NO309981B1

NO309981B1 - Kinoksalinforbindelser, farmasøytisk preparat samt anvendelse

Info

Publication number: NO309981B1
Application number: NO961770A
Authority: NO
Inventors: Sui Xiong Cai; Eckard Weber; John F W Keana; Sunil Kher
Original assignee: Cocensys Inc; Univ California; Oregon State
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2001-04-30
Also published as: FI961858A; EP0732942A1; CA2175795A1; IL111533A0; US5631373A; IL111533A; JP4164547B2; FI961858A0; US6251903B1; NZ276892A; US5977107A; JPH09504794A; EP0732942A4; NO961770D0; US6147075A; NO961770L; AU1172395A; WO1995012417A1; AU699353B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kinoksalinforbindelser, farmasøytiske preparater inneholdende de nevnte forbindelser samt deres anvendelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører området medisinsk kjemi og vedrører spesielt forbindelser som har en høy affinitet for glycin-bindingssetet, som mangler PCP bivirkninger, og som krysser blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner. Spesielt vedrører oppfinnelsen nye alkyl-, azido-, alkoksy- og. fluor-substituerte, og kondenserte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner og deres anvendelse for å behandle eller forebygge nevronal degenerasjon, konvulsjoner, angst, kronisk smerte og for å indusere anestesi.

Glutamat antas å være den viktigste eksitatoriske nevrotrans-mitter i hjernen. Der er tre hoved-subtyper av glutamat-reseptorer i CNS. Disse omtales vanligvis som kainat, AMPA

og N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptorer (Watkins and Olverman, Trends in Neurosci. 7:265-272 (1987)). NMDA reseptorer er funnet i membranene i praktisk talt hver nevron i hjernen. NMDA reseptorer er ligand-"gated" kationkanaler som tillater Na<+>, K<+>og Ca<++>å permeere når de aktiveres ved glutamat eller aspartat (ikke-selektive, endogene agonister) eller ved NMDA (en selektiv, syntetisk agonist) (Wong and Kemp, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 31:401-425 (1991).

Glutamat alene kan ikke aktivere NMDA reseptoren. For å bli aktivert ved glutamat, må NMDA reseptorkanalen først binde glycin i et spesifikt, høyaffinitets, glycin-bindingssete som er separat fra glutamat/NMDA bindingssetet på reseptorprote-inet (Johnson and Ascher, Nature-325:329-331 (1987)). Glycin er derfor en obligatorisk ko-agonist i NMDA reseptor/kanalkomplekset (Kemp, J. A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85 : 6547-6550 (1988) ) .

I tillegg til bindingssetene for glutamat/NMDA og glycin,

bærer NMDA reseptoren en rekke andre funksjonelt viktige bindingsseter. Disse inkluderer bindingsseter for Mg<++>, Zn<++>, polyaminer, arachidonsyre og fencyklidin (PCP) (Reynolds and

Miller, Adv. in Pharmacol. 21:101-126 (1990), Miller, B., et al., Nature 355:722-725 (1992)). PCP bindingssetet, nå vanligvis omtalt som PCP reseptoren, er lokalisert inne i poren til ionoforen av NMDA reseptor/kanalkomplekset (Wong, E.H.F., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7104-7108 (1986), Huettner and Bean, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:1307-1311

(1988) , MacDonald, J. F., et al., Neurophysiol. 58:251-266

(1987)). For at PCP skal skaffe seg tilgang til PCP reseptoren, må kanalen først åpnes ved hjelp av glutamat og glycin. I fravær av glutamat og glycin kan PCP ikke binde til PCP reseptoren skjønt noen undersøkelser har foreslått at en liten mengde PCP binding kan forekomme selv i fravær av glutamat og glycin (Sircar and Zukin, Brain Res. 556:280-284

(1991)). Når PCP binder til PCP reseptoren, blokkerer den ionefluks gjennom den åpne kanal. PCP er derfor en åpen-kanal-blokkerer og en ikke-konkurrerende glutamatantagonist i NMDA reseptor/kanalkomplekset.

Et av de mest potente og selektive medikamenter som binder til PCP reseptoren er det anti-konvulserende medikament MK801. Dette medikament har en Kdpå omtrent 3 nM i PCP reseptoren (Wong, E.H.F., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7104-7108 (1986)).

Både PCP og MK801 såvel som andre PCP reseptor-ligander, f.eks. dekstrometorfan, ketamin og N,N'-disubstituerte guani-diner, har nevrobeskyttende effekt både in vitro og in vivo (Gill, R., et al., J. Neurosci. 7:3343-3349 (1987), Keana, J.F.W., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:5631-5635

(1989) , Steinberg, G.K., et al., Neuroscience Lett. 89:193-197 (1988), Church, J., et al., i: Sigma and Phencyclidine-Like Compounds as Molecular Probes in Biology, Domino and Kamenka, eds., Ann Arbor: NPP Books, s. 747-756 (1988)). Den godt karakteriserte nevrobeskyttende effekt av disse medikamenter skyldes stort sett deres evne til å blokkere usedvanlig stor Ca<++>innstrømning inn i nevroner gjennom NMDA reseptorkanaler, som blir overaktiverte ved usedvanlig stor glutamat frigivelse under forhold som hjerneischemi (f.eks. ved slag, ved ischemi på grunn av hjertestans osv.) (Collins, R. C, Metabol . Br. Dis. 1:231-240 (1986), Collins, R. C, et al., Annals Int. Med. 110:992-1000 (1989)).

Det terapeutiske potensial til disse PCP reseptor-medikamenter som ischemi-redningsmidler ved slag er blitt alvorlig hemmet ved det faktum at disse medikamenter har sterke PCP-lignende adferds-bivirkninger (psykotomimetiske adferdseffekter) som synes å skyldes interaksjonen av disse medikamenter med PCP reseptoren (Tricklebank, M. D., et al.-, Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989), Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989), Willets and Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988)). Disse PCP-lignende adferds-bivirkninger ser ut til å ha bevirket tilbaketrek-kingen av MK801 fra klinisk utvikling som et ischemi-befri-ende middel. Videre ser det ut til at disse PCP reseptor-ligander har et betydelig potensiale for misbruk som vist ved misbruks-tilbøyeligheten til selve PCP.

De PCP-lignende adferdseffekter til PCP reseptor-ligandene kan vises i dyremodeller: PCP og beslektede PCP reseptor-ligander kan gi en adferds-eksitasjon (hyperbevegelse) i gnagere (Tricklebank, M. D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)) og en karakteristisk katalepsi hos duer (Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989), Willets and Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988)), og i medikament diskriminerings-paradigma er der en sterk korre-lasjon mellom PCP reseptoraffiniteten til disse medikamenter og deres potens til å indusere en PCP-passende adferdsrespons (Zukin, S. R., et al., Brain Res. 294:174 (1984), Brady, K. T., et al., Science 215:178 (1982), Tricklebank, M. D., et al., Eur. J. Pharmacol. 141:497 (1987)).

Medikamenter som virker som konkurrerende antagonister i glu-tamatbindingssetet til NMDA reseptoren, som CGS 19755 og

LY274614, har også nevrobeskyttende effekt fordi disse medikamenter, som PCP reseptor-ligandene, kan forhindre usedvanlig stor Ca<++>fluks gjennom NMDA reseptor/kanaler ved ischemi (Boast, C.A., et al., Brain Res. 442:345-348 (1988), Schoepp, D. D., et al., J. Neural. Trans. 85:131-143 (1991)). De kon kurrerende NMDA reseptorantagonister har imidlertid også PCP-lignende adferds-bivirkninger i dyremodeller (adferdseksita-sjon, aktivitet i PCP medikamentdiskrimineringstester) skjønt ikke så kraftig som MK801 og PCP (Tricklebank, M. D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)).

En alternativ måte å inhibere NMDA reseptorkanalaktivering er ved anvendelse av antagonister i glycin-bindingssetet til NMDA reseptoren. Da glycin må binde til glycinsetet - ±or at glutamat skal bevirke kanalåpning (Johnson and Ascher, Nature 325:329-331 (1987), Kemp, J. A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6547-6550 (1988)), kan en glycinantagonist fullstendig forhindre ionefluks gjennom NMDA reseptorkanalen, selv i nærvær av en stor mengde glutamat.

Senere in vivo mikrodialysestudier har vist at i modellen med fokal ischemi i rotte er der en stor økning i glutamatfri-givelse i den ischemiske hjerneregion uten signifikant økning i glycinfrigivelse (Globus, M.Y.T., et al., J. Neurochem.

57:470-478 (1991)). Således bør glycinantagonister teoretisk være svært kraftige nevrobeskyttende midler fordi de på ikke-konkurrerende måte kan forhindre åpningen av NMDA kanaler ved glutamat og derfor, til forskjell fra konkurrerende NMDA

antagonister, behøver de ikke å overvinne den store konsentrasjon av endogent glutamat som er frigitt i den ischemiske hjerneregion.

Videre, fordi glycinantagonister hverken virker i glutamat/- NMDA eller PCP bindingssetene for å forhindre NMDA kanalåpning, vil disse medikamenter ikke kunne gi den PCP-lignende adferds-bivirkning som man ser med både PCP reseptorligander og konkurrerende NMDA reseptorantagonister (Tricklebank, M. D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989), Koek, W., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 245:969 (1989), Willets and Balster, Neuropharmacology 27:1249 (1988), Tricklebank, M. D. et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989), Zukin, S. R., et al., Brain Res. 294:174 (1984), Brady, K. T., et al., Science 215:178 (1982), Tricklebank, M. D., et al., Eur. J. Pharmacol. 141:497 (1987)). At glycinantagonister faktisk kan være fri for PCP-lignende adferds-bivirkninger er blitt foreslått i senere studier hvor tilgjengelige glycinantagonister ble injisert direkte inn i hjernene til gnagere uten å gi PCP-lignende adferd (Tricklebank, M. D., et al., Eur. J. Pharmacol. 167:127-135 (1989)).

Der har imidlertid vært to hovedproblemer som har forhindret utviklingen av glycinantagonister som klinisk anvendbare nevrobeskyttende midler: A. De fleste tilgjengelige glycinantagonister med relativt høy reseptorbindingsaffinitet in vitro som 7-Cl-kynurensyre (Kemp, J. A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6547-6550 (1988)), 5,7-diklorkynurensyre (McNamara, D., et al., Neuroscience Lett. 120:17-20

(1990)) og indol-2-karboksylsyre (Gray, N. M., et al.,

J. Med. Chem. 34:1283-1292 (1991)) kan ikke penetrere blod/hjernebarrieren og har derfor ingen nytte som terapeutiske midler,

B. De eneste tilgjengelige glycinantagonister som i tilstrekkelig grad penetrerer blod/hjernebarrieren, medikamentet HA-966 (Fletcher and Lodge, Eur. J. Pharmacol. 151:161-162 (1988)), er en delvis agonist med kun mikromolar affinitet for glycinbindingssetet. En nevrobeskyttende effekt for HA-966 in vivo er derfor ikke blitt vist, og det er heller ikke blitt vist for andre tilgjengelige glycinantagonister fordi de mangler biotilgjengelighet in vivo.

Et gunstig resultat i forbindelse med å identifisere oralt aktive glycinreseptorantagonister ble imidlertid rapportert av Kulagowski et al., J. Med. Chem. 37:1402-1405 (1994), som angir at 3-substituerte 4-hydroksykinolin-2(1H)-oner er selektive antagonister som utviser potent in vivo aktivitet.

Innen litteraturen har det vært en rekke rapporter om at substituerte 1,4-dihydroksykinoksalin-2,3-dioner er anvendbare for behandling av patofysiologiske tilstander mediert ved ikke-NMDA, NMDA og glycinreseptorer. US patent nr. 4.975.430 omhandler f.eks. 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionforbindelser med formelen:

hvor hver X uavhengig er nitro eller cyano og hvor hver Y uavhengig er H, lavere alkyl, lavere alkoksy eller CF3. Disse forbindelser er rapportert til å kunne anvendes for å behandle nevro-tilstander assosiert med stimulering av NMDA reseptoren.

US patent nr. 3.962.440 omhandler 1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dionforbindelser med formelen:

hvor R<1>kan være hydrogen eller metyl, ^ kan være lavere alkyl, lavere alkoksy, lavere alkyltio, cyklopropyl, nitro, cyano, halogen, fluoralkyl av Cx- C2 (trifluormetyl)amino, eller substituert amino, og n kan være 0, 1 eller 2. Disse forbindelser er rapportert til å være anvendbare som sove-midler .

US patent nr. 4.812.458 vedrører 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionforbindelser med formelen:

hvor R<1>er halogen, cyano, trifluormetyl, etynyl eller N3, og R<2>er S02C1_ 2 alkyl, trif luormetyl, nitro, etynyl eller cyano. Disse forbindelser er rapportert til å være anvendbare for behandling av indikasjoner bevirket ved hyperaktivitet av de eksitatoriske nevrotransmittere, særlig quisqualat-reseptorene, og som nevroleptika.

US patent nr. 4.659.713 omhandler 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 - dionforbindelser med formelen:

hvor X representerer hydrogen, klor, brom, fluor, jod, tri-klormetyl, diklorfluormetyl, difluormetyl, eller trifluormetyl , og n representerer 1 eller 2. Disse forbindelser er rapportert til å være anvendbare for kontroll av coccidiose i dyr.

US patent nr. 4.948.794 vedrører 1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dionforbindelser med formelen:

hvor

- R<1>er C1_12alkyl som eventuelt kan være substituert med hydroksy, formyl, karboksy, karboksylsyreestere, amider eller aminer, C3_8cykloalkyl, aryl, aralkyl, og hvor R<6>er hydrogen, halogen, CN, CF3, N02eller OR<1>hvor R<1>er C1.4alkyl, og R<5>, R<7>og R<8>er hydrogen, med den betingelse atR<6>ikke er CF3, OCH3, N02, Cl eller Br nårR<1>erCH3, eller -R<6>ogR<7>kan uavhengig være N02, halogen, CN, CF3eller OR' hvor R' er C1.4alkyl, ogR<5>ogR<8>er hver hydrogen, eller

R<5>ogR<6>kan sammen danne en ytterligere kondensert aromatisk ring som kan være substituert med halogen, N02, CN,

CF3eller OR<1>, hvorR1 er C1.4alkyl, eller

R7 ogR<8>danner sammen en ytterligere kondensert aromatisk ring som kan være substituert med halogen, N02, CN, CF3eller OR' hvor R' er C-^ alkyl, og R5 ogR<6>er uavhengig av hverandre hydrogen, halogen, CN, CF3, N02eller OR' hvor R' er C1-4alkyl. Disse forbindelser er angitt til å være anvendbare for behandling av indikasjoner bevirket-ved hyperaktivitet av de eksitatoriske nevrotransmittere, særlig quisqualat-reseptorene, og som nevroleptika.

Yoneda og Ogita, Biochem. Biophys, Res. Commun. 164:841-849

(1989) angir at følgende 1,4-dihydrokinoksalin-1,2-dion på konkurrerende måte erstattet den stryknin-insensitive binding av [3H] glycin, uten å påvirke de andre bindingssetene på NMDA reseptorkomplekset:

Ifølge forfatterne indikerer sammenhengen mellom struktur og aktivitet blant kinoksalinene klart at begge kloridgruppene i6- og 7-stillingene i benzenringen er avgjørende for antagonist-styrken mot Gly setene. Fjerning av ett klorid fra molekylet resulterer i en 10 ganger reduksjon i affinitet for Gly seter.

Kleckner og Dingledine, Mol. Pharm. 36:430-436 (1989) angir at 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er sterkere antagonister av kainat enn glycin, men substituering av Cl i 6-stillingen og særlig i 6- og 7-stillingene øker styrken i glycinsetet.

I tillegg foreslår forfatterne at antagonister av glycinsetet vil kunne være effektive mot NMDA reseptor-medierte nevro-patologier.

Rao, T. S. et al., Neuropharmacology 29:1031-1035 (1990) angir at 6,7-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-cyano-6-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion antagoniserer responser mediert ved NMDA-assosierte glycin-gjenkjennelses-seter in vivo.

Pellegrini-Giampietro, D. E. et al., Br. J. Pharmacol. 98:1281-1286 (1989) angir at 6-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion og 6 , 7-dinitro-1, 4-dihydrokinoksa-lin-2 , 3-dion kan antagonisere responsene overfor L-glutamat ved å interagere med glycin-gjenkjennelsessetene til NMDA reseptor ion- kanalkomplekset.

Ogita og Yoneda, J. Neurochem. 54:699-702 (1990) angir at 6 , 7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er en konkurrerende antagonist som er spesifikk for de stryknin-insensitive [3H] glycin-bindingssetene på NMDA reseptorkomplekset. Ifølge forfatterne er de to kloridradikaler i 6- og 7-stillingene på benzenringen til kinoksalinet avgjørende for den antagonis-tiske styrke overfor glycin-bindingssetene.

Kessler, M. et al., Brain Res. 489:377-382 (1989) angir at 6 , 7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion inhiberer [<3>H]glycin-binding til de stryknin-insensitive glycin-bindingsseter assosiert med NMDA reseptorer.

EP patentsøknad med publikasjonsnr. 0.377.112, publisert 11. juli 1990, omhandler 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionforbin-delser med formelen:

hvor R<1>blant annet kan være hydroksy, alkoksy, aryloksy, aralkyloksy, cykloalkylalkoksy, cykloalkoksy eller alkanoyl-

oksy, ogR<5>,R<6>,R7 og R<8>kan uavhengig være hydrogen, nitro, halogen, cyano, trifluormetyl, S02NR'R', S02R' eller OR<1>, hvor R' er hydrogen eller C1_4alkyl. Disse forbindelser er rapportert til å være anvendbare for behandling av indikasjoner bevirket ved hyperaktivitet av de eksitatoriske nevrotransmittere, særlig quisqualat-reseptorene, og som nevroleptika.

Lester, R. A. et al., Mol. Pharm. 35:565-570 (1989), -angir at 6-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion antagoniserer NMDA reseptormedierte responser ved en konkurrerende interaksjon av glycin-bindingssetet.

Patel, J. et al., J. Neurochem. 55:114-121 (1990) angir at den nevrobeskyttende aktivitet til 6 , 7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion skyldes antagonisme av ko-agonist-aktiviteten av glycin i NMDA reseptor-kanalkomplekset.

Horner, L. et al., Chem. Abstracts 48:2692 (1953) angir 6,8-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Cheeseman, G. W. H., J. Chem. Soc.:1170-1176 (1962) angir 6,7-dibrom-2,3-dihydroksykinoksalin (også kjent som 6,7-dibrom-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion) .

Honoré, T. et al., Science 241:701-703 (1988) angir at 6,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-cyano-6-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er sterke ikke-NMDA glutamat reseptorantagonister.

Sheardown, M. J. et al., Eur. J. Pharmacol. 174:197-204

(1989) angir at 5,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion er en sterk antagonist av den stryknin-insensitive glycin-reseptor og har antikonvulserende egenskaper. Sheardown et al. angir imidlertid også at 5,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksa-lin-2, 3-dion såvel som DNQX og CNQX har dårlig tilgang til sentralnervesystemet. Internasjonal patentsøknad med publikasjonsnr. WO 91/13 87 8 omhandler følgende N-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dioner som binder til glycinreseptoren:

hvor R representerer hydrogen, Cx_6alkyl eller aralkyl, og n er et helt tall fra 0 til 5, R<4>representerer hydrogen eller hydroksy,R<5>,R<6>, R7 ogR<8>representerer uavhengig hydrogen, nitro, halogen, alkoksy, aryloksy, aralkoksy, C1_ 6 alkyl eller aryl, R<9>representerer hydrogen, lavere alkyl eller aryl,R<10>representerer hydrogen eller alkyl, og farmasøytisk tålbare salter derav.

Leeson et al., J. Med. Chem. 34:1243-1252 (1991) omhandler en rekke derivater av den ikke-selektive eksitatoriske aminosyre -antagonist kynurensyre. Der er også angitt en rekke strukturelt relaterte kinoksalin-2,3-dioner som også er glycin/NMDA antagonister, men som ikke er selektive og som er langt mindre potente enn kynurensyrederivatene. Kinoksalin-2 . 3-di nnpnp har stTukt-.urf ormelen :

hvor R er H, 5-Cl, 7-Cl, 5,7-Cl2, 6,7-Cl2, 6,7-(CH3)2, 6-N02, eller 6,7-(N02)2. Der er også angitt en rekke N-metylderi-vater. Epperson et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3(12):2801-2804 (1993) rapporterer syntesen og aminosyrefar-makologien til tolv N-substituerte kinoksalindioner. Spesielt forbindelsene med strukturen

er rapportert til å ha signifikant antagonisme i både AMPA og glycin-sete NMDA reseptorene. Den funksjonelle antagonisme til 4a er blitt demonstrert. Som bakgrunn angir forfatterne at kinoksalindioner som 6,7-dinitrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-nitrokinoksalin-2,3-dion og 6-cyano-7-dinitrokinok-salin-2,3-dion er blitt vist til å være AMPA (Honoré et al., Science 241:701 (1988)) såvel som glycinantagonister (Birch et al., Eur. J. Pharmacol. 156:177 (1988)), og også til å være nevrobeskyttende in vitro (Frandson, et al., J. Neurochem. 53:297 (1989)) og det AMPA selektive kinoksalin-dionet 2 , 3-dihydroksy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(F)kinoksalin er blitt vist til å være nevrobeskyttende i modeller med cerebral ischemi (Sheardown et al., Science 247:571 (1990)).

For et tilbakeblikk på glycinantagonister vises det til Leeson, P. D., "Glycine-Site N-Methyl-D-Aspartate Receptor Antagonists", kapittel 13 i Drug Design for Neuroscience, Kozikowski, A. P. (ed.), Raven Press, New York, s. 338-381

(1993) .

Det er fortsatt et behov for sterke og selektive glycin/NMDA antagonister som: mangler de PCP-lignende adferds-bivirkninger som er vanlige for PCP-lignende NMDA kanalblokkere som MK801, eller for de konkurrerende NMDA reseptorantagonister som CGS19755, viser sterk anti-ischemi effekt på grunn av den ikke- konkurrerende naturen til deres glutamatantagonisme iNMDA reseptoren, • krysser blod/hjernebarrieren i mengder som er tilstrekke-lige til å være effektive, • har anvendelse som nye anti-konvulserende midler med færre bivirkninger enn de PCP-lignende NMDA kanalbokkere eller

i de konkurrerende NMDA antagonister,

• hjelper med å definere den funksjonelle signifikansen av glycin-bindingssetet til NMDA reseptoren in vivo.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny gruppe av forbindel-

) ser som utviser høy affinitet for det stryknin-insensitive glycin-bindingssetet, som ikke utviser PCP bivirkninger, og som krysser blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner. Slike forbindelser inkluderer bl. annet alkyl, azido,

alkoksy, hydroksy og fluor-substituerte 1,4-kinoksalin-2,3-dioner. De alkylsubstituerte 1,4-kinoksalin-2,3-dionenes høye affinitet for glycin-bindingssetet var uventet sett på bakgrunn av de mange rapporter innen litteraturen som angir at tilstedeværelsen av elektron-tiltrekkende grupper på ben-zenkjernen kreves for høy bindingsaffinitet og at alkyl- og

D alkoksygrupper er elektron-donerende og azido er kun svakt e1ekt ront ilt rekkende.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse for

fremstilling av et farmasøytisk preparat for å behandle eller5forebygge nevronalt tap forbundet med slaganfall, ischemi, CNS traume, hypoglykemi og kirurgi, for behandling av nevrodegenerative sykdommer inkluderende Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral-sklerose, Huntingtons sykdom og Downs

syndrom, for å behandle eller forebygge de negative følger av o overstimuleringen av de eksitatoriske aminosyrer, for behandling av angst, konvulsjoner; kronisk smerte eller psykose, for å forhindre opiattoleranse eller for å indusere en hypnotisk effekt eller anestesi hos et dyr med behov

derfor. For en slik behandling eller forebygging

15administreres et substituert 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, som definert heri, med en høy affinitet for glycin-bindingssetet og som har evnen til å krysse

blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner, og som samtidig mangler PCP bivirkninger.

Oppfinnelsen vedrører således forbindelser som er funnet til å ha eksepsjonell in vivo aktivitet og som har formelen (I)

eller en tautomer eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav, hvorR<1>er C-L-Cg-alkyl, azido, C-L-Cg-alkoksy, halo-C^-Cg-alkyl,

halo, nitro, cyano eller C^-Cg-alkanoylamino,

R<2>er C1-C6-alkyl, azido, C^^-Cg-alkoksy, fenyl-C1-C4-alkoksy, cyano, halo-Cj^-Cg-alkyl, halo, hydroksy eller

nitro,

R<3>er C^-Cg-alkyl, azido, C-L-Cg-alkoksy, cyano, halo, halo-Cx-Cg-alkyl eller hydroksy,

R<4>er hydrogen eller fluor,

med den betingelse at (a) minst en av R<1>, R<2>ellerR<3>er hydroksy eller azido, eller (b) minst en av R<2>ellerR<3>er C^ C6-alkyl eller C-^Cg-alkoksy, eller (c) R<1>er cyano.

Oppfinnelsen vedrører også en forbindelse som er kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen som omfatter 5,6,7-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 6-klor-7-fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-brom-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-5,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 5-klor-6,7,8-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion og 6-klor-7-f luor-5-trif luormetyl-1, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Oppfinnelsen vedrører også en forbindelse til bruk som terapeutikum som er kjennetegnet ved at den er valgt fra en av de ovennevnte forbindelser.

Oppfinnelsen vedrører også et farmasøytisk preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter en av de ovennevnte forbindelser og en farmasøytisk aksepterbar bærer.

Endelig vedrører oppfinnelsen anvendelse av en av de ovennevnte forbindelser for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av (A) nevronalt tap assosiert med slag, ischemi, CNS traume eller hypoglykemi, eller (B) de negative nevrologiske følger av kirurgisk inngrep som et resultat av: (a) luftbobler som samler seg i hjernen under eller

umiddelbart etter kirurgi,

(b) kardiopulmonal bypass-kirurgi, eller

(c) karotid endarektomi kirurgi, eller

for behandling av en nevrodegenerativ sykdom valgt fra Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom, for antagonisering av eksiterende aminosyrer i NMDA reseptorkomplekset, for behandling eller forebygging av de negative følger av hyperaktiviteten til NMDA reseptoren, for behandling av kronisk smerte, for behandling eller forebygging av angst, for behandling eller forebygging av konvulsjoner, for å indusere anestesi, for behandling eller forebygging av NMDA reseptorionkanalrelatert psykose, for indusering av en hypnotisk effekt, eller for å forebygge opiattoleranse.

Et 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion med formelen:

eller en tautomer derav, hvor

R<1>er nitro,

R2 er halo-C^-Cg-alkyl, halo, cyano, Cx-C6-alkyl eller Cx-C6- alkoksy,

R3 er halo-C^-Cg-alkyl, halo, cyano, C1-C6-alkyl eller C1-Cg-alkoksy, og

R<4>er hydrogen,

kan fremstilles ved at en forbindelse med formel (V):

eller en tautomer derav hvor

R<1>er hydrogen,

R2 er halo-C-L-Cg-alkyl, halo, cyano, C^-Cg-alkyl eller Cx-Cg-alkoksy,

R3 er halo-C1-C6-alkyl, halo, cyano, C^-Cg-alkyl eller Cx-Cg-alkoksy, og

R4 er hydrogen,

reageres med rykende salpetersyre, og hvoretter det således dannede 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dionet isoleres.

En forbindelse med formelen:

eller en tautomer derav, hvor

R<1>er nitro, cyano eller CF3,

R<2>er C-L-Cg-alkoksy, fenyl-C1-C4-alkoksy, hydroksy eller

azido,

R<3>er halo, halo-C^^-Cg-alkyl, C1-C6-alkyl, C-L-Cg-alkoksy,

azido eller cyano, og

R<4>er hydrogen,

kan fremstilles ved at en forbindelse med formelen (VII) :

eller en tautomer derav hvor

R<1>er nitro, cyano eller CF3,

R<2>er fluor,

R<3>er halo, halo-C^^-Cg-alkyl, C^-Cg-alkyl, C-^Cg-alkoksy,

azido eller cyano, og R<4>er hydrogen,

reageres med et alkoksyd, fenylalkoksyd, hydroksyd eller azid i et inert løsningsmiddel og hvorpå den således dannede forbindelse isoleres.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk tålbart salt av en forbindelse med den ovennevnte formel eller en tautomer derav.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 angir en kurve som viser effekten av 5-nitro-6,7-dimetylkinoksalindion (NDMQX) på den tidlige fase av formalintesten for smerte. Fig. 2 angir en kurve som viser effekten av NDMQX på den sene

fase av formalintesten for smerte.

Fig. 3 angir en kurve som viser tidsforløpet til 7-klor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (NMCQX)

[7,5 mg/kg NMCQX i 0,05 M Tris buffer] i MES testen for anti-konvulserende effekt.

Fig. 4 angir en kurve som viser doseresponsen (målt 60 min.

etter i.p. injeksjon) av NMCQX i MES testen for anti-konvulserende effekt.

Fig. 5 angir en kurve som viser tidsforløpet til NDMQX (15

mg/kg NDMQX i 0,1 M argininbuffer) i MES testen for anti-konvulserende effekt.

Fig. 6 angir en kurve som viser doseresponsen (målt 3 0 min.

etter i.p. injeksjon) til NDMQX i MES testen for anti-konvulserende effekt.

Fig. 7 angir en kurve som viser effekten av kronisk (8 dager)

NDMQX på morfintoleransen i formalintesten,@, p < 0,03,<*>, p < 0,05.

Fig. 8 angir en kurve som viser effekten av kronisk (8 dager)

NDMQX på morfin-indusert antinocicepsjon i formalintesten.

Fig. 9 angir en kurve som viser effekten av NDMQX på

kortikalt og subkortikalt infarktvolum.

Fig. 10 angir en kurve som viser effekten av NMCQX på

kortikalt og subkortikalt infarktvolum.

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som har en høy affinitet for glycin-bindingssetet og som har evnen til å krysse blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner, og som mangler PCP bivirkninger. Slike forbindelser inkluderer bl. annet alkyl, azido, alkoksy og fluor-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner, som er svært selektive,- konkurrerende antagonister til glycin-bindingssetet av NMDA reseptoren.

I foretrukne forbindelser som er innenfor rammen for formel I er R<1>er C1-C6-alkyl, azido, C-^Cg-alkoksy, cyano eller nitro, R2 er C1-C6-alkyl, azido, C1-C6-alkoksy, fenyl-C1-C4-alkoksy, cyano, hydroksy eller halo, R3 er C-L-Cg-alkyl, azido, Cx-C6-alkoksy, halo, cyano, hydroksy eller halo-Cj^-Cg-alkyl, og R<4>er hydrogen, men hvor minst én av R<1->R<3>er C-^-Cg-alkyl, C1-C6-alkoksy, hydroksy eller azido, eller R<1>er cyano.

Typiske C-^g alkylgrupper inkluderer metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, neopentyl, heksyl, 2-heksyl, 3-heksyl, 2-metyl-1-pentyl, 3-metyl-1-pentyl, 4-metyl-1-pentyl, o.l.

Typiske alkoksygrupper inkluderer oksygen som er substituert med hvilken som helst av C1.6-alkylgruppene nevnt i det foregående .

Typiske fenylalkoksygrupper inkluderer de ovennevnte alkoksygrupper som er substituert med én eller flere fenylgrupper, f.eks. 3 - fenylpropoksy, 2 - fenyletoksy o.l.

Typiske halogrupper inkluderer fluor, klor, brom og jod.

Typiske haloalkylgrupper inkluderer C-^g-alkylgrupper substituert med én eller flere fluor, klor, brom eller jodatomer, f.eks. fluormetyl, difluormetyl, trifluormetyl, pentafluor-etyl, 1,1-difluoretyl og triklormetylgrupper.

Typiske aminogrupper omfatter -NH2, NHR<9>og -NR<9>R<10>hvor hverR<9>og R<10>er en av de C1_ 6 alkylgrupper som er nevnt i det foregående. Aminogruppen kan også være substituert med en (-NHCN) eller to (-N(CN)2) cyanogrupper. Disse grupper kan fremstilles ved å reagere det tilsvarende amin med cyanogen-bromid.

Typiske alkanoylgrupper inkluderer Cx_5C(0) alkanoylgrupper, f.eks. acetyl, propionyl, butanoyl, pentanoyl og heksanoyl-grupper.

Typiske alkanoylaminogrupper inkluderer en aminogrupper som er substituert med en av C1_5C(0) alkanoylgruppene.

Særlig foretrukne substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dioner ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, 6,7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 7-fluor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,.3 -dion, 5,7-dimetyl-6-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2.3- dion, 6,7-dietyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-klor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-brom-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-fluor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dimetoksy-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-azido-5,7-difluor-1.4- dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-azido-5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-azido-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 6,7-dimetyl-5-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 6,7-dietyl-5-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 5,7-dietyl-6-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 6-brom-7-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 -dion, 7-jod-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-jod-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-metoksy-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 7-klor-6-metoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-azido-7-fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-metyl-5,6-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-metyl-5,7-dinitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-diklor-5-cyano-1, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-difluor-5-cyano-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7,8-trifluor-5-klor-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-5,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 6-klor-7-fluor-5-nitro-1, 4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, 6-brom-7 - fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 -dion, 5-amino-7-klor-6-metyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-klor-6-etyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 6-klor-7-etyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion,7-klor-6-etyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-(n-butoksy)-7-fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion, og7-fluor-5-nitro-6-(3-fenylpropoksy)-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse har man funnet at visse alkylsubstituerte kinoksalin-2,3-dioner har høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren og har uventet høy in vivo aktivitet som anti-konvulserende midler i "maximum electroshock seizure" (MES) forsøk i mus. Disse forbindelser er derfor istand til å krysse blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner. 6,7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (NDMQX) ble funnet til å ha høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren med K±på 43 nM, som er omtrent 10 ganger mindre aktiv enn 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion. NDMQX ble imidlertid funnet til å ha uventet høy in vivo aktivitet. Den hadde en ED50på 4-5 mg/kg som et anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus. Til sammenligning har 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion en ED50på 4-5 mg/kg som et anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus. Således fremgår det at NDMQX er 10 ganger bedre når det gjelder å krysse blod/hjernebarrieren enn 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Da metylgruppene i NDMQX vil kunne erstattes med andre lengre alkylgrupper som etyl eller propyl, eller med arylalkyl-grupper som benzyl og fenetyl, såvel som med lengre alkyl-kjeder inneholdende etergrupper som metoksyetyl, som forventes å øke lipofilisiteten til molekylet og øke evnen til å krysse blod/hjernebarrieren, har det ovennevnte funn ført til en ny gruppe kinoksalindioner (QXer) med gode in vivo egenskaper .

En annen gruppe med svært interessante forbindelser er dem som er substituert med både alkyl og halogensubstituenter, som 6-klor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-klor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, som forventes å kombinere det beste av 6,7-diklor-5-nitro-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-difluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6,7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion, som har høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren og som er istand til å krysse blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner. 7-klor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion (NMCQX) ble funnet til å ha en høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren med en K±på 5 nM, som er omtrent like god som 6,7-diklor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion . NMCQX ble imidlertid funnet til å ha uventet høy in vivo aktivitet. Det hadde en ED50på 1 mg/kg som et anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus, som er omtrent 4- 5 ganger bedre enn 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion (ED50= 4-5 mg/kg). 7-fluor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (K^=53 nM, ED50=2 mg/kg) og 6-klor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (^ = 27 nM, ED50=2 mg/kg) ble også funnet til å ha en høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren og til å ha en uventet høy in vivo aktivitet.

Ved et aspekt av oppfinnelsen har man også funnet at visse fluorsubstituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dioner har en høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren og har uventet høy in vivo aktivitet som anti-konvulsive midler i MES forsøket i mus (tabell III). Disse forbindelser er derfor istand til å krysse blod/hjernebarrieren i høye konsentrasjoner. 6,7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble funnet til å ha en høy affinitet for glycin/NMDA reseptoren med en K±på 87 nM, som er mere enn 20 ganger mindre aktiv enn 6,7-diklor-5- nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ( K± = 3,3 nM). 6,7 difluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble imidlertid funnet til å ha overraskende høy in vivo aktivitet. Det har en ED50på 0,7-0,8 mg/kg som et anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus. Til sammenligning har 6,7-diklor-5-nitro-1, 4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion en ED50på 4-5 mg/kg som et anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus. Dette betyr at 6,7-difluor-5-nitro-1, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion vil være omtrent 100 ganger bedre til å krysse blod/hjernebarrieren enn 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Generelt bør forbindelser som anvendes for å behandle dyr ikke ha et fluor i 6- eller 8-stillingene og en elektrontil-trekkende gruppe som nitro i 5-stillingen, da slike forbindelser er ustabile. Som omtalt heri kan fluorgruppen i slike forbindelser lett erstattes med vanlige nukleofiler.

Således, skjønt 6,7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion har en god in vivo aktivitet, bør den ikke administreres til dyr da den kan reagere med biologiske nukleofiler.

7-klor-6,8-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble funnet til å ha en høy affinitet for ,glycin/NMDA reseptoren med K±lik 170 nM, som er omtrent 50 ganger mindre aktiv enn 6.7- diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. 7-klor-6.8- difluor-5-nitro-l, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion ble også funnet til å ha overraskende høy in vivo aktivitet. Den har en ED50lik 2-3 mg/kg som et anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus. Til sammenligning har 6,7-diklor-5-nitro-1, 4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion en ED50lik 4-5 mg/kg som et

anti-konvulsivt middel i MES forsøket i mus. Dette betyr at7-klor-6,8-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion vil kunne være omtrent 100 ganger bedre til å krysse blod/hjerne-barrieren enn 6,7-diklor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

Forbindelsene omtalt heri er aktive for å behandle eller forebygge nevronalt tap, nevrodegenerative sykdommer og kronisk smerte og er aktive som anti-konvulsive midler og for å indusere anestesi uten uheldige bivirkninger forårsaket av ikke-selektiv binding med andre reseptorer, særlig kainat, AMPA og quisqualat reseptorer og PCP og glutamat reseptorene assosiert med NMDA reseptoren. I tillegg er disse forbindelser effektive for å behandle eller forebygge de negative følger av hyperaktiviteten til de eksitatoriske aminosyrer, f.eks. dem som er involvert i NMDA reseptorsystemet, ved å blokkere glycinreseptorene og forhindre at "ligand-gated" kationkanaler åpnes og tillater usedvanlig stor tilstrømning av Ca<++>inn i nevroner, noe som skjer under ischemi. -

Nevrodegenerative sykdommer som kan behandles med de ovennevnte forbindelser omfatter dem valgt fra gruppen som omfatter av Alzheimer's sykdom, amyotrofisk lateral-sklerose, Huntington's sykdom og Downs syndrom.

Disse forbindelser kan også spesielt benyttes i behandling eller forebygging av nevronalt tap forbundet med multiple slag som fører til demens. Etter at en pasient er blitt diagnostisert til å lide av slag, kan forbindelsene administreres for å forbedre den umiddelbare ischemi og videre forhindre nevronal skade som kan forekomme etter tilbake-vendende slagtilfeller.

Disse forbindelser er dessuten istand til å krysse blod/- hjernebarrieren i motsetning til 6-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-7-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og andre 6,7-disubstituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som ikke kan krysse blod/hjernebarrieren etter i.p.

administrering (se Turski, L. et al., J. Pharm. Exp. Ther.

) 260: 742-747 (1992)). Se også Sheardown et al., Eur. J.

Pharmacol. 174:197-204 (1989) som angir at 5,7-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dinitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dion og 6-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion har dårlig tilgang til sentralnervesystemet.

For at en forbindelse skal vise in vivo effektivitet og således evnen til å krysse blod/hjernebarrieren, bør forbindelsen utvise en ED50som er mindre enn omtrent 100 mg/kg kroppsvekt av dyret. Forbindelsene i henhold til oppfin nelsen utviser foretrukket en ED50som er mindre enn omtrent 2 0 mg/kg og mere foretrukket mindre enn omtrent 10 mg/kg.

Disse forbindelser kan spesielt anvendes for å behandle eller forebygge de negative nevrologiske følger av kirurgi.Koronar bypass-kirurgi krever f.eks. bruk av hjerte-lunge maskiner, som vil kunne innføre luftbobler i sirkulasjons-systemet som kan avsette seg i hjernen. Tilstedeværelsen av slike luftbobler berøver oksygen fra nevronalt vev, noe som resulterer i anoksi og ischemi. Pre- eller post-operativ administrering av 1,4-dihydrokinoksalinene i henhold til oppfinnelsen vil behandle eller forebygge den resulterende ischemi. I en foretrukket utførelsesform administreres forbindelsene til pasienter som gjennomgår kardiopulmonal bypass-kirurgi eller karotid endarterektomi kirurgi.

Disse forbindelser kan også anvendes for å behandle eller forebygge smerte, f.eks. kronisk smerte. Slik kronisk smerte kan være et resultat av kirurgi, traume, hodepine, artritt eller andre degenerative sykdommer. Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan spesielt anvendes i behandling av fan-tomsmerte resulterende fra amputasjon av en ekstremitet. I tillegg til smertebehandling kan forbindelsene i henhold til oppfinnelsen også anvendes for å indusere anestesi, enten generell eller lokal anestesi, som f.eks. under kirurgi.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan testes for potensiell glycinantagonistaktivitet ved å observere inhiberingen av binding av 1fxM glycin-stimulert [3H] -MK801 i hjernemembranhomogenater fra rotte eller marsvin. Desto sterkere glycinantagonisten er, désto mindre kan [<3>H]-MK801 binde da [<3>H]-MK801 bindingssetet (PCP reseptoren) kun er tilgjengelig ved åpning av ionekanalen ved glutamat og glycin (Fletcher, E. L., et al., i Glycine Neurotransmission, Otterson, P., et al. (eds.), John Wiley and Sons (1990), Johnson, J. W., et al., Nature 325:529 (1987)).

Bindingsaffinitetene til kinoksalin-2,3-dionene i NMDA resep-torglycinsetene ble også estimert ved elektrofysiologiske analyser med enten klonet rotte NMDA reseptorer uttrykt i Xenopus oocytter, eller ikke-NMDA reseptorer uttrykt i oocytter ved poly(A)<+>RNA fra hel rottehjerne. Kxverdier ble estimert ved å anta konkurrerende inhibering og måle suppresjon av membranstrømresponser utløst ved faste agonist-konsentrasjoner: 1 mM glycin og 100 mM glutamat for NMDA reseptorer, 20 mM kainsyre for ikke-NMDA reseptorer. For NMDA reseptorer ble K^er approksimert ved gjennomsnitts-verdier av tre subtype kombinasjoner (NR1A / NR2A, NR1A / NR2B og NRIA / NR2C). Se US patentsøknad nr. 08/148.259, med tittelen "Glycine Receptor Antagonists and the Use Thereof", supra.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen utviser foretrukket en bindingsaffinitet til glycinbindingssetet på Kx= omtrent 10/xM eller mindre, mere foretrukket 1/iM eller mindre og mest foretrukket 500 nM eller mindre og enda mere foretrukket 100 nM eller mindre og mest foretrukket omtrent 10 nM eller mindre. Også foretrukket er forbindelser som utviser binding i kainat og AMPA setene med ikke mindre enn K±= 1/iM og mere foretrukket ikke mindre enn 10 / xM.

De nye glycinantagonistene kan testes for in vivo aktivitet etter intraperitoneal injeksjon ved anvendelse av en rekke anti-konvulsive tester i mus (audiogenisk slagmodell i DBA-2 mus, pentylentetrazol-induserte slag i mus, NMDA-indusert død i mus og MES i mus). Foretrukne forbindelser utviser ataksi bivirkninger i "rotorod" ataksitesten ved dosenivåer som er større enn omtrent 100 mg/kg, mere foretrukket større enn omtrent 2 00 mg/kg.

Forbindelsene kan også testes i medikament-diskriminerings-tester i rotter som er trenet til å diskriminere PCP fra saltløsning. Det forventes at de fleste forbindelser ikke vil generalisere til PCP ved noen dose. I tillegg forventes det også at ingen av forbindelsene vil gi en adferdseksita-sjon i testene med lokomotorisk aktivitet i mus. Det forventes at slike resultater vil foreslå at glycin, AMPA, kainat og quisqualat-antagonistene i henhold til oppfinnelsen ikke viser de PCP-lignende adferds-bivirkninger som er vanlig for NMDA kanalblokkere som MK-801 og PCP eller for konkurrerende NMDA antagonister som CGS19755.

Glycin og eksitatoriske aminosyre-antagonister forventes også å vise sterk aktivitet in vivo etter intraperitoneal injeksjon noe som foreslår at disse forbindelser kan penetrere blod/hj ernebarrieren.

Azido-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner kan anvendes til å fotoaffinitetsmerke glycinreseptoren. Det er uventet blitt funnet at 6-azido-1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion binder ganske fordelaktig til glycin-bindingssetet, sammenlignet med tilsvarende 6-CF3, 6-N02, 6-F, 6-CN, 6-NH2, og substituerte derivater (tabell I) :

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles som følger. Som vist i reaksjonsskjerna I kan det isomere 6-halo-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-halo-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion fremstilles fra et 3-halo-4-metylanilin ved beskyttelse av aminogruppen med f.eks. trifluoreddiksyreanhydrid, etterfulgt av orto-nitrering. Fjerning av den aminobeskyttende gruppe og reduksjon av orto-nitro gruppen gir 3-halo-4-metyl-l,2-fenylendiamin. Dette 1,2 - fenylendiamin kan deretter kondenseres med oksalsyre til å gi 7-halo-6-metyl-l,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dionet. Nitrering fører til en blanding av de to isomere forbindelser.

Alternativt kan mellomproduktet trifluoracetyl-2-amino-5-halo-4-metylanilid behandles videre med trifluoreddiksyreanhydrid etterfulgt av nitrering til å gi to isomere nitro-forbindelser, som kan separeres. Fjerning av beskyttelses-gruppene, kondensering med oksalsyre og etterfølgende nitrering gir de isomerisk rene 7-halo-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-halo-7-metyl-5-nitro-l,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion. (Se reaksjonsskjerna II).

En annen fremgangsmåte er basert på det funn at nitrering av 3 , 4-dihydrokinoksalin-2(1H)-on resulterte utelukkende i produktet med nitrogruppen i 5-stillingen. Behandling av f.eks. 2,5-difluor-4-nitrotoluen med natriumglycinat gav det substituerte anilin. Nitrogruppen ble redusert med SnCl2og produktet cykliserte spontant til å gi 3,4-dihydrokinoksalin-2(lH)-on. Dette ble nitrert ved hjelp av rykende salpetersyre i trifluoreddiksyre, noe som resulterte i både nitrering og oksydasjon av forbindelsen til å gi 7-fluor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i et enkelt trinn

(reaksjonsskjema III). F - H koblingskonstantene målt fra<1>H NMR spekteret bekreftet at fluor var meta til nitrogruppen.

Behandling av l-brom-2,4-difluor-5-nitrobenzen med natriumglycinat gav likeledes en blanding av de substituerte ani-liner. Nitrogruppen ble redusert ved hjelp av SnCl2og produktet cykliserte spontant til å gi 3,4-dihydrokinoksalin-2 (1H) -on. Dette ble nitrert ved HN03i trifluoreddiksyre noe som resulterte i både nitrering og oksydasjon av forbindelsen til å gi 7-brom-6-fluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion i ett eneste trinn (reaksjonsskjema IV). F - H koblingskonstantene som målt fra<X>H NMR spekteret bekreftet at fluor var orto til nitrogruppen. Alternativt kan 1-brom-2,5-difluor-4-nitrobenzen reduseres, cykliseres og oksyderes med HN03til å gi 6-brom-7-fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion. Et 1, 4-dihydrokinoksalin-2 , 3r.di.on. med formelen:'

eller en tautomer derav, hvor

R<1>er nitro,

- R2 er halo-C^-Cg-alkyl, halo, cyano, C-L-Cg-alkyl eller C1-C6-alkoksy,

R3 er halo-C1-C6-alkyl, halo, cyano, C^-Cg-alkyl eller Cx-C6-alkoksy, og

R4 er hydrogen,

5

kan fremstilles ved at en forbindelse med formelen:

eller en tautomer derav hvor

R<1>er hydrogen,

R<2>er halo-C1-C6-alkyl, halo, cyano, Cx-C6-alkyl eller Cx-Cg-alkoksy,

R<3>er halo-Cx-C6-alkyl, halo, cyano, Cx-C6-alkyl eller Cx-Cg-alkoksy, og

R<4>er hydrogen,

reageres med rykende salpetersyre, og hvoretter 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dionet som således er dannet isoleres. Et foretrukket løsningsmiddel som kan anvendes for denne reaksjon er trifluoreddiksyre. Reaksjonen gjennomføres ved romtemperatur inntil der er fravær av utgangsmaterial (f.eks. over natten).

6, 7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (NDMQX) ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å kondensere 4,5-dimetyl-1,2 - fenylendiamin med oksalsyre etterfulgt av nitrering (HN03/H2S04eller KN03/CF3C02H) . Det ble funnet at nitrering i trifluoreddiksyre gav et renere produkt enn i svovelsyre. (Se reaksjonsskjema V).

Reaksjonsskjema V

Ved anvendelse av en prosedyre som er lignende den angitt i reaksjonsskjema I kan forbindelser med karbocykloalkyl, hete-roalkyl, aromatiske og heteroaromatiske grupper kondensert til 6- og 7-stillingene i kinoksalinringen fremstilles. (Se reaksjonsskjema VI).

6 , 7-dimetoksy-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion ble fremstilt fra 1,2-dimetoksybenzen. Nitrering av 1,2-dimetoksybenzen gav 1, 2-dimetoksy-4,5-dinitrobenzen som ble redusert til 1,2-diamino-4,5-dimetoksybenzen. Kondensering av diaminet med oksalsyre gav 6,7-dimetoksy-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

5-nitrocyklopento[g]-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion ble fremstilt fra 5-aminoindan som vist i reaksjonsskjema VII.Nitrering av 5-acetamidoindan gav en blanding av nitropro-dukter som ble separert ved kromatografi til å gi 5-acet-

amido-6-nitroindan i et utbytte på omtrent 20%. Avbeskyt-telse etterfulgt av reduksjon og kondensering av det resulterende diamin med oksalsyre gav cyklopento[g]-1,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion i et godt utbytte. Nitrering under be-tingelser med KN03/H2<S>04eller HN03/H2S04gav kompliserte produkter. Nitrering under den milde betingelse med KN03/CF3C02H gav imidlertid 5-nitrocyklopento[g]-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion som det eneste produkt.

Azido-substituerte kinoksalin-2,3-dioner ble fremstilt ved diazotering av aminosubstituert 1,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dioner etterfulgt av behandling med natriumazid:

Sammenhengen mellom struktur og aktivitet for en rekke alkyl, azido, fluor, alkoksy og cyano-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dioner er vist i tabell II.

a fra elektrofysiologi ved anvendelse av Xenopus oocytter

dersom annet ikke er angitt.

b fra bindingsforsøk.

c PA = delvis aktiv.

d inneholder -4% av forbindelsen hvor R5= CN, R6= Cl, R7=

NH2, R8= H.

Tabell III angir in vivo aktivitetene til en rekke fluor-substituerte 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner. Som man vil se utviser disse forbindelser god anti-konvulsiv aktivitet in vivo.

Tabell IV oppsummerer resultatene av åtte 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3 -dioner testet i.v. som anti-konvulsive midler i MES forsøk i mus. De fleste av de testede forbindelser har rask maksimal virkning, særlig de fluorsubstituerte forbindelser. Den beskyttende effekt av fluorsubstituerte forbindelser mot MES falt svært raskt. Etter 60 min. ble ingen ytterligere beskyttelse observert for 6,7-difluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 5,6,7-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Klorsubstituerte forbindelser har også en rask maksimal virkning, men den beskyttende effekt varer mye lengre enn de fluorsubstituerte forbindelser. Trifluormetyl-substituerte forbindelser har relativt sen maksimal virkning, og den beskyttende effekt varer lengre enn for de fluorsubstituerte forbindelser. Denne forskjell i virkningsmønster for 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner vil kunne anvendes til å benytte individuelle komponenter for ulike typer av terapeu-tisk behandling. Den foreliggende oppfinnelse omfatter også dette funn.

Under formulerings- og stabilitetsforsøkene med nitro- og fluorsubstituerte 1, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner ble det funnet at noen av disse forbindelsene er ustabile overfor nukleofiler som tiol (SH) i 2-merkaptoetanol og amino og guanidin i arginin, og utbytting av F med tiol eller aminogrupper ble observert. Det ble erkjent at disse observa-sjoner kunne anvendes for å fremstille en gruppe av 1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dioner som på annen måte ikke lett ville kunne fremstilles. Nukleofil substituering av fluor i orto-stilling til nitrogruppen i 6,7-difluor-5-nitrokinok-salin-2,3-dion (1) med forskjellige nukleofiler ble gjennom- ført som vist ved (11) - (15). Reaksjonen ble generelt fulgt ved<1>H NMR og/eller<19>F NMR spektroskopi. Erstatning av fluor orto til nitrogruppen med en nukleofil omdanner den aromatiske H fra en dublett av dubletter til en dublett. F - H koblingskonstanten er rundt 11,5 Hz, som bekrefter at resterende F er orto til H. Reaksjonen mellom 1 og natriumazid er nesten øyeblikkelig etter at de to er blandet i DMSO. Måling av<1>H NMR spekteret umiddelbart etter at prøven var blandet viste en dublett ved 7,1 ppm for det aromatiske H og intet utgangsmaterial ble observert.

Likeledes gav reaksjonen av 7-klor-6-fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion med natriummetoksyd 7-klor-6-metoksy-5-nitrokinoksalin-2 , 3-dion, og gav 7-klor-6-etyltio-5-nitrokinoksalin-2,3-dion med etantiol.

En fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med

eller en tautomer derav hvor

R<1>er nitro, cyano eller CF3,

R<2>er C-L-C6-alkoksy, fenyl- C-^- C^-alkoksy, hydroksy eller

azido,

R<3>er halo, halo-C1-C6-alkyl, nitro, C-L-Cg-alkyl, C-l-C6-alkoksy, azido eller cyano,. og

R<4>er hydrogen,

omfatter at en forbindelse med formelen:

eller en tautomer derav hvor

R<1>er nitro, cyano eller CF3,

R2 er fluor,

R<3>er halo, halo-C^^-Cg-alkyl, C-^Cg-alkyl, C^Cg-alkoksy,

azido eller cyano, og

R4 er hydrogen,

reageres med et alkoksyd, fenylalkoksyd, hydroksyd eller azid i et inert løsningsmiddel, og med påfølgende isolering av den således dannede forbindelse. Eksempler på slike inerte løs-ningsmidler inkluderer dipolare aprotiske løsningsmidler som DMF og DMSO. Der nukleofilen er en alkoksygruppe, kan løs-

ningsmiddelet være den tilsvarende alkohol. Reaksjonen gjen-nomføres mellom romtemperatur og 120°C, og reaksjonsforløpet måles ved NMR spektroskopi.

ElektrontUtrekkende grupper som cyano og CF3, i 5-stillingen forventes til å oppføre seg i likhet med nitro. Reaksjonen vil fortsette uavhengig av gruppen tilstede i 7- og 8-stillingene.

Eksempler på forbindelser ifølge oppfinnelsen som kan fremstilles i henhold til denne fremgangsmåte omfatter 6-azido-7-fluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7 - fluor-6-metoksy-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-etoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-hydroksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 7-klor-6-metoksy-5-nitro-kinoksalin-2,3-dion.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således forbindelser med omfattende binding til glycinreseptoren og liten binding til kainat og AMPA setene. Glycinantagonist-styrken in vitro kan bestemmes ved anvendelse av en 1/zM glycin-stimulert [<3>H]-MK801 bindingsanalyse. Denne analyse drar fordel av avhengigheten av bindingen av [3H] -MK801 til PCP reseptoren inne i poren til NMDA kanalen av nærvær av både glutamat og glycin. I fravær av glycin, men i nærvær av glutamat, kan [<3>H]-MK801 ikke binde effektivt til PCP reseptoren fordi NMDA kanalen forblir lukket og tilgang av [<3>H]-MK801 til PCP reseptoren inne i den lukkede kanalpore er sterkt begrenset.

Analysen gjennomføres ved anvendelse av rottehjernemembran-homogenater som er anriket med NMDA reseptorer. Membranene fremstilles som følger. Frosne rottehjerner (oppnådd fra Pel-Freez, Rogers, Arkansas) homogeniseres i 15 volumdeler (vekt/volum) av iskald 0,32 M sukrose. Homogenatene sentrifugeres ved 1.000 x g i ti min. Supernatanten samles og sentrifugeres i 20 min. ved 44.000 x g. Pelleten suspenderes i 15 volumdeler vann (i forhold til original hjernevekt). Homogenatet sentrifugeres igjen ved 44.000 x g i tyve min. Pelleten resuspenderes i 5 volumdeler vann og suspensjonen fryses-tines i 2 timer. Etter den siste tining bringes suspensjonen til 15 volumdeler med vann og sentrifugeres ved44.000 x g i tyve min. Pelleten resuspenderes i 5 volumdeler iskald 10 mM HEPES og titreres til pH 7,4 med KOH inneholdende 0,04% Triton X-100. Membraner inkuberes med Triton/- HEPES buffer ved 37°C i 15 min. Volumet bringes deretter til 15 med iskald 10 mM HEPES, pH 7,4 og blandingen sentrifugeres/vaskes tre ganger med sentrifugeringer på 44.000 x g mellom vaskingene. Den endelige pellet suspenderes i tre volumdeler 50 mM HEPES, pH 7,4 , og proteinkonsentrasjonen bestemmes med en standard farge-bindingsproteinanalyse (Bio-Rad, Richmond, CA). Suspensjonen lagres ved -80°C inntil den anvendes. Kun vann med HPLC kvalitet anvendes for alle buffere og suspensjoner/vaskeløsninger. De omfattende vaskinger er nødvendige for å fjerne så mye endogent glycin fra membranpreparatet som mulig.

På analysedagen blir de tidligere fremstilte membraner tint og 5 mM Tris/HCl buffer, pH 7,4, tilsettes til å gi en endelig proteinkonsentrasjon på 0,156 mg/ml. For bindingsana-lyser blir 0,8 ml membraner pipettert inn i polypropylenrør etterfulgt av 0,033 ml 15,1/xM 5,7-diklorkynurensyre (DCK) , 0,033 ml 30,3/xM glycin i buffer (eller buffer alene), 0,033 ml 303/xM glutamat i buffer (eller for kontroller, 0,1 ml 1 mM PCP i stedet for DCK/gly/glu) , 0,033 ml glycinantagonist i buffer (eller buffer alene) og 0,1 ml buffer inneholdende

200.000 cpm [<3>H]-MK801. Ikke-spesifikk binding defineres som den forskjell i binding som forekommer i fravær eller nærvær av PCP (sluttkonsentrasjon: 100 /xM) . For å bestemme effekten av 1/xM glycin på bindingen av [<3>H]-MK801, blir bundet radioaktivitet i nærvær av 10/xM glutamat alene (sluttkonsentrasjon) subtrahert fra bundet radioaktivitet i nærvær av både 10 izM glutamat og 1/xM glycin (sluttkonsentrasjon) . En 500 nM konsentrasjon (endelig) av 5,7-diklorkynurensyre (DCK) tilsettes til alle analyserørene. Denne konsentrasjon av

glycinantagonisten DCK "buffrer" det meste av det resterende endogene glycin som ikke er fjernet ved de omfattende vaske-trinn som gjennomføres under membranfremstillingsprosedyren. Den 500 nM DCK interfererer ikke med stimuleringen av [3H] -

MK801 binding som bevirkes ved tilsetning av 1/xM eksogent glycin.

Prøvene inkuberes i 12 0 min. ved romtemperatur hvoretter membranbundet radioaktivitet isoleres fra den frie radioaktivitet ved vakuumfiltrering gjennom Whatman glassfiber-filtre som var blitt forbehandlet med 0,3% polyetylenimin. Filtrering gjennomføres ved anvendelse av en Brandel 4 8 brønncellehøster. Filtrerte membraner vaskes tre ganger med 3 ml iskald buffer. Filteret overføres til scintillasjonsrør og 5 ml seintillasjonsblanding tilsettes. Rørene rystes over natten og radioaktiviteten telles ved væskescintillasjonsspektroskopi. Analysene gjennomføres- in triplo og alle forsøk utføres minst tre ganger.

Dose-respons inhiberingskurver konstrueres ved anvendelse av økende konsentrasjoner av glycinantagonister fra 5 nM til 330/xM. IC50verdier bestemmes for forbindelser som er aktive i inhibering av 1/xM glycin-stimulert [3H] -MK801 binding ved dataassistert plotting av inhiberingskurvene og ved inter-polasjon. Når forbindelsene blir funnet til å inhibere glycin-stimulert [<3>H]-MK801 binding, gjennomføres forsøk for å bestemme om inhiberingen av den glycin-stimulerte [3H] - MK801 binding faktisk formidles i glycinbindingssetet til NMDA reseptoren. I disse forsøk blir en fast konsentrasjon av antagonist som er tilstrekkelig til å gi en > 95% inhibering av den 1/xM glycin-stimulerte [3H] -MK801 binding inkubert med membranene uten noe ytterligere glycin (over 1/xM) og i nærvær av økende konsentrasjoner av ytterligere glycin (2/xM til 1 /xM) . Dersom inhiberingen av [3H] -MK801 binding ved medikamentet i nærvær' av 1/xM glycin er fullstendig reversert ved tilsetning av økende konsentrasjoner av glycin, da er inhiberingen av [<3>H]-MK801 binding formidlet ved medikamentet som virker som en antagonist i glycin-bindingssetet til NMDA reseptoren.

Etter konstruksjon av dose-respons inhiberingskurver og bestemmelse av glycin-reverserbarhet, beregnes K±verdier for glycinantagonistene ved anvendelse av Cheng og Prusoff lig- ningen ved bruk av de eksperimentelt bestemte IC50verdier, de kjente konsentrasjoner av glycin i forsøket (1/zM) og glyci-nets kjente affinitet for glycin-bindingssetet til NMDA reseptoren (100 nM).

De samme rottehj ernemembran-homogenater som anvendes for 1/xM glycin-stimulert [<3>H]-MK801 bindingsforsøket anvendes for t<3>H]-AMPA radioligand bindingsforsøket. På dagen for selve forsøket tines de frosne membraner (fremstilt som beskrevet over) og fortynnes med 30 mM Tris/HCl buffer inneholdende 2,5 mM CaCl2og 100 mM KSCN, pH 7,4, til å gi en endelig membran-konsentrasjon på 1,2 5 mg/ml membranprotein. For bindings-forsøket tilsettes 0,8 ml membranhomogenat til polypropylen-rør etterfulgt av 0,033 ml medikament og 0,067 ml buffer (eller for kontroller, 0,1 ml buffer alene) og 0,1 ml buffer inneholdende 200.000 cpm [<3>H]-AMPA. Prøven inkuberes i 30 min. på is. Bundet radioaktivitet separeres fra fri radioaktivitet ved filtrering på Whatman glassfiberfiltere (forbehandles med 0,3% polyetylenimin) ved anvendelse av enBrandel 48 brønncellehøster.

Filtrerte membraner vaskes tre ganger med 3 ml iskald buffer. Filtrene overføres til seintillasjonsrør og 5 ml scintillasjonsvæske tilsettes. Rørene rystes over natten og radioaktivitet telles ved væskescintillasjonsspektroskopi. Ikke-spesifikk binding bestemmes ved den radioaktivitet som forblir bundet til membranene i nærvær av 10 mM glutamat. Dose-respons inhiberingskurver konstrueres ved å tilsette økende konsentrasjoner av medikament fra 10 nM til 100 ixM.

Det samme membranpreparat som anvendt i [<3>H]-AMPA bindings-forsøket kan anvendes for [<3>H]-kainat radioligand bindings-forsøket. På selve forsøksdagen tines de frosne rottehjerne-membraner og 5 mM Tris/HCl buffer, pH 7,4, tilsettes i en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg/mL membranprotein. For bin-dingsf orsøket tilsettes 0,8 ml membranhomogenat til poly-propylenrør etterfulgt av 0,033 ml medikament og 0,067 ml buffer (eller for kontroller, 0,1 ml buffer alene) og 0,1ml buffer inneholdende 200.000 cpm [<3>H]-kainat. Prøven inku beres i 2 timer på is. Bundet radioaktivitet separeres fra fri radioaktivitet ved filtrering over Whatman glassfiber-filtre (forbehandlet med 0,3% polyetylenimin) ved anvendelse av en Brandel 48 brønncellehøster. Filtrerte membraner vaskes tre ganger med 3 ml iskald buffer. Filtrene overføres til scintillasjonsrør og 5 ml scintillasjonsvæske tilsettes. Rørene rystes over natten og radioaktivitet telles ved væskescintillasjonsspektroskopi. Ikke-spesifikk binding bestemmes ved den radioaktivitet som forblir bundet til membranene i nærvær av 10 mM glutamat. Dose-respons inhiberingskurver konstrueres ved å tilsette økende konsentrasjoner av medikament fra 250 nM til 330/iM.

Den anksiolytiske aktivitet til hvilken som helst spesiell forbindelse i henhold til oppfinnelsen kan bestemmes ved anvendelse av enhver av de kjente dyremodeller for angst/uro. En foretrukket modell er beskrevet av Jones, B.J. et al., Br. J. Pharmacol. 93:985-993 (1988). Denne modell involverer administrering av den aktuelle forbindelse til mus som har et høyt basalt angst/uronivå. Testen er basert på det funn at slike mus har aversjon når de tas fra en mørk hjemlig om-givelse i et mørkt forsøksrom og plasseres i et område som er malt hvitt og som er sterkt opplyst. Forsøksboksen har to avdelinger, en hvit og sterkt opplyst og en sort og ikke-opplyst. Musene hadde adgang til begge avdelinger i en åpning på gulvnivå i skilleinnretningen mellom de to avdelinger. Musene plasseres i sentrum av det sterkt opplyste området. Etter lokalisering av åpningen til det mørke området, kan musene fritt passere frem og tilbake mellom de to avdelinger. Kontrollmus har en tendens til å tilbringe en større del av tiden i den mørke avdelingen. Når de får et anksiolytikum tilbringer musene mere tid med å undersøke den mere opplyste avdeling og utviser en utvidet latensperiode før de beveger seg til den mørke avdeling. Dessuten utviser musene som er behandlet med det anksiolytiske middel mere adferd i den hvite avdeling som målt ved at dyrene reiser seg opp for eksplorativt formål og ved deres linjekryssing. Siden mus kan vende seg til testsituasjonen, bør naive mus alltid anvendes i testen. Fem parametre kan måles: latens inntil inntreden i den mørke avdeling, tiden som brukes i hvert område, antall overganger mellom avdelingene, antall linjer som krysses i hver avdeling, og det antall ganger som musene reiser seg i hver avdeling. Administreringen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen forventes å føre til at musene tilbringer mere tid i det større, sterkt opplyste området i forsøkskammeret.

I modellen med lys/mørkeeksplorasjon, kan den anksiolytiske aktivitet til et putativt middel identifiseres ved økningen av antall linjekryssinger og oppreisinger i den lyse avdeling på bekostning av antallet linjekryssinger og oppreisinger i den mørke avdeling, sammenlignet med kontrollmus.

En annen foretrukket dyremodell er den sosiale interaksjons-test hos rotter som beskrevet av Jones, B.J. et al., supra, hvor den tid som to mus tilbringer i sosial interaksjon kvantifiseres. Den anksiolytiske aktivitet til et putativt middel kan identifiseres ved økningen i tid som par med hannrotter tilbringer i aktiv sosial interaksjon (90% av adferden er av undersøkende natur). Både familiaritet og lysnivå på forsøksplassen kan manipuleres. Rotter som ikke mottar medikament viser det høyeste nivå av sosial interaksjon når for-søksplassen er familiær og er svakt opplyst. Sosial interaksjon avtar dersom plassen er ufamiliær for rottene eller at den er sterkt opplyst. Anksiolytiske midler forhindrer denne nedgang i sosial interaksjon. Det totale nivå av motorisk aktivitet kan også måles for å kunne påvise medikament-effekter som er særegne for sosial adferd.

Effekten av glycin og eksitatosjons-aminosyreantagonister til å inhibere glutamatnevrotoksisitet i et rottehjernekorteks-nervecelle-dyrkingssystem kan bestemmes som følger. En eksi-totoksisitetsmodell som er modifisert etter den er utviklet av Choi (Choi, D.W., J. Neuroscience 7:357 (1987)) kan anvendes for å teste anti-eksitotoksisk effekt av glycin og eksitasjons-aminosyreantagonistene. Rottefoster fjernes på dag 19 fra "tids-parete" gravide rotter. Hjernene fjernes fra fostrene og den cerebrale korteks dissekeres. Celler fra den dissekerte korteks dissosieres ved en kombinasjon av mekanisk omrøring og enzymatisk nedbrytning i henhold til metoden etter Landon og Robbins (Methods in Enzymology 124:412 (1986)). De dissosierte celler føres gjennom en 80 tim nitex-sikt og levedyktigheten til cellene bestemmes ved Trypan Blue. Cellene plates på poly-D-lysinbelagte plater og inkuberes ved 37°C i en atmosfære som inneholder 91% 02/9% C02. Seks dager senere tilsettes fluor-d-uracil i to dager for å undertrykke ikke-nevral cellevekst. På dyrkingsdag 12 blir de primære nevronkulturer eksponert for 100 txM glutamat i 5 minutter med eller uten økende doser glycin og eksitasjons-aminosyreantagonist eller andre medikamenter. Etter 5 minutter vaskes kulturene og inkuberes i 24 timer ved 3 7°C. Nervecelleødeleggelse kvantifiseres ved å måle laktatdehydro-genase (LDH) aktivitet som er frigitt inn i dyrkingsmediumet. LDH aktivitet måles i henhold til metoden etter Decker et al.

(Decker et al., J. Immunol. Methods 15:16 (1988)).

Den anti-konvulsive aktivitet til glycin og eksitasjons-aminosyreantagonister kan bestemmes i den audiogene slagmodell i DBA-2 mus som følger. DBA-2 mus kan oppnås fra Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Disse mus utvikler i en alder < 27 dager et tonisk slaganfall innen 5-10 sekunder og dør når de eksponeres for en lyd på 14 kHz (sinusbølge) ved 110 dB (Lonsdale, D., Dev. Pharmacol. Ther. 4:28 (1982)). Slagbeskyttelse defineres når dyrene som er injisert med medikament 30 min. før lydeksponering ikke utvikler et slaganfall og ikke dør i løpet av 1 min. eksponering for lyd. 21 dager gamle DBA-2 mus anvendes i alle forsøk. Forbindelsene gis intraperitonealt i enten salt-løsning, DMSO eller polyetylenglykol-400. Passende løsnings-middelkontroller er inkludert i hvert forsøk. Dose-respons kurver konstrueres ved å gi økende medikamentdoser fra 1 mg/kg til 100 mg/kg. Hver dosegruppe (eller løsningsmiddel-kontroll) utgjøres av minst seks dyr.

Den anti-konvulsive effekt til glycin-reseptorantagonistene kan bestemmes i den pentylentetrazol (PTZ)-induserte slagtest som følger. Swiss/Webster mus, injisert med 50 mg/kg PTZ (i.p.) utvikler et minimalt klonisk slaganfall som varer omtrent 5 sekunder i løpet av 5 til 15 min. etter medika-mentinjeksjon. Anti-konvulsiv effekt av et glycin/eksitasjons-aminosyreantagonist (eller annet) medikament er definert som fravær av et slaganfall når et medikament gis 30 min. før PTZ tilførsel og når et slaganfall ikke utvikles i opp til 45 min. etter PTZ administrering. Glycin/eksitasjons-aminosyreantagonist eller andre medikamenter gis intraperitonealt i enten saltløsning, DMSO eller polyetylenglykol-400. Passende løsningsmiddelkontroller er inkludert i hver forsøk. Dose-respons kurver konstrueres ved å gi økende medikamentdoser fra 1 mg/kg til 100 mg/kg. Hver dosegruppe (eller løsningsmiddelkontroll) utgjøres av minst seks dyr.

Effekten av glycin/eksitasjons-aminosyreantagonister for å beskytte mus fra NMDA-indusert død kan bestemmes som følger. Når mus injiseres med 200 mg/kg N-metyl-D-aspartat (NMDA) i.p., vil dyrene utvikle slaganfall etterfulgt av død innen 5-10 min. Glycin/eksitasjons-aminosyreantagonister testes for deres evne til å forhindre NMDA-indusert død ved at medi-kamentene gis i.p. 3 0 min. før NMDA tilførsel. Glycin/ eksitasjons-aminosyreantagonist eller andre medikamenter gis intraperitonealt i enten saltløsning, DMSO eller polyetylenglykol-400. Passende løsningsmiddelkontroller er inkludert i hvert forsøk. Dose-respons kurver konstrueres ved å gi

økende medikamentdoser fra 1 mg/kg til 100 mg/kg. Hver dosegruppe (eller løsningsmiddelkontroll) utgjøres av minst seks dyr.

Den antikonvulsive aktivitet til glycinantagonistene kan bestemmes i MES forsøkene i mus. Elektrosjokk ble påført hannmus av typen Swiss/Webster (20 - 30 g, Simonsen) gjennom kornealelektroder (Swinyard, E. A. (1973) i Anticonvulsant drugs, Mercier J. Ed. Pergamon Press, Oxford s. 47-65) .Slaganfallsstimuliparameterne var: 50 mA, 60 Hz, rektangulær puls, bredde 0,8 msek, varighet 200 msek. Tonisk bakben- ekstensjon observert etter tilføring av elektrisk stimuli ble målt som forekomst av anfall. Medikamentet ble tilført i.v. som en vandig Tris (Trometamin) løsning.

En rekke ulike evalueringer kan utføres på doser av glycin/- eksitasjons-aminosyreantagonistene i henhold til oppfinnelsen for å bestemme den biologiske aktivitet til forbindelsene både i normale gerbiler og i dyr som er blitt utsatt for 5 min. bilateral karotid okklusjon. Se reaksjonsskjerna, VIII. Disse studier utføres i dyr som er bevisste og som ikke har fått tilført andre farmakologiske midler. Gerbiler pre-instrumenteres 48 timer før ischemi for å tillate komplett eliminering av det anvendte pentobarbitale anestesimiddel. Når dyrene testes med medikament, får dyrene i.p. injeksjoner av glycin/eksitatosjons-aminosyreantagonist eller vehikkel. I tilfellet med multiple injeksjoner gis dyrene i.p. injeksjoner med 2 timers mellomrom og sluttinjeksjonen gis 3 0 min. før den ischemiske periode eller i tilfellet med etterbehandling gis dyrene injeksjoner 30 min., 2 timer, 4 timer og 6 timer etter ischemisk reperfusjon.

For å bestemme den direkte farmakologiske aktivitet eller potensielle aktivitet til glycin/eksitasjons-aminosyre-antagonister, injiseres naive gerbiler med enten saltløsning eller forskjellige doser av antagonisten. Adferdsforan-dringene bestemmes ved anvendelse av et lokomotorisk aktivitet skammer med fotostråle, som er en sirkulær plass med diameter lik 2 fot og med fotostråledeteksjon. Dyr plasseres individuelt i kamrene med diameter lik 2 fot. Kamrene anbringes i et skap som er lukket og lyd fjernes ved anvendelse av både en bakgrunns-hvit-lyd-generator og en vifte. Dyrene plasseres i disse kamre i forbindelse med den initiale farmakologiske evaluering i en periode på 6 timer og den totale aktivitet under hver påfølgende time samles ved anvendelse av datakontrol1systemene.

Saltløsning resulterte i en initial høy aktivitetsrate, hvor kontro11dyrene viste et aktivitetsnivå i den første timen på omtrent 1600 "counts". Dette nivå av kontrollaktivitet er typisk for gerbilen under disse eksperimentelle forhold. Etter hvert som forsøket skrider frem mister dyrene deres eksplorative aktivitet og i sluttperioden er aktiviteten falt til omtrent 250 "counts" pr. time. Det forventes at glycin/- eksitasjons-aminosyreantagonisten i henhold til oppfinnelsen ikke vil ha signifikant effekt på hverken den initiale eksplorative rate eller den terminale eksplorative rate.

I en neste fase av evalueringen av glycin/eksitasjons-aminosyreantagonistene, forbehandles gerbiler med varierende doser av antagonistene og eksponeres deretter for en fem-minutters periode med bilateral karotid okklusjon. Etter initieringen av reperfusjon plasseres dyrene i det sirkulære apparat for testing av lokomotorisk aktivitet og aktiviteten på begynnel-sen av den første time etter reperfusjon måles i de påfølgen-de fire timer.

Kontrolldyr som ikke er blitt eksponert for ischemi og som har fått injeksjoner av saltløsning før de plasseres i kammeret for måling av lokomotorisk aktivitet viser et karakteristisk aktivitetsmønster, som i den første timen med lokomotorisk aktivitet er vesentlig høyere enn i løpet av alle andre timer og som avtar progressivt over de fire timene til en svært lav verdi. I motsetning til den progressive nedgang i aktivitet i løpet av den fire timers testperiode, viser kontrolldyr som er eksponert for fem-minutters kortikal ischemi et fullstendig forskjellig mønster for lokomotorisk aktivitet. Under den første timen er der et signifikant fall i aktivitet som etterfølges av en progressiv økning hvor aktiviteten under den fjerde timen er ti ganger høyere enn den som vises hos dyr som ikke er blitt eksponert for karotid okklusjon. Disse resultatene er typiske og er et pålitelig resultat av de endringer som er forårsaket ved fem-minutters bilateral karotid okklusjon i gerbilen.

Separate grupper av gerbiler forbehandles med glycin/eksitasjons-aminosyreantagonister i henhold til oppfinnelsen 30 min. før inntreden av karotid okklusjon og plasseres deretter i kammeret for lokomotorisk aktivitet etter en times reperfusjon. Det forventes at forbehandling av gerbilene med glycin/eksitasjons-aminosyreantagonister i henhold til oppfinnelsen vil forhindre både den post-ischemiske nedgang og økning i aktivitet. Post-ischemisk nedgang i aktivitet forventes til å være nær null under den første timen etter reperfusjon. Forbehandling med glycin/eksitasjons-aminosyreantagonister i henhold til oppfinnelsen forventes å redusere eller forhindre denne tidlige adferdsdepresjon. I tillegg forventes glycin/eksitasjons-aminosyreantagonistene i henhold til oppfinnelsen å forhindre den post-ischemiske stimulering av adferd.

Etter fullføring av enkeldose-forbehandlingsevalueringene, evalueres gerbiler også med multiple injeksjoner av glycin/- eksitasjons-aminosyreantagonister i henhold til oppfinnelsen. Doser administreres i.p. 6 timer, 4 timer, 2 timer og 30 min. før inntreden av 5-minutters ischemi.

Etter 24 timer evalueres alle dyrene for forskjeller i patruljeringsadferd ved anvendelse av en 8-arms radiell labyrint. I denne prosedyre plasseres dyrene i labyrintens midtre startkammer, barrieren fjernes og den tid og det antall timer som dyrene gjør en feil måles før fullføring av eksplorasjon i alle 8 labyrintarmer. En feil er definert som revisiteringen av en arm ved at et dyr går inn med hele kroppen uten at halen inkluderes. Dersom dyret forblir eller ikke klarer å forlate armen i løpet av 5 min., avsluttes for-søket. I kontrollpopulasjonen av dyr er antallet feil og eksplorasjon av labyrinten uten tidligere erfaring (naiv) omtrent 6 feil. Dette er en gjennomsnittsverdi for et antall på 28 gerbiler. Etter 5 min. med bilateral karotid okklusjon og etter testing i 24 timer, gjør gerbiler et gjennomsnittlig antall feil lik 21. Når dyrene er forbehandlet med glycin/- eksitasjons-aminosyreantagonister i henhold til oppfinnelsen, forventes der å være en signifikant reduksjon i antallet feil som gjøres. Der forventes også å være en signifikant nedgang i de adferdsmessige forandringer som induseres ved bruk av labyrint med radielle armer.

Det forventes også at etterbehandling med glycin/eksitasjons-aminosyre-antagonistene i henhold til oppfinnelsen vil redusere korttidsminne-svekkelsen 24 timer etter ischemi/re-perfusj on.

Effekten av 5-minutter bilateral karotid okklusjon på nerve-celledød i den dorsale hippocampus kan evalueres i dyr7dager etter ischemi-reperfusjon-skade. Tidligere studier har vist at nevronal degenerering inntrer omtrent 3 dager etter cerebral ischemi. Etter 7 dager vil de nevroner som er blitt påvirket gjennomgå cytolyse og har enten fullstendig degenerering eller de er lett synlige som mørke kjerner og deplas-serte kjerner eller som celler med eosinofilt cytoplasma og pyknotiske kjerner. Lesjonen med 5-minutters ischemi begrenses vesentlig innen hippocampus til CA1 regionen av den dorsale hippocampus. Den intermediale laterale sone til hornet er upåvirket og den takkede gyrus og/eller cellene i ..CA3 viser ikke patologi. Gerbiler bedøves på dag 7 etter ischemi med 60 mg/kg pentobarbital. Hjerner perfusjoneres trans-kardielt med iskaldt saltvann etterfulgt av bufret parafor-maldehyd (10%). Hjernene fjernes, innestøpes og snitt fremstilles. Snitt farges med hematoksylin-eosin og antall nerveceller bestemmes som antallet nervekjerner/100fim. Normale kontrolldyr (ikke eksponert for ischemi-reper-fusjonsskade) vil ikke vise noen signifikant forandring i normal kjernedensitet innen dette området. Eksponering for en 5-minutters bilateral karotid okklusjon resulterer i en signifikant reduksjon i antallet kjerner tilstede i CA1 regionen. Generelt resulterer denne lesjon i en regulær nekrose i stedet for en konfluent nekrose, som sees dersom 10-minutters ischemi anvendes. Forbehandling med glycin-reseptorantagonistene i henhold til oppfinnelsen forventes å gi en signifikant beskyttelse av hippocampus nevronal degene-rasj on.

Det er kjent at NMDA reseptorer er kritisk involvert i utviklingen av vedvarende smerte etter nerve- og vevsskade. Vevsskade, slik som dem bevirket ved å injisere en liten mengde formalin subkutant inn i bakfoten'til et forsøksdyr, er blitt vist til å gi en umiddelbar økning av glutamat og aspartat i ryggmargen (Skilling, S. R., et al., J. Neurosei. 10:1309-1318 (1990) ) . Administrering av NMDA reseptorblokkere reduserer responsen av ryggmargs-dorsalhorn-nevroner etter formalininjeksjon (Dickenson and Aydar, Neuroscience Lett. 121:263-266 (1991), Haley, J. E., et al., Brain Res. 518:218-226 (1990)). Disse dorsalhorn-nevroner er kritiske med hensyn til å bære smertesignalet fra ryggmargen til hjernen og en redusert respons hos disse nevroner viser en reduksjon i smerte som oppfattet av forsøksdyret hvortil smerte er blitt påført ved subkutan injeksjon av formalin.

På grunn av den observasjon at NMDA reseptorantagonister kan blokkere dorsalhorn-nevronresponsen indusert ved den subku-tane injeksjon av formalin, har NMDA reseptorantagonister potensiale for behandling av kronisk smerte, som smerte bevirket ved kirurgi, ved amputasjon (fantomsmerter) ..eller som påført ved andre sår (sårsmerter). Bruk av konvensjonel-le NMDA antagonister som MK801 eller CGS 19755 for å forebygge eller behandle kronisk smerte er imidlertid sterkt begrenset ved de negative PCP-lignende adferds-bivirkninger som man oppnår med disse medikamenter. Det forventes at glycinreseptorantagonistene som er formålet med den foreliggende oppfinnelse vil være svært effektive i å forhindre kronisk smerte i mus som indusert ved å injisere formalin subkutant inn i bakfoten til dyrene. Fordi glycin/eksita-sj ons-aminosyre -antagonisten i henhold til oppfinnelsen forventes å være uten PCP-lignende bivirkninger, er disse medikamenter svært anvendbare for å forhindre eller behandle kronisk smerte uten å gi PCP-lignende negative adferds-bivirkninger.

Effektene av glycinreseptorantagonister i henhold oppfinnelsen på kronisk smerte kan evalueres som følger. Hannmus av typen Swiss/Webster som veide fra 25-35 gram holdes fem i hvert bur med fri adgang til for og vann og de holdes på en

12 timers lyssyklus (lys påsettes klokken 08.00). Glycin-

i reseptorantagonisten oppløses i DMSO i en konsentrasjon på

henholdsvis 1-40 og 5-40 mg/ml. DMSO anvendes som vehikkelkontroll. Alle medikamenter injiseres intraperitonealt (1 /il/g) . Formalintesten utføres som beskrevet (Dubuisson and

Dennis, Pain, 4:H161-174 (1977)). Musene observeres i en

i pleksiglassylinder, som har en diameter på 25 cm og en høyde på 30 cm. Plantar-overflaten til den ene bakfot injiseres subkutant med 2 0 izl 5% formalin. Graden av smerte bestemmes ved å måle det tidsforløp som dyret tilbringer med å slikke den formalininjiserte fot under de følgende tidsintervaller: 0-5 min. (tidlig fase), 5-10, 10-15 og 15-50 min. (sen fase). For å teste om glycin/eksitasjonsaminosyreantagonistene forhindrer kronisk smerte i forsøksdyrene, blir vehikkel (DMSO) eller medikamenter oppløst i vehikkel i doser på 1 mg/kg til 40 mg/kg injisert intraperitonealt 30 min. før formalin-injeksjonen. For hver dose av medikament eller vehikkelkontroll anvendes minst seks dyr.

Sammenlignet med vehikkelkontroll forventes det at den intra-peritoneale injeksjon av glycinreseptorantagonistene 3 0 min. før formalininjeksjon inn i bakfoten signifikant vil inhibere den formalininduserte kroniske smerte på en doseavhengig måte som bestemt ved reduksjon av den tid som musen bruker til å slikke den formalininjiserte bakfot, som bevirket ved økende doser av glycin/eksitasjons-aminosyreantagonist.

Det er vel kjent å anvende opiater, f.eks. morfin, innen det medisinske området for å lindre smerte. (Som anvendt heri skal betegnelsen "opiater" bety ethvert preparat eller derivat av opium, særlig de alkaloider som naturlig er inneholdt deri, hvorav der er omtrent tyve, f.eks. morfin, noskapin, kodein, papaverin og tebain og deres derivater). Med kontinuerlig bruk vil dessverre kroppen bygge opp en toleranse for opiatet og således for fortsatt lindring, og pasienten må underkastes stadig større doser. Dette i seg selv kan være skadelig for pasientens helse. Videre kan det komme et tidspunkt når toleransen er hovedsakelig fullstendig og hvor medikamentets smertestillende egenskaper ikke lenger er effektive. I tillegg kan administrering av høyere doser av morfin føre til respiratorisk depresjon noe som fører til at pasienten stopper å puste. Senere studier har foreslått en modulerende rolle for NMDA reseptoren i morfintoleranse. Man har nå funnet at administrering av kinoksalindioner kan inhibere opiattoleranse ved å blokkere glycin-koagonistsetet assosiert med NMDA reseptoren.

Preparater som er innenfor rammen for den foreliggende oppfinnelse inkluderer alle dem hvor forbindelsene i henhold til oppfinnelsen er inneholdt i en mengde som er effektiv til å oppnå de tiltenkte formål. Mens individuelle behov varierer, er bestemmelse av de optimale områder av de effektive mengder for hver forbindelse innen området for en fagkyndig. Forbindelsene kan typisk administreres til pattedyr, f.eks. mennesker, oralt i en dose fra 0,0025 til 50 mg/kg, eller en ekvivalent mengde av det farmasøytisk tålbare salt derav, pr. dag, av kroppsvekten til pattedyret som behandles for angst-forstyrrelser, f.eks. generalisert angst, fobier, tvangsli-delser, panikkangst og lidelser som post-traumatisk atress. Fra omtrent 0,01 til omtrent 10 mg/kg administreres foretrukket oralt for å behandle eller forebygge slike lidelser. For intramuskulær injeksjon er dosen generelt omtrent halvparten av den orale dose. For behandling eller forebygging av angst er f.eks. en passende dose fra omtrent 0,0025 til omtrent 15 mg/kg, og mest foretrukket fra omtrent 0,01 til omtrent 10

mg/kg.

For behandling eller forebygging av nevronalt tap ved ischemi, hjerne- og ryggmargstraumer, hypoksi, hypoglykemi og ved kirurgi, såvel som for behandling av Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom, eller for å behandle en sykdom hvor lidelsens pato-fysiologi involverer hyperaktivitet av de eksitatoriske aminosyrer eller NMDA reseptor-ion-kanal relatert nevrotok-sisitet eller psykose, kan de farmasøytiske preparater i henhold til oppfinnelsen omfatte forbindelsene ifølge oppfinnelsen i en enhetsdose på fra 0,01 til omtrent 50 mg/kg kroppsvekt, eller en ekvivalent mengde av det farmasøytisk tålbare salt derav, for anvendelse i en kur på 1-4 ganger pr. dag. For anvendelse i behandling av kronisk smerte eller for å indusere anestesi, kan forbindelsene i henhold til oppfinnelsen administreres i en enhetsdose fra omtrent 0,01 til omtrent 50 mg/kg kroppsvekt, eller en ekvivalent mengde av et farmasøytisk tålbart salt derav, som en kur fra 1-4 ganger pr. dag. Det skal selvfølgelig forståes at det eksakte behandlingsnivå vil avhenge av sykdomshistorien til det dyr, f.eks. det menneske som behandles. Det nøyaktige behandlingsnivå kan bestemmes av en fagkyndig på området uten unødig eksperimentering.

Den orale enhetsdose kan omfatte fra omtrent 0,01 til omtrent 50 mg, foretrukket fra omtrent 0,1 til omtrent 10 mg av forbindelsen. Enhetsdosen kan administreres en eller flere ganger daglig som en eller flere tabletter som hver inneholder fra omtrent 0,1 til omtrent 10, passende fra omtrent 0,25 til 50 mg av forbindelsen eller dens solvater.

I tillegg til å administrere forbindelsen som et råkjemi-kalie, kan forbindelsene i henhold til oppfinnelsen administreres som en del av et farmasøytisk preparat inneholdende passende farmasøytisk tålbare bærere omfattende eksipienser og hjelpestoffer som forenkler prosessering av forbindelsene til preparater som kan anvendes farmasøytisk. Preparatene, særlig de preparater som kan administreres oralt og som kan anvendes for den foretrukne type av administrering, som tabletter, dragéer og kapsler, og preparater som kan administreres rektalt, som stikkpiller, såvel som passende oppløsninger for administrering ved injeksjon eller oralt, kan foretrukket inneholde fra 0,01 til 99%, særlig fra omtrent 0,25 til 75% av en eller flere aktive forbindelser, sammen med eksipiensen.

De ikke-giftige farmasøytisk tålbare salter av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen er også innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse. Basiske salter dannes ved å blande en oppløsning av det spesielle 1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dionet i henhold til oppfinnelsen med en oppløsning av en farmasøytisk tålbar ikke-toksisk base, som natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, natriumbikarbonat, natriumkarbonat eller en aminoforbindelse som cholinhydroksyd, Tris, bis-Tris, N-metylglukamin, arginin o.l. Se US patentsøknad nr. 08/14 8.268, supra.

De farmasøytiske preparater i henhold til oppfinnelsen kan

administreres til ethvert dyr som kan ha fordel av de fordel-aktige effekter av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen. Fremst blant slike dyr er mennesker, skjønt oppfinnelsen ikke skal begrenses sådan.

De farmasøytiske preparater i henhold til oppfinnelsen kan administreres på en hvilken som helst måte som fører til oppnåelse av deres tilsiktede formål. Administrering kan f.eks. være parenteral, subkutan, intravenøs, intramuskulær, intraperitoneal, transdermal, buccal eller okulært. Alternativt eller samtidig kan administreringen gjennomføres oralt. Den dose som administreres vil avhenge av alder, helsetil-stand og vekt hos mottakeren, typen samtidig behandling om noen, hyppigheten av behandlingen og beskaffenheten av den ønskede effekt.

Når preparatene i henhold til oppfinnelsen administreres okulært, kan man oppnå enten lokal eller systemisk administrering. Preparatene i henhold til oppfinnelsen kan f.eks. administreres i form av øyedråper som er hovedsakelig isotoniske med tårefluidet for å oppnå systemisk administrering. Slike preparater vil foretrukket også omfatte et permeasjonsøkende middel som understøtter den systemiske absorpsjon av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen. Se US patent nr. 5.182.258. Alternativt kan preparatene ifølge oppfinnelsen administreres okulært for å behandle eller forebygge degenerering av den optiske nerve. I denne utførelses-form administreres forbindelsene i henhold til oppfinnelsen i form av øyedråper, som angitt i det foregående, eller de kan injiseres i nærheten av den optiske nerve. Alternativt kan tynne okulærimplantater anvendes som sakte frigir forbindelsene i henhold til oppfinnelsen.

I tillegg til de farmakologisk aktive forbindelser kan de nye farmasøytiske preparater inneholde passende farmasøytisk tålbare bærere omfattende eksipienser og hjelpestoffer som forenkler prosessering av de aktive forbindelser til preparater som kan anvendes farmasøytisk.

De farmasøytiske preparater i henhold til oppfinnelsen fremstilles på en måte som i seg selv er kjent, f.eks. ved hjelp av konvensjonell blanding, granulering, dragé-fremstilling, oppløsning eller frysetørking. Således kan farmasøytiske preparater for oral anvendelse oppnås ved å kombinere de aktive forbindelser med faste eksipienser, eventuelt maling av den endelige blanding og prosessering av blandingen av granuler, etter tilsetning av passende hjelpestoffer, om ønsket eller nødvendig, for å oppnå tabletter eller dragé-kjerner.

Passende eksipienser er spesielt fyllstoffer, som sakkarider, f.eks. laktose eller sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater og/eller kalsiumfosfater, f.eks. trikalsium-fosfat eller kalsiumhydrogenfosfat, såvel som bindemidler, som stivelsespasta ved anvendelse av f.eks. maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse, potetstivelse, gelatin, tragant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkar-boksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon. Om ønsket kan desintegrasjonsmidler tilsettes, som de ovennevnte stivelser og også karboksymetylstivelse, tverrbundet polyvinylpyrrolidon, agar eller alginsyre eller et salt derav som natriumalginat. Hjelpestoffer er fremfor alt flytregulerende midler og smøremidler som f.eks. silika, talkum, stearinsyre eller salter derav, som magnesiumstearat eller kalsium-stearat, og/eller polyetylenglykol. Dragékjernene tilveie-bringes med passende belegg som om ønsket er resistente mot magesafter. For dette formål kan konsentrerte sakkaridopp-løsninger anvendes som eventuelt kan inneholde gummi ara-bicum, talkum, polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol og/eller titandioksyd, lakkoppløsninger, og passende organiske løs-ningsmidler eller løsningsmiddelblandinger. For å fremstille belegg som er resistente mot magesafter, anvendes oppløsnin-ger av passende cellulosepreparater som acetylcelluloseftalat eller hydroksypropylmetylcelluloseftalat. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller dragébeleggene for f.eks. identifikasjon eller for å karakterisere kombinasjoner av doser av aktiv forbindelse.

Andre farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt inkluderer "push-fit" kapsler dannet av gelatin, såvel som myke, forseglede kapsler dannet av gelatin og en mykner, som glyse-rol eller sorbitol. "Push-fit" kapslene kan inneholde de aktive forbindelser i form av granuler som kan være blandet med fyllstoffer som laktose, bindemidler som stivelser og/eller smøremidler som talkum eller magnesiumstearat, og eventuelt stabiliseringsmidler. I myke kapsler er de aktive forbindelser foretrukket oppløst eller suspendert i passende væsker som fettoljer eller flytende parafin. I tillegg kan stabiliseringsmidler tilsettes.

Mulige farmasøytiske preparater som kan anvendes rektalt inkluderer f.eks. stikkpiller som utgjøres av en kombinasjon av en eller flere aktive forbindelser med en stikkpillebasis. Passende stikkpillebasiser er f.eks. naturlige eller syntetiske triglycerider eller parafinhydrokarboner. I tillegg er det også mulig å anvende rektale gelatinkapsler som utgjøres av en kombinasjon av de aktive forbindelser med en basis. Passende basismaterialer inkluderer f.eks. flytende triglyserider, polyetylenglykoler eller parafinhydrokarboner.

Passende formuleringer for parenteral administrering inkluderer vandige oppløsninger av de aktive forbindelser i vannopp-løselig form, f.eks. vannoppløselige salter og alkaliske opp-løsninger. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelser som passende oljeaktige injeksjonssuspensjoner administreres. Passende lipofile løsningsmidler eller vehikler inkluderer fettoljer, f.eks. sesamolje eller syntetiske fett-syreestere, f.eks. etyloleat eller triglyserider eller polyetylenglykol -400 (forbindelsene er oppløselige i PEG-400). Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen, f.eks. natriumkarboksy-metylcellulose, sorbitol og/eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde stabiliseringsmidler.

Karakteriseringen av glycin-bindingsseter in vitro har vært

vanskelig på grunn av mangel på selektive medikament1igander. Således kan glycinligandene i henhold til oppfinnelsen anvendes til å karakterisere glycin-bindingssetet. De særlig foretrukne forbindelser som kan anvendes for dette formål er isotopiske radioaktivt merkede derivater, f.eks. hvor en eller flere av atomene er erstattet med<3>H,<1:L>C, 14C, 15N eller 18F.

Eksempler på foretrukne fotoaffinitetsligander er<3>H eller<18>F substituert 6-azido-5,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion og<3>H substituert 6-azido-5,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2 , 3-dion. 1 det etterfølgende er det angitt eksempler som skal illus-trere oppfinnelsen. EKSEMPEL 1 Fremstilling av 5,6,7-trifluor-1,4-dihydro kinoksalin-2,3-dion 2 , 3,4-trifluoracetanilid. Til en rosa oppløsning av 2,3,4-trifluoranilin (1,04 g, 9,45 mmol) i kloroform (12 ml) ble det tilsatt eddiksyreanhydrid (1,63 g, 16,0 mmol), noe som gav en blekrosa oppløsning som ble omrørt over natten under nitrogen. Kloroformet ble fjernet i vakuum til å gi 1,35 g (99%) av acetanilidet som et hvitt faststoff:<1>H NMR (CDC13) , 2.28 (s, 3H) , 6,95 (m, 1H) , 7.31 (m, 1H), 7.97 (m, 1H) .

3, 4 ,5-trifluor-1,2-fenylendiamin. Til 2,3,4-trifluoracetanilid (1,35 g, 7,09 mmol) tilsettes konsentrert svovelsyre (8 ml) . Mens flasken er i et isbad tilsettes KN03sakte, noe som gir en gulbrun blanding som omrøres over natten. Reaksjonsblandingen som nå er mørk rød tilsettes deretter til isvann (45 ml) noe som øyeblikkelig gir et orange presipitat. Den flyktige forbindelse, trolig 2,3,4-trifluor-6-nitro-anilin, oppløses i etylacetat (18 ml) og etylalkohol (12 ml). Til den orange oppløsning tilsettes stannokloriddihydrat (7,6 g,34mmol). Den oppnådde blanding omrøres og bringes til tilbakeløp under N2i 4 timer. Blandingen tilsettes til isvann (40 ml) og gjøres basisk med 2N NaOH (40 ml). Den ekstraheres med etylacetat (3 x 20 ml) og de kombinerte ekstrakter vaskes med vann (2 0 ml) og saltvann (20 ml). Denne mørkerøde oppløsning tørkes (MgS04) og avdampes til å gi 285 mg (25%) av diaminet som et mørkerødt faststoff.<1>H NMR (CDC13), 3.22 (br s, 2H), 3.46 (br s, 2H), 6.32 (m, 1H).

5 , 6,7-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Til en brun oppløsning av 3,4,5-trifluor-1,2 - fenylendiamin (285 mg, 1,75 mmol) i vandig 2N HCl (10 ml) tilsettes oksalsyre (221 mg, 1,75 mmol). Den brune blanding bringes til tilbakeløp og omrøres under N2over natten. Blandingen filtreres til å gi 139 mg (37%) av den urene tittelforbindelsen. En analytisk prøve fremstilles ved å oppløse 42 mg av dette brune pulver i 2,5 ml kokende etanol. Ved avkjøling dannes brune, stav-lignende krystaller som filtreres og tørkes i vakuum til å gi 15 mg (36%) av en ren tittelf orbindelse:<X>H NMR (DMS0-d6) , 6.91 (m, 1H), 12.02 (s, 1H), 12.19 (s, 1H), analyse beregnet for C8H3F3N202: C, 44.46, H, 1.40, N, 12.96. Funnet: C, 44.42, H, 1.16, N, 12.76.

Eksempel 2 Fremstilling av 6-klor-5,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

3-klor-2,4-difluor-(trifluoracetamido)benzen. Til en oppløs-ning av 10,5 g (64,3 mmol) 3-klor-2,4-difluoranilin i 25 ml dioksan som ble holdt på et isbad ble det dråpevis tilsatt 10 ml (14,8 g, 70,4 mmol) trifluoreddiksyreanhydrid. Oppløsnin-gen ble omrørt ved romtemperatur i 2 0 timer. Den ble deretter tilsatt til 150 ml isvann og blandingen ble omrørt i 1 time. Den ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et nesten fargeløst faststoff, 16,1 g (96%), smp 73-74°C,<X>H NMR (CDC13), 7.068 (m, 1), 7.976 (mb, 1), 8.146 (m, 1).

3-klor-2,4-difluor-6-nitro-(trifluoracetamido)benzen. Til en oppløsning av 15,1 g (58,1 mmol) 3-klor-2,4-difluor-(trif luoracetamido) -benzen i 80 ml H2S04som ble holdt på et isbad ble det dråpevis tilsatt 10 ml HN03. Fast presipitat ble observert under tilsetningen av HN03. Blandingen ble omrørt i et isbad i 4 timer og deretter tilsatt til 600 ml isvann. Presipitatet ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et nesten fargeløst faststoff (16,8 g, 95%), smp 124-125°C, ^-H NMR (CDCl3), 7.69 (dd, 1), 8.936 (mb, 1).

3-klor-2,4-difluor-6-nitroanilin. En oppløsning av 6,35 g (20,8 mmol) 3-klor-2,4-difluor-6-nitro-(trifluoracet-amido)benzen i 60 ml 7% K2C03metanol/vann (3:2) ble omrørt

ved 25°C i 4 timer. Oppløsningen ble avdampet for å fjerne metanol. Faststoff ble observert i resten. Den ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 3 01 mg av et krystallinsk gult faststoff, smp 96 - 97°C,<X>H NMR (CDC13), 6,07 (mb, 2), 7.815 (dd, 1, J = 1.92, 9.13). Mere faststoff ble observert etter at den vandige moderløsning fikk stå ved romtemperatur over natten. Den ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff (1,01 g). Mere faststoff ble krystallisert fra moderløsningen. Det ble samlet ytterligere tre ganger til å gi 2,48 g av et gult faststoff.

■"•H NMR er identisk med det ovennevnte, og det totale utbytte var 3,80 g (87%).

4-klor-3 , 5-dif luor-1,2-fenylendiamin. En oppløsning av 348 mg (1,67 mmol) 3-klor-2,4-difluor-6-nitroanilin og 1,57 g (8,28 mmol) SnCl2i 8 ml etanol ble oppvarmet ved 70°C i 2 timer. Oppløsningen ble avdampet for å fjerne etanol. Resten ble behandlet med 2 N NaOH til pH = 13. Hvitt presipitat ble observert. Blandingen ble ekstrahert med CHC13(3 x 10 ml) . Ekstrakten ble tørket (MgS04) og avdampet til å gi et rødt faststoff (285 mg, 95%), smp 77 - 78°C,<X>U NMR (CDC13) , 3.156 (b, 2), 3.704 (b, 2), 6.352 (dd, 1,J = 1.86, 9.95) .

6-klor-5 , 7-dif luor-1, 4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion. En blanding av 230 mg (1,29 mmol) 4-klor-3,5-difluor-1,2 -

f enylendiamin og 125 mg (1,38 mmol) oksalsyre i 4 ml 2 N HC1 ble behandlet med tilbakeløp i 3 timer og avkjølt til romtemperatur. Blandingen ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et brunt faststoff (245 mg, 82%) , smp >250°C,<X>H NMR (DMSO-d6), 6.921 (d, 1, J = 9.61)/12.143 (s, 1), 12.168 (s, 1). MS, 232 (M<+>, 100), 204 (80), 176 (40), 149 (70), 171 (80). HRMS beregnet for C8H3<35>C1F2N202, 231,9848, funnet 231,9851.

Eksempel 3 Fremstilling av 6-klor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

2-klor-4-fluor-5-nitrotoluen. Til en omrørt oppløsning av 2-klor-4-fluortoluen (2,000 g, 1,383 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i konsentrert H2S04(15,0 ml) ved 0°C tilsettes KN03(1,400 g, 1,385 mmol) i én porsjon. Den oppnådde blekgule oppløsning ble oppvarmet til 28°C og omrørt over natten ved 28°C. Den ble deretter helt inn i is (100 g) og .ekstrahert med etylacetat (2 x 100 ml). Etylacetat ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og den oppnådde olje ble tørket videre under vakuum til å gi 2,085 g (80%) av tittelforbindelsen som en olje som ble anvendt som sådan i den neste reaksjon,<X>H NMR (CDC13) : 6 2.422 (s, 3H) , 7.325 (d, 1H, J1= 10.2 Hz), 7.973 (d, 1H, Jx= 5.2 Hz).

N-(5<1->klor-4<1->metyl-2<1->nitrofenyl)glycinnatriumsalt. Til en omrørt oppløsning av 2-klor-4-fluor-5-nitrotoluen (2,080 g,10,97 mmol, som fremstilt i det foregående) i DMF (11,0 ml) og ved 70°C ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (1,065 g, 10,97 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i vann (11,0 ml). Den oppnådde suspensjon ble omrørt over natten ved 70°C, avkjølt til romtemperatur og det oppnådde røde faststoff ble filtrert, vasket med aceton (35 ml) og tørket under vakuum til å gi 1,005 g (37%) av den rene (<X>HNMR) tittelforbindelsen som et rødt pulver,<1>H NMR (DMSO-d6): 6 2.184 (s, 3H), 3.396 (d, 2H, J = 4.2 Hz), 6.852 (s, 1H), 7.991 (s, 1H), 8.671 (s, 1H).

6-klor-3 , 4-dihydro-7-metylkinoksalin-2 (1H)-on. En oppløs-ning av N-(5'-klor-4<1->metyl-2<1->nitrofenyl)glycin (1,000 g, 4,088 mmol, som fremstilt i det foregående) og tinn (II) kloriddihydrat (2,767 g, 12,26 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i etanol (20,0 ml) ble behandlet med tilbakeløp i 30 min. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur og det presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med etanol (4,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,251 g (31%) av tittelforbindelsen som et gult pulver,<X>H NMR (DMS0-d6) : 6 2.093 (s,

3H) 3.657 (d, 2H, J = 1.5 Hz), 5.984 (s, 1H) , 6.583 (s, 1H) , 6.632 (s, 1H) , 10.253 (s, 1H) .

6-klor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Til en omrørt suspensjon av 6-klor-3,4-dihydro-7-metylkinoksalin-2(1H)-on (0,150 g, 0,763 mmol, som fremstilt i det foregående) i CF3COOH (1,6 ml), ble overskudd av rykende salpetersyre (0,40 ml) tilsatt og den oppnådde røde oppløsning ble omrørt over natten ved 2 8°C. Løsningsmiddelet ble fjernet under vakuum og resten ble fortynnet med vann (3,0 ml). Det presipiterte faststoff ble filtrert og tørket under vakuum til å gi 0,151 g (77%) av ren (renhet ved HPLC - 100%) tittelforbindelse som et lysegult pulver, smp - mørkner ved 350°C,<X>H NMR (DMSO-d6): 6 2.311 (s, 3H), 7.149 (s, 1H), 12.107 (s, 1H) 12.193 (s, 1H) , elementanalyse for C9H6C1N304: beregnet C, 42,29%, H, 2,37%, N, 16,44%, funnet C, 42,46%, H, 2,10%, N, 16,33%.

Eksempel 4 Fremstilling av 7-klor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

2-klor-5-fluor-4-nitrotoluen. Til en omrørt løsning av 2-klor-5-fluortoluen (0,500 g, 3,46 mmol, Lancaster, anvendt som mottatt) i konsentrert H2S04(5,0 ml) ved 0°C, tilsettes KNO3(0,350 g, 3,46 mmol) i én porsjon. Den oppnådde blekgule oppløsning ble oppvarmet til 28°C og omrørt over natten ved 28°C. Den ble deretter helt inn i is (50 g) og ekstrahert med eter (2 x 50 ml) . Eteren ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og den oppnådde olje ble tørket videre under vakuum til å gi 0,616 g (94%) av tittelforbindelsen som en olje som ble anvendt som sådan for den neste reaksjonen,<X>H NMR (CDC13) : 6 2.459 (s, 3H) , 7.193 (d, 1H, J1= 11.1 Hz), 8.083 (d, 1H, J1= 6.6 Hz).

N-(4 '-klor-5 '-metyl-2 1-nitrofenyl) glycin-natriumsalt. Til en omrørt oppløsning av 2-klor-5-fluor-4-nitrotoluen (0,605 g, 3,19 mmol, som fremstilt i det foregående) i DMF (3,0 ml) ved 70°C, ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (0,310 g, 3,19 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i vann (3,0 ml). Den oppnådde suspensjon ble omrørt over natten ved 70°C. Suspensjonen ble avkjølt til romtemperatur og det oppnådde røde faststoff ble filtrert, vasket med kloroform (10 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,360 g (46%) av den rene (<X>H NMR) tittelforbindelsen som et rødt pulver,<1>H NMR (DMS0-d6) : 6 2.276 (s, 3H) , 3.431 (d, 2H, J = 4.2 Hz), 6.848 (s, 1H) , 7.963 (s, 1H) , 8.773 (s, 1H) .

7-klor-3,4-dihydro-6-metylkinoksalin-2(1H)-on. En oppløsning av N-(4<1->klor-5'-metyl-2<1->nitrofenyl)glycin-natriumsalt (0,300 g, 1,23 mmol, som fremstilt i det foregående) og tinn (II) kloriddihydrat (0,830 g, 3,68 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i etanol (4,0 ml) ble behandlet med tilbakeløp i 30 min. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur og det presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med etanol (1,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,160 g (66%) av tittelforbindelsen som et gult pulver,<X>H NMR (DMS0-d6): 6 2.099 (s, 3H) , 3.655 (s, 2H) , 6.037 (s, 1H) , 6.538 (s, 1H) 6.685 (s, 1H), 10.241 (s, 1H).

7-klor-6-metyl-5-nitrokinoksalin-2(1H),3(4H)-dion. Til en omrørt suspensjon av 7-klor-3 , 4-dihydro-6-metylkinoksalin-2(lH)-on (0,100 g, 0,509 mmol) som fremstilt i det foregående) i CH3C00H (3,0 ml), ble overskudd av rykende HN03(0,30 ml) tilsatt og den oppnådde røde oppløsning ble omrørt over natten ved 28°C. Løsningsmiddelet ble fjernet under vakuum og resten fortynnet med vann (4,0 ml) . Det presipiterte faststoff ble filtrert og tørket under vakuum til å gi 0,067 g (52%) av den rene (renhet ved HPLC: 100%) tittelforbindelsen som et lysegult pulver, smp - mørkner ved 340°C. -"-H NMR (DMSO-d6) : 6 2.184 (s, 3H) , 7..263 (s, 1H) , 11.948 (s, 1H) , 12.144 (s, 1H) , Elementanalyse for C9H6CN304- H20, beregnet: C, 40,85%, H, 2,28%, N, 15,87%, funnet: C, 40,63%, H, 2,05%, N, 15,75%.

Eksempel 5 Fremstilling av 6-brom-7-fluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion l-brom-2,5-difluor-4-nitrobenzen. Til en omrørt oppløsning av l-brom-2,5-difluorbenzen (1.000 g, 5,181 mmol, Aldrich,

anvendt som mottatt) i konsentrert H2S04(8,0 ml) ved 0°C, ble KN03(0,525 g, 5,19 mmol) tilsatt i én porsjon. Den oppnådde gule oppløsning ble oppvarmet til 28°C og omrørt ved 28°C over natten. Den ble deretter helt inn i is (80 g) og ekstrahert med etylacetat (75 ml). Etylacetatet ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og det oppnådde hvite faststoff ble tørket videre under vakuum til å gi 1,102 (89%) av tittelforbindelsen som et hvitt pulver, smp 58 - 60°C,<1>H NMR (CDCI3): 6 7.591 (dd, 1H, Jx= 9,6 Hz, J2= 5,4 Hz), 7.891 (t, 1H, J = 6.9 Hz).

N-(51 -brom-4'-fluor-21-nitrofenyl)glycin-natriumsalt. Til en omrørt oppløsning av l-brom-2,5-difluor-4-nitrobenzen (1.100 g, 4,622 mmol, som fremstilt i det foregående) i DMF (11,0 ml) ved 70°C ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (0,451 g, 4,65 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i vann (5,0 ml). Den oppnådde oppløsning ble omrørt over natten ved 70°C. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur og det klare orange faststoff ble filtrert, vasket med kald aceton (10 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,469 g (35%) av tittelf orbindelsen som et klart orange pulver, -"-H NMR (DMSO-d6): 6 3.458 (d, 2H, J = 3.9 Hz), 7.148 (d, 1H, J=6,0 Hz), 7.944 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 8.740 (s, 1H) .

6-brom-3,4-dihydro-7-fluor-kinoksalin-2(1H)-on. En oppløs-ning av N-(5'-brom-4'-fluor-2'-nitrofenyl)glycin-natriumsalt (0,450 g, 1,54 mmol, som fremstilt i det foregående) og tinn (II) kloriddihydrat (1,039 g, 4,605 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i etanol (7,0 ml) ble behandlet med tilbakeløp i 3 0 min. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur og løs-ningsmiddelet ble fjernet under vakuum. Resten ble fortynnet med vann (15,0 ml) og gjort basisk med 10% Na2C03til pH~8. Den oppnådde suspensjon ble ekstrahert med etylacetat (10 0 ml). Etylacetatet ble tørket over vannfri Na2S04og fjernet

under vakuum til å gi 0,241 g (64%) av tittelforbindelsen som et gult pulver, smp 214 - 216°C,<1>H NMR (DMS0-d6) : 6 3.684 (s, 2H), 6.062 (s, 1H), 6.631 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 6.825 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 10.303 (s, 1H).

6-brom-7-fluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Til en omrørt oppløsning av 6-brom-3,4-dihydro-7-fluor-kinoksalin-2(1H)-on (0,050 g, 0,20 mmol, fremstilt som i det foregående) i CF3COOH (1,0 ml), ble overskudd av rykende HN03(0,10 ml) tilsatt og den oppnådde røde suspensjon ble omrørt over natten ved 2 8°C. Løsningsmiddelet ble fjernet under vakuum og resten ble fortynnet med vann (2,0 ml). Det presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med vann (2,0 ml) og tørket i en tørkepistol (toluen-tilbakeløp) til å gi 0,034 g (55%) ren (<1>H NMR) tittelforbindelse som et gult pulver, smp. 323 - 327°C,<1>H NMR (DMS0-d6) : 6 7.179 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 12.208 (s, 1H) , 12.317 (s, 1H) , elementanalyse for C8H3BrFN304beregnet: C, 31,60%, H, 0,99%, N, 13,82%, funnet: C, 31,30%, H, 0,87%, N, 13,66%.

Eksempel 6 Fremstilling av 7-brom-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

2-brom-5-fluor-4-nitrotoluen. Til en omrørt oppløsning av 2-brom-5-fluortoluen (1,495 g, 7,909 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i konsentrert H2S04(10,0 ml) ved 0°C ble KN03(0,800 g, 7,91 mmol) tilsatt i én porsjon. Den oppnådde blekgule

oppløsning ble oppvarmet til 28°C og omrørt over natten ved 28°C. Den ble deretter helt inn i is (50 g) og ekstrahert med etylacetat (75 ml). Etylacetatet ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og den oppnådde olje ble videre tørket under vakuum til å gi 1,832 g (98%) av tittelforbindelsen som en olje.<X>H NMR (CDCl3) : 6 2.495 (s, 3H) , 7.213 (d, 1H, J-l = 11.4 Hz), 8.268 (d, 1H, J1= 7,2 Hz).

N-(4' -brom-5'-metyl-2'-nitrofenyl)glycin-natriumsalt. Til en omrørt oppløsning av 2-brom-5-fluor-4-nitrotoluen (1,662 g, 7,102 mmol, som fremstilt i det foregående) i DMF (7,0 ml) ved 70°C, ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (0,690 g, 7,11 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i vann (7,0 ml). Den oppnådde suspensjon ble omrørt over natten ved 70°C. Suspensjonen ble avkjølt til romtemperatur og det røde faststoff ble filtrert, vasket med aceton og tørket under vakuum til å gi 0,932 g (45%) av den rene (-""H NMR) tittelforbindelsen som et rødt pulver.<1>H NMR (DMSO-d6): 6 2.306 (s, 3H), 3.452 (d, 2H, J = 3.9 Hz), 6.874 (s, 1H), 8.125 (s, 1H), 8.799 (s, 1H).

7-brom-3,4-dihydro-6-metyl-kinoksalin-2(1H)-on. En oppløs-ning av N-(4'-brom-5'-metyl-21-nitrofenyl) glycin-natriumsalt (0,200 g, 0,692 mmol, som fremstilt i det foregående) og tin (II) kloriddihydrat (0,468 g, 2,07 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i etanol (2,0 ml) ble behandlet med tilbakeløp i 30 min. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur. Det presipiterte faststoff ble filtrert og tørket under vakuum til å gi 0,064 g (38%) av tittelforbindelsen som et gult pulver.

<1>H NMR (DMSO-d6): 6 2.130 (s, 3H), 3.674 (s, 2H), 6.120 (s, 1H) , 6.583 (s, 1H) , 6.868 (s, 1H) , 10.284 (s, 1H) .

7-brom-6-metyl-5-nitrokinoksalin-2(1H),3(4H)-dion. Til en omrørt suspensjon av 7-brom-3,4-dihydro-6-metyl-kinoksalin-2(lH)-on (0,028 g, 0,012 mmol, fremstilt som i det foregående) i CF3COOH (0,30 ml) ble overskudd av rykende HN03(0,020 ml) tilsatt og den oppnådde røde oppløsning ble omrørt over natten ved 28°C. Den således oppnådde suspensjon ble avkjølt i et isbad og fortynnet med vann (2,0 ml) . Det presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med vann (2,0 ml) og tørket i en tørkepistol (toluen-tilbakeløp) til å gi 0,014 g (40%) av den rene (^"H NMR) tittelf orbindelsen som et lysegult pulver,

smp > 340°C,<X>H NMR (DMS0-d6) : 5 2.227 (s, 3H) , 7.440 (s, 1H) , 11.980 (s, 1H), 12.143 (s, 1H), elementanalyse for C9H6BrN304-0,45 H20 beregnet: C, 35,07%, H, 1,96%, N, 13,63%, funnet: C, 35,44%, H, 1,92%, N, 13,23%.

Eksempel 7 Fremstilling av 6-azido-7-fluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

Til en fast blanding av 23 mg (0,094 mmol) 6,7-difluor-5-nitrokinoksalin-2,3-dion og 7 mg (0,10 mmol) natriumazid ble det tilsatt 0,5 ml DMS0-d6og blandingen ble rystet i en vortex - blander i 10 sekunder. Noe hvitt uoppløselig material ble observert. En dråpe D20 ble tilsatt og blandingen ble rystet i 10 sekunder. Igjen ble noe hvitt faststoff observert. ^-H NMR, 7.109 (1, d, J = 12.0). Oppløsningen ble tilsatt til 3 ml isvann. Det gule presipitat ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff (21 mg, 84%), smp 255 - 257°C.<1>H NMR (DMSO-d6) , 7.166 (1, d, J = 11.8), 12.2-12.1 (m,2). 19F NMR (C6<F>5som referanse, -162,9 ppm), -130.5 (mb). IR (KBr), 2154, 1753, 1540, 1359, 1308 cm"<1>. MS, 266 (M<+>, 1), 238 (M<+>- N2, 100), 178 (90), 150 (40) .

Eksempel 8 Fremstilling av 7-fluor-6-metoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

Til en oppløsning av 21 mg (0,086 mmol) 6, 7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i 0,5 ml DMSO-d6ble det tilsatt 16 mg (0,29 mmol) natriummetoksyd. Oppløsningen ble rystet i en vortex - blander i 10 sekunder og holdt ved romtemperatur i 3 timer. Den ble deretter tilsatt til 3 ml vann og surgjort med 2 N HC1 til pH = 4. Presipitatet ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff (17 mg, 77%), smp 290 - 292°C.<X>H NMR (DMS0-d6) , 3.899 (s, 3), 7.163 (1, d, J = 11.6), 11.97.(mb, 1), 12.137 (s,1).<19>F NMR, -134.48 (mb). MS, 255 (M<+>, 100), 243 (15), 179 (16), 151 (40). HRMS, beregnet for C9H6FN305255,0287, funnet 255,308.

Eksempel 9 Fremstilling av 7-fluor-6-etoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

En oppløsning av 24 mg (0,098 mmol) 6,7-difluor-5-nitro-1,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion og 24 mg (0,33 mmol) natrium-etoksyd (96%) i 0,5 ml DMSO-d6ble holdt ved romtemperatur i 5 timer. Den røde oppløsning ble tilsatt til 3 ml vann og surgjort med 2 N HCl til pH = 4. Presipitatet ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff (24 mg, 91%), smp 293 - 295°C,<X>H NMR (DMS0-d6), 1.239 (t, 3, J = 7.0), 4.141 (q, 2, J = 7.2), 7.152 (1, d, J = 11.7), 11.975 (s, 1), 12.135 (s, 1).<19>F NMR, -134.06 (mb). MS, 269 (M<+>, 90), 241 (100), 195 (70). HRMS, beregnet for C10H8FN3O5269,0443, funnet 269,0454.

Eksempel 10 Fremstilling av 7-fluor-6-hydroksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

En blanding av 24 mg (0,098 mmol) 6,7-difluor-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 19 mg (0,47 mmol) natriumhydroksyd i 0,6 ml D20 ble oppvarmet ved 105°C i 24 timer. Blandingen ble tilsatt til 2 ml vann og surgjort med 2 N HCl til pH = 1. Presipitatet ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et rødt faststoff (19 mg, 80%), smp >360°C.

<1>H NMR (DMSO-d6) , 7.101 (1, d, J= 10.9), 11.10 (mb, 1), 11.70 (mb, 1), 11.99 (s, 1).<19>F NMR -137.4 (mb). MS 242 (M<+>+ 1, 100), 195 (50), 152 (20), 140 (25). HRMS, beregnet for C8H4FN305241,0131, funnet 241,0110.

Eksempel 11 Fremstilling av 5-azido-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

En blanding av 45 mg (0,18 mmol) 5-amino-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i 1 ml konsentrert H2S04(97%) ble omrørt i et isbad i 1 time. Til den oppnådde gule oppløsning ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av 70 mg (1,0 mmol) NaN02i 0,6 ml H20 og oppløsningen ble omrørt i et isbad i3timer. Til den oppnådde røde oppløsning ble det tilsatt en oppløsning av 98 mg NaN3i 0,6 ml H20 og den ble omrørt i 1 time. Til blandingen ble det tilsatt en oppløsning av 101 mg NaN3i 0,6 ml H20 og blandingen ble omrørt over natten. Blandingen ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff, 44 mg (88%), smp 130°C (spalting). XH NMR (DMSO-d6) , 7.148 (s,l), 11.75 (mb,l), 12.09 (s,l). IR (KBr) , 2120, 1700 cm"<1>.

Eksempel 12 Fremstilling av 6-azido-5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

En blanding av 10 mg (0,040 mmol) 6-amino-5,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i 0,5 ml konsentrert H2S04(97%) ble omrørt i et isbad i 1 time. Til den oppnådde gule opp-løsning ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av 30 mg (0,43 mmol) NaN02i 0,3 ml H20 og oppløsningen ble omrørt i et isbad i 2 timer. Til den oppnådde røde oppløsning ble det tilsatt en oppløsning av 4 0 mg NaN3i 0,3 ml H20 og den ble omrørt i 2 timer. Blandingen ble fortynnet med 2 ml H20 og omrørt over natten. Blandingen ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et nesten fargeløst faststoff, 10 mg (90%),

smp 150°C (spalting).<1>H NMR (DMSO-d6) , 7.153 (s,l), 11.602 (s,l), 12.02 (s,l). IR (KBr), 2127, 1720 cm"<1>.

Referanseksempel 1 Fremstilling av 6,7-dimetyl-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

En blanding av 2,72 g (2,0 mmol) 4,5-dimetyl-l,2-fenylendiamin og 1,92 g (21,3 mmol) oksalsyre i 30 ml 2 N HCl ble behandlet med tilbakeløp i 2,5 timer og avkjølt til romtemperatur. Blandingen ble fortynnet med 20 ml H20, filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et lysebrunt faststoff 3,57 g (94%), smp >250°C,<1>H NMR. (DMS0-d6) , 2.161 (s,6), 6.869 (s,2), 11.78 (s,2).

Eksempel 13 Fremstilling av 6,7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

Til en oppløsning av 1,90 g (10,0 mmol) 6,7-dimetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion i 25 ml H2S04(97%) holdt på et isbad ble det dråpevis tilsatt 1,2 ml HN03(69 - 70%) og oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 48 timer. Den ble helt inn i 300 ml isvann og omrørt i 10 min. Blandingen ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff, 1,40 g (60%). Faststoffet ble renset ved DMS0/H20 presipitering etterfulgt av NaOH/HCl presipitering til å gi 0,85 g av et gult faststoff, smp > 250°C.<X>H NMR (DMSO-d6) , 2.079 (s,3), 2.246 (s,3), 7.048 (s,l), 11.770 (s,l), 12.030 (s,l). HRMS beregnet for C10H9N3O4235,0588, funnet 235,0584.

Eksempel 14 Fremstilling av 7-fluor-6-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

2,5-difluor-4-nitrotoluen. Til en omrørt oppløsning av 2,5-difluortoluen (0,544 g, 4,25 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i konsentrert H2S04 (5,0 ml) ved 0°C tilsettes KN03(0,430 g, 4,25 mmol) i én porsjon. Den oppnådde blekgule oppløsning ble oppvarmet til 2 8°C og omrørt ved denne tempe-ratur over natten. Den ble deretter helt inn i is (25 g) og ekstrahert med etylacetat (40 ml). Ekstrakten ble tørket over Na2S04og avdampet til å gi 0,555 g (91%) av tittelforbindelsen som en lyserød olje. -"-H NMR (CDC13) : 2.369 (d, 3H, J = 1.8 Hz), 7.127 (dd, 1H, Jx= 8.1 Hz, J2= 6.0 Hz), 7.734 (dd, 1H, Jx=8.4 Hz, J2= 6.3 Hz).

N- (4-fluor-5-metyl-2-nitrofenyl) glycin-natriumsalt. Til en omrørt oppløsning av 2,5-difluor-4-nitrotoluen (0,550 g, 3,18 mmol) i DMF (5,0 ml) ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (0,3 08 g, 3,18 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i vann (1,0 ml). Den oppnådde suspensjon ble omrørt ved 28°C over natten. Faststoffet ble filtrert og tørket under vakuum til å gi 0,168 g (23%) urent produkt. Dette ble renset som følger. 0,150 g material ble kokt i etylacetat (5,0 ml) og filtrert i varm tilstand til å gi 0,134 g (18%) av de rene (<1>H NMR) tittelf orbindelsen som et gult pulver.<X>H NMR (DMSO-d6) : 2.213 (s, 3H) , 3.428 (d, 2H, J = 3.9 Hz), 6.765 (d, 1H, J = 6.9 Hz), 7.700 (d, 1H, J = 10.5 Hz), 8.728 (s, 1H).

7-fluor-3,4-dihydro-6-metylkinoksalin-2(1H)-on. En blanding av N-(4-fluor-5-metyl-2-nitrofenyl)glycin-natriumsalt (0,125 g, 0,548 mmol) og tinn (II) kloriddihydrat (0,370 g,

1,64 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i etanol (3,0 ml) ble behandlet med tilbakeløp i 3 0 min. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur og løsningsmiddelet ble fjernet under vakuum. Resten ble fortynnet med vann (4,0 ml) og gjort basisk med mettet NaHC03til pH -8. Den oppnådde suspensjon ble ekstrahert med etylacetat (30 ml). Ekstrakten ble tørket over Na2S04og avdampet til å gi 0,032 g av tittelforbindelsen som et gult pulver som ble anvendt i den neste reaksjon.<1>H NMR (DMSO-d6) : 2.024 (s, 3H) , 3.607 (s, 2H) , 5.751 (s, 1H), 6.453 (d, 1H, J = 9.9 Hz), 6.456 (d, 1H, J = 8.1 Hz) , 10.162 (s, 1H) .

7-fluor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion. Til en omrørt oppløsning av 7-fluor-3,4-dihydro-6-metyl-kinoksalin-2(1H)-on (0,023 g, 0,094 mmol) i CF3COOH (0,30 ml) ble overskudd av rykende HN03(0,020 ml) tilsatt og den oppnådde røde suspensjon ble omrørt over natten ved 28°C. Den således oppnådde røde oppløsning ble avkjølt i et isbad og fortynnet med vann (2,0 ml). Presipitatet ble filtrert, vasket med vann (2,0 ml) og tørket i en tørkepistol (toluen-tilbakeløp) til å gi 0,020 g (66%) av den rene tittelforbindelsen som et gult pulver. Smp 308 - 311°C.<X>H NMR (DMSO-d6) : 2.106 (s, 3H) , 7.058 (d, 1H, J = 9.9 Hz), 11.769 (bs, 1H) , 12 .172 (s, 1H) .

Eksempel 15 Fremstilling av 6-klor-5-cyano-7-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

Til en omrørt oppløsning av 2,6-diklor-3-nitrobenzonitril (3,935 g, 18,13 mmol, Lancaster, anvendt som mottatt) i DMF (25 ml) ved 7 0°C, ble en vandig oppløsning av natriumglycinat (1,760 g, 18,13 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i vann (25,0 ml) tilsatt dråpevis. Den oppnådde oppløsning ble omrørt ved 70°C i 48 timer. Suspensjonen ble avkjølt til romtemperatur og det presipiterte gule faststoff ble filtrert, vasket med kloroform (20 ml) og tørket under vakuum til å gi 2,020 g (44%) rent (<1>H NMR) N-(3'-klor-2<1->cyano-6'-nitro) fenylglycin som et gult pulver. -"-H NMR (DMS0-d6) : 6 3.888 (d, 2H, J = 3.9 Hz), 6.857 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 8.283 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 9.572 (s, 1H) .

En suspensjon av N-(3'-klor-2<1->cyano-6<1->nitro)fenylglycin (2,000 g, 7,824 mmol fremstilt som i det foregående) og tinn (II) kloriddihydrat (6,000 g 26,59 mmol, Aldrich, anvendt som mottatt) i etanol (40 ml) ble oppvarmet med tilbakeløp i 30 min. Den oppnådde suspensjon ble avkjølt til romtemperatur og faststoffet ble filtrert, vasket med etanol (20 ml) og tørket under vakuum til å gi 1,261 g (78%) av rent NMR) 6-klor-5-cyano-3,4-dihydrokinoksalin-2(1H)-on som et lysegult faststoff.<1>H NMR (DMSO-d6) : 8 3.668 (s, 2H) , 6.719 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.843 (d, 1H, J=8.1 Hz), 6.912 (s, 1H) 10.682 (s,1H).

Til en suspensjon av 6-klor-5-cyano-3,4-dihydrokinoksalin-2(1H)-on (0,096 g, 0,46 mmol, som fremstilt i det foregående) i CF3COOH (1,0 ml) ble rykende salpetersyre (0,40 ml) tilsatt slik at det dannet en mørk rød oppløsning. (En mindre mengde rykende salpetersyre dannet en suspensjon som gav en blanding av delvis oksyderte og fullstendig oksyderte produkter). Den oppnådde oppløsning ble deretter omrørt over natten ved romtemperatur. De flyktige forbindelser ble fjernet under vakuum og resten ble fortynnet med vann (3,0 ml). Det gule faststoff ble filtrert, vasket med vann (2,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,090 g (73%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelse som et gult pulver. Smp 327 - 331°C.<1>H NMR (DMSO-d6) : 6 7.950 (s, 1H) , 12.381 (s, 1H) . IR (KBr, cm" x) : 3501, 3452, 3157, 2259, 1740, ,1712, 1635, 1607, 1550, 1396, 1340, elementanalyse for C9H3C1N404beregnet: C, 40,55%, H, 1,13%, N, 21,02%, funnet: C, 40,57%, H, 1,11%, N, 20,84%.

Eksempel 16 Fremstilling av 5-cyano-6,7-diklor-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

En suspensjon av 6-klor-5-cyano-7-nitrokinoksalin-2(1H), 3(4H)-dion (0,100 g, 0,38 mmol, som fremstilt i det foregåen de) og tinn (II) kloriddihydrat (0,508 g, 2,25 mmol, Aldrich) i etanol (4,0 ml) ble behandlet med tilbakeløp i 24 timer. Den oppnådde suspensjon ble deretter avkjølt til romtemperatur og det gule faststoff ble filtrert, vasket med etanol (2,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,078 g (88%) av 7-amino-6-klor-5-cyanokinoksalin-2(1H),3(4H)-dionet som et gult pulver.<X>H NMR (DMS0-d6) : 6 5.762 (br s, 2H), 6.818 (s, 1H) , 11.69 (s, 1H) , 12.03 (s, 1H) .

Til en omrørt oppløsning av 7-amino-6-klor-5-cyanokinoksalin-2(1H),3(4H)-dion (0,035 g, 0,15 mmol, som fremstilt i det foregående) i konsentrert HCl (1,5 ml) ved 0°C, ble en vandig oppløsning av NaN02(0,060 g, 0,87 mmol) i vann (0,20 ml) tilsatt og den oppnådde turbide oppløsning ble omrørt i et isbad i 2 timer. En oppløsning av CuCl (0,100 g, 1,01 mmol) i konsentrert HCl (1,0 ml) ble tilsatt dertil mens kolben ble avkjølt i et isbad. Omgående N2utvikling fulgte og den oppnådde mørkegrønne suspensjon ble omrørt ved 0°C i 2 timer. Vann (1,0 ml) ble tilsatt dertil etterfulgt av omrøring over natten ved romtemperatur. Til den lysegrønne suspensjon som ble dannet ble vann (4,0 ml) tilsatt med ytterligere omrøring ved romtemperatur i 1 time. Det faste presipitat ble filtrert, vasket med vann (2,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,029 g (77%) av tittelforbindelsen som et kremfarget faststoff.. Smp 327 - 335°C (spalting) .<X>H NMR (DMS0-d6) : 6 7.463 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 12.306 (s, 2H). Kobling av aromatisk signal forsvant ved tilsetning av 3 dråper metanol-d4som indikerte at det aromatiske protonet hadde koblet med peri N - H proton. IR (KBr, cm"<1>), 3574, 3479, 2237, 1737, 1710, 1392, 1271, 1183.

Eksempel 17 Fremstilling av 7-klor-6-metoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

Til en omrørt oppløsning av 7-klor-6-fluor-5-nitrokinoksalin-2(1H),3(4H)-dion (0,100 g, 0,385 mmol, som fremstilt i det foregående) i DMSO (1,0 ml) ved romtemperatur, ble natriummetoksyd (0,125 g, 2,31 mmol, Mallinckrodt) tilsatt i én porsjon. Den oppnådde mørkerøde oppløsning ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den ble deretter fortynnet med vann (5,0 ml) og surgjort med konsentrert HCl (6 dråper) til pH ~2 . Det presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med vann (5,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,116 g (110%) av den rene (<1>H NMR) tittelf orbindelsen som et gult pulver. Smp-mørkner ved 316°C.<X>R NMR (DMS0-d6) : 6 3.821 (s, 3H) , 7.275 (s, 1H), 12.079 (s, 1H) 12.121 (s, 1H). NMR indikerer også tilstedeværelsen av DMSO (reaksjonsløsningsmiddel).

Eksempel 18 Fremstilling av 6,7-dietyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (26)

1,2-dietyl-4-nitrobenzen (16), 1,2-dietyl-3-nitrobenzen (17), og 4,5-dietyl-l,3-dinitrobenzen (18). Prosedyren etter Lambooy, J. P., J. Am. Chem. Soc. 71:3756 (1949) ble benyttet for denne reaksjon. En blanding av rykende salpetersyre (8,75 ml, Baker) og iseddik (4,5 ml) ble avkjølt til 10°C. Til denne blanding ble 1,2-dietylbenzen (15) (2,5 g, 18,6 mmol, Aldrich) tilsatt dråpevis i en slik takt at temperatu-ren holdes ved 10 - 20°C med kraftig omrøring i løpet av 3 0 min. Etter at tilsetningen var ferdig ble reaksjons-

blandingen omrørt ved 15°C i ytterligere 1 time. Reaksjonsblandingen ble deretter helt inn i is-vann (50 ml) . Nitro-forbindelsene ble ekstrahert med eter (4 x 20 ml) . Den kombinerte eterekstrakt ble vasket med vann (3 x 7,5 ml), 10%av en vandig natriumhydroksydoppløsning (2 x 8 ml) og vann (2x 7,5 ml). Eterekstrakten ble tørket over natriumsulfat. Løsningsmiddelet ble avdampet til å gi en rest som ble renset ved preparativ TLC (heksaner: EtOAc = 8:2), til å gi mono-nitroforbindelsene (16) og (17) (1,90 g, 57%) som en gul olje (Rf = 0,8), sammen med dinitroforbindelsen (18) (0,30 g, 7%) som en brun olje (Rf = 0,5).<X>H NMR (CDCl3, 300 MHz) 8 (16): 1.220 (t, 6H, J = 7 Hz), 2.725 (q, 4H, J = 7 Hz), 7.728 (d, 1H, J = 6 Hz), 7.986 (d, 1H, J = 6 Hz), 8.034 (s, 1H). (17): 1.220 (t, 6H, J = 7 Hz), 2.725 (q, 4H, J = 7 Hz), 7.242 (m, 1H) , 7.378 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.550 (d, 1H, J = 7.5 Hz). (18): 1.231 (t, 6H, J = 7 Hz), 2.655 (q, 4H, J = 7 Hz), 8.044 (s, 1H), 10.636 (s, 1H).

3.4- dietylanilin (19) og 2,3-dietylanilin (20). En blanding av 1,2-dietyl-4-nitrobenzen (16) og 1,2-dietyl-3-nitrobenzen (17) (1,4 g, 7,82 mmol) ble oppløst i etylacetat (20 ml). Til denne oppløsning ble det tilsatt 10% Pd-C (350 mg, 20%, Aldrich). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur under et trykk på 35 psi (H2) i 10 timer. Katalysatoren ble fjernet gjennom en kolonne av Celite (5 g) og vasket med etylacetat (3 x 15 ml). Filtratene ble kombinert og avdampet i vakuum til å gi en rest som ble separert ved preparativ TLC (heksaner: EtOAc = 8:2), til å gi 3,4-dietylanilin (19)

(0,822 g, 71%) som en blekgul olje (Rf = 0,7) og 2,3-dietylanilin (20) (0,219 g, 19%) som en brun olje (Rf = 0,6).<X>H NMR (CDC13, 300 MHz): 6 (19): 1.184 (t, 6H, J = 7 Hz), 2.573(q, 4H, J = 7 Hz), 3.456 (br, s, 2H) 6.513 (m, 2H) , 6.970 (d, 1H, J = 7.8 Hz). (20): 1.215 (t, 6H, J = 7 Hz), 2.617 (q, 4H, J = 7 Hz), 6.570 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 6.650 (d, 1H, J = 7.5 Hz) , 6 . 973 (m, 1H) .

4.5- dietyl-2-nitrotrifluoracetylanilid (21) og 3,4-dietyl-2-nitrotrifluoracetylanilid (22) . Til en 15 ml, en-halset, rundbunnet kolbe utstyrt med en magnetisk rører, tilbakeløps-

kondensator og tørkerør ble det tilsatt 3,4-dietylanilin (19)

(0,822 g, 5,52 mmol), ammoniumnitrat (0,456 g, 5,70 mmol, Baker), og trifluoreddiksyreanhydrid (5 ml, 35,0 mmol, Sigma). Til denne blanding ble det tilsatt kloroform (10 ml) ved 0°C under N2med omrøring. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2,5 timer. Blandingen ble helt inn i is (20 g), ekstrahert med kloroform (3 x 20 ml) og tørket over natriumsulfat. Løsningsmiddelet ble fjernet ved aspirasjon til å gi en rest som ble separert ved preparativ TLC (heksaner: EtOAc = 8:2), til å gi 4,5-dietyl-2-nitrofluoracetylanilid (21)

(0,898 g, 56%) som et gult faststoff, smp 58 - 60°C, og 3,4-dietyl-2-nitrofluoracetylanilid (22) (0,30 g, 18%) som et brunt faststoff, smp 70 - 72°C.<X>H NMR (CDC13, 300 MHz): 6 (21): 1.275 (m, 6H) , 2.742 (m, 4H) , 8.099 (s, 1H) , 8.539 (s, 1H) , 11.375 (s, 1H) , (22): 1.262 (m, 6H) , 2.661 (m, 4H) , 7.420 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.915 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.742 (s, 1H).

4,5-dietyl-2-nitroanilin (23). Til en oppløsning av 4,5-dietyl-2-nitrotrifluoracetylanilid (21) (0,898 g, 3,1 mmol) i absolutt alkohol (30 ml) ble det tilsatt 10% av en vandig natriumhydroksydløsning (10 ml). Oppløsningen ble omrørt ved 80°C (oljebad) i 4 timer. Etanol ble avdampet i vakuum til å gi et orange faststoff som ble samlet ved sugfiltrering, vasket med vann (3 x 15 ml) og tørket i vakuum til å gi 567 mg (95%) av tittelforbindelsen 23 som et orange faststoff, smp 63 - 65°C (lit. smp. 64 - 65°C, Lambooy, J. P., J. Am. Chem. Soc. 71:3756 (1949)). 1H NMR (CDC13, 300 MHz) 6 1.242 (m, 6H) , 2.568 (m, 4H) , 5.846 (br, s, 2H) , 6.593 (s, 1H) , 7.899 (s, 1H).

4,5-dietyl-l,2-diaminobenzen (24). 4,5-dietyl-2-nitroanilin (23) (567 mg, 2,92 mmol) ble oppløst i etylacetat (20 ml). Til denne oppløsning ble det tilsatt 10% Pd-C (142 mg, 20%, Aldrich). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur og under et trykk på 35 psi (H2) i 5 timer. Katalysatoren ble fjernet gjennom en Celite kolonne (5 g) og vasket med etylacetat (3 x 2 0 ml). Filtratene ble kombinert og avdampet i vakuum til å gi 4,5-dietyl-l,2-diaminobenzen (24) (459 mg, 96%) som et

fargeløst faststoff, smp 114 - 116°C (lit. smp. 114 - 115°C, Lambooy, J. P., J. Am. Chem. Soc. 71:3756 (1949)).<1>H NMR (CDC13, 300 MHz) 6 1.158 (t, 6H, J = 7.5 Hz), 2.498 (q,4H, J = 7.5 Hz), 2.908 (br, s, 4H), 6.555 (s, 2H).

6 , 7-dietyl-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (25). 4,5-dietyl-1,2-diaminobenzen (24) (459 mg, 2,80 mmol) ble oppløst i 4 N saltsyre (12 ml) ved 90°C. Oksalsyredihydrat (983 mg, 6,47mmol) ble tilsatt til oppløsningen i én porsjon med omrøring under N2. Blandingen ble behandlet med tilbakeløp ved130- 135°C (oljebad) i 3 timer. Et gult faststoff presipiterte som ble samlet ved sugfiltrering og tørket i vakuum over natten til å gi 538 mg (88%) av tittelforbindelsen 25 som et brunt faststoff, smp > 360°C.<X>H NMR (DMSO-d6, 3 00 MHz) 6 1.092 (t, 6H, J = 7.5 Hz), 2.510 (q, 4H, J = 7.5 Hz), 6.867 (s, 2H) , 11.742 (s, 2H) . EIMS m/e 218 (95, M+) , 203 (100, M<+>-CH3). (HPLC renhet 100%).

5-nitro-6,7-dietyl-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (26). 6,7-dietyl-1,4-dihydro-kinoksalin-2,3-dion (25) (218 mg, 1,0mmol) ble tilsatt til trifluoreddiksyre (8 ml, Sigma). Til denne suspensjon ble det tilsatt kaliumnitrat (121,2 mg,1,2 mmol, Baker) i én porsjon med omrøring under N2. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 48 timer. Trifluoreddiksyre ble avdampet i vakuum til å gi en rest. Vann (10 ml) ble tilsatt til denne rest med kraftig omrøring. Et gult faststoff presipiterte som ble samlet ved sugfiltrering og tørket i vakuum til å gi 182 mg (69%) av tittelforbindelsen (26) som et gult faststoff, smp 270 - 272°C (spalting).<1>H NMR (DMS0-d6, 300 MHz) 6 1.137 (m, 6H), 2.622 (m, 4H), 7.088 (s, 1H), 11.762 (s, 1H), 12.028 (s, 1H). EIMS m/e 263 (100, M<+>). (HPLC renhet 100%).

Eksempel 19 Fremstilling av 7-fluor-6-(n-butoksy)-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (28).

Til en blanding av 25 mg (1,0 mmol) NaH og 50 mg (0,67 mmol) n-butanol ble det tilsatt 1,5 ml DMSO og blandingen ble omrørt i 1 time. Til den oppnådde oppløsning ble det tilsatt

27 mg (0,11 mmol) 6,7-difluor-5-nitrokinoksalin-2,3-dion (27) og oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 5 dager. Oppløsningen ble fortynnet med 3 ml vann og surgjort med 2 N HCl til pH = 1. Presipitatet ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 11 mg (33%) av et gult faststoff, smp 290

- 292°C.<X>H NMR (DMSO-d6) , 0.882 (t, 3, J = 7.4), 1.360 (m, 2), 1.595 (m, 2), 4.084 (t, 2, J = 6.3), 7.151 (1, d, J = 11.54), 11.98 (m, 1), 12.12 (m, 1), MS, 297 (M<+>, 20), 241

(100), 195 (20). HRMS, beregnet for C12<H>12FN305297,0755, funnet: 297,0757.

Eksempel 20 Fremstilling av 7-fluor-6-(3-fenylpropoksy)-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (29)

Forbindelse (29) ble fremstilt på en måte tilsvarende den for forbindelse (28). Fra 25 mg (1,0 mmol) NaH, 61 mg (0,44 mmol) 3-fenylpropanol og 28 mg (0,11 mmol) 6,7-difluor-5-nitrokinoksalin-2,3-dion (27) i 2 ml DMSO ble det oppnådd 25 mg (63%) av et gult faststoff, smp 280 - 282°C.<l>R NMR (DMSO-d6), 1.923 (m, 2), 2.653 (t, 2, J = 7.8), 4.103 (t, 2, J = 6.1), 7.135-7.306 (m, 6), 11.98 (m, 1), 12.131 (s,1). 1<9>F NMR, -133.87 (mb). MS, 359 (M<+>, 20), 243 (15), 119 (40), 91

(100). NRMS, beregnet for<C>17<H>14FN305359,0911, funnet: 359,0927.

Eksempel 21 Fremstilling av 6-klor-7-etyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (37)

3-etyl-5-nitroanilin (30). Til 160 ml konsentrert H2S04omrørt ved romtemperatur ble det tilsatt 24,5 g (0,20 mol) 2-etylanilin. Den oppnådde oppløsning ble holdt i et aceton-isbad (-10 til -5°C) og 10,5 ml (15,75 g, 0,225 mol) rykende HN03(d = 150, > 90% HN03) i 20 ml konsentrert H2S04ble tilsatt dråpevis. Oppløsningen ble omrørt i et aceton-isbad i 3 0 min. etter tilsetning av HN03og deretter oppvarmet til romtemperatur. Den ble helt inn i 1000 ml is hvoretter blandingen ble nøytralisert med ammoniumhydroksyd (30%) til pH = 8. Blandingen ble omrørt i 1 time, filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 32,2 g (97%) av et rødt faststoff.

Rekrystallisering med 100 ml absolutt alkohol gav 25,8 g av et gult faststoff, smp 60 - 61°C (Lambooy & Lambooy, J. Med. Chem. 16:765-770 (1973): 63 - 64°C). 1H NMR (CDC13), 1.128 (t, 3, J = 7.5), 2.565 (q, 2, J = 7.6), 3.915 (sb, 2), 7.177 (d, 1, J = 8.2), 7.502 (d, 1, J = 2.2), 7.582 (dd, 1, J = 2.2, 8.3).

3-klor-4-etylnitrobenzen (31). En blanding av 8,3 g (50 mmol) (30) i 4 0 ml konsentrert HCl og 4 0 ml H20 ble oppvarmet ved 80°C i 1 time. Blandingen ble avkjølt i et isbad og en oppløsning av 3,6 g (52 mmol) NaN02i 6 ml H20 ble tilsatt dråpevis. Oppløsningen ble omrørt i et isbad i 1 time etter tilsetning av NaN02. Oppløsningen ble dråpevis tilsatt til en omrørt oppløsning av 10 g (102 mmol) CuCl i 40 ml konsentrert HCl holdt i et isbad. Blandingen ble omrørt i isbadet i1time etter tilsetning av diazoniumløsningen og ekstrahert med CHC13(3 x 4 0 ml) Ekstrakten ble tørket (MgS04) og avdampet til å gi 9,2 g (99%) av en blekrød olje.<1>H NMR (CDCI3), 1.276 (t, 3, J = 7.5), 2.851 (q, 2, J = 7.5), 7.408 (d, 1, J = 8.5), 8.064 (dd, 1, J = 2.0, 8.4), 8.227 (d, 1, J = 2,0).

3- klor-4-etylanilin (32). En oppløsning av 8,9 g (48 mmol) av forbindelse (31) og 54,6 g (241 mmol) SnCl2• 2H20 i 100 ml absolutt alkohol ble behandlet med tilbakeløp i ltime. Den ble avdampet for å fjerne det meste av løsningsmiddelet og resten ble behandlet med 2 N NaOH til pH = 9. Blandingen ble filtrert og faststoffet ble vasket med metanol (10 ml) og etylacetat (200 ml). Filtratet ble separert og den vandige fase ble ekstrahert med etylacetat (2 x 50 ml) . Den kombinerte organiske oppløsning ble tørket (MgS04) og avdampet til å gi 7,31 g (98%) væske.<1>H NMR (CDC13), 1.178 (t, 3, J = 7.5), 2.639 (q, 2, J = 7.4), 6.532 (dd, 1, J = 2.2, 8.1), 6.700 (d, 1, J = 2.2), 6.996 (d, 1, J = 8.2).

4- klor-5-etyl-2-trifluoracetamidonitrobenzen (33) . Til 2 5 ml (CF3CO)20 holdt på et isbad ble det dråpevis tilsatt2,56g (16,4 ml) av forbindelse (32) og den oppnådde blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Til blandingen som ble

holdt i isbadet ble det tilsatt, i porsjoner, 1,72 g (17,0 mmol) KN03og den oppnådde oppløsning ble omrørt i isbadet i 1 time og ved romtemperatur over natten. Oppløsningen ble tilsatt til 100 ml is-vann noe som gav et presipitat som ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et blekgult faststoff. Dette ble krystallisert med absolutt alkohol (30 ml) til å gi 2,55 g (52%) av et fargeløst faststoff, smp 82 - 83°C.<X>H NMR (CDC13), 1.293 (t, 3, J = 7.5), 2.825 (q, 2, J = 7.7), 8.197 (s, 1), 8.805 (s, 1), 11.35 (mb, 1).

3-klor-4-etyl-6-nitroanilin (34). En blanding av 1,4 g (4,7 mmol) av forbindelse (33) og 10 ml 7% K2C03i metanol/H20 (3:2) ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Den ble fortynnet med 15 ml vann, filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 691 mg (73%) av et gult faststoff, smp 100 - 101°C, (litterært smeltepunkt 104 - 106°C Lambooy & Lambooy, supra).<X>H NMR (CDCI3) , 1.228 (t, 3, J = 7.5), 2.665 (q, 2, J = 7.5), 5.957 (sb, 2), 6.859 (s, 1), 7.995 (s, 1).

Etyl-N- (3-klor-4-etyl-6-nitrofenyl) glycinat (35). En blanding av 200 mg (1,0 mmol) av forbindelse (34), 140 mg K2C03og 2 ml etylbromacetat ble oppvarmet ved 130°C i 3 døgn. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur, fortynnet med 10 ml 1 N NaOH og omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Blandingen ble surgjort med 2 N HCl til pH = 1, filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 280 mg (97%) av et gult faststoff.<X>H NMR (DMSO-d6), 1.144 (t, 3, J = 7.4), 1.213 (t, 3, J = 7.1), 2.620 (q, 2, J = 7.4), 4.165 (q, 2, J = 7.1), 4.271 (d, 2,

J = 5.8), 7.042 (s, 1), 8.034 (s, 1), 8.281 (s, 1).

6-klor-7-etyl-3,4-dihydrokinoksalin-2-on (36) . En oppløsning av 280 mg (0,977 mmol) av forbindelse (35), 950 mg (4,21 mmol) SnCl2• 2H20 og 8 ml absolutt alkohol ble oppvarmes med tilbakeløp i 4 timer og avkjølt til romtemperatur. Den ble avdampet og resten ble behandlet med 1 N NaOH til pH = 10. Blandingen ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi

et faststoff. Faststoffet ble omrørt med 15 ml etylacetat og filtrert. Filtratet ble avdampet til å gi 137 mg (66%) faststoff.<X>H NMR (DMSO-d6) , 1.080 (t, 3, J = 7.4), 2.503 (q, 2,

J = 7.2), 3.700 (s, 2), 6.036 (s, 1), 6.632 (s, 1), 6.662 (s, 1) , 10.281 (s, 1) .

6-klor-7-etyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (37). Til en oppløsning av 13 7 mg (0,65 mmol) av forbindelse (36) i 4 ml CF3C02H holdt i et isbad ble det dråpevis tilsatt 0,4 ml rykende HN03. Oppløsningen ble omrørt i et isbad i 1 time og ved romtemperatur over natten. Den ble avdampet og resten ble behandlet med 6 ml vann og omrørt i 10 min. Blandingen ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi et gult faststoff, 140 mg (80%), smp > 330°C.<1>H NMR (DMSO-d5), 1.161 (t, 3, J = 7.4), 2.712 (q, 2, J = 7.6), 7.192 (s, 1), 12.209 (mb, 2). MS, 269 (M<+>, 100), 254 (12), 226 (15), 160 (20). HRMS, beregnet for C10<H>8ClN3O4: 269.0198, funnet: 269.0196.

Referanseeksempel 2 Fremstilling av 6-klor-7-etyl-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (39)

l,2-diamino-4-klor-5-etylbenzen (38). En oppløsning av 271 mg (1,35 mmol) av forbindelse (34) og 1,24 g (5,49 mmol) SnCl2• 2H20 i 5 ml absolutt alkohol ble oppvarmet med til-bakeløp i 2 timer. Den ble avdampet og resten ble behandlet med 1 N NaOH til pH = 10. Blandingen ble ekstrahert med CH2C12(3 x 10 ml). Ekstrakten ble tørket (MgS04) og avdampet til å gi 229 mg (99%) av et gult faststoff.<X>H NMR (CDCl3) , I. 165 (t, 3, J = 7.5), 2.594 (q, 2, J = 7.2), 6.560 (s, 1), 6.696 (s, 1) .

6-klor-7-etyl-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (39). En blanding av 228 mg (1,33 mmol) av.forbindelse (38) og 124mg (1,38 mmol) oksalsyre i 4 ml vandig 2 N HCl ble behandlet med tilbakeløp i 4 timer. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur, filtrert og tørket til å gi 275 mg (92%) av et brunt faststoff, smp >400°C.<1>H NMR (DMSO-d6) , 1.134 (t, 3, J = 7.4), 2.635 (q, 2, J = 7.4), 7.026 (s, 1), 7.107 (s, 1), II. 890 (s, 1), 11.927 (s, 1). MS, 224 (M<+>, 100), 209 (45), 181 (80). HRMS, beregnet for C10, H9C1N202224,0348, funnet: 224,0359.

Eksempel 22 Fremstilling av 6-klor-7-etyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (37) og 7-klor-6-etyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion

(40)

Til en blanding av 232 mg (103 mmol) av forbindelse (39) i 6 ml CF3C02H som ble holdt i et isbad, ble det porsjonsvis tilsatt 113 mg KN03. Blandingen ble omrørt i isbadet i 1 time og ved romtemperatur over natten. Til oppløsningen ble det tilsatt 2 8 mg KN03og den ble omrørt over natten. Den ble avdampet og resten ble behandlet med 10 ml vann, filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 227 mg (81%) av et gult faststoff.<1>H NMR (DMSO-d6) , (37): 1.14 (m, 3), 2.712 (q, 2, J = 7.4), 7.193 (s, 1), 12.209 (mb, 2) og (40): 1.14 (m, 3), 2.582 (q, 2, J = 7.4), 7.303 (s, 1), 12.0 (mb, 1), 12.17 (mb, 1) . 37:40 = 1:1.

Eksempel 23 Fremstilling av 6-klor-7-fluor-5-trifluormetyl-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion (41)

En blanding av 25 mg (0,095 mmol) 6-amino-7-fluor-5-tri-fluormetylkinoksalin-2,3-dion (29) i 1,0 ml konsentrert HCl ble omrørt i et isbad i 1 time. Til den oppnådde oppløsning ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av 40 mg (0,58 mmol) NaN02i 0,1 ml H20 og oppløsningen ble omrørt i et isbad i 4 timer. Til oppløsningen ble det dråpevis tilsatt en oppløs-ning av 60 mg CuCl i 0,3 ml 6 N HCl. Den oppnådde blanding ble omrørt i et isbad i 4 timer og ved romtemperatur over

natten. Blandingen ble fortynnet med 1 ml H20 og omrørt i 10

min. etterfulgt av ytterligere 1 ml H20 med omrøring i ytter-1ligere 10 min. Den ble filtrert, vasket med vann og tørket til å gi 21 mg (78%) av et blekgult faststoff. Smp 323 -

325°C.<X>H NMR (DMSO-d6) , 7.337 (d, 1, J = 9.34), 10.95 (mb,' 1), 12.309 (s, 1). MS, 282 (M<+>, 100), 254 (20), 234 (80),

207 (40). HRMS, beregnet for C9H3C1F4N202281,9816, funnet: i 281,9833.

Eksempel 24 Fremstilling av 6-klor-l,4-dihydro-7-fluor-5-nitrokinoksalin-2,3-dion l-klor-2,5-difluor-4-nitrobenzen. Til en omrørt oppløsning av 1-klor-2,5-difluorbenzen (0,770 g, 5,18 mmol) i konsentrert H2S04(8,0 ml) ved 0°C ble KN03(0,525 g, 5,19 mmol) tilsatt i en porsjon. Den oppnådde gule oppløsning ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt over natten ved romtemperatur. Den ble deretter helt inn i is (80 g) og. ekstrahert med etylacetat (75 ml). Etylacetatet ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og resten ble tørket videre under vakuum til å gi 0,845 g (85 %) av tittelforbindelsen som en gul væske,<X>H NMR (CDC13) 6 7.43 (dd, 1H, J1= 9,6 Hz, J2=6,0 Hz), 7.93 (t, 1H, J = 7.2 Hz).

N-(5'-klor-4<1->fluor-2'-nitrofenyl)glycin-natriumsalt. Til en omrørt oppløsning av l-klor-2,5-difluor-4-nitrobenzen (0,825 g, 4,26 mmol) i etanol (8,0 ml) ble det tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (0,415 g, 4,27 mmol) i vann (1,5 ml). Den oppnådde suspensjon ble oppvarmet med tilbake-løp i 60 timer. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur og det presipiterte klare orange faststoff ble filtrert, vasket med kald etanol (5 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,673 g (64%) av tittelforbindelsen som et klart orange pulver.<X>H NMR (DMS0-d6) 6 3.50 (d, 2H, J = 3.6 Hz), 7.04 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 8.01 (d, 1H J = 9.9 Hz), 8.74 (s, 1H). Det ureagerte l-klor-2,5-difluor-4-nitrobenzen ble nesten kvantitativt gjenvunnet fra filtratet.

6-klor-3,4-dihydro-7-fluor-kinoksalin-2(1H)-on. En suspensjon av N-(5<1->klor-4'-fluor- 2<1->nitrofenyl)glycin-natriumsalt (0,650 g, 2,61 mmol) og tinn (II) kloriddihydrat (1,770 g, 7,845 mmol) i etanol (10,5 ml) ble oppvarmet med tilbakeløp i en time. Den ble deretter avkjølt ved romtemperatur og - 5 ml etanol ble fjernet under vakuum. Det presipiterte faststoff ble samlet ved filtrering under vakuum, vasket med etanol (3 ml) og tørket til å gi 0,311 g (59%) av tittelforbindelsen som et gråhvitt pulver.<1>H NMR (DMSO-d6) 63.69 (s, 2H), 6.08 (s, 1H), 6.65 (d, 1H, J = 9.9 Hz), 6.71

(d, 1H, J = 7.2 Hz), 10.39 (s, 1H). Løsningsmiddelet fra filtratet ble fjernet under vakuum. Resten ble fortynnet med vann (15,0 ml) og pH ble justert med 10% Na2C03til~9. Den oppnådde suspensjon ble ekstrahert med etylacetat (50 ml). Etylacetatet ble tørket over vannfri Na2S04og fjernet under vakuum til å gi ytterligere 0,118 g (22%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelsen for et kombinert utbytte på 81%.

6-klor-l, -dihyd.ro-7-f luor-5-nitrokinoksalin-2 ,3-dion. Til en omrørt suspensjon av 6-klor-3,4-dihydro-7 - fluor-kinoksalin-2(lH)-on (0,14 0 g, 0,698 mmol) i TFA (3,0 ml) ble overskudd av rykende HN03(0,20 ml) tilsatt og den oppnådde røde opp-løsning ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den oppnådde gule suspensjon ble helt inn i is-vann (15,0 ml). Det presipiterte faststoff ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann (5,0 ml) og tørket i en tørkepistol (toluen-tilbakeløp) til å gi 0,124 g (69%) av den rene (HPLC) tittelforbindelsen som et gult pulver.<1>H NMR (DMSO-d6) 7.21 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 12.20 (s, 1H), 12.30 (s, 1H).

Eksempel 25 Fremstilling av 7-klor-l,4-dihydro-6-etyl-5-nitrokinoksalin-2,3-dion

2,5-diklor-l-etylbenzen. En suspensjon av granulert sink (10

g) og kvikksølvklorid (0,5 g) i konsentrert HCl (0,5 ml) og vann (5 ml) ble rystet i -5 min. Det vandige lag ble deretter dekantert. Til resten ble det tilsatt konsentrert HCl (7,5 ml) og vann (7,5 ml) etterfulgt av 2',5'-dikloraceto-fenon (3,106 g, 16,43 mmol) og suspensjonen ble oppvarmet med tilbakeløp i 4 timer, og under denne tidsperiode ble det hver time tilsatt konsentrert HCl (90,5 ml). Den oppnådde suspensjon ble avkjølt til romtemperatur og det vandige lag ble

dekantert. Den faste rest ble vasket med eter (3 x 3 0 ml). Det vandige lag ble ekstrahert med eter (3 x 50 ml). De kombinerte eterlag ble vasket med saltvann, tørket over vannfri Na2S04og fjernet under vakuum. Resten ble tørket videre under vakuum til å gi 2,664 g urent produkt som ble renset på silikagel (heksan) til å gi 0,813 g (28%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelsen som en fargeløs væske. -"-H NMR

(DMSO-d6) 6 1.23 (t, 3H, J = 7.5 Hz), 2.73 (q, 2H, J = 7.5 Hz), 7.09 - 7.27 (m, 3H).

2,5-diklor-4-etyl-l-nitrobenzen. Til en kraftig oppløsning av 2,5-diklor-l-etylbenzen (0,795 g, 4,68 mmol) i konsentrert H2S04(4,5 ml) og ved 0°C ble KN03(0,473 g, 4,68 mmol) tilsatt i én porsjon. Den oppnådde blekgule oppløsning ble oppvarmet til romtemperatur og ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den ble deretter helt inn i is (80 g), og ekstrahert med eter (3 x 3 0 ml). Eteren ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og den oppnådde olje ble ytterligere tørket under vakuum til å gi 0,943 g (92%) av tittelforbindelsen som en olje.<1>H NMR (CDC13) 6 1.27 (t, 3H, J = 7.5 Hz), 2.80 (q, 2H, J = 7.5 Hz), 7.42 (s, 1H), 7.94 (s, 1H) .

N-(4<1->klor-5<1->etyl-2'-nitrofenyl)glycin-natriumsalt. Til en oppløsning av 2,5-diklor-l-etylbenzen (0,585 g, 2,66 mmol) i etanol (10,0 ml) og ved romtemperatur ble det tilsatt en oppløsning av natriumglycinat (0,260 g, 2,68 mmol) i vann (2,5 ml) og den oppnådde suspensjon ble oppvarmet med til-bakeløp i 2 dager. Oppløsningen ble deretter avkjølt til romtemperatur og det presipiterte røde faststoff ble filtrert, vasket med etanol (4 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,086 g (13%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelsen som et rødt pulver.<X>H NMR (DMSO-d6) 6 1.15 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.63 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 3.47 (d, 2H, J = 3.0 Hz), 6.77 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 8.77 (s, 1H). Det ureagerte 2,5-diklor-4-etyl-1-nitrobenzen ble nesten kvantitativt gjenvunnet fra filtratet.

7-klor-3,4-dihydro-6-etylkinoksalin-2(1H)-on. En suspensjon av N-(4<1->klor-5<1->etyl-2'-nitrofenyl)glycin-natriumsalt (0,082 g, 0,31 mmol) i tinn (II) kloriddihydrat (0,215 g,

0,953 mmol) i etanol (1,0 ml) ble oppvarmet med tilbakeløp i 45 min. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur og det

presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med etanol (1,0 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,04 8 g (72%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelsen som et lysegult pulver.<1>H

NMR (DMSO-d6) 6 1.05 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.52 (d, 2, J = 7.2), 3.67 (s, 2H) , 6.04 (s, 1H) , 6.54 (s, 1H) , 6.67 (s, 1H) , 10.25 (s, 1H).

7-klor-l, 4-dihydro-6-etyl-5-nitrokinoksalin-2 , 3-dion. Til en omrørt suspensjon av 7-klor-3,4-dihydro-6-etylkinoksalin-2(lH)-on (0,020 g, 0,095 mmol) i TFA (0,4 ml) ble overskudd av rykende HN03(0,04 ml) tilsatt og den oppnådde røde opp-løsning ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den oppnådde suspensjon ble fortynnet med vann (4 ml) og det presipiterte faststoff ble filtrert, vasket med vann (2 ml) og tørket under vakuum til å gi 0,024 g (94%) av den rene (HPLC) tittelforbindelsen som et lysegult pulver. -"-H NMR (DMSO-d6) 5 1.09 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.52 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 7.27 (s, 1H) , 11.99 (s, 1H) , 12.15 (s, 1H) .

Eksempel 26 Fremstilling av 7-klor-6-metyl-5-nitrokinok-salin-2(1H),3(4H)-dion

2-klor-5-fluor-4-nitrotoluen. Til en omrørt oppløsning av2-klor-5 - fluortoluen (10,356 g, 71,628 mmol Lancaster, anvendt som mottatt) i konsentrert H2S04(70 ml) og ved 0°C ble KN03(7,252 g, 71,72 mmol) tilsatt i fire like porsjoner. Den oppnådde blekgule oppløsning ble oppvarmet til romtemperatur og ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den ble. deretter helt inn i is-vann (350 g) og ekstrahert med eter (3 x 100 ml) . Eter ble tørket over vannfri Na2S04, fjernet under vakuum og den oppnådde olje ble ytterligere tørket under vakuum til å gi 12,277 g (90%) av tittelforbindelsen som en olje som ble anvendt som sådan i den neste reaksjon.<1>H NMR (CDC13) 6 2.459 (s, 2H), 7.193 (d, 1H, J1=11.1 Hz), 8.083 (d, 1H,<J>j_<=>6.6 Hz) .

N-4(4'-klor-5<1->metyl-2'-nitrofenyl)glycin-kaliumsalt. En suspensjon av 2-klor-5-fluor-4-nitrotoluen (11,200 g, 59,078 mmol), glycin (4,500 g, 59,94 mmol) og K2C03(8,300 g, 60,05 mmol) i etanol (55 ml) og vann (30 ml) ble oppvarmet med tilbakeløp i 7 timer. Det oppnådde klare orange faststoff ble avkjølt til romtemperatur. Faststoffet ble samlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann (50 ml) og tørket i vakuum. Det ble deretter tatt opp i acetat (150 ml), oppvarmet med tilbakeløp i 1 time og avkjølt til romtemperatur. Det orange faststoff ble vakuumfiltrert og tørket i vakuum til å gi 11,37 g (72%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelsen som et rødt pulver.<X>H NMR (DMS0-d6) : 6 2.276 (s, 3H) , 3.431 (d, 2H, J = 4.2 Hz), 6.848 (s, 1H), 7.963 (s, 1H), 8.773 (s, 1H).

7-klor-3,4-dihydro-6-metylkinoksalin-2(1H)-on. Til en omrørt klar orange oppløsning av N-(4'-klor-5<1->metyl-2'-nitrofenyl)glycin-kaliumsalt (0,097 g, 0,36 mmol) i vann (5,0 ml) og ved 8 0°C ble natriumditionat (0,500 g, 2,87 mmol) tilsatt i to like porsjoner. Det ble straks dannet en hvit suspensjon som ble omrørt ved 80°C i 1 time. Den ble deretter avkjølt ved romtemperatur og faststoffet ble vakuumfiltrert, vasket med vann (5,0 ml) og tørket i vakuum til å

gi 0,062 g (86%) av tittelforbindelsen som et hvitt pulver.<X>H NMR (DMSO-d6): 6 2.10 (s, 3H), 3.66 (s, 2H, J = 1.2 Hz), 5.98 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 10.20 (s, 1H).

7-klor-6-metyl-5-nitrokinoksalin-2(1H),3(4H)-dion. Til en omrørt suspensjon av 7-klor-3,4-dihydro-6-metyl-kinoksalin-2(lH)-on (0,040 g, 0,20 mmol) i TFA (0,50 ml) ble overskudd av rykende H2S03(0,040 ml) tilsatt og den oppnådde gule suspensjon ble omrørt over natten ved romtemperatur..Den ble deretter helt inn i isvann (3 ml) og det presipiterte faststoff ble vakuumfiltrert, vasket med vann (5 ml) og tørket i vakuum til å gi 0,048 g (92%) av den rene (<1>H NMR) tittelforbindelsen som et lysegult pulver. -"-H NMR (DMSO-d6) : 6 2.184 (s, 3H), 7.263 (s, 1H), 11.948 (s, 1H), 12.144 (s, 1H).

Eksempel 27 Evaluering av den anti-nociseptive effekt av 5-nitro-6,7-dimetylkinoksalindion (NDMQX) i formalintesten i Swiss-Webster mus

Introduksjon

Sameksistensen av glutamat med substans P i dorsal rot ganglion nevroner (Battaglia & Rustioni, J. Comp. Neurol. 277:302 - 312 (1988)) og involveringen av N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren i wind up-fenomenet i dorsal-horn nociseptive nevroner (Davies & Lodge, Brain Res. 424:402 - 406 (1987), Dickenson & Sullivan, Brain Res. 506:31 - 39

(1990), Haley, J. E. et al., Brain Res. 518:218 - 226

(1990)), foreslår at eksiterende aminosyrer er involvert i nociseptiv transmisjon. Der er ganske mye material som viser den analgesiske effekt av NMDA reseptorantagonistene i forskjellige dyre-smertemodeller -(Cahusac, P. M. et al., Neuropharmacol. 23:719 - 724 (1984), Murray, C. W. et al., Pain 44:179 - 185 (1991), Elliott, K. J. et al., Neurosci. Abs. 17588 (1991), Nasstrom, J. et al., Eur. J. Pharmacol. 212:21 - 29 (1992), Coderre & Melzack, J. Neurosci. 12:3665 - 3670 (1992), Yamamoto & Yaksh, Anesthesiol. 77:757 - 763

(1992) , Vaccarino, A. L. et al., Brain Res. 615:331 - 334

(1993) , Milan & Seguin, Eur. J. Pharmacol. 238:445 - 447

(1993)). Den manglende tilgang til hjernen og/eller de PCP- lignende bivirkninger er imidlertid ufordelaktige for anvendelse av noen av disse forbindelser.

Det er vel kjent at aktivering av det glycinmodulerende setet assosiert med NMDA reseptoren kreves for aktivering av NMDA reseptoren (Johnson & Ascher, Nature 325:529-531 (1987), Kleckner & Dingledine, Science 241:835-837 (1988), Thomson, A. M. et al., Nature 338:422-424 (1989), Mayer, M. L. et al., Nature 338:425-427 (1989)). Det er blitt vist at 7-k_lor-kynurenat (7CK), antagonisten for det glycinmodulerende setet koblet til NMDA reseptoren blokkerte wind up-fenomenet (Dickenson & Ayder, Neurosci, Let. 121:263-266 (1991)). En annen måte å oppnå analgesi på vil således kunne være å antagonisere det glycinmodulerende setet på NMDA reseptoren.

Smerte, i kliniske situasjoner, er vanligvis langvarig og av inflammatorisk natur. Bruk av dyremodeller med vedvarende smerte synes således å være mere passende for å evaluere den potensielle kliniske bruk av nye analgetiske medikamenter. Det foreliggende studium ble utformet for å evaluere den analgetiske effekt av NDMQX, en ny og systemisk aktiv glycin/NMDA reseptorantagonist i Swiss-Webster mus med formalin-indusert smerte.

Metoder

Individer

Swiss-Webster hannmus (25 - 35 g) oppnådd fra Simonsen Laboratories, Inc. (Gilroy, CA) ble anvendt i alle forsøkene. 4-6 mus ble holdt i hvert bur med fri adgang til for og vann under en 12/12 timers lys/mørke syklus. Musene ble beskyttet i minst 5 døgn før forsøketbg anvendt kun én gang. Alle forsøk ble gjennomført under lyssyklusen på en "blind" måte hvor observatørene ikke ble informert om de forskjellige behandlinger.

1. Effekt av NDMQX i formalintesten

Den formalintesten som ble utført var en modifikasjon av metoden i henhold til Hunskaar et al. (Hunskaar, S. et al., J. Neurosci. Meth. 14:69-76 (1985)). Etter en 60 minutters tilpasningsperiode i pleksiglassbeholdere ble musene veid og injisert intraperitonealt (i.p.) med NDMQX (1-20 mg/kg, N = 6-10 mus/dose). Kontroller fikk injisert DMSO (1 ml/kg, i.p.). Tretti minutter senere ble musene injisert med formalin (20/il av en 5% oppløsning) like under huden i den høyre bakfot, overført til pleksiglassbeholderne og umiddelbart observert for slikking eller biting i den injiserte foten i løpet av 1 time. Den tiden som hver mus brukte på å slikke den injiserte foten ble målt ved 0-5 minutter (tidlig fase) og 15 - 50 minutter (sen fase).

Resultater

1. Effekt av NDMQX i formalintesten

Systemisk administrering (i.p.) av NDMQX minsket den gjennom-snittlige tid som ble brukt til å slikke, på en doseavhengig måte i begge faser av formalintesten i Swiss-Webster mus (fig. 1 og 2, og tabell V).

Konklusjon

NDMQX gav en signifikant analgesisk effekt i begge faser av den formalininduserte toniske smerte i Swiss-Webster mus noe som viser at forbindelsen har potensiale som et analgesika for tilstander med tonisk smerte.

Eksempel 28 Den anti-konvulsive effekt og den anti-nociseptive effekt av 5-nitro-6-metyl-7-klor-2,3-kinoksalindion (NMCQX) og 5-nitro-6,7-dimetyl-2,3-kinoksalindion (NDMQX) i MES og formalintesten.

Den anti-konvulsive og den anti-nociseptive effekt av NMCQX og NDMQX i MES og i formalintesten i Swiss-Webster mus ble evaluert.

I MES testen ble mus injisert i.p. med NMCQX (1,25 - 7,50 mg/kg) eller NDMQX (5,00 - 15,00 mg/kg). Kontrollmus ble injisert med henholdsvis Tris (0,05 M) eller Arginin (0,1 M). Slaganfall ble deretter indusert ved å påføre en rektangulær puls, 50 mA, 60 pulser/sek, 0,8 msek pulsbredde, og 0,2 sek "train" lengde, på tidspunktet med medikamentenes toppeffekt. Begge forbindelser beskyttet, på doseavhengig måte, mus fra generaliserte kloniske-toniske slaganfall indusert ved elektrosjokk. Forsøksresultater er vist i fig. 3-6.

I formalintesten, etter en 1 times tilpasningsperiode, ble mus injisert i.p. med NMCQX (1,00 - 10,00 mg/kg, N = 7-13 mus/dose) eller NDMQX (0,5 - 20,00 mg/kg, N = 8 - 9 mus/- dose). Kontrollmus ble injisert med henholdsvis Tris (0,5M) eller Bis-Tris (0,2 M). Mus ble deretter injisert med formalin. En s.c. injeksjon av formalin gav en bi-fase nociseptiv respons, dvs. en tidlig fase (0-5 min.) etterfulgt av en tonisk sen fase (15 - 50 min.). Begge forbindelser gav en doseavhengig anti-nociseptiv effekt i begge faser av formalintesten. Den tid som hver mus forbrukte til å slikke og/eller bite i den injiserte foten ble målt i løpet av 1 time.

Dataene foreslår en modulerende rolle for NMDA reseptoren i MES-induserte slaganfall og i formalin-induserte nociseptive smerter.

Eksempel 29 Blokkering av morfintoleranse ved 5-nitro-6,7-dimetyl-2,3-kinoksalindion (NDMQX)

Introduksjon

Opioide analgetika anvendes for å klare smerte. Utvikling av toleranse overfor opioide analgetika svekker imidlertid den terapeutiske anvendelse av disse medikamenter. Søken etter alternative medikamenter til å gi analgesi uten utvikling av toleranse eller som en supplerende terapi for å blokkere toleranse uten å interferere med analgesi, er et aktivt forskningsområde. Toleranse utvikler seg etter både akutt og kronisk morfinadministrering (Kornetsky et al., Science 162:1011 - 1012 (1968), Way et al., J. Pharmacol. Exp Ther.167:1 - 8 (1969), Huidobro et al., J. Pharmacol. Exp Ther. 198:318 - 329 (1976), Lutfy et al., J. Pharmacol. Exp Ther. 256:575 - 580 (1991)). Resultater fra senere studier har foreslått en modulerende rolle for N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren ved morfintoleranse (Trujillo et al., Science 251:85 - 87 (1991), Marek et al., Brain Res. 547:77 - 81

(1991), Tiseo et al., J. Pharmacol. Exp Ther. 264: 1090 - 1096 (1993), Lutfy et al., Brain Res. 616:83 - 88 (1993).

Glycin kreves for aktivering av NMDA reseptoren (Johnson et al., Nature 325:529 - 533 (1987), Kleckner et al., Science 241:835 - 837 (1988), Mayer et al., Nature 338:425 - 427

(1989), Thomson et al., Nature 338:422 - 424 (1989)). En annen måte å blokkere NMDA reseptoren på og følgelig blokkere toleranse vil således være å antagonisere det glycinmodulerende setet av NMDA reseptoren. Dette eksempel viser bruk av 5-nitro-6,7-dimetyl-1,4-dihydro-2,3-kinoksalindion (NDMQX) for å teste den hypotese at inhibering av NMDA reseptor/- glycin-setet kan være et mulig middel for å blokkere morfintoleranse.

Materialer og metoder

Individer

Swiss-Webster hannmus som veide fra 2 5 - 3 5 g og oppnådd fra Simonsen Laboratories, Inc. (Gilroy, CA) ble anvendt i alle forsøk. 4-6 mus ble holdt i hvert bur med fri adgang til for og vann under en 12-timers lys/12-timers mørke syklus. Musene ble beskyttet i minst 5 dager før forsøket og anvendt kun én gang. Alle forsøk ble utført under lys-syklusen og på en "blind" måte hvor observatørene var uvitende om de forskjellige behandlinger.

Formalintest

En modifikasjon av en tidligere beskrevet metode ble anvendt (Hunskaar et al., J. Neurosci. Meth. 14:69 - 76 (1985)). Kort sagt ble mus plassert i pleksiglassbeholdere i minst 1 time for tilpasning til forsøksbetingelser. Formalin (20 fil av en 5% formaldehydoppløsning i saltvann) ble injisert inn i dorsal-overflaten til den høyre bakfot ved anvendelse av en mikrosprøyte (Hamilton Co., Reno, NV) med en nål med tykkelse 27. Musene ble deretter overført til pleksiglassbeholderne og umiddelbart observert for slikking eller biting av den injiserte foten i løpet av 1 time. Den tid som hver mus brukte til å slikke eller bite den injiserte foten ble målt hvert 5. minutt i en observasjonsperiode på 1 time. 1. Effekt av NDMQX på morf intoleranse i f ormalintesten Mus fikk daglig injisert i en periode på 8 dager, enten vehikkel (Bis-Tris, 0,2 M) eller NDMQX (1, 20 og 40 mg/kg, i.p., N = 9 - 12 mus/gruppe). Mus fikk umiddelbart, innen1min., injisert enten saltvann eller morfin (20 mg/kg, s.c). På dag 9 ble musene veid og etter en 1-times tilpasningsperiode fikk de injisert morfin (4 mg/kg, s.c.). 30 minutter senere ble alle musene testet i formalintesten (se det foregående). 2 . Effekt av NDMQX på morfin anti-nocisepsjon i

formalintesten

Mus fikk daglig injisert, over en periode på 8 dager, enten vehikkel (Bis-Tris, 0,2 M) eller NDMQX (40 mg/kg, i.p., N = 7 mus/gruppe). En gruppe med mus (N = 11) ble holdt ubehand-let .

På dag 9 ble musene veid og etter en 1-times tilpasningsperiode ble de injisert med morfin (4 mg/kg, s.c.). Den ubehandlede gruppe ble oppdelt i to undergrupper, hvorav halvparten mottok saltløsning mens den andre halvpart fikk injisert morfin (4 mg/kg). Tretti minutter senere ble alle musene testet i formalintesten (se det foregående).

Resultater

1. Effekt av NDMQX på morfintoleranse i formalintesten Morfinadministrering i 8 dager gav toleranse i tidlig og sen fase i formalintesten (fig. 7). En en-veis ANOVA etterfulgt av Newman-Keul testen viste en statistisk signifikant toleranse i mus behandlet kronisk med morfin (F447<=><4,>20 og F447= 3,93 for henholdsvis tidlig og sen fase, p < 0,05 eller bedre). Toleranse ble ikke utviklet i mus behandlet med NDMQX etterfulgt av morfin. Den inhiberende effekt av NDMQX på morfintoleranse var doseavhengig. NDMQX hadde ingen effekt på morfintoleranse ved 2 mg/kg, og høyere doser derav svekket (ved 2 0 mg/kg) eller opphevet fullstendig (ved 4 0 mg/kg) morfintoleransen (fig. 7). 2 . Effekt av NDMQX på morfin anti-nocisepsjon i

formalintesten

Det ble funnet at kronisk administrering av NDMQX i 8 dager ikke endrer den anti-noeiseptive effekt av morfin i formalintesten (fig. 8). Der var ingen signifikant forskjell i morfin-indusert anti-nocisepsjon mellom NDMQX-forbehandlede og kontroll (vehikkel-forbehandlede) grupper (p > 0,05). I tillegg var nivået av anti-nocisepsjon dannet ved morfin i disse to grupper ikke signifikant forskjellig fra det hos ubehandlede (naive) mus.

Konklusjon

NDMQX, en ny NMDA reseptor/glycin-sete antagonist blokkerte morfintoleranse i begge faser i formalintesten. Blokkeringen av toleransen ved NDMQX skyldes ikke potensiering av morfin-indusert anti-nocisepsjon i formalintesten. Disse data foreslår at NMDA reseptoren er involvert i moduleringen av morfintoleranse i en dyremodell med tonisk smerte. Blokaden av morfintoleransen ved hjelp av NDMQX i formalintesten foreslår at antagonisme i det glycinmodulerende setet assosiert med NMDA reseptoren er et mulig middel for å inhibere NMDA reseptor og blokkere morfintoleranse. Antagonismen i det glycinmodulerende setet assosiert med NMDA reseptoren frem- kommer derfor til å være et potensielt sete for utviklingen av nye medikamenter som vil kunne anvendes med morfin som supplerende terapi i smertebehandling og forebygging av toleranse.

Eksempel 30 Den nevrobeskyttende effekt av NDMQX i en rottemodell med permanent fokal cerebral ischemi ved anvendelse av kontinuerlig intravenøs infusjon av medikament

N-metyl-D-aspartat (NMDA) subtypen av eksiterende aminosyre-reseptorer viser seg å spille en viktig rolle i nevronal degenerering indusert ved fokal cerebral ischemi. En rekke konkurrerende og ikke-konkurrerende NMDA reseptorantagonister er blitt vist å gi signifikant beskyttelse mot nevronal degenerering i forskjellige dyremodeller med fokal ischemi (se Bullock et al., J. Neurotrauma 9 (Supp. 2):S443 - S462

(1992)) . I dette eksempel er den nevrobeskyttende effekt av NMDA reseptor-glycinseteantagonisten NDMQX i rottemodellen med fokal ischemi beskrevet.

Metoder

1. Induksjon av fokal ischemi

Hannrotter av typen Spraque-Dawley (290 - 320 g) ble inkubert og holdt under anestesi med ± 2% halotan. Kroppstemperaturen ble holdt ved 37,5°C under inngrepet ved hjelp av en varme-pute og en rektal probe forbundet til kontrollenheten. De felles karotidarterier (CCA) ble isolert, og en løs silke-ligatur ble plassert rundt hver CCA. Et vertikalt snitt ble gjort mellom venstre orbita og ørekanalen, den bakre del av zygoma ble fjernet og en liten åpning (2,0 / 2,5 mm) ble boret dorsorostralt til foramen ovale under konstant skylling med saltvann. Dura ble åpnet med en mikrokirurgisk hake og hjernen ble forsiktig trukket tilbake med en fin spatel for å eksponere bifurkasjonen av den interne karotidarterien og den midtre cerebralarterien. Den ipsilaterale CCA ble ligert og MCA koagulerte fra sitt utspring til den olfaktoriske kanal. To timer etter MCA okklusjon ble sårklemmen fra den kontra-laterale CCA fjernet.

2 . Medikamentadministrering

NDMQX ble oppløst i 0,1 M L-arginin og 5% glukose og infusert som en sakte 10 mg/kg i.v. bolus (umiddelbart etter MCA okklusjon) etterfulgt av en 7 mg/kg/time infusjon i 22 timer.

3. Histologi

Hjerner ble snittet i 2 mm blokker og farget med tatrazolium-rød (2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid) . Områdene med hjerne-skade ble bestemt ved anvendelse av en avbildingsanalysator (Image-1, Universal Imaging Corporation, PA) for å bestemme volumet av kortikalt og subkortikalt infarkt ved integrering av områder og avstanden mellom hvert nivå.

Resultater

NDMQX gav en signifikant reduksjon (71%, F119= 11,57, p < 0,05, ANOVA) i kortikalt infarktvolum. Se fig. 9.

Konklusjon

NDMQX gav en signifikant nevrobeskyttelse i en rottemodell med fokal ischemi.

Eksempel 31 Nevrobeskyttende effekt av NMCQX i en rottemodell med permanent fokal cerebral ischemi ved anvendelse av kontinuerlig intravenøs infusjon av medikament

Eksempel 2 9 ble gjentatt med unntak av at NMCQX erstattet NDMQX anvendt deri. For medikament administrering, ble NMCQX oppløst i 0,05 Tris og 5% glukose. Det ble infusert i en sakte 2 mg/kg i.v. bolus (umiddelbart etter MCA okklusjon) etterfulgt av en 1,4 mg/kg/time infusjon i 22 timer.

NMCQX gav en signifikant reduksjon (75%, F118= 5,24, p < 0,05, ANOVA) i kortikalt infarktvolum. Se fig. 10.

Således tilveiebragte også NMCQX signifikant nevrobeskyttelse

i en rottemodell med fokal ischemi.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har formelen:

eller en tautomer eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav, hvor R<1>er C-^Cg-alkyl, azido, C-^Cg-alkoksy, halo-C-L-Cg-alkyl, halo, nitro, cyano eller C-L-Cg-alkanoylamino, R2 er C1-C6-alkyl, azido, C^^-Cg-alkoksy, fenyl-C1-C4- alkoksy, cyano, halo-C^^-Cg-alkyl, halo, hydroksy eller nitro, R3 er C-L-Cg-alkyl, azido, C1-C6-alkoksy, cyano, halo, halo- C-L-Cg-alkyl eller hydroksy, R<4>er hydrogen eller fluor, med den betingelse at (a) minst en av R<1>, R<2>ellerR<3>er hydroksy eller azido, eller (b) minst en av R<2>ellerR<3>erC1-Cg-alkyl eller Cj^-Cg-alkoksy, eller (c) R<1>er cyano.

2. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert vedat den nevnte forbindelse er 6,7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-klor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-brom-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-7-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6,7-dietyl- 5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-cyano-6,7-diklor-l,4 - dihydrokinoksalin-2,3-dion eller 5-azido-6,7-diklor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

3. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert vedat den har formelen

eller en tautomer eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav, hvor R<1>er nitro, cyano eller CF3, R2 er C1-C6-alkoksy, fenyl-C1-C4-alkoksy, hydroksy eller azido, R3 er halo, halo-C^^-Cg-alkyl, C^-Cg-alkyl, Cj^-Cg-alkoksy, azido eller cyano, og R4 er hydrogen. med den betingelse at (a) minst en av R2 eller R<3>er hydroksy eller azido, eller (b) minst en av R2 eller R<3>er C^-Cg-alkyl eller C^-Cg-alkoksy, eller (c) R<1>er cyano.

4. Forbindelse som angitt i krav 3,karakterisert vedat den er valgt fra gruppen som omfatter 6-azido-7-fluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-metoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion, 7-klor-6-metoksy-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2 ,3-dion og 7-fluor-6-etoksy-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

5. Forbindelse, karakterisert vedat den er valgt fra gruppen som omfatter 5 , 6 , 7-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-7-fluor-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3 - dion, 7-fluor-6-brom-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 7-fluor-6-metyl-5-nitro-l, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 6-klor-5,7-difluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion, 5-klor-6,7,8-trifluor-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion og 6-klor-7-fluor-5-trifluormetyl-1, 4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

6. Forbindelse som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte forbindelse er 6,7-dimetyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

7. Forbindelse som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte forbindelse er 6- klor-7-metyl-5-nitro-1,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

8. Forbindelse som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte forbindelse er 7- fluor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

9. Forbindelse som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte forbindelse er 7-klor-6-metyl-5-nitro-l,4-dihydrokinoksalin-2,3-dion.

10. Farmasøytisk aksepterbart salt av en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-5 og 6-9,karakterisert vedat det er et cholinsalt, et Tris-salt, et bis-Tris-propansalt, et N-metylglukaminsalt eller et argininsalt.

11. Forbindelse til bruk som terapeutikum,karakterisert vedat den er valgt fra en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-5 og 6-9.

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter en forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-5 og 6-9 og en farmasøytisk aksepterbar bærer.

13. Anvendelse av en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-5 og 6-9 for fremstilling av et farma-søytisk preparat for behandling eller forebygging av (A) nevronalt tap assosiert med slag, ischemi, CNS traume eller hypoglykemi, eller (B) de negative nevrologiske følger av kirurgisk inngrep som et resultat av: (a) luftbobler som samler seg i hjernen under eller umiddelbart etter kirurgi, (b) kardiopulmonal bypass-kirurgi, eller (c) karotid endarektomi kirurgi, eller for behandling av en nevrodegenerativ sykdom valgt fra Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Huntingtons sykdom og Downs syndrom, for antagonisering av eksiterende aminosyrer i NMDA reseptorkomplekset, for behandling eller forebygging av de negative følger av hyperaktiviteten til NMDA reseptoren, for behandling av kronisk smerte, for behandling eller forebygging av angst, for behandling eller forebygging av konvulsjoner, for å indusere anestesi, for behandling eller forebygging av NMDA reseptorionkanalrelatert psykose, for indusering av en hypnotisk effekt, eller for å forebygge opiattoleranse.