NO310022B1

NO310022B1 - Kinoksalinforbindelser, deres anvendelse, samt farmasöytiske preparater

Info

Publication number: NO310022B1
Application number: NO944942A
Authority: NO
Inventors: Eckard Weber; John F W Keana
Original assignee: Univ California; Univ Oregon
Priority date: 1992-06-22
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 2001-05-07
Also published as: EP0647137A1; FI946005A0; NO944942L; EP0647137A4; AU672617B2; FI120094B; AU4641293A; US5514680A; NZ254404A; PT647137E; EP0647137B1; ES2313714T3; JP3301024B2; ATE404201T1; WO1994000124A1; FI946005A; US5620979A; NO944942D0; DK0647137T3; CA2138026A1

Description

Den foreliggende oppf-innelse vedrører kinoksalinforbindelser, ammoniumsalter av slike forbindelser, farmasøytiske preparater omfattende slike forbindelse eller ammoniumsalter, samt deres anvendelse ved fremstilling av farmasøytiske preparater .

Den foreliggende oppfinnelse vedrører området medisinsk kjemi. Den foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som har høy affinitet for glycinbindingsstedet, som mangler PCP-bivirkninger og som krysser blod-hjerne-barrieren ved høye nivåer. Den foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt nye 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner, og deres anvendelse ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for å behandle eller forebygge nevronal degenerering assosiert med ischemi, patofysiologiske tilstander assosiert med nevronal degenerering, konvulsjoner, angst, kronisk smerte og å indusere anestesi. Oppfinnelsen vedrører også visse svært oppløselige ammoniumsalter av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner.

Glutamat er antatt å være den viktigste eksitatoriske nevro-transmitter i hjernen. Det er tre hovedsubtyper av glutamat-reseptorer i CNS (sentralnervesystemet). Disse refereres vanligvis til som kainat-, AMPA- og N-metyl-D-aspartat-(NMDA) reseptorer (Watkins og Olverman, Trends in Neurosci. 7:265-272) (1987)). NMDA-reseptorer finnes i membranene av praktisk talt hvert nevron i hjernen. NMDA-reseptorer er ligand-port- kationkanaler som tillater Na<+>, K<+> og Ca<++> å trenge gjennom når de er aktivert av glutamat eller aspartat (ikke-selektive, endogene agonister) eller av NMDA (en selektiv, syntetisk agonist)(Wong og Kemp, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 31:401-425 (1991)).

Glutamat alene kan ikke aktivere NMDA-reseptoren. For å bli aktivert av glutamat må NMDA-reseptorkanalen først binde glycin ved et spesifikt glycinbindingssted med høy affinitet som er separat fra glutamat/NMDA-bindingsstedet på reseptorproteinet (Johnson og Ascher, Nature 325:329-331

(1987)). Glycin er derfor en obligatorisk koagonist ved

NMDA-reseptor/kanalkomplekset (Kemp, J.A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6547-6550 (1988)).

Foruten bindingsstedene for glutamat/NMDA og glycin bærer NMDA-reseptoren et antall av andre funksjonelt viktige bindingssteder. Disse omfatter bindingssteder for Mg<++> og Zn<++>, polyaminer, arakidonsyre og phencyklidin (PCP)(Reynolds og Miller, Adv. in Pharmacol. 21:101-126 (1990): Miller, B., et al., Nature 355:722-725 (1992)). PCP-bindingsstedet - nå vanligvis referert til som PCP-reseptoren - er lokalisert inne i poren av ionoforen av NMDA-reseptor/kanalkomplekset (Wong, E.H.F., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7104-7108 (1986); Huettner og Bean, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:1307-1311 (1988); MacDonald, J.F., et al., Neurofhysiol. 58:251-266 (1987)). For at PCP skal få adgang til PCP-reseptoren må kanalen først åpnes av glutamat og glycin. I fravær av glutamat og glycin kan ikke PCP binde til PCP-reseptoren selv om noen studier har antydet at en liten mengde PCP-binding kan forekomme selv i fravær av glutamat og glycin (Sircar og Zukin, Brain Res. 556:280-284 (1991)). Så snart PCP binder til PCP-reseptoren blokkerer den ionestrømming gjennom den åpne kanalen. Derfor er PCP en åpen kanalblokker og en ikke-konkurrerende glutamatantagonist ved NMDA-reseptor/kanalkomplekset .

Et av de mest kraftige og selektive medikamenter som binder til PCP-reseptoren er antikonvulsjonsmiddel-medikamentet MK801. Dette medikamentet har en Kd på omtrent 3nM ved PCP-reseptoren (Wong, E.H.F., et al., Proe. Nati. Acad. Sei.' USA 83 = 7104-7108 (1986)) .

Både PCP og MK801 så vel som andre PCP-reseptorligander [f.eks. dekstrometorfan, ketamin og N,N'-disubstituerte guanidiner] har nevrobeskyttende virkningsfullhet både in vitro og in vivo (Gill, R., et al., J. Neurosci. 7:3343-3349

(1987): Keana, J.F.W., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:5631-5635 (1989); Steinberg, G.K., et al., Neuroscience Lett. 89:193-197 (1988); Church, J., et al., In: Sigma and Phencyclidine-Like Compounds as Molecular Probes in Biology, Domino og Kamenka, forfattere, Ann Arbor: NPP Books, side 747-756 (1988)). Den velkarakteriserte nevrobeskyttende virkningsfullheten av disse medikamentene skyldes i høy grad deres kapasitet til å blokkere overdreven Ca<++->innstrømning i nevroner gjennom NMDA-reseptorkanaler som blir overaktiverte ved overdreven glutamatfrigivelse i tilstander av hjerne-ischemi (f.eks. ved slag, hjertestansischemi, etc.) (Collins, R.C., Metabol. Br. Dis. 1:231-240 (1986); Collins, R.C., et al., Annals Int. Med. 110:992-1000 (1989)).

Imidlertid har det terapeutiske potensialet av disse PCP-reseptormedikamenter som ischemi-redningsmidler ved slag blitt alvorlig hemmet av det faktum at disse medikamentene har sterke PCP-lignende oppførselsmessige bivirkninger (psykotomimetiske oppførselsmessige virkninger) som synes å skyldes interaksjonen av disse medikamentene med PCP-reseptoren (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989); Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets og Balster, Neuropharmacology 27:1249

(1988)). Disse PCP-lignende oppførselsmessige bivirkningene synes å ha forårsaket tilbaketrekningen av MK801 fra klinisk utvikling som et ischemi-redningsmiddel. Videre synes disse PCP-reseptorligandene å ha betydelig misbrukspotensiale som demonstrert ved misbrukstilbøyeligheten av PCP i seg selv.

De PCP-lignende oppførselsmessige virkninger av PCP-reseptorligandene kan demonstreres i dyremodeller: PCP og beslektede PCP-reseptorligander forårsaker en oppførselsmessig eksitering (hyperbevegelse) i gnagere (Tricklebank, M.D., et al., Euro. J. Pharmacol 167:127-135 (1989)) og en karakteristisk katalepsi i duer (Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets og Balster, Neuropharmacology 27:1249

(1988)); i medikamentdiskrimineringsparadigmaer er det en sterk korrelasjon mellom PCP-reseptoraffiniteten av disse medikamenter og deres kraft til å indusere en PCP-passende responsoppførsel (Zukin, S.R., et al. , Brain Res. 294:174

(1984); Brady, K.T., et al., Science 215:178 (1982); Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 141:497 (1987)). Medikamenter som opptrer som konkurrerende antagonister ved glutamatbindingsstedet av NMDA-reseptoren slik som CGS 19755 og LY2 74 614 har også nevrobeskyttende virkningsfullhet fordi disse medikamentene - som PCP-reseptorligandene - kan avverge overdreven Ca<++->strømning gjennom NMDA-reseptor/kanaler ved ischemi (Boast, C.A., et al., Brain Res. 442:345-348 (1988); Schoepp, D.D., et al., J. Neural. Trans. 85:131-143 (1991)). Konkurrerende NMDA-reseptorantagonister har imidlertid også PCP-lignende oppførselsmessige bivirkninger i dyremodeller (oppførselsmessig eksitering, aktivitet i PCP-medikament-diskrimineringsforsøk) skjønt ikke så kraftig som MK801 og PCP (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)) .

En alternativ måte å inhibere NMDA-reseptorkanalaktivering er ved å anvende antagonister ved glycinbindingsstedet av NMDA-reseptoren. Siden glycin må binde til glycinstedet for at glutamat skal bevirke kanalåpning (Johnson og Ascher, Nature 325:329-331 (1987); Kemp, J.A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6547-6550 (1988)), kan en glycinantagonist fullstendig avverge ionestrøm gjennom NMDA-reseptorkanalen - selv i nærvær av en stor mengde glutamat.

Nylige in vivo mikrodialysestudier har demonstrert at i fokalischemi-rottemodellen er det en stor økning i glutamatfrigivelse i den ischemiske hjerneregionen med ingen signifikant økning i glycinfrigivelse (Globus, M.Y.T., et al.,

J. Neurochem. 57:470-478 (1991)). Teoretisk bør således glycinantagonister være svært kraftige nevrobeskyttende midler fordi de kan avverge åpningen av NMDA-kanaler av glutamat ikke-konkurrerende og må derfor ikke - i motsetning til konkurrerende NMDA-antagonister - overvinne de store konsentrasjonene av endogent glutamat som frigis i den ischemiske hjerneregionen.

Dessuten, fordi glycinantagonister hverken virker ved glutamat /NMDA eller PCP-bindingsstedene til å avverge NMDA-kanalåpning, forårsaker disse medikamentene muligens ikke den PCP-lignende oppførselsmessige bivirkning som sees med både PCP-reseptorligander og konkurrerende NMDA-reseptorantagonister (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989); Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989); Willets og Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988); Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol 167:127-135 (1989); Zukin, S.R., et al., Brain Res. 294:174

(1984); Brady, K.T., et al., Science 215:178 (1982); Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol. 141:497 (1987)). At glycinantagonister virkelig kan være fri for PCP-lignende oppførselsmessige bivirkninger har blitt foreslått av nyere studier hvori tilgjengelige glycinantagonister ble injisert direkte inn i hjernene til gnagere uten å resultere i PCP-lignende oppførsler (Tricklebank, M.D., et al., Eur. J. Pharmacol-. 167:127-135 (1989)).

Det har imidlertid vært to hovedproblemer som har hindret utviklingen av glycinantagonister som klinisk nyttige nevrobeskyttende midler: A. De fleste tilgjengelige glycinantagonister med relativt høy reseptorbindingsaffinitet in vitro slik som 7-Cl-kynurensyre (Kemp, J.S., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6547-6550 (1988)), 5,7-diklorkynurensyre (McNamara, D., et al., Neuroscience Lett. 120:17-20 (1990)), og indol-2-karboksyl-syre (Gray, N.M., et al., J. Med. Chem. 34:1283-1292 (1991)) kan ikke trenge gjennom blod/hjernebarrieren og har derfor ingen anvendelse som terapeutiske midler,

B. Den eneste tilgjengelige glycinantagonist som i tilstrekkelig grad trenger gjennom blod/hjernebarrieren - medikamentet HA-966 (Fletcher og Lodge, Eur. J. Pharmacol. 151:161-162 (1988)) - er en partiell agonist med kun mikro-molar affinitet for glycinbindingsstedet. En nevrobeskyttende virkningsfullhet for HA-966 in vivo har derfor ikke blitt demonstrert og det har heller ikke blitt demonstrert for de andre tilgjengelige glycinantagonister fordi de mangler biotilgjengelighet in vivo.

Det har vært et antall rapporter i litteraturen av substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som er nyttige for å behandle patofysiologiske tilstander mediert ved ikke-NMDA-, NMDA- og glycinreseptorene. For eksempel omtaler U.S. patent nr. 4,975,430 (1990) 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-forbindelser med formelen:

hvori hver X uavhengig er nitro eller cyano og hvori hver Y uavhengig er H, lavere alkyl, lavere alkoksy eller CF3. Disse forbindelsene er rapportert å være nyttige for behandling av nevronale tilstander assosiert med stimulering av NMDA-reseptoren.

U.S. patent nr. 3,962,440 (1976) omtaler 1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dionforbindelser som har formelen:

hvori R<1> kan være hydrogen eller metyl, Rn kan være lavere alkyl, lavere alkoksy, lavere alkyltio, cyklopropyl, nitro, cyano, halogen, fluoralkyl av C1-C2 (trifluormetyl)amino eller substituert amino, og n kan være 0, 1 eller 2. Disse forbindelsene er rapportert å være nyttige som hypnotiske midler.

U.S. patent nr. 4,812,458 (1989) omtaler 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion-f orbindelser som har formelen:

hvori R<1> er halogen, cyano, trifluormetyl, etynyl eller N3 og R<2> er S02<C>1_3-alkyl, trifluormetyl, nitro, etynyl eller cyano. Disse forbindelsene er rapportert å være nyttige for

behandling av indikasjoner forårsaket av hyperaktivitet av de eksitatoriske nevrotransmi11ere, spesielt quisqualat-reseptorene, og som nevroleptika.

U.S. patent nr. 4,659,713 (1987) omtaler 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion- f orbindelser som har formelen:

hvori X representerer hydrogen, klor, brom, fluor, jod, tri-klormetyl, diklorfluormetyl, difluormetyl eller trifluormetyl , og n representerer 1 eller 2. Disse forbindelsene er rapportert å være nyttige for kontrollen av koksidiose i dyr.

U.S. patent nr. 4,948,794 (1990) omtaler 1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion-forbindelser som har formelen:

hvori R<1> er C1.12-alkyl, som eventuelt kan være substituert med hydroksy, formyl, karboksy, karboksylsyreestere, amider eller aminer, C3.8-cykloalkyl, aryl og aralkyl, og hvori R<6> er hydrogen, halogen, CN, CF3, N02 eller OR', hvori R1 er C1, i-alkyl og R5, R<7> og R<8> er hydrogen, med den forutsetning at R<6 >ikke er CF3, OCH3, N02, C<1> eller Br når R<1> er CH3, eller R<6> og R<7> er uavhengig N02, halogen, CN, CF3 eller OR', hvori R' er C1_4-alkyl og R<5> og R<8> er hver hydrogen, eller

R<5> og R<6> danner sammen en ytterligere kondensert aromatisk ring, som kan være substituert med halogen, N02, CN, CF3 eller OR', hvori R<1> er C1.4-alkyl, eller

R<7> og R8 danner sammen en ytterligere kondensert aromatisk ring, som kan være substituert med halogen, N02, CN, CF3 eller OR1, hvori R1 er <C>1.4-alkyl, og R<5> og R6 er uavhengig hydrogen, halogen, CN, CF3, NH2 eller OR', hvori R' er C-^-alkyl. Disse forbindelsene er rapportert å være nyttige for behandlingen av indikasjoner forårsaket av hyperaktivitet av de eksitatoriske nevrotransmittere, spesielt quisqualat-reseptorene, og som nevroleptika.

Yoneda og Ogita, Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:841-849

(1989) angir at de følgende 1,4-dihydrokinoksalin-1,2-dioner på konkurrerende måte fortrengte den stryknin-upåvirkelige bindingen av [<3>H]glycin, uten å påvirke de andre bindingsstedene på NMDA-reseptorkomplekset:

Ifølge forfatterne indikerer struktur-aktivitet-forholdene blant kinoksaliner klart at både kloridgrupper i posisjoner 6 og 7 i benzenringen er avgjørende for antagoniststyrken mot Gly-stedene. Fjerning av et klorid fra molekylet resulterer i en 10-dobbel reduksjon i affiniteten for Gly-steder.

Kleckner og Dingledi ne, Mol. Pharm. 36:430-436 (1989) angir at 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er mer kraftige antagonister av kainat enn glycin, men substitusjon av Cl ved 6-posisjonen og ved 6- og 7-posisjonene øker styrken ved glycinstedet. I tillegg foreslår forfatterne at antagonister av glycinstedet kan være effektive mot NMDA-reseptormedierte nevropatologier.

Ra, T.S. et al., Neuropharmacology 29:1031-1035 (1990) angir at 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-cyano-6-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion motvirker responser mediert av NMDA-assosierte glycingjenkjennelsessteder in vivo.

Pellegrini-Giampietro, D.E., et al., Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286 (1989) angir at 6-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksaliri-2,3-dion kan motvirke responsene til L-glutamat ved interaksjon med de glycingjenkjennende steder av NMDA-reseptorionekanal-komplekset.

Ogita og Yoneda, J. Neurochem. 54:699-702 (1990) angir at 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er en konkurrerende antagonist spesifikk for de stryknin-upåvirkelige [<3>H]glycinbindingsstedene på NMDA-reseptorkomplekset. Ifølge forfatterne er de to kloridradikalene ved 6- og 7-posisjonene i benzenringen av kinoksalinet avgjørende for den antagonist-iske styrken mot glycinbindingsstedene.

Kessler, M. et al., Brain Res. 489:377-382 (1989) angir at 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion inhiberer [<3>H]glycin-binding til de strykning-upåvirkelige glycinbindingssteder assosiert med NMDA-reseptorer.

Europeisk patentsøknad med publiseringsnr. 0 377 112 publi-sert 11. juli 1990 omtaler 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-forbindelser som har formelen:

hvori blant annet R<1> kan være hydroksy, alkoksy, aryloksy, aralkyloksy, cykloalkylalkoksy, cykloalkoksy eller acyloksy,

og R<5>, R<6>, R7 og R<8> kan uavhengig være hydrogen, nitro, halogen, cyano, trifluormetyl, S02NR<1>R', S02R' eller OR', hvori R' er hydrogen eller C1_4-alkyl. Disse forbindelsene er rapportert å være nyttige for behandling av indikasjoner forårsaket av hyperaktivitet av de eksitatoriske nevrotransmittere, spesielt quisqualat-reseptorene, og som nevroleptika.

Lester, R.A. et al., Mol. Pharm. 35:565-570 (1989) angir at 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion motvirker NMDA-reseptormedierte responser ved en konkurrerende interaksjon av glycyinbindingsstedet.

Patel, J. et al., J. Neurochem. 55:114-121 (1990) angir at den nevrobeskyttende aktivitet av 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion skyldes antagonisme av koagonistaktiviteten av glycin ved NMDA-reseptorkanalkomplekset.

Horner, L. et al., Chem. Abstracts 48:2692 (1953) angir 6,8-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1170-1176 (1962) omtaler 6,7-dibrom-2,3-dihydroksykinoksalin (også kjent som 6,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion).

Honoré, T. et al., Science 241:701-703 (1988) angir at 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-cyano-6-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er kraftige ikke-NMDA-glutamatreseptorantagonister.

Sheardown, M.J. et al., Eur. J. Pharmacol. 174:197-204 (1989) angir at 5,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er en kraftig antagonist av den stryknin-upåvirkelige glycinreseptoren og har antikonvulsive egenskaper. Sherdown et al. angir imidlertid også at 5,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion så vel som DNQX og CNQX har dårlig tilgang til sentralnervesystemet.

Internasjonal søknad med publiseringsnr. W091/13878 angir de følgende N-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som binder til glycinreseptoren:

hvori R representerer hydrogen, C1_6-alkyl eller aralkyl og n er et helt tall fra 0 til 5, R<4> representerer hydrogen eller hydroksy, R<5>, R6, R<7> og R<8> representerer uavhengig hydrogen, nitro, halogen, alkoksy, aryloksy, aralkoksy, C1_6-alkyl eller aryl, R<9> representerer hydrogen, lavere alkyl eller aryl, R<10 >representerer hydrogen eller alkyl, og farmasøytisk tålbare salter derav.

Leeson et al., J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991) omtaler et antall derivater av den ikke-selektive eksitatoriske amino-syreantagonist kynurensyre. Det omtales også et antall strukturelt beslektede kinoksalin-2,3-dioner som også er glycin/NMDA-antagonister men som ikke er selektive og som er mye mindre kraftige enn kynurensyrederivatene. Kinoksalin-2,3-dionene har strukturen:

hvori R er H, 5-C1, 7-Cl, 5,7-Cl2, 6,7-Cl2, 6,7-(CH3)2, 6-N02 eller 6,7-(N02)2. Det omtales også et antall N-metylderi-vater. Swartz et al., Mol. Pharmacol. 41:1130-1141 (1992) angir at visse substituerte og usubstituerte benzazapiner er konkurrerende antagonister av glutamatreseptorkanaler i kultiverte kortikale nevroner. Se også internasjonal søknad med publiseringsnr. W092/11854 som angir at forbindelser med formelen

hvori R1-!^4 kan være hydrogen, C1.3perf luoralkyl, halo, nitro eller cyano og R<5> kan være hydrogen eller en C1_5-alkylgruppe, er antagonister av glycinbindingsstedet på NMDA-reseptorkomplekset.

Det er fortsatt et behov for kraftige og selektive glycin/- NMDA-antagonister som: - mangler de PCP-lignende oppførselsmessige bivirkninger som er vanlig for de PCP-lignende NMDA-kanalblokkere slik som MK8 01 eller for de konkurrerende NMDA-reseptorantagonistene

slik som CGS19755,

- viser kraftig anti-ischemisk virkningsfullhet på grunn av den ikke-konkurrerende beskaffenhet av deres glutamat-antagonisme ved NMDA-reseptoren, - krysser blod-hjerne-barrieren ved nivåer som er tilstrekke-lige for virkningsfullhet, - har anvendelighet som nye antikonvulsjonsmidler med mindre bivirkninger enn de PCP-lignende NMDA-kanalblokkere eller

de konkurrerende NMDA-antagonister,

- hjelper til å definere den funksjonelle signifikans av glycinbindingsstedet av NMDA-reseptoren in vivo.

Oppfinnelsen vedrører funnet av en klasse forbindelser som utviser høy affinitet for det stryknin-upåvirkelige glycinbindingsstedet, som ikke utviser PCP-bivirkninger og som krysser blod-hjerne-barrieren ved høye nivåer. Dette er i motsetning til rapporter innen litteraturen om at andre forbindelser, for eksempel spesielle 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner og HA-966 enten ikke krysser blod-hjernebarrieren eller gjør dette ved lave nivåer. I tillegg utviser mange av disse forbindelsene lav bindingsaffinitet til andre reseptor-steder. Den foreligger oppfinnelse vedrører således forbindelser som har høy affinitet for glycinbindingsstedet, mangler PCP-bivirkninger og som krysser blod-hjerne-barrieren ved høye nivåer. Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er således ekstremt nyttige for å behandle patofysiologiske tilstander uten signifikante bivirkninger eller toksisitet.

Oppfinnelsen muliggjør også en metode for å behandle eller forebygge nevronalt tap assosiert med slag, ischemi, CNS-traume, hypoglykemi og kirurgi, så vel som å behandle nevrodegenerative sykdommer omfattende Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom, å behandle eller forebygge de uheldige konsekvenser av overstimulering av de eksitatoriske aminosyrer, så vel som å behandle angst, konvulsjoner, kronisk smerte, psykose og å indusere anestesi, omfattende å administrere til et dyr med behov for slik behandling en forbindelse som har høy affinitet for glycinbindingsstedet, som mangler PCP-bivirkninger og som krysser blod-hjerne-barrieren ved høy nivåer.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse, som er kjennetegnet ved at forbindelsen har formelen

eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvor

R<1> er halo, amino, Cx- C2 acylamino eller nitro,

R2 er amino, nitro eller halo,

R<3> er halo eller haloalkyl, og

R<4> er hydrogen,

med den betingelse at når R<2> er amino da er R<3> ikke halo.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en forbindelse, som er kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen bestående av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-8-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-brom-7-trifluormetyl - 1 , 4 -dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 5-brom-7-fluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et ammoniumsalt, som er kjennetegnet ved at det er et ammoniumsalt av en 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-forbindelse i samsvar med oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det omfatter forbindelsen eller ammoniumsaltet i samsvar med oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Visse svært oppløselige ammoniumsalter av 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dioner er spesielt cholin, tris(2-amino-2-hydroksymetyl-1,3-propandiol, også kjent som trometamin), bis-tris-propan, arginin og N-metyl-glukaminsalter.

1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion kan fremstilles ved en metode omfattende kondensering av en forbindelse som har formelen:

med oksalsyre i en vandig sur oppløsning i en tidsperiode og ved en temperatur som er tilstrekkelig til å bevirke en kondenseringsreaksjon til å gi 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion som har formelen

hvori

R<1> er Cx-C3 acylamino, halo, amino eller nitro,

R2 er nitro, amino eller halo,

R3 er halo eller haloalkyl, og

R4 er hydrogen.

Hvor en hvilken eller hvilke som helst av R1-R2 er amino, starter man med en triaminobenzen hvor minst to av aminogruppene er orto med hensyn til hverandre. Produktet vil være det korresponderende aminosubstituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion, hvor de to orto-aminogruppene har blitt 1,4-nitrogenene av kinoksalindionet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av en forbindelse eller ammoniumsalt i samsvar med oppfinnelsen ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for systemisk behandling og/eller forebygging av: (a) nevronalt tap assosiert med slag, ischemi, CNS-traume, hypoglykemi eller kirurgi, (b) en nevrodegenerativ sykdom valgt fra Alzheimers sykdom,

amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs

syndrom,

(c) de uheldige konsekvenser av hyperaktiviteten til de

eksitatoriske aminosyrer,

(d) de uheldige konsekvenser av hyperaktiviteten til NMDA

reseptoren,

(e) kronisk smerte,

(f) angst,

(g) konvulsjoner, eller

(h) psykoser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av en forbindelse eller ammoniumsalt i samsvar med oppfinnelsen ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for systemisk:

(a) indusering av anestesi, eller

(b) indusering av en hypnotisk effekt.

Beskrivelse av figurene.

Fig. 1 viser et søylediagram som demonstrerer normal,

kontroll-lokomotorisk aktivitet i gerbiler (ørken-rotter) som er forbehandlet med saltoppløsning. Normale kontroll-gerbiler ble gitt intraperitoneale injeksjoner umiddelbart forut for den seks timers vurderingsperioden av lokomotorisk aktivitet. Grupper på 6 gerbiler hver ble anvendt og data er presentert som gjennomsnittet + standardfeil.

Fig. 2 viser et søylediagram som demonstrerer virkningene av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion på lokomotorisk aktivitet, normale kontroll-gerbiler (åpne søyler) og dyr som gis 1,0 mg/kg av forbindelsen (fylte søyler). Gerbiler ble gitt intraperitoneale injeksjoner av forbindelsen umiddelbart før den seks timers vurderingsperioden av lokomotorisk aktivitet. Kontroildyrene ble gitt injeksjoner av saltoppløsning. Grupper på 6 gerbiler hver ble anvendt og data er presentert som gjennomsnittet + standardfeil. Fig. 3 viser et søylediagram som demonstrerer virkningene av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion på lokomotorisk aktivitet, normale kontroll-gerbiler (åpne søyler) og dyr som er gitt 3,2 mg/kg av forbindelsen (fylte søyler). Gerbiler ble gitt intraperitoneale injeksjoner av forbindelsen umiddelbart før den seks timers vurderingsperioden av lokomotorisk aktivitet. Kontroildyrene ble gitt injeksjoner av saltoppløsning. Grupper på 6 gerbiler hver ble anvendt og data er presentert som gjennomsnittet ± standardfeil. Fig. 4 viser et søylediagram som demonstrerer virkningen av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion på lokomotorisk aktivitet i normale kontroll-gerbiler (åpne søyler) og dyr som er gitt 10 mg/kg av forbindelsen. Gerbiler ble gitt intraperitoneale injeksjoner av forbindelsen umiddelbart forut for den seks timers vurderingsperioden av lokomotorisk aktivitet. Kontrolldyr ble gitt injeksjoner av saltoppløsning. Grupper på 6 gerbiler hver ble anvendt og data er presentert som gjennomsnittet ± standardfeil. Fig. 5 viser et søylediagram som demonstrerer virkningen av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion på lokomotorisk aktivitet i normale kontroll-gerbiler (åpne søyler) og dyr som er gitt 32 mg/kg av forbindelsen (fylte søyler). Gerbiler ble gitt intraperitoneale injeksjoner av forbindelsen umiddelbart forut for den seks timers vurderingsperioden av lokomotorisk aktivitet. Kontrolldyr ble gitt injeksjoner av saltoppløsning. Grupper på 6 gerbiler hver ble anvendt og data er presentert som gjennomsnittet + standardfeil. Fig. 6 viser et diagram som demonstrerer virkningen av forbehandling med saltoppløsning umiddelbart forut for begynnelsen av en fem minutters periode av bilateral karotidokklusjon. Dyr ble testet for endringer i lokomotorisk aktivitet i 4 etterfølg-ende timer etter ischemireperfusjonsskade sammenlignet med kontrolldyr som ikke mottar noen karotidarterieokklusjon. Data uttrykkes som gjennomsnittsverdien for hver gruppe av 6 gerbiler som er gitt 5 minutter bilateral karotidokklusjon med forbehandling med saltoppløsning (lukket symbol) eller forbehandlet med saltoppløsning men uten bilateral karotidokklusjon (åpent symbol). Dyrene ble anbragt i lokomotorisk aktivitet-kammere i de 4 etterfølgende timene som indikert. Fig. 7 viser et diagram som demonstrerer virkningene av forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (0,32 mg/kg) umiddelbart forut for begynnelsen av en 5 minutters periode av bilateral karotidokklusjon. Dyrene ble testet for endringer i lokomotorisk aktivitet i 4 etterfølg-ende timer etter ischemireperfusjonsskade. Data uttrykkes som gjennomsnittsverdien for hver gruppe av 6 gerbiler gitt 5 minutter bilateral karotid-okklus jon med medikamentforbehandling (lukket symbol) eller forbehandlet med saltoppløsning men uten bilateral karotidarterieokklusjon (åpent symbol). Dyrene ble anbragt i lokomotorisk aktivitet-kammere i de 4 etterfølgende timer som indikert. Fig. 8 viser et diagram som demonstrerer virkningene av forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion (3,2 mg/kg) umiddelbart forut for begynnelsen av en 5 minutters periode av bilateral karotidokklusjon. Dyrene ble testet for endringer i lokomotorisk aktivitet i 4 etterfølg-ende timer etter ischemireperfusjonsskade. Data uttrykkes som gjennomsnittsverdien for hver gruppe av 6 gerbiler gitt 5 minutter bilateral karotid-okklus jon med medikamentforbehandling (lukket symbol) eller forbehandlet med saltoppløsning men uten bilateral karotidarterieokklusjon (åpent symbol). Dyrene ble anbragt i de lokomotorisk aktivitet-kammere i de 4 etterfølgende timer som indikert. Fig. 9 viser et diagram som viser virkningene av forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (10 mg/kg) umiddelbart forut for begynnelsen av en 5 minutters periode av bilateral karotidokklusjon. Dyrene ble testet for endringer i lokomotorisk aktivitet i 4 etterfølg-ende timer etter ischemireperfusjonsskade. Data uttrykkes som gjennomsnittsverdien for hver gruppe av 6 gerbiler gitt 5 minutter bilateral karotidokklusjon med medikamentforbehandling (lukket

symbol) eller forbehandlet med saltoppløsning men uten bilateral karotidarterieokklusjon (åpent symbol). Dyrene ble anbragt i de lokomotorisk aktivitet-kammere i de 4 etterfølgende timer som indikert.

Fig. 10 viser et diagram som viser virkningene av forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (32 mg/kg) umiddelbart forut for begynnelsen av en 5 minutters periode av bilateral karotidokklusjon. Dyrene ble testet for endringer i lokomotorisk aktivitet i 4 etterfølgende timer etter ischemireperfusjonsskade. Data uttrykkes som gjennomsnittsverdien for hver gruppe av 6 gerbiler gitt 5 minutter bilateral karotidokklusjon med ingen forbehandling (lukket symbol) eller forbehandlet med saltoppløsning men uten bilateral

karotidarterieokklusjon (åpent symbol). Dyrene ble anbragt i de lokomotorisk aktivitet-kammere i de 4 etterfølgende timer som indikert.

Fig. 11 viser et søylediagram som viser virkningene av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion på første times lokomotoriske aktivitets-endringer sammenlignet med saltoppløsning og de ikke-ischemiske kontroilverdier. Disse data

oppsummeres fra de foregående figurer og indikerer at det er en signifikant forbedring i den spontane lokomotoriske aktivitet hos dyrene som er gitt 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ved doser over 0,32 mg/kg i den første timen etter ischemi. I motsetning til dette demonstrerte dyr som ikke ble utsatt for ischemireperfusjonsskade et signifikant høyt nivå av lokomotorisk aktivitet i den første timen med undersøkelse sammenlignet med ischemiske gerbiler.

Fig. 12 viser et søylediagram som viser virkningene av forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion på lokomotorisk aktivitet i den 4. timen med testing etter 5 minutter bilateral

karotidokklusjon. Alle doser av forbindelsen som er signifikant beskyttet mot den lokomotoriske aktivitet øker rutinemessig produsert ved bilaterale karotidokklusjoner på 5 minutter eller mer.

Kontrolldyr som ikke var utsatt for ischemi demonstrerte en lav eksplorativ aktivitet som er normal for friske dyr anbragt i lokomotorisk aktivitet-kammeret i 4 timer. Saltoppløsningsforbehandling unnlot å forstyrre den post -ischemiske forøkelse av lokomotorisk aktivitet som rutinemessig observeres. 0,32-32 mg/kg av forbindelsen reduserte signifikant den ischemiutløste økning i eksplorativ aktivitet innen det sirkulære området av lokomotorisk aktivitet-kammeret. Data uttrykkes som gjennomsnittet av 6 individer ± standardfeil. Fig. 13 viser et søylediagram som viser endringer i lokomotorisk aktivitet som et resultat av behandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (AG1) 24 timer etter ischemi under en 1 times testeperiode. Dyr ble anbragt i de lokomotorisk aktivitet-kammere 24 timer etter ischemi-reperf us j onsskaden og evaluert for endringer i lokomotorisk aktivitet. Kontrolldyr var ikke-ischemiske saltoppløsningskontrolldyr eller ikke-ischemiske medikamentkontrolldyr anbragt i kammeret 24 timer etter saltoppløsnings/medikamentinjek-sjonen. Ischemiske (ISC) dyr representerer dyr som er gitt saltoppløsningsforbehandlinger og anbragt i lokomotorisk aktivitet-kammeret 24 timer etter begynnelsen av ischemireperfusjon. Disse dyrene var også slike som ble testet hver time for de post-ischemiske endringer i lokomotorisk aktivitet som er representert i tidligere figurer. Dyr som er gitt forbehandling med forbindelsen var dyr som er representert i tidligere figurer for de omgående post-reperfusjonsendringer i oppførsel. Alle dyr ble testet ved 24 timer i en periode på 1 time. Fig. 14. viser et søylediagram som viser virkningene av pre-og postbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ved 32 mg/kg. Kontroll (CON) dyr som ikke mottok noe ischemi, saltoppløsn-ingskontrolldyr (SAL) mottok ischemi men med salt-oppløsningsbehandling istedenfor medikament. Forbehandlede dyr som mottok flere injeksjoner på 32 mg/kg ved 6,4 og 2 timer og 3 0 minutter forut for begynnelsen av 5 minutter bilateral karotid-okklus jon. Etterbehandlede dyr mottok doser ved 30 minutter etter reperfusjon, 2 timer, 4 timer og 6 timer. Testing ble utført ved 24 timer etter reperfusjon. Hver gruppe representerer gjennomsnittet ± standardfeil for 6 dyr pr. behandlings-gruppe. Som det kan sees, ga både forbehandling og etterbehandling en signifikant oppførselsmessig beskyttende virkning. En klar indikasjon på beskyttelse ved 32 mg/kg opptrådte. Fig. 15 viser et søylediagram som viser de post-ischemiske endringer i opptreden i en radielt forgrenet labyrint hos gerbiler utsatt for 5 minutter av bilateral karotidokklusjon 24 timer tidligere og forbehandlet med de indikerte doser av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Dyr ble testet umiddelbart etter lokomotorisk akti-vitetstesting for patruljerende oppførsel i en 8-forgrenet labyrint. Denne 8-forgrenede labyrinten er lokalisert i et rom hvor det ikke ble utført noe annet forsøk. Alle 8 grenene var ident-iske i dimensjoner og i figurasjon. Ingen grener var utstyrt med lokkemat. Dyrene ble testet inntil de hadde kommet inn i og utforsket hver av de 8 grenene. Inntreden i en tidligere besøkt gren definerte en feil. Alle dyr fullførte hele den eksploritative oppgaven før de ble fjernet. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± standardfeil for 6 dyr pr. behandlingstilstand. Kontrolldyr mottok intet ischemi, saltoppløsnings (SAL) dyr mottok ischemi men intet medikament. Dyr som mottar ischemi pluss behandling med 0,32-32 mg/kg medikament viste en signifikant oppførselsmessig beskyttelse fra ischemiinduserte endringer i patruljerende oppførsel. Fig. 16 viser et søylediagram som viser virkningene av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-forbehandlingsdoser på nevronal celledensitet i dorsal hippocampus (CA-1) til gerbilen. Gerbiler ble forbehandlet med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion-doser som beskrevet i de

tidligere figurer og tillatt å komme seg etter ischemireperfusjonsskaden i 7 døgn forut for bedøv-else og fiksering av vevet. Vev ble frosset, snittet og farget, og nevronale kjerner ble tellet i adskilte områder av CA-1 regionen av hippocampus. Data presenteres som gjennomsnittet ± standardfeil for 6 individer (hvert individ ble evaluert for et minimum av 3 etterfølgende snitt av dorsal hippocampus for nevronalt tap). Forbehandling med

0,32-32 mg/kg av medikamentet ga en signifikant beskyttelse fra ischemiindusert nevronalt celletap.

Fig. 17 viser et søylediagram som viser virkningene av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion på nevronal densitet i dorsal hippocampus (CA-1) til gerbilen. Gerbiler ble forbehandlet og etterbehandlet med 3,2 mg/kg 5-klor-7-trifluormetyl - 1 , 4 -dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og tillatt å komme seg etter ischemireperfusjonsskaden i 7 døgn før bedøvelse og fiksering av vevet. Vev ble

frosset, snittet og farget, og nevronale kjerner ble tellet i adskilte områder av CA-1. Data presenteres som gjennomsnittet + standardfeil for 6 individer (hvert individ ble evaluert for et minimum av 3 etterfølgende snitt av dorsal hippocampus for nevronalt tap). Både forbehandling og etterbehandling med 3,2 mg/kg medikament ga en signifikant beskyttelse fra ischemiindusert nevronalt celletap.

Fig. 18 viser et søylediagram som viser inhiberingen av formalinindusert smerte i mus ved 1, 5, 10, 20, 30 og 40 mg/kg av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion. Mus ble injisert intraperitonealt med enten DMSO (vehikkelkontroll) eller med medikamentet i DMSO 3 0 minutter forut for subkutan injeksjon av 20 /il av 5 % formalin inn i plantaroverflaten av bakpoten. Musene ble deretter

observert og den tid som musene brukte på å slikke den injiserte bakpoten i fem minutters intervaller under de indikerte tidsperiodene ble registrert.

Den tiden som ble brukt til slikking av den injiserte bakpoten er en indikator på den smerte som oppleves av dyret. Som vist i fig. 18, inhiberte 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion den formalininduserte slikkingen på en doseavhengig måte hvilket indikerer kraftig antinociseptiv virkningsfullhet i denne dyremodellen av kronisk smerte.

Fig. 19 viser et søylediagram som viser inhiberingen av formalinindusert smerte i mus ved 5, 10, 20 og 40 mg/kg av 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Mus ble injisert intraperitonealt med enten DMSO (vehikkelkontroll) eller med medikamentet i DMSO 3 0 minutter forut for subkutan injeksjon av 20 ml 5 % formalin inn i plantaroverflaten av bakpoten. Musene ble deretter observert og den tid som musene brukte på å slikke den injiserte bakpoten i fem minutters intervaller under de

indikerte tidsperioder ble registrert. Den tiden som ble brukt til slikking av den injiserte bakpoten er en indikator på den smerte som dyret opplever. Som vist i fig. 19, inhiberte 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion den formalininduserte slikkingen på en doseavhengig måte hvilket indikerer kraftig antinociseptiv virkningsfullhet i denne dyremodellen av kronisk smerte.

Fig. 20A

og 20B viser linjediagrammer som viser inhiberingen av formalinindusert smerte i mus ved 1, 5, 10, 20 og 4 0 mg/kg av 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion. Mus ble injisert intraperitonealt med enten DMSO (vehikkelkontroll) eller med medikamentet i DMSO 3 0 minutter forut for subkutan injeksjon av 20 ml av 5 % formalin inn i plantar-overf laten av bakpoten. Musene ble deretter

observert og den tid som musene brukte på å slikke den injiserte bakpoten i fem minutters intervaller under de indikerte tidsperioder ble registrert. Den tiden som ble brukt på å slikke den injiserte

bakpoten er en indikator på den smerte som dyret opplever. Som vist i figurer 20A og 20B, inhiberte 6,7-dibrom-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion den formalininduserte slikkingen på en doseavhengig måte både i den tidlige fase (0-5 minutter; fig.

20A) av smerte (slikking) responsen og i den sene fasen (15-50 minutter; fig. 20B) av smerteslikkingsresponsen hvilket indikerer kraftig antinociseptiv virkningsfullhet i denne dyremodellen av kronisk smerte. Fig. 21 viser et diagram som viser oppløselighetene av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, cholinsaltet, monokaliumsaltet og dikaliumsaltet derav. Fig. 22A viser en graf som viser den sedative aktiviteten (tap av opprettingsrefleks) av mus over tid etter i.p.-injeksjon av 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (forbindelse nr. 1, se fig. 22B) sammenlignet med 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (forbindelse nr. 2, se fig. 22B, inaktiv) og ketamin (forbindelse nr. 3, se fig. 22B).

Fig. 23A

og 23B viser diagrammer som viser virkningene av ulike doser av PCP, 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-di - hydrokinoksalin-2,3-dion i rotter som er trenet til å skjelne 2 mg/kg PCP fra saltoppløsning. Fig. 23A viser grad av PCP-lignende virkninger som vist i den gjennomsnittlige prosentdel av PCP-spak-utvelg-else. Fig. 23B viser virkningene på totale respon-deringsrater. Verdier over SAL, PCP og DMSO viser resultatene av kontrollforsøk med saltoppløsning, 2 mg/kg PCP og 0,5 ml/kg DMSO utført forut for

testingen av PCP, 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-di - hydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion. Verdier representerer gjennomsnittet for seks rotter.

Fig. 24 viser et søylediagram som viser den lokomotoriske aktiviteten av Swiss/Webster-mus etter intraperitoneal injeksjon av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i DMSO eller MK801 i saltoppløsning. Grupper av minst seks mus hver ble injisert med vehikkel eller med økende doser av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i DMSO eller MK801 i saltoppløsning. Lokomotorisk aktivitet ble deretter registrert i fire etterfølg-ende 15 minutters perioder. Den lokomotoriske aktiviteten i det andre 15 minutters intervallet er vist.

Den foreliggende forbindelse vedrører forbindelser som har høy affinitet for glycinbindingsstedet, som mangler PCP-bivirkninger og som krysser blod-hjerne-barrieren ved høy nivåer. Slike forbindelser er 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som er svært selektive, konkurrerende antagonister av glycinbindingsstedet av NMDA-reseptoren.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionene som har formelen:

eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvor

R<1> er halo, amino, C1-C3 acylamino eller nitro,

R2 er amino, nitro eller halo,

R<3> er halo eller haloalkyl, og

R<4> er hydrogen,

med den betingelse at når R2 er amino da er R3 ikke halo.

Foretrukne forbindelser er slike hvor R<1> er halo eller nitro, R2 er nitro eller halo, R3 er halo eller haloalkyl og R<4> er hydrogen. Andre foretrukne forbindelser er slike hvor en av R1R4 er amino. Spesielt foretrukne forbindelser er slike hvor R<1> er amino eller nitro, R<2> er halo, R<3> er halo eller haloalkyl og R<4> er hydrogen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dionene valgt fra gruppen bestående av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-8 - nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-brom-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-brom-7-fluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Typiske halogrupper omfatter fluor, klor, brom og jod.

Typiske haloalkylgrupper omfatter C1.6 alkylgrupper substituert med en eller flere fluor-, klor-, brom- eller jod-atomer, f.eks. fluormetyl-, difluormetyl-, trifluormetyl-, pentafluoretyl-, 1,1-difluoretyl- og triklormetylgrupper.

Typiske C1_6 alkylgrupper omfatter metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, neopentyl, heksyl, 2-heksyl, 3-heksyl, 2-metyl-1-pentyl, 3-metyl-1-pentyl, 4-metyl-1-pentyl, og lignende.

Typiske aminogrupper omfatter -NH2, NHR<9> og -NR<9>R10, hvori R<9 >og R<10> er en av C1.6 alkylgruppene som er nevnt i det foregående .

Typiske C-l-C^ acylaminogrupper omfatter en aminogruppe substituert med en C2_3 acylgruppe, f.eks. acetyl- og propionyl-gruppper.

Spesielt foretrukne kinoksalin-2,3-dioner i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omfatter 6,7-diklor-5-nitro-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 6-klor-5-nitro-7-brom-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 6,7-diklor-5-brom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 5-klor-6-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2.3- dion, 6-klor-5-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-8-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 5-klor-6,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2, 3-dion, 5-brom-6,7-difluor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5,7-dibrom-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-brom-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-brom-7-fluor-1.4- dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dibrom-5-nitro-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-amino-6,7-dibrom-l,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 5-amino-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion, og 6-amino-5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Spesielt foretrukne forbindelser er 6,7-diklor-5-nitro-l,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 6,7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-5-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion og 7-brom-6-klor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion. 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion forebygger ischemiindusert nervecelledød i den globale ischemimodell for gerbiler etter i.p. administrering. 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-klor-7-trifluormetyl - 1 , 4 -dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion er kraftige antikonvulsjonsmidler i minst to av tre dyremodeller etter i.p. administrering . 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble også funnet å utvise analgesisk virkningsfullhet etter i.p. administrering i et dyr med kronisk (formalinindusert) smerte.

Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse viser lav kryssreaktivitet med kainat-, AMPA- og quisqualat-reseptorer og glutamat- og PCP-bindingssteder av NMDA-reseptorene, og er derfor i motsetning til hvilke som helst tidligere beskrevne 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner, spesielt 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6,7-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion som angitt i U.S. patent nr. 4,975,430.

Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er aktive ved behandling eller forebygging av nevronalt tap, nevrodegenerative sykdommer, kronisk smerte, de er aktive som antikonvulsjonsmidler og induserer anestesi uten uheldige bivirkninger forårsaket av ikke-selektiv binding med andre reseptorer, spesielt kainat-, AMPA- og quisqualat-reseptorer og PCP- og glutamatreseptorene assosiert med NMDA-reseptoren. I tillegg er forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse effektive ved behandling eller forebygging av uheldige konsekvenser av hyperaktiviteten av de eksitatoriske aminosyrer, f.eks. dem som er involvert i NMDA-reseptor-systemet, ved å blokkere glycinreseptorene og å hindre ligandport-kationkanalene fra å åpne og tillate overdreven innstrømning av Ca<++> inn i nevroner, hvilket forekommer under ischemi.

Nevrodegenerative sykdommer som behandles med forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omfatter dem valgt fra gruppen bestående av Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom.

Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse finner spesiell anvendbarhet ved behandlingen eller fore-byggingen av nevronalt tap assosiert med et flertall slag som gir opphav til demens. Etter at en pasient har blitt diagno-stisert til å lide av et slag, kan forbindelsen i samsvar med den foreliggende oppfinnelse administreres for å bedre den umiddelbare ischemi og å hindre ytterligere nevronal skade som kan inntreffe fra tilbakevendende slag.

Dessuten er forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse i stand til å krysse blod/hjernebarrieren, i motsetning til 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og andre 6,7-di-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som er ute av stand til å krysse blod/hjernebarrieren etter i.p. administrering (se Turski, L., et al., J. Pharm. Exp. Ther. 260:742-747 (1992)). Se også Sheardown et al., Eur. J. Pharmacol. 174:197-204 (1989), som angir at 5,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion har dårlig tilgang til sentralnervesystemet.

For at en forbindelse skal begynne å vise in vivo virkningsfullhet og således evnen til å krysse blod-hjerne-barrieren, bør forbindelsen utvise en ED50 på mindre enn omtrent 100 mg/kg kroppsvekt av dyret. Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse utviser foretrukket en ED50 på mindre enn omtrent 2 0 mg/kg, og mer foretrukket mindre enn omtrent 10 mg/kg.

Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse finner spesiell anvendbarhet ved behandling eller forebygging av de uheldige nevrologiske konsekvenser av kirurgi. Koronar by-pass kirurgi krever for eksempel anvendelsen av hjerte-lungemaskiner som tenderer til å innføre luftbobler i krets-løpet som kan avsettes i hjernen. Tilstedeværelsen av slike luftbobler frarøver nevronalt vev oksygen, hvilket resulterer i anoksi og ischemi. Pre- eller post-kirurgisk administrering av 1,4-dihydrokinoksaliner i samsvar med den foreliggende oppfinnelse vil behandle eller forebygge den resulterende ischemi. Foretrukket administreres forbindelsen i samsvar med den foreliggende oppfinnelse til pasienter som undergår kardiopulmonal by-passkirurgi eller karotidendarte-rektomikirurgi.

Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse finner også anvendbarhet ved behandling eller forebygging av kronisk smerte. Slik kronisk smerte kan være resultatet av kirurgi, traume, hodepine, artritt eller annen degenerativ sykdom. Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse finner spesiell anvendelse i behandlingen av fantomsmerte som resulterer fra amputering av en ekstremitet. I tillegg til behandling av smerte er forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse også nyttige ved indusering av anestesi, enten generell eller lokal anestesi, for eksempel under kirurgi.

Et totalt antall på mer enn 30 1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion-derivater har blitt syntetisert og testet for glycin-antagonistaktivitet in vivo. Blant disse nye medikamentene har flere forbindelser med en spesielt høy affinitet for glycin/NMDA-reseptorer blitt identifisert. Fra undersøkelse av strukturen av de kraftigste analogene fremkommer det at kombinasjonen av en N02-gruppe med to halogenatomer, f . eks. klor eller brom, eller med en Cl- og en CF3-gruppe i 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-ringsystemet gir spesielt kraftige glycinantagonister. Faktisk er 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6,7-diklor-5-nitro-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion, med affiniteter på henholdsvis 6 nM og 8 nM for glycinbindingsstedet, de kraftigste glycin/NMDA-antagonistene som er oppdaget frem til nå. Det verdt å merke seg at N02-gruppen i 6,7-diklor-5-nitro-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion-forbindelse har økt, med flere hundre ganger, glycinreseptoraffiniteten av sin opphavsfor-bindelse, 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (DCQX), som har blitt beskrevet av andre som en kraftig og selektiv glycinantagonist (Yoneda og Ogita, Biochem. Biophy. Res. Commun. 164:841-849 (1989). Det er overraskende mulig å redusere nitrogruppen av 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion for å oppnå aminosubstituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som også har høy bindingsaffinitet til glycinbindingsstedet .

Fordi 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner, spesielt CNQX og DNQX, er kjent for å være sterke kainat- og AMPA-antagonister, ble de nye forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse testet i kainat- og AMPA-bindingsanalyser for å bestemme kryssreaktivitet ved disse ikke-NMDA-reseptorene . De sterke glycinantagonistene ble funnet å ha ingen signifikant kryssreaktivitet ved kainat- og AMPA-stedene eller kun mindre kryssreaktivitet. Oppfinnelsen vedrører således også forbindelser som er kraftige glycinantagonister men som utviser liten eller ingen kryssreaktivitet ved kainat- og AMPA-stedene.

Foretrukket utviser forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse en bindingsaffinitet til glycinbindingsstedet på K^ = omtrent 10 /iM eller mindre, mer foretrukket 1 fiM eller mindre, og mer foretrukket 500 nM eller mindre og mer foretrukket 100 nM eller mindre, og mest foretrukket omtrent 10 nM eller mindre. Også foretrukket er forbindelser som utviser binding ved kainat- og AMPA-stedene på ikke mindre enn Ki = 1 /zM, og mer foretrukket ikke mindre enn 10 /iM.

De nye glycinantagonistene ble deretter testet for in vivo aktivitet etter intraperitoneal injeksjon ved anvendelse av et antall antikonvulsive tester i mus (audiogen anfalls/slag-modell i DBA-2 mus, pentylentetrazol-induserte anfall i mus, NMDA-indusert død i mus). Alle forbindelsene som ble testet viste aktivitet i en eller flere av de tre modellene. 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (forbindelse nr. 1, tabell IV) var den kraftigste av de fem, spesielt i den autogene anfallsmodellen (ED50 = 5 mg/kg) og den NMDA-induserte dødsmodellen (ED50=20 mg/kg). 6,7-dibrom-5-nitro-1, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (forbindelse nr. 13, tabell IV) var også svært kraftig, spesielt i den audiogene anfallsmodellen (ED50=10 mg/kg). Disse to forbindelsene utviste imidlertid avvikende tilbøyeligheter til å forårsake ataksi-bivirkninger som bestemt ved rotorod (dreiemuskel) ataksitesten i musen. Spesielt 6,7-dibrom-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion utviste en TD50 = 200 mg/kg i denne testen. Denne forbindelsen er således effektiv i å forebygge anfall ved doser som er mye lavere enn slike som forårsaker ataksi-bivirkninger. Dette kan sammenlignes med en TD50 = 2 7 mg/kg i rotorod-ataksitesten for 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Oppfinnelsen vedrører således også forbindelser som utviser ataksi-bivirkninger i rotorod-ataksitesten ved doserings-nivåer på mer enn omtrent 100 mg/kg, mer foretrukket mer enn omtrent 200 mg/kg.

To forbindelser (nr. 1 (tabell IV) og 5-klor-7-trifluormetyl-5 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (forbindelse nr. 2 (tabell IV)) ble også testet for nevrobeskyttende virkningsfullhet etter intraperitoneal injeksjon i den globale gerbil-ischemi-modellen og ble funnet til å ha kraftig nevrobeskyttende

virkningsfullhet i denne paradigmaen. De samme forbindelsene ) ble også testet i medikamentdiskrimineringstester i rotter som er trenet til å skjelne (diskriminere) PCP fra saltopp-løsning. Ingen av de to forbindelsene generaliserte til PCP ved noen dose i disse medikamentdiskrimineringsstudiene. I

tillegg ga ingen av forbindelsene en oppførselsmessig eksita-5 sjon i lokomotoriske aktivitetstester i musen. Resultatene fra disse studiene antyder at de nye glycinantagonistene i

samsvar med den foreliggende oppfinnelse ikke viser de PCP-lignende oppførselsmessige bivirkninger som er vanlig for

NMDA-kanalblokkere slik som MK801 og PCP eller for konkurrer-3 ende NMDA-antagonister slik som CGS19755.

Det er viktig at de nye glycinantagonistene viste kraftig aktivitet in vivo etter intraperitoneal injeksjon hvilket

antyder at disse forbindelsene kan penetrere blod/hjerne-

5 barrieren. Andre undersøkelser har rapportert at 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion-analogene CNQX og DNQX ikke kan trenge gjennom blod/hjernebarrieren (Turski, L., et al., J. Pharm. Exp. Ther. 260:742-747 (1992)), et funn som har blitt

bekreftet av oppfinnerne. Endringer i benzenringsubstitu-o entene av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionene resulterer til-synelatende ikke bare i en dramatisk økning i glycinresep-toraffinitet og tap i AMPA/kainatreseptoraffinitet men kan også gi forbindelser med en ganske tilfredsstillende evne til

å trenge gjennom blod/hjerne barrieren (se Turski L., et al., 5 J. Pharm. Exp. Ther. 260:742-747 (1992)).

Forut for den foreliggende oppfinnelse var en av de primære farmakoforer for glycinantagonisme antatt å være amidgruppen i 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindionet med forøkelse av styrke som inntreffer med substitusjonen av elektronborttrekkende substituenter på den aromatiske ringen, som således senker pKa av amidhydrogenet (Gray et al., J. Med. Chem. 34:1283

(1991), Leeson, P.D., et al., J. Med Chem. 34:1243 (1991)). Mens studiene som er beskrevet i denne oppfinnelsen generelt har bakgrunn i dette forslaget, har det nå blitt oppdaget at de relative posisjoner av substituentene på ringen så vel som identiteten av de elektronborttrekkende grupper også er viktig. Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot dette funnet.

Det har videre blitt funnet at en eller begge av amidhydro-genene kan erstattes av amin-, hydroksy-, karboksyalkyl- og karboksyaralkylgrupper og at de resulterende forbindelsene bibeholder høy binding til glycinreseptoren.

Den kraftigste nye antagonisten som er del av denne oppfinnelsen er 6 , 7-dibrom-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (Ki = 6 nM). Den nest kraftigste antagonisten er 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (Ki = 8 nM). Andre kraftige antagonister omfatter en blanding av nitrert 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (3x og 3y tabell I, og forbindelser nr. 3 og nr. 4, tabell IV). En annen kraftig antagonist som er syntetisert i 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion-serien er 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (3h, tabell I og forbindelse nr. 2, tabell IV). Et annet derivat med merkbar men mye lavere styrke er 6-nitro-7-(trifluormetyl)-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (3k, tabell I). Plasseringen og typen av elektronborttrekkende gruppe på ringen synes å være viktig, da substitusjoner på 5- og 7-posisjonene av 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindionringen synes å forøke styrken av glycinbindingsstedet. Substitusjon ved 6-posisjonen med ioniserbare grupper som sulfonater, primære sulfonamider (3 l-n, tabell I) og karboksylsyrer ødelegger forbindelsenes bindingsevne til glycinreseptoren. Hverken alkylering av sulfonamidet (3 o-p, tabell I) eller metylering av syren fører til økt aktivitet. Metylering av amidnitrogenet i kinoksalinringen ødelegger også bindingsevnen til forbindelsen, som vist ved mangelen på aktivitet av 6,7-dinitro-N-metyl-1,4-dihydro-2,3 - kinoksalindion. Syntese av pyridinanalogen og en pteridin-analog av 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion ga inaktive forbindelser .

Et annet viktig aspekt ved den foreliggende oppfinnelse ved-rører det funn at aminosubstituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner også har høy bindingsaffinitet til glycinbindingsstedet. Dette var uventet i lys av det faktum at aminogrupper er elektrondonerende og den forventning at elektronborttrekkende grupper er viktige for høy bindingsaffinitet.

De syntetiserte forbindelser for testing som potensielle glycinantagonister er oppsummert i det etterfølgende (tabell I). De fleste var tilgjengelige ved enkel kondensering av dietyloksalat med den tilsvarende diaminobenzen i samsvar med Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962). Det har også blitt oppdaget at 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindionene lett kan fremstilles i høyt utbytte ved å oppvarme oksalsyre og det tilsvarende o-diamin til omtrent 100 til omtrent 140°C i 1 til 10 timer i nærvær av en sterk mineralsyre slik som HC1, H2S04 , H3P04 og lignende. I en foretrukket utførelse opp-varmes oksalsyre og o-diamin til 125°C i 2N HC1 i 2,5 timer til å gi det tilsvarende 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion i høyt utbytte. 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindioner i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles ved denne forbedrede fremgangsmåten .

De o-diaminobenzenene man går ut fra er enten tilgjengelige direkte fra fabrikanten eller var lett tilgjengelige via reduksjon av det tilsvarende o-nitroanilin (skjema I, ligning 1), ifølge Bellamy, F.D. og Ou, K., Tetr. Lett. 25:839

(1984) . Nitreringer ble utført ved behandling av 1,4-dihydro-kinoksalin-2,3-dionet med KN03 i konsentrert H2S04 (skjema I, ligning 2). 5-halo-6,7-difluor-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindionene ble fremstilt ved behandling av 4,5-difluor-2-nitroanilin med N-bromsuccinimid eller N-klorsuccinimid (Mitchell, R.H., et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)), etterfulgt av reduksjon og kondensering med dietyloksalat. Forbindelsene ble testet for potensiell glycinantagonist-aktivitet ved å observere inhiberingen av binding av 1 fiM glycinstimulert [<3>H]-MK-801 i rotte- eller marsvinhjerne-membranhomogenater. Jo kraftigere glycinantagonist, jo mindre [<3>H]-MK-801 kan binde siden [<3>H]-MK801-bindingsstedet (PCP-reseptor) kun er tilgjengelig ved åpning av ionekanalen ved hjelp av glutamat og glycin (Fletcher, E.L., et al., i Glycine Neurotransmission, Otterson, P., et al. (forf.), John Wiley and Sons (1990), Johnson, J.W., et al., Nature 325:529

(1987)) .

Sulfonater og derivater ble fremstilt ved behandling av opp-havsforbindelsen 1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion med klorsul-fonsyre og etterfølgende behandling med det ønskede amin for å danne sulfonamidet (skjema I, ligning 3). Se Mitchell et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979). 5-brom-7-fluor-l, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet ble fremstilt ved behandling av 4-fluor-2-nitroanilinet med N-bromsuccinimid etterfulgt av reduksjon og kondensering med dietyloksalat.

Den anxiolyttiske aktivitet av en hvilken som helst spesiell forbindelse i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan bestemmes ved anvendelse av en hvilken som helst av de anerkjente dyremodeller for angst. En foretrukket modell er beskrevet av Jones, B.J. et al., Br. J. Pharmacol. 93:985-993

(1988) . Denne modellen involverer å administrere den aktu-elle forbindelsen til mus som har et høyt angst-basalnivå. Testen er basert på det funn at slike mus utviser aversjon mot å bli tatt fra mørke hjemlige omgivelser i et mørkt testerom og anbragt i et område som er malt hvitt og sterkt opplyst. Testboksen har to rom, et hvitt og sterkt opplyst og et svart og uopplyst. Musen som har tilgang til de rommene via en åpning ved gulvnivå i skilleanordningen mellom de to rommene. Musene anbringes i sentrum av det sterkt opplyste området. Etter lokalisering av åpningen til det mørke området har musene fri anledning til å spasere frem og tilbake mellom de to rommene. Kontrollmus tenderer til å tilbringe en større andel tid i det mørket rommet. Når de gis et anxiolyttisk middel tilbringer musene mer tid med å utforske det nyere opplyste rommet og utviser en forsinket latens til å bevege seg mot det mørket rommet. Dessuten utviser musene behandlet med det anxiolyttiske middel mer oppførsel i det hvite rommet, som målt ved eksploratoriske oppreisninger og linjekryssinger. Siden musene kan venne seg til testsituasjonen bør det alltid anvendes naive mus i testen. Fem parametere kan måles: latensen til å bevege seg inn i det mørke rommet, tiden som tilbringes i hvert område, antall overganger mellom rommene, antall linjer som krysses i hvert rom, og antallet oppreisninger. Administreringen av forbindelsene forventes å resultere i at musene tilbringer mer tid i det større, kraftig opplyste området av test-kammeret.

I den lyse/mørke eksplorasjonsmodellen kan den anxiolyttiske aktiviteten av et putativt middel identifiseres ved økningen av antallet linjekryssinger og oppreisninger i det lyse rommet på bekostning av antallet linjekryssinger og oppreisninger i det mørke rommet, sammenlignet med kontroll-musene.

En andre foretrukket dyremodell er testen av rotters sosiale interaksjon beskrevet av Jones, B.J. et al., supra, hvori den tid som to mus tilbringer i sosial interaksjon kvantifiseres. Den anxiolyttiske aktiviteten av et putativt middel identifiseres ved den økning i tid som par av hannrotter tilbringer i aktiv sosial interaksjon (90 % av oppførselen er av under-søkende natur). Både familiæriteten og lysnivået i testarenaen kan manipuleres. Ikke-medikamentbehandlede rotter viser det høyeste nivå av sosial interaksjon når testarenaen er familiær og er opplyst av svakt lys. Sosial interaksjon avtar hvis arenaen er ufamiliær for rottene eller er opplyst av sterkt lys. Anxiolyttiske midler avverger denne avtagn-ingen. Det totale nivå av motorisk aktivitet kan også måles for å tillate påvisning av medikamentvirkninger som er spesifikke for sosial oppførsel.

Forbindelsene omtalt heri er også anvendelige som sedativ-hypnotika. Det ble funnet at glycin/NMDA-antagonisten 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion har kraftig sedativ/søvndyssende (hypnotisk) aktivitet etter i.v. injeksjon i mus. I motsetning til dette er 6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion fullstendig fri for sedativhypnotisk aktivitet (se fig. 22A). 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion er betydelig mer kraftig og langvarig som et sedativ-hypnotikum enn ketamin, en NMDA-kanalblokker som anvendes som et anestetikum i mennesker.

Bindingsaffiniteten av 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (Ki=0,9 izM) ved glycinreseptoren er ikke vesentlig forskjellig fra den av 6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (Ki = 0,33 /iM) . Også kainat- og AMPA-bindingsaf f initeten av 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er ikke vesentlig forskjellige. Det er således sannsynlig at forskjellen i sedativ/hypnotisk aktivitet mellom de to forbindelsene skyldes det faktum at 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion lett trenger gjennom blod/hjernebarrieren, mens 6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion ikke gjør dette. Den samme forskjellen i in vivo virkningsfullhet mellom disse to forbindelsene har også blitt observert i de antikonvulsive virkningsfullhets-testene.

Preparater innenfor rammen av denne oppfinnelsen omfatter alle preparater hvori forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er inneholdt i en mengde som er effektiv for å oppnå sitt tiltenkte formål. Mens individu-elle behov varierer, er bestemmelse av optimale områder av effektive mengder av hver komponent kunnskaper som besittes av en fagmann innen området. Forbindelsene kan typisk administreres til pattedyr, f.eks. mennesker, oralt ved en dose på 0,0025 til 50 mg/kg, eller en ekvivalent mengde av det farmasøytisk tålbare salt derav, pr. døgn av kroppsvekten av pattedyret som behandles for angstsykdommer, f.eks. gene-ralisert angstsykdom, fobiske sykdommer, obsesjonskompulsiv sykdom, panisk sykdom, og post-traumatiske stressykdommer. Omtrent 0,01 til omtrent 10 mg/kg administreres foretrukket oralt for å behandle eller forebygge slike sykdommer. For intramuskulær injeksjon er dosen generelt omtrent halvparten av den orale dosen. For behandling eller forebygging av f.eks. angst vil en passende intramuskulær dose være omtrent 0,0025 til omtrent 15 mg/kg, og mest foretrukket fra 0,01 til omtrent 10 mg/kg.

I en metode for å behandle eller forebygge nevronalt tap ved ischemi, hjerne- og ryggmargtraume, hypoxia, hypoglykemi og kirurgi, så vel som for behandling av Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom, eller i en metode for å behandle en sykdom hvori patofysiologien av sykdommen involverer hyperaktivitet av de eksitatoriske aminosyrene eller NMDA-reseptor-ionekanal-relatert nevrotoksisitet, kan de farmasøytiske preparatene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omfatte forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse ved et enhetsdosenivå på omtrent 0,01 til omtrent 50 mg/kg kroppsvekt, eller en ekvivalent mengde av det farmasøytisk tålbare saltet derav, ved en kur på 1-4 ganger pr. døgn. Når anvendt for å behandle kronisk smerte eller for indusere anestesi, kan forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen administreres ved et enhetsdoseringsnivå på fra omtrent 0,01 til omtrent 50 mg/kg kroppsvekt, eller en ekvivalent mengde av det farmasøytisk tålbare saltet derav, ved en kur på 1-4 ganger pr. døgn. Det skal naturligvis forstås at det eksakte behandlingsnivået vil avhenge av forhistorien til det enkelte dyr, f.eks. det mennesket, som behandles. Det nøyaktige behandlingsnivå kan bestemmes av en fagmann innen området uten unødig eksperimentering.

Den orale enhetsdosen kan omfatte fra omtrent 0,01 til omtrent 50 mg, foretrukket omtrent 0,1 til omtrent 10 mg av forbindelsen. Enhetsdosen kan administreres en eller flere ganger daglig som en eller flere tabletter som hver inneholder fra omtrent 0,1 til omtrent 10, hensiktsmessig omtrent 0,25 til 50 mg av forbindelsen eller dens solvater.

I tillegg til å administrere forbindelsen som et råkjemikalie kan forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen administreres som del av et farmasøytisk preparat inneholdende egnede farmasøytisk tålbare bærere omfattende eksipienser og hjelpestoffer som letter bearbeiding av forbindelsene til preparater som kan anvendes farmasøytisk. Preparatene, spesielt de preparater som kan administreres oralt og som kan anvendes for den foretrukne type administrering, slik som tabletter, drasjeer og kapsler, og også preparater som kan administreres rektalt, slik som suppositorier (stikkpiller), så vel som egnede oppløsninger for administrering ved injeksjon eller oralt, inneholder foretrukket fra omtrent 0,01 til 99 %, mer foretrukket fra omtrent 0,25 til 75 % aktiv(e) forbindelse (r), sammen med eksipiensen.

Også inkludert innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse er de ikke-toksiske farmasøytisk akseptable saltene av forbindelsene i samsvar med den foreliggende forbindelse. Syreaddisjonssalter dannes ved å blande en oppløsning av forbindelsen med en oppløsning av en farmasøytisk tålbar ikke-toksisk syre slik som saltsyre, fumarsyre, maleinsyre, ravsyre, eddiksyre, sitronsyre, vinsyre, karbonsyre, fosfor-syre, oksalsyre og lignende. For eksempel dannes basiske salter ved å blande en oppløsning av 1,4-dihydrokinoksalin-2.3- dion med en oppløsning av en farmasøytisk tålbar ikke-toksisk base slik som natriumhydroksyd, natriumkarbonat og lignende.

Foretrukne salter av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionene i samsvar med oppfinnelsen er de svært oppløselige salter som omfatter et C3.24 ammonium-motion, hvori en av alkylgruppene kan være substituert med en hydroksygruppe. De fleste 1.4- dihydrokinoksalin-2,3-dioner er svært uoppløselige i vandig oppløsning. Således er i.v. administreringen av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner begrenset av den relative uoppløseligheten av det aktive middel. De svært oppløselige ammoniumsaltene kan være framstilt ved for eksempel opp-løsning av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet i en oppløsning av en molar ekvivalent av det tilsvarende ammoniumhydroksyd eller aminoforbindelse.

Ammonium-motionene kan være kvarternære ammoniumkationer eller mono-, di- eller trisubstituerte aminer som danner protonerte ammoniumsalter når blandet med et 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion i oppløsning.

Monocholinsaltet av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionene har en pH på omtrent 7,8-9,8, avhengig av det 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion som anvendes. Alternativt kan 1,4-dihydrokinoksalin-2, 3-dion først oppløses i en oppløsning inneholdende 2 molare ekvivalenter av ammoniumhydroksydet. Dicholinsaltet kan isoleres eller pH i oppløsningen kan justeres til omtrent 7,8-9,8 med 1 ekvivalent eddiksyre.

Ammoniumsaltet av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionene kan lett isoleres i ren form ved frysetørking av oppløsningen til å gi et tørt pulver som er svært oppløselig i vann. Opptil 90 mg/ml eller mer av monocholinsaltet av et 1,4-dihydrokinoksalin-2, 3-dion vil oppløses i vann til å gi en klar oppløsning. Saltet kan også oppløses i en isotonisk glukoseoppløsning som er egnet for i.v. injeksjon.

Eksempler på 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som kan opp-løseliggjøres i oppfinnelsens sammenheng omfatter dem som er angitt heri så vel dem som er omtalt i U.S. patenter nr. 5,109,001, 5,081,123, 5,079,250, 5,075,306, 5,057,516, 5,026,704, 5,061,706, 4,977,155, 4,975,430, 4,889,855, 4,812,458, 3,992,378, 3,962,440, 4,812,458, 4,659,713, 4,94 8,7 94, internasjonal søknad med publiseringsnr. W091/13878, Yoneda og Ogita, Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:841-849 (1989), Kleckner og Dingledine, Mol. Pharm. 36:430-436 (1989), Rao, T.S. et al., Neuropharmacology 29:1031-1035 (1990), Pellegrini-Giampietro, D.E. et al., Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286 (1989), Ogita og Yoneda, J. Neurochem. 54:699-702 (1990), Kessler, M. et al., Brain Res. 489:377-382 (1989), europeiske patentsøknader med publiser-ingsnummere 0 377 112, 0 315 959 og 260,467, Lester, R.A. et al., Mol Pharm. 35:565-570 (1989), Patel, J. et al., J. Neurochem. 55:114-121 (1990), Horner, L. et al., Chem. Abstracts 48:2692 (1953), Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc.:1170-1176 (1962), Honoré, T. et al., Science 241:701-703

(1988), og Sheardown, M.J. et al., Eur. J. Pharmacol. 174 :197-204 (1989) .

Eksempler på ammoniumhydroksyder som kan anvendes for å fremstille ammoniumsaltene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omfatter ethvert tetra-C-^g alkylammoniumhydroksyd, f.eks. tetrametylammoniumhydroksyd, tetraetylammoniumhydroksyd, tetrabutylammoniumhydroksyd, tetrapentylammoniumhydrok-syd, tetraheksylammoniumhydroksyd, så vel som et hvilket som helst tri-C1_6 alkyl-C-L.g alkanolammoniumhydroksyd, f.eks.

cholinhydroksyd, (3-hydroksypropyl)trimetylammoniumhydroksyd, (4-hydroksybutyl)trimetylammoniumhydroksyd, (2-hydroksyetyl)-trietylammoniumhydroksyd, (2-hydroksyetyl)tripropylammonium-hydroksyd og (2-hydroksyetyl)tributylammoniumhydroksyd. Ammoniumhydroksydet er foretrukket cholinhydroksyd. I tillegg kan et hvilket som helst C6_12 aralkyl-C-^g trialkyl-ammoniumhydroksyd anvendes, f.eks. benzyltrimetylammonium-hydroksyd.

Eksempler på aminoforbindelser som kan benyttes for å fremstille salter av 1,4-kinoksalin-2,3-dionene omfatter etylendiamin, dietyltriamin, N-metyletanolamin, di-(2-etanol)amin, tri-(2-etanolamin), spermidin, spermin, og aminokarbohydrater slik som glukosamin, N-metylglukamin, galaktosamin, mannos-amin, xylosamin, cellobiosamin og maltosamin. Andre aminoforbindelser som kan benyttes for fremstille ammoniumsalter av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omfatter mono-N-, di-(N,N og N,N')-, tri-(N,N,N') - og tetra- (N,N,N' ,N• ) -C-^g alkylguanidiner såvel som biguanidin, poly C-^g alkylsubstituerte biguanidiner, amidin, arginin, N-Cj.g alkylamidiner, 1,8-diazabicyklo-

[5.4.0]undek-7-en (DBU), tris(hydroksymetyl)aminometan (tris, trometamin) og bis-tris-propan.

Som vist i fig. 21, når mono-kaliumsaltet av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion fremstilles er det uoppløselig i vann. Imidlertid er dikaliumsaltet av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion oppløselig i vann, men krever tilsetningen av 4 ekvivalenter KOH for å gi en oppløsning som har en pH på 12,7. 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet vil forbli oppløselig når pH senkes til 11,9 ved tilsetning av en ekvivalent eddiksyre. Tilsetningen av en andre ekvivalent eddiksyre forårsaker imidlertid dannelse av et presipitat. Ved tidspunktet pH når 11 er presipiteringen fullstendig. Det har overraskende blitt oppdaget at 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion lett oppløses i kun 1 ekvivalent cholinhydroksyd. Når eddiksyre tilsettes begynner ikke et presipitat å dannes før pH når omtrent 9,2. Likeledes kan 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion oppløses i 1 ekvivalent cholinhydroksyd i vann. pH kan justeres til omtrent 8 uten forekomst av et bunnfall. Det tørre monocholinsaltet kan isoleres i ren form ved for eksempel frysetørking (lyofilisering) av en vandig oppløsning, og er oppløselig ved svært høye konsentrasjoner (minst 90 mg/ml). Dette aspektet av oppfinnelsen er således en stor fordel innen fagområdet da det tillater fremstillingen av konsentrerte vandige oppløsninger av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner for intravenøs administrering.

Noen av ammonium-motionene som er nyttige for oppløselig-

) gjøring av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner kan vise toksisitet etter i.v. administrering, for eksempel tetrametylammoniumhydroksyd og tetraetylammoniumhydroksyd. Det har blitt funnet at mange 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner lett

kan oppløseliggjøres i 0,05M-0,5M oppløsninger av trishydrok-s symetylaminometan (tris, tromethamin USP). Tromethamin er praktisk talt ikke-toksisk når administrert intravenøst i mennesker. Således er en tromethaminoppløsning av 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion svært nyttig for i.v. administrering til mennesker og overvinner hovedhindringen for oppnåelse av

en oppløsning av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner for human i.v. anvendelse. Den foreliggende oppfinnelse omhandler delvis dette funn. Som et alternativ til tromethamin kan det anvendes bis-tris-propan (1,3-bis[tris-(hydroksymetyl)metyl-amino]propan), en analog av tromethamin som også viser lav toksisitet i pattedyr. Bis-tris-propan har en høyere pK enn tromethamin og er derfor nyttig for oppløsning av noen 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som ikke er lett oppløselige i t rome t hami n.

De farmasøytiske preparatene i samsvar med oppfinnelsen kan administreres til et hvilket som helst dyr som kan oppleve de fordelaktige virkningene av forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen. Fremst blant slike dyr er mennesker.

De farmasøytiske preparatene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan administreres ved hvilket eller hvilke som helst midler som oppnår deres tiltenkte formål. For eksempel kan administrering utføres ved parenterale, subkutane, intra-venøse, intramuskulære, intraperitoneale, transdermale, buckale eller okulære ruter. Alternativt, eller samtidig, kan administrering utføres ved den orale rute. Den admini-strerte doseringen vil være avhengig av alderen, helsen og vekten til mottakeren, type av samtidig behandling, hvis slik er tilfelle, hyppighet av behandling, og beskaffenheten av den ønskede virkningen.

Når preparatene i samsvar med oppfinnelsen administreres okulart kan man oppnå enten lokal eller systemisk administrering. Preparatene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan for eksempel administreres i form av øyedråper som er i alt vesentlig isotonisk med tårevæske for å oppnå systemisk administrering. Slike preparater vil foretrukket også omfatte et gjennomtrengningsforøkende middel som hjelper den systemiske absorpsjonen av forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Se U.S. patent nr. 5,182,258. Preparatene i samsvar med oppfinnelsen kan alternativt administreres okulart for å behandle eller forebygge syns-nervedegenerering. I denne utførelsen administreres forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse i form av øyedråper, som omtalt i det foregående, eller de kan injiseres inn i området nær synsnerven. I dette alternativet kan tynne okulare implantater anvendes som sakte frigir forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

I tillegg til de farmakologisk aktive forbindelsene kan de nye farmasøytiske preparatene inneholde passende farmasøytisk tålbare bærere omfattende eksipienser og hjelpestoffer som letter bearbeiding av de aktive forbindelsene til preparater som kan anvendes farmasøytisk. Foretrukket er preparatene, spesielt de preparater som kan administreres oralt og som kan anvendes for den foretrukne type administrering, slik som tabletter, dragéer, kapsler, og også preparater som administreres rektalt slik som suppositorier, så vel som egnede oppløsninger for administrering ved injeksjon eller oralt, til stede ved en konsentrasjon på fra omtrent 0,01 til 99 %, sammen med eksipiensen.

De farmasøytiske preparatene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er fremstilt på en måte som i seg selv er kjent, for eksempel ved hjelp prosesser som konvensjonell blanding, granulering, dragé-fremstilling, oppløsning eller fryse-tørking (lyofilisering). Således kan farmasøytiske preparater for oral anvendelse oppnås ved å kombinere de aktive forbindelser faste eksipienser, eventuelt ved å male den resulterende blandingen og å bearbeide blandingen av granuler, etter tilsetning av egnede hjelpestoffer, hvis ønskelig eller nødvendig, for å oppnå tabletter eller dragékjerner.

Egnede eksipienser er spesielt fyllstoffer slik som sakka-rider, for eksempel laktose eller sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosefremstillinger og/eller kalsiumfosfater, fore eksempel trikalsiumfosfat eller kalsiumhydrogenfosfat, så vel som bindemidler slik som stivelsespasta, ved anvendelse av for eksempel maisstivelse, hvetestivelse, risstiv-else, potetstivelse, gelatin, tragant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon. Hvis ønskelig kan disintegrasjonsmidler tilsettes slik som de ovennevnte stiv-elser og også karboksymetylstivelse, fornettet polyvinylpyrrolidon, agar, eller alginsyre eller et salt derav, slik som natriumalginat. Hjelpestoffer er fremfor alt strømnings - regulerende midler og smøremidler, for eksempel silika, talk, stearinsyre eller salter derav, slik som magnesiumstearat eller kalsiumstearat, og/eller polyetylenglykol. Dragékjerner tilveiebringes med egnede belegg som, hvis ønskelig, er motstandsdyktige overfor magesafter. For dette formål kan konsentrerte sakkaridoppløsninger anvendes, som eventuelt kan inneholde gummi arabikum, talk, polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol og/eller titandioksyd, lakkoppløsninger og passende organiske løsningsmidler eller løsningsmiddelblandinger. For å fremstille belegg som er motstandsdyktige overfor magesafter benyttes oppløsninger av egnede cellulosefremstillinger slik som acetylcelluloseftalat eller hydroksypropyl-metylcelluloseftalat. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller dragébeleggene for eksempel for identifisering eller for å karakterisere kombinasjoner av doser av aktiv forbindelse.

Andre farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt omfatter "push-fit" kapsler fremstilt av gelatin, så vel som myke, forseglede kapsler fremstilt av gelatin og et plastifi-seringsmiddel (mykner) slik som glyserol eller sorbitol. "Push-fit" kapslene kan inneholde de aktive forbindelsene i form av granuler som kan være blandet med fyllstoffer slik som laktose, bindemidler slik som stivelse, og/eller smøre-midler slik som talk og magnesiumstearat, og eventuelt stabiliseringsmidler. I myke kapsler er de aktive forbindelsene foretrukket oppløst eller suspendert i passende væsker, slik som fettoljer eller flytende paraffin. I tillegg kan stabiliseringsmidler tilsettes.

Mulige farmasøytiske preparater som kan anvendes rektalt omfatter for eksempel suppositorier som består av en kombinasjon av en eller flere av de aktive forbindelsene med en suppositorium-basis. Egnede suppositoriumbasiser er for eksempel naturlige eller syntetiske triglyserider, eller paraffinhydrokarboner. I tillegg er det også mulig å anvende rektale gelatinkapsler som består av en kombinasjon av de aktive forbindelsene med en basis. Mulige basismaterialer omfatter for eksempel flytende triglyserider, polyetylen-glykoler eller paraffinhydrokarboner.

Egnede formuleringer for parenteral administrering omfatter vandige oppløsninger av de aktive forbindelsene i vannopp-løselig form, for eksempel vannoppløselig ammonium (spesielt tris, bistrispropan og cholin) salter og alkaliske oppløsn-inger. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene som passende oljeaktige injeksjonssuspensjoner administreres. Egnede lipofile løsningsmidler eller vehikler omfatter fettoljer, for eksempel sesamolje, eller syntetiske fettsyre-estere, for eksempel etyloleat eller triglyserider eller polyetylenglykol-4 00 (forbindelsene er oppløselige i PEG-400). Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde sub-stanser som øker viskositeten av suspensjonen, omfattende for eksempel natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol og/eller dextran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde stabiliseringsmidler .

Karakteriseringen av glycinbindingsstedene in vitro har vært vanskelig på grunn av mangelen på selektive medikament-ligander. Således kan glycinligandene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse anvendes for å karakterisere glycinbindingsstedet. Spesielt foretrukne substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dioner som kan benyttes for dette formål er isotopisk radiomerkede derivater, f.eks. hvor en eller flere av atomene er erstattet med <3>H, 1:LC, 1<4>C, <15>N eller 18F. I tillegg kan positronemittere slik som 11C og <18>F innlemmes i 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet for anvendelse i positron-emissjonstomografi (PET) for lokalisering av glycinbindingsstedene. Dessuten kan <123>I-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dioner anvendes for enkeltfotonemissjonsberegnet tomografi (SPECT) avbilding av glycinbindingsstedet. I tillegg kan man fremstille isotopisk merkede forbindelser som ikke er radioaktive for anvendelse i metabolske studier, f.eks. hvori ett eller flere av hydrogenene og/eller karbonene er beriket med hensyn på <2>H eller <13>C.

De følgende eksempler er illustrerende med hensyn til fremgangsmåten og preparatene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Metoder og materialer.

I de følgende eksempler 1-8, ble alle <1>H NMR kjørt ved 300 MHz og <13>C NMR ved 75 MHz på et QE-300 instrument og henviser til det resterende protioløsningsmiddelet. <19>F NMR ble kjørt ved 339 MHz på et NT-360 instrument og henviser til eksternt C6F6. Smeltepunktene ble målt på et Mel-Temp smeltepunktapparat og er ukorrigerte. Prøver ble anbragt i blokken hvor temperaturen var >250°C for å minimalisere spalting forut for smelting. DMF ble avdestillert før anvendelse. Alle andre reagenser ble anvendt i den form de ble mottatt fra fabrikanten. Forbindelser ble anskaffet fra Aldrich Chemical Co. med mindre annet er indikert i det etterfølgende. 1,2-di-nitro-3,4,5,6 -tetraklorbenzen, 5,6-diamino-1,3-dimetylurasil-hydrat og 1,2-diamino-3-klor-5-trifluormetylbenzen ble anskaffet fra Maybridge Chemical. 3-fluor-6-nitroanilin ble tilveiebragt fra dr. Michael Scherz. 1,2-diamino-4-klor-5-fluorbenzen, 1,2-diamino-3-klor-5-trifluormetylbenzen og 1,2-diamino-3-brom-5-trifluormetylbenzen ble anskaffet fra PCR Chemical.

Eksempel 1.

Fremstilling av 6. 7- diklor- 5- nitro- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metode A:

6. 7- diklor- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion. (1) En blanding av 422 mg (2,5 mmol) 4,5-diklor-o-fenylendiamin (Pfaltz & Bauer, Inc., anvendt slik den ble mottatt) og 1,10 g (7,7 mmol) dietyloksalat (Sigma, anvendt slik den ble mottatt) ble omrørt under Ar ved 160°C i 2 timer, deretter ved 180°C i 7 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur (22°C), fortynnet med heksaner (10 ml), presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering og vasket med heksaner (2 x 10 ml). Det grå faststoffet ble omrørt med 40 ml vandig NaOH (omtrent IN) og aktivt kull (0,4 g) ved romtemperatur i 3 0 minutter, kullet ble fjernet ved vakuumfiltrering og vasket med destillert H20 (6 x 10 ml), som ble kombinert med det opprinnelige filtratet, surgjort med omtrent 4N vandig HC1 (omtrent 20 ml). Det hvite presipitatet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med destillert H20 (5 x 10 ml), EtOH (3 x 5 ml), deretter tørket ved 60°C under et trykk på 0,1 mmHg i 8 timer og ga 426 mg (73,8 %) av 1 som et kremaktig faststoff. Sm.p. >400°C <1>H NMR (DMSO-d6) 12,010 (s, 2H) 7,226 (s, 2H) ppm.

5- nitro- 6. 7- diklor- l, 4- dihydro- 2, 3- kinoksalindion. (2) Forbindelse 1 (416 mg, 1,80 mmol) ble oppløst i 5,5 ml konsentrert H2S04 ved 0°C under omrøring. Til denne resulterende dypgrå oppløsningen ble det tilsatt 202 mg (2,22 mmol) finmalt KN03 (Baker, anvendt slik det ble mottatt) ved 0°C med omrøring. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer, deretter ved romtemperatur (22°C) i 30 timer. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til is-H20 (60 g), presipitatet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med destillert H20 (5 x 10 ml), EtOH (3 x 5 ml), deretter tørket under et trykk på 0,1 mmHg ved 80°C i 2 timer hvilket gir 443,5 mg (89,6 %) rå 2 som et kremaktig amorft faststoff. (<1>H NMR indikerte at det var 95-98 % rent).

Den ytterligere rensingen var som følger:

443 mg av det rå 2 (oppnådd i det foregående) ble oppløst i omtrent IN vandig NaOH (120 ml) ved romtemperatur, aktivt kull (1 g) ble tilsatt, deretter omrørt ved romtemperatur i 15 minutter. Kullet ble fjernet ved vakuumf iltrering, og vasket med destillert H20 ( 2 x 10 ml). Det kombinerte filtratet ble surgjort til pH 2 med omtrent 4N vandig HC1 (omtrent 50 ml). Presipitatet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med destillert H20 (5 x 10 ml), EtOH (2 x 5 ml), tørket under et trykk på 0,1 mmHg ved 80°C i 2 timer hvilket gir 327 mg (74 % utbytte) av hovedsakelig ren 2, sm.p. 350-354°C (spalting). (<1>H NMR indikerte at det var nesten ingen urenheter tilstede).

Rekrystallisering: 315 mg av det renere 2 (oppnådd i det foregående) ble oppløst i 45 ml DMSO, til denne oppløsningen ble det tilsatt H20 (omtrent 1 ml) dråpevis inntil det ble dannet et presipitat. Blandingen ble oppvarmet (i et 100-105°C oljebad) med omrøring (ved anvendelse av en liten magnetisk stav), H20 (omtrent 1 ml) ble tilsatt dråpevis inntil det ble dannet en uklar blanding, og DMSO ble tilsatt dråpevis til å gi en klar oppløsning. Etter å ha stått ved romtemperatur i 8 timer ble de gule mikrokrystallene oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med destillert H20 (5 x 10 ml), EtOH (2x3 ml), tørket under et trykk på 0,1 mmHg ved 80°C i 3 timer hvilket gir 286 mg (90,8 % utbytte) av ren 2, sm.p. 354-357°C.

Metode B:

4, 5- diklor- 1. 2 - fenylendiamin (1) . Til en suspensjon av 6,21 g (30,0 mmol) 4,5-diklor-2-nitroanilin (Aldrich, anvendt som den ble mottatt) i EtOH (100 ml) ble det tilsatt 310 mg 5 % Pd/C, blandingen ble hydrogenert ved 3 0-20 parr H2 i 4 timer, deretter filtrert. Filtratet ble rotasjonsinndampet til tørrhet. Den svarte faste resten ble omrørt med 250 ml av 2N vandig HC1 i 2 minutter, deretter filtrert. Filtratet ble gjort basisk til pH 13 med 4N vandig NaOH (125 ml). Presipitatet ble oppsamlet på en sintret trakt ved vakuumfiltrering, vasket med H20 (5 x 10 ml), tørket ved 40°C under et trykk på 0,1 mmHg i 16 timer hvilket gir 3,72 g (70 %) av råproduktet som et kaffefarget pulver.

Råproduktet (3,70 g) oppnådd i det foregående ble renset ved krystallisering fra benzen (60 ml) hvilket gir 3,17 g (85 % utbytte) som svakt purpurfargede flak, som var rene ved TLC (CHCl3:EtOH = 9:1). Sm.p. 159-160°C (Aldrich: 159-162°C). 6. 7- diklor- l. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion: En suspensjon av 2,655 g (15,0 mmol) 4,5-diklorfenylen-1,2-diamin og 1,986 g (15,75 mmol) oksalsyredihydrat (Fisher Scientific Co., anvendt som det ble mottatt) i 22,5 ml 2N vandig HCl ble kokt under tilbakeløp ved omrøring ved 125°C (bad-temperatur) i 2,5 timer (under de første 5 minutter med oppvarming endret suspensjonen seg nesten til en oppløsning, og begynte deretter å danne et presipitat). Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til 22°C, og H20 (50 ml) ble tilsatt. Presipitatet ble oppsamlet på en Hirsh-trakt ved vakuumfiltrering, vasket med H20 (6 x 25 ml) og tørket ved 60°C under et trykk på 0,1 mmHg i 12 timer hvilket gir 3,39 g (98 %) 6,7-diklor-kinoksalin-2,3-dion som et dyprosa pulver. Sm.p. >400°C. <1>H NMR (DMSO-dg): 6 12,016 (s, 2H), 7,234 (s, 2H). Dette produktet ble benyttet i den neste reaksjonen uten ytterligere rensing. 6. 7- diklor- 5- nitro- l. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion: 3,335 g (14,5 mmol) 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble oppløst i 65 ml konsentrert H2S04 med omrøring og avkjøling i et is-H20-bad, deretter 2,20 g (21,76 mmol) KN03 (Baker, anvendt som det ble mottatt) tilsatt i porsjoner i løpet 10 minutter med omrøring. Den resulterende blandingen ble omrørt ved 22°C under N2 i 20 timer og ble deretter sakte helt i is-H20 (400 ml) med omrøring. Presipitatet ble oppsamlet på en sintret trakt ved vakuumfiltrering, vasket med H20 (5 x 10 ml), og tørket ved 60°C under et trykk på 0,1 mmHg i 12 timer hvilket gir 3,39 g (85 %) av det rå 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion som et grågult pulver.

Renhet: >98,5 % basert på HPLC-analyse.

Forbindelsen ble renset som følger. 3,365 g 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion oppnådd i det foregående ble tilsatt til 550 ml IN vandig NaOH og kraftig omrørt i 20 minutter. Den resulterende blandingen ble filtrert ved vakuumfiltrering gjennom en sintret trakt for å fjerne en liten mengde uoppløselig materiale. Til filtratet blir det sakte tilsatt konsentrert HCl (omtrent 43 ml)(dråpevis) under kraftig omrøring for å justere pH fra 13 til 11 (ved anvendelse av pH-meter for kontroll). (Et blindforsøk viste at 6,7-diklorkinoksalin-2,3-dionet, utgangsmaterialet for nitreringsreaksjonen kan presipiteres fra sin IN vandige NaOH-oppløsning kun under slike forhold at pH var innenfor 9,5-8). Presipitatet ble oppsamlet på en sintret trakt ved vakuumfiltrering og vasket med H20 (5 x 50 ml) . Det fuktige produktet ble tilsatt til 200 ml H20, og til denne resulterende suspensjonen ble det sakte tilsatt konsentrert HCl (dråpevis) for å justere pH til 5. Presipitatet ble oppsamlet på en Hirsh-trakt ved vakuumfiltrering, vasket med H20 (8 x 50 ml), og tørket ved 60°C under et trykk på 0,1 mmHg i 16 timer hvilket gir 3,12 g (92,9 % utbytte) av det renere 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Sm.p. 347-348°C. <1>H NMR (DMS0-d6) : 12,265 (bs, 2H) , 7,379 (s, 1H) . Renhet: >99,2 % basert på HPLC-analyse.

Eksempel 2

Fremstilling av 5- klor- 7- trifluormetyl- 1. 4- dihydrokinoksalin-2. 3- dion 4 3 9,0 mg (3,0 mmol) dietyloksalat (fra Sigma, anvendt som det ble mottatt) ble tilsatt til 210,6 mg (1,0 mmol) 1,2-diamino-3-klor-5-trifluormetylbenzen (fra PCR Inc., anvendt som det ble mottatt), og den resulterende gule oppløsningen ble oppvarmet ved 180°C (bad-temperatur) under Ar med omrøring i 3,5 timer, oppløsningen ble tykk med dannelse av kremaktig presipitat og ble vanskelig å omrøre. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur, og triturert med heksan (2 x 10 ml). Presipitatet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med heksan (2 x 10 ml)(det kombinerte heksanfiltrat ble tatt vare på), tørket under trykk på 0,1 mmHg i 4 timer hvilket gir 134,6 mg (58 %) av det rå ønskede produktet som et gult pulver (95-98 % rent ved NMR), sm.p. 330-332°C (spalting) (forvarmet blokk).

En del (125,5 ml) av det rå produktet oppnådd i det foregående ble omrørt med IN vandig NaOH (10 ml) ved romtemperatur, den resulterende klare gule basiske oppløsningen ble surgjort til pH 2 ved tilsetning av 5N vandig HCl (omtrent 1,2 ml) dråpevis med risting ved romtemperatur. Det hvite presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket med H20 (5 x 10 ml), deretter tørket ved ko-inndampning med EtOH (2 x 10 ml) ved 40°C hvilket gir 118,8 mg (94,6 % utbytte) av ren

(ved NMR) forbindelse som et off-white pulver, sm.p. 334-336°C (spalting) (forvarmet blokk). Forsøk på å rekrystallisere fra EtOH, EtOH-H20 og DMSO-H20 slo feil (disse oppløsningene ga kun enten et presipitat eller intet). <1>HNMR(DMS0-d6) 6:7,349(s, 1H) , 7,604(s, 1H) , ll,724(s, 1H) , 12,222(s, 1H) ppm.

Det kombinerte heksanfiltrat oppnådd i det foregående ble rotasjonsinndampet ved 4 0°C til tørrhet, resten (viskøs oransje olje) ble varmet ved 180°C i 5 timer. Det resulterende brune bulk-faststoffet ble triturert med heksan (5 ml), presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket med heksan (4 x 5 ml), deretter omrørt med IN vandig NaOH

(4,5 ml), sentrifugert for å fjerne en liten mengde svart faststoff, supernatanten ble surgjort til pH 2 ved tilsetning av 5N vandig HCl (omtrent 1 ml) dråpevis med rysting ved romtemperatur. Det gulaktige presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket med (5 x 5 ml), deretter tørket ved ko-inndampning med EtOH (3x5 ml) ved 40°C hvilket gir 51,8 mg (22,3 %, basert på utgangsdiaminet i den første reaksjonen) av den i overskriften nevnte forbindelse som et gul-aktig pulver (hovedsakelig rent ved NMR) sm.p. 334-336°C (forvarmet blokk).

Etter at det utvundne blandede materialet ble brukt på ny, var det totale utbyttet omtrent 77 %.

Resultatet som rapporteres herved var fra en av tre eksperimenter og var reproduserbart. Reaksjonen med 1:2 forhold av diamin til oksalat ved anvendelse av samme prosedyre som den for 1 -. 3 forhold ble også forsøkt, men produktet hadde en komplisert beskaffenhet.

Den i overskriften angitte forbindelse ble alternativt fremstilt ved anvendelse i en tilpasning av metoden til Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962). En blanding av dietyloksalat (1,34 g, 9,60 mmol) og 1,2-diamino-3-klor-5-trifluormetylbenzen (200 mg, 0,95 mmol) ble oppvarmet til tilbakeløp under N2 i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og faststoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og renset med iskald EtOH (10 ml). Dette gulhvite faststoffet ble oppløst i IN NaOH (15 ml) og noen få uoppløselige partikler ble fjernet ved gravitasjonsfiltrering. Oppløsningen ble behandlet med avfargende karbon og blandingen ble filtrert gjennom en matte av kiselgur og den resulterende oppløsningen ble surgjort med 4N HCl. Det ble dannet et presipitat som ble isolert ved vakuumfiltrering og vasket med vann (20 ml). Dette hvite faststoffet ble tørket i tørkepistol (0,05 torr, 78°C) til å gi 91,9 mg (36,0 %) , sm.p. 346-348°C (spalting). <1>HNMR(d<6->dmso) 8 7,30 (s, 1H, ArH) , 7,53 (s, 1H, ArH) , 11,9(br s, 2H, NH). <19>F NMR (C6<F>6 ekstern standard, 6 -162,9) 8 -58,43 (s). EIHRMS beregnet for C9H4C1F3N202 er 263,9912, funnet er 263,9891.

Eksempel 3

Fremstilling av 5- klor- 6. 7- difluor- 1. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3-dion

2- klor- 3. 4- difluor- 6- nitroanilin

2-klor-3,4-difluor-6-nitroanilin ble fremstilt ved anvendelse av en tilpasning av metoden til Mitchell, et al. (Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). Til en opp-løsning av 4,5-difluor-2-nitroanilin (500 mg, 2,87 mmol) i tørr DMF (16 ml) under N2 ble det tilsatt N-klorsuccinimid (401 mg, 3,00 mmol) i DMF. Reaksjonsblandingen ble tillatt å omrøres i 48 timer. Oppløsningen ble deretter helt i 75 ml H20. Den uklare orange suspensjonen som ble dannet ble deretter ekstrahert med 4 x 25 ml metylenklorid. De kombinerte organiske ekstraktene ble vasket med 5 x 20 ml H20 og 25 ml mettet NaCl-oppløsning. Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og tørkemiddelet ble fjernet ved vakuumfiltrering. Løsningsmiddelet ble rotasjonsfordampet til å gi en gulorange olje som krystalliserte når den fikk stå. <X>H NMR viste at dette faststoffet er en blanding av klorert produkt og utgangsmaterialet. Blandingen ble separert ved flashkromato-grafi (silikagel 3:1 heksaner:etylacetat) til å gi 162 mg av et gult krystallinsk faststoff (27 %). <X>H NMR (CDC13) 6 6,60(br s, 2H, NH2), 8,00(m, 1H, H-5). Det var 17 % forurensning av utgangsmaterialet påvist ved NMR.

. l- klor- 4 . 5- dif luor- 1. 2- diaminobenzen

3-klor-4,5-difluor-1,2-diaminobenzen ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Bellamy, et al.

(Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). En blanding av 2-klor-3,4-difluor-6-nitroanilin (160 mg, 0,767 mmol) og SnCl2 -2H20 (0,863 g, 3,84 mmol) ble oppløst i 5 ml etylacetat og 2 ml absolutt etanol under N2 og varmet ved 75°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og helt i 50 ml H20. Tilstrekkelig mettet NaHC03-oppløsning ble tilsatt (skumming!) til å bringe pH til 7. Den resulterende blandingen ble ekstrahert med 3 x 20 ml etylacetat og de kombinerte organiske ekstraktene ble vasket med 20 ml mettet NaCl-oppløsning. Den organiske fasen ble tørket (MgS04), vakuumfiltrert og løsningsmiddelet rotasjonsfordampet til å gi et brunt faststoff, 124 mg (91 %). <1>H NMR (CDC13) 6 3,52(br s, 4H, 2(NH2)), 6,49(dd, 1H, JHF = 7,5, 10,8 Hz, H-6. Det var 13 % 4,5-difluor-1,2-diaminobenzen til stede ved NMR.

5- klor- 6, 7- difluor- 1. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion Den i overskriften angitte forbindelse ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). En blanding av dietyloksalat (981 mg, 6,72 mmol) og 3-klor-4,5-difluor-1,2-diaminobenzen (120 mg, 0,670 mmol) ble varmet til tilbakeløp under N2 i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og det grå faststoffet oppsamlet ved vakuumfiltrering og renset med iskald EtOH (10 ml) og luft-tørket. Faststoffet ble tatt og oppløst i 5 ml IN NaOH ved oppvarming. Oppløsningen ble behandlet med aktivt kull og filtrert gjennom en matte av kiselgur. Den resulterende oppløsningen ble forsiktig surgjort med IN HCl (pH = 1). Et hvitt pulver ble dannet i oppløsningen ved pH = 6, men noen få dråper IN NaOH klaret oppløsningen og ved tilsetning av noen få dråper IN HCl ble hvite nåler sakte dannet i opp-løsningen. Disse ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, renset

med 20 ml H20 og tørket under vakuum (0,1 torr, 78°C) til å gi 24,9 mg (16 %) blekgule nåler. <1>HNMR(d6-DMS0) 6 7,05(dd, 1H,

J = 10,5, H-8), ll,6(br s, 1H, NH) , 12,0(br s, 1H, NH). Det var 13 % 6,7-difluor-l,4-dihydro-2,3-kinoksalindion til stede ved NMR.

Eksempel 4

Fremstillin<g> av 5- brom- 6. 7- difluor- 1. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

2- brom- 3. 4- difluor- 6- nitroanilin

2- brom-3,4-difluor-6-nitroanilin ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Mitchell, et al. (Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). Til en oppløsning av 4,5-difluor-2-nitroanilin (500 mg, 2,87 mmol) i DMF (25 ml) under N2 ble det på en gang tilsatt N-bromsuccinimid (511 mg, 2,87 mmol) i tørr DMF (16 ml). Reaksjonsblandingen fikk omrøres over natten. TLC (1:1 heksaner:etylacetat) viste at noe utgangsmateriale fremdeles var tilstede. Ytterligere N-bromsuccinimid (100 mg) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 12 timer. Oppløsningen ble deretter helt i 100 ml H20 og den resulterende uklare suspensjonen ble ekstrahert med 3 x 20 ml metylenklorid. De kombinerte organiske fasene ble vasket med 4 x 25 ml H20 og 25 ml mettet NaCl-oppløsning og tørket (MgS04) . MgS04 ble vakuumfiltrert og løsningsmiddelet ble rotasjonsfordampet til å gi en gulbrun olje som sakte krystalliserte til å gi 700 mg (96 %). <X>H NMR (CDC13) 6 6,70(br s, 2H, NH2), 7,99(m, 1H, H-5).

3- brom- 4. 5- difluor- 1. 2- diaminobenzen

3-brom-4,5-difluor-1,2-diaminobenzen ble fremstilt ved anvendelse av en tilpasning av metoden til Bellamy, et al.

(Bellamy, F.D. et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). En blanding av 2-brom-3,4-difluor-6-nitroanilin (700 mg, 2,78 mmol) og SnCl2-2H20 (3,14 g, 13,9 mmol) oppløst i 7 ml etylacetat og 3 ml absolutt etanol under N2 ble varmet ved 75°C i 2 timer. Alt utgangsmaterialet hadde reagert, hvilket ble bekreftet ved TLC (silikagel, 2:1 heksaner:etylacetat). Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur

og helt i 20 ml knust is. Tilstrekkelig mettet NaHC03-opp-løsning ble tilsatt (skumming!) til å bringe pH til 5. Den tykke gulhvite emulsjonen ble deretter ekstrahert med 3 x 25 ml etylacetat og de kombinerte organiske ekstraktene ble vasket med mettet NaCl-oppløsning. Den organiske fasen ble tørket (MgS04), vakuumfiltrert og løsningsmiddelet ble rotasjonsfordampet til å gi en mørkebrun olje som krystalliserte når den ble tillatt å stå til å gi 410 mg (66 %). <X>H NMR (CDC13) 6 3,59 (br s, 4H, 2(NH2) ) ; 6,52(m, 1H, H-6).

5- brom- 6. 7- difluor- 1. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion Den i overskriften angitte forbindelse ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). En blanding av dietyloksalat (2,70 g, 18,5 mmol) og 3-brom-4,5-difluor-1,2-diaminobenzen (410 mg, 1,85 mmol) ble oppvarmet til tilbakeløp under N2 i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å av-kjøles til romtemperatur og det mørkebrune faststoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og renset med EtOH (20 ml) og lufttørket til å gi 215 mg (42 %). En del av dette faststoffet (159 mg) ble tatt og oppløst i 20 ml IN NaOH med oppvarming. Oppløsningen ble behandlet med aktivt kull og filtrert gjennom en matte av kiselgur. Den resulterende oppløsningen ble forsiktig surgjort med IN HCl (pH = 1). Blekgule nåler ble sakte dannet i oppløsningen og ble oppsamlet ved vakuumfiltreringen, renset med 20 ml H20 og tørket under vakuum (0,1 torr, 78°C) til å gi 67,8 mg pulveraktige blekgule krystaller. Sm.p. 306-310°C (spalting). <1>HNMR(d6-DMSO) 6 7, 09(dd, 1H, J = 7,5, H-8), 11,3(br s, 1H, NH) , 12,1(br s, 1H, NH). EIMS m/z 278 (M+2, 75), 276 (M+, 77), 250 (56), 248(57), 141 (bp) . EIHRMS beregnet for C8H4BrF2N202 er 275,9346, funnet er 275,9331.

Eksempel 5

Fremstilling av 5. 7- dibrom- l. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion

3. 5- dibrom- 1. 2- diaminobenzen

3,5-dibrom-1,2-diaminobenzen ble fremstilt ved anvendelse av en tilpasning av metoden til Bellamy, et al. (Bellamy, F.D.

et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984)). En blanding av 2,4-dibrom-6-nitroanilin (500 mg, 1,69 mmol) og SnCl2 -2H20 (1,90 g, 8,45 mmol) oppløst i 5 ml etylacetat og 2 ml absolutt etanol under N2 ble oppvarmet ved 70°C i 1 time. Alt utgangsmaterialet hadde reagert hvilket ble påvist ved TLC (silikagel, 3:1 heksaner:etylacetat). Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og helt i 20 ml knust is. Tilstrekkelig mettet NaHC03-oppløsning ble tilsatt (skumming!) til å bringe pH til 5. Den tykke gulhvite emulsjonen ble vakuumfiltrert og filtratet ekstrahert med 3 x 25 ml etylacetat og de kombinerte organiske ekstraktene ble vasket med mettet NaCl-oppløsning. Den organiske fasen ble tørket (MgS04), vakuumfiltrert og løsningsmiddelet ble rotasjonsfordampet til å gi et blekgul olje som krystalliserte når den ble tillatt å stå til å gi 400 mg (89 %). <1>H NMR (CDC13) 6 3,62(br s, 4H, 2(NH2) ) ; 6,78(d, J = 1,8, 1H, H-6); 7,01(d, J = 1,8, 1H, H-4).

5. 7- dibrom- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Den i overskriften angitte forbindelse ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). En blanding av dietyloksalat (2,19 g, 15,0 mmol) og 3,5-dibrom-1,2-diaminobenzen (400 mg, 1,50 mmol) ble oppvarmet til tilbakeløp under N2 i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og det blekbrune skinnende faststoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og renset med EtOH (20 ml) og lufttørket til å gi 264 mg (55 %). En del av dette faststoffet (150 mg) ble tatt og oppløst i 20 ml IN NaOH med oppvarming. Oppløsningen ble behandlet med aktivt kull og filtrert gjennom en matte av kiselgur. Den resulterende oppløsningen ble forsiktig surgjort med 2N HCl (pH = 1). Blekgule nåler ble sakte dannet i oppløsningen og ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, renset med 20 ml H20 og tørket under vakuum (0,1 torr, 78°C) til å gi 50,0 ml pulveraktig hvitt faststoff, sm.p. 356-358°C (spalting). <X>H NMR (d6-DMSO) 6 7,21(d, 1H, J = 2,1, H-8), 7,53(d, 1H, J = 2,1, H-6), 11,1(br s, 1H, NH), 12,1(br s, 1H, NH). EIMS m/z 322 (M+4, 51,3), 320 (M+2, bp), 318 (M+, 53,9), 294 (32,2), 292 (62,6), 290 (28,7), 185 (24,3), 183 (25,2). EIHRMS beregnet for C8H4Br2N202 er 317,8641, funnet er 317,8642.

Eksempel 6

Fremstilling av 5- klor- 6- nitro- 7- trifluormetyl- 1. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion og 5- klor- 8- nitro- 7- trifluormetyl- 1. 4-dihydrokinoksalin- 2. 3- dion

De i overskriften angitte forbindelser ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Cheeseman. (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). 6-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (500 mg, 1,89 mmol) ble opp-løst i 15 ml konsentrert H2S04 og den klare oppløsningen ble avkjølt til 0°C under omrøring. Til dette ble det tilsatt KN03 (191 mg, 1,89 mmol) i små porsjoner. Reaksjonsblandingen ble tillatt å omrøres i 1 time ved 0°C og ble deretter tillatt å komme til romtemperatur og omrørt over natten. Den blekgule reaksjonsblandingen ble deretter helt i 50 ml is-H20. Produktet ble isolert ved vakuumfiltrering som et hvitt faststoff som ble renset med en liten mengde kaldt H20 og lufttørket. Det hvite faststoffet ble oppløst i en minimums-mengde varm DMSO. Kokende H20 ble tilsatt dråpevis, med oppvarming etter hver tilsetning, inntil presipitatet ikke kunne oppløses. Noen få dråper DMSO ble tilsatt til oppløsningen var klar, og oppløsningen ble tillatt å avkjøles sakte til romtemperatur. Det hvite faststoffet ble isolert ved vakuumfiltrering og tillatt å lufttørke. Faststoffet ble ytterligere tørket under vakuum (0,1 torr, 25°C) til å gi 241,6 mg av en blanding av 6-nitro- og 8-nitro-produktene i et 3,3:1 forhold ved -""H NMR. Presipitatet som ble dannet i det ovennevnte filtratet ble isolert ved vakuumfiltrering, renset med 50 ml H20 og tørket som ovenfor til å gi et hvitt pulver (80,7 mg) som var en blanding av 6-nitro- og 8-nitro-produktene i et 12,6:1 forhold. Kombinering av de ovennevnte prøvene resulterte i et 55 % utbytte, med korrigering for ureagert utgangsmateriale. En del av 3,3:1 blandingen ble tatt og rekrystallisert fra DMSO:H20 som beskrevet i det foregående til å gi små nållignende krystaller som ble isolert ved vakuumfiltrering til å gi 21,1 mg av en blanding av 6-nitro- og 8-nitro-produktene i et 1:1,76 forhold. Forhold av produktblandinger ble bestemt ved <1>H NMR, ved observering av integrasjon av de aromatiske hydrogener ved 6 7,45 og 7,84. Substitusjonsposisjoner er tentative og er basert på relative kjemiske skift av de aromatiske hydrogenene. <X>H NMR (d6-DMSO) 6 7,45 (s, 8-H, 6-nitroprodukt) ,

(s, 6-H, 8-nitroprodukt) , 12,18 (s, N-H) , 12,41 (s, N-H) . EIMS m/z 311 (M+2, 35), 309 (M+, bp), 251 (60), 235 (95). EIHRMS beregnet for C9H3C1F3N304: 3 08,9733, funnet er 308,9768.

Hovedisomeren, 5 - klor-6-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion, ble isolert i ren form i 64 % utbytte ved krystallisering fra DMSO-vann. Sm.p. 343-347°C. Strukturen ble bekreftet ved røntgenanalyse.

Eksempel 7

Fremstilling av 5- brom- 7- fluor- 1, 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion

6- brom- 4- fluor- 2- nitroanilin

6-brom-4-fluor-2-nitroanilin ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Mitchell, et al. (Mitchell, R.H. et al., J. Org. Chem. 44:4733 (1979)). Til en oppløsning av 4-fluor-2-nitroanilin (500 mg, 3,2 mmol) i tørr DMF (16 ml) under N2 ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av N-bromsuccinimid (570 mg, 3,2 mmol) i tørr DMF (16 ml). Reaksjonsblandingen ble tillatt å omrøres i 24 timer. Oppløsningen ble deretter helt i 100 ml H20 og denne vandige fasen ble ekstrahert med 4 x 25 ml CH2C12. De kombinerte organiske fasene ble vasket med 3 x 4 ml H20 og tørket (MgS04) . MgS04 ble vakuumfiltrert og løsningsmiddelet ble rotasjonsfordampet til å gi en brun olje som krystalliserte når den ble tillatt å stå. 642 mg (85,4 %) . <X>H NMR (CDCl3) 6 6,51(br s, 2H, NH2) , 7,58(dd, <J>H4_3 = 3Hz, <J>H4.F = 6,5 Hz, H-4), 7,92(dd, JH34 = 3 Hz, JH3.F = 8,7 Hz, H-3) .

1. 2- diamino- 3- brom- 5- fluorbenzen

1,2-diamino-3-brom-5-fluorbenzen ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Bellamy, et al., Tetrahedron Lett. 25:839 (1984). En blanding av 6-brom-4-fluor-2-nitro-

anilin (673 mg, 2,87 mmol) og SnCl2-2H20 (3,23 g, 14,3 mmol) oppløst i 6 ml etylacetat og 3 ml absolutt etanol ble oppvarmet ved 70°C i 30 minutter. Alt utgangsmaterialet hadde reagert, hvilket ble påvist ved TLC (silikagel, 2:1 heksaner:etylacetat). Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og helt i 20 ml knust is. Tilstrekkelig fast NaHC03 ble tilsatt (skumming!) til å bringe pH til 7,5. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med 3 x 20 ml etylacetat og de kombinerte organiske fasene ble vasket med mettet NaCl-oppløsning. Den organiske fasen ble tørket (MgS04) , vakuumfiltrert og løsningsmiddelet ble rotasjonsfordampet til å gi 510 mg (86,7 %) av en mørkebrun væske.

<1>H NMR (CDC13) 6 3,64 (br s, 4H, 2 (NH2) ) , 6,44(dd, 1H, H5,

<J>4.5 = 2,7, JH.F = 9,8), 6,72(dd, 1H, H4, J4.5 = 2,7, <J>HF 8,4) .

5- brom- 7- fluor- 1. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion Den i overskriften angitte forbindelse ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Cheeseman (Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962)). En blanding av dietyloksalat (3,31 ml, 24,4 mmol) og 1,2-diamino-3-brom-5-fluorbenzen (500 mg, 2,44 mmol) ble oppvarmet til tilbakeløp under N2 i 5 timer. Reaksjonsblandingen var mørkebrun. Reaksjonen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og faststoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og renset med EtOH (3 0 ml). Det brune faststoffet ble lufttørket i 1 time til å gi 250 mg (39,6 % rått utbytte). En del av dette faststoffet ble fjernet og oppløst i IN NaOH (10 ml) og noen få uoppløselige partikler ble fjernet ved gravitasjonsfiltrering. Oppløs-ningen ble behandlet med avfargende karbon og blandingen ble filtrert gjennom en matte av kiselgur og den resulterende oppløsningen ble surgjort med IN HCl. Det ble dannet hvite krystaller som ble isolert ved vakuumfiltrering og vasket med vann (20 ml). Krystallene ble tørket i en tørkepistol (0,05 torr, 78°C) til å gi 54,1 mg, sm.p. 308-310°C (spalting).

<X>U NMR (d6-DMSO) 8 6,2 (dd, 1H, <J>H6.8= 2,7, JH.F= 9,3, ArH), 7,35(dd, 1H, <J>H6.8 2,<4,> JHF = 8,4 Hz), ll,l(br s, 1H, NH) , 12,l(brs, 1H, NH) . EIHRMS beregnet for C8H4BrFN202: 257,9440, funnet: 257,9455.

Eksempel 8

Fremstilling av 5- brom- 7- trifluormetyl- 1. 4- dihydro- 2, 3- kinoksalindion

Den i overskriften angitte forbindelse ble fremstilt ved å anvende en tilpasning av metoden til Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1171 (1962). En blanding av dietyloksalat

(1,15 g, 7,91 mmol) og 1,2-diamino-3-brom-5-trifluormetyl-benzen (200 mg, 0,95 mmol) ble oppvarmet til tilbakeløp under N2 i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og faststoffet oppsamlet ved vakuumfiltrering og renset med EtOH (15 ml). Dette hvite faststoffet ble tørket i en tørkepistol (0,05 torr, 78°C) til å gi 148,3 mg, (60,7 %). Sm.p. 301-304°C (spalting). <1>H NMR(d6-DMSO) 6 7,28(s, 1H, ArH), 7,56(s, 1H, ArH), ll,7(br s, 2N, NH).

<19>F NMR (C6F6 ekstern standard, 6 -162,9), 6 -57,97(s). EIHRMS beregnet for C9H4BrF3N202 er 307,9408, funnet er 307,9411.

I de etterfølgende eksempler 9-14, ble reagensene anvendt slik de ble mottatt med mindre annet er indikert. Smeltepunkter ble tatt på et Mel-Temp smeltepunktapparat og er ukorrigerte. Prøver ble anbragt i blokken når temperaturen var >250°C for å minimalisere spalting forut for smelting. Kolonnekromatografi ble utført i flash-modus på Davisil silikagel (200-425 mesh), med mindre annet er indikert. Analytisk tynnsjiktskromatografi ble utført på silikagel 60 F254 plater med aluminiumsbakside og visualisering ble utført med en ultrafiolett lampe. -"-H NMR-spektra ble registrert på en 300 MHz General Electric QE-300, kjemiske skift rapporteres i deltaenheter under henvisning til restprotonsignaler av de deutererte løsningsmidlene (CHC13, 6 7,26; CHD20D, 6 3,3 0; CD3SOCD2H, 6 2,4 9; CD3COCD2H, 8 2,04 . <13>C NMR-spektra ble kjørt ved 75 MHz. Infrarøde spektra ble oppnådd på et Nicolet 5DXB FT-IR spektrometer. Absorpsjoner registrert i bølgetall (cm'<1>) og intensiteten av absorpsjonene er indikert ved bokstavene s (sterk), m (medium), og w (svak). Massespektra ble registrert på et VG ZAB-2-HF massespektrometer med et VG-11-250 datasystem, i elektronioniseringsmodus

(70 eV) med mindre annet er indikert. Mikroanalyser ble utført av Desert Analytics of Tuscon, Arizona.

Eksempel 9

Fremstilling av 5- nitro- 6. 7- dibrom- 1. 4- dihydro- 2, 3- kinoksalindion

Prosedyren til Cheeseman, G.W.H., J. Chem. Soc. 1170 (1962) ble tilpasset. Til en omrørt suspensjon av 6,7-dibrom-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (576 mg, 1,8 mmol) i konsentrert H2S04 (6 ml) ved 0°C i 30 minutter ble KN03 (220 mg, 2,18 mmol, Baker) tilsatt i en porsjon. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer og deretter ved romtemperatur i 1 døgn. Fargen på blandingen ble endret fra rød til gulbrun. Deretter ble den helt i is (60 g) hvilket resulterer i separasjon av et lysegult presipitat, som ble oppsamlet ved filtrering og vasket med destillert vann (2x2 ml) etterfulgt av etanol (2x1 ml) til gi 498 mg rå 5-nitro-6,7-dibrom-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (76 %, inneholder mindre mengder urenheter ved NMR). Krystallisering fra DMSO/H20 rent 5-nitro-6,7-dibrom-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion som lysegule mikrokrystaller, sm.p.: 352-354°C (spalting). IR(KBr, cm"<1>): 3387, 3256, 1756, 1700, 1537. NMR (<X>H, DMSO-d6) 6 7,475 (s, 1H) ; 12,217 (s, 1H), 12,265 (s, 1H). HRMS: beregnet for C8H3N304Br2 (M+) m/z:362,8489; funnet:362,8509.

Eksempel 10

Fremstilling av 6- nitro- 5. 7- diklor- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metoden til Cheeseman, supra, ble tilpasset. 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (239 mg, 1,03 mmol) ble oppløst i konsentrert H2S04 (3 ml) ved 0°C i 30 minutter, og KN03 (125,3 mg, 1,24 mmol, Baker) ble tilsatt til denne oppløsningen. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer og deretter omrørt ved romtemperatur i 30 timer. Den ble deretter helt i isvann (15 g). Et presipitat kom til syne og ble oppsamlet ved filtrering, deretter oppløst i IN KOH (10 ml) og det røde presipitatet ble fjernet ved filtrering. Oppløsningen ble deretter surgjort til pH = 2 med 4N HCl til å gi et kremaktig presipitat, som ble oppsamlet ved filtrering, og deretter tørket i luft ved 50°C i 4 timer til å gi det rene 6-nitro-5,7-diklor-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (231 mg, 80 %), som gule mikrokrystaller. Sm.p.: 320-325°C (spalting fra 290°C). IR(KBr, cm"<1>): 3467, 3140, 3055, 2946, 1717, 1693, 1541. NMR (<X>H, DMSO-d6) 6 7,221 (s, 1H) ; 11,932 (s, 1H) , 12,312 (s, 1H) . HRMS: beregnet for C8H3N304C12 (M+) m/z: 274,9499, funnet: 274,9509.

Eksempel 11

Fremstilling av 6- nitro- 5. 7- dibrom- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metoden til Cheeseman, supra, ble tilpasset. 5,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (74 mg, 0,23 mmol) ble oppløst i konsentrert H2S04 (1 ml) ved 0°C i 30 minutter, og deretter ble KN03 (28 mg, 0,27 mmol, Baker) tilsatt til denne opp-løsningen. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer og deretter ved romtemperatur i 3 0 timer. Den ble helt i isvann

(8 g) og presipitatet ble oppsamlet ved filtrering, og deretter oppløst i IN KOH (5 ml), og det røde presipitatet ble fjernet ved filtrering. Oppløsningen ble deretter surgjort til pH = 2 med 4N HCl for oppnåelse av et kremaktig presipitat, som ble oppsamlet ved filtrering, og deretter tørket i luft ved 50°C i 4 timer, hvilket gir det rene 6-nitro-5,7-dibrom-l,4-dihydro2,3-kinoksalindion (71 mg, 84,5 %), som et gult pulver, sm.p.: 318-320°C (spalting). IR(KBr, cm"<1>): 3468, 3131, 3062, 2931, 1712, 1593, 1537. NMR (<X>H, DMSO-d6) : 6 7,392 (s,lH), 11,566 (s,lH), 12,274 (s,lH). HRMS: beregnet for C8H3N304Br2 m/z: 3 62,84 89, funnet: 362,8478.

Eksempel 12

Fremstilling av 5- klor- 6- nitro- 7- fluor- 1. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metoden til Cheeseman, supra, ble tilpasset. 5-klor-7-fluor-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (30 mg, 0,14 mmol) ble oppløst i konsentrert H2S04 (0,5 ml) ved 0°C i 3 0 minutter, og KN03 (17 mg, 0,17 mmol, Baker) ble tilsatt i en porsjon til denne oppløsningen. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer, deretter ved romtemperatur i 3 0 timer. Den ble helt i isvann

(5 g) og presipitatet ble oppsamlet ved filtrering. Presipitatet ble oppløst i IN NaOH (5 ml), og ble deretter surgjort til pH = 2 med 4N HCl til å gi et kremaktig presipitat, som ble oppsamlet ved filtrering, og deretter tørket i luft ved 50°C i 4 timer, hvilket gir den rene (ved NMR) i overskriften angitte forbindelse 5-klor-6-nitro-7 - fluor-1,4-dihydro-2,3 - kinoksalindion (31 mg, 85,4 %), som et hvitt amorft faststoff. Smeltepunkt spaltes fra 280°C. IR(KBr, cm"<1>): 3600, 3462, 3131, 1712, 1612, 1550. NMR (<1>H, DMSO-d6) : 6 7,106

(d, J = 10,2Hz, 1H), 11,800 (s, 1H), 12,371 (s, 1H). HRMS: beregnet for C8H3N304C1F (M+) m/z: 258,9795, funnet: 258,9790.

Eksempel 13

Fremstilling av 5- brom- 6- nitro- 7 - fluor- 1. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metoden til Cheeseman, supra, ble tilpasset. 5-brom-7-fluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (77 mg, 0,30 mmol) ble oppløst i konsentrert H2S04 (1 ml) ved 0°C i 30 minutter, og KN03

(35 mg, 0,346 mmol, Baker) ble tilsatt til denne opp-løsningen. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer og deretter ved romtemperatur i 3 0 timer. Blandingen ble helt i isvann (10 g) og presipitatet ble oppsamlet ved filtrering.

Presipitatet ble oppløst i IN NaOH (10 ml), deretter surgjort til pH = 2 med 4N HCl til å gi kremaktig presipitat, som ble oppsamlet ved filtrering og tørket i luft ved 50°C i 4 timer, hvilket gir rent (ved NMR) 5-brom-6-nitro-7-fluor-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (81 mg, 90 %), som et hvitt amorft faststoff. Sm.p. fra 320-325°C (spaltes fra 290°C). IR(KBr, cm"<1>): 3416, 3071, 2952, 1721, 1609, 1546. NMR ^H, DMSO-d6) : 8 7,146 (d, J = 10,2Hz, 1H) , 11,432 (s, 1H) , 12,340 (s, 1H) . HRMS: beregnet for C8H3N304BrF (M+) m/z: 302,9290, funnet: 302,9290.

Eksempel 14

Fremstillin<g> av 5- brom- 6( 8)- nitro- 7- trifluormetyl- 1. 4-dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metoden til Cheeseman, supra, ble tilpasset. 5-brom-7-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (75 mg, 0,24 mmol) ble oppløst i konsentrert H2S04 (1 ml) ved 0°C med omrøring, hvortil det ble tilsatt KN03 (30 mg, 0,28 mmol, Baker) ved 0°C med omrøring. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 2 timer, og deretter ved romtemperatur i 1 døgn. Fargen på blandingen endret seg til gulbrun. Den ble deretter helt i isvann (10 g) for å separere det lysegule presipitatet. Presipitatet ble oppsamlet ved filtrering og vasket med destillert vann (1 ml) etterfulgt av etanol (2 x 1 ml) til å gi rå 5-brom-6(8)-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (78 mg, 92 %), som inneholder noe isomer ved NMR. Krystallisering fra DMSO/H20 ga rent produkt som hvite mikrokrystaller. Sm.p. 290-292°C. IR (KBr, cm"<1>): 3435, 3143, 1713, 1613, 1555. (NMR (<X>H, DMSO-d6): 6 7,519 (s, 1H) for 6-nitro, 7,960 (s, 1H) for 8-nitro (6:8 = 70:30), 11,811 (s, 1H) , 12,391 (s, 1H). HRMS: beregnet for C9H3N304<F>3Br (M+) m/z: 352,9258, funnet: 352,9270.

Generelt

I de følgende syntesene ble reagensene anvendt slik de ble mottatt med mindre annet er indikert. Smeltepunkter ble registrert på et Mel-Temp smeltepunktsapparat og er ukorrigerte. Prøver ble anbragt i blokken når temperaturen var

>250°C for å minimalisere spalting forut for smelting. Kolonnekromatografi ble utført i flashmodus på Davisil silikagel (200-425 mesh), med mindre annet er indikert. Analytisk tynnsjiktskromatografi ble utført på silikagel 60 F254 plater på aluminiumsbakside og visualisering ble utført med en ultrafiolett lampe. <1>H NMR-spektra ble registrert på en 300 MHz General Electric QE-300, kjemiske skift er rapportert i delta-enheter i forbindelse med restprotonsignaler av de deutererte løsningsmidlene (CHCH3, d 7,26; CHD2OD, d 3,30; CD3SOCD2H, d 2,49; CD3COCD2H, d 2,04). <13>C NMR-spektra ble kjørt ved 75 MHz. Infrarød spektra ble oppnådd på et Nicolet 5DXB FT-IR spektrometer. Absorpsjoner registrert i bølgetall (cm"<1>) og intensiteten av absorpsjonene er indikert ved bokstavene s (sterk), m (medium), og w (svak). Massespektra ble registrert på et VG ZAB-2-HF massespektrometer med et VG-11-250 datasystem, i elektronioniseringsmodus (70 eV) med mindre annet er indikert. Mikroanalyser ble utført av Desert Analytics of Tuscon, Arizona.

Eksempel 15

Fremstilling av 5- amino- 6. 7- dibrom- 1, 4- dihydro- 2, 3- kinoksalindion

Til en omrørt blanding av 5-nitro-6,7-dibrom-1,4-dihydro-2,3 - kinoksalindion (327 mg, 0,89 mmol) i etanol (10 ml) ble det tilsatt SnCl2 -2H20 (1,0 g, 4,45 mmol) i en porsjon. Blandingen ble kokt under tilbakeløp ved 80°C (oljebad 90°C) med omrøring i 4 timer. Blandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og det gule presipitatet ble oppsamlet ved filtrering, etterfulgt av vasking med kald etanol (2x1 ml) for oppnåelse av 227 mg (76 %) av det i overskriften angitte produkt i rå versjon (inneholder mindre mengder urenheter ved NMR) . Krystallisering fra DMS0/H20 ga 193 mg av det i overskriften angitte produkt i ren form som lysegule nåler, sm.p. 324-326°C (spalting), med endring av farge fra 270°C. IR(KBr, cm"<1>): 3456, 3281, 1700, 1643. NMR (<1>H, DMSO-d6) : d 5,844 (s, 2H), 6,732 (s, 1H), 11,257 (s, 1H), 11,810 (s, 1H). Renhet: >96,96 % ved HPLC. HRMS: beregnet for C8H5N302Br2 (M+) m/z: 332,8747, funnet: 332,8754. Styrke i forhold til DCK: 341 %.

Eksempel 16

Fremstilling av 5- amino- 6. 7- diklor- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Til en omrørt blanding av 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (110 mg, 0,4 0 mmol) i etanol (6 ml) ble det tilsatt SnCl2 -2H20 (448 mg, 2,0 mmol) i en porsjon. Blandingen ble kokt under tilbakeløp ved 80°C (oljebad 90°C) med omrøring i 1 time for dannelse av en klar oppløsning og kontinuerlig kokt under tilbakeløp i ytterligere 3 timer. Blandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og det gule presipitatet ble oppsamlet ved filtrering, og vasket med kald etanol (2x1 ml) til å gi 61 mg (62 %) av den i tittelen angitte forbindelse i rå form (inneholder mindre mengder urenheter ved NMR) . Krystallisering fra DMS0/H20 ga 43 mg av den i overskriften angitte forbindelse i ren form som lysegule nåler, sm.p. >350°C (spalting), fargen endret fra 320°C. IR(KBr, cm"<1>): 3468, 3389, 3057, 1695, 1636, 1596, 1397. NMR (<1>H, DMSO-d6) : 6 5,935 (s, 2H) , 6,595 (s, 1H) , 11,317 (s, 1H) , 11,868 (s, 1H). Renhet: >98,95 % ved HPLC. HRMS: beregnet for C8H5N302Br2 (M+) m/z: 244,9757, funnet: 244,9740. Styrke i forhold til DCK: 323 %.

Eksempel 17

Fremstilling av 5- amido- 6. 7- diklor- l, 4- dihydro- 2, 3- kinoksalindion

Til en omrørt oppløsning av 5-amino-6,7-diklor-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (61,5 mg, 0,25 mmol) i tørket DMF (7 ml) ble det tilsatt trietylamin (33 mg, 32 mmol destillert før anvendelse) og acetylklorid (20 mg, 0,255 mmol, destillert før anvendelse). Blandingen ble en gul oppløsning etter 2 minutter. Etter 2 timer ved 25°C kom et presipitat til syne og omrøring ble fortsatt over natten, og under denne tids-perioden kom mer hvitt presipitat til syne. Presipitatet ble oppsamlet ved filtrering og vasket vann (2x1 ml), hvilket gir 34 mg av et hvitt pulver som var den i overskriften angitte forbindelse i rå form (inneholder noen urenheter ved NMR). Filtratet ble tilsatt til vann (15 ml) til å gi et presipitat og dette ble oppsamlet ved filtrering og vasket med vann

(2,1 ml), hvilket gir 29 mg rent produkt (ved NMR). Det totale utbyttet var 88 %. Krystallisering fra DMSO/H20 ga 25 mg av den i overskriften angitte forbindelse i ren form som hvite mikrokrystaller, sm.p. 320-322°C (spalting fra 315°C). IR(KBr, cm"<1>): 3500, 3162, 3056, 1706, 1606, 1531. NMR (<1>H, DMSO-d6) : d 2,065 (s, 3H) , 7,236 (s, 1H) , 9,621 (s, 1H), 11,655 (s, 1H), 12,096 (s, 1H). HRMS: beregnet for C10H7N3O3Cl2 (M+) m/z: 286,9863, funnet: 286,9859. Styrke i forhold til DCK: 44 %.

Eksempel 18

Fremstilling av 5- iod- 6. 7- diklor- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

A. Syntese av 4. 5- diklor- 6- jod- 2- nitroanilin: Prosedyren til Sy, W.W. (Synthetic Communications 22 (22):3215-19 (1992)) ble tilpasset. Til en oppløsning av 4,5-diklor-2-nitroanilin (4,14 g, 2,0 mmol, anvendt slik den ble mottatt) i EtOH

(40 ml) ble det tilsatt jod (521 g, 2,05 mmol, anvendt slik den ble mottatt) og Ag2S04 (622 mg, 2,0 mmol, anvendt slik den

ble mottatt). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 døgn (undersøkt ved TLC), deretter ble det dannede gule presipitatet fjernet ved filtrering. Filtratet ble inndampet til tørrhet under redusert trykk, hvilket gir 600 mg av rå 4,5-diklor-6-jod-2-nitroanilin. Dette ble oppløst i diklor-metan og vasket med 5 % natriumhydroksydoppløsning (2 0 ml), etterfulgt av vann. Det organiske laget ble tørket over MgS04 og inndampet til tørrhet. Resten ble kromatografert over silikagel og eluert med kloroform, hvilket gir råprodukt. Dette ble renset ved preparativ TLC (eluering med kloroform) til å gi rent 4,5-diklor-2-jod-6-nitroanilin

(356 mg, 53 %) som et gult pulver. NMR (<1>H, CDC13): 6,940 (s, 2H); 8,378 (s, 1H).

B. Syntese av 1. 2- diamino- 4- diklor- 6- jodbenzen: Til en omrørt blanding av 2-nitro-4,5-diklor-6-jodanilin (216 mg, 0,648 mmol) i etanol (5 ml) ble det tilsatt SnCl2-2H20 (730 mg, 3,24 mmol) i en porsjon. Blandingen ble kokt under til-bakeløp ved 80°C (oljebad 90°C) med omrøring i 0,5 time for dannelse av en klar oppløsning og deretter ble kokingen under tilbakeløp forsatt i ytterligere 0,5 time. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur og isvann (10 g) ble tilsatt. pH ble justert til pH ~ 7 med vandig 5 % NaHC03-oppløsning og blandingen ble ekstrahert med etylacetat. Ekstraktene ble tørket over MgS04 og konsentrert til tørrhet til å gi 156 mg (80 %) av 1,2-diamino-4,5-diklor-6-jodbenzen som et brunt faststoff. NMR (<X>H, DMS0-d6) : 4,954 (s, 2H) ; 5,162 (s, 2H) , 6, 722 (s, 1H) .

C. Syntese av 5- jod- 6, 7- diklor- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion : Prosedyren til Foged, C. og Journal, P. (J. of Lab. Compd. and Radiopharmac. XXXI (5):365-373 (1992)) ble tilpasset. Til en omrørt blanding av 1,2-diamino-4,5-diklor-6-jodbenzen (70 mg, 0,23 mmol) i 2N HCl (10 ml) ble det tilsatt oksalsyre (32 mg, 0,2 5 mmol, anvendt slik den ble mottatt) i en porsjon. Blandingen ble kokt under tilbakeløp ved 12 0-125°C i 3 timer, deretter avkjølt til romtemperatur over natten. Blandingen ble sentrifugert og det røde faststoffet ble vasket to ganger med kaldt vann (2x1 ml), oppsamlet ved filtrering, og tørket ved 60°C med redusert trykk i 2 timer, hvilket gir 60 mg av den i overskriften angitte forbindelse (73 %) i rå form, som et rødt pulver. Prøven ble oppløst i IN NaOH (8 ml) og det uoppløselige materialet ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble surgjort til pH=6, hvilket gir 46 mg av den i overskriften angitte forbindelse. Krystallisering fra DMSO/H20 ga 19 mg rent produkt (23 %) som røde mikrokrystaller, sm.p.: 335-338°C (spalting begynte ved 330°C). IR (KBr, cm"<1>) 3437, 3325, 1750, 1712, 1475, 1393. NMR (<X>H, DMSO-d6) : 6 7,273 (s, 1H) ; 10,282 (s, 1H) ; 12,038

(s, 1H). HRMS: beregnet for C8H3N202C12I (M+) m/z: 355,8614, funnet: 355,8603. Styrke i forhold til DCK: 152 %.

Eksempel 19

Fremstilling av 5- jod- 6- nitro- 7- klor- l. 4- dihydro- 2. 3- kinoksalindion

Metoden til Cheeseman, G.W.H., (J. Chem. Soc. 1170 (1962)) ble tilpasset. 5-jod-7-klor-l,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (96 mg, 0,33 mmol) ble oppløst i konsentrert H2S04 (1,0 ml) ved 0°C i 3 0 minutter og deretter ble KN03 (36 mg, 0,36 mmol, Baker) tilsatt i denne oppløsningen. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 0,5 time og deretter ved romtemperatur i 30 timer. Den ble helt i isvann (5 g). Et presipitat kom til syne og ble oppsamlet ved filtrering og ga 101 mg av den i overskriften angitte forbindelse i rå form. Prøven ble oppløst i IN KOH (5 ml) og deretter ble rødt presipitat fjernet ved filtrering. Filtratet ble sugjort til pH=2 med 4N HCl til å gi et brunt presipitat som ble oppsamlet ved filtrering og deretter lufttørket ved 50°C i 4 timer. Den i overskriften angitte forbindelse (75 mg, 67 %) ble oppnådd som et brunt pulver. Krystallisering fra DMSO/H20 ga ren forbindelse

(34 mg) som brune mikrokrystaller, sm.p.: 388-390°C (spalting) . IR(KBr, cm"1) : 3462, 3200, 3050, 1712, 1587, 1537. NMR (<X>H, DMS0-d6) 6 7,289 (s, 1H); 10,846 (s, 1H), 12,225 (s, 1H). HRMS: beregnet for C8H3N304C1I (M+) m/z: 366,8855, funnet: ennå ikke bestemt. Styrke i forhold til DCK: delvis aktiv.

Eksempel 20

Bindingsanalyser og dyremodeller som anvender - 1, 4- dihydrokinoksalin- 2 . 3- dioner.

Metoder.

A. 1fiM <g>lycinstimulert f3Hl - MK801 - bindingsanalyse. GLycinantagoniststyrke in vitro ble bestemt ved anvendelse av 1 /iM glycinstimulert [<3>H]-MK801-bindingsanalyse. Denne analysen drar fordel av det faktum at bindingen av [<3>H]-MK801 til PCP-reseptoren inne i poren av NMDA-kanalen er avhengig av nærværet av både glutamat og glycin. I fravær av glycin men i nærvær av glutamat kan ikke [<3>H]-MK801 binde effektivt til PCP-reseptoren, forbi NMDA-kanalen forblir lukket og til-gangen av [<3>H]-MK801 til PCP-reseptoren inne i den lukkede kanalporen begrenses i sterk grad.

Analysen ble utført ved anvendelse av rottehjernemembran-homogenater som er beriket med hensyn til NMDA-reseptorer. Membranene ble preparert som følger. Frosne rottehjerner (anskaffet fra Pel-Freez, Rogers, Arkansas) ble homogenisert i 15 volumer (vekt/volum) av iskald 0,32 M sukrose. Homogenatet ble sentrifugert ved 1.000 x g i ti minutter. Supernatanten ble oppsamlet og sentrifugert i tyve minutter ved 44.000 x g. Pelleten ble suspendert i 15 volumer vann (relativt til opprinnelig hjernevekt). Homogenatet ble igjen sentrifugert ved 44.000 x g i tyve minutter. Pelleten ble resuspendert i 5 volumer vann og suspensjonen ble frosset-tint to ganger. Etter den siste tinesyklusen ble suspensjonen bragt til 15 volumer vann og sentrifugert ved 44.000 x g i tyve minutter. Pelleten ble resuspendert i 5 volumer iskald 10 mM HEPES, titrert til pH 7,4 med KOH inneholdende 0,04 % Triton X-100. Membraner ble inkubert med Triton/HEPES-bufferen ved 37°C i femten minutter. Volumet ble deretter bragt til 15 med iskald 10 mM HEPES, pH 7,4, og sentrifugert/vasket tre ganger med sentrifugeringer på 44.000 x g mellom vaskingene. Sluttpelleten ble suspendert i 3 volumer 50 mM HEPES, pH 7,4, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt med en standard fargestoffbindingsproteinanalyse (Bio-Rad, Richmond, CA). Suspensjonen ble lagret ved -80°C inntil dens anvendelse. Det ble kun anvendt vann av HPLC-kvalitet for alle buffere og suspensjoner/vaskinger. De omfattende vaskingene var nødvendig for å fjerne så mye endogenglycin fra membranpreparatet som mulig.

På dagen for analysen ble de tidligere preparerte membranene tint og 5 mM Tris/HCl-buffer, pH 7,4, ble tilsatt til å gi en sluttproteinkonsentrasjon på 0,156 mg/ml. For bindingsanalyser ble 0,8 ml membraner pipettert inn i polypropylenrør etterfulgt av 0,033 ml av 15,1 /xM 5,7-diklorkynurensyre (DCK), 0,033 ml 30,3 /xM glycin i buffer (eller buffer alene), 0,033 ml 303 /xM glutamat i buffer (eller for kontroller,

0,1 ml 1 mM PCP istedet for DCK/gly/glu, 0,033 ml glycinantagonist i buffer (eller buffer alene) og 0,1 ml buffer inneholdende 200.000 cpm [<3>H]-MK801. Ikke-spesifikk binding ble definert som forskjell i binding som forekom i fravær eller nærvær av PCP (sluttkonsentrasjon: 100 /xM) . For å bestemme effekten av 1 /xM glycin på bindingen av [3H] -MK801 ble bundet radioaktivitet i nærvær av 10 /xM glutamat alene (sluttkonsen-tras jon) subtrahert fra den bundede radioaktivitet i nærvær av både 10 /xM glutamat og 1 /xM glycin (sluttkonsentrasjon) . En 500 nM konsentrasjon (sluttlig) av 5,7-diklorkynurensyre (DCK) ble tilsatt til alle analyserør. Denne konsentrasjonen av glycinanatagonisten DCK "bufret" det meste av det resterende endogene glycin som ikke var blitt fjernet ved de omfattende vasketrinnene som var blitt utført under membran-prepareringsprosedyren. Den 500 nM DCK forstyrret ikke stimuleringen av [<3>H]-MK801-binding som ble bevirket ved tilsetningen av 1 /xM eksogen glycin.

Analysene ble inkubert i 12 0 minutter ved romtemperatur, hvoretter den membranbundede radioaktivitet ble isolert fra den fri radioaktivitet ved vakuumfiltrering gjennom Whatman glassfiberfiltre som var blitt forbehandlet med 0,3 % polyetylenimin. Filtrering ble gjennomført ved anvendelse av en Brandel 48 brønncellehøster. Filtrerte membraner ble vasket tre ganger med 3 ml hver av iskald buffer. Filtre ble overført til seintillasjonsflasker og 5 ml scintillasjons-cocktail ble tilsatt. Flaskene ble rystet over natten og radioaktiviteten ble telt ved væskescintillasjonsspektroskopi. Analysene ble utført in triplo og alle eksperimenter ble utført minst tre ganger.

Inhibering-doserespons-kurver ble konstruert ved anvendelse av økende konsentrasjoner av glycinantagonister fra 5 nM til 330 iiM. IC50-verdier ble bestemt for forbindelser som er aktive i inhibering av 1 xxM glycinstimulert [3H] -MK801-binding ved datamaskinassistert plotting av inhiberingskurver og interpolasjon. Når forbindelser ble funnet å inhibere glycinstimulert [<3>H]-MK801-binding, ble eksperimenter utført for å bestemme hvorvidt inhiberingen av den glycinstimulerte [<3>H]-MK801-binding faktisk var mediert ved glycinbindingsstedet av NMDA-reseptoren. I disse eksperimentene ble en fast konsentrasjon av antagonist som var tilstrekkelig til å gi en mer enn 95 % inhibering av den 1 /xM glycinstimulerte [<3>H]-MK801-binding inkubert med membranene uten noe ytterligere glycin (over 1 xxM) og i nærvær av økende konsentrasjoner av ytterligere glycin (2 /xM til 1 xxM) . Hvis inhiberingen av [<3>H]-MK801-binding av medikamentet i nærvær av 1 mM glycin ble fullstendig reversert ved tilsetning av økende konsentrasjoner av glycin, da ble inhiberingen av [<3>H]-MK801-binding mediert av medikamentet som fungerer som en antagonist ved glycinbindingsstedet av NMDA-reseptoren.

Etter konstruering av inhibering-doserespons-kurver og bestemmelse av glycinreverserbarhet, ble K^-verdier for glycinantagonistene beregnet ved anvendelse av Cheng og Prusoff-ligningen som benytter de eksperimentelt bestemte IC50-verdiene, den kjente konsentrasjonen av glycin i analysen (1 xxM) og den kjente affiniteten av glycin for glycinbindingsstedet av NMDA-reseptoren (100 nM).

B. f3- Hl - AMPA- radioligandbindingsanalyse.

De samme rottehjernemembranhomogenatene som ble anvendt for den 1/xM glycinstiumlerte [3H] -MK801-bindingsanalysen ble anvendt for denne analysen. På dagen for analysen ble de frosne membranene (preparert som beskrevet i det foregående) tint og fortynnet med 3 0 mM Tris/HCl-buffer inneholdende 2,5 mM CaCl2 og 100 mM KSCN, pH 7,4, til å gi en slutt-membrankonsentrasjon på 1,2 5 mg/ml membranprotein. For bindingsanalysen ble 0,8.ml membranhomogenat tilsatt til polypropylenrør etterfulgt av 0,033 ml medikament og 0,067 ml buffer (eller for kontroller av 0,1 ml buffer alene) og 0,1 ml buffer inneholdende 200.000 cpm [<3>H]-AMPA. Analysen ble inkubert i 30 minutter på is. Bundet radioaktivitet ble separert fra fri radioaktivitet ved filtrering over Whatman glassfiberfiltre (forbehandlet med 0,3 % polyetylenimin) ved anvendelse av en Brandel 48 brønncellehøster.

Filtrerte membraner ble vasket tre ganger med 3 ml hver av iskald buffer. Filtrene ble overført til scintillasjonsflasker og 5 ml seintillasjonscocktail ble tilsatt. Flaskene ble rystet over natten og radioaktivitet ble telt ved væskescintillasjonsspektroskopi. Ikke-spesifikk binding ble bestemt ved radioaktiviteten som forble bundet til membranene i nærvær av 10 mM glutamat. Inhibering-doserespons-kurver ble konstruert ved tilsetning av økende konsentrasjoner av medikament fra 10 nM til 100 fiM.

C. r3Hl- kainatradioligandbindingsanalyse.

Det samme membranpreparatet som ble anvendt for [<3>H]-AMPA-bindingsanalysen ble anvendt. På dagen for analysen ble de frosne rottehjernemembranene tint og 5 mM Tris/HCl-buffer, pH 7,4, ble tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon på

0,5 mg/ml membranprotein. For bindingsanalysen ble 0,8 ml membranhomogenat tilsatt til polypropylenrør etterfulgt av 0,033 ml medikament og 0,067 ml buffer (eller for kontroller av 0,1 ml buffer alene) og 0,1 ml buffer inneholdende 200.000 cpm av [<3>H]-kainat. Analysen ble inkubert i to timer på is. Bundet radioaktivitet ble separert fra fri radioaktivitet ved filtrering over Whatman glassfiberfiltre

(forbehandlet med 0,3 % polyetylenimin) ved anvendelse av en Brandel 48 brønncellehøster. Filtrerte membraner ble vasket tre ganger på 3 ml hver av iskald buffer. Filtrene ble over-ført til scintillasjonsflasker og 5 ml seintillasjonscocktail ble tilsatt. Flaskene ble rystet over natten og radioaktivitet ble telt ved væskescintillasjonsspektroskopi.

Ikke-spesifikk binding ble bestemt ved radioaktiviteten som forble bundet til membranene i nærvær av 10 mM glutamat. Inhibering-doserespons-kurver ble konstruert ved tilsetning av økende konsentrasjoner av medikament fra 250 nM til 330 fiM. D. Evaluering av virkningsfullhet av glycinantagonister forinhibering av glutamatnevrotoksisitet i rottehjerne-korteks- nevroncellekultursystem.

En eksitotoksisitetsmodell modifisert etter den utviklet av Choi (Choi, D.W., J. Neuroscience 7:357, 1987), ble anvendt for å teste antieksitotoksisk virkningsfullhet av nye glycinantagonister. Rotteføtuser ved embryonisk døgn 19 ble fjernet fra gravide rotter som ble paret ved et bestemt tidspunkt. Hjernene ble fjernet fra føtusene og cerebral-korteksen ble dissekert. Celler fra den dissekerte korteksen ble dissosiert ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk røring og enzymatisk digestion i samsvar med metoden til Landon og Robbins (Methods in Enzymology 124:412, 1986). De dissosi-erte celler ble ført gjennom en 80 /xM nitex-sikt, og leve-dyktigheten av cellene ble vurdert ved hjelp av Trypan Blue. Cellene ble utplatet på poly-D-lysinbelagte plater og inkubert ved 37°C i en atmosfære inneholdende 91 % 02/9 % C02. Seks døgn senere ble fluor-d-uracil tilsatt i to døgn for å undertrykke ikke-nervecellevekst. Ved kulturdøgn 12 ble de primære nevronkulturer eksponert for 100 xxM glutamat i fem minutter med eller uten økende doser av glycinantagonist eller andre medikamenter. Etter fem minutter ble kulturene vasket og inkubert i 24 timer ved 37°C. Nevronal celle-ødeleggelse ble kvantifisert ved å måle laktatdehydrogenase (LDH) aktivitet som var blitt frigitt i kulturmediet. LDH-aktiviteten ble målt i samsvar med metoden til Decker et al.

(Decker et al., J. Immunol. Methods 15:16, 1988).

E. Vurdering av antikonvulsiv aktivitet av glycinantagonister

i den audiogene anfallmodell i DBA- 2 mus.

DBA-2 mus ble anskaffet fra Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Ved en alder av mindre enn 27 døgn utvikler disse musene et tonisk anfall i løpet av fem til ti sekunder og dør når de utsettes for en lyd på 14 kHz (sinusbølge) ved 110 dB (Lonsdale, D., Dev. Pharmacol. Ther. 4:28, 1982). Beskyttelse mot anfall ble definert når dyrene som var injisert med medikament 3 0 minutter forut for lydeksponering ikke utviklet et anfall og ikke døde i løpet av en ett minutts eksponering for lyden. 21 dager gamle DBA-2 mus ble benyttet for alle eksperimentene. Forbindelser ble alltid gitt intraperitonealt i enten saltoppløsning, DMSO eller polyetylenglykol-400. Passende løsningsmiddelkontroller ble alltid inkludert i hvert eksperiment. Doseresponskurver ble konstruert ved å gi økende doser av medikament fra 1 mg/kg til 100 mg/kg.

Hver dosegruppe (eller løsningsmiddelkontroll) besto av minst seks dyr.

F. Vurdering av antikonvulsiv virkningsfullhet av nye medikamenter i den pentylentetrazol ( PTZ) induserte

anfalIstesten.

Swiss/Webster mus utvikler, når de er injisert med 50 mg/kg PTZ (i.p.), et minimalt klonisk anfall med en varighet på omtrent fem sekunder i løpet av fem til femten minutter etter medikamentinjeksjon. Antikonvulsiv virkningsfullhet av et glycinantagonist (eller annet) medikament ble definert som fraværet av et anfall når et medikament ble gitt 3 0 minutter før PTZ-tilføring og et anfall ble ikke utviklet i opp til 45 minutter etter PTZ-administrering. Glycinantagonist eller andre medikamenter ble alltid gitt intraperitonealt i enten saltoppløsning, DMSO eller polyetylenglykol-400. Passende løsningsmiddelkontroller ble alltid inkludert i hvert eksperiment. Doseresponskurver ble konstruert ved å gi økende doser medikament fra 1 mg/kg til 100 mg/kg. Hver dosegruppe (eller løsningsmiddelkontroll) besto av minst seks dyr.

G. Vurdering av virkningsfullhet av glycinantagonister for å

beskytte mus mot NMDA- indusert død.

Når mus injiseres med 200 mg/kg N-metyl-D-aspartat (NMDA) i.p., vil dyrene utvikle anfall etterfulgt av død i løpet av fem til ti minutter. Glycinantagonister ble testet for deres evne til å forebygge NMDA-indusert død ved å gi medikamentene i.p. 30 minutter forut for NMDA-tilføringen. Glycinantagonist eller andre medikamenter ble alltid gitt intraperitonealt i enten saltoppløsning, DMSO eller polyetylenglykol-400. Passende løsningsmiddelkontroller ble alltid inkludert i hvert eksperiment. Doseresponskurver ble konstruert ved å gi økende doser medikament fra 1 mg/kg til 100 mg/kg. Hver dosegruppe (eller løsningsmiddelkontroll) besto av minst seks dyr.

H. Vurdering av ataksiske bivirkninger hos mus ved rotorod-ataksitesten .

Graden av motorisk inkoordinasjon ble evaluert ved anvendelsen av en standard rotorod-tredemølle for mus (Hugo Basile, Varese, Italia). Mus vennes til tredemøllen ved å anbringe dem på denne forut for det faktiske eksperiment. Normal motorisk koordinasjon defineres som evnen til hver mus til å forbli på rotorod-tredemøllen fortløpende for en vilkårlig bestemt tid (ett minutt). Dette tjener som en basis for evaluering av effekten av hvert medikament på motorisk inkoordinasjon. Se Dar, M.S., J. Pharm. Pharmacol. 40:482-487, 1988, Dar, M.S. et al., Life Sei. 33:1363-1374, 1983, og Dar og Wooles, Life Sei 39:1429-1437, 1986. Mus ble injisert med enten vehikkel (DMSO), 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion eller 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion oppløst i DMSO ved doser på 1-300 mg/kg (i.p., seks dyr pr. medikamentdose eller vehikkelkontroll). 30 minutter etter injisering ble musene anbragt på rotorod-tredemøllen. Tredemøllen ble drevet ved en hastighet på 6 opm. De dyr som var istand til å forbli på tredemøllen i 60 sekunder ble vurdert til ikke å ha noen signifikant motorisk inkoordinasjon. Den toksiske dose50 (T<D>50) ble betegnet som den dose medikament hvorved 50 % av dyrene faller av rotorod-tredemøllen i løpet av mindre enn 6 0 sekunder.

Resultater.

Tabell II viser resultatene av bindingsanalyser ved glycinbindingsstedet, kainat- og AMPA-reseptorene med 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (nr. 1) og 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (nr. 2).

Tabell III viser resultatene av de in vivo antikonvulsive dyremodellene som anvender forbindelser nr. 1, nr. 2 og nr.

13 (audiogene anfall hos DBA-2 mus, pentylentetrazolinduserte anfall hos Swiss/Webster-mus, og NMDA-induserte anfall/død hos Swiss/Webster-mus).

Tabell IV viser bindingsdata, resultater av in vivo antikonvulsive dyremodell og resultater av test av nevrobeskyttende virkningsfullhet (in vitro) for andre 1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dioner:

Tabell V viser resultater av en in vitro analyse som anvender en eksitotoksisitetsmodell som involverer hjernecellekulturer som viser at forbindelser nr. 1 og nr. 2 forebygger nerve-celledød.

Tabell VI viser resultatene av in vivo testing av 6,7-disub-stituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner i den DBA-2 audiogene anfallsmodell.

Eksempel 21

Global ischemisk beskyttelse med 5- klor- 7- trifluormetyl- 1, 4-dihydrokinoksalin- 2, 3- dion.

En serie forskjellige evalueringer ble utført på doser av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion for å bestemme den biologiske aktiviteten av denne forbindelsen både i normale gerbiler og i dyr som er eksponert for fem minutter med bilateral karotidokklusjon. Se skjema VII. Disse studier ble utført i dyr som var bevisste og ikke hadde noen andre farmakologiske midler administrert i seg. Gerbiler ble preinstrumentert 48 timer forut for ischemi for å tillate fullstendig eliminering av den pentobarbitale bedøvelse som anvendes. Når testet med medikamenter ble dyrene gitt IP-injeksjoner av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion eller vehikkel. I tilfellet med flere injeksjoner ble dyr gitt IP-injeksjoner med to timers mellomrom og den siste injeksjonen ble gitt 30 minutter forut for den ischemiske perioden eller i tilfellet med etterbehandling ble dyrene gitt injeksjoner ved 30 minutter, to timer, fire timer og seks timer etter ischemisk reperfusjon.

For å vurdere den direkte farmakologiske aktiviteten eller potensielle aktivitet av denne forbindelsen ble naive gerbiler injisert med enten saltoppløsning eller forskjellige doser av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. De oppførselsmessige forandringene ble vurdert ved anvendelse av et lysstrålekammer for lokomotorisk aktivitet som er en arena med en diameter på 61 cm (2') med lysstråle-detektering. Dyrene anbringes individuelt i kamrene med diameter på 61 cm. Kamrene oppbevares i et kabinett som er lukket og støy dempes ved anvendelse av både en generator for hvit bakgrunnsstøy og en vifte. Dyrene anbringes i disse kamrene i tilfellet med den initiale farmakologiske evalueringen i en periode på seks timer og den totale aktiviteten under hver etterfølgende time akkumuleres ved anvendelse av datamaskinstyrte systemer.

Saltoppløsning resulterte i en initial høy aktivitetsgrad hvilket demonstreres i fig. 1, idet kontrolldyrene viser et første times aktivitetsnivå på omtrent 1600 tellinger. Dette nivå for kontrolldyraktivitet er typisk for gerbilen under disse instrumentelle betingelsene. Ettersom forsøket skred frem reduserte dyrene sin eksploratoriske aktivitet og ved slutten av perioden avtok aktiviteten til omtrent 250 tellinger pr. time.

Over hele det testede doseområde (1,0-32 mg/kg) ga ikke 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion noen ensartet forandring i spontan lokomotorisk aktivitet. Opp-førselen til kontrolldyr ble karakterisert ved en høy grad av lokomotorisk aktivitet i den første timen av testen og en markert redusert aktivitetsgrad i den siste timen av det seks timers forsøket. Observasjon av gerbilene, i tillegg til de lokomotoriske aktivitetstestene, indikerte at doser så høye som 32 mg/kg ikke endret normal oppførsel. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ved 1,0 mg,

3,2 mg/kg, 10 mg/kg og 32 mg/kg (fig. 2-5) hadde ingen signifikant effekt på hverken den initiale eksploratoriske grad eller den terminale eksplorasjonsgrad. Der var noen mindre forskjeller som indikerte at hvis dosen ble ytterligere økt så kunne der faktisk være noen oppførselsmessige funksjons-nedsettende effekter. Ved en dose på 32 mg/kg var den initiale eksploratoriske aktiviteten omtrent 850 til 900 tellinger sammenlignet med 1200 tellinger i saltoppløsnings-kontrollgruppen (fig. 5). Ettersom tiden skred frem avtok

aktiviteten på en måte lik den for saltoppløsningskontrolldyr og avtok til slutt til et signifikant lavt nivå (sammenlignet med den første timen), som var lignende på tvers av en rekke forskjellige doser. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion synes således ikke å ha hverken signifikant oppførselsmessig stimulerende (PCP-lignende) eller funksjons-nedsettende effekter, hvilket kan observeres med NMDA-reseptorantagonistene MK801 (se US-PS 4.888.347) og CGS-19755 (cis-4-fosfonometyl-2-piperidinkarboksylat) . Alle dyrene synes å tolerere injeksjoner opp til 32 mg/kg ganske bra og viste ingen tegn på alvorlig toksisitet. Alle dyrene over-levde en periode på syv døgn etter disse dosene.

I den neste fasen av evalueringen av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble gerbiler forbehandlet med ulike doser av forbindelsen og deretter eksponert for en fem minutters periode med bilateral karotidokklusjon. Etter initieringen av reperfusjon ble dyrene anbragt i det sirkulære testeapparatet for lokomotorisk aktivitet og aktiviteten ved begynnelsen av den første timen etter reperfusjon ble overvåket for de etterfølgende fire timer.

Kontroildyrene som ikke var eksponert for ischemi og gitt injeksjoner av saltløsning forut for at de ble anbragt i det lokomotoriske aktivitetskammeret viste et typisk aktivitets-mønster som i den første timen med lokomotorisk aktivitet var betydelig høyere enn under alle andre timer og avtok progres-sivt i løpet av de fire timene til en svært lav verdi. Fig. 6 (åpne symboler) demonstrerer dette aktivitetsmønsteret for kontrolldyr som er typisk for de fleste gnagere når anbragt i nye omgivelser for testing av lokomotorisk aktivitet. I motsetning til den progressive reduksjon i aktivitet i løpet av den fire timers testeperioden, demonstrerte kontro11dyrene som ble eksponert for fem minutter kortikal ischemi et fullstendig forskjellig mønster av lokomotorisk aktivitet. Under den første timen var der en signifikant reduksjon i aktivitet som ble etterfulgt en progressiv økning hvor aktiviteten i løpet av den fjerde timen var ti ganger høyere enn den som ble demonstrert av de dyr som ikke var utsatt for karotid-okklus jon (fig. 6, lukkede symboler). Disse resultatene er typiske og er et pålitelig resultat av de endringer som forårsakes av fem minutter med bilateral karotid okklusjon i gerbilen.

Separate grupper av gerbiler ble forbehandlet med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion 30 minutter før begynnelsen av karotidokklusjon og deretter anbragt i den lokomotoriske aktivitet etter en times reperfusjon. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion avverget både den postischemiske reduksjon og økning i aktivitet (fig. 7-10, lukkede symboler). Postischemiske reduksjoner i aktivitet var nær null under den første timen etter reperfusjon. Forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2, 3-dion reduserte eller avverget på en pålitelig måte denne tidlige undertrykkelse av oppførsel. I tillegg forebygget 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion den postischemiske stimulering av oppførsel. Alle doser forebygget stimuleringen av aktivitet som på en pålitelig måte inntreffer under den tredje og fjerde time etter reperfusjon (se fig. 7-10). Disse endringene i det postischemiske mønster under den første og fjerde timen for evaluering av den postischemiske perioden presenteres i fig. 11 og 12. Spesielt fig. 12 demonstrerer klart den dramatiske reduksjon i postischemisk hyperaktivitet under den fjerde timen med vurdering ved doser på 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion fra 0,32-32 mg/kg.

Av sammenlignende hensyn ble det også evaluert effekten av en serie I.P. forbehandlinger med ikke-strykninglycinantagon-isten 3-amino-l-hydroksypyrrolid-2-on (HA966). Når doser av HA966 ble administrert en time før begynnelsen av ischemi var der et klart skille mellom inaktive og aktive doser. 1 mg/kg HA966 syntes hverken å ha noen effekt eller å forverre de oppførselsmessige endringene som inntraff etter reperfusjon når dyrene ble testet for lokomotorisk aktivitet 24 timer etter reperfusjon. Likeledes når 3,2 mg/kg HA966 ble testet var der en enda større endring i lokomotorisk aktivitet hvori kontrolldyrene demonstrerte et totalt aktivitetsnivå på omtrent 3361 tellinger/time. Når dosen ble økt noe ble det observert signifikant beskyttelse mot de oppførselsmessige endringene indusert med bilateral karotidokklusjon. Både 5,6 mg/kg og 10 mg/kg HA966 syntes å være virkningsfulle for å avverge de postischemiske økninger i aktivitet etter 24 timer. Både 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og HA966 syntes således å være effektive for redu-sering av denne spesielle oppførselsmessige endring som er karakteristisk for cerebral ischemisk respons hos gerbilen.

Etter fullføring av evalueringene av enkeltdoseforbehandl-ingen ble gerbiler evaluert med flere injeksjoner av 32 mg/kg 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Doser ble administrert I.P. ved seks timer, fire timer, to timer og 3 0 minutter før begynnelsen av fem minutters ischemi. I etterbehandlingsmodaliteten ble doser på 32 og 100 mg/kg administrert 30 minutter, to timer, fire timer og seks timer etter begynnelsen av reperfusjonen.

I motsetning til 6-trifluormetyl-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 5,7-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (MNQX), ble en signifikant effekt av enkeltdoseetterbe-handling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion observert. Postischemisk behandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion avverget doseavhengig en økning i lokomotorisk aktivitet (fig. 13). I tillegg resulterte flere etterbehandlinger i en signifikant reduksjon i postreperfusjonsaktiviteten (fig. 14). Dette aktivitetsnivå var signifikant forskjellig fra enkeltdose-etterbehandling med den samme dosen.

Ved 24 timer ble alle dyrene evaluert for forskjeller i patruljerende oppførsel ved anvendelse av én radiell labyrint med åtte forgreninger. I denne prosedyren ble dyrene anbragt i det midtre startkammeret av labyrinten, barrieren ble fjernet og tiden og antall ganger dyrene gjør en feil ble registrert før undersøkelsen i alle de åtte forgreningene av labyrinten er fullført. En feil ble definert som det gjen-tatte besøk i en forgrening ved å gå inn i denne med hele kroppen men uten å omfatte halen til dyret. Hvis dyret fort-satte eller ikke forlot forgreningen i mer enn fem minutter ble forsøket terminert. I tilfellene med alle disse evalueringene overskred dyrene aldri avbrytningspunktet på fem minutter, og alle de åtte forgreningene ble på en vellykket måte undersøkt med forskjellige grader av feil. I kontroll-populasjonen av dyrene var antallet feil og undersøkelse av labyrinten uten noen tidligere erfaring (naive) omtrent seks feil. Dette er et gjennomsnittlig tall for en N på 28 gerbiler. Etter fem minutter bilateral karotidokklusjon og testing ved 24 timer, gjorde gerbilene et gjennomsnittlig antall feil på 21. Når dyrene ble forbehandlet med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion var der en signifikant reduksjon i antall utførte feil (X = 14). Disse data er presentert i fig. 15 og indikerer at der ikke bare er en endring i den 24 timers lokomotoriske aktivitet som gis av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion når den er gitt som en forbehandling før fem minutters ischemi, men

der synes også å være signifikant reduksjon av de

oppførselsmessige endringer som induseres med hensyn til yteevnen i labyrinten med de radielle forgreningene.

Etterbehandling med 32 mg/kg 5-klor-7-trifluormetyl-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion reduserte også svekkelsen av kort-tidshukommelsen 24 timer etter ischemi/reperfusjon. Dette er en enestående oppdagelse blant de forbindelser som er blitt testet i denne modellen. Mangelen på åpenbar oppførsels-messig effekt vil i tillegg antyde at mer aggressiv testing i denne og andre in vivo modeller er berettiget. Mangelen på åpenbar toksisk respons med høye doser av 5-klor-7-trifluormetyl - 1 , 4 -dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion antyder at det kan ha en sikkerhetsmargin som kan gjøre den til et godt terapeutisk emne.

Virkningen av fem minutter med bilateral karotidokklusjon på nevronal celledød i den dorsale hippocampus ble evaluert i dyr syv døgn etter ischemireperfusjonsskade. Tidligere studier har demonstrert at nevronal nedbrytning begynner å inntreffe tre døgn etter cerebral ischemi. Etter syv døgn har de nevroner som er blitt berørt og vil undergå cytolyse enten fullført nedbrytning eller er lett synlige som mørke kjerner og fortrengte kjerner med eosinofilt cytoplasma med pyknotiske kjerner. Lesjon med fem minutters ischemi er hovedsakelig begrenset i hippocampus til CAl-regionen av den dorsale hippocampus. Den intermediale laterale sone av hornet er upåvirket og den tannede gyrus og/eller i CA3 viser ikke patologi. Gerbiler ble bedøvet på dag 7 etter ischemi med 60 mg/kg pentobarbital. Hjernene ble perfusert trans-kardialt med iskald saltoppløsning etterfulgt av bufret para-formaldehyd (10 %). Hjernene ble fjernet, anbragt på egnet sted og det ble utført snitt. Snittene ble farget med hematoksylin-eosin og nevronale celletellinger ble bestemt uttrykt ved antallet nevronale kjerner/100 iim. Fig. 16 indikerer at normale kontrolldyr (ikke utsatt for ischemisk reperfusjonsskade) ikke demonstrerer noen signifikant endring i kjerner med normal densitet i denne regionen. Utsettelse for fem minutters bilateral karotidokklusjon resulterte i en signifikant reduksjon i antallet kjerner som er tilstede i CAl-regionen. Generelt resulterer denne lesjonen i en flekk-vis nekrose istedet for en sammenflytende nekrose som sees hvis det utføres ti minutter med ischemi. Forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ved doser på 0,32-32 mg/kg gir en signifikant beskyttelse av nevronal degenerering av hippocampus (fig. 16). Etterbehandling med 3,2 mg/kg reduserte signifikant graden av celletap i CA-1 etter ischemisk reperfusjonsskade (fig. 17).

Oppsummering av resultater.

1. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion demonstrerte ikke signifikante oppførselsmessige bivirkninger hos normale kontrolldyr. 2. Forbehandling med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion-doser på 0,32-32 mg/kg ga doserelatert beskyttelse mot de oppførselsmessige virkninger av fem

minutter med cerebral ischemi.

3. En dose på 3,2 mg/kg av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion tilført etter ischemi avverget postischemisk skade på hippocampus CAl-celler. Fire doser av 0,32-32 mg/kg tilført før ischemi avverget postischemisk skade på hippocampusceller i CAl-regionen. 4. Oppførselsmessig beskyttelse var mer sensitiv enn beskyttelse mot cellulær skade i hippocampus. 5. Etterbehandling med 32 mg/kg 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion reduserte de oppførselsmessige virkninger, og reduserte eller avverget de histopatolog-iske konsekvenser av fem minutters bilateral karotid-arterieokklus j on .

Konklusjon:

Av de tre testede forbindelsene (6-nitro, 7CF3-QX, 5,7-di-nitro-QX, 5-CI-7-CF3-QX) , er 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion langt den beste forbindelsen for ischemibeskyttelse i gerbilen. Denne forbindelsen var fri for signifikante direkte virkninger på oppførsel. Den var imidlertid et sterkt beskyttende middel når administrert forut for ischemi. I tillegg ga flere forbehandlings- og etterbehandlingsdoser signifikant beskyttelse. Den oppførselsmessige beskyttelse omfatter både lokomotorisk aktivitet og oppførsel i en labyrint med radielle forgreninger. I overensstemmelse med denne kraftige oppførsels-messige beskyttelse, beskyttet 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion også mot nevronal skade.

Eksempel 22.

Virkninger av 5- klor- 7- trifluormetyl- 1. 4- dihydrokinoksalin-2. 3- dion. 6. 7- diklor- 5- nitro- 1. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion

og 6. 7- dibrom- 5- nitro- 1. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion på kronisk smerte.

Det er kjent at NMDA-reseptorer er kritisk involvert i utviklingen av vedvarende smerte etter nerve- og vevskade. Vevskade slik som den som forårsakes av en liten mengde formalin subkutant inn i bakpoten på et testdyr er blitt vist å produsere en umiddelbar økning av glutamat og aspartat i ryggmargen (Skilling, S.R. et al., J. Neurosci. 10:1309-1318, 1990). Administrering av NMDA-reseptorblokkere reduserer responsen av dorsale hornnevroner i ryggmargen etter formalininjeksjon (Dickenson og Aydar, Neuroscience Lett. 121:263-266, 1991, Haley, J.E. et al., Brain Res. 518:218-226, 1990) . Disse dorsale hornnevroner er kritiske ved bæring av smertesignaler fra ryggmargen til hjernen og en redusert respons av disse nevroner er en indikasjon på reduksjon i smerte som oppfattes i testdyret som er blitt påført smerte ved subkutan formalininjeksjon.

På grunn av den observasjon at NMDA-reseptorantagonister kan

blokkere dorsal hornnevronrespons indusert ved subkutan formalininjeksjon, har NMDA-reseptorantagonister potensial for behandling av kronisk smerte, slik som smerte som forårsakes ved kirurgi eller ved amputasjon (fantomsmerter) eller ved at det voldes andre sår (sårsmerte). Anvendelse av

konvensjonelle NMDA-antagonister slik som MK801 eller CGS

i 19755 ved forebygging eller behandling av kronisk smerte er imidlertid sterkt begrenset av de uheldige PCP-lignende opp-førselsmessige bivirkninger som forårsakes av disse medikamenter. Det er blitt funnet at de 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionbaserte antagonistene av glycinbindingsstedet av NMDA-

reseptoren som er gjenstand for den foreliggende oppfinnelse er svært effektive for forebygging av kronisk smerte i mus som er indusert ved injisering av formalin subkutant i bakpoten til dyrene. Fordi de 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-baserte glycinantagonistene i samsvar med oppfinnelsen er fri for PCP-lignende bivirkninger, er disse medikamentene svært nyttige i forebygging eller behandling av kronisk smerte uten å forårsake PCP-lignende uheldige oppførselsmessige bivirkninger .

Swiss/Webster hannmus som veier 25-35 g ble oppbevart fem i et bur med fri tilgang til mat og vann og ble opprettholdt på en tolv timers lyssyklus (lyset på kl. 0800). 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (1-40 mg/ml), 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (5-40 mg/ml) eller 6,7-dibrom-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

(1-40 mg/ml) ble oppløst i DMSO. DMSO ble benyttet som vehikkelkontroll. Alle medikamenter ble injisert intraperitonealt (1 /il/g) . Formalintesten ble utført som beskrevet (Dubuisson og Dennis, Pain 4:H161-174, 1977). Musene ble observert i en sylinder av pleksiglass med en diameter på 2 5 cm og en høyde på 3 0 cm. Plantaroverflaten av en bakpote ble injisert subkutant med 20 /il 5 % formalin. Graden av smerte ble bestemt ved å måle den tid som dyret brukte på å slikke den formalininjiserte poten under de følgende tids-intervaller: 0-5 minutter (tidlig fase), 5-10 minutter, 10-15 minutter og 15-50 minutter (sen fase). For å teste hvorvidt de to glycinantagonistene avverget kronisk smerte hos test-dyrene ble vehikkel (DMSO) eller medikamenter oppløst i vehikkel ved doser på 1 mg/kg til 40 mg/kg injisert intraperitonealt 30 minutter før formalininjeksjonen. For hver dose medikament eller vehikkelkontroll ble det benyttet minst seks dyr.

Fig. 18 viser at, sammenlignet med vehikkelkontroll, intraperitoneal injeksjon av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion 30 minutter før formalininjeksjon i bakpoten signifikant inhiberte formalinindusert kronisk smerte på en doseavhengig måte som bestemt ved reduksjonen av den tid som musen bruker på å slikke den formalininjiserte bakpoten forårsaket av økende doser glycinantagonist. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion inhiberte formalinindusert slikking ved alle doser (1-40 mg/kg) i både de tidlige og sene faser.

Fig. 19 viser at, sammenlignet med vehikkelkontroll, intraperitoneal injeksjon av 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion også inhiberte formalinindusert smerte som bedømt ved inhiberingen av den tid som dyret bruker å slikke den formalininjiserte bakpoten. 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion inhiberte den formalininduserte slikkingen ved doser på 5-40 mg/kg i de sene fasene mens den tidlige fasen ble inhibert ved doser på 10-40 mg/kg. 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion utviste en ED50 på 5 mg/kg ved forebygging av formalinindusert smerte hos musen.

Som vist i fig. 2OA og 2OB, inhiberte 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion den formalininduserte slikking på en doseavhengig måte både i den tidlige fasen (0-5 minutter, fig. 20A) av smerte (slikke) responsen og i den sene fasen (15-50 minutter, fig. 20B) av smerteslikkingsresponsen, hvilket indikerer kraftig antimociseptiv virkningsfullhet i denne dyremodellen for kronisk smerte.

Disse resultatene demonstrerer at 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion og 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion er effektive for behandling av kronisk smerte som er indusert ved subkutan formalininjeksjon. Siden begge forbindelsene er antagonister ved glycinstedet av NMDA-reseptoren antyder resultatene at blokkeringen av glycinstedet av NMDA-reseptoren ved glycinantagonister representerer en ny metode for å behandle kronisk smerte hos et pattedyr. Siden glycinantagonistene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse ikke har uheldige oppførselsmessige (PCP-lignende) bivirkninger som er vanlige for andre NMDA-reseptorblokkere, muliggjør denne oppfinnelsen en ny og svært forbedret metode for å behandle kronisk smerte hos pattedyr, omfattende (og foretrukket) mennesker.

Eksempel 23.

Oppløselighet av cholinsalter sammenlignet med kaliumsalter av 1. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dioner.

5-klor -7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er uoppløselig i vann, men oppløses i nærvær av fire ekvivalenter KOH (eller fem ekvivalenter NaOH). pH av oppløsningen er 12,7. Dette saltet forblir oppløselig når pH senkes til 11,9 ved tilsetning av en ekvivalent eddiksyre. Ytterligere tilsetning av en ekvivalent eddiksyre forårsaker dannelse av et presipitat. Ved pH 11 er presipiteringen i all hovedsak ferdig.

Spektroskopiske observasjoner (3 00 MHz<1>NMR, FTIR) og smelte-punktbestemmeler antyder av pH-presipitatet er mono-K- eller mono-Na<+->saltet av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion, hvilket antyder at monosaltene er helt uoppløselige i vann.

Det ble uventet funnet at 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion lett kan oppløses i en eller to ekvivalenter av cholinhydroksyd. Når 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion oppløses i én ekvivalent cholinhydroksyd etterfulgt av tilsetning av eddiksyre, dannes ikke et presipitat før pH 9,4. Således fører oppløsningen av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i en ekvivalent cholinhydroksyd til monocholinsaltet som, i motsetning til natrium- og kaliumsaltene, er helt oppløselig i vann. Se fig. 21.

Monocholinsaltet ble isolert ved frysetørking av oppløsn-ingen. Det ble oppnådd et lysebrunt, tørt pulver. Vann kan tilsettes for å gi en oppløselig oppløsning av 90 mg/l ml vann. Pulveret ble umiddelbart oppløst i vannet til å gi en klar, lysebrun oppløsning. Monocholinsaltet av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion kan således isoleres i ren form.

I et andre eksperiment ble det bestemt at monocholinsaltet av 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion også er svært oppløselig i vann. Etter oppløsning av denne forbindelsen i én ekvivalent cholinhydroksyd forårsaker ikke tilsetning av eddiksyre tilsynekomst av et presipitat før pH når omtrent 8.

Svært vannoppløselige ammoniumsalter av kinoksalindioner kan således fremstilles. Siden vannoppløselighet er en forutsetning for human terapeutisk anvendelse representerer denne oppdagelsen et betydelig fremskritt innen fagområdet.

Eksempel 24.

Formulering av 5- nitro- 6. 7- diklor- l. 4- dihydrokinoksalin- 2, 3-dion i tris ( trometamin).

En 5 mg/ml oppløsning av 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion ble fremstilt ved å oppløse 5-nitro-6,7-kinoksalin-2,3-dion i en vandig oppløsning inneholdende 10 % polyetylenglykol 400 (PEG-400), 0,45 % Tween-80 og 0,18 M tris (trometamin) til å gi en sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml av 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet ble lett oppløst i denne formuleringen. Oppløsningen ble sterilisert ved autoklavbehandling og ble funnet å være stabil i minst to måneder. Det forventes at denne oppløsningen vil være stabil i minst ett til to år. En 10 mg/ml oppløsning av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble fremstilt ved å oppløse forbindelsen i en oppløsning inneholdende 50 % PEG-400, 0,5 % Tween-80 og 0,1 M tris (trometamin). 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet ble lett oppløst i denne oppløsningen ved oppvarming til 60-100°C. Oppløsningen ble autoklavbehandlet og ble funnet å være stabil i minst to måneder. Det forventes at denne oppløsning vil være stabil i minst ett til to år. En 5 mg/ml oppløsning av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble også fremstilt uten PEG-400 ved å oppløse forbindelsen i en oppløsning inneholdende 0,05 M tris (trometamin), 0,5 % Tween-80 og 5 % glukose. Oppløsningen ble sterilisert og funnet å være stabil i minst to måneder. Det forventes at denne opp-løsningen vil være stabil i minst ett til to år.

Eksempel 25.

Formulering av 5- klor- 7- trifluormetyl- 1. 4- dihydrokinoksalin-2. 3- dion i bis- tris- propan.

En 10 mg/ml oppløsning av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion ble fremstilt ved å oppløse forbindelsen i 0,1 M bis-tris-propan, 50 % PEG-400 eller propylenglykol, og 0,75 % Tween-80. Forbindelsen ble lett oppløst ved oppvarming i et kokende vannbad. Oppløsningen ble autoklavbehandlet og funnet å være stabil i minst to måneder. Forbindelsen i bis-tris-propanoppløsningen forventes å være stabil i minst ett til to år.

Eksempel 2 6.

Sedativ/ hypnotisk aktivitet av 5. 7- diklor- l. 4- dihydrokinoksalin- 2 . 3 - dion og 6. 7- diklor- l. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion i oppretningsreflekstesten hos mus.

Når mus snus på ryggen, vil de umiddelbart rette seg tilbake opp på bena. Sedative hypnotiske medikamenter eller bedøv-ende medikamenter vil ved lave doser forårsake en forsinkelse i opprettingsrefleksen, eller de vil ved høyere doser forårsake at dyret forblir på ryggen i en forlenget tidsperiode. Det ble utført eksperimenter for å bestemme virkningen av 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og dets analog, og 6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion på opprettingsrefleksen hos mus etter intraperitoneal injeksjon. De to kinoksalindionene ble sammenlignet med ketamin, en kjent NMDA-kanalblokker med bedøvende virkning.

Swiss/Webster hannmus (25-30 g) ble injisert intraperitonealt med 5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion eller 6,7-diklor- 1, 4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion i DMSO (1 /xl/g) , begge ved en dose på 50 mg/kg, eller med 50 mg/kg ketamin i salt-oppløsning (1 Ml/g)■ Opprettingsrefleksen ble testet ved å snu dyrene på ryggen med fem minutters intervaller. Virkningen av medikamentene på opprettingsrefleksen ble bedømt som følger: Dyr som retter seg opp umiddelbart etter å ha blitt snudd ble bedømt som 0, dyr som retter seg opp etter mellom ett og to sekunder ble bedømt som 1, dyr som retter seg opp etter mellom to og ti sekunder ble bedømt som 2, dyr som ikke har rettet seg opp etter ti sekunder ble bedømt som 3. 13 dyr ble testet i 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-gruppen, ti dyr ble testet i 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -diongruppen, og ti dyr ble testet i ketamingruppen.

Fig. 22A viser virkningen av de tre medikamentene på opp-rettingsref leksen. 50 mg/kg 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion viste en sterk og langvarig inhibering av opp-rettingsref leksen. I motsetning til dette var 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion fullstendig inaktiv ved den samme dosen (50 mg/kg). Ketamin ved 50 mg/kg viste en kort-varig inhibering av opprettingsrefleksen som varer i omtrent 15 minutter. Ketamin nådde ikke den inhiberingsgraden av opprettingsrefleksen som sees med 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion. Glycin/NMDA-antagonisten 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er således en sedativ/- hypnotisk anestetisk forbindelse med en betydelig høyere styrke enn ketamin, et klinisk anvendt anestetisk middel. Siden ketamin virker ved PCP-stedet av NMDA-reseptoren, har den PCP-lignende oppførselsmessige bivirkninger. 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er en glycinantagonist og har derfor ikke PCP-lignende bivirkninger.

Siden bindingsaffinitetene av 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ved glycin-, kainat- og AMPA-reseptorer ikke er vesentlig forskjellig mellom de to forbindelsene, konkluderes det med at forskjellen mellom forbindelsene med hensyn til deres sedative/hypnotiske virkning skyldes det faktum at 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion kan trenge gjennom blod/hjernebarrieren, mens 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ikke kan dette. Disse funnene strekker seg utover tidligere observasjoner at 5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er svært aktiv ved forebygging av lydinduserte anfall hos DBA-2 mus, mens 6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er fullstendig inaktive.

Det konkluderes med at en substitusjon ved posisjon 5 i kinoksalindionringsysternet er avgjørende for å oppnå in vivo aktivitet etter systemisk administrering omfattende sedativ/- hypnotisk og antikonvulsiv aktivitet.

Eksempel 27.

PCP- diskriminering i rotter med 5- klor- 7- trifluormetyl- 1. 4-dihydrokinoksalin- 2, 3- dion og 5- nitro- 6. 7- diklor- 1. 4- dihydrokinoksalin- 2 . 3- dion.

Phencyklidin (PCP) er et viktig medikament i forbindelse med misbruk og gir en forstyrrende intoksikering når det tas selv ved subanestetiske doser (Balster, R.L., "The Behavioral Pharmacology of Phencyclidine", i Psychopharmacology: The Third Generation of Progress, Meltzer, H.Y., ed., Raven Press, New York, side 1573-1579, 1987). Det er blitt utviklet en dyremodell som kan forutsi medikamenters evne til å gi en PCP-lignende intoksikering hos mennesker. Modellen benytter treningsprosedyrer for å skjelne mellom medikamenter for å lære dyr å oppfatte PCP-intoksikasjon. Hver dag må rotter som er blitt trenet til å trykke på en spak for å få mat, velge hvilken av to spaker som er riktig i burene sine. Det eneste stimuli de har for å velge den riktige spaken er deres evne til å oppdage hvorvidt de mottok en PCP- eller vehikkelinjeksjon. Etter trening i omtrent to måneder ble rottene svært flinke til å skjelne PCT fra vehikkelinjek-sjoner og kan deretter testes med andre medikamenter for å bestemme om de skjelnes slik som PCP.

Ved testing i denne prosedyren erstattes PCP av andre medikamenter som er kjent å gi en PCP-lignende intoksikasjon. Disse medikamenter omfatter ulike PCP-analoger som ketamin, sigmaagonistmedikamentet N-allylnormetazocin og de 1,3-substituerte dioksolaner, deksoksadrol og etoksadrol (Brady et al., Pharm. Biochem. Behav. 17:291-295, 1982, Brady et al., Science 212: 178-180, 1982, Brady et al., J. Pharm. Exp. Ther. 220:56-62, 1982, Slifer og Balser, Subst. Alcohol Actions/Misuse 5:273-280, 1984, Balster og Willetts, "Receptor Mediation of the Discriminative Stimulus Properties of Phencyclidine and Sigma-Opioid Agonists", i Transduction Mechanisms of Drug Stimuli, Colpaert og Balster, eds., Springer-Verlag, Berlin, side 122-135, 1988).

For denne undersøkelsen ble rotter som var trenet i å skjelne 2 mg/kg PCP fra saltoppløsningsvehikkel testet med 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Doseområdet for hver forbindelse ble nøye valgt for å sikre at en tilstrekkelig høy dose til å gi virkninger på hjernen og oppførsel ble testet.

Metoder.

Som forsøksindivider ble det benyttet seks voksne Sprague-Dawley hannrotter (COBS CD, Charles River Farms, Wilmington, DE), oppbevart individuelt og holdt på en begrenset forings-kur.

Apparatur.

Eksperimentelle forsøk ble utført i kommersielle, 2-spaks, rotteopererte kammere utstyrt med lyd- og lysdempende avluk-ker. Kamrene ble utstyrt med pelletdispensere for 45 mg pellets. Et stimulerende lys signaliserte når forsøkene var i gang.

Trening.

Forut for begynnelsen av denne undersøkelsen var rottene blitt trenet til å presse en spak for å få mat under et program med fast forhold 32 under daglige (mandag-fredag) 30 minutters perioder. I treningsperiodene ble reaksjon på kun en av spakene forsterket, responser på den gale spaken nullstiller fast-forhold kravet på den riktige spaken. Under trening ble hver spak assosiert med enten en 2 mg/kg PCP-eller saltoppløsningsinjeksjon. PCP- og saltoppløsnings-treningsperioder forekom i en dobbeltalternerende sekvens. Treningen ble fortsatt inntil individene begynte hver periode på den korrekte spaken i fire etterfølgende perioder. Etter treningen var avsluttet (to til tre måneder) begynte teste-fasen.

Testing.

Generaliseringstester ble utført to ganger pr. uke (tirsdag og fredag). Mellom testperiodene ble dyrene gitt fortsatt trening med PCP- og saltoppløsningsinjeksjoner. Det ble ut-ført tester hvis det første fast - forholdet i den forutgående treningsperiode var på den riktige spaken og det totalt var mer enn 85 % respons på riktig spak. I testperiodene ble respons på begge spakene forsterket. Tester med 2,0 mg/kg PCP og saltoppløsning ble utført ved begynnelsen av hver doseeffekt-kurvebestemmelse. Tester ble utført med PCP (0,5, 1,0, 2,0, 4,0 og 8,0 mg/kg), 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (6,0, 12,5 og 25 mg/kg) og 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ((2,0, 4,0, 6,0, 8,0 og 16,0 mg/kg). Testene med 0,5 ml/kg DMSO-vehik-kelen ble også utført forut for testing av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Medikamenter. Phencyklidin HCl ble anskaffet fra the National Institute on Drug Abuse. Det ble oppløst i salt-oppløsning og administrert i 1,0 ml/kg i.p. 15 minutter før trenings- og testingsperiodene. Doser refererer til HCl-saltet. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble oppløst i DMSO slik at injeksjonsvolumet for alle doser var 0,5 ml/kg. Både 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble injisert i.p. 40 minutter før testingsperiodene.

Dataanalyser. Graden av testmedikamentets likhet med 2,0 mg/kg PCP reflekteres i den gjennomsnittlige prosentandelen av responser på PCP-spaken. Ikke-spesifikke virkninger på oppførsel åpenbares i forskjeller i gjennomsnittlige responsgrader fra saltoppløsningskontrolltester. Når responsgradene under tester med doser med høyt medikamentinnhold ble redusert til mindre enn 0,05/sekund ble prosentandelen for respons på PCP-spaken for det individet for den testen ikke inkludert i gruppens gjennomsnitt. Dette ble gjort siden det er vanskelig å tolke data for valg av spak når individene er alvorlig svekket.

Resultater

Resultatene for både 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion er vist i figurer 23A og 23B. På figurenes venstre deler er resultatene av kontrolltester med 1,0 ml/kg saltoppløsning, 2 mg/kg PCP og 0,5 ml/kg DMSO. Både saltopp-løsning og DMSO ga 0 % PCP-spak respons ved hver anledning de ble testet (øvre felt). PCP, når testet før hver av doserespons-kurvebestemmelsene, ga 100 % PCP-spak respons. Denne overensstemmende nøyaktighet er typisk for denne diskrimi-neringsprosedyren. Responsgrader etter saltoppløsning, PCP og DMSO (nedre felt) var noe mer variabelt, men det var ingen klar virkning av hverken PCP eller DMSO til å gi responsgrader forskjellig fra dem i saltoppløsningskontrolltestene.

NÅr det ble testet forskjellige doser av PCP, ble det frem-bragt en doserelatert økning i PCP-spak respons. Ved to 2 mg/kg og mer, inntraff 100 % generalisering. Kun 8 mg/kg dosen av PCP reduserte respons hos rottene, hvilket viser spesifisiteten på denne prosedyren for lav-dose PCP-lignende diskriminerende stimulansvirkninger.

Hverken 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion eller 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ga noen PCP-spak respons ved noen testet dose. 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion frembragte dose-relaterte responsgradreduserende virkninger ved 12,5 og 25 mg/kg. 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion frembragte responsgradreduserende virkninger ved doser på 6, 8 og 16 mg/kg. Under hensyntagen til variabiliteten i disse data, kan det ikke konkluderes med at 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion med sikkerhet var sterkere enn 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion for responsgradvirkninger. Ikke desto mindre var det klart at et oppførselsmessig aktivt doseringsområde av begge forbindelser ble evaluert.

Diskusjon og konklusjoner

Både 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion var fullstendig fri for PCP-lignende diskriminerende stimulanse-virkninger. I dette henseende skiller de seg dramatisk fra dé PCP-sted ikke-konkurrerende NMDA-antagonister slik som PCP, dizosilpin, ketamin og (+)-N-allylnormetazosin, som fullstendig erstatter PCP i denne prosedyren (Brady et al., Pharm. Biochem. Behav. 17:291-295 (1982); Brady et al., Science 212:178-180 (1982), Wiletts og Balster, Eur. J. Pharm. 146:167-169 (1988)). Testforbindelsenes evne til å gi PCP-lignende virkninger i rotter kan forutsies ut fra deres evne til å gi PCP-lignende psykotomimetiske virkninger og tilbøyelighet til misbruk hos mennesker. Disse data vil således understøtte konklusjonen om at 5-klor-7-trifluormetyl - 1 , 4 -dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er fri for disse PCP-lignende bivirkningene. På den annen side kan det ikke konkluderes ut fra disse data at disse forbindelsene kan mangle andre bivirkninger, kun at de ikke vil forventes å være svært lik dem som fremskaffes ved PCP.

Eksempel 28

Fravær av PCP- lignende motorisk stimulering av 5- nitro- 6. 7-diklor- 1. 4- dihydrokinoksalin- 2. 3- dion i mus

Introduksjon

NMDA-reseptorantagonister, spesielt NMDA-kanalblokkerene, forårsaker en oppførselsmessig stimulering hos gnagere (Koek et al., J. Pharmacol. Exptl. Ther. 245:969 (1988)). Opp-førselsmessig stimulering er antatt å ligge til grunn for de psykotomimetiske bivirkninger av PCP hos mennesker (Koek et al., J. Pharmacol. Exptl. Ther. 245:969 (1988); Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)). Den opp-førselsmessige stimuleringen er spesielt tydelig med NMDA-kanalblokkere slik som MK8 01 og PCP men forårsakes også av konkurrerende NMDA-antagonister slik som CGS19755 (Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)). For å undersøke hvorvidt 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion har oppførselsmessige stimulerende virkninger hos gnagere ble forbindelsen testet i en lokomotorisk aktivi-tetstest. Det ble funnet at 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion, ved doser opp til anestetiske nivåer, ikke induserte oppførselsmessig stimulering når bedømt ut fra den lokomotoriske aktiviteten. I motsetning til dette forårsaket MK081 ved subanestetiske doser en sterk stimulering av lokomotorisk oppførsel. Disse resultatene antyder at 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion muligens ikke har PCP-lignende oppførselsmessige stimulerende virkninger.

Metoder og materialer

Swiss/Webster hannmus (25-30 g) ble anskaffet fra Simonsen og oppbevart i grupper på 8-10 i et rom med styrt temperatur og i en 12 timers lys/mørke-syklus. Mat og vann ble gitt ad libitum.

Lokomotorisk aktivitet ble testet ved anvendelse av et Omni-tech lokomotorisk aktivitet-apparat. Dyrene ble injisert intraperitonealt (i.p.) med enten DMSO eller 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion oppløst i DMSO ved doser på 0,1, 0,25, 0,5, log5 mg/kg. Injeksjonsvolum var 1 ml/kg. Dyrene ble deretter anbragt i lokomotorisk aktivitet-kammeret og deres lokomotoriske oppførsel ble registrert i 4 etterfølgende 15 minutters intervaller. Andre dyr ble injisert (i.p.) med enten saltoppløsning eller MK801 i saltopp-løsning ved doser på 0,1, 0,25, 0,5, 1 og 5 mg/kg etterfulgt at registrering av lokomotorisk aktivitet.

Resultater

Injeksjon av MK801 (i.p.) i Swiss/Webster mus ga en doseavhengig økning i lokomotorisk aktivitet (fig. 24). Det høyeste nivå av lokomotorisk aktivitet ble registrert i det andre 15 minutters intervallet. Lokomotorisk aktivitet i det andre 15 minutters intervallet etter injeksjon av medikament er derfor vist i fig. 24. Den høyeste lokomotoriske aktivitet ble fremkalt av en dose på 0,25 mg/kg av MK801. Ytterligere økning av MK801-dosen resulterte i lavere lokomotorisk aktivitet i forhold til 0,25 mg/kg dosen. En dose på 5 mg/kg MK801 resulterte i undertrykkelse av lokomotorisk aktivitet under grunnlinjenivåer. I motsetning forårsaket ikke 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion noen stimulering av lokomotorisk aktivitet over grunnlinjenivåer (fig. 24). En dose på 5 mg/kg 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion senket lokomotorisk aktivitet til under grunnlinjenivåer. Høyere doser av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble også testet (10, 20 og 50 mg/kg). Det var ingen stimulering av lokomotorisk aktivitet ved noen dose. Ved 50 mg/kg dosen hadde dyrene et fullstendig tap av opprettingsrefleks 30 minutter etter i.p. injeksjon. Det var også et merkbart tap av smerterespons hvilket antyder anestetisk aktivitet av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ved 50 mg/kg dosen.

Konklusjon

5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion frembragte ikke stimulering av lokomotorisk aktivitet hos mus. I motsetning frembragte NMDA-kanalblokkeren MK801 en sterk stimulering av lokomotorisk aktivitet i overensstemmelse med de PCP-lignende oppførselsmessige virkninger som forårsakes av denne forbindelsen. Fraværet av PCP-lignende oppførsels-messige stimulerende virkninger antyder at NMDA/glycin-antagonisten 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ikke har de uheldige oppførselsmessige stimulerende virkninger som har plaget den kliniske utviklingen av andre klasser av NMDA-antagonister.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at forbindelsen har formelen eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvor R<1> er halo, amino, C1- C2 acylamino eller nitro, R2 er amino, nitro eller halo, R<3> er halo eller haloalkyl, og R<4> er hydrogen, med den betingelse at når R<2> er amino da er R<3> ikke halo.

2. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at R<1> er halo eller nitro, R<2> er halo og R<3> er halo eller haloalkyl.

3. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 6,7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 6-klor-5-nitro-7-brom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-6-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 6-klor-5-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2.3- dion, 5-klor-6,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5- brom-6,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dibrom-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-amino-6,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-amino-6,7-diklor-1.4- dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-klor-6-nitro-5-trifluormetyl - 1 , 4 -dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 6-amino-5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

4. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 7-brom-6-klor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion,

6- klor-7-trifluormetyl- 5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5-brom-6,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

5. Forbindelse som angitt i krav 4, karakterisert ved at den er 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

6. Forbindelse som angitt i krav 4, karakterisert ved at den er 6,7-dibrom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

7. Forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-8-nitro-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-brom-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion og 5-brom-7-fluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, eller en tautomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

8. Ammoniumsalt, karakterisert ved at det er ammoniumsalt av en 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion-forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-7.

9. Ammoniumsalt som angitt i krav 8, karakterisert ved at det er saltet av en aminoforbindelse valgt fra gruppen bestående av et tetra-C-^galkylamin, et tri-C-L.galkyl-C-L.galkanolamin, et C6_12aralkyl-C1.gtrialkylamin, etylendiamin, dietylentriamin, N-metyletanolamin, di-(2-etanol)amin, tri-(2-etanolamin), spermidin, spermin, et aminokarbohydrat, N-metylglukamin, arginin, et N-C1.6alkylguanidin, et N,N-di-C-^galkylguanidin, et N,N' -di-C1_6alkylguanidin, et N,N,N'-tri-C1.6alkylguanidin, et N,N,N' ,N' -tetra-C1_6alkylguanidin, biguanidin, N-C1.6alkyl-biguanidin, et N,N-C1_6dialkylbiguanidin, et N,N1 -C-^gdialkyl-biguanidin, amidin, et N-C1_4alkylamidin, 1,8-diazabicyklo-[5,4,0]undek-7-en og tris.

10. Ammoniumsalt som angitt i krav 8, karakterisert ved at det er ett av et cholinsalt, et trissalt, et bis-tris-propansalt, et N-metyl-glukaminsalt eller et argininsalt.

11. Ammoniumsalt som angitt i krav 10, karakterisert ved at det er tris-saltet av 5-nitro-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

12. Ammoniumsalt som angitt i krav 10, karakterisert ved at det er bis-tris-saltet av 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

13. Ammoniumsalt som angitt i krav 10, karakterisert ved at det er N-metylglukamin-saltet av 5-nitro-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion eller 5-klor-7-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

14. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-13 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

15. Anvendelse av en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-13 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for systemisk behandling og/eller forebygging av: (a) nevronalt tap assosiert med slag, ischemi, CNS-traume, hypoglykemi eller kirurgi, (b) en nevrodegenerativ sykdom valgt fra Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom, (c) de uheldige konsekvenser av hyperaktiviteten til de eksitatoriske aminosyrer, (d) de uheldige konsekvenser av hyperaktiviteten til NMDA reseptoren, (e) kronisk smerte, (f) angst, (g) konvulsjoner, eller (h) psykoser.

16. Anvendelse som angitt i krav 15, hvor det nevronale tap forekommer som et resultat av : (a) luftbobler som avsettes i hjernen under eller umiddelbart etter kirurgi, (b) kardiopulmonal bypass-kirurgi, (c) karotid endarterektomikirurgi, eller (d) multiple slag som resulterer i demens.

17. Anvendelse av en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-13 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for systemisk: (a) indusering av anestesi, eller (b) indusering av en hypnotisk effekt.

18. Anvendelse som angitt i ett eller flere av kravene 15-17, hvor preparatet er tilpasset for oral, intravenøs, subkutan, intramuskulær, intraperitoneal, transdermal eller buckal administrering.

19. Anvendelse som angitt i ett eller flere av kravene 15-17, hvor preparatet videre omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.