CN106061466A - 瘦蛋白mRNA组合物和制剂 - Google Patents

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Abstract

包含修饰的合成信使RNA和递送剂的制剂。修饰的合成信使RNA编码瘦蛋白蛋白质，是不复制的并且是翻译‑准备好的。可以向患有先天性瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平是低的其它病况的受试者递送制剂。

Description

瘦蛋白mRNA组合物和制剂
本发明领域
本发明一般地涉及影响生命或身体吃的多核苷酸组合物，并且具体地涉及通过向受试者施用编码人瘦蛋白蛋白质的修饰的、合成的、非复制的信使核糖核酸(mRNA)来治疗患有先天的瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平低的其它病况的受试者。
发明背景
瘦蛋白是由白色脂肪组织生产并且分泌到个体的循环系统中的激素。循环的瘦蛋白进入个体的大脑，在那里它与瘦蛋白受体结合而通过激活几个信号转导级联来调节食欲(饱食的感觉)、能量代谢和神经内分泌的功能。
先天性瘦蛋白缺乏是由瘦蛋白基因的突变所引起的。患有先天性瘦蛋白缺乏的个体贪得无厌地吃并且变成病态地肥胖的，遭受肥胖的结果，包括性腺机能减退和糖尿病。患有引起一般化的脂肪代谢障碍(接近完全的缺少脂肪组织)的瘦蛋白突变或单基因突变的个体也具有不足的瘦蛋白水平。这些患有脂肪代谢障碍和低瘦蛋白水平的个体是瘦的，但是发展饮食过多、严重的脂质异常和糖尿病。
采用重组的瘦蛋白蛋白质治疗逆转这些效果。Licinio J等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(13):4531-6显示在遵照瘦蛋白蛋白质治疗的缺乏瘦蛋白的肥胖成人中重量减轻。用美曲普汀(metreleptin)(重组瘦蛋白蛋白质)以皮下方式治疗患者持续18个月，导致增加的物理活动、II型糖尿病和性腺机能减退两者的解决和体重指数的减小。Ebihara K等人(2007)J.Clin.Endocrinol.Metab.92 532–541在患有一般化脂肪代谢障碍的患者中显示:采用美曲普汀通过每日注射两次治疗40个月在1个星期之内开始改善了空腹葡萄糖和甘油三酯水平。瘦蛋白替代疗法减小了胰岛素抗性并且增加了胰岛素分泌。美曲普汀疗法对糖尿病和脂肪代谢障碍并发症有益处。Chan JL等人(2011)Endocr.Pract.17(6):922-932显示:美曲普汀疗法使在脂肪代谢障碍患者中的代谢异常正常化。特别地，Chan等人(2011)显示:在贯穿3年的治疗期间，美曲普汀疗法减小血红蛋白A1c和甘油三酯水平。
然而，瘦蛋白蛋白质难以生产并且具有短的半衰期、需要每日皮下(SC)给药一次或两次。因此，在本领域中存在着对于通过把瘦蛋白给药方案从每日两次减少到每几天一次或甚至更小的频度而改善患者护理标准的需要。
发明概述
本发明提供可用于矫正受试者瘦蛋白缺乏的制剂。该制剂可以有利地每几天施用给受试者一次，在体内以最低的免疫活化并且以瘦蛋白蛋白质的受控表达。
所述制剂的一种组分是修饰的合成瘦蛋白信使核糖核酸(mRNA)。对mRNA的修饰提供改善的mRNA稳定性和减小的免疫原性。修饰的合成瘦蛋白mRNA的合成可以借助于包括体外转录在内的几种方法中的任何一种。在一种实施方式中，在瘦蛋白mRNA的体外转录期间，通过采用假尿嘧啶核苷(Ψ)取代瘦蛋白mRNA中的尿嘧啶核苷而在其合成期间修饰瘦蛋白mRNA。在具体的实施方式中，瘦蛋白mRNA中所有的尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代。
在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白具有在自然界中发现的编码序列。在备选的实施方式中，修饰的合成瘦蛋白具有密码子优化的编码序列。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白具有编码序列，其编码在功能上与天然人瘦蛋白蛋白质等同的蛋白质。
制剂的另一种组分是递送剂。在一种实施方式中，递送剂是脂质纳米微粒。在一种实施方式中，阳离子脂质纳米微粒包括:(i)用于包裹和用于内体脱逸的阳离子脂质，(ii)用于稳定化的中性脂质，(iii)也用于稳定化的辅助脂质，和(iv)防止聚集的隐型脂质(stealth lipid)。在更具体的实施方式中，阳离子脂质可以是阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C或阳离子脂质D；辅助脂质是胆固醇；并且隐型脂质是聚乙二醇(PEG)脂质(“脂质化的PEG”)。在另一种实施方式中，把改善的脂质纳米微粒用作递送剂来在个体的细胞中提供改善的瘦蛋白蛋白质的表达以及在个体的循环中提供增加的瘦蛋白。在另一种实施方式中，辅助脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在又一种实施方式中，隐型脂质是S024(进一步在本文中描述)。在另一种实施方式中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比率在3:1和8:1之间。
本发明也提供向患有瘦蛋白缺乏的受试者施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的方法。受试者可具有病况，例如先天性和获得性一般化脂肪代谢障碍(其中具有非常低的瘦蛋白水平、获得性HIV脂肪代谢障碍(其中具有低的瘦蛋白水平)、下丘脑性闭经或肥胖(特别地，患有减少瘦蛋白水平的那些受试者)。可以向受试者体内或向器官或组织离体施用修饰的合成瘦蛋白mRNA以在器官中或在脂肪组织中诱导瘦蛋白蛋白质的外源性表达。因此，可以以最低的癌症风险把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂用于类似于基因疗法的目的，因为不能在哺乳动物细胞中逆转录mRNA而产生可能形成染色体插入风险的DNA拷贝。
在一种实施方式中，以静脉内方式向个体施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在另一种实施方式中，以皮下方式施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在又一种实施方式中，首先以静脉内方式施用，然后以皮下方式施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。可以以重复的剂量施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在一种实施方式中，以至少0.2mg瘦蛋白mRNA/kg受试者的体重的剂量递送本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在另一种实施方式中，以至少0.6mg瘦蛋白mRNA/kg受试者的体重的剂量递送本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。
本发明具有几个优点。所述优点中的一个是可以以比施用瘦蛋白蛋白质所需要的给药(它是每日皮下给药一次或两次)更小的频度，向个体给药制剂。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的施用可以是每三天一次。在另一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的施用可以是每个星期一次。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA被包裹在脂质纳米微粒复合体中，其向个体提供低的免疫原性。在另一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA被有利地包裹在可生物降解的递送剂中。
所述优点中的一个是向受试者施用制剂，递送足以在体内导致药学上活性的瘦蛋白水平的修饰的合成瘦蛋白mRNA。正如本文中描述的那样，已经测定了用于抑制食物摄取的本发明修饰的合成瘦蛋白在血浆中的EC50浓度值为1.4ng/mL(85pM)。在一种实施方式中，向受试者施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂，使得施用导致瘦蛋白蛋白质的血浆浓度为至少2.8ng/毫升，该值是用于减少缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠体重的人瘦蛋白蛋白质浓度的EC50的两倍。在另一种实施方式中，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂导致1.4ng/mL的瘦蛋白蛋白质的血浆浓度。在又一种实施方式中，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂导致185ng/mL的血浆浓度。在另一种实施方式中，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂导致1300ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度。在一种实施方式中，以足以使血浆瘦蛋白蛋白质浓度至少比施用以前受试者的基线瘦蛋白蛋白质浓度高10ng/mL的数量，向受试者施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。
本发明给被施用了本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的受试者提供了几种了可测量的益处。递送本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂诱导剂量依赖性的食物摄取和体重的减少。递送本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂改善了肥胖症和糖尿病。在一种实施方式中，施用导致血浆葡萄糖的浓度减少至少30％。在一种实施方式中，本发明瘦蛋白mRNA的施用导致血浆甘油三酯的浓度减少至少40％。
向瘦的受试者施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA，导致在循环中的瘦蛋白蛋白质水平比向肥胖的受试者施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的更低。这些结果显示本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂具有用于治疗肥胖的受试者的优点。
附图的简要描述
图1显示用于配制体内递送修饰的合成人瘦蛋白mRNA的阳离子脂质(阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C和阳离子脂质D)的化学结构。
图2是显示施用采用阳离子脂质A配制在脂质纳米微粒中的人瘦蛋白mRNA，因为短暂地恢复瘦蛋白蛋白质表达而特异性地并且短暂地逆转缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠的肥胖和饮食过量表型的一组图。以0.2mg的mRNA/千克小鼠体重(mg/kg，mpk)，以静脉内方式向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用采用阳离子脂质A配制的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或编码人瘦蛋白(hLeptin或hLep)(SEQ ID NO:4)或小鼠红细胞生成素(mEPO)(SEQ ID NO:12)的mRNA。图2A-C合起来显示与PBS和mEPO mRNA对照相比，人瘦蛋白mRNA引起体重减少(图2A)，该体重减少与食物摄取的减少(图2B)和人瘦蛋白蛋白质的表达(图2C)相关。图2A是显示被包裹在阳离子脂质A中并且以静脉内方式施用的人瘦蛋白mRNA(hLeptin)对于体重的特异性作用的一组线状图。有关进一步的细节参见实施例9。图2B是显示被包裹在阳离子脂质A中并且以静脉内方式施用的人瘦蛋白mRNA对于食物摄取的特异性影响的一组柱状图。有关进一步的细节参见实施例9。图2C是显示在施用包裹在阳离子脂质A中并且以静脉内方式施用的人瘦蛋白mRNA之后，人瘦蛋白蛋白质(Leptin)的表达水平的线状图。有关进一步的细节参见实施例10。在接受mEPO mRNA(6小时54,582pg/mL)的小鼠中，mEPO蛋白质表达是高的，证实了mEPO mRNA的递送。
图3是显示施用采用阳离子脂质B配制在脂质纳米微粒中的人瘦蛋白mRNA，因为短暂地恢复瘦蛋白蛋白质的表达而特异性地并且短暂地逆转缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠的肥胖和饮食过量表型的一组图。以静脉内方式向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用采用阳离子脂质B配制的磷酸缓冲的盐水(PBS)或人瘦蛋白mRNA(hLeptin)(SEQ ID NO:4)或小鼠红细胞生成素(mEPO)(SEQ ID NO:12)。以0.02、0.06和0.2mg/kg体重(mg/kg；mpk)施用人瘦蛋白mRNA。在平行研究中，以0.2mpk施用小鼠红细胞生成素mRNA。结果显示:与PBS相比，人瘦蛋白mRNA引起体重减少(图3A)，该体重减少与食物摄取的减少(图3B)和人瘦蛋白蛋白质的表达(图3C)相关。图3A是显示包裹在阳离子脂质B中并且以静脉内方式施用的不同数量的人瘦蛋白mRNA(hLeptin)对于体重的特异性影响的一组线状图。有关进一步的细节参见实施例11。图3B是显示包裹在阳离子脂质B中并且以静脉内方式施用的不同的数量的人瘦蛋白mRNA(hLeptin)对于食物摄取的特异性影响的一组柱状图(图3B)。有关进一步的细节参见实施例11。图3C是显示在施用包裹在阳离子脂质B中并且以静脉内方式施用的0.6mpk人瘦蛋白mRNA之后，人瘦蛋白蛋白质(Leptin)的表达水平的柱状图。关于进一步的细节，参见实施例12。图3D是显示在小鼠中施用小鼠红细胞生成素mRNA(mEPO)没有引起体重减少的线状图。施用人瘦蛋白mRNA对于减少体重的效力是特异性的。有关进一步的细节，参见实施例15。在接受mEPO mRNA(6小时892,633pg/mL)的小鼠中，mEPO蛋白质的表达是高的，证实了mEPOmRNA的递送。
图4是显示施用采用阳离子脂质C配制的人瘦蛋白mRNA，因为短暂地恢复瘦蛋白蛋白质的表达而特异性地并且短暂地逆转缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠的肥胖和饮食过量表型的一组图。以静脉内方式向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用采用阳离子脂质C配制在脂质微粒中的PBS或人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)或小鼠红细胞生成素(mEPO)(SEQ ID NO:12)。以0.02、0.06和0.2mpk施用人瘦蛋白mRNA。在平行研究中，以0.2mpk施用mEPO mRNA。结果显示:与PBS相比，人瘦蛋白mRNA引起体重减少(图4A)，该体重减少与食物摄取的减少(图4B)和人瘦蛋白蛋白质的表达(图4C)相关。图4A是显示包裹在阳离子脂质C中的人瘦蛋白mRNA对于体重的特异性影响的一组线状图。有关进一步的细节参见实施例13。图4B是显示包裹在阳离子脂质C中的人瘦蛋白mRNA对于食物摄取的特异性影响的一组柱状图。有关进一步的细节参见实施例13。图4C是显示在施用包裹在阳离子脂质C中的人瘦蛋白mRNA之后，人瘦蛋白蛋白质的表达水平的柱状图。关于进一步的细节，参见实施例14。图4D是显示在小鼠中施用小鼠红细胞生成素mRNA(mEPO)没有引起体重减少的线状图。施用人瘦蛋白mRNA对于减少体重的效力是特异性的。有关进一步的细节，参见实施例15。在接受mEPO mRNA(6小时158,865pg/mL)的小鼠中，mEPO蛋白质的表达是高的，证实了mEPO mRNA的递送。
图5是显示在向瘦的小鼠静脉内(IV)对比皮下(SC)递送配制在阳离子脂质A中的瘦蛋白mRNA之后，血浆瘦蛋白蛋白质水平的线状图。有关进一步的细节，参见实施例7(IV)和实施例8(SC)。有效浓度相当于在实施例1中所示的用于抑制缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠中食物摄取的EC50。
图6是显示用于改善方法A的包裹设置的一组图。有关进一步的细节，参见实施例34。关于改善方法A的附加信息，也参见实施例5。
图7是显示用于改善方法B的包裹设置的一组图。图7A显示用于改善方法B的包裹设置。图7B显示用于方法B的两个注射器泵上的注射器的设置。图7C显示用于改善方法B的第二种稀释设置。有关进一步的细节，参见实施例35。
本发明的详细说明
引言
在本文中公开了修饰的合成瘦蛋白mRNA的组合物及其生产方法。本发明组合物和方法不包括基于外源性DNA或病毒载体的用于瘦蛋白蛋白质表达的方法，因此没有引起基因组的永久修饰或没有关于非故意的诱变效果的可能性。本发明组合物、制剂和方法基于把在体外合成的RNA直接引入细胞中，当其在体外或在体内翻译时，提供所要的瘦蛋白蛋白质。
修饰本发明合成瘦蛋白mRNA的一个目标是减小免疫原性。较高级的真核细胞对于外来的、"非自我的"RNA具有细胞防御。这些防御引起对细胞的蛋白质合成的全局性抑制，导致细胞毒性。细胞防御正常地把在体外合成的RNA看成是外来的，并且诱导该细胞先天的免疫反应。在本文中描述的方法中，通过使用以避免或减小反应的方式修饰的合成的RNA，细胞的先天的免疫反应的效果被减轻了。避免或减小先天的免疫反应允许来自外源地引入RNA的持续表达。在一个方面中，通过重复引入本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA实现持续的表达。
Kariko等人的美国专利号8,278,036公开了有尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷(Ψ)取代的mRNA分子、合成该mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白质的方法。专利公开了能够通过所述公开的方法生产的许多mRNA。也参见Kariko K等人(2007)CurrentOpinion in Drug Discovery and Development 10(5):523-532；Kariko K等人(2008)Molecular Therapy 16(11)，1833–1840和Anderson BR等人(2010)Nucleic Acids Res.38(17):5884-5892。
本发明提供关于在静脉内和皮下递送以后，包裹在新的脂质纳米微粒复合体中的瘦蛋白mRNA的体内效力数据和关于瘦蛋白蛋白质表达的体内测试数据。
定义
"以共转录方式添加的"是指在RNA分子的转录期间，向本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA添加特征，例如5'二鸟苷帽或其它修饰的核苷或核苷酸(即在添加5'帽之前，修饰的RNA没有被完全转录)。
“可生物降解的”意指材料在受试者的身体内分解并且失去它的化学的身份。可生物降解的脂质是与大多数脂质相比，在体内被迅速地清除的脂质。在体内施用之后，在组织暴露的峰值之后，可生物降解的脂质部分迅速地消失。可以通过以药物动力学方式，以在肝脏中的半衰期来测定清除。参见国际专利申请号WO 2011/153493。为了避免用来除去它们或逐渐地释放药物的二次操作，可生物降解的聚合物可以是被用于医疗设备的类型的聚合物。
“编码区(CDS)”或“编码序列”是信使RNA(mRNA)的一部分，其编码多肽，例如蛋白质。编码区典型地以AUG密码子为起点并且以一种或更多种终止密码子终止。在本文中描述了几种示例性的密码子区。在本文中也描述了用于测定其它编码区的方法。真核生物的信使RNA包含对把编码区中的信息翻译成多肽有用的但是它们自身不是编码区的其它部分。在本文中进一步描述了这样的信使RNA的其它部分。正如本文中所用的那样，术语“开放阅读框(ORF)”也被用于描述编码区或编码序列。
"接触"细胞是指使细胞在体内或在体外与本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA或其制剂接触。当这样的细胞在体内时，使细胞与本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA接触包括:通过适当的施用途径，以制剂形式向受试者施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA，使得化合物与细胞在体内接触。
“保守的”核苷酸或氨基酸分别是多核苷酸序列或多肽序列，其在被比较的两个或更多个序列的相同的位置不发生改变。相对地保守的核苷酸或氨基酸是与出现在序列中别处的核苷酸或氨基酸相比，在更相关的序列中间保守的那些核苷酸或氨基酸。两个或更多个序列是"完全地保守的"，如果它们彼此是100％相同的。在一些实施方式中两个或更多个序列是"高度地保守的"，如果它们彼此至少是90％相同的。在一些实施方式中，两种或更多种碱基是“保守的"，如果它们彼此是相同的。序列的保守可以应用于寡核苷酸或多肽的整个长度或可以应用于其一部分、区或特征。
“递送"是指递送化合物、物质、实体、部分、负荷或有效负载的行为或方式。"递送剂”是促进，至少部分地促进体内的核酸分子向细胞递送的任何物质。
“缺失”是其中一部分DNA消失或被除掉的突变。
“可检测的标记"意指容易通过包括射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光率等等在内的本领域中已知的方法检测的与另一种实体(例如RNA或蛋白质)连接、合并或有联系的一种或更多种标记、信号或部分。可检测的标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素和半抗原)、量子点等等。可检测的标记可以位于在本文中公开的RNA或蛋白质中的任何位置。
"给药方案"是施用计划或医师确定的治疗、预防或减轻性护理的方案。
“外源的”核酸是通过涉及人的干预的方法被引入生物系统(例如细胞或有机体)中的核酸(例如本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA)，正常地没有在该生物系统发现该核酸或在该生物系统中发现较低数量的该核酸。因子(例如本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA)是外源的，如果它被引入直接的前体细胞或继承物质的后代细胞中。相比之下，“内源的”是生物系统或细胞天然的因子或表达产物(例如基因的内源的表达)。.
“表达”是涉及生产RNA和蛋白质并且视情况而定分泌蛋白质的细胞过程，包括转录、翻译、折叠、修饰和加工。核酸序列的“表达”是指一个或多个下列事件:(i)从DNA序列生产RNA模板(例如通过转录)；(ii)RNA转录本的加工(例如通过剪接、编辑、5'帽形成或3'端加工)；(iii)把RNA翻译成多肽或蛋白质；和(iv)多肽或蛋白质的翻译后修饰。“表达产物”或“基因产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA的翻译得到的多肽。
“移码”是由来自DNA序列的不是均匀地被三整除的一些核苷酸的插入或缺失所引起的突变。由于依据密码子的基因表达的三联体本性，插入或缺失可能改变读框(密码子的分组)，导致完全不同于正本的翻译。这经常产生截短的蛋白质，导致功能损失。
"同源性”是指在核酸分子(例如DNA分子或RNA分子)之间或在多肽分子之间的总体相关性。术语“同源的”必要地是指在至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
“同一性"是指在聚合物分子之间，例如在寡核苷酸分子(例如DNA分子或RNA分子)之间或在多肽分子之间的总体相关性。两个多核苷酸序列的同一性百分数的计算例如可以通过用于最佳的比较目的的比对两个序列来进行(例如可以在第一和第二核酸序列中的一条或两条中引入缺口用于最佳的比对，并且为了比较目的可以忽视非相同的序列)。然后比较处于相应的核苷酸位置的核苷酸。当在所述第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则两个分子在那个位置是相同的。在两条序列之间的同一性％是两条序列共享的相同位置数目的函数，其考虑需要被引入用于两条序列的最佳比对的缺口的数目和每个缺口的长度。可以使用数学算法来完成在两条序列之间的序列比较和同一性％的测定。例如，可以使用方法，例如由国家生物技术信息中心(the National Centerfor Biotechnology Information)描述的那些方法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)来测定两条核苷酸序列之间的同一性％。例如，可以使用Clustal 2.0多序列比对程序测定两条核苷酸序列之间的同一性％。Larkin MA等人(2007)“Clustal@_和Clustal X版本2.0.”Bioinformatics 23(21):2947-2948。
“先天的免疫应答”或“干扰素应答"意指由细胞对被外来的有机体(例如病毒或细菌或这样的有机体的产物，例如在受试者中产生的缺乏RNA的修饰特征的RNA)感染的识别的响应而启动的细胞防御反应。先天的免疫应答通过诱导检测外源的核酸的细胞死亡来防止病毒和细菌的感染。Kariko等人的美国专利号8,278,036提供了关于“先天的免疫应答”或"干扰素应答"的描述。
“分离的细胞"是已经被从最初发现的有机体中移出的细胞，或这样的细胞的后代。任选地细胞已经被体外培养，例如在其它细胞存在下。任选地，细胞后来被引入第二有机体或重新被引入从中分离它(或自其传代的细胞或细胞群)的有机体。
“插入”是其中额外的碱基对被插入DNA中的位置的突变。
“瘦蛋白”是大约16kDa的蛋白质，其在受试者中参与调节能量吸收和消耗，包括食欲和饥饿、代谢作用和行为。正如本文中所用的那样，术语“瘦蛋白”包括可以起瘦蛋白蛋白质作用的任何蛋白质，正如通过在体内的功能或在体外的功能测定的那样，例如通过与人瘦蛋白受体(LEPR、CD295)在功能上的结合来测定。术语“人瘦蛋白”包括具有蛋白质登录#_NP_000221的序列(SEQ.ID NO:3)的天然的人瘦蛋白(LEP)和起人瘦蛋白蛋白质作用的人瘦蛋白的任何变体。哺乳动物非人瘦蛋白多肽一般具有与人瘦蛋白67％或更大的同一性。Doyon C等人(2001)“Molecular Evolution of Leptin.”Gen.and Comp.Endocrinol.124:188-198；Denver RJ等人(2011)“Evolution of Leptin Structure and Function.”Neuroendocrinol.94:21 38。术语“瘦蛋白”也包括美曲普汀，人瘦蛋白的合成类似物，它的用途被Licinio等人(2004)、Ebihara K等人(2007)和Chan等人(2011)描述了。术语“瘦蛋白”也包括具有人瘦蛋白的功能特征的任何硬骨鱼或两栖动物瘦蛋白直向同源物。例如非洲爪蟾属瘦蛋白激活在细胞上表达的人瘦蛋白受体。Hen G等人(2008)“Monitoringleptin activity using the chicken leptin receptor.”J.Endocrinol.197:325-333。
"修饰的"意指本发明的分子的改变的状态或结构。"修饰的”mRNA包括相对于标准的鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶核苷(C)和尿嘧啶核苷(U)核苷，包含修饰的核糖核苷。非标准的核苷可以是天然发生的或非天然发生的。通过本领域技术人员已知的方法，可以以包括在化学上、在结构上和在功能上在内的许多方式修饰RNA。这样的RNA修饰可以包括例如正常地在转录以后，向哺乳动物细胞mRNA引入的修饰。而且，通过在天然的和非天然的核苷或核苷酸的转录期间的引入可以修饰mRNA分子，正如在Kariko等人的美国专利号8,278,036和Schrum的美国专利申请号2013/0102034、de Fougerolles等人的美国专利申请号2013/0115272和de Fougerolles等人的美国专利申请号2013/0123481中描述的那样。修饰的，因为它涉及本发明修饰的合成瘦蛋白，它也可以是指与野生型人瘦蛋白编码序列不同的任何改变。
"患者"是可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或处于受过训练的针对特殊的疾病或病况的专业人员护理之下的受试者。
短语"药学上可接受的"是指在健全的医学裁判的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物或剂型。
"药学上可接受的盐"是本发明化合物的衍生物，其中通过把存在的酸或碱部分转变为它的盐形式而修饰了亲本化合物。药学上可接受的盐的实例包括但是不局限于碱性的残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性的残基(例如羧酸)的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括形成的亲本化合物的常规的无毒的盐，例如从无毒的无机或有机酸形成的亲本化合物的常规的无毒的盐。通过常规的化学方法，可以从包含碱性的或酸性的部分的亲本化合物合成药学上可接受的盐。一般来说，可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量数量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备这样的盐。合适的盐的名单在Allen LV等人编辑的Remington's The Science andPractice of Pharmacy，第22版(20012)，Pharmaceutical Press和Journal ofPharmaceutical Science(1977)66，2中找到。
“引物”是短的核酸序列。聚合酶链式反应(PCR)的引物典型地是用于聚合酶链式反应中的具有相当短的长度的寡核苷酸(例如8-30个核苷酸)。利用来自目标序列的序列信息，本领域技术人员可以容易地开发和生产PCR引物和杂交探针。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press。
“探针”(寡核苷酸探针)是核酸分子，其典型地大小在长度从大约50-100个核苷酸至几百个核苷酸至几千个核苷酸的范围。因此，探针可以是用于在本文中描述的测定中的任何合适的长度的，包括以整数增加的在50到几千个核苷酸范围内的任何长度。这样的分子典型地被用于通过在严格杂交条件下与特定的核酸序列杂交来鉴定样品中特定的核酸序列。杂交条件是本领域中已知的。参见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press。
"减小的细胞毒性"是指在重复地与本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA接触的细胞培养中，细胞的死亡少于50％，例如相比于与具有相同的序列但是缺乏对RNA的修饰的RNA分子接触。可以通过利用例如TUNEL测定测量细胞程序死亡来评定减少的细胞毒性。其它有用的用于测定"减少的细胞毒性"的量度包括例如基于流式细胞术和珠子的生存能力、细胞生长或细胞构成的测量(例如通过血球计显微和定量测量的)。
"重复的施用"是向受试者施用许多次(例如不止一次或至少两次)。在一些实施方式中，在给定的时间期间，施用的频度每24-48小时或更长发生一次。频度也可以改变，使得每次给药之间的间隔是不同的(例如第一间隔36个小时，第二间隔48个小时，第三间隔72个小时等等)。
“核糖核酸(RNA)多核苷酸”是核糖核苷酸的聚合物，正如生物学和化学领域的技术人员已知的那样。RNA分子中的每个核苷酸包含核糖，其具有编号1'至5'的碳。碱基被连接到1'位置。一般说来，碱基是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，虽然许多修饰对于本领域技术人员来说是已知的。例如，正如本文中描述的那样，RNA可以包含一种或更多种假尿嘧啶(Ψ)碱基，使得假尿嘧啶核苷核苷酸取代了尿嘧啶核苷核苷酸。正如本文中描述的那样，许多其它的RNA修饰是本领域技术人员已知的。在所述种类的RNA之中有“信使核糖核酸(mRNA)”，其在本质上起着将遗传信息从DNA传送到核糖体的作用，在核糖体中它们通过被称为转录的过程指定基因表达的蛋白质产物的氨基酸顺序。在结构上和在信息上，信使RNA在编码区中为蛋白质编码信息，正如生物学的领域的技术人员已知的那样。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLabs Press。
“样品"是它的组织、细胞或组分部分的子集(例如体液)。样品进一步可以包括从整体有机体或它的组织、细胞或组分部分的子集制备的匀浆、裂解物或提取物或其级分或部分，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部部分、眼泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官。样品进一步是指可能包含细胞组分(例如蛋白质或核酸分子)的培养基，例如营养肉汤或凝胶。"测试样品"或"患者样品"意指包含细胞或已经从细胞分泌的将要通过本发明方法评价的产物的任何类型的样品，包括但不限于分离的细胞样品、组织样品或体液样品。“组织样品”虽然类似于分离的细胞样品，但它是身体的器官或组织的一部分，其典型地包括几种细胞类型，任选地具有把细胞保持在一起的细胞骨架结构。"细胞样品"是"组织样品"中的一种类型，虽然术语"组织样品"可以更经常地被用于称呼比细胞样品更复杂的结构。通过活组织检查，例如包括通过切割、切片或穿孔可以得到组织样品。“体液样品”，像组织样品一样，包含将要被评价的细胞，并且是通过适于采样特定的体液的任何方法得到的液体。适于采样的体液包括血液、血浆和血清，等等。
"选择性地与...结合"是指一种化合物与另一种化合物的特异性结合(例如本发明的制剂与细胞的特异性结合)，其中根据通过任何标准测定测量的结合的水平在统计学上显著地高于测定的背景对照。
正如本文中所用的那样，"受试者"是可以向其施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的任何有机体，无论用于实验的、诊断的、预防的目的，还是用于治疗的目的。典型的受试者包括哺乳动物例如小鼠、大鼠、非人灵长类和人。
“取代”是把一种碱基调换为另一种碱基的突变(即单一的"化学的字母"的改变，例如A变换为G)。这样的取代可以:(i)把密码子改变为编码不同的氨基酸的一种密码子并且引起所生产的蛋白质的小的变化；(ii)把密码子改变为编码相同的氨基酸的密码子并且没有引起所生产的蛋白质的变化(“沉默突变”)；或(iii)把编码氨基酸的密码子改变为单一的"终止"密码子并且引起不完全的蛋白质。
"遭受"疾病、病症或病况的个体已经被诊断患有或显示一种或更多种疾病、病症或病况的症状。
对疾病、病症或病况“易感的”个体还没有被诊断出患有或没有展示疾病、病症或病况的症状但是具有发展疾病或它的症状的倾向。在一些实施方式中，对疾病、病症或病况(例如肥胖)易感的个体可以以下列中的一个或多个为特征:(i)与发展疾病、病症或病况相关联的遗传突变；(ii)与发展疾病、病症或病况相关联的遗传多态性；(iii)与疾病、病症或病况相关联的蛋白质或核酸的增加或减小的表达或活性；(iv)与疾病、病症或病况的发展相关联的习惯或生活方式；(v)疾病、病症或病况的家族史；和(vi)暴露于与发展疾病、病症或病况相关联的微生物或被其感染。在一些实施方式中，对疾病、病症或病况易感的个体将会发展疾病、病症或病况。在一些实施方式中，对疾病、病症或病况易感的个体不会发展疾病、病症或病况。
"合成的"是指通过人的干预生产的、制备的或制造的。本发明的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学的或酶促的。
"靶向部分"是朝向或优先与特定的组织、细胞类型、受体、感染剂或其它目的区域缔合或结合的作用剂。靶向部分与mRNA递送组合物的加成将会增强mRNA向想要的细胞类型或位置的递送。与细胞中的靶向部分的加成或细胞中的靶向部分的表达增强该细胞向动物或受试者之内的预定位置的定位。
“治疗有效量”或“有效量”是当向遭受疾病、病症或病况或对其易感的受试者施用时，足以治疗、改善疾病、病症或病况的症状、诊断、预防或延迟疾病、病症或病况的发作或将会引发研究人员、兽医、医学医生或其它临床医师所寻求的组织、系统、动物或人的生物学的或医学的应答的将要被递送的作用剂(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等等)的数量。
"治疗"是部分地或完全地缓和、改善、改进、减轻、延迟特定疾病、病症或病况的发作、抑制特定疾病、病症或病况的进展、减小特定疾病、病症或病况的严重程度或减少特定疾病、病症或病况的一种或更多种症状或特征的发生。例如，“治疗”可以提及意指逆转或缓和瘦蛋白缺乏或脂肪代谢障碍。"治疗"是指治疗(例如瘦蛋白缺乏或脂肪代谢障碍)的行为。为了减小发展与疾病相关联的病理学的风险的目的，可以向没有展示疾病迹象的受试者或向仅仅展示早期疾病迹象的受试者施用治疗。
瘦蛋白缺乏
本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA可用于向患有缺乏瘦蛋白的受试者施用。原则上，通过施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA，可以治疗导致瘦蛋白缺乏(低的循环瘦蛋白水平)的任何状态。患有缺乏瘦蛋白的受试者可以包括患有下列病况的那些受试者:(i)由于瘦蛋白基因的突变而导致的先天性瘦蛋白缺乏，(ii)先天性和获得性一般化脂肪代谢障碍；(iii)获得性HIV脂肪代谢障碍，其中患者具有低的瘦蛋白水平；(iv)下丘脑性闭经，无论运动诱导的形式还是非运动形式(它是膳食诱导的)；(v)在体重减少10％以后的体重维持(即代谢适应力)。患有这些病况中的任何的受试者处于低的循环瘦蛋白水平状态并且将会受益于用于使代谢疾病(糖尿病、胰岛素抗性、高甘油三酯血症和饮食过多)、月经周期和体重保持的施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。参见Kelesidis T等人(2010)Annals ofInternal Medicine 152(2):93-101和Dardeno TA等人(2010)Frontiers inNeuroendocrinology 31:377-393。
先天性瘦蛋白缺乏是由瘦蛋白基因的突变所引起的。患有先天性缺乏瘦蛋白的受试者贪得无厌地吃，变成病态地肥胖的并且遭受包括性腺机能减退和糖尿病在内的肥胖症的后果。
脂肪代谢障碍综合征可以是继承性的或获得性的，具有一般化的或部分的脂肪组织损失以及产生的循环中的瘦蛋白水平不足。患有脂肪代谢障碍综合征的患者具有身体的脂肪组织降解或重新分布(低度脂肪过多)或者两者。患有脂肪代谢障碍综合征的患者显示经常与病态的肥胖症相关联的严重的新陈代谢表型，例如胰岛素抗性、糖尿病、高甘油三酯血症和饮食过多。患有严重的脂肪代谢障碍的患者也倾向于发展心肌病、急性胰腺炎、硬化、盲和需要肾移植的晚期糖尿病性的肾病。
获得性HIV脂肪代谢障碍影响15-35％的HIV感染的受试者。患有获得性HIV脂肪代谢障碍的患者显示新陈代谢综合症，包括胰岛素抗性、高脂血症和中央肥胖。
下丘脑性闭经是由受试者的下丘脑垂体性腺轴的调节异常产生的月经周期的停止。下丘脑性闭经可以由压力、运动或体重减轻诱发。
肥胖患者一般是瘦蛋白抗性的。在适度的体重降低之后，瘦蛋白敏感性被部分地恢复。因此，施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA允许患者维持体重。
修饰的合成瘦蛋白mRNA
本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA编码瘦蛋白多肽，其包括至少一个修饰的核苷并且具有至少下列特征:(i)它是在体外产生的并且没有从细胞中分离；(ii)它能够在体内或离体在细胞(例如人细胞)中被翻译；和(iii)相对于非修饰的相同序列的RNA，它在它被引入或接触的受试者中激起显著地减少的先天的免疫应答或干扰素应答。
本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA可以编码在功能上等同于天然人瘦蛋白蛋白质(SEQ ID NO:3)的瘦蛋白多肽，正如通过体内功能(例如通过调节食欲、能量代谢或神经内分泌功能)或体外功能(例如通过在功能与人瘦蛋白受体(LEPR，CD295)的结合)或两者所测定的那样。本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA可以编码在结构上类似于天然人瘦蛋白蛋白质的瘦蛋白多肽，正如通过与天然人蛋白质的同源性所测定的那样。本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA可以编码既在功能上等同于也在结构上类似于天然人瘦蛋白蛋白质的瘦蛋白多肽。在具体的实例中，本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA包含选自SEQ ID NOS:17-20的编码序列。参见实施例31。这四种人瘦蛋白开放阅读框的核苷酸序列彼此之间是78％-91％相同的。因此，本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA可以包含与从SEQ ID NOS:17-20中间选择出来的编码序列至少78％同一的功能性编码区。
通过对包括天然的人瘦蛋白编码序列在内的任何天然的瘦蛋白编码序列进行密码子优化，可以构建本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的编码区。通过可商购的服务例如(可以从Life Technologies Corporation，Grand Island，NY，美国获得)、GENEWHIZ(可以从GENEWHIZ，Inc.，Cambridge MA，美国获得)和GenScript(可以从GenScript，Inc.，Piscataway NJ，美国获得)，可以进行密码子优化。
表1提供了可用于实施本发明的一些多核苷酸和多肽序列。
本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA可以包含多个启动和加强翻译、对抗脱腺苷化和RNA链降解以及防止诱导炎性应答的元件。
修饰的合成瘦蛋白mRNA可以从具有mRNA帽的5’端开始，该mRNA帽是已经在体外通过RNA聚合酶转录了mRNA之后以酶促方式被合成的。mRNA帽促进翻译的启动，同时避免把mRNA识别成外来的并且保护mRNA避免5'核酸外切酶介导的降解。5'帽可以包含修饰的鸟嘌呤核苷，其利用5'-5'三磷酸酯键与RNA分子的5'端相连。5'帽还可以是5'帽类似物，例如5'二鸟苷帽、具有亚甲基双(膦酸酯)部分的四磷酸帽类似物(参见例如Rydzik AM等人(2009)Org.Biomol.Chem.7(22):4763-76)、具有硫代磷酸酯修饰的二核苷酸帽类似物(参见例如Kowalska J等人(2008)RNA 14(6):1119-1131)、具有硫取代非桥氧的帽类似物(参见例如Grudzien-Nogalska E等人(2007)RNA 13(10):1745-1755)、N7-苄化的二核苷四磷酸类似物(参见例如Grudzien E等人(2004)RNA 10(9):1479-1487)或抗逆转帽类似物(参见例如Jemielity J等人(2003)RNA 9(9):1108-1122和Stepinski J等人(2001)RNA 7(10):1486-1495)。在一种这样的实施方式中，5'帽类似物是5'二鸟苷帽。也参见在实施例2中显示的属于New England Biolabs(Beverly MA美国)的加帽方法。在一些实施方式中，本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA不包含5'三磷酸。
其次可以是真核生物或病毒来源的合成的5’非翻译区(UTR)，其具有最小的二级结构并且通过提高核糖体募集或者改进核糖体从帽扫描到Kozak序列和起始密码子的效率来加强帽依赖性的翻译效率。
在一些实施方式中，本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA包括Kozak序列。"Kozak序列"是指在真核生物mRNA上的一段序列，其具有共有(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO:1)，其中R是起始密码子(AUG)三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，在其之后是另一个“G”。Kozak共有序列被核糖体识别而启动多肽的翻译。典型地，启动发生在翻译机构遇到的第一个AUG处，其最接近转录本的5'端。在AUG密码子附近Kozak序列的存在加强了作为翻译启动位置的该密码子，使得发生正确多肽的翻译。在一些这样的实施方式中，Kozak序列包含一种或更多种修饰的核苷。
在这之后是开放阅读框，其编码在功能上等同于天然的人瘦蛋白蛋白质的多肽。虽然在本文中公开了示范性的开放阅读框，然而可以使用产生功能性的瘦蛋白蛋白质的其它开放阅读框。
在开放阅读框之后可以是合成的真核生物或病毒来源的3’非翻译区(3’UTR)序列。3'UTR可以选自已知在细胞中具有高稳定性的mRNA。例如，合成3’UTR序列可以是鼠α-球蛋白3'UTR或鼠β-球蛋白3'UTR，正如美因茨约翰内斯古藤贝格大学(Johannes Gutenberg-Mainz)的国际专利申请号WO2007/036366中描述的那样。在该3’UTR之后可以是另一种合成3’UTR序列，其编码聚腺苷尾，其一起对抗mRNA的降解并且增强它在细胞中的翻译。
本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA可以包括用来防止被核酸内切酶和核酸外切酶快速降解的修饰以及用来避免或减少细胞对RNA的先天的免疫的或干扰素应答的修饰。修饰可以包括例如，(i)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化作用、脱磷酸作用、缀合、反向连接等等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等等)，(ii)碱基修饰，例如采用修饰的碱基、稳定化的碱基、不稳定化的碱基或与扩展的配偶体库或缀合的碱基进行碱基配对的碱基置换，(iii)糖修饰(例如在2'位或4'位)或糖的置换，以及(iv)核苷间键的修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。这些修饰中的许多已经被用于修饰siRNA分子。一些碱基修饰可用于减少对施用的mRNA的免疫应答。参见Kariko K等人(2005)Immunity 23:165-175。
可以按照任何可用的技术，例如通过体外转录酶促合成、对较长的前体的酶促的切割或化学的切割等等，来制备本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。合成RNA的方法是本领域中已知的。参见例如早期的关于利用重组体T7RNA聚合酶，从质粒模板体外转录长的RNA的参考文献，例如Chapman KA和Wells RD(1982)“Bacteriophage T7 late promoters；construction and in vitro transcription properties of deletion mutants.”Nucleic Acids Research 10(20):6331–6340以及Schenborn ET和Mierendorf RC(1985)“A novel transcription property of SP6and T7RNA polymerases:dependence ontemplate structure.”Nucleic Acids Research13(17):6223-6236。转录方法被进一步描述在本文的实施例2中。
可以通过体外转录瘦蛋白DNA模板来产生本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。利用标准的分子克隆技术，用于产生模板的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。采用包含修饰(例如采用假尿嘧啶核苷取代尿嘧啶核苷)的核糖核苷酸在体外合成mRNA，该修饰具有增强mRNA的翻译和稳定性并且避免诱导炎性的应答的效果。可以在转录以后进一步修饰转录的修饰的合成瘦蛋白mRNA，例如通过添加帽或其它官能团。
关于转录，修饰的核苷酸可以被至少一种RNA聚合酶识别为基质。一般地，RNA聚合酶可以容忍一定范围的核苷碱基修饰。核糖和磷酸酯-修饰的核苷或核苷类似物是本领域中已知的允许被RNA聚合酶转录。接受修饰的核苷的聚合酶是本领域技术人员已知的。参见Kariko等人的美国专利号8,278,036。例如RNA聚合酶可以是噬菌体RNA聚合酶。被RNA聚合酶接受的修饰的核苷酸包括假尿嘧啶核苷(Ψ)、5-甲基-尿嘧啶核苷(m5U)、2-硫尿嘧啶核苷(s2U)、6-甲基-腺嘌呤(m6A)和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)，已知它们与利用噬菌体RNA聚合酶的转录相容，然而N1-甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、2'-O-甲基尿苷和2'-O-甲基胞苷与利用噬菌体RNA聚合酶的转录不相容。
修饰的聚合酶可用于产生本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。有效地插入2'-O-甲基修饰的核糖核苷酸5'-三磷酸酯的修饰的(突变体，R425C)T7 RNA聚合酶最近被Ibach J等人描述了(2013)“Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits theenzymatic synthesis of fully 2’-O-methyl-modified mRNA.”J.Biotechnology 167:287-295。
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来监测本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的转录或其它合成。例如可以通过光谱手段，例如核磁共振光谱法(例如1H或13C)、红外光谱学、分光光度测定法(例如紫外线-可见的)或质谱学，或通过色谱法例如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法，来监测产物形成。
可以通过真核细胞的翻译机制翻译本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。除了假尿嘧啶核苷(Ψ)之外的核苷修饰可以干扰翻译。本领域技术人员可以利用体外翻译测定(例如兔子网织红细胞裂解物测定(报道分子活性测定)或翻译的蛋白质中的放射性标记的测定)，并且利用SDS-PAGE、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定或免疫化学测定等等检测所生产的多肽的数量，来测试本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的承受翻译的能力和翻译效率。把包含候选修饰的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的翻译与缺乏候选修饰的RNA的翻译进行比较，使得如果具有候选修饰的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的翻译保持一样或被增加，则考虑把候选修饰用于本文中所描述的组合物和方法中。
制剂
采用具有几个有利的特征的递送剂配制修饰的合成瘦蛋白mRNA。递送剂保护修饰的合成瘦蛋白mRNA不被降解。递送剂还可以帮助把修饰的合成瘦蛋白mRNA递送到预定的组织或细胞类型，其导致在受试者的循环系统中瘦蛋白蛋白质的增加的翻译和增加的瘦蛋白蛋白质水平。
mRNA它自己不能被有效地递送到细胞的细胞质并且易受RNase降解。mRNA也是强烈地带负电荷的和亲水性的，这使得mRNA从细胞外空间或内吞的小泡进入细胞的细胞质非常不太可能。因此，用于治疗目的的在体内向细胞递送mRNA需要利用制剂，其中在制剂中，递送剂既保护mRNA免遭RNase又促进向细胞的细胞质递送mRNA。
修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂可以包括递送剂，例如纳米微粒、树枝状聚合物(dendrimer)、聚合物、乳液、脂质体、阳离子脂质、非阳离子脂质、阴离子型脂质、带电荷的脂质或渗透增强剂。带正电荷的阳离子型递送系统促进本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA(带负电荷的多核苷酸)的结合以及还增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用而允许有效的细胞摄取。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可以与修饰的合成RNA结合或诱导形成小泡或胶束。参见例如Kim SH等人(2008)Journal of Controlled Release129(2):107-116)，其中包含修饰的RNA。用于制造和使用阳离子型修饰的RNA复合物的方法很好地在本领域技术人员的能力范围之内(参见例如Sorensen DR等人(2003)J.Mol.Biol.327:761-766；VermaUN等人(2003)Clin.Cancer Res.9:1291-1300；Arnold AS等人(2007)J.Hypertens.25:197-205。Nguyen J和Szoka FC提供了关于如何评定用于核酸递送的脂质载体和聚合载体的指导(2012)Accounts of Chemical Research 45(7):1153–1162。
用于转染或脂转染的递送剂。在一些实施方式中，通过转染或脂转染，可以把本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA引入细胞或组织中。用于转染或脂转染的合适的递送剂包括例如磷酸钙、DEAE右旋糖酐、脂转染剂(lipofectin)、lipofectamine、DIMRIE CTM、SuperfectTM和EffectinTM(QiagenTM)、UnifectinTM、MaxifectinTM、DOTMA、DOGSTM(Transfectam；二-十八烷酰胺基甘氨酰基精胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DDAB(溴化二甲基二(十八基)铵)、DHDEAB(N，N-二(正十六碳烷基)-N，N-二(羟乙基)溴化铵)、HDEAB(N-正十六烷基-N，N-二(羟乙基)溴化铵)、polybrene、聚(氮丙啶)(PEI)等等。参见例如Banerjee等人(1999)Med.Chem.42:4292-99；Godbey等人(1999)Gene Ther.6:1380-88；Kichler等人(1998)GeneTher.5:855-60；Birchaa等人(1999)J.Pharm.183:195-207。
细胞渗透增强剂。在一些实施方式中，与一种或更多种渗透增强剂、表面活性剂或螯合剂同时使用来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。合适的表面活性剂包括脂肪酸和/或酯以及其盐、胆汁酸以及其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、谷胆酸(glucholic acid)、甘胆酸(glycholicacid)、甘油脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺-24，25-二氢褐霉酸钠和甘油二氢褐霉酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油基酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰肉碱、酰基胆碱或单酸甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施方式中，使用渗透增强剂的组合，例如脂肪酸/盐和胆汁酸/盐的组合。一种示范性的组合是月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。其它渗透增强剂包括聚氧化乙烯-9-月桂基醚、聚氧化乙烯-20-鲸蜡基醚。
脂质体。包含核酸的许多脂质体是本领域中已知的。Thierry等人的国际专利申请号WO 96/40062公开了用于把高分子量核酸包裹在脂质体中的方法。Tagawa等人的美国专利号5,264,221公开了蛋白键合的脂质体并且宣布这样的脂质体的内容可以包含核糖核酸分子。Rahman等人的美国专利号5,665,710描述了把寡脱氧核糖核苷酸包裹在脂质体中的某些方法。Love等人的国际专利申请号WO 97/04787公开了包括RNAi分子的脂质体。用于制备包含核酸的脂质体制剂的方法还可以在例如下列中找到:美国专利号6,011,020；6,074,667；6,110,490；6,147,204；6,271,206；6,312,956；6,465,188；6,506,564；6,750,016；和7,112,337。这些方法中的每一种都可用于提供向细胞递送本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA。
聚合物。可以使用天然的或合成的聚合物来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA，如国际专利申请号WO2013/090186A1中所示的那样。可以被用于递送的聚合物的例子包括来自Bio(Madison WI USA)和Roche Madison(Madison WI USA)的DynamicPOLYCONJUGATETM制剂、PHASERXTM聚合物制剂例如SMARTT POLYMER TECHNOLOGYTM(PhaseRx，Seattle WA美国)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、来自Vical(San Diego CA美国)的佐剂、脱乙酰壳多糖、来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena CA美国)的环糊精、树枝状聚合物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM(RNAi/寡核苷酸纳米微粒递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation，Pasadena CA WA)和pH响应性共嵌段聚合物例如PHASERXTM(Seattle WA USA)。参见美国专利号6,835,393、7,374,778、7,737,108、7,718,193和8,003,129。也参见欧洲专利EP1044021B1。
聚(乳酸-共-乙交酯)(PLGA)制剂的实例包括PLGA可注射的贮存，例如
这些聚合物方法中的许多已经在体内证明了在把寡核苷酸递送到细胞的细胞质中的效力。已经由de Fougerolles对这些方法进行了综述(2008)Hum Gene Ther.19:-132。两种已经在体内产生核酸(特别是小的干扰RNA)递送的聚合物方法是基于动态的聚缀合物和环糊精的纳米微粒。这些递送方法中的第一种利用动态的聚缀合物并且已经在小鼠中在体内显示有效地递送siRNA。Rozema等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:12982-12887。这种方法是多组分的聚合物系统，其特征包括膜活性的聚合物，核酸可以通过二硫键与该聚合物共价偶联，并且其中通过pH敏感的键使PEG(用于电荷掩蔽)和N-乙酰半乳糖胺(用于肝细胞靶向的靶向部分)基团两者相连。Rozema等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:12982-12887。
另一种聚合物方法涉及使用靶向转铁蛋白的包含环糊精的聚阳离子纳米微粒。这些纳米微粒已经在表达转铁蛋白受体的尤文肉瘤肿瘤细胞中证明对EWS-FLI1基因产物的靶向的沉默。参见Hu-Lieskovan等人(2005)Cancer Res.65:8984-8982。配制在这些纳米微粒中的siRNA在非人灵长类中被很好地忍受。参见Heidel等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:5715-21。可以通过不同的配体(例如叶酸、转铁蛋白和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))的表达，使聚合物制剂选择性地靶向。参见Benoit等人(2011)Biomacromolecules 12:2708-2714；Rozema等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:12982-12887；Davis(2009)Mol.Pharm.6:659-668；Davis(2010)Nature 464:1067-1070。
递送剂可以包括至少一种聚合物，例如聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(l-赖氨酸)(PLL)、接枝到PLL上的PEG、阳离子脂质聚合物、可生物降解的阳离子脂质聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、交联的带支链的聚(亚烷基亚胺)、聚胺衍生物、修饰的泊洛沙姆、可生物降解的聚合物、可生物降解的嵌段共聚物、可生物降解的无规共聚物、可生物降解的聚酯共聚物、可生物降解的聚酯嵌段共聚物、可生物降解的聚酯嵌段无规共聚物、线性的可生物降解的共聚物、聚[a-(4-氨基丁基)-L-羟基乙酸)(PAGA)、可生物降解的交联的阳离子型多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚丙基富马酸酯(polypropylfumerates)、聚己酸内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚膦腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙撑亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、丙烯酸类聚合物、包含胺的聚合物或其组合。
可以由制剂领域的技术人员，利用在科学文献、专利和出版的专利申请中提供的指导，采用聚合物来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。例如，可以采用美国专利号6,177,274中描述的采用PLL接枝的PEG的聚合物来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA并且用于体内递送。对于第二个实例，可以把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA悬浮在含有阳离子聚合物的溶液或介质、干燥的药物组合物或能够按照美国专利申请号2009/0042829和2009/0042825中描述的方式被干燥的溶液中。
还可以按照美国专利申请号2012/0004293和美国专利号8,236,330描述的方式，采用PLGA-PEG嵌段共聚物配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。可以采用PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA，正如美国专利号8,246,968中描述的那样。可以使本文中所描述的聚合物与脂质封端的PEG缀合。例如，可以使PLGA与脂质封端的PEG缀合，形成PLGA-DSPE-PEG。在国际专利申请号WO2008/103276中描述了PEG缀合物。
可以按照美国专利申请号2010/0260817所描述的方式，采用将要被包括在可植入的或可注射的装置中的聚胺衍生物递送剂来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。可以采用在美国专利申请号2010/0260817中描述的聚胺衍生物来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。
可以采用丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯以及其组合，来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的制剂可以包含至少一种包含胺的聚合物，例如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物或其组合。
可以采用在国际的专利申请号WO2011/15862、WO2012/082574和WO2012/068187中描述的至少一种聚合物来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。而且，可以把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA配制在递送剂中，该递送剂包括聚(亚烷基亚胺)、可生物降解的阳离子脂质聚合物、可生物降解的嵌段共聚物、可生物降解的聚合物或可生物降解的无规共聚物、可生物降解的聚酯嵌段共聚物、可生物降解的聚酯聚合物、可生物降解的聚酯无规共聚物、线性的可生物降解的共聚物、PAGA、可生物降解的交联的阳离子型多嵌段共聚物或其组合。可以通过在美国专利号6,696,038或美国专利申请号2003/0073619和2004/0142474中描述的方法来制造可生物降解的阳离子脂质聚合物。可以利用在美国专利申请号2010/0004315中描述的方法来制造聚(亚烷基亚胺)。可以利用在美国专利号6,517,869或6,267,987中描述的方法来制造可生物降解的聚合物、可生物降解的嵌段共聚物、可生物降解的无规共聚物、可生物降解的聚酯嵌段共聚物、可生物降解的聚酯聚合物或可生物降解的聚酯无规共聚物。可以利用本领域中已知的方法，例如按照美国专利号6,652,886中描述的方式，来制造线性的可生物降解的共聚物。可以利用在美国专利号6,217,912中描述的方法来制造PAGA聚合物。可以使PAGA聚合物与聚合物共聚合而形成共聚物或嵌段共聚物，该聚合物例如为但不限于聚L-赖氨酸、聚argine、聚鸟氨酸、组蛋白、亲和素、鱼精蛋白、聚交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。可以通过在美国专利号8,057,821或美国专利申请号2012/009145中描述的方法制造可生物降解的交联的阳离子型多嵌段共聚物。例如可以利用线性的聚乙烯亚胺(LPEI)嵌段(其与带支链的聚乙烯亚胺相比，具有不同的模式)来合成多嵌段共聚物。进一步，可以通过在美国专利申请号2010/0004315或美国专利号6,267,987或6,217,912中描述的方法来制造组合物或药物组合物。
美国专利申请号2010/0004313描述了制剂怎样能够包含核苷酸序列和泊洛沙姆。因此，采用泊洛沙姆可以把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA用于递送基因的组合物中。
可以采用至少一种可以包含聚阳离子侧链的可降解的聚酯来配制本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。可降解的聚酯包括但是不局限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯以及其组合。在另一种实施方式中，可降解的聚酯可以包含PEG缀合而形成PEG化的聚合物。
阳离子脂质纳米微粒。在一些实施方式中，可以把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA包裹在纳米微粒中。用于纳米微粒包裹的方法是本领域熟知的，并且被描述在例如Bose S等人(2004)J.Virol.78:8146；Dong Y等人(2005)Biomaterials 26:6068；Lobenberg R等人(1998)J Drug Target 5:171；Sakuma SR等人(1999)Int.J.Pharm.177:161；Virovic L等人(2005)Expert Opin.Drug Deliv.2:707；和Zimmermann E等人(2001)Eur.J.Pharm.Biopharm.52:203中。
把阳离子脂质用于细胞递送核酸具有几个优点。利用阳离子脂质包裹阴离子化合物由于静电相互作用的缘故而基本上是定量的。阳离子脂质可以与带负电荷的细胞膜相互作用，启动细胞膜的转运。Akhtar等人(1992)Trends Cell Biol.2，139；Xu等人(1996)Biochemistry 35，5616。进一步，阳离子脂质的分子的形状、构象和性质可以提供提高的从内体区室向细胞溶胶递送的效率。Semple SC等人(2010)Nature Biotechnol.28(2):172-176。已经显示包含阳离子脂质的脂质纳米微粒充分地包裹小的抑制性RNA(siRNA)并且有效地把siRNA递送到动物中的细胞中。Jayaraman M等人(2012)Angew.Chemie Int.Ed.51:1-6。
在一种实施方式中，用于把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA包裹在脂质纳米微粒中的组合物包含:(i)用于包裹并且用于内体脱逸的阳离子脂质，(ii)用于稳定化的中性脂质，(iii)辅助脂质，和(iv)防止聚集的隐型脂质。
“阳离子脂质”是带正电荷的脂质。关于利用阳离子脂质来制造用于核酸递送的阳离子脂质体或阳离子脂质复合体的综述，参见Gallas A等人(2013)Chem.Soc.Rev.42:7983-7997；Falsini等人(2013)J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；和在本文中提供的其它参考文献。在具体的实施方式中，阳离子脂质可以选自阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C和阳离子脂质D，其每一种都被描述在本文中。
中性脂质是关于仅仅可溶解在很低极性的溶剂中的任何脂质的操作术语。适用于本发明的递送剂中的中性脂质包括多种中性的、不带电的或两性离子的脂质，例如:5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生四烯酰基(diaRachidoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-双二十碳烯酰基(dieicosenoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。在一个实施方案中，中性磷脂选自DSPC和DMPE。
辅助脂质是能够将转染(例如包括生物活性成分的纳米颗粒的转染)提高的脂质。辅助脂质提高转染的机制可能包括例如提高粒子的稳定性或改善膜的融合性(fusogenicity)。辅助脂质包括甾体类和烷基间苯二酚类。适用于本发明递送剂中的辅助脂质包括胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。
“隐型脂质”是增加纳米微粒可以在体内(例如在血液中)存在的时间长度的脂质。适用于本发明的递送剂中的隐型脂质包含但是不局限于具有与脂质部分相连的亲水性头部基团的隐型脂质。这样的隐型脂质的实例包括在国际专利申请号WO2011/076807中描述的化合物。适用于本发明的递送剂中的其它隐型脂质以及有关这样的隐型脂质的生物化学的信息可以在Romberg等人(2008)Pharmaceutical Research 25(1):55 71和Hoekstra等人(2004)Biochimica et Biophysica Acta 1660:41-52中找到。适当的隐型脂质可以从类似于聚(乙二醇)(PEG)的分子之中选择，其包括聚(环氧乙烷)和基于聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(丙三醇)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]的聚合物。其它适当的PEG脂质公开于国际专利申请号WO 2006/007712。PEG脂质包括聚乙二醇-二酰基甘油或聚乙二醇-二酰基咪唑二酰胺(diacylglycamide)(PEG-DAG)共轭物，包括那些含有二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺(dialkylglycamide)基团的共轭物，其烷基链长度独立含有约C4至约C40饱和的或不饱和的碳原子。二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺还可以含有一或多个取代的烷基。在本文所述的任何实施例中，PEG共轭物可以选自PEG-二月桂基甘油、PEG-二豆蔻基甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，源自NOF，东京，日本)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二甾醇基甘油、PEG-二月桂基咪唑二酰胺、PEG-二豆蔻基咪唑二酰胺、PEG-二棕榈酰基咪唑二酰胺和PEG-二甾醇基咪唑二酰胺、PEG-胆固醇(1-[8’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3’,6’-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四烷基(tetradecoxyl)苄基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目录号880150P，源自Avanti Polar lipids，Alabaster，AL，USA)。
在一种实施方式中，隐型脂质是化合物S024，其被描述在国际专利申请号WO2011/076807中。化合物S024的化学结构是:
S024的化学名称是2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,70,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135-四十六氧杂一百四十烷-140-基氨基甲酸[二十九烷-15-基]酯，其中n＝45。
在一种实施方式中，递送剂包含作为辅助脂质的胆固醇、中性脂质和作为隐型脂质的PEG脂质。在更具体的实施方式中，递送剂包含30-60％的选自阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C或阳离子脂质D的阳离子脂质、5-10％辅助脂质、30-60％中性脂质和1-5％PEG脂质。在更具体的实施方式中，递送剂包含30-60％的选自阳离子脂质A、阳离子脂质B或阳离子脂质C的阳离子脂质、5-10％辅助脂质、48％胆固醇和2％PEG脂质。
在一种实施方式中，在包裹修饰的合成瘦蛋白mRNA.的制剂的时候，递送剂的pH是4-6。在更具体的实施方式中，在包裹或配制的时候，递送剂的pH是5-6。在还更具体的实施方式中，在包裹或配制的时候，递送剂的pH是5.6-6.0。虽然并不要求，但是建议的用于采用阳离子脂质C配制脂质纳米微粒的pH是pH 5.6。虽然并不要求，但是建议的用于采用阳离子脂质B配制脂质纳米微粒的pH是pH 6.0。
取决于所选择的阳离子脂质，在这个范围之内的不同的pH值时，mRNA包裹的百分数可以更高或更低。可以在范围之内通过经验确定用于特定的阳离子脂质制剂的最佳的包裹pH。在递送剂中，四种脂质组分的摩尔比率和阳离子脂质胺与mRNA磷酸酯(N:P)的摩尔比率一般是有用的指导，但是可以与其有差异，并且可以是3:1的N:P比率到8:1的N:P比率。N:P比率的变化可以影响mRNA包裹的效率、微粒分析和体内mRNA递送性能。可以凭经验确定满足体内mRNA递送要求的理想脂质制剂。
本领域技术人员可以通过调整在这些各种类型的脂质之间的脂质摩尔比率来进一步最优化本发明的递送剂。在一种实施方式中，进一步最优比是通过调整下列中的一种或多种而达到的:所要的微粒大小、N:P比率、配制方法。
在本文中以及特别是在实施例34和实施例35中改进的方法中，利用阳离子脂质和迅速的混合，把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA配制在阳离子脂质纳米微粒中。包裹是有效的并且所配制的微粒可以适合于在体外和在体内把所述包裹的mRNA递送到活细胞。表2显示在实施例34和实施例35中描述的通过两种改进方法在脂质纳米微粒中包裹瘦蛋白mRNA的分析结果。
药物组合物。可以通过药物学领域中任何已知的或今后发展的方法制备在本文中描述的药物组合物的制剂。一般说来，这样的制备方法包括使活性成分与赋形剂和任选地一种或更多种其它助剂缔合的步骤，然后任选地把产物成形或包装成所要的单或多剂量单元。
虽然在本文中提供的关于药物组合物的描述主要地指向适合于向人施用的药物组合物，但是技术人员将会理解这样的组合物一般地适合于向各种各样的动物施用。
可以把根据本发明的药物组合物制备、包装成单个的单位剂量或许多单个的单位剂量或以单个的单位剂量或许多单个的单位剂量形式整批出售。"单位剂量"是包含预先确定数量的活性成分的药物组合物的分散量。活性成分的数量一般地等于将会向受试者施用的活性成分的剂量。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的赋形剂，其包括任何和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等，只要适合于所要的特定剂型。Remington's The Scienceand Practice of Pharmacy，22ndedition(20012)Allen LV等人编辑，PharmaceuticalPress，公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于它们的制备的已知的技术。
在一些实施方式中，赋形剂被美国食品药物管理局批准。在一些实施方式中，赋形剂是药物级的。在一些实施方式中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典或国际药典的标准。
在配制或生产药剂中的总体考虑可以在Remington's The Science andPractice of Pharmacy，第22版(20012)Allen LV等人编辑，Pharmaceutical Press中找到。
在本文中描述的药物组合物的特征可以在于一种或多种下列性质:
生物利用率。当采用本文中描述的递送剂被配制成组合物时，与缺乏本文中描述的递送剂的组合物相比，mRNA分子可以展示生物利用率的增加。术语"生物利用率"是指向哺乳动物施用的一定量的mRNA分子的系统性利用率。可以在向哺乳动物施用化合物以后，通过测量曲线下面的面积(AUC)或未改变的化合物形式的最大血清或血浆浓度(Cmax)来评定生物利用率。AUC是沿着纵座标(Y轴)的化合物的血清或血浆浓度对沿着横坐标(X轴)的时间绘制的曲线下方的面积的测定值。一般地，可以利用本领域普通技术人员已知的方法，如在G.S.Banker(1996)Modern Pharmaceutics，Drugs and the PharmaceuticalSciences，v.72，Marcel Dekker，New York，Inc.中描述的方法(通过引用插入本文中)，来计算关于特定化合物的AUC。
Cmax值是在向哺乳动物施用化合物以后，在哺乳动物的血清或血浆中达到的所述化合物的最大浓度值。可以利用本领域普通技术人员已知的方法测定特定的化合物的所述Cmax值。正如本文中所用的那样，短语"增加生物利用率"或"改善药物动力学"是指当与本文中描述的递送剂共同施用时，根据在哺乳动物中的AUC、Cmax或Cmin所测量的第一mRNA的系统性利用率比当这样的共同施用不发生时相比更大。
治疗窗口。当被配制成本文中描述的组合物时，与施用缺乏本文中描述的递送剂的mRNA分子组合物的治疗窗口相比，mRNA分子可以展示所施用的mRNA分子组合物的治疗窗口的增加。正如本文中所用的那样，"治疗窗口"是指在作用位点处，在治疗上有活性的物质以高的概率引起治疗效果的血浆浓度范围或水平范围。在一种实施方式中，用于施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的治疗窗口是血浆瘦蛋白蛋白质在基线上方增加10ng/mL，其中基线可以是在施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂以前在受试者中的血浆瘦蛋白，或可以是在可比较的测试患者中的血浆瘦蛋白蛋白质。
分配体积。当被配制成本文中描述的组合物时，本发明修饰的合成mRNA可以展示改善的分配体积(V分配)。V分配把在身体内药物的数量与在血液或血浆中药物的浓度关联。术语"分配体积"是指以与在血液或血浆中相同的浓度，在身体内包含总量的药物将会需要的流体的体积:V分配等于在身体内药物的数量/在血液或血浆中药物的浓度。例如，对于10mg剂量和10mg/L的血浆浓度，分配体积将会是1升。分配体积反映药物存在于血管外组织中达到的程度。大的分配体积反映与血浆蛋白结合相比较，化合物倾向于与组织组分结合。在临床设置中，V分配可以被用于确定达到稳态浓度的负载剂量。基于在实施例部分中呈现的药代动力学研究，V分配是很低的，意味着当化合物离开循环时，化合物不重新进入循环。
剂量
本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的剂量和施用将随着被治疗的病况和在给定情况中采取的治疗方法而变化。剂量还可以取决于修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂是以治疗量还是以预防药量被施用而不同。
剂量也将取决于所采用的方法、递送方式和将要被治疗的疾病而改变。在一种实施方式中，剂量可以在0.2mg核糖核酸多核苷酸/kg体重(mg/kg，mpk)的范围之内。在另一种实施方式中，剂量可以在0.6mg核糖核酸多核苷酸/kg体重(mg/kg，mpk)范围之内。参见实施例20和实施例23。在其它实施方式中，剂量可以最高到2mg/kg或4mg/kg。
可以以常规方式以单位剂量施用包含本发明的至少一种修饰的合成瘦蛋白mRNA的治疗组合物。术语"单位剂量"，当其关于治疗组合物被使用时，是指作为用于受试者的单位剂量的物理上分离的单元，每个单元包含与所需要的生理学上可接受的稀释剂(即载体或运载体)相关的预先确定数量的经计算要产生所要的治疗的效果的活性物质。
以一种与给药制剂相适合的方式，并且以治疗有效量施用组合物。将要被施用的数量和时机取决于将要被治疗的受试者、受试者的系统将要利用活性成分的容量和所要的治疗效果的程度。
施用
取决于期望局部的治疗还是系统性治疗以及将要被治疗的区域，可以通过多种途径向受试者递送或施用本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。示范性的途径包括静脉内和皮下递送途径。
可以由受试者或由他人(例如护理者)提供本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的施用。护理者可以是参与向人提供护理的任何实体，例如医院、安养院、医师办公室、门诊患者诊所；保健工作者，例如医生、护士或其它执业者；或配偶、父母或保护人。
可以通过实现修饰的合成瘦蛋白mRNA的细胞内递送的任何方式，把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA引入体内的或离体的细胞中，使得由修饰的合成瘦蛋白mRNA编码的所述瘦蛋白多肽的翻译和表达可以发生在细胞中。通过独立的扩散过程或主动的细胞过程或通过在下面的本文中描述的或本领域中已知的助剂“或”装置，可以发生细胞对本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的吸收或摄取。
可以与一种或更多种其它治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂或包含本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的药物组合物。短语"与...组合"不是指作用剂必须被同时施用或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本发明保护范围之内。可以与一种或更多种其它所要的治疗剂或医学方法同时、在一种或更多种其它所要的治疗剂或医学方法之前或之后，施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。一般说来，将会以按照为所述作用剂确定的剂量或时间表施用每种作用剂。在一些实施方式中，本发明包括与作用剂组合递送药物、预防剂、诊断剂或成像组合物，该作用剂可以改善它们的生物利用率、减少或改变它们的代谢作用、抑制它们的排泄或改变它们在身体内的分布。
本领域中已知的用于向受试者、器官、组织或细胞施用的装置和方法被考虑用于与本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA一起使用。这些包括例如利用例如腔管或导管的具有针、混合式装置的方法和装置。
在一些实施方式中，通过转染、核转染、脂转染、电穿孔法(参见例如Wong和Neumann(1982)Biochem.Biophys.Res.Commun.107:584-87)、生物射弹(即粒子轰击)、细胞融合等等，把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA引入靶细胞中。
在一些实施方式中，以单剂量或以两个或更多个剂量施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。如果希望便利于重复或频繁的输注，非可植入的输送装置(例如针、注射器、钢笔装置)或可植入的输送装置(例如泵、半永久性的支架(例如静脉内的、腹膜内的、脑池内的或囊内的)或储存器是可行的。在一些这样的实施方式中，输送装置可以包括用来分配单位剂量的包含本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的药物组合物的机构。在其它实施方式中，装置连续地(例如通过扩散)释放包含本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的药物组合物。在一些实施方式中，装置可以包含监测受试者中的参数的传感器。例如，装置可以包含例如泵以及任选地相关的电子设备。示范性的装置包括支架、导管、泵、人工器官或器官部件(例如人造心脏、心脏瓣膜等等)和缝线。
还可以通过使用植入的、留置的导管来递送本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA，该导管提供了用于把小体积的包含本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的流体直接地注射到局部的组织中的工具。可以把这些导管的近端与通过手术固定到受试者的身体的植入物进入孔或位于例如受试者的躯干中的植入的药物泵相连。
备选地，可以使用可植入的输送装置，例如可植入的泵。供包含本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA的所述组合物使用的输送装置的实例包括由美国明尼苏达州的Medtronic，Inc.of Minneapolis制造的Model 8506研究装置，其可以以皮下方式被植入身体内或颅上，并且提供进入孔，通过该进入孔可以递送治疗剂。备选地，可以通过多种装置，例如由美国专利号5,735,814、5,814,014和6,042,579描述的那些装置，来递送本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。利用在本文中描述的教导，本领域技术人员将会认识到这些和其它装置以及系统可以适合于递送本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。
在一些这样的实施方式中，输送系统进一步包括把泵移植到身体的外面，泵与导管的近端偶联，并且操作泵，通过导管的释放部分，来递送预先确定的剂量的本发明的修饰的合成mRNA。更多的实施方式包括周期性地更新向身体外面的泵供给本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA。
Bahami等人已经在美国专利申请号2011/0230839中描述了用于向实体组织递送治疗剂的方法。一系列针被插入装置中，该装置沿着每个针的长度在实体组织中的任何位置处递送实质上等量的流体。
Kodgule等人已经在美国专利申请号2011/0172610中描述了用于跨越生物学的组织递送生物材料的装置。多个由一种或更多种金属制成的并且具有从大约200微米到大约350微米的外径和至少100微米的长度的空心微针被插入装置中，该装置递送肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质和其它药学上的活性成分或其组合。
Gunday等人已经在美国专利申请号2011/0270184中描述了用于向组织递送治疗剂的递送探针。多个针被并入装置中，该装置在活化位置和钝化位置之间移动所连接的囊，来通过针把作用剂从囊中挤出。
Assaf已经在美国专利申请号2011/0218497中描述了多重注射医疗设备。多个针被并入装置中，该装置具有与一个或多个针相连的室和用于在每次注射之后连续地给室再填充医疗流体的工具。
Berenson已经在美国专利申请号2010/0130910中描述了用于透皮递送治疗有效量的铁的方法。可以使用多个针来在角质层中创造多个微通道，以增强在离子电渗贴上离子性铁的透皮递送。
Kodgule等人已经在美国专利申请号2011/0196308中描述了用于跨越生物学的组织递送生物材料的方法。多个包含治疗剂活性成分的可生物降解的显微针被并入递送蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质和其它药学上的活性成分或其组合的装置中。
Desai已经在美国专利申请号2003/0073908中描述了用于向组织细胞递送基因、酶和生物作用剂的方法。多个针被并入一种装置中，该装置被插入身体中并且通过针递送药物流体。
Angel等人已经在美国专利号7,364,568中描述了显微针透皮传送装置。多个针被并入装置中，该装置通过从不同的方向插入表面中的针，把物质转运到身体的表面里。
Dalton等人已经在美国专利号7,150,726中描述了用于皮下的输注的装置。多个针被插入装置中，该装置通过针把流体递送到皮下组织中。
Mikszta等人已经在美国专利号7,473,247中描述了用于通过微套管皮内递送疫苗和基因治疗剂的装置和方法。至少一个空心的显微针被并入装置中，该装置向受试者的皮肤递送疫苗达到在0.025mm和2mm之间的深度。
Down等人已经在美国专利号6,607,513中描述了用于通过皮肤抽取或递送物质的装置。被并入装置中的多个透皮构件具有大约100微米至大约2000微米的长度并且是大约30至50规格的。
Prausnitz等人已经在美国专利号6,743,211中描述了用于通过改善在微针和人皮肤之间相互作用而增强药物和生物分子跨越组织转运的方法。多个微针被并入装置中，该装置能够呈现更加刚性的并且可更少变形的施加微针的表面。
Brown已经在美国专利号4,695,273中描述了多针夹持器和皮下多通道输注口。在针夹持器上的多个针通过输注口的隔膜被插入并且与输注口中分离的室连通。
Horn已经在美国专利号3,552,394中描述了双皮下注射器。被并入装置中的两根针间隔小于68mm并且可以是不同的型式和长度的，因此确保将要被注射到不同的深度。
Pettis等人已经在国际专利申请号WO2003/094995中描述了用于把物质施用到皮肤中的至少两个区室中，用于全身性吸收并且改善药物动力学的方法和装置。具有在大约300um和大约5mm之间的长度的多个针被并入装置中，该装置同时地向皮内的和皮下的组织区室递送。
Zimmerman等人已经在国际专利申请号WO2012/006259中描述了具有针和辊的药物递送装置。位于辊中的多个空心针被并入装置中，当辊旋转时，该装置通过针递送储存器中的内容物。
Nayak已经在美国专利号7,699,803中描述了用于施用多组分治疗的方法。可以把多个注射套管插入装置中，可以在该装置中包括深度槽用于控制治疗物质被递送在组织内所达到的深度。
Yeshurun等人已经分别在美国专利号7,998,119和8,007,466中描述了用于把流体递送到柔性的生物屏障中的装置和方法。在装置上的微针穿透并且伸展到柔性生物屏障中并且通过空心微针的孔注射流体。
如果想要这样的话，可以用作用剂(例如归巢因子)预处理哺乳动物或受试者。例如，可以施用归巢因子以增强细胞靶向组织并且可以把归巢因子置于一个部位以鼓励细胞靶向所要的组织。直接把归巢因子注入组织可以在全身性递送配体靶向的细胞之前进行。
效力的评定
可以由具有普通技术的临床医师通过监测被治疗的病况的一种或更多种症状或标记来评价施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的成功，病况包括诸如先天性瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍这样的病况或其中循环的瘦蛋白水平是低的其它病况。效力的评定包括在一种或更多种病况的指标的任何统学计上显著的改善。当合适时，可以施加关于给定的病况的临床上认可的分级或打分系统，在打分或分级方面的改善指示有效的治疗。
由来自施用其它瘦蛋白治疗的结果可以提供关于评定施用本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的效力的指导。
Licinio J等人(2004)报道了在采用美曲普汀进行皮下治疗以后，在缺乏瘦蛋白的肥胖成人中在几个治疗指数方面的改善。Licinio J等人(2004)报道了增加的身体活力、II型糖尿病和性腺机能减退两者的消除以及体重指数的减小。在6个月的治疗以后，患者的平均体重指数下降到大约36.5kg/m2。在12个月的治疗之后，患者的平均体重指数下降到大约28.9kg/m2。在18个月的治疗之后，患者的平均体重指数下降到大约26.9kg/m2。并且，在2个星期的治疗之后，患者的平均每日热量摄取下降了49％。在6个月的治疗之后，患者的血清瘦蛋白水平增加到大约12.67ng/mL。在6个月的治疗之后，患者的血浆黄体生成素(LH)水平增加到大约2.75毫单位/mL。在18个月的疗程期间，甘油三酯水平下降了至少49％。
Ebihara K.等人(2007)每天使用美曲普汀两次，采用美曲普汀以皮下方式治疗患有一般化脂肪代谢障碍的被治疗的患者。患有一般化脂肪代谢障碍的患者，在1个星期的治疗之内显示在空腹血糖和血清甘油三酯方面的显著改善。在患有一般化或部分的脂肪代谢障碍的患者中，持续四个月的美曲普汀治疗显著地把空腹葡萄糖从184±91mg/dL改善到146±14mg/dL，把血红蛋白A1c从8.5％±2.1％改善到7.3％±0.3％，以及把甘油三酯从479±80mg/dL改善到254±40mg/dL。Ebihara等人(2007)也显示在1个星期的治疗之内，空腹葡萄糖水平从大约172减少到大约120mg/dL，以及甘油三酯水平从大约700减少到大约260mg/dL。
Chan JL等人(2011)报道在3年的美曲普汀治疗期间若干治疗指数的减少。血红蛋白A1c的血浆水平(最初增加了大约8.5％)减小了大约2.1％。血红蛋白A1c(HbA1c)是糖化的血红蛋白并且被表示成占总血红蛋白的百分比，使得更高的百分数反映随着时间的推移，更高的循环中的葡萄糖水平。甘油三酯的血浆水平(最初升高了大约479mg/dL)减小了大约35.4％。在三年的美曲普汀治疗之后，空腹葡萄糖水平从大约184mg/dL下降到大约124mg/dL，血红蛋白A1c水平从大约8.5％下降到大约6.0％，并且甘油三酯从大约743mg/dL下降到大约164mg/dL。Chan等人(2011)参考了Oral EA等人(2002)N.Engl.J.Med.346(8):570-8，其描述了在用于脂肪代谢障碍的瘦蛋白取代疗法之后，测试瘦蛋白、葡萄糖、甘油三酯和糖基化的血红蛋白的结果方法。由Oral等人(2002)以及其它人描述的测试方法为相关的血液、血浆或血清的测试提供了指导。
由Licinio等人(2004)、Ebihara等人(2007)、Chan等人(2011)和Oral等人(2002)提供的结果可以提供关于施用本发明瘦蛋白mRNA制剂的指导。因为施用本发明瘦蛋白mRNA至少与施用美曲普汀一样有效地递送瘦蛋白蛋白质，在七天的瘦蛋白治疗之后，将会有可比较的血浆葡萄糖水平或甘油三酯水平的减小。因为以皮下方式接受美曲普汀的患者持续七天的施用导致葡萄糖和甘油三酯水平的减小，施用本发明瘦蛋白mRNA制剂导致血浆葡萄糖水平减小至少30％以及血浆甘油三酯水平减小至少40％。
在实施例37和实施例38中找到了关于减小血浆葡萄糖水平和血浆甘油三酯水平的另外的指导。
为了描述和公开的目的，通过引用并入所有的专利、通过基因识别号识别的寡核苷酸序列和在本文中鉴定的其它出版物。这包括在专利和出版物中描述的可用于与本发明相联系的方法。所有的关于日期的陈述或关于这些文献内容的陈述都基于可用的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。在引用的来源和在本文中的公开之间存在冲突的陈述的情况下，以在本文中公开中的陈述为准。
单数形式的冠词例如“a”、“an”和“the”可以意指一个或超过一个，除非在上下文中明显地有相反的或其它方式的指示。正如在本文中和在权利要求书中所用的那样，单数形式包括复数参照，反之亦然，除非上下文清楚地另外指示。除了在操作实施例中或其中以别的方式指示以外，在一切情况下，在本文中使用的表示成分的数量或反应条件的所有的数字都应该被理解为被术语"大约"所修饰。
当给出范围时，端点被包括在内。而且，在本发明的不同的实施方式中，被表示成范围的值可以取在所声明的范围之内的任何具体的值或子范围，达到范围的下限的单位的十分之一，除非上下文清楚地以别的方式指令。
随后的实施例举例说明本发明的具体实施方式以及其各种用途。陈列它们仅仅是为了解释性的目的，不应把它们看成是限定本发明。
实施例
实施例1
瘦蛋白DNA的体内药物动力学和效力研究
这个实施例的目的是将要证实从编码瘦蛋白的多核苷酸构建体表达可以递送人瘦蛋白蛋白质。为了确定从人瘦蛋白DNA表达瘦蛋白蛋白质和体内效力，发展和使用了流体动力学的基因递送方法(HDI)。裸的DNA的递送诱导了瘦蛋白蛋白质的表达之后是在ob/ob小鼠中的体内效力。
在HDI之前，记录小鼠的体重和食物重量。根据小鼠的体重对小鼠进行分组.
通过使小鼠在加热灯下温暖～2分钟，小鼠距离加热灯大约12英寸，使小鼠做好注射的准备。
对于流体动力学注射方法，把小鼠置于限制器中并且采用70％酒精清洁它们的尾。把与3ml注射器相连的27规格的蝴蝶针插入尾静脉中，斜面朝上，并且向后拉注射器柱塞以确保血液被抽入注射器中。用短的时间(5-10秒)手工注射所要体积(体重的7％，在3.2ml加帽)的DNA构建体。然后退出针并且通过采用纱布向注射部位加压来止血。
关于在注射以后的护理，把小鼠置于加热垫上用于在监视之下的完全恢复(～15分钟)，然后把它们放回到圈养它们的房间中。然后在最初的48小时内每日监测两次小鼠。
把8-9个星期龄的雄性单圈养的ob/ob小鼠用于体内研究。以每平均组体重30μg、3μg、0.3μg和0.03μg的剂量，把在表1中描述的人瘦蛋白DNA构建体稀释在可注射的盐水中。
在第0天，将动物称重并且按照平均体重分选。按照体重，以上面DNA剂量(然后将其稀释到可注射的盐水中)给小鼠的尾静脉中注射。最后的剂量体积是小鼠体重的7％，具有3.0ml的帽。给小鼠给药。然后，在第1、2、4、7、14和21天中的每一天记录体重、健康和食物摄取(FI)。另外，在第4和7天，采集15μl血浆以评定瘦蛋白蛋白质表达水平。
在流体动力学的注射瘦蛋白DNA之后，按照这个实施例的方法施用的人瘦蛋白在缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠中使体重减少(表4)并且使食物摄取减少(表5)。体脂肪分析证实体重损失完全是由于体脂肪损失所致。
人瘦蛋白蛋白质酶联免疫吸附测定分析。通过酶联免疫吸附测定测量小鼠血浆中的人瘦蛋白。使用PBS重组从R&D systems duoset购买的抗体(目录#_DY398E，对于捕获抗体，分配#_840279，而对于检测抗体，分配#_840280)，并且再一次使用PBS滴定。在白色Maxisorp384孔板(目录#_460372)上，以30μl/孔，4μg/mL给捕获抗体包衣。在室温下孵育整夜之后，吸出捕获抗体并且在室温下采用90μL/孔的KPL乳阻断剂(目录#_50-82-00)阻断板2个小时。一旦孵育完成了，就抽吸板并且在37℃以30μL/孔向板添加重组的标准样品和样品持续2个小时，振摇600rpm。使用酪蛋白样品稀释剂制造样品/标准稀释物。随后使用Teknova板洗液(目录#_P1192)洗涤/吸出3次，100μL/孔。其次，使用酪蛋白检测抗体稀释剂把检测抗体稀释到12.5ng/mL，并且在室温下以30μL/孔添加持续2个小时。在这种孵育以后，再次洗涤板并且向每个孔添加(30μL/孔)以1:1250的稀释度在HRP稀释缓冲剂中的多链霉亲和素-HRP(目录#_21140)的溶液，并且在室温孵育持续30分钟。最后的洗涤/吸出除去了HRP溶液，并且以30μL/孔添加化学发光的底物(目录#_1859678与1859679)。使用具有50ms积分时间的SpectramaxM5板读数器迅速地读取板。酶联免疫吸附测定的动态范围是100-2,000pg/mL的人瘦蛋白。测定适用于来自小鼠、大鼠和食蟹猴的血浆。血浆人瘦蛋白水平被显示在表6中。
药物动力学(PK)和药效学(PD)分析确立了用于抑制食物摄取的瘦蛋白的EC50是1.4ng/mL(85pM)。
实施例2
修饰的合成瘦蛋白mRNA的体外转录和加帽
通过体外转录(IVT)产生了这个实施例的修饰的合成瘦蛋白mRNA，通过氯化锂(LiCl)提纯进行纯化，然后使用可商购的来自New England Biolabs(Beverly MA美国)的试剂盒进行加帽。
原料和试剂被显示在表7中。
正如在表8中所列的那样，把转录反应汇编，对于使用不含RNase的试管、枪头和实际操作要小心.
在这个实施例中关于制造修饰的合成瘦蛋白mRNA的方法如下:
1.在30℃孵育上面材料持续2个小时，同时监测温度。通过添加0.04U/μLDNase消化DNA模板，然后在37℃孵育持续30分钟。
2.添加LiCl到2.81M的最终浓度，充分混合并且在-20℃孵育持续超过一个小时。在4℃以大约20，000xg的最高转速(最大速度)离心混合物持续15分钟。除去上清液并且采用1mL 70％乙醇洗涤小丸。按照上面刚刚描述的方式离心持续10分钟，然后除去上清液并且再次如上所述离心持续少于一分钟。
3.除去剩余的乙醇并且把小丸再悬浮在不含核酸酶的水中。观察小丸的溶解并且在37℃用移液管上下地移液和孵育以帮助小丸溶解。测定浓度并且调节到～1μg/μL。
4.添加10％体积的3M pH 5.5的乙酸钠并且充分混合。添加1个体积的室温异丙醇并且充分混合。在-20℃孵育一整夜。在4℃以大约20,000xg的最高转速(最大速度)离心混合物持续15分钟。除去上清液并且采用1mL70％乙醇洗涤小丸。按照上面刚刚描述的方式离心持续10分钟，然后除去上清液并且再次如上所述离心持续少于一分钟。
5.除去剩余的乙醇并且把小丸再悬浮在不含核酸酶的水中。小心地观察小丸的溶解并且在37℃用移液管上下地移液以帮助小丸溶解。测定浓度并且调节到～4μg/μL。
然后可以把修饰的合成瘦蛋白mRNA贮藏在-80℃直到加帽，并且在解冻时再次测定浓度。
关于加帽，所使用的方法是新英格兰生物实验室(New England BioLabs)的方法。在65℃把合成瘦蛋白mRNA和水的混合物加热变性持续10分钟，然后转移到冷的区域以淬火持续5分钟。刚好在使用前，把S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的储备溶液(32mM)以1:8稀释在水中至4mM，然后以表9中所指定的顺序添加剩余的反应组分。
然后，在37℃孵育混合物持续1个小时。如上所述通过LiCl沉淀纯化样品，贮藏在-80℃。
实施例3
FPLC纯化修饰的合成瘦蛋白mRNA
在快速蛋白质液相层析(FPLC)柱(Semi-Prep RNA Sep 21×100mm柱(Transgenomic Inc.目录#_RPC-99-2110))上纯化本发明修饰的合成mRNA。把柱放在温度被设定在50℃的柱加热器(Timberline Instruments(目录#_TL-105)中，并且采用5个柱体积的62％的波最优化的缓冲液A(0.1M醋酸三乙基铵，pH 7.0)(Transgenomic Inc.目录#_553401))和38％波最优化的缓冲液B(0.1M醋酸三乙基铵，pH 7.0，25％乙腈)(Transgenomic Inc.目录#_553402)进行预平衡。一个柱体积等于35mL。
把1.5mL每种修饰的合成mRNA溶液注射到2mL样品环管中。然后，按照表10中描述的梯度开始FPLC运转。把流速设置在5mL/分钟。
汇集级分，并且通过异丙醇和乙酸钠沉淀分离修饰的合成mRNA。汇集与第一mRNA峰值(在注射后～23分钟洗脱)相关联的级分。
采用Amicon Ultra-15离心滤器装置，30K(Millipore目录#_UFC 903024)在22℃浓缩样品，在4750rpm下持续15分钟，并且通过采用水稀释浓缩物以及放置混合物使其通过离心器两次而把缓冲液换成水。
把浓缩的mRNA样品转移到微量离心管，并且采用1/10体积的pH 5.5的3M乙酸钠(Ambion#_AM9740)和2x体积的2-丙醇以及1/100体积的GlycoBlue(Ambion目录#_AM9515)使mRNA沉淀，并且在-20℃保持一整夜。
在4℃离心混合物持续15分钟。除去上清液，并且用1mL冷的70％乙醇(Sigma目录#_459844)洗涤小丸。离心混合物持续3分钟，并且除去上清液。
把小丸再悬浮在不含核酸酶的水(Life Technologies目录#_10977-015)中。在37℃用移液管移动和孵育持续大约5-10分钟，帮助小丸溶解。测定浓度并且调节到～1.5mg/mL。然后把mRNA贮藏在-80℃直到加帽，并且在解冻时再次测定浓度。
实施例4
通过HPLC纯化mRNA
通过高效液相色谱法纯化本发明修饰的合成mRNA。使用Shimadzu SCL-10A VP系统控制器来同步分离到SIL-10AP自动取样器、LC-8A液相色谱仪、SPD-20A紫外线/可见光检测器和FRC-10A级分收集器。把Phenomenex Luna C18(2)30x 100mm 5μ反相高效液相色谱柱用于hLeptin mRNA的色谱分离。把柱容纳在Timberline Instruments T105双柱和流动相加热装置中。试剂被列在表11中。
使用5ml的环，通过6-8次注射，以4mg/mL在0.1M TEAA和4.5％乙腈中的浓度，把100mg的mRNA负载到柱上。流动相A是0.1M在水中的TEAA，而流动相B是0.1M在90:10的乙腈:水中的TEAA。对于全部梯度，使流速保持恒定在10mL/分钟，并且使高效液相色谱柱和流动相两者都一直保持在65℃。用于高效液相色谱运转的时间程序被显示在表12中。一旦260nm波长读数到达20mV，就把人瘦蛋白mRNA收集在12毫升级分中。继续试样收集直到高效液相色谱峰值的尾端在20mV以下。
在任何下游的测试和应用之前，把高效液相色谱级分的缓冲液转换成水。在具有三个Pellicon3 88cm2盒子的Millipore CogentμScale TFF上进行缓冲液转换。把个别的LC级分或合并的级分倒入所述装置的样品室中，并且转换至少100x变成不含热原和RNase的水。把样品在水中的最终体积最优化以确保人瘦蛋白mRNA的最终浓度至少为1mg/mL。把在水中的人瘦蛋白mRNA样品贮藏在-80℃直到加帽，并且当需要用于体内实验时，在解冻时再次测定浓度。
实施例5
把修饰的合成瘦蛋白mRNA包装在递送运载体中
在这个实施例中使用的原料如下:
在阳离子脂质胺基与mRNA磷酸基(N:P)的摩尔比率＝4:1下，把本发明的修饰的合成mRNA包装在脂质纳米微粒中，透析，并且浓缩。例如，显示用于实验规程的数量导致以>0.4mg/mL mRNA的浓度，～2mg包装的修饰的合成mRNA。
使用不含RNase的试剂、试管、枪头和实际操作，将脂质纳米微粒混合物试剂称重并且混合在表14中描述的小瓶中。
为了便于加工，把乙醇(8.8mL)添加到脂质中，其代表所需要的体积比率的1.1x。在37℃将混合物简单地超声处理并且温和地搅拌持续5分钟。然后，在37℃没有搅拌下孵育混合物直到准备好使用。
通过把mRNA溶液负载到Amicon Ultra-15离心装置上，并且在4℃以4,000rpm离心持续15分钟，来把修饰的合成mRNA从水中转换到pH 6.0缓冲液中。把浓缩的mRNA再悬浮在pH 6.0柠檬酸缓冲液中，并且测定mRNA浓度。
在清洗过的闪烁小瓶中配制了在pH 6.0柠檬酸缓冲液中的0.5mg/mL的最终修饰的合成mRNA浓度(4mg mRNA在8mL中)，并且测定了mRNA溶液的最终浓度。在37℃孵育mRNA稀释物，直到准备好使用。
制备了三个10ml注射器，每个具有8mL的:(a)脂质混合物；(b)mRNA溶液；(c)柠檬酸缓冲液。使注射器(a)和(b)与T形接头的Leur配件连接。简单来说，使具有0.5mm内径的P727T-混合器与P652适配器(IDEX，Oak Harbor WA美国)相连。使注射器(a)和(b)与P658路厄配件(IDEX)连接。通过具有P938x螺母和套圈(IDEX)的PTFE 0.8mm内径的管材(#_3200068，Dolomite，Royston，英国)，使注射器(a)和(b)与T-形混合器连接。使注射器(c)与路厄配件连接，后者通过P938x螺母和套圈与最后的单管相连。管的末端被一起固定在预冲洗的具有搅拌棒并且被温和地搅拌的烧杯的上方。
把注射器泵的设置设定到合适的注射器制造商和尺寸，并且输入体积(8mL)和1.0mL/分钟的流速。启动泵，并且把所得的材料收集到具有搅拌棒的不含RNase的50mL塑料烧杯中。把包含mRNA的脂质纳米微粒的悬浮液转移到透析管中，每个袋2-3mL，然后在4℃向磷酸缓冲盐水(PBS)中透析整夜。
把分开的材料汇集到一个15mL锥形管中。使用切向流过滤(TFF)浓缩脂质纳米微粒(LNP)悬浮液。使用新鲜的管材使新鲜的500K分子量截止囊与Minimate系统连接，通过用500mL不含RNA的水以150rpm的流速冲洗而制备TFF系统。
把脂质纳米微粒/修饰的合成mRNA悬浮液负载到TFF装置的贮存器中，然后以75mL/分钟的流速浓缩到2-3ml最终体积。
使用来自Life Technologies(Grand Island NY美国)的Quant-iT RibogreenRNA Assay试剂盒测量修饰的合成mRNA的包裹％。通过在缓冲液中(微粒外面的mRNA)和在缓冲液加去污剂中(总的mRNA)的荧光测量，测定脂质纳米微粒/修饰的合成mRNA悬浮液。从所提供的核糖体RNA制备了1000ng/mL储备液，并且使用储备液来产生用于Ribogreen测定的标准曲线，遵照表15中所示的TE和TE+0.75％Triton X-100的比率。为了测定，把样品配制在TE缓冲液或TE加Triton中，并且向每一个中添加荧光试剂。计算的差是微粒内部的mRNA。
把样品配制在TE缓冲液和TE缓冲液+0.75％Triton X-100中，其具有合适的稀释度，使得读数在标准曲线中(400-600倍)。在96孔板中，向每个孔添加100μL标准/样品。以1:200把Ribogreen试剂稀释在TE缓冲液中并且向每个孔中添加100μL。
使用荧光小平板读数器测量样品在480nm处激发，在520nm处发射的荧光。从每个RNA样品的荧光值中减去所述试剂的空白测定的荧光值，产生荧光对RNA浓度的标准曲线。从每一个样品的荧光值中减去所述试剂的空白测定的荧光值，并且从标准曲线确定样品的RNA浓度。通过用样品加Triton和仅仅样品之间的浓度差除以样品加Triton浓度，测得了样品的包裹％。产生了脂质纳米微粒/修饰的合成悬浮液的6倍稀释物，并且使用ZetasizerNano ZS仪器(Malvern Instruments，Ltd，Worcestershire英国)测定了直径和多分散指数。
实施例6
包裹在阳离子脂质A中的瘦蛋白mRNA；体内药物动力学研究
在静脉内和皮下递送本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA以后，诱导了瘦蛋白蛋白质的表达。瘦蛋白蛋白质的表达(正如通过在实施例1中描述的酶联免疫吸附测定所测定的那样)导致在缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠中的体内效力。
为了向小鼠施用在阳离子脂质A中的修饰的合成mRNA所使用的材料被详细地列在表16中。
实施例7
小鼠静脉内尾静脉注射修饰的合成瘦蛋白mRNA
在尾静脉注射之前，记录小鼠体重并且将膳食称重，按照小鼠的体重将它们分组。通过使小鼠在加热灯下面温暖持续～2分钟来准备小鼠，小鼠距离加热灯大约12英寸。
关于尾静脉注射方法，把小鼠置于限制器中并且采用70％酒精清洁它们的尾部。把与1ml注射器(Becton Dickinson，目录#_309659)相连接的27规格的针(BectonDickinson，目录#_305109)插入尾静脉中，斜面朝上，并且向后拉注射器塞以确保把血液抽入注射器中。采用中等压力和速度手工注射所要体积的修饰的合成瘦蛋白mRNA。然后退出针并且通过采用纱布向注射部位加压来止血。
把单个圈养的8-9星期龄的雄性C57BL/6小鼠用于体内研究。把其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的FPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)包裹在阳离子脂质A中(N:P摩尔比率＝8:1)，然后以每平均组体重10μg的剂量稀释在可注射的盐水中。
在第0天，将动物称重并且按照平均体重分类。在第1-7天和第9、11和16天中的每一天，给小鼠给药，并且记录食物摄取(FI)。
按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测量人瘦蛋白蛋白质水平。将在静脉内施用在阳离子脂质A中的瘦蛋白mRNA之后的瘦蛋白蛋白质水平详细地列在表17和图5中。
按照这个实施例方法向瘦的小鼠静脉内递送人瘦蛋白mRNA导致在血浆中19ng/mL的瘦蛋白水平，其超过在实施例1中测定的用于在缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠中抑制食物摄取的1.4ng/mL的EC50 10倍以上。
实施例8
小鼠皮下注射修饰的合成瘦蛋白mRNA
在皮下注射之前，记录小鼠体重并且将膳食称重，按照小鼠的体重将它们分组。以人工方式限制小鼠并且放置在工作台面上。捏它们的颈背并且脱离开下面的肌肉，向其中的空间中插入一根与1mL注射器相连接的25规格的针。以这样一种方式向后拉注射器柱塞，以确保没有液体被抽入注射器中，然后以中等压力和速度手工注射所要体积的瘦蛋白mRNA。然后退出针并且让小鼠回到它们的笼子中。
把8-9星期龄的雄性C57BL/6小鼠用于体内研究。以每平均组体重10μg的剂量，把其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代(N:P摩尔比率＝8:1)的包裹在阳离子脂质A中的FPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)稀释在可注射的盐水中。
在第0天，把动物称重并且按照平均体重分类。在上午9点向小鼠给药并且在第0天上午9点采集血液。也在第1和2天中的每一天上午9点采集血液并且评定瘦蛋白蛋白质水平。也记录体重和食物摄取。
按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测量人瘦蛋白蛋白质水平。将在皮下施用在阳离子脂质A中的瘦蛋白mRNA之后的瘦蛋白蛋白质水平详细地列在表18和图5中。
按照这个实施例方法向瘦的小鼠皮下递送人瘦蛋白mRNA导致在血浆中1.4ng/mL的瘦蛋白蛋白质水平，其等于在实施例1中测定的用于在缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠中抑制食物摄取的EC50。
实施例9
采用阳离子脂质A包裹的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的瘦蛋白mRNA的药 效学
这个实施例的目的是将要证明人瘦蛋白对具有遗传性瘦蛋白缺陷的小鼠模型的体重和食物摄取的特异性影响。通过施用FPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)来递送人瘦蛋白，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，并且瘦蛋白mRNA被包裹在阳离子脂质A中并且以静脉内方式被施用。
所使用的小鼠是来自Jackson Labs的9个星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、包装在阳离子脂质A(N:P摩尔比率＝4:1)中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)或对照修饰的合成小鼠红细胞生成素mRNA(SEQ ID NO:12)。按照实施例7中描述的方式给小鼠的尾部注射。
三只小鼠接受PBS(A组)。三只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。三只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成小鼠红细胞生成素mRNA(C组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。在研究开始时，也把它们的食物称重。在第1、2、3、4、5、6、7和8天在上午9点，把所有的小鼠称重并且把它们的食物称重。
图2A和图2B B代表这个研究体重和食物摄取结果。
实施例10
采用阳离子脂质A包装的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的瘦蛋白mRNA的药 物动力学
这个实施例的目的是将要显示在施用FPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)之后，在具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型中人瘦蛋白蛋白质的表达水平，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，其中mRNA被包装在阳离子脂质A中并且以静脉内方式被施用。
所使用的小鼠是来自Jackson Labs的9个星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、包装在阳离子脂质A(N:P摩尔比率＝4:1)中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)或对照修饰的合成小鼠红细胞生成素mRNA(SEQ ID NO:12)。按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
三只小鼠接受PBS(A组)。三只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。三只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成小鼠红细胞生成素mRNA(C组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。也在所述研究的随后的每一天在上午9点把所有的小鼠称重。
在第0天在下午3:00(在给药以后6小时)，然后在第1、2和4天在上午9点，通过尾部切口给来自每个组的小鼠放血。分离血浆并且测定人瘦蛋白或小鼠红细胞生成素水平。
图2C代表按照在实施例1中实验规程测定的这个研究的血浆中人瘦蛋白水平的结果。关于支持图2C的工作，在接受mEPO mRNA(54，582pg/mL，以6个小时)的小鼠中，mEPO蛋白质的表达是高的，证实了mEPO mRNA的递送。
实施例11
采用阳离子脂质B包装的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的瘦蛋白mRNA的药 效学
这个实施例的目的是将要证明人瘦蛋白对具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型的体重、食物摄取的影响。通过施用HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)来递送人瘦蛋白，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，并且瘦蛋白mRNA被包装在阳离子脂质B中并且以静脉内方式被施用。
所使用的动物是来自Jackson Labs的12星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00–18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、包裹在阳离子脂质B(N:P摩尔比率＝4:1)中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
五只小鼠接受PBS(A组)。五只小鼠以0.02mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。五只小鼠以0.06mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。五只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。在研究开始时，也把它们的食物称重。在第1、2、3、4、5、6和7天在上午9点，把所有的小鼠称重并且把它们的食物称重。
图3A和图3B代表这个研究体重和食物摄取结果。
实施例12
采用阳离子脂质B包装的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的瘦蛋白mRNA的药 物动力学
这个实施例的目的是将要显示在施用HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)之后，在具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型中人瘦蛋白蛋白质的表达水平，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，其中瘦蛋白mRNA被包装在阳离子脂质B中并且以静脉内方式被施用。
所使用的动物是来自Jackson Labs的16星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、包装在阳离子脂质B(N:P摩尔比率＝4:1)中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
五只小鼠接受PBS(A组)。三只小鼠以0.6mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。也在所述研究的随后的每一天在上午9点把所有的小鼠称重。
在第0天在下午3:00(在给药以后6个小时)，然后在第1、2、3、4、5、6和7天在上午9点，通过尾部切口给来自每个组的小鼠放血。分离血浆并且按照实施例1的酶联免疫吸附测定方法测定人瘦蛋白蛋白质水平。
图3C代表这个研究的血浆中人瘦蛋白蛋白质的结果。
实施例13
采用阳离子脂质C包装的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的瘦蛋白mRNA的药 效学
这个实施例的目的是将要证明瘦蛋白蛋白质对具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型的体重、食物摄取的影响。通过施用HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)来递送人瘦蛋白，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，并且其被包装在阳离子脂质C中并且以静脉内方式被施用。
所使用的动物是来自Jackson Labs的10星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00–18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、包裹在阳离子脂质C(N:P摩尔比率＝4:1)中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
五只小鼠接受PBS(A组)。五只小鼠以0.02mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。五只小鼠以0.06mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。五只动物以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。在研究开始时，也把它们的食物称重。在第1、2、3、4、5、6和7天在上午9点，把所有的小鼠称重并且把它们的食物称重。
图4A和图4B代表这个研究体重和食物摄取结果。
实施例14
采用阳离子脂质C包装的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的瘦蛋白mRNA的药 物动力学
这个实施例的目的是将要显示在把其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)包装在阳离子脂质C中并且以静脉内方式向具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型施用之后，人瘦蛋白蛋白质的表达水平。
所使用的动物是来自Jackson Labs的10星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00–18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、以4:1的N:P摩尔比率包装在阳离子脂质C中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
三只小鼠接受PBS(A组)。三只小鼠以0.02mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。三只小鼠以0.06mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。三只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。也在所述研究的随后的每一天在上午9点把所有的小鼠称重。
在第0天在下午3:00(在给药以后6个小时)，然后在第1、2、3、4、5、6和7天在上午9点，通过尾部切口给来自每个组的小鼠放血。分离血浆并且按照实施例1中酶联免疫吸附测定方法测定人瘦蛋白蛋白质水平。
图4C代表这个研究的血浆中人瘦蛋白蛋白质的结果。
实施例15
采用阳离子脂质B或阳离子脂质C包裹的并且向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的小 鼠红细胞生成素mRNA的药物动力学
这个实施例的目的是将要显示在施用HPLC纯化的被包装在阳离子脂质B或阳离子脂质C中并且以静脉内方式被施用的小鼠红细胞生成素mRNA(SEQ ID NO:12)之后，缺乏对具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型的体重和食物摄取的影响，所述mRNA中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代。
所使用的动物是来自Jackson Labs的8星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、以4:1的N:P摩尔比率包装在阳离子脂质B或阳离子脂质C中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的修饰的合成小鼠红细胞生成素(mEPO)mRNA(SEQ ID NO:12)。按照实施例7中描述的方式给小鼠的尾部注射。
五只小鼠接受PBS(A组)。五只小鼠以0.02mpk的剂量接受在阳离子脂质B中的所述修饰的的合成mEPO mRNA(B组)。五只小鼠以0.2mpk的剂量接受在阳离子脂质C中的修饰的合成mEPO mRNA(C组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。在研究开始时，也把它们的食物称重。在第1、2、3、4和7天在上午9点，把所有的小鼠称重并且把它们的食物称重。
图3D和图4D代表这个研究的结果。对于支持图3D的工作，在接受mEPO mRNA(892，633pg/mL，以6个小时)的小鼠中，mEPO蛋白质的表达是高的，证实了mEPO mRNA的递送。对于支持图4D的工作，在接受mEPO mRNA(158，865pg/mL，以6个小时)的小鼠中，mEPO蛋白质的表达是高的，证实了mEPO mRNA的递送。
实施例16
在C57BL/6小鼠中，对采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白的毒性和耐受性 研究
这个实施例描述采用阳离子脂质C包装的并且以静脉内方式(4mpk)和以皮下方式(2mpk)施用的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)怎么在小鼠中一般是安全的。
雄性C57BL/6小鼠(3只动物/组)要么以皮下方式或以静脉内方式接受磷酸缓冲盐水(PBS)并且充当对照，要么接受采用阳离子脂质C作为阳离子脂质配制在脂质纳米微粒中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)的给药。表19描绘了研究设计。表20描绘制剂的特征。所述研究的小鼠在其臂的静脉内接受大约10mL/kg的剂量体积。在给药之前，给以皮下方式给药的小鼠剃毛。在研究结束时(在给药之后大约24和72小时)，提交分配到所述研究的合适段的所有小鼠用于尸检，记录它们的最终体重并且采集血样用于临床化学。
通过心脏的穿刺采集血样并且保存在平试管中。使用6000分析仪(Roche Diagnostics)，测定了下列参数:天冬氨酸转氨酶(AST)；总胆红素；丙氨酸转氨酶(ALT)；总蛋白；碱性磷酸酶；白蛋白；尿素；球蛋白；肌酸酐；肌酸激酶(CK)；葡萄糖；白蛋白/球蛋白比率。
临床化学变化发生在给药后72小时时并且被描绘在表21中。
以静脉内方式用采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)给药的小鼠具有减小的蛋白质值，没有相应的显微变化。另外，在被以静脉内方式给药的小鼠中减少的血液尿素氮(BUN)表明减少的食物摄取。
变化反映采用皮下施用采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ IDNO:4)的最小的炎症(减小的总蛋白，具有减少的白蛋白、增加的球蛋白和减小的白蛋白-球蛋白比率)。这些变化与显微的嗜中性白细胞的脾浸润和皮肤的serocellular crust相对应。
在尸检时，记录脾、肝脏和肾的重量并且把来自所有动物的这些组织与肺一起固定在10％中性的缓冲液福尔马林中并且以常规方式加工而产生适合于显微评估的着色的组织切片。
没有检测到与修饰的合成瘦蛋白mRNA有关的器官重量变化。没有观察到与修饰的合成瘦蛋白mRNA有关的易见的变化。在以皮下方式用采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)给药的小鼠中，在给药以后在72小时时仅仅在一只动物中清楚地出现与测定物品有关的皮肤变化(皮下的和皮肤的炎性细胞浸润)。在脾中的显微观察(增加的所述红髓的多孔性或嗜中性的浸润或两者)被认为是对任何皮肤刺激反应性的和继发性的。
以静脉内方式用采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)给药的小鼠具有异常的肝脏中血管内细胞、增加的脾红髓中的多孔性和肺血管病和血栓形成(1/3的动物)。
在给药以后72小时，以静脉内方式用采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)给药的一只小鼠具有肺血管病。
实施例17
采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA；体内初步的临床前安全性研究
这一实施例的目的是要测定来自通过向小鼠静脉内(IV)注射制剂而递送的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)的施用的蛋白质的表达，所述mRNA中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代且在阳离子脂质C中被包装。正如通过酶联免疫吸附测定所测定的那样，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA诱导了瘦蛋白蛋白质的表达。也分析了毒性和耐受性。
按照上述实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
采用单独圈养的8-9星期龄的雄性ob/ob小鼠进行体内研究。以用于这个实施例的4mpk的剂量给予它们包装在阳离子脂质C中并且稀释在可注射的盐水中的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)(N:P摩尔比率＝4:1)。使用了盐水对照。
三只小鼠接受盐水对照。一个组的三只小鼠每只以4mpk的剂量接受包装在阳离子脂质C中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。在第0天，将小鼠称重并且按照它们的体重将它们分组，然后基于它们的分组给它们给药。记录食物重量。
在第1天(在给药以后24小时)，杀死所有的小鼠并且记录体重和食物重量，同时视觉观察小鼠行为和活动。
通过心脏穿刺采集血液:血清用于ALT/AST/ALP/胆红素(总的和活性的)(150至250μl)；血浆用于酶联免疫吸附测定(15μl)。
收集肝脏、脾和肾。记录完整的组织重量。
在研究中观察到与剂量成比例的瘦蛋白蛋白质的暴露。以4mpk的剂量(其超过在ob/ob小鼠中0.2mpk剂量的20倍)在瘦的C57BL/6小鼠中给药包装在阳离子脂质C中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。观察到185ng/mL的处于循环中的瘦蛋白蛋白质水平。
实施例18
采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA；采用重复的剂量的体内 药物动力学和效力研究
为了测定包装在阳离子脂质C中的修饰的合成瘦蛋白mRNA的蛋白质表达和体内效力，按照实施例7实验规程，使用重复地静脉内(IV)注射来向小鼠递送采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。通过在ob/ob小鼠中体内效力来跟踪递送修饰的合成瘦蛋白mRNA所诱导的瘦蛋白蛋白质的表达。
按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
采用单独圈养的12星期龄的雄性ob/ob小鼠进行体内研究。以用于研究的0.2mpk的剂量给予小鼠采用阳离子脂质C包装的稀释在可注射的盐水中的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。使用了盐水对照。
药物动力学。一个组的5只小鼠接受盐水对照，而一个组的5只小鼠以0.2mpk(10μg)的剂量接受采用阳离子脂质C包装的本发明HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代。分开的用于测定瘦蛋白蛋白质表达的动力学和用于测定瘦蛋白mRNA的效力的小鼠组是必要的，因为所述重复的采血行为本身的压力将会引起小鼠体重减轻。在五天中的每一天，将小鼠称重并且分类，使得每个组的平均体重是相同的。也将食物称重。
在第0天，在上午(早晨)9点向小鼠给药，并且在下午3点(下午)通过尾部切口放血用于瘦蛋白分析(15μl的血浆)。在第3、7、10、14、14和17天，在上午9点向小鼠给药。在第1、2、4、8、11、15和18天，在上午9点，将小鼠称重，并且通过尾部切口放血，用于瘦蛋白分析(15μl的血浆)。按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测定在血浆中人瘦蛋白蛋白质水平。在这个实施例中测定的瘦蛋白蛋白质水平被列在表22中。在第一次给药以后，在时间点6、24和48小时测定瘦蛋白蛋白质水平，并且在最后的给药以后24小时，测定随后的蛋白质水平。
药效学。6只动物接受盐水对照。一个组的6只小鼠每只以0.2mpk(10μg)的剂量接受采用阳离子脂质C包装的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代。把动物称重并且分类，使得每个组的平均体重是相同的。
在第1天，在上午(早晨)9点，向小鼠给药。在第1、2、4、8、9、11-13、15、16、18-20、22和23天，仅仅记录体重和食物摄取。在第3、7、10、14、17和21天，在早晨最先记录体重和食物摄取，并且在上午9点向小鼠给药。
采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的重复治疗得到持续的体重降低和瘦蛋白蛋白质的表达。每个星期两次持续三个星期给药采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)(总共6个剂量，由箭头代表)，并且在每个剂量以后，观察体重的减少和瘦蛋白蛋白质水平的保持，正如在表23中详述的那样。
实施例19
采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA；体内稳定性研究
为了测定包装在阳离子脂质C中(N:P摩尔比率＝4:1)的其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的HPLC纯化的人瘦蛋白信使RNA(SEQ ID NO:4)的稳定性，使用静脉内(IV)注射在各种时间点向小鼠递送采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA。递送瘦蛋白mRNA诱导了瘦蛋白蛋白质的表达，并且比较了在所有的时间点的表达水平。
按照实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
采用单独圈养的10星期龄的雄性C57BL/6小鼠进行体内研究。以用于研究的0.4mpk的剂量给予小鼠包装(N:P摩尔比率＝4:1)在阳离子脂质C中并且稀释在可注射的盐水中的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。使用了盐水对照。
4只小鼠接受了盐水对照。一个组的4只小鼠每只以0.4mpk(10μg)的剂量接受采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。
在第1天以及在第1、2、4和8个星期，把动物称重并且分类，使得每个组的平均体重是相同的。在上午9点向小鼠给药，然后在24小时时称重和放血，用于瘦蛋白水平(3个等分试样)。
在静脉内递送以后，通过按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测定瘦蛋白蛋白质表达来测定采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA的稳定性。采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA被用来遵照最初的制剂日期在第1、7、14、28和56天向小鼠给药，并且在每次给药之后24小时测定瘦蛋白蛋白质水平。在制备了采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA之后56天，在施用之后，瘦蛋白蛋白质水平减小了～60％。
实施例20
包装在阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA在食蟹猴中的药物动力学和药效学
这个实施例的目的是要检查以0.6mg/kg的剂量在猴子中在静脉内施用包装在阳离子脂质C中的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)以后，瘦蛋白的药物动力学(PK)和药效学(PD)，所述mRNA中尿嘧啶核苷被取代为假尿嘧啶核苷。研究了血浆中的瘦蛋白蛋白质水平、血液化学和在血浆或血清中的脂质水平。
表24描绘了为这个实施例而设计的研究。表25描绘了所述制剂的特征。正如在表26中描绘的那样，采集血样。在隐静脉或股静脉处，把血液样品采集到注射器中。分析了全血的血液化学。采集血清用于血清化学，并且采集血浆用于瘦蛋白酶联免疫吸附测定和脂类代谢。
以0.6mpk的剂量，使用采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白(SEQ ID NO:4)，以静脉内方式向三只猴子给药。在药物产品处理以后4小时时观察到129ng/mL的峰值瘦蛋白表达。这证实从啮齿动物到食蟹猴的瘦蛋白表达的翻译。
在实施例的条件下，以0.6mg/kg的剂量，以静脉内方式向雄性食蟹猴施用采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA产生了基于临床病理学参数的炎性变化，并且增加了促炎细胞因子和趋化因子。另外的临床病理学改变表明肝脏和肌肉的变化。还有抗炎细胞因子IL-1RA的增加。所有这些变化在早期时间点是最突出的并且经过24小时(在细胞因子的情形中)或72小时(临床病理学)大多是正常的。
正如如下所述，以0.6mg/kg向食蟹猴静脉内单次给药采用阳离子脂质C包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)被很好地耐受并且产生炎性变化和绝大多数最小的显示肝脏和肌肉损害的改变。
把用于血液学的血样采集到EDTA抗凝血剂中。使用ADVIA分析仪测定了下列参数:红细胞计数、白血细胞计数、血红蛋白、嗜中性白细胞计数、血细胞比容、淋巴细胞计数、平均红细胞体积、单核细胞计数、平均红细胞血红蛋白(Mean CorpuscularHemoglobin)、嗜酸性粒细胞计数、平均红细胞血红蛋白浓度、嗜碱性粒细胞计数、网织红细胞计数、不染色大细胞计数和血红蛋白计数。
通过心脏穿刺采集血样并且保存在平试管中。使用Cobas 6000分析仪测定了下列参数:天冬氨酸转氨酶(AST)；总胆红素；丙氨酸转氨酶(ALT)；总蛋白；碱性磷酸酶；白蛋白；尿素；球蛋白；肌酸酐；肌酸激酶(CK)；葡萄糖；白蛋白/球蛋白比率；钠；磷；钾；胆固醇；氯化物；甘油三酯；钙；和镁。
把Invitrogen Cytokine Monkey Magnetic 28-Plex Panel(试剂盒目录号:LPC0003M，Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)用于列在表27中的被分析物的测定。基于1:2的稀释系数，使低于定量下限的值作为定量的下限(LLOQ)进入数据表。在有些情况下，LLOQ是不同的，因为使用不同的稀释度用于它的计算。把Bioplex 200(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA)用于分析(软件版本:Bio-Plex ManagerTM 5.0SecurityEdition，Build 531)并且使用Microsoft2010来促进数据处理并且将原始数据包括在内。
结果。没有发生显著的血液学变化。临床化学变化被描绘在表28中。以0.6mg/kg的剂量静脉内施用采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA在两个时间点都引起临床化学改变，反映了在给药以后24小时时最小的肝细胞变化(增加的AST、ALT，减小的白蛋白)和潜在的肌肉变化(增加的AST和CK)。由减少的白蛋白指示了微妙的炎性变化(另外还有下面详细描述的促炎细胞因子的增加)。主要地在给药以后24小时时的减少的甘油三酯可能已经反映了对脂质代谢的影响，减少的食物摄取或者可能起因于生物变异。
当把值与给药之前相比时，使用采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA以0.6mg/kg的剂量，以静脉内的方式给药以后，注意到增加的细胞因子、趋化因子和生长因子浓度。如果被分析物在给药之前的值低于定量的下限(LLOQ)，则使用LLOQ计算倍数变化。当血清被分析物水平高于ULOQ(关于动物#_3，在6小时时的MCP-1)时，使用所述定量的上限来计算倍数增加(ULOQ)。
早在给药以后2小时时在所有的三只动物中注意到几个与测试物品有关的变化，并且在给药以后经过24小时，这些变化中的大多数回到给药之前的水平。还有一些被分析物仅仅在一只动物中提高了。这些后者的变化与治疗的关系不能被排除，因为它们高于给药之前的值并且因为在这些相同的猴子中细胞因子被增加了。
从给药以后2小时经过给药以后6小时，包括两端在内，在所有的三只猴子中发生了血清IL1RA水平的增加，在给药以后经过24小时，水平恢复正常；在至少一只动物中在一个时间点，最大的增加量级是大约12倍。同时在所有的动物中，从给药以后2小时到给药以后6小时，血清IL6水平被提高了(在一个时间点在至少一个猴子中超过100倍)，经过24小时，血清IL6水平回到给药之前的值。在给药以后2小时时，血清MCP-1水平被增加了，包括直到在给药以后6小时时超过100倍的增加和在给药以后24小时时大约2倍的增加以及在给药以后72小时时给药之前的值。在给药以后4小时时在所有的三只动物中血清I-TAC(CXCL11趋化因子)水平被增加了，并且在6小时时仍然被提高了(在一只动物中提高了至多78倍)。经过24小时，I-TAC水平被提高了至多8倍并且在给药以后经过72小时回到给药之前的水平。另外，在动物#_1和#_3中，大约3倍的增加发生在血清VEGF水平方面，但是在动物#_2中没有发生。这些增加都是在给药以后在2、4或6小时时看到的。表29描绘了4种具有最一致的提高的被分析物的随时间变化。
表29显示在血清细胞因子和趋化因子水平中观察到与给药之前的值相比，与向雄性食蟹猴施用采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA有联系的显著变化。
在实施例的条件下，基于临床病理学参数和增加的促炎细胞因子和趋化因子，以0.6mg/kg以静脉内方式向雄性食蟹猴施用采用阳离子脂质C构建体包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA产生炎性变化。另外的临床病理学改变表明肝脏和肌肉的变化。在抗炎细胞因子、IL-1RA方面也有增加。在早期时间点，所有这些变化都是最突出的，并且经过24小时(在细胞因子的情形中)或72小时(临床病理学)，所有这些变化大部分都是正常的。
瘦蛋白本身通过增加促炎细胞因子和抗炎细胞因子两者而具有免疫调节效应(在体外在周围血液单核细胞中刺激TNFα、IL-6和IFNγ以及IL-1RA。参见Juge-Aubry CE和Meier CA(2002)Mol.Cell Endocrinol.194(1-2):1-7)。
总之，向食蟹猴静脉内单次给药采用阳离子脂质C包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA产生炎性变化，这些变化在72小时之后被消除和大部分是最小的表明肝脏和肌肉受损害的变化。基于这个实施例结果，在食蟹猴中0.6mg/kg的剂量被很好地耐受。
实施例21
采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA；体内初步的临床前安全 性研究
在这个实施例中，采用单独圈养的8-9星期龄的雄性C57BL/6小鼠进行体内研究。以用于研究的7mpk的剂量给予小鼠包装在阳离子脂质B(N:P摩尔比率＝4:1)中并且稀释在可注射的盐水中的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代。使用了盐水对照。
在第0天，按照实施例7中描述的方式，给予小鼠尾部静脉内注射。
正如在表30中详述的那样，三只小鼠接受盐水对照(A组)并且一个组的三只小鼠每只以7mpk的剂量接受采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。在1天杀死A和B组的小鼠。三只小鼠接受盐水对照(C组)，并且一个组的三只小鼠每只以7mpk的剂量接受采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。在第3天杀死C和D组的小鼠。表31描绘了所述制剂的特征。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重分组，然后基于它们的分组向它们给药。记录食物重量。
在第1天，杀死所有的来自A和B组的小鼠并且记录体重和食物重量，同时视觉观察小鼠的行为和活动。在第3天，杀死所有的来自C和D组的小鼠并且记录体重和食物重量，同时视觉观察小鼠的行为和活动。
通过心脏穿刺采集血液:血清用于ALT/AST/ALP/胆红素(总的和活性的)(150至250μL)；血浆用于瘦蛋白蛋白质测量(15μL)和阳离子脂质测量(20μL)。
收集肝脏、脾和肾：记录完整的组织重量。
在耐受性研究中观察到与剂量成比例的瘦蛋白蛋白质的暴露。以7mpk的剂量，在瘦的C57BL/6小鼠中给药包装在阳离子脂质B中的本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ IDNO:4)。根据在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测定的，观察到1300ng/mL的瘦蛋白蛋白质水平处于循环中，它是针对在C57BL/6小鼠中0.6mpk剂量观察到的水平的17倍。
通过心脏的穿刺采集血样并且保存在平试管中。使用Cob as 6000分析仪，测定了下列参数:天冬氨酸转氨酶(AST)；总胆红素；丙氨酸转氨酶(ALT)；总蛋白；碱性磷酸酶；白蛋白；尿素；球蛋白；肌酸酐；肌酸激酶(CK)；葡萄糖；白蛋白/球蛋白比率。
在尸检时，记录脾、肝脏和肾的重量并且把来自所有动物的这些组织与肺一起固定在10％中性的缓冲液福尔马林中并且以常规方式加工而产生适合于显微评估的组织切片。
临床化学变化被描绘在表32中。
变化反映了在两个时间点最小的炎症(减少的总蛋白，具有减少的白蛋白、增加的球蛋白和减小的白蛋白-球蛋白比率)。这些变化在显微镜下与嗜中性白细胞的脾浸润、在肝的脉管系统中异常的血管内细胞或肺血管病和血栓形成对应。另外，减少的BUN表明减少的食物摄取。
把器官重量呈现在表33中。在给药以后大约72小时时在脾重量方面发生的与修饰的合成瘦蛋白mRNA有关的增加是最小的(在三只小鼠中8％的净差)并且与显微镜下增加的红髓和嗜碱性细胞的多孔性对应。
在给药以后24小时时，与修饰的合成瘦蛋白mRNA有关的脾和肝脏变化呈现在给药的小鼠中，然而在给药以后72小时时，除了在肝脏和脾方面的变化之外，形态变化也呈现在肺中。在给药以后24小时时，与修饰的合成瘦蛋白mRNA有关的脾变化包括在白髓和红髓中的细胞碎屑/单细胞坏死、减少的红髓的多孔性、嗜中性白细胞浸润和嗜碱性细胞。脾嗜碱性细胞最可能与早期的巨核细胞对应。这些变化符合在临床病理学中观察到的炎性模式。
在肝脏中，异常的血管内细胞呈现在用本发明采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA给药的动物中，进一步指示炎性的反应。
在给药以后72小时时，异常的血管内细胞仍然呈现在肝脏中。也有以红髓或嗜碱性细胞的细胞碎屑和增加的多孔性为特征的脾变化(全部都指示骨髓外造血)。
在72小时时在肺中，血管病和血栓呈现在介质以及小口径脉管系统中。
另外，在两个检查的时间点，在所有的动物中，红髓稍微被扩张并且变稀少(但是在那些用本发明采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA处理的动物中更加如此)。
在实施例的条件下，采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA在24小时时产生了与在肝脏中炎性的临床病理学模式、细胞碎屑/单细胞坏死、嗜中性白细胞浸润和嗜碱性细胞(早期的巨核细胞)以及异常的血管内细胞一致的变化。除了这些变化之外，它还经过72小时产生了肺血管病。
实施例22
采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA；采用重复的剂量的体内 药物动力学和效力研究
为了测定采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)的蛋白质表达和体内效力，使用重复的静脉内(IV)注射向小鼠递送修饰的合成瘦蛋白mRNA。通过在ob/ob小鼠中体内效力来跟踪递送瘦蛋白mRNA所诱导的瘦蛋白蛋白质的表达。
按照上述实施例7中描述的方式，给小鼠的尾部注射。
采用单独圈养的16星期龄的雄性ob/ob小鼠进行这个实施例体内研究。以用于研究的0.2mpk的剂量给予小鼠包装在阳离子脂质B中的稀释在可注射的盐水中的HPLC纯化的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)(N:P摩尔比率＝4:1)。使用了盐水对照。
药物动力学。5只动物接受盐水对照。一个组的5只小鼠每只以0.2mpk(10μg)的剂量接受采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。在五天中的每一天把动物称重并且分类，使得每个组的平均体重是相同的。也将会把食物称重。
在第0天，在上午(早晨)9点向小鼠给药，并且在下午3点通过尾部切口放血用于瘦蛋白(15μL的血浆)。在第1、2、4、8、11、15和18天，在上午9点称重并且通过尾部切口放血用于瘦蛋白(15μL的血浆)。记录体重和食物摄取。在第3、7、10、14和17天，在上午9点，向小鼠给药并且记录体重和食物摄取。在第9和21天，仅仅记录体重和食物摄取。
在第一次给药以后在时间点6、24和48小时时测定瘦蛋白蛋白质水平。在随后的给药之后24小时测定了瘦蛋白蛋白质水平。表34中结果显示了采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的重复治疗得到相似的水平的瘦蛋白蛋白质表达。
药效学。6只动物接受盐水对照。一个组的6只小鼠每只以0.2mpk(10μg)的剂量接受采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。把小鼠称重并且分类，使得每个组的平均体重是相同的。
在第0、3和7天，在上午9点向小鼠给药并且记录体重和食物摄取。在第1、2、5、6和8-21天，仅仅记录体重和食物摄取。
采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA的重复治疗产生持续的体重降低和瘦蛋白蛋白质表达。用采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ IDNO:4)在第1、和7天处理ob/ob小鼠三次。在每次给药之后，小鼠继续减少显著数量的体重。
瘦蛋白蛋白质表达保持在25ng/mL。在第一次给药以后，在时间点6、24和48小时时的瘦蛋白蛋白质水平，以及在最后的给药以后24小时，测定随后的蛋白质水平。
实施例23
包装在阳离子脂质B中的瘦蛋白mRNA在食蟹猴中的药物动力学和药效学
这个实施例的目的是要检查在静脉内施用0.6mg/kg的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)以后，瘦蛋白在猴子中的药物动力学和药效学(PD)，所述mRNA中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，其中mRNA被包装在阳离子脂质B中。研究了所有猴子血浆中的瘦蛋白蛋白质水平、血液化学和在血浆或血清中的脂质水平。
在隐静脉的或股静脉处采集血样到注射器中。表36描绘了研究设计。表格37描绘制剂的特征。按照在表38中描绘的方式采集血样。基于列在表38中的时间点，采集了全血、血浆和血清。分析全血的血液化学。采集血清用于血清化学并且采集血浆用于瘦蛋白酶联免疫吸附测定和脂质代谢。以0.6mpk的剂量，使用采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白，以静脉内方式向三只猴子给药。在药物产品处理以后6小时时观察到95ng/mL的峰值瘦蛋白蛋白质表达，同时按照实施例1中描述的方式，通过酶联免疫吸附测定来测定瘦蛋白蛋白质水平。这证实从啮齿动物到食蟹猴的瘦蛋白表达的翻译。在实施例的条件下，基于临床病理学参数和增加的促炎细胞因子和趋化因子，以0.6mg/kg以静脉内方式向雄性食蟹猴施用采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)产生炎性变化。另外的临床病理学改变表明肝脏和肌肉的变化。在抗炎细胞因子、IL-1RA方面也有增加。所有细胞因子变化在给药以后6小时时是最突出的并且经过24小时大部分都是正常的。在给药以后24小时时，临床病理学变化是突出的，但是一些变化持续于全部研究。
如下所述，以0.6mg/kg向食蟹猴静脉内单次给药采用阳离子脂质B包装的修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)被很好地耐受。
把用于血液学的血样采集到EDTA抗凝血剂中。使用ADVIA分析仪测定了下列参数:红细胞计数、白血细胞计数、血红蛋白、嗜中性白细胞计数、血细胞比容、淋巴细胞计数、平均红细胞体积、单核细胞计数、平均红细胞血红蛋白(Mean CorpuscularHemoglobin)、嗜酸性粒细胞计数、平均红细胞血红蛋白浓度、嗜碱性粒细胞计数、网织红细胞计数、不染色大细胞计数和血红蛋白计数。
把用于凝固测定的血样采集到包含柠檬酸三钠作为凝血剂的试管中。使用StagoSTA-R仪器测定了下列参数:凝血酶原时间和活化的部分促凝血酶原激酶时间。
通过心脏穿刺采集血样并且保存在平试管中。使用Cobas 6000分析仪测定了下列参数:天冬氨酸转氨酶(AST)；总胆红素；丙氨酸转氨酶(ALT)；总蛋白；碱性磷酸酶；白蛋白；尿素；球蛋白；肌酸酐；肌酸激酶(CK)；葡萄糖；白蛋白/球蛋白比率；钠；磷；钾；胆固醇；氯化物；甘油三酯；钙；和镁。
把Invitrogen Cytokine Monkey Magnetic 28-Plex Panel(试剂盒目录号:LPC0003M，Invitrogen Corporation，Carlsbad CA美国)用于在实施例20中列在表25中的被分析物的测定。把Bioplex 200(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules CA美国)用于分析(软件版本:Bio-Plex ManagerTM 5.0Security Edition，Build 531)，并且使用Microsoft2010来促进数据处理并且将其包括在原始资料内。基于1:2的稀释系数，使低于定量下限的值进入数据表作为LLOQ。
没有发生显著的血液学变化。临床化学变化被描绘在表39中。以0.6mg/kg静脉内施用采用阳离子脂质C包装的本发明的修饰的合成瘦蛋白mRNA在两个时间点引起临床化学改变，反映了在给药以后24小时时最小的肝细胞变化(增加的天冬氨酸转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、减少的白蛋白)和潜在的肌肉变化(增加的AST和CK)。由减少的白蛋白指示微妙的炎性变化(除此之外，还有下面详述的促炎细胞因子的增加)。主要地在给药以后24小时时减少的甘油三酯可能已经反映了对脂质代谢的影响、减少的食物摄取或可能起因于生物变异。
当把数值与给药之前的数值相比时，在以0.6mg/kg的剂量，以静脉内方式给药采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA以后，注意到增加的细胞因子和趋化因子。如果被分析物在给药之前的数值低于LLOQ，则使用LLOQ计算倍数变化。
在所有的三只猴子的大部分中在给药以后6小时时注意到几个与修饰的合成瘦蛋白mRNA有关的变化，并且在给药以后经过24小时，这些变化中的大多数回到给药之前的水平。还有一些被分析物仅仅在一只猴子中提高了。这些后者的变化与治疗的关系不能被排除，因为它们高于给药之前的值并且因为在这些相同的猴子中其它细胞因子被增加了。
从给药以后6小时，在所有的三只猴子中发生了血清IL1RA水平的增加，在给药以后经过24小时，水平恢复正常(增加相差大约2倍直到大约11倍)。在3只猴子中的2只中在给药以后3小时时，血清IL6水平被提高了大约5倍，并且在所有的猴子中，在给药以后6小时时，血清IL6水平被进一步提高至多大约4到8倍，经过24小时，血清IL6水平回到给药之前的值。在3只猴子中的2只中，在给药以后1小时时，血清MCP-1水平被增加了大约1倍，在所有的动物中，在给药以后3小时时，水平被提高了1至4倍，然而在给药以后6小时时，在3只猴子中的2只中MCP-1水平被增加了14至30倍以及在一只猴子中增加了4倍，同时在给药以后24小时时，在所有的猴子中增加仍然是1至3倍。在所有的三只动物中，在给药以后6小时时，I-TAC的血清水平被增加了4至37倍，并且在给药以后24小时时，I-TAC的血清水平仍然被提高了。表40描绘了4种具有最一致的提高的被分析物的随时间变化。。
表40显示与给药之前的值相比，与向雄性食蟹猴施用采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA有联系的在血清细胞因子和趋化因子水平方面的变化。
在实施例的条件下，基于临床病理学参数和增加的促炎细胞因子和趋化因子，以0.6mg/kg以静脉内方式向雄性食蟹猴施用采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA产生炎性变化。另外的临床病理学改变表明肝脏和肌肉的变化。在抗炎细胞因子、IL-1RA方面也有增加。所有细胞因子变化在给药以后6小时时是最突出的，并且经过24小时，大部分是正常的。在给药以后24小时时，临床病理学变化是突出的，但是一些变化在整个研究中是持续的。
瘦蛋白本身通过增加促炎细胞因子和抗炎细胞因子两者而具有免疫调节效应(在体外在周围血液单核细胞中刺激TNFα、IL-6和IFNγ以及IL-1RA。参见Juge-Aubry CE和Meier CA(2002)Mol.Cell Endocrinol.194(1-2):1-7)。
总之，以0.6mg/kg向食蟹猴静脉内单次给药采用阳离子脂质B包装的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA被很好地耐受并且产生炎性变化以及大部分是最小的表明肝脏和肌肉受损害的变化。
实施例24
在向ob/ob小鼠皮下给药以后，包装在阳离子脂质B中的人瘦蛋白mRNA的药效学
这个实施例的目的是将要在具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型中显示瘦蛋白蛋白质对体重和食物摄取的所述特异性影响。通过HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)来递送瘦蛋白蛋白质，所述mRNA中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代，其中mRNA被包装在阳离子脂质B中并且以皮下方式被施用。
所使用的动物是来自Jackson LaCs的10星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将小鼠单个圈养。给予它们其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的本发明HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)或其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的已被突变成不可翻译的HPLC纯化的对照人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:16)。mRNA被包装在阳离子脂质C(N:P摩尔比率＝4:1)中。制剂被稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中。按照实施例8中描述的方式，以皮下方式给小鼠的尾部注射。
五只小鼠接受PBS(A组)。五只小鼠以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。五只小鼠以0.6mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。五只小鼠以2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。五只小鼠以6mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(E组)。五只小鼠以0.6mpk的剂量接受修饰的合成的不可翻译的瘦蛋白mRNA(F组)。五只小鼠以2mpk的剂量接受修饰的合成的不可翻译的瘦蛋白mRNA(G组)。五只小鼠以6mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(H组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个分组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组，在上午9点向它们给药。在研究开始时，也把它们的食物称重。在第1、2、3、4、5、6、7、10、14和24天在上午9点，把所有的小鼠称重并且把它们的食物称重。.
表41代表这个实施例的体重结果，而表42代表这个实施例的食物摄取结果。最低剂量的瘦蛋白mRNA(0.2mg/kg)对于体重和食物摄取是有效的。瘦蛋白mRNA对于体重和食物摄取的效应以剂量依赖性方式增加，经过顶部6mg/kg剂量。对照不可翻译的瘦蛋白mRNA仅仅在2mg/kg剂量时有较小的效应。不可翻译的瘦蛋白mRNA的效应在最高的6mg/kg剂量时较大，但是这个效应仍然小于在最低剂量的能翻译的瘦蛋白mRNA时看到的效应。这些结果证明以皮下方式向缺乏瘦蛋白的小鼠施用的瘦蛋白mRNA有力地减少食物摄取和体重，并且这种影响主要是由于人瘦蛋白蛋白质的特异性表达所致。
实施例25
在向ob/ob小鼠皮下给药以后，包装在阳离子脂质C中的人瘦蛋白mRNA的药效学
这个实施例的目的是要显示在具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型中，以静脉内方式施用的包装在阳离子脂质C中的其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)对于体重和食物摄取的特异性影响。
采用正常光线周期(6:00-18:00)，把来自Jackson Labs的8星期龄的缺乏瘦蛋白的雄性ob/ob小鼠个别地圈养。给予它们其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的本发明HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)，或给予它们HPLC纯化的不可翻译的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:21)。按照实施例35制剂方法，把mRNA包装在阳离子脂质C中(N:P摩尔比率＝4:1)。把制剂稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中。按照实施例8中描述的方式，以皮下方式给小鼠注射。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重将它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组，在上午9点给它们给药。使由5只小鼠组成的组的每只小鼠要么接受磷酸缓冲盐水，要么接受0.6mg/kg(mpk)配制在阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA，要么接受配制在阳离子脂质C中的不可翻译的瘦蛋白mRNA。在研究开始时还把它们的食物称重。在第1、2、3、4、5、6、7、10和15天在上午9点，把所有的小鼠称重并且把它们的食物称重。
在皮下施用在阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA之后的体重变化被详细地列在表43中。食物摄取被详细地列在表44中。采用阳离子脂质C的结果证明:在ob/ob小鼠中可能导致瘦蛋白蛋白质表达的0.6mpk瘦蛋白mRNA的皮下施用使体重和食物摄取减少。相比之下，施用0.6mpk不可翻译的瘦蛋白mRNA对体重和食物摄取具有最小的影响。
实施例26
在向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠皮下施用之后，采用阳离子脂质C包装的瘦蛋白mRNA 的药物动力学。
这个实施例的目的是将要显示在把其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)包装在阳离子脂质C中并且以皮下方式向具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型施用之后，人瘦蛋白蛋白质的表达水平。
所使用的动物是来自Jackson Labs的10星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的本发明HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)或其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的已被突变成不可翻译的HPLC纯化的对照人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:21)，mRNA被包装在阳离子脂质C(N:P摩尔比率＝4:1)中并且被稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中。按照实施例8中描述的方式，以皮下方式给小鼠注射。
4只动物接受PBS(A组)。4只动物以0.2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。4只动物以0.6mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。4只动物以2mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。4只动物以6mpk的剂量接受修饰的合成瘦蛋白mRNA(E组)。4只动物以6mpk的剂量接受修饰的合成的不可翻译的瘦蛋白mRNA(F组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。也在所述研究的随后的每一天在上午9点把所有的小鼠称重。
在第0天在下午3:00(在给药以后6小时)，然后在第1和2天在上午9点，通过尾部切口给来自每个组的小鼠放血。分离血浆并且测定人瘦蛋白或小鼠红细胞生成素的水平。
表43代表按照实施例1中方法测定的这个研究血浆人瘦蛋白水平的结果。
实施例27
阳离子脂质A的合成
中间体A1:(6Z，9Z)-18-溴十八-6,9-二烯的制备。
在装备有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，把甲磺酸亚油醇酯(50g，145mmol)溶于二乙醚(200mL)中。缓慢地添加溴化镁二乙基醚合物(101g，392mmol)。在室温下搅拌反应过夜。以分液漏斗向混合物中添加盐水和醚。然后用盐水洗涤有机物，在MgSO4上干燥，在压力下过滤和浓缩而提供粗产物混合物。然后通过硅胶柱色谱纯化粗产物，采用100％庚烷洗脱而提供45g产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.26-5.46(m，4H)3.42(t，J＝6.90Hz，2H)2.78(t，J＝6.65Hz，2H)2.06(q，J＝6.78Hz，4H)1.86(dt，J＝14.43，7.09Hz，2H)1.21-1.49(m，16H)0.82-0.95(m，3H)ppm。
中间体A2:(13Z，16Z)-1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)二十二碳-13，16-二烯-4-醇的制备。
在装备有搅拌棒的500mL三颈圆底烧瓶中，称出Mg切屑(turnings)(0.443g，18.22mmol)，并且在真空下保持5分钟同时采用加热枪使其受热。把烧瓶留在真空下持续5-10分钟。然后给烧瓶充满N2，并且采用隔片密封。迅速地把四氢呋喃(75mL)倒入反应容器中，随后倒入I2(0.039g，0.152mmol)和中间体A1(5g，15.18mmol)，并且把回流冷凝器装配到烧瓶上。用N2置换整个系统三次，并且把混合物加热回流(90℃)持续2小时。然后在N2下把澄清的混合物冷却到室温。
在第二个250mL圆底烧瓶中，把4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丁醛(2.76g，13.66mmol)溶于四氢呋喃(30mL)中并且在冰水浴中冷却。然后通过注射器用超过10分钟的时间把所制备的亚油基格利雅试剂逐滴加到醛中，并且在环境温度搅拌反应持续30分钟。再次在冰浴中冷却反应烧瓶。缓慢地添加饱和的NH4Cl(含水)溶液，以把pH调节到7并且搅拌反应，温热到室温超过1小时。以分液漏斗把盐水和乙酸乙酯添加到混合物中。收集有机物并且用盐水洗涤，在MgSO4上干燥，在减压下过滤和浓缩而提供粗产物混合物。然后通过硅胶柱色谱纯化粗产物，采用在庚烷中的0-20％乙酸乙酯洗脱而提供4.91g无色的油状物形式的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.26-5.46(m，4H)3.51-3.80(m，3H)2.71-2.84(m，2H)1.99-2.13(m，4H)1.56-1.75(m，4H)1.21-1.52(m，20H)0.82-0.98(m，12H)0.01-0.14(m，6H)ppm。
中间体A3:碳酸[(13Z，16Z)–1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)二十二碳-13，16-二烯-4-基][3-(二甲基氨基)丙基]酯的制备。
在装备有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，把4-硝基苯基氯甲酸酯(3.49g，17.31mmol)溶于DCM(100mL)中。添加Py(1.4mL，17.31mmol)和DMAP(397mg，3.25mmol)，随后添加中间体A2(4.9g，10.82mmol)，并且在室温下搅拌混合物过夜。然后添加3-二甲基氨基-1-丙醇(6.7g，64.9mmol)，然后把混合物转移到密封管中并且在50℃加热过夜。添加DCM以稀释反应混合物。使用饱和的NaHCO3(含水的)(50mL x 4)来洗涤反应。在MgSO4上干燥有机相，过滤并且在减压浓缩下。通过硅胶柱色谱纯化残余物，采用在庚烷中的0–60％乙酸乙酯洗脱。使分离的材料穿过Bond Elute NH2柱(Agilent)而提供4g无色的油状物形式的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.27-5.47(m，4H)4.62-4.79(m，1H)4.19(t，J＝6.40Hz，2H)3.61(d，J＝3.01Hz，2H)2.72-2.83(m，2H)2.42-2.59(m，2H)2.31(br.s.，6H)2.05(d，J＝6.78Hz，4H)1.83-2.00(m，2H)1.47-1.74(m，6H)1.17-1.43(m，18H)0.80-0.97(m，12H)-0.05-0.10(m，6H)ppm。
中间体A4:碳酸[3-(二甲基氨基)丙基][(13Z，16Z)-1-羟基二十二碳-13，16-二烯-4-基]酯的制备。
在塑料管中，把中间体A3(2g，3.44mmol)溶于在冰浴中冷却的20mL THF中。滴加HF-Py(1.51mL，86mmol)。然后使混合物升温到环境温度并且搅拌持续一个小时。把反应混合物转移到分液漏斗中并且用DCM稀释。缓慢地添加饱和的NaHCO3(含水的)，直到反应混合物停止起泡，然后把水相分离并且采用乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，在MgSO4上干燥，过滤并且在减压下浓缩。使用粗产物，无需进一步纯化。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.28-5.47(m，4H)4.67-4.80(m，1H)4.13-4.28(m，2H)3.66(t，J＝5.77Hz，2H)2.78(t，J＝6.53Hz，2H)2.44-2.65(m，2H)2.26-2.44(m，6H)2.01-2.14(m，4H)1.88-2.01(m，2H)1.50-1.80(m，6H)1.19-1.44(m，18H)0.80-0.97(m，3H)ppm。
中间体A5:(13Z，16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13，16-二烯酸的制备。
把琼斯试剂(1.6mL，3.2mmol，在H2O中的2M溶液)滴加到中间体A4(1.5g，3.21mmol)在丙酮(20mL)中的溶液中，在冰水浴中冷却，直到反应混合物停留在橙色持续>5分钟。然后搅拌反应混合物持续30分钟，在该时间之后，移去冷却浴，并且继续搅拌持续另外的45分钟。添加iPrOH(1mL)，并且过滤混合物。添加丙酮和5M NaOH水溶液，直到把pH调节到6为止。采用在DCM中的5％甲醇萃取混合物四次。把合并后的DCM萃取物干燥并且在减压下浓缩而提供288mg产物，使用该产物，无需进一步纯化。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.25-5.48(m，4H)4.84(dt，J＝7.72，3.80Hz，1H)4.38(ddd，J＝10.85，6.84，3.39Hz，1H)3.98(ddd，J＝11.04，8.28，3.01Hz，1H)2.99-3.10(m，1H)2.78(t，J＝6.53Hz，2H)2.62-2.74(m，2H)2.47-2.59(m，6H)2.24-2.42(m，2H)2.18(br.s.，1H)1.89-2.11(m，6H)1.58-1.78(m，2H)1.47-1.58(m，1H)1.19-1.42(m，18H)0.89(t，J＝6.65Hz，3H)ppm。
脂质A:二辛酸[2-(((13Z，16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13，16-二烯酰基)氧基)丙烷-1，3-二基]酯的合成。
在圆底烧瓶中，把中间体A5(280mg，0.581mmol)、DMAP(28.4mg，0.233mmol)、EDC·HCl(223mg，1.163mmol)和二辛酸[2-羟基丙烷-1，3-二基]酯(300mg，0.872mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中。滴加DIPEA(0.2mL，1.163mmol)，并且在环境温度搅拌反应。在24小时之后，在减压下浓缩反应。通过急骤柱色谱(硅胶，在庚烷中的0％至50％乙酸乙酯)纯化残余物。收集级分并且在减压下除去溶剂而提供188mg无色的油状物形式的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.45-5.21(m，5H)，4.73(d，J＝4.3Hz，1H)，4.30(dd，J＝4.3，11.8Hz，2H)，4.23-4.07(m，4H)，2.77(t，J＝6.3Hz，2H)，2.49-2.36(m，4H)，2.36-2.21(m，9H)，2.12-1.80(m，7H)，1.70-1.48(m，6H)，1.40-1.20(m，36H)，0.94-0.81(m，9H.)ppm。
液相色谱/质谱(LC-MS m/z)＝808.5(M+1)。
实施例28
阳离子脂质B的合成
中间体1a:甲磺酸[5-(苄氧基)戊基]酯的制备。
在0℃在N2下，在装备有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中，通过注射器一次性地把Et3N(10.79mL，78mmol)添加到5-苄氧基-1-戊醇(10.08g，51.9mmol)在DCM(75mL)中的溶液中。其次，通过注射器以4个分开的部分以一定的速度滴加MsCl(4.85mL，62.3mmol)，使得内部温度不要超过15℃。允许反应继续搅拌持续1小时，在其之后，用H2O(200mL)和DCM(150mL)稀释反应。分离有机层，并且用DCM(225mL)洗涤水层。用盐水(200mL)洗涤合并后的有机层，采用Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩而提供标题化合物，呈粗橙色油状物(14.46g，99％)。
质谱(“MS”)(m+1)＝272.9.
中间体1b:中间体1b:2-(5-(苄氧基)戊基)丙二酸二乙酯的制备。
在N2气氛下，向冷的0℃的丙二酸二乙酯(7.5g，46.8mmol)在干燥的二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液中分批添加60％NaH(2.23g，56.2mmol)超过10分钟。观察到气体的释放。在0℃搅拌混合物持续30分钟，然后滴加在干燥的二甲基甲酰胺(41mL)中的中间体1a(14.46g，51.5mmol)超过10分钟，随后滴加碘化四丁铵(1.73g，4.68mmol)。然后在100℃加热混合物持续1.5小时。在室温下冷却混合物并且留下过夜。然后用饱和的NH4Cl(50mL)猝灭混合物并且用H2O(100mL)稀释。采用EtOAc(2x 200mL)萃取混合物。用H2O(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并后的有机层，在MgSO4上干燥，过滤，并且在真空下浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，采用0-30％EtOAc/庚烷洗脱而提供化合物，呈油状物(11.7g，74％)。
(MS)(m+1)＝336.6.
中间体1c:2-(5-(苄氧基)戊基)丙烷-1，3-二醇的制备。
在N2下，向中间体1b(5.5g，16.35mmol)在干燥的四氢呋喃(20mL)中的0℃冷的溶液中，滴加在四氢呋喃中的2.0M LiAlH4(24.52mL，49.0mmol)。允许混合物温热到室温并且搅拌过夜。把混合物冷却到0℃，再次采用在四氢呋喃中的2.0M LiAlH4(16.35mL，32.7mmol)处理，允许其温热到室温，并且搅拌过周末。把反应冷却到0℃并且用滴加的EtOAc(9.30mL)猝灭超过10分钟。然后用H2O(3.10mL)以滴加方式、用15％NaOH溶液(3.10mL)以滴加方式以及用另外的H2O(9.30)以滴加方式处理混合物。在室温下搅拌混合物持续30分钟。让混合物通过硅藻土垫过滤。用EtOAc洗涤硅藻土。在减压下浓缩滤液而提供标题化合物，呈半蜡状固体(1.52g，37％)。
MS(m+1)＝253.0.
中间体1d:二辛酸[2-(5-(苄氧基)戊基)丙烷-1，3-二基]酯的制备。
在0℃在N2下，在装备有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中，通过注射器向中间体1c(1.51g，5.98mmol)在DCM(20ml)中的溶液中滴加吡啶(1.21mL，14.96mmol)超过～30秒。然后通过注射器滴加辛酰氯(2.145mL，12.57mmol)超过几分钟，并且允许反应温热到室温，然后搅拌过夜。用饱和的NH4Cl(100mL)和CH2Cl2(100mL)稀释混合物。分离有机相。采用CH2Cl2(100mL)萃取水相。在MgSO4上干燥合并后的有机物，过滤，并且在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱纯化粗产物，采用0-10％EtOAc/庚烷洗脱而提供标题化合物，呈无色的油状物(2.88g，95％)。
MS(m+1)＝505.6。
中间体1e:二辛酸[2-(5-羟基戊基)丙烷-1，3-二基]酯的制备。
在室温下，向中间体1d(2.5g，4.95mmol)在甲醇(25ml)中的溶液中添加10％湿的迪高沙(degussa)类型的Pd/C(264mg)。在H2气囊下搅拌混合物过夜。让粗的反应混合物通过硅藻土垫过滤并且在减压下浓缩滤液而提供标题化合物，呈无色的油状物(2.0g，97％)。
1H NMR(400MHz，CD2Cl2)δ4.11-3.96(m，4H)，3.59(t，J＝6.5Hz，2H)，2.28(t，J＝7.5Hz，4H)，2.04-1.91(m，1H)，1.66-1.48(m，7H)，1.41-1.34(m，6H)，1.34-1.20(m，16H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H)。
中间体1f:7-(辛酰氧基)-6-((辛酰氧基)甲基)庚酸的制备。
在室温下，在装备有磁性搅拌棒的小瓶中，向在MeCN:H2O(46.84mL，1:1比率)中的中间体1e(2.0g，4.82mmol)中一次性地添加TEMPO(0.151g，0.965mmol)。然后一次性地添加碘代苯双乙酸酯(3.42g，10.61mmol)，并且允许反应继续在室温下搅拌过夜，在其之后，用15％含水的硫代硫酸钠(50mL)猝灭反应。用H2O稀释反应并且采用EtOAc(3x 100mL)萃取。采用Na2SO4干燥合并后的有机层，过滤，并且在减压下浓缩而提供浅黄色油状物。把油状物溶于甲苯(15mL)并且在减压下浓缩(x 6)而提供浅黄色油状物，把该油状物溶于DCM并且在减压下浓缩(x 3)而提供标题化合物(加较少的芳香族杂质，其可能对应于剩余的甲苯或碘代苯)，呈浅黄色油状物(2.0g，97％)。
MS(m-1)＝427.2。
中间体1g:3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙醛的制备。
在装备有搅拌棒的1L圆底烧瓶中，把叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙醇(20g，105mmol)溶于DCM(500mL)中。添加Et3N(43.9mL，315mmol)。在装备有搅拌棒的第二个500mL烧瓶中，把SO3.Py(25.08g，158mmol)溶于二甲亚砜(100mL，1409mmol)中。在0℃(在冰水浴中)，把所得到的溶液滴加到醇溶液中。搅拌反应同时温热到室温过周末。以分液漏斗把水和DCM添加到混合物中。然后用水洗涤有机相，在DCM中萃取，在MgSO4上干燥，过滤并且在减压下浓缩(冷的)而提供粗产物混合物。通过硅胶柱色谱(330g柱，100％DCM)纯化，提供了标题化合物(17.7g，89％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝9.81(t，J＝2.1Hz，1H)，3.99(t，J＝6.0Hz，2H)，2.61(td，J＝6.0，2.3Hz，2H)，0.88(s，9H)，0.07(s，6H)。
中间体1h:1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十五碳烷-3-醇的制备。
在500mL圆底烧瓶中，把中间体1g(17.7g，94mmol)溶于四氢呋喃(100mL)中，并且在冰水浴中冷却到0℃。然后通过移液管向醛中滴加在二乙醚中的1M溴化十二碳烷基镁(132mL，132mmol)超过10分钟，移去冰浴，并且在室温下搅拌反应持续30分钟。再次在冰浴中把反应烧瓶冷却到0℃。缓慢地添加饱和的NH4Cl溶液以调节到pH～7(600mL)，并且把混合物倒入1L分液漏斗中。然后用饱和氯化铵溶液洗涤有机相，在EtOAc中萃取，在MgSO4上干燥，过滤并且在减压下浓缩而提供粗产物混合物。通过硅胶柱色谱纯化(330g柱，100％庚烷持续2个柱体积，0％至2％EtOAc/庚烷持续1个柱体积，2％EtOAc/庚烷持续3个柱体积，2％至5％EtOAc/庚烷持续1个柱体积，然后5％EtOAc/庚烷持续10个柱体积)，提供了标题化合物(24.9g，74％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.97-3.87(m，1H)，3.87-3.77(m，2H)，1.69-1.60(m，2H)，1.57-1.36(m，3H)，1.36-1.19(br，19H)，0.93-0.84(m，12H)，0.09(s，6H)。
中间体1i:碳酸[1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十五碳烷-3-基](4-硝基苯基)酯的制备。
在室温下，在装备有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中，一次性地把氯代甲酸(4-硝基苯基)酯(2.084g，9.92mmol)添加到中间体1h(2.9660g，8.27mmol)在DCM(28mL)中的溶液中。给反应装备隔膜并且放置在N2下，在此之后，通过注射器滴加吡啶(1.003mL，12.40mmol)超过几分钟。允许反应在室温下搅拌过夜。在24小时的反应时间之后，用H2O(100mL)和DCM(125mL)稀释反应。分离有机层，并且用DCM(125mL)洗涤水层。用盐水(100mL)洗涤合并后的有机层，采用Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩而提供灰白色的残余物。通过硅胶柱色谱纯化(80g柱，液体负载，0-2.5％EtOAc:庚烷)粗的残余物而提供3.144g(73％)的标题化合物(加较少的未经确认的杂质峰)，呈无色油状物。
1H NMR(400MHz，CD2Cl2)δ8.29-8.24(m，2H)，7.41-7.35(m，2H)，5.03-4.95(m，1H)，3.73(dd，J＝6.6，5.7Hz，2H)，1.95-1.80(m，2H)，1.80-1.63(m，2H)，1.45-1.19(m，20H)，0.92-0.83(m，12H)，0.06(s，6H)。
中间体1j:碳酸[1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十五碳烷-3-基](3-(二乙基氨基)丙基)酯的制备。
在N2下，在装备有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中，通过注射器向在DCM(40mL)中的中间体1i(2.9153g，5.57mmol)中滴加3-(二乙基氨基)丙烷-1-醇(3.48mL，22.26mmol)超过几分钟。然后，通过注射器滴加吡啶(2.251mL，27.8mmol)超过～30秒，随后一次性地添加DMAP(0.136g，1.113mmol)。允许反应继续在室温下搅拌过夜。在22个小时的反应时间之后用H2O(200mL)和DCM(200mL)稀释反应。分离有机层并且用DCM(200mL)洗涤水层。用盐水(100mL)洗涤合并后的有机层，采用Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩而提供粗的黄橙色油状物，通过硅胶柱色谱纯化(120g柱，液体负载(在DCM中)，0-8％甲醇:DCM)该油状物而提供黄色油状物。使这黄色油状物穿过键洗脱NH2柱(10g)，采用DCM洗脱。在减压下浓缩滤液而提供浅黄色油状物。再次重复键洗脱方法而提供标题化合物，呈无色的油状物(2.0887g，73％)。
MS(m+1)＝516.4。
中间体1k:碳酸[3-(二乙基氨基)丙基](1-羟基十五碳烷-3-基)酯的制备。
在室温下，向中间体1j(2.2g，4.26mmol)在甲醇(50mL)的溶液中一次性地添加CAN(5.14g，9.38mmol)。在室温下搅拌混合物并且随后是TLC(70％EtOAc/庚烷，KMNO4着色)。在观察到原材料被消耗之后，用CH2Cl2(100mL)稀释混合物，并且用饱和的NaHCO3(2X 100mL)洗涤。采用CH2Cl2(100mL)萃取水层。将合并后的有机相在Na2SO4上干燥，过滤，并且在减压下浓缩而提供标题化合物(与一些较少的杂质一起)，呈油状物。
MS(m+1)＝402.2。
最终的化合物阳离子脂质B:二辛酸[2-(10-十二烷基-3-乙基-8，14-二氧代-7，9，13-三氧杂-3-氮杂十八碳烷-18-基)丙烷-1，3-二基]酯的制备。
在圆底烧瓶中，把中间体1f(1.99g，4.66mmol)、DMAP(0.207g，1.693mmol)、DIPEA(1.48mL，8.47mmol)和中间体1k(1.7g，13.07mmol)加入二氯甲烷(20mL)中。一次性地添加EDC.HCl(1.62g，8.47mmol)，并且在环境温度搅拌反应。在24小时之后，在减压下浓缩反应。通过硅胶柱色谱纯化(在CH2Cl2中的0％至5％甲醇)残余物。收集级分并且在减压下除去溶剂而提供黄色油状物(3.8g)。通过硅胶柱色谱(0-75％EtOAc/庚烷)再次纯化油状物而提供标题化合物，呈米黄色的油状物(2.6g，71.8％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.80(t，J＝6.1Hz，1H)，4.25-3.96(m，8H)，2.62(br.s.，4H)，2.30(t，J＝7.5Hz，6H)，2.05-1.85(m，5H)，1.71-1.53(m，8H)，1.43-1.21(m，42H)，1.21-0.98(m，6H)，0.96-0.79(m，9H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ＝174.15(s，2C)，173.71，155.20，75.90，66.41，64.14(s，2C)，60.85，49.32，47.10(s，2C)，37.46，34.56(s，3C)，34.52，34.29，33.28，32.22，31.97(s，2C)，29.95(s，2C)，29.88，29.80，29.76，29.66，29.41(s，2C)，29.23(s，2C)，28.20，26.64，25.36，25.25(s，4C)，23.00，22.90(s，2C)，14.44，14.38(s，2C)，11.37(s，2C)。
实施例29
阳离子脂质C的合成
中间体1a:(9Z，9'Z，12Z，12'Z)–二(十八碳-9，12-二烯酸)[2-(羟甲基)丙烷-1，3-二基]酯的制备
在圆底烧瓶中，把亚油酸(95.0g，339mmol)、DMAP(4.14g，33.90mmol)、DIPEA(74.1mL，424mmol)和2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇(18.0g，170mmol)溶于二氯甲烷(435ml)中。一次性地添加EDC(81.0g，424mmol)，并且在环境温度搅拌反应。在24小时之后，为了干燥的负载，采用硅胶粉末在减压下浓缩反应，并且在硅胶(Biotage)上纯化残余物，使用乙酸乙酯/庚烷(0％至40％)作为洗脱剂，提供47g(44％收率)的所要的产物，呈无色油状物。
1H NMR(400MHz，CDCl3):δ＝5.19-5.50(m，8H)，4.19(tt，J＝11.83，5.87Hz，4H)，3.51-3.69(m，2H)，2.78(t，J＝6.53Hz，4H)，2.33(t，J＝7.53Hz，4H)，2.20(五重峰，J＝5.83Hz，2H)，2.06(q，J＝6.78Hz，8H)，1.49-1.72(m，5H)，1.20-1.46(m，26H)，0.79-0.98(m，6H)ppm。
最终的化合物阳离子脂质C:(9Z，9'Z，12Z，12'Z)–二(十八碳-9，12-二烯酸)[2-(((1，3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1，3-二基]酯的制备。
在圆底烧瓶中，把中间体1a(15.0g，23.77mmol)、DMAP(0.581g，4.75mmol)、DIPEA(8.30mL，47.5mmol)和1，3-二甲基吡咯烷-3-羧酸(5.11g，35.7mmol)溶于二氯甲烷(78ml)中。一次性地添加EDC(9.11mg，47.5mmol)，并且在环境温度搅拌反应。在24小时之后，为了干燥的负载，采用干燥的硅胶在减压下浓缩反应，并且在硅胶(Biotage)上纯化残余物，使用乙酸乙酯/庚烷(0％至80％)作为洗脱剂，提供15g(82％收率)的所要的产物，呈无色油状物。
1H NMR(400MHz，CDCl3):δ＝5.26-5.47(m，8H)，4.08-4.21(m，6H)，2.97(d，J＝9.29Hz，1H)，2.78(t，J＝6.53Hz，4H)，2.56-2.69(m，2H)，2.24-2.49(m，10H)，2.05(q，J＝6.78Hz，8H)，1.54-1.76(m，5H)，1.22-1.42(m，31H)，0.89(t，J＝6.78Hz，6H)ppm.MS(m+1)＝756.7。
实施例30
阳离子脂质D的合成
中间体13a:4，4-双(辛氧基)丁腈的制备。
向4，4-二乙氧基丁腈(15g，95mmol)和辛醇(37.3g，286mmol)的混合物中添加对甲苯磺酸吡啶盐(1.2g，4.77mmol)，并且把混合物加热到105℃。在72小时之后，冷却反应混合物并且在硅胶上纯化，使用乙酸乙酯/庚烷作为洗脱剂而提供9.34g所期待的产物。1HNMR(400MHz，CDCl3):δ＝4.56(t，J＝5.40Hz，1H)，3.61(dt，J＝9.16，6.59Hz，2H)，3.44(dt，J＝9.22，6.68Hz，2H)，2.43(t，J＝7.28Hz，2H)，1.95(td，J＝7.34，5.40Hz，2H)，1.50-1.66(m，4H)，1.17-1.44(m，20H)，0.80-0.95(m，6H)ppm。
中间体13b:4，4-双(辛氧基)丁酸的制备。
在高压反应器中，把中间体13a(9.34g，28.7mmol)溶于30mL乙醇中。把KOH(4.83g)溶于30mL水中并且把KOH溶液添加到乙醇溶液中。把试管密封并且加热到110℃过夜。冷却混合物并且用乙酸乙酯稀释。添加1N HCl以调节pH到5，并且采用乙酸乙酯萃取水相两次。在MgSO4上干燥合并后的有机萃取物，过滤并且在减压下浓缩而提供10.9g所期待的产物。1HNMR(400MHz，CDCl3):δ＝4.46(t，J＝5.52Hz，1H)，3.46-3.59(m，2H)，3.08-3.46(m，3H)，2.18(t，J＝7.28Hz，2H)，1.72-1.89(m，2H)，1.46-1.63(m，4H)，1.28(d，J＝3.76Hz，20H)，0.79-0.96(m，6H)ppm。
中间体13c:(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯酸[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]酯的制备。
在圆底烧瓶中，把亚油酸(23.78g，85mmol)、DMAP(2.072g，16.96mmol)、DIPEA(22.22mL，127mmol)和2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇(9g，85mmol)溶于二氯甲烷(200ml)中。一次性地添加EDC(24.39g，127mmol)，并且在环境温度搅拌反应。在24小时之后，在减压下浓缩反应，并且在硅胶上纯化浓缩物，采用乙酸乙酯/庚烷作为洗脱剂，提供12.4g所期待的产物。还分离出9.5g的中间体1a。1H NMR(400MHz，CDCl3):δ＝4.27(d，J＝6.27Hz，2H)，3.77(qd，J＝11.25，5.14Hz，4H)，2.78(t，J＝6.40Hz，2H)，2.23-2.48(m，4H)，1.90-2.15(m，6H)，1.53-1.76(m，3H)，1.15-1.45(m，14H)，0.77-0.98(m，3H)ppm。
中间体13d:(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯酸[3-((4，4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-(羟甲基)丙基]酯的制备
在圆底烧瓶中，把中间体13c(10.9g，31.6mmol)、DMAP(773mg，6.33mmol)、DIPEA(11.05mL，63.3mmol)和中间体13b(13.99g，38mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中。一次性地添加EDC(12.13g，63.3mmol)，并且在环境温度搅拌反应。在24小时之后，在减压下浓缩反应。在硅胶上纯化浓缩物，采用0-20％乙酸乙酯/庚烷作为洗脱剂而提供11.2g所期待的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3):δ＝5.27-5.45(m，4H)，4.50(t，J＝5.52Hz，1H)，4.08-4.25(m，4H)，3.50-3.69(m，4H)，3.41(dt，J＝9.22，6.68Hz，2H)，2.78(t，J＝6.53Hz，2H)，2.42(t，J＝7.53Hz，2H)，2.33(t，J＝7.53Hz，2H)，2.13-2.29(m，2H)，2.00-2.13(m，4H)，1.88-2.00(m，2H)，1.49-1.69(m，7H)，1.20-1.44(m，32H)，0.83-0.95(m，9H)ppm.
最终的化合物阳离子脂质D:(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯酸[3-((4，4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-(((((1-乙基哌啶-3-基)甲氧基)羰基)氧基)甲基)丙基]酯的制备。
在圆底烧瓶中，把氯甲酸(4-硝基苯基)酯(290mg，1.439mmol)溶于DCM(10mL)中。添加吡啶(0.116ml，1.439mmol)和DMAP(26.4mg，0.216mmol)，随后添加中间体13d((500mg，0.719mmol)，并且在环境温度搅拌混合物持续1小时。添加(1-乙基哌啶-3-基)甲醇(618mg，4.32mmol)，并且继续反应过夜。在减压下浓缩反应，并且在硅胶上纯化浓缩物，采用乙酸乙酯/庚烷作为洗脱剂而提供530mg所期待的化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3).:δ＝5.25-5.46(m，4H)，4.49(t，J＝5.52Hz，1H)，4.17(dd，J＝19.32，5.77Hz，6H)，4.02-4.09(m，1H)，3.91-4.00(m，1H)，3.57(dt，J＝9.22，6.68Hz，2H)，3.40(dt，J＝9.22，6.68Hz，2H)，2.82-2.99(m，2H)，2.77(t，J＝6.40Hz，2H)，2.36-2.48(m，5H)，2.31(t，J＝7.53Hz，2H)，2.05(q，J＝6.78Hz，5H)，1.84-1.97(m，3H)，1.50-1.81(m，12H)，1.21-1.41(m，31H)，0.94-1.14(m，5H)，0.80-0.94(m，9H)ppm.MS(m+1)＝865.1。
实施例31
从不同的瘦蛋白mRNA序列表达瘦蛋白蛋白质
这个实施例的目的是要证明瘦蛋白mRNA核苷酸序列对于瘦蛋白蛋白质的表达效率的影响。
在实施例中使用的瘦蛋白mRNA构建体每个包含不同的人瘦蛋白编码区序列。SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的人瘦蛋白mRNAs包含密码子优化的序列(分别为SEQID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)。SEQ ID NO:10的人瘦蛋白mRNA包含天然的人编码序列(SEQ ID NO:20)。四条人瘦蛋白密码子序列的核苷酸序列是同源的序列，彼此之间是78％至91％相同的。
像在实施例2中那样转录瘦蛋白mRNA。在具有加湿的5％CO2气氛的37℃培养箱中，使HepG2/C3a细胞生长在补充有10％胎牛血清的Dulbecco修饰的Eagle培养基。使1.5微克的瘦蛋白mRNA与Lipofectamine 2000(Life Technologies)复合，并且按照生产商的实验规程将其转染到HepG2/C3a细胞中。
孵育细胞持续24小时，并且除去条件培养基。用磷酸缓冲盐水洗涤细胞一次，然后把具有10％胎牛血清的新鲜的Dulbecco’s修饰的Eagle培养基添加到细胞中。孵育细胞持续第二个24小时，然后除去条件培养基。
按照在实施例1中描述的方式测量在条件培养基中的瘦蛋白蛋白质水平。把结果显示在表46中。SEQ ID NO:4的瘦蛋白mRNA支持了瘦蛋白蛋白质的最高表达。
实施例32
包装在阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA；以皮下方式递送的不同制剂的体内药物动 力学研究
在皮下递送使用不同的脂质制剂包装在阳离子脂质C中的其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的人瘦蛋白mRNA(SEQ.ID:NO.4)以后，诱导了瘦蛋白的蛋白质表达。
按照实施例2中描述的方式合成了瘦蛋白mRNA并且除了像在表47中那样改变阳离子脂质C与中性脂质(DSPC)、胆固醇和脂质化的PEG的比率之外，像在实施例5中那样将其封装在阳离子脂质纳米微粒中。
正如在实施例8中那样，以皮下方式向9星期龄的雄性C57Bl/6小鼠(n＝4只/组)施用在脂质纳米微粒中的瘦蛋白mRNA。在第0天，把动物称重并且按照平均体重分类。在上午9点向小鼠给药并且在6个小时时采集血液。还记录了体重和食物摄取。
按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测量人瘦蛋白蛋白质水平。将在皮下施用在阳离子脂质C中的处于不同制剂条件下的瘦蛋白mRNA之后的瘦蛋白蛋白质水平详细地列在表47中。
因此，正如由更高的血浆人瘦蛋白蛋白质水平所证明的那样，按照这个实施例方法向瘦的小鼠皮下递送人瘦蛋白mRNA能够在皮下施用之后，增加mRNA递送的效力。
实施例33
包装在阳离子脂质B或阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA，以静脉内方式重复递送的体 内药物动力学研究
在静脉内递送人瘦蛋白mRNA(SEQ.ID.NO:4)以后，诱导了瘦蛋白的蛋白质表达，其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代并且使用不同的脂质制剂把瘦蛋白mRNA包装在阳离子脂质C中。按照实施例2中描述的方式合成瘦蛋白mRNA并且像在实施例5中那样将其包裹在阳离子脂质纳米微粒中。
正如在实施例8中那样，以静脉内方式向15星期龄的雌性129Sv小鼠(n＝4只/组)施用在脂质纳米微粒中的瘦蛋白mRNA。在第0天，把动物称重并且按照平均体重分类。在表48中所指示的第几天的上午9点向小鼠给药并且在6个小时时采集血液。还记录了体重。
按照在实施例1中实验规程测量人瘦蛋白蛋白质水平。将在每次静脉内施用在阳离子脂质B或阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA之后的瘦蛋白蛋白质水平详细地列在表48中。
按照这个实施例方法向129Sv小鼠重复的静脉内递送人瘦蛋白mRNA导致在mRNA递送之后6小时血浆中瘦蛋白蛋白质的主要可再生的水平。对于阳离子脂质B，向与接受它们的第17天剂量的所述重复剂量小鼠组同时的另外一个组的小鼠施用单一的2mg/kg剂量的瘦蛋白mRNA，产生252，622pg/mL的血浆瘦蛋白蛋白质水平。这指示在重复给药在阳离子脂质B中的瘦蛋白mRNA之后，血浆瘦蛋白蛋白质水平的变化在单次施用的正常变化范围之内。在研究的过程上，在几个组的小鼠之间在体重方面没有一致性差别，指示了重复施用在阳离子脂质B或阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA一般是被耐受的。
实施例34
改善方法A
通过改善方法A在脂质纳米微粒中包装mRNA。下列改进是方法，其是关于以最多0.4mg/mL的浓度使用0.75ml体积的脂质和0.75ml体积的mRNA的包裹方法，其是关于0.3mgmRNA的包裹操作。这个方法能够被按比例缩小到少至40μg的mRNA。通过与柠檬酸缓冲液在处于搅拌板上的具有搅拌棒的收集器中混合，使最初在50％乙醇中的初始mRNA脂质纳米微粒被立刻稀释。
任选地，可以由生产商证明设备和一次性的供应品是不含RNase活性的或者通过利用RNase Zap试剂使其变成不含有RNase的。
把本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA配制在柠檬酸缓冲液中，该缓冲液可以在pH6.0，但是如果需要的话，其还可以以小的增量降低，直到pH 5.6。
制备在乙醇中的脂质混合物。下列是以4:1的阳离子脂质胺与mRNA磷酸酯(N:P)的摩尔比率包裹mRNA的一个实例。单独地把脂质(阳离子脂质、DSPC、胆固醇和脂质化的PEG)称出并且配制成在乙醇中的10mg/mL储备溶液(除聚乙二醇(PEG)之外，其被以5mg/mL的浓度配制)。这些储备溶液被用来配制脂质混合物。摩尔比率分别是40:10:48:2。例如，在表50中是关于1.5mL体积的脂质，所有的组分在乙醇中的数量和最终浓度。1.5mL体积代表要确保目标体积能够利用于负载到注射器中所需要的体积的2倍。把混合物配制在闪烁小瓶中并且被保持在37℃直到使用。
在柠檬酸缓冲液中配制mRNA。首先证实柠檬酸缓冲液的pH是pH 6.0。如果不是，则在进行之前调节pH。
使足够用于包裹的在水中的mRNA从-80℃储藏中解冻，并且通过利用AmiconUltra-15离心浓缩器，从水转换成pH 6.0的柠檬酸缓冲液。可以把在10和12mg之间的mRNA负载到每个浓缩器中，使其以4,000rpm在4℃离心持续8分钟。通过添加柠檬酸缓冲液pH6.0增加体积。推荐采用柠檬酸缓冲液pH 6.0进行>10体积的转换来实现所要的缓冲条件。通过在紫外线分光光度计中在260nm处的光密度来测定mRNA的浓度。在冲洗过的闪烁小瓶中，在0.825mL的柠檬酸缓冲液中，把mRNA的最终浓度调节到0.4mg/mL，并且保持在室温下直到使用。0.825mL体积代表要确保目标体积能够利用于负载到注射器中所需要的数量的1.1倍。
在脂质纳米微粒中包裹mRNA。如图6中所示的那样准备具有输入管线和输出管线的T形接头。给无菌的1mL注射器装载相等体积(0.75mL)的在乙醇中的脂质(注射器(a))、在柠檬酸缓冲液中的mRNA(注射器(b))和单独的柠檬酸缓冲液(注射器(c))。使从分别包含脂质和mRNA的注射器(a)和(b)上的路厄配件引出的管材与T形接头连接，并且使从包含单独的柠檬酸缓冲液的注射器(c)上的路厄(Luer)配件引出的管材与离开收集器上方的T形接头的管材配套，该收集器包含搅拌棒，位于活动的搅拌板上。把注射器安装在注射器泵上。把注射器泵设定到合适的注射器(例如Becton Dickinson，Plastipak，1mL)和1mL/分钟的流速。
立刻把现在包裹在脂质纳米微粒中的mRNA转移到透析管材(例如Snake Skin10kDa分子量截止值，Thermo Scientific)中。在4℃，对着不含RNase和热原的1x磷酸缓冲盐水透析物质过夜。移去mRNA脂质纳米微粒并且放置在无菌的试管中并贮藏在4℃直到分析。
有关关于改善方法A的附加信息，参见实施例5。
实施例35
改善方法B
通过改善方法B在脂质纳米微粒中包裹mRNA。下列改进是方法，用于以最多0.5mg/mL的浓度使用60ml体积的脂质和60ml体积的mRNA的包裹方法，或者用于30mg mRNA的包裹操作。可以把这个方法按比例缩小到少至2mg的mRNA。
与改善方法A对比，在改善方法B中，在收集在容器中之前，通过与柠檬酸缓冲液在第二个T形接头中混合，在50％乙醇中的最初的mRNA脂质纳米微粒立刻被稀释。所得的mRNA脂质纳米微粒悬浮液然后通过与穿过另一个T形接头的柠檬酸缓冲液混合而被第二次稀释。方法B也包括利用切向流过滤(TFF)用于进行mRNA脂质纳米微粒的浓缩和在TFF装置中代替透析缓冲液转换。任选地，可以首先使TFF筒(例如Vivaflow 50)变成无热原的。
制备在乙醇中的脂质混合物。下列是以4:1的阳离子脂质胺与mRNA磷酸酯(N:P)的摩尔比率包裹的mRNA的实例。把脂质(阳离子脂质、DSPC、胆固醇和脂质化的PEG)溶于乙醇中。摩尔比率分别是40:10:48:2。表51显示关于63ml体积的在乙醇中的脂质的所有组分的数量和最终浓度。63mL体积代表要确保目标体积能够利用于负载到注射器中所需要体积的1.05倍。称出混合物并且将其放入无菌的聚对苯二甲酸乙二醇酯乙二醇修饰的(PETG)125mL瓶子中并且添加乙醇。简短地对混合物进行超声处理，然后温和地搅拌持续5分钟，然后保持在37℃直到使用。
在柠檬酸缓冲液中配制mRNA。首先证实柠檬酸缓冲液的pH是pH 6.0。如果不是，则在进行之前调节pH。使足够用于所述包裹的在水中的mRNA从-80℃储藏中解冻，并且通过利用Amicon Ultra-15离心浓缩器从水转换变成柠檬酸缓冲液pH 6.0。可以把在10和12mg之间的mRNA负载到每个浓缩器中，在4℃以4，000rpm将其离心持续5分钟。通过添加柠檬酸缓冲液pH 6.0来增加体积。推荐采用柠檬酸缓冲液pH 6.0进行>10体积的转换来达到所要的缓冲条件。通过在紫外线分光光度计中在260nm处的光密度来测定mRNA的浓缩。在无菌的125mL PETG瓶子中，在63mL柠檬酸缓冲液中，把mRNA的最终浓度调节到0.5mg/mL，并且保持在室温下直到使用。63mL体积代表要确保目标体积能够利用于负载到注射器中所需要体积的1.05倍。
在脂质纳米微粒中包裹mRNA。如图7A中所示的那样，准备具有输入管线和输出管线的T形接头。给无菌的60mL注射器装载相等体积(60mL)的在乙醇中的脂质(注射器(a))、在柠檬酸缓冲液中的mRNA(注射器(b))和单独的柠檬酸缓冲液(注射器(c))。使从分别包含脂质和mRNA的所述注射器(a)和(b)上的路厄配件引出的管材与第一T形接头连接，并且安装在注射器泵A上。参见图7B。使从包含单独的柠檬酸缓冲液的注射器(c)上的路厄配件引出的管材与第二T形接头连接以确保mRNA脂质纳米微粒的管线内稀释，并且把注射器(c)安装在注射器泵B上。来自第二T形接头的输出管线位于用于收集稀释的mRNA脂质纳米微粒的无菌的250mL PETG瓶子的上方。在注射器上的所有的配件都是紧密的。把注射器泵设定到合适的注射器制造商和尺寸(BD，Plastipak，60ml)和最多40ml/分钟的流速。同时地起动两个泵，并且在大约0.5秒之后开始收集物质。可以收集到大约160-170ml的mRNA脂质纳米微粒。
可以使用140mL注射器来抽吸135mLmRNA脂质纳米微粒悬浮液。把剩余的35-45mL转移到60mL注射器中。准备具有相同体积的柠檬酸缓冲液的140mL和60mL注射器。如在图7C中显示的那样，设定了用于mRNA脂质纳米微粒悬浮液的另一种稀释的另一种T形接头。采用仅仅在一个注射器泵上的两个注射器运行这个稀释步骤。首先运行140mL注射器(一个包含脂质纳米微粒，另一个包含柠檬酸缓冲液)，第二运行60mL注射器。在注射器上所有的配件都是紧密的。关于首先运行，把注射器泵上的设定改变到正确的尺寸和制造商(140mL，Sherwood-monoject)。把流速设定到25ml/分钟。把稀释的mRNA脂质纳米微粒悬浮液收集到无菌的500ml PETG瓶子中。关于第二运行，把注射器泵上的设定改变到正确的尺寸和制造商(60ml，BD Plastipak)。把流速设定到25mL/分钟。把稀释的mRNA脂质纳米微粒悬浮液收集到相同的无菌的500mL PETG瓶子中。最终体积将会是大约370-380mL。
通过切向流过滤透析和浓缩mRNA脂质纳米微粒。关于在包裹操作中的15mg mRNA，可以使用Vivaflow 50筒。关于30mg mRNA包裹操作，可以使2个Vivaflow 50筒串联连接。任选地，可以首先使再生纤维素筒变成无热原的。任选地，可以在包裹之前一天，开始这个工序。
使用Minimate TFF系统，将两个Vivaflow 50筒串联设置并且用管材连接。把500mL无热原的、不含核酸酶的水负载到贮存器中并且使其以20psi压力流过两个筒。把100mL的0.1M NaOH/1.0M NaCl负载到贮存器中并且使50mL流过筒。剩余的50mL静置在筒中过夜。次日早晨，使所述剩余的50mL以20psi流过筒。把更多无热原的、不含核酸酶的水负载到贮存器中并且使50mL流过筒。再重复这种水洗两次。测试最后的水冲洗的等分试样的内毒素以确保它低于可检测数量。
把mRNA脂质纳米微粒悬浮液负载到Minimate TFF贮存器中。浓缩混合物同时保持20-25psi的总压力。滤液可以以大约4ml/分钟的洗脱开始，但是然后可以慢下来。浓缩直到在贮存器中的液位在40ml刻度处为止。使浓缩的mRNA脂质纳米微粒悬浮液对着300ml无热原的、无核酸酶的1x PBS进行渗滤。保持20-25psi的压力。在渗滤之后，重新开始浓缩物质到刚好低于贮存器上的10ml刻度标记。收集来自贮存器的mRNA脂质纳米微粒悬浮液。可以采用另外的5ml 1x PBS清洗TFF系统并且可以收集这种包含稀释的mRNA脂质纳米微粒悬浮液的洗涤液，但是可以把这种洗涤液与浓缩的mRNA脂质纳米微粒悬浮液分开收集。在4℃贮藏材料直到分析。采用无热原的、不含核酸酶的水，随后采用70％乙醇/水洗涤TFF系统。
实施例36
在向瘦的C57Bl/6只膳食诱导的肥胖(DIO)或缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠皮下给药在 阳离子脂质B或阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA以后，瘦蛋白蛋白质表达的药物动力学
为了确定皮下脂肪的数量是否影响皮下递送瘦蛋白mRNA之后表达的瘦蛋白蛋白质的数量，评价了三个不同的小鼠模型。
采用正常的光线周期(6:00-18:00)圈养来自Jackson Labs的8星期龄的瘦的C57Bl/6小鼠、来自Taconic的13星期龄的雄性膳食诱导的肥胖(DIO)小鼠和来自JacksonLabs的16星期龄的缺乏瘦蛋白的雄性ob/ob小鼠，每个笼子4只。给予它们其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的本发明HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。按照实施例35配制方法，把mRNA包裹在阳离子脂质B或阳离子脂质C(N:P摩尔比率＝4:1)中。把制剂稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中。按照实施例8中描述的方式，以皮下方式给小鼠注射。
由4只小鼠组成的组中的每只小鼠在上午9点接受0.2、0.6或2.0mg/kg(mpk)配制在阳离子脂质B或阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA，并且在6个小时以后在下午3点被采集血液。也在施用之后24、48、72和96小时(每次施用随后的那天上午9点，持续4天)采集血液，用于评估瘦蛋白蛋白质水平。
按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测定血浆中的人瘦蛋白蛋白质水平。在皮下施用在阳离子脂质B中的瘦蛋白mRNA之后，瘦蛋白蛋白质水平被详细地列在表52中。在皮下施用在阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA之后，瘦蛋白蛋白质水平被详细地列在表53中。
采用两种阳离子脂质制剂的结果证明:与瘦的C57Bl/6小鼠模型相比，在适度地肥胖的DIO小鼠模型中更大的瘦蛋白蛋白质水平。与适度地肥胖DIO小鼠模型相比，在严重地肥胖的ob/ob小鼠模型中，瘦蛋白蛋白质水平甚至更高。因此，更大的皮下脂肪数量与在皮下施用在阳离子脂质B或阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA之后更大的瘦蛋白蛋白质表达相关联。
实施例37
向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用采用阳离子脂质B或阳离子脂质C包装的瘦蛋白 mRNA的重复皮下治疗的药物动力学
这个实施例的目的是要证明瘦蛋白mRNA的重复的(每周的)治疗导致在每次相继的给药以后一致的(稳定的)瘦蛋白水平而且体内效力在全部给药期间被保持。把其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)包装在阳离子脂质B和C中并且以皮下方式向具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型施用。
所使用的动物是来自Jackson Labs的10个星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、以4:1的N:P摩尔比率包装在阳离子脂质B或阳离子脂质C中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。以正常的方式限制小鼠。如实施例8中所示的那样，以皮下方式施用瘦蛋白mRNA。
五只小鼠接受PBS(A组)。五只小鼠以0.6mpk的剂量接受包装在阳离子脂质C中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。五只小鼠以0.2mpk的剂量接受包装在阳离子脂质C中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。五只小鼠以0.06mpk的剂量接受包装在阳离子脂质C中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。五只小鼠以0.6mpk的剂量接受包装在阳离子脂质B中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(E组)。五只小鼠以0.2mpk的剂量接受包装在阳离子脂质B中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(F组)。五只小鼠以0.06mpk的剂量接受包装在阳离子脂质B中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(G组)。五只小鼠以0.02mpk的剂量接受包装在阳离子脂质B中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(H组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的体重把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。也在所述研究的随后的每一天在上午9点把所有的小鼠称重。
在第0天在下午3点(在给药以后6小时)，然后在第1、7、10、15、21、22、28和31天在上午9点，通过尾部切口给来自每个组的小鼠放血。分离血浆并且按照在实施例1中酶联免疫吸附测定方法测定人瘦蛋白蛋白质水平。使用由Polymer Technology Systems，Inc.，Indianapolis IN美国生产的CardioPA(目录号730)和甘油三酯(TG)测试条(参考号1716)来测定甘油三酯。把15μL通过小鼠尾静脉新采集的EDTA血液应用到流量计并且在～2分钟之内记录TG数值。使用由Abbott Laboratories，Inc.，Abbott Park IL美国生产的Alpha仪表(目录号321250401)和葡萄糖测试条(参考32109-46-50)来测定小鼠葡萄糖水平。仅仅需要一滴来自尾静脉的全血就能在～20秒之内从这个仪表读取葡萄糖。
下表显示来自每个星期(4次给药)采用本发明的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQID NO:4)治疗的体重、葡萄糖水平和甘油三酯水平，在人瘦蛋白mRNA中，尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代并且人瘦蛋白mRNA被配制在要么包含阳离子脂质B，要么包含阳离子脂质C的脂质纳米微粒中。
实施例38
在向缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠施用的采用阳离子脂质D包装的瘦蛋白mRNA的皮下 治疗以后的葡萄糖和甘油三酯数据
这个实施例的目的是将要证明在单一的皮下治疗之后，瘦蛋白mRNA对于葡萄糖和甘油三酯(TG)的动力学(减少并且回到基线的速率)的影响。其中尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代的HPLC纯化的人瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)被包装在阳离子脂质D中并且以皮下方式向具有遗传性瘦蛋白缺乏的小鼠模型施用。
阳离子脂质D的结构被显示在图1中。
所使用的动物是来自Jackson Labs的10个星期龄的雄性ob/ob小鼠。采用正常的光线周期(6:00-18:00)，将动物单个圈养。给予它们已经被HPLC纯化的、以4:1的N:P摩尔比率包装在阳离子脂质D中并且稀释在可注射的磷酸缓冲盐水(PBS)中并且按照实施例8中所示以皮下方式注射的本发明修饰的合成瘦蛋白mRNA(SEQ ID NO:4)。
4只小鼠接受PBS(A组)。4只小鼠以0.6mpk的剂量接受包装在阳离子脂质D中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(B组)。4只小鼠以0.2mpk的剂量接受包装在阳离子脂质D中的修饰的合成瘦蛋白mRNA(C组)。5只小鼠以0.06mpk的剂量接受包装在阳离子脂质D中修饰的合成瘦蛋白mRNA(D组)。
在第0天，把小鼠称重并且按照它们的被喂养的葡萄糖和甘油三酯水平把它们分组，使得每个组的平均体重是相同的，然后基于它们的分组在上午9点给小鼠给药。也在所述研究的随后的每一天在上午9点把所有的小鼠称重。
在第0天在下午3点(在给药以后6个小时)，然后在第1、2、3、5、6、7和14天在上午9点，通过尾部切口给来自每个组的小鼠放血。按照实施例37中描述的方式，使用CardioPA(目录号730)和甘油三酯测试条(参考号1716)来测定甘油三酯。还按照在实施例37中所描述的方式，使用1Alpha仪表(目录号321250401)和葡萄糖测试条(参考32109-46-50)来测定小鼠葡萄糖水平。
实施例39
在食蟹猴中静脉内施用包装在阳离子脂质B和阳离子脂质C中的瘦蛋白mRNA的施 用之后，关于食蟹猴的毒理学结果
正如实施例20中描述的那样，食蟹猴接受静脉内施用包装在要么包含阳离子脂质B，要么包含阳离子脂质C的脂质纳米微粒中的瘦蛋白mRNA。在给药以后24小时时或者在给药以后72小时时，检查了猴子的大脑，获取毒理学结果。
在静脉内施用之后24小时时，对于一些猴子的脾的组织学分析显示:与在对照动物中成熟的淋巴细胞群相比，它们的动脉周围的淋巴管鞘的多孔性增加，具有向淋巴细胞与组织细胞群的转移。
以较高的剂量，在静脉内施用脂质纳米微粒中的任何一种(例如对于阳离子脂质B制剂以1.5mpk或者对于阳离子脂质C制剂以1.25mpk)之后，在72小时时，关于一些猴子的组织学分析显示了脑出血的损害和分散的病灶。损害大部分局限于猴子的大脑白质，并且主要与进入周围神经纤维网的嗜中性白细胞的炎性细胞浸润有关并且与其混合。分散的灶性出血局限于白质。
在24小时时，在所述动物的大脑皮质的灰质和白质两者中观察到神经胶质细胞的活化。通过增加的GFAP表达(指示星形细胞的活化)和增加的Iba1表达(指示小神经胶质细胞的活化)，以免疫组织化学方式测定了神经胶质细胞的活化。观察到星形细胞的活化起始于在给药以后24小时时。在给药以后72小时时，在显示组织病理学病变的动物中观察到星形细胞的活化更加显著。
还测试了其它标记。正如以免疫组织化学方式测定的那样，在所有高剂量的动物中，在24和72小时时间点，Ki67被增加了。通过原位杂交和以免疫组织化学方式两者，在所有的高剂量动物中观察到了IL-1β，并且在发展了大脑损害的猴子中IL-1β被增加得最多。在24小时时观察到IL-1βmRNA和蛋白质表达并且在72小时时增加得最多；在24小时时，mRNA表达似乎出现在灰质和白质的星形细胞中。在72小时时观察到发生血管周围的GFA阳性的星形细胞损失，其与炎性细胞浸润和内皮细胞连续性的丧失同时发生。在给药之后72小时时，出现被切割的胱天蛋白酶3证明在一些受影响的动物的白质内的凋亡。关于人瘦蛋白RNA的原位杂交的结果证明在所有的剂量下经过24小时，在灰质和白质的胶质细胞和内皮之内存在瘦蛋白mRNA。在72小时时，在出血区中，在所述受影响的动物的内皮和神经胶质细胞中观察到广泛的定位。正常的白质内皮细胞表达低水平的LDLR(正如以组织化学方式测定的那样)，在施用脂质纳米微粒之后，在所述受影响的动物中观察到该LDLR重新分布而变得被上调。关于C5b-9的免疫组织化学结果(MAC)证明了在72小时时，在接受了高剂量的静脉内施用的动物的内皮上的补充沉积。观察到这种补充沉积在受影响的动物中更加显著并且先于在神经纤维网中普遍的瘦蛋白信号传导(正如通过原位杂交检测的那样)。
并不打算使本发明的保护范围局限于上述描述，而是本发明的保护范围正如在所附的权利要求书中所阐述的那样。

Claims (36)

1.制剂，其包含:
(a)核糖核酸(RNA)多核苷酸，
(i)其中多核苷酸编码瘦蛋白蛋白质，并且
(ii)其中多核苷酸包括假尿嘧啶核苷核苷酸；和
(b)递送剂。
2.权利要求1的制剂，其中编码的瘦蛋白蛋白质是人瘦蛋白蛋白质。
3.权利要求1-2中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸不包括尿嘧啶核苷核苷酸。
4.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含编码区，其与选自由SEQ ID NOS:17-20组成的组的序列具有至少78％的序列同一性。
5.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含编码区，其与选自由SEQ ID NOS:17-20组成的组的序列具有至少90％的序列同一性。
6.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含选自由SEQ ID NOS:17-20组成的组的序列。
7.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10组成的组的序列。
8.权利要求1-7中任意一项的制剂，其中制剂是脂质纳米微粒(LNP)。
9.权利要求1-8中任意一项的制剂，其中递送剂包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐型脂质。
10.权利要求9的制剂，其中阳离子脂质与核糖核酸多核苷酸的摩尔比率在3:1和8:1之间。
11.权利要求9-10中任意一项的制剂，其中阳离子脂质选自由阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C和阳离子脂质D组成的组。
12.权利要求9-11中任意一项的制剂，其中中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
13.权利要求9-12中任意一项的制剂，其中辅助脂质是胆固醇。
14.权利要求9-13中任意一项的制剂，其中隐型脂质是聚乙二醇(PEG)脂质。
15.权利要求9-14中任意一项的制剂，其中隐型脂质是S024。
16.权利要求1-15中任意一项的制剂，其中递送剂包括阳离子脂质、胆固醇、中性脂质和聚乙二醇(PEG)脂质。
17.权利要求1-16中任意一项的制剂，用作药物。
18.权利要求1-17中任意一项的制剂，用于治疗瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平是低的其它病况。
19.用于治疗受试者中的瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平是低的其它病况的方法，包括下列步骤:
(a)选择患有瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平是低的其它病况的受试者；
(b)向受试者施用权利要求书1的制剂；
其中施用制剂缓和受试者的瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平是低的其它病况的症状。
20.权利要求19方法，其中以重复的剂量施用制剂。
21.权利要求19-20中任意一项的方法，其中以静脉内方式施用制剂。
22.权利要求19-20中任意一项的方法，其中以皮下方式施用制剂。
23.权利要求19-20中任意一项的方法，其中以静脉内方式施用制剂，然后以皮下方式施用制剂。
24.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以至少0.2mg核糖核酸多核苷酸/kg所述受试者的体重的剂量施用制剂。
25.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以至少0.6mg核糖核酸多核苷酸/kg所述受试者的体重的剂量施用制剂。
26.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到至少1.4ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
27.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到至少2.8ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
28.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到比施用制剂之前受试者的血浆瘦蛋白蛋白质浓度至少10ng/mL之上的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
29.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到至少19ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
30.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到至少25ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
31.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到至少185ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
32.权利要求19-23中任意一项的方法，其中以足以达到至少1300ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度的数量施用制剂。
33.权利要求19-32中任意一项的方法，其中施用导致血浆葡萄糖浓度减少至少30％。
34.权利要求19-33中任意一项的方法，其中施用导致血浆甘油三酯浓度减少至少40％。
35.权利要求19-34中任意一项的方法，其中施用导致稳定的体重。
36.权利要求19-34中任意一项的方法，其中施用导致持续的体重减轻。
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