PT2357230E - Modificação de arn resulta numa estabilidade de transcrito e numa eficiência de tradução melhoradas - Google Patents
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Description
ΕΡ 2 357 23Ο/PT
DESCRIÇÃO "Modificação de ARN resultando numa estabilidade de transcrito e numa eficiência de tradução melhoradas"
As vacinas convencionais, incluindo patogénios atenuados ou inactivados, são eficazes em muitas áreas mas apesar disso não conferem imunidade protectora eficaz para alguns patogénios infecciosos e tumores. Isto requer vacinas que sejam eficazes, versáteis, prontas e eficientes de produzir em termos de custo e fáceis de armazenar.
Após a injecção intramuscular directa de ADN de plasmideo ter mostrado resultar em expressão prolongada dos genes codificados sobre a superfície celular (Wolff et al., 1990), as vacinas baseadas em ADN foram encaradas como uma nova estratégia de imunização promissora. Isto proporcionou um incentivo importante para o desenvolvimento de vacinas baseadas em ácidos nucleicos. Inicialmente, foram testadas vacinas baseadas em ADN para patogénios infecciosos (Cox et al., 1993; Davis et al., 1993; Ulmer et al., 1993; Wang et al., 1993) mas cedo foram porém investigados em mais detalhe também em terapia génica contra tumores de modo a induzir imunidade específica antitumor (Conry et al., 1994; Conry et al., 1995a; Spooner et al., 1995; Wang et al., 1995). Esta estratégia de imunização contra tumores tem várias vantagens importantes. Vacinas baseadas em ácidos nucleicos são fáceis de preparar e relativamente pouco dispendiosas. Para além disso podem ser amplificadas a partir de um pequeno número de células.
0 ADN é mais estável do que o ARN mas acarreta alguns riscos de segurança potencial tais como a indução de anticorpos anti-ADN (Gilkeson et al., 1995) e a integração do transgene no genoma do hospedeiro. Isto pode inactivar genes celulares, causar expressão de longo prazo incontrolável do referido transgene ou oncogénese e por isso não é usualmente aplicável a antigénios associados a tumor com potencial oncogénico, tais como, por exemplo, erb-B2 (Bargmann et al., 1986) e p53 (Greenblatt et al., 1994). A utilização de ARN oferece uma alternativa atractiva de modo a contornar estes riscos potenciais. ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
As vantagens de se utilizar ARN como um tipo de terapia génica reversível incluem expressão transiente e um carácter não transformante. 0 ARN não necessita de entrar no núcleo de modo a ser expresso transgenicamente e além disso não pode integrar-se no genoma do hospedeiro, eliminando desse modo o risco de oncogénese. Tal como com ADN (Condon et ai., 1996; Tang et al., 1992), a injecção de ARN pode também induzir ambas as respostas imunitárias celulares e humorais in vivo (Hoerr et al., 2000; Ying et ai., 1999). A imunoterapia com ARN transcrito in vitro (ARN-IVT) utiliza duas estratégias diferentes ambas as quais têm sido testadas com sucesso em vários modelos animais. Ou o ARN é injectado directamente através de diferentes vias de imunização (Hoerr et al., 2000) ou células dendriticas (DC) são transfectadas com ARN transcrito in vitro por meio de lipofecção ou electroporação e depois administradas (Heiser et al., 2000). Estudos publicados recentemente demonstraram que a imunização com DC transfectadas com ARN induz linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos de antigénio in vitro e in vivo (Su et al., 2003; Heiser et al., 2002). Um factor de importância central para indução óptima das respostas imunitárias mediadas por células T é inter alia a dose, i.e. densidade de apresentação de antigénio sobre as DC. Tem sido tentado estabilizar ARN-IVT por várias modificações de modo a conseguir a expressão prolongada de ARN IVT transferido e desse modo aumentar a apresentação de antigénio sobre DC. Um requisito básico para tradução é a presença de uma sequência poli(A) 3', com a eficiência de tradução estando correlacionada com o comprimento de poli(A) (Preiss e Hentze, 1998) . A cobertura (cap) 5' e a sequência poli(A) 3 ' activam sinergicamente a tradução in vivo (Gallie, 1991) . Regiões não traduzidas (UTR) de genes de globina são outros elementos conhecidos que podem contribuir para a estabilização e ARN e para o aumento da eficiência de tradução (Malone et al., 1989) .
São conhecidos na literatura alguns vectores IVT que são utilizados de um modo padrão como modelo para transcrição in vitro e que foram geneticamente modificados de um modo tal que são produzidos transcritos de ARN 3 ΕΡ 2 357 23Ο/PT estabilizados. Protocolos actualmente descritos na literatura (Conry et al., 1995b; Teufel et al., 2005; Strong et al., 1997; Carralot et al., 2004; Boczkowski et al., 2000) são baseados num vector de plasmídeo com a estrutura seguinte: um promotor de ARN-polimerase 5' possibilitando a transcrição de ARN, seguido por um gene de interesse que está flanqueado por regiões não traduzidas (UTR) a 3' e/ou a 5', e uma cassete de poliadenilo a 3' contendo 50-70 nucleótidos A. Antes da transcrição in vltro, o plasmídeo circular é linearizado a jusante da cassete de poliadenilo por enzimas de restrição do tipo II (a sequência de reconhecimento corresponde a um local de clivagem). A cassete de poliadenilo corresponde assim à sequência poli(A) tardia no transcrito. Como resultado deste procedimento, alguns nucleótidos permanecem como parte do local de clivagem da enzima após linearização e prolongam-se ou mascaram a sequência poli(A) na extremidade 3'. Não é claro se esta parte saliente não fisiológica afecta a quantidade de proteína produzida intracelularmente a partir de uma tal construção.
Por conseguinte, o ARN parece ser particularmente adequado para aplicações clínicas. No entanto, a utilização de ARN em terapia génica está grandemente restringida especialmente pela meia-vida curta do ARN, em particular no citoplasma, resultando em baixa expressão de proteína. O objecto do presente invento foi proporcionar ARN com estabilidade e eficiência de tradução aumentadas e meios para obtenção deste ARN. Deverá ser possível obter graus de expressão aumentados utilizando o referido ARN em abordagens de terapia génica.
Este objecto é conseguido de acordo com o invento pela matéria sujeito das reivindicações. O presente invento refere-se à estabilização de ARN, em particular ARNm, e a um aumento na tradução de ARNm. O presente invento refere-se particularmente a três modificações de ARN, em particular ARN transcrito in vitro, resultando em estabilidade do transcrito e em eficiência de tradução aumentadas. ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
De acordo com o invento, constatou-se que ARN possuindo uma sequência poli(A) de extremidade aberta era traduzido mais eficientemente do que ARN possuindo uma sequência poli(A) com um terminal mascarado. Constatou-se que uma sequência poli(A) longa, em particular de cerca de 120 pb, resulta em estabilidade do transcrito de ARN e em eficiência de tradução óptimas. O invento demonstrou também que uma região não traduzida (UTR) a 3' dupla, em particular do gene de beta-globina humana, na molécula de ARN melhora a eficiência de tradução de um modo que excede claramente o efeito total que seria de esperar utilizando duas UTR individuais. Constatou-se que uma combinação das modificações acima descritas de acordo com o invento tem uma influência sinérgica na estabilização de ARN e no aumento na tradução.
Utilizando RT-PCR quantitativa e variantes de eGFP para medir as quantidades de transcrito e o rendimento de proteina, o invento demonstrou que as modificações de ARN de acordo com o invento melhoram independentemente a estabilidade do ARN e a eficiência de tradução na transfecção de células dendriticas (DC) . Assim foi possível aumentar a densidade de complexos de péptido específico de antigénio/MHC nas células transfectadas e a sua capacidade para estimular e expandir células T CD4+ e CD8+ específicas de antigénio. Deste modo o invento refere-se a uma estratégia para optimizar vacinas de DC transfectadas com ARN utilizando ARN que foi modificado pelas modificações de ARN descritas de acordo com o invento.
De acordo com o invento, a modificação de ARN, e por esse motivo a estabilização e/ou aumento em eficiência de tradução, é preferivelmente conseguida modificando geneticamente vectores de expressão que preferivelmente servem como modelo para transcrição de ARN in vitro.
Vectores deste tipo destinam-se a permitir em particular a transcrição de ARN com uma sequência poli(A) que preferivelmente tem uma extremidade aberta no referido ARN, i.e. nenhuns nucleótidos para além de nucleótidos A flanqueiam a referida sequência poli(A) na sua extremidade ΕΡ 2 357 230/ΡΤ C. 3'. Uma sequência poli(A) de extremidade aberta no ARN pode ser conseguida introduzindo um local de clivagem por restrição de tipo IIS num vector de expressão que permite ao ARN ser transcrito sob o controlo de um promotor de ARN-polimerase 5' e que contém uma cassete de poliadenilo (sequência poli(A)), onde a sequência de reconhecimento está localizada 3' da sequência poli(A), enquanto o local de clivagem está localizado a montante e assim no interior da sequência poli(A). A clivagem por restrição no local de clivagem por restrição do tipo IIS possibilita a um plasmideo ser linearizado no interior da sequência poli(A) (Fig. 2). 0 plasmideo linearizado pode depois ser utilizado como modelo para transcrição in vitro, o transcrito resultante terminando numa sequência poli(A) não mascarada.
Para além disso, ou alternativamente, uma modificação de ARN, e por esse motivo a estabilização e/ou o aumento em eficiência de tradução, pode ser conseguidos de acordo com o invento modificando geneticamente vectores de expressão de um modo tal que estes permitam a transcrição de ARN com duas ou mais regiões não traduzidas a 3' na sua extremidade 3', e preferivelmente entre a sequência que codifica um péptido ou uma proteína (moldura de leitura aberta) e a sequência poli(A).
Num aspecto, o invento refere-se a uma molécula de ácido nucleico compreendendo, no sentido de transcrição 5' -> 3': (a) um promotor, (b) uma sequência de ácido nucleico transcrevível ou uma sequência de ácido nucleico para introduzir uma sequência de ácido nucleico transcrevível, (c—1) uma primeira sequência de ácido nucleico que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada; e (c-2) uma segunda sequência de ácido nucleico que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada.
Numa concretização, a molécula de ácido nucleico de acordo com o invento compreende adicionalmente (c-3), pelo menos uma sequência de ácido nucleico adicional que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada. 6
ΕΡ 2 357 23Ο/PT
Na molécula de ácido nucleico de acordo com o invento, as sequências de ácido nucleico (b) , (c-1), (c-2) e, onde apropriado, (c-3) sob o controlo do promotor (a) podem preferivelmente ser transcritas para dar um transcrito comum no qual as sequências de ácido nucleico transcritas a partir das sequências de ácido nucleico (c-1) e/ou (c-2) e/ou, onde apropriado, (c-3), são preferivelmente activas de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico transcrevível (b).
As sequências de ácido nucleico (c-1), (c-2) e, onde apropriado, (c-3) podem ser idênticas ou diferentes.
Numa concretização, a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente (d) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controlo do promotor (a), codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito.
As sequências de ácido nucleico (b), (c-1), (c-2), onde apropriado (c-3), e (d) sob o controlo do promotor (a) podem preferivelmente ser transcritas para dar um transcrito comum no qual as sequências de ácido nucleico transcritas a partir das sequências de ácido nucleico (c-1) e/ou (c-2) e/ou, onde apropriado, (c-3) e/ou (d) são preferivelmente activas de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico transcrevível (b).
Em concretizações particulares, a sequência de ácido nucleico (d) , quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A sequência de ácido nucleico (d), quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , preferivelmente codifica uma sequência de nucleótidos de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos no transcrito. ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
Numa concretização, a molécula de ácido nucleico é caracterizada por poder ser clivada, de preferência enzimaticamente ou de outro modo bioquímico, no interior da sequência de ácido nucleico (d) de um modo tal que a referida clivaqem resulta numa molécula de ácido nucleico que compreende, no sentido de transcrição 5' -> 3', o promotor (a) , a sequência de ácido nucleico (b) , as sequências de ácido nucleico (c-1), (c-2) e, onde apropriado, (c-3), e pelo menos uma parte da sequência de ácido nucleico (d), onde a pelo menos uma parte da sequência de ácido nucleico (d) , quando transcrita sob o controlo do promotor (a), codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito e onde no transcrito o nucleótido 3'-terminal é um nucleótido A da referida sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos.
Preferivelmente, após clivagem, a referida molécula de ácido nucleico, na extremidade da cadeia que serve como modelo para a sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, possui um nucleótido T que é parte da sequência de nucleótidos que serve como modelo para a referida sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito.
Em concretizações particulares, a pelo menos parte da sequência de ácido nucleico (d) , quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A sequência de ácido nucleico (d), quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica preferivelmente uma sequência de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A molécula de ácido nucleico de acordo com o invento é preferivelmente uma molécula circular fechada antes da clivagem e uma molécula linear após clivagem.
ΕΡ 2 357 23Ο/PT
Preferivelmente, a clivagem é realizada com a ajuda de um local de clivagem por restrição que é preferivelmente um local de clivagem por restrição para uma endonuclease de restrição do tipo IIS.
Numa concretização, a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição do tipo IIS está localizada 5-26 pares de bases, preferivelmente 24-26 pares de bases, a jusante da extremidade 3' da sequência de ácido nucleico (d).
Numa concretização preferida, as sequências de ácido nucleico (c-1), (c-2) e, onde apropriado, (c-3) são, independentemente umas das outras, derivadas de um gene seleccionado do grupo que consiste em genes de globina tais como alfa2-globina, alfal-globina, beta-globina e hormona do crescimento, preferivelmente beta-globina humana, e correspondem, numa concretização particularmente preferida, à sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID No. 1 da listagem de sequências ou a uma sequência de ácido nucleico dela derivada.
Num outro aspecto, o invento refere-se a uma molécula de ácido nucleico compreendendo, no sentido de transcrição 5' -> 3': (a) um promotor; (b) uma sequência de ácido nucleico transcrevivel ou uma sequência de ácido nucleico para introduzir uma sequência de ácido nucleico transcrevivel; e (c) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito.
As sequências de ácido nucleico (b) e (c) sob o controlo do promotor (a) podem preferivelmente ser transcritas para dar um transcrito comum no qual a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (c) é preferivelmente activa de modo a aumentar a eficiência da tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico transcrevivel (b). 9 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
Em concretizações particulares, a sequência de ácido nucleico (c) , quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A sequência de ácido nucleico (c), quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , preferivelmente codifica uma sequência de nucleótidos de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos no transcrito.
Numa concretização, a molécula de ácido nucleico pode ser clivada, de preferência enzimaticamente ou de outro modo bioquímico, no interior da sequência de ácido nucleico (c) de um modo tal que a referida clivagem resulta numa molécula de ácido nucleico que compreende, no sentido de transcrição 5' -> 3', o promotor (a), a sequência de ácido nucleico (b), e pelo menos uma parte da sequência de ácido nucleico (c), onde a pelo menos uma parte da sequência de ácido nucleico (c), quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito e onde, no transcrito, o nucleótido 3'-terminal é um nucleótido A da referida sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos.
Preferivelmente, após clivagem, a molécula de ácido nucleico, na extremidade da cadeia que serve como modelo para a sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, possui um nucleótido T que é parte da sequência de nucleótidos que serve como modelo para a sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito.
Em concretizações particulares, a pelo menos parte da sequência de ácido nucleico (c) , quando transcrita sob o controlo do promotor (a) , codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A sequência de ácido nucleico (c) , quando transcrita sob o controlo do ΕΡ 2 357 230/ΡΤ promotor (a), preferivelmente codifica uma sequência de nucleótidos de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A molécula de ácido nucleico é preferivelmente uma molécula circular fechada antes da clivagem e uma molécula linear após clivagem.
Preferivelmente, a clivagem é realizada com a ajuda de um local de clivagem por restrição que é preferivelmente um local de clivagem por restrição para uma endonuclease de restrição do tipo IIS.
Numa concretização, a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição do tipo IIS está localizada 5-26 pares de bases, preferivelmente 24-26 pares de bases, a jusante da extremidade 3’ da sequência de ácido nucleico íc).
Numa molécula de ácido nucleico de acordo com o invento, a sequência de ácido nucleico transcrevivel compreende preferivelmente uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido ou uma proteína e a sequência de ácido nucleico para introduzir uma sequência de ácido nucleico transcrevivel é preferivelmente um local de clonagem múltiplo.
Uma molécula de ácido nucleico de acordo com o invento pode compreender adicionalmente um ou mais membros seleccionados entre o grupo consistindo em: (i) um gene repórter; (ii) um marcador seleccionável; e (iii) uma origem de replicação.
Numa concretização, uma molécula de ácido nucleico de acordo com o invento está numa conformação circular fechada e preferivelmente adequada para transcrição in vitro de ARN, em particular ARNm, em particular após linearização.
Em aspectos adicionais, o invento refere-se a uma molécula de ácido nucleico obtenível por linearização de uma molécula de ácido nucleico acima descrita, preferivelmente por clivagem no interior da sequência de ácido nucleico que ΕΡ 2 357 230/ΡΤ codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, e a ARN que pode ser obtido por transcrição, preferivelmente transcrição in vitro, com moléculas de ácido nucleico acima descritas sob o controlo do promotor (a).
Num aspecto adicional, o invento refere-se a um método para transcrição in vitro de uma molécula de ARN seleccionada de modo a aumentar a sua estabilidade e/ou eficiência de tradução, compreendendo: (i) acoplamento de uma primeira sequência de ácido nucleico (b-1) que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada, na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico (a) que pode ser transcrita para dar a referida molécula de ARN, (ii) acoplamento de uma segunda sequência de ácido nucleico (b-2) que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada, na extremidade 3' da referida primeira sequência de ácido nucleico (b-1), e (iii) transcrição in vitro do ácido nucleico obtido.
Num aspecto adicional, o invento refere-se a um método para tradução de uma molécula de ARNm seleccionada de modo a aumentar a sua expressão, compreendendo: (i) acoplamento de uma primeira sequência de ácido nucleico (b-1) que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada, na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico (a) que pode ser transcrita para dar a referida molécula de ARNm, (ii) acoplamento de uma segunda sequência de ácido nucleico (b-2) que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada, na extremidade 3' da referida primeira sequência de ácido nucleico (b-1), e (iii) tradução do ARNm que pode ser obtido pela transcrição do ácido nucleico obtido. Preferivelmente a transcrição é realizada in vitro.
De acordo com o invento, o termo "acoplamento de uma sequência de ácido nucleico na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico" refere-se a uma ligação covalente das duas sequências de ácido nucleico de um modo tal que a primeira sequência de ácido nucleico está a jusante da segunda sequência de ácido nucleico e pode estar separada desta última por sequências adicionais de ácido nucleico. 12 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
Numa concretização, os métodos de acordo com o invento compreendem adicionalmente o acoplamento de pelo menos uma sequência de ácido nucleico adicional (b-3) que corresponde à região não traduzida a 3' de um gene ou é dela derivada, na extremidade 3' da segunda sequência de ácido nucleico (b-2).
As sequências de ácido nucleico (a), (b-1), (b-2) e, quando apropriado, (b-3), podem preferivelmente ser transcritas para dar um transcrito comum no qual as sequências de ácido nucleico transcritas a partir das sequências de ácido nucleico (b-1) e/ou (b-2) e/ou, quando apropriado, (b-3), estão preferivelmente activas de modo a aumentar a eficiência da tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita pela sequência de ácido nucleico (a).
Numa concretização adicional, os métodos de acordo com o invento compreendem adicionalmente o acoplamento de uma sequência de ácido nucleico (c) que, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, na extremidade 3' da sequência de ácido nucleico (b-2) ou, onde apropriado, da sequência de ácido nucleico (b-3).
As sequências de ácido nucleico (a), (b-1), (b-2) e, onde apropriado, (b-3), e (c) podem preferivelmente ser transcritas para dar um transcrito comum no qual as sequências de ácido nucleico transcritas a partir das sequências de ácido nucleico (b-1) e/ou (b-2) e/ou, onde apropriado, (b-3), e/ou (c) são preferivelmente activas de modo a aumentarem a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (a).
Em concretizações particulares, a sequência de ácido nucleico (c) , quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A sequência de ácido nucleico (c) , quando transcrita, preferivelmente ΕΡ 2 357 230/ΡΤ codifica uma sequência de nucleótidos de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos no transcrito.
Em concretizações particulares, os métodos de acordo com o invento compreendem, antes da transcrição do ácido nucleico obtido, clivagem no interior da sequência de ácido nucleico (c) de um modo tal que a transcrição do ácido nucleico obtido deste modo gera um transcrito que possui as sequências de ácido nucleico transcritas a partir das sequências de ácido nucleico (a), (b-1), (b-2) e, onde apropriado, (b-3) e uma sequência de nucleótidos 3'-terminal de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, onde o nucleótido 3'-terminal do referido transcrito é um nucleótido A da sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos.
Em concretizações particulares, o transcrito possui na sua extremidade 3' uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos. O transcrito possui preferivelmente na sua extremidade 3' uma sequência de nucleótidos de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos.
Em concretizações preferidas, as sequências de ácido nucleico (b-1), (b-2) e, onde apropriado, (b-3), são, independentemente umas das outras, derivadas de um gene seleccionado do grupo que consiste em genes de globina tais como alfa-2-globina, alfal-globina, beta-globina e hormona do crescimento, preferivelmente beta-globina humana, e correspondem, numa concretização particularmente preferida, à sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID No. 1 da listagem de sequências ou a uma sequência de ácido nucleico dela derivada.
Num aspecto adicional, o invento refere-se a um método para a transcrição in vitro de uma molécula de ARN seleccionada de modo a aumentar a sua estabilidade e/ou 14 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ eficiência de tradução, compreendendo: (i) acoplamento de uma sequência de ácido nucleico (b) que, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico (a) que pode ser transcrita para dar a referida molécula de ARN, e (ii) transcrição in vitro do ácido nucleico obtido.
Num aspecto adicional, o invento refere-se a um método para a tradução de uma molécula de ARNm seleccionada de modo a aumentar a sua expressão, compreendendo: (i) acoplamento de uma sequência de ácido nucleico (b) que, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico (a) que pode ser transcrita para dar a referida molécula de ARNm, e (ii) tradução do ARNm que pode ser obtido por transcrição do ácido nucleico obtido. A transcrição é preferivelmente realizada in vitro.
As sequências de ácido nucleico (a) e (b) podem preferivelmente ser transcritas para dar um transcrito comum no qual a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (b) é preferivelmente activa de modo a aumentar a eficiência da tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (a).
Em concretizações particulares, a sequência de ácido nucleico (b) , quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos no transcrito. A sequência de ácido nucleico (b) , quando transcrita, preferivelmente codifica uma sequência de nucleótidos de até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos no transcrito.
Em concretizações particulares, os métodos de acordo com o invento compreendem adicionalmente, antes da transcrição do ácido nucleico obtido, clivagem no interior da sequência de ácido nucleico (b) de uma maneira tal que a transcrição do ΕΡ 2 357 23Ο/PT ácido nucleico obtido desta maneira gera um transcrito que possui as sequências de ácido nucleico transcritas a partir da sequência de ácido nucleico (a) e uma sequência de nucleótidos 3'-terminal de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, onde o nucleótido 3'-terminal do referido transcrito é um nucleótido A da sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos.
Em concretizações particulares, o transcrito possui pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, e em particular cerca de 120, nucleótidos A consecutivos na sua extremidade 3'. O transcrito preferivelmente possui até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos na sua extremidade 3'.
Em todos os aspectos dos métodos de acordo com o invento, a clivagem é preferivelmente realizada com a ajuda de um local de clivagem por restrição que é preferivelmente um local de clivagem por restrição para uma endonuclease de restrição do tipo IIS.
Numa concretização, a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição do tipo IIS está 5-26 pares de bases, preferivelmente 24-26 pares de bases, a jusante da extremidade 3' da sequência de ácido nucleico que, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos. 0 invento refere-se também a ARN que pode ser obtido pelos métodos de acordo com o invento para transcrição in vitro de uma molécula de ARN seleccionada. A preparação de ARN que pode ser obtido pelos métodos de acordo com o invento para transcrição in vitro de uma molécula de ARN seleccionada, a partir de uma molécula de ácido nucleico de acordo com o invento como modelo é preferivelmente homogénea ou essencialmente homogénea no que se refere ao comprimento da sequência poli(A) do ARN, i.e. o comprimento da sequência poli(A) em mais de 90%, preferivelmente mais de 95%, preferivelmente mais de 98% ou 99%, das moléculas de ARN na preparação difere não mais de 10, preferivelmente não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1, nucleótidos A. ΕΡ 2 357 230/ΡΤ Ο invento pode ser utilizado, por exemplo, para aumentar a expressão de proteínas recombinantes na transcrição e expressão celulares. Mais especificamente, quando se produzem proteínas recombinantes, é possível introduzir as modificações descritas de acordo com o invento e uma sua combinação em vectores de expressão e utilizar estes para o propósito de aumentar a transcrição de ácidos nucleicos recombinantes e a expressão de proteínas recombinantes em sistemas baseados em células. Isto inclui, por exemplo, a preparação de anticorpos recombinantes, hormonas, citoquinas, enzimas, e outros. Isto permite inter alia reduzir os custos de produção. É também possível utilizar as modificações descritas de acordo com o invento e uma sua combinação para aplicações de terapia génica. As referidas modificações podem ser introduzidas em vectores de terapia génica e desse modo utilizados para aumentar a expressão de um transgene. Para este fim, podem-se utilizar quaisquer sistemas de vector baseados em ácido nucleico (ADN/ARN) (por exemplo plasmídeos, adenovírus, vectores de vírus pox, vectores de vírus influenza, vectores de alfavírus, e outros). Podem ser transfectadas células com estes vectores in vitro, por exemplo em linfócitos ou células dendríticas, ou outras in vivo por administração directa. É ainda possível que as modificações descritas de acordo com o invento e uma sua combinação aumentem a estabilidade e/ou a eficiência da expressão de ácidos ribonucleicos e desse modo a quantidade dos péptidos ou proteínas codificados pelos referidos ácidos ribonucleicos. Podem ser utilizados ácidos ribonucleicos de codificação, por exemplo, para expressão transiente de genes, com campos de aplicação possíveis sendo vacinas baseadas em ARN que são transfectadas em células in vitro ou administradas directamente in vivo, expressão transiente de proteínas recombinantes funcionais in vitro, por exemplo de modo a iniciar processos de diferenciação em células ou para estudar funções de proteínas, e expressão transiente de proteínas recombinantes funcionais tais como eritropoietina, hormonas, inibidores de coagulação, etc., in vivo, em particular como fármacos. ΕΡ 2 357 230/ΡΤ ARN, em particular ARN transcrito in vitro, modificado pelas modificações descritas de acordo com o invento, pode ser utilizado em particular para transfectar células de apresentação de antigénio e assim como uma ferramenta para entregar o antigénio a ser apresentado e para carregamento de células de apresentação de antigénio, com o referido antigénio a ser apresentado correspondendo ao péptido ou proteína expressos a partir do referido ARN ou deles derivados, em particular através de processamento intracelular tal como clivagem, i.e. o antigénio a ser apresentado é, por exemplo, um fragmento do péptido ou proteína expressos a partir do ARN. Podem ser utilizadas células de apresentação de antigénio para estimulação de células T, em particular células T CD4+ e/ou CD8+.
Descrição detalhada do invento
De acordo com o invento, podem ser utilizados métodos padrão para a preparação de ácidos nucleicos recombinantes, cultura de células e introdução de ácidos nucleicos, em particular ARN, em células, em particular electroporação e lipofecção. Reacções enzimáticas são realizadas de acordo com as instruções do fabricante ou de um modo conhecido per se.
De acordo com o invento, uma molécula de ácido nucleico ou uma seguência de ácido nucleico refere-se a um ácido nucleico gue é preferivelmente ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN) . De acordo com o invento, ácidos nucleicos compreendem ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas preparadas recombinantemente e sintetizadas quimicamente. De acordo com o invento, um ácido nucleico pode estar na forma de uma molécula de cadeia simples ou de cadeia dupla e linear ou circular fechada covalentemente. "ARNm" significa "ARN mensageiro" e refere-se a um "transcrito" que é produzido utilizando ADN como modelo e que codifica ele próprio um péptido ou proteína. Um ARNm compreende tipicamente uma região não traduzida a 5', uma região de codificação de proteína e uma região não traduzida a 3' . 0 ARNm tem um meio-tempo limitado tanto em células como in vitro. De acordo com o invento, o ARNm pode ser 18 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ preparado a partir de um modelo de ADN por transcrição in vitro. Pode ser modificado por modificações de estabilização adicionais e capeamento, para além das modificações de acordo com o invento. 0 termo "ácido nucleico" adicionalmente compreende também uma derivatização química de um ácido nucleico sobre uma base de nucleótido, sobre o açúcar ou sobre o fosfato, e ácidos nucleicos contendo nucleótidos não naturais e análogos de nucleótido.
De acordo com o invento, uma "sequência de ácido nucleico que é derivada de uma sequência de ácido nucleico" refere-se a um ácido nucleico contendo, em comparação com o ácido nucleico a partir do qual é derivado, substituições, deleções e/ou adições de nucleótido simples ou múltiplas, e que é preferivelmente complementar em relação ao ácido nucleico a partir do qual é derivado, i.e. existe um certo grau de homologia entre os referidos ácidos nucleicos e as sequências de nucleótidos dos referidos ácidos nucleicos correspondem de um modo significativo directo ou complementar. De acordo com o invento, um ácido nucleico derivado de um ácido nucleico tem uma propriedade funcional do ácido nucleico a partir do qual é derivado. Estas propriedades funcionais incluem em particular a capacidade para aumentar, numa ligação funcional a um ácido nucleico que pode ser transcrito em ARN (sequência de ácido nucleico transcrevível), a estabilidade e/ou a eficiência de tradução de ARN produzido a partir deste ácido nucleico na molécula de ARN completa.
De acordo com o invento, "ligação funcional" ou "ligado funcionalmente" refere-se a uma ligação numa relação funcional. Um ácido nucleico está "ligado funcionalmente" se estiver relacionado funcionalmente com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está ligado funcionalmente a uma sequência de codificação se este influenciar a transcrição da referida sequência de codificação. Ácidos nucleicos ligados funcionalmente estão tipicamente adjacentes um ao outro, onde apropriado, separados por sequências adicionais de ácido nucleico, e, em concretizações particulares, são transcritos por ARN 19 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ polimerase para dar uma única molécula de ARN (transcrito comum) .
Os ácidos nucleicos descritos de acordo com o invento são preferivelmente isolados. 0 termo "ácido nucleico isolado" de acordo com o invento significa que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo por reacção em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido recombinantemente por clonagem, (iii) purificado, por exemplo, por clivagem e fraccionamento electroforético em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico disponível para manipulação por técnicas de ADN recombinante.
Um ácido nucleico é "complementar" em relação a outro ácido nucleico se as duas sequências se puderem hibridar uma com a outra e formar um duplex estável, a referida hibridação sendo realizada preferivelmente sob condições que permitem hibridação específica entre polinucleótidos (condições estringentes). Condições estringentes estão descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et ai., eds., 2.a edição, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, e referem-se, por exemplo, a uma hibridação a 65°C em tampão de hibridação (3,5 x SSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro de bovino, NaH2P04 2,5 mM (pH 7), 0,5% de SDS, EDTA 2 mM) . SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridação, a membrana para a qual o ADN foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 x SSC à temperatura ambiente e depois em 0,1 -0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas até 68°C.
De acordo com o invento, ácidos nucleicos complementares possuem nucleótidos que são pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, e preferivelmente pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, idênticos. O termo "% idênticos" pretende referir-se a uma percentagem de nucleótidos que são idênticos num alinhamento 20 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ óptimo entre duas sequências que se pretendem comparar, com a referida percentagem sendo puramente estatística, e as diferenças entre as duas sequências podem estar aleatoriamente distribuídas ao longo de todo o comprimento da sequência e a sequência a ser comparada pode compreender adições ou deleções em comparação com a sequência de referência, de modo a obter um alinhamento óptimo entre duas sequências. Comparações de duas sequências são usualmente realizadas comparando as referidas sequências, após alinhamento óptimo, em relação a um segmento ou "janela de comparação", de modo a identificar regiões locais de sequências correspondentes. O alinhamento óptimo para uma comparação pode ser realizado manualmente ou com a ajuda do algoritmo de homologia local por Smith e Waterman, 1981, Ads. App. Math. 2, 482, com a ajuda do algoritmo de homologia local por Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, e com a ajuda algoritmo de pesquisa de similaridade por Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 2444 ou com a ajuda de programas de computador utilizando os referidos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). A percentagem de identidade é obtida determinando o número de posições idênticas nas quais as sequências que se pretendem comparar correspondem, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando este resultado por 100.
Por exemplo, pode-se utilizar o programa BLAST "BLAST 2 sequences" que está disponível no sitio da internet http://www.nebi.nlm.nih.gov/blast/b!2seq/wblast2.egi. "Extremidade 3' de um ácido nucleico" de acordo com o invento refere-se àquela extremidade que possui um grupo hidroxi livre. Numa representação esquemática de ácidos nucleicos de cadeia dupla, em particular ADN, a extremidade 3' está sempre do lado direito. "Extremidade 5' de um ácido nucleico" de acordo com o invento refere-se àquela extremidade que possui um grupo fosfato livre. Numa representação esquemática de ácidos nucleicos de cadeia dupla, em particular ADN, a extremidade 5' está sempre do lado esquerdo. 21
ΕΡ 2 357 23Ο/PT extremidade 5' 5'—Ρ-ΝΝΝΝΝΝΝ-ΟΗ-3' extremidade 3' 3'-ΗΟ-ΝΝΝΝΝΝΝ-Ρ — 5 '
Em concretizações particulares, de acordo com o invento, um ácido nucleico está ligado funcionalmente a sequências de controlo de expressão que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao ácido nucleico.
Um ácido nucleico transcrevivel, em particular um ácido nucleico que codifica um péptido ou uma proteína, e uma sequência de controlo de expressão estão "ligados funcionalmente" um ao outro, se estiverem ligados covalentemente um ao outro de um modo tal que transcrição ou expressão do ácido nucleico transcrevivel, e em particular de codificação, estiverem sob o controlo ou sob a influência da sequência de controlo expressão. Se o ácido nucleico se destinar a ser traduzido num péptido ou proteína funcional, a indução de uma sequência de controlo de expressão ligada funcionalmente à sequência de codificação resulta na transcrição da referida sequência de codificação, sem causar um desvio de moldura na sequência de codificação ou a sequência de codificação sendo incapaz de ser traduzida no péptido ou proteína desejados.
De acordo com o invento, o termo "sequência de controlo de expressão" compreende promotores, sequências de ligação a ribossoma e outros elementos de controlo que controlam a transcrição de um gene ou a tradução do ARN derivado. Em concretizações particulares do invento, as sequências de controlo de expressão podem ser reguladas. A estrutura exacta das sequências de controlo de expressão podem variar, dependendo das espécies ou tipos de células, mas usualmente inclui sequências não transcritas a 5' e não traduzidas a 5' e a 3', envolvidas no início da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como a caixa TATA, sequência de capeamento, sequência CART e outras. Mais especificamente, sequências de controlo de expressão não transcritas a 5' incluem uma região de promotor que abrange uma sequência de promotor para controlo de transcrição do gene ligado funcionalmente. Sequências de controlo de expressão podem 22 ΕΡ 2 357 23Ο/PT também incluir sequências de intensificador ou sequências de activador a montante.
Os ácidos nucleicos aqui especificados, em particular ácidos nucleicos transcreviveis e de codificação, podem ser combinados com quaisquer sequências de controlo de expressão, em particular promotores, que podem ser homólogos ou heterólogos dos referidos ácidos nucleicos, com o termo "homólogo" referindo-se ao facto de um ácido nucleico estar também ligado funcionalmente naturalmente à sequência de controlo de expressão, e o termo "heterólogo" referindo-se ao facto de um ácido nucleico não estar ligado funcionalmente naturalmente à sequência de controlo de expressão. 0 termo "promotor" ou "região de promotor" refere-se a uma sequência de ADN a montante (5') da sequência de codificação de um gene, que controla a expressão da referida sequência de codificação proporcionando um local de reconhecimento e de ligação para ARN-polimerase. A região de promotor pode incluir locais adicionais de reconhecimento ou ligação para factores adicionais envolvidos na regulação da transcrição do referido gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Um promotor pode ser "induzível" e iniciar a transcrição em resposta a um indutor, ou pode ser "constitutivo" se a transcrição não é controlada por um indutor. Um promotor induzivel é expresso apenas numa extensão muito pequena ou não é expresso de todo, se um indutor estiver ausente. Na presença do indutor, o gene é "accionado" ou o nivel de transcrição é aumentado. Isto é usualmente mediado por ligação de um factor de transcrição especifico.
Exemplos de promotores preferidos de acordo com o invento são promotores para polimerase SP6, T3 ou T7.
De acordo com o invento, o termo "expressão" é utilizado no seu significado mais geral e compreende produção de ARN ou de ARN e proteína. Compreende também expressão parcial de ácidos nucleicos. Adicionalmente, a expressão pode ser transiente ou estável. Em relação ao ARN, 23 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ ο termo "expressão" ou "tradução" refere-se em particular à produção de péptidos ou proteínas. 0 termo "ácidos nucleicos que podem ser transcritos para dar um transcrito comum" significa que os referidos ácidos nucleicos estão ligados funcionalmente uns aos outros de um modo tal que, onde apropriado após linearização tal como clivagem por enzima de restrição da molécula de ácido nucleico compreendendo os referidos ácidos nucleicos, em particular de uma molécula de ácido nucleico circular fechada, a transcrição sob o controlo de um promotor resulta numa molécula de ARN compreendendo os transcritos dos referidos ácidos nucleicos ligados covalentemente uns aos outros, onde apropriado separados por sequências localizadas entre eles.
De acordo com o invento, o termo "transcrição" compreende "transcrição in vitro", onde o termo "transcrição in vitro" se refere a um método no qual ARN, em particular ARNm, é sintetizado in vitro de um modo isento de células, i.e. preferivelmente utilizando extractos celulares preparados apropriadamente. A preparação de transcritos recorre preferivelmente a vectores de clonagem que são geralmente referidos como vectores de transcrição e que, de acordo com o invento, estão incluídos no termo "vector". 0 termo "sequência de ácido nucleico transcrita a partir de uma sequência de ácido nucleico" refere-se a ARN, onde apropriado como parte de uma molécula de ARN completa, que é um produto de transcrição desta última sequência de ácido nucleico. 0 termo "sequência de ácido nucleico que é activa de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade de uma sequência de ácido nucleico" significa que o primeiro ácido nucleico é capaz de modificar, num transcrito comum com o segundo ácido nucleico, a eficiência de tradução e/ou a estabilidade do referido segundo ácido nucleico de um modo tal que a referida eficiência de tradução e/ou a estabilidade estão aumentadas em comparação com a eficiência de tradução e/ou a estabilidade do referido segundo ácido nucleico sem o referido primeiro ácido nucleico. Neste 24 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ contexto, ο termo "eficiência de tradução" refere-se a uma quantidade de produto de tradução proporcionada por uma molécula de ARN dentro de um período de tempo particular e o termo "estabilidade" refere-se à meia vida de uma molécula de ARN. A região não traduzida a 3' refere-se a uma região que está localizada na extremidade 3' de um gene, a jusante do codão de terminação de uma região de codificação de proteína, e que é transcrita mas não é traduzida numa sequência de aminoácido.
De acordo com o invento, considera-se que uma primeira região de polinucleótido está localizada a jusante de uma segunda região de polinucleótido, se a extremidade 5' da referida primeira região de polinucleótido for a parte da referida primeira região de polinucleótido mais próxima da extremidade 3' da referida segunda região de polinucleótido. A região não traduzida a 3' prolonga-se tipicamente a partir do codão de terminação para um produto de tradução até à sequência poli(A) que está usualmente ligada após o processo de transcrição. As regiões não traduzidas a 3' de ARNm de mamífero têm tipicamente uma região de homologia conhecida como a sequência hexanucleotídica AAUAAA. Esta sequência é presumivelmente o sinal de ligação de poli(A) e está frequentemente localizada de 10 a 30 bases a montante do local de ligação de poli(A).
Regiões não traduzidas a 3' podem conter uma ou mais repetições invertidas que se podem dobrar para dar estruturas em haste-laço que actuam como barreiras para exorribonucleases ou interactuam com proteínas conhecidas por aumentarem a estabilidade de ARN (e.g. proteínas de ligação a ARN).
De acordo com o invento, regiões não traduzidas a 5' e/ou a 3' podem estar ligadas funcionalmente a um ácido nucleico transcrevivel, e em particular de codificação, de modo a estas regiões estarem associadas ao ácido nucleico de um modo tal que a estabilidade e/ou eficiência de tradução ΕΡ 2 357 230/ΡΤ 2 5 do ARN transcrito, a partir do referido ácido nucleico transcrevivel, são aumentadas.
As regiões não traduzidas a 3' de ARNm de imunoglobulina são relativamente curtas (menos de cerca de 300 nucleótidos), enquanto as regiões não traduzidas a 3' de outros genes são relativamente longas. Por exemplo, a região não traduzida a 3' de tPA tem cerca de 800 nucleótidos de comprimento, a do factor VIII tem cerca de 1800 nucleótidos de comprimento e a de eritropoiet ina tem cerca de 560 nucleótidos de comprimento.
De acordo com o invento, pode ser determinado se uma região não traduzida a 3' ou uma sequência de ácido nucleico dai derivada aumenta a estabilidade e/ou eficiência de tradução de ARN, incorporando a região não traduzida a 3' ou uma sequência de ácido nucleico dai derivada na região não traduzida a 3' de um gene e medindo se a referida incorporação aumenta a quantidade de proteína sintetizada.
Por conseguinte, o anterior aplica-se ao caso em que, de acordo com o invento, um ácido nucleico compreende duas ou mais regiões não traduzidas a 3' que são preferivelmente acopladas sequencialmente com ou sem um ligante entre elas, preferivelmente num "relacionamento cabeça-cauda" (i.e. as regiões não traduzidas a 3' têm a mesma orientação, preferivelmente a orientação de ocorrência natural num ácido nucleico).
De acordo com o invento, o termo "gene" refere-se a uma sequência de ácido nucleico particular que é responsável por produzir um ou mais produtos celulares e/ou por conseguir uma ou mais funções intercelulares ou intracelulares. Mais especificamente, o referido termo refere-se a uma secção de ADN que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína específica ou uma molécula de ARN funcional ou estrutural.
Os termos "cassete de poliadenilo" ou "sequência poli(A)" referem-se a uma sequência de resíduos adenilo que está tipicamente localizada na extremidade 3' de uma molécula de ARN. O invento proporciona que uma tal sequência 26 ΕΡ 2 357 23Ο/PT seja ligada durante a transcrição de ARN através de um modelo de ADN com base em resíduos timidilo repetidos na cadeia complementar da cadeia de codificação, enquanto a referida sequência não é normalmente codificada no ADN mas é ligada à extremidade 3' livre do ARN por uma ARN-polimerase independente do modelo após transcrição no núcleo. De acordo com o invento, uma sequência poli(A) deste tipo é entendida como significando uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100 e preferivelmente até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150, nucleótidos A consecutivos, e em particular cerca de 120 nucleótidos A consecutivos, onde o termo "nucleótidos A" se refere a resíduos adenilo.
Numa concretização preferida, uma molécula de ácido nucleico de acordo com o invento é um vector. O termo "vector" é aqui utilizado no seu significado mais geral e compreende quaisquer veículos intermédios para um ácido nucleico que, por exemplo, possibilitem ao referido ácido nucleico ser introduzido em células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas e, onde apropriado, ser integrado num genoma. Estes vectores são preferivelmente replicados e/ou expressos na célula. Os vectores compreendem plasmídeos, fagomídeos ou genomas de vírus. O termo "plasmídeo", como aqui utilizado, refere-se geralmente a uma construção de material genético extracromossómico, usualmente um duplex de ADN circular, que se pode replicar independentemente do ADN cromossómico.
De acordo com o invento, o termo "célula hospedeira" refere-se a qualquer célula que pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. O termo "célula hospedeira" compreende, de acordo com o invento, células procarióticas (e.g. E. coli) ou eucarióticas (e.g. células de levedura e células de insecto). É dada preferência particular a células de mamífero tais como células de humanos, ratinhos, hamsters, porcos, cabras, primatas. As células podem ser obtidas a partir de uma multiplicidade de tipos de tecido e compreendem células primárias e linhas de células. Exemplos específicos incluem queratinócitos, leucócitos de sangue 27 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ periférico, células estaminais de medula óssea e células estaminais embrionárias. Noutras concretizações, a célula hospedeira é uma célula de apresentação de antigénio, em particular uma célula dendritica, um monócito ou um macrófago. Um ácido nucleico pode estar presente na célula hospedeira numa única cópia ou em várias cópias e, numa concretização, é expresso na célula hospedeira.
De acordo com o invento, um péptido ou proteína codificado por um ácido nucleico podem ser um péptido ou proteína que está localizado no citoplasma, no núcleo, na membrana, em organelos ou é segregado. Incluem proteínas estruturais, proteínas reguladoras, hormonas, neurotransmissores, factores de regulação do crescimento, factores de diferenciação, factores de regulação da expressão génica, proteínas associadas a ADN, enzimas, proteínas de soro, receptores, medicamentos, imunomoduladores, oncogenes, toxinas, antigénios de tumor ou antigénios. Os péptidos ou proteínas podem ter uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência mutada de modo a melhorar, inibir, regular ou eliminar a sua actividade biológica. 0 termo "péptido" refere-se a substâncias que compreendem dois ou mais, preferivelmente 3 ou mais preferivelmente 4 ou mais, preferivelmente 6 ou mais preferivelmente 8 ou mais, preferivelmente 10 ou mais preferivelmente 13 ou mais, preferivelmente 16 ou mais preferivelmente 20 ou mais, e até preferivelmente : 50 preferivelmente 100 ou preferivelmente 150, aminoácidos consecutivos ligados uns aos outros através de ligações peptídicas. O termo "proteína" refere-se a péptidos grandes, preferivelmente péptidos possuindo pelo menos 151 aminoácidos, mas os termos "péptido" e "proteína" são aqui empregues usualmente como sinónimos. Os termos "péptido" e "proteína" compreendem de acordo com o invento substâncias que contêm não apenas componentes aminoácido mas também componentes não aminoácido tais como açúcares e estruturas de fosfato, e também compreendem substâncias contendo ligações tais como ligações éster, tioéter ou dissulfureto. 28
ΕΡ 2 357 23Ο/PT Ο invento proporciona ácidos nucleicos, em particular ARN, para serem administrados a um paciente. Numa concretização, os ácidos nucleicos são administrados por métodos ex vivo, i.e. retirando células de um paciente, modificando geneticamente as referidas células e reintroduzindo as células modificadas no paciente. São conhecidos do técnico competente métodos de transfecção e transdução. 0 invento proporciona também ácidos nucleicos para serem administrados in vivo.
De acordo com o invento, o termo "transfecção" refere-se à introdução de um ou mais ácidos nucleicos num organismo ou numa célula hospedeira. Podem ser utilizados vários métodos de acordo com o invento de modo a introduzir ácidos nucleicos em células in vitro ou in vivo. Estes métodos incluem transfecção de precipitados de ácido nucleico-CaP04, transfecção de ácidos nucleicos associados a DEAE, transfecção ou infecção com vírus portadores dos ácidos nucleicos de interesse, transfecção mediada por lipossomas, e outros. Em concretizações particulares, é dada preferência a direccionar o ácido nucleico a células particulares. Nestas concretizações, um transportador utilizado para administrar um ácido nucleico a uma célula (e.g. um retrovírus ou um lipossoma) pode ter uma molécula de direccionamento ligada. Por exemplo, uma molécula tal como um anticorpo específico de uma proteína de membrana de superfície sobre a célula visada, ou um ligando para um receptor sobre a célula alvo podem ser incorporados ou ligados ao transportador de ácido nucleico. Se é desejada a administração de um ácido nucleico por lipossomas, podem ser incorporadas na formulação de lipossoma proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície associada a endocitose de modo a possibilitar o direccionamento e/ou absorção. Estas proteínas incluem proteínas de capsídeo ou seus fragmentos que são específicas de um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que são internalizadas, proteínas dirigidas a um local intracelular, e outras. "Repórter" refere-se a uma molécula, tipicamente um péptido ou proteína, que é codificado por um gene repórter e medido num ensaio de repórter. Sistemas convencionais 29 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ empregam usualmente em repórter enzimático e medem a actividade do referido repórter. 0 termo "local de clonagem múltiplo" refere-se a uma região de ácido nucleico contendo locais de enzima de restrição, qualquer um dos quais pode ser utilizado para clivagem, por exemplo, de um vector e inserção de um ácido nucleico.
De acordo com o invento, dois elementos tais como nucleótidos ou aminoácidos são consecutivos, se estiverem directamente adjacentes um ao outro, sem qualquer interrupção. Por exemplo, uma sequência de x nucleótidos N consecutivos refere-se à sequência (N)x. "Endonuclease de restrição" ou "enzima de restrição" refere-se a uma classe de enzimas que clivam ligações fosfodiéster em ambas as cadeias de uma molécula de ADN em sequências de bases especificas. Reconhecem locais de ligação específicos, referidos como sequências de reconhecimento, numa molécula de ADN de cadeia dupla. Os locais nos quais as referidas ligações fosfodiéster no ADN são clivadas pelas referidas enzimas são referidos como locais de clivagem. No caso de enzimas do tipo IIS, o local de clivagem está localizado a uma distância definida do local de ligação de ADN. De acordo com o invento, o termo "endonuclease de restrição" compreende, por exemplo, as enzimas SapI, Ecil, Bpil, AarI, Alol, Bael, BbvCI, Ppil e Psr I, BsrDl, Btsl, EarI, Bmrl, Bsal, BsmBI, Faul, Bbsl, BciVI, BfuAI, BspMI, BseRI, Ecil, BtgZI, BpuEI, Bsgl, Mmel, CspCI, Bael, BsaMI, Mval269l, Pctl, Bse3DI, BseMI, Bst6l, Eamll04I, Ksp632l, Bfil, Bso31I, BspTNI, Eco31I, Esp3l, Bful, Acc36l, AarI, Eco57I, Eco57MI, Gsul, Alol, Hin4I, Ppil e Psrl. "Meia-vida" refere-se ao tempo requerido para eliminar metade da actividade, quantidade ou número de moléculas. 0 presente invento é descrito em detalhe pelas figuras e exemplos seguintes que deverão ser entendidos apenas como ilustração e não como limitação. Com base na descrição e nos exemplos, concretizações adicionais estão acessíveis ao 30 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ técnico competente e estão do mesmo modo dentro do âmbito do invento.
Figuras:
Fig. 1: Vectores básicos utilizados de acordo com o invento para clonagem adicional
Os vectores permitem a transcrição de ARN sob o controlo de um promotor de ARN-polimerase 5' e contêm uma cassete de poliadenilo.
Fig. 2: Linearização de vectores por enzimas de restrição do tipo II (e.g. Spel) em comparação com enzimas de restrição de tipo IIS (e.g. SapI)
Por introdução de um local de clivagem por restrição do tipo IIS, cuja sequência de reconhecimento está localizada a 3' da sequência poli(A), enquanto o local de clivagem está 24-26 pb a montante e assim localizado no interior da sequência poli (A) , é possível linearizar um plasmídeo no interior da sequência poli(A).
Fig. 3: Vectores preparados de acordo com o invento como modelos para transcrição in vitro
De modo a estudar os efeitos de modificações de ARN de acordo com o invento sobre o nível e duração de expressão, foram preparados vários vectores que serviram subsequentemente como modelos para transcrição in vitro. a. Vectores com sequência poli (A) mascarada versus não mascarada; b. Vectores com sequências de poli (A) de comprimento diferente; c. Vectores com região não traduzida a 3' de beta-globina humana; d. vectores SIINFEKL e pp65; Cap - capeamento 5'; eGFP - gene repórter de GFP; 3' g região não traduzida a 3' de -globina; A(x) - x refere-s ao número de nucleótidos A na sequência poli(A).
Fig. 4: Determinação do estado de maturação de células dendriticas imaturas versus maduras através dos marcadores de superfície indicados 0 efeito das modificações de ARN de acordo com o invento foi testado em células dendriticas humanas (DC), com um estimulo imunogénico despoletando um processo de 31
ΕΡ 2 357 23Ο/PT maturação de DC. As DC foram coradas com anticorpos anti-CD80, anti-CD83, anti-CD86 e anti-HLA-DR que reconhecem marcadores de maturação de DC específicos, e analisadas por citometria de fluxo.
Fig. 5: Influência da sequência poli(A) livre versus mascarada na eficiência de tradução e na estabilidade do transcrito a. Influência da sequência poli(A) livre versus mascarada na eficiência de tradução de ARN de eGFP em células K562 e células dendríticas através da determinação da intensidade de fluorescência média [MFI] em FACS-Kalibur; b. Influência da sequência poli(A) livre versus mascarada na estabilidade do transcrito de ARN de eGFP em células dendríticas imaturas após 48 h. Tanto na linha de células de tumor como em DC imaturas, o ARN com uma sequência poli (A) de extremidade aberta é traduzido mais eficientemente e durante um período mais longo do que ARN com uma sequência poli(A) de extremidade mascarada. A eficiência de tradução para uma sequência poli(A) de extremidade não mascarada em DC é aumentada por um factor de 1,5, com sequências poli (A) de comprimento igual. Para além disso, uma sequência poli(A) de extremidade aberta resulta em estabilidade de ARN mais elevada.
Fig. 6: Influência do comprimento da sequência poli(A) na eficiência de tradução e na estabilidade do transcrito a. Influência do comprimento da sequência poli(A) na eficiência de tradução de ARN de eGFP em células K562 e células dendríticas; b. Influência do comprimento da sequência poli(A) na eficiência de tradução de ARN de d2eGFP em células K562 e células dendríticas; c. Influência do comprimento da sequência poli(A) na estabilidade do transcrito de ARN de eGFP em células K562 48 h após electroporação. 0 prolongamento da sequência poli(A) até 120 nucleótidos A aumenta a estabilidade e a tradução do transcrito. Um prolongamento superior a este não tem qualquer efeito positivo. O prolongamento da sequência poli (A) de 51 para 120 nucleótidos A produz um aumento de 1,5 a 2 vezes na eficiência de tradução. Este efeito é também reflectido na estabilidade de ARN. 32 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
Fig. 7: Influência de uma região não traduzida a 3' de beta-globina humana (BgUTR) na eficiência de tradução em DC imaturas e maduras A introdução de uma região não traduzida a 3' de beta-globina humana resulta em expressão crescente do transcrito de ARN. Uma região não traduzida a 3' dupla de beta-globina humana melhora o nivel de expressão após 24 h, com o referido nivel excedendo nitidamente o efeito combinado de duas regiões não traduzidas a 3' individuais de beta-globina humana.
Fig. 8: Efeito das modificações combinadas de acordo com o invento na eficiência de tradução em DC imaturas e maduras A eficiência de tradução de eGFP em DC imaturas e maduras pode ser aumentada por um factor de mais de cinco combinando as modificações do transcrito de ARN descritas de acordo com o invento.
Fig. 9: Efeito das modificações combinadas de acordo com o invento na apresentação de péptidos por moléculas de MHC em células EL4 A utilização de construções de ARN modificadas de acordo com o invento resulta em apresentação melhorada de complexos de péptido-MHC sobre a superfície celular, devido a eficiência de tradução aumentada. Nos vectores IVT descritos, o eGFP foi substituído pelo epítopo OVA257-264 (SIINFEKL) e foram utilizadas células EL4 (murina, linfoma de células T) como células alvo para transfecção.
Fig. 10: Aumento de complexo de péptido específico de antigénio/MHC utilizando construções de ARN IVT estabilizadas de acordo com o invento
As células foram electroporadas com ARN Sec-SIINFEKL-A67-ACUAG ou com ARN Sec-SIINFEKL-2BgUTR-A120 (células EL4: 10 pmol, 50 pmol; BMDC imaturas de C57B1/J6 em triplicado; 150 pmol). Electroporação com tampão sozinho foi utilizada como controlo. As células foram coradas com anticorpos 25D1.16 em relação a complexos SIINFEKL/Kb. As concentrações de péptido SIINFEKL foram calculadas a partir dos valores de fluorescência média de células vivas, utilizando uma titulação de péptido como curva padrão. Os dados de BMDC são mostrados como médias de três experiências ± SEM. 33 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
Fig. 11: Efeito de construções de ARN IVT estabilizadas de acordo com o invento na estimulação de células T in vivo e in vitro (A) Expansão de células T in vivo melhorada por utilização de construções de ARN IVT estabilizadas. 1 x 105 células OT-I CD8+ TCR-transgénicas foram transferidas adoptivamente para ratinhos C57B1/J6. BMDC de ratinhos C57B1/J6 foram transfectadas com 50 pmol de ARN (Sec-SIINFEKL-A6 7-ACUAG, Sec-SIINFEKL-2BgUTR-Al2 0 OU ARN de controlo), amadurecidas com poli(I:C) (50 pg/ml) durante 16 h e injectadas i.p. um dia após transferência de células T (n=3). Colheu-se sangue periférico ao dia 4 e corou-se em relação a células T CD8+ positivas em tetrâmero. Os dot blots ilustram células T CD8+, e os números indicados representam a percentagem de células T CD8+ positivas em tetrâmero. (B) Expansão in vitro melhorada de células T contendo construções de ARN IVT estabilizadas. Linfócitos CD8+ e CD4+ a partir de dadores saudáveis seropositivos em HCMV foram co-cultivados com DC autólogas que tinham sido transfectadas com ARN Sec-pp65-A67-ACUAG, ARN Sec-pp652BgUTR-A120 ou ARN de controlo (dados não mostrados) ou pulsados com solução de péptido pp65 (1,75 pg/ml) como controlo positivo. Após expansão durante 7 dias, cada população de células efectoras (4 x 104/poço) foi ensaiada em IFN- -ELISpot com DC autólogas (3 x 104/poço) que tinham sido carregadas quer com solução de péptido pp65 quer com uma solução de péptido irrelevante (1,75 pg/ml). A representação gráfica ilustra o número médio de pontos de medições em triplicado ± SEM.
Exemplos:
Exemplo 1: Preparação de vectores e transcrição de ARN in vitro
De modo a estudar os efeitos das modificações de ARN de acordo com o invento no nível e duração da expressão, foram preparados vários vectores IVT que serviram como modelos para transcrição in vitro (Fig. 3).
Os genes repórter para eGFP e d2eGFP, duas moléculas com diferentes meias-vidas (HL), foram inseridos nos 34 ΕΡ 2 357 23Ο/PT vectores, possibilitando desse modo analisar a influência das modificações de ARN de acordo com o invento. A fluorescência diminui com uma HL média de 17,3 h para eGFP e 2 h para d2eGFP. Estas construções foram utilizadas para preparar ARN de eGFP e ARN de d2eGFP transcritos in vitro, respectivamente.
Exemplo 2: Transfecção de células com o ARN transcrito in vitro modificado de acordo com o invento e efeito na tradução e estabilidade de ARN
Utilizaram-se ARN de eGFP e ARN de d2eGFP para transfectar células K562 (humanas, leucemia) através de electroporação. A eficiência de transfecção foi >90% em células K562.
Isto foi seguido por ensaio da acção das modificações de ARN descritas em células dendriticas (DC) humanas que são os moduladores mais importantes do sistema imunitário. Esta abordagem é imunologicamente relevante porque DC transfectadas com ARN podem ser consideradas para vacinação. DC imaturas estão localizadas na pele e em órgãos periféricos. Ai estas estão num estado imaturo que é caracterizado por marcadores de superfície bem estudados e que se distingue funcionalmente por actividade endocitótica elevada. Um estímulo imunogénico tal como, por exemplo, uma infecção com patogénios desencadeia um processo de maturação de DC. Ao mesmo tempo, o referido estímulo inicia a migração de DC nos nódulos linfáticos regionais, onde as referidas DC são os indutores mais eficazes de respostas imunitárias de células T e células B. O estado maduro das referidas DC é também caracterizado por expressão de marcadores de superfície e citoquinas estudados em detalhe e por uma morfologia de DC característica. Existem sistemas de cultura de células estabelecidos para diferenciação de DC humanas imaturas a partir de monócitos de sangue. Estas podem ser feitas amadurecer por vários estímulos. A eficiência de transfecção em células dendriticas primárias foi 70-80%. As DC foram coradas com anticorpos anti-CD80, anti-CD83, anti-CD86 e anti-HLA-DR que reconhecem marcadores de maturação de DC específicos, e analisadas por citometria de fluxo (Fig. 4). ΕΡ 2 357 230/ΡΤ Ο nível e duração de expressão foram determinados com a ajuda de FACS-Kalibur através da determinação da intensidade de fluorescência de eGFP. A quantidade de ARN nas células foi determinada com a ajuda de RT-PCR quantitativa.
a. Efeito de uma sequência poli(A) de extremidade aberta na tradução e estabilidade de ARN A linha de células de tumor K562 e as DC imaturas (iDC) mostraram ambas traduzir ARN possuindo uma sequência poli(A) de extremidade aberta mais eficientemente e durante um periodo de tempo mais longo do que ARN possuindo uma sequência poli(A) de extremidade mascarada (Fig. 5a). A eficiência de tradução para uma sequência poli(A) de extremidade não mascarada em DC imaturas é aumentada por um factor de 1,5, com sequências poli(A) de igual comprimento. Além disso, a referida modificação resulta em estabilidade de ARN mais elevada (Fig. 5b) . Uma quantidade de ARN de 4 a 5 vezes pode ser detectada em DC imaturas que foram transfectadas com ARN possuindo uma sequência poli(A) não mascarada 48 h após electroporação.
b. Efeito do comprimento da sequência poli(A) na tradução e estabilidade de ARN A análise de ARN possuindo sequências de poli(A) de 16 pb, 42 pb, 51 pb, 67 pb, 120 pb, 200 pb, 300 pb e 600 pb de comprimento revelou que o prolongamento da sequência poli(A) até 120 nucleótidos A aumenta a estabilidade e a tradução do transcrito e que um prolongamento para além disso não tem qualquer efeito positivo. Este efeito é observado tanto em células K562 como em DC imaturas (iDC) (Fig. 6a e 6b). O prolongamento da sequência poli(A) de 51 para 120 nucleótidos A produz um aumento de 1,5 a 2 vezes em eficiência de tradução. Este efeito é também reflectido na estabilidade de ARN (Fig. 6c).
c. Efeito da ocorrência de uma região não traduzida a 3' na tradução e estabilidade de ARN
Uma análise em função do tempo com células K562 e DC imaturas confirmou que a introdução de uma região não 36 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ traduzida a 3' (UTR) de beta-globina humana resulta em expressão crescente de um transcrito de ARN. Adicionalmente, foi demonstrado que uma região não traduzida a 3' (UTR) dupla de beta-globina humana resulta num nível de expressão melhorado após 24 h, que nitidamente excede o efeito combinado de duas UTR individuais (Fig. 7).
d. Efeito de uma combinação das modificações acima descritas na tradução e estabilidade de ARN
De acordo com o invento, foi mostrado que uma combinação das modificações acima descritas num transcrito de ARN aumenta a eficiência de tradução de eGFP em DC imaturos e também em DC maduras por um factor superior a cinco (Fig. 8).
Exemplo 3: Apresentação de um péptido expresso através de transcrito de ARN in vitro com estabilidade e eficiência de tradução aumentadas por moléculas de MHC
De acordo com o invento, foi mostrado que a utilização de construções de ARN modificadas de acordo com o invento aumenta a apresentação de péptido-MHC sobre a superfície celular. Para este propósito, a sequência de ácido nucleico que codifica eGFP nos vectores IVT descritos foi substituída por uma sequência de ácido nucleico que codifica o epítopo OVA257-264 (SIINFEKL), e as construções foram comparadas umas com as outras. As células alvo utilizadas para transfecção foram células EL4 (murinas, linfoma de células T) .
De modo a quantificar péptidos SIINFEKL apresentados por moléculas de MHC, as células foram coradas com um anticorpo anti-H2-Kb-OVA257-264 em vários momentos no tempo após electroporação, e a intensidade de fluorescência de um anticorpo secundário foi determinada com a ajuda de FACS-Kalibur (Fig. 9).
Adicionalmente, o péptido SIINFEKL foi clonado no vector que reflectiu todas as optimizações (pSTl-Sec-SIINFEKL-2BgUTR-A120-Sapl) e num vector com características padrão (pSTl-Sec-SIINFEKL-A67-Spel). ARN IVT derivado de ambos os vectores foi electroporado em células EL4 e BMDC. 37 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
Complexos OVA-péptido/Kb foram encontrados sobre a superfície celular em números substancialmente mais elevados e foram mantidos durante um período de tempo mais longo após electroporação do ARN modificado de acordo com o invento, Sec-SIINFEKL-2-BgUTR-A12 0 (Fig. 10) .
Exemplo 4: Efeito de uma transfecção de células com ARN transcrito in vitro codificando um péptido a ser apresentado na expansão de células T especificas de antigénio
De modo a avaliar o efeito na capacidade estimuladora, utilizou-se OT-I-TCR gue tinha sido utilizada intensivamente nos antecedentes de C57BL/J6 (B6) de modo a detectar a apresentação por MHC classe I do péptido SIINFEKL. Células T CD8+ OT-I, gue são transgénicas no gue se refere ao receptor de células T (TCR) e gue reconhecem o péptido específico Kb SIINFEKL a partir de OVA de galinha (OVA257-264) , foram gentilmente fornecidas por H. Schild (Instituto de Imunologia, Universidade de Mainz, Alemanha).
Ao dia 0, os animais sofreram transferência adoptiva com células T CD8+ OT-I. Para este propósito, foram preparados esplenócitos a partir de ratinhos OT-I tg TCR e introduziram-se na veia caudal de ratinhos receptores C57BL/J6. O número de células foi ajustado a 1 x 105 células T CD8+ tg TCR. No dia seguinte, foram administradas i.p. aos ratinhos 1 x 106 BMDC de ratinhos C57BL/J6 que tinham sido electroporadas com 50 pmol de variantes de construção de ARN codificando SIINFEKL e tinham sido deixadas amadurecer por meio de poli(I:C) durante 16 horas. Ao dia 4, mediram-se as células T CD8+ OT-I no sangue periférico com o auxílio de tecnologia de tetrâmero. Para este propósito, amostras de sangue retro-orbital foram colhidas e coradas com anti-CD8 (Caltag Laboratories, Burlingame, USA) e tetrâmetro SIINFEKL (H-2Kb/SIINFEKL 257-264; Beckman Coulter, Fullerton, E.U.A.).
Constatou-se que a expansão in vivo de células T CD8 + transgénicas TCR específicas de antigénio é substancialmente melhorada quando se utiliza ARN Sec-SIINFEKL-2BgUTR-A120 para fornecer antigénio em comparação com ARN Sec-SIINFEKL-A67-ACUAG (Fig. 11A). 38 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ
De modo a avaliar se construções de ARN IVT estabilizadas para fornecimento de antigénio melhoravam também a estimulação de células T humanas especificas de antigénio, utilizou-se HCMV-pp65, o antigénio imunodominante de citomegalovirus de humano que é muitas vezes utilizado para validação de estimulação autóloga de reacções de células T poliepitópicas. Células T CD4+ e CD8+, que tinham sido purificadas a partir de dadores saudáveis seropositivos em HCMV por classificação celular magnética positiva por meio de micropérolas revestidas a anticorpo (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemanha), foram co-cultivadas com 2 x 105 DC autólogas que tinham sido electroporadas com as variantes de ARN IVT correspondentes que codificam pp65. Uma expansão de células T, medida ao dia 7 num ensaio IFN-ELISpot utilizando DC autólogas, que tinham sido pulsadas com um conjunto de péptidos sobrepostos cobrindo toda a sequência da proteína pp65, ou com uma proteína de controlo, demonstraram a superioridade de Secpp65-2BgUTR-A120, com os efeitos no que se refere à expansão de células T CD4+ sendo os mais pronunciados (Fig. 11B).
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Lisboa, 2014-06-30
Claims (10)
- ΕΡ 2 357 230/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico compreendendo no sentido de transcrição 5' -> 3': (a) um promotor; (b) uma sequência de ácido nucleico transcrevivel ou uma sequência de ácido nucleico para introduzir uma sequência de ácido nucleico transcrevivel; (c) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controlo do promotor (a), codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos no transcrito, e (d) uma sequência de reconhecimento para uma endonuclease de restrição do tipo IIS, onde a distância entre a sequência de ácido nucleico (c) e a sequência de reconhecimento (d) é escolhida de tal modo que o local de clivagem para a endonuclease de restrição do tipo IIS que se liga à sequência de reconhecimento está localizado no interior da sequência de ácido nucleico (c).
- 2. Molécula de ácido nucleico como reivindicada na reivindicação 1, onde as sequências de ácido nucleico (b) e (c) sob o controlo do promotor (a) podem ser transcritas num transcrito comum e onde no transcrito comum a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (c) é activa de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico transcrevivel (b).
- 3. Molécula de ácido nucleico como reivindicada na reivindicação 1 ou 2, onde a sequência de ácido nucleico (c), quando transcrita sob o controlo do promotor (a), codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 40, pelo menos 80, pelo menos 100, preferivelmente cerca de 120 nucleótidos A consecutivos no transcrito.
- 4. Molécula de ácido nucleico como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 3, onde, após clivagem, a molécula de ácido nucleico possui um nucleótido T na ! / 3 ΕΡ 2 357 230/ΡΤ extremidade da cadeia que serve como modelo para a sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, que é parte da sequência de nucleótidos que serve como modelo para a sequência de nucleótidos no transcrito de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos.
- 5. Molécula de ácido nucleico como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada por ser uma molécula circular fechada antes da clivagem e uma molécula linear após clivagem.
- 6. Molécula de ácido nucleico como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 5, onde a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição do tipo IIS está localizada a uma distância de 5-26, preferivelmente 24-26 pares de bases a jusante da extremidade 3' da sequência de ácido nucleico (c).
- 7. Molécula de ácido nucleico que pode ser obtida por linearização da molécula de ácido nucleico como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 6.
- 8. Método para transcrição in vitro de uma molécula de ARN seleccionada de modo a aumentar a sua estabilidade e/ou eficiência de tradução, compreendendo: (i) acoplamento de uma sequência de ácido nucleico (b) a qual, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico (a) que é transcrevivel na referida molécula de ARN, e (ii) transcrição in vitro do ácido nucleico obtido, caracterizado por o método compreender, antes da transcrição do ácido nucleico obtido, clivagem no interior da sequência de ácido nucleico (b) de um modo tal que a transcrição do ácido nucleico obtido desta maneira gera um transcrito que possui as sequências de ácido nucleico transcritas a partir da sequência de ácido nucleico (a), e uma sequência de nucleótidos 3' -terminal de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, onde o nucleótido 3' -terminal do referido transcrito é um nucleótido A da sequência de nucleótidos de ΕΡ 2 357 23Ο/PT 3 / 3 pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos e onde a clivagem é realizada com a ajuda de um local de clivagem por restrição para uma endonuclease de restrição do tipo IIS.
- 9. Método para tradução de uma molécula de ARNm seleccionada de modo a aumentar a sua expressão, compreendendo: (i) acoplamento de uma sequência de ácido nucleico (b) a qual, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, na extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico (a) que é transcrevivel na referida molécula de ARNm, e (ii) tradução do ARNm que pode ser obtido por transcrição, preferivelmente por transcrição in vitro, do ácido nucleico obtido, caracterizado por o método compreender, antes da transcrição do ácido nucleico obtido, clivagem no interior da sequência de ácido nucleico (b) de um modo tal que a transcrição do ácido nucleico obtido deste modo gera um transcrito que possui as sequências de ácido nucleico transcritas a partir da sequência de ácido nucleico (a) , e uma sequência de nucleótidos 3'-terminal de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, onde o nucleótido 3'-terminal do referido transcrito é um nucleótido A da sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos, e onde a clivagem é realizada com a ajuda de um local de clivagem por restrição para uma endonuclease de restrição do tipo IIS.
- 10. Método como reivindicado na reivindicação 8 ou 9, onde a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição do tipo IIS está localizada a uma distância de 5-26 pares de bases, preferivelmente 24-26 pares de bases, a jusante da extremidade 3' da sequência de ácido nucleico que, quando transcrita, codifica uma sequência de nucleótidos de pelo menos 20 nucleótidos A consecutivos. Lisboa, 2014-06-30
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