ADMINISTRACIÓN INTRADÉRMICA DE VACUNAS Y AGENTES TERAPÉUTICOS GÉNICOS A TRAVÉS DE MICROCÁNULA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y dispositivos para la administración de vacunas y agentes terapéuticos génicos en la capa intradérmica de la piel. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La importancia de la administración eficaz y segura de sustancias farmacéuticas para el propósito de profilaxis, diagnóstico o tratamiento se ha reconocido desde hace mucho tiempo. El uso de agujas convencionales ha ofrecido durante mucho tiempo un medio para administrar sustancias farmacéuticas a seres humanos y animales mediante la administración a través de la piel. Un esfuerzo considerable se ha hecho para lograr una administración reproducible y eficaz a través de la piel mientras se mejora la facilidad de inyección y se reduce el temor del paciente y/o el dolor asociado con las agujas convencionales. Además, ciertos sistemas de administración eliminan totalmente las agujas y se basan en mediadores químicos o bien fuerzas impulsoras externas como por ejemplo corriente iontoforéticas o electroporación o bien poración térmica o bien sonoforesis para romper el estrato córneo, la capa más externa de la piel, y administrar las sustancias a través de la superficie de la piel. Sin embargo, tales sistemas de administración no rompen de manera reproducible las barreras cutáneas ni suministrar la sustancia farmacéutica a una profundidad dada debajo de la superficie de la piel y por consiguiente los resultados clínicos pueden variar. Asi, la ruptura mecánica del estrato córneo como por ejemplo con agujas ofrece, según se considera, el método más reproducible de administración de sustancias a través de la superficie de la piel y proporciona control y conflabilidad en la colocación de sustancias administradas. Enfoques para administrar sustancias debajo de la superficie de la piel han sido involucrados casi exclusivamente con la administración transdérmica, es decir, la administración de sustancias a través de la piel a un sitio debajo de la piel. La administración transdérmica incluye la administración subcutánea, intramuscular o intravenosa, entre las cuales las más comunes han sido las inyecciones intramusculares (IM) y subcutánea (SC) . Anatómicamente hablando, la superficie externa del cuerpo consiste de dos capas tisulares principales, una externa la epidermis y una subyacente, la dermis, que conjuntamente constituyen la piel (para una reseña, véase Physiologyr Blochemistry, and Molecular Biology of the Skin [Fisiología, Bioquímica y Biología Molecular de la Piel] , Segunda Edición, L. A. Goldsmith, Ed. , Oxford University Press; Nueva York, 1991) . La epidermis se subdivide en cinco capas o estratos de un espesor total comprendido entre 75 y 150 um. Debajo de la epidermis se encuentra la dermis, la cual contiene dos capas, una parte más externa conocida como dermis papilar y una capa más profunda conocida como dermis reticular. La dermis papilar contiene vastos plexos sanguíneos y linfáticos de la microcirculación. En contraste, la dermis reticular es relativamente acelular y avascular y consiste de colágena densa y tejido conectivo elástico. Debajo de la epidermis y de la dermis se encuentra el tejido subcutáneo, que se conoce también como la hipodermis, que consiste de tejido conectivo y tejido graso. El tejido muscular se encuentra debajo del tejido subcutáneo. Como se observó arriba, tanto el tejido subcutáneo como el tejido muscular han sido utilizados comúnmente como sitios para la administración de sustancias farmacéuticas. Sin embargo, la dermis, ha sido enfocada pocas veces como sitio para la administración de sustancias, y esto puede deberse, por lo menos en parte, a la dificultad de una colocación precisa de aguja en el espacio intradérmico . Además, aún cuando la dermis, en particular, la dermis papilar, tiene un alto grado de vascularidad, no se ha observado hasta ahora que se podía aprovechar este alto grado de vascularidad para obtener un perfil de absorción mejorado para las sustancias administradas en comparación con la administración subcutánea. Esto se debe al hecho que las pequeñas moléculas de fármaco son típicamente rápidamente absorbidas después de administración en el tejido subcutáneo que ha sido mucho más fácil y predeciblemente enfocado que la dermis. Por otra parte, grandes moléculas tales como proteínas típicamente no son bien absorbidas a través del epitelio capilar independientemente del grado de vascularidad de tal manera que no se podía esperar lograr una ventaja de absorción significativa en comparación con la administración subcutánea a través de la administración intradérmica más difícil de lograr aún en el caso de moléculas grandes. Un enfoque hacia la administración debajo de la superficie de la piel y en la región del espacio intradérmico ha sido utilizado rutinariamente en la prueba de tuberculina de Mantoux. En este procedimiento, un derivado de proteína purificado es inyectado a un pequeño ángulo con relación a la superficie de la piel empleando una aguja calibre 27 o calibre 30 como jeringa estándar (Flynn y colaboradores, Chest 106: 1463-5, 1994). La técnica de Mantoux incluye la inserción de la aguja en la piel lateralmente, y después el hecho de "culebrear" la aguja adicionalmente en el tejido ID. La técnica es conocida por ser bastante complicada y requiere de una capacitación especializada. Un grado de imprecisión en la colocación de la inyección resulta en un número significativo de resultados de prueba negativos falsos.
Además, la prueba incluye una inyección localizada para provocar una respuesta en el sitio de inyección y el enfoque de Mantoux no ha llevado al uso de una inyección intradérmica para la administración sistémica de sustancias. Otro grupo reportó sobre lo que se describió como un dispositivo de administración de fármaco por via intradérmica (Patente Norteamericana No. 5,997,501). La inyección fue indicada como llevándose a cabo a una velocidad lenta y el sitio de inyección se contemplaba en alguna región debajo de la epidermis, es decir, la interfaz entre la epidermis y la dermis o la parte interna de la dermis o tejido subcutáneo. Esta referencia, sin embargo, no proporcionó ninguna enseñanza que pudiera sugerir una administración selectiva en la dermis ni la referencia sugirió que las vacunas o agentes terapéuticos génicos pudieran ser administrados de esta maner . A la fecha, numerosas proteínas terapéuticas y compuestos de bajo peso molecular han sido administrados de manera intradérmica y utilizados para provocar efectivamente una respuesta farmacológica benéfica. La mayoría de estos compuestos (por ejemplo, insulina, Neupogen, hGH, calcitonina) han sido proteínas hormonales no receptores manipulados ni anticuerpos. A la fecha, todas las proteínas administradas han presentados varios efectos asociados con la administración ID, incluyendo un inicio más rápido de absorción y distribución (en comparación con SC) y en algunos casos una biodisponibilidad incrementada. El tejido dérmico representa un sitio blanco atractivo para la administración de vacunas y agentes terapéuticos génicos. En el caso de vacunas (tanto genéticas como convencionales) , la piel es un sitio de administración atractivo debido a la alta concentración de células de presentación de antigeno (APC) y precursores de APC que se encuentran dentro de ese tejido, en particular las células epidérmicas de Langerhan y células dendriticas dérmicas. Varios agentes terapéuticos génicos son diseñados para el tratamiento de enfermedades cutáneas, padecimientos cutáneos y canceres de la piel. En tales casos, la administración directa del agente terapéutico al tejido cutáneo afectado es deseable. Además, células cutáneas son un blanco atractivo para agentes terapéuticos génicos cuyas proteínas codificadas o proteínas son activas en sitios distantes de la piel. En tales casos, las células cutáneas (por ejemplo, queratinocitos ) pueden funcionar como "bio-reactores" produciendo una proteína terapéutica que puede ser absorbida rápidamente en la circulación sistémica a través de la dermis papilar. En otros casos, un acceso directo de la vacuna o agente terapéutico a la circulación sistémica es deseable para el tratamiento de enfermedades distantes de la piel. En tales casos, la distribución sistémica puede lograrse a través de la dermis papilar.
Sin embargo, como se comentó arriba, la inyección intradérmica (ID) utilizando agujas estándares y jeringas estándares es técnicamente muy complicado de efectuar y es dolorosa. La técnica previa contiene varias referencias a la administración ID de vacunas convencionales y de vacunas basadas en ADN y agentes terapéuticos, sin embargo, los resultados han sido conflictivos, por lo menos en parte debido a dificultades para enfocar con precisión el tejido ID con técnicas existentes. Virtualmente todas las vacunas humanas actualmente en el mercado son administradas a través de las vías IM o SC. De las 32 vacunas comercializadas por los 4 productores principales de vacunas a nivel global en el año 2001 (Aventis-Pasteur, GlaxoSmithKline, Merck, Wyeth) , solamente 2 son aprobadas para su uso ID (2001 Physicians Desk Reference) . De hecho, los folletos de producto para 6 de estas 32 vacunas establecen de manera específica que no se debe usar la vía ID. Esto a pesar de varios estudios pre-clínicos y clínicos tempranos publicados que sugieren que la administración ID puede mejorar las vacunas mediante la introducción de una respuesta inmune más fuerte que la inyección por la vía IM o SC o bien mediante la inducción de una respuesta inmune comparable a una dosis reducida en comparación con la dosis administrada IM o SC (Playford, E.G y colaboradores, Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 23:87, 2002; Kerr, C. Trends Microbiol. 9:415, 2001; Rahman, F . y colaboradores, Hepatology 31:521, 2000; Carlson, U. y colaboradores, Sean J. Infect. Dis. 28:435, 1996; Propst, T. y colaboradores, Amer. J. idney Dis. 32:1041, 1998; Nagafuchi, S. y colaboradores, Rev. Med. Virol., 8:97, 1998; Henderson, E. A. y colaboradores, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 21:264, 2000). Otras mejoras se encuentra la eficacia de la vacuna después de administración ID han sido observadas en algunos casos, en otros casos no se ha observado dichas ventajas (Crowe, Am. J. Med. Tech. 31:387-396, 1965); Letter to Britis Medical Journal 29/10/77, p. 1152; Brown y colaboradores, J. Infect. Dis. 136:466-471, 1977; Herbert & Larke, J. Infect. Dis. 140:234-238, 1979; Ropac y colaboradores, Periodicum Biologorum 103:39-43, 2001) . Un factor principal que ha preferido el uso generalizado de la vía de administración ID y ha contribuido a los resultados conflictivos descritos arriba es la falta de dispositivos adecuados para lograr una administración reproducible en las capas cutáneas epidérmicas y dérmicas. Las agujas estándares comúnmente utilizadas para inyectar vacunas son excesivamente grandes para enfocar con precisión estas capas de tejido cuando se insertan en la piel. El método más común de administración es a través de inyección de tipo Mantoux utilizando agu a y jeringa estándares. Esta técnica es difícil de efectuar, no es confiable, y es dolorosa para el sujeto. Además, existe la necesidad de dispositivos y métodos que permitan una administración eficiente, precisa y reproducible de vacunas y agentes terapéuticos génicos a la capa intradérmica de la piel. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención mejora la utilidad clínica de la administración ID de vacunas y agentes terapéuticos génicos a seres humanos y animales. Los métodos emplean dispositivos para enfocar directamente el espacio intradérmico y para administrar sustancias al espacio intradérmico en forma de bolos o bien por infusión. Se ha descubierto que la colocación de la sustancia dentro de la dermis proporciona una respuesta eficaz y/o mejorada a las vacunas y agentes terapéuticos génicos. El dispositivo está diseñado de tal manera que impida la fuga de la sustancia a partir de la piel y la adsorción o absorción celular en el espacio intradérmico. La respuesta inmunológica a una vacuna administrada de conformidad con los métodos de la presente invención es equivalente o mejorada en comparación con la administración IM convencional de la vacuna, lo que indica que la administración ID de conformidad con los métodos de invención proporcionará en muchos casos resultados clínicos mejorados, además de las demás ventajas de la administración ID.
La presente divulgación se refiere también a métodos y dispositivos para administrar vacunas o material genético a un individuo con base en el enfoque directo del espacio dérmico por lo que dicho método permite una administración mejorada y/o una respuesta mejorada a la vacuna o material génico. Mediante el luso del medio de administración intradérmica directa (ID (se conoce a continuación como medio de acceso dérmico) , por ejemplo utilizando sistemas de infusión e inyección basados en micro agujas, o bien otros medios para enfocar con precisión el espacio intradérmico, la eficacia de muchas sustancias incluyendo vacunas y agentes de terapia génica puede mejorarse en comparación con las vias de administración parentales tradicionales para la administración subcutánea e intramuscular. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención ofrecer un método para enfocar con precisión el tejido ID para administrar una vacuna o un fármaco que comprende material genético para proporcionar una respuesta inmunogénica o terapéutica. Es un objeto adicional de la presente invención ofrecer un método para mejorar la respuesta inmunogénica o terapéutica sistémica a una vacuna (convencional o genética) o bien fármaco que comprende material genético mediante el enfoque preciso del tejido ID. Otro objeto de la invención es ofrecer un método para mejorar la disponibilidad de una vacuna (convencional o genética) a APC que se encuentran en la piel con el objeto de efectuar una respuesta inmune especifica para antígeno a través de la vacuna mediante el enfogue preciso del tejido ID. Esto puede permitir, en muchos casos, la administración de dosis más pequeñas de la sustancia a través de la vía ID. Otro objeto de la presente invención es ofrecer un método para mejorar la administración de un fármaco que comprende material genético para el tratamiento de enfermedades cutáneas, trastornos cutáneos genéticos o canceres de la piel, mediante el enfoque preciso del tejido ID. El material genético resultante es subsecuentemente expresado a través de las células dentro del tejido ID enfocado. Otro objeto de la presente invención es ofrecer un método para mejorar la administración de un fármaco que comprende material genético para el tratamiento de enfermedades, trastornos genéticos, o canceres que afectan tejidos distantes de la piel mediante el enfoque preciso del ejido ID. El material genético resultante es subsecuentemente expresado por las células dentro de los tejidos ID enfocados, distantes o ambas cosas. Estos y otros beneficios de al invención se logran mediante la administración directamente enfocada de la sustancia a la profundidad preferida para el agente terapéutico o profiláctico particular. Los inventores han encontrado que mediante la administración específicamente enfocada de la sustancia al espacio intradérmico, la respuesta a las vacunas y agentes terapéuticos génicos puede ser mejorada de manera inesperada y puede ser variada en muchas situaciones con ventaja clínica resultante. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una actividad de gen reportero en piel de conejillo de la india seguido por la administración de ADN de plásmido que codifica luciferasa de luciérnaga. Los resultados se muestran como unidades de luz relativas (RLU) por mg de proteína para administración intradérmica a través del método de Mantoux, el método de administración de la presente invención, y un grupo de control en el cual se llevó a cabo una aplicación tópica de ADN de plásmido sobre la piel afeitada. La Figura 2 muestra la actividad de gen reportero en piel de rata después de la administración de ADN de plásmido que codifica luciferasa de luciérnagas. Los resultados se muestran como RLU/mg de proteína para administración transdérmica por el método de administración micro dérmico (una modalidad de la invención, MDD) , y grupo de control en el cual se inyectó ADN de plásmido no relacionado. La Figura 3 muestra la actividad de gen reportero en piel de cerdo después de la administración de ADN de plásmido que codifica ß-galactosidasa . Los resultados se muestran como RLU/mg de proteína para administración intradéritiica por el método de Mantoux, por administración ID a través de inserción perpendicular en la piel utilizando dispositivo MDD (34 g) o bien aguja de 30 g a profundidad de 1.5 mm, respectivamente, y control negativo. La Figura 4 muestra el contenido total de proteína en sitios de la piel recuperados en cerdos después de la administración ID y MDD Mantoux de ADN de plásmido reportero. El control ("Negativo") es piel no tratada. La Figura 5 muestra la respuesta a anticuerpo sérico específico para influenza . en ratas después de la administración de ADN de plásmido que codifica la hemaglutinina de virus de influenza en ausencia de adyuvante agregado. El ADN de plásmido fue administrado a través de administración ID con el dispositivo MDD o bien a través de inyección intramuscular (IM) con una aguja y jeringa estándares. El término "tópico" se refiere al grupo de control, en donde la preparación fue aplicada tópicamente a la piel. La Figura 6 muestra la respuesta de anticuerpo sérico específico para la influenza en ratas después de la administración de ADN de plásmido que codifica la hemaglutinina de virus de influenza en presencia de adyuvante. El ADN de plásmido fue administrado a través de administración ID con el dispositivo MDD o bien a través de inyección intramuscular (IM) con una aguja y jeringa estándares. El término "tópico" se refiere a un grupo de control, en donde la preparación fue aplicada tópicamente sobre la piel. La Figura 7 muestra la respuesta de anticuerpo sérico especifico para influenza en ratas después de ""cebado" con ADN de plásmido en ausencia de adyuvante agregado seguido por "refuerzo" con el virus de influenza desactivado entero en ausencia de adyuvante agregado. El ADN de plásmido o el virus de influenza desactivado entero fue administrada a través de administración ID con el dispositivo MDD o a través de inyección intramuscular (IM) con una aguja y jeringa estándares. El término "tópico" se refiere a un grupo de control, en donde la preparación fue aplicada tópicamente sobre la piel. La Figura 8 muestra la respuesta de anticuerpo sérico especifico para influenza en ratas después "cebado" con ADN de plásmido en presencia de adyuvante agregado seguido por "refuerzo" con virus de influenza desactivado entero en ausencia de adyuvante agregado. El ADN plásmido o bien virus de influenza desactivado entero fue administrado a través de administración ID con el virus MDD o bien a través de inyección intramuscular (IM) con una aguja y jeringa estándares. El término "tópico" se refiere al grupo de control, en donde la preparación fue aplicada tópicamente sobre la piel. La Figura 9 muestra la respuesta de anticuerpo sérico especifico para influenza en ratas a una preparación de virus de influenza desactivado entero administrado a través de administración ID con el dispositivo MDD o a través de inyección intramuscular (I ) con una aguja y jeringa estándares. La expresión "tópico" se refiere a un grupo de control en donde la preparación fue aplicada de manera tópica sobre la piel. La Figura 10 muestra la respuesta de anticuerpo sérico especifico para influenza en cerdos a una preparación de virus de influenza desactivado entero administrada a través de administración ID con el dispositivo MDD o bien a través de inyección intramuscular (IM) con una aguja y jeringa estándares. La Figura 11 muestra la respuesta de anticuerpo sérico especifico para influenza en ratas dosis reducidas de una preparación de virus de influenza desactivado entero administrada a través de administración ID con el dispositivo MDD o bien a través de inyección IM con una aguja y jeringa estándares . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se emplea aquí, el término "intradérmica" (ID) tiene el propósito de referirse a la administración de una sustancia en la dermis de tal manera que la sustancia alcance fácilmente la dermis papilar muy vascularizada en donde dicha sustancia puede ser absorbida sistémicamente de manera rápida, o bien en el caso de vacunas (convencionales y genéticas) o agentes terapéuticos génicos puedan ser absorbidos directamente por células de la piel. En el caso de vacunas genéticas, las células blanco contempladas incluyen APC (incluyendo células epidérmicas de Langerhan y células dendriticas dérmicas) . En el cado de agentes terapéuticos génicos para enfermedades, padecimientos genéticos o canceres que afectan tejidos distantes de la piel, las células blanco contempladas incluyen queratinocitos u otras células cutáneas capaces de expresar una proteina terapéutica. En el caso de agentes terapéuticos génicos para enfermedades, trastornos genéticos o canceres que afectan la piel, las células blanco contempladas incluyen las células cutáneas que pueden ser afectadas por la enfermedad, trastornos genéticos o cáncer. Como se emplea aqui, una administración enfocada" se refiere a una administración de una sustancia a la profundidad blanco, e incluye la administración que puede resultar en las misma respuesta en un animal tratado, pero que puede resultar en menos dolor, mayor capacidad de reproducción, u otra ventaja en comparación con un dispositivo de administración aceptado alternativo (por ejemplo, administración tópica, subcutánea o intramuscular) . Como se emplea aqui, una "respuesta mejorada" incluye una respuesta equivalente a una cantidad reducida de un compuesto administrado o una respuesta incrementada a una cantidad idéntica de compuesto administrado por una vía alternativa de administración o bien cualquier otro beneficio terapéutico o inmunológico . Los términos "aguja" y "agujas" como se emplean aquí abarcan todas las estructuras de tipo aguja. Los términos microcánula o microaguj s, como se emplean aquí, abarcan estructuras inferiores a calibre 31 aproximadamente,. típicamente de aproximadamente calibre 31 a 50 cuando dichas estructuras son cilindricas por naturaleza. Estructuras no cilindricas abarcadas por el término "microagu as" tendrían un diámetro comparable e incluirían formas piramidales, rectangulares, octagonales, de cuñas u otras formas geométricas. Cornos e emplea aquí, el término "bolos" se refiere a una cantidad administrada dentro de un período de tiempo inferior a diez (10) minutos. Un "bolo rápido" se refiere a una cantidad administrada en menos de un minuto. La infusión" se refiere la administración de una sustancia en un tiempo mayor que diez (10) minutos. El término "ácido nucleico" incluye polinucleótidos, ARN, ADN, o bien secuencias híbridas ARN/ADN de más de un nucleótido ya sea en cadena simple o en forma dúplex, y puede ser de cualquier tamaño que pueda ser formulada y administrada utilizando los métodos de la presente invención.
Los ácidos nucleicos pueden ser de tipo de "antisentido". Por entidad derivada de ácido nucleico" se refiere a una entidad compuesta de ácidos nucleicos enteros o en parte. Por "agente terapéutico génico" nos referimos a un agente contemplado para su administración en células o capas de absorción por células del individuo tratado para incorporación y expresión de material genético. El agente terapéutico genético incluirá habitualmente un polinucleótido que codifica un péptido, polipéptido, proteína o glicoproteina de interés, opcionalrtiente contenido en un vector o plásmido, operacionalmente enlazado a secuencias de ácido nucleico adicionales necesarias para expresión. Con referencia a la administración de vacunas o agentes terapéuticos génicos, el término "simultáneamente" se refiere generalmente a la administración de dos dosificaciones dentro del mismo periodo de horas, mientras que los términos "secuencialmente o "subsecuentemente" se refieren al hecho que las dosificaciones son separadas por lo menos por 24 horas. Se observará por parte de los expertos en la materia que la administración simultánea se referirá generalmente a dosificaciones administradas en la misma visita médica, mientras que subsecuentemente o secuencialmente se refiere a dosificaciones que pueden separadas por días, semanas, meses o eventualmente años, según los efectos de una vacuna particular o terapia génica particular. En una modalidad preferida, los términos "secuencial" o subsecuente" se refieren a dosificaciones separadas por un dia a seis semanas . En la respuesta terapéutica o inmunogénica deseada se relacionan directamente con la profundidad de enfoque de ID. Estos resultados pueden ser obtenidos mediante la colocación de la sustancia en la región superior de la dermis, es decir, la dermis papilar o bien en la parte superior de la dermis reticular con relativamente poca vascularización de tal manera que la sustancia pueda difundirse fácilmente en la dermis papilar. La colocación de la sustancia predominantemente a una profundidad de por lo menos 0.025 m a aproximadamente 2.5 mm se prefiere. En particular, en el caso de vacunas, se prefiere que la administración se encuentre a una profundidad enfocada solamente por debajo del estrato corneo y que abarque la epidermis y la dermis superior (aproximadamente 0.025 mm a aproximadamente 2.5 mm) . Para agentes terapéuticos que enfocan células en la piel, la profundidad blanco preferida depende de la célula particular a enfocar; por ejemplo, para enfocar células de Langerhan, la administración debe abarcar por lo menos en parte la profundidad de tejido epidérmico típicamente dentro de un rango de aproximadamente 0.025 mm a aproximadamente 0.2 mm en seres humanos. Para agentes terapéuticos y vacunas que requieren de circulación sistémica, la profundidad blanco preferida estará entre aproximadamente por lo menos 0.4 mm y con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 0.5 mm hasta una profundidad no mayor que aproximadamente 2.5 mm, con mayor preferencia no mayor que aproximadamente 2.0 mm, y muy especialmente no mayor que aproximadamente 1.7 mm para administrar la sustancia a la capa dérmica deseada. La colocación de la sustancia predominantemente en profundidades mayores y/o en la porción más baja de la dermis reticular se considera habitualmente como menos deseable. El medio de acceso dérmico utilizado para la administración ID de conformidad con la presente invención no es critico en la medida en que ofrece la profundidad de administración en la piel de un sujeto necesario para proporcionar la profundidad de administración blanco de la sustancia. En la mayoría de los casos, el dispositivo penetra en la piel a una profundidad de aproximadamente 0.5-2 mm. El medio de acceso dérmico puede comprender agujas para inyección convencional, catéteres, microcánulas o microagu as de todos tipos, empleados de manera individual o bien en conjuntos de agujas múltiples . Mediante la variación de la profundidad blanco de administración de sustancias por el dispositivo de acceso dérmico, el comportamiento del fármaco o sustancia puede ser adecuado a la aplicación clínica deseada más apropiada para una condición de paciente particular. La profundidad blanco de administración de sustancias por el dispositivo de acceso dérmico puede controlarse manualmente por parte del medico, o bien con o sin la asistencia de un indicador para indicar cuando se llega a la profundidad deseada. De preferencia, sin embargo, el dispositivo tiene un medio estructural para controlar la penetración en la piel a la profundidad deseada dentro del espacio intradérmico . Esto se logra más típicamente a través de un área ensanchada, o campana, asociada con el dispositivo de acceso dérmico que puede tomar la forma de una estructura de respaldo o plataforma a la cuál las agujas están fijadas. La longitud de las microagujas como medios de acceso dérmico son variadas fácilmente durante el proceso de fabricación y se producen de manera rutinaria. Las microagujas son también muy filosas y de un calibre muy pequeño con el objeto de reducir adicionalmente el dolor u otra sensación durante la inyección o infusión. Pueden utilizarse en la presente invención como microagujas de lumen simple individuales o bien microagujas múltiples pueden ser ensambladas o fabricadas en conjuntos lineales de un conjunto bidimensionales con el objeto de incrementar la velocidad o la administración de la cantidad de sustancia administrada en un período de tiempo dado. Las microagujas que tienen uno o varios puertos laterales están también incluidas como medio de acceso dérmico. Las microagujas pueden estar incorporadas en varios dispositivos tales como sujetadores y alojamientos que pueden servir también para limitar la profundidad de penetración. El medio de acceso dérmico de la presente invención puede también incorporar depósitos que contienen la sustancia antes de la administración o bombas u otros medios para administrar el fármaco u otra sustancia bajo presión. Alternativamente, el dispositivo que aloja el medio de acceso dérmico puede estar conectado externamente a tales componentes adicionales. El medio de acceso dérmico puede también incluir características de seguridad, ya sea pasivas o activas, para evitar o reducir una lesión accidental. En una modalidad de la invención, la inyección ID puede ser lograda de manera reproducible empleando una o varias microcánulas de calibre angosto insertadas perpendicularmente a la superficie de la piel. Este método de administración ("administración microdérmica" o bien "MDD") es más fácil de lograr que las inyecciones estándares de tipo Mantoux, y en virtud de su profundidad limitadas y controlada de penetración en la piel, es menos invasiva y menos dolorosa. Además, respuestas biológicas similares o mayores, de conformidad con lo medido aquí por expresión génica y respuesta inmune, pueden lograrse utilizando los dispositivos MDD en comparación con las agujas estándares. La profundidad óptima para la administración de la sustancia dada en una especie dada puede determinarse por parte de una persona con conocimientos en la materia sin experimentos exagerados. Los dispositivos de administración que colocan el dispositivo de acceso dérmico a una profundidad apropiada en el espacio intradérmico, controlar el volumen y velocidad de administración de fluido y proporcionan una administración precisa de la sustancia en la ubicación deseada sin fugas son los dispositivos preferidos. Metodología basada en microcánula y microaguj así como dispositivos para la aplicación de esta metodología se describen en los documentos EP 1 092 444 Al, y Solicitud Norteamericana No. de Serie 606,909, presentada el día 29 de Junio de 2000. Se puede utilizar también cánulas estándares de acero para administración intradérmica empleando dispositivos y métodos descritos en la Solicitud Norteamericana No. de Serie 417, 671, presentada el día 14 de Octubre de 1999, cuyos contenidos se incorporan expresamente aquí por referencia. Estos métodos y dispositivos incluyen la administración de sustancias a través de ""microcánulas" de calibre angosto (aproximadamente 30 G) con profundidad limitada de penetración, de conformidad con lo definido por la longitud total de la cánula o la longitud de la cánula expuesta más allá de una característica de limitación de profundidad. Estos métodos y dispositivos ofrecen la administración a sustancias a través de cánulas de calibre 30 o 31, sin embargo, la presente invención emplea también cánulas calibre 34G o "microcánulas" de calibre más pequeño, incluyendo, si se desea, profundidad limitada o controlada del dispositivo de penetración. Dentro del alcance de la presente invención se encuentra la administración enfocada de sustancias que puede lograrse ya sea a través de una microcánula individual o bien a través de un conjunto de microcánulas (o bien "microagujas"), por ejemplo, 3-6 microagujas montadas en un dispositivo para inyección que puede incluir o estar conectada a un depósito en el cuál la sustancia a administrar puede estar contenida. Utilizando los métodos de la presente invención, vacunas y agentes terapéuticos génicos pueden ser administrados en forma de un bolo, o bien a través de infusión. Se entiende que la administración de bolo puede efectuarse a través de un dispositivo de control de velocidad, por ejemplo, una bomba, o bien no tener un dispositivo de control de velocidad especifico, por ejemplo, autoinyeccion por parte del usuario. Mejor a través de la administración enfocada directa precisa de sustancias de sustancias al compartimiento de tejido dérmico incluyendo el tejido epidérmico. Esto se logra, por ejemplo, mediante la utilización de sistemas de microagujas de menos que aproximadamente 250 mieras de diámetro externo, y menos que 2 mm de longitud expuesta. Mediante la expresión "longitud expuesta" entendemos la longitud de la cánula hueca angosta o aguja disponible para penetrar en la piel del paciente. Tales sistemas pueden ser construidos utilizando métodos conocidos de varios materiales incluyendo acero, silicio, cerámica, y otros metales, plásticos, polímeros, azucares, materiales biológicos y/o biodegradables, y/o combinaciones de los mismos. Se ha encontrado que ciertas características de los métodos de administración intradérmica ofrecen los resultados más eficaces. Por ejemplo, se ha encontrado que la colocación de la salida de la aguja dentro de la piel afecta de manera significativa la respuesta clínica a la administración de una vacuna o agente de terapia génica. La salida de una aguja de calibre convencional o estándar con un corte de ángulo abiselado a 15 grados o menos tiene una "altura expuesta" relativamente grande. Como se emplea aquí, el término "altura expuesta" se refiere a la longitud de la abertura con relación al eje de la cánula que resulta del corte abiselado. Cuando se colocan agujas estándares a la profundidad deseada dentro del espacio intradérmico (aproximadamente 90 grados con relación a la piel), la altura expuesta grande de estas salidas de aguja provoca que la sustancia salga habitualmente de la piel debido a la contrapresión ejercida por la piel misma y a la acumulación de presión proveniente del fluido acumulado a partir de la inyección o infusión. Típicamente, la altura expuesta de la salida de aguja de la presente invención es de 0 a aproximadamente 1 mm. Una salida de aguja con una altura expuesta de 0 mm no tiene corte abiselado (o bien un ángulo de bisel de 90 grados) y se encuentra en la punta de la aguja. En este caso, la profundidad de la salida es igual a la profundidad de penetración de la aguja. Una salida de aguja formada por un corte abiselado o por una abertura a través del lado de la aguja tiene una altura expuesta medible. En una aguja que tiene un bisel, la altura expuesta de la salida de aguja es determinada por el diámetro de la aguja y el ángulo del corte abiselado primario (^ángulo de bisel") . En general, ángulos de bisel mayores que 20° se prefieren, con mayor preferencia ángulos de bisel entre 25° y 40°. Se entiende que una aguja simple puede tener más que una abertura o salida adecuada para la administración de sustancias al espacio dérmico. Asi, la altura expuesta y, en el caso de una cánula con una abertura a través de la parte lateral, su posición en el eje de la cánula contribuye a la profundidad y a la especificidad de administración de una sustancia. Factores adicionales individuales o en combinación con la cánula, por ejemplo, velocidad de administración volumen total de fluido administrado, contribuyen a la administración objetivo de sustancias y variación, la variación de tales parámetros para optimizar los resultados se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Se ha encontrado también que el control e la presión de inyección o infusión puede evitar la contra presión alta ejercida durante la administración ID. Mediante la colocación de una presión constante directamente sobre la interfaz de líquido, se puede lograr una velocidad de administración más constante, que puede optimizar la absorción y obtener una respuesta mejorada para la dosificación de vacuna o agente terapéutico administrado. La velocidad de administración y el volumen pueden también ser controlados para prevenir la formación de ronchas de en el sitio de administración y para prevenir que la contrapresión empuje el medio de acceso dérmico fuera de la piel. Las velocidades de administración y volúmenes apropiados para obtener tales efectos para una sustancia seleccionada pueden determinarse experimentalmente utilizando la capacidad de una persona con conocimientos ordinarios en la materia y sin experimentos exagerados. Incremento del espaciado entre varias agujas permite una distribución de fluido más amplia y velocidades incrementadas de administración o volúmenes de fluido mayores. En una modalidad, para administrar una sustancia, el dispositivo de acceso dérmico se coloca adyacente a la piel de un sujeto proporcionando un acceso directamente enfocado dentro del espacio intradérmico y la sustancia o las sustancias se administran o se suministran al espacio intradérmico en donde pueden actuar localmente o bien en donde pueden ser absorbidas por el torrente sanguíneo y distribuidas sistémicamente. En otra modalidad, el dispositivo de acceso dérmico se coloca sustancialmente perpendicularmente a la superficie cutánea con el objeto de ofrecer una inserción vertical de una o varias cánulas. El dispositivo de acceso dérmico puede estar conectado a un depósito que contiene la sustancia o las sustancias a suministrar. La forma de la sustancia o de las sustancias a suministrar o administrar incluye soluciones de las mismas en diluyentes o solventes farmacéu icamente aceptables, emulsiones, suspensiones, geles, partículas tales como micropartículas y nanopartículas ya sea suspendidas o dispersas, asi como vehículos de formación in situ. La administración a partir del depósito en el espacio intradérmico puede ocurrir ya sea pasivamente, sin aplicación de la presión externa, o bien de otro dispositivo impulsor a la sustancia o a las sustancias a suministrar, y/o activamente, con la aplicación de presión u otro dispositivo impulsor. Ejemplos de dispositivos generadores de presión preferidos incluyen bombas, jeringas, membranas elastoméricas, presión de gas, bombeo piezoeléctrico, electromotor, electromagnético, resortes helicoidales, o bien resortes Belleville o bien empaques o combinaciones de los mismos. En caso deseado, la velocidad de administración de la sustancia puede ser controlada de manera variable a través de un dispositivo generador de presión. Como resultado, la sustancia penetra en el espacio intradérmico y es absorbida en una cantidad y a una velocidad suficiente para producir un resultado clínicamente eficaz. Sustancias que pueden ser administradas de conformidad con los métodos de la presente invención incluyen vacunas, con o sin vehículos, adyuvantes y vehículos, incluyendo antígenos profilácticos y terapéuticos, que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, proteínas subunitarias, péptidos y polisacáridos, conjugados de polisacáridos, toxoides, vacunas basadas en aspectos genéticos, bacterias o virus atenuados vivos, bacterias o virus sometidos a mutación, bacterias o virus reordenados, bacterias o virus desactivados, célula enteras o componentes de las mismas (por ejemplo, células de mamífero) , vacunas celulares (por ejemplo, células dendríticas antologas) , o bien componentes de las mismas (por ejemplo, exosomas, dexosomas, fragmentos de membrana, o vesículas), virus vivos, bacterias vivas, vectores virales y bacterianos incluyendo, sin limitación, los derivados de adenovirus, retrovirus, alfavirus, flavivirus, y virus de vaccinia) con relación a la adicción (por ejemplo, adicción a la cocaína) , ántrax, artritis, cólera, difteria, dengue, tétanos, lupus, esclerosis múltiple, enfermedades parasíticas, psoriasis, enfermedad de Lyme, meningococo, sarampión, paperas, rubéola, varicela, fiebre amarilla, virus sincitial respiratorio, encefalitis japonesa portada por garrapatas, pneumococos, viruela, estreptococo, estafilococos, tifoide, influenza, hepatitis, incluyendo hepatitis A, B, C y E, otitis media, rabia, poliomielitis, VIH, parainfluenza, rotavirus, virus de Epstein Barr, CMV, clamidia, haemophilus no tipificable, haemophilus influenza B (HIB) , moraxella catarrhalis, virus de papiloma humana, tuberculosis incluyendo BCG, gonorrea, asma, aterosclerosis, malaria, E. coli, enfermedad de Alzheiiuer, H. Pylori, salmonera, diabetes, cáncer, herpes simples, papiloma humano, Yersinia pestis, enfermedades de viajeros, encefalitis de Nilo Occidental, Camplobacte , C. difficile. Composiciones ejemplares adecuadas para inmunización genética se describen, por ejemplo, en las patentes norteamericanas No. 5,589,466, 5,583,972 y 5,703,055. Sustancias particularmente preferidas que pueden ser administradas de conformidad con los métodos de la presente invención incluyen ácidos nucleicos, entidades derivadas de ácido nucleico asi como agentes terapéuticos génicos y similares utilizados en la prevención, diagnóstico, mitigación, tratamiento o cura de enfermedades. Adyuvantes adecuados para su inclusión en vacunas son conoci os por parte de los expertos en la materia. Agentes adicionales para incrementar la respuesta inmune que pueden utilizare en la presente invención son divulgados en la Solicitud Norteamericana No. 10/142,966, presentada el día 13 de Mayo del 2002, que se incorpora aquí por referencia. Agentes terapéuticos génicos particularmente preferidos incluyen los indicados para el tratamiento de cáncer, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, melanoma, linfoma de células T cutáneos, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células escamosas cutáneo y carcinoma de células básales, deficiencia en adenosina desaminasa, enfermedades cutáneas hiperproliferativas, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, psoriasis, enfermedades cutáneas genéticas incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, hiperqueratosis epidermolítica, epidermolisis bullosa, ictiosis lamelar así como ictiosis relacionada a X, hemofilia, fibrosis cistica, trastornos del crecimiento, deficiencias hormonales incluyendo, sin limitarse deficiencia en hormona de crecimiento de ser humano, aterosclerosis, deficiencia en cuanto a transferina, así como agentes terapéuticos génicos indicados para la curación de heridas y la regeneración de tejidos. Composiciones ejemplares adecuadas para agentes terapéuticos genéticos adecuados se describen, por ejemplo, en la patente norteamericana No. 5,547,932. La sustancia puede ser administrada en la piel en cualquier forma farm céuticamente aceptable. Vacunas a utilizar en los métodos de la presente invención pueden incluir adyuvantes y vehículos o portadores que son adecuados en formulaciones particulares, como es familiar a los con conocimientos en la materia . Formulaciones de péptidos y polipéptidos farmacéuticamente aceptables para su uso en el presente invención, incluyen formulaciones para composiciones alergénicas, como se conoce en la técnica. Ácidos nucleicos para su uso en los métodos de la presente invención pueden ser ARN o ADN, o bien una combinación de los mismos. Pueden estar en cualquier forma física adecuada para administración ID y para absorción y expresión por células. El ADN y/o ARN puede estar contenido en vectores virales o liposoma, o bien pueden ser administrados como polinucleótido libre, por ejemplo, plásmido, como se sabe en la técnica. El ácido nucleico será formulado típicamente en una formulación farmacéuticamente aceptable, por ejemplo fluido, gel, o suspensión compatible con el ácido nucleico. Típicamente, para administrar vacuna u otro fármaco, un medico debe remover el volumen apropiado de un frasco sellado con un septo utilizando una jeringa. La misma jeringa es después utilizada para administrar la vacuna al paciente. Sin embargo, una microaguja o microcánula, típicamente entre 0.1 y 2 mm de longitud, además de ser relativamente inadecuada en cuanto a longitud para penetrar totalmente en el septo, es generalmente demasiado frágil para perforar un septo de un frasco para extraer un fármaco mientras mantiene un filo adecuado y un carácter derecho suficiente para ser utilizado subsecuentemente en un paciente. El uso de tales microdispositivos para perforar un septo puede también resultar en el taponamiento del orifico de la aguja. Además, el calibre angosto, típicamente calibre 31 a 50, de la microcánula reduce en gran medida la capacidad volumétrica que puede atravesar la aguja e la jeringa, por ejemplo. Esto seria inconveniente para la mayoría de los médicos que están acostumbrados a una transferencia rápida de líquidos desde frascos utilizando dispositivos convencionales y por consiguiente incrementaría de manera importante la cantidad de tiempo que el médico debe invertir con el paciente. Factores adicionales a considerar en el uso generalizado de microdispositivos incluyendo la necesidad de reformular la mayoría de los fármacos y vacunas para dar cavidad al volumen total reducido (10-100 ul) utilizado o administrado por microdispositivos. Por consiguiente, sería deseable proporcionar un kit que incluya el dispositivo ya sea en combinación con la sustancia a suministrar o bien adaptado para integrar la sustancia a administrar. Kits y similares que comprenden el instrumento de administración y la composición terapéutica son bien conocidos en la técnica. Sin embargo, la aplicación de microdispositivos ID mínimamente invasivos para la administración de fármacos y vacunas presenta claramente una necesidad inmediata de acoplamiento del dispositivo con la formulación para proporcionar un medio seguro, eficaz, y consistente para administrar formulaciones para permitir respuestas inmunogenicas y terapéuticas. El kit proporcionado por la presente invención comprende un dispositivo de administración que tiene por lo menos una microaguja hueca diseñada para administrar intradérmicamente una sustancia a una profundidad entre .025 y 2 rom adaptada de tal manera que la microaguja esté o pueda estar en conexión fluida con un depósito adaptado para contener una dosificación de una vacuna o terapia génica. En una modalidad preferida, el kit contiene también una dosificación efectiva de una vacuna o terapia génica, opcionalmente contenida en un depósito que forma parte integral del dispositivo de administración o bien que puede conectarse funcionalmente con dicho dispositivo de administración. La microaguja hueca tiene de preferencia un calibre 31 a 50, y puede ser parte de un conjunto de 3-6 microagujas, por ejemplo. En una modalidad particularmente preferible, el kit de la presente invención comprende una porción de campana que puede estar conectada al depósito previamente llenado de almacenamiento de vacuna; por lo menos una microaguja soportada por dicha porción de campana que tiene una punta delantera que se extiende alejándose de dicha porción de campana; y una porción de limitador que rodea dicha (s) microaguja (s) y se extiende alejándose de dicha porción de campana hacia dicha punta delantera de dich (s) microaguja (s) , dicho limitador incluye una superficie de enganchamiento con la piel generalmente plano que se extiende en un plano generalmente perpendicular a un eje de dicha (s) microaguja (s) y adaptado para ser recibido contra la piel de un mamífero para administrar una inyección intradérmica de la vacuna, dicha (s) punta (s) delanter (s) de microaguja (s) se extiende (s) más allá de dicha superficie de enganchamiento con la piel sobre una distancia de aproximadamente 0.5 mm a 2.0 mm en donde dicha porción de limitador limita la penetración de la(s) microagu a (s) en la capa dérmica de la piel del mamífero. Para utilizar un kit de conformidad con lo contemplado por la presente invención, el médico debe romper un sello térmico para proporcionar acceso al microdispositivo y, opcionalmente la vacuna o composición inmunogénica o terapéutica. La composición puede ser previamente cargada dentro del microdispositivo en cualquier forma incluyendo pero sin limitación, gel, pasta, aceite, emulsión, partícula, nanopartícula, micropartícula, suspensión o líquido. La composición puede estar empacada separadamente dentro del paquete de kit, por ejemplo, en un depósito, frasco, tubo, blister, bolsa o similar. Uno o varios constituyentes de la formulación puede estar liofilizado, secado y congelado, secado y congelado por rociado, o en cualquier otra forma reconstituible. Varios medios de reconstitución, agentes de limpieza o desinfectantes, o bien esterilizantes tópicos (torundas de alcohol, yodo) pueden proporcionarse adicionalmente en un caso deseado. El médico carga entonces o integra la sustancia en caso necesario en el dispositivo y después administra la formulación al paciente utilizando el microdispositivo para inyección ID. Habiendo descrito la invención en términos generales, los siguientes ejemplos específicos pero no limitativos así como referencias a las figuras adjuntas presentan varios ejemplos para la práctica de la presente invención. Un ejemplo representativo de un microdispositivo de acceso dérmico (dispositivo MDD) que comprende una aguja individual fue preparada a partir de acero calibre 34 (MicroGroup, Inc., Medway, MA) y con un ángulo de bisel de 28° fue esmerilado utilizando una rueda de esmeril de carborundo de 800 arenillas. Las agujas fueron limpiadas por sonicación secuencial en acetona y agua destilada, y se revisó el flujo con agua destilada. Las microaguj as fueron fijadas sobre tubo de catéter de calibre pequeño (Maersk Medical) utilizando resina epóxica curada con UV. La longitud de la aguja fue ajustada utilizando una placa de indexación mecánica con la campana del tubo de catéter actuando como control de limitación de la profundidad y se confirmó mediante microscopía óptica. El segmento de aguja expuesto fue ajustado a 1 mm utilizando una placa de indexación. La conexión para jeringa fue a través de un adaptador Luer integral en la entrada de catéter. Durante la inyección, agujas fueron insertadas perpendicularmente a la superficie de la piel y fueron mantenidas en su lugar a través de una presión manual suave para administración de bolos. Los dispositivos fueron revisados para determinar su funcionamiento y flujo de fluido inmediatamente antes de la inyección e inmediatamente después de la inyección. Un dispositivo de aguja intradérmica de calibre 30-31 con un segmento expuesto de 1.5 mm controlado por una campana de limitación de profundidad de conformidad con lo descrito en el documento EP 1 092 444 Al fue también utilizado en algunos ejemplos. Ejemplo 1. Administración ID y expresión de agentes terapéuticos/profilácticos genéticos de modelo, modelo de conejillo de la india. La absorción y expresión de ADN por células in vivo son criticas para una terapia génica efectiva y para una inmunización genética eficaz. Un ADN de plásmido que codifica el gen reportero, luciferasa de luciérnaga fue utilizado como agente terapéutico de gen modelo (Aldevron, Fargo, ND) . EL ADN fue administrado a conejillos de la india Hartley (Charles River, Raleigh, NC) de manera intradérmica (ID) a través de la técnica de Mantoux (ID-Mantoux) utilizando una aguja estándar 30G o bien fue administrado a ID a través de MDD (ID-MDD) utilizando una microcánula de acero calibre 34G de 1 mm de longitud (dispositivo MDD) insertada aproximadamente de manera perpendicular. El ADN de plásmido fue aplicado típicamente sobre la piel afeitada como control negativo (el tamaño del plásmido es excesivamente grande para permitir una absorción pasiva en la piel) . La dosis total fue de 100 µg por animal en un volumen total de 40 µ? de PBS administrado en forma de una inyección de bolo rápida (menos que 1 min) utilizando una jeringa de 1 ce. Biopsias cutáneas de espesor completa de los sitios de administración fueron recogidas 24 horas después de la administración, fueron homogeneizadas y procesadas adicionalmente para determinar la actividad luciferasa utilizando un ensayo comercial (Promega, Madison, WI) . La actividad luciferasa fue normalizada para el contenido total de proteína en las muestras de tejido de conformidad con lo determinado por ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL) y se expresa como Unidades de Luz Relativas (RLU) por mg de proteína total (n = 3 animales por grupo para Mantoux y control negativo y n = 6 para dispositivo MDD) . Los resultados (figura 1) demuestran una expresión luciferasa fuerte en ambos grupos de inyección ID. La actividad luciferasa media en los grupos MDD y Mantoux fue 240 y 220 veces arriba de los controles negativos, respectivamente. Los niveles de expresión de luciferasa en controles tópicos no fueron significativamente mayores que en sitios cutáneos no tratados (datos o ilustrados) . Estos resultados demuestran que el método de la presente invención utilizando dispositivos MDD es por lo menos tan eficaz que la técnica de Mantoux para administrar materiales genéticos al tejido ID y resultan en niveles significativos de expresión génica localizada por células cutáneas in vivo. Ejemplo 2: Administración ID y expresión de agentes terapéuticos/profilácticos genéticos de modelo, modelo de rata . Experimentos similares (sin control de Mantoux) a los descritos en el Ejemplo 12 arriba fueron efectuados en ratas Brown-Norway (Charles River, Raleigh, NC) para evaluar la utilidad de esta plataforma entres especies múltiples. El mismo protocolo se utilizó como en el Ejemplo 1, excepto que la carga de ADN de plásmido total fue reducida a 50 g en volumen de 50 µ? de ??? . Además, un ADN de plásmido no relacionado (que codifica ß-galactosidasa) inyectado ID (utilizando el dispositivo de MDD) fue utilizado como control negativo. (n = 4) animales por grupo) . La actividad luciferasa en la piel fue determinada de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1 arriba. Los resultados, mostrados en la Figura 2, demuestran una expresión génica signi icativa después de administración ID a través del dispositivo de MDD. La actividad luciferasa en sitios cutáneos recuperados fue más que 3000 mayor que en controles negativos. Estos resultados demuestran adicionalmente la utilidad del método de la presente invención para administrar entidades basadas en gen in vivo, lo que resulta en altos niveles de expresión génica por células cutáneas. Ejemplo 3: Administración de ID y expresión de agentes terapéuticos/profilácticos genéticos de modelo, modelo de cerdo. El cerdo ha sido reconocido desde hace mucho tiempo como el modelo de animal preferido para estudios de administración cutánea. La piel del cerdo es más similar a la piel humana en cuanto a espesor total y densidad de folículos pilares que la piel de los roedores. Así, el modelo de cerdo (Yorkshire swine: Archer Farras, Belcamp, MD) fue utilizado como medio para predecir la utilidad de este sistema en seres humanos. Experimentos fueron realizados como arriba en los Ejemplos 1 y 2, excepto que se utilizó un sistema de gen reportero diferente, ß-galactosidasa (Aldevron, Fargo, ND) . La dosis de administración total fue 50 µg en un volumen de 50 µ? . El ADN fue inyectado empleando los métodos siguientes: I) a través del método Mantoux utilizando una aguja y jeringa 30G, ii) por administración ID a través de inserción perpendicular en la piel utilizando una aguja 30/31G equipada con una característica para limitar la penetración de la aguja a una profundidad de 1.5 mm, e iii) por administración ID a través de inserción perpendicular en la piel utilizando una aguja 34G equipada con una característica para limitar la penetración de la aguja a una profundidad de 1.0 mm (dispositivo MDD) . El grupo de control negativo consistió de administración ID por i-iii de un ADN de plásmido no relacionado que codifica luciferasa de luciérnaga, (n = 11 sitios cutáneos de 4 cerdos para el grupo ID Mantoux; n = 11 sitios cutáneos de 4 cerdos para ID, 30/31G, dispositivo de 1.5 mm; n = 10 sitios cutáneos de 4 cerdos para ID, dispositivo 1 mm para 34G; n = 19 sitios cutáneos de 4 cerdos para control negativo) . Para el control negativo, datos de los 3 métodos de administración de ID fueron combinados puesto que los 3 métodos generaron resultados comparables.
La actividad de gen reportero en tejido fue determinada esencialmente de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1 excepto que se sustituyó el ensayo de detección de ß-galactosidasa (Applied Biosystems, Foster City, CA) en lugar del ensayo de luciferasa. Los resultados, mostrados en la Figura 3, indican una expresión de gen reportero fuerte en la piel de los 3 tipos de administración ID. Respuestas en el grupo ID-Mantoux fueron 100 veces arriba del nivel de fondo, en comparación con un incremento de 300 veces arriba del nivel de fondo en el grupo ID, 34G, 1 mm (MDD) y un incremento de 20 veces arriba del nivel de fondo en el grupo ID, 30G, 1.5 mm (30 g, 1.5 mm) . La expresión total de gen reportero por células cutáneas, de conformidad con lo medido por la actividad media de gen reportero recuperada a partir de biopsias de tejido de piel removida fue más fuerte en el grupo ID, 34G, 1 mm (MDD) en 563,523 RLU/mg en comparación con 200,788 RLU/mg en el grupo ID, 30G Mantoux, 42,470 RLU/mg en el grupo ID (30G, 1.5 mm) y 1,869 RLU/mg en los controles negativos. Asi, la administración ID a través de inserción perpendicular de una aguja 34G, 1.0 mm (MDD) resulta en una absorción superior y una mayor expresión de ADN por células cutáneas en comparación con la inyección estándar de tipo Mantoux o una inserción de aguja perpendicular similar y administración similar utilizando una aguja más larga (1.5 mm) , de diámetro mayor (30G) . Estudios similares utilizando estos 3 dispositivos y métodos para administrar colorantes visibles demuestran también que la aguja 34G, 1.0 mm resulta en una administración más consistente al tejido ID que las demás 2 agujas/métodos y resulta en un menor "derrame" de la dosis administrada en el tejido subcutáneo (SC) . Estas diferencias fueron inesperadas puesto que los 3 dispositivos y métodos se enfocan teóricamente al mismo espacio tisular. Sin embargo, es mucho más difícil controlar la profundidad de administración utilizando una técnica de inserción lateral (Mantoux) en comparación con una técnica de inserción sustancialmente perpendicular que se logra mediante el control de la longitud de la cánula a través de la campana de limitación de profundidad. Además, la profundidad de la inserción de aguja y altura expuesta de la salida de aguja son características importantes asociadas con una administración ID reproducible sin ?"derrame" o fuga SC en la superficie de la piel. Estos resultados demuestran adicionalmente la utilidad de los métodos de la presente invención en la administración de entidades basadas en genes en mamíferos más grandes in vivo, lo que resulta en niveles altos de expresión génica por células cutáneas. Además, las similaridades en cuanto a composición cutánea entre cerdos y seres humanos indican que mejoras clínicas comparables pueden ser obtenidas en seres humanos . Ejemplo 4: Medición indirecta del daño tisular localizado después de administración ID Los resultados presentados en el Ejemplo 3 arriba sugieren que pueden existir mejoras inesperadas en cuanto a eficacia a través de la administración ID basada en MDD en comparación con lo obtenido por inyecciones basadas en Mantoux utilizando agujas estándares. Además, las cánulas MDD trastornan mecánicamente un área total menor de tejido puesto que se insertan a una profundidad reducida en comparación con las agujas estándares que no son "serpenteadas" lateralmente a través del tejido ID como en el caso de las inyecciones de tipo antoux. Este daño tisular e inflamación provocan la liberación de varias proteínas inflamatorias, quimiocinas, citocinas y otros mediadores de la inflamación. Así, el contenido total de proteína en los sitios cutáneos recuperados puede emplearse como una medición indirecta del daño tisular y de la inflamación localizada inducida por los dos métodos de administración. Los niveles totales de proteína fueron medidos en biopsias de piel recuperada de muestras de cerdo presentadas en el Ejemplo 3 arriba (excluyendo 30 g, 1.5 ram) utilizando un ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL) . Ambos métodos de administración indujeron un incremento del contenido total de proteína en comparación con la piel no tratada, como se muestra en la Figura . Sin embargo, los niveles totales de proteína en biopsias de piel recuperada del grupo ID Mantoux fueron significativamente mayores (p = 0.01 por prueba t) que los niveles correspondientes en el grupo MDD (2.4 mg/ml vs . 1.5 mg/ml) . Estos resultados proporcionan evidencia indirecta que sugiere fuertemente que la administración por los métodos de la presente invención induce un menor daño mecánico al tejido que el daño correspondiente inducido por la inyección ID tipo Mantoux . Ejemplo 5: Inducción de respuesta inmune a la vacuna de ADN de influenza después de administración ID en rata Los ejemplos presentados arriba demuestran que una microcánula de calibre angosto puede ser utilizada para administrar efectivamente compuestos basados en ácido nucleico de modelo en la piel que resultan en niveles altos de expresión génica por las células cutáneas. Para investigar la utilidad de la administración de vacunas de ADN por los métodos de la presente invención, ratas fueron inmunizadas con ADN de plásmido que codifica la hemaglutinina del virus de influenza (HA) a partir de la cepa A/PR/8/34 (plásmido proporcionado por el Dr. Harriet Robinson, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA) . Ratas Brown-Norway (n = 3 por grupo) fueron inmunizadas tres veces (días 0, 21 y 42) con ADN de plásmido en solución de PBS (50 pg por rata en volumen de 50 µ? administrado por inyección de bolo rápido) ID utilizando el dispositivo MDD descrito en el Ejemplo 2 o IM en los cuadríceps utilizando una aguja 30G convencional y una jeringa de 1 ce. Como control negativo, se aplicó ADN tópicamente a la piel no tratada. Sueros fueron recogidos en las semanas 3, 5, 8 y 11 y analizados para determinar la presencia de anticuerpos específicos para influenza por ELISA. En resumen, pozos de microtitulación (Nalge Nunc, Rochester, NY) fueron revestidos por 0.1 ug de virus de influenza desactivado entero (A/PR/8/34; Charles River SPAFAS, North Franklin, CT) durante la noche a temperatura de 4°C. Después de bloqueo durante 1 hora a 37 °C PBS más leche descremada al 5%, las placas fueron incubadas con diluciones en serie de suero de prueba durante 1 hora a 37 °C. Las placas fueron después lavadas e incubadas adicionalmente con IgG anti-rata conjugada con peroxidasa de rábano agrio, cadena H +L (Southern Biotech, Birmingham, AL) durante 30 minutos a 37 °C y después reveladas utilizando sustrato TMB (Sigma, St. Louis, MO) . Mediciones de absorbencia (A450) fueron leídas en un lector de plata Tecan Sunrise™ (Tecan, RTP, NC) . Los resultados (Figura 5) demuestran que la administración por el método de la presente invención de una vacuna contra influenza genética en ausencia de adyuvante agregado induce una respuesta de anticuerpo en el suero específica para influencia potente. La magnitud de esta respuesta fue comparable a la respuesta inducida por inyección IM en todos los puntos temporales medidos. No se observaron respuestas detectables en los controles tópicos. Así, la administración de vacuna genética por el método de la presente invención induce respuestas inmunes que son por lo menos igualmente fuertes que las inducidas por la vía convencional de inyección IM. Para investigar adicionalmente la administración por el método de la presente invención de vacunas genéticas con adyuvantes, el ADN de plásmido codificado, HA de influenza descrito arriba fue preparado utilizando el sistema de adyuvante MPL + TDM Ribi (RIBI ImitiunoChemicals, Hamilton, MT) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Ratas (n = 3 por grupo) fueron inmunizadas y analizadas para anticuerpo sérico especifico para influenza de conformidad con lo descrito arriba. Títulos en el grupo de administración ID fueron comparables a IM después de la primera y segunda inmunizaciones (semana 3-5; Figura 6). Después de la tercera dosis, sin embargo, los títulos inducidos con ID fueron significativamente mayores (p = 0.03 por prueba t) que los títulos correspondientes inducidos por inyección IM (Figura 6) . Para la semana 11, el título inducido por ID medio fue 42,000 en comparación con solamente 4,600 obtenido por inyección IM. Los controles tópicos no generaron una respuesta específica para la influenza. Así, la administración por el método de la presente invención de vacunas genéticas en presencia del adyuvante induce respuestas inmunes que son más fuertes que las respuestas inducidas por la vía convencional de inyección IM. Ejemplo 6: Inducción de respuesta inmune al "cebado-refuerzo" de ADN/virus de influenza después de administración ID en ratas Un enfoque de vacuna recientemente desarrollado para numerosas enfermedades, incluyendo VIH, es lo que se conoce como el enfoque de "cebado-refuerzo" en donde en la inmunización de "cebado" inicial y en los "refuerzos" secundarios se emplean diferentes clases de vacunas (Immunology Today, Apr 21(4); 163-165, 2000). Por ejemplo se puede cebar con una versión de ADN de plásmido de la vacuna seguido por un refuerzo subsecuente con una proteina sub-unitaria, virus desactivado o bien preparación de ADN en vector. Para investigar la administración por el método de la presente invención de los estos tipos de métodos de vacunación, el primer experimento del Ejemplo 5 fue proseguido durante 6 semanas adicionales. Para la semana 11, ratas cebadas con ADN fueron reforzadas con virus de influenza desactivado entero (A/PR/34, 100 ug en volumen de 50 µ? de PBS por inyección de bolos rápidos) . El virus fue obtenido de Charles River SPAFAS, North Franklin, CT. Títulos de anticuerpos séricos específicos para influenza fueron medidos las semanas 13 y 17 por ELISA de conformidad con lo descrito arriba. Tanto la administración ID como la inyección IM indujeron un efecto de refuerzo potente (Figura 7) . Los títulos específicos para influenza medios para la semana 17 fueron equivalentes (título = 540,000) por ambos métodos de administración y fueron significativamente mayores que los títulos muy débiles observados después de administración tópica no auxiliada (título = 3200) . Así, la administración por los métodos de la presente invención es adecuada para regímenes de inmunización de "cebado-refuerzo", induciendo respuestas inmunes que son por lo menos tan fuertes como las inducidas por la vía convencional de inyección IM. Para evaluar el efecto de adyuvante sobre la respuesta de "cebado-refuerzo", el segundo experimento descrito en el Ejemplo 5 prosiguió durante 6 semanas adicionales. Para la semana 11, ratas cebadas con ADN fueron reforzadas con virus de influenza desactivado entero (A/PR/8/34, 100 pg en un volumen de 50 µ? por inyección rápida de bolos como arriba) . Los títulos de anticuerpos séricos específicos para influenza fueron medidos las semanas 3 y 17 por ELISA de conformidad con lo descrito arriba. Tanto la administración ID como la inyección IM indujeron un efecto de refuerzo potente (Figura 8) . Los títulos medios en el grupo de administración ID fueron mayores que a través de inyección IM después del refuerzo de virus; para la semana 13, el título medio de ID-MDD (MDD) fue 540,000 en comparación con 240,000 por inyección IM y 3,200 por aplicación tópica no auxiliada. Así, la administración por el método de la presente invención es adecuada para regímenes de administración de ""cebado-refuerzo" que incorporan adyuvantes, incluyendo respuestas inmunes que son más fuertes que las respuestas inducidas por al vía convencional de inyección IM. Ejemplo 7: Inducción de respuesta inmune a la vacuna de virus de influenza después de administración ID en ratas Para investigar la utilidad de la administración de vacunas convencionales por el método de la presente invención, ratas fueron inmunizadas con una preparación de virus de influenza desactivado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 6 a través de administración ID o bien inyección intramuscular (IM) con una aguja y jeringa estándares. Como control negativo, se aplicó una solución de vacuna tópicamente sobre la piel no tratada; el peso molecular grande del virus de influenza desactivado impide una inmunización efectiva a través de absorción tópica pasiva. Como arriba, la dosis de vacuna fue de 100 µg de proteina total en un volumen de 50 µ? por animal, administrada por inyección rápida de bolo (menos que 1 minuto) . Ratas fueron inmunizadas tres veces (los días 0, 21, y 42) ; el suero fue recogido y analizado para determinar la presencia de anticuerpos específicos para influenza por ELISA como arriba los días 21, 35 y 56; n=4 ratas por grupo. Los resultados mostrados en la figura 9 indican que la administración ID induce unas respuestas inmunes específicas para antígeno potentes. Niveles similares de anticuerpo fueron inducidos por las dos vías de inyección, IM e ID. Los títulos medios geométricos picos fueron relativamente más altos en el grupo ID-MDD (MDD) ; 147,200 en comparación con 102,400 por inyección IM. La aplicación tópica de la vacuna estimuló solamente respuestas muy débiles (título medio pico = 500) . Así, la administración ID de vacunas convencionales en dosis elevadas induce a respuestas inmunes que son por lo menos igualmente fuertes que las repuestas inducidas por la vía convencional de inyección I . Ejemplo 8: Inducción de respuesta inmune a la vacuna de la influenza después de administración ID en cerdos Como se observó arriba, el cerdo representa un modelo de piel atractivo que se parece estrechamente a la piel humana. Para probar dispositivos de administración ID en administración de vacunas, cerdos Yorkshire fueron inmunizados con una vacuna de influenza desactivada como arriba, en comparación con la administración ID con inyección IM. Cerdos fueron inmunizados los días 0, 21 y 49; el suero fue recogido y analizado para anticuerpos específicos para influenza por ELISA, como arriba, los dias 14, 36, 49 y 60. Anticuerpos secundarios específicos para cerdos fueron obtenidos de Bethyl Laboratorios, Montgomery, TX. Los resultados (figura 10) indican que la administración ID induce respuestas inmunes específicas para antígeno potentes. Niveles similares de anticuerpo fueron inducidos por las vías de inyección, IM e ID. Títulos medios geométricos picos fueron ligeramente más altos en el grupo MDD; 1,333 en comparación con 667 a través de inyección IM. Así, la administración ID de vacunas convencionales en dosis altas induce repuestas inmunes que son por lo menos igualmente fuertes que las repuestas inmunes inducidas por la vía convencional de inyección IM.
Ejemplo 9: Administración ID de dosis más bajas de vacuna contra la influenza En el ejemplo 7, ratas fueron inmunizadas con 100 µg de virus de influenza desactivado a través de inyección ID, o IM utilizando una aguja y una jeringa convencionales. Este nivel de dosis, ambos métodos de administración indujeron niveles similares de anticuerpos séricos, aún cuando en el último punto temporal, el titulo inducido por ID fue ligeramente más alto que el titulo inducido por IM. Para estudiar adicionalmente la relación entre método de administración y nivel de dosificación, ratas fueron inmunizadas con dosis reducidas de virus de influenza desactivado, dentro de un rango de 1 µg a 0.01 µg por animal, utilizando las vías de administración ID e IM como arriba. Ratas recibieron 3 inmunizaciones (días 0, 21 y 42) y fueron analizadas para determinar la presencia de anticuerpos antiinfluenza en el suero los días 21, 35 y 56 (n=4 ratas por grupo) . Los datos mostrados en la figura 11 reflejan los títulos el día 56, aún cuando tendencias similares fueron observadas el día 21 y el día 35. La administración ID (MDD) resultó en una respuesta de anticuerpos significativa que no fue significativamente diferente en cuando a magnitud en las tres dosis probadas; es decir, la administración es de 0.01 µg (10 ng) indujo títulos comparables a los títulos observados empleando 100 veces más de vacuna (1 µg) . En contraste, una reducción significativa en cuanto a titulo se observó cuando la dosis IM fue reducida de 1 µg a 0.1 µg y otra vez cuando la dosis fue reducida adicionalmente a 0.01 µg. Además, se observó una variación considerablemente menor en cuando a los títulos inducidos por administración ID en comparación con IM. Notablemente, no se observó ninguna reacción colateral visible (efectos cutáneos adversos) en los sitios de administración ID. Estos resultados indican fuertemente que la administración ID por el método de la presente invención permite una reducción significativa (por lo menos 100 veces) de la dosis de vacuna en comparación con una inyección IM. Respuestas inmunes significativas fueron observadas empleando cantidades del orden de nanogramo de vacuna. Beneficios similares podrían esperarse en entornos clínicos. Los resultados descritos aquí demuestran que la inyección ID de vacuna y material genético puede efectuarse de manera reproducible a través de los métodos de la presente invención. Este método de administración es más fácil de lograr que las inyecciones estándares de tipo Mantoux o bien IM y, en una modalidad, en virtud de su profundidad de penetración limitada y controlada en la piel, es menos invasivo y menos doloroso. Además, este método ofrece una administración ID más reproducible que a través de inyecciones de tipo Mantoux utilizando agujas convencionales que resultan en un enfoque mejorado de las células cutáneas con beneficios resultantes de conformidad con lo descrito arriba . Además, el método es compatible con una vacuna viral desactivada entera y con plásmidos de ADN sin reducción asociada en cuanto a potencia biológica como ocurriría si las partículas virales o el ADN de plásmido fuesen cortadas o degradadas al pasar a través de la microcánula a presiones relativamente altas asociadas con la administración ID in vivo. Los resultados detallados a uí demuestran que respuestas inmunes más fuertes son inducidas a través de administración ID, especialmente en dosis de vacuna reducidos, permitiendo así potencialmente reducciones significativas de dosis y vacunas de combinación en seres humanos. Los resultados presentados arriba muestran una inmunización mejorada con administración ID empleando dispositivos tales como los descritos arriba en comparación con la inyección intramuscular estándar (IM) que emplea aguja y jeringa convencionales. El estudio de reducción de dosis (ejemplo 9) muestra que la administración ID induce a respuestas de anticuerpos séricos a una vacuna contra la influenza en ratas empleando por lo menos 100 veces menos vacuna que lo requerido a través de inyección IM. Si es aplicable en un entorno clínico, dicha reducción de dosis reduciría o eliminaría el problema de le escasez de vacuna contra la influenza común en el mundo entero. Además, tales capacidades de reducción de dosis pueden permitir la administración de un número mucho mayor de antígenos de vacuna en una sola dosis, permitiendo así vacunas de combinación. Este enfoque es de relevancia particular para las vacunas de VIH en donde es probable que sea necesario inmunizar simultáneamente con numerosas variantes genéticas/sub-cepas con el objeto de inducir una inmunidad protectora. Beneficios similares se esperan de otros tipos de vacunas profilácticas y terapéuticas, inmunoterapia y entidades basadas en células en virtud del enfoque mejorado del sistema inmune utilizando los métodos y dispositivos de la presente invención. En otra modalidad, dentro del alcance de la presente invención se encuentra la combinación de la administración ID de la presente invención con métodos convencionales de administración, por ejemplo, vía IP, IM, intranasal u otra vía mucosal, o bien inyección SQ, métodos tópicos o de abrasión cutánea para proporcionar una mejora de la respuesta inmunológica o terapéutica. Esto incluiría por ejemplo vacunas y/o terapias de la misma clase o de clases diferentes, y administración simultánea o secuencial. Todas las referencias citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia. El comentario en las referencias aquí se contempla simplemente para resumir las aserciones efectuadas por sus autores y no se hace ninguna admisión que una referencia constituya una técnica anterior relevante para el proceso de otorgamiento de patente. Los solicitantes se reservan el derecho de retar la precisión y pertinencia de las referencias citadas. Las modalidades ilustradas y comentadas en la presente especificación tienen el propósito solamente de enseñar a las personas con conocimientos en la materia la mejor forma conocida por los inventores para efectuar y utilizar la invención y no deben considerarse como limitativas del alcance de la presente invención. Las modalidades ejemplificadas de la presente invención pueden ser modificadas o variadas, y se pueden agregar elementos u omitir elementos sin salirse de la invención, como lo observarán las personas con experiencia en la materia tomando en cuenta las enseñanzas anteriores. Se entiende por consiguiente que, dentro del alcance de las reivindicaciones y sus equivalentes, la invención puede practicarse de manera diferente a lo específicamente descrito aquí.