5 h. Se enfrió la
disolución hasta temperatura ambiente y se añadió agua con hielo
(20 g). Se ajustó el pH a pH \sim7 y se extrajo la mezcla con
acetato de etilo. Se secó el extracto sobre MgSO_{4}, y se evaporó
hasta sequedad dando 336 mg (96%) de
2-amino-4-cloro-6-yodoanilina,
como un sólido marrón. RMN (^{1}H, CDCl_{3}): \delta 3,536 (s,
2H); 3,763 (s, 2H); 7,165 (d, 1H, J=1,8 Hz); 6,671 (d, 1H, J=1,8
Hz).
C. Síntesis de
5-yodo-7-cloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona:
Se adaptó el procedimiento de Foged, C. y Journal, P. (J. de Lab.
Compd. y Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)). A
una mezcla agitada de
2-amino-4-cloro-6-yodoanilina
(366 mg, 1,253 mmol) en HCl 2 N (30 ml) se le añadió ácido oxálico
(160 mg, 1,269 mmol, usado tal como se recibió) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 120-5ºC durante 3 h,
luego se enfrió hasta temperatura ambiente durante la noche. Se
centrifugó la mezcla y se retiró la fase líquida. Se lavó el sólido
rojo dos veces con agua fría (2x2 ml), se recogió mediante
filtración, y se secó a 60ºC a presión reducida durante 2 h, dando
300 mg de
5-yodo-7-cloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
bruta (74%), como un polvo rojo que contenía algo de impurezas
(mediante RMN). Se disolvió una muestra de 300 de producto bruto en
NaOH 1 N (10 ml). Se eliminó mediante filtración algo de material
insoluble, y luego se acidificó el filtrado hasta pH=6, dando 260
mg de producto más puro. La cristalización en DMSO/H_{2}O, dio 169
mg de producto puro (42%), como microcristales rojos, p.f.:
>350ºC (desc. a partir de 295ºC). IR (KBr, cm^{-1}) 3443, 3212,
1750, 1706, 1606, 1587, 1393. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 7,133 (d, 1H, J=1,5 Hz);
7,628(d, 1H, J=1,5 Hz); 10,386 (d, 1H, J=1,5 Hz); 12,015 (d,
1H, J=1,8 Hz). HRMS: calc. para C_{8}H_{4}N_{2}O_{2}ClI
(M^{+}) m/z: 321,9004; hallado: 321,8995. Potencia con respecto a
DCK: 28,4%.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Síntesis de
4-fluoro-6-yodo-2-nitroanilina:
Se adaptó el procedimiento de Sy, W.W. (Synthetic Communications 22
(22):3215-19 (1992)). A una disolución de
4-fluoro-2-nitroanilina
(312 mg, 2,0 mmol, Aldrich, usada tal como se recibió) en EtOH (40
ml) se le añadió yodo (0,508 g, 2,0 mmol, usado tal como se recibió)
y Ag_{2}SO_{4} (622 mg, 2,0 mmol, usado tal como se recibió).
Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante un día. La CCF
(CHCl_{3}) de la mezcla mostró que consistía en el 40% de material
de partida y el 60% de producto. Se añadió yodo (127 mg, 0,5 mmol)
y Ag_{2}SO_{4} (311 mg, 1 mmol) adicional. Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante otro día, luego se eliminó mediante
filtración el precipitado amarillo que se formó y se evaporó el
filtrado hasta sequedad a presión reducida, dando 774 mg de
4-fluoro-6-yodo-2-nitroanilina
bruta. Ésta se disolvió en diclorometano y se lavó con disolución
de hidróxido de sodio al 5% (20 ml), seguido por agua. Tras la
separación de las fases, se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} y
se evaporó hasta sequedad. Se sometió a cromatografía el residuo
sobre gel de sílice y se eluyó con cloroformo, dando
4-fluoro-6-yodo-2-nitroanilina
bruta. Se purificó la muestra mediante CCF preparativa (eluida con
cloroformo) dando
4-fluoro-6-yodo-2-nitroanilina
pura (466 mg, 83%), como un polvo amarillo. RMN (^{1}H,
CDCl_{3}): \delta 6,538 (\sigma, 2H); 7,768 (q, J1=3 Hz,
J2=6,9 Hz, 1H); 7,939 (q, J1=3 Hz, J2=6,9 Hz, 1H).
B. Síntesis de
2-amino-4-fluoro-6-yodoanilina:
A una mezcla agitada de
4-fluoro-6-yodo-2-nitroanilina
(359 mg, 1,273 mmol) en etanol (10 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (1,432 g, 6,365 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 0,5 h para formar una disolución transparente, y
luego se continuó el reflujo durante otras 0,5 h. Se enfrió la
disolución hasta temperatura ambiente y se añadió agua con hielo
(20 g). Se ajustó el pH a pH \sim 7 y se extrajo la mezcla con
acetato de etilo. Se secó el extracto sobre MgSO_{4} y se evaporó
hasta sequedad dando 232 mg (73%) de
2-amino-4-fluoro-6-yodoanilina
como un sólido marrón. RMN (^{1}H, CDCl_{3}): \delta 4,366 (s,
2H); 5,149 (s, 2H); 6,368 (tetra, 1H, J1=3 Hz, J2=6,9 Hz); 6,655
(tetra, J1=3,0 Hz, J2=6,9 Hz, 1H).
C. Síntesis de
5-yodo-7-fluoro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona:
Se adaptó el procedimiento de Foged, C. y Journal, P. (J. de Lab.
Compd. y Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)). A
una mezcla agitada de
2-amino-4-fluoro-6-yodoanilina
(232 mg, 0,92 mmol) en HCl 2 N (10 ml) se le añadió ácido oxálico
(126 mg, 1,0 mmol, usado tal como se recibió) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 120-5ºC durante 3 h,
luego se enfrió hasta temperatura ambiente durante la noche. Se
centrifugó la mezcla y se retiró la fase líquida. Se lavó el
precipitado rojo con agua fría (2x2 ml), se recogió mediante
filtración, y se secó a 60ºC a presión reducida durante 2 h, dando
160 mg del compuesto del título bruto (57%), como un polvo rojo que
contenía algo de impurezas (RMN). Se disolvió la muestra de
producto bruto en NaOH 1 N (10 ml) y se eliminó mediante filtración
algo del material insoluble. Se acidificó el filtrado hasta pH=6,
dando 156 mg de producto purificado. La cristalización en
DMSO/H_{2}O dio 149 mg del compuesto del título puro (51%) como
microcristales rojos, p.f.: 310-2ºC (cambio de
color, a partir de 242ºC). IR (KBr, cm^{-1}) 3431, 3350, 3062,
1743, 1718, 1606, 1518, 1400. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 6,947 (q, 1H, J1=2,7 Hz,
J2=9,3 Hz); 6,963 (q, 1H, J1=2,7 Hz, J2=9,3 Hz); 10,313 (s, 1H);
12,054 (s, 1H). HRMS calc. para C_{8}H_{4}N_{2}O_{2}FI
(M^{+}) m/z: 305,9301; hallado: 305,9288. Potencia con respecto a
DCK: parcialmente activo.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Síntesis de
4,5-dicloro-6-yodo-2-nitroanilina:
Se adaptó el procedimiento de Sy, W.W. (Synthetic Communications
22(22):3215-19 (1992)). A una disolución de
4,5-dicloro-2-nitroanilina
(4,14 g, 2,0 mmol, usada tal como se recibió) en EtOH (40 ml) se le
añadió yodo (521 g, 2,05 mmol, usado tal como se recibió) y
Ag_{2}SO_{4} (622 mg, 2,0 mmol, usado tal como se recibió). Se
agitó la mezcla a temperatura ambiente durante un día (monitorizado
mediante CCF), luego se eliminó mediante filtración el precipitado
amarillo que se formó. Se evaporó el filtrado hasta sequedad a
presión reducida dando 600 mg de
4,5-dicloro-6-yodo-2-nitroanilina
bruta. Ésta se disolvió en diclorometano y se lavó con disolución
de hidróxido de sodio al 5% (20 ml) seguido por agua. Se secó la
fase orgánica sobre MgSO_{4} y se evaporó hasta sequedad. Se
sometió a cromatografía el residuo sobre gel de sílice y se eluyó
con cloroformo, dando el producto bruto. Éste se purificó mediante
CCF preparativa (elución con cloroformo) dando
4,5-dicloro-2-yodo-6-nitroanilina
pura (356 mg, 53%), como un polvo amarillo. RMN (^{1}H,
CDCl_{3}); \delta 6,940 (s, 2H); 8,378 (s, 1H).
B. Síntesis de
1,2-diamino-4,5-dicloro-6-yodobenceno:
A una mezcla agitada de
2-nitro-4,5-dicloro-6-yodoanilina
(216 mg, 0,648 mmol) en etanol (5 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (730 mg, 3,24 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 0,5 h para formar una disolución transparente y
luego se continuó el reflujo durante otras 0,5 h. Se enfrió la
disolución hasta temperatura ambiente y se añadió agua con hielo
(10 g). Se ajustó el pH a pH \sim7 con disolución acuosa de
NaHCO_{3} al 5% y se extrajo la mezcla con acetato de etilo. Se
secó el extracto sobre MgSO_{4} y se concentró hasta sequedad
dando 156 mg (80%) de
1,2-diamino-4,5-dicloro-6-yodobenceno
como un sólido marrón. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}):
\delta 4,954 (s, 2H); 5,162 (s, 2H); 6,722 (s, 1H).
C. Síntesis de
5-yodo-6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona:
Se adaptó el procedimiento de Foged, C. y Journal, P. (J. de Lab.
Compd. y Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)). A
una mezcla agitada de
1,2-diamino-4,5-dicloro-6-yodobenceno
(70 mg, 0,23 mmol) en HCl 2 N (10 ml) se le añadió ácido oxálico
(32 mg, 0,25 mmol, usado tal como se recibió) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 120-5ºC durante 3 h,
luego se enfrió hasta temperatura ambiente durante la noche. Se
centrifugó la mezcla y se lavó el sólido rojo dos veces con agua
fría (2x1 ml), se recogió mediante filtración, y se secó a 60ºC a
presión reducida durante 2 h, dando 60 mg del compuesto del título
bruto (73%), como un polvo rojo. Se disolvió la muestra en NaOH 1 N
(8 ml) y se eliminó mediante filtración el material insoluble. Se
acidificó el filtrado hasta pH=6, dando 46 mg de compuesto del
título. La cristalización en DMSO/H_{2}O dio 19 mg de producto
puro (23%) como microcristales rojos, p.f.: 335-8ºC
(la desc. comenzó a 330ºC). IR (KBr, cm^{-1}): 3437, 3325, 1750,
1712, 1475, 1393. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}):
\delta 7,273 (s, 1H); 10,282 (s, 1H); 12,038 (s, 1H). HRMS, calc.
para C_{8}H_{3}N_{2}O_{2}Cl_{2}I (M^{+}) m/z: 355,8614;
hallado: 355,8603. Potencia con respecto a DCK: 152%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el método de Cheeseman, G.W.H. (J.
Chem. Soc. 1170 (1962)). Se disolvió
5-yodo-7-cloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(96 mg, 0,33 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1,0 ml) a 0ºC
durante 30 min. y luego se añadió KNO_{3} (36 mg, 0,36 mmol,
Baker) a esta disolución. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 0,5 h y
luego a temperatura ambiente durante 30 h. Se vertió en agua con
hielo (5 g). Apareció un precipitado y se recogió mediante
filtración dando 101 mg del compuesto del título bruto. Se disolvió
la muestra en KOH 1 N (5 ml) y luego se eliminó mediante filtración
el precipitado rojo. Se acidificó el filtrado hasta pH=2 con HCl 4 N
dando un precipitado marrón que se recogió mediante filtración y
luego se secó al aire a 50ºC durante 4 h. Se obtuvo compuesto del
título (75 mg, 67%) como un polvo marrón. La cristalización en
DMSO/H_{2}O produjo el compuesto puro (34 mg) como microcristales
marrones, p.f.: 388-90ºC. IR (KBr, cm^{-1}): 3462,
3200, 3050, 1712, 1587, 1537. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}): \delta 7,289 (s, 1H), 10,846 (s,
1H), 12,225 (s, 1H). HRMS: calc. para
C_{8}H_{3}N_{3}O_{4}ClI (M^{+}) m/z: 366,8855, hallado,
está pendiente. Potencia con respecto a DCK: parcialmente
activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adaptó el método de Cheeseman, G.W.H. (J.
Chem. Soc. 1170 (1962)). Se disolvió
5-yodo-7-cloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(74 mg, 0,23 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (1,0 ml) a 25ºC
durante 30 min. y se añadió luego KNO_{3} (116 mg, 1,17 mmol,
Baker) a la disolución. Se agitó la mezcla a 25ºC durante 12 h y a
100ºC durante 4 h. Tras enfriarse la mezcla a temperatura ambiente,
se vertió en agua con hielo (5 g). Apareció un precipitado y se
recogió mediante filtración. Se disolvió en KOH 1 N (10 ml), se
filtró, y se acidificó el filtrado hasta pH=5 con HCl 4 N dando un
precipitado rojo. Éste se secó al aire a 50ºC durante 4 h
produciendo el compuesto del título (27 mg, 28%) como un polvo rojo
oscuro, p.f.: 240-2ºC (con desc., cambio de color a
partir de 180-5ºC). IR (KBr, cm^{-1}): 3431,
3218, 3143, 1712, 1550, 1400, 559. HRMS: calc. para
C_{8}H_{2}N_{4}O_{6}ClI (M^{+}) m/z: 411,8705, hallado:
411,8713. Potencia con respecto a DCK: pendiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adoptó el método de Leeson, P.D. et
al. (J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991)). Se
disolvió
6,7-dicloro-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(92 mg, 0,40 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (2,0 ml) a
temperatura ambiente durante 30 min. y luego se añadió ICl (383 mg,
2,16 mmol, Aldrich) a esta disolución. Se agitó la mezcla a
115-20ºC durante 14 h. Se enfrió hasta temperatura
ambiente y se vertió en agua con hielo (10 g). Apareció un
precipitado y se recogió mediante filtración. Se disolvió el
precipitado en KOH 1 N (10 ml), se filtró, y se acidificó el
filtrado hasta pH=5 con HCl 4 N dando a precipitado rojo. Éste se
recogió mediante filtración y se secó al aire a 50ºC durante 4 h
produciendo el compuesto del título (147 mg, 75%) como un polvo
blanco. La cristalización en DMSO/H_{2}O dio microcristales
blancos (96 mg, 50%), p.f.: 353-4ºC (desc. a partir
de 315ºC). IR (KBr, cm^{-1}): 3428, 3189, 3142, 1741, 1688, 1462,
1396, 579. HRMS: calc. para
C_{8}H_{2}N_{2}O_{2}Cl_{2}I_{2} (M +) m/z: 481,7579,
hallado 481,7575. Potencia con respecto a DCK: pendiente.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Síntesis de
4-yodo-2-nitroanilina:
Se adaptó el procedimiento de Sy, W. W. (Synthetic Communications
22(22): 3215-19 (1992)). A una disolución de
2-nitroanilina (1,38 g, 10,0 mmol, Aldrich, usada
tal como se recibió) en EtOH (100 ml) se le añadió yodo (2,54 g,
10,0 mmol, usado tal como se recibió) y Ag_{2}SO_{4} (3,11 g,
10,0 mmol, usado tal como se recibió). Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante 1 h (monitorizado mediante CCF). Se
retiró el precipitado amarillo que se formó mediante filtración y se
evaporó el filtrado hasta sequedad a presión reducida dando 2,74 g
de producto bruto. Se disolvió la muestra en diclorometano y se
lavó con disolución de hidróxido de sodio al 5% (40 ml), seguido por
agua. Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} y se evaporó hasta
sequedad. Se sometió el residuo a cromatografía sobre gel de sílice
y se eluyó con cloroformo. La CCF preparativa (elución con
cloroformo) dio
4-yodo-2-nitroanilina
pura (1,8 g, 68,0%) como un polvo amarillo. RMN (^{1}H,
CDCl_{3}): \delta 4,832 (s, 2H); 6,658 (d, J=8,7 Hz, 1H); 7,595
(tetra, J_{1}=1,5 Hz, J2=8,7 Hz, 1H); 8,442 (d, J=1,5 Hz, 1H).
B. Síntesis de
6-yodo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona:
Se adaptó el procedimiento de Foged, C. y Journal, P. (J. de Lab.
Compd. y Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)). A
una mezcla agitada de
2-nitro-4-yodoanilina
(1,8 g, 6,9 mmol) en etanol (40 ml) se le añadió
SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (7,8 g, 34,6 mmol) en una porción. Se
sometió la mezcla a reflujo a 80ºC (baño de aceite a 90ºC) con
agitación durante 0,5 h para formar una disolución transparente y
se continuó el reflujo durante otra 1,5 h. Se enfrió la disolución
hasta temperatura ambiente y se añadió agua con hielo (100 g). Se
ajustó el pH hasta pH \sim7 y se extrajo la mezcla con acetato de
etilo. Se secó el extracto sobre MgSO_{4} y se concentró hasta
sequedad dando 1,235 g (78%) de compuesto del título como un sólido
marrón. A una mezcla agitada de este producto (450 mg, 1,92 mmol) en
HCl 4 N (20 ml) se le añadió ácido oxálico (267 mg, 2,115 mmol,
usado tal como se recibió) en una porción. Se sometió la mezcla a
reflujo a 120-5ºC durante 3 h, luego se enfrió hasta
temperatura ambiente durante la noche. Se centrifugó la mezcla y se
lavó el precipitado rojo con agua fría (2x2 ml), se recogió mediante
filtración y se secó a 60ºC a presión reducida durante 2 h,
produciendo 140 mg (25%) de producto bruto como un polvo blanco. Se
disolvió la muestra en NaOH 1 N (10 ml), se filtró y se acidificó el
filtrado hasta pH=6, produciendo 130 mg de producto que se lavó con
EtOH (2 ml). La cristalización en DMSO/H_{2}O dio 19 mg del
compuesto del título puro como microcristales blancos, p.f.:
355-7ºC. IR (KBr, cm^{-1}) 3459, 3148, 1750, 1704,
1392. RMN (^{1}H, DMSO-d_{6}): \delta 6,727
(d, J=8,1 Hz, 1H), 7,053 (q, J1=1,8 Hz, J2=8,4 Hz, 1H), 11,952 (s,
1H), 11,998 (s, 1H). HRMS: calc. para C_{8}H_{5}N_{2}O_{2}I
(M^{+}) m/z 287,9393. Hallado: 287,9390. Potencia con respecto a
DCK: 4,7%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adoptó el método de Leeson, P.D. et
al. (J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991)). Se
disolvió
6,7-dibromo-1,4-dihidro-2,3-quinoxalindiona
(105 mg, 0,33 mmol) en H_{2}SO_{4} concentrado (2,0 ml) a 0ºC
durante 30 min. Luego se añadió ICI (358 mg, 2,19 mmol, Baker). Se
agitó la mezcla a 120ºC durante 14 h y luego se enfrió hasta
temperatura ambiente y se vertió en agua con hielo (5 g). Se
recogió el precipitado mediante filtración y se disolvió en KOH 1 N
(10 ml). Se retiró un precipitado rojo mediante filtración y se
acidificó el filtrado hasta pH=2 con HCl 4 N dando un precipitado
blanco. Éste se recogió mediante filtración y se secó al aire a 50ºC
durante 4 h produciendo el compuesto del título (240 mg, > 100%)
como un polvo blanco. La cristalización en EtOH dio el compuesto
del título puro (140 mg, 75%), p.f.: >350ºC. IR (KBr, cm^{-1}):
3437, 3287, 1718, 1593, 1550. RMN (^{1}H,
DMSO-d_{6}) \delta 12,297 (s, 2H). HRMS: calc.
para C_{8}H_{2}N_{2}O_{2}Br_{2}I_{2} (M^{+}), m/z
569,6569. Hallado: pendiente. Potencia con respecto a DCK:
pendiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la potencia antagonista de glicina
in vitro usando un ensayo de unión a
[^{3}H]-MK801 estimulada con glicina 1 \muM.
Este ensayo se aprovecha del hecho de que la unión de
[^{3}H]-MK801 al receptor de PCP dentro del poro
del canal de NMDA depende de la presencia tanto de glutamato como de
glicina. En ausencia de glicina pero en presencia de glutamato,
[^{3}H]-M801 no puede unirse de manera eficaz al
receptor de PCP, porque el canal de NMDA permanece cerrado y el
acceso de [^{3}H]-MK801 al receptor de PCP dentro
del poro de canal cerrado está fuertemente restringido.
Se realizó el ensayo usando homogeneizados de
membrana de cerebro de rata que están enriquecidos en receptores de
NMDA. Se prepararon las membranas tal como sigue. Se homogeneizaron
cerebros de rata congelados (obtenidos de
Pel-Freez, Rogers, Arkansas) en 15 volúmenes (p/v)
de sacarosa 0,32 M helada. Se centrifugó el homogeneizado a 1.000 x
g durante diez minutos. Se recogió el sobrenadante y se centrifugó
durante 20 minutos a 44.000 x g. Se suspendió el sedimento en 15
volúmenes de agua (con respecto al peso original del cerebro). Se
centrifugó de nuevo el homogeneizado a 44.000 x g durante veinte
minutos. Se resuspendió el sedimento en 5 volúmenes de agua y se
congeló-descongeló la suspensión 2 veces. Tras el ciclo de
descongelación final, se llevó la suspensión hasta 15 volúmenes con
agua y se centrifugó a 44.000 x g durante veinte minutos. Se
resuspendió el sedimento en 5 volúmenes de HEPES 10 mM helado, se
titró hasta pH 7,4 con KOH que contenía Triton X-100
al 0,04%. Se incubaron membranas con el tampón Triton/HEPES a 37ºC
durante 15 minutos. Entonces se llevó el volumen hasta 15 con HEPES
10 mM helado, pH 7,4, y se centrifugó/lavó tres veces con
centrifugaciones de 44.000 x g entre los lavados. Se suspendió el
sedimento final en tres volúmenes de HEPES 50 mM, pH 7,4 y se
determinó la concentración de proteína con un ensayo de proteína de
unión a colorante convencional (Bio-Rad, Richmond,
CA). Se almacenó la suspensión a -80ºC hasta que se usó. Sólo se usó
agua de calidad para HPLC para todos los tampones y
suspensiones/lavados. Los lavados extensos fueros necesarios para
eliminar tanta glicina endógena de la preparación de membrana como
fuera posible.
El día del ensayo, se descongelaron las
membranas preparadas previamente y se añadió tampón Tris/HCl 5 mM,
pH 7,4, para dar una concentración de proteína final de 0,156 mg/ml.
Para los ensayos de unión, se pipetearon 0,8 ml de membranas en
tubos de polipropileno seguido de 0,033 ml de ácido
5,7-dicloroquinurénico (DCK) 15,1 \muM, 0,033 ml
de glicina 30,3 \muM en tampón (o tampón solo), 0,033 ml de
glutamato 303 \muM en tampón (o para los controles, 0,1 ml de PCP
1 mM en lugar de DCK/gly/glu), 0,033 ml de antagonista de glicina en
tampón (o tampón solo) y 0,1 ml de tampón que contiene 200.000 cpm
de [^{3}H]-MK801. Se definió la unión no
específica como la diferencia en la unión que se producía en
ausencia o presencia de PCP (concentración final: 100 \muM). Para
determinar el efecto de glicina 1 \muM sobre la unión de
[^{3}H]-MK801, se sustrajo la radiactividad unida
en presencia de glutamato 10 \muM solo (concentración final) de la
radiactividad unida en presencia tanto de glutamato 10 \muM como
glicina 1 \muM (concentración final). Se añadió una concentración
(final) de 500 nM de ácido 5,7-dicloroquinurénico
(DCK) a todos los tubos de ensayo. Esta concentración del
antagonista de glicina DCK "tamponó" la mayor parte de la
glicina endógena residual que no se había eliminado mediante las
etapas de lavado extenso que se habían llevado a cabo durante el
procedimiento de preparación de membrana. El DCK 500 nM no
interfirió con la estimulación de la unión a
[^{3}H]-MK801 que se efectuó mediante la adición
de glicina exógena 1 \muM.
Se incubaron los ensayos durante 120 minutos a
temperatura ambiente, tiempo tras el cual se aisló la radiactividad
unida a membrana de la radiactividad libre mediante filtración a
vacío a través de filtros de fibra de vidrio Whatman que se habían
pretratado con polietilenimina al 0,3%. Se llevó a cabo la
filtración usando un colector de células de 48 pocillos Brandel. Se
lavaron las membranas filtradas tres veces con 3 ml cada una de
tampón helado. Se transfirieron los filtros a viales de centelleo y
se añadieron 5 ml del cóctel de centelleo. Se agitaron los viales
durante la noche y se contó la radiactividad mediante espectroscopía
de centelleo líquido. Se realizaron los ensayos por triplicado y se
realizaron todos los experimentos al menos tres veces.
Se construyeron curvas de respuesta a dosis de
inhibición usando concentraciones crecientes de antagonistas de
glicina de desde 5 nM hasta 330 \muM. Se determinaron los valores
de CI_{50} para compuestos activos en la inhibición de la unión a
[^{3}H]-MK801 estimulada con glicina 1 \muM
mediante representación gráfica asistida por ordenador de las
curvas de inhibición y la interpolación. Cuando se encontró que los
compuestos inhibían la unión a [^{3}H]-MK801
estimulada con glicina, se llevaron a cabo experimentos para
determinar si la inhibición de la unión a
[^{3}H]-MK801 estimulada con glicina estaba
realmente mediada en el sitio de unión a glicina del receptor de
NMDA. En estos experimentos, una concentración fija de antagonista
suficiente para producir una inhibición >95% de la unión a
[^{3}H]-MK801 estimulada con glicina 1 \muM se
incubó con las membranas sin nada de glicina adicional (por encima
de 1 \muM) y en presencia de concentraciones crecientes de
glicina adicional (de 2 \muM a 1 \muM). Si la inhibición de la
unión a [^{3}H]-MK801 mediante el fármaco en
presencia de glicina 1 mM se revirtió completamente añadiendo
concentraciones crecientes de glicina, entonces la inhibición de
unión a [^{3}H]-MK801 estaba mediada por el
fármaco que actúa como antagonista en el sitio de unión a glicina
del receptor de NMDA.
Tras construir curvas de respuesta a dosis de
inhibición y la determinación de la reversibilidad de glicina, se
calcularon los valores de K_{i} para los antagonistas de glicina
usando la ecuación de Cheng y Prusoff que emplea los valores de
CI_{50} determinados experimentalmente, la concentración conocida
de glicina en el ensayo (1 \muM) y la afinidad conocida de la
glicina para el sitio de unión a glicina del receptor de NMDA (100
nM).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los mismos homogeneizados de membrana
de cerebro de rata para el ensayo de unión a
[^{3}H]-MK801 estimulada con glicina 1 \muM
para este ensayo. El día del ensayo se descongelaron las membranas
congeladas (preparadas tal como se describió anteriormente) y se
diluyeron con tampón Tris/HCl 30 mM que contenía CaCl_{2} 2,5 mM
y KSCN 100 mM, pH 7,4, para dar una concentración de membrana final
de 1,25 mg/ml de proteína de membrana. Para el ensayo de unión, se
añadieron 0,8 ml de homogeneizado de membrana a los tubos de
polipropileno seguido de 0,033 ml de fármaco y 0,067 ml de tampón
(o para los controles de 0,1 ml de tampón solo) y 0,1 ml de tampón
que contenía 200.000 cpm de [^{3}H]-AMPA. Se
incubó en ensayo durante 30 minutos en hielo. Se separó la
radiactividad unida de la radiactividad libre mediante filtración a
través de filtros de fibra de vidrio Whatman (pretratados con
polietilenimina al 0,3%) usando un colector de células de 48
pocillos Brandel.
Se lavaron las membranas filtradas tres veces
con 3 ml cada una de tampón helado. Se transfirieron los filtros a
viales de centelleo y se añadieron 5 ml de cóctel de centelleo. Se
agitaron los viales durante la noche y se contó la radiactividad
mediante espectroscopía de centelleo líquido. Se determinó la unión
no específica mediante la radiactividad que permaneció unida a las
membranas en presencia de glutamato 10 mM. Se construyeron curvas
de respuesta a dosis de inhibición añadiendo concentraciones
crecientes de fármaco desde 10 nM hasta 100 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó la misma preparación de membrana que la
usada para el ensayo de unión a [^{3}H]-AMPA. El
día del ensayo se descongelaron las membranas de cerebro de rata
congeladas y se añadió tampón Tris/HCl 5 mM, pH 7,4, para dar una
concentración final de 0,5 mg/ml de proteína de membrana. Para el
ensayo de unión, se añadieron 0,8 ml de homogeneizado de membrana a
tubos de polipropileno seguido de 0,033 ml de fármaco y 0,067 ml de
tampón (o para los controles de 0,1 ml de tampón solo) y 0,1 ml de
tampón que contenía 200.000 cpm de
[^{3}H]-cainato. Se incubó el ensayo durante 2
horas en hielo. Se separó la radiactividad unida de la radiactividad
libre mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio
Whatman (pretratados con polietilenimina al 0,3%) usando un
colector de células de 48 pocillos Brandel. Se lavaron las membranas
filtradas tres veces con 3 ml cada una de tampón helado. Se
transfirieron los filtros a viales de centelleo y se añadieron 5 ml
de cóctel de centelleo. Se agitaron los viales durante la noche y
se contó la radiactividad mediante espectroscopía de centelleo
líquido. Se determinó la unión no específica mediante la
radiactividad que permaneció unida a las membranas en presencia de
glutamato 10 mM. Se construyeron curvas de respuesta a dosis de
inhibición añadiendo concentraciones crecientes de fármaco de desde
250 nM hasta 330 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un modelo de excitotoxicidad modificado
según el desarrollado por Choi (Choi, D.W., J. Neuroscience 7:357
(1987)) para someter a prueba la eficacia de antiexcitotóxica de los
antagonistas de glicina novedosos. Se extrajeron los fetos
embrionarios de rata de 19 días de ratas embarazadas el mismo
tiempo. Se extrajeron los cerebros de los fetos y se disecó la
corteza cerebral. Se disociaron las células de la corteza disecada
mediante una combinación de agitación mecánica y digestión
enzimática según el método de Landon y Robbins (Methods in
Enzymology 124:412 (1986)). Se hicieron pasar las células disociadas
a través de un tamiz Nitex de 80 micras y se valoró la viabilidad
de las células mediante azul trípano. Se cultivaron en placa las
células en placas recubiertas con
poli-D-lisina y se incubaron a 37ºC
en una atmósfera que contenía el 91% de O_{2}/el 9% de CO_{2}.
Seis días después, se añadió
fluoro-d-uracilo durante dos días
para suprimir el crecimiento celular no neural. En el día 12 de
cultivo, se expusieron los cultivos neuronales primarios a glutamato
100 \muM durante 5 minutos con o sin dosis crecientes de
antagonista de glicina u otros fármacos. Tras 5 minutos se lavaron
los cultivos y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Se cuantificó
el daño en las células neuronales midiendo la actividad de la
lactato deshidrogenasa (LDH) que se había liberado en el medio de
cultivo. Se midió la actividad de la LDH según el método de Decker
et al. (Decker et al., J. Immunol. Methods 15:16
(1988)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron ratones DBA-2 de
Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Estos ratones a una edad de
<27 días desarrollan una convulsión tónica en el plazo de
5-10 segundos y mueren cuando se exponen a un sonido
de 14 kHz (onda sinusoidal) a 110 dB (Lonsdale, D., Dev. Pharmacol.
Ther. 4:28 (1982)). Se definió la protección frente a las
convulsiones cuando los animales inyectados con el fármaco 30
minutos antes de la exposición al sonido no desarrollaban una
convulsión y no morían durante una exposición de 1 minuto al sonido.
Se usaron ratones DBA-2 de 21 días de edad para
todos los experimentos. Siempre se administraron los compuestos por
vía intraperitoneal en cualquiera de solución salina, DMSO o
polietilenglicol-400. Siempre se incluyeron
controles de disolvente apropiados en cada experimento. Se
construyeron curvas de respuesta a dosis administrando dosis
crecientes de fármaco de desde 1 mg/kg hasta 100 mg/kg. Cada grupo
de dosis (o control de disolvente) consistía en al menos seis
animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones Swiss/Webster, cuando se les inyecta
PTZ 50 mg/kg (i.p.) desarrollan una convulsión clónica mínima de
aproximadamente 5 segundos de duración en el plazo de
5-15 minutos tras la inyección de fármaco. Se
definió la eficacia anticonvulsiva de un fármaco de antagonista de
glicina (u otro) como la ausencia de una convulsión cuando se
administraba un fármaco 30 minutos antes de la aplicación de PTZ y
no se desarrollaba una convulsión durante hasta 45 minutos tras la
administración de PTZ. Siempre se administraron el antagonista de
glicina u otros fármacos por vía intraperitoneal en cualquiera de
solución salina, DMSO o polietilenglicol-400.
Siempre se incluyeron controles de disolvente apropiados en cada
experimento. Se construyeron curvas de respuesta a dosis
administrando dosis crecientes de fármaco de desde 1 mg/kg hasta 100
mg/kg. Cada grupo de dosis (o control de disolvente) consistía en al
menos seis animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se inyectan los ratones con
N-metil-D-aspartato
(NMDA) 200 mg/kg i.p., los animales desarrollarán convulsiones
seguido de muerte en el plazo de 5-10 minutos. Se
sometieron a prueba antagonistas de glicina para determinar su
capacidad para evitar la muerte inducida por NMDA administrando los
fármacos i.p. 30 minutos antes de la aplicación de NMDA. Siempre se
administraron el antagonista de glicina u otros fármacos por vía
intraperitoneal en cualquiera de solución salina, DMSO o
polietilenglicol-400. Siempre se incluyeron
controles de disolvente apropiados en cada experimento. Se
construyeron curvas de respuesta a dosis administrando dosis
crecientes de fármaco de desde 1 mg/kg hasta 100 mg/kg. Cada grupo
de dosis (o control de disolvente) consistía en al menos seis
animales.
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Se evaluó el grado de descoordinación motriz
mediante el uso de una noria Rotorod para ratón convencional (Hugo
Basile, Varese, Italia). Se aclimatan los ratones a la noria
colocándolos sobre la misma antes del verdadero experimento. Se
define la coordinación motriz normal como la capacidad de cada ratón
de permanecer en la Rotorod de manera consecutiva durante un tiempo
definido arbitrariamente (1 min.). Esto sirve como la base para
evaluar el efecto de cada fármaco sobre la descoordinación motriz.
Véase, Dar, M.S., J. Pharm. Pharmacol. 40:482-487
(1988); Dar, M.S. et al., Life Sci.
33:1363-1374 (1983); y Dar y Wooles, Life Sci
39:1429-1437 (1986). Se inyectaron los ratones con
cualquier vehículo (DMSO),
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
o
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
disuelta en DMSO a dosis de 1-300 mg/kg (i.p.; 6
animales por dosis de fármaco o control de vehículo). Treinta
minutos tras la inyección, se colocaron los ratones en la noria
Rotorod. Se hizo funcionar la noria a una velocidad de 6 rpm. Se
consideró que los animales que pudieron permanecer en la noria
durante 60 segundos no tenían una descoordinación motriz
significativa. Se designó la dosis tóxica _{50} (DT_{50}) como
la dosis de fármaco a la que el 50% de los animales cayeron de la
noria Rotorod en el plazo de menos de 60 segundos.
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La tabla II muestra los resultados de los
ensayos de unión al sitio de unión a glicina, los receptores de AMPA
y cainato con
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(nº 1) y el compuesto de referencia
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(nº 2).
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\vskip1.000000\baselineskip
La tabla III muestra los resultados de los
modelos animales anticonvulsivos in vivo que emplean los
compuestos nº 1, nº 2 y nº 13. (convulsiones audiogénicas en ratones
DBA-2; convulsiones inducidas por pentilentetrazol
en ratones Swiss/Webster; y convulsiones/muerte inducidos por NMDA
en ratones Swiss/Webster).
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\newpage
La tabla IV muestra los datos de unión, los
resultados del modelo animal anticonvulsivo in vivo y los
resultados de la prueba de eficacia neuroprotectora (in
vitro) para otras
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La tabla V muestra los resultados de un ensayo
in vitro que emplea un modelo de excitotoxicidad que implica
cultivos de células cerebrales que muestra que los compuestos nº 1 y
nº 2 evitan la muerte de células nerviosas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla VI muestra los resultados de las
pruebas in vivo de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
6,7-disustituidas (todos los compuestos de
referencia) en el modelo de convulsiones audiogénicas de
DBA-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La tabla VII muestra los resultados de ciertas
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-dionas
N-sustituidas 6,7-disustituidas
(todos los compuestos de referencia) en el ensayo de unión
[^{3}H]-MK801 estimulada con glicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una serie de diferentes
evaluaciones en dosis de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
para determinar la actividad biológica de este compuesto tanto en
jerbos normales como en animales expuestos a 5 minutos de oclusión
de la carótida bilateral. Véase el esquema VII.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Estos estudios se llevaron a cabo en animales
que estaban conscientes y a los que no se les había administrado
ninguno otro agente farmacológico. Se instrumentaron previamente los
jerbos 48 horas antes de la isquemia para permitir la eliminación
completa del anestésico pentobarbital que se emplea. Cuando se
sometieron a prueba con fármacos, se les administraron a los
animales inyecciones i.p. de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
o vehículo. En el caso de inyecciones múltiples, se les
administraron a los animales inyecciones i.p. con 2 horas de
diferencia y se administró la inyección final 30 minutos antes del
periodo isquémico o en el caso de un tratamiento posterior, se les
administraron a los animales inyecciones a 30 minutos, 2 horas, 4
horas y 6 horas tras la reperfusión isquémica.
Con el fin de valorar la actividad farmacológica
directa o la actividad potencial de este compuesto, se les inyectó
a jerbos novatos o bien solución salina o bien diferentes dosis de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se valoraron los cambios de comportamiento usando una cámara de
actividad locomotriz de haz luminoso que es un área con un diámetro
circular de dos pies con detección con haz luminoso. Los animales se
colocan individualmente en las cámaras con un diámetro de 2 pies.
Las cámaras están alojadas en un armario que está cerrado y se
reduce el ruido usando tanto un generador de ruido blanco de fondo
como un ventilador. Los animales se colocan es estas cámaras en el
caso de la evaluación farmacológica inicial durante un periodo de 6
horas y se acumula la actividad total durante cada hora sucesiva
usando los sistemas de control por ordenador.
La solución salina dio como resultado una tasa
elevada inicial de actividad tal como se demuestra en la figura 1,
mostrando los animales control un nivel de actividad en la primera
hora de aproximadamente 1600 cuentas. Este nivel de actividad
control es típico para el jerbo en estas condiciones experimentales.
A medida que avanzó la sesión, los animales redujeron su actividad
exploradora y en el periodo terminal la actividad se redujo hasta
aproximadamente 250 cuentas por hora.
En todo el intervalo de dosis sometidas a prueba
(1,0-32 mg/kg) la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no produjo ningún cambio consecuente en la actividad locomotriz
espontánea. El comportamiento control se caracterizaba por un alta
tasa de actividad locomotriz en la primera hora de la sesión y una
tasa de actividad marcadamente reducida en la última hora de la
sesión de 6 horas. La observación de los jerbos, además de las
pruebas de actividad locomotriz, indicó que las dosis tan altas
como 32 mg/kg no alteraban el comportamiento normal. La
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a 1,0 mg, 3,2 mg/kg, 10 mg/kg y 32 mg/kg (figuras
2-5) no tenía un efecto significativo ni sobre la
tasa exploradora inicial ni la tasa terminal de exploración. Hubo
algunas diferencias menores que indicaban que si la dosis se
aumentaba adicionalmente, podía haber de hecho algunos efectos
depresivos en el comportamiento. A la dosis de 32 mg/kg la actividad
exploradora inicial era de aproximadamente 850 a 900 cuentas en
comparación con 1200 cuentas en el grupo control de solución salina
(figura 5). A medida que avanzaba el tiempo, la actividad se redujo
de una manera similar al control de solución salina y finalmente se
redujo hasta un nivel significativamente bajo (en comparación con la
primera hora), que era similar en toda una variedad de diferentes
dosis. Por tanto, la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no parece tener ni efecto depresivo ni estimulante (similar a PCP)
sobre el comportamiento significativo tal como se observa con los
antagonistas del receptor de NMDA MK801 (véase la patente
estadounidense número 4.888.347) y CGS-19755
(cis-4-fosfono-metil-2-piperidin-carboxilato).
Todos los animales parecen tolerar las inyecciones hasta 32 mg/kg
bastante bien y no mostraban ninguna evidencia de toxicidad grave.
Todos los animales sobrevivieron durante un periodo de 7 días tras
estas dosis.
En la siguiente fase de la evaluación de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
se pretrataron los jerbos con dosis variables del compuesto y
entonces se expusieron a un periodo de oclusión de la carótida
bilateral de cinco minutos. Tras el inicio de la reperfusión, se
colocaron los animales en el aparato de pruebas de la actividad
locomotriz circular y se monitorizó la actividad al comienzo de la
primera hora tras la reperfusión durante las cuatro horas
posteriores.
Los animales control no expuestos a isquemia y a
los que se les administraron inyecciones de solución salina antes
de colocarlos en la cámara de actividad locomotriz mostraron un
patrón característico de actividad que en la primera hora de
actividad locomotriz era sustancialmente mayor que durante todas las
demás horas y se reducía progresivamente a lo largo de las cuatro
horas hasta un valor muy bajo. La figura 6 (símbolos en blanco)
muestra este patrón control de actividad que es típico de la mayoría
de roedores cuando se colocan en un entorno de pruebas de actividad
locomotriz novedoso. A diferencia de la reducción progresiva en la
actividad a lo largo del periodo de pruebas de cuatro horas, los
animales control que se expusieron a cinco minutos de isquemia
cortical mostraron un patrón completamente diferente de actividad
locomotriz. Durante la primera hora hubo una reducción
significativa en la actividad que fue seguida de un aumento
progresivo en el que la actividad durante la cuarta hora era diez
veces mayor que la mostrada por animales no expuestos a oclusión de
la carótida (figura 6, símbolos en negro). Estos resultados son
típicos y son un resultado fiable de las alteraciones provocadas por
cinco minutos de oclusión de la carótida bilateral en el jerbo.
Se pretrataron grupos separados de jerbos con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
30 minutos antes del inicio de la oclusión de la carótida y
entonces se pusieron en actividad locomotriz tras una hora de
reperfusión. La
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
evitó tanto la disminución como el aumento postisquémicos en la
actividad (figuras 7-10, símbolos en negro). Las
disminuciones postisquémicas en la actividad eran próximas a cero
durante la primera hora tras la reperfusión. El pretratamiento con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
redujo de manera fiable o evitó esta depresión temprana en el
comportamiento. Además, la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
evitó la estimulación postisquémica del comportamiento. Todas las
dosis evitaron la estimulación de la actividad que se produce de
manera fiable durante la 3ª y 4ª horas tras la reperfusión (véanse
las figuras 7-10). Estos cambios en el patrón
postisquémico de comportamiento durante la primera y cuarta horas de
evaluación del periodo postisquémico se presentan en las figuras 11
y 12. En particular, la figura 12 muestra claramente la dramática
reducción en la hiperactividad postisquémica durante la cuarta hora
de valoración mediante dosis de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a partir de 0,32-32 mg/kg.
Para fines de comparación se evaluaron también
los efectos de una serie de pretratamientos i.p. con el antagonista
de glicina no de estricnina
3-amino-1-hidroxipirrolid-2-ona
(HA966). Cuando se administraron dosis de HA966 1 hora antes del
inicio de la isquemia hubo una separación clara entre las dosis
inactivas y activas. 1 mg/kg de HA966 pareció o bien no tener
ningún efecto o bien exacerbar los cambios de comportamiento que se
producían tras la reperfusión cuando se sometieron a prueba los
animales para determinar la actividad locomotriz 24 horas tras la
reperfusión. De manera similar, cuando se sometieron a prueba 3,2
mg/kg de HA966, hubo un cambio incluso mayor en la actividad
locomotriz en el que los animales control mostraron un nivel de
actividad total de aproximadamente 3361 cuentas/h. Cuando se
aumentó la dosis ligeramente se observó una protección significativa
frente a los cambios de comportamiento inducidos por la oclusión de
la carótida bilateral. Tanto 5,6 mg/kg como 10 mg/kg de HA966
parecían ser eficaces a la hora de evitar los aumentos
postisquémicos en la actividad a 24 horas. Por tanto, parece que
tanto la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como HA966 son eficaces a la hora de reducir este cambio de
comportamiento particular que es característico de la respuesta
isquémica cerebral en el jerbo.
Después de completarse las evaluaciones de
pretratamiento de dosis única se evaluaron los jerbos con múltiples
inyecciones de 32 mg/kg de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se administraron las dosis i.p. a 6 horas, 4 horas, 2 horas y 30
minutos antes del inicio de los 5 minutos de isquemia. En la
modalidad de postratamiento se administraron dosis de 32 y 100
mg/kg 30 minutos, 2 horas, 4 horas y 6 horas tras el inicio de la
reperfusión.
A diferencia de los compuestos de referencia
6-trifluorometil-7-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5,7-dinitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(MNQX), se observó un efecto significativo de postratamiento de
dosis única con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
El tratamiento postisquémico con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
evitó dependiendo de la dosis un aumento en la actividad locomotriz
(figura 13). Además, el postratamiento múltiple dio como resultado
una reducción significativa en la hiperactividad tras la reperfusión
(figura 14). Este nivel de actividad era significativamente
diferente del postratamiento de dosis única con la misma dosis.
A 24 horas se evaluaron todos los animales para
determinar diferencias en el comportamiento de patrulla usando un
laberinto de 8 brazos radiales. En este procedimiento, se colocaron
los animales en la cámara de inicio central del laberinto, se
retiró la barrera y se registraron la cantidad de tiempo y el número
de veces que el animal comete un error antes de completar la
exploración en los 8 brazos del laberinto. Se definió un error como
volver a visitar un brazo entrando el animal en la medida de todo el
cuerpo sin incluir la cola. Si el animal perseveró o no abandonó el
brazo en más de cinco minutos, se terminó la sesión. En los casos de
todas estas evaluaciones los animales nunca superaron el punto de
corte de cinco minutos y se exploraron los 8 brazos
satisfactoriamente con diferentes grados de errores. En la población
control de los animales, el número de errores y la exploración del
laberinto sin experiencia previa (novatos) fue de aproximadamente 6
errores. Éste es un valor promedio para un N de 28 jerbos. Tras 5
minutos de oclusión de la carótida bilateral y pruebas a 24 horas,
los jerbos cometieron un número de errores promedio de 21. Cuando se
pretrataron los animales con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
hubo una reducción significativa en el número de errores cometidos.
(X=14) Estos datos se presentan en la figura 15 e indican que no
sólo hay un cambio en la actividad locomotriz a 24 horas producido
por la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
cuando se administra como un pretratamiento antes de 5 minutos de
isquemia, sino que también parece haber un ahorro significativo de
los cambios de comportamiento que se inducen en el resultado en el
laberinto de brazos radiales.
El tratamiento posterior con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidro-quinoxalin-2,3-diona
32 mg/kg redujo también el empeoramiento en la memoria a corto
plazo 24 horas tras la isquemia/reperfusión. Éste es un hallazgo
único entre los compuestos que se han sometido a prueba en este
modelo. Además, la falta de un efecto de comportamiento manifiesto
podría sugerir que se garantizan pruebas más agresivas en éstos y
otros modelos in vivo. La falta de una respuesta tóxica
manifiesta, con dosis altas de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sugiere que puede tener un margen de seguridad que lo convertiría en
un buen candidato terapéutico.
Se evaluaron los efectos de 5 minutos de
oclusión de la carótida bilateral sobre la muerte de células
neuronales en el hipocampo dorsal en animales 7 días tras lesión
por isquemia y reperfusión. Estudios previos han demostrado que la
degeneración neuronal empieza a producirse aproximadamente 3 días
tras la isquemia cerebral. A los 7 días aquellas neuronas que se
han visto afectadas y experimentarán citolisis y o bien tendrán una
degeneración completa o bien serán fácilmente visibles como núcleos
oscuros y núcleos desplazados con citoplasma eosinófilo con núcleos
picnóticos. La lesión con 5 minutos de isquemia está restringida
esencialmente dentro del hipocampo a la región CA1 del hipocampo
dorsal. La zona lateral intermedia del asta no se ve afectada y el
giro dentado y/o en CA3 no muestra patología. Se anestesiaron los
jerbos el día 7 tras la isquemia con 60 mg/kg de pentobarbital. Se
prefundieron transcardialmente los cerebros con solución salina
helada seguido de paraformaldehído tamponado (al 10%). Se
extrajeron los cerebros, se incrustaron y se realizaron cortes. Los
cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina y se
determinaron recuentos de células neuronales en cuanto al número de
núcleos neuronales/100 micrómetros. La figura 16 indica que los
animales control normales (no expuestos a lesión por isquemia y
reperfusión) no mostraron ningún cambio significativo en los
núcleos de densidad normal dentro de esta región. La exposición a
cinco minutos de oclusión de la carótida bilateral dio como
resultado una reducción significativa en el número de núcleos
presentes en la región CA1. En general, esta lesión da como
resultado una necrosis irregular en lugar de una necrosis
confluente que se observa si se emplean 10 minutos de isquemia. El
pretratamiento con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a dosis de 0,32-32 mg/kg produce una protección
significativa de la degeneración neuronal del hipocampo (figura 16).
El postratamiento con 3,2 mg/kg redujo significativamente el grado
de pérdida celular en la CA-1 tras la lesión por
isquemia y reperfusión (figura 17).
- 1.
- El compuesto de referencia 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona no mostró efectos secundarios de comportamiento significativos en controles normales.
- 2.
- El pretratamiento con dosis de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona de 0,32 a 32 mg/kg produjo una protección relacionada con la dosis frente a los efectos de comportamiento de 5 min. de isquemia cerebral.
- 3.
- Una dosis de 3,2 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona aplicada tras la isquemia evitó un daño postisquémico en las células CA-1 del hipocampo. Cuatro dosis de 0,32-32 mg/kg aplicadas antes de la isquemia evitaron un daño postisquémico en las células del hipocampo en la región CA-1.
- 4.
- La protección de comportamiento era más sensible que la protección frente al daño celular del hipocampo.
- 5.
- El postratamiento con 32 mg/kg de 5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona redujo los efectos de comportamiento, y redujo o evitó las consecuencias histopatológicas de una oclusión de la arteria carótida bilateral de 5 min.
De los tres compuestos de referencia sometidos a
prueba (6-Nitro, 7CF_{3}-QX;
5,7-dinitro-QX,
5-Cl-7-CF_{3}-QX),
la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es con diferencia el mejor compuesto para la protección frente a
isquemia en el jerbo. Este compuesto carecía de efectos directos
significativos sobre el comportamiento. Sin embargo, era un
protector potente cuando se administraba antes de la isquemia.
Además, las dosis de postratamiento y de pretratamiento múltiple
proporcionaron una protección significativa. La protección del
comportamiento se extendía tanto a la actividad locomotriz como al
resultado en el laberinto de brazos radiales. De acuerdo con esta
protección del comportamiento robusta, la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
también protegía frente al daño neuronal.
Se sabe que los receptores de NMDA están
implicados de manera crítica en el desarrollo del dolor persistente
tras daño tisular y de los nervios. Se ha mostrado que el daño
tisular tal como el provocado inyectando una cantidad pequeña de
formalina por vía subcutánea en la pata trasera de un animal de
prueba produce un aumento inmediato de glutamato y aspartato en la
médula espinal (Skilling, S.R., et al., J. Neurosci.
10:1309-1318 (1990)). La administración de
bloqueantes de receptores de NMDA reduce la respuesta de las
neuronas del asta posterior de la médula espinal tras la inyección
de formalina (Dickenson y Aydar, Neuroscience Lett. 121:
263-266 (1991); Haley, J.E., et al., Brain
Res. 518:218-226 (1990)). Estas neuronas del asta
posterior son críticas a la hora de transportar la señal de dolor
desde la médula espinal hasta el cerebro y una respuesta reducida
de estas neuronas es indicativa de una reducción en el dolor
percibido por el animal de prueba al que se le ha infligido dolor
mediante inyección de formalina subcutánea.
Debido a la observación que los antagonistas de
receptores de NMDA pueden bloquear la respuesta de las neuronas del
asta posterior inducida mediante inyección de formalina subcutánea,
los antagonistas de receptores de NMDA tienen potencial para el
tratamiento de dolor crónico tal como el dolor que se provoca
mediante cirugía o mediante amputación (dolor en miembro fantasma)
o mediante ocasionamiento de otras heridas (dolor en heridas). Sin
embargo, el uso de antagonistas de NMDA convencionales tales como
MK801 o CGS 19755, a la hora de evitar o tratar el dolor crónico,
está limitado gravemente por los efectos secundarios de
comportamiento similares a PCP adversos que se provocan por estos
fármacos. Se ha encontrado que los antagonistas a base de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
del sitio de unión a glicina del receptor de NMDA que son el sujeto
de esta invención son altamente eficaces a la hora de evitar el
dolor crónico en ratones inducido inyectando formalina por vía
subcutánea en la pata trasera de los animales. Ya que los
antagonistas de glicina a base de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
de esta invención están libres de efectos secundarios similares a
PCP, estos fármacos son altamente útiles a la hora de evitar o
tratar el dolor crónico sin provocar efectos secundarios de
comportamiento adversos similares a PCP.
Se alojaron cinco ratones macho Swiss/Webster
que pesaban 25-35 gramos en una jaula con acceso
libre a alimento y agua y se mantuvieron en un ciclo de luz de 12
horas (aparición de luz a las 08,00 h). Se disolvieron
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(1-40 mg/ml),
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(5-40 mg/ml) o
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(1-40 mg/ml) en DMSO. Se usó DMSO como control de
vehículo. Se inyectaron todos los fármacos por vía intraperitoneal
(1 \mul/g). Se realizó la prueba de formalina tal como se
describió (Dubuisson y Dennis, Pain 4:H161-174
(1977)). Se observaron los ratones en un cilindro de plexiglás, de
25 cm de diámetro y 30 cm de alto. Se inyectó la superficie plantar
de una pata trasera por vía subcutánea con 20 \mul de formalina al
5%. El grado de dolor se determinó midiendo la cantidad de tiempo
que el animal pasaba lamiendo la pata inyectada con formalina
durante los siguientes intervalos de tiempo: 0-5'
(fase temprana); 5'-10', 10'-15' y
15'-50' (fase tardía). Para someter a prueba si los
dos antagonistas de glicina evitaban el dolor crónico en los
animales de prueba, se inyectaron un vehículo (DMSO) o fármacos
disueltos en vehículo a dosis de 1 mg/kg a 40 mg/kg por vía
intraperitoneal 30 minutos antes de la inyección de formalina.
Durante cada dosis de control de vehículo o fármaco se usaron al
menos seis animales.
La figura 18 muestra que, en comparación con el
control de vehículo, la inyección intraperitoneal de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
30 minutos antes de la inyección de formalina en la pata trasera
inhibía significativamente el dolor crónico inducido por formalina
de una manera dependiente de la dosis tal como se determinó mediante
la reducción del tiempo que el ratón pasó lamiendo la pata trasera
inyectada con formalina provocado por el aumento de dosis del
antagonista de glicina. La
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhibía el lamido inducido por formalina a todas las dosis
(1-40 mg/kg) tanto en la fase temprana como en la
tardía.
La figura 19 muestra que, en comparación con el
control de vehículo, la inyección intraperitoneal de
6,7-di-cloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
también inhibía el dolor inducido por formalina tal como se evalúa
mediante la inhibición del tiempo que el animal pasaba lamiendo la
pata trasera inyectada con formalina. La
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhibía el lamido inducido por formalina a dosis de
5-40 mg/kg en las fases tardías mientras que se
inhibió la fase temprana mediante dosis de 10-40
mg/kg. La
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
mostró una DE_{50} de 5 mg/kg a la hora de evitar el dolor
inducido por formalina en el ratón.
Tal como se muestran en las figuras 20A y 20B,
la
6,7-dibromo-5-nitro-dihidroquinoxalin-2,3-diona
inhibía el lamido inducido por formalina de manera dependiente de
la dosis tanto en la fase temprana (0-5 minutos;
figura 20A) de la respuesta al dolor (lamido) como en la fase tardía
(15-50 minutos; figura 20B) de la respuesta de
lamido por dolor indicando una eficacia antinociceptiva potente en
este modelo animal de dolor crónico.
Estos resultados demuestran que las
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-diona
y
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
son eficaces a la hora de tratar el dolor crónico inducido mediante
inyección de formalina subcutánea. Puesto que ambos compuestos son
antagonistas en el sitio de glicina del receptor de NMDA, los
resultados sugieren que el bloqueo del sitio de glicina del receptor
de NMDA por antagonistas de glicina representa un método novedoso
de tratamiento del dolor crónico en un mamífero. Puesto que los
antagonistas de glicina de la presente invención no tienen efectos
secundarios (similares a PCP) de comportamiento adversos comunes a
otros bloqueantes de receptores de NMDA, esta invención proporciona
medicamentos novedosos y mejorados enormemente para tratar el dolor
crónico en mamíferos incluyendo (y preferiblemente) seres
humanos.
La
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(compuesto de referencia) es insoluble en agua pero se disuelve en
presencia de 4 equivalentes de KOH (o 5 equivalentes de NaOH). El pH
de la disolución es de 12,7. Esta sal permanece soluble si el pH se
disminuye hasta 11,9 mediante la adición de 1 equivalente de ácido
acético. La adición adicional de 1 equivalente de ácido acético
provoca que se forme un precipitado. A pH 11, la precipitación está
esencialmente completa.
Observaciones espectroscópicas (300 MHz
^{1}RMN, FTIR) y determinaciones de punto de fusión sugieren que
el precipitado por pH es la sal de mono-K o
mono-Na^{+} de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
lo que sugiere que las monosales son bastante insolubles en
agua.
De manera inesperada, se descubrió que la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
puede disolverse fácilmente en 1 ó 2 equivalentes de hidróxido de
colina. Cuando se disuelve la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en 1 equivalente de hidróxido de colina seguido de la adición de
ácido acético, no se forma un precipitado hasta pH 9,4. Por tanto,
la disolución de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en 1 equivalente de hidróxido de colina conduce a la sal de
monocolina que, al contrario que las sales de sodio y potasio, es
bastante soluble en agua. Véase la figura 21.
Se aisló la sal de monocolina liofilizando la
disolución. Se obtuvo un polvo seco, ligeramente marrón. Puede
añadirse agua para dar una disolución soluble de 90 mg/1 ml de agua.
Se disolvió instantáneamente el polvo en el agua dando una
disolución transparente, ligeramente marrón. Por tanto, puede
aislarse la sal de monocolina de la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en forma pura.
En un segundo experimento, se determinó que la
sal de monocolina de
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
también es altamente soluble en agua. Tras disolver este compuesto
en 1 equivalente de hidróxido de colina, la adición de ácido
acético no provoca que se produzca un precipitado hasta que el pH
alcanza aproximadamente 8.
Por tanto, pueden prepararse sales de amonio
altamente solubles en agua de dionas de quinoxalina. Puesto que la
solubilidad en agua es un requisito previo para el uso terapéutico
humano, este descubrimiento representa un avance significativo en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución 5 mg/ml de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
disolviendo la
5-nitro-6,7-quinoxalin-2,3-diona
en una disolución acuosa que contenía polietilenglicol 400 al 10%
(PEG-400), Tween-80 al 0,45% y Tris
(trometamina) 0,18 M dando una concentración final de 5 mg/ml de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se disolvió fácilmente la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en esta formulación. Se esterilizó la disolución mediante autoclave
y se encontró que era estable durante al menos dos meses. Se espera
que esta disolución sea estable durante al menos
1-2 años. Se preparó una disolución de 10 mg/ml de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
disolviendo el compuesto en una disolución que contenía
PEG-400 al 50%, Tween-80 al 0,5% y
Tris (trometamina) 0,1 M. Se disolvió rápidamente la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en esta disolución calentando hasta 60-100ºC. Se
trató mediante autoclave la disolución y se encontró que era estable
durante al menos 2 meses. Se espera que esta disolución sea estable
durante al menos 1-2 años. También se preparó una de
disolución 5 mg/ml de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sin PEG-400 disolviendo el compuesto en una
disolución que contenía Tris 0,05 M (trometamina),
Tween-80 al 0,5% y glucosa al 5%. Se esterilizó la
disolución y se encontró que era estable durante al menos dos
meses. Se espera que esta disolución sea estable durante al menos
1-2 años.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución 10 mg/ml de
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
disolviendo el compuesto en
bis-tris-propano 0,1 M,
PEG-400 o propilenglicol al 50%,
Tween-80 al 0,75%. Se disolvió fácilmente el
compuesto calentando en un baño de agua hirviendo. Se trató mediante
autoclave la disolución y se encontró que era estable durante al
menos 2 meses. Se espera que el compuesto en la disolución de
bis-tris-propano sea estable durante
al menos 1-2 años.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando los ratones se tumban sobre su lomo, se
enderezan de nuevo por sí mismos sobre sus pies inmediatamente.
Fármacos sedantes hipnóticos o fármacos anestésicos, a dosis bajas,
provocarán un retraso en el reflejo de enderezamiento o, a dosis
superiores, provocarán que el animal permanezca sobre su lomo
durante un periodo de tiempo prolongado. Se llevaron a cabo
experimentos para determinar el efecto de la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y su análogo
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
sobre el reflejo de enderezamiento en ratones tras la inyección
intraperitoneal. Se compararon las dos quinoxalindionas con
ketamina, un bloqueante de canal de NMDA conocido con actividad
anestésica.
Se inyectaron ratones macho Swiss/Webster
(25-30 g) por vía intraperitoneal con
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
o
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en DMSO (1 \mul/g), ambas a una dosis de 50 mg/kg o con 50 mg/kg
de ketamina en solución salina (1 \mul/g). Se sometió a prueba el
reflejo de enderezamiento tumbando los animales sobre su lomo a
intervalos de 5 minutos. Se puntuó el efecto de los fármacos sobre
el reflejo de enderezamiento tal como sigue: se puntuaron los
animales que se enderezaron por sí mismos inmediatamente tras
tumbarse con 0; se puntuaron los animales que se enderezaron por sí
mismos entre 1 y 2 segundos con 1; se puntuaron los animales que se
enderezaron por sí mismos a entre 2 y 10 segundos con 2; y se
puntuaron los animales que no se enderezaron por sí mismos tras 10
segundos con 3. Se sometieron a prueba trece animales en el grupo
de la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
se sometieron a prueba 10 animales en el grupo de la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y se sometieron a prueba 10 animales en el grupo de la ketamina.
La figura 22A muestra los efectos de los tres
fármacos sobre el reflejo de enderezamiento. La
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
cincuenta mg/kg mostró una inhibición fuerte y duradera del reflejo
de enderezamiento. Por el contrario, la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
era completamente inactiva a la misma dosis (50 mg/kg). La ketamina,
a 50 mg/kg mostró una inhibición de actuación corta del reflejo de
enderezamiento que duraba aproximadamente 15 minutos. La ketamina
no alcanzó el grado de inhibición del reflejo de enderezamiento
observado con
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Por tanto, el antagonista de glicina/NMDA
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es un compuesto sedante/hipnótico y anestésico con una fuerza
considerablemente superior a la ketamina, un agente anestésico usado
clínicamente. Puesto que la ketamina actúa en el sitio de PCP del
receptor de NMDA, tiene efectos secundarios de comportamiento
similares a PCP. La
5,7-Dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es un antagonista de glicina y por tanto no tiene efectos
secundarios similares a PCP.
Puesto que las afinidades de unión de
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a receptores de glicina, cainato y AMPA no son sustancialmente
diferentes entre los dos compuestos, se concluye que la diferencia
entre los compuestos en lo que respecta a su efecto
sedante/hipnótico se debe al hecho de que la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
puede penetrar la barrera sangre/cerebro mientras que la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no. Estos hallazgos extienden las observaciones previas de que la
5,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es altamente activa a la hora de evitar convulsiones inducidas por
sonido en ratones DBA-2, mientras que la
6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
es completamente inactiva.
Se concluye que una substitución en la posición
5 en el sistema de anillo de quinoxalindiona es crucial para lograr
la actividad in vivo tras la administración sistémica
incluyendo la actividad sedante/hipnótica y anticonvulsivo. La
presente invención se refiere a este descubrimiento.
La fenciclidina (PCP) es una droga importante y
produce una intoxicación alarmante incluso si se toma a dosis
subanestésicas (Balster, R.L., "The behavioral pharmacology of
phencyclidine", en Psychopharmacology: The Third Generation of
Progress, Meltzer, H.Y., ed., Raven Press, Nueva York, págs.
1573-1579 (1987)). Se ha desarrollado un modelo
animal que es predictivo de la capacidad de los fármacos para
producir una intoxicación similar a PCP en seres humanos. El modelo
utiliza procedimientos de entrenamiento de discriminación de
fármacos para enseñar a los animales a percibir la intoxicación por
PCP. Cada día, las ratas que se habían entrenado para presionar la
palanca para un refuerzo de alimento deben seleccionar cuál de las
dos palancas en sus jaulas es correcta. El único estímulo que
tienen para seleccionar la palanca correcta es su capacidad para
detectar si reciben una inyección de PCP o de vehículo. Tras
aproximadamente dos meses de entrenamiento, las ratas llegan a ser
muy buenas en discriminar las inyecciones de PCP de las de vehículo
y entonces pueden someterse a prueba con otros fármacos para
determinar si éstos se discriminan como la PCP.
Cuando se someten a prueba en este
procedimiento, otros fármacos que se sabe que producen una
intoxicación similar a PCP sustituyen a la PCP. Estos fármacos
incluyen diversos análogos de PCP tales como ketamina, el fármaco
sigma agonista N-alilnormetazocina y los dioxolanos
1,3-sustituidos, dexoxadrol y etoxadrol (Brady
et al., Pharm. Biochem. Behav. 17:291-295
(1982); Brady et al., Science 212:178-180
(1982); Brady et al., J. Pharm. Exp. Ther.
220:56-62 (1982); Slifer y Balster, Subst. Alcohol
Actions/Misuse 5:273-280 (1984); Balster y
Willetts, "Receptor mediation of the discriminative stimulus
properties of phencyclidine and sigma-opioid
agonists", en Transduction Mechanisms of Drug Stimuli, Colpaert y
Balster, eds., Springer-Verlag, Berlín, págs.
122-135 (1988)).
Para este estudio, se sometieron a prueba ratas
entrenadas para discriminar PCP 2 mg/kg del vehículo de solución
salina con
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Se seleccionó cuidadosamente el intervalo de dosis de cada
compuesto para asegurar que una dosis suficientemente alta produce
efectos sobre el cerebro y se sometió a prueba el
comportamiento.
Los sujetos eran seis ratas macho adultas
Sprague-Dawley (COBS CD, Charles River Farms,
Wilmington, DE), alojadas individualmente, y mantenidas en un
régimen de alimentación restringido.
Aparato. Se llevaron a cabo sesiones
experimentales en cámaras operantes de rata de 2 palancas,
comerciales que contenían cubículos que atenuaban la luz y el
sonido. Se equiparon las cámaras con dispensadores de gránulos para
gránulos de 45-mg. Una luz de estímulo señalaba si
las sesiones habían comenzado.
Entrenamiento. Antes de comenzar este
estudio, se habían entrenado las ratas para presionar la palanca
para un refuerzo de alimento bajo un programa de razón fija 32
durante sesiones de 30 min. diariamente
(lunes-viernes). En las sesiones de entrenamiento,
se reforzó la respuesta sólo a una de las palancas; las respuestas
en la palanca incorrecta reiniciaban el requerimiento de razón fija
en la palanca correcta. Durante el entrenamiento, se asoció cada
palanca con una inyección de o bien PCP 2 mg/kg o bien de solución
salina. Se produjeron las sesiones de entrenamiento de PCP y de
solución salina en una secuencia de alternancia doble. Se continuó
el entrenamiento hasta que los sujetos comenzaron cada sesión en la
palanca correcta durante cuatro sesiones consecutivas. Tras
completar el entrenamiento (2-3 meses), se comenzó
la fase de prueba.
Pruebas. Se llevaron a cabo pruebas de
generalización dos veces por semana (jueves y viernes). Entre
sesiones de prueba, se proporcionó a los animales entrenamiento
continuado con inyecciones de PCP y de solución salina. Se llevaron
a cabo las pruebas si en la sesión de entrenamiento anterior, la
primera razón fija era en la palanca correcta y en global había una
respuesta de palanca correcta superior al 85%. En las sesiones de
prueba, se reforzó la respuesta a ambas palancas. Se llevaron a
cabo pruebas con PCP 2,0 mg/kg y solución salina al comienzo de
cada determinación de curva dosis-efecto. Se
llevaron a cabo pruebas con PCP (0,5, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 mg/kg),
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(6,0, 12,5 y 25 mg/kg) y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(2,0, 4,0, 6,0, 8,0 y 16,0 mg/kg). También se llevaron a cabo
pruebas con el vehículo de DMSO 0,5 ml/kg antes de someter a prueba
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
Fármacos. Se obtuvo fenciclidina HCl del
National Institute on Drug Abuse. Se disolvió en solución salina y
se administró en 1,0 ml/kg i.p. 15 min. antes del entrenamiento y de
las sesiones de pruebas. Las dosis se refieren a la sal de HCl. Se
disolvieron
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
en DMSO de modo que el volumen de inyección para todas las dosis
era de 0,5 ml/kg. Se inyectaron i.p. tanto
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
40 min. antes de las sesiones de prueba.
Análisis de datos. El grado de similitud
de fármaco de prueba con PCP 2,0 mg/kg se refleja en el porcentaje
medio de respuestas en la palanca de PCP. Se revelaron efectos no
específicos en el comportamiento en diferencias en las tasas medias
de respuesta a partir de pruebas control de solución salina. Cuando
las tasas de respuesta durante la pruebas con dosis de fármaco
altas disminuían hasta menos de 0,05/segundo, la respuesta de
palanca de PCP en porcentaje para ese sujeto para esa prueba no se
incluyó en la media del grupo. Esto se realizó ya que es difícil
interpretar los datos de selección de palanca si los sujetos están
gravemente perjudicados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados tanto para
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como para
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
se muestran en las figuras 23A y 23B. En las partes izquierdas de
las figuras están los resultados de pruebas de control con solución
salina 1,0 ml/kg, PCP 2 mg/kg y DMSO 0,5 ml/kg. Tanto la solución
salina como el DMSO produjeron una respuesta de palanca de PCP del
0% en cada ocasión en la que se sometieron a prueba (panel
superior). La PCP, cuando se sometió a prueba cada una de las
determinaciones de curva dosis-respuesta,
proporcionó una respuesta de palanca de PCP del 100%. Esta
precisión consistente es típica de este procedimiento de
discriminación. Las tasas de respuesta tras solución salina, PCP y
DMSO (panel inferior) eran de algún modo más variables, pero no
había un efecto claro de que o bien PCP o bien DMSO produjeran tasas
de respuesta diferentes a las de las pruebas de control de solución
salina.
Cuando se sometieron a prueba dosis diferentes
de PCP, se produjo un aumento relacionado con la dosis en la
respuesta de palanca de PCP. A 2 mg/kg y superior, se produjo una
generalización del 100%. Sólo la dosis de 8 mg/kg de PCP redujo las
tasas de respuesta, mostrando la especificidad de este procedimiento
para efectos de estímulo discriminatorio similares a PCP de dosis
baja.
Ni
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
ni
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
produjeron ninguna respuesta de palanca de PCP a ninguna dosis
sometida a prueba. La
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
produjo efectos de disminución de tasa de respuesta relacionada con
la dosis a 12,5 y 25 mg/kg. La
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
produjo efectos de disminución de tasa de respuesta a dosis de 6, 8
y 16 mg/kg. Considerando la variabilidad en estos datos, no puede
concluirse que la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
fuera de manera fiable más potente que la
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
para los efectos de tasa de respuesta. Sin embargo, está claro que
se evaluó un intervalo de dosificación activa para el comportamiento
de ambos compuestos.
\vskip1.000000\baselineskip
Tanto
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
como
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
carecían completamente de efectos de estímulo discriminatorios
similares a PCP. A este respecto se diferencian radicalmente de los
antagonistas de NMDA no competitivos de sitios PCP tales como PCP,
dizocilpina, ketamina y
(+)-N-alilnormetazocina, que se
sustituyen completamente por PCP en este procedimiento (Brady et
al., Pharm. Biochem. Behav. 17:291-295 (1982);
Brady et al., Science 212:178-180 (1982);
Willetts y Balster, Eur. J. Pharm. 146:167-169
(1988)). La capacidad de los compuestos de prueba para producir
efectos similares a PCP en ratas es predictiva de su capacidad para
producir efectos psicotomiméticos similares a PCP y responsabilidad
de abuso en seres humanos. Por tanto, estos datos soportarían la
conclusión de que
5-cloro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
carecen de estos efectos secundarios similares a PCP. Por otro
lado, no puede concluirse a partir de estos datos que estos
compuestos puedan carecer de otros efectos secundarios, sólo que no
se esperaría que fueran muy similares a los producidos por PCP.
Antagonistas de receptor de NMDA, en particular
los bloqueantes de canal de NMDA, provocan una estimulación del
comportamiento en roedores (Koek et al., J. Pharmacol. Exptl.
Ther. 245:969 (1988)). Se cree que la estimulación del
comportamiento subyace a los efectos secundarios psicotomiméticos de
PCP en hombres (Koek et al., J. Pharmacol. Exptl. Ther.
245:969 (1988); Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol.
167:127-135 (1989)). La estimulación del
comportamiento es particularmente pronunciada con bloqueantes de
canal de NMDA tales como MK801 y PCP pero también está provocada
por antagonistas de NMDA competitivos tales como CGS19755
(Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol.
167:127-135 (1989)).
Con el fin de someter a prueba si la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
tiene efectos estimulantes sobre el comportamiento en roedores, se
sometió a prueba el compuesto en una prueba de actividad locomotriz.
Se encontró que la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
a dosis de hasta niveles anestésicos, no inducía estimulación del
comportamiento tal como se evalúa por la actividad locomotriz. Por
el contrario, MK081, a dosis subanestésicas, provocó una
estimulación fuerte del comportamiento locomotor. Estos resultados
sugieren que la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
puede que no tenga efectos estimulantes del comportamiento similares
a PCP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron ratones macho Swiss/Webster
(25-30 g) de Simonsen y se alojaron en grupos de
8-10 en una habitación con temperatura controlada y
un ciclo luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionó alimento y agua a
voluntad.
Se sometió a prueba la actividad locomotriz
usando un aparato de actividad locomotriz Omnitech. Se inyectaron
los animales por vía intraperitoneal (i.p.) con o bien DMSO o bien
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
disuelta en DMSO a dosis de 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 5 mg/kg. El volumen
de inyección era de 1 ml/kg. Entonces se colocaron los animales en
la cámara de actividad locomotriz y se registró su comportamiento
locomotor durante 4 intervalos sucesivos de 15 minutos. Se
inyectaron otros animales (i.p.) con o bien solución salina o bien
MK801 en solución salina a dosis de 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 5 mg/kg
seguido del registro de la actividad locomotriz.
\vskip1.000000\baselineskip
La inyección de MK801 (i.p.) en ratones
Swiss/Webster produjo un aumento dependiente de la dosis en la
actividad locomotriz (figura 24). Se registró el nivel más alto de
actividad locomotriz en el segundo intervalo de quince minutos. Por
tanto, la actividad locomotriz en el segundo intervalo de quince
minutos tras la inyección de fármaco se muestra en la figura 24. El
pico de actividad locomotriz se produjo mediante una dosis de 0,25
mg/kg de MK801. El aumento adicional de la dosis de MK801 dio como
resultado una actividad locomotriz inferior en relación con la
dosis de 0,25 mg/kg. Una dosis de 5 mg/kg de MK801 dio como
resultado la supresión de la actividad locomotriz por debajo de los
niveles iniciales. Por el contrario, la
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no provocó ninguna estimulación de la actividad locomotriz por
encima de los niveles iniciales (figura 24). Una dosis de 5 mg/kg
de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
redujo la actividad locomotriz por debajo de los niveles iniciales.
También se sometieron a prueba dosis superiores de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
(10, 20 y 50 mg/kg). Con ninguna dosis hubo una estimulación de la
actividad locomotriz. A la dosis de 50 mg/kg, los animales tenían
una completa pérdida del reflejo de enderezamiento 30 minutos tras
la inyección i.p. También hubo una pérdida notable de respuesta al
dolor lo que sugiere una actividad anestésica de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
a la dosis de 50 mg/kg.
\vskip1.000000\baselineskip
La
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no produjo estimulación de la actividad locomotriz en ratones. Por
el contrario, el bloqueante de canal de NMDA MK-801
produjo una fuerte estimulación de actividad locomotriz consistente
con los efectos de comportamiento similares a PCP provocados por
este compuesto. La ausencia de efectos estimulantes de
comportamiento similares a PCP sugiere que el antagonista de
NMDA/glicina
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
no tiene los efectos estimulantes de comportamiento adversos que
han plagado el desarrollo clínico de otras clases de antagonistas de
NMDA.
Claims (15)
1. Uso de una composición farmacéutica que
comprende un compuesto que tiene la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un tautómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo;
en la que R^{1} es flúor, bromo, yodo, amino,
hidroxilamino, un grupo amino sustituido con un grupo acilo
C_{2-6}, (por ejemplo grupos acetilo, propionilo,
butanoílo, pentanoílo y hexanoílo), un grupo alquilo
C_{1-6} sustituido con uno o más átomos de flúor,
cloro, bromo o yodo, o nitro;
R^{2} es amino, hidroxilamino, un grupo amino
sustituido con un grupo acilo C_{2-6}, (por
ejemplo grupos acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y
hexanoílo), nitro, alquilo C_{1-6} alquilo
sustituido con uno o más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, o
halógeno;
R^{3} es halógeno, amino, hidroxilamino, un
grupo amino sustituido con un grupo acilo C_{2-6},
(por ejemplo grupos acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y
hexanoílo) o un alquilo C_{1-6} sustituido con uno
o más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo; y
R^{4} es hidrógeno;
y un vehículo farmacéuticamente aceptable,
para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de:
(a) pérdida neuronal asociada a accidente
cerebrovascular, isquemia, traumatismo del SNC, hipoglucemia o
cirugía;
(b) una enfermedad neurodegenerativa
seleccionada de enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral
amiotrófica, enfermedad de Huntington y síndrome de Down;
(c) dolor crónico;
(d) ansiedad;
(e) convulsiones; o
(f) psicosis.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicha pérdida neuronal se produce como resultado de:
(a) burbujas de aire que se depositan en el
cerebro durante o inmediatamente tras la cirugía;
(b) cirugía de derivación cardiopulmonar;
(c) cirugía de endoarterioctomía carotídea;
o
(d) accidentes cerebrovasculares múltiples que
dan como resultado demencia.
\newpage
3. Uso de una composición farmacéutica que
comprende un compuesto que tiene la fórmula
o un tautómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo;
en la que R^{1} es flúor, bromo, yodo, amino,
hidroxilamino, un grupo amino sustituido con un grupo acilo
C_{2-6}, (por ejemplo grupos acetilo, propionilo,
butanoílo, pentanoílo y hexanoílo), un grupo alquilo
C_{1-6} sustituido con uno o más átomos de flúor,
cloro, bromo o yodo, o nitro;
R^{2} es amino, hidroxilamino, un grupo amino
sustituido con un grupo acilo C_{2-6}, (por
ejemplo grupos acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y
hexanoílo), nitro, alquilo C_{1-6} sustituido con
uno o más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, o halógeno;
R^{3} es halógeno, amino, hidroxilamino, un
grupo amino sustituido con un grupo acilo C_{2-6}
(por ejemplo grupos acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y
hexanoílo) o un alquilo C_{1-6} sustituido con uno
o más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo; y
R^{4} es hidrógeno;
y un vehículo farmacéuticamente aceptable,
para la fabricación de un medicamento para:
(a) inducir anestesia; o
(b) inducir un efecto hipnótico.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, comprendiendo dicha composición un compuesto, en el que
R^{1} es flúor, bromo, yodo o nitro, R^{2} es halógeno y R^{3}
es halógeno o alquilo C_{1-6} sustituido con uno o
más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, comprendiendo dicha composición un compuesto en el que al
menos uno de R^{1}-R^{3} es amino o acilamino
C_{2-6}.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, comprendiendo dicha composición un compuesto que se
selecciona de
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
6,7-difluoro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
6-cloro-5-nitro-7-bromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
6-cloro-5-nitro-7-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
5-bromo-6,7-difluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
5-amino-6,7-dibromo-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
5-amino-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
7-cloro-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona,
6-amino-7-cloro-5-trifluorometil-1,4-dihi-
droquinoxalin-2,3,-diona, 7-bromo-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 6-amino-7-bromo-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 7-fluoro-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 6-
amino-7-fluoro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 6,7-dicloro-5-hidroxilamino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona y 6,7-dibromo-5-hidroxilamino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
droquinoxalin-2,3,-diona, 7-bromo-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 6-amino-7-bromo-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 7-fluoro-6-nitro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 6-
amino-7-fluoro-5-trifluorometil-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, 6,7-dicloro-5-hidroxilamino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona y 6,7-dibromo-5-hidroxilamino-1,4-dihidroquinoxalin-2,3,-diona, o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, comprendiendo dicha composición un compuesto que se
selecciona del grupo que consiste en:
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
7-bromo-6-cloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
6-cloro-7-trifluorometil-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
y
5-bromo-6,7-difluoro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. Uso según la reivindicación 7, comprendiendo
dicha composición
6,7-dicloro-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. Uso según la reivindicación 7, comprendiendo
dicha composición
6,7-dibromo-5-nitro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona,
o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-9, comprendiendo dicha composición una sal de
amonio de un compuesto de
1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona
tal como se define en dicha reivindicación.
11. Uso según la reivindicación 10,
comprendiendo dicha composición una sal de amonio, que es la sal de
un compuesto de amino seleccionado del grupo que consiste en:
tetraalquil-C_{1-6}-amina,
una tri-alquil
C_{1-6}-alcanolamina
C_{1-6}, una aralquil
C_{6-12}-trialquil
C_{1-6}-amina, etilendiamina,
dietilentriamina, N-metiletanolamina,
di-(2-etanol)amina,
tri-(2-etanolamina), espermidina, espermina, un
aminocarbohidrato, N-metilglucamina, arginina, una
N-alquil
C_{1-6}-guanidina, una
N,N-di-alquil
C_{1-6}-guanidina, una
N,N'-di-alquil
C_{1-6}-guanidina, una
N,N,N'-tri-alquil
C_{1-6}-guanidina, una
N,N,N',N'-tetra-alquil
C_{1-6}-guanidina, biguanidina,
N-alquil
C_{1-6}-biguanidina, una
N,N-dialquil
C_{1-6}-biguanidina, una
N,N'-dialquil
C_{1-6}-biguanidina, amidina, una
N-alquil
C_{1-4}-amidina,
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
y Tris.
12. Uso según la reivindicación 10,
comprendiendo dicha composición una sal de amonio, que es una de una
sal de colina, una sal de tris; una sal de
bis-tris-propano, una sal de
N-metilglucamina o una sal de arginina.
13. Uso según la reivindicación 12,
comprendiendo dicha composición la sal de tris de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidroquinoxalin-2,3-diona.
14. Uso según la reivindicación 12,
comprendiendo dicha composición la sal de
N-metilglucamina de
5-nitro-6,7-dicloro-1,4-dihidro-quinoxalin-2,3-diona.
15. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, en el que dicha composición
está adaptada para administración oral, intravenosa, subcutánea,
intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal.
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