UA128182C2 - Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань - Google Patents

Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань Download PDF

Info

Publication number
UA128182C2
UA128182C2 UAA201805270A UAA201805270A UA128182C2 UA 128182 C2 UA128182 C2 UA 128182C2 UA A201805270 A UAA201805270 A UA A201805270A UA A201805270 A UAA201805270 A UA A201805270A UA 128182 C2 UA128182 C2 UA 128182C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cancer
list
cells
cell
amino acid
Prior art date
Application number
UAA201805270A
Other languages
English (en)
Inventor
Уґур Сахін
Езлем Тюречі
Крістіане Штадлер
Юлія Холанд
Хаят Бер-Махмуд
Тім Байсерт
Лаура ПЛЮМ
Гол Фабріс Ле
Арне Єндрецкі
Маркус Фідлер
Original Assignee
Біонтех Аґ
Астеллас Фарма Інк.
ТРОН-ТРАНСЛАЦІОНАЛЕ ОНКОЛОҐІ АН ДЕР УНІВЕРЗІТЕТСМЕДІЦІН ДЕР ЙОХАННЕС ҐУТЕНБЕРҐ-УНІВЕРЗІТЕТ МАЙНЦ ҐЕМАЙННЮТЦІҐЕ ҐмбХ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2012/004712 external-priority patent/WO2014075697A1/en
Application filed by Біонтех Аґ, Астеллас Фарма Інк., ТРОН-ТРАНСЛАЦІОНАЛЕ ОНКОЛОҐІ АН ДЕР УНІВЕРЗІТЕТСМЕДІЦІН ДЕР ЙОХАННЕС ҐУТЕНБЕРҐ-УНІВЕРЗІТЕТ МАЙНЦ ҐЕМАЙННЮТЦІҐЕ ҐмбХ filed Critical Біонтех Аґ
Publication of UA128182C2 publication Critical patent/UA128182C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

Винахід стосується з’єднувальних агентів, які містять з’єднувальний домен, який є специфічним відносно CD3, що забезпечує можливість зв'язування з Т-клітинами, і зв'язуючий домен, який є специфічним відносно пухлиноасоційованої молекули клаудина, а також способи застосування цих з’єднувальних агентів або нуклеїнових кислот для них для лікування раку. 7

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується з'єднувальних агентів, які містять з'єднувальний домен, який є специфічним відносно СОЗ, що забезпечує можливість зв'язування з Т-клітинами, і зв'язуючий домен, який є специфічним відносно пухлиноасоційованої молекули клаудина, а також способи застосування цих з'єднувальних агентів або нуклеїнових кислот для них для лікування раку.
Клаудини є інтегральними мембранними білками, локалізованими в щільних контактах епітелію й ендотелію. Передбачається, що клаудини містять чотири трансмембранні сегменти із двома позаклітинними петлями, і М- і С-кінці, розташовані в цитоплазмі. Клаудин (СІ ОМ), сімейство трансмембранних білків, відіграє важливу роль у підтримці епітеліальних і ендотеліальних щільних контактів, а також може брати участь у підтримці цитоскелету й у клітинній сигналізації.
Молекула клаудина 18 (СІ ОМ18) є інтегральним трансмембранним білком (тетраспанін), який має у своєму складі чотири трансмембранні гідрофобні області й дві позаклітинні петлі (петлю 1, розташовану між гідрофобною областю 1 і гідрофобною областю 2; петлю 2, розташовану між гідрофобними областями З і 4). СІ ОМ18 існує у двох різних сплайс-варіантах, які описані в мишей і в людини (Мійті, Мої. СеїІ. ВіоїЇ. 21:7380-90, 2001). Сплайс-варіанти (номер доступу в сСепрапК: сплайс-варіант 1 (СІ 0ОМ18.1): МР 057453, ММ 016369, і сплайс-варіант 2 (СГОМ18.2): ММ 001002026, МР 001002026) мають молекулярну масу приблизно 27,9/27,72 кДа. Сплайс-варіанти СІ ОМ18.1 ії СІ ОМ18.2 відрізняються в М-кінцевій частині, яка містить першу трансмембранну (ТМ) область і петлю 1, тоді як первинна білкова послідовність на С- кінці є ідентичною.
У нормальних тканинах відсутня детектована експресія СІ ОМ18.2, за винятком шлунка, де
СІ ОМ18.2 експресується винятково на короткоживучих диференційованих клітинах епітелію шлунка. Експресія СІ ОМ18.2 зберігається в процесі злоякісної трансформації й, таким чином, часто проявляється на поверхні людських клітин раку шлунка. Більше того, цей пан-пухлинний антиген у значній мірі ектопічно активується при аденокарциномі стравоходу, підшлункової залози й легенів. Білок СІОМ18.2 також локалізований у метастазах у лімфовузли аденокарциноми шлунка й віддалених метастазах, особливо, у яєчниках (так звані пухлини
Крукенберга).
СІОМб експресується в ряді різних людських ракових клітин, при цьому експресія в нормальних тканинах обмежується плацентою.
Диференціальна експресія клаудинів, таких як СІ ОМ18.2 і СІ ОМб, у ракових і нормальних клітинах, їх локалізація в мембрані й відсутність у переважної більшості з них токсичності відносно релевантних нормальних тканин робить ці молекули привабливими мішенями для
Зо імунотерапії раку, і використання лікарських засобів на основі антитіл для спрямованого впливу на клаудини в терапії раку обіцяє високий рівень терапевтичної специфічності.
Підходи, у яких використовується потенціал Т-клітин для лікування раку, включають вакцинацію білками, виділеними з пухлини; РНК або пептидними антигенами; інфузію виділених з пухлини, збагачених ех-мімо Т-клітин (названу адоптивним переносом); перенос гена Т- клітинного рецептора або пряме захоплення Т-клітин бі- або триспецифічними антитілами.
Подібним чином, безліч стимуляторів Т-клітинних відповідей пройшли клінічне тестування в комбінації або у вигляді монотерапії, такі як ліганди для ТоїІ-подібних рецепторів; антитіла, що блокують СТІ А-4 на Т-клітинах; цитокіни, що стимулюють імунну відповідь; або антитіла, що нейтралізують молекули, залучені в «услизання» ракових клітин від імунної відповіді, такі як Таї-
Бета або В7-НІ. Інтенсивна розробка терапій на основі Т-клітин продиктована тим спостереженням, що пацієнти, очевидно, живуть значно довше, якщо їх пухлини інфільтровані
Т-клітинами. Більше того, численні мишачі моделі показали, що захоплення Т-клітин різними способами може усунути навіть великі пухлини, і ряд Т-клітинних терапій останнім часом добилися значного прогресу в лікуванні різних симптомів раку.
Задачею винаходу є забезпечення нових агентів і способів для терапії ракових захворювань.
Розв'язок проблеми, що лежить в основі винаходу, оснований на концепті створення з'єднувального агента, що містить з'єднувальний домен, який є специфічним відносно пухлино- асоційованої молекули клаудина, тобто ракових клітин. Інший з'єднувальний домен є специфічним відносно СОЗ, забезпечуючи зв'язування з Т-клітинами й входження в комплекс, роблячи, таким чином, можливим направлення цитотоксичної дії Т-клітин на ракові клітини.
Утворення цього комплексу може індукувати передачу сигналу в цитотоксичних Т-клітинах, або самостійно, або в комбінації з А-клітинами, що приводить до вивільнення цитотоксичних медіаторів.
Автори вперше повідомляють, що з'єднувальні агенти, які направлено впливають на клаудин і СОЗ, можуть індукувати сильний опосередкований Т-клітинами лізис і є ефективними в лікуванні пухлинних захворювань.
Короткий опис винаходу
В одному аспекті винахід належить до з'єднувального агента, який містить щонайменше два з'єднувальні домени, при цьому перший з'єднувальний домен зв'язується із клаудином і другий з'єднувальний домен зв'язується з СОЮЗ. З'єднувальний агент за винаходом може зв'язуватися із цитотоксичною клітиною (утягуючи СО З-рецептор) і раковою клітиною, яка еспресує СІ ОМ, яка є мішенню, що підлягає знищенню.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент є біспецифічною молекулою, такою як біспецифічне антитіло, зокрема біспецифічне одноланцюгове антитіло. В одному варіанті здійснення зазначений клаудин експресується в раковій клітині. В одному варіанті здійснення зазначений клаудин експресується на поверхні ракової клітини. В одному варіанті здійснення зазначений клаудин вибраний із групи, яка складається із клаудина 18.2 і клаудина 6. В одному варіанті здійснення зазначений перший з'єднувальний домен зв'язується з позаклітинним доменом зазначеного клаудина. В одному варіанті здійснення зазначений перший з'єднувальний агент зв'язується з нативними епітопами СІ ОМ, присутніми на поверхні живих клітин. В одному варіанті здійснення зазначений перший з'єднувальний домен зв'язується з першою позаклітинною петлею СІМ. В одному варіанті здійснення зазначений другий з'єднувальний домен зв'язується з епсилон-ланцюгом СОЗ. В одному варіанті здійснення зазначений СОЗ експресується на поверхні Т-клітини. В одному варіанті здійснення зв'язування зазначеного з'єднувального агента з СОЗ на Т-клітинах приводить до проліферації й/або активації зазначених Т-клітин, при цьому зазначені активовані Т-клітини переважно вивільняють цитотоксичні фактори, наприклад перфорини й гранзими, і ініціюють цитолізис і апоптоз ракових клітин. В одному варіанті здійснення зазначене зв'язування із клаудином і/або зазначене зв'язування з СОЗ є специфічне зв'язування.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент знаходиться у форматі повнорозмірного антитіла або фрагмента антитіла. В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент містить чотири варіабельні домени антитіла щонайменше із двома з'єднувальними доменами, при
Зо цьому щонайменше один з'єднувальний домен зв'язується із клаудином і щонайменше один з'єднувальний домен зв'язується з СОЮЗ. В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент містить варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну (МН) зі специфічністю відносно антигену клаудину (МН(СІ ОМ)), варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ) зі специфічністю відносно антигену клаудину (МІ (СІ ОМ)), варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну (МН) зі специфічністю відносно СОЗ (УН(СОЗ)), і варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ) зі специфічністю відносно СОЗ (МІ (СО3)).
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент знаходиться у форматі діатіла, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга, з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга на тому ж самому поліпептидному ланцюзі таким чином, що два домени не утворюють пари. В одному варіанті здійснення діатіло містить два поліпептидні ланцюги, при цьому один поліпептид містить МН(СІ ОМ) ії МІ (СО3) і інший поліпептидний ланцюг містить МН(СОЗ) і
МЦСГОМ).
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент знаходиться у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке складається із двох молекул 5сСЕм, з'єднаних за допомогою лінксерного пептиду, при цьому варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) переважно розташовані в напрямку від М-кінця до С- кінця в порядку МН(СІ ОМ)-М «(СІ 0ОМ)-УН(СО3)-МЦ((С03), МН(ІСОЗ3)-МІ (С603)-УН(С ОМ)-М (СІ ОМ) або МН(СОЗ3)-МІ (2С03)-М (СІ 0ОМ)-УН(СІГ ОМ). В одному варіанті здійснення зазначені варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) з'єднані за допомогою довгого пептидного лінкера, переважно пептидного лінкера, що містить амінокислотні послідовності (00(05055)3 або МЕ(бОбО5)200М0. В одному варіанті здійснення зазначені дві одиниці МН-МІ або МІ-МН 5сЕм з'єднані за допомогою короткого пептидного лінкера, переважно пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність 506005 або савасцсв.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІ ОМ18.2, і зазначена МН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 8, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 15, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент. 60 В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІ ОМ18.2, і зазначена МН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: б, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М'(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 11, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІГОМб, і зазначена МН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 22, або її варіант, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 23, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІГОМб, ії зазначена МН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 22, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М'(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 97, 98, 99 або 100, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному варіанті здійснення зазначена МН(СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 36, 94 або 95, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М (СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО
ІО МО: 37 або 96, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному варіанті здійснення зазначена МН(СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 36, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М (СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО
ІО МО: 37, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному варіанті здійснення зазначена МН(СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 95, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М (СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО
ІО МО: 96 або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному аспекті з'єднувальний агент за винаходом представлений у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке містить дві молекули 5сЕм, з'єднані за
Зо допомогою лінкерного пептиду, при цьому варіабельні області важкого ланцюга (УН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МН(СІ ОМ)-М (СІ 0ОМ)-МН(СОЗ3)-М (С2СО3). В одному варіанті здійснення зазначені
МН(СОЗ) ії М (СО3) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність (5(0505(055)4. В одному варіанті здійснення зазначені МН(ІСІ ОМ) і МІ (СІ ОМ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність (0900505)4. В одному варіанті здійснення зазначені дві одиниці МН-МІ 5сЕм з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, що містить амінокислотну послідовність 50500505. Одна або обидві із зазначених одиниць МН-МІ 5сЕм можуть містити один або більш сполучних дисульфідних містків.
В одному аспекті з'єднувальний агент за винаходом знаходиться у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке містить дві молекули 5сЕм, з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, при цьому варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МІ (СІ ОМ)-
УН(СІ ОМ)-МН(СО3)-М| (2СО3). В одному варіанті здійснення зазначені МН(СОЗ3) ії М (СО3) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність ((5(0(05055)4. В одному варіанті здійснення зазначені МИ (СІ ОМ) ії МН(СІ ОМ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність (((05(3(055)5. В одному варіанті здійснення зазначені одиниці МІ-МН ї МН-МІ. 5сЕм з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, що містить амінокислотну послідовність 50505065. Одна або обидві із зазначених двох одиниць МІ/-МН або МН-МІ 5сЕм можуть містити один або більше сполучних дисульфідних містків.
В одному аспекті з'єднувальний агент за винаходом знаходиться у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке містить дві молекули 5сЕм, з'єднані за допомогою лінкерного 60 пептиду, при цьому варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МН(СІ ОМ)-
МЦСГОМ)-М(С03)-УН(СОЗ3). Переважно, зазначена одиниця МІ (СО3)-МН(СОЗ) 5сЕм містить один або більше сполучних дисульфідних містків. В одному варіанті здійснення зазначені
МЦ(СО3) ії МН(СОЗ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 20-25, переважно 20 або 25 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність ((3(05(03(05)5. В одному варіанті здійснення зазначені МН(ІСІ ОМ) і МІ (СІ ОМ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність (000605)4. В одному варіанті здійснення зазначені одиниці МН-МІ. і МІ-МН 5сЕм з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, що містить амінокислотну послідовність 50500505. Зазначена одиниця МН(СІ ОМ)-М (СІ ОМ) 5сбм може містити один або більше сполучних дисульфідних містків.
В одному аспекті з'єднувальний агент за винаходом знаходиться у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке містить дві молекули 5сЕм, з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, при цьому варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МІ (СІ ОМ)-
УН(СІ ОМ)-М (С203)-МН(СОЗ). Переважно, зазначена одиниця МІ (СО3)-МН(СОЗ) 5сЕм містить один або більше сполучних дисульфідних містків. В одному варіанті здійснення зазначені
МЦ(СО3) ії МН(СОЗ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 20-25, переважно 20 або 25 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність ((3(05(05055)5. В одному варіанті здійснення зазначені МІ (СІ ОМ) ії МН(СІ ОМ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 20-25, переважно 20 або 25 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність (с9О00о5(05)5. В одному варіанті здійснення зазначені дві одиниці МІ-МН 5сЕм з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, що містить амінокислотну послідовність 50500055. Зазначена ланка МІ (СІ 0ОМ)-УН(СІ ОМ) 5сЕм може містити один або більше сполучних дисульфідних містків.
В одному варіанті здійснення кожного із зазначених вище аспектів зазначений СІ ОМ є
Зо СІ ОМ18.2. Переважно, зазначена УН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену
ЗБЕО ІЮ МО: 8, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М (СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 15, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент. Альтернативно, зазначена МН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 6, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М (СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 11, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент. В одному варіанті здійснення зазначена
МН(СО3) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 95, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М((СО3) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 96, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному аспекті з'єднувальний агент за винаходом знаходиться у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке містить дві молекули 5сЕм, з'єднаних за допомогою лінкерного пептиду, при цьому варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МН(СІ ОМ)-
МЦСГОМ)-УН(СОЗ3)-М(СО3); або в порядку МН(ІСОЗ3)-МІ (С203)-МН(СІ ОМ)-М| (СІ ОМ). В одному варіанті здійснення зазначені МН(ІСІ ОМ) і МІ (СІ ОМ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність (0090605)3. В одному варіанті здійснення зазначені МН(СОЗ) і М (СОЗ) з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що складається з 15-20, переважно 15 або 20 амінокислот, переважно гліцину й/або серину, і переважно з'єднані за допомогою пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність со((5((3(35)30505055. В одному варіанті здійснення зазначені дві одиниці МН-МІ. 5сЕм з'єднані за допомогою лінкерного пептиду, що містить амінокислотну послідовність 5((0(5(5.
В одному варіанті здійснення зазначеного вище аспекту зазначений СІОМ є СІ ОМб.
Переважно, зазначена УН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ
МО: 22, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
Переважно, зазначена МІ (СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ 60 МО: 98, 99 або 100, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент. Найбільше переважно, зазначена МІ (СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 99, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент. В одному варіанті здійснення зазначена МН(СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 95, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент, і М (СОЗ3) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 96, або її фрагмент, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності або фрагмент.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІ ОМ18.2, і зазначений з'єднувальний агент за винаходом містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з
ЗЕО ІЮ МО: 38, 39, 40 і 41, або їх фрагментів або варіантів.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІ ОМ18.2, і зазначений з'єднувальний агент за винаходом містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з
ЗЕО ЮР МО: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 і 93, або її фрагмент або варіант. В одному варіанті здійснення зазначений
СІОМ є СІ ОМ18.2, і зазначений з'єднувальний агент містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 103, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 їі 93, або її фрагмент або варіант, при цьому зазначена амінокислотна послідовність позбавлена сигналів секреції, таких як М-кінцеві сигнали секреції, особливо послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 51, і/або позбавлена Нів- міток, таких як С-кінцеві Ніз-мітки, особливо послідовність СіІу-спіу-5ег-(Нів)є або (Нівз)є, у випадку присутності.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІ ОМб, і зазначений з'єднувальний агент за винаходом містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ
МО: 42, 43, 44 і 45, або її фрагмент або варіант.
В одному варіанті здійснення зазначений СІ ОМ є СІ ОМб, і зазначений з'єднувальний агент за винаходом містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ
МО: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 і 65, або її фрагмент або варіант. В одному варіанті здійснення зазначений СІОМ є СІОМб, і зазначений з'єднувальний агент містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 101, 102, 60, 61, 62,63, 64 і 65,
Зо або її фрагмент або варіант, при цьому зазначена амінокислотна послідовність позбавлена сигналів секреції, таких як М-кінцеві сигнали секреції, особливо послідовність відповідно до ЗЕ
ІО МО: 51, і/або позбавлена Нів-міток, таких як С-кінцеві Нібз-мітки, особливо послідовність С1у-
Сіу-зег-(Нів)є або (Ніз)є, у випадку присутності.
В одному варіанті здійснення зазначені ракові клітини, які експресують СІ ОМ18.2, являють собою ракові клітини раку, вибраного із групи, яка складається з раку шлунка, раку стравоходу, раку підшлункової залози, раку легені, такого як недрібноклітинний рак легені (МЗС С), раку молочної залози, раку яєчників, раку товстої кишки, раку печінки, раку голови й шиї, раку жовчного міхура, і їх метастазів, пухлини Крукенберга, перитонеальних метастазів (і/або метастазів у лімфатичні вузли.
В одному варіанті здійснення зазначені ракові клітини, які експресують СІ ОМб, являють собою ракові клітини раку, вибраного із групи, яка складається з раку сечового міхура; раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника й теракарциноми яєчника; раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легені (ЗСІС) і недрібноклітинний рак легені (МЗСІ С), зокрема плоскоклітинний рак легені й аденокарциному; раку шлунка; раку молочної залози; раку печінки; раку підшлункової залози; раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми; злоякісної меланоми; раку голови й шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми; саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми; раку жовчної протоки; раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми й папілярного раку; раку нирки, зокрема плоскоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки й папілярну карциному нирки; раку товстої кишки; раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциноми тонкої кишки й аденокарциноми клубової кишки; ембріональної карциноми яєчка; плацентарної хоріокарциноми; раку шийки матки; раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка; раку матки; герміноми, такої як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка і їх метастатичних форм.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент містить М-кінцевий сигнал секреції й/або
С-кінцеву гістидинову епітопну мітку, переважно епітопну мітку із шести гістидинів.
В одному аспекті винахід належить до рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує з'єднувальний агент за винаходом. В одному варіанті здійснення рекомбінантна нуклеїнова кислота знаходиться у формі вектора. В одному варіанті здійснення рекомбінантна нуклеїнова бо кислота є РНК.
В одному аспекті винахід належить до клітини-хазяїна, яка містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту за винаходом.
В одному аспекті винахід належить до з'єднувального агента за винаходом, рекомбінантної нуклеїнової кислоти за винаходом або клітини-хазяїна за винаходом для застосування в терапії, зокрема для застосування в лікуванні й попередженні раку.
В одному аспекті винахід належить до фармацевтичної композиції, яка містить з'єднувальний агент за винаходом, рекомбінантну нуклеїнову кислоту за винаходом або клітину- хазяїна за винаходом.
В одному аспекті винахід належить до способу лікування або попередження ракового захворювання, який включає введення пацієнтові фармацевтичної композиції за винаходом.
В одному варіанті здійснення клітини зазначеного раку експресують клаудин, з яким зазначений з'єднувальний агент здатний зв'язуватися.
В одному варіанті здійснення зазначений клаудин є СІ ОМ18.2, і зазначений рак вибраний із групи, яка складається з раку шлунка, раку стравоходу, раку підшлункової залози, раку легені, такого як недрібноклітинний рак легені (МЗСІ С), раку молочної залози, раку яєчника, раку товстої кишки, раку печінки, раку голови й шиї, раку жовчного міхура і їх метастазів, пухлини
Крукенберга, перитонеальних метастазів і/або метастазів в лімфовузли.
В одному варіанті здійснення зазначений клаудин є СІ ОМб, і зазначений рак вибраний із групи, яка складається з раку сечового міхура; раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника й теракарциноми яєчника; раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легені (ЗСІС) і недрібноклітинний рак легені (М5СІ С), зокрема плоскоклітинний рак легені й аденокарциному; раку шлунка; раку молочної залози; раку печінки; раку підшлункової залози; раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми; злоякісної меланоми; раку голови й шиї, зокрема, злоякісної плеоморфної аденоми; саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми; раку жовчної протоки; раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми й папілярного раку; раку нирки, зокрема плоскоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки й папілярну карциному нирки; раку товстої кишки; раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциноми тонкої кишки й аденокарцдиноми клубової кишки; ембріональної карциноми яєчка; плацентарної хоріокарциноми; раку шийки
Зо матки; раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка; раку матки; герміноми, такої як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка і їх метастатичних форм.
В одному аспекті винахід забезпечує з'єднувальний агент або нуклеїнову кислоту, що кодує з'єднувальний агент, або клітину-хазяїна, описану тут, для застосування в способах лікування, описаних тут. В одному варіанті здійснення винахід забезпечує фармацевтичну композицію, описану тут, для застосування в способах лікування, описаних тут.
Згідно з винаходом, СІ ОМ18.2 переважно містить амінокислотну послідовність відповідно до
ЗЕО ІЮ МО: 1, і СОМ переважно містить амінокислотну послідовність відповідно до ЗЕО ІЮ
МО: 2 або 3.
Інші відмітні ознаки й переваги даного винаходу будуть очевидні з наступного докладного опису й пунктів формули винаходу.
Короткий опис креслень
Фіг. 1. Блокова схема, що ілюструє дизайн рекомбінантних білків рі--сСЕм, що направлено впливають на СІ 0ОМ18.2 ТАА.
Дизайн Бі-зсЕм5 в (А) М-кінцевому й (В) С-кінцевому положенні відносно варіабельних областей анти-ТАА. Області МН і Мі анти-СОМ18.2 створені на основі послідовності моноклонального антитіла СІ ОМ18.2 (тСІ ОМ18.2а5). Анти-СОЗ є загальним для областей МУНі
МІ, створених з послідовностей наступних моноклональних антитіл до СОЗ3: ОСнНТ1-НИ (гуманізоване МАВ) ШОСНТІ, СІ8-Т3, ТАбб, 145-2С011. Ві-єсЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; Ніб, гістидинова мітка, що містить б залишків гістидина; НИ, гуманізоване; І, довгий лінкер (15-18 амінокислот); Зес, сигнал секреції; 5, короткий лінкер (5-6 амінокислот); ТАА, пухлиноасоційований антиген; М, варіабельна область важкого (Н) і легкого (І) ланцюга антитіла.
Фіг. 2. Ефект орієнтації доменів і вибору анти-СОЗ-5сЕм на специфічний лізис клітин- мішеней: 5'--тСІі 0М18.2а6 УНІ ТАбб УНМІ-3 1ВІМАВ бБі-5сЕм5 і по.15 є найбільш сильними варіантами.
Кілька варіантів Бі-5сЕм, спрямованих проти СІ ОМ18.2 і СОЗ, були тимчасово експресовані в клітинах НЕК293Т їі очищені в малому масштабі на колонках Мі-МТА для порівняння їх сили в аналізі на цитотоксичність. Як клітини-мішені використовували клітини МидсС4, які ендогенно бо експресують СІ ОМ18.2 і стабільно які експресують люциферазу. Людські Т-клітини й клітини-
мішені інкубували в співвідношенні ЕТ, рівному 5:1, з 5 нг/мл кожного білка рі-5сЕм в 96- лунковому форматі. Як негативні контролі використовували по.35, що направлено впливає на неекспресований ТАА, по.11 і по.16 - обоє, що направлено впливають на мишачі, але не людські Т-клітини. Кожний тестований зразок висівали в шестиразовій повторності, контрольний зразок для І піп висівали в дев'ятикратній повторності. Час спільної інкубації перед початком аналізу склав 8 год, 16 год і 24 год. Після додавання розчину люциферину в задані моменти часу люмінесценцію вимірювали на рідері Іпїйпйе М200 ТЕСАМ. Специфічний лізис клітин- мішеней розраховували шляхом нормалізації до зразків з контрольним по.35 (І піп) Бі-5сЕм.
Найбільш сильні білки Бі-єсЕм - 1ВІМАВ і по.15 - мали однакову орієнтацію доменів і походження анти-СОЗ МАВ ТКб66б, але відрізнялися своєю оптимізацією кодонів (Н5 і СНО, відповідно) і довгими послідовностями лінкера. СНО означає клітини яєчника китайського хом'ячка; МАВ, моноклональне антитіло; НИ, гуманізоване; ТАА, пухлиноасоційований антиген.
Фіг. 3. Фарбування кумаси й вестерн-блот аналіз білка 1ВіІМАВ бБі-5сЕм.
Супернатант без ЕС5 моноклональних клітин НЕК293, які стабільно експресують 1ВіМАВ, очищали афінною хроматографією (ІМАС) на колонку Мі-МТА. Аліквоти різних стадій очищення вносили на 4-12 95 Вів-Ттгі5 гелі. (А) Фарбування Кумаси клітинного супернатанта, пропущення й вісім фракцій елюата. Фракції першого піка елюювання видаляли, фракції другого піка елюювання поєднували для наступних досліджень, діалізували проти РВ5 і потім проти 200 мм аргінінового буфера (Доріжка 1: НЕК293/1ВІМАВ ЗМ; доріжка 2: Проточна фракція ІМАС; доріжки 3-4: Фракції піка елюювання 1 (вилучені); доріжки 5-10: Фракції піка елюювання 2 (об'єднані)); (В) Вестерн-Блот аналіз 0,5 г 1ВіМАВ із трьох незалежних очищень (доріжка 1, 2, 3).
Детекцію виконували з первинним моноклональним анти-Ніх і вторинним антимишачим антитілом, кон'югованим з пероксидази. ІМАС означає афінну хроматографію з використання іммобілізованих металів; РВ5, фосфатно-буферний сольовий розчин; ЗМ, супернатант; МВ, вестерн-блотинг.
Фіг. 4. Білок 1ВІМАВ рі-5сЕм ефективно й специфічно зв'язується з СІ ОМ18.2-експресуючими клітинами-мішенями й людськими Т-клітинами. (А) 2,5х105 клітин МидС4, ендогенно експресуючих СІ ОМ18.2, інкубували з 50 мкг/мл 1ВІМАВ або 10 мкг/мл тс О0М18.2а5 як позитивний контроль й відповідними АРС-кон'югованими
Зо вторинними антитілами. Контрольні фарбування включали тільки вторинні АРС-кон'юговані антитіла (д-а-й, д-а-т), анти-Ні5 і д-а-т АРС, або 1ВІМАВ і д-а-т АРС. Аналіз виконували за допомогою проточної цитометрії. МЕЇ АРС-Сигналу розраховували за допомогою програмного забезпечення РіІом/о. (В) 1х105 клітин МидС4, ендогенно експресуючих СІ ОМ18.2, фарбували наростаючими концентраціями 1ВіМАВ (20 пг/мл - 20 мкг/мл), анти-Ніє і д-а-т АРС. Як негативний контроль клітини інкубували з анти-Ніхє і д-а-т АРОС. Як позитивний контроль використовували ті ОМ18.2а6 і д-а-п АРС. МЕЇ АРС-сигналу розраховували за допомогою програмного забезпечення Біом/о. (С) 1х106 людських Т-клітин інкубували з наростаючими концентраціями 1ВІМАВ (2 нг/мл - 2 мкг/мл), анти-Ні5 і д-а-т АРС. Як негативний контроль клітини інкубували з анти-Ніє і д-а-т АРС або тільки д-а-т АРС. МР! АРС-сигналу розраховували за допомогою програмного забезпечення РіІом/о. (0) 1х105 СІ ОМ18.2-негативних клітин РА-1 інкубували з наростаючими концентраціями 1ВіМАВ (10 нг/мл - 10 мкг/мл), анти-Нів і д-а-т АРС. Як негативний контроль клітини фарбували анти-Нів і д-а-т АРС або тільки д-а-п
АР. 10 мкг/мл тс ОМ18.2а65 ії д-а-л АРС використовували для підтвердження негативності клітин відносно СІ ОМ18.2. С-а-п означає козяче-антилюдське; д-а-т, козяче-антимишаче; МРЇ, середня інтенсивність флуоресценції; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 5. Білок 1ВІМАВ Брі-5сЕм викликає утворення кластерів Т-клітин на СІ ОМ18.2-позитивних клітинах-мішенях.
Клітини МидсСа4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, інкубували протягом 24 год з 1 нг/мл і 1 мкг/мл 1ВІМАВ і людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:1 в б-лункових планшетах. Як контрольні зразки вибирали тільки Т-клітини (ТІ), тільки клітини-мішені (Мидса) і людські Т-клітини із клітинами-мішенями (-контр). Через 24 год робили знімки зразків за допомогою мікроскопа Мікоп Есіїрзе Ті при збільшенні 200х. Білі стрілки вказують на кластери Т- клітин на клітинах-мішенях. ТІ. означає Т лімфоцит.
Фіг. 6.1 Вітар опосередковує Т-клітинну активацію дозо-залежним чином.
Клітини МидсСа4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, інкубували протягом 24 год і 48 год з наростаючими концентраціями білка 1ВІМАВ бБі-зсЕм (0,001 - 1000 нг/мл) і людськими Т- клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:11 у двох повторностях в 24-лунковому форматі. Як контроль людські Т-клітини інкубували з 1-1000 нг/мл 1ВІМАВ без клітин-мішеней
МидС4 для підтвердження залежної від мішені активації Т-клітин, опосередкованої 1ВімАВ. 60 Через 24 год (А) і 48 год (В) Т-клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ і анти- б
СОб69-АРС, і аналізували за допомогою проточної цитометрії. ТІ означає Т-лімфоцит.
Фіг. 7.1 ВІМАВ опосередковує активацію Т-клітин, строго залежну від мішені, навіть після тривалої інкубації із клітинними лініями, високо-, низько- і неекспресуючими СІ ОМ18.2. (А) Показані дані КТ-РСК, отримані із загальної РНК шести пухлинних клітинних ліній.
Величини СІ експресії СІ ОМ18.2, нормалізовані стосовно гена домашнього господарства НРКТ, розраховували на підставі двох незалежних експериментів. Клітинна лінія раку молочної залози
МСЕ? (сірий стовпець) неекспресуюча СІ ОМ18.2 була вибрана як контроль. (В) Ракові клітинні лінії (А) інкубували протягом 144 год з 5 нг/мл білка 1ВІМАВ рі-5сЕм з людськими Т-клітинами або без них у співвідношенні ефектора до мішені 5:11 у двох повторностях в б-лунковому форматі. Т-клітини мітили анти-СО3-РІТС, анти-СО25-РЕ і анти-СО69-АРС для аналізу загальної популяції Т-клітин (СОЗ), ранньої активації (СОб69) і пізньої активації (СО25) Т-клітин за допомогою проточної цитометрії. ТІ. означає Т-лімфоцит.
Фіг. 8.1ВІМАВ індукує Т-клітинну проліферацію й підвищувальну регуляцію гранзима В тільки в присутності СІ ОМ18.2-позитивних клітин-мішеней. (А) Людські Т-клітини людини фарбували СЕЗЕ і вирощували окремо (ТІ) або в присутності 1 нг/мл 1ВІМАВ (ТІ. «з 1 нг/мл 1ВіІМАВ), клітин Мидса4 (ТІ я МидСаУ), або клітин Мидса і 1 нг/мл 1ВІМАВ (ТІ ж 1 нг/мл 1ВІМАВ - Ми4б4) протягом 120 год. Було вибране співвідношення ефектора до мішені, рівне 5:11. Зменшення сигналу СЕБЕ, що вказує на Т-клітинну проліферацію, аналізували за допомогою проточної цитометрії. (В) Людські Т-клітини інкубували із клітинами-мішенями МидС4 або без них, і з 5 нг/мл білка 1ВІМАВ Брі-5сЕм або без нього.
Співвідношення ефектора до мішені склало 5:11 в б-лунковому форматі. Через 96 год спільної інкубації Т-клітини збирали й внутриклітинно фарбували анти-СтВ-Ре і аналізували за допомогою проточної цитометрії. МЕїІ-сигнал анти-с/В-РЕ розраховували за допомогою програмного забезпечення РіІом/о. Сигнал незабарвленого зразка ТІ ї- МидсСа4 « 5 нг/мл 1ВІМАВ віднімали із усіх зразків. СЕЗЕ означає складний ефір сукцинимідилу й карбоксифлуоресцеїну;
СВ, гранзим В; МРЇ, середня інтенсивність флуоресценції; РЕ, фікоеритрин; ТІ, Т-лімфоцити.
Фіг. 9. Величина ЕС50 1ВіІМАВ для специфічного лізису клітин-мішеней через 48 год склала приблизно 10 пг/мл.
Клітини МидС4, які ендогенно експресують СІОМ18.2, які стабільно експресують
Зо люциферазу, інкубували протягом 24 год і 48 год з білком 1ВІМАВ рі-5сЕм у наростаючих концентраціях (0,001-1000 нг/мл) з людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:11 у трьох повторностях в 96б-лунковому форматі. Як мінімальний лізис (І піп) контрольні ефекторні клітини й клітини-мішені висівали без 1ВІМАВ Брі-5сЕу. Максимальний лізис (І тах) для нормалізації стосовно спонтанного числа імпульсів люмінесценції був досягнутий шляхом додавання ТІйоп Х-100 у контрольні лунки, що містять ефекторні клітини й клітини-мішені у відсутності Бі-х:сСЕм безпосередньо перед додаванням люциферину. Після додавання розчину люциферину люмінесценцію вимірювали на мікропланшетному рідері Іпіїпйе М200 Тесап через 24 год і 48 год. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 95 специфічного лізису: 1-(люмінесценція тестований зразок-Ї тах)/(І тіп-Ї тах))х100. Величини наносили залежно від од 10 концентрації 1ВіМАВ. Величина ЕС50О означає половину максимальної ефективної концентрації; Г,, лізис.
Фіг. 10.1ВІМАВ показує терапевтичну ефективність /л м/мо у моделі пухлини 5С на пізній стадії.
Мишам МОЮО.Са-Ргказсіа І 2гуїтіМмИ/52.Т (МО) ін'єктували підшкірно (С) клітини НЕК293 у кількості 1 х 107, стабільно, які експресують СІ ОМ18.2. Через п'ять днів клітини РВМС людини як ефекторні клітини у кількості 2 х 107 ін'єктували інтраперитонеально (ІР) групам 3 і 4, контрольні групи (СІ і (832) одержували тільки РВ5. Наступного дня починали щоденне ІР уведення 5 мкг білка 1ВіІМАВ бБі-5сЕм кожній тварині або носія як контролю. Терапію проводили протягом 22 днів, обсяг пухлини вимірювали з використанням каліпера й розраховували за формулою ммЗ-довжина мм х ширина мм х (ширина мм/2). (А) Обсяг пухлини однієї миші й середнє значення на групу показано для лікувальних днів 0 і 15 (верхній ряд), і днів З і 13 після закінчення лікування (нижній ряд). (В) Показаний середній обсяг пухлини двох лікувальних груп, привитих людськими ефекторними клітинами. Тире вказує забитих тварин. (С) Крива виживаності Каплана-Мейєра, що демонструє всі групи від дня інокуляції пухлини до дня 41.
Тварин забивали після досягнення обсягу пухлини 500 мм. Після дня 41 тварин, що залишилися, забивали для аналізу приживлення людських ефекторних клітин у селезінках мишей. (0) Спленоцити всіх мишей ізолювали й фарбували анти-СО45-АРС і анти-СОЗ3-РІТО для детекції людських Т-клітин за допомогою проточної цитометрії. Медіана приживлення відображена на коробчатій діаграмі (З означає групу; ІР, інтраперитонеально; РВМС, бо мононуклеарні клітини периферичної крові; РВ5, фосфатно-буферний сольовий розчин; ЗС,
підшкірно.
Фіг. 11. Блокова схема, що ілюструє дизайн рекомбінантних білків Бі--:СЕм, що направлено впливають на СІ Мб ТАА.
Дизайн бБі-зсЕм5 в (А) М-кінцевому (В) С-кінцевому положенні відносно варіабельних областей анти-ТАА. Області МН і Мі анти-СІОМб створені на основі послідовності моноклонального антитіла СІ ОМб (тс ОМвбабр). Області МН і МІ анти-СОЗ створені на основі послідовності моноклонального антитіла СОЗ Тбб. Ві-єсЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; Ні, гістидинова мітка, що містить шість залишків гістидина; ГЇ, довгий лінкер (15-18 амінокислот); Зес, сигнал секреції; ЗІ, короткий лінкер (5 амінокислот); ТАА, пухлиноасоційований антиген; У, варіабельна область важкого (Н) і легкого (І) ланцюга антитіла.
Фіг. 12. Білки ЄРНИ5 і 6РНОИЗ рі-5сЕм викликають утворення кластерів Т-клітин на СІ ОМ 6- позитивних клітинах-мішенях.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІ ОМб, інкубували протягом 24 год з 50 нг/мл б6РНИиИ5 або 6РНИиИЗ їі людськими Т-клітинами людини в співвідношенні ефектора до мішені 5:1 в б-лункових планшетах. Як контрольні зразки були вибрані тільки Т-клітини (ТІ), тільки клітини- мішені (РА-1) і людські Т-клітини із клітинами-мішенями (-контр.). Через 24 год робили знімки зразків на мікроскопі Мікоп Есіїрхе Ті при збільшенні 200х. Білі стрілки вказують на Т-клітинні кластери на клітинах-мішенях. ТІ. означає Т-лімфоцити.
Фіг. 13. Ефект орієнтації доменів на ефективність: білок ЄБРНОЗ рі-5сЕм є небагато більш ефективним відносно індукції активації Т-клітин у порівнянні з БРНО5Б.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІОМб, інкубували протягом 44 год з наростаючими концентраціями (5 - 200 нг/мл) ЄРНО5 або 6РНИЗ і людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:1 у двох повторностях в б-лунковому форматі. Як контроль людські Т-клітини людини інкубували з 100 і 200 нг/мл 6РНИ5 або 6РНИиИЗ без клітин-мішеней.
Через 44 год Т-клітини збирали й мітили анти-СОЗ-РЇТС, анти-СО25-РЕ і анти-СОб69-АРО.
Дозозалежну Т-клітинну активацію аналізували за допомогою проточної цитометрії. Ни означає людські; ТІ, Т-лімфоцити.
Фіг. 14. Фарбування кумаси й вестерн-блот аналіз білка бБРНИЗ.
Зо Супернатант без ЕС5 поліклональних клітин НЕК293, стабільно експресуючих 6РНИЗ, очищали на Мі-МТА афінної хроматографії (ІМАС). Аліквоти різних стадій очищення наносили на 4-1295 Вів-Тгіє5 гелі. (А) Фарбування кумаси клітинного супернатанта, пропущення й дев'ять фракцій елюата. Фракції першого піка елюювання видаляли, фракції другого й третього піків елюювання поєднували для подальших досліджень, діалізували проти РВ5 і потім проти 200 мм аргінінового буфера. (Доріжка 1: НЕК293/6ЄРНИОИЗ ЗМ; доріжка 2: ІМАС проточні фракції; доріжки
З - 5: Фракції піка елюювання 1 (вилучені); доріжки 6-11: Фракції піка елюювання 2 із (об'єднані)) (В) Вестерн-Блот аналіз 0,5 мкг 6РНОИЗ із двох незалежних очищень. Детекцію виконували з первинним моноклональним анти-Ніз і вторинним антимишачим антитілом, кон'югованим з пероксидазою. ІМАС означає афінну хроматографію з використанням іммобілізованих металів; РВ5; фосфатно-буферний сольовий розчин; 5М, супернатант; М/В, вестерн-блотинг.
Фіг. 15. Білок ЄРНИЗ Брі-5сЕм ефективно й специфічно зв'язується з СІ ОМ б-експресуючими клітинами-мішенями й людськими Т-клітинами. (А) 1 х 105 клітин РА-1, ендогенно експресуючих СІ ОМб, і клітини ОМ-90 інкубували з наростаючими концентраціями 6РНИЗ або контрольним 1ВіІМАВ бБрі-5сЕм (10 нг/мл - 10 мкг/мл) і 10 мкг/мл тс! ОМбар або контрольним МАВ тс 0ОМ18.2а6 з відповідними АРС-кон'югованими вторинними антитілами. Контрольні фарбування являли собою тільки вторинні АРС-кон'юговані антитіла (д-а-й, д-а-т). Аналіз виконували за допомогою проточної цитометрії. МЕ! АРС-сигналу розраховували за допомогою програмного забезпечення РБіІом/о. (В) 5хІ0?» людських Т-клітин інкубували з наростаючими концентраціями 6РНОЗ (100 нг/мл - 10 мкг/мл), анти-Нів і д-а-т РЕ.
Як негативний контроль клітини інкубували з анти-Нів і д-а-т РЕ або тільки д-а-т РЕ. МЕЇ РЕ- сигналу розраховували за допомогою програмного забезпечення Біом/о. (С) 1 х 105 СІ ОМ 6- негативних клітин МидсСа4 інкубували з наростаючими концентраціями ЄРНИЗ і 1ВіІМАВ (10 нг/мл - 10 мкг/мл), анти-Ні5 і д-а-т АРС. Як негативний контроль клітини інкубували тільки з д-а-т
АРОС. 10 мкг/мл тс ОМбаБб і д-а-п АРС використовували для підтвердження негативності СІ ОМ клітин. Як позитивний контроль використовували тсі ОМ18.2аБб і д-а-нп АРС. МЕЇ АРС-сигналу розраховували за допомогою програмного забезпечення РіІом/ю. АРС означає алофікоціанін; д- а-й, козячі-антилюдські; д-а-т, козячі-антимишачі; МАВ, моноклональне антитіло; МЕЇ, середня інтенсивність флуоресценції; РЕ, фікоеритрин; ТІ, Т-лімфоцит. бо Фіг. 16.6РНИЗ опосередковує активацію Т-клітин дозозалежним чином
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІ ОМб, інкубували протягом 24 год і 48 год з наростаючими концентраціями білка ЄРНОЗ бБі-всЕм (0.001-1000 нг/мл) і людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:11 у двох повторностях в 24-лунковому форматі. Як контроль людські Т-клітини інкубували з 1-1000 нг/мл бРНИЗ без клітин-мішеней РА-1 для підтвердження залежної від мішені активації Т-клітин, опосередкованої 6РНИЗ. Через 24 год (А) і 48 год (В) Т-клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ і анти-СО69-АРС, і аналізували за допомогою проточної цитометрії. ТІ. означає Т-лімфоцити.
Фіг. 17. Величина ЕС50 6РНИЗ для специфічного лізису клітин-мішеней через 48 год склала приблизно 10 пг/мл.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІ ОМб, які стабільно експресують люциферазу, інкубували протягом 24 год і 48 год з білюм ЄРНОИЗ у наростаючих концентраціях (0,001-1000 пг/мл) з людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:1 у трьох повторностях в 9б-лунковому форматі. Як мінімальний контроль лізису (І піп) ефекторні клітини й клітини-мішені висівали без бРНИЗ бБі-5сЕм. Максимальний лізис (І лах) для нормалізації відносно числа імпульсів спонтанної люмінесценції був досягнутий шляхом додавання Топ Х-100 у контрольні лунки, що містять ефекторні клітини й клітини-мішені при відсутності Бі-5:сСЕм безпосередньо перед додаванням лициферину. Після додавання розчину люциферину люмінесценцію вимірювали на мікропланшетному рідері Іпіїпйе М200 Тесап через 24 год і 48 год. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 95 специфічного лізису - (1 - (люмінесценція тестованого зразка - І тах) / (І тіп - І тах)| х 100. Значення наносили залежно від 0910 концентрації б6РНИЗ. Величина ЕС5О означає половину максимальної ефективної концентрації; І, лізис.
Фіг. 18.6РНОЗ показує терапевтичну іп мімо ефективність у моделі пухлини 5С на пізній стадії.
Мишам МОО.Са-Рікавсі || дгдіту/57| (МБО) ін'єктували підшкірно (5С) клітини РА-1 у кількості 71 х 107, які ендогенно експресують СІОМб. Через 15 днів групам 53 і 04 інтраперитонеально (ІР) ін'єктували клітини РВМС людини в кількості 2 х 107, контрольні групи (СІ ії 52) одержували тільки РВ5. Щоденне ІР уведення 5 мкг 6РНИОЗ кожній тварині або контрольного 1ВІМАВ бБі-5сЕм, або тільки носія як контролю починали через п'ять днів після ін'єкції РВМС. Терапію проводили протягом 25 днів, обсяг пухлини вимірювали за допомогою
Зо каліпера й розраховували за формулою мм? - довжина, мм х ширина, мм х (ширина, мм/2). (А)
Обсяг пухлини однієї миші й середнє значення на групу показано для днів 0 і 14 терапії (верхній ряд), і 21 ії 25 (нижній ряд). (В) Показаний середній обсяг пухлини всіх лікувальних груп.
Пунктирні лінії означають забитих тварин. (С) Показана крива виживаності Каплана-Мейєра, для всіх груп від дня інокуляції пухлини до дня 45. Тварин забивали при обсязі пухлини 21500 мм3.
Через 45 днів усіх, що залишилися тварин забивали для аналізу приживлення людських ефекторних клітин у селезінках мишей. (0) Спленоцити всіх мишей виділяли й фарбували анти-
СО45-АРС і анти-СОЗ3-РІТС для детекції людських Т-клітин за допомогою проточної цитометрії.
Медіана приживлення відбита на коробчатій діаграмі. ІР означає інтраперитонеально; РВМС, мононуклеарні клітини периферичної крові; РВ5, фосфатно-буферний сольовий розчин; 5С, підшкірно.
Фіг. 19. Підвищена інфільтрація Т-клітин в ЗС РА-1 пухлини у відповідь на терапію ЄРНОЗ.
Мишам М5С ін'єктували підшкірно (ЗС) клітини РА-1 у кількості 1 х 107, які ендогенно експресують СІ ОМб. Через 15 днів групам 3 і 54 інтраперитонеально (ІР) ін'єктували клітини
РВМС людини в кількості 2 х 107, контрольні групи (СІ ї 52) одержували тільки РВ5. Щоденне ІР уведення 5 мкг ЄРНОЗ кожній тварині або контрольного 1ВІМАВ брі-5сЕм, або тільки носія як контролю починали через п'ять днів після ін'єкції РВМС. Пухлини вирізали при розмірі 1500 мм3 або наприкінці експерименту, і консервували в 4 95 буферному розчині формальдегіду для поміщення в парафін.
Поміщені в парафін пухлинні тканини 5С РА-1 пухлин піддавали імуногістохімічним фарбуванням. Послідовні зрізи фарбували поліклональним первинним антитілом антиклаудин 6 або антилюдськими СО3. Первинні антитіла детектували з використанням вторинних антикролячих антитіл, кон'югованих з пероксидазою НКР. Верхні ряди А-Е показують фарбування СІ ОМб, нижні ряди фарбування СОЗ3. Зображення одержували за допомогою сканера Мігах. (А) і (В) показують РВ5-контрольні групи СІ і 52, які не одержували людських ефекторних клітин і одержували носій або ЄРНИЗ рі-5сЕм, відповідно, (С) показує контрольну групу 53, яка одержувала людські ефекторні клітини й носій як терапію, (0) показує групу 04, яка одержувала людські ефекторні клітини й ЄРНИЗ Бі-5сЕм як терапію, і (Е) показує контрольну групу 55, яка одержувала людські ефекторні клітини й контрольні 1ВІМАВ брі-зсЕм. Позитивні сигнали з'являються у вигляді червоного фарбування. Чорні стрілки вказують на приклади бо сигналів СОЗ. ІР означає інтраперитонеально; РВМС, мононуклеарні клітини периферичної крові; РВ5, фосфатно-буферний сольовий розчин; 5С, підшкірно.
Фіг. 20. Схематичне зображення молекул ІМТ-РНК антитіла, що кодують, рі-5сЕм, що направлено впливають на СІ ОМ18.2 ТАА.
Схема іп міго транскрибованих послідовностей РНК, що кодують анти-СІ ОМ18.2 антитіла бі- 8сЕм. (А) ІМТ-мРНК в о 5- і 3З'положенні щодо варіабельних областей анти-ТАА. (В) ІМТ альфавірусний реплікон в 5'-положенні щодо варіабельних областей анти-ТАА. Області МН і МІ анти-СІ ОМ18.2 створювали на основі послідовності моноклонального антитіла СІ ОМ18.2 (тс ОМ18.2а5). «Кеп» однаково використовується для АКСА, бета-5-АКСА (0) або бета-5-
АКСА (02). В (А) «анти-СОЗ» означає області МН і Мі, створені на основі послідовностей наступних моноклональних СОЗ антитіл: ОСНТ1-НИи (гуманізоване МАВ), ЮСНТІ, СІ В-Т3, ТАб6б, 145-2С11, в (В) «анти-СОЗ» описує тільки МН і МІ з ТКб6. А означає аденін; бі-5сЕм, біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; пПАд, людський альфа глобін 5-ОТА;
ВО, людський бета-глобін 3-ШТЕК; Нів, гістидинова мітка, що містить шість залишків гістидину;
ІМТ, іп міго транскрибований; Г Ї, довгий лінкер (15-18 амінокислот); п5РІ-4, неструктурні білки 1- 4; ес, сигнал секреції; 59Р, субгеномний промотор; ЗІ, короткий лінкер (5-6 амінокислот); ТАА, пухлиноасоційований антиген; ОТК, нетрансльована область; У, варіабельна область важкого (Н) ланцюга й легкого (І) ланцюга антитіла.
Фіг. 21. Ефект орієнтації доменів і вибору анти-СО3-5сЕм на залежну від мішені активацію Т- клітин і специфічний лізис клітин-мішеней.
Клітини Мидса4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, тимчасово трансфікували декількома варіантами Бі-з5:сЕм, спрямованими проти СІ ОМ18.2 ії СОЗ для порівняння їх сили в аналізі на цитотоксичність. Клітини МидС4 у кількості 5 х 106 на кожний варіант електропорували з 20 мкг/мл ІМТ-МРНК. Трансфіковані клітини-мішені підраховували, 1 х 109 клітин засівали на кожний б-лунковий планшет і інкубували з людськими цитотоксичними Т-клітинами (вибрані Т клітини
СО8) у співвідношенні Е:Т, рівному 5:1. Як негативні контролі використовували ІМТ-мРНК бі- «СЕМ, що направлено впливає на неекспресований ТАА (контр), і батьківське дд МАВ
СС ОМ18.2а5 (контр 99), що направлено впливає на СІ ОМ18.2, але не Т-клітини. Білок 1ВІМАВ у концентрації 5 нг/мл служив як позитивний контроль. Як референсні фонові загиблі клітини електропоровані клітини засівали без Т-клітин і, як референсну фонову активацію Т-
Зо клітини засівали без клітин-мішеней. Кожний зразок висівали у двох повторностях. Через 48 год
Т-клітини й клітини-мішені збирали й мітили анти-СО3-РІТС, анти-СО25-РЕ, анти-СОб69-АРС і 7-
ААО для фарбування живих і загиблих клітин і аналізували за допомогою проточної цитометрії. (А) ТАА-залежну, опосередковану рі-5сЕм активацію Т-клітин спостерігали для всіх варіантів анти-СІ ОМ18.2 рі-5сЕм. (В) Специфічний лізис клітин-мішеней визначали шляхом вирахування референсної популяції 7-ААО з популяції клітин-мішеней зразків 7-ААО. Антитіла рі-зсЕм, що викликає небагато більш високий лізис клітин-мішеней - 1ВІМАВ і по.5 - мають однакову орієнтацію доменів і анти-СО З-походження МАВ ТКб66, але відрізняються оптимізацією своїх кодонів (Н5 і СНО, відповідно) і послідовностями довгого лінкера. Ві-5сЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; контр, контроль; дос, імуноглобулін о;
ІМТ, іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 22. Спільна інкубація клітин-мішеней, трансфікованих ІМТ-МРНК 1ВІіМАВ, і людських Т- клітин приводить до утворення кластерів Т-клітин.
Клітини МидС4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, тимчасово трансфікували шляхом електропорації 80 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВІМАВ і інкубували разом з людськими цитотоксичними Т- клітинами (вибрані Т-клітини СО8") у співвідношенні ефектора до мішені 5:1 в 96-лункових планшетах. Як негативний контрольний зразок використовували клітини-мішені Мидса, трансфіковані ІМТ-МРНК бБі-5сЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА (-контр), спільно інкубовані з людськими цитотоксичними Т-клітинами (верхній ряд, ліворуч). Нижній ряд показує клітини МидС4, трансфіковані контрольним бБі-5сЕм (ліворуч) або ІМТ-МмРНК 1ВімАВ (праворуч) без людських Т-клітин. Через 24 год спільної інкубації робили знімки зразків на мікроскопі Мікоп Есіїрзе Ті при збільшенні 200х. Білі стрілки вказують на Т-клітинні кластери на клітинах-мішенях. СТІ. означає цитотоксичні Т-лімфоцити; контр, контроль; Пи, людські.
Фіг. 23.1ВіМАВ, секретований клітинами-мішенями після трансфекції ІМТ-мМмРНК, опосередковує активацію Т-клітин залежним від концентрації чином.
Клітини МидС4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, тимчасово трансфікували шляхом електропорації ІМТ-МРНК у загальній кількості 40 мкг/мл, що містять 0.4-40 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВІМАВ плюс відповідні кількості ІМТ-МРНК люциферази. Трансфіковані клітини-мішені спільно інкубували з людськими цитотоксичними Т-клітинами (вибрані Т клітини СО8-) у співвідношенні ефектора й мішені 5:11 в б-лункових планшетах у двох повторностях. Як активацію Т-клітин бо референсні людські Т-клітини спільно інкубували із клітинами-мішенями /Мидса,
трансфікованими 40 мкг/мл ІМТ-МРНК люциферази (0.0 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВіІМАВ). Через 24 год (А) і 48 год (В) Т-клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ і анти-СО69-АРС, і аналізували за допомогою проточної цитометрії. На діаграмах показаний процентний вміст позитивно пофарбованих цитотоксичних Т-клітин людини, визначений за допомогою програмного забезпечення Ріом/о. ІМТ означає іп міго транскрибовані; мРНК, месенджер РНК;
ТЕ, Т-лімфоцит.
Фіг. 241ВіМАВ, секретований клітинами-мішенями після трансфекції ІМТ-мРНК, приводить до залежного від концентрації лізису клітин-мішеней.
Клітини МидС4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, тимчасово трансфікували шляхом електропорації ІМТ-мМРНК у загальній кількості 40 мкг/мл, що містить 0,4 - 40 ІМТ-МРНК 1ВІМАВ плюс відповідні кількості ІМТ-МРНК люциферази або 40 мкг/мл тільки ІМТ-МРНК люциферази як референсний зразок. Трансфіковані клітини-мішені засівали з людськими цитотоксичними Т- клітинами (вибрані Т-клітини СО8:) у співвідношенні ефектора й мішені 5:1 або без ефекторних клітин для визначення процентного вмісту фонових загиблих клітин-мішеней шляхом індивідуальної електропорації. Усі зразки вирощували в б-лункових планшетах у двох повторностях. Через 24 год (А) і 48 год (В) Т-клітини збирали, мітили йодидом пропідію (РІ) для фарбування живих/загиблих клітин і аналізували за допомогою проточної цитометрії.
Процентний вміст загиблих (Рі) клітин-мішеней визначали за допомогою програмного забезпечення Біом/о. Значення потім нормалізували відносно кожного індивідуального фонового зразка й референсного зразка. ІМТ означає /л Уго транскрибовані; мРНК, месенджер
РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 25. Т-клітинна проліферація специфічно індукована у відповідь на секрецію 1ВІМАВ клітинами-мішенями в присутності СІ ОМ18.2
Людські Т-клітини фарбували СЕБЕ для аналізу. Т-клітини вирощували без клітин-мішеней (Т-клітини) у комбінації з 5 мкг/мл ОКТЗ і 2 мкг/мл аСО28 як позитивний контроль активації (кконтр), з 5 нг/мл нетаргетного контрольного бі-зсЕм (білок -контр) або з 5 нг/мл білка 1ВІМАВ (білок 1ВІМАВ).Т-клітини й клітини-мішені МидС4, які надекспресують СІ 0ОМ18.2, інкубували разом (Т-клітиниж СІ ОМ18.2-позитивні клітини-мішені) без будь-чого (що імітує контроль) або з 5 нг/мл білка 1ВІМАВ (білок 1ВІМАВ). Для тестування ІМТ-МРНК клітини МидС4 трансфікували
Зо 20 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВіМАВ (мРНК 1ВіМАВ) або ІМТ-мРНК бі-5сЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА (мРНК-контр) і інкубували з Т-клітинами. Крім того, клітини Мидса4, трансфіковані ІМТ-мМРНК рі-5сЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА, поєднували з 5 нг/мл білка 1ВІМАВ (мРНК -контр т білок 1ВІМАВ). Як додатковий контроль специфічності включали зразки, що містять неекспресуючу СІ ОМ18.2 лінію клітин-мішеней
МОА-МВ-231 разом з Т-клітинами (Т-клітиних СІ ОМ18.2-негативні клітини-мішені). МОА-МВ-231 використовували неопрацьованими й інкубували без будь-чого (контроль, що імітує), з 5 нг/мл контрольного білка Бі-5сЕм (білок-контр) або 5 нг/мл білка 1ВІМАВ (білок 1ВІМАВ), або МОА-МВ- 231 трансфікували 20 г/мл ІМТ-МРНК 1ВіМАВ (мРНК 1ВімАВ) або ІМТ-МРНК бБі-5сЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА (мРНК -контр). Аналіз виконували при співвідношенні ефектора до мішені 5:11 в 9б6-лунковому планшеті, кожний зразок готовили в трьох повторностях, і час інкубації склав 72 год. Зменшення сигналу СЕБЕ, що вказує на проліферацію Т-клітин, аналізували за допомогою проточної цитометрії, розраховували за допомогою програмного забезпечення Ріом/о і наносили на графік у вигляді 95 проліферуючих
Т-клітин. СЕБЕ означає складний ефір сукцинімідилу й карбоксифлуоресцеїну; ІМТ, іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК.
Фіг. 26. Активація Т-клітин і опосередкований Т-клітинами лізис клітин-мішеней у відповідь на секрецію 1ВіІМАВ починається при співвідношення ефектора й мішені 0,3:1.
Клітини МидС4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, тимчасово трансфікували шляхом електропорації 40 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВіМАВ. Трансфіковані клітини-мішені спільно інкубували з людськими цитотоксичними Т-клітинами (вибрані Т-клітини СЮО8") у зазначених співвідношеннях ефектора й мішені в діапазоні від 0,3:1 до 10:1 в б-лункових планшетах у двох повторностях. Як референсні зразки людські Т-клітини вирощували під час відсутності клітин-мішеней (А) 1:00) і клітини-мішені, трансфіковані контрольним ІМТ-мМРНК, вирощували під час відсутності ефекторних клітин ((В) 0:1). Як негативний контроль людські Т-клітини спільно інкубували із клітинами-мішенями МидС4, трансфікованими 40 мкг/мл ІМТ-МРНК люциферази (контр ІМТ-
МРНК) у співвідношенні Е:Т, рівному 10:1, (А) ії (В) контр ІМТ-МРНК 10:1). Через 48 год клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ, анти-СО69-АРС і йодидом пропідію (РІ) для фарбування живих/загиблих клітин і аналізували за допомогою проточної цитометрії. (А) показує процентний вміст позитивно пофарбованих цитотоксичних людських Т-клітин. (В) бо демонструє процентний вміст загиблих (Рі) клітин-мішеней. Усі величини визначали за допомогою програмного забезпечення Ріоу/Ло. Е:Т означає співвідношення ефектора й мішені;
ІМТ, іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 27. Людські цитотоксичні Т-клітини можуть служити як реципієнт ІМТ-МРНК бБі-бсЕм клітин-продуцентів
Людські цитотоксичні Т-клітини виділяли зі свіжих РВМСО шляхом СО 8-позитивного відбору й потім тимчасово трансфікували шляхом електропорації 80 або 240 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВімМАВ.
Трансфіковані ефекторні клітини спільно інкубували із клітинами-мішенями МидС4, ендогенно експресуючими СІ ОМ18.2, у співвідношенні ефектора й мішені 5:11 в б-лункових планшетах у двох повторностях. Як референсні зразки неопрацьовані людські Т-клітини вирощували із клітинами-мішенями. Як негативний контроль людські Т-клітини, трансфіковані 80 або 240 мкг/мл ІМТ-МРНК контролю есЕР, спільно інкубували із клітинами-мішенями МидС4. Через 48 год клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ, анти-СО69-АРС і йодидом пропідію (РІ) для фарбування живих і загиблих клітин, і аналізували за допомогою проточної цитометрії. (А) показує процентний вміст позитивно пофарбованих цитотоксичних людських Т-клітин. В (В) показано процентний вміст загиблих (РІ") клітин-мішеней, нормалізованих до референсного зразка. Усі величини визначали за допомогою програмного забезпечення Ріом/о. контр означає контрольний; ІМТ; іп міго транскрибовані; мРНК, месенджер РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 28. СІ ОМ18.2-негативні клітини-мішені, трансфіковані ІМТ-мРНК 1ВіМАВ, не є лізованими Т-клітинами
СІ ОМ18.2-негативна лінія клітин РА-1, стабільно експресуюча люциферазу, служила як лінія клітин-мішеней. 5 х 105 клітин РА-Йис трансфікували шляхом електропорації ІМТ-мРНК у загальній кількості 40 мкг/мл. Як позитивний контроль трансфікували 4 і 40 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВІМАВ або бКНИЗ, що направлено впливає на СІ ОМб, що ендогенно експресується. Як Бі- 5сЕм-негативний контроль трансфікували 40 мкг/мл ІМТ-МРНК брі-5сЕм, що направлено впливає на неекспресований ТАА (- контр). Цей ІМТ-МРНК служив також як наповнення РНК в 4 мкг/мл зразків ІМТ-МРНК (4 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВІМАВ, 4 мкг/мл ІМТ-МРНК 6КНИЗ). Включені контрольні зразки білків, що містять 1ВІМАВ і б6РНИЗ у комбінації з бБрі-єсЕм-негативним контролем, трансфіковані клітинами РА-ІЛис і ефекторними клітинами.
Трансфіковані клітини-мішені засівали з людськими цитотоксичними Т-клітинами (пан-Т-
Зо клітини) у співвідношенні ефектора й мішені 5:1. Усі зразки засівали в трьох повторностях в 96- лунковому форматі й спільно інкубували протягом 72 год. Як контроль мінімального лізису (І піп) кожний індивідуальний зразок трансфікованих клітин-мішеней засівали без ефекторних клітин.
Максимальний лізис (птах) для нормалізації стосовно числа імпульсів спонтанної люмінесценції досягався шляхом додавання Тийоп Х-100 у контрольні лунки, що містять ефекторні клітини й неопрацьовані клітини-мішені (І пах) або тільки неопрацьовані клітини-мішені (І пахг) перед додаванням люциферину. Через 30 хв. після додавання розчину люциферину люмінесценцію вимірювали на мікропланшетному рідері Іп'їпйе М200 Тесап. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 95 специфічний лізис - |! - (люмінесценція тестований зразок - Ї тах
ІІ піп тестований зразок - Ї тахг)| х 100. контр означає контроль; ІМТ; іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК.
Фіг. 29. Підтвердження продукції 1ВІМАВ клітинами ссавців, трансфікованими ІМТ-мРНК бі- 5СЕм або - репліконом РНК (А) 5 х 106 клітин ВН 21 тимчасово трансфікували шляхом електропорації 40 мкг/мл ІМТ-
МРНК 1ВіМАВ або -репліконом РНК. Як імітуючий контроль клітини електропорували без РНК.
Через 18 год після трансфекції супернатант і клітини збирали. Клітини лізували й супернатанти піддавали - 50-кратному концентруванню. Неопрацьовані й концентровані супернатанти аналізували за допомогою ЕЇГІ5БА з використанням стовпчиків Мі-МТА, анти-спСіІ ОМ18.2ар ідіотипічного МАВ і вторинного АР-кон'югованого антитіла. Очищений білок 1ВІМАВ у ряді розведень від 2,3 до 37,5 нг/мл з 2 кроками використовували як стандарт. (В) Концентрований супернатант, клітинні лізати (А) і 0,1 мкг очищеного білка 1ВІМАВ як позитивний контроль розділялли за допомогою 505-РАСЕ.Вестерн-блот аналіз виконували з первинним моноклональним анти-Ніз і вторинним анти-мишачим антитілом, кон'югованим з пероксидазою. (С) 5 х 106 клітин ВНК21 тимчасово трансфікували шляхом електропорації 40 мкг/мл 1ВІМАВ або ІМТ-МРНК по.25. Як імітуючий контроль клітини піддавали електропорації без РНК. Через 48 год після трансфекції супернатант збирали й піддавали 40-кратному концентруванню. 5М і 0,1 мкг очищеного білка 1ВІМАВ як позитивний контроль розділяли за допомогою 5ЗЮО5-РАСЕ.
Вестерн-блот аналіз виконували з первинним моноклональним анти-Ніхє і вторинним антимишачим антитілом, кон'югованим з пероксидазою. Контр означає контроль; МАВ, моноклональне антитіло; 5М, супернатант; УУВ, Вестерн-блотинг. бо Фіг. 30. Ін'єкція ІМТ-МРНК 1ВіМАВ рі-5сЕм або - реплікона РНК приводить до іп мімо продукції й молекул 1ВІМАВ рі-5сЕм, що виявляються у мишей 10 мкг ІМТ-МРНК 1ВіМАВ з ІМТ-мРНК ЕВК або без нього, або 10 мкг ІМТ-реплікона 1ВІМАВ ін'єктували внутрішньом'язово (ІМ) мишам М5О. Сироватку із крові, зібраної на 2, 4 і 7 дні після ін'єкції застосовували в аналізі на цитотоксичність іп мійго. СІОМ18.2 і стабільно, які експресують люциферазу МидсС4-Ї МТ-СІ ОМ18.2Лис, клітини-мішені спільно інкубували з людськими Т-клітинами в співвідношенні Е:Т, рівному 30:1, з 20 мкл зразка сироватки протягом 48 год. Стандартний контрольний білок 1ВІМАВ, І піп і лах містили 20 мкл сироватки М5О. ЕВК означає суміш білків вірусу осповакцини ЕЗ, В-І 8К, КЗ; ІМ, внутрішньом'язово.
Фіг. 31. Схематична ілюстрація молекул ІМТ-РНК, що кодують антитіла бБі-5сЕм, що направлено впливають на СІ ОМб ТАА.
Схема іп міго транскрибованих послідовностей РНК, що кодують анти-СІ ОМб антитіл бі- 5СЕм. (А) ІМТ мРНК в о 5- і 3- положенні щодо варіабельних областей анти-ТАА. (В) альфавірусний ІМТ-реплікон в 3'-положенні щодо варіабельних областей анти-ТАА. Області МН і
МІ анти-СІОМб створювали на основі послідовності моноклонального антитіла СІОМб (тс ОМбаб). "Кеп" однаково використовується для АКСА, бета-5-АКСА (01) або бета-5-АНСА (02). Області МН їі МІ анти-СОЗ створювали на основі послідовності моноклонального СОЗ антитіла ТК6б. А означає аденін; Бі-5сЕм, біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; пАд, людський альфа-глобін 5-ОТК; пВо, людський бета-глобін 3-ОТА; Нів, гістидинова мітка, що містить шість залишків гістидину; ІМТ, іп міго транскрибований; ГІЇ, довгий лінкер (15-18 амінокислот); п5Рі-4, неструктурні білки 1-4; бБес, сигнал секреції; 5оР, субгеномний промотор; 5, короткий лінкер (5-6 амінокислот); ТАА, пухлиноасоційований антиген; ОТЕ, нетрансльована область; М, варіабельна область важкого (Н) і легкого (І) ланцюга антитіла.
Фіг. 32. Спільна інкубація клітин-мішеней, трансфікованих анти-СІ ОМб6 ІМТ-мРНК бі-5сЕм, з людськими Т-клітинами приводить до утворення кластерів Т-клітин.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІОМб, тимчасово трансфікували шляхом електропорації 20 мкг/мл ІМТ-МРНК бКНиИ5 або 6КНИиЗ і спільно інкубували з людськими Т- клітинами (пан-Т-клітини) у співвідношенні ефектора до мішені 5:1 в б-лункових планшетах. Як негативний контрольний зразок використовували клітини-мішені РА-1, трансфіковані ІМТ-МРНК
Зо рі-зєсЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА (- контр), спільно інкубовані з людськими Т-клітинами (верхній ряд, фото ліворуч). У середньому ряді показані неопрацьовані клітини РА-1 і людські Т-клітини без білка як негативного контролю (контроль, що імітує, фото ліворуч), або з 50 мкг/мл очищених анти-СЇОМб білків б6РНО5 (у середині) або б6РНОЗ (праворуч) Бі-5сЕм як позитивні контролі. У нижньому ряді показані неопрацьовані клітини РА-1 (ліворуч) і тільки людські Т-клітини (праворуч). Через 24 год спільної інкубації робили знімки зразків за допомогою мікроскопа Мікоп Есіїрзе Ті при збільшенні 200х. Білі стрілки вказують на
Т-клітинні кластери на клітинах-мішенях. Ві-єсЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; контр, контрольний; пи, людський; ІМТ, іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 33. Ефект орієнтації доменів на ефективність: трансфекція клітин-мішеней анти-СЇ ОМб б6АНОЗ рі-єсЕм приводить до більш високого процентного вмісту активованих Т-клітин у порівнянні з БКНО5.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СіІОМб, тимчасово трансфікували двома варіантами Бі--сєм 6КНИ5 і бКЕНИЗ, спрямованими проти СІ ОМб і СОЗ для порівняння їх активності в аналізі активації Т-клітин. Для кожного варіанта 5 х 105 клітин РА-1 піддавали електропорації 20 мкг/мл ІМТ-МРНК. Трансфіковані клітини-мішені повторно підраховували, 1 х 105 клітин засівали в кожний б-лунковий планшет і інкубували з людськими цитотоксичними Т- клітинами (вибрані Т-клітини СО8:") у співвідношенні Е:Т, рівному 5:1. Як негативні контролі вибирали неопрацьовані клітини-мішені (пи ТІ - неопрацьовані РА-1) і клітини-мішені, трансфіковані ІМТ-МРНК бБі-5сЕм, спрямованим на неекспресований ТАА (пи ТІ. ж РА-1 - контр).
Білок ЄРНИ5 служив як позитивний контроль в концентрації 50 нг/мл (пи ТІ. -- РА-1 білок контр).
Крім того, Т-клітини засівали без клітин-мішеней з білюоом бРНИ5 і без нього як референсну фонову активацію. Кожний зразок засівали у двох повторностях. Аналіз виконували через 24 год і 48 год: Т-клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ, анти-СО69-АРС і 7-ААО для фарбування живих і загиблих клітин і аналізували за допомогою проточної цитометрії. ТАА- залежну Бі--єсЕм-опосередковану активацію Т-клітин спостерігали в обох варіантах анти-СІ ОМб рі-зсЕм через 24 год (А) і 48 год (В) спільної інкубації. Трансфекція БКНОЗ Бі-5сЕм викликала приблизно на 20 95 більш високу активацію Т-клітин в обидва моменти часу. Ві-з-сЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; Контр, контрольний; пи, людський; ІМТ, 60 іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 34. Секреція БКНООЗ опосередковує Т-клітинну активацію залежним від концентрації чином.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІОМб, тимчасово трансфікували шляхом електропорації ІМТ-мМРНК у загальній кількості 20 мкг/мл, що включає 0,2-20 мкг/мл ІМТ-МРНК бКНИЗ плюс відповідні кількості ІМТ-МРНК рі-5сЕм, що направлено впливає на неекспресований
ТАА. Трансфекція 20 мкг/мл ІМТ-мМРНК бБі-5сЕм, що направлено впливає на неекспресований
ТАА (0.0 мкг/мл ІМТ-МРНК бКНИЗ), служила як контроль специфічності. Трансфіковані клітини- мішені спільно інкубували з людськими цитотоксичними Т-клітинами (пан-Т-клітинами) у співвідношенні ефектора до мішені 5:11 в б-лункових планшетах у двох повторностях. як референсну активацію Т-клітин тільки людські Т-клітини вирощували без білка ЄБРНО5 (пи ТІ. -) або з білюм 6ЄРНИО5 (пи Ті білковий контр). Як негативний контроль Т-клітини спільно інкубували з неопрацьованими клітинами-мішенями РА-1 (пи ТІ ж- РА-1 - Контр). Білок ЄБРНО5 служив як позитивний контроль в концентрації 50 нг/мл (пи ТІ. ж РА-1 білковий контр). Через 48 год Т-клітини збирали й мітили анти-СОЗ3-РІТС, анти-СО25-РЕ і анти-СО69-АРС і аналізували за допомогою проточної цитометрії. На графіках показаний процентний вміст позитивно пофарбованих людських Т-клітин, визначених за допомогою програмного забезпечення РіІом/о.
Ві-5сЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; контр, контрольний;
Пи, людський; ІМТ, іп міго транскрибований; мРНК, месенджер РНК; ТІ, Т-лімфоцит.
Фіг. 35. Величина ЕС50О 6КНИиИЗ для специфічного лізису клітин-мішеней через 48 год склала приблизно 200 нг/мл.
Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІ ОМб, які стабільно експресують люциферазу, тимчасово трансфікували шляхом електропорації ІМТ-мРНК бБі-5сЕм у загальній концентрації 13,3 мкг/мл, що включає 0,004-13,3 мкг/мл бКНИЗ і відповідну кількість ІМТ-МРНК бі-5сЕм, що направлено впливає на неекспресований ТАА. Трансфіковані клітини-мішені засівали з людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені 5:1 у трьох повторностях в 96- лунковому форматі. Як контроль мінімального лізису (І лі) кожний індивідуальний зразок трансфікованих клітин-мішеней засівали без ефекторних клітин. Максимальний лізис (І птах) ДЛЯ нормалізації стосовно числа імпульсів спонтанної люмінесценції був досягнутий шляхом додавання Тгйоп Х-100 у контрольні лунки, що містять ефекторні клітини й неопрацьовані клітини-мішені, безпосередньо перед додаванням люциферину. Через 30 хв після додавання розчину люциферину люмінесценцію вимірювали на мікропланшетному рідері Іпїйпйе М200
Тесап через 24 год і 48 год. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 90 специфічного лізису ж и - (люмінесценція тестованого зразка - Ї тах) (Ї піп тестованого зразка -Ілах)| х 100.
Значення наносили на графік залежно від ІодіО концентрації БКНОЗ. Величини ЕС50О означають половину максимальної ефективної концентрації; Г.,, лізис.
Фіг. 36. Т-клітинна проліферація специфічно індукована у відповідь на секрецію бКНОЗ клітинами-мішенями в присутності СІ ОМб.
Людські Т-клітини фарбували СЕБЕ для аналізу. Т-клітини вирощували без клітин-мішеней (Т-клітини) у комбінації з 5 мкг/мл ОКТЗ і 2 мкг/мл «С028 як позитивний контроль активації (контр), з 5 нг/мл нетаргетного контрольного рі-всЕм (-контр білок) або з 5 нг/мл білка бБРНОЗ (білок 6РНИЗ).Т-клітини й клітини-мішені РА-1, які ендогенно експресують СІГОМб, разом інкубували (Т-клітини ж СІ ОМ б-позитивні клітини-мішені) без будь-чого (імітуючі) або з 5 нг/мл білка 6РНИЗ (білок 6РНИЗ). Для тестування ІМТ-МРНК клітини РА-1 трансфікували 20 мкг/мл
ІМІ-МРНК б6КНИОЗ (мРНК бКНИЗ) або ІМТ-мРНК бі-зсЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА (мРНК -контр), і інкубували з Т-клітинами. Крім того, клітини РА-1, трансфіковані ІМТ-мМРНК рі-5сЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА, поєднували з 5 нг/мл білюка ЄРНОЗ (мРНК -контр ї- білок ЄРНИЗ). Як додатковий контроль специфічності були включені зразки з лінією клітин-мішеней МОА-МВ-231, яка не еспресує
СІ ОМб, разом з Т-клітинами (Т-клітини ї- СІ ОМ б-негативні клітини-мішені). МОА-МВ-231 використовували неопрацьованими й інкубували без будь-чого (що імітує контроль), з 5 нг/мл контрольного білка рі-зеЕм (-контр білок) або 5 нг/мл білка ЄРНОИЗ (білок ЄРНИЗ), або МОА-МВ- 231 трансфікували 20 мкг/мл ІМТ-МРНК бКНИОЗ (мРНК бКНИиИЗ) або ІМТ-МРНК бі-5сЕм, що направлено впливають на неекспресований ТАА (-контр мРНК). Аналіз виконували в співвідношенні ефектора до мішені 5:1 в 96-лунковому планшеті, з кожним зразком у трьох повторностях і часом інкубації 72 год. Зменшення сигналу СЕЗЕ, що вказує на Т-клітинну проліферацію, аналізували за допомогою проточної цитометрії, розраховували за допомогою програмного забезпечення Ріоум/Ло і наносили на графік у вигляді 96 проліферуючих Т-клітин.
СЕБЕ означає складний ефір сукцинімідилу й карбоксифлуоресцеїну; ІМТ, іп мйго транскрибований; мРНК, месенджер РНК. бо Фіг. 37. Підтвердження бКНИЗ трансляції клітинами ссавців, трансфікованими ІМТ-мРНК бі-
5СЕм або - репліконом РНК. (А) 5 х 106 клітин ВНК21 тимчасово трансфікували шляхом електропорації 40 мкг/мл ІМТ-
МРНК бКНИЗ або -реплікона РНК. Трансфекція 40 мкг/мл ІМТ-МРНК по.25 була включена як додатковий зразок. Як імітуючий контроль клітини піддавали електропорації без РНК. Через 18 год після трансфекції супернатант і клітини збирали. Клітини лізували й супернатанти піддавали
Б50-кратному концентруванню. Неопрацьовані й концентровані супернатанти аналізували за допомогою ЕГІБА з використанням стовпчиків Мі-МТА, анти-тСі ОМбар ідіотипічного МАВ і вторинного АР-кон'югованого антитіла. Очищений білок ЄРНОИЗ у розведенні від 2,3 до 150 нг/мл за 2 кроки використовували як стандарт. (В) Концентрований супернатант і клітинні лізати (А) і 0,1 мкг очищеного білка 6РНОЗ як позитивний контроль розділяли за допомогою 50О5-РАСЕ.
Вестерн-блот аналіз виконували з первинним моноклональним анти-Ніхє і вторинним антимишачим антитілом, кон'югованим з пероксидазою. (С) 5х105 клітин ВНК21 тимчасово трансфікували шляхом електропорації 40 мкг/мл бКНИЗ або ІМТ-мМРНК по.25. Як імітуючий контроль клітини піддавали електропорації без РНК. Через 48 год після трансфекції супернатант збирали й піддавали 40-кратному концентруванню. ЗМ і 0,1 мкг очищеного білка бРНИЗ як позитивний контроль розділяли за допомогою 505-РАСЕ. Вестерн-блот аналіз виконували з первинним моноклональним анти-Ніз і вторинним антимишачим антитілом, кон'югованим з пероксидазою. Контр означає контрольні; МАВ, моноклональне антитіло; 5М, супернатант; МВ, Вестерн-блотинг.
Фіг. 38. Ін'єкція ІМТ-МРНК бКНИОЗ Бі-5сЕм або - реплікона РНК приводить до іп мімо трансляції й молекул Бі-5сЕм, що детектуються у мишей. 10 мкг ІМТ-МРНК бКНИиЗ з ІМТ-МРНК ЕВК або без нього або 10 мкг ІМТ-реплікона бБЕНОЗ ін'єктували ІМ мишам М5О. Сироватку крові, зібраної через 7 днів після ін'єкції, застосовували в аналізі на цитотоксичність іп міго.Клітини-мішені РА-ІЛис, які ендогенно експресують СІ ОМб і які стабільно експресують люциферазу, спільно інкубували з людськими Т-клітинами в співвідношенні ЕТ, рівному 30:11, з 20 мкл зразка сироватки протягом 48 год. Стандартний контрольний білок ЄРНИЗ, І піп і Ї тах, яЯкИЙ містить 20 мкл імітуючої сироватки МО. ЕВК означає суміш білків вірусу осповакцини ЕЗ, В-18К, КЗ; ІМ, внутрішньом'язово.
Фіг. 39. Результати аналізу на цитотоксичність анти-СІ ОМ18.2 білків Бі-5СЕмМ, що містять
Зо анти-СОЗ з'єднувальний домен 5сЕм у С-кінцевій частині білка.
Варіанти рі-з5сЕм, спрямовані проти СІ ОМ18.2 ії СОЗ, тимчасово експресували в клітинах
СНО і очищали полімером Ргоїевіп-І/. для порівняння їх сили в аналізі на цитотоксичність. Клітини
МидсС4, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2, які стабільно експресують люциферазу, були використані як клітини-мішені. Людські Т-клітини й клітини-мішені інкубували в співвідношенні
Е:Т, рівному 5:1, з 5000, 1000, 200 їі 40 нг/мл кожного з білків Бі-з-сЕм в 96-лунковому форматі.
Кожний тестований зразок висівали в трикратному повторенні, контрольний зразок для І піп висівали в трикратному повторенні. Тривалість спільної інкубації перед аналізом склала 24 год і 48 год. Після додавання розчину люциферину в задані моменти часу люмінесценцію вимірювали на рідері Іпїпіе М200 ТЕСАМ. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували для кожної концентрації й записували. а. Варіабельні домени анти-СОЗ розташовані в порядку доменів МН - МІ і розділені пептидним лінкером Г Г.4. р. Варіабельні домени анти-СОЗ розташовані в порядку доменів МН - МІ і розділені пептидним лінкером 4. Анти-СОЗ 5сЕм містить сполучний дисульфідний місток між доменами
МН і мг. с. Варіабельні домени анти-СОЗ розташовані в порядку МІ - МН і розділені пептидним лінкером Г І.5. а. Варіабельні домени анти-СОЗ розташовані в порядку МІ - МН їі розділені пептидним лінкером Г5. Анти-СОЗ 5сЕм містить сполучний дисульфідний місток між доменами МІ. і МН.
Фіг. 40. Внутрішньоаналітичне порівняння величин ЕС5О0, отриманих в аналізі на цитотоксичність на основі люциферази з використанням анти-СІ ОМб білків Бі-всгУ.
Аналізи на цитотоксичність на основі люоциферази виконували за допомогою трьох різних донорів для Т-клітинного препарату. Величини ЕС5О, розраховані з використанням 6 тестованих анти-СІ ОМб білків Бі-5сЕм через 24 год і 48 год інкубації представлені для кожного незалежного аналізу (А, В і С). Клітини РА-1, які ендогенно експресують СІ ОМб, інкубували протягом 24 год і 48 год з наростаючими концентраціями (0,025-50000 нг/мл для А і В, 0,0025-5000 нг/мл для С) анти-СІ ОМб білків Бі-5сЕм і людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора й мішені 5:1 у трьох повторностях в 9б-лунковому форматі. Як контроль мінімального лізису (І піп) ефекторні клітини й клітини-мішені висівали без білків Бі-5сЕм. Максимальний лізис (І пах) для нормалізації 60 відносно числа імпульсів спонтанної люмінесценції досягався шляхом додавання Тгйоп Х-100 у контрольні лунки, що містять ефекторні клітини й клітини-мішені під час відсутності Бі-бсЕм безпосередньо перед додаванням люциферину. Через 30 хв. після додавання розчину люциферину люмінесценцію вимірювали на мікропланшетному рідері Іпіїпйе М200 Тесап через 24 год і 48 год інкубації клітин-мішеней і ефекторних клітин. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 95 специфічний лізис - (1 - (люмінесценція тестований зразок - І тах). / (Сліп - Ї лах)) х 100.-ЕС50 означає половину максимальної ефективної концентрації; І, лізис; МА, немає даних.
Докладний опис винаходу
Хоча даний винахід описаний докладно далі, слід розуміти, що даний винахід не обмежується конкретними методиками, протоколами й реагентами, описаними тут, тому що зазначені методики, протоколи й реагенти можуть змінюватися. Також, слід розуміти, що термінологія, використовувана тут, призначена тільки для опису конкретних варіантів здійснення й не призначена для обмеження обсягу даного винаходу, який може бути обмежений тільки прикладеними пунктами формули винаходу. Якщо не зазначене інше, усі технічні й наукові терміни, використовувані тут, мають такі ж значення, як звичайно розуміється фахівцями в даній області.
Далі будуть описані елементи даного винаходу. Ці елементи перераховані разом з певними варіантами здійснення, однак, слід розуміти, що вони можуть бути об'єднані будь-яким способом і в будь-якій кількості для створення додаткових варіантів здійснення. Різні описані приклади й кращі варіанти здійснення не повинні розглядатися як обмежуючі обсяг даного винаходу тільки конкретно описаними варіантами здійснення. Слід розуміти, що даний опис служить підтримкою й охоплює варіанти здійснення, які поєднують чітко описані варіанти здійснення з будь-яким числом розкритих і/або кращих елементів. Крім того, будь-які перестановки й комбінації всіх описаних елементів у даній заявці будуть уважатися розкритими за допомогою опису за даною заявкою, якщо контекст не вказує на інше.
Переважно, терміни, використовувані тут, визначені, як описано в «А тишііпдиаї! діоб5загу ої
Біотесппоодіса! Тегте: (ОРАС Кесоттепааїйопв5)», Н.С.МУ. ецепрегдег, В. Мадеї, і Н. Коїбі, Еаз5.,
Неїмеїса Спітіса Асіа, СН-4010 Вазеї, Зм/йгепапа, (1995).
Якщо не зазначене інше, здійснення даного винаходу буде передбачати використання стандартних методів хімії, біохімії, клітинної біології, імунології й методів рекомбінантних ДНК, описаних у літературі в даній області (дивися, наприклад, МоїІесшіаг Сіопіпд: А І арогайгу
Мапиаї!, 279 Едайоп, У. батргоок еї аї. едв., Соїй брііпуд Натог І арогаїогу Ргез5, Соїй бріїпу
Нарог 1989).
У всьому даному описі й прикладеній формулі винаходу, якщо контекст не вимагає іншого, слово «містити» і його варіації, такі як «містить» і «містячий», будуть розумітися як включення зазначеного елемента, цілого числа або стадії, або груп елементів, цілих чисел або стадій, але не як виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або груп елементів, цілих чисел або стадій, хоча в деяких варіантах здійснення такий інший елемент, ціле число або стадія, або групи елементів, цілих чисел або стадій можуть бути виключені, тобто об'єкт винаходу полягає у включенні зазначеного елемента, цілого числа або стадії, або груп елементів, цілих чисел або стадій. Використання однини в контексті опису винаходу (особливо в контексті прикладеної формули винаходу) повинне витлумачуватися так, щоб охоплювати і однину й множину, якщо інше не зазначене в даному документі або явно суперечить контексту.
Перерахування діапазонів значень у даному документі призначене тільки для того, щоб воно служило способом скорочення для зазначення кожного окремого значення, що попадає в діапазон. Якщо не зазначене інше, кожне окреме значення включається в технічний опис так, ніби воно було окремо перераховане в даному документі. Усі способи, описані в даному документі, можуть бути виконані в будь-якому належному порядку, якщо інше не зазначене в даному документі або явно спростовується контекстом. Використання будь-якого або всіх прикладів, або мова зразків (наприклад, «такий як»), представлена у даному документі, призначена тільки для кращого роз'яснення винаходу, і не накладає ніяких обмежень на область застосування винаходу, якщо не заявлене інше. Ніяка мова в даному описі не повинна витлумачуватися, як така, що вказує який-небудь незаявлений у формулі винаходу елемент як найважливіший для здійснення винаходу.
У даному описі цитуються деякі документи. Кожний з документів, процитованих тут (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, специфікації виробника, інструкції і т.д.), вище або нижче, уведені тут посиланнями у всій повноті. Ніщо тут не повинне бути витлумачене як визнання того, що винахідник не має права датувати винахід більш раннім числом, внаслідок більш ранньої дати створення винаходу (апієдаїе). 60 Клаудини являють собою сімейство білків, які є найбільш важливими компонентами щільних контактів, де вони встановлюють параклітинний бар'єр, який контролює потоки молекул у міжклітинному просторі між клітинами епітелію. Клаудини являють собою трансмембранні білки, що чотирикратно перетинають клітинну мембрану, при цьому обидва кінці, М-кінець і С-кінець, розташовані в цитоплазмі. Перша позаклітинна петля, названа ЕСІ або ЕСІ1, складається в середньому з 53 амінокислот, і друга позаклітинна петля, названа ЕС2 або ЕСІ2, складається приблизно з 24 амінокислот. Білки клітинної поверхні сімейства клаудина, такі як СІ ОМ і
СІ ОМ18.2, експресуються в пухлинах різного походження, і є особливо придатними як структури-мішені в опосередкованій антитілами імунотерапії раку завдяки їхній селективній експресії (експресія відсутня в нормальних тканинах, значимих з погляду токсичності) і локалізації в плазмовій мембрані.
У контексті даного винаходу кращі клаудини являють собою СІ ОМб і СІ ОМ18.2. СІ ОМб і
СІ ОМ18.2 були ідентифіковані як такі, що диференційно експресуються в пухлинних тканинах, при цьому єдиними нормальними тканинами, експресуючими СІ ОМ18.2, є шлунок, і єдиною нормальною тканиною, яка еспресує СІ ОМб, є плацента.
СІ ОМ18.2 селективно експресується в нормальних тканинах у диференційованих клітинах епітелію слизової оболонки шлунка. СІ ОМ18.2 експресується в раку різного походження, такому як карцинома підшлункової залози, карцинома стравоходу, карцинома шлунка, бронхіальна карцинома, карцинома молочної залози й пухлини ЛОР-органів. СІ ОМ18.2 є цінною мішенню для попередження й/або лікування первинних пухлин, таких як рак шлунка, рак стравоходу, рак підшлункової залози, рак легені, такий як недрібноклітинний рак легені (МЗСІ С), рак яєчника, рак товстої кишки, рак печінки, рак голови й шиї, і рак жовчного міхура, і їх метастазів, зокрема, метастазів раку шлунка, таких як пухлини Крукенберга, перитонеальних метастазів і метастазів у лімфовузли.
Було виявлено, що СІ ОМб експресується, наприклад, у раку яєчника, раку легені, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, мелономі, раку голови й шиї, саркомі, раку жовчних проток, нирково-клітинному раку й раку сечового міхура. СІ ОМб є особливо кращою мішенню для попередження й/або лікування раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника й тератокарциноми яєчника; раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легені (ЗСІС) і недрібноклітинний рак легені (МЗС С), зокрема
Зо плоскоклітинний рак легені й аденокарциному; раку шлунка; раку молочної залози; раку печінки; раку підшлункової залози; раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми; злоякісної меланоми; раку голови й шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми; саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми; раку жовчної протоки; раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми й папілярного раку; раку нирки, зокрема плоскоклітинного рака, включаючи світлоклітинний рак нирки й папілярну карциному нирки; раку товстої кишки; раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарцдиноми тонкої кишки й аденокарциноми клубової кишки; ембріональної карциноми яєчка; плацентарної хоріокарциноми; раку шийки матки; раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка; раку матки; герміноми, такої як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка і їх метастатичних форм. В одному варіанті здійснення ракові захворювання, асоційовані з експресією СІ ОМб, вибрані із групи, яка складається з раку яєчників, раку легені, метастатичного раку яєчників і метастатичного раку легені. Переважно, рак яєчника є карциномою або аденокарциномою. Переважно, раком легені є карцинома або аденокарцинома, і переважно є бронхіолярний рак, такий як бронхіолярна карцинома або бронхіолярна аденокарцинома.
Термін «СІ ОМ», використовуваний тут, означає клаудин і включає СІ ОМ18.2 їі СІ ОЮМб.
Переважно, клаудин є клаудином людини.
Термін «СІ ОМ18» належить до клаудина 18 і включає будь-які варіанти, включаючи сплайсований варіант 1 клаудина 18 (клаудин 18.1 (СІ ОМ18.1)) і сплайсований варіант 2 клаудина 18 (клаудин 18.2 (СІ ОМ 18.2)).
Термін «СІ 0ОМ18.2» переважно належить до СІ ОМ18.2 людини й, зокрема, до білка, що складається з амінокислотної послідовності згідно з «ЕО ІЮ МО: 1 переліку послідовностей або варіанта зазначеної амінокислотної послідовності. Перша позаклітинна петля СІОМ18.2 переважно містить амінокислоти з 27 по 81, більш переважно амінокислоти з 29 по 78 амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 1. Друга позаклітинна петля
СІ ОМ18.2 переважно містить амінокислоти з 140 по 180 амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІО МО: 1. Зазначені перша й друга позаклітинні петлі переважно утворюють позаклітинну частину СІ ОМ18.2.
Термін «СІ ОМб» переважно належить до СІіОМб людини й, зокрема, до білка, що, 60 переважно, складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІО МО: З переліку послідовностей або варіанта зазначеної амінокислотної послідовності. Перша позаклітинна петля СІ ОМб переважно містить амінокислоти з 28 по 80, більш переважно, амінокислоти з 28 по 76 амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 2, або амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 3. Друга позаклітинна петля СІ 0ОМб переважно містить амінокислоти з 138 по 160, переважно, амінокислоти з 141 по 159, більш переважно, амінокислоти з 145 по 157 амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ
МО: 2, або амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 3. Зазначені перша й друга позаклітинні петлі, переважно, утворюють позаклітинну частину СІ ОМб.
Термін «варіант» відповідно до винаходу належить, зокрема, до мутантів, сплайсованих варіантів, конформацій, ізоформ, алельних варіантів, варіантів різновидів і гомологів різновидів, зокрема таких, які присутні природним шляхом. Алельний варіант належить до альтерації нормальної послідовності гена, значення якої часто буває неясним. Повне секвенування гена часто дозволяє ідентифікувати численні алельні варіанти заданого гена. Гомологом різновидів є нуклеїнова кислота або амінокислотна послідовність із різновидами, що мають походження, яке відрізняється від походження заданої нуклеїнової кислоти або амінокислотної послідовності.
Термін «варіант» охоплює будь-які посттрансляційно модифіковані варіанти й конформаційні варіанти.
Другою молекулою-мішенню для з'єднувальних агентів, описаних тут, є кластер клітинного диференціювання СОЗ (Сіивїег ої ЮОШегепіаєнйоп 3). Комплекс СОЗ позначає антиген, який експресується на зрілих людських Т-клітинах, тимоцитах і субпопуляції природних клітин- кілерів, як частина мультимолекулярного комплексу Т-клітинного рецептора (ТСК). Т-клітинний корецептор є білюювим комплексом і складається із чотирьох різних ланцюгів. У ссавців комплекс містить ланцюг СОЗу, ланцюг СОЗ5б і два ланцюги СОЗє. Ці ланцюги пов'язані з молекулою, відомою як Т-клітинний рецептор (ТСК) і б-ланцюгом для генерації сигналу активації в Т-лімфоцитах. Разом, ТОК, с-ланцюг і молекули СОЗ утворюють ТОК комплекс.
Амінокислотна послідовність СО З-епсилон людини описана в СепрапкК під реєстраційним номером ММ 000733 ї містить БЕО ІЮ МО: 4. Амінокислотна послідовність СО 3-гамма людини описана в сСепрапкК під реєстраційним номером ММ 000073. Амінокислотна послідовність СО 3- дельта людини описана в СепрапкК під реєстраційним номером ММ 000732. СОЗ відповідає за трансдукцію сигналу ТОК. Як описано в іп і УуУеїз5, Уошигпаї ої СеїЇ Зсіепсе 114, 243-244 (2001), активація ТОК комплексу шляхом зв'язування МНС-презентованих специфічних епітопів антигенів приводить до фосфорилювання імунорецепторних тирозинових мотивів, що активують (ІТАМ) кіназами 5го-сімейства, запускаючи рекрутинг інших кіназ, що приводить до Т- клітинної активації, включаючи вивільнення Саг-. Утворення кластерів СОЗ на Т-клітинах, наприклад шляхом іммобілізації анти-СО З-антитіл, приводить до Т-клітинної активації, аналогічній активації Т-клітинного рецептора, але яка не залежить від типової для цього клону специфічності.
Використовуваний тут термін «СОЗ» включає СОЗ людини й позначає антиген, який експресується на людських Т-клітинах як частина мультимолекулярного комплексу Т-клітинного рецептора.
Відносно СОЗ зв'язуючий агент за винаходом переважно розпізнає епсилон-ланцюг СОЗ, зокрема, він розпізнає епітоп, який відповідає першим 27 М-кінцевим амінокислотам СО3- епсилон або функціональним фрагментам цього подовження з 27 амінокислот.
Відповідно до винаходу, термін «клаудин-позитивний рак», або аналогічні терміни, означає рак, у який залучені ракові клітини, які експресують клаудин, переважно на поверхні зазначених ракових клітин. «Клітинна поверхня» використовується відповідно до її звичайного значення в даній області й, таким чином, включає зовнішню частину клітини, яка є доступною для зв'язування білками й іншими молекулами.
Клаудин експресується на клітинній поверхні, якщо він розташований на поверхні зазначених клітин і є доступним для зв'язування клаудин-специфічними антитілами, доданими в клітини.
Термін «позаклітинна частина» у контексті даного винаходу належить до частини молекули, такої як білок, яка звернена до позаклітинного простору клітини й, переважно, є доступною зовні зазначеної клітини, наприклад, для антигензв'язуючих молекул, таких як антитіла, локалізовані зовні клітини. Переважно, термін належить до однієї або більше позаклітинних петель або доменів, або їх фрагментів.
Термін «частина» або «фрагмент» використовуються тут взаємозамінно й належать до безперервного елемента. Наприклад, частина структури, такої як амінокислотна послідовність 60 або білок, належить до безперервного елемента зазначеної структури. Ділянка, частина або фрагмент структури, переважно, має одну або декілька функціональних властивостей зазначеної структури. Наприклад, ділянка, частина або фрагмент епітопу або пептиду є, переважно, імунологічно еквівалентною епітопу або пептиду, з якого вона походить. Частина або фрагмент білкової послідовності, переважно, містить послідовність, що складається щонайменше з 6, зокрема щонайменше з 8, щонайменше з 12, щонайменше з 15, щонайменше 3 20, щонайменше з 30, щонайменше з 50 або щонайменше з 100 послідовних амінокислот білкової послідовності.
Відповідно до винаходу СІ ОМ18.2 значно не експресується в клітині, якщо рівень експресії нижче в порівнянні з експресією в клітинах шлунка або тканини шлунка. Переважно, рівень експресії становить менш 10 95, переважно менше 5 95, З 95, 2 905, 1 95, 0,5 95, 0,1 9о або 0,0595, або навіть нижче, від експресії в клітинах шлунка або тканини шлунка. Переважно, СІ ОМ18.2 в основному не експресується в клітині, якщо рівень експресії перевищує рівень експресії в нераковій тканині, відмінної від шлунка, не більш ніж в 2 рази, переважно в 1,5 рази й, переважно, не перевищує рівень експресії в зазначеній нераковій тканині. Переважно,
СІ ОМ18.2 в основному не експресується в клітині, якщо рівень експресії нижче межі виявлення й/або якщо рівень експресії є занадто низьким для того, щоб забезпечити зв'язування
СІ ОМ18.2-специфічними антитілами, доданими в клітини.
Відповідно до винаходу, СІ ОМ18.2 експресується в клітині, якщо рівень експресії перевищує рівень експресії в нераковій тканині, відмінної від шлунка, переважно, більш ніж в 2 рази, переважно в 10 разів, 100 разів, 1000 разів. Переважно, СІ ОМ18.2 експресується в клітині, якщо рівень експресії вище межі виявлення й/або якщо рівень експресії є досить високим для забезпечення зв'язування СІ ЮОМ18.2-специфічними антитілами, доданим у клітини. Переважно,
СІ ОМ18.2, який експресуєтьсяся в клітині, експресується або експонується на поверхні зазначеної клітини.
Відповідно до винаходу, СІ ОМб в основному не експресується в клітині, якщо рівень експресії нижче в порівнянні з експресією в клітинах плаценти або тканини плаценти.
Переважно, рівень експресії становить менше 10 95, переважно менше 5 95, З 95, 2 905, 1 905, 0,5
Фо, 0,1 У або 0,05 95, або навіть нижче, від експресії в клітинах плаценти або тканини плаценти.
Переважно, СІ ОМб в основному не експресується в клітині, якщо рівень експресії перевищує
Зо рівень експресії в нераковій тканині, відмінної від плаценти, не більш ніж в 2 рази, переважно в 1,5 рази, і переважно, не перевищує рівень експресії в зазначеній нераковій тканині.
Переважно, СІ ОМб в основному не експресується в клітині, якщо рівень експресії нижче межі виявлення й/або рівень експресії є занадто низьким для забезпечення зв'язування СІ ОМ 6- специфічними антитілами, доданими в клітини.
Відповідно до винаходу СІ ОМб експресується в клітині, якщо рівень експресії перевищує рівень експресії в нераковій тканині, відмінної від плаценти, переважно, більш ніж 2 рази, переважно в 10 разів, 100 разів, 1000 разів або 10000 разів. Переважно, СІ ОМб експресується в клітині, якщо рівень експресії вище межі виявлення й/або якщо рівень експресії є досить високим для забезпечення зв'язування СІ ОМ б-специфічними антитілами, доданими в клітини.
Переважно, СІ ОМб, який експресується в клітині, експресується або експонується на поверхні зазначеної клітини.
Відповідно до винаходу термін «захворювання» належить до будь-якого патологічного стану, включаючи рак, зокрема, таких форм раку, які описані в даному документі. Будь-яке посилання в даному документі на рак або конкретні форми раку також включає метастази зазначеного раку. У кращому варіанті здійснення захворювання, що підлягає лікуванню відповідно до даного винаходу, включає клітини, які експресують клаудин (СІ ОМ), такі як
СІ ОМ18.2 і/або СІ ЮМб. «Захворювання, асоційоване із клітинами, експресуючими Сі ОМ» або подібні експресії означає відповідно до винаходу, що СІ ОМ експресується в клітинах хворої тканини або органа.
В одному варіанті здійснення експресія СІОМ у клітинах хворої тканини або органа є збільшеною в порівнянні зі станом у здоровій тканині або органі. Збільшення належить до збільшення щонайменше на 10 956, зокрема щонайменше на 20 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 100 95, щонайменше на 200 95, щонайменше на 500 95, щонайменше на 1000
Фо, щонайменше на 10000 95, або навіть більше. В одному варіанті здійснення експресія виявляється тільки у хворої тканини, тоді як експресія в здоровій тканині є подавленою.
Відповідно до винаходу, захворювання, асоційовані із клітинами, експресуючими СІ ОМ, включають ракові захворювання. Крім того, відповідно до винаходу ракові захворювання переважно являють собою такі захворювання, у яких ракові клітини експресують СІ ОМ.
Використовуваний тут термін «ракове захворювання» або «рак» включає захворювання, яке бо характеризується аберантно регульованим клітинним ростом, проліферацією, диференціацією,
адгезією й/або міграцією. Під терміном «ракова клітина» розуміється аномальна клітина, яка росте шляхом швидкої неконтрольованої клітинної проліферації й продовжує рости після стимулу, який ініціював нову зупинку росту. Переважно, «ракове захворювання» характеризується клітинами, експресуючими СІОМ, і раковими клітинами, експресуючими
СІ ОМ. Клітина, експресуюча СІ ОМ, переважно є раковою клітиною, переважно типів раку, описаних тут.
Термін «рак» відповідно до винаходу включає лейкоз, семіному, меланому, тератому, лімфому, нейробластому, гліому, рак прямої кишки, рак ендометрію, рак нирки, рак надниркової залози, рак щитовидної залози, рак крові, рак шкіри, рак головного мозку, рак шийки матки, рак шлунково-кишкового тракту, рак печінки, рак товстої кишки, рак шлунка, рак кишечнику, рак голови й шиї, рак ШКТ, рак лімфовузлів, рак стравоходу, колоректальний рак, рак підшлункової залози, рак вух, носа й гортані (ЕМТ), рак молочної залози, рак передміхурової залози, рак матки, рак яєчника й рак легені, і їхні метастази. Прикладами зазначеного раку є карцинома легені, карцинома молочної залози, карцинома передміхурової залози, карцинома товстої кишки, нирково-клітинна карцинома, карцинома шийки матки або метастази раку або пухлин, описаних вище. Термін рак відповідно до винаходу також включає метастази раку.
Відповідно до винаходу «карцинома» є злоякісною пухлиною, що складається з епітеліальних клітин. Ця група представляє найпоширеніші види раку, включаючи розповсюджені форми раку молочної залози, передміхурової залози, легені й товстої кишки. «Аденокарцинома» є раком, який походить із залозистої тканини. Ця тканина є також частиною більшої категорії тканини, відомої як епітеліальна тканина. Епітеліальна тканина включає шкіру, залози й цілий ряд інших тканин, які вистилають порожнини й органи організму.
Епітеліальна тканина походить із зародкових листків, ектодерми, ендодерми й мезодерми. Для класифікації раку як аденокарциноми клітини необов'язково повинні бути частиною залози, оскільки вони мають секреторні властивості. Ця форма карциноми може виникати в деяких вищих ссавців, включаючи людину. Добре диференційовані аденокарциноми мають подібність із залозистою тканиною, з якої вони походять, тоді як помірно диференційовані аденокарциноми такої властивості не мають. Шляхом фарбування клітин, отриманих з біопсії, патолог визначає, чи представляє пухлина аденокарциному або який-небудь інший тип раку. Аденокарцинома
Зо може виникати в багатьох тканинах організму за рахунок убіквитарної природи залоз в організмі. Незважаючи на те, що кожна залоза може не секретувати однакову речовину, оскільки існує екзокринна функція клітини, рак уважається залозистим і його злоякісна форма, таким чином, названа аденокарциномою. Злоякісна аденокарцинома інвазує інші тканини й часто поширює метастази, за умови що їй дали достатню кількість часу. Аденокарцинома яєчника є найпоширенішим типом карциноми яєчника. Вона включає серозні й муцинозні аденокарциноми, світло-клітинну аденокарциному й ендометриоїдну аденокарциному.
Термін «метастазування» означає поширення ракових клітин з їхньої ділянки походження в іншу частину організму. Формування метастазів є дуже складним процесом і залежить від відкріплення злоякісних клітин від первинної пухлини, інвазії позаклітинного матрикса, проникнення крізь базальні мембрани ендотелію для входження в порожнину організму й судини, і потім, після перенесення кров'ю, інфільтрації цільових органів. На закінчення, ріст нової пухлини в цільовій ділянці залежить від ангіогенезу. Метастазування пухлини часто виникає навіть після видалення первинної пухлини, тому що пухлинні клітини або компоненти можуть залишатися й розбудовувати метастатичний потенціал. В одному варіанті здійснення термін «метастазування» відповідно до винаходу належить до «віддалених метастазів», які належать до метастазів, віддалених від первинної пухлини й регіональної системи лімфатичних вузлів. В одному варіанті здійснення термін «метастази» відповідно до винаходу належить до метастазів у лімфатичні вузли. Однією конкретною формою метастазів, яка піддається лікуванню з використанням терапії за винаходом, є метастази, що походять з раку шлунка як первинної ділянки. У кращому варіанті здійснення такі метастази раку шлунка являють собою пухлину Крукенберга, перитонеальні метастази й/або метастази в лімфатичні вузли.
Пухлина Крукенберга є метастатичною пухлиною яєчника, що рідко зустрічається, на яку доводиться від 1 до 2 95 від усіх пухлин яєчника. Прогноз при пухлині Крукенберга дотепер є дуже поганим і не існує затвердженого лікування пухлин Крукенберга. Пухлина Крукенберга є метастатичною перстневидноклітинною аденокарциномою яєчника. Шлунок є первинною ділянкою для більшості випадків пухлини Крукенберга (70 95). Карциноми товстої кишки, апендициту й молочної залози (в основному інвазивна лобулярна карцинома) є наступними найпоширенішими первинними ділянками. Повідомлялося про рідкі випадки пухлини
Крукенберга, що походить з карциноми жовчного міхура, жовчної протоки, підшлункової залози, бо тонкого кишечнику, фатерова соска, шийки матки й сечового міхура/сечової протоки.
Термін «лікувати» означає введення сполуки або композиції, або комбінації сполук або композицій суб'єктові для попередження або усунення захворювання, включаючи зменшення розміру пухлини або кількості пухлин у суб'єкта; купірування або вповільнення розвитку захворювання в суб'єкта; інгібування або вповільнення розвитку нового захворювання в суб'єкта; зменшення частоти або тяжкості симптомів і/або повторного виникнення в суб'єкта, який на теперішній момент має або який раніше мав захворювання, і/або продовження, тобто збільшення тривалості життя суб'єкта.
Зокрема, термін «лікування захворювання» включає лікування, скорочення тривалості, ослаблення, попередження, уповільнення або інгібування прогресування або погіршення, або попередження або затримку початку виникнення захворювання або його симптомів.
У контексті даного винаходу терміни, такі як «захищати», «попереджати», «превентивні» або «захисні» належать до попередження або лікування, або й того й іншого, виникнення й/або поширення захворювання в суб'єкта й, зокрема, відомості до мінімуму ймовірності того, що в суб'єкта буде розвиватися захворювання, або затримки розвитку захворювання. Наприклад, особа, що має ризик розвитку раку, буде кандидатом на лікування або попередження раку. «Що має ризик» означає суб'єкта, який ідентифікований, як такий, що має більш високу, ніж нормальна, імовірність розвитку захворювання, зокрема раку, у порівнянні із загальною популяцією. Крім того, суб'єкт, який мав або який на теперішній момент має захворювання, зокрема рак, є суб'єктом, який має підвищений ризик розвитку захворювання, наприклад, у суб'єкта може продовжувати розвиватися захворювання. Суб'єкти, які на теперішній момент мають, або які мали рак, також мають підвищений ризик метастазування раку.
Термін «пацієнт» відповідно до винаходу означає суб'єкта, що підлягає лікуванню, зокрема хворого суб'єкта, включаючи людину, приматів нелюдського походження або інших тварин, зокрема ссавців, таких як корови, коні, свині, кози, собаки, кішки або гризуни, такі як миші й пацюки. В особливо кращому варіанті здійснення пацієнтом є людина. «Клітина-мішень» означає будь-яку небажану клітину, таку як ракова клітина. У кращих варіантах здійснення клітина-мішень експресує СІ ОМ.
Термін «антиген» належить до агента, такого як білок або пептид, що містить епітоп, проти якого спрямована і/або повинна бути спрямована імунна відповідь. У кращому варіанті
Зо здійснення антиген є пухлиноасоційованим антигеном, таким як СІ ОМ18.2 або СІ ОМб, тобто компонентом ракових клітин, який може походити із цитоплазми, клітинної поверхні й клітинних ядер, зокрема, такі антигени, які продукуються, переважно у великій кількості, внутрішньоклітинно або як поверхневі антигени на ракових клітинах.
У контексті даного винаходу термін «пухлино-асоційований антиген» переважно належить до білків, які в нормальних умовах специфічно експресуються в обмеженому числі тканин і/або органів, або на специфічних стадіях у процесі розвитку, і експресуються або аберантно експресуються в одній або більше пухлинах або ракових тканинах. У контексті даного винаходу пухлиноасоційований антиген переважно пов'язаний із клітинною поверхнею ракової клітини й переважно не експресується або тільки рідко експресується в нормальних тканинах.
Термін «епітоп» належить до антигенної детермінанти в молекулі, тобто частини молекули, яка розпізнається імунною системою, наприклад, яка розпізнається антитілом. Наприклад, епітопи являють собою дискретні, тривимірні ділянки на антигені, які розпізнаються імунною системою. Епітопи звичайно складаються з хімічно активних груп, розташованих на поверхні молекул, таких як бічні ланцюги амінокислот або цукрів, і звичайно мають специфічні характеристики тривимірної структури, а також специфічні характеристики зарядів.
Конформаційні й неконформаційні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першим, на відміну від зв'язування з останнім, втрачається в присутності денатуруючих розчинників. Епітоп білка переважно містить безперервну або переривчасту частину зазначеного білка й, переважно, становить від 5 до 100, переважно від 5 до 50, більш переважно від 8 до 30, найбільше переважно від 10 до 25 амінокислот у довжину, наприклад, епітоп може містити переважно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислот у довжину.
Термін «антитіло» належить до глікопротеїну, що містить щонайменше два важкі (Н) ланцюги й два легкі () ланцюги, зв'язані між собою дисульфідними зв'язками. Термін «антитіло» включає моноклональні антитіла, рекомбінантні антитіла, людські антитіла, гуманізовані антитіла й химерні антитіла. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначуваної тут як МН) і константної області важкого ланцюга. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначуваної тут як МІ) і константної області легкого ланцюга. Області МН і МІ можуть далі 60 підрозділятися на ділянки гіперваріабельності, названі ділянками, що визначають комплементарність (СОК), які перемежовуються з ділянками, що є більш консервативними, названими каркасними областями (ЕК). Кожна УН і МІ. складається із трьох СОК і чотирьох ЕК, організованих у напрямку від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК1, СОКІ,
ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4. Варіабельні області важкого й легкого ланцюгів містять з'єднувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, що включають різні клітини імунної системи (наприклад ефекторні клітини), і першим компонентом (С14) класичної системи комплементу.
Термін «моноклональне антитіло», використовуваний тут, належить до препарату молекул антитіла однієї молекулярної композиції. Моноклональне антитіло проявляє одну специфічність зв'язування й афінність. В одному варіанті здійснення моноклональні антитіла продукуються гібридомою, яка включає В-клітину, отриману від тварини, відмінної від людини, наприклад миші, злиту з імморталізованою клітиною.
Термін «рекомбінантне антитіло», використовуваний тут, передбачає включення всіх антитіл, які отримані, експресовані, створені або виділені рекомбінантними способами, таких як: (а) антитіла, виділені у тварини (наприклад мишії), яка є трансгенною або трансхромосомною за генами імуноглобуліну, або з гібридоми, отриманої з нього, (Б) антитіла, виділені із клітини- хазяїна, трансформованої таким чином, щоб вона експресувала антитіло, наприклад, із трансфектоми, (с) антитіла, виділені з бібліотеки рекомбінантних комбінаторних антитіл, і (4) антитіла, отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими способами, які включають сплайсинг послідовностей гена імуноглобуліну з іншими послідовностями ДНК.
Термін «людське антитіло», використовуване тут, передбачає включення антитіл, що мають варіабельні й константні області, утворені з послідовностей імуноглобулінів зародкової лінії людини. Людські антитіла можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані послідовностями імуноглобулінів зародкової лінії людини (наприклад, мутації, внесені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом іп міїго, або за допомогою соматичної мутації іп мімо).
Термін «гуманізоване антитіло» належить до молекули, що має антигензв'язуючий сайт, який, по суті, походить із імуноглобуліну від різновидів нелюдського походження, і іншу
Зо структуру імуноглобуліну цієї молекули, основану на структурі й/або послідовності імуноглобуліну людини. Цей антигензв'язуючий сайт може містити або повні варіабельні домени, злиті з константними доменами, або тільки визначальні комплементарність області (СОК), пересаджені на придатні каркасні області у варіабельних доменах. Антигензв'язуючі сайти можуть бути сайтами дикого типу або модифікованими однією або декількома амінокислотними замінами, наприклад модифікованими для того, щоб вони мали більш близьку подібність із імуноглобуліном людини. Деякі форми гуманізованих антитіл зберігають усі СОБК- послідовності (наприклад гуманізоване мишаче антитіло, яке містить усі шість СОК з мишачого антитіла). Інші форми мають одну або більше СОБК, які змінені щодо вихідного антитіла.
Термін «химерне антитіло» належить до таких антитіл, у яких одна частина кожної з амінокислотних послідовностей важких і легких ланцюгів гомологічна відповідним послідовностям антитіл, отриманих від певних різновидів або приналежних конкретному класу, тоді як інший сегмент ланцюга гомологічний відповідним послідовностям від інших видів.
Звичайно варіабельна область і легкого, і важкого ланцюгів імітує варіабельні області антитіл, отриманих від одного виду ссавців, тоді як константні області гомологічні послідовностям в антитілах, отриманих від інших видів. Одна з явних переваг таких химерних форм полягає в тому, що варіабельна область може бути легко отримана з відомих у цей час джерел з використанням легко доступних В-клітин або гібридом організмів-хозяїнів, що не є людиною, у комбінації з константними областями, отриманими, наприклад, із препаратів клітин людини. У той час як перевага варіабельної області полягає в простоті одержання й на специфічність не впливає її джерело, константна область, якщо вона є людською, менш імовірно викличе імунну відповідь у суб'єкта-людини при ін'єкції антитіл, ніж в тому випадку, коли константна область отримана від джерела, відмінного від людини. Однак визначення не обмежене таким конкретним прикладом.
Антитіла можуть бути отримані від різних видів, включаючи, але без обмеження, мишей, пацюків, кроликів, морських свинок і людини.
Антитіла, описані тут, включають антитіла ІдА, такі як ІДдДАЇ або ІдАг, ІДС, Ідс2, Іде, Ідс4,
ІЗЕ, ІМ ії 90. У різних варіантах здійснення антитіло є антитілом ІДС, зокрема, ізотип ІДС каппа або лямбда |до (тобто ІдДСІ, к, АХ), антитіло ЇдО2а (наприклад Ідсга, К, А), антитіло І(Д2р (наприклад ІдС2Б, к, АХ), антитіло ЇДО3 (наприклад Іде, к, А) або антитіло Ідс4 (наприклад Ідся4, бо К, А).
Використовуваний тут термін «гетерологічне антитіло» визначають відносно трансгенного організму, продукуючого дане антитіло. Цей термін належить до антитіла, що має послідовність амінокислот або кодуючу послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає послідовностям, виявленим в організмі, який не є трансгенною твариною, і звичайно виділеному в різновидів, відмінних від трансгенної тварини.
Використовуваний тут термін «гетерогібридне антитіло» належить до антитіла, що має легкий і важкий ланцюги організмів різного походження. Наприклад, антитіло, що має людський важкий ланцюг, асоційований з мишачим легким ланцюгом, є гетерогібридним антитілом.
Антитіла, описані тут, переважно, є виділеними. Термін «виділене антитіло», використовуване тут, належить до антитіла, яке практично не містить інші антитіла, що мають відмінні антигенні специфічності (наприклад виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з
СІ ОМ18.2, практично не містить антитіла, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від СІ ОМ18.2). Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою або варіантом людського СІ ОМ18.2, може, однак, мати перехресну реактивність із іншими спорідненими антигенами, наприклад, від інших видів (наприклад гомологи різновидів
СІ ОМ18.2). Крім того, виділене антитіло може практично не містити інший клітинний матеріал іабо хімічні речовини. В одному варіанті здійснення комбінація «виділених» моноклональних антитіл належить до антитіл, що мають різні специфічності, і об'єднані у добре охарактеризовану композицію або суміш.
Терміни «антигензв'язуюча область» антитіла (або просто «з'єднувальна область») або «антигензв'язуючий фрагмент» антитіла (або просто «з'єднувальний фрагмент»), або аналогічні терміни належать до одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном. Було показано, що антигензв'язуюча функція антитіла може здійснюватися фрагментами всієї послідовності. До прикладів з'єднувальних фрагментів, включених у термін «антигензв'язуюча область» антитіла, належать (ї) фрагменти Раб, моновалентні фрагменти, що складаються із доменів МІ, МН, СІ ї СН; (ії) фрагменти Е(ар)», бівалентні фрагменти, що складаються із двох фрагментів Раб, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; (ії) фрагменти Ей, що складаються із доменів МН ії СН; (ім) фрагменти Гм, що складаються із доменів МІ ї МН окремої області антитіла; (м) фрагменти ЯАБ (Мага еї аї.,
Зо (1989) Маїйге 341: 544-546), які складаються з домена МН; (мі) ізольовані області, що визначають комплементарність (СОК), і (мії) комбінації двох або більше ізольованих СОК, які можуть бути необов'язково з'єднані синтетичним лінкером. Більше того, незважаючи на те, що два домени у фрагменті Ем, МІ і МН кодуються різними генами, їх можна об'єднати, використовуючи рекомбінатні технології, за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє побудувати з них єдиний білюовий ланцюжок, у якому області МІ. і МН зв'язуються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одиночний ланцюг Ем (5сЕм); дивися, наприклад, Віга еї аї. (1988) 5Зсієпсе 242: 423-426; і Нивіоп еї а!. (1988) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також передбачаються бути охопленими терміном «антигензв'язуючий фрагмент» антитіла. Додатковим прикладом є злиті білки з'єднувальний домен-імуноглобулін, що містять (ї) поліпептид з'єднувального домена, який злитий з поліпептидом шарнірної області імуноглобуліну, (ії) константну область СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну, злиту із шарнірною областю, і (ії) константну область СНЗ важкого ланцюга імуноглобуліну, злиту з константною областю СН2. Поліпептид з'єднувального домена може бути варіабельною областю важкого ланцюга або варіабельною областю легкого ланцюга. Злиті білки з'єднувальний домен- імуноглобулін додатково розкриті в З 2003/01 18592 ії 05 2003/0133939. Такі фрагменти антитіл одержують із використанням загальноприйнятих способів, відомих фахівцям у даній області, і ці фрагменти піддають скринінгу в такий же спосіб, як і інтактні антитіла.
Термін «з'єднувальний домен» характеризується в контексті даного винаходу структурою, наприклад, антитіла, яка зв'язується/взаємодіє із заданою цільовою структурою/антигеном/епітопом. Таким чином, зв'язуючий домен відповідно до винаходу, означає «ділянка взаємодії антигену».
Усі антитіла й похідні антитіл, такі як фрагменти антитіл, описані тут, з метою винаходу позначені терміном «антитіло». Термін «похідні антитіла» належить до будь-якої модифікованої форми антитіла, наприклад кон'югату антитіла й іншого агента або антитіла, або фрагмента антитіла. Крім того, антитіла й похідні антитіл, як описано тут, є придатними для одержання з'єднувальних агентів за винаходом, таких як фрагменти антитіла.
Антитіла природного походження, як правило, є моноспецифічними, тобто вони зв'язуються з одним антигеном. Даний винахід забезпечує з'єднувальні агенти, що зв'язуються із цитотоксичними клітинами (шляхом зв'язування з СОЗ рецептором) і раковими клітинами бо (шляхом зв'язування з СІ ОМ). З'єднувальні агенти за даним винаходом є щонайменше біспецифічними або мультиспецифічними, такими як триспецифічні, тетраспецифічні і т.д.
З'єднувальний агент за винаходом може бути у форматі молекули антитіла або молекули, подібної антитілу, або білкового кістяка із властивостями, подібними антитілу, або циклічного пептиду щонайменше із двома специфічностями зв'язування. Таким чином зв'язуючий агент може містити одне або більше антитіл, описаних тут, або їх фрагменти.
Відповідно до винаходу біспецифічна молекула, зокрема біспецифічний білок, такий як біспецифічне антитіло, є молекулою, яка містить дві різні специфічності зв'язування й, таким чином, може зв'язуватися із двома різними типами антигену, такими як СІ ОМ і СОЗ3. Зокрема, термін «біспецифічне антитіло», використовуваний тут, належить до антитіла, що містить дві антигензв'язуючих ділянки, перша ділянка зв'язування, що має афінність відносно першого антигену або епітопа, і друга ділянка зв'язування, що має афінність зв'язування відносно другого антигену або епітопа, відмінного від першого. Зокрема, біспецифічне антитіло є штучним білком, який складається із фрагментів двох різних антитіл (зазначені фрагменти двох різних антитіл утворюють два з'єднувальні домени) і, таким чином, зв'язується із двома різними типами антигену. Біспецифічне антитіло відповідно до винаходу сконструйоване для одночасного зв'язування із клітиною імунної системи, такою як імунна ефекторна клітина, зокрема Т-клітина, така як цитотоксична клітина (шляхом зв'язування з СОЮЗ), і клітиною- мішенню, такою як ракова клітина (шляхом зв'язування з пухлино-асоційованим антигеном
СІ ОМ), що підлягає знищенню.
Термін «біспецифічне антитіло» також включає діатіла. Діатіла є бівалентними, біспецифічними антитілами, у яких домени МН і МІ. експресуються на єдиному поліпептидному ланцюзі, але використання лінкера, який є занадто коротким для створення можливості спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі, змушує ці домени спаровуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга й створює два антигензв'язуючих сайти (дивися, наприклад, НоїїЇїдег, Р., еї аїЇ. (1993) Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 90: 6444-6448; РоЦак, В.
У., еї а. (1994) біписішге 2: 1121- 1123). «Мультиспецифічні з'єднувальні агенти» являють собою молекули, які містять більше двох різних специфічностей зв'язування.
Особливо кращими відповідно до винаходу є біспецифічні антитіла, включаючи фрагменти
Зо біспецифічних антитіл, зокрема біспецифічні одноланцюгові антитіла, включаючи фрагменти біспецифічних одноланцюгових антитіл. Термін «біспецифічне одноланцюгове антитіло» означає один поліпептидний ланцюг, що містить два з'єднувальні домени. Зокрема, термін «біспецифічне одноланцюгове антитіло» або «одноланцюгове біспецифічне антитіло», або споріднені терміни відповідно до даного винаходу, переважно, означає конструкції антитіла, отримані в результаті з'єднання щонайменше двох варіабельних областей антитіла в одному поліпептидному ланцюзі, позбавленому константної й/або Ес частини(н), що присутня у повних імуноглобулінах.
Наприклад, біспецифічне одноланцюгове антитіло може бути конструкцією, що містить усього дві варіабельні області антитіла, наприклад дві МН-області, при цьому кожна область здатна до специфічного зв'язування з окремим антигеном і з'єднані одна з одною за допомогою короткого поліпептидного спейсера, таким чином, що дві варіабельні області антитіла з їхнім включеним спейсером існують у вигляді одного безперервного поліпептидного ланцюга. Іншим прикладом біспецифічного одноланцюгового антитіла може бути один поліпептидний ланцюг із трьома варіабельними областями антитіла. У цьому випадку, дві варіабельні області антитіла, наприклад одна МН і одна Мі, можуть становити 5СсЕм, при цьому дві варіабельні області антитіла з'єднані одна з одною за допомогою синтетичного поліпептидного лінкера, причому зазначений лінкер генетично сконструйований таким чином, щоб бути мінімально імуногенним, при цьому залишаючись максимально стійким до протеолізу. Такий 5сЕм здатний до специфічного зв'язування з конкретним антигеном і з'єднаний з варіабельною областю іншого антитіла, наприклад МН-областю, здатною до зв'язування з антигеном, відмінним від антигену, зв'язаного 5сЕм. Ще іншим прикладом біспецифічного одноланцюгового антитіла може бути єдиний поліпептидний ланцюг із чотирма варіабельними областями антитіла. У цьому випадку, перші дві варіабельні області антитіла, наприклад МН-область і Мі -область, можуть формувати один 5СЕм, здатний до зв'язування з одним антигеном, тоді як друга МН-область і Мі -область можуть формувати другий 5сЕм, здатний до зв'язування з іншим антигеном. У межах одного безперервного поліпептидного ланцюга індивідуальні варіабельні області антитіла однієї специфічності можуть бути успішно розділені синтетичним поліпептидним лінкером, тоді як відповідні 5ХСЕмМ можуть бути успішно розділені коротким поліпептгидним спейсером, як описано вище. 60 Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу перший з'єднувальний домен біспецифічного антитіла містить один варіабельний домен антитіла, переважно домен УНН.
Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу перший з'єднувальний домен біспецифічного антитіла містить два варіабельні домени антитіла, переважно 5сЕм, тобто МН-МІ. або МІ-МН. Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу другий з'єднувальний домен біспецифічного антитіла містить один варіабельний домен антитіла, переважно домен УНН.
Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу другий з'єднувальний домен біспецифічного антитіла містить два варіабельні домени антитіла, переважно 5сЕм, тобто МН-МІ. або МІ-МН. У своїй мінімальній формі загальне число варіабельних областей антитіла в специфічному антитілі відповідно до винаходу рівне, таким чином, тільки двом. Наприклад, таке антитіло може містити два домени МН або два домени МНН.
Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу перший з'єднувальний домен і другий з'єднувальний домен біспецифічного антитіла, кожний, містить один варіабельний домен антитіла, переважно, домен УНН. Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу перший з'єднувальний домен і другий з'єднувальний домен біспецифічного антитіла, кожний, містять два варіабельні домени антитіла, переважно 5сЕм, тобто МН-МІ або МІ-МУН. У цьому варіанті здійснення з'єднувальний агент за винаходом переважно містить (ї) варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла проти СІ ОМ, (ії) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла проти СІ ОМ, (ії) варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла проти СОЗ, і (їм) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла проти СОЗ.
Біспецифічні антитіла повної довжини можуть бути отримані шляхом ковалентного зв'язування двох моноклональних антитіл або за допомогою стандартних методів на основі міжвидових гібридом. Ковалентне зв'язування двох моноклональних антитіл описане в
Апаегзоп, Віоса 80 (1992), 2826-34. У контексті даного винаходу одне з антитіл є специфічним відносно СІ ОМ і інше відносно СОЗ.
В одному варіанті здійснення біспецифічний з'єднувальний агент знаходиться у форматі подібної антитілу молекули, при цьому важкий ланцюг містить два послідовні М-кінцевих варіабельних домени з різними специфічностями, і легкий ланцюг містить два послідовні варіабельні домени з різними специфічностями, приводячи до утворення чотирьох з'єднувальних доменів із двома різними специфічностями (УМи еї аї, Маї. Віотесппоіоду, 2007,
Зо 25(11)), при цьому однією специфічністю є СОЗ і іншою специфічністю є СІ ОМ.
У кращому варіанті здійснення біспецифічний з'єднувальний агент за винаходом знаходиться у форматі фрагмента антитіла.
В одному варіанті здійснення біспецифічні молекули відповідно до винаходу містять дві Бар- області, одну, спрямовану проти СІ ОМ, і іншу, спрямовану проти СО3. В одному варіанті здійснення молекула за винаходом є комплексом антигензв'язуючих фрагментів (Рар)2.
Комплекс Рар2 складається із двох Раб-фрагментів, при цьому один Бар-фрагмент містить домен Ем, тобто домени МН і Мі, специфічні відносно антигену СОЗ, і інший Рар-фрагмент містить домен Ем, специфічний відносно СІ ОМ. Кожний з Раб-фрагментів може складатися із двох одиночних ланцюгів, модуля МІ-Сі ії модуля МН-СН. Альтернативно, кожний з індивідуальних Габ-фрагментів може бути складений в одиночний ланцюг, переважно МІ-СЇ -С2Н-
МН, ії індивідуальні варіабельні й константні домени можуть бути з'єднані за допомогою пептидного лінкера. У цілому, індивідуальні одиночні ланцюги Рар-фрагментів можуть бути з'єднані за допомогою дисульфідних зв'язків, адгезивних доменів, зв'язані хімічно й/або за допомогою пептидного лінкера. Біспецифічна молекула може також містити більше двох Еар- фрагментів, зокрема молекула може бути Рар3, Баб4 або мультимерним комплексом Раб зі специфічністю відносно 2, 3, 4 або більше різних антигенів. Винахід також включає хімічно зв'язані Габ.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент відповідно до винаходу включає різні типи бівалентних і тривалентних одноланцюгових варіабельних фрагментів (5сЕм), злиті білки, що імітують варіабельні домени двох антитіл. Одноланцюговий варіабельний фрагмент (5сЕм) є злитим білком, що складається з варіабельних областей важкого (МН) і легкого ланцюгів (МІ) імуноглобулінів, з'єднаних коротким лінкерним пептидом, що складаються із приблизно 10-25 амінокислот. Лінкер звичайно багатий гліцином для гнучкості, а також серином або треоніном для розчинності, і може з'єднувати або М-кінець МН з С-кінцем МІ, або навпаки. Дивалентні (бівалентні) одноланцюгові варіабельні фрагменти (ді-єсЕм, рі-з5сСЕм) можуть бути сконструйовані шляхом зв'язування двох 5сЕм. Це може бути зроблено шляхом одержання одиночного пептидного ланцюга із двома областями МН і двома областями МІ з одержанням тандемних 5сЕм. Винахід також включає мультиспецифічні молекули, що містять більше двох 5сЕм- з'єднувальних доменів. Це забезпечує те, що молекула має безліч специфічностей до антигену і бо є триспецифічною, тетраспецифічною або мультиспецифічною молекулою, або молекула є біспецифічною молекулою, що містить більше одного з'єднувального домена 5сгУ, зі специфічністю відносно того самого антигену. Зокрема, молекула за винаходом може бути мультиспецифічною одноланцюговою молекулою Ем.
Іншою можливістю є створення 5сЕм з лінкерними пептидами, які є надто короткими для з'єднання двох варіабельних областей (приблизно п'ять амінокислот), ініціюючи димеризацію 5СЕм. Цей тип відомий як діатіла. Ще більш короткі лінкери (одна або дві амінокислоти) приводять до формування тримерів, так званих триатіл або тритіл. Тетратіла також були отримані. Вони проявляють навіть більш високу афінність стосовно своїх мішеней, ніж діатіла.
Особливо кращим прикладом фрагмента біспецифічного антитіла є діатіло (Кіргіуапом, пі. у.
Сапсег 77 (1998), 763-772), яке є невеликим фрагментом бівалентного й біспецифічного антитіла. Діатіла містять варіабельний домен важкого ланцюга (УН), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) на одному й тому ж поліпептидному ланцюзі (МН-МІ) за рахунок пептидного лінкера, який має занадто малу довжину, щоб забезпечувати можливість спарювання між двома доменами на одному й тому ж ланцюзі. Це викликає спарювання з комплементарними доменами іншого ланцюга й сприяє складанню димерної молекули із двома функціональними антигензв'язуючими ділянками. Для конструювання біспецифічних діатіл за винаходом М-домени анти-СОЗ антитіла й анти-СІ ОМ антитіла можуть бути злиті для створення двох ланцюгів МН(ІСОЗ3)-МІ (СІ ОМ), МН(СІ ОМ)-М (203). Кожний ланцюг сам по собі нездатний до зв'язування з відповідним антигеном, але відтворює функціональні антигензв'язуючі ділянки анти-СОЗ антитіла й анти-СІ ОМ антитіла при спарюванні з іншим ланцюгом. У цьому випадку використовується пептидний лінкер, який є занадто коротким для того, щоб забезпечити можливість спарювання між двома доменами на одному й тому ж ланцюзі. Дві молекули 5сСЕм з лінкером між варіабельним доменом важкого ланцюга й варіабельним доменом легкого ланцюга, який є занадто коротким для внутрішньомолекулярної димеризації, співекспресуються й самозбираються з формуванням біспецифічних молекул із двома сайтами зв'язування на протилежних кінцях.
В одному варіанті здійснення мультиспецифічна молекула відповідно до винаходу містить варіабельні (МН, М) і константні (С) домени імуноглобулінів. В одному варіанті здійснення біспецифічна молекула є мінітіло, переважно мінітіло, що містить два одиночні ланцюги МН-МІ -
С, які з'єднані один з одним за допомогою константних доменів (С) кожного ланцюга. Згідно із цим аспектом відповідні варіабельні області важкого ланцюга (МН), відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) і константні домени (С) розташовані в напрямку від М-кінця до С- кінця в порядку МН(СІ ОМ)-МІ (СІ ОМ)-(С) ї МН(ІСОЗ3)-МІ (СО3)-С, де С переважно є доменом СНЗ.
Спарювання константних доменів приводить до утворення мінітіла.
Відповідно до іншого, особливо кращого аспекту, біспецифічний з'єднувальний агент за винаходом знаходиться у форматі конструкції біспецифічного одноланцюгового антитіла, при цьому зазначена конструкція містить або складається щонайменше із двох з'єднувальних доменів, при цьому один із зазначених доменів зв'язується з СІ ОМ і другий домен зв'язується з
СО3. Такі молекули, також названі «Брізресіїїс Т сеїЇ епдадеге» (Віїе; термін Впе належить тільки до біспецифічних молекул, одне плече яких є специфічним відносно СОЗ), складаються із двох молекул 5сСЕм, з'єднаних за допомогою лінкерного пептиду.
Використовуваний тут термін «біспецифічне одноланцюгове антитіло» означає одиночний поліпептидний ланцюг, що містить два з'єднувальні домени. Кожний з'єднувальний домен містить одну варіабельну область із важкого ланцюга антитіла («область МН»), при цьому область МН першого з'єднувального домена специфічно зв'язується з СІ ОМ, і область УН другого з'єднувального домена специфічно зв'язується з СОЗ. Два з'єднувальні домена необов'язково зв'язані один з одним коротким поліпептидним спейсером. Необмежуючим прикладом поліпептидного спейсера є І М-(41 М-С1 М-(51 М-5ЕВ ((1-0-(-(3-5) і її повтори. Кожний з'єднувальний домен може додатково містити одну варіабельну область із легкого ланцюга антитіла («область МІ»), при цьому область МН і область МІ у межах кожного з першого й другого з'єднувальних доменів зв'язані один з одним за допомогою поліпептидного лінкера, що має достатню довжину для того, щоб забезпечити можливість спарювання області МН і області
МІ. першого з'єднувального домена з областю МН і областю МІ. другого з'єднувального домена.
Відповідно до цього аспекту відповідні варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МУН(СІ ОМ)-М (СІ 0ОМ)-УН(СО3)-М (203), УнН(СОЗ3)-М (С03)-УН(СІ ОМ)-М (СГ ОМ) або
МнН(СОрз3)-М (203)- МСГ ОМ)-УН(СІ ОМ). Однак передбачається, що біспецифічні одноланцюгові антитіла за винаходом містять інші розташування доменів, такі як МІ (СІ 0ОМ)-УН(СГОМ)-
Ун(Сорз3)--ЦС03), Уц(СГОомМ)-Ун(СІ ОМм)-Мм (203)-УН(СОЗ), УнН(СГОМ)-М (СІ 0М)-М (С03)- 60 мн(Сорз), мМ((бОо3)-УН(СО3)-УН(СГ ОоМ)-У (СГ ОМ), М (Сб03)-УН(СО3)-М (СІ 0М)-УН(СІ ОМ).
Довгий лінкер звичайно з'єднує відповідні варіабельні області важкого ланцюга (МІ) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) з утворенням з'єднувального зсЕм-домена, тоді як короткий лінкер звичайно з'єднує два з'єднувальні 5сЕм-домени. Лінкер звичайно розроблений для забезпечення гнучкості й стійкості до протеази й, переважно, лінкер містить амінокислотні залишки гліцину й/або серину. Короткі послідовності пептидного лінкера можуть складатися з 12 або менше, наприклад 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, З або 2 амінокислот, і переважно 5 або 6 амінокислот. Короткі пептидні лінкери, переважно, містять амінокислотні послідовності 5БОосО5 або бООО5. Довгі пептидні лінкери можуть складатися з 12 або більше, наприклад 15-25 або 15-20, або 15-18 амінокислот. Довгі пептидні лінкери, переважно, містять амінокислотні послідовності ((3003(055)3 або МЕ(0б505055)250М0. Додаткові довгі пептидні лінкери можуть містити амінокислотні послідовності ((50505(055)4, ((500055)5 або савасе(ав)зааав.
З'єднувальні агенти відповідно до винаходу можуть також містити амінокислотну послідовність для сприяння секреції молекули, наприклад М-кінцевого сигналу секреції, і/або одну або більше епітопних міток, що сприяють зв'язуванню, очищенню або детекції молекули.
Переважно, сигнал секреції є сигнальною послідовністю (наприклад вибраною з кожної з
ЗЕО ІЮО МО: 51, 52, 53, 54, 55), яка забезпечує достатнє проходження по секреторному шляхові й/або секрецію з'єднувального агента в позаклітинний простір. Переважно, послідовність сигналу секреції є, що розщеплюється й віддаляється зі зрілого з'єднувального агента.
Послідовність сигналу секреції, переважно, вибирається відповідно до клітини або організму, у якому з'єднувальний агент продукується.
Амінокислотна послідовність епітопної мітки може бути введена в будь-яке положення в межах амінокислотної послідовності з'єднувального агента, і може набувати форми петлі в межах кодованої білкової структури, або може бути злита на М-кінцях або С-кінцях зі з'єднувальним агентом. Переважно, епітопна мітка злита на С-кінці зі з'єднувальним агентом.
Епітопна мітка може містити сайт розщеплення, який забезпечує можливість видалення мітки зі з'єднувального агента. Зазначена епітопна мітка може бути будь-яким видом епітопної мітки, який є функціональним у нативних і/або денатуруючих умовах, переважно гістидиновою міткою, найбільше переважно міткою, що містить шість залишків гістидину.
Біспецифічний з'єднувальний агент за винаходом може містити додатково до зазначеного першого й другого з'єднувального домену, додатковий з'єднувальний домен, який служить, наприклад, для підвищення селективності відносно пухлинних клітин. Це може бути досягнуто, наприклад, шляхом забезпечення з'єднувальних доменів, які зв'язуються з іншими антигенами, що експресуються на пухлинних клітинах.
У контексті даного винаходу, створені з'єднувальні агенти, переважно, здатні викликати імунні ефекторні функції, описані тут. Переважно, зазначені імунні ефекторні функції спрямовані проти клітин, що несуть пухлиноасоційований антиген СІ ОМ на своїй поверхні.
Термін «імунні ефекторні функції» у контексті даного винаходу включають будь-які функції, опосередковані компонентами імунної системи, які приводять, наприклад, до інгібування росту пухлини й/або інгібування розвитку пухлини, включаючи інгібування поширення пухлини й метастазів. Переважно, імунні ефекторні функції призводять до загибелі пухлинних клітин. Такі функції включають комплемент-залежну цитотоксичність (СОС), антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (АЮСС), антитіло-залежний клітково-опосередкований фагоцитоз (АОСР), індукцію апоптозу в клітинах, що несуть пухлиноасоційований антиген, цитоліз клітин, що несуть пухлиноасоційований антиген, і/або інгібування проліферації клітин, що несуть пухлиноасоційований антиген. З'єднувальні агенти можуть також проявляти ефект просто шляхом зв'язування з пухлиноасоційованими антигенами на поверхні ракової клітини.
Наприклад, антитіла можуть блокувати функцію пухлиноасоційованого антигену або індукувати апоптоз лише шляхом зв'язування з пухлиноасоційованим антигеном на поверхні ракової клітини.
З'єднувальні агенти, описані тут, можуть бути кон'юговані з терапевтичним фрагментом або агентом, таким як цитотоксин, лікарським засобом (наприклад імуносупресантом) або радіоактивним ізотопом. Цитотоксин або цитотоксичний агент включає будь-який агент, який є згубним для клітин і, зокрема, убиває клітини. Приклади включають таксол, цитохалазин В, граміцидин 0, етидіум бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин 0, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, татракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їх аналоги або гомологи. Придатні терапевтичні агенти для формування кон'югатів включають, але без обмеження, антиметаболіти (наприклад 60 метотрексат, б6-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, флударабін, 5-фторурацил, декарбазин),
алкілюючі агенти (наприклад мехлоретамін, тіоепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ВБМО) і ломустин (ССМО), циклофосфамід, бусульфан, дибромманітол, стрептозотоцин, мітоміцин С і цис-дихлордіамін платини (ІІ) (ОР) цисплатин), антрацикліни (наприклад даунорубіцин (вихідна назва дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад дактиноміцин (вихідна назва актиноміцин), блеоміцин, митраміцин і антраміцин (АМС), і антимітотичні агенти (наприклад, вінкристин і вінбластин). У кращому варіанті здійснення терапевтичний агент є цитотоксичним агентом або радіотоксичним агентом. В іншому варіанті здійснення терапевтичний агент є імуносуппресантом. У ще іншому варіанті здійснення терапевтичний агент є ЗМ-С5БЕ. У кращому варіанті здійснення терапевтичним агентом є доксорубіцин, цисплатин, блеоміцин, сульфат, кармустин, хлорамбуцил, циклофорамід або рицин А.
Також зв'язуючі агенти можуть бути кон'юговані з радіоактивними ізотопами, наприклад, йодом-131, ітрієм-90 або індієм-111ї для створення цитотоксичних радіофармацевтичних засобів.
Методики кон'югації таких терапевтичних фрагментів з антитілами добре відомі, дивися, наприклад, Агтоп еї аїЇ., «Мопосіопаї! Апіїродієз Рог Іттипоїагдеїпод ОЇ Огидз Іп Сапсег Тпегару» в Мопосіопа! Апіїбодіеєз Апа Сапсег Тпегару, Кеїзтеїа еї аї. (едз.), рр. 243-56 (Аап ПН. І ів55, Іпс. 1985); Неїйвігот єї аї., «Апіїбодіез Бог ЮОгид Оеїїмегу» в СопігоПей Огид Оеїїмегу (214 Ева),
Вобіпзоп еї аї. (єдв.), рр. 623-53 (Магсеї! ОеккКег, Іпс. 1987); Тпогре, «Апіїрбоду Сагіег5 ОЇ Суюїйохіс
Адепі5 Іп Сапсег ТПпегару:; А Кеміему» в Мопосіопа! Апіібодіез "84: Віоіодіса!І Апа Сіїіпіса!
Арріїсайопв5, Ріпспегавї аї. (едв. ), рр. 475-506 (1985); «Апаїузі5, Кезийї5, Апа Ешиге Ргозресіїме
ОЇ Те Тпегарешіс О5зе ОЇ Кадіоїареїей Апіїбоду Іп Сапсег Тпегару» в Мопосіопа! Апіїродіє5 Еог
Сапсег Оеїесіїоп Апа Тнегару, ВаїЇдміп еї аї. (еа5.), рр. 303-16 (Асадетіс Ргез5 1985), і Тпогре еї аі,, «Те Ргерагайоп Апа Сушюйохіс Ргорепіє5з ОЇ Апіїбоду-Тохіп Сопішдаїев», Іттипої. Кем., 62: 119-58 (1982).
Термін «зв'язування» відповідно до винаходу переважно належить до специфічного зв'язування.
Відповідно до даного винаходу агент, такий як антитіло, здатний зв'язуватися з попередньо визначеною мішенню, якщо він має значну афінність відноссно зазначеної попередньо визначеної мішені й зв'язується із зазначеною попередньо визначеною мішенню в стандартних
Зо аналізах. «Афінність» або «афінність зв'язування» часто виміряється константою дисоціації (КО). Переважно, термін «значна афінність» належить до зв'язування з попередньо визначеною мішенню з константою дисоціації (КО), рівною 105 М або нижче, 105 М або нижче, 10-7 М або нижче, 108 М або нижче, 1079 М або нижче, 10-79 М або нижче, 10-" М або нижче, або 10-2 М або нижче.
Агент не здатний (значно) зв'язуватися з мішенню, якщо він не має значної афінності відносно зазначеної мішені й не зв'язується в значній мірі, зокрема не зв'язується детектованим чином із зазначеною мішенню в стандартних аналізах. Переважно, агент не зв'язується детектованим чином із зазначеною мішенню у випадку присутності при концентрації, що становить до 2, переважно 10, більш переважно 20, особливо 50 або 100 мг/мл або вище.
Переважно, агент не має значної афінності відносно мішені, якщо він зв'язується із зазначеною мішенню з КО, яка щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 рази, 104 рази, 105 разів або 106 разів вище, чим КО для зв'язування з попередньо визначеною мішенню, з якою агент здатний зв'язуватися. Наприклад, якщо КО для зв'язування агента з мішенню, з якою агент здатний зв'язуватися, рівна 10-7 М, КО для зв'язування з мішенню, відносно якої агент не має значної афінності, буде становити щонайменше 10 М, 105 М, 1072 М, 103 М, 102 М або 107 М.
Агент, такий як антитіло, є специфічним відносно попередньо визначеної мішені, якщо він здатний зв'язуватися із зазначеною попередньо визначеною мішенню, при цьому він не здатний зв'язуватися з іншими мішенями, тобто не має значної афінності відносно інших мішеней і значно не зв'язується з іншими мішенями в стандартних аналізах. Відповідно до винаходу агент є специфічним відносно СІ ОМ, якщо він здатний зв'язуватися з СІ ОМ, але не здатний (значно) зв'язуватися з іншими мішенями. Переважно, агент є специфічним відносно СІ ОМ, якщо афінність відносно таких інших мішеней і зв'язування з такими іншими мішенями значно не перевищує афінність відносно неспоріднених СІ ОМ білків або зв'язування з неспорідненими
СІ ОМ білками, такими як бичачий сироватковий альбумін (ВЗА), казеїн, людський сироватковий альбумін (НБА), або не стосовними до клаудину трансмембранними білками, такими як молекули МНС або рецептор трансферину, або будь-яким іншим зазначеним поліпептидом.
Переважно, агент є специфічним відносно попередньо визначеної мішені, якщо він зв'язується із зазначеною мішенню з КО, яка, щонайменше, в 10 разів, 100 разів, 103 рази, 104 рази, 105 разів, або 106 разів нижче, чим КО для зв'язування з мішенню, для якої він не є специфічним. 60 Наприклад, якщо КО для зв'язування агента з мішенню, відносно якої він є специфічним, рівна
107 М, КО для зв'язування з мішенню, відносно якої він не є специфічним, буде рівна, щонайменше, 105 М, 105 М, 102 М, 103 М, 102 М або 107 М.
Зв'язування агента з мішенню може бути визначене експериментально з використанням будь-якого придатного способу; дивися, наприклад, Веглої5Ку еї аї., «Апіїбоду-Апіїдеп
Іптегасіоп5» в Рипдатепіа! Іттипоїіоду, Раці, УМ. Е., Ед., Камеп Ргез5 Мем Моїк, М М (1984),
Кибу, дапі5 Іттипоіоду, М/. Н. Егеетап апа Сотрапу Мем/ МогК, М М (1992), і способи, описані в даному документі. Афінність може бути легко визначена стандартними методами, такими як рівноважний діаліз; аналіз із використанням обладнання Віасоге 2000 відповідно до загальних процедур, описаних виробником; радіоїмуноаналіз із використанням радіоактивно міченого цільового антигену; або іншим методом, відомим фахівцям у даній області. Дані афінності можуть бути проаналізовані, наприклад, методом 5саїснага еї аІ.,, Апп М.М. Асай. 5сі, 51:660 (1949). Обмірювана афінність конкретної антитіло-антиген взаємодії може змінюватися при вимірюванні в різних умовах, наприклад, концентрації солі, рН. Таким чином, вимірювання афінності й інших антигензв'язуючих параметрів, наприклад, КО, ІСзо, переважно проводять у стандартизованих розчинах антитіла й антигену, і стандартизованому буфері.
Використовуваний тут термін «ізотип» належить до класу антитіл (наприклад ІЗ9М або досі), кодованих генами константної області важкого ланцюга.
Використовуваний тут термін «перемикання ізотипа» належить до феномена, внаслідок якого клас або ізотип антитіла переходить із одного класу в один з інших класів Ід.
Термін «природний», використовуваний тут, застосовують до об'єкта для позначення того факту, що цей об'єкт може бути виявлений у природних умовах. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, яка присутня в організмі (включаючи віруси), яка може бути виділена із природного джерела і яка не була навмисно модифікована людиною в лабораторних умовах, є природною.
Термін «реаранжирований», використовуваний тут, належить до конфігурації локусу важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобуліну, де положення сегмента М знаходиться в безпосередній близькості до сегмента 0-) або У у конформації, що кодує в основному повний домен МН або Мі, відповідно. Реаранжирований локус гена імуноглобуліну (антитіла) може бути ідентифікований шляхом порівняння із ДНК зародкової лінії; реаранжирований локус буде
Зо містити щонайменше один, що піддався рекомбінації гептамерний/нонамерний гомологічний елемент.
Термін «нереаранжирований» або «конфігурація зародкової лінії», використовуваний тут відносно сегмента У, належить до конфігурації, у якій сегмент М не зазнає рекомбінації, при якій він знаходився би в безпосередній близькості до сегмента О або ..
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент за винаходом має здатність зв'язуватися з
СІ ОМ18.2, тобто здатність зв'язуватися з епітопом, присутнім в СІ 0ОМ18.2, переважно епітопом, розташованим у межах позаклітинних доменів СІ 0ОМ18.2, особливо, першій позаклітинній петлі, переважно, у положеннях амінокислот з 29 по 78 СІ ОМ18.2. У конкретних варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, зв'язується з епітопом на СІ ОМ18.2, який не є присутнім на СІ ОМ18.1.
Агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, переважно зв'язується з СІ ОМ18.2, але не з СГ ОМ18.1. Переважно, агент, що має здатність зв'язуватися з СІ 0ОМ18.2, є специфічним відносно СІ ОМ18.2. Переважно, агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, зв'язується з
СІ ОМІ1 18.2, що експресується на клітинній поверхні. В особливо кращих варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, зв'язується з нативними епітопами СІ ОМ18.2, присутніми на поверхні живих клітин.
У кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить варіабельну область важкого ланцюга (УН), яка містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 5, 6, 7, 8, 9, 10 і їх фрагментів.
У кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), яка містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 їі їх фрагментів.
У деяких кращих варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ), вибрану з наступних можливих варіантів з (і) по (їх): (Ї) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 5, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 12, або її фрагмент; (і) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 6, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 11, або її фрагмент; 60 (ії) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 7, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 13, або її фрагмент; (ім) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 9, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16, або її фрагмент; (М) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 8, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 15, або її фрагмент; (м) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 10, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 14, або її фрагмент; (мі) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5БО ІЮ МО: 10, або її фрагмент, і МІ містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 17, або її фрагмент; (мії) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 10, або її фрагмент, і МІ містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 18, або її фрагмент; (їх) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 10, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ХЕО ІЮ МО: 19, або її фрагмент.
В особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 8, або її фрагмент, і М. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 15, або її фрагмент.
У наступному, особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СІ ОМ18.2, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 6, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 11, або її фрагмент.
Термін «фрагмент» належить, зокрема, до однієї або декількох визначаючих комплементарність областей (СОК), переважно щонайменше варіабельної області СОВЗ, варіабельної області важкого ланцюга (МН) і/або варіабельної області легкого ланцюга (М). В одному варіанті здійснення зазначена одна або декілька визначаючих комплементарність
Зо областей (СОМ) вибрані із групи визначаючих комплементарність областей СОКІ, СОК2 і
СОКЗ. В особливо кращому варіанті здійснення термін «фрагмент» належить до визначаючих комплементарність областей СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН) і/або варіабельної області легкого ланцюга (МІ).
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент, що містить одну або декілька СОЕ, набір 35 СОМ або комбінацію наборів СОЖК, як описано тут, містить зазначені СОК разом з розташованими між ними каркасними областями. Переважно, частина буде також містити щонайменше приблизно 50 95 однієї із двох або обох першої й четвертої каркасних областей, при цьому 50 956 являють собою С-кінцеві 50 95 першої каркасної області й М-кінцеві 50 905 четвертої каркасної області. Конструювання з'єднувальних агентів, здійснюване способами на 40 основі рекомбінантної ДНК, може приводити до введення М- або С-кінцевих залишків у варіабельні області, кодованих лінкерами, уведеними для того, щоб полегшити клонування або інші стадії обробки, включаючи введення лінкерів, щоб з'єднати варіабельні області згідно з винаходом з додатковими послідовностями білка, включаючи важкі ланцюги імуноглобуліну, інші варіабельні домени (наприклад при одержанні діатіл) або білкові мітки. 45 В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент, що містить одну або декілька СОК, набір
СОК або комбінацію наборів СОК, як описано тут, містить зазначені СОК у каркасній області людського антитіла.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент за винаходом має здатність зв'язуватися з
СІОМб, тобто здатність зв'язуватися з епітопом, присутнім в СІ ОМб, переважно епітопом, 50 розташованим у межах позаклітинних доменів СІ ОМб, зокрема, у першій позаклітинній петлі, переважно в положеннях амінокислот з 28 по 76 СІ ОМб, або в другій позаклітинній петлі, переважно в положеннях амінокислот з 141 по 159 СІ ОМ6. У конкретних варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язується з епітопом на СІ ОМб, який не є присутнім на СІ ОМ9. Переважно, агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язується з 55 епітопом на СІ ОМб, який не є присутнім на СІ ОМА і/або СІ ОМ3. Найбільше переважно, агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язується з епітопом на СІ ОМб, який не є присутнім на білку СІ ОМ, відмінному від СІ 0ОМб.
Агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, переважно зв'язується з СІ ОМб, але не з
СІГОМО, і переважно не зв'язується з СІ ОМА і/або СІ ОМ3. Переважно, агент, що має здатність 60 зв'язуватися з СІ ОМб, є специфічним відносно СІ ОМб. Переважно, агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язується з СІ ОМб, що експресується на клітинній поверхні. В особливо кращих варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язується з нативними епітопами СІ ОМб, присутніми на поверхні живих клітин.
У кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, містить варіабельну область важкого ланцюга (УН) амінокислотну послідовність, що містить, вибрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 20, 22, 24, 26 і їх фрагментів.
У кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ) амінокислотну послідовність, що містить, вибрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 21, 23, 25, 27, 28, 29, 97, 98, 99, 100 і їх фрагментів.
У певних кращих варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ Мб, містить комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ), вибрану з наступних можливих варіантів від (Її) до (хі): (Ї) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІО МО: 20, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 21, або її фрагмент; (і) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 23, або її фрагмент; (ії) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 24, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 25, або її фрагмент; (ім) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 26, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 27, або її фрагмент; (мМ) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 21, або її фрагмент; (м) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 22, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 28, або її фрагмент; (мі) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕБО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і МІ містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 29, або її фрагмент; (мії) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і МІ містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 97, або її
Зо фрагмент; (їх) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 22, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ХЕО ІЮ МО: 98, або її фрагмент; (Х) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ХЕО ІЮ МО: 99, або її фрагмент; (хі) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 22, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 100, або її фрагмент.
В особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СІ ОМб, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 23, або її фрагмент.
У додатковому особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СІ ОМб, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (УН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 97, або її фрагмент.
У додатковому особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СІ ОМб, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
БО МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 98, або її фрагмент.
У додатковому особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СІ ОМб, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (УН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 99, або її фрагмент.
У додатковому особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СІ ОМб, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ): 60 МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 22, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 100, або її фрагмент.
Термін «фрагмент» належить, зокрема, до однієї або декількох визначаючих комплементарність областей (СОК), переважно щонайменше варіабельної області СОКЗ, варіабельної області важкого ланцюга (МН) і/або варіабельної області легкого ланцюга (М). В одному варіанті здійснення зазначена одна або декілька визначаючих комплементарність областей (СОК) вибрані з набору визначаючих комплементарність областей СОКІ, СОК2 і
СОКЗ. В особливо кращому варіанті здійснення термін «фрагмент» належить до визначаючих комплементарність областей СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН) і/або варіабельної області легкого ланцюга (МІ).
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент, що містить одну або декілька СОК, набір
СОК або комбінацію наборів СОЖК, як описано тут, містить зазначені СОК разом з розташованими між ними каркасними областями. Переважно, частина буде також містити щонайменше приблизно 50 95 однієї із двох або обох першої й четвертої каркасних областей, при цьому 50 956 являють собою С-кінцеві 50 95 першої каркасної області й М-кінцеві 50 905 четвертої каркасної області. Конструювання з'єднувальних агентів, здійснюване способами на основі рекомбінантної ДНК, може приводити до введення М- або С-кінцевих залишків у варіабельні області, кодованих лінкерами, уведеними для того, щоб полегшити клонування або інші стадії обробки, включаючи введення лінкерів, щоб з'єднати варіабельні області згідно з винаходом з додатковими послідовностями білка, включаючи важкі ланцюги імуноглобуліну, інші варіабельні домени (наприклад при одержанні діатіл) або білкові мітки.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент, що містить одну або декілька СОК, набір
СОК або комбінацію наборів СОК, як описано тут, містить зазначені СОК у каркасній області людського антитіла.
Анти-СОЗ антитіла, які є придатними для забезпечення з'єднувальних агентів відповідно до винаходу, включають, але без обмеження, ОСНТ1-Н5 (гуманізоване МАВ), ОСНТІ1-ММ (мишаче
МАВ), СІ В-ТЗ3, ТАбб, 145-2С11.
ОСНТІ1 є моноклональне ІдДС1 анти-СОЗ моноклональним антитілом, яке детектує СОЗ у людини й приматів. СГВ-ТЗ3 є мишачим моноклональним анти-СОЗ антитілом, яке спрямоване проти антигену СОЗ і взаємодіє з 80-90 95 людських периферичних Т-лімфоцитів і медулярних
Зо тимоцитів. ТК6б є мишачим ІдО1 моноклональним анти-СОЗ антитілом, яке розпізнає епсилон- ланцюг людського СОЮЗ. 145-2С11 є моноклональним антитілом сірого хом'ячка проти мишачого
Со3.
Переважно, області МН і Мі з'єднувального домена СОЗ3 отримані з молекул антитіл/антитіла й подібних антитілу молекул, які здатні специфічно розпізнавати людський СОЗ у контексті інших субодиниць ТСЕ, які присутні на активованих первинних людських Т-клітинах, експресуючих ТСК у своїй нативній конфігурації. Області МН їі Мі, отримані з антитіла, специфічного відносно СЮ З-епсилон ланцюга, є найбільш бажаними, і зазначені (батьківські) антитіла повинні бути здатні специфічно зв'язувати епітопи, що відображають нативну або близьку до нативної структуру, або конформаційний епітоп людського СОЗ, представлений у контексті комплексу ТСК. У кращому варіанті здійснення винаходу області МН і мМ. з'єднувального домена СОЗ отримані з СО З3-специфічного антитіла, вибраного із групи, яка складається з ШСНТ1-Н5, ОСНТІ1-ММ, СІ В-Т3 і ТКб66б, переважно Т66.
У кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СОЗ, містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 30, 32, 34, 36, 94, 95 і їх фрагментів.
У кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СОЗ, містить варіабельну область легкого ланцюга (М), що містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 31, 33, 35, 37, 96 і їх фрагментів.
У певних кращих варіантах здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СОЗ, містить комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (УН) і варіабельної області легкого ланцюга (М), вибрану з наступних можливих варіантів з (ї) по (їх): (Ї) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІО МО: 30, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 31, або її фрагмент; (і) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 32, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ХЕО ІЮ МО: 33, або її фрагмент; (ії) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 34, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 34, або її фрагмент; (ім) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 36, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 37, або її фрагмент; 60 (М) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 94, або її фрагмент,
і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 37, або її фрагмент; (м) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 95, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 37, або її фрагмент; (мі) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕБО ІЮ МО: 36, або її фрагмент, і МІ містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЗЕО ІЮ МО: 96, або її фрагмент; (мії) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 94, або її фрагмент, і МІ містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 96, або її фрагмент; (їх) МН містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 95, або її фрагмент, і МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ХЕО ІЮ МО: 96, або її фрагмент.
В особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з СОЗ, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 36, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 37, або її фрагмент.
У додатковому особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СО3, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 94, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 37, або її фрагмент.
У додатковому особливо кращому варіанті здійснення агент, що має здатність зв'язуватися з
СО3, містить наступну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ):
МН містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 95, або її фрагмент, і
МІ. містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 96, або її фрагмент.
Термін «фрагмент» належить, зокрема, до однієї або декількох визначаючих комплементарність областей (СОК), переважно щонайменше варіабельної області СОКЗ, варіабельної області важкого ланцюга (МН) і/або варіабельної області легкого ланцюга (М). В одному варіанті здійснення зазначена одна або декілька з визначаючих комплементарність областей (СОК) вибрані з набору визначаючих комплементарність областей СОКІ, СОН? і
СОКЗ. В особливо кращому варіанті здійснення термін «фрагмент» належить до визначаючих комплементарність областей СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН) і/або варіабельної області легкого ланцюга (МІ).
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент, що містить одну або декілька СОК, набір
СОК або комбінацію наборів СОЖК, як описано тут, містить зазначені СОК разом з розташованими між ними каркасними областями. Переважно, частина буде також містити щонайменше приблизно 50 95 однієї із двох або обох першої й четвертої каркасних областей, при цьому 50 956 являють собою С-кінцеві 50 95 першої каркасної області й М-кінцеві 50 905 четвертої каркасної області. Конструювання з'єднувальних агентів, здійснюване способами на основі рекомбінантної ДНК, може приводити до введення М- або С-кінцевих залишків у варіабельні області, кодованих лінкерами, уведеними для того, щоб полегшити клонування або інші стадії обробки, включаючи введення лінкерів, щоб з'єднати варіабельні області згідно з винаходом з додатковими послідовностями білка, включаючи важкі ланцюги імуноглобуліну, інші варіабельні домени (наприклад при одержанні діатіл) або білкові мітки.
В одному варіанті здійснення з'єднувальний агент, що містить одну або декілька СОК, набір
СОК або комбінацію наборів СОК, як описано тут, містить зазначені СОР. у людській каркасній області.
Відповідно до винаходу кращий з'єднувальний агент, що направлено впливає на СІ ОМ18.2,
БО містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІО МО: 38, 39, 40 і 41 або їх варіантів.
Відповідно до винаходу наступний кращий з'єднувальний агент, що направлено впливає на
СІ ОМ18.2, містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92 ії 93, або їх фрагментів або варіантів. В одному варіанті здійснення зазначена амінокислотна послідовність позбавлена сигналів секреції, таких як М-кінцеві сигнали секреції, зокрема, послідовності згідно з 5ХЕО ІЮ МО: 51, і/або позбавлена Нів-міток, таких як С-кінцеві Ніб- мітки, зокрема, послідовності Спу-Ссту-зег-(Нів)вє або (Нів)є, у випадку присутності.
Відповідно до винаходу кращий з'єднувальний агент, що направлено впливає на СІ ЮОМб, 60 містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 42, 43, 44 і
45 або їх варіантів.
Відповідно до винаходу наступний кращий з'єднувальний агент, що направлено впливає на
СІ ОМб, містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 і 65, або їх фрагментів або варіантів. В одному варіанті здійснення зазначена амінокислотна послідовність позбавлена сигналів секреції, таких як М-кінцеві сигнали секреції, зокрема, послідовності згідно з ФЕО ІЮО МО: 51, і/або позбавлена Нівб-міток, таких як С- кінцеві Ніз-мітки, зокрема, послідовності СіІу-спіу-5ег-(Нів)є або (Нів)є, у випадку присутності.
Слід розуміти, що з'єднувальні агенти, описані тут, можуть бути доставлені пацієнтові шляхом уведення нуклеїнової кислоти, такої як РНК, що кодує агент і/або шляхом уведення клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, таку як РНК, що кодує агент. Таким чином, нуклеїнова кислота, що кодує з'єднувальний агент, при введенні пацієнтові, може бути присутня у вільній формі або в придатному носії для доставки, наприклад у формі ліпосом або вірусних часток, або в межах клітини-хазяїна. Забезпечена нуклеїнова кислота може продукувати агент протягом тривалих періодів часу пролонгованим чином, пригнічуючи нестійкість, щонайменше частково, спостережувану відносно терапевтичних антитіл, особливо біспецифічних антитіл.
Нуклеїнові кислоти, що підлягають доставці пацієнтові, можуть бути отримані за допомогою рекомбінантних способів. Якщо нуклеїнову кислоту вводять пацієнтові при присутності в клітині- хазяїні, вона переважно поглинається клітинами пацієнта для експресії з'єднувального агента, кодованого нуклеїновою кислотою. Якщо нуклеїнову кислоту вводять пацієнтові у випадку присутності в клітині-хазяїні, вона переважно експресується клітиною-хазяїном в організмі пацієнта таким чином, щоб продукувати з'єднувальний агент, кодований нуклеїновою кислотою.
Термін «рекомбінантний» у контексті даного винаходу означає «виготовлений методом генної інженерії» Переважно, «рекомбінантний об'єкт», такий як рекомбінантна нуклеїнова кислота, у контексті даного винаходу не має природного походження.
Термін «природний», використовуваний тут, належить до того факту, що об'єкт може бути виявлений у природних умовах. Наприклад, пептид або нуклеїнова кислота, яка присутня в організмі (включаючи віруси), і яка може бути виділена із природного джерела, і не була навмисно модифікована людиною в лабораторних умовах, є природною.
Термін «нуклеїнова кислота», використовуваний тут, означає включення ДНК і РНК, таку як
Зо геномна ДНК, кКДНК, мРНК, рекомбінантно отримані й хімічно синтезовані молекули. Нуклеїнова кислота може бути однонитковою або двонитковою. РНК включає транскрибовану іп міго РНК (ІМТ КМА) або синтетичну РНК.
Нуклеїнові кислоти можуть бути включені у вектор. Термін «вектор», використовуваний тут, включає будь-які вектори, відомі фахівцеві в даній області, включаючи плазмідні вектори, космідні вектори, фагові вектори, такі як фаг лямбда, вірусні вектори, такі як аденовірусні або бакуловірусні вектори, або вектори на основі штучних хромосом, таких як бактеріальні штучні хромосоми (ВАС), штучні хромосоми дріжджів (УАС), або штучні хромосоми на основі РІ (РАС).
Зазначені вектори включають експресійні, а також клонуючі вектори. Експресійні вектори містять плазміди, а також вірусні вектори, і звичайно містять бажану кодуючу послідовність і відповідні послідовності ДНК, необхідні для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності в конкретному хазяїні-організмі (наприклад бактерії, дріжджі, рослина, комаха або ссавець) або в експресійних системах іп міго. Клонуючі вектори звичайно використовуються для створення й ампліфікації певних бажаних фрагментів ДНК і можуть бути позбавлені функціональних послідовностей, необхідних для експресії бажаних фрагментів ДНК.
У контексті даного винаходу термін «РНК» належить до молекули, яка містить рибонуклеотидні залишки й, переважно, повністю або, по суті, складається з рибонуклеотидних залишків. «Рибонуклеотид» належить до нуклеотиду, що містить гідроксильну групу в 2- положенні В-О-рибофуранозильної групи. Термін включає дволанцюгову РНК, одноланцюгову
РНК, виділену РНК, таку як частково очищена РНК, по суті, чиста РНК, синтетичну РНК, отриману рекомбінантними методами РНК, а також модифіковану РНК, яка відрізняється від природної РНК за рахунок внесення в неї добавки, делеції, заміщення й/або зміни одного або декількох нуклеотидів. Такі зміни можуть включати додавання матеріалу ненуклеотидної природи, такі як добавки, що містяться на одному або обох кінцях молекули РНК або введені усередину молекули, наприклад локалізовані в одному або декількох нуклеотидах у складі РНК.
Нуклеотиди в складі молекул РНК можуть також включати нестандартні нуклеотиди, такі як нуклеотиди неприродного походження, або хімічно синтезовані нуклеотиди, або дезоксинуклеотиди. Зазначені змінені РНК можуть розглядатися як аналоги або аналоги природних РНК.
Відповідно до даного винаходу термін «РНК» включає й переважно належить до «мРНК», бо що означає «месенджер РНК» і належить до «транскрипту», який може бути отриманий з використанням ДНК як матриці й кодує пептид або білок мРНК звичайно містить 5' нетрансльовану область (5'-0ТЕ), область, що кодує білок або пептид, і 3' нетрансльовану область (3'-ОТК). мРНК має обмежений час напівжиття в клітинах і іп міго. Переважно, мРНК одержують шляхом іп міго транскрипції з використанням матриці ДНК. В одному варіанті здійснення РНК отримана шляхом іп мійго транскрипції або хімічного синтезу. Метод транскрипції іп міго відомий для фахівців у даній області. Наприклад, існують різні комерційно доступні набори для міїго транскрипції.
В одному варіанті здійснення даного винаходу РНК є РНК, що самореплікується, такою як одноланцюгова РНК, що самореплікується. В одному варіанті здійснення РНК, що самореплікується є одноланцюговою позитивно-полярною РНК, що самореплікується. В одному варіанті здійснення РНК, що самореплікується, є вірусною РНК або РНК, отриманою з вірусної
РНК. В одному варіанті здійснення РНК, що самореплікується, є альфавірусною геномною РНК або РНК, отриманою з геномів альфавірусів. В одному варіанті здійснення РНК, що самореплікується, є експресійним вектором на основі вірусних генів. В одному варіанті здійснення вірус є вірусом лісу Семліки. В одному варіанті здійснення РНК, що самореплікується, містить один або декілька трансгенів, при цьому щонайменше один із зазначених трансгенів кодує з'єднувальний агент, описаний тут. В одному варіанті здійснення, якщо РНК є вірусною РНК або отримана з вірусної РНК, трансгени можуть частково або повністю заміняти вірусні послідовності, такі як вірусні послідовності, що кодують структурні білки. В одному варіанті здійснення РНК, що самореплікується, є іп міго транскрибованою РНК.
Геном альфавірусів є одноланцюговою позитивно-полярною РНК (55КМА(жх)), яка кодує дві відкриті рамки зчитування (ОКЕ) для великих поліпротеїнів. ОКЕ на 5'-кінці генома кодує неструктурні білки з п5Р1 по поРа4 (п5РІ-4), які транслюються й процесуються в РНК-залежну
РНК-полімеразу (репліказу); ОКЕ на 3-кінця кодує структурні білки - капсид і глікопротеїни.
Обидві ОКЕ розділені так званим субгеномним промотором (5ОР), який управляє транскрипцією структурної ОКЕ. При використанні як генних векторів структурні білки, розташовані перед субгенним промотором (5ОР), звичайно замінені трансгенами. Для впакування таких векторів у вірусні частки структурні білки звичайно експресуються іп їгапо5 з хелперних конструкцій. Реплікація альфавірусів відбувається в цитоплазмі інфікованих клітин,
Зо винятково на рівні РНК. Після інфікування геном 55КМА(ж) діє як мРНК для трансляції прекурсору поліпротеїну п5Р1234, який знаходиться на ранніх стадіях життєвого циклу вірусів, аутопротеолітично процесований у фрагменти п5Р123 і п5Р4. Фрагменти п5Р123 і п5Р4 формують (-)нитковий комплекс реплікази, який транскрибує (-)ниткову РНК із матриці геномної
РНК. На більш пізніх стадіях поліпротеїн пеР1234 повністю розщеплюється на одиночні білки, які збираються в (ж)нитковий комплекс реплікази, який синтезує нові (к)ниткові геноми, а також субгеномні транскрипти, які кодують структурні білки або трансгени. Субгеномна РНК, а також нова геномна РНК є кепованою і поліаденільованою і, таким чином, розпізнається як мРНК після інфікування клітин-мішеней. Тільки нова геномна РНК містить сигнал упакування, який забезпечує особливе впакування геномної РНК усередину, вібріонів, що брунькуються.
Привабливість альфавірусних репліконів для векторології основана на позитивній орієнтації кепованого й поліаденільованого генома РНК. Трансльований реплікон РНК може бути легко синтезований іп міго, при цьому кеповання може бути досягнуте за допомогою кеп-аналога, доданого в реакцію транскрипції іп мійго, і полі(А)-хвости можуть бути кодовані як сліди політімідилової кислоти (роїу-Т) на плазмідних матрицях. Транскрибовані іп міго (ІМТ) реплікони трансфікують традиційними методами трансфекції й навіть низькі кількості вихідної ІМТ КМА швидко розмножувалися. За кілька годин після переносу трансгени, які поміщають нижче по ходу транскрипції від ОР, транскрибувалися у велику кількість копій, приблизно від 40000 до 200000 копій субгеномної РНК на клітину, таким чином, не дивно, що експресія рекомбінантних білків є високою. Залежно від певної мети, ІМТ реплікони можуть бути трансфіковані прямо в клітини-мішені й упаковані в альфавірусні частки з хелперними векторами, які забезпечують структурні гени іп їгап5. Перенос у шкіру або м'язи приводить до високої й стійкої локальної експресії, поряд із сильною індукцією гуморальної й клітинної імунної відповіді.
Для збільшення експресії й/або стабільності РНК, використовуваної відповідно до даного винаходу, РНК може бути модифікована, переважно без зміни послідовності експресованого пептиду або білка.
Термін «модифікація» у контексті РНК, використовуваний відповідно до даного винаходу, включає будь-яку модифікацію РНК, яка природним шляхом не є присутня у зазначеній РНК.
В одному варіанті здійснення винаходу РНК, використовувана відповідно до винаходу, не містить некепованих 5'-трифосфатів. Видалення таких некепованих 5'--рифосфатів може бути 60 досягнуте шляхом обробки РНК фосфатазою.
РНК відповідно до винаходу може бути модифікована рибонуклеотидами природного походження або синтетичними для збільшення її стабільності й/або зменшення цитотоксичності.
Наприклад, в одному варіанті здійснення в РНК, використовуваної відповідно до винаходу, цітидин заміняли частково або повністю, переважно повністю, на 5-метилцітидин.
Альтернативно або додатково, в одному варіанті здійснення в РНК, використовуваної відповідно до винаходу, уридин заміняли частково або повністю, переважно повністю, на псевдоуридин.
В одному варіанті здійснення термін «модифікація» належить до забезпечення РНК із 5'- кепом або аналогом 5'-кепа. Термін «5'-кеп» належить до кеп-структури, виявленої на 5'-кінці молекули мРНК і, як правило, складається з гуанозинового нуклеотида, з'єднаного із мРНК за допомогою незвичайного 5-5 трифосфатного зв'язку. В одному варіанті здійснення цей гуанозин метильований в 7-положенні. Термін «типовий 5'-кеп» належить до 5-кепа РНК природного походження, переважно 7-метилгуанозинового кепа (птт/(б). У контексті даного винаходу термін «5'-кеп» включає аналог 5'-кепа, який має подібність із кеп-структурою РНКі є модифікованим для прояву здатності стабілізувати РНК у випадку приєднання до неї, переважно іп мімо і/або в клітині.
Забезпечення РНК 5'і-кепом або аналогом 5-кепа може бути досягнуте шляхом іп міго транскрипції ДНК-матриці в присутності зазначеного 5'-кепа або аналога 5'-кепа, при цьому зазначений 5'-кеп є котранскрипційно вбудованим в утворену нитку РНК, або РНК може бути утворена, наприклад, шляхом іп міго транскрипції, і 5'-кеп може бути прикріплений до РНК пост- транскрипційно з використанням кепуючих ферментів, наприклад кепуючих ферментів вірусу осповакцини.
РНК може містити додаткові модифікації. Наприклад, додаткова модифікація РНК, використовувана в даному винаході, може бути подовженням або вкороченням полі(А)-хвоста природного походження або зміною 5- або 3'-нетрансльованих областей (ТК), таким як уведення ИТЕ, яка не належить до кодуючої області, зазначеної РНК, наприклад вставці однієї або більше, переважно двох копій 3'-/ТЕ, отриманих з гена глобіна, такого як альфа-2-глобін, альфа-1-глобін, бета-глобін, переважно бета-глобін, більш переважно людський бета-глобін.
Таким чином, для підвищення стабільності й/або експресії РНК, використовуваної відповідно до даного винаходу, РНК може бути модифікована таким чином, щоб бути присутньою разом з послідовністю полі-А, що переважно має довжину від 10 до 500, більш переважно від 30 до 300, навіть більш переважно від 65 до 200, і особливо переважно від 100 до 150 аденозинових залишків. В особливо кращому варіанті здійснення послідовність полі-А має довжину приблизно 120 аденозинових залишків. Крім того, вбудовування двох або більш 3'-нетрансльованих областей (ШТК) в 3'-нетрансльовану область молекули РНК може привести до посилення ефективності трансляції. В одному конкретному варіанті здійснення 3'-0ТЕК отримана з гена рД- глобіна людини.
Переважно, РНК при доставці, тобто трансфекції в клітину, зокрема клітину, що присутня іп мімо, експресує білок, пептид або антиген, який вона кодує.
Термін "трансфекція» належить до введення нуклеїнових кислот, зокрема РНК, у клітину. З метою даного винаходу термін «трансфекція» також включає введення нуклеїнової кислоти в клітину або захоплення нуклеїнової кислоти такою клітиною, при цьому клітина може бути присутньою у суб'єкта, наприклад пацієнта. Таким чином, відповідно до даного винаходу, клітина, призначена для трансфекції нуклеїнової кислоти, описаної тут, може бути присутньою іп міго або іп мімо, наприклад клітина може формувати частину органа, тканини й/або організму пацієнта. Відповідно до винаходу, трансфекція може бути тимчасовою або стабільною. Для деяких застосувань трансфекції досить, щоб трансфікований генетичний матеріал експресувався тільки тимчасово. Оскільки нуклеїнова кислота, уведена в процесі трансфекції, звичайно не інтегрована в ядерний геном, чужорідна нуклеїнова кислота буде розведена за допомогою мітозу або деградована. Клітини, що забезпечують епісомальну ампліфікацію нуклеїнових кислот, значно знижують швидкість розведення. Якщо бажано, щоб трансфікована нуклеїнова кислота фактично залишалася в геномі клітини і її дочірніх клітинах, повинна виникнути стабільна трансфекція. РНК може бути трансфікована в клітини для тимчасової експресії її кодованого білка.
Термін «стабільність» РНК належить до «напівжиття» РНК. «Напівжиття» належить до періоду часу, який необхідний для усунення половини активності, кількості або числа молекул. У контексті даного винаходу напівжиття РНК є показником стабільності зазначеної РНК.
Напівжиття РНК може впливати на «тривалість експресії» РНК. Можна припустити, що РНК, що має довгий період напівжиття, буде експресуватися протягом більшого періоду часу. бо У контексті даного винаходу термін «транскрипція» належить до процесу, у якому генетичний код у послідовності ДНК транскрибований у РНК. Відповідно, РНК може бути трансльована в білок. Відповідно до даного винаходу, термін «транскрипція» включає «іп міго транскрипцію», при цьому термін «іп міго транскрипція» належить до процесу, у якому РНК, зокрема мРНК, є синтезованою іп міго у безклітинній системі, переважно з використанням відповідних клітинних екстрактів. Переважно, клонуючі вектори застосовуються для утворення транскриптів. Ці клонуючі вектори, як правило, розроблені як транскрипційні вектори і відповідно до даного винаходу охоплені терміном «вектор».
Термін «трансляція» відповідно до винаходу належить до процесу в рибосомах клітини, за допомогою якого нитка месенджера РНК направляє складання послідовності амінокислот на одержання пептиду або білка.
Термін «експресія» використовується відповідно до винаходу в найбільш загальному значенні й включає продукцію РНК і/або пептидів або білків, наприклад, шляхом транскрипції й/або трансляції. відносно РНК, термін «експресія» або «трансляція» належить, зокрема, до продукції пептидів або білків. Зазначений термін також включає часткову експресію нуклеїнових кислот. Більше того, експресія може бути тимчасовою або стабільною. Відповідно до винаходу, термін «експресія» також включає «аберантну експресію» або «аномальну експресію». «Аберантна експресія» або «аномальна експресія» означає відповідно до винаходу, що експресія є зміненою, переважно збільшеною, у порівнянні з референсною експресією, наприклад, станом суб'єкта захворювання, що не має, пов'язаного з аберантною або аномальною експресією певного білка, наприклад, пухлинного антигену. Збільшення експресії належить до збільшення щонайменше на 10 95, зокрема щонайменше на 20 95, щонайменше на 50 95 або щонайменше на 100 95, або більше. В одному варіанті здійснення експресія виявляється тільки у хворій тканині, при цьому експресія в здоровій тканині є подавленою.
Термін «специфічно експресується» означає, що білок переважно експресується тільки в специфічній тканині або органі. Наприклад, пухлинний антиген, що специфічно експресується в слизовій оболонці шлунка, означає, що зазначений білок головним чином експресується в слизовій оболонці шлунка й не експресується в інших тканинах, або не експресується в значній мірі в тканинах або органах інших типів. Таким чином, білок, який експресується винятково в клітинах слизової оболонки шлунка й у значно меншому ступені в будь-якій іншій тканині, такій
Зо як насінник, специфічно експресується в клітинах слизової оболонки шлунка. У деяких варіантах здійснення пухлинний антиген також може специфічно експресуватися в нормальних умовах у тканині або органі більш ніж одного типу, наприклад в 2 або З типах тканин або органах, але переважно не більш ніж З різних типах тканин або органів. У цьому випадку пухлинний антиген потім специфічно експресується в цих органах. Наприклад, якщо пухлинний антиген експресується в нормальних умовах, переважно у приблизно рівному ступені в легені й шлунку, то зазначений пухлинний антиген специфічно експресується в легені й шлунку.
Відповідно до винаходу термін «кодуючи РНК» означає, що РНК, у випадку присутності у відповідному середовищі, переважно в межах клітини, може експресуватися із продукуванням білка або пептиду, який вона кодує.
Деякі аспекти винаходу основані на адоптивному переносі клітин-хазяїв, які трансфіковані іп міго нуклеїновою кислотою, такою як РНК, що кодує з'єднувальний агент, описаний тут, і перенесені реципієнтами, таким як пацієнти, переважно, після ех мімо експансії від низького числа копій прекурсору до клінічно значимої кількості клітин. Клітини-хазяїни, використовувані для лікування відповідно до винаходу, можуть бути аутологічними, алогенними або сингенними відносно реципієнта, що зазнає лікування.
Термін «аутологічний» використовується для опису будь-чого, що отримане від того самого суб'єкта. Наприклад, «аутологічний трансплантат» належить до тканини або органами, отриманих від того самого суб'єкта. Такі процедури є кращими, тому що вони долають імунологічний бар'єр, що в іншому випадку приводить до відторгнення.
Термін «алогенний» використовується для опису будь-чого, що отримане від різних індивідуумів однакових різновидів. Два або більше індивідуумів уважаються алогенними один одному, коли гени в одному або більше локусах не є ідентичними.
Термін «сингенний» використовується для опису будь-чого, що отримане від індивідуумів або тканин, що мають ідентичні генотипи, тобто ідентичних близнюків або тварин однакового інбредного штаму, або їх тканин.
Термін «гетерологічний» використовується для опису будь-чого, що складається з безлічі різних елементів. Наприклад, перенос кісткового мозку одного індивідуума іншому індивідуумові представляє гетерологічний трансплантат. Гетерологічний ген є геном, отриманим від джерела, відмінного від суб'єкта. 60 Термін «пептид» відповідно до винаходу включає оліго- і поліпептиди, і належить до речовин, що містять дві або більше, переважно З або більше, переважно 4 або більше, переважно 6 або більше, переважно 8 або більше, переважно 9 або більше, переважно 10 або більше, переважно 13 або більше, переважно 16 або більше, переважно 21 або більше і аж до переважно 8, 10, 20, 30, 40 або 50, зокрема 100 амінокислот, з'єднаних ковалентно пептидними зв'язками. Термін «білок» належить до великих пептидів, переважно пептидів, що містять більше 100 амінокислотних залишків, але, як правило, терміни «пептиди» і «білки» є синонімами й використовуються тут взаємозамінно.
Дані, представлені в даному документі відносно специфічних амінокислотних послідовностей, наприклад, наведених у переліку послідовностей, слід розглядати як стосовні також до варіантів зазначених специфічних послідовностей, що приводять до послідовностей, які є функціонально еквівалентними зазначеним специфічним послідовностям, наприклад амінокислотним послідовностям, що проявляють властивості, ідентичні або подібні із властивостями специфічних амінокислотних послідовностей. Однією важливою властивістю є збереження зв'язування з мішенню або забезпечення ефекторних функцій. Переважно, щоб послідовність, яка є варіантом стосовно визначеної послідовності, коли вона заміняє певну послідовність в антитілі, зберігала зв'язування зазначеного антитіла з СІ ОМ і/або СОЗ, і, переважно, функції зазначеного антитіла, описані тут, наприклад СОС-опосередкований лізис або АОСС-опосередкований лізис.
Наприклад, послідовності, представлені в переліку послідовностей, можуть бути модифіковані для видалення одного або декількох, переважно всіх вільних цистеїнових залишків, зокрема, шляхом заміни цистеїнових залишків на амінокислоти, відмінні від цистеїну, переважно серин, аланін, треонін, гліцин, тирозин, лейцин або метіонін, найбільше переважно аланін або серин. Наприклад, цистеїн у положенні 103 послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ
МО: 36 переліку послідовностей, або відповідний цистеїн у послідовності, що містить зазначену послідовність, може бути, таким чином, модифікований. Інші цистеїни, які можуть бути модифіковані таким способом, являють собою цистеїни в положенні 178 в 5ЕО ІЮ МО: 42, у положенні 197 в 5ЕО ІЮО МО: 43, у положенні 427 в 5ЕО ІЮО МО: 44 або в положенні 446 в 5ЕО ІЮ
МО: 45.
Фахівцям у даній області слід урахувати, що гіперваріабельні й варіабельні області
Зо послідовності СОК, зокрема, можуть бути модифіковані без втрати здатності зв'язування з
СІ ОМ і/або СО3. Наприклад, області СОК будуть ідентичні або високогомологічні областям антитіл, зазначених тут. Під «високогомологічними» передбачається, що від 1 до 5, переважно від 1 до 4, наприклад від 1 до 3, або 1 або 2 заміщення може бути зроблено в СОМ. Крім того, гіперваріабельні й варіабельні області можуть бути модифіковані таким чином, що вони показують значну гомологію з областями антитіл, спеціально розкритих тут.
З метою даного винаходу «варіанти» амінокислотної послідовності включають варіанти амінокислотних вставок, варіанти амінокислотних добавок, варіанти амінокислотних делецій і/або варіанти амінокислотних заміщень. Варіанти амінокислотних делецій, які містять делецію на М-кінці й/або С-кінці білка, також називаються вкороченими варіантами на М-кінці й/або С- кінці.
Варіанти амінокислотних вставок включають вставки однієї або двох, або більше амінокислот у конкретну амінокислотну послідовність. У випадку варіантів амінокислотної послідовності, що мають вставку, один або кілька амінокислотних залишків вставлені в конкретну ділянку в амінокислотній послідовності, хоча випадкова вставка при відповідному скринінгу готового продукту також є можливою.
Варіанти амінокислотного додавання включають аміно- і/або карбокси-кінцеві злиття однієї або більше амінокислот, наприклад 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислот.
Варіанти амінокислотних делецій характеризуються видаленням однієї або декількох амінокислот з послідовності, наприклад, шляхом видалення 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більш амінокислот. Делеції можуть бути в будь-якому положенні білка.
Варіанти амінокислотного заміщення характеризуються тим, що щонайменше один залишок у послідовності вилучений і на його місце вставлений інший залишок. Перевага віддається модифікаціям у положеннях в амінокислотній послідовності, які не є консервативними між гомологічними білками або пептидами, і/або заміні амінокислот іншими амінокислотами, що мають подібні властивості. Переважно, амінокислотні зміни в білкових варіантах являють собою консервативні амінокислотні зміни, тобто заміщення подібним чином заряджених або незаряджених амінокислот. Консервативна амінокислотна зміна включає заміщення однієї амінокислоти із сімейства амінокислот, які є родинними за своїми бічними ланцюгами.
Амінокислоти природного походження, як правило, діляться на чотири сімейства: кислотні бо (аспартат, глутамат), основні (лізин, аргінін, гістидин), неполярні (аланін, валін, лейцин,
ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), і незаряджені полярні амінокислоти (гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин). Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікуються як ароматичні амінокислоти.
Переважно, ступінь подібності, переважно, ідентичність між заданою амінокислотною послідовністю й амінокислотною послідовністю, яка є варіантом заданої амінокислотної послідовності, буде становити щонайменше приблизно 60 95, 65 95, 70 95, 80 95, 81 905, 82 90, 83
Фо, 84 95, 85 95, 86 95, 87 90, 88 Фо, 89 9, 90 90, 91 95, 92 Фо, 93 Фо, 94 90, 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 95 або 99 95. Ступінь подібності або ідентичність, переважно, представлена для амінокислотної області, яка становить щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 20 9б, щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 60 956, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95 або приблизно 100 95 від загальної довжини референсної амінокислотної послідовності. Наприклад, якщо референсна амінокислотна послідовність складається з 200 амінокислот, ступінь подібності або ідентичність представлена, переважно, для щонайменше 20, щонайменше 40, щонайменше 60, щонайменше 80, щонайменше 100, щонайменше 120, щонайменше 140, щонайменше 160, щонайменше 180 або приблизно 200 амінокислот, переважно безперервних амінокислот. У кращих варіантах здійснення ступінь подібності або ідентичність представлена для повної довжини референсної амінокислотної послідовності. Вирівнювання для визначення подібності послідовностей, переважно ідентичності послідовностей, може бути виконане за допомогою відомих у даній області інструментів, переважно, з використанням оптимального вирівнювання послідовностей, наприклад з використанням АїЇдп, з використанням стандартних настроювань, переважно
ЕМВО55::певдіє, Майіх: Віозхитб2, Сар Ореп 10.0, Сар Ехієпа 0.5. «Подібність послідовностей» указує процентний вміст амінокислот, які є ідентичним або які представляють консервативні амінокислотні заміщення. «Ідентичність послідовностей» між двома амінокислотним послідовностями вказує процентний вміст амінокислот, які ідентичні між послідовностями.
Термін «відсоток ідентичності» призначений для позначення відсотка ідентичних амінокислотних залишків між обома порівнюваними послідовностями, отриманого після
Зо оптимального вирівнювання, при цьому цей відсоток є винятково статистичним і відмінності між обома послідовностями розподілені випадковим чином і по всій їхній довжині. Порівняння двох амінокислотних послідовностей традиційно проводять, порівнюючи ці послідовності після вирівнювання їх оптимальним чином, при цьому зазначене порівняння може бути проведене за допомогою порівняння сегментів або з використанням «вікна порівняння» для ідентифікації й порівняння локальних областей подібності послідовності. Оптимальне вирівнювання послідовностей для їхнього порівняння може бути здійснене також і вручну із застосуванням алгоритму локальної гомології 5тіййп ії Умаїегтап, 1981, Ааз Арр. мМаїйб. 2, 482, із застосуванням алгоритму локальної гомології МедаІетанп і Ууип5сп, 1970, 9. Мої. Віої. 48, 443, із застосуванням аналогічного способу пошуку Реагзоп і Гіртап, 1988, Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 85, 2444, або із застосуванням пакетів комп'ютерних програм, що використовують ці алгоритми (САР, ВЕЗТРЇІТ,
ЕАЗТА, ВІ АЗТ Р, ВІ АЗТ М і ТЕРАЗТА у пакеті програм УмМізсопзіп Сепеїйсз Бопмаге РасКаде,
Сепеїїсв Сотршиїег Стоир, 575 5сієпсе Огме, Мадізоп, М/ів.).
Відсоток ідентичності розраховують, визначаючи число ідентичних положень, загальних для двох порівнюваних послідовностей, і роблячи розподіл цього числа на загальне число положень у вікні порівняння, і роблячи множення отриманого результату на 100 для одержання відсотка ідентичності між обома цими послідовностями.
З'єднувальні агенти за винаходом можуть бути отримані внутрішньоклітинно (наприклад у цитозолі, периплазмі або тільцях включення) і потім виділені із клітин-хазяїв і необов'язково додатково очищені; або вони можуть бути отримані позаклітинно (наприклад у середовищі, у якому клітини-хазяїни вирощуються) і потім виділені з культурального середовища й необов'язково додатково очищені. Способи й реагенти, використовувані для одержання рекомбінантних поліпептидів, такі як специфічні придатні експресійні вектори, методи трансформації або трансфекції, селективні маркери, способи індукції експресії білка, умови вирощування й таке інше, є відомими в даній області. Аналогічно, технології виділення й очищення добре відомі фахівцям у даній області.
Термін «клітина» або «клітина-хазяїн» переважно належить до інтактної клітини, тобто клітини з інтактною мембраною, яка не вивільняє свої нормальні внутрішньоклітинні компоненти, такі як фермени, органели або генетичний матеріал. Інтактна клітина переважно є життєздатною клітиною, тобто живою клітиною, здатною виконувати свої нормальні метаболичні 60 функції. Переважно, зазначений термін належить відповідно до винаходу до будь-якої клітини,
яка може бути трансфікована екзогенною нуклеїновою кислотою. Переважно, щоб клітина при трансфекції екзогенною нуклеїновою кислотою й переносі реципієнтові могла експресувати нуклеїнову кислоту в реципієнта. Термін «клітина» включає бактеріальну клітину; інші придатні клітини являють собою клітини дріжджів, клітини грибів або клітини ссавців. Придатні бактеріальні клітини включають клітини від грамнегативних штамів бактерій, таких як штами
Евспегіснпіа сої, Ргоїеив і Рзейдотопав, і грампозитивні штами бактерій, такі як штами Васійс5,
Зігеріотусе5, еїарпуіососсив і І асіососси5. Придатні клітини грибів включають клітини від різновидів Тгісподегта, Меигозрога і АзрегуйШи5. Придатні клітини дріжджів включають клітини від видів засспаготусе5 (наприклад, засспаготусе5 сегемізіає), Зспі7озасспаготусев (наприклад, 5спі2о засспаготусез ротре), Ріспіа (наприклад, Ріспіа разіогіз і Ріспіа теїпапоїїса) і Напзепшіа. Придатні клітини ссавців включають, наприклад, клітини СНО, клітини ВНК, клітини
Неїа, клітини СО5, 293 НЕК ії таке інше. Однак клітини земноводних, клітини комах, клітини рослин і будь-які інші клітини, використовувані в даній області для експресії гетерологічних білків, також можуть бути використані. Клітини ссавців є особливо бажаними для адоптивного переносу, такі як клітини від людини, мишей, хом'яків, свиней, овець і приматів. Клітини можуть бути отримані з різноманітних типів тканин і включають первинні клітини й клітинні лінії, такі як клітини імунної системи, зокрема, антигенпредставляючі клітини, такі як дендритні клітини й Т- клітини, стовбурні клітини, такі як гематопоетичні стовбурні клітини й мезенхимальні стовбурні клітини, і інші типи клітин. Антигенпредставляюча клітина являє собою клітину, яка представляє антиген за допомогою його зв'язування з головним комплексом гістосумісності на своїй поверхні. Т-клітини можуть розпізнавати цей комплекс із використанням свого Т-клітинного рецептора (ТОК).
Термін «скорочувати», «зменшувати» або «інгібувати», використовуваний тут, означає загальне зменшення або здатність викликати загальне зменшення краще на 5 95 або більше, на 10 95 або більше, на 20 95 або більше, більш переважно на 50 95 або більше, і найбільше переважно на 75 95 або більше рівня експресії або рівня проліферації клітин.
Терміни, такі як «збільшує» або «підсилює», переважно, належать до збільшення або посилення приблизно, щонайменше на 10 95, переважно щонайменше на 20 95, переважно щонайменше на 30 95, більш переважно щонайменше на 40 95, більш переважно щонайменше
Зо на 50 95, навіть більш переважно щонайменше на 80 95, і найбільше переважно щонайменше на 100 95, щонайменше на 200 9565, щонайменше на 500 95, щонайменше на 1000 95, щонайменше на 10000 95, або навіть більше.
Антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність
АОСС описує здатність ефекторних клітин, зокрема лімфоцитів, знищувати клітини, що переважно вимагає мічення клітини-мішені антитілом.
АрСС переважно виникає, коли антитіла зв'язуються з антигенами на пухлинних клітинах і домени Ес антитіла зв'язуються з Ес-рецепторами (ЕсК) на поверхні імунних ефекторних клітин.
Ідентифіковано кілька сімейств Ес-рецепторів, і специфічні клітинні популяції характерним чином експресують певні Ес-рецептори. АОСС може розглядатися як механізм прямої індукції мінливого ступеня негайної деструкції пухлини, що приводить до презентації антигену й індукції пухлиноспрямованих Т-клітинних відповідей. Переважно, індукція АОСС іп мімо буде приводити до пухлиноспрямованих Т-клітинних відповідей і гуморальних імунних відповідей організма- хазяїна.
Комплементзалежна цитотоксичність
Комплементзалежна цитотоксичність (СОС) є іншим способом знищення клітин, який може направлятися антитілами. (ЯМ є найбільш ефективним ізотипом для активації комплементу.
Обидва, Ідс1 ії дО3, також є ефективними відносно направлення СОС класичним шляхом активації системи комплементу. Переважно, у цьому каскаді, утворення комплексів антиген- антитіло приводить до появи безлічі ділянок зв'язування С1д у безпосередній близькості на доменах Сна2г молекул антитіла, що беруть участь, таких як молекули Ідс (С14 є одним із трьох субкомпонентів комплементу С1). Переважно, ці з'єднувальні ділянки С1д переводять раніше низькоафінні взаємодії С1дД-Ідо у взаємодії з високою авидністю, які запускають каскад подій, у які залучені серії інших білків комплементу, і приводять до протеолітичного вивільнення хемотаксичних/активуючих агентів, СЗа і Сба. Переважно, каскад комплементу закінчується утворенням мембраноатакуючого комплексу, який створює пори в клітинній мембрані, що сприяють вільному проходженню води й розчинених речовин усередину й назовні клітини.
Антитіла, описані тут, наприклад для забезпечення областей МІ і УН, можуть бути отримані з використанням безлічі відомих технологій, таких як стандартна технологія гібридизації соматичних клітин КоПіег і Міїбіеійп, Маїшге 256: 495 (1975). Хоча процедури гібридизації бо соматичних клітин є кращими, у принципі можуть бути використані інші технології одержання моноклональних антитіл, наприклад, трансформація В-лімфоцитів вірусами або онкогенами, або технологія представлення на фагах з використанням бібліотек генів антитіл.
Кращою тваринною системою одержання гібридом, які продукують моноклональні антитіла, є мишача система. Одержання гібридоми з використанням мишей добре відоме в даній області.
Протоколи й технології виділення імунізованих спленоцитів для злиття відомі в даній області.
Партнери злиття (наприклад клітини мишачої мієломи) і методи злиття також відомі.
Іншими кращими тваринними системами для одержання гібридом, які продукують моноклональні антитіла, є щурячі й кролячі системи (наприклад описані в 5ЗріеКег-Роїеї еї аї.,
Ргос. Маї!. Асад. зсі. О.5.А. 92:9348 (1995), дивися також Кобзбі еї аі!., Ат. у. Сііп. Раїйої. 124: 295 (2005)).
У ще іншому кращому варіанті здійснення людські моноклональні антитіла можуть бути отримані з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини людської імунної системи, а не мишачої системи. Ці трансгенні й трансхромосомні миші включають мишей, відомих як миші НиМАВ і миші КМ, відповідно, і спільно називаються тут як «трансгенні миші». Продукція людських антитіл у таких трансгенних мишах може бути виконана, як описано докладно для СО2О в М/О2004 035607.
Ще однієї стратегією створення моноклональних антитіл є безпосереднє виділення генів, що кодують антитіла, з лімфоцитів, продукуючих антитіла певної специфічності, наприклад, дивися
Вабсоск еї аї., 1996; нова стратегія створення моноклональних антитіл з одиночних виділених лімфоцитів, продукуючих антитіла певних специфічностей. Для більш докладної інформації щодо конструювання рекомбінантного антитіла дивися, також, Ууеі5спої і Кгай5, Кесотрбіпапі апіїродез ог сапсег Шегару ІЗВМ-0-89603-918-8 і Веппу К.С. Го Апіїбоду Епдіпеегіпд ІЗВМ 1- 58829-092-1.
Для генерації антитіл мишей можна імунізувати кон'югованими з носієм пептидами, отриманими з послідовності антигену, тобто послідовності, проти якої повинні бути спрямовані антитіла, збагаченим препаратом рекомбінантно експресованого антигену або його фрагментів, іМабо клітинами, експресуючими антиген, як описано. Альтернативно, миші можуть бути імунізовані ДНК, що кодує антиген або його фрагменти. У випадку, коли імунізації з використанням очищеного або збагаченого препарату антигену не приводять до утворення
Зо антитіл, мишей можна також імунізувати клітинами, експресуючими антиген, наприклад клітинною лінією, з метою стимуляції імунних відповідей.
Імунна відповідь може бути піддана моніторингу в ході протоколу імунізації з використанням зразків плазми й сироватки, одержуваних при відборі крові із хвостової вени або ретроорбітальної вени. Миші з достатніми титрами імуноглобуліну можуть бути використані для злиттів. Мишам проводять бустерну імунізацію шляхом інтраперитонеального або внутрішньовенного введення антиген-експресуючих клітин за З дні до забиття й видалення селезінки для збільшення рівня секретуючих специфічні антитіла гібридом.
Для одержання гібридом, продукуючих моноклональні антитіла, спленоцити й клітини лімфатичних вузлів імунізованої миші можуть бути виділені й злиті з підходящою іморталізованою клітинною лінією, такою як клітинна лінія мишачої мієломи. Потім проводять скринінг отриманих гібридом на продукцію антиген-специфічних антитіл. Потім проводять скринінг окремих лунок за допомогою ЕГІБА на гібридоми, секретуючі антитіла. Шляхом імунофлуоресценції й аналізу ЕАС5 з використанням антиген-експресуючих клітин, антитіла зі специфічністю до антигену можуть бути ідентифіковані. Гібридоми, секретуючі антитіла, можуть бути повторно висіяні, знову піддані скринінгу й, якщо вони залишаються позитивними відносно моноклональних антитіл, їх субклонують шляхом обмежуючого розведення. Потім стабільні субклони культивують іп міго у середовищі для культур тканин з метою одержання антитіла для характеризації.
Антитіла також можна одержати в трансфектомі клітини-хазяїна при використанні, наприклад, комбінації технологій рекомбінантної ДНК і способів транфекції гена, як це добре відомо в даній області (Моїтізоп, 5. (1985) 5сіепсе 229: 1202).
Наприклад, в одному варіанті здійснення ген, що представляє інтерес(и), наприклад гени антитіла, може бути лігований в експресійний вектор, такий як еукаріотична експресійна плазміда, така як використовують у системі експресії гена 55, описаної в публікаціях УМО 87/04462, УМО 89/01036 і ЕР 338 841, або інших експресійних системах, добре відомих з рівня техніки. Очищену плазміду із клонованими генами антитіла вводять в еукаріотичні клітини-хазяї, наприклад клітини СНО, клітини М5/0, клітини НЕК 2937 або клітини НЕК293, або, альтернативно, в інші еукаріотичні клітини, наприклад клітини, виділені з рослин, грибів або дріжджів. Спосіб, використовуваний для введення даних генів, може бути представлений 60 способами, описаними в даній області, такими як електропорація, використання ліпофектаміна,
або іншими способами. Після введення даних генів антитіл у клітини-хазяї можна ідентифікувати й селектовати клітини, які експресують антитіло. Дані клітини представляють собою трансфектоми, які потім можуть бути розмножені на основі рівня експресії й масштабовані для одержання антитіл. Із супернатантів і/або клітин даних культур можна виділити й очистити рекомбінантні антитіла.
Альтернативно, дані клоновані гени антитіл можна експресувати в інших експресійних системах, включаючи прокаріотичні клітини, такі як мікроорганізми, наприклад Е. соїї. Крім того, антитіла можуть бути отримані з використанням трансгенних тварин, що не належать до людини, наприклад у молоці овець і пацюків або в курячих яйцях, або в трансгенних рослинах; дивися, наприклад, Мегпта, К., еї аІ. (1998) 9. Іттипої. Мей. 216: 165-181 ; РоПосК, еї а. (1999) у.
Іттипої. Мей. 231 : 147-157; і Еізопег, К., еї аї. (1999) ВіоІ. Спет. 380: 825-839.
Химеризація
Немічені мишачі антитіла є високоїмуногенними в людини при повторюванім застосуванні, приводячи до зниження терапевтичного ефекту. Основна імуногенність опосередкована константними областями важкого ланцюга. Імуногенність мишачих антитіл у людини може бути знижена або повністю усунута, якщо відповідні антитіла є химеризованими або гуманізованими.
Химерні антитіла являють собою антитіла, різні частини яких отримані за допомогою різних видів тварин, наприклад такі, де варіабельна область є антитіло миші, а константна область - імуноглобулін людини. Химеризація антитіл досягається шляхом з'єднання варіабельних областей важкого й легкого ланцюга мишачого антитіла з константною областю людського важкого й легкого ланцюга (наприклад як описано Кгацзх еї аіЇ., в Меїйпоа5 іп МоїІесшаг Віоіоду зепйев5, Весотбріпапі апіїродіеє їог сапсег Шегару ІЗВМ-0-89603-918-8). У кращому варіанті здійснення химерні антитіла отримані шляхом з'єднання людської константної області каппа- легкого ланцюга з мишачою варіабельною областю легкого ланцюга. У також кращому варіанті здійснення химерні антитіла можуть бути отримані шляхом з'єднання людської константної області лямбда-легкого ланцюга з мишачою варіабельною областю легкого ланцюга. Кращі константні області важкого ланцюга для створення химерних антитіл являють собою Ідс1, (доз і Ідс4. Інші кращі константні області важкого ланцюга для створення химерних антитіл представляють собою Ідсесаг, ІдА, дО і дм.
Зо Гуманізація
Антитіла взаємодіють із антисенами-мішенями в основному за допомогою амінокислотних залишків, які знаходяться у шести гіперваріабельних ділянках (СОК) легкого й важкого ланцюгів.
Із цієї причини амінокислотні послідовності усередині СОК є більш різноманітними серед окремих антитіл, ніж послідовності поза СОК. Оскільки послідовності СОК відповідають за більшість взаємодій антитіла й антигену, можна експресувати рекомбінантні антитіла, які імітують властивості специфічних природних антитіл шляхом конструювання експресійних векторів, які включають послідовності СОК зі специфічного природного антитіла, привиті на каркасні послідовності з іншого антитіла з іншими властивостями (дивися, наприклад,
Віесптапи, І. еї аї. (1998) Маїште 332: 323-327; щдопев, Р. еї аІ. (1986) Маїште 321 : 522-525; і
Оиееп, б. єї а). (1989) Ргос. Маї)!. Асад. бсі. 0. 5. А. 86: 10029-10033). Дані каркасні послідовності можуть бути отримані із загальнодоступних баз даних ДНК, які включають послідовності генів антитіл зародкової лінії. Дані послідовності зародкової лінії будуть відрізнятися від послідовностей генів зрілого антитіла, оскільки вони не будуть включати повністю зібрані варіабельні гени, які формуються шляхом зв'язування М (0) у у процесі дозрівання В-клітин.
Послідовності генів зародкової лінії також будуть відрізнятися від послідовностей високоафінного антитіла із вторинного репертуару характерним рівномірним розташуванням у варіабельній області.
Здатність антитіл і інших з'єднувальних агентів зв'язуватися з антигеном може бути визначена з використанням стандартних аналізів зв'язування (наприклад ЕГІ5ЗА, Вестерн блотинг, імунофлуоресценція й аналіз методом проточної цитометрії).
Для очищення антитіл відібрані отримані від виробника клітинні лінії можна вирощувати у дволітрових ролерних колбах для очищення рекомбінантного антитіла. Альтернативно, антитіла можуть бути отримані за допомогою діалізу в біореакторах. Перед проведенням афінної хроматографії з використанням білка І -сефарози супернатанти можуть бути відфільтровані й, за потреби, концентровані. Елюйований ІДС може бути перевірений за допомогою гель- електрофореза й високоефективної рідинної хроматографії для гарантії чистоти. Після заміни буферного розчину на РВ5 концентрацію можна визначити за 00280 з використанням відповідного коефіцієнта інстинкції. Рекомбінантні антитіла можуть бути розділені на аліквоти і можуть зберігатися при -80 "С. бо Для демонстрації зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, експресуючими антиген, можна використовувати проточну цитометрію. Клітинні лінії, які експресують природно або після трансфекції антиген і негативні контролі, позбавлені експресії антигену (вирощені в умовах стандартного росту), можна змішати з різними концентраціями моноклональних антитіл у супернатантах гібридоми або в РВ5, що містить 1 95 ЕВ5, і інкубувати при 4 "С протягом 30 хв.
Після промивання проводять реакцію анти-Ідс антитіла, міченого АРС або АІехаб47, з антиген- зв'язаним моноклональним антитілом у тих же умовах, що для фарбування первинного антитіла. Зразки можна аналізувати методом проточної цитометрії за допомогою обладнання
ЕАС5Б, з використанням характеристик світла й бічного розсіювання дискримінаційного вікна для окремих клітин. Для відмінності антиген-специфічних моноклональних антитіл від неспецифічних зв'язуючих в одному вимірюванні, може бути використаний спосіб котрансфекції.
Клітини, тимчасово трансфіковані плазмідами, що кодують антиген, і флуоресцентні маркери фарбують, як описано вище. Трансфіковані клітини можуть бути детектовані в каналах флуоресценції, відмінних від пофарбованих антитілом клітин. Тому що більша частина трансфікованих клітин експресує обидва трансгени, антиген-специфічні моноклональні антитіла зв'язуються переважно із клітинами, експресуючими флуоресцентний маркер, тоді як неспецифічні антитіла зв'язуються в порівнянному співвідношенні з нетрансфікованими клітинами. На додаток або замість проточного цитометричного аналізу може бути використаний альтернативний спосіб аналізу з використанням флуоресцентної мікроскопії. Клітини фарбують так, як описано вище, і досліджують за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Для демонстрації зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, експресуючими антиген, може бути використаний аналіз методом імунофлуоресцентної мікроскопії. Наприклад, клітинні лінії, які експресують або спонтанно або після трансфекції антиген, і негативні контролі, позбавлені експресії антигену, вирощують на предметних склах у стандартних умовах росту в середовищі ОМЕМ/Е12, доповненої 10 95 фетальною бичачою сироваткою (ЕС5), 2 мМ 1- глутаміну, 100 ОД/мл пеніциліну й 100 мкг/мл стрептоміцину. Клітини потім фіксують метанолом або параформальдегідом, або залишають неопрацьованими. Потім проводять реакцію клітин з моноклональними антитілами проти антигену протягом 30 хв при 25 "С. Після промивання проводять реакцію клітин з міченим АІеха555 вторинним антимишачим дос антитілом (МоїІесшаг
Ргобе5) у тих же самих умовах. Потім клітини досліджують за допомогою флуоресцентної
Зо мікроскопії.
Клітинні екстракти клітин, експресуючих антиген, і відповідних негативних контролів готують і піддають електрофорезу на натрій додецил сульфат-поліакриламідному гелі (5О5). Після електрофореза розділені антигени переносять на нітроцелюлозні мембрани, блокують і зондують тестованими моноклональними антитілами. Зв'язування (дО можна детектувати із використанням антимишачого Ідс, кон'югованого з пероксидазою, і проявляти за допомогою субстрату ЕСІ.
Антитіла можуть бути додатково тестовані на взаємодію з антигеном методами імуногістохімії добре відомими фахівцеві в даній області, наприклад, з використанням фіксованих параформальдегідом або ацетоном кріозрізів, або поміщених у парафін зрізів тканин, фіксованих параформальдегідом, отриманих зі зразків неракової тканини або ракової тканини від пацієнта під час звичайних хірургічних процедур, або від мишей, що несуть привиті пухлини, інокульовані клітинними лініями, експресуючими спонтанно або після трансфекції антиген. Для імунофарбування антитіла, реакційноздатні відносно антигену, можуть бути інкубовані з козячим антимишачими або козячими антикролячими антитілами, кон'югованими з пероксидазою хріну (САКО) відповідно до інструкцій виробника.
Передклінічні дослідження
З'єднувальні агенти, описані тут, також можуть бути тестовані в моделі іп мімо, наприклад, на імунодефіцитній миші, що несе ксенотрансплантовані пухлини, інокульовані клітинними лініями, експресуючими СІОМ, для визначення їх ефективності відносно контролю росту СІ ОМ- експресуючих пухлинних клітин.
Дослідження іп мімо після ксенотрансплантації СІ ОМ-експресуючих пухлинних клітин імунокомпромітованим мишам або іншим тваринам можуть бути проведені з використанням з'єднувальних агентів, описаних тут. З'єднувальні агенти можуть бути введені мишам, що не мають пухлини, з наступною ін'єкцією пухлинних клітин для вимірювання ефектів з'єднувальних агентів відносно запобігання формуванню пухлин або пов'язаних з пухлиною симптомів.
З'єднувальні агенти можуть бути введені несучим пухлину мишам для визначення терапевтичної ефективності відповідних з'єднувальних агентів відносно зменшення росту пухлини, метастазів або пов'язаних з пухлиною симптомів. Застосування з'єднувальних агентів може бути об'єднане із застосуванням інших речовин, таких як цитостатичні лікарські засоби, 60 інгібітори фактора росту, блокатори клітинного циклу, інгібітори антгіогенеза або антитіла, для визначення синергічної ефективності й потенційної токсичності комбінацій. Для аналізу токсичних побічних ефектів, опосередкованих з'єднувальними агентами, тварини можуть бути інокульовані з'єднувальними агентами або контрольними реагентами й ретельно досліджені відносно симптомів, можливо пов'язаних з терапією СІ ЮОМ-з'єднувальним агентом.
Картуванння епітопів, які розпізнали з'єднувальні агенти, може бути виконане як описано докладно в «Еріюре Марріпд Ргоїосої5» (Меїпоа5 іп МоїІесшіаг Віоіоду) Бу Сіепп Е. Моїті5 ІЗВІМ- 089603-375-9 і в «Ерпоре Марріпод: А Ргасіїса! Арргоасі» Ргасіїса! Арргоасі 5егіє5, 248 Бу ОМмуп
М. В. УУезімосад, Егапк с. Нау.
Сполуки й агенти, описані тут, можуть бути введені у формі будь-якої підходящої фармацевтичної композиції.
Фармацевтичні композиції за винаходом є переважно стерильними й містять ефективну кількість з'єднувальних агентів, описаних тут, і необов'язково додаткові агенти, описані тут, для досягнення бажаної реакції або бажаного ефекту.
Фармацевтичні композиції звичайно представлені у вигляді стандартної лікарської форми й можуть бути приготовлені способами, відомими в даній області. Фармацевтична композиція може, наприклад, знаходиться у формі розчину або суспензії.
Фармацевтична композиція може містити солі, буферні речовини, консерванти, носії, розріджувачі й/або допоміжні речовини, усі з яких переважно є фармацевтично прийнятними.
Термін «фармацевтично прийнятний» належить до нетоксичності матеріалу, який не перешкоджає дії активного компонента фармацевтичної композиції.
Солі, що не є фармацевтично прийнятними, можуть бути використані для приготування фармацевтично прийнятних солей і включені у винахід. Фармацевтично прийнятні солі цього виду включають, але без обмеження, солі, отримані з наступних кислот: соляна, бромистоводнева, сірчана, азотна, фосфорна, малеїнова, оцтова, саліцилова, лимонна, мурашина, малонова, бурштинова кислоти, і т.п. Фармацевтично прийнятні солі можуть бути також приготовлені у вигляді солей лужних металів або солей лужноземельних металів, таких як солі натрію, солі калію або солі кальцію.
Буферні речовини, що придатні для використання у фармацевтичній композиції, включають оцтову кислоту у вигляді солі, лимонну кислоту у вигляді солі, борну кислоту у вигляді солі й
Зо фосфорну кислоту у вигляді солі.
Консерванти, що придатні для використання у фармацевтичній композиції, включають бензалконію хлорид, хлорбутанол, парабен і тімерозал.
Ін'єктована лікарська форма може містити фармацевтично прийнятну допоміжну речовину, таку як лактат Рінгера.
Термін «носій» належить до органічного або неорганічного компонента природного або синтетичного походження, з яким об'єднаний активний компонент для сприяння, посилення або забезпечення можливості застосування. Відповідно до винаходу термін «носій» також включає одну або більше сумісних твердих або рідких наповнювачів, розріджувачів або інкапсулюючих речовин, які є придатними для введення пацієнтові.
Можливі речовини носія для парентерального введення являють собою, наприклад, стерильну воду, розчин Рінгера, лактат Рінгера, стерильний розчин хлориду натрію, поліалкіленгліколі, гідровані нафталіни й, зокрема, біосумісні лактидні полімери, співполімери лактиду/гліколіду або співполімери поліоксіетилену/поліоксипропілену.
Термін «допоміжна речовина», використовуваний тут, означає всі речовини, які можуть бути присутніми у фармацевтичній композиції й не є активними інгредієнтами, такі як, наприклад, носії, зв'язуючі, лубриканти, загущувачі, поверхнево-активні речовини, консерванти, емульгатори, буфери, смакові агенти й барвники.
Агенти й композиції, описані тут, можна вводити будь-яким звичайним способом, таким як парентеральне введення, включаючи ін'єкцію або інфузію. Переважно, уведення є парентеральним введенням, наприклад, внутрішньовенним, внутрішнартеріальним, підшкірним, інтрадермальним або внутрішньом'язовим.
Композиції, що придатні для парентерального введення, звичайно містять стерильний водний або неводний препарат активної сполуки, який переважно є ізотонічним стосовно крові реципієнта. Прикладами сумісних носіїв і розчинників є розчин Рінгера й ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, звичайно стерильні нелеткі масла використовуються як розчин або суспензійне середовище.
Агенти й композиції, описані тут, уводять в ефективних кількостях. «Ефективна кількість» належить до кількості, яка досягає бажаної реакції або бажаного ефекту, окремо або разом з додатковими дозами. При лікуванні конкретного захворювання або конкретного стану, бажана бо реакція переважно належить до інгібування плину захворювання. Це включає вповільнення прогресування захворювання й, зокрема, перериванню або зміні напрямку розвитку захворювання. Бажана реакція при лікуванні захворювання або стану може також являти собою затримку або попередження початку розвитку зазначеного захворювання або зазначеного стану.
Ефективна кількість агента або композиції, описаної тут, буде залежати від стану, що підлягає лікуванню, вазі захворювання, індивідуальних параметрів пацієнта, включаючи вік, фізіологічний стан, розмір і вага, тривалості лікування, типу супровідної терапії "у випадку присутності), конкретного шляху введення й подібних факторів. Відповідним чином, дози агентів, що вводяться, описаних тут, можуть залежати від цих різних параметрів. У випадку, якщо реакція в пацієнта недостатня після введення початкової дози, можуть бути введені більш високі дози (або, фактично, більш високі дози досягаються іншим, більш локалізованим способом уведення).
Агенти й композиції, описані тут, можуть бути введені пацієнтами, наприклад, іп мімо, для лікування або попередження різних порушень, таких як описані тут порушення. Кращі пацієнти включають пацієнтів-людей, що мають порушення, які можуть бути скоректовані або ослаблені шляхом уведення агентів і композицій, описаних тут. Це включає порушення, у які залучені клітини, що характеризуються зміненою картиною експресії СІ ОМ, такого як СІ ОМ18.2 і/або
СІ ОМб.
Наприклад, в одному варіанті здійснення агенти, описані тут, можуть бути використані для лікування пацієнта з раковим захворюванням, наприклад раковим захворюванням, описаним тут, що характеризується присутністю ракових клітин, експресуючих СІ ОМ.
Фармацевтичні композиції й способи лікування, описані відповідно до винаходу, можуть бути також використані для імунізації або вакцинації для попередження захворювання, описаного тут.
Фармацевтична композиція за винаходом може бути введена разом з додатковими посилюючими імунітет речовинами, такими як один або декілька ад'ювантів, і може містити одну або кілька підвищуючих імунітет речовин для додаткового збільшення їх ефективності, переважно, для досягнення синергічного ефекту імуностимуляції. Термін «ад'ювант» належить до сполук, які продовжують або підсилюють, або прискорюють імунну відповідь. Різні механізми можливі щодо цього залежно від різних типів ад'ювантів. Наприклад, сполуки, які забезпечують можливість дозрівання ОС, наприклад ліпополісахариди або ліганд СО40, утворюють перший клас підходящих ад'ювантів. Як правило, будь-який агент, який впливає на імунну систему типу «сигнал небезпеки» (І Р5, ОРОб, азКМА їі т.д.), або цитокіни, такі як ЗМ-С5Е, може бути використаний як ад'ювант, який забезпечує можливість посилення імунної відповіді й/або вплив на імунну відповідь контрольованим чином. Олігодеоксинуклеотиди можуть необов'язково використовуватися в цьому випадку, хоча їх побічні ефекти, які виникають при певних обставинах, як зазначено вище, підлягають уточненню. Особливо кращі ад'юванти являють собою цитокіни, такі як монокіни, лімфокіни, інтерлейкіни або хемокіни, наприклад 1-1, ІІ -2, І -
З, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-12, ІМЕса, ІМЕ-у, ОМ-С5Е, І Т-а, або фактори росту, наприклад ПОН. Наступні відомі ад'юванти являють собою гідроксид алюмінію, ад'ювант
Фрейнда або олію, таку як МопіапідеФ, найбільше переважно Мопіапіде? ІЗА51. Ліпопептиди, такі як РатЗСуб5, також є придатними для використання як ад'ювантів у фармацевтичній композиції за даним винаходом.
Агенти й композиції, забезпечені тут, можуть застосовуватися окремо або в комбінації із традиційними формами лікування, такими як хірургія, опромінення, хіміотерапія й/або трансплантація кісткового мозку (аутологічна, сингенна, алогенна або неспоріднена).
Лікування раку представляє область, у якій комбіновані стратегії є особливо бажаними, оскільки часто об'єднана дія двох, трьох, чотирьох або навіть більше протиракових лікарських засобів/терапій створює синергічні ефекти, які є більш сильними в порівнянні з ефектами при монотерапевтичному підході. Таким чином, в іншому варіанті здійснення даного винаходу лікування раку, у якому використовуються основані на імунітеті або вакцинуванні механізми, такі як способи й фармацевтичні композиції за даним винаходом, можуть бути ефективно об'єднані з різними іншими лікарськими засобами й/або способами, що мають подібний або інший механізм спрямованого впливу. У їхнє число входять, наприклад, комбінації із традиційними терапіями пухлин, стратегії мультиепітопів, додаткова імунотерапія й лікувальні підходи, що направлено впливають на ангіогенез або апоптоз (для огляду дивися, наприклад, Апаегзеп еї аї. 2008: Сапсег ігєаїйтепі: Ше сотрбіпайоп ої массіпайоп м/йй оїпег ІНегаріє5. Сапсег Іттипоіоаду
Ітітипоїпегару, 57(11): 1735-1743). Послідовне введення різних агентів може інгібувати ріст ракових клітин у різні моменти часу, тоді як інші агенти можуть, наприклад, інгібувати бо неоангіогенез, виживаність злоякісних клітин або метастазів, потенційно переводячи рак у хронічне захворювання. Наступний перелік представляє деякі необмежуючі приклади протиракових лікарських засобів і терапій, які можуть бути використані в комбінації з даним винаходом: 1. Хіміотерапія
Хіміотерапія є стандартом лікування безлічі типів раку. Найпоширеніші хіміотерапевтичні агенти діють шляхом знищення клітин, які швидко діляться, що є одним з основних особливостей ракових клітин. Таким чином, комбінування із загальновизнаними хіміотерапевтичними лікарськими засобами, такими як, наприклад, алкілюючі агенти, антиметаболіти, антрацикліни, алкалоїди рослин, інгібітори топоізомерази й інші протипухлинні агенти, які впливають на клітинний поділ або синтез ДНК, може значно поліпшити терапевтичні ефекти за даним винаходом шляхом очищення супресорних клітин, відновлення імунної системи шляхом наділення пухлинних клітин більшою сприйнятливістю до імунозумовленого знищення, або шляхом додаткової активації клітин імунної системи. Синергічна протиракова дія хіміотерапевтичних і основаних на вакцинуванні імунотерапевтичних лікарських засобів було продемонстровано в багатьох дослідженнях (дивися, наприклад, Оиоїх еї аЇ. 2011: Тпегарешіс массіпайоп міт ТО24010 апа їгві-їпе спетоїпегару іп адмапсед поп-зтаї-сеїЇ їшпуд сапсег а сопігоПей рпазе 2В ша). Іапсеяї Опсої. 12(12): 1125-33; дивися також І ізеф еї аї. 2010:
Сотбіпайоп ої іпіепвіме спетоїпегару апа апіїсапсег массіпе5 іп Ше ігеайтепі ої Нитап таїїдпапсіев: Ше Ппетайоіодіса! ехрегіепсе. У Віотей Віоїесппої. 2010: 6920979; дивися також
НіюокКа єї а! 2009: А сотбіпайоп (Шегару ої детсіаріпе мій іттипоїпегару ог раїїепів м/п іпорегавріє ІосаПу адмапсейд рапсгеаїйс сапсег. Рапстгеа5 38(3): еб69-74). Існують сотні доступних хіміотерапевтичних засобів, які в основному придатні для комбінованої терапії. Деякими (необмежуючі) прикладами хіміотерапевтичних лікарських засобів, які можна застосовувати в комбінації з даним винаходом, є карбоплатин (параплатин), цисплатин (платинол, платинол-
АФ), циклофосфамід (цитоксан, неозар), доцетаксел (таксотер), доксорубіцин (адриаміцин), ерлотиніб (тарцева), етопозид (вепезид), фторурацил (5-ЕУ), гемцитабін (гемзар), іматиніба мезилат (глівек), іринотекан (камптозар), метотрексат (фолекс, мексат, аметоптерин), паклітаксел (таксол, абраксан), сорафиніб (нексавар), сунитиніб (сутент), топотекан (гікамтин), вінкристин (онковін, вінказар РЕ5), і вінбластин (велбан).
Зо 2. Хірургія
Хірургія раку - операція з видалення пухлини - залишається основою для лікування раку.
Хірургія може бути комбінована з іншими терапіями раку для видалення будь-яких, що залишилися пухлинних клітин. Комбінування хірургічних способів 3 наступним імунотерапевтичним лікуванням є багатообіцяючим підходом, який був неодноразово продемонстрований. 3. Опромінення
Радіаційна терапія залишається важливим компонентом у лікуванні раку, при цьому приблизно 50 95 усіх ракових пацієнтів одержують радіаційну терапію в процесі їх захворювання. Основною метою радіаційної терапії є позбавлення ракових клітин їх потенціалу до розмноження (клітинний поділ). Типи опромінення, використовувані для лікування раку, яляють собою опромінення фотонами (рентгенівські промені й гама промені) і опромінення частками (електронні, фотонні й нейтронні пучки). Існує два способи доставки випромінювання в місце локалізації злоякісної пухлини. Опромінення зовнішнім пучком доставляється від джерел, розташованих поза організмом шляхом націлювання високоенергетичних променів (фотонів, протонів або опромінення частками) у місце локалізації пухлини. Внутрішнє опромінення або брахітерапія доставляється від радіоактивних джерел, розташованих поза організмом, розміщується в герметичні катетери, або вводиться безпосередньо в ділянку пухлини. Методи променевої терапії, які можна застосовувати в комбінації з даним винаходом, представляють собою фракціонування (сеанси променевої терапії в режимі фракціонування, наприклад, щоденні фракції від 1,5 до З Гр протягом декількох тижнів), З О-конформну променеву терапію (ЗОСЕТ; доставка випромінювання в макроскопічний обсяг пухлини), променеву терапію з модульованою інтенсивністю (ІМКТ; комп'ютеризоване модулювання інтенсивності пучків променів), променеву терапію під візуальним контролем (ІСКТ; метод, що складається в створенні зображень через короткі проміжки часу в ході сеансу променевої терапії, що дозволяє робити коректування), і стереотаксична радіотерапія (ЗКВТ, доставляє дуже високі дози випромінювання лише за декілька фракцій). Для огляду променевої терапії дивися ВахкКаг еї аї. 2012: Сапсег апа гадіаноп ІНегару: ситепі адмапсез апа їшиге аїгесійопв5. Іпі. У Меа 5сі. 9(3): 193- 199. 4. Антитіла бо Антитіла (переважно моноклональні антитіла) досягають свого терапевтичного ефекту проти ракових клітин за допомогою різних механізмів. Антитіла можуть мати безпосередній вплив на апоптоз або програмовану загибель клітин. Антитіла можуть блокувати компоненти шляхів сигнальної трансдукції, такі як, наприклад, рецептори факторів росту, ефективно пригнічуючи проліферацію пухлинних клітин. У клітинах, які експресують моноклональні антитіла, вони можуть сприяти утворенню антиідіотипових антитіл. Непрямі ефекти включають рекрутинг клітин, які мають цитотоксичність, таких як моноцити й макрофаги. Цей тип опосередкованої антитілом загибелі клітин називається антитілозалежна клітинно- опосередкована цитотоксичність (АОСС). Антитіла також зв'язують комплемент, що приводить до прямої клітинної токсичності, відомої як комплемент-залежна цитотоксичність (СОС).
Комбінування хірургічних методів з імунотерапевтичними лікарськими засобами й методами є успішним підходом, як продемонстровано, наприклад, в саагі еї аї. 2009: Зупегдівіїс епПесі ої депагйіс сеїЇ массіпайоп апа апіі-Саго апіїбоду ігеаїтепі іп Ше ІШегару ої тигіпе Іутрпота. У
Іттипоїйег. З32(4): 333-40. Наступний перелік забезпечує деякі необмежуючі приклади протиракових антитіл і потенційних мішеней антитіл "у дужках), які можна застосовувати в комбінації з даним винаходом: абаговомаб (СА-125), абциксимаб (СО041), адекатумумаб (Ерсат), афутузумаб (С0О20), алацизумаб пегол (МЕСЕК2), алтумомаб пентетат (СЕА), аматуксимаб (Могаб-009), анатумомаб мафенатокс (ТАС-72), аполізумаб (НІГА-ОБ), арцитумомаб (СЕА), бавитуксимаб (фосфатидилсерин), бектумомаб (С022), белімумаб (ВАЕРБ), бевацизумаб (УЕСБ-А), біватузумаб мертанзин (С044 мб), блінатумомаб (СО19), брентуксимаб ведотин (СОЗО ТМЕКЗЕв8), кантузумаб мертанзин (муцин Сапад), кантузумаб равтанзин (МОСТІ), капромаб пендетид (клітини карциноми передміхурової залози), карлумаб (СМТО888), катумаксомаб (Ерсат, СОЗ), цетуксимаб (ЕСЕК), цитатузумаб богатокс (Ерсат), циксутумумаб (рецептор ІСЕ-1), клаудиксимаб (клаудин), кліватузумаб тетракетан (МОС1), конатумумаб (ТВА -К2), дацетузумаб (СО040), долатузумаб (рецептор інсулінподібного фактора росту І), деносумаб (КАМКІ), детумомаб (клітини В-лімфоми), дрозитумаб (ОК5), екромексимаб (ганглозид 503), едреколомаб (Ерсат), елотузумаб (5ІАМЕ7), енаватузумаб (РОЇ 192), енситуксимаб (МРО-1 С), епратузумаб (С022), ертумаксомаб (НЕКг/пеи, СОЗ3), етарацизумаб (інтегрин ам8В3), фарлетузумаб (фолатний рецептор 1), ЕВТАО5 (СО20), фіклатузумаб (ЗСН 900105), фігітумумаб (ІСЕ-1 рецептор), фланвотумаб (глікопротеїн 75), фрезолімумаб (ТОБ-Д),
Зо галіксимаб (СО80), ганітумаб (ІСБ-І), гемтузумаб озогаміцин (СО33), гевокизумаб (ІІ-1р), гірентуксимаб (карбоангідраза 9 (СА-ІХ)), глембатумумаб ведотин (СРММВ), ібритумомаб тіуксетан (СО20), ікрукумаб (МЕСЕК-1), іговома (СА-125), індатуксимаб равтанзин (50С1), інтетумумаб (СО51), інотузумаб озогаміцин (СО022), іпілімумаб (СО 152), іратумумаб (СОЗ30), лабетузумаб (СЕА), лексатумумаб (ТЕАЇ-К2), лібівірумаб (поверхневий антиген гепатиту В), лінтузумаб (СО33), лорвотузумаб мертанзин (СО56), лукатумумаб (СО040), луміліксимаб (СО23), мапатумумаб (ТКАЇС-К1!), матузумаб (ЕСЕК), меполізумаб (1-5), мілатузумаб (С074), мітумомаб (503 гангліозид), могамулізумаб (ССК4), моксетумомаб пасудотокс (С022), наколомаб тафенатокс (антиген С242), наптумомаб естафенатокс (514), нарнатумаб (КОМ), нецитумумаб (ЕСЕК), німотузумаб (ЕСЕК), ніволумаб (1994), офатумумаб (С020), оларатумаб (РОСЕ-К о), онартузумаб (кіназа рецептора фактора росту гепатоцитів людини), опортузумаб монатокс (Ерсат), ореговомаб (СА-125), окселумаб (ОХ-40), панітумумаб (ЕСЕК), патритумаб (НЕКЗ), пемтумома (МОСТІ), пертузумаб (НЕКг/пец), пінтумомаб (антиген аденокарциноми), притумумаб (віментин), пакотумомаб (М-гліколіллоейрамінова кислота), радретумаб (екстра домен В фібронектина), рафівірумаб (глікопротеїн вірусу сказу), рамуципумаб (МЕСЕК2), рилотумумаб (НОБЕ), ритуксимаб (СО20), робатумумаб (рецептор ІСЕ-1), самализумаб (СО200), сібротузумаб (РАР), сілтуксимаб (І/-б6), табалумаб (ВАЕРЕ), такатузумаб тетраксетан (альфа- фетопротеїн), таплітумомаб паптокс (СО 19), тенатумомаб (тенасцин С), тепротумумаб (С0221), тицилимумаб (СТІ А-4), тігатузумаб (ТКА -Н2г), ТМХ-650 (І-13), тозітумомаб (СО20), трастузумаб (НЕК2г/пепш), ТКВ507 (502), тремелімумаб (СТІ А-4), тукотузумаб целмолейкін (ЕРСАМ), ублитуксимаб (М54А1), урелумаб (4-ІВВ), волоциксимаб (інтегрін а5Д1), вотумумаб (пухлинний антиген СТАА16.88), залутумумаб (ЕСЕЕК), занолімумаб (С04). 5. Цитокіни, хемокіни, костимуляторні молекули, білки злиття
Комбіноване використання антиген-коюодуючих фармацевтичних композицій за даним винаходом із цитокінами, хемокінами, костимуляторними молекулами й/або їх білками злиття для викликання сприятливого імунного модулювання або ефектів інгібування пухлини є іншим варіантом здійснення даного винаходу. Для збільшення інфільтрації імунних клітин у пухлині й сприяння руху антиген-презентуючих клітин у дренувальні пухлину лімфатичні вузли можуть бути використані різні хемокіни зі структурами С, СС, СХС і СХЗС. Деякими із самих багатообіцяючих хемокінів є, наприклад, ССК7 і його ліганди ССІ 19 і ССІ 21, крім того, ССІ2, 60 ССІЗ, ССІ15 і СС116. Іншими прикладами є СХСК4, СХСК7 і СХСІ12. Крім того, можна застосовувати костимуляторні або регуляторні молекули, такі як, наприклад, ліганди В7 (В7.1 і
В7.2). Також, можна застосовувати інші цитокіни, такі як, наприклад, інтерлейкіни (наприклад від
І--1 до І-17), інтерферони (наприклад від ІПГпаїрна! до ІпаїІрпав, паїІрпа10, Мпаїрпа13, паїрна14, паїІрпа16, Нпаїрпа17, МпаІрпа21, Мпреїат!, ІЕММУ, ІЕМЕ1 ї ІМК), гематопоетичні фактори, ТОЕ (наприклад ТОБ-а, ТОБ-ВД і інші члени сімейства ТОБ) і, нарешті, рецептор сімейства фактора некрозу пухлин і його ліганди, а також інші стимуляторні молекули, що містять, але без обмеження, 4-188, 4-188-І, СО 137, 201371, СТІ А-4СІТВ, СІТАЇ, Раз, Равз-Ї, ТМЕВІ, ТВА -
АТ, ТВА -Н2, р/5МОаБ-В, ОВб, І Т.реїа.ї, ВАМК, ЕСАНВІ, ХЕОСАН, Епі 4, Тгоу/Ітгаде, ТА),
ТМЕВІЇ, НУЕМ, С027, СО30, 2040, 4- 188, ОХ40, СІТВ, СІТАЇ, ТАСІ, ВАЕРЕ-К, ВСМА, КЕЇТ і
Сбрео5 (Раз/АРО-1), глюкокортикоїд-індуковані ТМЕК-зв'язані білки, ТМЕ рецептор-зв'язаний апоптоз-опосередковуючий білок (ТКАМР) і рецептор клітинної загибелі-6 (ОКб6)., СО40/С0401 і
ОХ40/ОХ401Ї є особливо важливими мішенями для комбінованої імунотерапії завдяки їхньому прямому впливу на Т-клітинну виживаність і проліферацію. Для огляду дивися І есппег еї аї. 2011: СпетокКіпев, совіїтиіайту тоієсцев апа Тивіоп ргоїєїпе ог Ше іттипоїпегару ої зоїїй
Тштогв. ІттипоїПегару З (11), 1317-1340. 6. Бактеріальні терапії
Дослідники використовували анаеробні бактерії, такі як Сіовзігідішт помуії, для поглинання внутрішньої частини бідних киснем пухлин. Бактерії потім гинуть при контакті з оксигенованими сторонами пухлини, що означає, що вони не будуть впливати на інший організм. Іншою стратегією є використання анаеробних бактерій, які були трансформовані ферментом, який може перетворювати нетоксичні проліки в токсичний лікарський засіб. При проліферації бактерій у некротичних і гіпоксичних областях пухлини фермент експресується тільки в пухлині.
Таким чином, системно застосовувані проліки метаболізується в токсичний лікарський засіб тільки в пухлині. Це було продемонстровано як ефективне з непатогенними анаеробними спорогенами Сіозігіаїішт. 7. Інгібітори кінази
Інша більша група потенційних мішеней для комплементарної терапії раку включає інгібітори кіназ, тому що ріст і виживаність ракових клітин тісно пов'язана з розрегулюванням кіназної активності. Для відновлення нормальної кіназної активності й, отже, зменшення росту
Зо пухлини застосовують широкий ряд інгібіторів. Група цільових кіназ включає рецепторні тирозинкінази, наприклад, ВСК-АВІ.,, В-Наї, ЕСЕН, НЕВ-2/ЕтЬЬаг, ІСЕ-ІВ, РОСЕВ-а, РОСЕВ-В, с-
КИ, Ей-4, БРИЗ, РЯЕВІ, РОЕВЗ, РОЕВЯ, С5Е1А, с-теї, ВОМ, с-геії, АЇК, цитоплазматичні тирозинкінази, наприклад, с-5гс, с-уе5, Арі, УАК-2, серин/греонінкінази, наприклад, АТМ, Аєйгога
А а В, Сак, тіог, РКсі, РІкК5, р-гаї, 56К, 5ТК1 1/КВІ і ліпідні кінази, наприклад, РІЗК, ЗКІ1.
Низькомолекулярні інгібітори кіназ представляють собою, наприклад, РНА-739358, нілотиніб, дазатиніб і РО166326, МЗС 743411, лапатиніб (5МУ/-572016), канертиніб (СІ-1033), семаксиніб (505416), ваталаніб (РТК787/27К222584), сутент (З0О1 1248), сорафеніб (ВАМ 43-9006) і лефлуномід (50101). Для додаткової інформації дивися, наприклад, 2папао еї аї. 2009: Тагдейіпд сапсег м/йй 5таї! тоїІесшіе Кіпазе іппіріюг5. Маїшге Неміємв Сапсег 9, 28-39. 8. ТоіІ-подібні рецептори
Члени сімейства ТоїІ- подібних рецепторів (ТІ К5) є ключовим з'єднанням між уродженим і адаптивним імунітетом, і ефект багатьох ад'ювантів оснований на активації ТІК. Велика кількість розроблених вакцин проти раку включає ліганди для ТІ К8, для викликання відповідей на вакцини. Крім ТІ К2, ТІ КЗ, ТІ К4, особливо ТІ К7 і ТІ ЕК 8 досліджували відносно терапії раку в пасивних імунотерапевтичних підходах. Близькоспоріднені ТІК7 ії ТГК8 сприяють протипухлинним відповідям шляхом впливу на клітини імунної системи, пухлинні клітини й мікрооточення пухлини, і можуть бути активовані структурами нуклеозидних аналогів. Усі ТІК застосовуються як окремі імунотерапевтичні засоби або ад'юванти протиракових вакцин і можуть бути синергічно комбіновані з лікарськими формами й способами за даним винаходом. Для більш докладної інформації дивися мап Юишїп еї аІ. 2005: Тіддетппа ТІ А зідпаїїпу іп массіпайоп. Тгепав іп
Іттипоіоду, 27(1):49-55. 9. Інгібітори ангіогенеза
Додатково до терапій, які направлено впливають на імунні модуляторні рецептори, що знаходяться під впливом пухлиноопосередкованих механізмів вислизання й імунної супресії, існують терапії, які направлено впливають на оточення пухлини. Інгібітори ангіогенеза запобігають надлишковому росту кровоносних судин (ангіогенез), які потрібні пухлинам для виживання. Ангіогенез, стимульований пухлинними клітинами для задоволення їх зростаючих потреб у поживних речовинах і кисні, може бути блокований шляхом спрямованого впливу на різні молекули. Необмежуючі приклади ангіогенез-опосередкованих молекул або інгібіторів 60 ангіогенеза, які можуть бути комбіновані з даним винаходом, включають розчинний МЕСЕ
(УЕСРЕ, ізоформи МЕСЕ121 і МЕСЕ165, рецептори МЕСЕКІ1, МЕСЕКа і корецептори нейропілін-1 і нейропілін-2) 1 і МЕКР-1, ангіопоетин 2, ТЗР-1 і Т5Р-2, ангіостатин і споріднені молекули, ендостатин, вазостатин, калретикулін, тромбоцитарний фактор-4, ТІМР ії СОАЇ, Меїй-1 і Меїй-2,
ІЄМ-а, -В ї -у, СХСІ 10, 1-4, -12 їі -18, протромбін (крингл-домен 2), фрагмент антитромбіну ПІ, пролактин, МЕССІ, 5РАКС, остеопонтин, маспін, канстатин, проліферин-зв'язаний білок, рестин і лікарські засоби, такі як наприклад, бевацизумаб, ітраконазол, карбоксиамідотриазол, ТМР-470,
СМ101, ІРМ-а, тромбоцитарний фактор-4, сурамін, 505416, тромбоспондин, антагоністи МЕСЕР, ангіостатичні стероїди ж гепарин, інгібуючі фактори ангіогенезу в хрящовій тканині, інгібітори матриксної металопротеїнази, 2-метоксіестрадіол, текогалан, тетратіомолібдат, талідомід, тромбоспондин, інгібітори пролактина амр3, ліномід, препарат «їаздціпітод». Для огляду дивися зепоептеїа і Огапоїй 2011: Апіі-апдіодепеві5 іттипоїНегару. Нит Массіп. (9):976-81. 10. Низькомолекулярні лікарські засоби таргетної терапії
У цілому, низькомолекулярні лікарські засоби таргетної терапії являють собою інгібітори доменів ферментів на мутованих, надекспресованих або іншим способом важливих білках у раковій клітині. Відомими й необмежуючими прикладами є інгібітори тирозинкінази іматиніб (СІєемес/Сіїмес) і гефіниніб (Іге55а). Використання малих молекул, наприклад сунитинібу малату й/"або сорафенібу тозилату, що направлено впливають на деякі кінази, у комбінації з вакцинами для терапії раку, також описане в більш ранній заявці на патент О52009004213. 11. Вакцини на основі вірусів
Існує ряд протиракових вакцин на основі вірусів, доступних або, що знаходяться на стадії розробки, які можна застосовувати в комбінованому терапевтичному підході разом з лікарськими формами за даним винаходом. Однією перевагою використання таких вірусних векторів є їхня вроджена здатність ініціювати імунні відповіді, при цьому запальні реакції, що виникають у результаті вірусної інфекції, створюють сигнал небезпеки, необхідний для імунної активації. Ідеальний вірусний вектор повинен бути безпечним і не повинен приводити до антивекторної імунної відповіді для того, щоб забезпечити можливість бустер-імунізації протипухлинних специфічних відповідей. Рекомбінантні віруси, такі як вірус осповакцини, віруси простого герпеса, аденовіруси, аденоасоційовані віруси, ретровіруси й віруси роду Амірох використовували у тваринних пухлинних моделях і на основі їх обнадійливих результатів були
Зо ініційовані клінічні дослідження на людині. Особливо важливими вакцинами на основі вірусів є вірусоподобні частки (МІ Р), малі частки, які містять певні білки із зовнішньої оболонки вірусу.
Вірусоподобні частки не містять якого-небудь генетичного матеріалу вірусу й не можуть викликати інфекцію, але вони можуть бути сконструйовані для представлення пухлинних антигенів на своїй оболонці. МІ Р можуть бути отримані з різних вірусів, таких як, наприклад, вірус гепатиту В або інші сімейства вірусів, включаючи Рагмуомігідае (наприклад аденоасоційований вірус), Кеїгомігідає (наприклад, ВІЛ) і Ріамімігідаеє (наприклад, вірус гепатиту
С). Для загального огляду дивися 5огепзеп і Тпотрзеп 2007: Міги5-базей іттипоїПегару ої сапсег: паї до ме Кпом/ апа м/пеге аге же доїпд? АРМІЗ 1 15(11)11 177-93; вірусо-подібні частки проти раку описані в Виопадиго еї аї. 2011: ОемеІортепів іп міги5-ІЇКе рапісіє-базейд массіпев ТОг іптесійоив аізеазе5 апа сапсег. Ехреп Нем Массіпе5 10(1 1): 1569-83; і в СийШеп еї а. 2010: Міги5-
ІКе рапісієє аб массіпе апідеп5 апа асдіимапіє: арріїсайоп о сПгопіс адібвеазе, сапсег іттипоїПпегару апа іптесійбив аізеазе ргемепіїме зігагедієв. Ргоседіа іп МассіпоЇоду 2 (2), 128-133. 12. Стратегії на основі мультиепітопів
Використання мультиепітопів показало багатообіцяючі результати відносно вакцинації.
Технології швидкого секвенування в комбінації із системами інтелектуального алгоритму дозволяють використовувати мутаному пухлини й можуть забезпечити мультиепітопи для індивідуальних вакцин, які можуть бути комбіновані з даним винаходом. Для більш докладної інформації дивися 2007: Массіпацйіоп ої теїавзіаїййс соїогесіаІ| сапсег рабепів м/йп тайшгеа аепагйіс сеї їоадей м/йй тийіріє таог півіосотраїйрійу сотріех сіавз І реріідев5. ) ІттипоїНег 30: 762- 772; додатково, СазйцЦе еї аї. 2012: Ехріойіпд Ше тшапоте ог їштог массіпайоп. Сапсег Кез 72 (5): 1081 -91. 13. Адоптивне Т-клітинне перенесення
Наприклад, комбінація вакцинації пухлинного антигену й Т-клітинного перенесення описана в: Каророгі еї а. 2011: Сотбіпайоп іттипоїНегару изіпд адоріїме Т-сеїЇ ігапетег апа штог апіїдеп массіпайоп оп Ше Бравів ої Пепй апа виг/міп айег АБСТ ог тувіота. Віоса 1 17(3):788-97. 14. Таргетні терапії на основі пептидів
Пептиди можуть зв'язуватися з рецепторами клітинної поверхні або впливати на позаклітинний матрикс, що оточує пухлину. Радіонукліди, які прикріплені до цих пептидів (наприклад КОО) у підсумку вбивають ракові клітини, якщо нуклід руйнується близько клітини. бо Оліго- або мультимери цих з'єднувальних мотивів становлять особливий інтерес, тому що це може привести до підвищення пухлинної специфічності й авидності. Для огляду необмежуючих прикладів дивися татада 2011: Рерііде-рбазей сапсег массіпе ІШегару ог рговіаїе сапсег, ріадаеєг сапсег, апа таїїдпапі діюта. Міпоп Ніп5по 69(9): 1657-61. 15. Інші терапії
Існує ряд інші терапій раку, які можуть бути комбіновані з лікарськими формами й способами за даним винаходом для створення синергічних ефектів. Необмежуючими прикладами є терапії, спрямовані на апоптоз, гіпертермію, гормональну терапію, терапію тіломеразою, потенційовану інсулінову терапію, генну терапію й фотодинамічну терапію.
Даний винахід додатково проілюстрований наступними прикладами, які не повинні розглядатися як обмежуючі обсяг винаходу.
Приклади
Приклад 1: Створення й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМ18.2 і СОЗ а. Походження послідовності, дизайн конструкцій рі-5сЕм і клонування в експресійні вектори
Готовили конструкції тандемного біспецифічного одноланцюгового антитіла (Бі-5сЕм), що містять з'єднувальні домени, специфічні відносно компонента СОЗ людського Т-клітинного рецептора й людських пухлиноасоційованих антигенів (ТАА). Відповідні варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) для кожної конструкції специфічно розташовані в напрямку від М- до С-кінця в наступному порядку:
М - МНнасСіІ 0М'82 - МС ОМІВ2 - МНнаСОз - Мі «СО (1ВІМАВ, 18РНИ5, по.11-15)
М - МНнасСОз - М аСОз - МНасСіІ ОМ'82 - Мі аб 0826 (18РНИЗ, по.16-20)
У таблиці 1 представлені всі конструкції Бі-5сЕм, специфічні відносно ТАА СІ ОМ18.2 і РІ АСІ1, які були створені в рамках винаходу. Конструкції Бі-5сЕм були створені шляхом генного синтезу
Сепеай АС (Сепеанй//йе Тесппоїодіеє Стр, Ведепериг9, Септапу) з використанням послідовностей МН і МІ. відповідних антитіл. Оптимізації кодонів, таких як Ното заріеп5 (Н5Б),
Ми тизсши5 (ММ) або клітини яєчника китайського хом'ячка (Спіпехе Натвіег Омагу, СНО) були реалізовані за допомогою програмного забезпечення Сепедгї5 СепеОріїтіе!", і перераховано в таблиці 1. Інформація зі специфічності, походження послідовності з моноклональних антитіл (МАВ), використання кодонів, додаткових відмінних рис послідовностей
Зо і посилань на всі, що застосовуються домени узагальнено в таблиці 2. Походження послідовностей варіабельного домена відповідних антитіл СОЗ наведено в таблиці 2. Завдяки високій гомології людських і мишачих ТАА, однакові послідовності МН і МІ. анти-ТАА можуть бути використані для створення конструкцій рі-з-сЕм для тестів на мишах, але в комбінації з послідовностями УН, МІ. клону 145-231 мишачого специфічного анти-СОЗ антитіла.
Клонування ДНК і конструювання експресійного вектора проводили згідно зі стандартними процедурами (Сгееп/ЗатбгоокК, МоїІесшіаг Сіопіпд, 2012), добре відомими фахівцем у даній області. Коротко, основні ДНК-послідовності Бі-5сЕм містили сайти рестрикції 5' Ніпан ї 3' ХпоЇ (Ніпап ї Храї! у випадку 1ВІМАВ брі-5сЕм) для клонування в експресійні плазміди. Послідовність сигналу секреції вводили на 5'-кінці (вище) послідовності рі-5сЕм для секреції білка із клітинної цитоплазми в культуральне середовище. Послідовність, що кодує гнучкий гліцин-сериновий пептидний лінкер, що складається з 15-18 амінокислот, вставляли для з'єднання доменів МН і
МІ для композиції одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіла (5СЕМм), з яких один зв'язується з СОЗ і інший з ТАА. Для формування біспецифічного одноланцюгового антитіла послідовності двох доменів 5сЕм з'єднували послідовністю, що кодує короткий пептидний лінкер (60905). Разом із цією послідовністю лінкера сайт рестрикції ВатНі уводили для обмінів доменів 5сЕм для клонування наступних конструкцій рі-з-сЕм. Зокрема, 5 5сЕм-домени можуть бути замінені на сайти рестрикції Ніпап ї Ватні і 3 5сЕм-домени на рестрикцію Ватні і Хпо1.
Схему конструкції дивися також на фігурі 1.
Усі використовувані конструкції антитіла рі--сСЕм клонували в стандартний експресійний вектор ссавця рсоМА 7м3.1/тус-Нів (-) (пийгодеп/І їїе Тесппоіодіеє Сітрй, Оаптвіайії, Сегптапу).
С-кінцева 6 хНіз-мітка може бути використана для метал-афінного очищення білка й аналізів на виявлення. Усі конструкції підтверджували шляхом секвенування через сервіс по секвенуванню одиночних прочитань (МУ 5іпдіє геай зедиепсе 5егмісе) (Е/шгоїйп5 МУУС Орегоп, Ебегерего,
Сетптапу). 5О0
Таблиця 1
Короткий опис конструкцій біспецифічних одноланцюгових антитіл, специфічних до ТАА і СОЗ найменування кодонів
Щи паж не | я ве 5сгМ
СНО, клітини яєчника китайського хом'ячка; Н5, Ното-зарієп5; НИ, гуманізоване; ММ, Ми5
Таблиця 2
Коротка інформація з конструкцій Бі-5сЕм фрагмент СОЗ фрагмент ТАА
Реак- Реак-
Внутр. Походж. тивн ТАА Походж. тивн. в'-МН-МІ. 3-УН мМ. Короткий найм. тар | різно- таб. Різно- лінкер видн. видн. твбб СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тесідп18.2а6 | ТА!66 ссаоа5 полі МаБостт миша. СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тсідп18.2ар| 145-2С11 |ї5С000:05 по.12 | УСНІ |Люди- | С ОМ18,2) тсідп18.гар | людина, одп18.2ав | ОсНнтТі-ни. |50осо5 ни на миша иОСНТтІ СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тсідп18.2аб6 | ОСНТІ заа,асОа5
СІ в-т3 СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тесідп18.2аб | СІ В-ТЗ заа,асОа5 твбб СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тесідп18.2а6 | ТА!66 заа,асОа5 полв М45-2С11 миша |СІОМТ8.2 тоідптв.2ар, людина 145-2С11 | тсідп18.2а5 | 50:05 по.17 УСНІ |Люди- | С ОМ18,2) тсідп18.2ар | Людина, | оНтІ-НО | тсідпі8.гаь | з00со5 ни на миша иОСНТтІ СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина иОСНТтІ тесідп18.2ав | БОСХСССО
СІ в-т3 СІ ОМ18.2| тсідп18.2ар СІ в-тТ3 тесідп18.2ав | БОСХСССО твбб СІ ОМ18.2| тсідп18.2ар твеб тесідп18.2ав | БОСХСССО 18РНИБІ ТАбб СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тесідп18.2а6 | ТА!66 заа,асОа5 18РНИОЗІ ТАбб СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина твеб тесідп18.2ав | БОСХСССО
ТВРМОВИ45-2С11 миша | СІ ОоМ18.2 тоідптв.2аь людина тсідп18.2ар| 145-2С11 |ї5С000:05
ТВРМОЗ45-2С11 миша |СІОМТВ2 тоідптв.2аь людина 145-2С11 | тсідп18.2а5 | 50:05 тає Рост 1твни вно тяеє 0 |5обссе на миша
Продовження Таблиця 2
Внутр.| . Анти-СОЗ лінкер донів мен... посилання
Ї апгамессніа 8
У Іттипої 1987 зи дбосовнсвасв, Зненеснлнититне ою МАЕ по.11 |(3(0С(5)з | (ЯС(СО)з МОМ/ЗСП РІ МАТАТаУНн5 сно Маї! Асай 5сі, 1987
Веменівеу евї аї., по13 | (0са5)з| (й00105)з МОМ/5СПРІМАТАТОУНО |СНО Ешиг У Іттипої 1981 ттипоіоду 1989
Ї апгамессніа 8 по.15 |(3(0(5)з | (ССО) з МОУУ5СІ РІ МАТАТИУМНО |СНО Зспеідеддег, Ешиг
У Іттипої 1987
Ї о ега!., Ргос по.16 |((С(5)з | (ССО) з ММЗИагОЇїмМеЕМІ ТІ Ка |СнНО Маї! Асай 5сі, 1987
Веменівеу евї аї., по.18 | (30405) з | (ССО) з ММБОГОЇ МЕРЕМІ ТІ КОС |СнНОоО Еиг У Іттипої 1981
Ї апгамессніа 8 по20 |(3(й0(5)з | (ЙСЮ(СО)з МЕМ/БУМІГІ РІ! 5МТТОаМУНнВ СНО Зспеідеддег, Ешиг
У Іттипої 1987
Ї апгамессніа 8
У Іттипої 1987
І8РНИ мумк(ааза Гапгамесспіа й
З азрасм | (с2(:045)з МОМ/ЗСП РІ МАТАТаУНн5 но ЗсПеідедаєг, Ешиг р У Іттипої 1987
Ї о ега!., Ргос 18РМУІ (дсосв)з| ХЕ(6О5665)2 | Му 5СП РІ МАТАТОУН ММ Май Асаоб 5сі, сао 1987 1І8РМИ мумк(ааза Ї ео єї аї., Ргос
З азрасм | (с2(:045)з ММЗИагОЇїмМеЕМІ ТІ Ка |ММ Маї! Асай 5сі, р 1987
Ї апгамессніа 8 по.35 |(с(йС(5)з | (ЯСК(СО)з МОМ ММ РІ МАААОЗАСА | СНО ЗсПеідедаєг, Ешиг
У Іттипої 1987
СНО означає клітини яєчника китайського хом'ячка; Н5, Ното-зарієп5; МАВ, моноклональне антитіло; ММ, Ми5 тиз5сцін5; ТАА, пухлиноасоційований антиген. 5 Б. Генерація стабільних клітинних ліній-продуцентів
Для генерації стабільних клонів клітин-продуцентів СІ 0ОМ18.2-специфічних білків рі-зсЕм використовували клітинну лінію ембріональних нирок людини НЕК293 (АТСС СТІ -1573) і клітинну лінію яєчника китайського хом'ячка СНО-КІ (АТСС ССІ 461).
Трансфекція НЕК29З3 1 х 107 клітин НЕК293 засівали за два дні до трансфекції на чашки Петрі 14,5 см в 20 мл повного середовища ОМЕМ (ОМЕМ/Е-12 Сішатах, доповненого 10 95 термоінактивованої ЕВ: і
0,5 95 пеніциліну-стрептоміцину; усі реагенти від фірми сірсо/І бе ТесппоЇодіех стр, ЮОаптеїавдії,
Септапу). Перед трансфекцією клітини промивали фосфатно-сольовим буфером Дульбекко (ОРВ5), доповненим 2 мМ ЕОТА, потім додавали 20 мл чистого середовища ЮОМЕМ без додавання ЕВ5 або антибіотиків. 20 мкг лінеаризованої ДНК конструкцій, описаних у прикладі 1, розбавляли в 0,5 мл чистого середовища ЮМЕМ/Е-12. 75 мкл розчину лінійного РЕЇ при концентрації 1 мг/мл (поліетиленімін; Роїухзсіепсе5 Еигоре стр, Ерреїпеїт, Сеппапу) додавали в розведену ДНК і енергійно перемішували на вортексі. Через 15 хв. інкубації за кімнатної температури (КТ) у клітини краплями додавали комплекси ДНК/РЕЇ, чашки для клітинних культур обережно перемішували обертовим рухом і потім інкубували при 37 "С, 5 95 СО». Через 24 год після трансфекції середовище міняли. Відбір трансфікованих клітин починали через 48 год після трансфекції за допомогою сульфату 5418 (бірсо/ їе Тесппоіодіез Стр, Оагтєеїавдії,
Сегптапу) у кінцевій концентрації 0,8 мг/мл. (5418 безупинно додавали в культуральне середовище для вирощування клітин.
Трансфекція СНО-К1 1 х 106 клітин СНО-КІ1 засівали за день до трансфекції в б-лункові тканинні культуральні планшети в 2 мл повного середовища ЮОМЕМ (ОМЕМ/Е-12 Сішатах, доповненого 10 905 термоінактивованої ЕВ5, без антибіотиків; усі реагенти від фірми Ссірсо/ їїе ТесппоЇодіе5 стр,
Раптзіадії, Сегтапу). Перед трансфекцією клітини промивали ОРВ5, доповненим 2 мМ ЕОТА, потім додавали 1,5 мл звичайного середовища ОМЕМ без додавання ЕС5 або антибіотиків. 4 мкг лінеаризованої ДНК конструкцій, описаних у прикладі 1.а, розбавляли в 0,25 мл звичайного середовища ЮОМЕМ/Р-12 і обережно перемішували. У другій реакційній пробірці 2,5 мкл ліпофектаміна 2000 (Іпийгодеп/ їе ТесппоЇодіез стр, Юагтвіайі, Септапу) розбавляли в 0,25 мл звичайного середовища ОМЕМ/Е-12, обережно перемішували й інкубували протягом 5 хв. за кімнатної температури (КТ). Суміш ДНК ії суміш ліпофектаміна поєднували в співвідношенні 11, обережно перемішували й інкубували протягом 20 хв. за кімнатної температури (КТ). У клітини краплями додавали комплекси ДНК/ліпофектамін 2000, чашки для клітинних культур обережно перемішували обертовим рухом і потім інкубували при 37 "С, 5 95 СО». Через 6 год після трансфекції середовище заміняли повним середовищем ЮОМЕМ/Е-12. Клітини розщеплювали наступного дня в співвідношенні 1:10. Відбір трансфікованих клітин починали через 48 год після
Зо трансфекції за допомогою сульфату 5418 (сірсо/І Пе ТесппоЇодіез стр, Багтвіасдії, Ссепгтапу) у кінцевій концентрації 0,5 мг/мл. (3418 безупинно додавали в культуральне середовище для вирощування клітин. с. Відбір НЕК293 як клітин-продуцентів
Експресію білків Бі--сЕм стабільно трансфікованими клітинними лініями НЕК293 ї СНО-1, 35 описаними в прикладі І.5, характеризували за допомогою імунофлуоресцентного фарбування для детекції експресії рі-з-сЕм згідно зі стандартними процедурами (Сштепі Ргоїосої5 іп
Іттипоіоду, 2012). Коротко, 2 х 107 клітин вирощували на предметних склах протягом 24 год і потім пермеабілізували 2 95 РЕА. ОРВ5, доповнений 5 95 В5БА і 0,2 95 сапоніном, використовували як блокувальний буфер. Після промивання за допомогою ОРВ5 і блокування 40 за допомогою блокувального буфера клітини інкубували з первинним антитілом Апії-піз Ерпоре-
Тад (Оіапома стрій, Натбиго, Септапу) у розведенні 1:500 у блокувальному буфері протягом хв. при КТ. Після відмивання блокувальним буфером додавали вторинне кон'юговане з Суз козяче антимишаче Ідс (На) антитіло (Фаскбзоп Іттипогезеагспй Еигоре, ЗМИПОЇК, Епдіапа) у розведенні 1:500 у блокувальному буфері й інкубували протягом З год при КТ. Після промивання блокувальним буфером і НгО клітини занурювали в ОАКО-закріпляюче середовище (бакКо, Сагріпіепйа, СА, О5А), доповнене барвником Ноеспв5і 33342 (Ріегсе//пегто
Еізпег Зсіепіййс, КосКтога, І, ОБА). Зрізи досліджували й робили знімки за допомогою флуоресцентного мікроскопа Мікоп-Есіїрхее Ті для виявлення присутності рі-єсЕм-позитивних клітин (дані не показані). Клітини НЕК293 показали кращу загальну експресію білків Бі-5-сЕм у порівнянні із клітинами СНО-К'І і, таким чином, були відібрані як клітинна лінія- продуцента. а. Продукція й детекція білка 1ВІМАВ рі-5сЕм за допомогою клону 2528 НЕК293 1ВіІМАВ брі-5сЕм був відібраний як перший білок Брі-5сЕм, який підлягає одержанню, очищенню й використанню для проведення різних аналізів. Для цієї мети клональні клітинні лінії всіх клітин
НЕК293, стабільно експресуючих 1ВІМАВ (дивися Приклад І.Б), одержували шляхом сортингу окремих клітин з використанням клітинного сортера БГАС5 Агіа сеїЇ зогіег (ВО Віозсіепсев,
НеїдеІрего, Сегтапу). Після розмноження близько 40 клональних ліній кращий клон-продуцент був відібраний за допомогою імунофлуоресценції, як описано в Прикладі 1.с.
Відібраний клон-продуцент 228 розмножували й культивували в 10-шаровій клітинній фабриці (Мипс, Козхкіїде, ОептагКк) у середовищі ОМЕМ/Е-12 СіІшатах, доповненому 10 95 ЕВ5, бо 0,5 9о пеніциліну-стрептоміцину й 0,8 мг/мл 5418 (усі реагенти від фірми бірсо/ їе Тесппоодієв
Стр, Оагтеїадії, Сеппапу) відповідно до інструкцій виробника. На конфлюентній стадії клітини промивали ЮОРВ5З і середовище заміняли на ЮМЕМ/Е-12 з антибіотиками, але без ЕВ5.
Клітинний супенатант, що містить білок 1ВІМАВ бБі-5сЕм, збирали кожні 3-5 днів протягом 4 тижнів. Супернатант фільтрували за допомогою 500 мл 5іейор ЕШег Опії5 (МегокК МіпШіроге,
ВіПегіса, МА, ОА) і зберігали при 4 "С до ЕРІ С-очищення.
Перед ЕРІ С-очищенням присутність рі-зсЕм у супернатанте клітинної культури тестували шляхом електрофореза на поліакриламідному гелі з наступним фарбуванням кумаси й вестерн- блот-аналізом, виконуваним стандартним способом (Сигтепі Ргоїосої!5 іп Ргоїеіп 5сіепсе, 2012).
Супернатант концентрували 5х - 10х за допомогою обладнань Сепігісоп Сепігітида! Рійег Оемісе5 -4А0К МУУСО (Мегск Мійїроге, Війегіса, МА, ОБА) відповідно до протоколу виробника.
Концентровані й неконцентровані супернатанти розділяли на Мираде Момех 4 - 12 Фо Віб- гів
Сеї5 (Іпмігодеп/ їе Тесппоіодіе5 тб, Юаптеїайді, Сегтапу). Потім гелі фарбували розчином кумаси брильянтовим синім згідно зі стандартними процедурами для детекції білка 1ВіМАВ бі- 5сЕм у діапазоні від 50 до 60 Ка і інших білків, що містяться в супернатанті клітинної культури.Вестерн-блот-аналіз виконували для специфічної детекції білка 1ВІМАВ бБі-5сЕс за допомогою його бхНівб-мітки. Коротко, після блотинга білків на РУОЕ мембрані й блокування за допомогою РВЗТ/З395 сухого молока мембрану інкубували протягом 1 год при 4 "С з первинним антитілом Апіі-Ніє Ерпоре-Тад (Оіапома Стрий, Натбригуд, Септапу) у розведенні 1:500 у блокувальному буфері. Після промивання блокувальним буфером мембрани інкубували з Ес- специфічним вторинним козячим-антимишачим ІдсС антитілом, кон'югованим з пероксидазою (Зідта Аїагісп, сепгтапу), у розведенні 1:10000 у блокувальному буфері протягом 1 год при 4 "С.
Після промивання блокувальним буфером сигнали визуалізували за допомогою Зирегзідпаї
МУезі Бетіо Спетіштіпевсепі Зибвзігаїє (Ріегсе/Ппепто РЕібзпег Зсіепійіс, КосКтога, І, О5А) і записували за допомогою Ітадедциапі ГА5 4000 Ітадег (ЗЕ Неакрсаге І Ше 5сіепсе5, Мипіси,
Сегтапу). Сигнали рі-5сЕм детектували в діапазоні від 50 до 60 Ка у порівнянні із внутрішніми стандартами молекулярної маси (дивися фігуру З А і В). е. Очищення й кількісне визначення білка 1ВіІМАВ рі-5сЕм
Супернатант клітинної культури клону 228 НЕК293 білок, що містить 1ВІМАВ бБі-в5сЕм (описаний у прикладі І.4), піддавали афінній хроматографії з використанням іммобілізованих
Зо металів (ІМАС) з використанням стандартних процедур (Сиггепі РгоїосоїЇ5 іп Ргоїєвіп Зсієпсе, 2012). Коротко, фільтрований супернатант клітинної культури наносили на стовпчик Ні Тгар ЕЕ 5 мол, з'єднану із системою АКТА Ригійег 10 ЕРІ С 5уєїет (обидві фірми СЕ Неайнсаге І Ме
Зсіепсе5, Мипісп, сСегтапу). Промивний буфер РВ5 містив 10 мМ імідазола, елююючий буфер
РВЗ містив 500 мМ Масі, 50 мМ МанНне»Рох і 250 мМ імідазола, рН обох буферів було доведено до 7,4. Елюювання виконували з використанням східчастого градієнта. Елюйований білок 1ВіІМАВ бі-зсЕм відразу ж піддавали діалізу проти їх РВЗ5 з використанням Зііде-А-Іулег (2
Оіаіузіз Саззеце 10К МУУСО (Ріегсе/пепто Різпег Зсіепійіс, КоскКтога, І, ОБА). Після діалізу проти І х РВ5, Брі-5СЕм піддавали діалізу проти 200 мМ аргинінового буфера на основі НгО (І- аргінін-моногідрохлорид; Коїй, Кагізгипе, сегтапу).
Концентрацію Бі-5сЕм визначали шляхом вимірювання при 280 нм за допомогою Мапоадгор 2000с, враховуючи коефіцієнт екстинкції й молекулярну масу білка 1ВІМАВ брі-5сЕм, визначені за допомогою інструмента Ргоїрагат 00! (пЕр:/Амер.ехразу.огод/ргоїрагат/). Очищений білок розділяли на аліквоти і зберігали при -80 "С для тривалого зберігання або при 4 "С для негайного використання.
Якість і чистоту білка 1ВІМАВ Брі-5сЕм тестували шляхом фарбування кумаси й вестерн-блот- аналізу, як описано в Прикладі І.4 (дивися також фігури ЗА і В). Стандартне розведення ВЗА було включено в процедуру фарбування кумаси для попереднього підтвердження концентрації, обмірюваної за допомогою Мапоагор (дані не показані).
Ї. Проведення аналізу ЕГІЗА
Для кількісного визначення 1ВІМАВ у супернатанті клітинної культури клітин НЕК 293 проводили специфічний аналіз ЕГІЗА. Для цієї мети використовували супернатант із Прикладу 1.4 ї очищений білок ІБІМАВ брі-зсЕм, описаний у Прикладі ее. Попередньо блоковані ВЗА колонках Мі-МТА (Тпепто Різпег Зсіепійіс, Коскіога, ІС, О5А) використовували для іммобілізації білка 1ВІМАВ бБі-5сЕм за допомогою його бхПпі5-мітки. Усі стадії промивання виконували три рази 200 мкл Їх РВЗ/0,05 95 Ту"ееп (промивний буфер) на лунку й усі стадії виконували за кімнатної температури. Як стандарт використовували очищений білок 1ВІМАВ, розведений у І х РВЗ у діапазоні 10 - 500 нг/мл. Супернатанти розбавляли в співвідношенні 1:10 в Їх РВ5. У кожну лунку переносили по 100 мкл розведеного білка або супернатанта й інкубували протягом однієї години при струшуванні. Після промивання антиіїдіотипове антитіло проти доменів Мнин-Мі бо тс ОМ18.2ар розбавляли до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл в Їх РВЗ/395 ВЗА. У кожну лунку додавали по 100 мкл розчину анти-тСі 0ОМ18.2ар і інкубували протягом однієї години при струшуванні. Після промивання АР-кон'юговане антимишаче-Бс антитіло (Часк5оп
Ітітипогезеагсй Еигоре, 5ийОїЇК, Епдіапа) розбавляли до кінцевої концентрації 300 нг/мл в Їх
РІВВБ/396 ВЗА. У кожну лунку додавали по 100 мкл цього розчину вторинного антитіла й інкубували додатково протягом години при струшуванні. Як негативні контролі використовували тільки вторинне антитіло, 1ВІМАВ плюс вторинне антитіло, і анти-птСіІ ОМ18.2аб плюс вторинне антитіло. Крім того, в аналіз був включений супернатант клітин НЕК293 без білка рі-5сЕм. На закінчення, після промивання в кожну лунку додавали по 50 мкл розчину Ар-Субстрату (1,5 мг рпрр на мл субстратного буфера, Арріїспет Стр, Оагтєеїаді, Сегтапу). Через 5, 15 їі 30 хв інкубації в умовах темряви вимірювали поглинання при 405 нм із довжиною хвилі випущення 492 нм за допомогою мікропланшетного рідера Іпіпйе М200 Тесап (Тесап, Маппеодог',
Зм/й7епапа). Концентрацію білка Бі-5сЕм у супернатанті визначали шляхом розрахунків проти стандартного ряду (дані не показані). 9. Тимчасова трансфекція СІ ОМ18.2-специфічних білків Бі--сЕм для порівняльних досліджень
Для тимчасової генерації переважно високих кількостей СІ 0ОМ18.2-специфічних білків бі- 5СЕм використовували клітинну лінію ембріональних нирок людину НЕК293Т (АТСС СКІ -11268) для трансфекції. 1 х 107 клітин НЕК293Т засівали за два дні до трансфекції на чашки Петрі 14,5 см в 20 мл повного середовища ОМЕМ (ОМЕМ/Е-12 СІшатах, доповненого 10 95 термоінактивованого ЕВ5 і 0,5 95 пеніциліну-стрептоміцину; усі реагенти від Фірми сірсо/ їе Тесппоїодіе5 «зт,
Баптеїайді, Септапу). Перед трансфекцією клітини промивали ОРВ5, доповненим 2 мМ ЕОТА, потім додавали 20 мл звичайного середовища ОМЕМ без ЕВ5 або антибіотиків. 20 мкг кільцевих ДНК-конструкцій 1ВіМАВ, по. 11 - 20 і по.35 (описаних у Прикладі І.Б), розбавляли в 0,5 мл звичайного середовища ЮМЕМ/Е-12. У розведену ДНК додавали 75 мкл розчину лінійного РЕЇ (поліетиленімін; РоїЇузсіепсе5 Еигоре Стр, ЕрреїІПпеїт, Септапу) при концентрації 1 мг/мл і енергійно перемішували на вортексі. Через 15 хв. інкубації за кімнатної температури (КТ) у клітини краплями додавали комплекси ДНК/РЕЇ, чашки для клітинних культур обережно перемішували обертовим рухом і потім інкубували при 37 "С, 595 СО» протягом 24 год. Після
Зо заміни середовища на звичайне ОМЕМ/Е-12 клітини інкубували додатково протягом 48 год при 33 "С, 5 95 СО». Клітинний супернатант збирали після інкубації й стерильно фільтрували за допомогою 0,2 мкм шприцевих фільтрів Міпізагі зугіпде Якег5 (Зідта-Аїагісп, Сегтапу). Потім білки рі--сЕм очищали в малому масштабі із супернатантів клітинних культур за допомогою спин-стовпчиків Мі-МТА відповідно до протоколу виробника (Оіадеп, Ніїдеп, Сетапу).
Концентрації білка Ві--сЕм оцінювали за допомогою ЕЇІЗА, як описано в прикладі 1.ї, і підтверджували за допомогою вестерн-блот аналізу, як описано в прикладі І.е (дані не показані).
Очищені білки зберігали при 4 "С для негайного використання.
Приклад 2: Проведення функціональних аналізів для контролю специфічної активації Т- клітин і лізису клітин-мішеней за допомогою переспрямованих Т-клітин, опосередкованих білками рі-5сегм.
ЕРІ СО-очищений білок 1ВіМАВ рі-5сЕм використовували для проведення аналізів іп міго для контролю здатності білків Бі-хсЕм специфічно перенаправляти людські ефекторні клітини на
ТАА-позитивні клітини-мішені. Метою є візуалізація ефектів і кількісна оцінка активації людських
Т-клітин і специфічного лізису клітин-мішеней. а. Мікроскопічний аналіз Т-клітин, переспрямованих на клітини-мішені за допомогою білка Бі-
СЕМ
Для візуалізації функціональності білка Бі-з-сЕм проводили аналіз для демонстрації перенаправлення ефекторних клітин на СІ 0ОМ18.2-які експресують клітини-мішені білками бі- 5сЕм за допомогою мікроскопа. Для цієї мети як клітинну лінію-мішень використовували клітинну лінію карциноми шлунка МидС4, яка ендогенно експресує порівняно високі рівні людського
СГОМ18.2 (Запіп М. еї а), Сіїп Сапсег Невз. 2008 Оес І 14(23):7624-34).
Людські ефекторні клітини свіжоїзолювали з людської крові здорових донорів згідно зі стандартними процедурами (Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, 2012): коротко, кров розбавляли
ОРВ5, наносили шарами на РісоїІ-Радие Ріи5 (ЗЕ Неайвйсаге І їе Зсіепсе5, Мипісп, Септапу) і центрифугували. Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) збирали з інтерфази, промивали холодним ОРВ5, доповненим 2 мм ЕОТА і підраховували. Людські Т-клітини потім відокремлювали шляхом відділення магнітно-активованих клітин (МАС5) від РВМС за допомогою набору Рап Т Сеї| ІзоЇайоп Кії І (Мікепуї Віоїес, Тесгегому, сбептапу) відповідно до протоколу виробника. бо 1 х 105 клітин Мидса засівали на лунку в тканинні культуральні б-лункові планшети. Людські клітини готовили, як описано вище, і додавали в співвідношенні ефектора до мішені (Е:Т) 5:1.
Середовище КРМІ 1640, доповнене 5 95 термоінактивованою людською АВ сироваткою, 0,5 90 пеніциліну-стрептоміцину, І х МЕАА і 1 мМ пірувата натрію (сірсо// їе ТесппоЇодіе5 («зтри, рагтеїайі, Септапу), використовували для всіх клітин, і кінцевий обсяг кожної лунки доводили до 2 мл на лунку. Контрольні зразки містили клітини-мішені або Т-клітини з білком рі-з-сЕм або без нього. Тканинні культуральні планшети потім інкубували при 37 "С, 5 95 СО».
Спостереження за ходом аналізу проводили в безперервному режимі на інвертаційному мікроскопі УМіометі 5 іплепей тісгозсоре (Нипа, УмеїлІаг, септапу) в інтервалі від 6 год до 48 год спільної інкубації. Значні ефекти відносно утворення кластерів Т-клітин на клітинах-мішенях, формування імунологічного синапса й знищення клітин-мішеней у присутності білка 1ВІМАВ бі- 5сЕм спостерігали через 24 год. Через 48 год життєздатні клітини-мішені із труднощами могли бути виявлені. Знімки робили через 24 год на інвертаційному мікроскопі Мікоп Есіїрхсе Т5 100 (Мікоп, Чарап). Дивися також фігуру 5.
Цей аналіз надалі використовували як візуальний контроль у всіх аналізах на цитотоксичність у різних форматах лунок. р. Залежна від мішені активація Т-клітин білком 1ВІМАВ рі-5сЕм
Для детекції специфічної активації людських Т-клітин білками Бі-х:сЕм проводили аналіз методом проточної цитометрії. Для детекції активації Т-клітин маркер ранньої активації СОб69 і маркер пізньої активації СО25 минулого відібрані для фарбування антитілами, кон'югованими із флуоресцентними мітками. Для детекції людських Т-клітин у суміші клітин-мішеней і Т-клітин,
СОЗ на Т-клітинах фарбували.
Порядок проведення аналізу був вибраний з наведеного вище прикладу (Приклад 2.а).
Коротко, клітини-мішені МидС4 засівали з людськими Т-клітинами в співвідношенні Е:Т, рівному 5/1, в 2 мл повного середовища, і білок 1ВІМАВ рі-5сСЕм додавали в концентрації з діапазоні 0,001 - 1000 нг/мл. Контрольні зразки містили клітини-мішені або Т-клітини з білком 1ВІМАВ бі- 5СЕм або без нього. Через 24 год і/або 48 год - залежно від результату візуального контролю - усі клітини збирали шляхом обережного зішкрябування за допомогою Сеї! Зсгарегв5 (Загвівйді АС 8 Со, Міїппьгесні, сСептапу) і переносили в пробірки із круглим дном обсягом 5 мл (ВО Раїсоп,
НеїдеІрегу, Сегтапу). Клітини центрифугували й промивали ОРВ5. Для фарбування клітин використовували мишачі антилюдські СОЗ-РІТС, мишачі антилюдські СО6УО-АРС і мишачі антилюдські СО25-РЕ антитіла (усі антитіла фірми ВО Віозсіепсе5, НеїдеїЇрегуд, Сегтапу).
Клітинні опади ресуспендували в 50 мкл РАС5-буфера (ОРВ5, доповнений 5 956 ЕВ5), що містить антитіла кон'юговані із рлуоресцентними мітками. Після інкубації протягом 20 хв при 4 "С в умовах темряви зразки промивали 4 мл ОРВЗ5 і клітинний осад ресуспендували в 200 мкл
ЕАС5-буфера, що містить йодид пропідію (РІ) або 7-ААО (обидві фірми бідта Аїагісп, зеппапу) у кінцевому розведенні 1:1000 для детекції загиблих клітин. Зразки зберігали на льоду й в умовах темряви протягом проведення вимірювання. Аналіз виконували за допомогою
ЕРасзсаїїриг, наступні виміри виконували за допомогою проточного цитометра Расзсапіо ІІ (обидва фірми ВО Віозсіепсе5, НеїдеїІрегд, Септапу). Дані аналізів оцінювали за допомогою програмного забезпечення Ріоуло зопйуаге (Тгее Заг, Зап Сапов5, СА, ОА).
Як показано на фігурах 6А і В, 1 ВІМАВ-опосередкованої активації Т-клітин не виявляється під час відсутності клітин-мішеней, підтверджуючи строгу залежність функціональності рі-бсЕм від мішені. Значна активація Т-клітин у присутності клітин-мішеней виникала тільки при концентрації 1ВІМАВ, що становить 0,01 нг/мл, через 24 год. Максимальна ефективність була досягнута з використанням 100 нг/мл 1ВІМАВ.
Крім дослідження активації Т-клітин, даний аналіз забезпечує також кількісні аналізи опосередкованих бБі-5сЕм ефектів відносно знищення клітин-мішеней, шляхом гейтування популяції клітин-мішеней і оцінки процентного вмісту РІ- або 7-ААО-позитивних клітин-мішеней (дані відсутні). Усі аналізи виконували з використанням програмного забезпечення Ріоум/о (Тгее еїаг, Зап Сапов5, СА, ОА). с. Аналіз на цитотоксичність із використанням люциферази
Для визначення відмінностей у потенціалі білків рі-5:СЕмМ, спрямованих проти СІ ОМ18.2 і
СОЗ3, знищувати клітини-мішені, повинен бути розроблений високочутливий аналіз. Ціль полягала в проведенні аналізу, за допомогою якого можна було високопродуктивним чином кількісно контролювати знищення клітин-мішеней. Для досягнення цієї мети був вибраний цитотоксичний аналіз із використанням люциферази. За допомогою даного аналізу вимірювання експресії люциферази життєздатними клітинами-мішенями забезпечує можливість непрямого визначення лізису клітин-мішеней, опосередкованого цитотоксичними ефекторними клітинами в присутність антитіла. бо Спочатку клітини МидсСа4 (описані вище) трансдукували лентивірусним вектором, що несуть люциферазу світлячка, репортерний ген ЕСЕР і маркер селекції антибіотика. Після антибіотичного відбору трансдукованих клітин, клітини, які експресують на високому рівні ЕСЕР, піддавали сортингу за допомогою клітинного сортера ЕРасзагіа (ВО Віозсіепсе5, Неїдеїрег,
Септапу), аналізували на високу експресію люциферази й потім розмножували для наступних досліджень.
Людські ефекторні клітини готовили, як описано в прикладі 2.а. Аналіз проводили при концентрації білка 1ВІіМАВ бБі-зсЕм у діапазоні 1-100 нг/мл, при цьому було виявлено, що концентрація 5 нг/мл забезпечувала високоефективні й відтворені результати, і надалі була використана як стандартна концентрація. Клітини МидС4, стабільно які експресують люциферазу (описану вище), використовували як клітини-мішені. У кожну лунку засівали 1 х 1027 клітин-мішеней у білі плоскодонні 96-лункові планшети. Людські Т-клітини (приготовлені, як описано в Прикладі 2.а) додавали в співвідношенні ЕТ, рівному 5:1. Використовували середовище, описане вище (Приклад 2.а), і кінцевий обсяг кожної лунки доводили до 100 мкл.
Тестовані зразки й контрольні зразки засівали щонайменше у трьох повторностях. Клітинні культуральні мікропланшети інкубували протягом 24 год і 48 год при 37 "С, 5 95 СО». Для аналізу 50 мкл водяного розчину, що містить 1 мг/мл люциферину (ВО Мопоїїдні во
Віозсіепсе5, НеїдеІрегуо, Сеппапу) і 50 мМ НЕРЕЗ додавали в кожну лунку, і планшети потім інкубували протягом 30 хв. в умовах темряви при 37 "С. Люмінесценцію, що виникає в результаті окиснення люциферина люциферазой, яка еспресує життєздатні клітини, вимірювали на мікропланшетному рідері (Іпбпйе М200, Тесап, Маппейдогї Зм/йгегпапа). Відсоток специфічного лізису клітин-мішеней розраховували за наступною формулою: 95 специфічного лізису - (1 - (люмінесценція тестований зразок" І тах) / (І тіп - Ї тах)) Х 100, де «І» означає лізис. І піп належить до мінімального лізису під час відсутності рі-5сЕм, і Ї лах до максимального лізису (рівного числу імпульсів спонтанної люмінесценції) під час відсутності рі-з5сЕм, досягнутого шляхом додавання Топ Х-100 (кінцева концентрація 2 95).
Потенційні прямі ефекти білків Бі-5сЕм на клітини-мішені незалежно від ефекторних клітин визначали шляхом засівання клітин-мішеней без людських Т-клітин, включаючи всі контролі, такі як І ліп і Ї лах. Даний аналіз використовували для наступних досліджень для вивчення специфічного лізису клітин-мішеней, опосередкованого Т-клітинами. Модифікації здійснювали, наприклад, шляхом зміни концентрацій бБі-5сЕм, білків Бі-5сЕм, співвідношення Е:Т або ефекторних клітин (СЮОвж, СО4-- Т-клітини, РВМС).
Приклад 3: Відбір лідерного кандидата СІ ЮОМ18.2-специфічного Бі-єсЕм
Аналіз на цитотоксичність із використанням люциферази з різними СІ ОМ18.2-специфічними білками рі-5сЕм для відбору найбільш сильного варіанта Бі-сЕм
Усі 10 кодон-оптимізованих конструкцій СНО (по. 11-20), специфічних відносно ТАА
СІ ОМ18.2, тестували в порівнянні з оптимізованим по кодонах людським білком 1ВІіМАВ рі-5сЕм в аналізі на цитотоксичність із використанням люциферази із клітинами-мішенями Мидса, які ендогенно експресують СІ ОМ18.2 і ектопічно експресують люциферазу (дивися також приклад 2.с). Характеристики використовуваних білків Бі-5:сСЕм представлено в таблиці 2. Ві-єсЕм по.35, специфічний відносно ТАА РІАСТІ, використовували як контроль ізотипу, тому що РГАС1 не експресується клітинами МидС4. Активність зв'язування з СЮОЗ на людських Т-клітинах була підтверджена в аналізі зв'язування ГАСЗ (дані не показані). Усе білки Бі-5сЕм генерували, як описано в прикладі 1.9, і використовували для аналізу на цитотоксичність, як описано в прикладі 2.6.
Усі білки рі-5сСЕм використовували в кінцевій концентрації 5 нг/мл. Для визначення І піп, контрольний білок Бі--сЕм по.35 засівали із клітинами-мішенями й Т-клітинами в дев'яти повторностях, тестовані зразки засівали в шести повторностях. На кожний момент часу один планшет готовили для аналізу.
Специфічний лізис у кожний аналізований момент часу (8 год, 16 год, 24 год) показаний
БО залежно від використовуваних білків Бі-5сЕм. Було доведено, що білки 1ВІМАВ бБі-зсЕм (5ЕО І
МО: 39) і по.15 (З5ЕО ІО МО: 41) - які сконструйовані в однаковій орієнтації й містять однакову послідовність анти-СОЗ (ТКб66), і відрізняються тільки за використанням їх кодонів на рівні нуклеїнової кислоти й за послідовностями лінкера - є найбільш сильними антитілами відносно опосередкування лізису клітин-мішеней (дивися фігуру 2). Тому що 1ВІМАВ і по.15 рівносильні по ефективності, найбільше добре вивчений на сьогоднішній день білок 1ВІМАВ бБі-5сЕм був відібраний для всіх наступних аналізів. Конструкції І8РНОЗ ї 18РНИиИ5 (дивися таблицю 1 і 2) порівнювали в більш пізній момент часу з 1ВІМАВ. Ефективність 18РНИ5 була еквівалентна 1ВІМАВ, 18РНИЗ був менш сильним (дані не показані).
Приклад 4: З'єднувальна здатність білка 1ВІМАВ рі-5сЕм бо Проведення аналізу на зв'язування на основі ЕАС5
Аналіз методом проточної цитометрії використовували для оцінки з'єднувальної здатності
СІ ОМ18.2 і фрагментів білків Бі-хсЕм, що направлено впливають на СО3. СІ ОМ18.2, ендогенно експресований клітинами МидС4, використовували для вивчення анти-СІОМ18.2 сайту й людські Т-клітини використовували для вивчення анти-СОЗ сайту.
Для вивчення з'єднувальної здатності анти-СІОМ18.2, клітини МидС4 трипсинували, промивали повним середовищем КРМІ 1640 і потім ОРВ5. Усі промивні стадії виконували шляхом центрифугування при 1200 об/хв. протягом б хв. при 4 "С. 2,5 х 105 клітин МидбС4 переносили в круглодонні пробірки обсягом 5 мл і інкубували з 50 мкг/мл ЕРІ С-очищеного білка 1ВІМАВ в ЕАСсС5З-буфері протягом 30 хв. при 4 "С. Клітини промивали 2 мл ЕАС5-буфера й потім інкубували з 3,3 мкг/мл моноклонального антитіла Апіі-НІЗ Еріюре-Тад (Оіапома Стр,
Натрбиго, Сепгтапу) протягом 30 хв. при 4 "С. Після промивання 2 мл ГАС5-буфера, клітинний осад інкубували з АРбС-кон'югованим козячим-антимишачим вторинним антитілом (Чдаск5оп
Іттипогезеагсп Еигоре, З5ийМОїЇК, Епдіапа) у розведенні 1:200 в ГЕАС5-буфері протягом 20 хв. при 4 "Сб в умовах темряви. Клітини двічі промивали 2 мл БАСЗ-буфера й на закінчення ресуспендували в 150 мкл РЕАС5-буфера, доповненого 1 мкг/мл РІ (Зідта Аїадгісй, зеппапу) для контрастного фарбування загиблих клітин. Інше фарбування було включено з використанням такої ж процедури за допомогою 50 мкг/мл 1ВІМАВ і АРС-кон'югованого козячого-антимишачого вторинного антитіла (1:200), але без Апіі-НІ5 Ерпоре-Тад антитіла. Негативні контрольні зразки включали вторинне козяче-антимишаче антитіло, кон'юговане з алофікоцианіном (АРС), моноклональне антитіло Апіі-НІ5 Еріоре-Тад плюс вторинне козяче-антимишаче антитіло, кон'юговане з АРС. Як позитивний контроль використовували 10 мкг/мл моноклонального
СІ ОМ18.2-специфічного антитіла ті ОМ18.2а5, пофарбованого вторинним /козячим- антилюдським антитілом, кон'югованим з АРС (даскбоп Іттипогезеагсй Еигоре, БИиМОЇК,
Епдіапа), і його вторинного антитіла.
Зразки вимірювали за допомогою проточного цитометра Расзсаїйриг (ВО Віозсіепсев,
НеїдеІрегдо, Сегпгтапу) і аналізували за допомогою програмного забезпечення РіоулЛо Зоймаге (Ттее Зіаг, Зап Сапо5, СА, О5А). Сильні сигнали детектували шляхом послідовного фарбування 1ВІМАВ, Апіі-НІ5 Ерйоре-Тад і козячим-антимишачим АРС. Інтенсивність сигналу була порівнянна з позитивним контролем ті 0М18.2ар з козячим-антилюдським АРС. Низький
Зо рівень прямого зв'язування козячого-антимишачого АРС з 1ВіІМАВ спостерігали в зразку, пофарбованому 1ВіМАВ і козячим-антимишачим АРС без Апіі-НІЗ Ерйоре-Тад (дивися фігуру 4
А).
Для всіх наступних аналізів ЕАС5-зв'язування для дослідження з'єднувальної здатності білків рБі-5сСЕм використовували послідовний протокол, фарбуючи бБі-зсЕм, Апіі-НІ5 Еріюре-Тад і козячим-антимишачим АРС (дивися фігуру 48, С і 0). Для виключення неспецифічного зв'язування 1ВІМАВ, клітини-мішені, які не експресують СІ 0ОМ18.2, що підтверджується даними
ВТ-РСК (дані не показані), піддавали аналізу на зв'язування на основі ЕАС5. Неспецифічного зв'язування 1ВІМАВ не було виявлено, як показано на фігурі 40.
Для вивчення з'єднувальної здатності анти-СОЗ плеча білка 1ВіМАВ брі-5сЕм використовували людські Т-клітини, 1 х 106 Т-клітин, отриманих, як описано в прикладі 2.а, переносили в круглодонні пробірки обсягом 5 мл і інкубували з ЕРІ С-очищеним білком 1ВІМАВ при концентрації в діапазоні 0,002 - 2 мкг/мл в РЕАС5-буфері протягом 30 хв. при 4 "С. Наступна процедура фарбування описана вище. Контрольні зразки включали тільки вторинне козяче- антимишаче АРС антитіло й моноклональне антитіло Апіі-НІ5 Ерйоре-Тад плюс вторинне козяче-антимишаче АРС антитіло. Вимірювання й аналіз проводили, як описано вище. Значний сигнал був отриманий при 2 мкг/мл 1ВіІМАВ (дивися фігуру 4С).
Приклад 5: Вивчення високоспецифічної, залежної від мішені активації Т-клітин білком 1ВіІМАВ брі-5сЕм
Лінії ракових клітин, які ендогенно експресують високі або низькі рівні СОМ 18.2, і лінії ракових клітин, які не експресують СІ ОМ18.2, відбирали для підтвердження строгої залежності від мішені білка 1ВІМАВ брі-5сЕм в аналізі іп міго цитотоксичності. Відібрані клітинні лінії являли собою два основні типи карциноми, які експресують СІ ОМ18.2: карциному шлунка (Мидса,
МКМ, 5МИ-1) і підшлункової залози (Юапо, КР-4). Клітинну лінію раку молочної залози МСЕ7 використовували як негативний контроль. а. Аналіз методом КТ-РСА СІ ОМ18.2 клітинних ліній злоякісних новоутворень
Загальну РНК екстрагували із клітинних ліній карциноми, зазначених вище, за допомогою набору Кпеазу Міпі Кі згідно із процедурою відповідно до протоколу виробника (Оціадеп,
Ніїдеп, Сегтапу). 5 мкг РНК використовували для синтезу кКДНК із використанням зворотної транскриптази Зирегзсегіри І (І їе ТесппоЇодіез тр, баптеїайії, Септапу). бо Аналізи КТ-РСЕ проводили із застосуванням системи АВІ Ргізт 7300 Кеаї! Тіте РСВ бувієт
(Арріїеєд Віозуєтетв5/І їе ТесппоЇодіез тб, баптєеїайії, Сегтапу) з використання барвника Зубг
Сгееп і наступних праймерів:
СІ ОМ18.2: для ТООСТСТОТОТСОАСАСТОТО; гем СОТОТАСАТОТТАОСТОТОСАС НРКЕТ: для ТОАСАСТОССААДААСААТОСА; гем ЗПОТССТТТТСАССАССАДОИаСТ
Величину дельта Сі розраховували шляхом вирахування величини Сі гена домашнього господарства НРКТ з величини СІ СІ ОМ18.2 (результати показано на фігурі 7 А). р. Ексклюзивна активація Т-клітин у присутність СІ ОМ18.2
Аналіз цитотоксичності проводили, як описано в прикладі 2.а. Клітинні лінії карциноми, досліджені відносно транскриптів СІ ОМ18.2 згідно із прикладом 5.а за допомогою кількісної КТ-
РСЕ, використовували як клітини-мішені. Концентрація білка 1ВІМАВ брі-5сЕм у даному аналізі склала 5 нг/мл. Клітини-мішені засівали з людськими Т-клітинами й 1ВімМАВ у двох повторностях для аналізу активації Т-клітин. Для контролю будь-якої потенційної алореативності Т-клітин проти клітин-мішеней незалежно від білка 1ВІМАВ бБі-5сЕ, клітини-мішені й Т-клітини засівали без 1ВІМАВ у двох повторностях. Клітини безупинно спостерігали під мікроскопом на утворення кластерів Т-клітин і зв'язування клітин-мішеней. У випадку клітинної лінії МидС4, яка високо еспресує СІ ОМ18.2, значний ефект виникав через 2 год; через 48 год життєздатні клітини- мішені були ледве видимими. У випадку низької еспресії СІ ОМ18.2 клітинною лінією бапд перші ефекти спостерігалися через 96 год і значні ефекти через 120 год. У випадку СІ ОМ18.2- негативних клітинних ліній ефекти, що вказують на яку-небудь активацію Т-клітин, були відсутні навіть через 144 год. Т-клітини всіх зразків аналізували через 144 год спільної інкубації із клітинами-мішенями за допомогою проточної цитометрії, як описано в прикладі 2.а для маркера
СО69 ранньої активації Т-клітин і маркера СО25 пізньої активації, контрастно пофарбованих
СОЗ для Т-клітинної популяції й РІ для загиблих клітин. Дивним чином, до 100 95 Т-клітин, спільно інкубованих з МидсС4 і 1ВіМАВ, були СО 25-позитивними, але СО 69-негативними, що вказувало на тривалу активацію Т-клітин, коли знижуюча регуляція СОбУ уже виникла.
Приблизно 75 95 Т-клітин, спільно інкубованих з ЮБапд і 1ВІМАВ, було активовано, з яких приблизно 40 95 одночасно експресували СО25 і СОб69, що вказувало на активацію Т-клітин, яка усе ще триває. Т-клітини, спільно інкубовані з СІ ОМ18.2-негативними клітинними лініями, не показали якої-небудь ознаки індукції активації Т-клітин: експресія СО69 і 2025 не була значно
Зо підвищеною в порівнянні з рівнями експресії зразків без 1ВІМАВ (дивися також фігуру 7В).
Приклад 6: Дослідження індукованої білюом 1ВіМАВ Бі-5сЕм функції Т-клітин а. Індукція проліферації Т-клітин
Проліферація Т-клітин є ознакою активації Т-клітин. Для демонстрації проліферації Т-клітин у відповідь на білок 1ВІМАВ брі-зсбм у присутності СІ ОМ18.2-позитивних клітин-мішеней використовували аналіз методом проточної цитометрії. Коротко, 1 х 106 людських Т-клітин виділяли, як описано в прикладі 2.а, фарбували в умовах темряви при 37 "С протягом 10 хв. із 0,5 мкМ карбоксифлуоресцеїну діацетату сукцинімідилового складного ефіру (СеЇйгасе СЕБЕ,
Іпмігодеп/ їе ТесппоЇодіеє (три, Сегпгтапу), розчиненого в ОРВ5. Фарбування зупиняли шляхом додавання 5 обсягів холодного повного середовища КРМІ 1640. Клітини зберігали на льоді протягом 5 хв. і промивали З рази повним середовищем КРМІ (595 термоінактивованої людської сироватки АВ, 0,5 95 пеніциліну-стрептоміцину, їх МЕАА і 1 мМ пірувату натрію) і потім ресуспендували до 1 х 10» клітин на мл. Аналіз на цитотоксичність, описаний у прикладі 2.5, проводили з СІ ОМ18.2, ендогенно експресуючим клітини МидС4, і людськими Т-клітинами як ефекторними клітинами. У клітини додавали 50 ОД 1-2 на мл середовища. Зразки включали тільки Т-клітини, Т-клітини з 1 нг/мл 1ВІМАВ, Т-клітини й клітини МидС4, ї Т-клітини з 1 нг/мл 1ВІМАВ і клітинами МидС4. Через 120 год спільної інкубації Т-клітини відбирали, збирали в круглодонні пробірки обсягом 5 мл, промивали й фарбували розчином 7-ААО ОРВ5 у розведенні 1:1000 для контрастного фарбування загиблих клітин протягом 15 хв. при 4 "С. Після промивання ЮОРВО5 клітини ресуспендували в ЕБАС5-буфері й аналізували за допомогою
ЕРасзсапіо ІІ (ВО Віозсієпсев, НеїдеІрег9, Септапу).
Проліферацію Т-клітин детектували за зменшенням СЕ5Е-сигналу тільки в присутності клітин-мішеней і білка 1ВіМАВ брі-5сЕм (дивися також фігуру 8 А). р. Індукція серинпротеази Сгтапгуте В
Для демонстрації підвищувального регулювання протеолітичних молекул після активації Т- клітин, опосередкованої білюоюм 1ВІМАВ бБрі-5сЕм у присутності СІ ОМ18.2-позитивних клітин- мішеней, вибрали детекцію серинпротеази Стаплуте В за допомогою аналізу методом проточної цитометрії. Аналіз на цитотоксичність, описаний у прикладі 2.65, проводили з
СІ ОМ18.2, ендогенно експресуючим клітини МидС4, і людськими Т-клітинами як ефекторними клітинами. Зразки включали тільки Т-клітини, Т-клітини з 5 нг/мл 1ВІМАВ, Т-клітини й клітини бо Мидса, і Т-клітини з 5 нг/мл 1ВІМАВ і клітинами Мидса4. Через 96 год спільної інкубації Т-клітини відбирали, збирали в круглодонні пробірки обсягом 5 мл, промивали й фарбували розчином 7-
ААОр рРВ5 у розведенні 1 : 1000 для контрастного фарбування загиблих клітин протягом 15 мн при 4 "С. Після промивання ОРВ5 клітини фіксували 100 мкл розчину Суїорегт/Сушїїх протягом 20 хв. за кімнатної температури (КТ). Клітини промивали Їх Репт//Л/азй і потім фарбували Ре- кон'югованим мишачим антилюдським Сгаплуте В антитілом протягом 20 хв. при КТ. Після промивання клітини ресуспендували в РАС5-буфері й аналізували на приладі Расзсапіо ІІ (усі реагенти й ЕАС5 таспіпе ВО Віозсіепсев5, НеїдеїІрего, Сегтапу).
Підвищувальну регуляцію Сгапгуте В у Т-клітинах детектували тільки в присутності клітин- мішеней і білка 1ВІіМАВ Бі-5сЕм (дивися також фігуру 88).
Приклад 7: Визначення ЕС5О білка 1ВіІМАВ рі-5сЕм в аналізі іп міго на цитотоксичність
Аналіз на цитотоксичність із використанням люциферази
Для визначення половини максимальної ефективної дози білка 1ВімМмАВ бі-5сЕм, ряд титрувань 1ВіІМАВ тестували в аналізі іп міго на цитотоксичність із використанням люциферази, головним чином, як описано в прикладі 2.с.
Стабільно експресуючі люциферазу клітини МидС4, описані в прикладі 2.с, інкулювали з людськими Т-клітинами й білком 1ВІМАВ рі-зсЕм у концентраціях у діапазоні від 1 пг/мл до 1 мкг/мл (10 кроків) і без ТВІМАВ для визначення величин І лі. Люмінесценцію життєздатних клітин вимірювали на планшетному рідері Іпїпне М200 Тесап через 24 год і 48 год після початку аналізу. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою, наведеною у прикладі 2.6.
Максимальний лізис був досягнутий через 48 год з використанням 1 - 10 нг/мл 1ВіМАВ.
Певна величина ЕС5О через 48 год у цьому аналізі склала 10 пг/мл (дивися також фігуру 9).
Результат цього аналізу залежить значною мірою від активності людських Т-клітин, яка різниться залежно від імунного статусу донора, як описано в інших роботах (наприклад,
І Шегриезе, В еї аї, Ргос. Май. Асай. осі. ОБА. 2010 Ош! 13; 107(28): 12605- 10). Крім того, використовувана лінія клітин-мішеней МидОС4 показує мінливу експресію СІ ОМ18.2, також впливаючи на результат. Таким чином, у ході винаходу спостерігалося відхилення величин
ЕС5О білка 1ВіМАВ бБі-5сЕм у діапазоні 10 - 300 пг/мл.
Приклад 8: Ефективність у мишачій моделі ксенотрансплантата
Зо Для дослідження терапевтичного потенціалу білка 1ВІМАВ Брі-5сЕм іп мімо був вибраний мишачий штам МОО.Са-Ріказсіа ПІ 2гдітім/57| або короткий МО (УаскК5зоп Іабогафогу, Ваг
Нагбоиг, МЕ, ОБА). Для описаного дослідження щеплення людських ефекторних клітин і людських Т-лімфоцитів у мишей необхідно для дослідження ефектів Т-клітинного захоплення бі- 5СЕм іп мімо. Через повну відсутність В-, Т- ії МК-клітин мишачий штам М5О є підходящим для цього виду досліджень ксенотрансплантата. Мишача модель із привитими, головним чином, людськими Т-клітинами після ін'єкції РВМС становить частину винаходу. а. Лікування з пізнім початком пухлин на пізній стадії, високоекспресуючих СІ ОМ18.2, у мишей за допомогою білка 1ВІМАВ Бі-зсЕм
В описаному дослідженні 40 самкам мишей М5О у віці 8 тижнів підшкірно інокулювали 1 х 10'"клітин НЕК293, стабільно експресуючих високі рівні людського СІ ОМ18.2 (НЕК293-
СІ ОМ18.2). Через 5 днів після інокуляції пухлинних клітин мишей розподіляли відповідно до обсягу їх пухлин на лікувальні групи, при цьому миші, у яких ріст пухлини був відсутній, були виключені. У той же день мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяли з людської крові здорових донорів методом центрифугування в градієнті щільності фікола, як описано в прикладі 2.а, і використовували як ефекторні клітини іп мімо. 2 х 107 РВМС, розведених в 300 мкл ОРВБ5, ін'єкктгували інтраперитонеально в день виділення експериментальним лікувальним групам, позначеним «РВМС». Лікувальні групи, позначені «РВ5», одержували 300 мкл простого ОРВ5 інтраперитонеально й служили як контроль без людських ефекторних клітин. За допомогою контрольних груп «РВ5» можна досліджувати потенційний ефект на ріст пухлини самого 1ВІМАВ або будь-які потенційні побічні ефекти, які викликано 1ВІМАВ або носієм, але не людськими ефекторними клітинами, проти мишачої тканини(тобто реакція трансплантат проти хазяїна, викликана людськими ефекторними клітинами, проти мишачої тканини). Група «РВ5З/носій» включала 4 мишей (п-4), «РВ5/Л ВІМАВ» 5 мишей (п-5), «РВМС/носій» 13 мишей (п-13) і «РВМС/1ВІМАВ» 15 мишей (п-15). Терапію починали через 1 день після застосування ОРВ5З або РВМС: групи «РВЗ/ЛВІМАВ» і «РВМС/1ВІМАВ» одержували інтраперитонеально 5 мкг очищеного білка 1ВіМАВ бі-5сгЕм, розведеного в 200 мкл ЮОРВ5З на тварину. Групи «РВб/носій» і «РВМС/носій» одержували інтраперитонеально 200 мкл буферного носія (200 мМ (І -аргініну моногідрохлориду, розчиненого в НгО, стерильно фільтрованого), розведеного в ОРВ5. Лікувальні групи коротко бо описано в таблиці 3. Терапію проводили на щоденній основі протягом 22 днів. Двічі в тиждень вимірювали розмір пухлин за допомогою цифрового каліброваного каліпера, і обсяг пухлин розраховували за формулою мм? - довжина х ширина х (ширина/2). На фігурах 10А і В показане інгібування росту пухлини й зменшення пухлини у два рази в мишей групи «РВМС/1ВІМАВ» тільки за допомогою антитіла в присутності людських ефекторних клітин. Мишей забивали шляхом зсуву шийних хребців, коли обсяг пухлини перевищував 500 мм3, або у випадку серйозних клінічних проявів (у деяких мишей спостерігалися симптоми реакції трансплантат проти хазяїна).
Таблиця З
Лікувальні групи с п клітини рі-зсЕм миша 11171114 - ба Ї77117171717511171717171171771111111-111111117111 вітав 0/5 2 63 77777771 Ї77171711113 РВМСОГ/////// Її 7777-1111 р. Визначення впливу терапії на масу тіла
Масу тіла кожної миші вимірювали два рази на тиждень із використанням лабораторних ваг.
Жодна з мишей у будь-якій групі не показала зниження маси тіла протягом періоду лікування (дані не показані). Деякі миші в обох групах «РВМС» виявили симптоми реакції трансплантат проти хазяїна через 4 тижні після ін'єкції РВМС і через кілька днів після завершення лікування.
Ефекти самого 1ВіМАВ на масу тіла або інші побічні ефекти, що належать до стану здоров'я мишей, не спостерігалися. с. Консервація тканини й виділення спленоцитів
Після забиття мишей пухлини видаляли, і тканину відразу ж фіксували в 10 мл 495 Коїі-
Нівіоїїх (Сагі Ко, Кап5гийе, Септапу) для імуногістохімічного аналізу. Крім того, селезінки видаляли для детекції приживлення людських клітин за допомогою проточної цитометрії.
Виділення спленоцитів виконували відразу ж після видалення селезінок, продавлюючи їх через клітинний фільтр із розміром гнізд 70 мкм, поміщений у реакційну пробірку обсягом 50 мл зі стерильним поршнем 3-5 мл шприца, і повторного промивання клітинного фільтра теплим
ОРВ5. Виділені спленоцити центрифугували, ОРВ5 декантували й осад спленоцитів ресуспендували в 1 мл термоінактивованої фетальної бичачої сироватки, доповненої 10 95 10 95 рМ5О. Зразки негайно заморожували при -80 "С і зберігали до одержання зразків спленоцитів від усіх мишей. а. Аналіз приживлення людських Т-лімфоцитів у мишачих селезінках
Спленоцити від усіх мишей збирали й заморожували, як описано в Прикладі 8.с. Повну колекцію зразків спленоцитів відтавали одночасно, усі клітини промивали двічі теплим ОРБУХ, і 1 х 1056 спленоцитів на зразок інкубували з антитілами, кон'югованими із флуоресцентними мітками, протягом 20 хв. при 4 "С в умовах темряви для детекції приживлення людських клітин шляхом фарбування анти-СО45 і процентного вмісту людських клітин шляхом фарбування анти-СОЗ, анти-СО4 і анти-СО8. Аналіз методом проточної цитометрії проводили на проточному цитометрі Расзсаїїриг (ВО Віозсієпсез, НеїдеІрегдо, Сегтапу). Приживлення людських Т-клітин в обох групах «РВМС» може підтверджуватися високим процентним вмістом двічі СО45-СО 3- позитивних спленоцитів, як показано на фігурі 100.
Приклад 9: Генерація й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМб і СОЗ а. Походження послідовності, розробка конструкцій Бі-5-сЕм і клонування в експресійні вектори
Конструкції біспецифічного тандемного одноланцюгового антитіла (Брі-5сЕм) містили з'єднувальні домени, специфічні відносно компонента СОЗ людського Т-клітинного рецептора й людських пухлиноасоційованих антигенів (ТАА). Відповідні варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані для кожної конструкції специфічно в напрямку від М- до С-кінця в наступному порядку:
М-МНасСІ ОМ - Мас ОМ МНасоз - Мі асСоз - С (6РНИБ; 5ЕО ІЮ МО: 43)
М- МнаСОз - М асо -МНаСІ ОМ Мі ас ом б (6РНОБ; 5ЕО ІО МО:45)
У таблиці 4 коротко описані всі конструкції рі-5сЕм, специфічні відносно ТАА СІ ОМб, які були генеровані в рамках винаходу. Сі ОМ18.2-специфічну конструкцію 1ВіІМАВ бБі-зсЕм використовували як контрольне антитіло. Конструкції рі-5сЕм генерували шляхом генного синтезу Сепеагп АС (Сепеаг// їе ТесппоЇодіез5 (трі, Кедепоригд, Септапу) з використанням послідовностей УН і Мі. відповідних антитіл. Оптимізації кодонів, такі як Ното з5аріепо5 (Н5) або
Ми5 тизсціи5 (ММ) були реалізовані за допомогою програмного забезпечення СепеАгі5
СепеОріїтіге!?, і перераховано в таблиці 5. Інформація зі специфічності, походження послідовностей з моноклональних антитіл (МАВ), використанню кодону, додатковим відмітним ознакам послідовностей і посиланням на всі, що застосовуються домени коротко описано в таблиці 5. Походження послідовностей варіабельного домена відповідних антитіл СОЗ перераховано в таблиці 5. Завдяки високій гомології людських і мишачих ТАА, можуть бути використані послідовності МН і МІ. того самого анти-ТАА для генерації конструкцій рі-з-сЕм для мишачих аналізів, але в комбінації з МН, МІ. послідовностями мишачого специфічного клону 145- 2С11 анти-СОЗ антитіла.
Клонування ДНК і конструювання експресійних векторів проводили у відповідності зі стандартними процедурами (ЗатбгоокК, 1989), добре відомими фахівцеві в даній області.
Коротко, Послідовність "-послідовності-днк-послідовності Бі-5сЕм містили рестрикцію 5' Ніпан ії
З Ватні для клонування в експресійні плазміди. Послідовність сигналу секреції вводили на 5' кінці (вище) послідовності рі-5-сЕм для секреції білка із клітинної цитоплазми в культуральне середовище. Послідовність, що кодує гнучкий гліцин-сериновий пептидний лінкер, що складається з 15-18 амінокислот, вставляли для з'єднання доменів МН і Мі для композиції одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіла (5сЕм), з яких один зв'язується з СОЗ і інший з ТАА. Для формування біспецифічного одноланцюгового антитіла послідовності двох доменів 5сЕм з'єднували послідовністю, що кодує короткий пептидний лінкер (5050055). Разом із цією послідовністю лінкера сайт рестрикції Ватні уводили для обмінів доменів 5сЕм для клонування наступних конструкцій Бі-5сЕм. Зокрема, 5 зсЕм-домени можуть бути замінені на сайти рестрикції
Ніпан ї Ватні і 3 всЕм-домени на рестрикцію Ватні і ХпоїЇ. Схему конструкції дивися також на фігурі 1.
Усі використовувані конструкції антитіла рі--сСЕм клонували в стандартний експресійний вектор ссавця рсоМА 7м3.1/тус-Нів (-) (пийгодеп/І їїе Тесппоіодіеє Сітрй, Оаптвіайії, Сегптапу).
С-кінцеву бхНіз-мітку використовували для метал-афінного очищення білка й аналізів на
Зо виявлення. Усі конструкції підтверджували шляхом секвенування через сервіс по секвенуванню одиночних прочитань (МУ 5іпдіє геай зедиепсе 5егмісе) (Еишгоїйп5 МУ Орегоп, Ебегерегод,
Сетптапу).
Таблиця 4
Короткий опис конструкцій біспецифічного одноланцюгового антитіла, специфічного до ТАА і
СсоЗ найменування кодонів
Н5, Ното-зарієп5; ММ, Ми5 тив5син5; ТАА, пухлиноасоційований антиген.
Таблиця 5
Коротка інформація з конструкції Бі-ссЕм
СОЗ з'єднувальний ТАА з'єднувальний фрагмент фрагмент
Вн Походж. | Реактивн Походж Реак- Короткий утр. дж 7 | ТАА АЖ тивн. Б-МН-МІ | 3-мн-мі. | ТОБ найм. |тар різновид. тар : лінкер різновид тТАбб СІ ОоМм18.2 топів дар) подина, тесідп18.2ар| ТАбб савасо бРНИ5 | ТАбб СІОМб | тсідпбар тсідпбар |Т86б6 засоа5 бРНОЗ | ТАбб людина |СІОМЄ тсідпбар людина, | тав тсідпбар | БНОССОИО бРМИ5 | 145-2С011 миша -|СІОМе тсідпбар людина, | поіпвав 145-20411 | БООсСОС С бРМИЗ | 145-211 СІОМб | тсідпбар 145-2011 | тсідпбар | БРВчСОО5
Продовження Таблиця 5 - Викор. найм лінкер В таб посилання
Ї апгамессніа 5
ІВітар (с0008)з |/Б95005950 Мом/есІРІМАТАТОУН|НВ | Зспеідеодег, Єшг
Іттипо! 1987
Ї апгамессніа 5 6РНОБ | (соссв)з | МЕ(Я95005)90 | МОМ ЗСІРІМАТАТОУНВ|НО | Зспеідеодег, ит /
Іттипо! 1987 ук(во5о Ї апгамессніа 5 бРНОЗ (аспаав)з МОМУ/ЗСІ РІ МАТАТОа МН | Н5 ЗсПеідеоддег, Єшг У сврасмо
Іттипо! 1987 мЕ(аавасав)рас Ї ео єї аї., Ргос Маї! б6РМИО5 | (24ХСа СО) з МОМ/ЗСІ РІ МАТАТаУНЬ дсас сі, 1987 мумк(аава Ї ео вї аї., Ргос Маї! бРМИОЗ се»ссМУ (аспаав)з ММЗаИгГгоОЇ МЕЕМІ ті Каює дсаєс 5сі, 1987
Н5, Ното-зарієпо; МАВ, моноклональне антитіло; ММ, Ми5 тивзсци5; ТАА, пухлиноасоційований антиген. р. Генерація стабільних клітинних ліній- продуцентів
Для генерації стабільних клонів клітин-продуцентів СІ ОМ б-специфічних білків брі-5сЕм використовували клітинну лінію ембріональних нирок людини НЕК293 (АТС СКІ -1573). 1 х 107 клітин НЕК293 засівали за два дні до трансфекції на чашки Петрі 14,5 см в 20 мл повного середовища ОМЕМ (ОМЕМ/Е-12 СІшатах, доповненого 1095 термоінактивованої ЕВ:5 і 0,595 пеніциліну-стрептоміцину; усі реагенти від фірми сірсо/і Пе ТесппоЇодіех Стр, ЮОаптеїавдії,
Септапу). Перед трансфекцією клітини промивали ЮОРВ5, доповненим 2 мМ ЕОТА, потім додавали 20 мл звичайного середовища ОМЕМ без додавання ЕВ5 або антибіотиків. 20 мкг лінеаризованої ДНК конструкцій рРсОМАЗ.1/6РНИи5 ії рсроМАЗ.1/6РНИЗ (описаних у прикладі 9.а), розбавляли в 0,5 мл звичайного середовища ОМЕМ/Е-12. 75 мкл розчину лінійного РЕЇ при концентрації 1 мг/мл (поліетиленімін; Роїухзсіепсе5 Еигоре стр, Ерреїпеїт, Сеппапу) додавали в розведену ДНК і енергійно перемішували на вортексі. Через 15 хв. інкубації за кімнатної температури (КТ) у клітини краплями додавали комплекси ДНК/РЕЇ, чашки для клітинних культур обережно перемішували обертовим рухом і потім інкубували при 37 "С, 5 95 СО». Через 24 год після трансфекції середовище міняли. Селекцію трансфікованих клітин починали через 48 год після трансфекції за допомогою сульфату 0418 (Сірсо/ Пе Тесппоіодіе5 (зт,
Багтеїайді, «Сзегтапу) у кінцевій концентрації 0,8 мг/мл. (5418 безупинно додавали в культуральне середовище для вирощування клітин.
с. Одержання в малому масштабі білків бРНО5 і б6РНИЗ рі-з-сбм за допомогою поліклональних клітин НЕК29З3
Білки 6РНИ5 ї б6РНИЗ рі-зсЕм одержували в малому масштабі й очищали із супернатантів поліклональних клітин НЕК293 для порівняння іп міїго.
Коротко, у конфлюентномуУ стані супернатант без ЕВ5 збирали з поліклональних клітинних ліній, описаних у прикладі 9.Б, і фільтрували через фільтруючу насадку з діаметром пор 0,2 мкм
Міпізай (Зідта-АїІдгісп, Сегтапу), використовуючи шприц. Потім білки рі--сЕм очищали в малому масштабі із супернатантів клітинних культур на спин-колонках Мі-МТА відповідно до протоколу виробника (Оіадеп, Ніїдеп, Сегт5хпу). Концентрації білків Бі-5:СЕмМ визначали шляхом вимірювання поглинання при 280 нм за допомогою Маподгор 2000с, враховуючи коефіцієнт екстинкції й молекулярну масу - визначені за допомогою інструмента Ргоїрагат (оо (ппр//меб. ехразу. ого/ргоїрагат/)- білків ЄРНО5 і 6РНОИЗ рі-5сЕм. Очищені білки зберігали при 4 "С для негайного використання.
Білки рі-з:сЕм тестували шляхом піддавання електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступним фарбуванням кумаси й вестерн-блот-аналізом, виконаним з використанням стандартних процедур (Сиггепі Ргоїосої5 іп Ргоївїп 5сіепсе, 2012). Очищені в малому масштабі білки розділяли на Мираде Момех 4-12 95 Вів-Ттів (ев (Іпмйгодеп//їе ТесппоЇодіеєє Стрий,
Багтеїайі, «Сзептапу). Потім гелі фарбували розчином кумаси брильянтовим синім у відповідності зі стандартними процедурами (Сиггепі РгоїосоЇ5 іп Ргоївіп Зсіепсе, 2012) для детекції білків ЄРНИ5 і 6РНИОИЗ бБі-5сЕм, і інших білків, що містяться в супернатанті клітинної культури.Вестерн-блот аналіз виконували для специфічної детекції білків ЄРНИ5 ії 6ЄРНОЗ бі- см за допомогою їх бхНіб-мітки. Коротко, після блотинга білків на РМОЕЄ мембрані й блокування РВ5Т/395 сухим молоком мембрани інкубували протягом 1 год при 4 "С з первинним антитілом Апіі-Ніє Ерпйоре-Тад (Оіапома Стріп, Натбригд, Септапу), розведеним у співвідношенні 1:500 у блокувальному буфері. Після промивання блокувальним буфером мембрани інкубували з Ес-специфічним вторинним козячим-анти-мишачим Ідс антитілом, кон'югованим з пероксидазою, (5ідта Аїагісп, Сегтапу) у розведенні 1:10000 у блокувальному буфері протягом 1 год при 4 "С. Після повторного промивання блокувальним буфером сигнали визуалізували за допомогою Зирегзідпа! М/ез5і Гетіо Спетійшитіпезсепі ЗибБзігаге (РіегсеЛ'пегто
Зо Еізпег Зсіепійс, Косктога, ІС, ОА) і записували на Ітадеднапі ГАБ5 4000 Ітадег (СЕ Неаййсаге
ІїТе зсіепсе5, Мипісп, Сегтапу). Сигнали білків Бі-5сСЕм детектували в діапазоні від 50 їі 60 Ка, отримані при порівнянні із внутрішнім стандартом молекулярної маси. а. Одержання у великому масштабі білків ЄРНОЗ Бі-з-сЕм за допомогою поліклональних клітин НЕК29З3
Поліклональну клітинну лінію-продуцент вирощували в 10-шаровій клітинній фабриці (Мипс,
КозкКіде, Юепітагк) в ОМЕМ/Е-12 СІшатах, доповненого 10 95 ЕВ5 їі 0,5 95 пеніциліну- стрептоміцину й 0,8 мг/мл (35418 (усі реагенти від фірми сСірсо//йе Тесппоіодіе5 три,
Багтеїайі, Септапу) відповідно до інструкцій виробника. На конфлюентній стадії клітини промивали ЮРВ5 і середовище заміняли на ЮМЕМ/Е-12 з антибіотиками, але без ЕВ5.
Клітинний супернатант, що містить білок ЄРНОИЗ брі-5сЕм, збирали кожні 3-5 днів аж до З тижнів.
Супернатант фільтрували за допомогою 500 мл 5(егпйор ЕШег Опії5 (Мегок МіШіроге, ВіпПегіса, МА,
О5А) і зберігали при 4 "С до Еріс-фФільтрації.
Перед ЕРІ С-фільтрацією присутність рі-5сЕм у супернатанті клітинних культур тестували за допомогою електрофореза в поліакриламідному гелі з наступним фарбуванням кумаси й вестерн- блот аналізом, виконуваним за допомогою стандартних процедур, як коротко описано в прикладі 9.с. е. Очищення й кількісне визначення білка ЄРНОЗ Бі-зсЕм
Клітинний культуральний супернатант поліклональних клітин НЕК293, що містить білка бРНИОИЗ бБі-5сЕм (описано в прикладі 9.5), піддавали афінній хроматографії з іммобілізованим металом (ІМАС) з використанням стандартної процедури (Сигепі Ргоїосої іп Ргоївіп Зсієпсе, 2012). Коротко, супернатант клітинної культури наносили на стовпчик Ніх5 Тгар ЕЕ 5 мл, з'єднаний із системою АКТА Ригійег 10 ГРІ С (обидва від фірми СЕ Неакнрсаге І їе Зсіепсе,
Мипісн, Сегптапу). Промивний буфер РВ5 містив 10 мМ імідазола, РВ5-буфер для елюювання містив 500 мМ Масі, 50 мМ МанНегРоОх і 250 мМ імідазола, рН обох буферів доводили до 7,4.
Елюювання проводили з використанням східчастого градієнта. Елюйований білок ЄРНОЗ Бі-5сЕм негайно диалізували проти їх РВ5 з використанням б5іїде-А-ІЇулег 2 Оіаузіз Саззеце 10К
МУУСО (Ріегсе/Ппепто РізПпег зсіепійіс, Коскіога, ІС, ОА). Після РВ5 діалізу рі-50Ем диалізували проти 200 мМ аргинінового буфера (І-аргінін-моногідрохлорид; Коїй, Кагіхгипйе, Септапу) на основі НгО. бо Концентрацію рі-5сЕм визначали шляхом вимірювання поглинання при 280 нм за допомогою
Маподгор 2000с с обліком коефіцієнта екстинкції й молекулярної маси білка 6РНОИЗБІ-5сЕм.
Очищений білок розділяли на аліквоти і зберігали при -80 "С для тривалого зберігання або при 4 "С для негайного використання.
Якість і чистоту білка БРНОЗ рі-з:сЕм тестували шляхом фарбування кумаси й вестерн-блот- аналізу, як описано в прикладі 9.сє. ВБА у стандартному розведенні включали в процедуру фарбування кумаси для приблизного підтвердження концентрації, обмірюваної за допомогою
Мапо Огор (дані не показані).
Приклад 10: Ефективність кандидатів ЄРНО5 і бРНОИЗ рі-5сЕм, що направлено впливають на
СІ Мб а. Мікроскопічний аналіз Т-клітин, переспрямованих на клітини-мішені за допомогою білків бРНИЗ5 і бРНОЗ рі-бсЕм
Для візуалізації перенаправлення ефекторних клітин на СІ ОМ б6-які експресують клітини- мішені за допомогою білків ЄРНО5 і б6РНИЗ Брі-5сбм за допомогою мікроскопічного аналізу, виконували аналіз на цитотоксичність іп міго. Очищені на колонці Міпіа білки ЄРНОЗ і 6РНИОЗ5 рі- 50Ем (дивися приклад 9.с) використовували для порівняння цих двох варіантів відповідно до їхньої ефективності. Використовували лінію клітин-мішеней, клітинну лінію тератокарциноми яєчників РА-1, яка ендогенно експресує високі рівні людського СІ ЮМб.
Людські ефекторні клітини виділяли зі свіжовідібраної людської крові здорових донорів згідно зі стандартними процедурами (Сшигтепі Ргоїосої5 іп Ргоївіп Зсіепсе, 2012): коротко, кров розводили ОРВ5, пошарово наносили на РісоїІ-Радне Ріиз5 (СЕ Неайнсаге І Ме бсієпсе5, Мипісн,
Сепгтапу) і центрифугували. Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) збирали з інтерфази, промивали холодним ОРВ5, доповненим 2 мм ЕОТА, їі підраховували. Людські Т- клітини потім відокремлювали від РВМС шляхом магнітно-активованого поділу клітин (МАС5) за допомогою набору Рап Т СеїЇ ІзоЇайоп Кії Ії (Мінепуї Віоїес, Тегегом/у, сепгтапу) згідно інструкцій виробника. 1 х 105 клітин РА-1 на лунку засівали в тканинні культуральні б-лункові планшети. Людські клітини готовили, як описано вище, і додавали в співвідношенні ефектора до мішені (Е:Т) 5:1.
Середовище МЕМ, доповнене 1095 термоінактивованої ЕВ5, 595 пеніциліну-стрептоміцину, їх
МЕАА, 1 мМ бікарбонату натрію й 1 мМ пірувата натрію (Спібсо//їє ТесНипоіодіез Стрий,
Зо Баптвіайді, Септапу), використовували для всіх клітин і кінцевий обсяг кожної лунки доводили до 2 мл. Використовувана в даному аналізі концентрація білка Бі-5сЕм склала 50 нг/мл.
Контрольні зразки містили клітини-мішені або тільки Т-клітини без білка рі-5-сЕм. Тканинні культуральні планшети потім інкубували при 37 "С, 5 95 СО». У ході аналізу проводили безперервне спостереження на інвертаційному мікроскопі Уміомегі 5 (Нипа, Умеїлаг, Сегтапу) в інтервалі від 6 год до 24 год спільної інкубації. Значні ефекти відносно утворення кластерів Т- клітин на клітинах-мішенях, формування імунологічного синапса й загибель клітин-мішеней у присутності білків ЄРНО5 і ЄРНОИЗ брі-5сЕм спостерігали через 24 год і робили знімки за допомогою інвертаційного мікроскопа Мікоп Есіїірхсе 5100 (Мікоп, Чарап). Обидва білка Бі-сЕм показали сильну агрегацію Т-клітин і загибель клітин-мішеней, як показано на фігурі 12.
А. Активація Т-клітин, опосередкована білками бРНИи5 і ЄРНОЗ Бі-5сЕм
Для детекції активації Т-клітин і визначення відмінностей в ефективності двох варіантів бі- 5СЕм, специфічних відносно СІ ОМб, використовували аналіз активації Т-клітин на основі ЕАС5.
Маркер ранньої активації СОб69 і маркер пізньої активації СО25 було вибрано для фарбування антитіл, кон'югованих із флуоресцентними мітками. Для детекції людських Т-клітин у суміші клітин-мішеней і Т-клітин, проводили фарбування СОЗ на Т-клітинах.
У цілому, були вибрані умови аналізу, зазначені вище (Приклад 10.а). Коротко, клітини- мішені РА-1, які ендогенно експресують СіОМб, засівали людськими Т-клітинами в співвідношенні Е:Т, рівному 5:1, в 2 мл повного середовища, і біли ЄРНИ5 ії б6РНИЗ рі-бсЕм додавали при концентрації в діапазоні 5-200 нг/мл. Контрольні зразки містили тільки клітини-
БО мішені або Т-клітини разом з білками рі-5сЕм або без них. Через 24 год і 48 год Т-клітини збирали шляхом споліскування й переносили в круглодонні пробірки обсягом 5 мл (ВО Раїсоп,
НеїдеІрегуо, Сегтапу). Клітини центрифугували й промивали ОРВ5. Для фарбування клітин використовували мишачі антилюдські СОЗ-РІТС, мишачі антилюдські СО6УО-АРС і мишачі антилюдські СО25-РЕ антитіла (усі антитіла фірми ВО Віозсіепсе5, НеїдеїЇрегуд, Сегтапу).
Клітинний осад ресуспендували в 50 мкл РЕАС5-Буфера (ОРВ5, доповнений 595 ЕВ5) антитіла, що містить, флуоресцентними із флуоресцентними мітками, і 2 мкл 7-ААО (ВО Віовзсієепсев,
НеїдеІрегуо, Сегтапу). Після інкубації протягом 20 хв. при 4 "С у умовах темряви зразки промивали 4 мл ОРВ5, і клітинний осад ресуспендували в 200 мкл РАС5З-буфера. Зразки зберігали на льоді й в умовах темряви протягом вимірювання за допомогою проточного бо цитометра ЕРасзсапіо ІП (обоє від фірми ВО Віозсіепсе5, НеїдеІрегд, Септапу). Результати аналізу оцінювали за допомогою програмного забезпечення Ріоуло (Тгее 5іаг, Зап Сагіо5, СА,
ИБА).
Обидва варіанта СОЇ М б-специфічних Бі-5:сЕм привели до ефективної активації Т-клітин аж до 60 95. Варіант ЄРНОЗ (рБі--сЕм СОЗ х СІОМб) був більш сильним у діапазоні низьких концентрацій 5-10 нг/мл (дивися також фігуру 13), і був, отже, вибраний для подальших досліджень.
Приклад 11: З'єднувальна здатність ЄРНИЗБІ-5сЕмМ
Аналіз зв'язування ЕАС5
Для оцінки з'єднувальної здатності фрагментів білка б6РНИЗ бБі-5сЕм, що направлено впливають на СІ ОМб і СОЗ, використовували аналіз методом проточної цитометрії. Клітини РА- 11 ОМ-90, які ендогенно експресують СІ Мб, використовували для вивчення сайту анти-СІ ЮОМб, і людські Т-клітини використовували для вивчення сайту анти-СО3. СІ ОМ б-негативні клітини
Мидса4 використовували як контрольні клітини.
Для вивчення з'єднувальної здатності анти-СІ ОМб, СІ ОМ 6б-позитивні клітини (РА-1, ОМ-90) і
СІ ОМ б-негативні клітини (Ми9С4) трипсинізували, промивали повним середовищем і потім
ОРВЗ. Усі промивні стадії виконували шляхом центрифугування при 1200 об/хв. протягом 6 хв. при 4 "С. 1 х 105 клітин переносили в круглодонні пробірки обсягом 5 мл і інкубували з 0,01-10 мкг/мл ЕРІ С-очищеного білка ЄРНОЗ або контрольного білка 1ВіМАВ Бі-5сЕм в ГАС5З-буфері протягом 30 хв. при 4 "С. Клітини промивали 2 мл ЕАС5-буфера й потім інкубували з 3,3 мкг/мл моноклонального антитіла Апіі-Ні5 Ерпоре-Тад (Оіапома Стр, Натбриго, Сегтапу) протягом 30 хв. при 4 "С. Після промивання 2 мл ЕБАС5-буфера клітинний осад інкубували з АРС- кон'югованим козячим-анти-мишачим вторинним антитілом (даскзоп Іттипогезеагсп Еигоре,
ЗМиПОЇК, ЕпдіІапа) у розведенні 1:200 в ЕАС5-Буфері протягом 20 хв. при 4"С у умовах темряви.
Клітини промивали двічі 2 мл ЕАС5-буфера й на закінчення ресуспендували в 150 мкл РАС5- буфера, доповненого 1 мкг/мл РІ (Зідта Аїдгісй, сегтапу) для контрастного фарбування загиблих клітин. Негативні контрольні зразки включали тільки вторинне козяче-анти-мишаче
АРС антитіло. Як позитивний контроль 10 мкг/мл моноклонального СІ ОМ б-специфічного антитіла тс! ОМар фарбували вторинним козячим-анти-людським АРС антитілом (ЧасКвбоп
Іптптипогезеагс!п Еигоре, ЗиМОїК, Епдіапа) і підходящим контрольним вторинним антитілом.
Зо Зразки вимірювали за допомогою проточного цитометра Расзсаїйриг (ВО Віозсієпсев,
НеїдеІрегуд, Сепгтапу) і аналізували за допомогою програмного забезпечення Біом/о боптмаге (Ттее 51аг, Зап Сагіо5, СА, ОСОБА). Інтенсивність сигналу 10 мкг/мл б6РНИЗ була в 4-9 раз нижче, чим позитивного контролю тс ОМбаб (дивися фігуру 15А). Неспецифічне зв'язування ЄРНИЗ з
СІ ОМ б-негативною клітинною лінією МидС4 не було детектоване (Фіг. 153).
Для вивчення з'єднувальної здатності анти-СОЗ плеча білка ЄРНОЗ рі-5сЕм використовували людські Т-клітини. 5 х 105 Т-клітин переносили в 5 мл пробірки із круглим дном і інкубували з
ЕРІ СО-очищеним білком 6РНОИЗ при концентрації в діапазоні 100 нг/мл - 10 мкг/мл в ЕАС5- буфері протягом 30 хв. при 4 "С. Наступна процедура фарбування була такою ж, як описано вище. Контрольні зразки включали тільки вторинне козяче-анти-мишаче АРС антитіло й моноклональне антитіло Апіі-Ніх Ерйоре-Тад плюс вторинне козяче-антимишаче РЕ антитіло.
Вимірювання і аналіз виконували, як описано вище. Значний сигнал був отриманий при 100 нг/мл 6РНИЗ (дивися також фігуру 158).
Приклад 12: Дослідження залежної від мішені активації Т-клітин за допомогою бі-всЕм бРНОЗ
Аналіз на цитотоксичність виконували, як описано в прикладі 10.а й Б. Коротко, клітини- мішені РА-1, які ендогенно експресують СіОМб, засівали з людськими Т-клітинами в співвідношенні Е:Т, рівному 5:1, в 2 мл повного середовища, і білок БРНИиЗ Брі-5СЕм додавали в концентрації в діапазоні 0,001-1000 нг/мл. Для аналізу залежності від мішені активації Т-клітин, опосередкованої Бі-5сЕм, Т-клітини засівали без клітин-мішеней, але інкубували з такими ж концентраціями рі-5сЕм 6РНИІИЗ, що й зразки клітин-мішеней з Т-клітинами. Через 24 год і 48 год
Т-клітини збирали й переносили в 5 мл пробірки із круглим дном (ВО Раїсоп, Неїаеїбего,
Сегтапу). Фарбування клітин і аналіз виконували, як описано в прикладі 10.60.
Як показано на фігурах 16А і В, активації Т-клітин, опосередкованої бРНИОЗ, не було детектовано під час відсутності клітин-мішеней, що вказує на пряму строгу залежність функціональності рі-5:сЕм від мішені. Значна активація Т-клітин виникала тільки з 0,1 нг/мл б6РНИЗ через 48 год.
Приклад 13: Визначення ЄС50 6РНИЗ Бі-5сЕм в аналізі на цитотоксичність іп міго
Аналіз на цитотоксичність із використанням люциферази
Для визначення половини максимальної ефективної дози білка Є6РНОЗ брі-5сЕм ряд бо титрувань 6РНІИЗ тестували в аналізі на цитотоксичність із використанням люциферази іп міїго.
Стабільно експресуючі люциферазу клітини РА-1 і людські Т-клітини в співвідношенні Е:Т, рівному 5:1, інкубували з концентраціями білка ЄРНОЗ брі-5сЕм у діапазоні від 1 пг/мл до 1 мкг/мл (10 кроків) або без 6РНІИЗ для визначення величин І піп.
Клітинні культуральні мікропланшети інкубували протягом 24 год і 48 год при 37"С, 595 СО».
Для аналізу 50 мкл водяного розчину, що містить 1 мг/мл люциферина (ВО Мопоїїдні ВО
Віозсіепсе5, НеїдеІрего, Септапу) і 50 мМ НЕРЕ5 додавали в кожну лунку й планшети потім інкубували протягом 30 хв. в умовах темряви при 37"С. Люмінесценцію, що виникає в результаті окиснення люциферина люциферазой, яка еспресує життєздатні клітини, вимірювали за допомогою мікропланшетного рідера Іпійпйе М200 Тесап (Тесап, Маппедогї, Зу/й7епапа).
Відсоток специфічного лізису клітин-мішеней розраховували за наступною формулою: 90 специфічного лізису - | 1-(люминесценціягестований зразок - І тах) / (І тіп - І тах)) Х 100, де «І» означає лізис. І піп належить до мінімального лізису під час відсутності Бі-5сЕм, і Ї лах до максимального лізису (рівному величині спонтанної люмінесценції) під час відсутності Бі-5сЕм, досягнутому шляхом додавання Топ Х-100 (у кінцевій концентрації 2 965).
Максимальний лізис був досягнутий через 48 год за допомогою 1-10 нг/мл Є6РНИІИЗ, певна величина ЄС50 через 48 год склала приблизно 10 пг/мл (дивися також фігуру 17). Результат цього аналізу в значній мірі залежить від сили людських Т-клітин, яка різниться відповідно до імунного статусу донора, що також було описано в інших роботах (дивися, наприклад,
І шШетриезе, ЕВ еї аї., 2010, Ргос. Маї!. Асад. 5сі ОБА, 2010 ди! 13;107(28):12605-10). Таким чином, відхилення величини ЄС50 білка ЄРНОИЗ Бі-5сЕм на фактор З спостерігалося в ході винаходу.
Приклад 14: Ефективність у мишачій моделі ксенотрансплантата
Для дослідження терапевтичного потенціалу білела бРНИЗ брі-5сЕм іп мімо був вибраний мишачий штам МОО.Са-Ріказсіа ІП 2гоїптім/57| або короткий МБО (даскКбзоп Іабогафогу, Ваг
Нагбоиг, МЕ, ОБА). Для описаного дослідження щеплення людських ефекторних клітин і людських Т-лімфоцитів у мишей необхідно для дослідження ефектів Т-клітинного захоплення бі- 5СЕм /п міо. Через повну відсутність В-, Т- ії МК-клітин мишачий штам М5О є підходящим для цього виду досліджень ксенотрансплантата. Мишача модель із привитими, головним чином, людськими Т-клітинами після ін'єкції РВМС становить частину винаходу. а. Лікування з відстроченим початком пухлин на пізній стадії, високоекспресуючих СІ ОМб, у
Зо мишей за допомогою білка БРНИЗБІі-5сЕм
В описаному дослідженні 25 мишачих самок і 25 мишачих самців лінії МО у віці 8-11 підшкірно інокулювали 1 х 107 клітин РА-1, ендогенно експресуючих високі рівні людського
СІ ОМб6. Через 5 днів після інокуляції пухлинних клітин мишей розподіляли відповідно до обсягу їх пухлин на лікувальні групи, при цьому миші, у яких ріст пухлини був відсутній, були виключені.
У той же день мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяли з людської крові здорових донорів методом центрифугування в градієнті щільності фікола й використовували як ефекторні клітини іп мімо. 2 х 107 РВМС, розведені в 200 мкл ОРВ5, ін'єктували інтраперитонеально в день виділення експериментальним лікувальним групам, позначеним «РВМС». Лікувальні групи, позначені «РВ5», одержували 200 мкл звичайного ОРВ5 інтраперитонеально й служили як контроль без людських ефекторних клітин. За допомогою контрольних груп «РВ5» можна досліджувати потенційний ефект на ріст пухлини самого бБРОНЗ або будь-які потенційні побічні ефекти, які викликано 6РОНЗ або носієм, але не людськими ефекторними клітинами, проти мишачої тканини(тобто реакція трансплантат проти хазяїна, викликана людськими ефекторними клітинами, проти мишачої тканини). Група «РВе/носій» включала 8 мишей (п-8), «РВБ/ЄРОНЗ» 8 мишей (п-8), «РВМС/носій» 7 мишей (п-7), «РВМС/6РИНЗ» 7 мишей (п-7) і «РВМС/1ВіМАВ» 8 мишей (п-8). Терапію починали через 7 днів після застосування ОРВЗ або РВМС: групи «РВЗ/6РНИЗ», «РВМС/6РНИЗ» і «РВМС/ЛВІМАВ» одержували інтраперитонеально 5 мкг очищеного білка ЄРНОЗ Брі-5сЕм або 1ВіІМАВ, розведеного в 200 мкл ОРВ5 она тварина. Групи «РВЗ/носій» і «РВМС/носій» одержували інтраперитонеально 200 мкл буферного носія (200 мМ (І -аргініну моногідрохлориду, розчиненого в НгО, стерильно фільтрованого), розведеного в ОРВ5. Лікувальні групи коротко описано в таблиці 3. Терапію проводили на щоденній основі протягом 26 днів. Двічі в тиждень вимірювали розмір пухлин за допомогою цифрового каліброваного каліпера, і обсяг пухлин розраховували за формулою мм3 - довжина х ширина х (ширина/2). На фігурах 184А і В показане інгібування росту пухлини у всіх мишей групи «РВМС/ЄРНИОЗ» за допомогою антитіла в присутності людських ефекторних клітин. Мишей забивали шляхом зсуву шийних хребців, коли обсяг пухлини досягав 1500 мм3, або у випадку серйозних клінічних проявів (у деяких мишей спостерігалися симптоми реакції трансплантат проти хазяїна).
Таблиця 6
Лікувальні групи с рі-зсЕм миша ві111Г1181111111-111111- ба Ї77117171717811111717171111111-111111 111 б6РНОЗ 0/7 5 63 77777777 17171717 1РВМСОГГ////// Її 7777-1111 65 77777 77171718 7711 1РВМСО | 43вітавїд | -:ББ5 р. Визначення впливу терапії на масу тіла
Масу тіла кожної миші вимірювали два рази в тиждень за допомогою лабораторних ваг.
Жодна з мишей до будь-якої групи не показала втрату маси протягом лікування (дані не показані). с. Консервація тканини й виділення спленоцитів
Після забиття мишей пухлини видаляли, і тканину відразу ж фіксували в 10 мл 4 95 Коїі-
Нівіоїїх (Сагі Ко, Кап5гийе, Септапу) для імуногістохімічного аналізу. Крім того, селезінки видаляли для детекції приживлення людських клітин за допомогою проточної цитометрії.
Виділення спленоцитів виконували відразу ж після видалення селезінок, продавлюючи їх через клітинний фільтр із розміром гнізд 70 мкм, поміщений у реакційну пробірку обсягом 50 мл зі стерильним поршнем 3-5 мл шприца, і повторного промивання клітинного фільтра теплим
ОРВ5. Виділені спленоцити центрифугували, ОРВ5 декантували й осад спленоцитів ресуспендували в 1 мл термоінактивованої фетальної бичачої сироватки, доповненої 10 95 10 95
РМ5О. Зразки негайно заморожували при -80 "С і зберігали до одержання зразків спленоцитів від усіх мишей. а. Аналіз приживлення людських Т-лімфоцитів у мишачих селезінках
Спленоцити від усіх мишей збирали й заморожували, як описано в Прикладі 14.с. Повну колекцію зразків спленоцитів відтавали одночасно, усі клітини промивали двічі теплим ОРВУХ, і 1 х 106 спленоцитів на зразок інкубували з антитілами, кон'югованими із флуоресцентними мітками, протягом 20 хв. при 4 "С в умовах темряви для детекції приживлення людських клітин шляхом фарбування анти-СО45 і процентного вмісту людських клітин шляхом фарбування анти-СОЗ, анти-СО4 і анти-СО8. Аналіз методом проточної цитометрії проводили на проточному цитометрі Расзсаїїриг (ВО Віозсіепсе5, НеїідеІрегуд, сСептапу). Приживлення людських Т-клітин в обох групах «РВМС» може підтверджуватися високим процентним вмістом двічі СО45-СО 3- позитивних спленоцитів, як показано на фігурі 180. е. Імуногістохімія для визначення експресії клітин-мішеней і Т-клітинної інфільтрації
Пухлини фіксували після видалення з використанням 495 буферного розчину формальдегіду (Ноїі-Нівіоїїх, Сагі Коїй, Кагізгипе, Септпапу) протягом 48 год при 4"С. Фіксовані пухлини
Зо розділяли на дві частини й переносили в автоматизований вакуумний тканинний процесор
АБР2О0 для дегідрування (Іеїса Місгозузіет5 (зтри, УМеїлЛаг, Септапу) з наступним розміщенням у парафін (Рагаріазі, Сагі Коїй, Кагізгипе, Сегптапу) за допомогою парафінової диспенсерної станції МРБ/С (5ієє Меадіса! Зтри, Маїп7, Септапу). Для імуногістохімічних фарбувань зрізи товщиною 3 мкм фіксованих у формаліні й розміщених у парафін тканин одержували з використанням роторної мікротоми КМ2255 (І віса Місгозувзіет5 Стр, УмеїлІаг,
Сегптапу). Депарафінізацію й регідрування виконували в білінійному обладнанні для фарбування біаійптабе Мах (Тпегпто Ріспег Зсіепійіс, КосКтога, І, О5БА) з наступним відокремленням термоіндукованого епітопа в 10 мМ лимонному буфері, рН 6, з 0,05 95 Тмеєп 20 протягом 10 хв. при 120 "С. Активність ендогенних пероксидаз гасили шляхом занурення в 0,1 до розчин Нг2О2 в РВЗ протягом 15 хв. (Сагпі Коїй) з наступною інкубацією з 1095 козячою сироваткою в РВЗ (РАА Гарогайгіє5 стрп/ЗЕ Неаїсаге, Разспіпо, А!йвігіа) протягом 30 хв. для блокування неспецифічних сайтів зв'язування антитіла. ТАА клаудина 6 детектували шляхом інкубації з поліклональним первинним антитілом Апіі-Моизе Сіацаіп 6 (С) Рарьії (ІбІ-атетгіса,
Міппеароїї5, ММ, ОА) при 4 "С протягом ночі; Т-клітини детектували на послідовних зрізах з використанням поліклонального анти-СОЗ АВ (Арсат, Сатрьгідде, ОК) при 4 "С протягом ночі з наступною інкубацією з анти-кролячим вторинним антитілом, кон'югованим з полімером Вгідні
Мізвіоп НКР (Іттипоїодісє, Юиїмеп, МеїПпегіапа5). Реакції зв'язування візуалізували з використанням набору Месіог Момагеа Кії (месіог І абогайфогіе5 Ц., Регегрогоцді, ОК) відповідно до інструкцій виробника з наступним контрастним фарбуванням гематоксиліном (Сагі Коїй),
дегідруванням і розміщенням у середовище. Аналізи й реєстрацію виконували з використанням установки для візуалізації Ахіо Ітадег М2 або сканера Мігах 5саппег (обоє від фірми Сагі 7еїів55
Містозсору стр, Соеніпдеп, Септапу).
Як показано на фігурі 19, найвищу інфільтрацію Т-клітин детектували в пухлинах групи «РВМС/6РНОИЗ» шляхом СО-3 фарбування, особливо в граничних областях експресії СІ ЮОМб.
Картина гетерогенної експресії ТАА СІ ОМб у контрольних групах (фігури 19А, В, С і 0) змінювалася в більш компактні області експресії СІ ОМб у пухлинах групи «РВМС/ЄРНИЗ» у результаті терапії (Фіг. 1903.
Приклад 15: Створення й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМ18.2 і СОЗ а. Вихідні послідовності, дизайн конструкцій Бі-5сЕм і клонування матрицю вектора
Готовили конструкції біспецифічного тандемного одноланцюгового антитіла (рі-5сЕмМ), що містять з'єднувальні домени, специфічні відносно компонента СО З-епсилон людського Т- клітинного рецептора, і пухлиноасоційованих антигенів (ТАА). Відповідні варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) для кожної конструкції специфічним чином були розташовані в напрямку від 5'- до 3-кінця в наступному порядку: рот1-пАдКогак-Мнесіомівг у асіом182-У асо: У| асоз-Нів-г4АВЯДОТ В-А120 (1ВІМАВ, 18АНИ, по. 1-5) рот1-пАдЯКогак-Мносаз-У| осозлудасіом182-У| асіцомів2.Нів-2гАВЯОТВ-А120 (18АНИЗ, по. 6-10)
У таблиці 7 коротко описані всі конструкції Бі-5сЕм, специфічні відносно ТАА СІ ОМ18.2 і
РІАСТ, які були генеровані в рамках винаходу. Конструкції Бі-5сЕм генерували шляхом генного синтезу Сепеагп АС (Сепеаг// їе ТесппоЇодіез5 (трі, Кедепоригд, Септапу) з використанням послідовностей Мн і Мі відповідних антитіл. Оптимізації кодонів, такі як Ното 5аріеп5 (Н5) або
Ми тизсціи5 (ММ) або клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), були реалізовані за допомогою програмного забезпечення СепеАгі5 СепеОрійтіег?е), і перераховані в таблиці 7.
Інформація зі специфічності, походження послідовностей з моноклональних антитіл (МАВ), використанню кодону, додаткових відмітних ознак послідовностей і посиланням на всі, що застосовуються домени коротко описано в таблиці 8. Походження послідовностей варіабельного домена відповідних антитіл СОЗ перераховано в таблиці 8. Завдяки високій гомології людських і мишачих ТАА, можуть бути використані послідовності Мні Мі того самого анти-ТАА для генерації конструкцій Бі--СЕм для мишачих аналізів, але в комбінації з Мн, Мі послідовностями мишачого специфічного клону 145-2С11 анти-СОЗ антитіла.
Клонування ДНК і конструювання експресійних векторів проводили у відповідності зі стандартними процедурами (ЗатбгоокК, 1989), добре відомими фахівцеві в даній області.
Коротко, основні ДНК-послідовності Бі-5сЕм містили сайт рестрикції 5-В5тВі і 3-ХпоЇ для клонування в резтТ1-плазміди. Послідовність сигналу секреції вводили на 5' кінці (вище) послідовності рі-єсЕм для секреції білка. Послідовність, що кодує гнучкий гліцин-сериновий пептидний лінкер, що складається з 15-18 амінокислот, вставляли для з'єднання доменів Мн і
Мі для композиції одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіла (5СЕМ), з яких один зв'язується з СОЗ і інший з ТАА. Для формування біспецифічного одноланцюгового антитіла послідовності двох доменів 5сЕм з'єднували послідовністю, що кодує короткий пептидний лінкер (собОо5). Разом із цією послідовністю лінкера сайт рестрикції Ватні уводили для обмінів доменів 5сЕм для клонування наступних конструкцій Бі-5сЕм. Коротко, 5 зсЕм-домени заміняли на рестрикцію В5ІтВІ і Хпої і З5сЕм-домени на рестрикцію Ватні і Хпої.С-кінцеву 6 хНіб-мітку використовували для аналізів на виявлення трансльованого білка. Нетрансльовані області людського альфа-глобін 5' ії людського бета-глобін 3' послідовності Бі-єсЕм були присутні у векторі роТ1 (дивися більш докладно в М/О2007/036366А2: Умаддопег, 5. еї аї. (2003) Ехр. Віої.
Меа. (Маужоса) 228 (4), рр. 387-395).
Для одержання вектора реплікона 1ВІМАВ повну послідовність 1ВІМАВ, включаючи сигнал секреції й бхНіз-мітку, субклонували в напрямку від З від субгеномного промотору вектора реплікона вірусу лісу Семліки (р5ЕМ), люб'язно наданого К. І ипавзігот (І ипавзігот, К. еї аї. (2001) Нібіоспет. Сеї! Вісі. 115 (1), рр. 83-91; Енгепагирег, М.). єї а!. (1999) Ргос. Маї!. Асад. 5сі.
И.5.А. 96 (12), рр. 7041-7046).
Усі конструкції підтверджували шляхом секвенування через сервіс по секвенуванню одиночних прочитань (МУ 5іпдіє геай зедиепсе 5егмісе) (Еишгоїйп5 МУ Орегоп, Ебегерегод,
Септапу) і використовували конструкції тільки із правильною послідовністю й полі(А)-хвостом, що складаються із більш ніж 100 аденінів, для іп міго транскрипції РНК. бо Схеми конструкцій представлені також на фігурі 20А.
Таблиця 7
Короткий опис конструкцій мРНК-матриць біспецифічного одноланцюгового антитіла, специфічного відносно ТАА й СОЗ найменування кодонів
Ши дві не З вн тео 5сгМ рі-єсЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; СНО, клітини яєчника китайського хом'ячка; Н5, Ното-5аріеп5; НИ, гуманізоване; ММ, Ми5 ти5сиціи5; ТАА, пухлиноасоційований антиген; УН, варіабельний домен важкого ланцюга, Мі, варіабельний домен легкого ланцюга.
Таблиця 8
Коротка інформація з конструкції мРНК-матриці Бі-бсЕм
СоЗ з'єднувальний ТАА з'єднувальний фрагмент. фрагмент
Реак-
Внутр Походж тивн. ТАА Походж. Реактивн Б'-УН-МІ. з УнН-мМ. Короткий найм. таб. Різно- тар різновид лін вид.
Віта |тАвє люди сомів тоіаптв зав Людина, тесІдп18.2ар| ТА6б6 асиа5 по. 145 |миша /СІОМІ18.2 тсідп18.2ар | Людина, | пар 145-2с11 |8сОо0О5 2011 миша уснт. СІОМ18.2 | тсідп18.2ар тсідп18.2ав оСсНТтІ-ну | 8со6с5 ни на миша иОСНТтІ Сі ОоМ18.2 тоіаптв зав Людина, тесідп18.2ар| ОСНТІ зааас5
СІ в-ТЗ3 Сі ОоМ18.2 тоіаптв зав Людина, тесідп18.2абрі| СІ В-ТЗ зааас5 пов |тАбЄ пюди сомів тоіаптв ов | подина, тесІдп18.2ар| ТА6б6 зааас5 145- Люди-на,
Б миша сцжтво тостів Пюдинаї уд52с11 |тпсомесяь зосооо по.7 | СНІП Люди: || ОМу8,2 | тсідп18.2ар | ЛюдИ-На, | |оНті Ну | тсідпі8.2ар З0сСО5 ни на миша оснтя |Поди |огомтв2 тосптвааь| Пюдина; ГоонтІ ОО |(тодптв ав зосооо тов |сівлта |Поди |огомів2 тодптвовр Людина; свт |тсоптв а 30009 поло |тяє пюди сомів топів 2вь| подина, | тябє тесідп18.2аь 51:00:05 18вниБ ТАбб СІ ОМ18.2 | тсідп18.2ар тесІдп18.2ар| ТА6б6 зааас5 18вниЗІ ТАбб Сі ОоМ18.2 тоіаптв зав Людина, твеб тесідп18.2аь 51:00:05 145- Людина, 188МИи5 2с11 миша (СІОМІ82 тоіаптв зав Людина, тесідп18.2ар| 145-211 | ССС О5 145- Людина, 1848МИиЗ 2с11 миша (СІОМІ82 тоіаптв зар Людина, 145-2С11 | тсідп18.2аб, 5000205 гол |тне РАст тен вн тео 0 5ососе на миша
Продовження Таблиця 8 ; . Анти-СОЗ найм. лінкер кодонів посилання
Ї апгамессніа 5 1Вітаб| (4105) 3 уУк(вО56о5)» | МОМУЗСПІ РІ МАТАТО но ЗсПеідедаеєтг, Єшиг У Іттипої сао УНЗ 1987
МОМУ/ЗСПІ РІ МАТАТО Ї о ега!., Ргос Маї! Асай тої босове|осоя» ув сно вору (ССС): | (ССОС8)» МОМ ВСІ УАТАТО пагабру ві а!., У Ехр Мей
МОМУ/ЗСПІ РІ МАТАТО Веменпеєу вї а!., Єиг У поз (0обов8» |(о0оо5 тил 19! по.4 (СО0С5)з | (00005): МОаУуУ5СПІ РІ МАТАТО сно Мап Чіег еї аї., ІттипоЇоду
УНЗ 1989
Ї апгамессніа 5 по;5 (00005): (00005): МОМУЗСПРІМАТАТО СНО | спейдеддег, Єиг У Іттипої ун 1987
ММЗаИагоОЇ мМЕеЕМмІ ТІК Ї ео єї аї., Ргос Маї! Асай (сдасов)з | (400с105)з СІОС Зсі, 1987 (ССС): | (ССОС8)» МОМ ВСІ УАТАТО пагабру ві а!., У Ехр Мей
ММЗаИагоОЇ мМЕеЕМмІ ТІК Веметіеу єї аї., Єиг / (50005)з |(666О05)з вод Іттипої! 1981 по9 | (сО0С5)з | (00005): ММРасзІЕСАСИ Кам сно Мап Чіег еї аї., ІттипоЇоду
Ос 1989
Ї апгамессніа 5 поло |(с0с0с5): (со005) МЕМ/ЗУЛЕНИ ЗМТТ сно | Зспеідеддег, Єшг У Іттипої бУНе 1987
Ї апгамессніа 5 18вНО (сс) ук(ааза(св)» | МОМ/ЗСІІ РІ МАТАТОа не Зспеідеодег, Єшг у Іттипої сао УНЗ 1987
Ї апгамессніа 5 1в8вВнЦ У(аа5а МОМУ/ЗСПІ РІ МАТАТО ; 1АРМ меЕ(авоа(ав)» | МОМУЗСІПРІ МАТАТО Ї ео вї аї., Ргос Маї! Асай 1вАМи| У(аОаЗа ММБИГОЇМЕЕМІ ТІК Ї ео вї аї., Ргос Маї! Асай св» сомо 9905)з вс Зсі, 1987
Ї апгамессніа 5 по.25 |(00005)з (0С005)з МОМ РІМААА сно | Єспеідеддег, Єиг У Іттипої
ОБАОА 1987
СНО означає клітини яєчника китайського хом'ячка; Н5, Ното заріеп5; МАВ, моноклональне антитіло; ММ, Ми5 тиз5сцін5; ТАА, пухлиноасоційований антиген. 5 Б. Синтез ІМТ-РНК
Для створення анти-СІ ОМ18.2-специфічних ІМТ-матриць Бі-5сЕм, плазміди лінеаризували даунстрим полі(А)-хвоста з використанням ендонуклеази класу Іїз. Лінеаризовану матрицю ДНК очищали екстракцією сумішшю фенол/хлороформ і осаджували ацетатом натрію, як описано в літературних джерелах (НокКатр, 5. еї а/. (2006) Віоса 108 (13), рр. 4009-4017).
Лінеаризовані матриці ДНК піддавали іп мйго транскрипції з використанням наборів
Медазсгірі Киів (Атбріоп//їє ТесппоЇодіе5, ЮОагтеїаді, Сеппапу) відповідно до інструкцій виробника: матриці роТ1 транскрибували за допомогою набору Медавсгірі 17 Кії і матриці РЕМ за допомогою набору Медазсгірі 5Рб Кії. Для реакцій з кеп-аналогом концентрацію СТР зменшували до 1,5 мМ і 6 мМ АКСА, бета-5-АКНСА(Ю1) або в реакцію додавали бета-5-
АКСА(02), синтезований, як описано в літературі (КомаїзкКа, 9. еї аІ. (2008) КМА 14 (6), рр. 1119- 1181; Стидгієвп, Е. еї а. (2004) АМА 10 (9), рр. 1479-1487; Єеріп5кКі, у. еї а. (2001) ВМА 7 (10), рр.
1486-1495). Очищення ІМТ-МРНК виконували за допомогою набору Медасієаг Кії (Атбіоп/ іїте
Тесппоїодіе5, Юагтеїайді, Септапу) відповідно до інструкції. Концентрацію і якість ІМТ-РНК оцінювали за допомогою спектрофотометрії й аналізували на біоаналізаторі 2100 Віоапаїугег (Адііїепі Тесппоіодієз, Запіа Сіага, СА, ОА).
Приклад 16: Активація Т-клітин у відповідь на секрецію бБі-5сЕм клітинами-мішенями, трансфікованими різними СІ ОМ18.2-специфічними ІМТ-МРНК
Для дослідження функціональності ІМТ-мМРНК СІ ОМ18.2-специфічного Бі-5сЕм клітинну лінію карциноми шлунка Мидса4, яка ендогенно експресує порівняно високі рівні людського СІ ОМ18.2 (Запіп, ). еїаї. (2008) Сіїп. Сапсег Вев. 14 (23), рр. 7624-7634), використовували як клітинну лінію-мішень.
Клітини-Мішені МидсаА -- які тестували звичайним способом на експресію ТАА за допомогою
ЕАС5-аналізу перед кожним випробуванням - двічі промивали крижаним середовищем Х-мМімо (ГОМ2А, Вазеї, Зм/йлепапа) і ресуспендували до щільності 2 х 107 клітин/мл. 250 мкл клітинної суспензії переносили в попередньо охолоджені кювети 0,4 см бепе РиїЇзег/Місгориїзег 15 Сименез (Віо-Кадй, Огеівісп, Септапу) і додавали 20 мкг/мл ІМТ-МРНК. Використовували наступні
ІМТ-МРНК: 1ВІіМАВ, по. 2, по. 3, по. 4, по. 5, по. 7, по. 8, по. 9 Її по. 10. Для більш докладної інформації про варіанти Бі-5сЕм дивися таблиці 7 і 8. Після обережного перемішування клітини трансфікували за допомогою електропоратора ВТХ ЕСМ 830 (Нагмага Аррагайш», Ноїїсїоп, МА,
БА) з використанням наступних умов: 250 В, 2 імпульсу, тривалість імпульсу 12 мс, пауза між імпульсами 40 мс. Відразу ж після електропорації кювети поміщали на лід на короткий проміжок часу, і потім клітинні суспензії переносили в нагріте до кімнатної температури аналітичне середовище (середовище КРМІ 1640, доповнене 595 термоіїнактивованою людською сироваткою АВ, 0,595 пеніциліну-стрептоміцину, їх МЕАА їі 1 мМ пірувата натрію (сірсо/ те
Тесппоіодіеє трі, Рагтеїгаді, Септапу)) у пробірки обсягом 15 мл. Трансфіковані клітини- мішені підраховували і їх концентрацію доводили до 1 х 105 клітин на мл.
Людські ефекторні клітини виділяли зі щойновзятої крові здорових донорів-людей у відповідності зі стандартними процедурами (Сиггепі Ргоїосої5 іп ІттипоїЇоду, 2012): коротко, кров розводили ОРВ5, наносили на РісоїІ-Радие Ріиб5 (СЕ НеаїйНсаге І йе Зсієпсев5, Мипісий,
Сепгтапу) і центрифугували. Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) збирали з інтерфази, відмивали холодним ЮОРВ5, доповненим 2 мМ ЕОТА їі підраховували. Людські цитотоксичні Т-клітини виділяли шляхом магнітно-активованого клітинного сортування (МАС5) з
РВМС за допомогою набору СО8.- Т сеї ІзоЇайоп Кії, питап (Мікепуї Віоїес, Теїегом/, сегтапу) відповідно до інструкцій виробника. Відділені ефекторні клітини тестували звичайним способом на успішне виділення Т-клітин за допомогою РАСз5-аналізу (604, СО8 фарбування). Т-клітини доводили до 5 х 105 клітин на мл в аналітичному середовищі. 1 х 105 клітин-мішеней засівали на лунку б-лункового планшета й людські цитотоксичні Т- клітини додавали до співвідношення Е:Т, рівного 5:1. Кінцевий обсяг на лунку склав 2 мл.
Контрольні зразки, що містять ефекторні клітини й клітини-мішені, містили клітини-мішені, секретуючі по.25, СПСІ ОМ18.2а5 батьківського МАВ Ідс і білок 1ВІМАВ як позитивний контроль в кінцевій концентрації 5 нг/мл. Контролі включали тільки піддані електропорації клітини-мішені або тільки Т-клітини з білююм 1ВІМАВ і без нього. Через 48 год Т-клітини й клітини-мішені збирали, мітили й аналізували методом проточної цитометрії. Коротко, усі клітини збирали шляхом обережного зішкрябування за допомогою клітинного шкребка Сеї| 5сгарег5 (Загеїеді АС 85 Со, Миптогеспї, Септапу) і переносили в 5 мл пробірки із круглим дном (ВО Раїсоп,
НеїдеІрегуд, Септапу). Клітини центрифугували й відмивали ОРВ5. Для фарбування клітин використовували мишачі антилюдські СОЗ3-РІТС, мишачі антилюдські СОб6ЯО-АРС і мишачі антилюдські СО25-РЕ (усі антитіла фірми ВО Віозсіепсе5, НеїдеІрегуд, Сегтапу). Клітинний осад ресуспендували в 50 мкл РАС5-буфера (ОРВ5, доповнений 595 ЕВ5) що містить антитіла, кон'юговані із флуоресцентними мітками. Після інкубації протягом 20 хв. при 4 "С в умовах темряви зразки промивали 4 мл ОРВ5 і клітинний осад ресуспендували в 200 мкл ГАС5- буфера, що містить йодид пропідію (РІ) (Зідта Аїагісй, септапу) у кінцевому розведенні 1:1000 для детекції загиблих клітин. Зразки зберігали на льоду й в умовах темряви до вимірювання.
Аналіз виконували з використанням приладу Расзсаїїрбиг (ВО Віозсіепсе5, НеїдеїЇрего, сЗептапу).
Результати аналізу оцінювали за допомогою програмного забезпечення БіоулЛо зоїймаге (Тгтее аг, Зап сапов, СА, ОА).
Як показано на фігурі 21А, кожний СІ ОМ18.2-специфічний ІМТ-МРНК викликав секрецію білка рі-5СЕм, як видно з ефективної активації Т-клітин. Найбільш сильними варіантами лише з незначними розбіжностями в Т-клітинній активації були по.5 » по.8 »по.10 » по.3 » 1ВіІМАВ у порядку зменшення. Усі ці варіанти приводили до загальної активації Т-клітин, що становить 60 більше 5595, тоді як варіанти по.2, по.4, по.7 і по.9 приводили до загальної активації Т-клітин,
що становить від 40 до 5095.
Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 9о лізис - (95 Рі» клітин- мішеней зразок - Зо Рі" клітин-мішеней Р порівняння), Де «зразок» означає спільно інкубовані ефекторні клітини й клітини-мішені, і «ЕР порівняння» тільки піддані електропорації клітини- мішені кожної індивідуальної електропорації ІМТ-тпКМА. Як показано на фігурі 218, лізис клітин- мішеней вище 6595 був досягнутий варіантами 1ВІМАВ » по.5 » по.8 » по.3 у порядку зменшення. Інші варіанти опосередковували лізис клітин-мішеней, що становить 55-649р5.
Найбільш сильний СІ 0ОМ18.2-специфічний рі-5сЕм містить домени Мн і М ТАб6б (1ВіМАВ, по.5, по.10) або ШСНТІ (по.3, по.8). Відносно орієнтацій доменів значної відмінності не спостерігалося на відміну від варіантів білка рі--сЕм (дивися приклад 3). Відповідно до досліджень білка, ІМТ-мМРНК, що кодує 1ВіІМАВ, був вибраний для наступних досліджень.
Конструкції 1І48КНИЗ5 і 18КНИЗ (дивися таблиці 7 і 8) порівнювали в більш пізній момент часу з 1ВІМАВ. Ефективність 14КНИиИ5 була еквівалентна 1ВІМАВ, 18КНИІИЗ був менш сильним (дані не показані).
Приклад 17. Мікроскопічний аналіз Т-клітин, переспрямованих на клітини-мішені, секретуючі
СІ ОМ18.2-специфічний 1ВіМАВ рі-зсЕм
Порядок проведення аналізу по суті був таким, як описано в прикладі 2.а.
Людські цитотоксичні Т-клітини відокремлювали, використовуючи МАС5, від РВМС, виділених зі свіжовідібраної крові, за допомогою набору СО8-- Т Сеї ІзоЇайіоп Кії, питап (Мінепуї
Віоїес, Тегегому, Сегтапу) відповідно до інструкцій виробника.
Клітини-мішені МидсСа4 готовили й трансфікували, як описано в прикладі 16, за винятком того, що використовували 80 мкг/мл 1ВІМАВ ІМТ-МРНК або 80 мкг/мл по.25 ІМТ-МРНК. Трансфіковані клітини-мішені підраховували й доводили до 2 х 105 клітин на мл. 1 х 107 клітин-мішеней засівали в кожну лунку 96-лункового планшета й людські цитотоксичні Т-клітини додавали при співвідношенні ЕТ, рівному 5:11. Кінцевий обсяг на лунку склав 100 мкл. Контрольні зразки містили тільки трансфіковані клітини-мішені для підтвердження лікувальних властивостей після електропорації й контрольні трансфіковані рі--сЕм клітини-мішені з ефекторними клітинами.
Тканинні культуральні планшети потім інкубували при 37"С, 595 СО». Значні ефекти відносно утворення кластерів Т-клітин на клітинах-мішенях, формування імунологічного синапса й
Зо загибелі клітин-мішеней у зразках, що містять трансфіковані 1ВіМАВ клітини-мішені, спостерігали через 24 год і записували за допомогою інвертаційного мікроскопа Мікоп Есіїрзе
Тт5100 (Мікоп, дарап). Утворення кластерів Т-клітин або лізису клітин-мішеней не спостерігалося в контрольному зразку з по.25 трансфікованими клітинами-мішенями, що свідчить про строгу залежність від експресії ТАА для індукції активації Т-клітин. Дивися також фігуру 22.
Приклад 18: Аналіз методом проточної цитометрії залежної від концентрації активації Т- клітин СІ ОМ18.2-специфічним 1ВіІМАВ рі-зсЕм
Для дослідження залежної від концентрації рі-з5сЕм активації Т-клітин у присутності ТАА- експресуючих клітин-мішеней серії трикратних розведень застосовували для процесу трансфекції.
Клітини-мішені МидС4 готовили й трансфікували, як описано в прикладі 16, але з кінцевою концентрацією ІМТ-МРНК, що становить 40 мкг/мл. Концентрації 1ВІМАВ ІМТ-МРНК змінювалися від 0,4 до 40 мкг/мл і були доповнені відповідними кількостями ІМТ-МРНК люциферази з метою піддання всіх клітин однаковому рівню стресу відносно кількостей ІМТ-мМРНК. 1 х 105 трансфікованих клітин-мішеней і людські цитотоксичні Т-клітини (виділені, як описано в прикладі 16) засівали в співвідношенні Е:Т, рівному 10:1, в 2 мл аналітичного середовища в 6- лунковому форматі. Контрольні зразки, що містять клітини-мішені, трансфікували 40 мкг/мл ІМТ-
МРНК люциферази, але не ІМТ-мМРНК 1ВіМАВ. Через 24 год і 48 год спільної інкубації клітин- мішеней і ефекторних клітин, клітини збирали, фарбували й аналізували, як описано в прикладі 16.
Як показано на фігурах 23 А і В, значну активацію Т-клітин спостерігали в зразках, які містять клітини -мішені, трансфіковані 4 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВімМмАВ. Максимальна активація Т- клітин у цьому аналізі була досягнута за допомогою 40 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВіМАВ. Експресія сО69 і С025 різнилася залежно від часу інкубації (Фіг. 23 від А до В) і концентрації ІМТ-мМмРНК.
Більш високі кількості ІМТ-МРНК 1ВІіМАВ (12 і 40 мкг/мл) приводили до більш швидкої ініціації механізму активації Т-клітин, яка спостерігалася, наприклад, при підвищеній експресії СО25 у порівнянні з експресією СОб6О9 на фігурі 238. Загальна активація Т-клітин не перевищувала
Або.
Приклад 19: Аналіз методом проточної цитометрії залежного від концентрації, опосередкованого Т-клітинами лізису клітин-мішеней за допомогою СІ ОМ18.2-специфічного 60 1ВіІМАВ брі-5сЕм
Для дослідження залежного від концентрації Бі--сЕм опосередкованого Т-клітинами лізису клітин-мішеней використовували спосіб, описаний у прикладі 18. Крім зразків спільно інкубованих ефекторних клітин і клітин-мішеней («зразок»), також засівали тільки окремо індивідуально піддані електропорації клітини-мішені. Останні служили як зразки порівняння («ЕР порівняння») для вирахування клітин-мішеней, що загинули в результаті процесу електропорації, із клітин-мішеней, лізованих Т-клітинами.
Збір і фарбування виконували відповідно до прикладу 18. Клітини-мішені на завершення аналізували за допомогою введення в них пропідію йодида за допомогою Расзсаїїбиг (ВО
Віозсієпсев, НеїдеІрег9, Септапу).
Процентний специфічний лізис клітин-мішеней визначали шляхом двостадійного вирахування вихідних загиблих клітин: 1. 96 опосередкованого Т-клітинами лізису - (95 Рі" клітин-мішеней зразок - бо РІ» клітин- мішеней гр порівняння) 2. У специфічного лізису ї- (96 опосередкованого Т-клітинами лізисСуУзразок - 0/9 опосередкованого Т-клітинами лізисуконтроль) «Опосередкований Т-клітинами лізис контроль» віднімається від різниці Рі" клітин-мішеней контрольних зразків (40 мкг/мл тільки ІМТ-МРНК люциферази) з ефекторними клітинами й без них.
За допомогою цього розрахунку максимальний специфічний лізис, що становить 55,5905 ж/- 5,695 досягається за допомогою 12 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВіМАВ у даному експерименті. Завдяки чутливості клітин мішеней МидС4 до стресу, викликаного електропорацією, і пов'язаної з ним неминучої загибелі вихідних клітин-мішеней, які віднімаються, відзначений на графіку специфічний лізис клітин-мішеней може бути нижчим за цих експериментальних умов, ніж фактичний процентний лізис.
Приклад 20: Проліферація Т-клітин у відповідь на трансфекцію ІМТ-МРНК 1ВІМАВ
Проліферація Т-клітин є ознакою активації Т-клітин. Для демонстрації проліферації Т-клітин рі-зсЕм, кодуючий 1ВіМАВ ІМТ-мРНК у присутності СІ ОМ18.2-позитивних клітин-мішеней, використовували аналіз методом проточної цитометрії. Коротко, 1 х 107 людських Т-клітин, виділених як описано в прикладі 16, фарбували 1 мкМ карбоксифлуоресцеїну діацетату
Зо сукцинімідилового складного ефіру (СеШгтасе СЕБЕ, Іпмігодеп//їйе Тесппоіодіе5 Стр,
Септапу), розчиненого в ОРВХ, в умовах темряви за кімнатної температури протягом 5 хв.
Клітини промивали двічі ОРВЗ /590Е05 і ресуспендували в аналітичному середовищі до 2 х 105 клітин на мл. Як клітини-мішені були вибрані клітини МидС4, лентивірально трандуковані людським СІ ОМ18.2 і - для тестування специфічності - СІ ОМ18.2-негативна клітинна лінія раку молочної залози МОА-МВ-231. 20 мкг/мл 1ВіМАВ ІМТ-мРНК або нетаргетний контроль використовували для електропорації. Електропорацію МидсСа4 виконували, як описано в прикладі 16. Електропорацію МОА-МВ-231 виконували з використанням наступних умов: 400 В, тривалість імпульсу З мс, 1 імпульс, інтервал між імпульсами 400 мс в 0,4 см кюветах Сепе
Риїзег/Місториїзег Симейнез (Віо-Кай, агеївісп, Ссептапу). Аналіз на цитотоксичність, описаний у прикладі 16, проводили із трансфікованими клітинами-мішенями й людськими СЕЗЕ-міченими
Т-клітинами як ефекторними клітинами. Як негативні контролі використовували тільки Т-клітини й нетрансфіковані або контрольні трансфіковані клітини-мішені плюс Т-клітини. Як позитивний контроль служили тільки Т-клітини, стимульовані 5 мкг/мл ОКТЗ (Віо Х СеїЇ, М/езі І ерапоп, МН,
О5А) і 2 мкг/мл анти-СО28 (Віоіедепа, теїї, Септапу), Білок ТВІМАВ у концентрації 5 нг/мл наносили на нетрансфіковані клітини-мішені плюс Т-клітини для підтвердження валідності аналізу. Зразки, об'єднані з нетаргетним білком б6РНИЗ рі-5сЕм, включали як контроль специфічності. Усі зразки готовили в трьох повторностях у загальному обсязі 0,2 мл аналітичного середовища в 9б лунках. Через 72 год спільної інкубації Т-клітини збирали, переносили в 5 мл пробірки із круглим дном, промивали й фарбували при 4"С протягом 30 хв. 2 мкл анти-С0О45-АРС для диференціації людських Т-клітин від пухлинних клітин, і 0,25 мкл еРіног506 (ВО Віозсієпсев5, НеїдеІрег9, Септапу) для контрастного фарбування загиблих клітин в 200 мкл ОРВ5. Після відмивання ОРВ5 клітини ресуспендували в ЕАС5-буфері й аналізували за допомогою Расзсапіо ІІ (ВО Віозсіепсе5, НеїдеїІрего, Сегтапу).
Проліферацію Т-клітин детектували за зменшенням СЕ5Е-сигналу тільки в присутності
СІ ОМ18.2-позитивних клітин-мішеней і 1ВіІМАВ рі-єсбм (дивися також фігуру 25). Крім позитивного контролю, проліферацію Т-клітин, яка складала 42-4895, можна було спостерігати в присутності СІ ОМ18.2-позитивних клітин-мішеней у комбінації з білком 1ВіІМАВ. Таргетні позитивні клітини, трансфіковані ІМТ-МРНК 1ВіМАВ, привели до 22905 -/- 395. Більш низька проліферація у відповідь на ІМТ-мРНК, ніж на білок, можливо обумовлена низькою бо ефективністю трансфекції, що досягається клітинами-мішенями МидС4. Т-клітини, інкубовані з
СІ ОМ18.2-негативними клітинами-мішенями МОА-МВ-231, не показали значної проліферації в будь-яких умовах, а також Т-клітини без клітин-мішеней, за винятком позитивного контролю.
Приклад 21: Титрування співвідношень ефектора до мішені для визначення ефективного співвідношення
Для визначення придатного співвідношення Е:Т для проведення аналізу цитотоксичності іп міго на основі ЕАС5-аналізу, співвідношення Е:Т у діапазоні від 0,3:1 до 10:1 вибирали за З стадії.
Клітини-мішені МидсС4 готовили й трансфікували, як описано в прикладі 16, з концентрацією
ІМТ-МРНК, що становить 40 мкг/мл. Один препарат трансфікованих ІМТ-МРНК 1ВіІМАВ клітин використовували для всіх тестованих зразків. Трансфекція 40 мкг/мл ІМТ-МРНК люциферази була вибрана як негативний контроль.
Людські цитотоксичні Т-клітини відокремлювали РВМС, виділених зі свіжовідібраної крові, як описано в прикладі 16, і служили як ефекторні клітини. 1 х 105 трансфікованих клітин-мішеней спільно інкубували із цитотоксичними Т-клітинами в б-лункових планшетах у двох повторностях у наступних співвідношеннях ефектора до мішені: 0,3:1 - 1:11 - 3:1 - 10:1. Крім того, людські цитотоксичні Т-клітини вирощували за відсутності клітин-мішеней для визначення вихідної активації Т-клітин. Клітини-мішені, трансфіковані контрольним ІМТ-МРНК або ІМТ-МРНК 1ВімМАВ, також вирощували за відсутності ефекторних клітин для визначення вихідних загиблих клітин шляхом піддання стресу електропорації. Люциферазний негативний контроль засівали тільки в максимальному співвідношенні Е:Т, рівному 10:11. Через 48 год спільної інкубації клітини відбирали, мітили й аналізували, як описано в прикладі 16.
На фігурі 26А показана специфічна активація цитотоксичних Т-клітин у відповідь на секрецію 1ВІМАВ клітинами-мішенями МидсС4. Незалежно від кількості Т-клітин у зразках, була виявлена загальна активація 50-60 95. Крім того, розподіл експресії СО25 і СОб69 у зразках є у високому ступені співвідносним. Це вказує на те, що в популяції цитотоксичних Т-клітин є фіксований відсоток Т-клітин, які можуть бути активовані.
На фігурі 268 залежність ефективного лізису клітин-мішеней від кількості цитотоксичних Т- клітин стає очевидною. Навіть якщо клітини-мішені лізовані в співвідношенні Е:Т, рівному тільки 0,3:1, активний лізис починається при співвідношенні 3:1.
Зо Приклад 22: Аналіз активації Т-клітин і лізис клітин-мішеней в аналізі на основі ЕАС5 з використанням трансфікованих ІМТ-МРНК 1ВІМАВ ефекторних клітин
У цьому експерименті метою було тестування здатності людських ефекторних клітин продукувати і секретувати 1ВІМАВ після трансфекції ІМТ-мМРНК. Раціональною основою був гіпотетичний варіант розвитку подій у пацієнта, де власні Т-клітини пацієнта можуть бути трансфіковані рі-5сЕм з наступним повторним перенесенням в організм пацієнта.
Людські цитотоксичні Т-клітини - ізольовані як описано в прикладі 16 - промивали двічі середовищем Х-Мімо 15 (ГОМ2А, Вазеї, Зм/йлегіапа) і ресуспендували до щільності 2 х 107 клітин/мл. 250 мкл клітинної суспензії переносили в попередньо охолоджені 0,4 см кювети бЗепе
Риїзег/Місториїзег СимейНез (Віо-Кад, агеївісп, сегтапу) і додавали 80 або 240 мкг/мл ІМТ-МмРНК.
Використовуваними ІМТ-мРНК були 1ВіМАВ і есЕР як контроль. Після обережного перемішування клітини електропорували з використанням електропоратора ВТХ ЕСМ 830 (Нагуага Аррагайшз, Ноїїїбіоп, МА, ОСОБА) з використанням наступних умов: 500 В, 1 імпульс, тривалість імпульсу З мс, інтервал між імпульсами 400 мс. Відразу ж після електропорації кювети поміщали на лід на короткий проміжок часу й потім клітинні суспензії переносили в аналітичне середовище (середовище КРМІ 1640, доповнене 595 термоїнактивованою людською сироваткою АВ, 0,5 95 пеніциліну-стрептоміцину, їх МЕАА ії 1 мМ пірувата натрію (сірсо/ Ше
Месппоіодіез «тн, Багтєеїайії, Сегтапу)), що містить 10 Од/мл 1-2. Трансфіковані ефекторні клітини вирощували протягом ночі при 37 "С, 5 95 СО»2. Наступного дня ефективність трансфекції аналізували за допомогою ГАС5, виявляючи ефективність трансфекції вище 7090 для обох концентрацій ІМТ-мРНК есЕР. Кожний зразок ефекторних клітин підраховували й доводили до 5 х 107 клітин на мл. Клітини-мішені МидСб4 збирали для аналізу шляхом трипсинізації, промивали аналітичним середовищем, підраховували й доводили до 1 х 105 клітин на мл. Ефекторні клітини й клітини-мішені змішували й засівали в б-лункових планшетах у двох повторностях у кінцевому співвідношенні Е:Т, рівному 5:1, і кінцевому обсязі 2 мл.
Неопрацьовані Т-клітини засівали без клітин-мішеней для визначення вихідних сигналів активації. Аналіз проводили, як описано в прикладі 16, через 48 год спільної інкубації при 37 "С, 5 95 СО».
Значна активація цитотоксичних Т-клітин, трансфікованих ІМТ-МРНК 1ВіІМАВ і спільно інкубованих із клітинами-мішенями, досягалася, як показано на фігурі 27А. Лізис клітин-мішеней бо трансфікованими ІМТ-МРНК 1ВіМАВ Т-клітинами склав більш 60 95, як показано на фігурі 278.
Ефекти 80 мкг/мл ІМТ-МРНК 1ВіМАВ не могли бути збільшені за допомогою більш високих кількостей РНК.
У результаті цього експерименту можна зробити висновок про те, що ефекторні клітини можуть теоретично бути використані як продукуючі і секретуючі рі-5сЕм клітини-реципієнти.
Приклад 23: Дослідження специфічності відносно мішені ІМТ-мРНК 1ВІіМАВ в аналізі на цитотоксичність на основі люциферази з використанням СІ ОМ18.2-негативних клітин-мішеней.
Строга специфічність відносно мішені є важливим питанням для запобігання небажаних побічних ефектів у пацієнтів. У цьому первинному дослідженні СІ ОМ18.2-негативну клітинну лінію - клітинну лінію тератокарциноми РА-1 (АТС СВІ-1572) - використовували для дослідження неспецифічного цитолітичного потенціалу 1ВіІМАВ, уведеного у вигляді ІМТ-МРНК.
Використовувана клітинна лінія РА-1 була стабільно трансдукована лентивірусним вектором на основі люциферази й, таким чином, могла застосовуватися в аналізі на цитотоксичності на основі люциферази.Клітини-мішені РА-1Лис готовили для електропорації, як описано в прикладі 16. Усього було трансфіковано 40 мкг/мл ІМТ-МРНК на зразок. Використовували наступні ІМТ-
МРНК: 1ВіМАВ, по. 25 і бКНИЗ. Мо. 25 направлено впливає на РІАС-1 ТАА, що не експресується, і 6КНИЗ направленно впливає на таргетний СІ ОМб, що високоекспресується у клітинах РА-1Лис. Для одержання більш докладної інформації, що стосується варіантів Бі-5сеЕм, дивися таблиці 7 і 8. Мо. 25 використовували як доповнення ІМТ-мРНК у зразках для електропорації 4 мкг/мл ІМТ-МРНК для забезпечення однакового рівня стресу, викликаного трансфекцією РНК, для всіх зразків клітин-мішеней. Після обережного перемішування клітини трансфікували за допомогою електропоратора ВТХ ЕСМ 830 (Нагмага Аррагаїсз», Ноїївіоп, МА,
БА) з використанням наступних умов для 0,4 см кювети: 200 В, 2 імпульса, тривалість імпульсу 12 мс, інтервал між імпульсами 400 мс. Відразу ж після електропорації кювети поміщали на лід на короткий проміжок часу, і потім клітинні суспензії переносили в нагріте до кімнатної температури аналітичне середовище РА-1 (МЕМ середовище, доповнене 10 905 термоінактивованої ЕС5, 0,5 95 пеніциліну-стрептоміцину, 1х МЕАА, 1,5 г/л бікарбонату натрію й 1 мМ пірувата натрію (сСірсо// їе ТесппоЇодіеє СтбБН, Баптвіавді, септапу)) в 15 мл пробірках.
Трансфіковані клітини-мішені підраховували й доводили до 1 х 107 клітин на мл.
Людські ефекторні клітини виділяли, як описано в прикладі 16. Людські цитотоксичні Т-
Зо клітини виділяли шляхом магнітно-активованого клітинного сортування (МАС5) з РВМС за допомогою набору Рап Т Сеї ІзоЇайоп Кі Ії, питап (Мінкепуїі Віоїес, Тегегому, Септапу) згідно з інструкціями виробника. Т-клітини доводили до 5 х 105 клітин на мл в аналітичному середовищі
РА-1. 1 х 107 клітин-мішеней засівали в кожну лунку 9б-лункового планшета й людські цитотоксичні Т-клітини додавали до співвідношення Е:Т, рівного 5:1. Кінцевий обсяг кожної лунки склав 100 мкл. Контрольні зразки, що містять ефекторні клітини й клітини-мішені, містили як негативний контроль клітини-мішені, секретуючі по. 25, як позитивний контроль білок БКНОЗ або 6РНИиЗ, і білок 1ВІМАВ. Концентрації білків доводили до кінцевої концентрації 100 нг/мл і поєднували з по.25-трансфікованими клітинами-мішенями для забезпечення однакових умов для використовуваних клітин-мішеней. Контролі мінімального лізису (І ліп) включали тільки кожний зразок електропорованих клітин-мішеней. Контролі спонтанного лізису (І птах) СКЛадалися з неопрацьованих клітин-мішеней і ефекторних клітин (І тах) для вирахування з І тестованого зразка або тільки неопрацьовані клітини-мішені (І пахг) для вирахування з І піп. Кожний зразок засівали в трьох повторностях. Аналіз проводили через 72 год інкубації при 37 "С, 5 95 СО». Контролі спонтанного лізису (І тах) обробляли Топ Х-100 у кінцевій концентрації 2 95.
Для аналізу 50 мкл водяного розчину, що містить 1 мг/мл люциферина (ВО Мопоїїдні, ВО,
Віозсіепсе5, НеїдеІрегу, Септапу) і 50 мМ НЕРЕ5, додавали в кожну лунку, і планшети потім інкубували протягом 30 хв. в умовах темряви при 37"С. Люмінесценцію, що виникає в результаті окиснення люциферина люциферазою, яка еспресує життєздатні клітини, вимірювали на мікропланшетному рідері (Іпїп(е М200, Тесап, Маппедоїпї, Зм/йгепапа). Відсоток специфічного лізису клітин-мішеней розраховували за наступною формулою: 96 специфічного лізису - (1 - (люмінесценція тестований зразок -- Ї тах) / (І піп - Ї тахг)| х 100.
На фігурі 28 показаний відсоток специфічного лізису клітин-мішеней. СІ ОМ18.2-негативні клітини РА-1Лис, трансфіковані негативним контролем по. 25 або 1ВіМАВ, не показують значного лізису навіть після інкубації протягом 72 год. Також, 100 нг/мл білка 1ВІМАВ не приводить до значного лізису, тоді як лізис, викликаний бБі-ссЕм-секрецією 6КНИЗ, що направлено впливає на ТАА, або 100 нг/мл білка ЄКНОИЗ, склав 85-9395. Аналіз також проводили через 24 год і 48 год, який показав еквівалентні результати (дані не показані).
Приклад 24: Кількісний аналіз продукції білка 1ВІМАВ після трансфекції клітин ссавців ІМТ- 60 МРНК
Для дослідження трансляції РНК у білок у клітинах ссавця вибирали клітинну лінію ВНК21 (АТСС СВІ -13001) як систему експресії. 2 х 107 клітин ВНК21 на мл трансфікували шляхом електропорації, як описано в прикладі 16, при цьому відмінність полягала в тому, що всі стадії виконували за кімнатної температури. 250 мкл клітинної суспензії переносили в 0,4 см кювети
Сепе Риїзе//Місториізег СименНез (Віо-гад, Огеіесп, Септпапу) і додавали 40 мкг/мл ІМТ-тАМА 1ВІМАВ або ІМТ-реплікон РНК. Умови електропорації були наступні: 300 В, тривалість імпульсу 16 мс, 1 імпульс, інтервал між імпульсами 400 мс.
Електропоровані клітини ресуспендували в культуральному середовищі за кімнатної температури (КРМІ 1640, 10 95 ЕС5) і переносили в 15 см культуральні чашки. Через 5 год після засівання середовище, що містить ЕС5, заміняли середовищем, що не містить ЕС5. У прикладах 24 а й р супернатант клітинної культури й клітини збирали для аналізу окремо через 18 год після електропорації. Клітинні осади лізували в їх ГО5 буфері для зразка (номер по каталогу МРОО0О8; те ТесппоЇодієх, Оаптвіадії, Септапу) і нагрівали при 72"С протягом 15 хв.
Для аналізу ЕГІ5А використовували неконцентрований і приблизно 50-кратно концентрований супернатант. Концентрування проводили за допомогою центрифужного фільтра Атісоп ийга-15 (Мегск МіПроге, ВіПегіса, МА, ОА) відповідно до протоколу виробника. У випадку прикладу 24с (тільки ІМТ-МРНК) супернатант збирали через 48 год після трансфекції й піддавали 40-кратному концентруванню, як описано вище. а. ЕГІЗА з використанням супернатанта
Для аналізу ЕГІЗБА планшети, покриті нікелем (Тпегто Різпег Зсієепійіс, Вопп, Септапу) використовували для захоплення аналіта через його Ніз-мітку. Спочатку планшет промивали три рази 200 мкл промивного буфера (0,01 95 Тмееп-20 в їх РВ5) на лунку. Як стандарт очищений білок 1ВІМАВ розводили в 1,75 95 Ма-казеїн в 1 х РВ5 (- розріджувач). Ряд розведень змінювався від 2,34 до 37,50 нг/мл із кроком в 2. 100 мкл на стандартне розведення переносили в лунки в трьох повторностях кожної концентрації. Відповідним чином, 100 мкл зразків переносили в трьох повторностях. Планшет герметично закривали адгезивною плівкою й інкубували при 37 "С протягом 30 хвилин. Після цього планшети промивали три рази 200 мкл промивного буфера на кожну лунку. Для детекції 1ВІМАВ використовували анти-ідіотипічне моноклональне Ід 8ВІЕЗ, яке специфічно зв'язується з МН-МІ СІ ОМ18.2ар і, отже, також з
Зо 1ВімМАВ. 8813 змішували з розріджувачем до кінцевої концентрації 1 мкг/мл. 100 мкл розчину анти-ідіотипічного антитіла переносили в кожну лунку з наступною інкубацією протягом 30 хв. при 37 "С. Потім планшет промивали 3-кратно 200 мкл промивного буфера на кожну лунку, і 100 мкл АР-кон'югованого анти-мишачого детекторного антитіла (даскбоп Іттипо Кезеагсп
І арогайогіе5, М/езі Стоме, РА, ОСОБА) - у розведенні 1:500 у розріджувачі - додавали в кожну лунку з наступною інкубацією протягом 30 хв. при 37 "С. Після заключної стадії промивання (З х 200 мкл промивного буфера) у кожну лунку додавали 1,5 мг/мл субстрату рМРР у відповідному субстратному буфері (1М диетаноламін, 0,5 мМ Мосі», 0,01 95 Ма-азид, рН 9,8) з наступною інкубацією протягом 30 хв. за кімнатної температури в умовах темряви. Для зупинки ферментативної реакції використовували 100 мкл ЗМ КІН на кожну лунку. Поглинання вимірювали за допомогою мікропланшетного ридера (Іппйпйе М200, Тесап, Маппедодог'і, зЗм/й7епапа). Для двохвильового аналізу 405 нм установлювали як довжину хвилі вимірювання й 492 нм як довжину хвилі порівняння. Величини поглинання розраховували шляхом вирахування довжини хвилі порівняння з довжини хвилі вимірювання.
На фігурі 29А нанесені середні величини поглинання при 405 нм, включаючи стандартні відхилення. Концентрований супернатант із клітин, трансфікованих ІМТ-МРНК 1ВіМАВ і ІМТт- репліконом, викликав значний сигнал, підтверджуючи трансляцію Брі-5сЕм, що кодує ІМТ-РНК.
Концентрований супернатант із ложно-трансфікованих клітин не викликав якого-небудь сигналу.
Фактичні концентрації білка не можуть бути запропоновані через різну токсичність конструкцій
ІМТ-МРНК ії ІМТ-реплікона, і х-кратних концентратів, які незначно відрізняються. Визначена приблизна концентрація білка в неконцентрованому супернатанті знаходилась в межах 1,5 нг/мл для зразків ІМТ-реплікона й 2,4 нг/мл для зразків ІМТ-т АМА. р. Вестерн-блот аналіз супернатанта й клітинного лізату (зразки ІМТ-МРНК і ІМТ-реплікона)
Для аналізу методом Вестерн-блотинга концентровані супернатанти й клітинні лізати розділяли на МИРАСЕ Момех 4-129о Вів-мів (звів (Іпмігодеп/І їє Тесппоїодіе5 СсІтрЬН, багтзвіадії,
Септапу). Навантажували супернатант і клітинний лізат клітин ВНК21, трансфікованих ІМТ-
МРНК 1ВіМАВ, ІМТ-репліконом РНК, або неопрацьованих клітин і позитивного контролю - 0,1 мкг очищеного білка 1ВімМАВ.Вестерн-блот-аналіз виконували за допомогою стандартних процедур (Сигтепі Ргоїосої5 іп Ргоївіп 5сіепсе, 2012). Коротко, після блотинга білків на РМОБ- мембрані й блокування за допомогою РВ5Т/395 сухого молока мембрану інкубували протягом 1 бо год при 4 "С з первинним антитілом Апіі-НІ5 Еріоре-Тад (Оіапома стрН, Натрбригод, Септпапу) у розведенні 1:500 у блокувальному буфері. Після повторного промивання блокувальним буфером мембрани інкубували з Ес-специфічним вторинним козячим-анти-мишачим Ідс антитілом, кон'югованим з пероксидазою (5Зідта А|їайгісй, Ссегтапу), у розведенні 1:10000 у блокувальному буфері протягом 1 год при 4 "С. Після повторного промивання блокувальним буфером сигнали визуалізували за допомогою Зирегзідпа! УмМебі Ретіо СПепіїштіпезсепі зиМирбігаїє (Ріегсе//пегто Різпег Зсіепійіс, Косктога, І, ОБА) і записували за допомогою
ІтадеОцапі І АБ 4000 Ітадег (СЕ НеаїШсаге Ііїе Зсіепсе5, Мипісп, Сепптапу). Сигнали 1ВІМАВ детектували в діапазоні від 50 до 60 кДа в порівнянні з молекулярною масою внутрішнього стандарту.
Як показано на фігурі 298 слабкі сигнали були детектовані в супернатанті клітин, трансфікованих ІМТ-МРНК (доріжка 2) і ІМТ-репліконом РНК (доріжка 3), тоді як сигнал був відсутній у доріжці 4 (супернатант від неопрацьованих клітин). Сильні сигнали можуть бути генеровані клітинними лізатами клітин, трансфікованих ІМТ-МРНК (лінія 5) і ІМТ-реплікона РНК (лінія 6). Сигнал знову був відсутній у клітинному лізаті неопрацьованих клітин (доріжка 7). Усі сигнали виникали на такій самій висоті, що й в очищеного контрольного білка 1ВІМАВ (доріжка 8). Слабкий сигнал у супернатанті й слабка секреція ІВІМАВ можливо обумовлені відносно коротким часом інкубації після трансфекції. Через токсичний ефект реплікона РНК більш тривалі періоди інкубації не можуть бути тестовані.
Обидва аналізи є якісними й не можуть бути використані для визначення концентрації білка. с. Вестерн-блот аналіз супернатанта (зразки ІМТ-МРНК)
Супернатант, зібраний через 48 год після трансфекції, відокремлювали за допомогою 505-
РАСЕ з наступним вестерн-блот-аналізом, як описано в прикладі 24р. Як показано на фігурі 29С, по.25 і 1ВІМАВ, трансльований з ІМТ-МРНК і секретований у супернатант, детектували за допомогою їх Ніз-мітки. При цьому продукція й секреція 1ВІМАВ, а також по.25, який використовували як контроль специфічності Бі-5сЕм, можуть бути підтверджені.
Приклад 25: Детекція /л7 мімо трансльованого й функціонального білка 1ВІМАВ після внутрішньом'язової ін'єкції РНК
Мишачих самок і самців лінії М5О у віці 8-16 тижнів відбирали й розподіляли на 4 групи по 5 мишей. Кожній миші в стегновий м'яз ін'єктували 40 мкл розчину РНК. В 40 мкл розчину РНК містилося їх РВ5, 5 мкг Б2-кепованого ІМТ-МРНК 1ВіМАВ або реплікона, 2 мкг 01-кепованої люциферази ІМТ-МРНК і 0 або 15 мкг 01-кепованого ІМТ-МРНК ЕВК. ІМТ-мРНК ЕВК, що кодує білки ЕЗІ, В18Е ії КЗІ (ЕВК) вірусу осповакцини, спільно ін'єктували для інгібування відповіді
ІЕМ ї для протидії активації РКК з метою посилення трансляції РНК (заявка на патент
РСТ/ЕР2012/04673). Сигнал люциферази спостерігали через 24 год після ін'єкції Хеподеп ІМІ5 2000 для виключення мишей без сигналу з колекції зразків.
Кров збирали через 2, 4 і 7 днів після ін'єкції. Сироватку збирали й потім заморожували при - 80 "С. М'язи мишей із сильним люмінесцентним сигналом вирізали й гістохімічно фіксували для імуногістохімічного аналізу (ІНС) або заморожували шляхом шокової заморозки для вестерн- блот-аналізу через 4 дні після ін'єкції РНК.
Аналіз на цитотоксичність
Сироватку мишей М5О аналізували в аналізі на цитотоксичність /л мЛго.Клітини-мішені
Мидс4, стабільно трансфіковані люциферазою світлячка й людським СІ ОМ18.2 для кращої експресії мішені, засівали людськими Т-клітинами (ізольованими як описано в прикладі 16) у співвідношенні Е:Т, рівному 30:11, для максимальної чутливості. Аналітичне середовище складалося із середовища КРМІ 1640, доповненого 1095 термоінактивованою ЕС5, 0,590 пеніциліну-стрептоміцину, їх МЕАА і 1 мМ пірувата натрію (Сібсо// Ше ТесппоІодіеє стрн,
Баптеїайді, Септапу). 20 мкл відталої тестованої сироватки додавали в кожну лунку з тестованим зразком. Лунки зі стандартним контрольним білюом 1ВІМАВ, лунки з І тліп і |. пах наповнювали 20 мкл сироватки неопрацьованих мишей М5О. Кінцевий обсяг кожної лунки склав 100 мкл. Глп засівали дванадцятикратно, І лах шестикратно й тестовані зразки в трьох повторностях. Через 48 год інкубації при 37 "С ії 5 95 СО»5 лунки з І тах змішували з 10 мкл 2 95 розчину Тийоп Х-100 і інкубували протягом 10 хв. В усі інші лунки додавали 10 мкл аналітичного середовища. Додавали 50 мкл розчину люциферина (дивися приклад 23) і планшети вимірювали - через 30 хв. стадії інкубації при 37 "С у умовах темряви - на мікропланшетному рідері Іпїпйе М200 (ТЕСАМ, Маппедогпї, Зм/йгегпапа). Розрахунки специфічного лізису клітин- мішеней виконували, як описано в прикладі 23.
На фігурі 30 нанесений відсоток специфічного лізису. Значні цитотоксичні ефекти детектували в кожній групі. Цитотоксичні ефекти збільшилися на фактор 1,7 у лунках мишей, що містять сироватку, ін'єкованих ЕВК і ІМТ-тАМА 1ВІМАВ, і збирали для аналізу через 2 дні після 60 ін'єкції. Значно більш низькі ефекти спостерігалися в зразках, зібраних на 4 або 7 день після ін'єкції. У випадку зразків 1 ВІМАВ-реплікона, сироватка, зібрана в більш пізні моменти часу, також генерували сильні цитолітичні ефекти.
Ці дані підтверджують /л міо трансляцію 1ВіМАВ з ІМТ-мМРНК або -реплікона й секрецію в кровоток після внутрішньом'язової ін'єкції.
Приклад 26: Генерація й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМ і СОЗ а. Вихідні послідовності, дизайн конструкції рі-5сЕм і клонування в матрицю вектора
Готовили конструкції біспецифічного тандемного одноланцюгового антитіла (рі-5сЕмМ), що містять з'єднувальні домени, специфічні відносно компонента СОЗ людського Т-клітинного рецептора й людських пухлиноасоційованих антигенів (ТАА). Відповідні варіабельні області важкого ланцюга (Мн) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (Мі) для кожної конструкції розташовані специфічно в напрямку від 5'- до 3-кінця в наступному порядку: рот1-5'АдКогак-Мнесіомб-у| асом У росоз У асоз.Нів-гАВЯОТВ-А120 (ЄННИиЗ) рет1-5'АдКогак-Мнесоз-у| асозурдасіомв-у,осГомв.Нів-2гАВаОТВ-А120 (ЄННИЗ)
У таблиці 9 коротко описані всі конструкції рі-5сЕм, специфічні відносно ТАА СІ ОМб, які були генеровані в рамках винаходу. Сі ОМ18.2-специфічну конструкцію 1ВіІМАВ бБі-зсЕм використовували як контрольне антитіло. Конструкції рі-5сЕм генерували шляхом генного синтезу СепеАгі АС (СепеАгпі/ їе ТесппоЇодіех тн, Кедепозбригу, Септапу) з використанням послідовностей Мн і Мі відповідних антитіл. Оптимізації кодонів, таких як Ното 5аріепо (Н5) або
Ми5 тизсци5 (ММ) були реалізовані за допомогою програмного забезпечення СепеАгі5
СепеОрійтігемк?, і перераховано в таблиці 9. Інформація, що стосується специфічності, походження послідовностей з моноклональних антитіл (МАВ), використання кодонів, додаткових відмітних ознак послідовностей і посилань на всі, що застосовуються домени, узагальнено в таблиці 10. Вихідні послідовності варіабельних доменів відповідних антитіл СОЗ перераховано в таблиці 10. Завдяки високій гомології людських і мишачих ТАА, однакові послідовності Мн і Мі. анти-ТАА можуть бути використані для створення конструкцій Бі-5сЕм для аналізів на мишах, але в комбінації з послідовностями Мн, Мі мишачого специфічного клону 145-2С11 анти-СОЗ антитіла.
Клонування ДНК і конструювання експресійних векторів проводили у відповідності зі
Зо стандартними процедурами (Сгееп/ЗатргоокК, МоїІесшіаг Сіопіпу, 2012), які добре відомі фахівцям у даній області. Коротко, головні ДНК послідовності Бі-5сЕм містили сайт рестрикції 5-
В5твВІ і 3'-ХпоїЇ для клонування в плазміди реТ1. Послідовність сигналу секреції вводили на 5' кінці (вище) послідовності рі-з-сЕм для секреції білка. Послідовність, що кодує гнучкий гліцин- сериновий пептидний лінкер, що складається з 15-18 амінокислот, вставляли для з'єднання доменів Мн і Мі для композиції одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіла (5СЕм), з яких один зв'язується з СОЗ і інший з ТАА. Для формування біспецифічного одноланцюгового антитіла послідовності двох доменів 5сЕм з'єднували послідовністю, що кодує короткий пептидний лінкер (500655). Разом із цією послідовністю лінкера вводили сайт рестрикції Ватні для обміну доменів 5сЕм для клонування наступних конструкцій Бі-5сЕм. Коротко, домени 55сіГу- заміняли шляхом рестрикції В5птвВІ і Ватні і 3" зсСбм-домени шляхом рестрикції Ватні і Хпої. С- кінцеву 6 хНіб-мітку використовували для аналізів на виявлення трансльованого білка. Для одержання вектора реплікона БКНОИЗ повну послідовність БКНИЗ, включаючи сигнал секреції й 6 хНів-мітку, субклонували в напрямку від 3' від субгеномного промотору вектора реплікона вірусу лісу Семліки (РЕМ), люб'язно наданого К. І ипавігот (І ипоабігот, К. еї аї. (2001)
Нівіоснет. Сеї! Віої. 115 (1), рр. 83-91; Енгепдгибег, М.О. еї а. (1999) Ргос. Маї). Асад. босі. О.5.А. 96 (12), рр. 7041-7046).
Усі конструкції підтверджували шляхом секвенування через сервіс з секвенування одиночних прочитань (МУ 5іпдіє геай зедиепсе 5егмісе) (Еишгоїйп5 МУ Орегоп, Ебегерегод,
Септапу) і використовували конструкції тільки із правильною послідовністю й полі(А)-хвостом, що складаються із більш ніж 100 аденінів, для іп міго транскрипції РНК.
Схеми конструкцій представлені також на фігурі З1А.
Таблиця 9
Короткий опис конструкцій мРНК-матриці біспецифічного одноланцюгового антитіла, специфічного відносно ТАА й СОЗ
Внутр. Специ- бо бо Використання наймен. ТАА фічність УМ. З Ун М. кодонів
СІОМ18.2 теїдп18.2ар тв вн |СГОМ6 тесідпбар твеб 6вниЗ ССО М6 людина /Т866 тесідпбар 6вМО5 |СГОМ6 тесідпбар 145-2С11 6вмМОЗ |ССОМ6 145-2С11 тсідпвар рі-зсЕм означає біспецифічний одноланцюговий варіабельний фрагмент; Н5, Ното-заріепв;
НИ, гуманізоване; ММ, Мих тизсицій5; ТАА, пухлиноасоційований антиген; Мн, варіабельний домен важкого ланцюга, Мі, варіабельний домен легкого ланцюга
Таблиця 10
Короткий опис конструкції матриці мРНК-рі-ссЕм
З'єднувальний ' -
Вн По- ) Реак- Походж Реак- Короткий утр. ходж. | тивн. ТАА дж. Б-Мн-Мі З3З-Мн-Мі р найм. тар тивн. вид лінкер тар вид тТАбб СІ ОМ18.2 | тсідп18.2ар тсідп18.2аБ | ТАбб сса5 6бАНи5 | ТАбб люди ої ом тсідпбар людина, тоідпвав тТАбб запсасо5 бвнНОЗ | ТАбб6 люди сі оме тсідпбар людина, | тАвв тсідпбар |512О0303045 ввми5| 757 |миша |СІОМб о |тсідпбар людина, сурдвар | 1445-2011 |ЗсСОС8 2011 миша ввмиз| 757 |миша |СІОМб о |тсідпбар людина, 345.2с11 |тсідпбав |8сссс8 2011 миша
Продовження Таблиця 10
Вико-
Внутр. 5 -довгий З'-довгий лінкер | сигнал секреції ристан- | посилання по анти-СОЗ найм. лінкер ня тар кодонів
Ї апгамессніа 5 1Вітаь | сССсОИ5)з ук(возоасврасу |МОМЗСТІ МА но ЗсПеідеоддег, Єшг / р ТАТОУН5
Іттипої! 1987
Ї апгамессніа 5 ввни5 (сосо5)» К(О5бОб5рОСУ| МОМ ЗСПЬРІМА Не | вспеідеддег, Єиг у р ТАТОУН5
Іттипої! 1987
Ї апгамессніа 5 мумЕ(аавсаав)» МОМ/ЗСП РІГ МА ; б6вниз сем (аспаав)з ТАТСУНе но ЗсПеідеоддег, Єшг /
Іттипої! 1987 ме(аавзасврацм | МЕМ/ЗСПС РІ МА Ї ео вї аї., Ргос Маї! Асад мумЕ(аавсаав)» ММаГгОМЕЕМ Ї ео вї аї., Ргос Маї! Асай
НМ | двур (50055)з ітІКсюс Зсі, 1987
Н5, Ното заріепсе; МАВ, »моноклональне антитіло; ММ, Ми5 тивзсци5; ТАА,
пухлиноасоційований антиген.
Б. Синтез ІМТ-РНК
Для створення анти-С ОМ б-специфічних ІМТ-матриць Бі-з5сЕм, плазміди лінеаризували нижче полі(А)-хвоста з використанням ендонуклеази класу Іїз. Лінеаризовану матрицю ДНК очищали екстракцією сумішшю фенол/хлороформ і осаджували ацетатом натрію, як описано в літературних джерелах (НоїКатр, 5. еї аІ. (2006) Віоса 108 (13), рр. 4009-4017).
Лінеаризовані матриці ДНК піддавали іп місто транскрипції з використанням наборів
МЕСАФ5осгірі Кв (АтБбіоп//йе Тесппоіодіе5, Юаптвхїайі, Септапу) відповідно до інструкцій виробника: матриці р5Т1 транскрибували за допомогою набору МЕСАзоесгірі Т7 Кії і матриці рЗЕМ за допомогою набору МЕСАзогірі ЗРб Кії. Для реакцій з кеп-аналогом концентрацію СТР зменшували до 1,5 мМ і б мМ АКСА, бета-5-АКНСА(Ю1) або в реакцію додавали бета-5-
АКСА(02), синтезований, як описано в літературі (Коухаїв5Ка, у. еї а. (2008) ЕМА 14 (6), рр. 1119- 1131; Стидгієвп, Е. єї а. (2004) АМА 10 (9), рр. 1479-1487; Єеріп5кКі, у. еї а. (2001) ВМА 7 (10), рр. 1486-1495). Очищення ІМТ-МРНК виконували за допомогою набору МЕСАсіваг Кії (Атріоп/ те
Тесппоодієх, Юагтеїайді, Сегтапу) відповідно до інструкцій. Концентрацію і якість ІМТ-РНК оцінювали за допомогою спектрофотометрії й аналізували на біоаналізаторі 2100 Віоапаїугег (Адііїепі Тесппоіодієз, Запіа Сіага, СА, ОА).
Приклад 27: Мікроскопічний аналіз Т-клітин, переспрямованих на клітини-мішені, секретуючі
СІ ОМ б-специфічний Бі-зсЕм 1ВІМАВ
Порядок проведення аналізу по суті був таким, як описано в прикладі 2.а.
Як лінії клітин-мішеней використовували субклон клітинної лінії тератокарциноми яєчників
РА-1 (АТОС СВІ -1572), яка ендогенно експресує високі рівні людського СІ ОМб. Людські цитотоксичні Т-клітини відокремлювали, використовуючи МАС5, від РВМС, виділених зі свіжовідібраної крові, за допомогою набору Рап Т Сеї ІзоЇїайоп Кії, питап (Міпепуї Віоїес,
Тейегому, Сеппапу) відповідно до інструкцій виробника.
Клітини-мішені РА-1 - які тестували звичайним способом відносно експресії ТАА за допомогою ЕАСсСзЗ-аналізу перед кожним аналізом - двічі промивали крижаним середовищем Х-
Мімо 15 (ГОМ2А, Вазеї, Зм/йї7епапа) і ресуспендували до щільності 2 х 107 клітин/мл. 250 мкл клітинної суспензії переносили в попередньо охолоджені 0,4 см кювети Сепе Риїізег/Місгориїзег
Зо Сименез (Віо-Кай, Огеївісі, Сегтапу) і додавали 20 мкг/мл ІМТ-МРНК. Умови електропоратора
ВТХ ЕСМ 830 (Нагмага аррагаїи»5, Ноїїїсїоп, МА, ОА) були наступні: 200 В, довжина імпульсу 12 мс, 2 імпульси, інтервал між імпульсами 400 мс. Використовували наступні ІМТ-МРНК: бКНИ»5, бКНИиУ, по. 25 (для докладної інформації дивися таблиці 9 ї 10). Трансфіковані клітини-мішені підраховували й доводили до 1 х 105 клітин на мл. 1 х 105 клітин-мішеней засівали в кожну лунку б-лункового планшета, і людські цитотоксичні Т-клітини додавали відповідно до співвідношення
Е:Т, яке дорівнює 5:1. Кінцевий обсяг кожної лунки склав 2 мл. Контрольні зразки містили тільки трансфіковані клітини мішені для підтвердження лікувальних властивостей після електропорації й контрольні трансфіковані Бі-5сЕм клітини-мішені з ефекторними клітинами. Як позитивні контролі відповідні СІ ОМ б-специфічні біли бКНОБ5 і б6КНИЗ Бі-єсЕм готовили в концентрації 50 мкг/мл. Таким чином, використовували неопрацьовані клітини РА-1 з людськими Т-клітинами.
Потім тканинні культуральні планшети інкубували при 37 "С, 595 СО». Значні ефекти з погляду утворення Т-клітинних кластерів на клітинах-мішенях, формування імунологічного синапса й загибелі клітин-мішеней у зразках, що містять трансфіковані БКНИ5 і 6КНИЗ клітини-мішені, спостерігали через 24 год і записували за допомогою інвертаційного мікроскопа Мікоп Есіірзе
Тт5100 (Мікоп, Чдарап). Як показано на фігурі 32, утворення кластерів Т-клітин або лізису клітин- мішеней не спостерігалося в контрольному зразку з по. 25 трансфікованими клітинами- мішенями, що свідчить про строгу залежність від експресії ТАА для індукції активації Т-клітин.
Імітуючий контроль без бБі-5:сЕм також показує відсутність утворення кластерів Т-клітин.
Контрольні білки навпаки приводять до утворення кластерів Т-клітин і лізису клітин-мішеней.
Приклад 28: Активація Т-клітин, індукованих кандидатами бКНИО5 і бКНИЗ бБі-5сЕм, що направлено впливають на СІ ОМб
Для детекції активації Т-клітин і визначення відмінностей в ефективності двох варіантів
СІ ОМ б-специфічних Бі-5сЕм, виконували аналіз активації Т-клітин на основі ЕАС5. Маркер ранньої активації СОб6О і маркер пізньої активації СО25 були вибрані для фарбування антитілами, кон'югованими із флуоресцентною міткою. Для детекції людських Т-клітин у суміші клітин-мішеней і Т-клітин їх фарбували СОЗ, який експресується всіма Т-клітинами.
Клітини-мішені й ефекторні клітини готовили, як описано вище (приклад 27). Коротко, клітини-мішені РА-1, які ендогенно експресують СІ ОМб, трансфікували шляхом електропорації 20 мкг/мл наступних ІМТ-МРНК: бКНИ5, бКНИЗ і по. 25. Як контроль специфічності бо використовували по.25, що направлено впливає на неекспресований ТАА, як імітуючий контроль використовували неопрацьовані клітини-мішені Як позитивний контроль використовували 50 нг/мл білка БКНИ5. Крім того, Т-клітини засівали без клітин-мішеней з білком бКНИ5 або без нього як референсні вихідні активації. Кожний зразок засівали у двох повторностях в б-лункові планшети й інкубували при 37 "С, 5 95 СО». Через 24 год і 48 год Т- клітини збирали шляхом зішкрябування й переносили в 5 мл пробірки із круглим дном (ВО
Еаїсоп, НеїдеІрегу, Сеппапу). Клітини центрифугували й промивали ОРВ5. Для фарбування клітин використовували мишачі антилюдські СОЗ-ЕІТС, мишачі антилюдські СО69-АРС і мишачі антилюдські СО25-РЕ (усі антитіла ВО Віозсіепсе5, Неїдеїрегод, Сегтапу). Клітинні осади ресуспендували в 50 мкл РАС5-буфера (ОРВ5, доповнений 595 ЕВ5) що містить антитіла, коньюговані з флуоресцентними мітками, і 2 мкл 7-ААО (ВО Віозсієпсев, НеїдеЇрего, Септапу).
Після інкубації протягом 20 хв. при 4"С в умовах темряви зразки промивали 4 мл ОРВЗ і клітинні осади ресуспендували в 200 мкл РЕАС5-буфера. Зразки зберігали на льоду в умовах темряви протягом вимірювання за допомогою проточного цитометра Расзсапіо Ії (обидва від фірми ВО
Віозсіепсе5, НеїдеІрегу, Сзеппапу). Результати оцінювали за допомогою програмного забезпечення РіІом/о зоїмаге (Тгее 5іаг, Зап Сапо5, СА, ОБА).
Як показано на фігурі 33 А і В, обидва варіанта привели до активації Т-клітин, тоді як жоден з негативних контролів не показав значної експресії маркерів СО69 і СО25 Т-клітинної активації.
Загальна активація Т-клітин у відповідь на ЄКНИЗ була в 1,53 разу вища через 24 год (А) і в 1,35 разу вище через 48 год (В) спільної інкубації, у порівнянні з відповіддю на б6КНИ5. На підставі цих виявлень усі наступні дослідження виконували тільки з варіантом БКНИЗ.
Приклад 29: Залежна від концентрації активація Т-клітин шляхом спільної інкубації із трансфікованими бКНИЗ клітинами-мішенями
Для визначення найнижчої концентрації ІМТ-МРНК 6КНИЗ, необхідної для індукції залежної від мішені активації Т-клітин, ряд розведень у діапазоні 0,2-20 мкг/мл ІМТ-МРНК трансфікували в клітини-мішені РА-1. Щоб усі зразки піддалися однаковому рівню стресу викликаного електропорацією РНК, трансфікували ІМТ-МРНК у загальній концентрації 20 мкг/мл. Мо.25 - що направлено впливає на неекспресований ТАА - використовували як наповнення ІМТ-МРНК.
Відповідно, 0 мкг/мл бКНИиИЗ корелює з 20 мкг/мл по.25. Електропорацію виконували, як описано в прикладі 27. Людські Т-клітини використовували як ефекторні клітини. Виділення з РВМС
Зо виконували відповідно до інструкцій виробника (Рап Т СеїЇ Ізоїайоп Кі Ії, Мінепуї, Тетегому,
Септапу). Ефекторні клітини й клітини-мішені змішували в співвідношенні 5:1. Неопрацьовані клітини-мішені з Т-клітинами служили як імітуючий контроль. Потім Т-клітини засівали без клітин-мішеней з білюоом бКНИиИ5 або без нього як референсні вихідні активації. Як позитивний контроль неопрацьовані клітини-мішені змішували з Т-клітинами й 50 нг/мл білка БКНИ5. Усі зразки готовили у двох повторностях в б-лункових планшетах.
Клітини-мішені й ефекторні клітини спільно інкубували протягом 48 год при 37"С, 595 СО».
Зразки готовили для аналізу методом проточної цитометрії, як описано в прикладі 28.
На фігурі 34 нанесений процентний вміст СО З-позитивних Т-клітин, які експресують маркери активації. Активації Т-клітин не спостерігалося в контролях. Початок значної активації
Т-клітин детектували при концентрації 0,7 мкг/мл ІМТ-МРНК бКНИиИЗ. Ефекти у відповідь на 2,0 мкг/мл ЇІМТ-МРНК 6КНИЗ були порівнянні з ефектами, опосередкованими 50 нг/мл контрольного білка БКНИ». Таким чином, трансляція білка й секреція із трансфікованого ІМТ-МРНК, очевидно, є ефективним процесом.
Приклад 30: Визначення ЄСзо для БЕНОЗ
Для визначення половини максимальної ефективної дози рі--сЕм, що кодує бКНИЗ ІМТ-
МРНК, ряд титрувань бКНИЗ тестували в іп мійго аналізі на цитотоксичність на основі люциферази. Клітини РА-1, які стабільно експресують люциферазу, тимчасово трансфікували шляхом електропорації, як описано в прикладі 27. Використовувані концентрації ІМТ-МмРНК б6АНОИЗ знаходились в діапазоні 0,004-13,3 мкг/мл в б6-східчастих розведеннях. Загальна концентрацію ІМТ-МРНК була постійною й склала 13,3 мкг/мл, по. 25 використовували як наповнення ІМТ-МРНК. Як контролі мінімального лізису (піп) усі зразки трансфікованих клітин- мішеней засівали без ефекторних клітин. За допомогою цієї процедури початково загиблі клітини кожного індивідуального зразка електропорації віднімають і одержують тільки ефекти лізису, опосередкованого Т-клітинами.
Трансфіковані клітини-мішені засівали з людськими Т-клітинами в співвідношенні ефектора до мішені, рівному 5:1, у трьох повторностях в 96-лунковому форматі й інкубували при 37"С, 595
СО. Максимальний лізис (І лах) для нормалізації до показників спонтанної люмінесценції досягався шляхом додавання Гийоп Х-100 у контрольні лунки, що містять ефекторні клітини й неопрацьовані клітини-мішені, безпосередньо перед додаванням люциферина. Після бо додавання розчину люциферина - у кожну лунку 50 мкл водяного розчину, що містить 1 мг/мл люциферина (ВО Мопоїіднії, ВО Віозсієпсе5, НеїдеІрегу, Сеппапу) і 50 мМ НЕРЕ5 - люмінесценцію вимірювали на мікропланшетному рідері Іпїпйе М200 Тесап через 24 год і 48 год. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою: 95 специфічного лізису -
П -(люмінесценція тестований зразок - Ї тах) / (І піп тестований зразок - Ї тах)) х 100.
На фігурі 35 показана крива залежності від концентрації специфічного лізису клітин-мішеней у відповідь на БКНИЗ. З використанням рівняння Сгарпрай Ргізт для розрахунків величин ЄСво «Іод(агоніст) проти відповіді - варіабельний нахил» виявили ЕСбзо (24 год) - 548,0 нг/мл, і ЄСво (48 год) - 194,5 нг/мл. Результат цього аналізу залежить значною мірою від сили людських Т- клітин, яка змінюється відповідно до імунного статусу донора, як описано також в інших джерелах (дивися, наприклад, (І шШегриєзе, К. еї а. (2010) Ргос. Май). Асай. 5сі О.5.А. 107 (28), рр. 12605-12610).
Приклад 31: Проліферація Т-клітин у відповідь на трансфекцію ІМТ-МРНК бКНОЗ
Проліферація Т-клітин є ознакою активації Т-клітин. Для демонстрації специфічної проліферації Т-клітин у відповідь на Бі-5сЕм, що кодує ІМТ-МРНК 1ВіМАВ, у присутності СІ ОМ 6- позитивних клітин-мішеней, використовували аналіз методом проточної цитометрії. Коротко, 1 х 107 людських Т-клітин, виділених, як описано в прикладі 16, фарбували 1 мкм карбоксифлуоресцеїну діацетату сукцинімідилового складного ефіру (Сеїйгасе СЕЗЕ,
Іпмігодеп// їе Тесппоіодіез СтрН, Септапу), розчиненого в ОРВ5, в умовах темряви за кімнатної температури протягом 5 хв. Клітини промивали двічі ОРВ5 /595 ЕС5 і ресуспендували в аналітичному середовищі до 2 х 105 клітин на мл. Як клітини-мішені були вибрані клітини РА-1, які ендогенно експресують СІОМб і - для тестування специфічності - СІ ОМ б-негативна клітинна лінія раку молочної залози МОА-МВ-231. 20 мкг/мл ІМТ-МРНК 6КНИЗ або нетаргетний контроль використовували для електропорації. Електропорацію РА-1 виконували, як описано в прикладі 27. Електропорацію МОА-МВ-231 виконували з використанням наступних умов: 400 В, тривалість імпульсу З мс, 1 імпульс, інтервал між імпульсами 400 мс в 0,4 см кюветах Сепе
Риїзег/Місториїзег Симейнез (Віо-Кай, агеївісп, Ссептапу). Аналіз на цитотоксичність, описаний у прикладі 27, проводили із трансфікованими клітинами-мішенями й людськими СЕЗЕ-міченими
Т-клітинами як ефекторними клітинами. Як негативні контролі використовували тільки Т-клітини й нетрансфіковані або контрольні трансфіковані клітини-мішені плюс Т-клітини. Як позитивний контроль служили тільки Т-клітини, стимульовані 5 мкг/мл ОКТЗ (Віо Х СеїЇ, М/е5і І ерапоп, МН,
О5А) і 2 мкг/мл анти-СО28 (ВіоіІєдепа, теїЇї, Септапу). Білок ЄРНОЗ у концентрації 5 нг/мл наносили на нетрансфіковані клітини-мішені плюс Т-клітини для підтвердження валідності аналізу. Зразки, об'єднані з нетаргетним білюом 1ВіІМАВ, включали як контроль специфічності.
Усі зразки готовили в трьох повторностях у загальному обсязі 0,2 мл аналітичного середовища в 96-лункових планшетах. Через 72 год спільної інкубації Т-клітини збирали, переносили в 5 мл пробірки із круглим дном, промивали й фарбували при 4"С протягом 30 хв. 2 мкл анти-СО45-
АРС для диференціації людських Т-клітин від пухлинних клітин, і 0,25 мкл еРішог50б6 (ВО
Віозсіепсе5, НеїдеІрегд, Сеппапу) для контрастного фарбування загиблих клітин в 200 мкл
ОРВ5. Після відмивання ЮОРВО клітини ресуспендували в БАС5-буфері й аналізували за допомогою ЕАСзСанпіо ІІ (ВО Віозсіеєпсез, НеїдеІрегд, Септапу).
Проліферацію Т-клітин детектували за зменшенням СЕ5Е-сигналу тільки в присутності
СІ ОМб-позитивних клітин-мішеней і анти-СІ ЮОМб-специфічного рі-5:сЕм (дивися також фігуру 36).
Крім позитивного контролю, проліферацію Т-клітин, яка складала 49-6195, можна було спостерігати в присутності СОМ б-позитивних клітин-мішеней у комбінації з білюм ЄРНИЗ.
Таргетні позитивні клітини, трансфіковані БРНОЗ ІМТ-МРНК, привели до 6295 ж/- 295. Т-клітини, інкубовані з СІ ОМ б-негативними клітинами-мішенями МОА-МВ-231, не показали значної проліферації в будь-яких умовах, а також Т-клітини без клітин-мішеней, за винятком позитивного контролю.
Приклад 32: Кількісний аналіз продукції білка після трансфекції ІМТ-МРНК 6РНИЗ клітин ссавця
Для дослідження трансляції РНК у білок у клітинах ссавця як системи експресії вибирали клітинну лінію ВНК21 (АТСС СВІ -13001). 2 х 10" клітин ВНК на мл трансфікували шляхом електропорації, як описано в прикладі 16, з тією відмінністю, що всі стадії проводили за кімнатної температури. 250 мкл клітинної суспензії переносили в 0,4 см кювети Сепе
Риїзег/Місториїзег Сименез (Віо-Кай, агеівісп, Сегтапу) і додавали 40 мкг/мл по.25 ІМТ-МРНК,
ІМТ-МРНК 6РНИЗ або ІмМТ-реплікон РНК 6РНИЗ. Електропорацію виконували з використанням наступних умов: 300 В, тривалість імпульсу 16 мс, 1 імпульс, інтервал між імпульсами 400 мс.
Електропоровані клітини ресуспендували в культуральному середовищі за кімнатної температури (КРМІ1640, 10 95 ЕС5) і переносили в 15 см культуральні чашки. Через 5 год після бо засівання середовище, що містить ЕС5, заміняли середовищем, що не містить ЕС5. Для прикладів 32 а й Б через 18 год після електропорації окремо збирали супернатант клітинної культури й клітини. Клітинні осади лізували в 1 х 05 буфері для зразка (номер за каталогом
МРОООЗ8; І Те т есппоїодієх5, Оаптвіасдії, сепгтапу) і нагрівали при 72 "С протягом 15 хв. Для аналізу
ЕІЗА використовували неконцентрований і приблизно 50-кратно концентрований супернатант.
Концентрування проводили за допомогою центрифужних фільтрів Атісоп ийга-15 (Мегск
МіПіроге, ВіПегіса, МА, ОА) відповідно до протоколу виробника. Для прикладу 32 с (тільки ІМТ-
МРАК) супернатант збирали через 48 год після трансфекції й піддавали 40-кратному концентруванню, як описано вище. а. ЕГІЗА з використанням супернатанта
Для аналізу ЕГІЗА планшети, покриті нікелем (Тпегпто Різпег Зсіепійіс, Вопп, Септапу) використовували для захоплення аналіта через його Ніз-мітку. Спочатку планшет промивали три рази 200 мкл промивного буфера (0,01 95 ПГмуееп-20 в їх РВ5) на лунку. Як стандарт очищений білок ЄРНИЗ розводили в 1,75 95 Ма-казеїн в 1 х РВЗ (7 розріджувач). Ряд розведень змінювався від 2,34 до 150 нг/мл із кроком в 2. 100 мкл на стандартне розведення переносили в лунки в трьох повторностях кожної концентрації. Відповідним чином, 100 мкл зразків переносили в трьох повторностях. Планшет герметично закривали адгезивною плівкою й інкубували при 37"С протягом 30 хвилин. Після цього планшети промивали три рази 200 мкл промивного буфера на кожну лунку. Для детекції 6РНОЗ/ЄКНИЗ використовували анти- ідіотипічне моноклональне Ідс 49, яке специфічно зв'язується з Мн-Мі СІ ОМбаб і, отже, також з бРНИЗ/бКНИЗ.4Б9 змішували з розріджувачем до кінцевої концентрації 2,5 мкг/мл. 100 мкл розчину анти-ідіотипічного антитіла переносили в кожну лунку з наступною інкубацією протягом 30 хв. при 37 "С. Потім планшет промивали З3-кратно 200 мкл промивного буфера на кожну лунку, і 100 мкл АР-кон'югованого антимишачого детекторного антитіла (даскзоп Іттипо
Везеагсі І арогайогіевз, МУеві Стоме, РА, ОБА) - у розведенні 1:500 у розріджувачі - додавали в кожну лунку з наступною інкубацією протягом 30 хв. при 37 "С. Після заключної стадії промивання (З х 200 мкл промивного буфера) у кожну лунку додавали 1,5 мг/мл субстрату РМРР у відповідному субстратному буфері (1М диетаноламін, 0,5 мМ Масі», 0,01 95 Ма-азид, рН 9,8) з наступною інкубацією протягом 30 хв. за кімнатної температури в умовах темряви. Для зупинки ферментативної реакції використовували 100 мкл ЗМ КІН на кожну лунку. Поглинання вимірювали за допомогою мікропланшетного ридера (Іпіпйе М200, Тесап, Маппедот'ї, зЗм/й7епапа). Для двохвильового аналізу 405 нм установлювали як довжину хвилі вимірювання й 492 нм як довжину хвилі порівняння. Величини поглинання розраховували шляхом вирахування довжини хвилі порівняння з довжини хвилі вимірювання.
На фігурі 37 А нанесені середні величини поглинання, включаючи стандартні відхилення.
Концентрований супернатант із клітин, трансфікованих бКНИЗ ІМТ-МРНК і ІмМТ-репліконом, викликав значний сигнал, підтверджуючи трансляцію рі-5сЕм-кодуючої ІМТ-РНК. Концентрований супернатант із ложно-трансфікованих клітин і контролю по.25 (-контр) не викликав якого-небудь сигналу, як очікувалося. Фактичні концентрації білка не можуть бути припущені через токсичність конструкцій ІМТ-МмМРНК і ІМТ-реплікона, які відрізняються, і х-кратних концентратів, які незначно відрізняються. Визначена приблизна концентрація білка в неконцентрованому супернатанті знаходилась в межах 1,4 нг/мл для зразків ІМТ-реплікона й 5,9 нг/мл для зразків
ІМТ-мМмРНК. р. Вестерн-блот аналіз супернатанта й клітинних лізатів (зразків ІМТ-ТЕМА і ІМТ-реплікона)
Для аналізу методом Вестерн-блотинга концентровані супернатанти й клітинні лізати розділяли на МИРАСЕ Момех 4-12 95 Вів-їгів (звів (Іпийтодеп/ їе Тесппоїодіеєз СтрН, Раптвгіасії,
Септапу). Навантажували супернатант і клітинний лізат клітин ВНК21, трансфікованих ІМТт-
МРНК 6бКНИиЗ, ІМТ-репліконом РНК, ІМТ-МРНК по.25 або неопрацьованих клітин і позитивного контролю - 0,1 мкг очищеного білка бКНИЗ.Вестерн-блот-аналіз виконували за допомогою стандартних процедур (Сигтепі Ргоїосої5 іп Ргоївіп 5сіепсе, 2012). Коротко, після блотинга білків на РМОЕ-мембрані й блокування за допомогою РВ5Т/395 сухого молока мембрану інкубували протягом 1 год при 4 "С з первинним антитілом Апіі-НІ5 Ерпоре-Тад (Оіапома СтрН, Натрбиго,
Сегптапу) у розведенні 1:500 у блокувальному буфері. Після повторного промивання блокувальним буфером мембрани інкубували з Ес-специфічним вторинним козячим-анти- мишачим |до антитілом, кон'югованим з пероксидазою (Зідта Аїагіси, Сегтапу), у розведенні 110000 у блокувальному буфері протягом 1 год при 4 "С. Після повторного промивання блокувальним буфером сигнали візуалізували за допомогою Зирегзідпа! УМебі ЕРетіо
Спетіштіпезсепі Зибзігайге (Ріегсе/пепто Різпег Зсіепійіс, Косктога, І, ОА) і записували за допомогою Ітадедчапі ГА 4000 Ітадег (ЗЕ Неакрсаге Ійе Зсіепсе5, Мипісй, Сегптапу).
Сигнали б6КНИиИЗ детектували в діапазоні від 50 до 60 кДа в порівнянні з молекулярною масою бо внутрішнього стандарту.
Як показано на фігурі 37 В сигнали були детектовані в супернатантах клітин, трансфікованих по.25 ІМТ-МРНК (доріжка 1), БКНОИЗ ІМТ-МРНК (доріжка 4) і ІМТ-репліконом РНК бКНИЗ (доріжка 5), тоді як сигнал був відсутній у доріжці б -супернатант від неопрацьованих клітин. Сильні сигнали можуть бути генеровані клітинними лізатами клітин, трансфікованих ІМТ-МРНК бКНИЗ (доріжка 8) і ІМТ-репліконом РНК (доріжка 9). Клітинний лізат клітин, трансфікованих по.25, привів до дуже слабкого сигналу (доріжка 2), неопрацьовані клітини (доріжка 10) показали відсутність сигналу. Піддавався детекції очищений контрольний білок бКНИЗ (доріжка 11).
Порівняно слабкі сигнали в супернатанті й, разом з тим, слабка секреція ЄЕНОЗ можливо обумовлені відносно коротким періодом інкубації після трансфекції. Через токсичний ефект реплікона РНК більш тривалі періоди інкубації не можуть бути тестовані.
Обидва аналізи є якісними й не можуть бути використані для визначення концентрації білка. с. Вестерн-блот аналіз супернатанта (зразки ІМТ-МРНК)
Супернатант, зібраний через 48 год після трансфекції, відокремлювали за допомогою 505-
РАСЕ з наступним вестерн-блот-аналізом, як описано в прикладі 32 Б. Як показано на фігурі 27
С, по.25 ії 6КНИиИЗ, трансльований з ІМТ-МРНК ії секретований у супернатант, детектували за допомогою їх Нібз-мітки. При цьому може бути підтверджена продукція й секреція бКНИиИЗ, а також по.25, який використовували як контроль специфічності рі-5сгЕм.
Приклад 33: Детекція іп мімо трансльованого й функціонального СІ ОМ б-специфічного бі- 5СЕм білка після внутрішньом'язової ін'єкції РНК
Мишачих самок і самців лінії МЗС у віці 8-16 тижнів відбирали й розподіляли на 4 групи по 5 мишей. Кожній миші в стегновий м'яз ін'єктували 40 мкл розчину РНК. В 40 мкл розчину РНК утримувалося їх РВ5, 5 мкг Ю 2-кепованого ІМІ-МРНК бКНИиИЗ або реплікона, 2 мкг О 1- кепованого ІМТ-МРНК люциферази й 0 або 15 мкг Ю 1-кепованого ІМТ-МРНК ЕВК. ІМТ-МРНК
ЕВК, що кодує білки ЕЗІ, ВІвАК і КЗІ (ЕВК) вірусу осповакцини, спільно ін'єктгували для інгібування відповіді ІЕМ і для протидії активації РКК з метою посилення трансляції РНК (заявка на патент РСТ/ЕР2012/04673). Сигнал люциферази спостерігали через 24 год після ін'єкції
Хеподеп ІМІ5 2000 для виключення мишей без сигналу з колекції зразків.
Кров збирали через 2, 4 і 7 днів після ін'єкції. Сироватку збирали й потім заморожували при - 80 с.
Зо Аналіз на цитотоксичність
Сироватку мишей М5О аналізували в аналізі на цитотоксичність іп міго. Клітини-мішені РА-1, стабільно трандуковані люциферазою світлячка й ендогенно експресованим СІ ОМб, засівали людськими Т-клітинами (виділеними, як описано в прикладі 16) у співвідношенні Е:Т, рівному 30:11, для максимальної чутливості. Аналітичне середовище складалося із середовища КРМІ 1640, доповненого 1095 термоінактивованою ЕС5, 0,5 95 пеніциліну-стрептоміцину, 1х МЕАА і 1
ММ пірувата натрію (сірсо// Пе ТесппоІодіе5 зЗтрН, Баптвхіайді, Септапу). 20 мкл відталої тестованої сироватки додавали в кожну лунку з тестованим зразком. Лунки зі стандартним контрольним білком ЄРНИиИЗ, лунки з І піп і Ї лах наповнювали 20 мкл сироватки неопрацьованих мишей МО. Кінцевий обсяг на лунку склав 100 мкл. І піп засівали дванадцятикратно, І пах шестикратно й тестовані зразки в трьох повторностях. Через 48 год інкубації при 37 "Сі 5 95 СО» лунки І тах змішували з 10 мкл 2 95 розчину Тгтйоп Х-100 і інкубували протягом 10 хв. В усі інші лунки додавали 10 мкл аналітичного середовища. Додавали 50 мкл розчину люциферина (дивися приклад 23) і планшети вимірювали - через 30 хв. стадії інкубації при 37 "С у умовах темряви - на мікропланшетному рідері Іпбйпйе М200 (ТЕСАМ, Маппеадоїї, Змйгепапа).
Розрахунки специфічного лізису клітин-мішеней виконували, як описано в прикладі 23.
На фігурі 28 показаний відсоток специфічного лізису. Значні цитотоксичні ефекти детектували в кожній групі. Концентрація СІ ОМб-специфічного білка Бі--сЕм була значно збільшена шляхом спільної ін'єкції з ЕВК у випадку ІМТ-МРНК бКНИЗ.
Ці дані підтверджують іп мімо трансляцію бКНИЗ з ІМТ-МРНК або -реплікона й секрецію в кровоток після внутрішньом'язової ін'єкції.
Приклад 34: Генерування й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМ18.2 або СІ ОМб і СОЗ
Для подальшої розробки анти-СІ ОМ18.2 і анти-СІ ОМб6 специфічних фрагментів антитіла бі- 5СЕм були розглянуті інші аспекти для оптимізації оригінального білка. Ці аспекти в основному спрямовані на одержання препаратів з більш високою однорідністю відносно різних різновидів фолдинга, дисульфідних ізомерів і олігомерів, які можуть формуватися при рекомбінантній продукції білка. Ці модифікації не повинні впливати на функціональну активність білків Бі-5сЕм.
Заміщення додаткового (непарного) цистеїнового залишку в анти-СОЗ з'єднувальному домені Бі-зсЕм білків. 60 Для дослідження здатності непарних цистетнових залишків, що виникають у межах первинної послідовності домена Ід, перешкоджати правильному формуванню внутрішньоланцюгових і/або міжланцюгових дисульфідних зв'язків, які є важливими для належного згортання й стабільності отриманого фрагмента антитіла, було генеровано кілька синтетичних конструкцій. Такі непарні цистеїни можуть негативно впливати на ефективність, однорідність, продуктивність і стабільність кінцевого білкового продукту й, отже, повинні уникатися. На додаток до «стандартного» набору цистеїнів, залучених в утворення пар дисульфідних зв'язків, у варіабельних доменах можуть бути присутніми вільні цистеїнові залишки.
Наприклад, у домені МН антитіла ОКТЗ у положенні НУО2 присутні три залишки консервативного цистеїна перед початком СОК-НЗ і формують структурний дисульфідний зв'язок з ПоОЛОЖенням Н22. Але в цій молекулі в положенні НІО0А (СОК-НЗ) інший цистеїн (Суз) може забезпечити неправильне згортання, при якому НІООА замість НУО2 є залученим у формування дисульфідного зв'язку з Н22, генеруючи, таким чином, неправильно згорнутий, нерозчинний і нефункціональний продукт. Для подолання цього можливого неправильного спарювання цистеїнових залишків виконували сайт-спрямоване заміщення вільного цистеїна (Кірпуапом, Ргоївїп Епдіпеегіпуд 10:445-453, 1997). За допомогою цього одиночного заміщення було досягнуто значне збільшення продуктивності й стабільності 5сЕм, отриманого з ОКТЗ, при збереженні загальної з'єднувальної активності.
Домен МН анти-СОЗ антитіла ТК66 (5БО ІО МО: 36), використовуваний у даному дослідженні, містить такий вільний цистеїн у положенні НІО3 первинної послідовності, як показано в ЗЕО І МО: 36. Порівняння послідовностей домена МН анти-СОЗ антитіла ТК66 (ЗЕО ІО МО: 36) з доменом МН анти-СОЗ антитіла ОКТЗ показало гомологію послідовностей, яка складає 96,6905.
Згідно із цими результатами, заміщення вільного цистеїна сериновим залишком у межах
СОВ-НЗ домена МН анти-СОЗ антитіла ТК6б виконували для білків Бі-єсЕмМ, що направлено впливають на СОЗ (5ЕО ІЮ МО: 94) і або для СІ ОМ18.2 або СІ ОМб. Уведення таких замісників дозволило сконструювати білки Бі--сЕм 1-БІМАВ-5 (5ЕО ІЮ МО: 103) ї 6-РНОЗ-5 (5ЕО ІЮ МО: 110) (дивися таблиці 11 і 12, відповідно).
Заміщення додаткових (непарних) цистеїнових залишків в анти-СІ ОМб білках Бі-зсЕм
Зо Батьківське анти-СІ ОМб антитіло тсСі ОМбаб, варіабельні домени якого використовували для складання відповідних білків Бі--сєм бРНОЗ (ЗЕО ІО МО: 45) і 6ЄРНО5 (ЗЕО ІО МО: 43), містить непарний цистетїновий залишок у межах фланкованої області СОК-1І2 домена 12 у положенні 46 відповідної первинної послідовності. Це відповідає положенню 45 у межах 5ЕО ІЮ
МО: 23, де перша амінокислота МІ пропущена. Різні заміщення виконували для заміщення цього вільного цистеїна: - сериновим залишком аналогічно заміщенню в домені МН анти-СОЗ антитіла (ТЕ66 (5ЕО ІЮ
МО: 100); - лейциновим залишком, шляхом порівняння з амінокислотною послідовністю інших анти-
СІ ОМ антитіл (ЗЕО ІЮ МО: 97 і 98); - триптофановим залишком, шляхом порівняння амінокислотної послідовності з базою даних зародкової лінії (ЗЕО ІО МО: 99).
Оцінка довжини лінкера, порядку М-доменів і штучних сполучних дисульфідних зв'язків в анти-СІ ОМ18.2 рі-5сЕм білках
Як інший приклад Атпої еї аї. (Віоспетівігу 37:12918-12926, 1998) описує так звану заміну домена як можливе пояснення появи нековалентно зв'язаних олігомерів фрагментів 5сгЕУ.
Згідно із цією моделлю білок знаходиться в стані можливої термодинамічної рівноваги між мономерною і димерною/олігомерною формою через постійно виникаючий внітрішньо- і міжмолекулярний обмін пограничних контактів МІ Л/Н. Ці олігомери можуть уже бути присутніми у супернатанті клітинної культури й повинні бути вилучені під час процесу очищення. Однак ці молекулярні різновиди можуть також формуватися під час зберігання очищених мономерних різновидів.
На кращий енергетичний статус сильний вплив виявляє загальна конструкція (первинна послідовність, довжина лінкера, орієнтація МІЛ/Н і т.д.).
ММогп і Рінскійип (МВ 305:989-1010, 1999) указують, що форми з більш високим вмістом мономерних різновидів можуть бути отримані шляхом використання лінкера, що складається з 20 або більше залишків. У публікації Оезріапса еї аї., (Ріоївїіп Епо. 7:1027-1033, 1994) зазначено, що орієнтація варіабельного домена також може впливати на формування димерів і високомолекулярних форм. У цій же публікації Оезріапсд зазначено, що лінкер, що складається з 25 або 30 амінокислот (аа) показав краще співвідношення мономера в порівнянні з димером бо для їхнього конкретного антитіла. Відстань між С-кінцем МІ. і М-кінцем МН становить близько 39-
43 А, і відстань між С-кінцем МН і М-кінцем МІ. становить 32-34 А (РіоскІпип еї аї., Егот РСК ї0
Теппепіайоп. (). Мссанепу, Н. В. Ноодепроот, 8 0. У. Спгізууеї!, Еав.). Іп: (ІВІ. Ргезв., рр. 203-252, 1996). Для одержання аналогічних молекулярних властивостей лінкер для орієнтації МІ -МН повинен бути довшим, ніж лінкер МН-МІ.. У публікації Рінскіпип еї аї., Егот РОК 10 Тегтепіаїйоп. (У. Мессамнепу, Н. В. Ноодепроот, 5 0. У. СПгівмеїЇ, Едв.). Іп: (ІВ Ргезв., рр. 203-252, 1996) рекомендовано використання лінкерів довжиною від 15 до 20 амінокислот в орієнтації МНЛ/.. і лінкерів довжиною 20-25 амінокислот в орієнтації МІ Л/Н.
Іншою можливістю направити формування мономерів і стабілізувати взаємодію доменів
МНЛ/Ї. є конструювання пограничного дисульфідного зв'язку в пограничну область контакту між двома доменами. Уведення дисульфідного містка в положенні Н4і4-1100 (нумерація Кабраї) найчастіше використовували в 5сЕм із задовільними результатами (ВгіпКтапп еї аї., РМАЗ. 90:7538-7542, 1993; ММот апа РінсКійшип, Віоспетівігу 38: 8739-8750, 1999; М/веаїенії! еї аї.,
РЕО5. 25:321-329, 2012). Цю стратегію успішно використовували для стабілізації Ідс-подібних біспецифічних антитіл, поєднуючи 5сЕм, злитий з ЇДо повної довжини (Міспає!50оп еї а!І., МАВ: 1: 128-141, 2009; Зспапаетге еї а!., Апіітістор. Адепів. СпетоїНег. 55:2369-2378, 2011).
МуеаїНетіїї еї аі., (РЕО5 25:321-239, 2012) стабілізував людський 5сЕм (МН-((й45)4м і МІ- (с245)4 мн) з дисульфідним зв'язком між положенням МУНА4 і МІ -100. Більше того, у цій публікації освітлена проблема можливої заміни домена на 5сЕм, що не містить пограничного дисульфідного зв'язку, шляхом виконання різних експериментів ЗЕ-НРІ С при різному обсязі навантаження й концентрації. Аналізи показали різні результати залежно від умов навантаження зразка для нестабілізованого 5сСЕм, але незалежно від умов, у яких використовувалися дисульфідні стабілізовані молекули, елюйовані аналогічно мономеру. У роботі 2пао еї аї., (Іпї. У. Мої. 5сі. 12:1-11, 2011) уведена така ж мутація в 5сЕм і спостерігалася більш висока стабільність стабілізованої молекули після зберігання протягом 20 год при 37 "С.
Для біспецифічного формату з використанням 5сЕм, злитого з ЇДО повної довжини, Зспапгег еї а!., (Апіїтістор. Адепів СпетоїНег, 55:2369-2378 2011) порівнювали ефект довжини лінкера й пограничного дисульфідного зв'язку. Вони зливали батьківський 5сЕм або 5сагм (МН-(245)3-МІ) на С- або М-кінцевій частині важкого ланцюга або легких ланцюгів. Для різної довжини лінкера (20, 25 і 30 амінокислот) вони зливали батьківський 5сЕм із С-кінцевою частиною важких або
Зо легких ланцюгів. Результати, отримані з використанням різної довжини лінкера, ідентифікували аа пептид як більш переважний лінкер для одержання стабільних мономерів. Рівень агрегатів через 7 днів зберігання при 40 "С склав 50 95 для 5сЕм15, 18 95 для 5сЕм20, 8 95 для 5сЕмМ25 і 6 956 для 5сЕУ30, але дисульфід 5сЕм15, стабілізований пограничним дисульфідним зв'язком, незначно перевершував 5сЕм30. Такий же підхід був використаний Міспає!5зоп еї аї., (МАВ5. 1:128-141 2009), і вони поліпшили своє батьківське Ідб-подібне біспецифічне антитіло, що містить 5сЕм з 15 аа лінкером в орієнтації МН/Л/ (генеруючи 40 95 агрегатів), шляхом збільшення довжини лінкера до 20 аа 5сЕм і введення пограничного дисульфідного зв'язку між положенням МНає і Мі-100. Отримана молекула містила більше 9895 мономерів, які були стабільними через три місяці при 4 "С. Автори вирішили працювати над поліпшенням молекули 5СЕм перед переходом до біспецифічного формату.
У випадку анти-СІОМ18.2-специфічних білків бБі--сЕм невідомо, чи може виникати формування димерів і високомолекулярних форм і яке залучення молекул анти-клаудин і/або анти-СОЗ 5сЕм. Для оцінки всієї оптимальної молекули для анти-СЇ ОМ18.2-специфічного білка рі-зсЕм для кожного окремого зсЕм оцінювали наступні модифікації: - орієнтацію домена; - довжину лінкера; - уведення пограничного дисульфідного зв'язку; - комбінацію трьох модифікацій.
Для анти-клаудин 18.2 з'єднувального домена, додатково до варіабельних доменів,
БО отриманих з тСі 0ОМ18.2ар (МН: 5ЕО ІО МО: 8; МІ: 5ЕО ІЮ МО: 15), послідовності, отримані з тс 0ОМ18.2ар1 (МН: 5ЕО ІЮ МО: 6; МІ: 5ЕО ІЮ МО: 11), використовували для конструювання анти-СІ ОМ18.2-специфічних білків рі-зегУ.
У таблиці 11 у розділі А.а «Вихідні послідовності, дизайн 32 анти-СІ ОМ18.2-специфічних конструкцій рі-5сЕм і клонування в експресійні вектори» описані різні конструкції.
А. Генерація й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМ18.2 і СО03 а. Вихідні послідовності, дизайн 32 анти-СЇОМ18.2-специфічних конструкцій бБі-5сЕм і клонування в експресійні вектори
Конструкції біспецифічного тандемного одноланцюгового антитіла рі-5сЕм, представлені тут, 60 містять два відмінні з'єднувальні домени, з яких перший є специфічним відносно людського пухлиноасоційованого антигену (ТАА), тоді як другий є специфічним відносно є-ланцюга людського Т-клітинного рецептора (СО3). Кожний із двох з'єднувальних доменів біспецифічної молекули містить два варіабельні домени антитіла, розташованих як фрагмент 5сЕм в МН-МІ. або МІ-МН орієнтації. Варіабельні домени антитіла з'єднані за допомогою гнучкого гліцин- серинового пептидного лінкера, що складається із чотирьох або п'яти повторів субодиниць 545 залежно від орієнтації. Таким чином, фрагменти 5сЕм, розташовані в орієнтації МН-МІ,, з'єднані лінкером з 20 амінокислот (названим «І 4»), МІ-МН з'єднані лінкером з 25 амінокислот (названим «ІІ 5»). Два фрагменти 5сЕм, з іншого боку, з'єднані за допомогою довгого лінкера 50245, що складається із шести амінокислот (названого «51 »). Інформація стосовно вихідних послідовностей, що походять з моноклональних антитіл (тАВ) і організації доменів узагальнено в таблиці 11.
Варіанти 5504, 5505, 5506, 5507, 5512, 5513, 5514, 5515, 5520, 5521, 5522, 5523, 5528, 5529, 5530, 5531, 5536, 5537, 5538, 5539, 5544, 5545, 5546, 5547, 5552, 5553, 5554, 5555, 5560, 5561, 5562 і 5563 містять МН анти-СОЗ з БЕО ІО МО: 95 і МІ. анти-СОЗ з БЕО ІЮО МО: 96.
У конкретному випадку 1-БІМАВ-5 зроблене тільки заміщення вільного цистеїну на серин в
МН анти-«СОЗ (5ЕБО ІО МО: 94) у порівнянні з амінокислотною послідовністю 1-ріМАВ послідовності (ЗЕО ІЮ МО: 39). Слід зазначити, що 5ЕО ІЮ МО: 39 ще містить амінокислотну послідовність М-кінцевої сигнальної послідовності, яка опосередковує секрецію 1-рімМАВ білка бі- 5сЕм у супернатант клітинної культури при експресії в ссавця. Ця сигнальна послідовність не є частиною секретованого рекомбінантного білка, тому що розщеплюється сигнальною пептидазою у просвіті ендоплазматичного ретикулума.
Гени, що кодують конструкції Бі-5сЕм, були створені за допомогою генного синтезу Сепеагі? (бе Тесппоїюодіеє СтЬН, Багтвіайді, Септапу) з використанням програмного забезпечення
СепеОріїтігег? 5ойулаге для оптимізації використання кодонів для експресії в клітинах СНО.
Крім загального сигналу секреції, усі ДНК-конструкції містять однакову послідовність Колак і сайт рестрикції Ніпа! на 5'-кінці. На 3'-кінці сайти розпізнавання В5ім/І ї ХпоЇ додані для забезпечення гнучкого субклонування в різні експресійні вектори. Субклонування в переважний експресійний вектор рСЕР4 (1ПШе Тесппоїодіезє СтрН, Юагтвіайді, Септапу) виконували за допомогою І їе Тесппоїодіє5х з використанням сайтів рестрикції Ніпап! ї Хпої.
Таблиця 11
Короткий опис конструкцій анти-СІ ОМ18.2 рі-зсЕм
Ідент. Походж. анти- | Походж. Заміна. у Порядок домена Організація ЗЕО варіанта Сі ОоМ18.2 анти-СОЗ пол. НТОЗ (від М- до З-кінця) домена") це
І Тнбеб МО; . 5сЕм-анти-сідп18.2- | см 1 Вітабр у 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-Г І 4-МІ -51 - 554 тсодпівярт | тАЄЄ зованти солі: ІМЕН Я МОВО вв 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МН-Г І А-МІ )-
БОБ |тсідпівсарі ТАЄ зсгусантитсілів: ТовУНЛ ЕМ, 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-Г І 4-МІ -51 -
ББОЄ |тсійпівсар ТАЄ згини им вв 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МН-Г І А-МІ )- 5507 |тсідптв.2аб |ТНбб 5сЕм анти-СОЗ 8І-УН-Ш Ам. ва 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-І І 4-МІ-5І- 5512 |тсідптвларт ТНБ 5сЕМ анти-СОЗ ав(МН-АШ А-МІ. 5сЕм-анти-сідп18.2- | авз-ми-114-МІ-5І-
ББі3 |тсідпів.2арі ТАЄ всгусантисіпівої ов УМ МВ 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-І І 4-МІ-5І- 5514 |тсійптв.2аб |ТНбб 5сЕм анти-СОЗ ав(уНАШ А-М. 5сЕм-анти-сідп18.2- | авз-ми-114-МІ-5І- 5515 |тсійптв.2аб |ТНбб 5сЕм анти-СОЗ ав(уН-Ш А-МІ. 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-Г І 4-МІ -51 - 5Боо |тсідпівсарі ТАЄ зсгугантисілів: НИМ. 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МН-Г І А-МІ )- 5521 тесідп18.2ар1 тнбб6 СЕМ анти-СОЗ СІ МІ-15-УН
5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-Г І 4-МІ -51 - 5522 тесідп18.2ар тнбб6 СЕМ анти-СОЗ МІ-15-МН 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МН-Г І А-МІ )- 5523 |тсптвтар |ТНББ зсЕм анти-СОЗ ЗІ-МІ-Ш5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-І І 4-МІ-5І- 5528 ф|тсіптв-тарт |ТНББ зсЕм анти-СОЗ а5(Мі-Ш-5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | авз-ми-114-МІ-5І- 5529 |тсііптв-тарт |ТНББ зсЕм анти-СОЗ а5(МІ-Ш-5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | МН-І І 4-МІ-5І- 5530 |тсюптвтар |ТНББ зсЕм анти-СОЗ а5(Мі-Ш-5-УН во 5сЕм-анти-сідп18.2- | авз-ми-114-МІ-5І- 5531 |тсптвтар |ТНбБ зсЕм анти-СОЗ а5(МІ-Ш-5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-". 5-МН-5І - 5536 тесідп18.2ар1 тнбб6 СЕМ анти-СОЗ НА Ам. 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МІ С 5-МН)- 5537 |тсііптв-тарт |ТНОБ зсЕм анти-СОЗ ЗІ-МН-ША-М. 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-". 5-МН-5І - 5538 тесідп18.2ар тнбб6 СЕМ анти-СОЗ НА Ам. 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МІ С 5-МН)- 5539 |тсідптвлар ТНБ 5СЕМ анти-СОЗ 5І-УН- Ам. 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-7 5-МН-51І-
ЗБ |тсіптвтарт |ТНбБ зсЕм анти-СОЗ (НАШ 4-МІ. в 5сЕм-анти-сідп18.2- | а5-мі-П5-МА-51- 5515 |тсііптв-тарт |ТНББ зсЕм анти-СОЗ (НАШ 4-МІ. 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-7 5-МН-51І- 5516 |тсптвтар |ТНбБ зсЕм анти-СОЗ (НАШ 4-МІ. 5сЕм-анти-сідп18.2- | а5-мі-П5-МА-51- 5517 |тсптвтар |ТНбБ зсЕм анти-СОЗ (НАШ 4-МІ. КК 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-". 5-МН-5І - 5552 тсідп18.2арі1 тТАбб СЕМ анти-СОЗ МІ-Л5-УН "т 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МІ С 5-МН)- 5553 |тсііпівтарт |ТНББ зсЕм анти-СОЗ 5І-М-И5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-". 5-МН-5І - 5554 тесідп18.2ар тнбб6 СЕМ анти-СОЗ МІ-І5-МУН "т 5сЕм-анти-сідп18.2- | аб-(МІ С 5-МН)- 5555 |тсп!втар |ТНББ зсЕм анти-СОЗ 5І-М-И5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-7 5-МН-51І- 5560 |тсптв-тарт |ТНОБ зсЕм анти-СОЗ а5(Мі-Ш-5-УН во 5сЕм-анти-сідп18.2- | а5-мі-П5-МА-51- 5561 |тсюптвтарт |ТНББ зсЕм анти-СОЗ а5(МІі-Ш-5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | МЕ-7 5-МН-51І- 5562 |тсптвтар |ТНББ зсЕм анти-СОЗ а5(МІі-Ш-5-УН 5сЕм-анти-сідп18.2- | а5-мі-П5-МА-51- 5563 |тсптвтар |ТНОБ 5сгМ анти-СОЗ а5(МІ-Ш.5-УН 714, (б45)45 11 5; (45)5; ЗІ, ЗО
Слід зазначити, що послідовності ЗЕО ІЮО МО: з 6б по 93 ще містять амінокислотну послідовність М-кінцевої сигнальної послідовності, яка опосередковує секрецію 1-рімМАВ білка бі- 50Ем у супернатант клітинної культури при експресії в ссавця. Ця сигнальна послідовність не є частиною секретованого рекомбінантного білка, тому що розщеплюється сигнальною пептидазою у просвіті ендоплазматичного ретикулума.
Б. Одержання й очищення 32 анти-СІЇ ОМ18.2-специфічних білків Бі--єсСЕм шляхом тимчасової трансфекції
Адаптовані до росту в суспензії СНО-клітини субкультивували в безсиворотковому середовищі у зволоженій атмосфері СО»: на орбітальному струшувачі. За день до трансфекції клітини засівали в безсивороткове середовище в колби у струшувачі. У день трансфекції клітини центрифугували (5 хв. при 200 х 9) і ресуспендували у свіжому середовищі ОМЕМ
(Іпийгодеп, 41965-039) у колбах струшувача. ДНК і реагент для трансфекції додавали в клітини й обережно перемішували шляхом струшування. Після інкубації в стандартних умовах у СО2- інкубаторі клітини розбавляли безсиворотковим середовищем для росту й потім вирощували для експресії в інкубаційному струшувачі. Клітини подживлювали СНО СО Еййсіеєпігеей"М С (Іпийгодеп, А13275) відповідно до потреб у живленні. Білки рі-5сЕм збирали після того, як життєздатність клітин починала знижуватися. Конструкції антитіла очищали за допомогою Саріо
Ї сефарози. Концентрацію білків визначали шляхом вимірювання поглинання при 280 нм. с. Аналіз на цитотоксичність на основі люциферази з використанням 32 анти-СЇ ОМ18.2- специфічних білків Бі-бсЕм
Для функціонального скринінгу 32 анти-СІЇОМ18.2-специфічних білків Бі-5сЕм чотири титрування (5000, 1000, 200 ї 40 нг/мл) тестували в іп міїго аналізі на цитотоксичність на основі люциферази, як описано в прикладі 2.с.
Клітини МидсСа4, які стабільно експресують люциферазу, описані в прикладі 2.с, інкубували з людськими Т-клітинами й білками рі-5сЕм або без білка рі-5сЕм для визначення величин І піп.
Люмінесценцію життєздатних клітин вимірювали за допомогою планшетного ридера Іпбпйе
М200 Тесап через 24 год і 48 год після початку аналізу. Специфічний лізис клітин-мішеней розраховували за формулою, наведеною у прикладі 2.с.
Після виконання кількісної оцінки результатів аналізу на цитотоксичність (фігури ЗЗа, Б, сі а) на основі 5сЕм анти-СО З-з'єднувальних доменів можуть бути зроблені наступні висновки.
Найбільш ефективні анти-СІ ОМ18.2-специфічні білки Бі-5сЕм в аналізі на цитотоксичність на основі люциферази містять фрагмент анти-СОЗ в орієнтації доменів МН/Л/,, з'єднаний лінкером «1 4» із пограничним дисульфідним містком або без нього (5504, 5505, 5506, 5507, 5536, 5537, 5538, 5539, 5512, 5513, 5514, 5515, 5544, 5545, 5546, 5547; фігури 39 а й Б). Більш низька цитотоксична активність отримана для варіантів, що містять фрагмент анти-СОЗ в орієнтації доменів МІ /Л/Н з пептидним лінкером «Г5» і утримуючих пограничний дисульфідний місток (5528, 5529, 5530, 5531, 5560, 5561, 5562, 5563; Фіг. 39 а). Найнижча цитотоксична активність отримана для варіантів, що містять фрагмент анти-СОЗ в орієнтації доменів МІ /Л/Н з пептидним лінкером «5» без пограничного дисульфідного містка (5520, 5521, 5522, 5523, 5552, 5553, 5554, 5555; фіг. 39 с).
Зо В. Генерація й тестування біспецифічних з'єднувальних агентів, що направлено впливають на СІ ОМб і СОЗ а. Походження послідовностей, дизайн конструкцій Бі-5сЕм і клонування експресійного вектора
Конструкції біспецифічного тандемного одноланцюгового антитіла рі-5сЕм, представлені тут, містять два відмінні з'єднувальні домени, один з яких є специфічним відносно людського пухлиноасоційованого антигену (ТАА), і інший є специфічним відносно є-ланцюга людського Т- клітинного рецептора (СО3). Кожний із двох доменів біспецифічної молекули містить два варіабельні домени антитіла, розташованих у вигляді фрагмента 5сЕм у кожній з орієнтацій МН-
МІ. або МІ-МН. Варіабельні домени антитіла з'єднані за допомогою гнучкого гліцин-серинового пептидного лінкера. Фрагменти 5сЕм, що направлено впливають на ТАА, розташовані в орієнтації МН-МІ. і з'єднані лінкером з 15 амінокислот (названим «і І 3»), що складаються із трьох ідентичних повторів субодиниць 545. Фрагменти 5сЕм, що направлено впливають на СОЗ, також розташовані в орієнтації МН-МІ,, але з'єднані лінкером з 18 амінокислот (названим «І м1») з послідовністю (545(С25)30135. Два фрагменти 5сЕм, з іншого боку, з'єднані за допомогою довгого лінкера 5545 із шести амінокислот (названого «51»). Інформація щодо походження послідовностей з моноклональних антитіл (МАВ) і організації доменів узагальнена в таблиці 12.
Варіанти 5454, 5456, 5458, 5460, 5462 і 5464 містять для анти-СОЗ з'єднувального домена УН анти-СОЗ з БЕО ІЮ МО: 95 ії МІ. анти-СОЗ з БЕО ІЮО МО: 96. Варіанти 5454 і 5458 містять МІ. анти-
СІ ОМ з 5ЕО ІЮО МО: 98; варіанти 5457 і 5460 містять МІ анти-СІ ОМб з ЗЕО ІЮ МО: 99; варіанти 5462 і 5464 містять МІ анти-СІ ОМб з БЕО ІЮ МО: 100.
У конкретному випадку 6РНОЗ-5 (ЗЕО ІЮО МО: 101) зроблено тільки заміщення вільного цистеїну на сериновий залишок в МН анти-СОЗ (ЗЕО ІЮ МО: 94) у порівнянні з амінокислотною послідовністю 6-РНОЗ (5БО ІЮ МО: 45). Слід зазначити, що 5ЕБО ІЮ МО: 45 ще містить амінокислотну послідовність М-кінцевої сигнальної послідовності, яка опосередковує секрецію 6-РНОИ-3 білка Бі-зсЕм у супернатант клітинної культури при експресії в ссавця. Ця сигнальна послідовність не є частиною секретованого рекомбінантного білка, тому що розщеплюється сигнальною пептидазою у просвіті ендоплазматичного ретикулума. Більше того, для 6РНОЗ-51. (ЗЕО ІЮ МО: 102) зроблено заміщення вільного цистеїну на лейциновий залишок в Мі. анти-
СОМ (ЗЕО ІО МО: 97) у положенні 46 відповідної первинної послідовності в порівнянні з 60 амінокислотною послідовністю 6РНИЗ-5. Це відповідає положенню 45 у межах 5ЕО ІО МО: 23,
де перша амінокислота МІ. є пропущеною.
Гени, що кодують конструкції Бі-5сЕм, були генеровані за допомогою генного синтезу
Сепеатйе (Ше Тесппоїодіеє СтрН, Юагтвїайді Септапу) з використанням програмного забезпечення СепеОрійтілег 5оїймаге для оптимізації використання кодонів для експресії в клітинах СНО. Крім загального сигналу секреції, усі ДНК-конструкції містять однакову послідовність
Коак і сайт рестрикції Ніпа на 5'-кінці. На 3"-кінці сайти розпізнавання В5іМ/ і Хпої додані для забезпечення гнучкого субклонування в різні експресійні вектори. Субклоновані в переважний експресійний вектор РЕЕ12.4 (ГОМ2А Сгоцир Ца., Вазеї, Зм/ї27епапа) виконували за допомогою стандартних технологій з використанням сайтів рестрикції НіпаП ї В5іУМІ.
Таблиця 12
Короткий опис конструкцій анти-СІ ОМ рі-всЕм
Ідентиф.| Походж. Заміна в Походж. Заміна в Порядок доменів Організ. зЕО варіанта |анти-СІ ОМб пол. 1-46 анти-СОЗ| ПОЛ. НТоЗ (від М- до С-кінця)| доменів") о тсідпбар Тнбеб МО: - 5сЕманти-СІ ОМ 6- | МН-І 3-мі-в1І- 5сЕманти-СІ ОМ 6-| МН І ЗМІ -51 - 5сЕманти-СІ ОМ 6- | МН-І 3-мі-в1І-
Немає 5сЕманти-СО 3- Зее 6РНОИЗ іп бРНИЗ- . 5сЕманти-СО 3- Зее 6РНОИЗ іп - 5сЕманти-СО 3- Мп-м1-МІ -51І - 5458 /тсідпбар тНеБ зсЕманти-сідпб | УН-Ш 3-МІ. 5сЕманти-СО 3- Мп-м1-МІ -51І - 5460 тсідпбар тНеБ зсЕманти-сідпб | УН-Ш 3-МІ. 5сЕманти-СО 3- Мп-м1-МІ -51І - 5464 | тсідпбар тНеБ зсЕманти-сідпб | УН-Ш 3-МІ. "ІЗ, (Сбаб5)3; МІ, Са((25)3с35; і; 045
Б. Одержання й очищення 6 анти-СЇ ЮОМб-специфічних білків рі-'-сСЕМм шляхом тимчасової трансфекції
Адаптовані до росту в суспензії СНО-клітини субкультивували в безсиворотковому середовищі у зволоженій атмосфері СО» на орбітальному струшувачі. За день до трансфекції клітини засівали в безсивороткове середовище в колби струшувача. У день трансфекції клітини центрифугували (5 хв. при 200 х 9) і ресуспендували у свіжому середовищі ОМЕМ (Іпмігодеп, 41965-039) у колбах струшувача. ДНК і реагент для трансфекції додавали в клітини й обережно перемішували шляхом струшування. Після інкубації в стандартних умовах у СОг-інкубаторі клітини розбавляли безсиворотковим середовищем для росту й потім вирощували для експресії в інкубаційному струшувачі. Клітини підживлювали СНО СО Ейісіепієєв(а"М С (Іпийгодеп,
А13275) відповідно до потреб у живленні. Білки Бі-5сЕм збирали після того, як життєздатність клітин починала знижуватися. Конструкції антитіла очищали за допомогою БЕРІС з використанням Саріо ЇЇ сефарози. Концентрацію білків визначали шляхом вимірювання поглинання при 280 нм. с. Визначення ЄС50 5 анти-СІ ОМб-специфічних білків рі-зсЕм
Для визначення половини максимальної ефективної дози анти-СІ ОМб-специфічних білків бі- 5сЕм ряд титрувань білків Бі--сСЕм тестували в аналізі на цитотоксичність із використанням люциферази іп міїго, як описано в прикладі 13.
Зо Клітини РА-1, які стабільно експресують люциферазу і людські Т-клітини в співвідношенні
Е:Т, рівному 5:1, інкубували з білком Брі-5сЕм при концентрації в діапазоні від 2,5 пг/мл до 5 мкг/мл (10 кроків) або без анти-СІ ОМб-специфічних білків Бі-5СЕм для визначення величин І піп.
Три незалежні аналізи препарату людських Т-клітин виконували з різними донорами- людьми. Результати представлено на фігурі 40.
Після виконання кількісного порівняння результатів аналізу на цитотоксичність на основі заміщення цистеїнового залишку в межах фланкуючої області СОК-І2 серином, лейцином або триптофаном, і на основі положення анти-СІ ОМб і анти-СОЗ з'єднувальних доменів, можуть бути зроблені наступні висновки.
Найбільш ефективні анти-СІ ОМ б-специфічні білки рі-5сЕм в аналізі на цитотоксичність на основі люциферази містять заміщення цистеїну на триптофан для анти-СЇ ОМб з'єднувального домена в М-кінцевій частині білка Бі-5сЕРм (варіант 5456). Незначно більш низька цитотоксична активність отримана для варіантів, що містять анти-СІ ОМб у С-кінцевій частині із заміщенням цистеїну на триптофан (варіант 5460) або серин (варіант 5464). Для варіантів, що містять заміщення цистеїну на лейцин, що містять анти-СІ ОМб в М-кінцевій частині (варіант 5454) або
С-кінцевій частині (варіант 5458) білків Бі-5сЕм, більш низька цитотоксична активність обмірювана в порівнянні з попередніми варіантами. Зненацька було виявлено, що варіант, що містить заміщення цистеїну на серин з анти-СІ ОМб в М-кінцевій частині (варіант 5462) білка бі- 5СЕм мав саму низьку цитотоксичну активність.
«ЕЛ» ОБІСНТЕХ АГ та наз «Іо» БЕН ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ЄКСПРЕСУЮЧИХ КЛАДИ БАКОВИХ «вай БО ЕВРО ОО «БЕЗ БОЮ «БО» ВСТА ЕРВОІЗ,ОВО2атО «ЕЗЕз 05-35 - «ШЕ ОБ «іт» Патентва версія 3.5 «ків ії «еісв КТ «гі3з мова аріеле жетї від Уаі ТК АТа Єм5 Бі біу ів БІЖ ВбБе ді ві бек ішБ тів
Сі Ш1е дів сіє Кі Іїв Аа Аіяа ТК Су Меї ха бі тв о Бвк ТБ та ЗЕ за віп або їн Тут й йзт вто таї тв ойід чаї Ре ака тут Фів і У іен тур Ага ву Су5 чаї та ств Зак яву і» ря тв бів Єва ЯК
БІК вк а
Бі Ту бе твг ів іви бі бе рес ів МЕЖ їв» бів Аїа Уді ЗкКЗ вЕ о а ща вів в: ще Еїв Уа? Бію Іі Уаї ех бі в'я КТ Зі без їец уд дак ІЗ Бе дід ев У Суб ІТВ йКш жТе Зі Бек Меж Бів дю Кек
І Ек ІЗ вів гу5 Аів дсп МЕЖ ТВ їец тТвУ Щек СІЖ Еф МЕБї Бе ІТЕ ді ВЕ
СТУ ев ска аів Кїв Аїя бі чаї бЗвк о хаі Бе йїа дев Меж ів: тд! з38 в ЕЕ твг а5л вне тр Меї бек тнт аіа й5оа Жежє тує тВУ бі Меї бі ЗЕ жеї Уві сія тБг Уві бів ТК вата тує тТБУ ВбБе сту аід від івеБ БББ ї65 ІТ їх
Уві ші тео Уві аа бі ОіУ івб твк о бев Ів сі біб Жаї Бех Мет
ШВЕ їВБЕ ЕЕ
Суз Іїв 18 Су5 Ага Зіу ів а3а ркБ шів ств ТК Аа Тук зу Аа жі Бек тУук НТ АХа бек бію Мі бек ві йаїа тук ів РКз Бі БіЖ
Ва і Кіш вт ті іу Ба сіу пек й» ТТГ ої ух вт зує зу ІВ ши ЖЕ ше тут вв єї ої Ат ат тн бів вев бів УаІ Бій ет тукК Вк ях я Б БЕ іуз нія бар о тжг ді
Ех «ії» ЕВ «233» Моєо ам
М
Меї в'я бек йїв сту Меї Біб ТЗ гав ос1у Уа Уві іш ти бек вв ї 5 і Її взіУ тор оУаі доп зі іеш та) бек Су дів ів Рго Меї ттр іш УВІ тТВкК Аля ре ЕТе сту ахв вк ІЗ ді ді Ата вів Уді МаЗ тер ові
ЗБ о а і. ем тко Шеятє Бек Сжщв Уді уд пій Бек тйкК Бі Бін Ме бій Сух до БЕ ва іу5 Уді ТуК Ар 5ЕТ іш ів авіа іш Беб сій дю о їівв Бі вів АТа що то Ж 8 дк із сез Су ЗР БТ 813 зе5 без а! АтТа ів Ре Біє зве вх чді тук іеи аї8 01 Аїд із Су ТК отнК Сх Уві ші Бі їУ5 Бр
ЕЕ іп З ву зу ВІВ ага вх Уді іви тв бек біх ЕТе Уді Не жі тів бак бі Еї ївц те ївУХ Іїє вБго УТ Сеє ТКротвк вів Ні АїВ Ів їв ік 135 5 дк Ази ре тек аа РК ів бат! кіз жін Аїв бів і вка 15 в їі55 ко Зх ще сіу віа бек ін тк із Бі туш Віа віз ек Б'іУ ів ів свц г ви їс5 ЕХ їх бі бі Сі гемо: Суб Суз ТК Су Бтго Зек Бі Бі вк бів Ту ко Бек Ні тет Мет Зіх ат тек дек ТВ бек АТ РКО Аїя Ії чех іЕ «ОН БЕ вга біж БО ет зів тТук рт ТВг ов дбай тк жа! ж Кі ЕЕ «Ей «тії» Ново заріялае «Я х меї ія Зак Аїв з5Іу Меї сій 118 їеБ Бім ді Уа? бен: ТНК беж ех піу тевБОУВІ Ап шт зей аї хаб су АЛ ев рга Мет трі чаї тТвВг від КБе Іїе зі йха дег тів чаї ба! ата бів тд жі Тр ошіВ вІМ фев: тка Меї БЗег був Уві Уві ів Бек тк біу Зіп Меє сів сСух во КБ 5а
Еуз ЖЖ ТУК Ар ЯК іец івш Аза без Бко бів Аза фец Фів дія Аа
БЕ ув Кі ще агдовів ев Суз чаї Ї1в АТ їев ів: ві АТа іш вне бію без вх ве що вк чі тУК без ат сту Аїд ів бує ТК ТВ Сжа УВІ зів бів і ж Яр їпо і м ек і дів ака Б Уві їз ТК Бак Су ЕТе Уві РвЕе Уа! ІЗв щает
І1х ВІ не птіу МВЇ їву тт оівх тіж вто Уві Се ту тБг оАїа Ні Дів жВТ ІЇВ кп АБО Ве туг ях Вт іш Уві із 36 вата зів іч вив сф Ех
ІМ йіз цег ів тег о іви шіу Тв о Аїа вія Бек дію ів оіви ів5 г ех їс5 І ТЕ -ЗіЖ іх С1у іш Б ів Сб Св ТВ Суб Бго 5еб зі бі Бек вів шту
ВУ її іща
Бта Жек нія тУуг Мет Аїд ат тук бек ТВК бБег дата вто Ав Ті БЕК їз го за вк ші ВТБ 5 ої: тек Ва ТК ге вою тет Уді ж Кі ЕЕ «Від» я «835» Мо зарівцх
Ме бій вву бЗім тБК Оні5 тУв о вке УР ев сту їв» Ужж іешз ївев ЗвК ї Е й і ті їж Ма! тТкр Бі бів ав сіу вям С1в ств Маї бі Бі ІЇ1в о тТВЕК сів так БНО тТуж же Ві Бек Ії Бех СТу тку ту Ві тів ївеБ о тВК був ка віз тує реа Зі Бек СЮ Іїв їшц тка зів Ні йзап йб5ов вух деп ші ші СіУ йо щіцш вер вов г ух джип Еїв Біу Бек пр БВ ве ак то ТЕ сжя
Ні гаю баг бен іє бів РМа бек Сію беш сбіш бі Бек Сі тек Туг ве що з «ві Сух тук Бгто ак віє дет г ККа оБів ар вів я ВБе тет еф
ТЕХ ік ЗІЗ тут бев ваги Аїз ака зві Су Біб вяхв Сух Меж зів Ме Ба Уді Ма її5 ЕЕ їі
Бет Уві АїшЖ ти жЕТвВ УВІ Іі УЖ: АЮ ІЛ се ІЇВБ ТВ ші» ЗУ ев їжа ї5Е 4 ів св їви Жаї ТЖК ТУ ТГроБек іт Аж» АгщіУ вія і у АТ Був їч5 Ії ЗБЕ 1655 вго Уві таг ака пі Аїд іх іа зІЖ БУ дк вів ага сіб зів век 165 і КУБ із шіш вга вго Вт Река Уві Бгто АВ о БКо а5о тує ЗіБ Бк жів АКе
ЗВ ї5Е 5 іуз сіж вів Ат Аж іец Тук Бек Сі ія и й ів Ага дга її їі-5 ЕІ 5 «ОМ «вав» Штучна послідвензєть «Ех «геї» Фрагвену дктитіда. «НЕ Б іп ота ів івв сів біз ет сів Аїа ім ви МЕї Уж вто біу ва
Бет ЖЖї бу Іїв яЕК Суз зу: із тв г Сі ЕКЖІ ТБ о бйшй Берт век тек ттв Із Бій тб отаї їУуз Бій да га Бі НІЗ вію гей сів тв ІТ ів біб же ве РКО б1іу дет ші Щек тв ал тук аа Сів ів БВе
У КЕ ЩО їж: БУ Ем5 Аїа тк вне тт вала Азшв отв Бет бек Ахя ТК дів ту вк то У що вет бів із Бек бек ів тт шек 035 йор Бек вів ді тет тек Сух вів ака ТУ дев тУуК БО тт ОРЕ Аза тує тТКрозію сія ші ТВ Ов чі ТВК о жаї Бек Ай «Вів» Кк «ії» ІБ кА РЕТ «віх» Штучна послідшеність «Е2Х» Фрагюент змтитіла «ме є іп Іїа зів ім МЕЕ зів ек сіє Бус зів івш і 5 іУ5 Вгоа Бі БІВ
ТЕ УЖ ЕУє ЖїТв БЕК СУє іх Вія дек зіу Туг тВК о РБе тіж йоя тУг ів Маж вх ткв Жак ім СІЯ ад БО Сіу ев дію Без ів Тв мех зе а я віт ТКВ жів йлп ТК аа тг обі 53 Ббто те тую аїа бін бів вв їв Бі Вга ББе ід РНе бетг ів 51» тТВг БЕК Тв Зак Ті дів туК
БЕ та ук а ївеа бів жІ1в асп ав івц іх дов бім ар тат ів тк тук Ре бух ве що че «Та вгш йез йіу Ббе сі» й5п Аза Мет ар туго ттровію бів іх тв бек Уві тв Уа! бек дек 115 «ЕЕ я «іх» Штучна посяздовність аю «22» фрагюаент жутитіла
Я я сій жаї ій івш бів біп баб бік Аза вів іви АТа Ато Рез іх 1
Зжег УАї се ЕМ Зак Сея із вла его зі Тут тТБж Вбе ТВ дав отуг тУуК жІЗе ан тТгрожатї іч іп ака ТВ обі шій зії фез шів тив Іїзв їк І 5 шім ів ІЇв ту РК бі Щек шіЖж йаБЖ ТАК ту ТЕ ва шої м Ше що КЕ ЕІ іт5 СіУ гЕте5 Аід ТБ о іей Вб вла 550 іт 5еР Бек ве тт тя тек шк то 5 ЩЕ меж біз с-м Бек ек ієц ТК щек 5іЮ дев Бек Та Уві Те вБе су. дів Ака Зак тую сіЖ Аїд Рв бен тує ттрошію пів б1у ТКС ТНЖ ке
Зоо І їх тт Уві ек бек «ЕВ В «і 15 «ші ЕТ «2і5з Штучна песлідсвниз сть «ех «Б33» Фрагмент знтитіда. піп Маї БІВ ін бів бія Руз ші іа бів ва Уа?! ага Бе Бі ів ї Ж їі їх -вг МЕі гУ5 іеги бек Су іт да Бек біб Тутб РБК ре ту жЖек тує ткв ІЗ ха тк оУаї іх бій дув ко БІ Бі шт іву бів ткш о жїе
Зк ояу З сім Аа Же тук Ркє хвкт дв ШЕек ту так о йши ТК Ява шій і Бе о їх Ве їзш Ваш Бу ВІВ ЖБК іви; ТВ ХЖї Б іш БЕ Щек бек тк а3а ТУ щЕ т 5 щ ет сік Ееи БетТ ЕК РгО ТТГ ожЕК бів ав оБат АТ ТВі ту тую суб
ВЕ що я5 тнж вує Бек тв оака бі беп бек Бе дер тут ткЕрвБ Зіу сій ші те
М іще БЕЗ
ТЕ ре: п жаї Бек ву 15 «ВЕ а
«еаїе ТЕ «Баха Штучна послідовність «БЕЖ. Фрагменк вититіла «дю З іп ові іп ів зів Бів бек ші Бк бід ішц ха! іув Бгто 15 від 1 х їо іх дет УАї уз Меб ек Су іуш Аїа Бак Сію туК тБК РВЕ тБжЖ дов отуК га ЗЕ за
Уві її. Бек ТК охаї БУ іп де ТвК бів вій БТ їв) Бін ткщ тів я шо 5 3 іш жі тжу Ре шу бек ші бек тнг о тжг тТук яв зів зу Бе ща 5 яке їв Біт зує АКА ТК Бев ТК вія вхо іт Бет Бек дея ТТ вів тУк
Мет віп фен Бех бек бец ТК Бек сіє дер бшат аїа Маї Ту ВМе Су я а ЗЕ ів ага Сі Уші ів їв: Зго тя Меї дер оте тр о б5іУ Бій бію тве
ВІ ЗЕ А дек жЖАтї тк жд) беб Бак
ЩІ
«А ОБО «Ба» ЕІО «гі» вЕТ «33» Штучна послідовність «РЕД» «223» Фрагжент аититідах «де їб с-іп оУЕї нія іш бів бів Бек сту бек БІБ іш яко Бак ру ві Бак
Бек Жаї іУб5 Ем Яег сСуз іх зв о ББе дер бек сої УВІ ВВЕ бю Бне га 25 зе дів тук Щеї бет тер ЕЇв ау сів іш Бгто ші нНі5 ші РНе біш тудв
ЖЕ и 5
ІВ 61 АБИ ЕТВ івББ БТ Бег тів БІ ак тт ЕТ ТукК БЖ ШІЩЧ ре ща я 53
Бе бін зв іт ат тк іви й5и аіа йЗВ о тВК хді Зег ап ТЕ дів вк то т5 во тут сви Бі: ів аа бат іви тТвк Бак Сів ахв яву 51 тів тУк оте о ЗБ бух іа вагш оїУ Зі: Бі тУук ші За тк о рРБае Аіа Тукг ттробБія 615
Іо ща З шіу тв о бец хаї тег ожвХ бек о йїа «Ше БК «даже Щеручня леслідаане ст
ЕК
«БІЖМ Фрагмент днтмті ща «оди її вв Іі ді Меє ТБ бБія Бег Бк Хек бек бвш ТК ді ТЕТ Ата Біж 5 ку Мі Тит МеХ Жах Сух іу5 Жет бек бій 5вк ши грец веж ек
М ЗЕ
Бте Бк іт ем бе: Б ів Тег тер дів бек тв вкш іш Шеє ші жд
ЕВ; їх я
Бке я ака Бе те Зіу Бек біу ет 03 тт ав Бе тат ів отве
ЩЕ жу КЕ ще
Ії» пек бек Уві бі: АЛ бін би бе: ав Уяі Тук тек Су Я5Ії Яжт
ЩЕ а Зк ав 'тят бат тує РК рей тег бе Бі АТ іх ТБ г ує ем бів р ех
ЕЕ їі КО кух «вії ЕТ «гі» Штучна преоліддвне сть «КЕ «БІ» Фрагмент внититіла «ЯМ І шій жІТе Ві ви тег оБів Зеб бус аа ІЗш Меж бат їв дего вка Ту і 5 ії 15 -1Щ Ку чаї тик ші ТВК Суз Зег За хег Бех Зшк Уа) бек ТЕГ Жеї
НІ тев БВ боїв о5ів ух Ба Бі ТВ же Рко уз ей тр оТів о туК
Зк З 5 пет тв ех ап оі ше: віх Бк осіу жі Еко АТа вк Ве бег Є1у Зв ва 55 ва і щЩек Бі тТВт оЗек тТУкК Бек о івц тВг о жІТЕ баг овуа Меї зів аз 515
ЩЕ т ТЕ ЩЕ ва іа від тЗзгОтук тУЖ Су бік о шів йтя Бет бек Тук Бгто Ре так
ВЕ «Ех щЕ
Бе о юізу Сі Бту ТЕГ іх бе 635 ІТВ ї т «гас ій «дв КТ «їй» Штучна послІДОВНІЄТЬ «ВІЗ» фрагаент внтиті яв. «ше І ка жзв Уві меж те о бія его бів бує Бе Мет Жеж Так Хек жваві шіх ква вка жві 5ег ЖЕЇв ТПУ Су іух Аза хат БІ Аши Уві Вгя тВкК Аля
Заї аа тив тет бі Бій Зуш БК оБіу Бі бек вка із від зв5 Іїв з Я я
Тук Ешие із 5вг бе Ага Вів ТВ шу Уві Рго др ага БМе так БЖ ка 55 Бе зак шіу зЗек зіх твК о аже ре так без: Тйг ІТ бек йзял ді вій Бек
БЕ т їх щі іш дев ієв Аа йбо Тк ВВЕ Су веб бію нНтЄ ТВ йдя ТУК ВуФ Б ех ще НХ ЗЕ те Бне сіу ЗТ бі ТНт іш зів щіб тів і в
ВІН АБ
«їн 115 ч«кісх ЕТ «йі3м Штучна послідовність «ВЕ» фрагмент жмтвтіла. «ке 15 ар ІЗе уві Меє бек бік бек ре Зег бен іїц Аїя Фаї бек Уві шіх вІМ уз Уві тБу Мет ек Сех іїуз авг Бех зіп Зек іец о іви ТУк Зак зек вав бій і ус хв туК івш АТа ткшотут бів вів Ух вго шію бів
Зк ж ЗЕ
Щет Бо су івц ек ІТ Тут Ткр віз бЗетг тв АКЕ бів БЗет бБію 8
БО БЕ ва
Бкз вазор овуд бе тет шіу его бі бек ші тТВт Ав РЕ тТВТ о їевотвЕ
ЩЕ то 5 83
ІЗе Баг Бех ха) ух Аіз він вер сек АТ ді туг тТук Су Єтп Бі тут тук бек тух Ето івц тТкт св бі Ля діУ ТБ ув ів бів ев що іш 5 і уз «іх їх «КАЛ» ІЗ «гі» вЕт «ті» Штучна пОослідЯевнІшть «255» фрагмент вититіда «ре 15 вва жів чаї Мет тт Бі бек бе хек щеє беш тет чаї тіж діа вз'у ї Ж 35 І -іщЩ гу ВІ Ту ЩМЕї дак Сех іє Бек бек Бій 5 ів івц дез бат іх дав п і Ух дей Тек ін тТвК оту Тух бБіпо вів іФ вго бі іх
ЗЕ Я Зк га Бго Ем фев бе жТВ Тує тко» йій башт тБт як бів ак бі чаї ще Ка
Бко Ав ака Ре те біу бесг ші Бек СТУ Тйг йлю Ре тВг бе ТК
БЕ ТЕ я 5 їЇїша бек бак Узі бій аіш ін йо їі АЇВ Уа ту Бук Су БІБ МО 85 а ве за тшЖк Бек туК Вкш РБеЄ ТВ Бе сію 5аат шіу ТБб ів ів біб ІТЕ шо ї5 Кб ух «каша КЕ «ВЕ ТІ час» РТ
«ФІ» фрагмент жвититіда «Я: КВ вав ІЗе Уві МжЖ бек біяй бег ба бек Бак ів дія Ммаї Бех Аза іх ії 2 В ї15 ін іуз хаі ТБу Мет Бег Су зуб Зек Зек БІВ ЕК івц ін йбж Явк «а 5 ЗЕ вкащ отВвг вк вуз ап Тук ів діа тквотує тя ів іуб Вт бік ів ак Бге їу5 ев ів: жі Тут тер віз зак тв Ата бів баг ші ді
БИ ше 55
Ба Ази жк РБЕе ТБ вію Бек ші шек сію ТБ вв бе ТІ ів отак
Ж КЕ як 53.
ІТ бег бек заї зів А1в Бі Аеріжч ія жаі Тук тук Суб і БІЯ х ях 5
Зак тет й ем тег тТвг вве бі бі Бі ТВ уз івц Бі ІЗвіва 100 і Мою «піде 17 «ак І «гії» ВЕК «ТіЖе Штучна послідовність
ФЕВ
«23» Фрагмент жититіва. «Хе У тв Іа щаї Мет Бек бів Жак ге ЗекК заг ів та Уві ще ді ту пін іуб УВІ тн шЖЕї дек Сух іт Шек Бех от» Бак ім їв) Теж Ще
Фа ак КЗ
Зег АБ Бій гУуш ази Тук ів іа ТК оту бів шій іш ВТО б3Ж бів
ЗЕ о ях
За" Бго іу5 гвш о ішо Іі Ту ткш АТ бек ту ди зів бек шіж жд!
Ба 5 ОЇ
Кто лах» ага Ве ту йіу Бег Бі бек ла Бу дер о бне ту іввБ'ТВК
БЕ У Ук ЕЕ
Ії Яег бек Уді бій А1а8 бін вер ів а варю тук Вій Су ЗМ БМ вх ЕХ 55 іш тує Жвк тую Рко Тек ТВ о бБе ТУ У ЗУ ТК іс їв сів Її
ЗК їх їла ії 15 кіт ВИК «БіжЖ» Штучна послідовність
ЖЕК
«УЖ» Фрагвент антитіла. «ОЧ» ІБ вер жїв жві Метс бек біз БЕ БК Бе йет ів вія Уаї бвт чат вію
Сів ух Уді тт ЖВї Бек Суз ії бек бЗек Бій ЕК івц іеш Тут бек
Жаеат даж сів іш вий тук іш за ткф отут стіп бій ув рт Біж БіК яка я ат ВКФ ім і ек жТа тук ткв Аїа йег твг ага Біш ее бі ша ща Р 3
Кз йо ага Бе тБг о сіу Бех ші бек ТУ ТБ Ашо РБе тв ік тат
Б. Ж ЖЕ 8
ТІТїіе дет бак хУаї ух Аїв Б'є й5р іш: Аїв Уа) Тук тУк Сує Бі щі
ЩЕ 50 ВЕ
Тут Тук Бек Тух Вгз із Ту РЕ біу від т ТК їм іеу сіш ге о іх зт і тв гіч Ва «віїМ вЦх «Мізе вт «іх» Штучна послідшваність «ЕВ» Фрагеент жититіля. «Ода Юа ве Ії а! МЕЖ тб оБзів бе Був їж чек Меж бЗег Меї беє хат пу ї 5 10 І5 шіЩ Акщ Мі МК а; ТНК Су: ів вів бе бів аа мах ші тт ОотУєЄ
Уді Бек тро тут БІБ СТВ іх БКо бід ли бат РУБ тт бе їв ІТВ
ЗЕ ша. ЗЕ тут Бі їж бек дже вто ту Твт ші Жді рго ав вка бне тв овіу й ЕК вк
ЩЕат Біб бат аїа тт др яна твт рве ТВ" жТшв Бак о5ек жі іх АВ
ВЕ Ж т5 ЕЕ бів звів йіа жаї тег тут Суз бій зіп тут Тк дет тут Бкво ог ев
ВЕ щих як ту Бе ТУ АТа бі ТВг іув івБ5 1; івш іх ї8О зох чаїв т «ії» ЕТ «й» штучна послідовність «Ех «ВШ» брагшманвт шмтюті ла. «оп ге
Бін жві ші іещ бів йіяй Бек ойіу ВТО сім іє Уві іув Ру Бі 818 і 5 ії ЕХ ек МеЖ іх ЖТїв бек Сея був вія бек щі ТЕГ бек Бе тВговіж тек
ЕВ ТЕ за твх Жех дхв ткв УшЖі гу Зі Бег мі ШіУ 15 ВЕБ їец обі тКкр о І1е
З я 5 ім ем Ії йдем РІЄ тТук йбп шіу Бію ТВг Бек тк вза Бій ія БНе щік 5 ЕЕ їі ЗУ іч Аїд ТВЕ і: ТВ жів А5р іа Бек Зак бек ТБ; ЯАТа Ту
Ве ші: ів іш бек і. ТВ дек біб дв ет Аїв Уві тТук Тук сх ах ЯКЕ 5
Кіш ака зр тУг сту тУук Уаї іеБ Або тет ткрозію сій щік ВК ОТНу
Ка і М іїши тв чаї 5ВК ЖЕК «ва» 0 ч«васв кет гаї» Штучна послідявність чеше «283» фрагмент днтуті да. «ром ді
Ії УЖІ івцв тмгобія бек бу Аза ІЗв Мет ет Аїв бег то ші 15
Буш ЖІ ТИЖ жІКе тк Сух Бет Аза дет бЗжеау 5втгт уж! бек тут іев НІ5 тер вве вів їв і рив бі ТВ Зеатб Без іт фе: тро ді Тут дек
БІ за ЧЕ тт пек дв іею рю бек віх Уві Бо жів ака вБЕ дію БУ ет ЗУ ща БЕ ва
ЕК Біу ТБу Бет тТуг бек іец: ТУ ЇІїв ек дка МЕЖ Шіш АТа іш лев щЕ т тк ща
Аїа йТа тиг о Тук тук Се сі» шій йкш Бек Ії Тук Бе Бгто ТКв отих ща ЗЕ
Ббе ші бі Зі ТК ів ів сів Ії гу
ВОЖЕ 5 сві ах ««Вісв РЕТ «їх» Штучна послідовні шть
Еш» «ВаЖе Фрагшмект внтитідЕ енве лЕ вів жі ія іев шій бів бе Бі Бго ім ішч так бує го діє ав ії Е і ТЕ
ЖЕГ Мех іф5 ЕТ Зег Суб іух Віа Бак шіу теж Бек Реве ТК Бі тук
Тк Жеї йдзв тгромаї ев ій Бек Ні Біт іу5 дв ви бій теж оІТЕ 5 «ка 85 іш їеш Ії й5п РБго тТук ап С3у ЗіМ ТВ ОЕТВ Тук зи шій іув БНе -3 ВЕ ЕхЕ
Ку шіу су Аїда ТОРГ ін ТВ УВІ й5ор суб 5БЖ БЕК Зак Ту дія тук ще я ЖЕ 3
Жеїт ім фей беш Жаг фев ТВг Бек ЄТ15 ар оБает АїВ ВІ тУт Тук Су
ЕЕ що Зк
Аїта Акш ав Бук йіу Ре бі іш дев тує тк ост Бій ві тТВвкКОотнЕ їев тв За? яву яв
ЕЕ
«Тіт 5 «ВІ ОБОВ «гій ВЕТ «ЗіЖ» Штучна посліІДОВНІСТЬ чего «ЕТ» врагшент жнтитіда. «ще п
Іїве ма: бен тет сім бек то Хек Їів Мет бах та: Бек го біЖж СЕ ії х 18 1Е
Бу Ві Тит Еів тк Суз бек ха Шеєб бек бек Уві Бек Тук Меш ніх ттвр ББе вів Ста іх Бгто шіу ТВК ожхетг Бк гу ів Се Іі Тег бек
ЗЕ а ах тнг Бек Яхж іви дТа Зек шіу Уві Бк вія Ак вБЕ бек біб Акш о БіУ а Е ей
Щек йБіжЖ Тк же тук хек іе«ь ТВ Іїв Кег агя Узі їв Аїд Бім дарв еЕ дХ ТЕ 0
Аіз Аїа так тут тТукК Се Сів бів вгш Жег йди тк о бга вре тТевОТВЕ
ЩЕ 50 ВЕ
Бпе ші ЄСТУ Бі ТВ їн ів ів ІЗ ЕЕ «жі ше «шій» І «іс БЕК «Еіх» Штузмня посліудсаніютіх
КЕШ
«225» фрагвент антитіка «але 8
Сів Уві бів без бі шія Бек сію Бко бів ін Уа ії вже вію діа ї Ж ії їЕ
Шег Бе гул ЕТ ЗК Сея їуш АЖ бег ші тут Бек бе тв вію туж твгОожеє вжи тТквотаї іУ5 ів Щек Ні і 5 ав ів сів Тир ІЗ бі бебю Ії йхп Вк тУК дев біУ БІ Ів ЕТв тк вп шій зуп БНЕ іт бік ге йів тйг оїецй тт УЖІ АзБ ої уз ект Зак Бек тик АТа туж ах ЖЕ ТЕ а щеЖ біб бец фен его їв Тв дек Бі: аеро щек аз шві вне тут ух
ЗБЕ Же
Ата ага йо Ве Тк тую Уві їєю Аза тег тк Ту Бів бік твк тВЕ 0 ізЕ АК зїеш твк Ат его бек 11 «вів Ї5 «ії ЩОБ «Еі2» ЕТ «БіЖ: Штучна послідовність «ЕЕ «ФІ Фрагмент антитіла
«Ух те
ІТ УК?! Єв; тв ій Зв бго аія ІЗв Меї бе аїа бек втрошім шк ів ЕІ ТК жТв їМК Су жає вій бек бак ат Уа ау Тук Мет ні за 25 за ттр ЕнНе шій біп о іуб5 Рго ші тпгобек Бгто їу5 БЕ тгроІ1е Тек Зак
Я чЕ
ТВг бек дай івц АТа бет сіу Увї Его Аїа ака РБе Бек бі Бек 015 що 5 що
Бек бік тк бБЕт туг Бек їв ТНК ІЛ де ака Мат ід їв Біб ва ще т ТЕ що азів аів тв Бук тЖК Сх вій зів ака БЕК о тВтТ тую ва вга ткротеЕ ве за ще бе вік бі бі тк вуз іно бів Ів гу 3830 ї55 «ІЕМ 117 «23 «ВЕЖ» Фрагувнт антитіла «жа Б -ін жі Біб іекобів бій жвб ак Бе бів оівн чаї і Бга бі їв ї 5 їо 15
Бак меж Уж Етв Зак Сех ів Аїд бек бім тет Бек РБЕЄ тт о бію тує
ТТ без ази тгр ока: іч шій хек ні шіуУ у ах їев Бін тр Ії
Зк ше ак 31 ке: Ііе зп орг Тук деп сію біу бег Зв тук йшв сів ів Ббе а ке 55 їж5 ав сус вата ТВБК ін ТС Уаї Яр їжа 5вт Бек бет тк діа тег
МЕЖ бів св ів бак ієц ТВг о бек б3в вою бе їв жві тує ТК Кж як 5 Вк ів вт ев тет шіЖ тк Уді Бе хе тут тТкКв от бів віх тв отВк
ВВА 13 ЗІ
Еец тнгожеї Бек оЗег «ба ШЕ
«гій» РЕТ «ріж» Штучна послідовність «ЖЕО «стш» Фрагшеакт вктитідв «НОМ ше
Іїте УТ ви ту 5ій вк орто ві: ІТЕ ЖеЖ Бек АТа Бек ту шІж ст щ ї Ех із ІБ ку: МЕ ТК жїШвЩ5 тк сх ет йта бШек ет ат Ві дея ту ЩЕЖ НІХ тив ВБе іп бе іт роз чі ТВ о Зеє Був ух вс; бе) ті) Тук Зек
ТБт це Ап бец аів ву Бім ві БО зЗіз ага Ре Бек зі Ак о БІЖ й щЕ Б ет шту ТВ БЗет тук Бетг і-й ТНК Ії чек Ага мех ів вія ші: ЕД
БЖ У ТБ Б іа Аза Ту тут Тук Су ші бів За зап овап ТУ Рез орто тТбвотКк
ВЕ щк 5
Же ві ві зішЖ ТК гу зе БІ: їв Бу
ЗЕ ї1ох «ід» ї8 «вії ЦЕ «іс жЕх «гі» Штучна послідовні єть «Ед» «РЕЖ о фрагмевт витУті дае «ее І
Іїте ЕТ сени ту Зі Бек Бго хек ІТЕв Жеї Бек УВІ Бек ув шіж Фі ї Е і ІБ ку5 ЖЕ ТК жтв ТК Сше Бе йла бек бетїт Жву жЖяї Живу тую Мет Ні
ЖЕ Її З тиж ВБа іп ші бух р Зі ТВК дек БУЄ ух ат зі тТіш Тук бек
ЗЕ и ЗЕ тв Бек зп ів аів бек Сі Уві Ва Ата ака ВбБе бак сі дкщоБі ж о БЕ ще
Зате шіу ТвВт Бетг тек Бетг ів ТК ОІїв ЗЕеак дга Маї Аа вія БІБ ла
БЕ т т 5а іа Аза тах тет тук бух Бій бів зга Зек йхтп тук Рез рт тТКщоОтВе вк 5 ЗБ
Же іш я1ж БІШЖ ТК Був зе шт Ів ЕЕ у
БО 105
«каібе ше хіх «Та» ВВУ «га» штучна песліданіІєть «ЕОх «ФІ» фрагмент антитіла «Ооща шЗ зе Уж кни тег осів бат Рко бек Іїв'Яеж бек бак Бек та вію вт ії Е вк ІЕ їу МЕТ ТК ЕТа тк Су» БЕТ Аза ЗЕБЕ Бат ву жаї Бе тет МЕ НІВ. но ткробна бів ші їу« Ргш бі твк бек бБта ух їве ве Тів Тек Щек
ЗЕ З ЖЕ тТВт бак ап і ен АТа Бек бік Удї Бо Зі Ага ббш дак сі ка БіЖ
ЕЕ 5 я ет Бім ТК о Бет тукК бек ін ТВгт Ії бек вага хаї із Віва Біб дад
БЕ як я ЩО ее ЕХ вк яке іх ік ші тЯг і м5 ів ші Іїв се
ЗИ 25 кеїї Я «Бій» РЕТ «вах» штучна послідовнієть
КЕ
«КК ОЗ сіп чаї вій ви бів зів его бік іа Бій Єви АТа га вго ші тя ї Ж ах іх
Бшт УВІ кт ЩЕЖ явг Си і у За бек бі тує ТК РВЕ ТК деко тежюЕ за ТЕ З тв важ нія тк 'УДІ і бі Яка БКе бі Бі» БІК ів) бів тео оІЇВ зе за ще пі ТК жїв дв обко бах беу шіж тут ТВ гу Туг пи Бій зу ББЕ
Бо Б 5 іч ави гу в'я Б іец тіж аіа Яр їух ву Жак Бек тк віа тує 5. я ЖЕ 53
Мет Бій іви бат Бак івц ТК бек Сів ваза бек ата ді Тут Тук Су а о 9Е діва Акш тр оБівй асо туго вор УВІ тує вБе дер отук тер ші вів ошіх
Ас Ок її тв тк без тв Уа: бех ЯвЕ
ТЕ
«іме лі «дії «гій» ВЕУ «іш» Штучна песліДОВНІСТЕ «иШУТ «Т2Б» фрагмент жнтитіла. «Нм ЗІ ав Іїе вік Мет ту бів бек ро Бек ек ів бек дів Бах жа б1у і Е її ЕЕ вар Акш ВІ ТВ ЕЇв тТви Суз ака Аїа дет бій або ЖТе дкя дев тек 28 25 ва їв 5 ТОВ туго щі: бів іш то бік ку вів рт тв ів ів: ІТВ
ЗЕ че 5
Тут тук тв пек якщо ів; ів Щек Бі В) Бк: Бег яко вва бек Бі що КЕ жа щег зіш ак біу ТР йшов ТУ ТЕР ОБ еБш ТВ ЕТ ЕК бек їв сів БК я їх За спін АбшоБбе ат ТБб отв тут Су БІВ бій жіу й ТТ ви без тв ах що ве
ТВ Бе зіу іп жі ТУ іх ЖЖ Бі ІТв іх
ВІН ЗЕ
«іще ДЕ «Ії СЕ «вій ВК «БЕХ: «Каї: фрагмент жктитіла. «ее 2 іш Маї БІВ іви зів бів бЗеб ші Ббуе вів ев Уа фуб рт іх Ві ії 2 іо їх дет Мет гу ЖТБ БЖЕ Се іх Аїа ек Сіу тут Берг РВЕ ТБ шіу тує
НІ ше ее тВу жЖет ящи ткросні іш БІВ 5ЕК Ні Зі іт5 йде фев щі тов ожЕх
ЗЕ мо Е шт івг; Ів Я5йп овКОо тТук іуш Бі ВТ бек тік туг аа бій іУв ББЕ
Б ЖЕ ОЇ іуз Ар їх Та тімб вБе ті Уа? вв г Зак Зек бег ТГК АВ тут вк то 7к во мет і ша іа бек іш те ет 3» аз Бе АТЗ аї Тут ТК Сех вк ЩЕ ща іа Ат: ву ШТ туго тук Сі дою бек ар о тгЮ о тТУК РБє За Уві тгр
БЕ іх ІБ сі» аіа біу тБготБг тд тт жЖЖі бек ет 115 ЖЕО «Еіщше я «Еії» Оу «ше БТ «БіЗ» ШтучНЕ ПОСЛІДВЕНІСТЬ «таж» Фрагмент антитіла «Мк 3
ЕВ ЕТ бік Мет тб осів те тет обек дек бец Бек аТЖ Бех ів БІЖ дев кує МаАЇ ТйК ІТ Бек Сує йдеш АЗа жет Бій йзщ о Іїш вив ДЕ тук
Бен дав тр от бів бій іш Буш Ар Бі тн Уві ух ів ів ІТ ї5 а Я тжг туУК ТК 5ет згЕ бец мії ет ЗУ жЖаї ВК дат іу ВВЕ дек іх
ЕІ ВЕ ще
Зву бів яву Ту ТМг о дяВ ТУТ Шег сен о тВЕ Ії Бек зап ів Сію вія
БЕ о ТЕ щи ів аа о їІ1їе іа ТОГО туХ Бвш Суж 33 іп вію ЕВ ТВЕ рем овВгО тв 85 вк зе
Тв Ббе ів ПТ Бі ТНК і іє5 ЗБ ІТЕ | у ж і155 «кі За «Жії» БІВ «ій» ТЕХ «іх» Штучна пасліІдсвнішть «таж» Фрагмент антитіла «Зо» я ів УВІ ів ви бак о біц Бек сі Є3їУ вза ів хаї руш бро шію бБіу
Зак іштй іш во дег См вів іш Бек ші Ве так о рРвєЄ Жак Бек тТуж
Сі Жеї Бе тгрозаї йод ші» тет орка дБроі хв ага ев бів тер оЖат жо ш Зк іа тнт Ії БЕТ Як Тук Щек ве: тТукК ІТе ту Тук Ркш язр Бек хдї що ВЕ ЕЕ іуї іх ага БЖе ти Ії Бех йкш йо яви жа! і жа дв ТІ їєЮ тек ще «У я 50 їв сій Мет Бек Бек ів) іїуя дер Зі дяр тв віза Іїє Тут Тук Су:
ЖЕ З ЗЕ їв Акта вм ргоа іву Тук ші бет бак БК йо тує тТКв осі вів бЗ
ВЕ: зок її тТвк ТНК бен ту Маї бек бБяк «дае В кві ВК кіс РТ «ЕВОх «83» Франщент антжттла. «НТ Т5
А ІЇв СТВ ях Уді ішм ТНК шіб аб БК аТ8 ЕЕ Мет дет вів Бак ії Ж і15 ТЕ
Бко бі бів уз Маї тик Має тб Сує дек аїв бек бек бак жЖї тв тЕи Ма НІ Тур отуЄ бі ій іу5 бек ап ТБ бек Вгш і ше ве тк жо ш Зк їІТЕ ту ва ту ак іс іши АлшШ Бек СТУ Уді Ва зі вка жЕї Бех
ЕЕ. ЕЕ ВЕ -Зіш Заг шіу Зшт пту вав ее Тут бек ев ТБ жІїв бат шегє Меж 35;
БЕ т ТЕ 5 за сіб вав ві ат тк отут тук сжя жБе ій ту Бег сіу тук вгЕ ща ЗЕ
Бе тк вЛе б5іу ЕК 01іу ТВГ ої во ШТ Мет ага
ВЕ: зок «діїе ЗВ «і БАХ «ії» вит «їж» Штучна послідовність «ЕЕ «25» Ффрагвент антитіла. «тя ЗБ іїуз ів Бій Бій» хак віу аїа 515 сеБ Аз АКД РКО Зі Ав шаг ві іт Бех бек Су іч тк Бе ші тТук тВк Бе тк Ага тує тн Жеї ні тер оУаї Був зів й Бо сім пік йіу івещ бів тТев о Ііїв о шту тек
ЗЕ 3 5
Ії ах бета Зек агЕ ЗЕУ Тут ТЕК зам тук йхп Ів Уж ВМ ії уж АБ
БЕ КЕ й іуш Від ТК їв тк ТНК йщо із Бек Зв бат тк Аїд тек меж жів ту Ек ж іш Бак Бек бе ТБ оЗег сіБ АБв бек вія Уа! Бук Тук Ку вія ага 5 за 5
Тут тТуг зр дар нів тег Су ів дбав отут ткроаїу їв біу тк отвК
ЗЕ і95 15 їев так о жа3 Зак Баг 5 «іще Оу «Кі ше «гії» Штучна пюсліІдсввість
Еш Ох «2» Фрагмент жмтитіла. «ця ОО вер жів БІВ Єви тт сія бетб рга атш ІТ Меє бе аїш Бек Бк ЄТу ії Е їй ї5
Сів уз Жві тмгожмех тк оСуз Ага азів бек бат бек ві Баг туб Жах
Ж Ж а деп отквотжК шій 015 іуУє ет Оу ТВ Бек вга іує ага тв ІЗ тук зе ща я
Авр Та бет гу ха! АтТЕ ет пі баї Бк тжу ато Не Зак біу ек
Б 55 о ші Шаг Бі ту вт тжК Бех ів ТВг о ІТЕ Бак беб Меї сій Аза 15
Е та її ЩО. азв оаів вів КР о тУК тТУК ШУ бів БІК тТКр ож ЕК АБ вго іЕБ ТВ
ЩЕ ОО 5
Ба пі Від ші п 15 зе шт сет іу
Оу ї1пх кейс кейї: 55
«ії: штучна послідовність «ШЕ «ЖЕО БІіСПесеЄТчнНа ВОлЛекуна вій таї сів їіви пів сія вк зх вала ші ев жа) зба виз іх Аїа ї 5 їі хх бек Маї їУб5 ви бек Сув іш Аза Бак Сім Тук ТЖК Ве тт дет тек
Б 5 За тЕв ІЗе ЯМ ткКв о жаЗ їуб5 вів йдеш Бкєб ші біп бі їв бів тевОІЇВ ах нові 55
Бі дак дів Бук Вгоа ак дов шет тук тк дев ту йхл вій іуз Бпв о Хе я іт деп із 1 ТК іїви Те УВІ йо ія Зжт Зек дек ТК о ала стук й то УК а
Мет ій рем бет бек Бгто тТНг о Бетє бів йо ву аїа вії тет Тут ух тк оагш пек тгвоаге Зіу й» Баг Ре ар тукК тко сію Бій шіх так нях: шк ЗЕ тт обен лик Уаі бек Явт ші Б3у бік Б'у вт штТх 1 БІ блю Баг сік еЗу бі зі бат й5р тів УВІ Ме тв бій ек вро Бен 5ег їх іх вх 133 тн жві тн атТа Зі іш і УВІ ТВК Жеї бек Се феш ще дек і
Ат 5 КЕ ЕХ
ЕК їеш гц ях Бек зіу йдп сів був ав тую іо ОтВРОтуВ тут ів 185 іт їх бій ув Бга Бі бій Ркз Бгто ів ев ім ЕЕ Туб тТгв» АЇВ ет стик
ІВ 155 а вата Бі дек ші уві вго зв дк ББе о твТ обі 5ек дію Бек ЗУ так авЕ Бі о ТВК іец тек ЕТ Ше бек Ма! Бій Ата СТБ яв ів Аза ві
ТІ 235 БВ тут Тут Су іп Ал дво Тут Бек тТук го Ве ТБ о рРБа БУ дек віх
ТЕХ 3 285 ша
ТВ Еуз ви БІ ЕЇв іуб Жвк лу Біж сім біб Бек Аа Ії іх ге шЖ5 БО ЕЕ віп вів Бек ст Аїа зіцш ією Аля вк Бго зії 8 Бег Уді іїу МЕЖ що ек ЖЕ ет Суз іжб ТК бЕК Бі Тут ТВкК Бе тв дуб тб тв Ме Мі тв
Ві Есе Ів ака вто пів Бій іх бекобБівш тка жїв бі тТУК ІТЕ йзю ж ЯЗ шк І вка зег ов ту БУК о твговахй тег дБ оОЛа г Бе їі вар ів ВІВ
ЗЕ ЗІ ЗІБ ЗЕ
ТВ Еви тк тт ав іт Бек дет Бек тТВгоЯТа тукК Мет бі» ів бек
БЕЗ 250 ЖЕ
Бек їв тв бет сті Яхробе" АТш жі ТУ ту сСу5 аа Вуд о тук тТуК
В Зах ЗБ р яр ні ТК Сух іви ав отут тв ошть ій штТу тйпЕ тт о їешж о ТВК
ЗБЕ ко зв
Уві бек Зак Уді зів зі біх Бек вію Біт бат сту зіу Бет Бі ші я їТЕ ЗО
Еет ЗУ Су Уші дов Ар І1в Сів бе ТВУ ій Бек РКО Аїа ї18 Мет
ЕСЕ ЕЕ ю а ОХ
Ще іа бек го зі йЗіц ів УВІ ТВт Жеї тт Суб дз вів Бек бек я ів Я
Зек ві Бек тек Меї вза Ттр отут ЄїБ Бій У Бе Бі ту бек Ех а ЗЕ ж їз яка тр о жТе туУукК Бе так Бек бу Уві аїа Жвг о біу ті бга о тук
ЖЕ чо я Е ака Бе чек От ек біб его сік ТВгобег тут Бегоїєец тб Іїв хек
У зе Би
Зак мет Бі) вів аіб вав вів вів Вт тут ту Су БІВ Їй тка Жак ща «ЕХ ЗУ З пет век БтЗ ши тк бе сі Вів сіу ТВЖ УЗ в Тв те ік
ЗБ 55 ак кім 38 «24» БІО «ії» ВЕт «Ж» Штучна послідовність «ЕФ «ТЕЖ» Біспацевічна аолекула. «ее Од мет ші тер обет Су ІТ Іі ія: Бе бе та АТа тк атТа так ОоБІЖ ї 5 15 іх чі нт Щек шіп Уж! бій іви сів б31КБ вуз отїу аа і) їіещш Уухт Вта
Ж ше ЗВ
Бтз вІЖ АТ бат Уаі Ух ів бат Су і т5 АТїв Бак шіу тук твК о бБе
Ех Ко ЗЕ
ТВК баг тек ТК ОЕТЕ зп отга ЖЖ? був віп йка Бгто пі Біт бів ев е Я 3
Є тк ІТ СТУ без ЖЕЇв Тут Бко бек йсв бат ТуУкК тк дп Ту дав
БЕ та ТЕ ва їй ку БМе і ув Ар іч ів ТВ Ее» тт Узі вхо ге бак бек Беж щЕ ЕЕ ВЕ тв аїа тек Жеж ТЗ ем о Беє Бек Бо тк бат ії дер ет Аза хд
ЕХ їЗЖ ЗІ
Тук тук Су тт ага Бек ТТГ дк біу ЕМ бБет РЕА Аве тТук тер о шТу
ІБ ща іх -іп шу ТК так без тпх ді бек Бек ту БТУу ТУ Біу Бек біж шіу ії50 ІЗ Іо -'ю ші чек шт Ту Зі Бі Бе т азо ІЛв хзі Щежї тат бів бе вто ї45 ж ІХЕ і55
Бек ет гей тет Уді тнУ АїВ8 б1уУу зії уз мі БЖ оМмет Зег сСсуз фа їі Іо Кв
Зек Бек іп Бек ів ву да дек ші в вів і йди ТУК вв отвК 50 і5Е ЕВ тер отук БІВ шт" ж вт бів БІК БКО БО у їв» Єацотів тує ткв ї55 ща МЕ аїзд пек пк вка і» Бек бі» ші ро айв дк Бе так біу бву біу
ТЕ тії5 З
Бек жіу БП дар Рбе тну ів ТУ Ії Зву баг ді зів йів8 63» дер шь ее ЗЕ че їви діа Уаї тет тук Сея ій дБ» Ар тк бек ту реко Бе тпк Бе
ЧЕ КО ЕВ і дек Біу тат ге5 іец Сів 118 гу Зет ЗТ ТУ ші СК бат АБ
Гессе Ок В
ІТе Куб сем ШТ ій ек бі» Аа бів ів За ауд ка віх йіЖж ех я т т
Уві га Вей же Сшо гУ5 ТВ Жер дію ту тБж Рішй тп ву тую ТВ щИ 5 БЕК
Мет НІ тКрозаі го ія ака го бі Бій бі Ер бів тр же Фіу ща Іа ЗЕ з ту ІЗв вен вка Зак аг Бі тут ту ази тут де СТ ії ВВЕ Був що жа ар уз ід ТК Бе» те тв йо іже Бек беу Бек Мода) тує мет ай Зак ЖЕ -тв ен ек аг ген тнпх Бег єї др о Зек дія таї тУК тує уз АТ
Зах ЗК ЗЕ вкя тук тукК дв вро нів ТК Сех єв Аз отут тер бі бів шіж тв ж ЖУБ ЗВ тТвх ке Тк Маї бБег бег Уві і: біу БІ» 5векх йтію Зі Зак сіу вію
ЗЕ Бе. 355 я ек сік Бі 5ЗвкоБт Бі Маї дб бар І1е Бій фев тт ої ек Бга
ЩО ЧЕ вія ї1їв Меї 5ек АТїа Бвк вго шіу БІВ уз хаі ТБ Мет тії Куб ВК
Б як У ів Жет пет бат жа! бек тТуУук Меї зп ту туК БІВ пів іх бат шію а яки ща твгобБек Бтвз іУуз Ам) тТтротів туб дав о тВК пек і ке маї ія дек біх
ЗЕ ЗБЕ о
Уві Бу: тег ака РМе Зек біб хек б5іу Зек ві ТК дак тує ЕФ рве 5 ЯК ша ЗБ
ТВг ІТВ Заг Бех Мех зів зі Сів» ев йлв ів твБК о туж Туг Сеж бів ях 5. віп ткБ бак бат дав Рез їем Так оББЕ ШТ аТа БТ ТК ої уш їв 515
ВК їх ЕН їв ку ніш НіЗ МТВ НІВ М35 МІВ
Ех вк «КАЖа Я «ваше вит «Ві» Штучна послідовніІшть «ЕВО: «ВІЗ» Біспецейічна вопехула іп чаї віп ів бів бів вко шіу АТа біб вн Ууаі ага вге ТУ від ї 5 їі іх ет таї ге ів бек Суб їуш: дід бек іш Ту тв рве Тиг Беат туУх тжр жїв дян ткрожаї бе шів йкш о бто ШТ зів ту ізо Є)Їн тео ЕВ
ЗЕ З ЗЕ їі йшв Іїе тут Реб Зег ар Бег тук Тк Я5п тжг два бій і Ре р Ся ЕхІщУ їтш Вжр іже АТ ТК ви так УБІР бер ку ат беєб Бек тт вів тук
Кк то я 5
Жеї вій сви Баг бек Рез ТВг бек біб во бек Аїа Уяї Ту тжж Су ща ще Вк тт втуд бек тер оАка бів йди баг ЖБбе АБ отут ткв обі Бій б3у так що і55 ЕВ
Тв Бех ТУ тУаї бек бек Сіу віх Біу Бі ЖХвг Бі бік Бі біу б5ет ік ік бі ів Бек ажр Іїв УР МЕЖ тв БІ" Явг рго Хек бек ге тв зд ЇпК АТВ сту Бін іт: Уві ТК ОМех бву Суб і Бвк Звк Ів їж ща їВЕ ій
Щек феш іви де Бек Бі доп о шів іх ак тух ре: тт тув Ту БІВ їі ах ЕР
Єїп і Бтга зі бів рго Бгто і еф іш жІївВ'ТУЖ ТКр Овід Щек тк
ВО ії М вкдовіюш бек аіуУу жаі рго аю ака Ве тат Бі ет бі 5вб ові ТВК їж 2 як вар Не тйк рез тт Бі Звк дек Уаї сів щі шій бер іен Аїв та
ТУТ тек Сух іп лю кр тут дек тек Бе Ба тб рве Бі ет і1ф
ТВЕ г5 ів іш ЕЇВ іч Бек сіу бі ік Біу бат іх5 ів5 ші БІВ ї45 т БЕ св
Бек біт Аіж Біш ім Аїа аг РКО б1Ж АЛ БВ Уа: я ВеЄ Бек Сув іже тв дек бі тт тТвК ва тв бУВ тТук тВУ ЖЕЖ НІ та УВІ кв пів вк: Без зі сій Зі івв бів: тТекв І3е Бі тт БЇв й» ргтб Бек ага ші хук тат а туУХ дБ Бі іфЕ РМа і у йо Її ДТ ТАК 1 ец тв ТНК во ус Бек Бек Хек ТК Аіш Ту Маж бів фен беж вк г вх
ЗБ ЗО Зах твкК бак Бін Азов зек ові аї тук тек Сея Аза ак тек тук яв вар нів тук Су ви ав тУК Ттрешіїіу сій Бі ТВ ТК їн тВЖ УВІ Бег вк ВЕ Зак
Яег Бі бі Зіу Бі бек Зі бі Бі бік Беж ші бі БУ бтіу Шег зр її біп іш б бів бвг Бгто діа Щ3е Мет его аія во вка віє
ЗЕ5 зво ха зда
Єів із чаї тКт о Меї Тк Су5 Яга дія 5вт о Бет Бег Уді 5аб тут Мет я Я ІБ деп тка тук віп БІК і вк шіу ТВК бак ВКо бух вка тт тів стук
Яго шо ща а5р Тк ЗЕ і ЖЕ Чаї віж Жек Бім жа Бо Тут ага бе бек Ту баг
ЗЕ ЕІ ча -іу аг бі тк Бег ток бек фез ТВ ІЇЕ БЕЖ бек Меї БІ Аза бі дав віза віз ТБ тТУк тТук Су сів Бій тер обЗеу бек йдая Вб фев тек
Зо ат З ЗБЕ
Бе бі іш шу ТК і уб5 іш бів фев г «дІіЕМ БЕ «іш ЕТ «іЖ» Штучна послідовність
ЕЕ
«ЕЖи Біспецпечня молекула. «аж Я
Мет біу тр жав Су К1е І1і2 їв5 БЕ ів Уа віз тк АЇїВ твк обі ії КЕ ЗО 15
У Ні Бек іп ха! бів іец бів бій Бкє бі АТа бів зве УВІ АкКф
Бгто Бі'ю дід Бек ді вух ієш Хек оСуз іе5 аТа БЕК ші Тут ТВ о БвНЄ ж нов я тТвЕ Бек ту тТКрБ о ЕЇв йБв о ттв УЖі Ух бів Ак вто щі біт іх вх
В Ех Ба щі тКВ Іїв шт 5 БЕ1їЕ тТУуг КО бет ар БЕК Бук РВК оди ТУК дев -Е то ТЕ ВИ
Сі бух РЕ іш: йв іш 18 ТВГобев ТК ожаї а5в іч Кего дек Зв
ТНК АЛа тук МЕЖ 5 іез Бет бег Бе тнг обег ат дяр Беб Аза ха
КЗЗ ОБ І туг тує Сея ТБР Аг Звк туш вк зІіх ев БЗеу РО йшв ТУ тв ОшІіу
Шіпобіу тп жу івУ тк оУВі дег дет біб бтх пі щію Бек шіу БІЖ іх ЕЕ її -іж вію Жак сті СТУ бі біє бек вб5в Іїе Мді МЕ тк обі бек вка їх ша 855 зб -аК бек іви тек ові так Аза Сі Бів ге щі тк Мет ХегосСух г ух 155 їх їТЕ
Зв бек бів Яек їв» о їеш йлю Шек біУ йевобів і У вже тук бец твж ттв тує бів зіп бу» го сік сів те Бте уз ів їн тів ту ткрв дів ек пк ака біз Бек Бі Уді Буб а5р ага вна тат Бі ек сі хек обі твк йо РУ твг оїєю Так ІЗеа Бек ет мдї Бій Аїв ші: ще іїец діа Уві тТУукК ТУуг СУ бій бЕБ йзЮБ тук ак Тук Рг вБе ти ве 245 то ЖЖ
Сі Бек ші Таг іуз ів Сі І1е бує Бег аїу ОТ піт пі Бек гу «що ке У їіви БІБ шій Зек бі вів Бій ів віз атш Бк Біб АТ бек УВІ з ух
ЖЕК та «а мех дет Єшв рух ТО Хек іх тТук тк Бве тк ака тук тв веж нія ткв ха гу Стій ага Рта бі Бі Су зе ошієш тк Іів БЗіУу тук ІВ
Зх 513 ЗЕ ЗО взп рго Бек Ак Зі тук ТЕ жа тТук деп іт і У РБе і ух йзв ЕЕ 5 ЕЕ
Аа твК іє: ТВ ТВК ахр іє бек деу хат тк АЗв тує меж іп їн
Зч5 БО дег Жег їец тк баг зі бо бек ваза уді тек тк Су вів йкщотук зх 65 55 тут дав вала Ні тТук Сух5 ів: йшов тує ттрошік дія ім тв отв ів те ЖЖ бек ет яім вію бі Бі Жек ші ші іх біу Бвтг ші ЇХ
ЗЕ ха хх кА. б3у шік Зетг ар Еїе бів ге: тв обів его Бтгє йЗа жів Меї бек дід дет БтБ Бі і і ус ві тиб МеЄ ту Суз ака АТа хв дек Бек Уві ше ЗЕ 5
Шет тук Мат век тур тук бів бів іш Бек бі ТВи Жву в ї5 жо «5 чав «3 тр Іїв тек яр ті Хек іх уд Аза Бек і Маї Во Тук Ак: БВЕ ка ВЕ ЖЕО ек бі Чек іш Бех йпіу ТК бек тек бет і еш ТУ жів бат бек меж а: аж Ех з він Ата вів ар віз вів ТМ тет тут Су СТВ шій тир бак Бек дах
Бкз іек тт ББе бі ід ші ТК і зем ШТ би бе МОЖ Між НВ
БЕН БЕ кій ні Ні 5 іх «КАВУ Я
ЕЕ ЗЕ
«вії» Штучна послідсанзсть «Я він УЖі ші іен біз 5ію дег ші Бе біш ів чаї г вка шіж Аля йпек мех ге Іїв Бек сСух іс Аза бетг бі Тук бек Бе ТВж ші ТЖЕ хо де Зо
Твк жЖеї два тр Уаї іт шій щек нія Бі і уз вв ей бів тив Її
ЗЕ « «5
Сі ев Ів йхп вт тк вт аіу ту ТНК ОЕЇТе ТУ бал шій сш Бе хо БЕ во
ЕУ5 БІК ЕУ5 Атя ТК оїец те хаї яв гук вт жегк Беу ТВЖ Аза ту
Жеж бів сец о івен 5вкК оїев Твб Бек бі; вар о хвг о аїав ді ту тук Ск «їв вує вав тУг ОЗТУ Ре тві ів ов тує тк оштУу Біп бію так оте їем тВкК УВІ бек вк Бі ші Бі штуУ Кат бі ту ші бію бак обі ік бік Біу Зек вв Еів Уві іїез тт сій Заг бга Бек Іі Меї хек ча1 бек его іш Ст їУ5 Уа! ТВкК Ії ТВ Суз БЗеФт йїд ек бек обех іч І МЕ 5 чі Бек тУк Мет ні тго ше ів шій іе5 РКО Зі ТЕ Ба ккБ ЕЕ Ж 165 те їтЕ іем бух Ії Тег Зк ТВК дет ай сен вія Звк о бїу в! Рез вів вед те бек с1у ака бі Бек ім ТВК бек ту Бек вв ТК І) бег да ї95 до дк чаї вія мій іш йо іш 513 ТК о тТук Тек бух шій бію ака бек ди тУкК Вб Бгто тТкротк вне бі ші Бі Твої без біц ІТ6 іш ек сі бі вію ші бек др Т1і6 зу івц бів вів бек штУ АТа бів їв:
зіва аа ето Бі АтТа Бек За) іс Ме его Суз бе Так Бек ші тек шо шВ ФЕВ т БВЕ тпК Агя тк тик Беж НІ тТго Уві гу бів ка ра шт Стя шт ТВ ЩЕ ім Еев сів тгрОоБів зів Тут Ії ав Его ву ага Бі Тук тТнт о дяв
А шо а тут ап Бі уз Рв гУ5 а ув віза ТБ бе» ту тк аа У5 Зак
ЗАВ віх зе щ-ви дет тпу йід ту Щеї сій іев бет бек ів тБг Яек бін ов дет 355 5 Б вів жа ТУ туг Сух Вів вт тТуУг тТУК Бр аю НІВ ТУуК Се івв йжа
ВУХ В Ба тут тув 'єїУ шій бту тТвБк ТАК оівю тТвВу ша! Зет Бек Уві шів ші у
ВЕ ХО 5 ат і Є1їу швк бїу і Бек бі Бі дет біб ЄТу Уві яв дев о Т1аВ 75 І БО ій сез тик Бій бек Рг А1А Іїв Мет 5Зех аїа бек рРгОо Сіу іш Бу
ЗБЕ ЗВО: ях ОХ чаї твт жеї тат суб ага аїа Бек бегт Беб таі Зв зЗук МЕЖ дов отКВ «85 аз ЗЕ тук дів біп у Бек Бі ти Бек Его Ух га тео о жЕТВ Туг ба ОТВЕ а а 488 ет уз Уві Аїяа Зек ші Уві та ту дка РБе Бек Бі Бег Бі вк з25 ща 5 -іж тВгт Бек Тут вт о їви о тТвЖ Ії1е бег ек Же бів аїа бів й5и о Ала як я я авіа тик тУук тТужЖ сСу5 ШІВ Сів тк бег бег ян Бкз бен отв РБе сту
БЕ ЖИ жи ж іа пік лу гу ів: БМ ів
Як «ві Я «гаї» БІЗ «Від» РВТ «ТЕ» Штучна послідсаність «жо «Ії» Бзіспецедічна яслекула «ОО» Я
Мек пі тер о бву Сух Хів т1е ів Ббе бек хаі аїа твг вів твговіш ї 5 15 ІБ чаї нів Бак ін щі бів іви Сів Бій бек біб РК Біб ів) Уа Еш
Бта Біт ід Бег Ме ін Ті бек Су Бу Та Бек бі тек бек Бе тТвт БіУ тТукК ТУ Меї дев тгв о УБІ У Бій Зек нта бі іч дЕМ їв а -ь 5 іш тв жів СТУ 185 ЕТЕ Ваш БЮ Тек дал ші СТУ тТВгОжТе Ту вав
ЕЕ В т ще
Бі іжж бе бує аіу їі вів тТвКк іш ТВ Уаї ав іш Хек фек Щек щЕ За З
ТнНг вата тет Ме БІ; фей іец ек ів ТБЖ Же Бі: Яр Бек Аза ма тут тук сух від ага зв теж бі Ве Уві іч йщо тУкК ттроБіу бік 1ї5 БЕ їі сту ТБ ОТВт ів твгожа) Бек БЕК сіу бі БІ БІіу Бек СТУ оїу БІЖ іо із жщ пів Бет зі Біж Бі 1 дет ахв жІїв В! їв тк бів ет Був ЕК
Іїв ет Зетк ді ет рт Бі біш У Уві їМЕК о ЕЇв твК оС Жву Аза їБЕ ї7о Вк че Бег бек та ет тую МЕЖ НІВ Тер Бе ів ші іт БТ БІТуУ ТК
А 155 ЕК -щет Бк гу ів Су ЖЇіє тує щек тк хег дяхп ів вів Хемх шіу тд
Ії Ж тах го віш яка ба хв о1у Ага ші За бі ТК бек тУК Жак фев тве
Ізе Бет жо Уві авіа Аїв Бічц дез вів Аза ж УК тук Сью Ів БІВ дк Жек вен тут Бгто рез ттр отак Бе віє ші С1у ТК оі в бе обл -ЯЕ в ТЕ
Іїе гуз бет Бім пі ШТ біу бек й5Ю Ш1і8 іш Єв» бів шій Бек бі дів БІВ ін від ага вто Бі віз Жек Уві їх Меї Бек Св фу ТКг
ТЕ 5 ВЕ ЕЕ -вг обі Тек ТВ РЕ ТйпК Ага тук тТВК ше нія ТКВ УВІ іч Бій ак
Бо біу шій Бім ів; Бі: ттр Ії ЗУ ТУ ЕТе ащх го Бег агя Бі
ЗЕ і ЗЕ аа тут тТВг ода" ТУ дви вій іт ВБЕ іє ації АТ ТВ ів тТВКОтТВЕ 225 50 55 вар іуз Бек ет ет тик Аїя тет Мет іп ів Баг Зак і ви тк Бек а ЗЕ ЗИ зів зо бак ів Ма! тук Тук бу: віз Акш тут Тук Ажр ав НІ тТуК я зви за кує се ев тут тго зі» вію Біу ТВ" тВж івц тк о Уді Зек бек ха! вка Зак КІ зів жі БІіЖ Бек іх Шіу БЕ у біт Бі Бек бік Бі Бек біт 3 МА
За ЗЕ зо хор що ЩТе СТ іо тк жів бек бо ах Іі Ве дет дід дек вБгбв
Зах чі ЗЕ віч бів: іч ша! тТБР Мат тк Су вка Аза ау Ек Бек Уді бек тук
ЕЕ Зак «ВХ
Мет вп зв тує зів бів іує ек іх тВжЖ хек РКО із Ага тур ІТ
ЗЕ о я тЖУ йшо ТК Бек іс Уві їв дек бі Маі Вк тжкК ви ба бек 3 5 Ех ЖЕО
Заг біу бе сте тт о Шек Тег бек ев; ТБ Іїв бШет ет МЕЖ біз 815. же же ня ЗВ вів аа ві йаів тБР о тук тук Су: 615 бій ткКшоЖЕК ек ап кв ія
ЗЕ ях ВЕ тТЕК ВВЕ Єіу їв ві; ТНК іїує їв ШТШ іш іт нія Міз ВТ віє Ві
БО жа БЕ нів «ЕІ я «Віїеа ЗБ «вЕіЖе ОВЕТ «Ті» Штучна послідвантшть «ВЕ «3» біспеацзевоі чна вопекхла. «Як Я еВ Іїе їу5 іви Бій пів Шет сім за пін оіец вата ка вко б3у й 3 х за 15
Бек жі іме ЖЕБЖЕ бек Му іуш ТК Ббег бі тук ТК вве ТВ Ак о тую
ТвЕ Мек нів ткромаї ії 1 вк Бк бі вій ві Бен бі тКр же
Зх ча як сіу тек Дів вп орг Зег яхта шіу ту ТИЖ йхп о Туб Ява шій фуш вКе
Зо я Ех кт З2р і АТ ТТГ оіїец тку ТАК о Ажроіуш Зек Зег бек ТИХ Аза тук вк то ТЕ що
Мет ів сви ак бак ів) тик о Бег віє Ар Бак АТа Уді тук тук Сех 85 я вк ід Ак. ту ТЖУ йо йо ніш ТУК Се БГшм ой тек тКрошія шій щі ж 5 1 тТНЕ ТНК бен: так Уві хв хек уі ші Біб тм вк єетім вію ак щі -зіЖ Зек бі 5ТїУ Бек біу ші УВІ авв авр ЕТ СТ ів т ші вт
Бкго Аїа Ії МЕЖ бек аід жак во ві віч Ешш Уві таж Меї тк осСух їх ша ЯКЕ 1 ага віз Бек Берк бег ді Бесг ТК МЕЖ ай тТКр отже бів іп іш 5Ег їщ5 ЕІ ЖЕ іч тВкК ек ВкгОо уз те тв Іі тек Ав ТВкК Бек іуш Уві Аїд БЕК
ЕЩщО їв В сів Жаі БО тут ага Ре Бет ші Зак бі 5вет біб тк Шет Тук ек
Ееч тк жІЇв бат Бек Меї ін аїа вії: айв оаів ід ТВ тук тУкК шув шіп бій тро Бек о бвг аа во іє: тк оБНе сте АТ 1 ТВ іш ех
Ех еВ «а З іч івецс бує вт Бі Біу ші сіу Бек сів хв' зіп івв бів бБія щехк
БЕ БЕ піу Бге єї ів ба! іу5 вже сіу ія Зег меж ру Бі бег Су Еф
Рессз а жУй від Зак ії тут бвк Ре тт шіу тек тик жає ав троха? ів шій
Бек ніж Біж бує й іс бів тек о Іїв Сію беб ЕТ Ба УЮ ТУ вою шк ге ЗК -іЖ ві ТНК ЕТЕ тук а Бі іу5 Ре іш БбіЖ їе5 Від тк о іви тах ті ев гу Бвг бвт бек то дів тк Жеб Тв бе іеб деб їєею таг
ЗЕ ще І
Заг бів в5а бек зів щаї туг тут Се йід вгя вар тук СТУ Реве Уді 540 З--ї 5 їеи йо оту тТкКроаіту Зі Сію ТР отТвК ге тет баї Бах хв 1у іх зЗжЕ Ей зва сів бі бек бі б1у бі Бі Бегт Бі Бі бі ЄТь бек я5оа Іїв Уві
Ва Ів В іем тнк обіб бек вує дек тів веї бек ді бек реє бі біз ії УЖ тв ІЗТВ ТК Су Бек атЖ бвг о Зек ек Уві БВТ тт Мет НІ тТУб ВВЕ
СКУ Зб У вій ів ів Ви Оу Тв дек Ра 5 ів Су Ії тТук Бех тТвВК дек йВолоїіви аїа Бег СТУ чі го Аза Яка Бе хат сту ака бі Бек віх ні я тнК ошек тух бек без тк ІЗ бег ака Уві Аїд а'я іш вер Ата вла 5 ав а
ТвВк отут тут Су бів бій дтд Щек дей тую вка бто тер тк бе сЗу «вх Е щей ява вію шу те іт ге ства тів ік
ЗБ
«ЕІ ах «ТіЖе кіз чжшїд» ККУ «ТіхХ» Штучна посятдовніІсть
Ей «23» Бішпец)зевічзна молекуля
НШ х ме шіу тер Баг бує Хі ІЗ ів» Бне сво щі АТа тве Аа твкоблу ії 5 іо 15 чаї ніж бе АБ Ж) іс івц бів ів бег сту ала бів ів віз АКЗ
Ега ЗУ дія За та: і Маж Бек оКУє У тб Бек об1іУ тт тВК ОвВаЕ
Зк о Ея тТвВу ву: тек тв ОМех Ні тт ові ге5 іп Ако Бгто бі Бій сію бе а КЕ - ші тв Іїе Зі ТУК жІїЄ йха РКО Бек Ага зі тТУК ТВК дя тук дод
БЕ я хх ще шій і рве іт вк іс дід ТК ів ТВО БИйК дяов гул Беж Жек шек -о 5 тву аїа ту Меї біз ізо; бак Щек іш: ТК Явт б'ю йзр Бет вів Ві
Тук Тут Схже Аїа агОо тк тУуК АБор яв Ні Тег Шев Сей ар о тук тКр
Біх ів обіу тНг От їец тп Уві Зеє бек Уві Зі: бі єіу щек віх і55 ізЕ І сі вет сію пі Бек оті Бі Бек ші Біу ді вла аАще ІТ шій ех ія ї55. їде ЕВ тв бік бек Рг аіз К1в Меаї бек о АТа беговкго з'ік бій ів УЖЕ ТВЕ і 70 КУ
Ммеї ТВг оСуз ага аія Бек бек бек ді баг тук Меї дп ттротук 6135
ЕН їх ЕВ іп бух Шах щі ТР Бек Бут 15 ака отр тів туК йо ТВ шеК вух
Уа! За шву діу Уді рго тУуК вка Бба баг пі бак оші Щек ші тк га Кік ша
Зв ту дек іви ТЕ Ії бет бек Мет піч ів ЗіБ хв ад вата тв
Тук тук бро бів зів ттродек бек ав Бус івги тк вве ші ТА віх
Як ж БЕ
ТВЖ Етуб івц ЗіБ їж: губ Бек сі б'ю Бім віх Бек ші: Уві сів еф що шщ5 Ж звіт ім вк ді то бій іев Уві гу ко ді їв Бек МеЖї гу Те
ЗУБ 280 зах
Заг осСух гу аіва Зв лі Тег Хе Бе тт Бі тк те Мах дев тКр
УВІ Був віп хат ні5 Бі іуш дБ ев Бі тк оІЇВ їж ши ІЇв яю
ЩЕ 15 хіх Ви
Бк отук важ сі Оу Тв ІТЕ Тук вав бл іув РВЕ гу іх і та веж З Жак
ТВЖ ЄЕвец тнУ Уді аа і у5 Бех бек хек твт від тУуг Меж 3 їез їв ча ЗЕ ЗБ ек кв» так бек біб йяр олег вів Жді Тут тук Ку ВІ Ва ВЕБ ОТуК
ЗЕ Ос ЗБ іч бе Уві іви до Тк тТтр сіу Б'є б5іУ ТК от івш ту щаї Бех 385 Бека ВЕ Ох аз Ів жаї іви тв Бій бек бує баб Ів меж бек а? Яви вт щі ак Зі ЧЕ бів губ Уві тв жТв ТК Сже дек Аза бек ет ЕК ді Щек о тук БВЕ
НтівБ ТКЕш Бе шій БіБ г 5 Ктв сію ТВ бек Бгш гу івБ Суб Жів тк «ВЕ ну я пе тв обдек довів; дів лег бі ді Бо дів дк: Бе хг б1іхУ АК сі бвг Сі ТБ Бет тк бек іви ТВ ті) бег ага тат АТа Атя вів джи іа Аіш Тит ту ТЕ Сую сів Бі АКО ЗВТ дя тУК РМ ФКО тТКВ
«ве зо Жак ту ББе ові Зіу біу тн ів ів; Сів Іі уз Ніз НТ Мі Ні НІВ
БЕ ОВ ЕЕ
«жаїм іх «ай» вт «Оз 45
Бі іх ту зі Бвг зі ші бі Біш ще сту зі БіЖ ші БЕК ї 5 її 1 «ваш ЯЕ «Вік Зв «ЕЗЇх БВ «ЕД УЕк «Ж Я;
УВІ вів біу бі бі 015 Хек ші Сію ші Бі Бек бі сі УТ дер ї х ії5 ї5 «ві й «Еаля вЕТ
КАН
«ЕТ» лінкев «вн Я
Бек бік Бію віх йту ВЕ ї Е «іш ВКХ «Ме Ж січ ім віу оту Жак і х «Ві ще «гаї» 8 «ЕМ ВАТ «іх шШтузна поспідваність «Ех «ча ОК тді Бі: шіу піч Звг обі зі Зег ші щі Бек о біу бі Бек Зі БІу і х ї5 15 чаї вад «Ве КІ «ек 18 «ІЕМ ВТ «ЕОМ «БЕЖ» Сигнай секреції «же Кі мес бі тра Зеу Су ІТ 116 зей не ів: бат ав ТНК дТа тТвгоБтЕ і х із І5 «Баба БЕ «ВВ Ем 18 «іш ВХ «ЕВ щ «ВЕЖ» Сегнах секреції «Че БЕ
МЕЖ дев бат бі їв» бій ів Уві пе бе ві їв ТНК їв Бех БІЖ ії Ж ї15 ТЕ
Ізв Бі у «піде жЗ «рії» 48 «Ві ТЕТ «215» Штучна послІДОВНІСТЬ «Еш «БЕЖ: Сегнав секреції
«вро дя мет лав Ве ші ів» бек їев ІТ ББЕе їі) Ата їв ІТ ім ім шію
Уві вів Сув «Ва» «гі» Штучна послідовність «вЕЖе Сигняя секреті «КЕШЕе ще мет біб тер Заг тк хтів БЕ і: Бе ів івв Бе уУуді тМК о ТвВК ТУ ії 5 А ж ча НІ БЕК «Таб» ж «ват» ЕВ «віХе Штучна послідошність «ЛЕО» «Ім шегнял свкреції «Одес меж Ззіж тгріви тго йза іев ів: ББе і 25 Меї аа дів Ат бів Зв ків ів вів «ха» БИ клізм Штузна прелідовні єсть «ЕЕ Опіговуклевтия «как КЕ хЗдДсЕсІдтИ ссавеВсбох В «Еш БЕ «етйХе Штучна послідовність
«Ешще «2аЖе Олігонухлестма «ОМ 57 діцтасакох їзда с ті «піша ЕВ гії» дії «ті» ШЩунчна люесліІдевнієт «Ох «гІЯ» Бдігенухлеєтид, а КВ тпасвствою зазасватає х і кі» 55 «ЕЕ» ді «гіЖо ШтучнЕ ПОСЛІДОВНІСТЬ «ЕКО» «ВЕЖ» блігонуклестид
Фе БЖ дитсктІжес вссвосавоє ї кіз що «їдь КТ «Біда щтечна «Еш «ЖЕЖЬ Штечне внтмттяв «Ж мет ім тв о Зает Сух ІївБ тів іш БВ ЕБИ Уяі ія тн АТА ТВ бу ї 5 їх ї5
ЧЕ нія Явет отв Уві бій беа бів бів бек біх РКО Бій ів Уві ув
Бер ові вів бат ЩЕеЄ гу Ті Бет Суб гт5 Ат бак бів тт Бек Бне
ЗЕ З як тву бі тТук тт ех аква отже УВІ іуз шій Бевт Ні5 сбіу іу дЕВ се зи ВЕ БЕ іш тер жів СТУ їв; о тІ18е й Бк тб Аза біх бію тик тів Ту за
БЕ КУ 5 ва сій Ева Ве ух БІУ і5 АВ ТК без тт ба а5Ю Зуб Бек Бек бак а вх твт вія тТук МЕЖ бів інв оіеш бек бе: тик Явк зі: Ашо Хек вів фа їщ5О ше З ту тТуг СБ АТа атш дар отук С1уУ БВе Уві ге Ащо ту тТтв ші вів сі твК ТНК ев тк Уві беж бек Бі бБіу шту ТУ Бек біу сі Ту
І ІЗ А сі дек біу Зі шіу ші Жек Сів Ії8 Уві ешз ТК бів Бек ко Бак 155 зо Зх їх
ІТЕ ЖЕех Бек уУді бек вго Бі бів іт УЖі ТйК ЕТЕ ТВУ Сух бек дів дет бек бек та баг тУук Маж Мі5 тТКо ББе іп бів бу5 та ші тТВЕ
ДЕ їх БЖ
Пет Буз іч ів ів ІЇв Туж ев тВг же дян і ех аів бег біж ж
Бгто яіз вка ба бат пі вт ш1у Щек Бі ТБ Зек тую Бег іш: ТК
Ід ках «І
ІїЕ ЗшК ав Уві Аїа АТВ сів зв ала ід тму тк о тУК Се бів о шів вк Заг вх тТук Рка РЕЗ ТКр ТАК БНе сіб шт Б5ІУ ТВ ву ік і ше ВХ е5Е
ЕІТв гу Бак вію бі щі сім Бек бів Уві іп ів бів сій Бек шіЖ що ше ж вів шію бен АТа Ак РО Сі» АЛа Бек Уві іт МЕЖ ВУ Су і ув ТВК ек ші тТжу тВт ве так йта о тТук ТВ ОМеє НІ ТВ УВІ ух Біб ага жа 295 що
Вге бїжЖ ЄївВ ту ев о бів тер оті б3у тук ЕТе дою ВР бак удо шу их Зі ЗІх ВЕ туг ТНК вза тут дви зіп із Бе уз зр іт аТа ТйХ зе тек тек
ЗІ за За дер вух бек бву бег тт ів Тук Жех сів еф бек век їв ТвВкК ек сів 5 чек Аївя ді тТУкК ТУ Се дів АКгш туго тукК азр о взв НІ ТК зак хво зе
Щет Бен вар тут тв обіу шій Біу Твг такое тб чаї Хто бек шію бі ік сі БВу бі Бі щек с1у Бі1у ше сік бі вк біб ші б1у
ВЕ ЗВ ЗЕ ЯКЕ бек сів Ії Уві іш» тк вій Бек Бтє ід Еїе Меї Бек Вів ву Бе
ЗБ ях 35 іш щійш ЕФя Маі тБг Меї тт Су: акш дія бек баг бек ві Яек тук ши ях «В
Мет ди тро тут БІБ бів іт дек бік ту бек Бгто їух йга тКв ІВ 435 чав «а тут вав ТНК Бетті Уві вів бек бі» хв! Рка тег до вне бек їх чо Ек яка
Зак вів бек щіу т хау тек Жабо гшвотвуУ ЕТ Хв хаху щежї бів ад се Я я як віз ав АТ аАіяв тк о тук Ту Суб ів Бів ткр бек бек ап ко ге ях Вк
Твк БнНе пі Вів БІУу ТУ зу ів Бі г ем і ух
ОО БО
«ап» ВЕ «В3їн БОт «іш КК «ІЗ» штучна «Ж «Ва» Штечне антитіпв кана ЖЕ меж сі тгроег Су Бі ті ів: ББе сем Уа! 8та тпгоаія твуУ ЄТУ ії 5 А її чаї НІ Бек Бій За бів ік бів ів Бек зі Рто Бій іа УВ' бух
ШЕ ЖЕ 5
Бгто пі тв Бег МЕЖ їіуз5 Іі бек Сух г у5 аа бек бі Тух Бвк БйЕ 35 чо че тт БІЖ ТУЖ ТК МЕЖ Азп тт ЕІ СУБ Бій БЕ Ні з'ю 195 йзм ех ща КЕ яко бів тевоІїе шіу їв: тіє йшп ба Тут йят шт дію тк тів Тут веж в З 5 КАХ йіпт геї Бе ів бі і із ТК о бв5 так о Заї Аза у Бек шек Щек 5 я ВЕ тн Азія тую МЕЖ ЗІ; ів іви бек бе; тнг Бек З; ахВ Звг авіа жд
ЗО і З туж тУКк ств Та ак вар ТУ бі БвВе ві ів й5дотУК тТтр облу Бі да 5 іш так тик і2ги тт Фах Беє бек вію і зі зію бек Бім тю щіж іще Ех а бі« бек ші Бі Бі бі Бек 51к ІЗв щі їв тк бів Бек Бка бек
ІТ Вк ї55 їй
Ії ЖеЖї бек Уші бек Бга біу шій феш ді тв жів ТБК оСує Хек АїВ
БЕ ітЕ ЖЕ ек заг Бех Уші бек туУук меж ні тк Бфе іп ої Ух РОЗУ ТК
БО ЕЕ І
Заг Бго ів ів тго Ії Туг Бек тТйК яву ап ів вів ву бі М вка віз вата ке бак 01 вт сію бек Бі ТНК Яве Тук дет Евш теж еВ іх ки
Іїв Бек йти шЖаі Та ав бів йзвоаїш дія КК ту тУК ШУ Є3М В
ЕЕ щи 35 ай ака бек дян туУуК РКО рив о ттв твК о БНе бі Біу бі ТАК бух Кен ОТ ах ВЕ Ек
І1е ів Бек сі ТУ Бі Біб Шек бів Уві іп іш: бі шій бек Ту вЕхЗжЯ ШЕ шУ від сів іен вів ага РКО Бі вів бек Уві у МЕЖ бек Сух куб ТЕЖ
ЖЕ еЕ БЕ та ог сію тук тт Ре тк оата ТуК ТВк о МеЄ Ніз тк о Уаї із ів ака а вах ВК вка біб БІЙ БІК іще 01 тТтр Ії Сіу Ту Жів аБИ Бо Шетк ва шт щ ЗІ зі: а тТук тег дав теж Аа вій іуш Не гу асв гу йіа ТВК ів тв ОТАК
ЗЕ З ЖЕК дер іт Баг Бет Бек тнЕ вія Тек Жеї Бій бек бег бек шу т хау
З за ЖЕ ші Абю Бек АТа Уаї ТУ Тут Сех Аза ак тУуК Тук ща во ВІ ту
ЗБЕ ЗЕ ЗБЕ зву іве5 хр тт тгтО 1 ші» біжЖ ТК тт бе: тв о Маї хек бек сію
З ат ЖБО сі щі біж бетгт біж щі Ше бік Бі Бек ві ТУ ву Бі Бім шу
БЕ ЗЕ 5 ща дек вів Іїшї Уа іез тик сій дек рез Вів Хі МЕЖ Щет йіа бву БКо
Ок КУ ЕВ ші вів ік Уді РМК Мат таб КУ Акпщовів вт ек баг ді ек тук
Я ЗЕ 5 мет вав тка тт ЗІЗ ій іуш бек іх ТВ бек Биз У ага тка тів зак Я зак тут дев тп Бек і Уві Аїд Бек Зі жЖді ВКо тут дев Ве дек шію
ШЕ ЗБЕ я пет Бім бак він ТК Бек тТук Бек іви ТК Ії бек Хвет Меї бів вів ше аа Я ЗВ пій вер ав АТа тт тек Тут Куз віл о жій Ткшобеєб Бек вп бе і вх
ЗЕ 50 щи тт о Бне ші вів вів п бух ів Сів їв Еш
Б ЗЕ
ЕВ БЕ
«ВЕ БУ «зах» вВт «ЕВ «2ЕЖа Штучне антитіла «Же БЕ меї Бім тер обег Сус Ії т) іб5 ББе іец таї Та тк аід тк оту ї х ї85 15 чаї нів Бег от ді ів іем вії бів Бек зі Бгто бів іек ді гу
Бгто біЖ вішж бе МЕ І і5 Бі Звг оСув іуз Дів бек о піу Тут Бек Не
ЗЕ ож г
ТВк бі Тук ТЕТ Ще бе тур УВІ Є бій бат Вт Бі і дов ів
Ж КЕ У
-ін тквої1іє Те ех І1в йши вк тук ха бів зії Тит ІТв тТук жа ве ТЕ те ва іп іч МЕ іт жі і А ТАК бер твг Уа ЗБ у Хат дек За щХ ЗЕ тт віз тук МЕЖ ЗТ івноіец Бек Евер отвВР 5ат СТЕ яв хат дів ді
НУ 105 ЗЕ тут ту Су вів ага йлр ту шім Еба У) Геш аа тук тр БІЖ пів х Іво і85 тсіу ТАК ОТВК іви тт Уві его Бек бір вію Зі Бі Бек Бім Бі йіж ї58 ВЗ: їИ «ЗУ Бек яіу бтУ Біх БіУ бек бів Ів Уві гец тк бів Бе ке ще ї45 Ії ЕЕ і58
Іїе МЕЖ Жах ба) Зег ру ші Біб т Уві ТЕ ІТЕ тп Се Бек ав і5х 7 ДУБ.
Зеє ет бБетг жа ет тук Меї Ні тТКроБВМе вій» зів ге Бур о біу тв
ІБ ій5 5 бек Беж Еш ів Бег ЖтТв Ту Хек ТНК ат дан ів Ав Жах ші ді іх І між
Бгто їв Яко Вле бек біу йтд ші Шек бів т бак тек Беб вввотВе т зах ж
Іїв Бек вга Ма) та вів вію ази вія Аїд тик тУуК Тек Су Бій жів
ЖЕ Й Ж ШК
АкдоЗек два тут вго бо Тур отак о Вне сію Ту Зі ТК г іез ші ше БЕ Ж
Ії їх ББек Бі іх пі бі бек Бів Ущі вій беж бів Бій Жвт біх 2 ВЕ Ю ів шіш ієц ЗІв ака Рута ші вія бек Уві ія Ме Его Сух іуб ТК
ЩШет біу тек ТАК оре ТВтг Ат Тук тТвгошеє мі Те ожаї Ух ів вк
Бкс зі іп зі іі: Біб тт оті бі тТУЖ ЕЇВ ап ко бе дга ТУ
ЗЕ ій ІК ЕВ тую тТвК вав тет ав бів і РеБ іх ар ішв Аа ТИ фе тк оте
ЗЕ 355 Бк
Ар ку Звк бак Бек тк Аїв Тук ЖЕЖ сій їєю бег бек іо тк дек
За як Б ін Ази бек вата жа! тТукК тУк Су віз ака тут ук йо вд Мі тет
Зк БЕ КЕ его Бенц вва тет тпрозіу сій ші ТНК ТК фе тв Уві Бек бе СТУ ші бік ші Бет ш0іу Шію Щет бік ші бек ші ші Бек Бім ші Біх
ЗБЕ ЗВУ ЖЖ я
Бек зів діє Ушї іш» тк обів бек вгоа вія ЕІЛЕ Беж ет Ід БК ОБТО
Ок ЗІ і ші біш ів Уві тк Мат тт о Сух ака АЇВ бат в Бек Уші его тек о ак Я мет деп тв ту зів ів зу бек бі тк жек та ух ваш тгае тів
Зах дат ща тук дев оТВУ ет іх щаї Ав Бек біб ві вка тУК дата ра бек БІ
ЗЕ Б Ехо чес ші Бек зтіу ТР Бек Ту Бек іє: Те ІЗ чЗег бек меж бів: 818 зве ЯКО шт ЕХ іш дев аів від тв отук тиж Су бів Бів тКроЗек Бах АБК БО Еш я аа тв Ббе віє ата Оту тк ож ех Бім ів зїуз
Є ЖЕ
«кА» щх «аж БО «іш ВБКК
КЕН
«г» Штучне янтиттлю «ак мех лі тпрозек Су5 Ж) Іі їв ББе ви Уаї та тТйУ аАія твгобіту
А 5 З Я та ні бат сів Узі бБіп ів ші» Бі бек пі АТїз вів ім іа кв
У ЩЕ ЗЕ
Кто вію від Явг Узі іт БМеї Жек бу іт: ТБу Явк бі Тут Твк вва
ЗБ й я твк Зка тн твт мех нії Ткр жа) їу5 бів ака Вта бі шів ші ве ща 5 ЩО жін тер о жТве сіу тТук хЇів йзв Бго Зек зх йдіу тук тк Ас Тег да
ЕЕ т ТЕ о сій тя БЕ іїуз взр о їУх АТ ТВК о фе тн те ар іч Як Зек Яве ах ВЕ ке тв діа тук Мет Ох іїво; его обек ев таго5ак ої яр Жак азів а ї50 їх Ії тТук тує Су 818 зкш ТУ Тук ВВ АВ НІВ ТУК БЗет івц АшО ТуК отКВ сіу шій шРБУ ТК ТК їзво тнє УВІ бек ат Бі Бі Бі Бі Зек опію і55 Зк їх
Бім Зек Сіу пі вк біт Бі Бек Бі бін штіу бвк бів І тв ех
АчЕ АХ їх ІБ
Тве бів бах Вго АТа Ііш Мей Бет яз бет вко бі БРВ ів фі тТвЕ 15: ЕІ їЕК
Мет ТАК ось йге Аїа Бек бет бат М! бе тут МЕЇ Азв отв тк пів
ЕВ ї55 ХЕ жіп 5 бе шіу ТК о Бек Бгто іУ5 яка ту ЕТ тТУК йзв ТК Жег і 5 135 ве зах чаї Ата бек віч шві Во Тут вка Ра Жат бів Зеб бію бе іш ТЕ бет тує Жек ів тБг ж)Їе бву дек Бех ші їв ої взр вів дія тВК
ЖЕ їж 5 Я тут тує Се Біб їй тКробак дек дів Бко ївев ті Ре сту Ав о БІЖ
Б Б г
Тлвт гу ген БІВ і е: із бак Біу біу іш бін 5Зепб бїйш Уві вів г еш віп овів бег ші из Бі зе УВІ із Бгз шт Аїв ше МЕТ іш Те
Беаг уз іч ат Бек зі тжт дет шКе так шт тк тк Шек дак тКд
Я Ох МО
УЖІ Бу вій Заг ні і 195 ди ге БІВ ТО Оті ші їеи ІВ ав хх ій Зі ЗЕ
Бгто тук Ява пі бі жйт тів тУкК дбав бів і уз Ре іч іх їУ5 Аїд
ЗБЕ ЖЖ ЗЖЕ тТВгобев лтиг Уді Ав гу его Зак Бек теж ат тук МеВї ЗІМ ів ід
Ж зах ДЗЗ щек обев тп о Зек бі: ав баг одіз Уві тет ту Сук АХ Аг Аа тує
Ех ЗХ за сі ББе о Уаі їв аз тує тгрошію Вів ім ТВУ ТВ фвш ту Фаї Бе й ат Ж ек бік бі пі бі Бек Біб ші йіУ ПТУ бат бої Біу шіу щіх Бек
ЗБ 585 ВВЕ Ок сіп Іїв чаї ем о твБк бій бек о Бус Бек ті шШеї бек аі Бек рт ші сін єв кі ТУ Ії ТНК Сув Бек Вів бек бек бек ді Шеж Тек меж ніш ТКвВОБВЕ сів бів Ух Бго діб твК бек Бгто Ух Сенів: Ж1є ТК я ші 5 -етх Твг бек ша ів» о аїв бег бі жаї Бгто Аїд га Ре дет Біу вкщ
Ба Зх я сіж его піу так бет тУук бек їшш тв тів: Бек ака чаі йїа АТ ші ах Ей Я У дер в'я вія тв тек тук Су Бій бів Акд ет ах» тТук вс БК отКВ твгоБвбе сію бі пі пк і уя ев о шіз ІТв б ко ваЕ жа ща «еАЕВ ОБУ «тій» ВЕТ «ТЕЖе Штучне внититтля мет ші тко бат Су: БІТ Ті іш ББе іеш уві і ТВвК овів так ші
Уві Ні шек бів жді Бій іви сів Бі дек біу АТа іш ією із Ка
Бгто вію А1ів Бек баї ме Мей Бек Суж гу ТК дек зіу Тут ТВК БВнНа ха ЗЕ -Е тт акш о тжК ТУ Меж Ні ттр о МЖі їж ві» дед Бо біу ші» шію і вх ща щЕ 5 вЗіш ткв Ів о біу тТУК Еїе Ап ру бек вка Бін тТжг тп аще тТук 5 че я, як в біп гу БЕ іт А5о уз і ТВ обЕвБотТВу тб я5Б іш Бек Бе бак ак 5 5 тТьтг Ата тУух Ме стій бен Зет бек іех тк 5Зек Бі: Ар Бек Аза ма!
ВІ ак ЗІ тут Тук Сех вів аг: ТуУК Ту ар ар ніх ТУК Жшк ів йшЮ тет тКК іїїх ВЖЕ 5
Бі вів біу Те ТК їм тег УВІ пек бек ШІ аТу БІ Бі Бек шЗж і55 БУК Уа іх пек бі БТ» Бек зі бі Жек зіу ші бі бек осів 112 Уві ів ік ЕКО: ДЕ 55 ть лів бву Рко йта Еїе Ме дек аів бек Рг шТж бій іу5 уд ТВЕ
БЕ іх ЗУ
Меї твг Сех ака в'я бек бЗет Хек Уді бек тую Мех Аа Ттв тут ШІ ке іКЕ В біп із Бек ші ТК Бек кг і тех АК. ТК ОЕТЕ Туб айва ті Бек оіуз ї5Е ЕК ОК
Уді тв дет бі» Уві Вго оту вка Бе Бек віх Бак бБіу шек шіФ тА дЕ У Тек бек ішц ТБ діє Бе ет Бех іш тя ОТ аа АТя Аля ТАК я «5 ЖЕ Я тЕУ ТК Сх бій бів тв о Бег ек йзае Був їв так Ре зі Аів бу щ-5 255 БЕ
ТЕ гу іви Бій івО Бу бак сіу Бім Біу біу Бвтгт бїї Удаї сів ів 2 шк я шій Бі'ю бек біт рт ін ів УВІ іУ5 Бе біх аа ет МЕЖ ге ЕТЕ шУЖ ЕЕ ЖЕ бек КВ ів АТв дек лі Тег Беатє Бве теж ші Туб ТВУ МЕЖ дзи тЕв щи 25 5
УЖі тв зів бат нів Біу ії беж бе іш ткЕ ОТів сту єв Іїв дав ще Зі іх з
Бто тук зп жі щію ТК тів Тут А зів ув Рбв і шіу іш АВ
ЕЕ ВЕ ах. тьг ев ТВк ха1ї ар гує Бег дек бек твк АЗа тую МЕТ Зі сівш і виш а шк Вк ек ів ТК бут бі: йжробек аїіа Уші тут тут Сух аіш ат йБщотук вх Б ЗЕ сі ББЕ таЗ іец ав ту ттрошіІу ів ші ТА о твгоіБШ ТБ УВІ яв зт ВЖК ЗБ
Шет іх ШІу ші бі бек бів Бі Бі Бі бек ої зі Б15 бі Бек
ЗЕ що Зж5 «ЕКЗ щ-іп жшіе Уві ів так зів Хек буа хек тів Шеї 5Зег Уві бЗег Ру с1у зах ява 15 бів ге Мі ТйгОжЕТа тви Сха Беб Ата дет бет бек За) Беб Тек МеЕх го ех «ща
Ні: тео Ве ЗМ" оЗІя уз т Зі так бек бує ух се тк Бі тує за за 345 бБет ТВкК бЯву ап ін аїх Шег сік ді Ко АТа Аа вне бат Бі ЗВ я ЗЕ о сім Бек Єїу тт бек тек баг єв тТвУ тт хвг о зка Уві АТа АВ ТВ
БЕ ж Ух З вер АТа АТ тВт тТуК ТтТуХ Суз зів бів вта Бек я Тук реа ра тув
Ех «ЕЕ ах тТвж Бве шіу ТУ Ту ТБ і єв сім Те ж здо ОХ «Вам ще «Ше БщЕ «жі: ЕТ «ЕКО «БЕЗ» штучне дитеттяє же 5
Мет віу та Бек су ІТ чі ве: вве се Уві) АТа тис дід ТЕК о БІх ї 5 1 їх
Уді НІ бек піп жа! Сів бе сів БІБ ет жі АТа Зі івБЕ їв ага
КО ах 35
Кто ді аа Бех Уві іх МШеї ек бує бує ТБР бек Шіу Ту ТК вне жк ше ЗЕ тат ву ЗМУ тат оМес Ні Тер УЖ: Кт Бій Ага вто Зі Бій біж б еБ
БО БЕ ЩО іш тк дів ту ТукК Ії й» ге ек вага Зі Тук тв ай Тук дея я Я ЕЕ ЩО ім ку ЙО і тУ5 Ар ів аТя ТАК обем тт тк ав бує вт ак дат ак я ак твт Ата тек Мет бів ієцщ беу бек бе ту Зек зії: дв бек вія жд
Ко шк Іо ттК ТЕР Су Ата Ага тук Тут аБр вхо НІ Ту бек ів АБ ОТуК тЕБ
ЗЕ І їх сі Біб біу ТТ ТВК о гГяцз тв жі бек бек зіу Бім Біу щі Бек віх іа І55 І їі Заг Бі ші вк Зі Бік« дек Бі Бім Біх бек бів тів Уді ех їжте ї5О Ех ВК твт бів бек РКО вів діє Беж Бек АЗа Зег Бгто ік іщш ів ші ТАК ня Ат мет ТР СУБ АгЯ АТа БЕК ЖК Бек Уаї Зак тую Ме дав тур отут Бій їж їі5Б5 Ах біп із бек бі тб бек Бгто іуз Якщо тТКВОЇТЕ Тугб йо Тит шетб г уж а ВО ТЕ
Уві вія бек піМ Увї РКО тТуг Акш вва баг зіу бвк о іу Бек Єту ТВЕ 2ї8 215 Еш бет Тек бег івеюв тйг хів бет бек мБеї бін АТа сто яв Аа дід сте
Те 5 ях жа тут тУК Себ пів шій тКтр яву Бек аби Би оіви тк о ЕНе бір від іх «ЧЕ БЕ ЕЕ т Еж5 без ЗзІШ бе Гуз бек біу п3у Бі» бі Бек зт ді вія ех
ЖЖ ВЖЕ. же бів бів бек сте рт ів іез Кві зу: Бк ст Аїд бат омеї фе ЕТЕ
ШЕ ЖВМ ЩЕ дек Кув їх та бек зі тук хек вбе ТБ 0тЖ тТуг тк Меж дБ тки
Іще 255 ЗО
Уві фа Сів беїюи нія 01у ів ал ів біш тТКЕ Ті Ту і ец ІТ ази
ВЕ жо Ех зе ко тут Ащи ів йІіу ТЕ жів Тк ази біпоі же БЕ і БІ був Від
ЗБЕ 855 555 тн ев тк Уаії Ар губ зве хек Зек те йіж тТук мет ати Кер іеви 53 45 ЗБ
Жшйт ЕЕ ТК БТ БІ Ар бек азів Маї ту тую Су ВІВ Вт Во ТК
ВЕ Кер ВЕ бі Бме Уві ів аа Тук ттровік Зв Бі тах так оіївб тк Хві Бек зв Ух 5 ет піу Сіу ту ТУ Зяес шіу шіх б53іЖ біу вт бі біу ші ші ща
ВЕ а ВЕ я віп дів УЖ) ішм отв зів ЯЗвговую бат Кі меж бек уві бек о рто Біу що ЗЛ «ЕЕ 5
Сіщ вує ФАЗ ТБТ ІТ ТБт Су Бек Ал ЗВ БЕК БЕК За Бек Тк МЕХ
ЗІ а ща нів ткробМне зЗіпй зів бе5 вто 51 ТИХ бек кто іт5 іви бек ІТ ТуК
435 за «45
Бек тек бак йхп іш вів Беж бік ді Бо вів аг БНе Зеб Біх яка ще КБ Би їж Жак Єіу ТК бшк ТуК яв бе: тТВК о ІТ бек Ак Ма Аза Аїх бі аж Як Я ав оаіз Аіш тт о тук тек Сую ші 63Б Ага ЗВУ вав тк Вт фКа г
Зах я Як тву вЕе іу Бі БіЖ ТК ру івБ біз хів г 5
ОН ех «ії» кщо «Кіш ЕТ
ЕЖЩЕх «ВІ» Штучне антитіло «че вв
Жеж пі ткрожежЖ Суї І1е тів ів Бе ої еб Заї Аїа тк АТа тв шіж ії 5 А ЕХ чаї нів бек ік Еішє шів зе) УВІ Бій бек ві Втз Пій іш зу г У5
ЕС 5 ЗО
Бта пік бід тв УТ Ге Іі БВК Ух Куз ВІ Зак ші Ту ТК БЕ
ЗЕ ше ж тт вЕ и ТК СТУ БЕЖ дя тТгроУВІ і іп дата рРго ші іу О3У вв ви 5 що
Етш ткф Мет Зі тт жів дом тк обов тв сі Бі; го тит ту дів в то т5 що ї-1 іш РЕ гу біт вка ве ала БЕ Зак ів Бі: ТК Бег вія ек зе дк ЗЕ тТвт дта тУК ів Бі Кі дп аз бе: бух вл Бі» йха тк Аза тв
БО ке А туЖ Бке Сех АТ Ага беб бі ББЕ б3у Ав від Меї йзв тек тквовіу іп ошжіЖ ХК о Зег Уві ТК жа! дек Бек зіЖ Біх ші зі БеЖ віх Шу і55 І5х ІЗ пін жі бек діє діє бі ші бек зі БЗУ Бім шіу Бек ази тів жа
Іїї5 ЖИ Ех їй
Мет так о бЄївз Бак Бгто бек Жеу ів: твг ді тБЕ Аза сію сім іуб5 жЖві!
Б ЕВ ЖУК тТВг МЕЖ бек су іуї Бек Бек ів ет св ів ащи Бек ші 55 шТВ їх їщЕ ЗБ іт дав ТУ Беш тк тк; тут Сів Бій і У РК біу шів Кк вке ув ївн гешБ жів тут тр оаів 5ве тв АкКа обі Зак бі УВІ ВО во АФ жа 215 ЕВ це тт осі Звк бтіу Же сіу ТТ йо Бе тб фев ТК тів бек жек чві Бі 18 зів йо» гей вія УудіІ ТЖжЕ ТУ Сх БІВ дк ар отує БЕК 245 250 те ту Ка ів ЖБК оРКе бів тя Б1У ТВК ог Уж ее ОТ ев івх фагт ошіу
ЕЕ ЖЕ ик пі. бі Біу шт шій УдІ віп іш Бі біп Бек біб яті Є ів АТа
У Ж о дя Бтєб сіу йтія Зак Заї ів Меї бек Суз ув ТВб Бек вію тТукК о тВК
Бе тк вуо ТуК тТЕК Ме Бі тер УЖЕ іш бій дк РКО бі ТВ озіх
ЗО зі Зі ЗЕ їм іш ТО тів їх тут Ії й5бБ Бтж Зв йка бі тТук тег о Аа тук же 50 ЕК дБп бів іув Ре і ух й5річ йла ТВ іє ту тт й і хз Зву Жах
БУ а ЗК дек тнг аїя Тк Ме 5ів ієею бег бек іец тБг бек пів бр бек дія зх: хо БЕ чаї тук тек сСуз Іа йо тут тТук ар ази НІ: ТЕМ Баг івем Ява тук ткр обі сів зік тв тв івж так Маї бег йетх бі Біу Бі шім Бек 355 ЖК Ж як січ бік піу зі вк Бі Бім шоу ші бек бі Бі біУу 615 Бек вія а ФЕБ
ІЗ1е ХЕ! із тБк бів Жах Бо АТ ІТв Меї ЗЕег аТа Бек Бта Бім ші
ЕЕ ак я іт ВІ пе Має тЕкК бує ага дів ет шШек Бех Уж баг ТУуК Меж Ем
ВВЕ а як ткротук сів біп іт баг Бу так бек Еко Буш вта тир тії тб дв
Б Ех З
ТВг бек іїу5 Чаї аа бек ді ві Рез Тух йущш Бне бат СТУ бек 15 5 ЖУш хх «ва дек зжіжЖж ТУ Бек Тек дек івф ТТ Ії бек бЕг меж пів ія 03) дБщ 5 Я «ак зіва АТа ту Ту тек Се бів БівВ ТКрошжеє пек ща ко іо тк о БНа
ЖЕМЕ МЕ ІЗ пів аїа бір ТБ уз іяц сі дей гу віу ші Бек нів ніш НЕ НІВ іх БІВ ЕЕ
Нік ІЗ
Ва «-В1ї» З «ій ВККТ «тії штучна «ЖЕК «ОЕМ Штучне знтитіяе «аю щу мет сію зв о ваеу Су ЕТ ІТ ів БВе сви Уа вата тт Ата тк оЄту ії 5 38 ї5
УЖ НІ бет БІВ Її піп іез УВЕ бів Явг бі Во біш іш бує ув ж 85 ща
Бто ші Бі тт ові іт тів бек СУ гу вів Бек Бір Тет ТК Бе
ЗЕ «У ще
ТНЕ яшК о ТУК СІМ Ме Аа ттроУуві і ей Аза вка БІК 15 Сех ге вк Вк їж тквошет сту ТБ ЕТ Ап ТВК дев ТВ СІ ШТ во тиг о тук 818 вк У т ВО
Бін зіш рве іїу5 зі В РМ авіа Рв Шег ів Бій ТК бек аїЖ Бак
Тв Аля тТУК ішЩБ БІЙ ІїВ ас вок ів гу ав Бі АшО тт Та ТАК
ЗО іще 15 тТуг вне Су АЇЗ агЕ і-ц іх РН Біу Ашм АТа Мет аб тек тр оїу
Бій сію ТнЕ Зек ді тн Уві бек хек шіу піч БТу вію Жех сію біх іл І35 155 вік спіу Бетг сту зі сіу ші Бак біу зіу сту БТ» БЕК аББ ЖІ1Е ХВ
ВЖЕ їО МЕх їв веж тк обі" ет вко Бек Хак їв» тб ожді тму Тая Бію ші іув Ма і15Е Кт ЕТ твк Мет жу Су і ус Щек Жвг біт бек ів ге Ба Бек шт демо шій
ЗХ і5Е А їжв йбж ТУ ів тБк тв ту бів БІБ уз Рез Ту Зі Бгто ро зу і ШО ех їєв іеш їїіє ту тмр Аїд Зв тьк оду сів бек бі Маї Ркеб йзв ага ве твк бів ет штТу Бек Біт ТВ ЯЗ ВВЕ ТМгоїівБ Тит ІТ Зевк бек
ЕЕ 33 жах Я
Уві бі ах і а5В іїен Аза ві тук тт Су СЗЯ дея йо теж БЕР 25 ду ВЕ тут Бк іє тет рев йіу Су біж ТВК ож іваш обі іш) іуд Жек бБіш ев БЕ ШК
ЄїіуУу ЄТУ ЄСТУ бБегт бтв Жві Бів ех пів шій ау бі Аіж Біб іш АТа тя я как
АК ОБКке іу АТ бБшк та іч МЕї ЕК КУБ їух ТК Бек Бі Тук тВЖ «5 855 ЗМО
Же тк Ага ту ТК Ме Ні: То Маї гу бБіп ака Бжуз Бі шій Ту
ВЕ 213 іх ЕК їен бі: їгО ЖТв бі Тук І1і2е дз Вка бе ако ші тет ТВгодаквотее
ЗІБ У ЗЕ дет іій куз РМе іт: Аза іує діа ТК Беж ТК ТБ ав іх Щек бек щі зах КІ бет так вій Тут Ме біп івез бек бек сен тт Як сій Ар обет Аза
ЕЕ ДекХ ЗЕ ві тУК тек Су вів вк Тук ТЕК дор во ніх Тук бак ів без о тук ке ЗІ ЗВО тЕровіу із ждту тжкК тик і тТВК жаї Зак зек БТ Бі шіу шту бат
Зк ЗО Ох Я біж ші шіу тіж бек йпіу Бі віх БіЖ Бек вБіж БІК віх Бі Хек бій я ЕЕ
Те жі ви тку Зі Бек го дата Іїв Жеї Зек аїа Зег рге Сіу їв
ЗІо ак «В іш УВІ ЗВГ Метсє те Суз гу дія бек бе ще т ха: щет тує щех дяк
ІБ ши --Е тв отут бів ій ух Бех сії ТК щек Бо їуз да тро тіє Тух Яр 5 з55 шк тт бек іх ві вія БЗет сіу хаї ге тут Ак бі дв ші бвт шію ее жа ях ас ет шіу ТК Обет ТуУкК Бек ією ТВ Її Зву Зак Жах віз іш 53: вав
ВЕ З55 ях іа вза пк ту ТК бу Бій бів туш бек Зек важ рез ів тВК ВВЕ
Ба Ба ів бі вія бі ТК ої У Без біз іев був ШТ ші Шет Вія із НІ НІ
БЕХ БІ аж ї5За «але жа
«Вії» 530 «Від ВЕ «ЕД «ВЕЖ» йтузне антЕттдя ме сіу тр оБек Сже ІТ гів ів Бе без та дів тв АТ твої ш ї 5 їі її
УЖ Ні баг бів ба: вів зіез бік шій Бгто зт та Бім ієн Уаї вк
ТК -Е Ве
Кто» віх іж ет таї їув івец щБет Сех уз АТЕ бег шіу Тук тк вне
ЗЕ «а ЗЕ тк бек тет ТКрОгї 5 Тр Уві ів БІВ ака бю ж іу іп БТ Бе в КЕ а ів тв Іі Біт Аям Кіш Тут Як ЗекК обер бек тую ТРК Вей тук дяк
БЕ то 5 5 їі ге Ба ус аж ге 18 Так оівен Твт та дв їж Шеб бак Бек ще ЕЕ тТвЕ АТ тТук Мет їх іо бу бек ВКоа Твт 5вговін ахв Беб аїя УЖ
Ку Ок їх
Тут тУк Ку ТБтТ акш Бех Ттр ока Сіу Ам Бвт РЕ а5В Те ТтКрощІх 115 ї2о 325 сік ожіу ТК Отто і ев тв Уві бек бет піт Бтіу ТУ б1жЖ Бек бік Ту іще ЕЕ шо
І СТУ бак зі ші Бі шіу Бег БІК БіЖ шТу піу Бек А5в Ії У! їй ББО їх і-й
Жет так сія яву Рг Бек зву іш отвкК о Зжі ТТ дів злу Бін іУя УВІ 155 іт Ух тт омех бах сСуз іа Бег Бех пів Зек Сенів йо Бек ші Аби ів
Іо БЕ їщ ух ав тк Єви ти ото Ту бів Бія у Рко зіу зів рт РФ їж і же пк
Кеш без: жів ту тк о А)д бег тв Акш вій Зекх Біх Уві ко зо вте
Шке тк Бі Зежк сту Бек щі тв йзш Бе так ів: тн тів Жек жег ша З ВЕ ШОЖЖ
УЖ вів ів Бім ав іїеоз вія Уві тує Тек Сжа 015 йзв др о тук бек
РЕ ВІВ ВЕБ. тТук Буш Ве ткт Рв сі Бех біу ТВЕК їж і ви ШТ ЕТе їжа бек ШІХ сік БІ біт Хетг бів ді Бій зїек Бім шій бек бік вів ші і АТа
Ех а еВ вага о Бка бі АТ бек хаї іт Меї 5ег Су і у ТК о бек ші тТУк тТВК
Же Ка ЯКЕ
Бе тк о дта тк тк Мет ніх тв о жаї гу Бій втЕ ВгОа сту бів У
Зх хід іх 2 ев біб тер ЕТ Бі тек Іів дб Буша бек Аке ОТ тек Тит од тут 25 ВО 35
Всп ів ів Ре іт дев іух іа ТВг бен ту тБК о ЯхаА ів БВ БЕК ща За БЕ дет ЗБК АТа тук мМеї бій іек бег Бек ви тв бек зії вар бек аа
ЗЕ яка ЗЕ
Уді тТУк тек Сх аїз Аг Тут Тег Ав ав нія Тук бек іоц да теж ази ЗЕ Ж тТЕв Бі бів сту ТБК ТВ іви тТВгоді Бек обек бі іу іх 6іуУу ак зЗвЕ 553 ЗЕ В ві бік вію Біх Бек шіу Бі бБіш ші бек бі бі щу сі Зек Бік чевЕ Зі «І5
ЇТЕе МЕЖ сн ТАК БІЙ Бех Бто 13 ІЗ Меї бдег Аїв Бек вго бу вік а ЕЕ Ящ
Ку: ЖЕйФІ Тит меж тк Суб атя Аза бек жег бет Уві бек Тут меж дах
ЗЖЕ пев Зак тЕр отут бів бів іу5 бек шіх ТВ Зет Бго іш Ага о теВ оІ1в8 тує Ава за ЯКЕ я
Тв Бек ге5 УВІ ія Щек Сі» Уа ра Тжг Акад ре бек сію ек злу ях КЗ З ВЕ ек іш ТК о Бег тук Бех ів ТВг о ІЗе хек бек Мет бі: вія бів Ба 585 Я ЖЕ вів Аїа так теж ту сСув віп ів тТеБ о бет бек дям рез зве тв Бе ки 5 бБіж ів 015 тт ів ієв сі зер іже Бі Біж бек НІВ НІ НІ Ні
БІ БЕ Бик нт НІВ за «ід» ще «Вії» 55 «еійдв» УЖЕ «Еш «ТЕЖ» Штучне вититіля
«НК 58 мет біт тр о яек бує ті Іі зв5 БББ ін та ів тп Від твК ші чі НІ бек зіп Мі зів іеш бів вів Бте сте Ат зім іен УдІ дк
Кте сіу аів Бек жа! бух зей шШег Ку т їв Бек бі тк тТВРг ОвНЕ
Е о я тнНи Бек тек ткрд жів й5в тур Уві їі55 бів ко р вів Бі» Суз еф
ВО ВЕ ва січ тко шІ1е с0іу ща Бі ту ву бех аБрЕ Бе Тук ТК вп Теж ях
БЕ ТЕ КЕ ЩО вій іт Бпбе із дов іч А1в ТК без тт ха ав ік баг дет дек тв вів тТук МеЖ бів ів баг дек Бко твБЕ Бе 5; хр де дію ЖЕ
Іс з ІЗ тут тук Сух тк ака Бу ттровко Бі век Бек ре дав тег тЕр о шік ах І їх бів шіу твК ответ вО так Уві бег дет бі ТУ бтУ вію Бек шіу іш
Ажх АЕО ї55 іа
Мет ТВкК ія 5еат Ро бек Жегт і: тТвг жа! ТК АТ зі сі іт УЖ ї155 ВЕЖ їтТ 5 тик мех Жвк Сух губ бек баг 015 бек івн ев йо Зек сшіу дов бів
Я їв ща іт й ТукК ів ТОК тгО тТук сів Бій ік рго бі бій Бгто Бо гу ів бею діє тт тео аів ЗеФе тТвг о вгш бів Щек пі ді БтЖо йбзвоакт
ЯнНе тк сію Бет Бі Бек Сі ТВг одбю Не ту іе: тп тіе ек Бек ва 23 ва
ТУТ жів Аїшж зіш вхо їецз АТа Уж? тут тег осує ЗіБ ажий Ар о туК Зак ах зх 25
Теж Бкао Вйе тзг оре бі Ку СіУ ТВК іш ів 5; жів і бек БІ жЯХ ак ККУ ші ш1У Сі яек дій Удї шій ге бів ші бек бі і Бі ів: дів
Ако Бке біу дів Щек Уві і Меї бек Ст і ме МК о Зекобію тек тв не так овта тег тк мет ніш ТКо хаї ії БІВ виш вБкЗз Бі шій ші щак Зі хіх ЗЕ іез піц ттроІїв ої тет Іів Ав Бк бет йке бі Тк твоя ТЕ зЗЕ5 Ж БЕ дев зій іув Ра ух ватрі АТа й фен тв так о йзвоіуз Жвг БЕЖ
Я ЗЕ КВК зак о тнк від тут МЕТ бій іец Баг жЖет о ів отВК о бег ін дор хек 818.
Зх ЗЕ Зах ча! Тук тжу Су Аїв Атш тут Тег дав яр от Тук Бех ів да туУК вий ЖЕ БО тгв біу шів віх ТК ОТВК ів ТК о Уді бек Бек біу шіхюх Бі йіЖ ет
ВХ Ва жа За шт Бі біу віх Бек бі шію шіж Біф Бек пік ші шіу Бі Бак віх
ШК Я ЕК
ІїВв Ущї іви те пів Хек Бгто 818 І1в Щеж хек Аза Хек вко шіу Кіш
ЖЕ я Е КІ іх Маї ТК Ме ТК Суб вт вів Бар БЗег Зак уві ет ТуУкК Меї а55 ща я ах тЕв тТшК сія Бій уз Бек Бі ТБг оШет вго гУ5 вка ТБ ОЖІЇВ Тук вад ка ее Еш
Тк оЗек іх хаї Аїа Зек Біу баі ге тук ага Рв ву біх ек сїж ях А ЖИВ ВЕ пет Бім Пк о5ек ту бат і шЕ тик тій Бек Баг Меї пів аа СТБ АБВ
ЕЕ ЗЕ ак аїа Аза так о туК тук Ск іп вів тк о бег жЖЕт дя РтЗз іш тк Бе
Ему ЗЕ щі сі Вів БР ТВЖ рух ів зіш Шеф зі іх жіуж Бек ніш ВІ МІ5 М35
ЗІ ЕВ ВІК ні ні ч«аїісле то «ії» 55 «війн КК «РЕ «823» ШтжчнЕ яНтИТТяВ «ВЕ я
МЕЖ віж тр оБет Су ІТ ті зве Бе івв ба АТа те дід тик біх чі Ні бег шій ЕТ бів зе кві шік Зег зі РК бійців ів гу
Бгто сім ім тик Уйї гу Те зе Сук у вів Звг сіє тук твкК рве
ЗЕ Зо я тт ази тк ЗіУ МЕЖ Яж ТВ Жаї ге о Біп Ата вк ОТ зу БІК і ше щи КЕ Я іувш тка ощЕї шію ттр жів Вхп Ту дев ТВ СТУ БВ о Бко тт о тУк вія вх то ЕЕ ва
ВІВ Сів Би гу БІК Аг рне Аза Бе Зак бвц бі: Тв бет Вт Заг тні Аіа те ец із Е1іе дп о йБа ів із Ашв Фін бер тк Ата тк
КЕ іль 31 тет Бпе Куб АЇВ Вк бе бі Ве бі доп оатя МеЖ Аа тук ТЕ Обіх пів вішж ТЕ Бек каї тних Мяї Зег Бек бі Бі б-іу бі Зв зі іх іщ ІЗ І шіУ ші Бек віх йіх Шіж Бі ек бі іш Бі ші бек дев тів ді і55 ІБ ЗБЕ їза век тв бів Зег обо Шет беб їех те Уві ТБ АЛ бі БІБ беж Уві їж ЕТО їтЕ тат Мат шек Сує і у« бек бак бік Ше се іев ай ак сію ев бів 8 ік 5 іт два тм ен так то Ту бів бів іч ка бі Єїп вка був і жк
Вк ЗЕ Зх іев іеБ ІТ тут тквБ ів Бе ТР ака сій бек бі Уі все зв кв
Ббе тв бі Бег ОТу бек зт ТВ АВ вве ТР о їер пи жЇв бек Зек
Уаі вів від ШТ Ар іви від Уві тТук тук Сух БІБ аа Аа Тук Хек
ЖЕ га ТЕЖ тут Вкз іво тб вне біх АтТа віх тк іх іез бів їв) і бек о шіу
ЕЖНХ ша ж іт ву піу Бех бів Мах бі» ів: Бі іп бек Бі АВ іш зе Аа вт Бга жіУ ат Бек чаї і ЩеЖж Шек Су Гуз ТК дек шім тую тв
Бнае тТВК дещо ТУЮ ТК Щеї Ні: ТКБ УЖ і т5 щій аАкжш Би Бі щі ух
Зх хі хіх ЗЕ іївев ЛШ ТК ЕТ СТУ тк тів йзЗки Бго бета БІ тТуУуХ ТИ ав о тук
БЕ З 35 вЕп сів гу Ре іт Ар ої у аа ВК оїшц ТУ ТР ав іуж Бек Заг
Ж ак 55 дек тв АТ тег МжЕ зів іещ щег его їв ТУ Бек ші: Ар БЕК щід
ЗЕ дя ЗЕ ді Тег тек Сух 1 Ага Тут Тег аеро аор Мі ТЖжб бек і вв йо туК зха але ЗИ тив ші ів віх КК ТВ ів твт Ушї БЗаак бек сту Сіу вію Біу бек
ВЕ а ах як сі Бім Бі ім зек о о1у сі Б1іу йіу Зек оту СТУ сію Бім Бак обїв «ЕХ ЗЕ ЧЕ
ІТе Уві іш тБК бів ек го Віз Ії Ме ву АТа Бек вує ФшІМ І ча «ах а тує ЖВІ Тни Мажб ТК Сух ага віз ЗЕ ЗЕ 5Звк уді пек Тук МЕЖ дяй 55 Я 3 тЕвотУЄ жів Біпоіує Бек ші ТТ Бек жто г уУуш акш тоб ЕЇв: Тук йер ее ше
ТЕг Баг їУу5 Уа! аа бек сію жаї вто Туг ага Ре бех Бім бек Ту зах шК Ук Ес Зя
Зек вік тт бвт тук Бек ів ТВК ІЇВ Яех БЕЖ МЕХ Бін АЛа шів дер
Як а чи.
Віа вата тнЕК тег о тук суб іп бій тур яву Бу дя руЗз іем тв вне
ОН ВЖКВ. Ії ту Сує біу ТВК о їув ген іш ів ої 5 зі зі» Бег віє Вії Вів НІ
ЖЕ БЕ БЕХ нт НІК «іЗб» 1 кЕВБї БЖ «іде ВЕТ «БЕЖ «225» штучне внтмтіпо «а ті
Жек зі тгробЗаек бує Ії Її і: Бе їеб ші ат тп аів ТВК о шІУ ї х їх ІБ
ЖІ Ні бек шій ЕТ Бій іо Ха: бі бек шіу Рез зів зїец іує Буш
ЖЕ Е Ве кто зі бін ТБ Уаї ев Ті бек Су: гу Ат бак шіу Туж Тве Бе
З о. «Ж тег Ави тук Біх мес яза ттр Уа? із віп аба РкБ Сі і Суб Бех вк БЕ Я їв ткЕрв Ме пі тгЕЖ Бі аз» тв йза ТВ о бтТУ СТ Бо так отук авіа
-к жо т ЖЕ бів іш не їі у ОТК яв Бе діяв Бе Жет їв бі: ТК Хек йзш БВ щЕ о -Е
Тву А1а тТУук ев бів Бі дп зв фев уз вам бі АБО ТИЖ ЯЗ ТАК
ЕМ їа5 ВЕ тут БЕ Су: аї3 АКБ ви сі Ре СТУ ап вів МЕІ до тт ткВОбТу
Єїп ші п Яевт уві тйгохді Бек Заг шлу шіуУу 6їЖ 515 бек пі щіж
АЖ ї35 КВ. зві сію бек От віх Зі сі Бек сії їх ші БІ Бак дб ІТ Ж іч ЗО ї55 жо мет так ощів чат Ркб бЗег пег ів; тпг ові тт о ва'ая бі Бі іуш ха! 165 Вл Ух
Тек Мет ву су ів бек бек ші Бек сЕєБ ів ха Бек Бім дей Вів
КБ ї5Е ща їж йбки тк Бенц ТК ОттТв Тук вію шій Ку Бра б5іЖж Бій Бто руш г Уа
З 2 ЕЕ ев іек ЇІїв тує тк Аж ет ТЕкК ага БІВ Баг шіє УВІ Бгто аа ага
Жбе тВт о шіу ет ТУ бек бі тк аю ББе так о іее тк тів Зк Баг
Ех КВ ЗЕ же чі вій Аїа бів ав фев вів УЖ тег тут Су бі Яви вв тТЕК дет
Тук Буква бен тк бе ді Се Бі ТК уз бен бі їец іш Щек біх
Рух ТБ В ЖЕХ
Єім іш 5іу вт Сів ді біп ів п'ю шій яв бі вів Біб іш АЗа
У ЕЯч ШО ка Бк біу атїя Бек ові іч МеХ Кег бує їу5 ТЖК Кв сію Тук отак а 285 ЗК
Шке тТВт ака тУЖ ТК о Мет Ммі5 тТкКшОожаї у шіп ато Бгто сі ші Са их БУ зії ЗЕ їеа Бі: тв ЖІ сту тус Ії8 да Бгто бе дк бі ТК ТЕЖ два отУК зе З а доповів сУ5 Ре і у дріт Аа ТВ о Бец тк тВК др ії уз Бек о Яве я 5 за ет тВк вів тую Меї піл івещ бек бек єю ТБ бек біш ахро Бек ав
ЗЕ ще ЗЕ чі Тут Тук Ку Аїа ака ТУТ тТук бе асо Ні тТукК Баг зів дБЕ Ту я як ЗО ттвроїу ів ші тТйб о твК їв Тк Уві Бет шек сі 5іУ Бі зу Ще
За ХВ ІВЕ ОК -і бі Бі ПТУ бек зі Бі січ віє Звгобтіу пі Біж шт Бек бів 55 зій щік
ІЗа УТ їво тв ої Бет рт вів ІЗЕ Жеї Бек дія бак о бто ші 515
Я и ака іуг УЖ тні Ме тБкК Су Атю АЇв бек Зег Зех Уві Бех ТУг Меї зл
ЗЕ ше 45 тЕв о тУкК Бій іп іт вк ші таб дек Був іме вгЕ тр Ії тук вав я ак Ехо твЖ Бег бух Уві аіа бек бі Уді Бто тут Ага бе Зак сію бек сту
БЕК Ж ТЕ о дет Сію тек Бек туК БЕЖ іш тк ОЇТв баг бек Мет Бім Вів іш ар
ЕЕ чав зе віз вія тк тує тую Сех шій сів тв о бе бек аби ВТО ів твК Бе
ОО БК. БЕ віж Су Бі ТАК У ен Бій їєБ же ож БТ Бек Ві нт ВРБ5 ОН
БІ ВІЙ ща ніш НІВ
БЕ
«гав» БЕ «іх» штучна. «Еш Ох «БЕЖа Штучне вититіле «Ода я
Мет шжім тер ет Ске Ії 118 іеБ Ббе ій Уж) Ата тйпт від тв обіу
Уді ніїі5 бек іп чі щік іш сів бів Бк ої вів вів ів УЖ АЖ я її За
Бко пі діж пек ужі їу5 їеи бек Сх і Ух АТа дек БіжЖ теж тТВК БНе
ЗЕ «Х я
ТВ о шек тут ТтТкр о їТЕ дев Ттр о жЖ: же шій ака Рг пі Бій ші гер
БЕХ КБ У пів тт жІЇе з'у й Жіє Туг Бгш бек вер Бек тук тк де Тек дЕд т Ук ща піп У ре із Ада їуб бід ТНК оїех тВт ді) Я іуб беж Бек Бек ак о ве твЕ Аза тук мех бів іец БЗег Бек Бо ту Бек оЗі:ю дев Беу Ата жвії
МО з т тУг теє Ск тВговта Зак тга агЕ біу азйп вет Ре ява ту тТевобТу іп ші твК Отто зе: тат о Уді дет бек слу пт бі Бі хек шію бу 158 І35 Ео іт ші Бек ої ві бБіЖ Бію его Бі вім пів зі Бек БО ІЛЕ УЖ 185 зщо ЗБ Іо жек твк бБів бегт го бетг Бек їсш ТБ УВІ ТБ АТа 1 бів ів У!
Ек їх ВЕ твж Мат бек Суз іє Бек обеє бів Бек сей ви б5в Зах сі дев СІВ
Яся і55 53 іш: вай ТК івШОТЖК ттротжху бів вів ув вВкЗз ої; щі го ву г ї55 ке хх іен іш: Іїш8 туК тт АїВ Бет ТК яка Бім Бег зі ві БТ язв ага
І їх З це твк обі ЖХет 0іУу Бек Бі ТЕЖ дів Бе тк га: ТВУ тів 5вк бак
ТК ОЇ ща З
Уві бів дід Зім йо іє; вія УВІ тег оТук сСух Іі джЖа й5д тук За шНх 5 КЕ тут Бта ре тку РБе бі Бек ші ТТ Був без 015 К)ів іуж Бек сту
ЖЕ ж ТЕ сім ші Сі Бвгобіюя Уві сій ев зів бій жве ОТ Аїд сів ів 88 ши ВЕ «де вхуад Еге пі ата бвг Уші зу МЕеЕї Бек буз бу ТБ ву Бі туго ТВ 28 ва 0
Кне так ато тук так Меї Ні: Тв ОжЖі гу біп Акш Рго ві їв су зх 530 іх зе ів біб тер Ете бі Тук Тів бек БКО Бек дго ші тук тат дей ТУ
ЗК аж ЖЕ вп ОБіп інЕ Ме іє вхрівх Вата ТВГг бен твг От др гу зву вк
НЕ РЕ Ж дет так Ві туго Мет бій іез бек хег сви тб Зег зів ав бек яїВ
ВЕ хв Зах та тук Тук Су Ав Яка тТук Тук вер дв Ні Тут Явт сец яр оту же ях З тер 'шту БІВ Бім тк тв ів тТВК УЖІ Бе Зетк Зі 1іу вію ТУ Заг
ЗЕ що В5 ОЗ вію бі Бі і Бак біт Бі ш1у іх Шет Бі 51У Бі 03 бек ів 5. а як
Іїв УДІ ів: тк бів Бву т йля Іїв МБеї Бак йтТа бек вто Зх Ів
РЕ ЕЕ ща іже УЖ тк меж ту Сех Ага із Жак бек шаеб щі беж тує Мет дея тЕвБ тк Бій шій" їу5 Бетгт ші ТК бек Бгто іт Якшо ттро Ії тук оо ака Зх як тат Бек іч Уді Аїд Бек ші бі Бка тек Аке ББе бат СТ» Жак сі
Щек ші тб о 5ег тк бек іш: ТК ІЗЕВ Баг Бег МЕТ БІЦ Ав 1 дав «вх Я ах аіа віз тк тут тик Сех віп Бій тт ак ек 5 БО бе ТУ вне -іЖ Сух іу КБУ їж ев ін іш був Бі зіж Бек ні Ві БІБ НІХ
БЕК Ж ЗА
-Ї «жі» т «ія Б «тіше БЕК «тіж штучна «ВЕЖ штучне внтиютіла «або» т
Жек ші тра бет Сує Е1їв Іі8 збе ББе ве ді Та те віа тт шіх ті нів дек ботів Уа: бів івез бів Бій Бтз Біу АТа зі без Уві АКЕ
Бка бі дів Бет заї ге5 зіец дек Су і уз АТа Зегбозіу тег о твкК Бе
ЩЕ Я 55 тТвІ Бек тжу тТКв КшЇв ЯЗ ТТБ ОЖЕЕ був Бій дкд Рг» шіУу БІВ Су бек що їх Б вБіш тко Іїв 5ІУ айв Е)Їве тут ргЗ БЕК вв ЗВУ тТУК ТК ЕВ тТУК ВБИВ ах то ТЕ ща вій Еф БВ іш айв У АЛ ТК вв так УВІ Як іря ЖвтУ Бек бу
ЩЕ ЧЕ 55 тв віз тек Щет зів беш бек бек Бе ТК Обет Тв дар Бе яЗа ма
ХК ЗЕ ІІ тук тТУК Се ТУ Ага Бек ТТ о Агш Сі й Бек Бце йо о тукК терція 115 ха їз вів сію лк ток ре тп шждаї Хек оБЕє бі шіу ші Бі бак шт 63у ща БЕЗ Ії ві сію ек сту бі Зіу сі бек Б'т Бі ші Б1у бат Аза Е1в ха їх їка їБЕ іще век тк бів ба вкш Бек жхак ією: тв од! ту аТя 1 БІБ зу чаї і6Е ВЕ ЖЕ тв щет шек Сує рус ву Жвк сіп Хек іш ів деп бек йшіу йшя шів
ІБ ї155 З іш й а Тук івш ТМ тга ту Бій сіб гу Вге вті бія тв Був їж іван ім жі тет тв одія Зег тих йхе сів бек бі Щі РК й Ага
Бе так бі ат бік бек Бі тик дер ББе ТК оів:; Тв ІТ Щек бек ше 25 їх ши
Уві вів Аїв БТ в5ш іви АбТа УВІ тТуУук тую СУБ Ся ап йо тут Бе ах ЩЕ КЕ
ТУт Бкз Бе таж РО ТУ Суз бі ТВК гуд ів БІ Кі іуш Хек іх
БО тях ша бів ві жі Бек зів Фа ШІ рев бів бів жет стю щів зі Бен 15 ака вка біт аа ет ві іт Меї Звг Су і у тк Бу ші тТук тн ве тт Ага ту ТВЕР ОМеж мі тТкрожаї іуз БІ» Акщ рез ат ів Ск 95 513 5І5 ЗЕ ів бін тва о жІїв бі тТук тів йомй Бкш Бек ага жі тує тт аа тЕК
Ек Кн ЗЕ взповБікй Був Ве ух пр іх вія ТК ів т тв вевоі ж беат Бек жа ЖЕ ЗБ
Жет тВК віж тут Мах бій ів дек Заг без тк Бек щі аз) Бек ав ех Бей ЗБЕ.
Уві тук ту Сея ВІ га тТук ТУ АВ вБЕ МНІ5 ТУ бек ів Або теУЄ
ЗУБ Жук Ва ткв обі бів жі ТР отак зе; тк жа? Бех бек вії йпію сту Ту БЕК
ЗО ЗЕ чо сі віх ші тіж Зек о Біу біу ші біб Бак бі ТУ бі БІ Бе Біж як ЗЕ В
ІТе Уві їец т зів бек Рг вія ЕЗв меж бек аТа зт око сі 15 о 25 ща ітш ді ТК МЕеБЖ ТО Суб дга йза Чет бек Бек мні Зв Тет Меї ях тЕвдотук бів вію бух Бвк біб твк ет Буп із вбз ттроїїв Тут вв
ЗБВ З аз тТВтг ЗЕ Гух Ма вів Бех Бі Уві Бко тут ага вЯв бек бі вк ошіЖ
ЗЕ т ЕН БЕ
Зак оІЖ Заг оЗЕг тує Бек іши ТК Іїв Бек БЕК Мет зіз АТя є аа евЕ За ІК «а йАта ТК тЕт тує Ку шіп Ів ТУ Бет Бек вякй вВгз їви ТВт ВВЕ ще щук Ії іх Сх бі ту іф5 ів) Сі іев груз Бім бі БЕК Ні ВІТ Бі5 Ні віх Баш ве Б ні НІВ
ЗІ
«гйсе я «Кі 535 «ВД» «2235 Штучне дититіла «Я
Мей зі ТК БУ Су Іфв Іі збе Бе беш ві Та тйпк Аіїя тв ОБІЖ і Е а І: чі нта бек Бій жїТВ віп івм о Уді Бій Бе бі РКО бів їв: Бех ух
Бу бік Зі) тт оУЯЇ іч Ів Хек Сех уз АТа Бек обі ту ТВ Бе
ЗЕ за 5
Те важки тух біх МЕТ за тТтв жа: гу СТй АТа Рго Біу іж оту ех що 5 ж
Еш тКроВет сту тгрохів йзя Тк дев ТВгОдію ОТ» вго т туго та що тв ТЕ во їз бів ре їж ту Агш вКе Аза РБе бек ів ОТ тк обет йза бек щЕ що ЗЕ тТвк дія ТУ і ви ів ІТ дя" дам сек іх йоп оз дярв ти аа тВг
ІН ох Ів тук ВБЕ Сх: АТа аж ім іх ВВЕ о біж док вів МЕІ дев тук тр ОБІЖ позі тв оБвК жаї пт ожУді его бет віх Бі БТУ зіу Зеаб шіж БІШ ії55 її 353 бі ік бек ші їж Біу іх бШег бік Бі біб шту Яве яви тів в ії155 ща її Ех мес тв бій бет Рго Зах Бет зіецс твг о жді тк о аТа бі Бін ія дії тт мет Бак Суб і: Же бег бів его ів ів а5яй Бек Бі аа бів
ВЕ і 5 ії: ди ту ів тв тКр тек бів бів у РК діж бів вго БК Б ух їешй без жІїв тус тт оаіа Жах ТНК вка їн Бек цЗіу тді вро йзр Кв
ВвБе тт шіу Бет бі бек СТУ ТК Я БНе тк іш ТК ІТве дек Жак їж з ше ее
Уві 5ів зів БІВ ав зе) дів УІ ТУТ ТУ Су БІБ ВВ аще туК Жат ях шо ЕЕ ттг Бко іец тазу РБЕЄ Зіу АТ8 біш ТВРК гуш івБ бів баці: Бек ЗУ
ЖЖ «ща З бік Біу шіу ек пів Бі хаії іїєю ТК Б'яй Зекг Ртє Аїд Іїв меж Зак вів век вто зі піш іБ5 Ма! ТК Мет те Сух ау: дів Беє Бек бак
Ве 285 ЗО чаї пек тук Мет дам ттр тет ій бів ге Бак обі ТВК оБеє БкБ був
Зах хіЗ ЗЕХ ЗЕ дкс туК о тхів те ажо ТВУ Хек оіу МІ АЛ дет Бі Уві Бто тук вищ
ЗІ: за з35 бе Зег сі 5шт Оу бат СТУ ТК обег тут 5ЕТт іо тв тів Бек 5ег
НЕ за аа -Ж-ет Сі: Ат БІШ хв А1ж Ів тТвВК отут тут Ст бів бів тт Щек беж
ЗЕ З ЗБ доп оБуб свв отмж рев З1іу Тв ші ТВ БЕ бвБ СТБ Св їі ші іх
Сім Бі бек біб ді 01 Бі дек ші ш3іу шт Бі Бек Єїу БІК Ту
ЗЕ Же Жак же сім ет сі Бі бі 61 Бек бів ві ЇВ іев зів бів Жек тю дів
ЗЕ зо че сів іевБ зів ака вто б1іу Та ек Уві ге Щеї ву Суб іш ТВК ат бів тут тп о РБе тт ага те тВкК о жеє ніз тк УВІ губ бій Ак вка а а бік ів жіу ів бів тв ІТ бі тТук Іїв асп Руб Бе ага біЖ тук ака Б я твг вза тує яв бів гм ЕЕ іх БО іш та ТМ ів оте так аа вх жи чи а їу5 Бек Бек Бек тт дід тут МЕЖ бів без бек бек їеш твт бек Зк
БЕ щО а вх дек ів Уві тут тк Ст Вів ау тут туго АБИ до ВІ Тек ШеЖ
ВІН БО ЕВ
Бем дбав те тка обі бів бі тТВкК о твБт їеш тк хаї бек ек б3у 1
ЕЕ аа БЕ чат ні Ні Ні НТ Ні НЗх
ІВ Б
«жі» ВЕТ «ВЕ «ЕЇЗ3» Штжчне аититтяле «Я те мет БішЖ тв вт Су Хі І116 іяБ: БЕ Се Уві йіз ТБ дів тБт о БТіЖ чі нія Щек віп ІЇЕ бів івб Уді бій его бі Рез бій ів іу5 Гу
Бека віу ів тат Уа? У тів бак Су іїух АТВ ЗВ Сі тТУК тват Ве тТвК АВ Тук шіУ Меї дсп тт Уві УЗ 1 аТа вт о ЗІТу іч Суд Ще -З нм ЕІ і тгв Мат і ТК жЇв ап тВкК оди ТР боту зів вко тк о тУкК Аїд
Е я Ж ща пів бів Бе гу ЗІ Ак вне Ав Ве бек іш зів їй бег дів хек тнг овів ту ген бів Ії аа Аа г єм і ух й зів йо ТНК а1ія таЕ тут Бе кує АТв аго ів: сіу Бе сі оп Ата Ме Яр туУуЮ ТУБ ОСТ віп Біу тп оБег Мат тве Уві бек ект ші ші бі біж бек оту Ту їж ЕЕ а сіу ві бат бі Ст Сі Сіу бак їх БІЖ БТ сік бек ях тів УЖ їх жо АБ за
Мет тВу бів Зв виб ет дет ів ТЕБЕ Ма? тк о Аіа бі їв іт та тик Меї бву сСтшх ух Зак Бвт 1 де ги фі єн дея хак о єїм б я
ЕжЕ Аби тек ей тк отгр отУуК вів 61 зує ко бту шій ВК вгО ЕЕ 185 го 205 їєм ев тІіє тут тк Аїд ЗВГ Так АК БІВ БЕ зі Уві вга йо ак
Бе тк БіЖ бе бі Бек 5іу тп ав вве тк іє) тк Ії ву бе
ЕЕ 235 5 шо тя! ів Аа отв й5в іви Аїв Уві туго тут Суш зів йша ВЕЮ Туг Баг ва 25о БЕ ту Еко івц оте ВО ЗУ Су ЗУ ТБ із іо» бід іви і ух Бек ші «о Вк Ж піч шію Біж яве Бій Ії Уві і: тб обії Зек рго вів її Беї ет від пек БО СТУ бі іх жаї тТВкКОВет тб Су АКБ АЇЖ Вб хек бву ді бек тжк Шек йзе тТКв тут бів 55 і ет Біу ТАК Шек вКо і ув ас І ЗЕ зга вка тквВво'Іїє тут йо тнЕК 5ЕК гу жаЗ ів бевгт біу ві Ру тут вт
Зак ва ЗЕ
Бе зак сі башт оїу бек ші ТК Бек тук Бек ів тв тів Хетг Бег
За з45 За
Ме ші: АтТаА ств вхо ав ад ТВК оту Те Шу вія вія тез Бек Щек
ЗЕ ВО ЗБЕ
Ав5поБка івгци тт о ВБе біу вів шіУ ТВг огуз ів 015 їз і бі бту зх дж ВИ піУу Бі Звг сту ТУ ЄТУ Бі 5вк вію сім зім Зі ву Бі ЗУ ту зх ад 5 ЗО іш Зак єї сі О0Ту бі Бех сів Уа? бБіп ін бів Зія вк сїіж 18 шій геБ АТа ака ка віх Віа дег ча? зу МеЖї 5ву Суз гу ТВК ожег я Зак Зо іх тк тк бе ТК ака тує тк жех нія тгтроуді іс Бій удо рго ча аа За піу ів Сію іевоб5ів те ті 5іхЖ тує її ак Бгто бек вата ші туК ча ЗБЕ Ес тнНг оди тЖжК й бів Бе ба іт вові від ТК ої ям так твК ва
Еш Бек Бек бе т ТК ойЇд тує Беж Біб ви бех бег о іївен ТВ ет бік
Зак Ся ак йо Зек ів Уві тТук тУкК Су вів вке туж туж ше йжо Ні тук Щек
ЕМ В ІЗ івч Я5ап отУук ткрозіх 5ія ші ТВ о тТВР обвв ту та! бек Бег біу бту
КІ БЮ Ба щат НІ Ніж НІВ НІВ НІВ МІ
З ва «вів я
«вії» ЩЕ «Кіт ЕТ «Фе «ще яв меж ші тгроБек сже Ії Ії іїеюб Ббе івц Уві Та так о йаїв тк оште ї Б М 15 чаї ніш Бет Бій жЖаї віп зви шів бів рКаз шіу вія Зі ів УВІ вгш шЕ 25 35
Бгто бік іш ет Уві ух ге дає бух Буш йїд Бек бі ТУ о тТве ББе ак ноя ях
ТНЕ бек тУк ТГрожІТ Аа тгроУЖЇ гу віп вка Рг бі іп Бі г ев
ХЕ ЕЕ ЖНХ ін тка Іі б0іу дя Іі Тут Вгб бек дБ Бек тук тп аа тТУК вх
ЩЕ то тк За іп іУ5 БЕ гу ар іт Від ТВК оїієш ТВК ма) лю іт бак одек Бег тв Аїа тет МЕЖ пів ієц Бек Бек Бтє Тк бе сів за бек вія МЖЕ
ЕК їіЗЕ 1 тет тжЕ бух ТЕТ АК дет ттв Аге бі Аб5п бат ВМЕ Во тує тКВвОбТуУ іп бі тп тВжЖ івв тат ба! Баб бек сту ші Ії ші бек бі біх пів ші Бек БіЖ шік бі Біу БЗек віЖ 1 СТУ Бі Бек ЗБ тів ді
І ШО ІЕ5 1
Ме тк обій Жак яго бек Хв ів тТЕгожді тт Аїв СТУ шій і Уві їі55 жо дя тТвЕ Жех бек сук ії бег бек сів Беє сво ів ба бек сі Ба вия
Іо ЕЕ Е5 їж ши ТУ БЕ ТйК ОтТУВ тух ші Бій уз ЕКО шт вів Бгто РКО їх ак ще ШЕ ен іште жів ТУук ткр Аж бог тТВкК ака бі Щек жі УДІ вто Ав аКщ
І ЕЕ ЕМ
Бпце твгобіу Бетгт зі бек бію Так Ав БКе твг бе: тТвК Орів Хек Бек ша ШО а Ки 33
Заії Бі вів ЗіБ аа іев ія УаТї Тук тую Су бів вв й5в тек Же
ЧЕ БО їЖЕ
Тут БтЕ ББЕ тбт Рв біт ет сію тв Був вв озіш ЖІ1е ічз Бек ші «БО ЕЕ шЕВ міх Бію біж Бвт бів КТ У! ів тк о жію ек рко А18 ті Мей Зак
ШЕ ЖЕ ВЕ кіш Зак ВгОо ші Біб ж УВІ ТАК оБекс тн кує акш дів дек беє Бек я шах ЗО
Уві чек Тек ЩеЖ дяк Та Ту бів бій ге Бак обі ТК бек рефі шо ик ЗІЗ і ЗЕ
ВК ОТО ІТЕЄ тег дяд ТВ ше ів ді від Зах бі ті Бгто тук АК же а ЗЕ
Бе Зек шіу З-у БТУ Бек шік таб ощек тук ек іще; тк ІЇв 5ег Заг о ЗЕ ЕКО
Мат БІШ Від ді ахв від дів тйготук теж Су бів шів тв Вт ВЕК з: ак ЗЕ депо вто фец ту Рв обі дів БІіЮ ТК тв ів СТЬ БВ іїу5 ші піту за же 5 їі вію бюх ші БІ тіж ші бек біу шіж 51 оту БЕК ші Біу Бу
БЕ 533 ах а іх Зек шіу зі бі шіу Бе" Бій Уаї Бій іец ім зів щег шіу 218 а я ЗІ іш ее вів Ага Бгто 01у дід Бег о Уа) гу Мет бек суб зу ТК Бек чо «ВЕ 438 віх тук ту Ббйе тб ака тТук тТаг ОЖеє ніз тт жаї уз шій вед во ах я з-кЕ ді БІВ Сіу івН БІ: Тк тів бію тук Еія й Рка Бек ву ші ту жа 5 ях тат Ав тук вп БІБ гу Ре іх йо зу лід ТК ів отву Тих вхв
ЗБЕ Я ЖЕ Б іт: бек Бек Заг ТК Аїд Тут МЕЖ Бій іенй щет БЕК рей твг Бек сів
ЯЗ ах шк пек дів Уа тут ту Ку Аа лу тук тк ахр ди ні ТжкК Жах що ЗЕ ів їви аБа ТК тТгр от шів Бім ТР ОтВкК ген твк ота Бек бег бік шіж
І ке зЕх ет нів Ні нт Ніз Нів НБ ха ее «Еш ях вкідз 55 кій» ВКТ ех «БЕ» Штучна антитіл
«Уют
Же зіжЖ ттробек Сує Ж1е Тіє Зец Бе сен уві Ат тВК АТтТа тв віх ї Ж їз 15
УВІ нт ак віп Уві Бій ів; зі шій те бі вла шів ес ві ау зе 25 за
Бка сім діж Зетг ха! ух іем Зв Ку кує їв Бек Бі Ту так вве щх як
ТВ Явг Тук ТЕБОІТе Ява тгв о Увї іш віп ака Еко Бі та сСуз і ви
ЩО ь як січ тгр жів 51У яв ЖІ Тут Бгто 5ек ар бат тук ТВК о АШТ ТК аа
БЕ що ЕЖя ща бій ста БЕ їж р уз Від ТНГоі вв тіж Узі Авроїув беб бек Бек
ВЕ Фа 5 те щі тт ВЕК бів Бей бег бек Ба тТБг оба ти йлр бег вія жд ї50 і і тує тТЕК бує ТУ ака жек тв Ага С3у вБЙ Жак ве ях ТУК тювОоБІу 5 ЖЖ ак бівпозішж ТК Отто іш: твК о Уді бек бек Біу біу ЗІ б0іу бах і ТУ їх ї55 їі сіу іш Бек БІу бі ші шіу дек ділу БіУ біу зт бат АБО» ЖЗв Уві
ЧЕ їжа їБЕ їі
Меї Тк бій Жвт Ркб бЗет Жек іех тв жа) те втя сію Бін іуя жд 655 їз їж тТвЕ Мет бак Су іуш Зак Жак бів бек ши ів аА5а бву БІ В5вБошій
ЕВ їЕ ща їт5 вв тет ви ОтбК тв тек бій бів куб го ої ія вто бує б т
Ук ча ІйЖ їжи їев І1іє туг тев аїж Ше ТК ака зім Баг іх Уві та В5Б АК
БвЕ Твгошіу Зек сту Бех Бі твг дар же те без тВУ ІТ щЕг Бек
ШЕ 235 Фе таб ча! віє іш Б'є й5ш Без дід Маї Тут ту Су їх дев АВ тТуг ЖЕК 255 за ЕВ тук Бта Бйе ту вЗе шіу Ку Ту тТВг їі 5 ів ОТО же іух БЕТ БІЖ
І жа шо ві віу Сію вт ві Іїе ув! іеб тВт Зі" бек Руб Аід Ії Ме же жи га ВЕ вій бевт Бта бі Сі уз Ууаї ТЕГ ожшї ТВг оСув Ат Вів бет шек Бек тв! пеє тую Мет ям тр отук Вік шій Еш дек зт ТК обег во їж хх За ЗІ5 ВІВ агЯ ТЕБЕ тЖЕ АЮ тк бек і тУді вів Бек оту ді ре тТуК ЯК
Зх ВУХ ах пев бек тіж Бек шт» бек ТУ Тв оБШеає тут ет бе) ТВЕ Іїв бек Звк 3 зчЕ Ж
Мет вію аів бі Ар АТа ат ТАК отУК тує сш бій бів тер бек де якЕ БІС ВЕ вжи Шу із; тА ре ст аїа сію Твг Бу бшєщ ШІ Бещц іч шк ж за зт зва сіу піу беу СТУ СТУ біу Бі Бвгошішж ші зіу зії Бек ші шт ше
ВЕ ВИ ЗБЕ а іх Бшт Біу іш бі піу бЕг Бій Ж БІВ рен бів зів Бег Бі ТЕ
Ок ЗІ щік січ ів віз ака Ркб бтіу Аїа 5ег жжЖТ їз МЕЖ Жек о Сув іує ТК БЕК
ЗЕ Я 5 шіжЖ тжт так Ре ту о АгО ТУ ТК Мет Ніз тгррожаї вже 1 яке вка «ЕД рек а
Біт БІБ БІ іви оті тгр ІТ бі Буг ІТа ап РУБ Беб АД щіЖ ТжК
За ЯК ЕХ твг о вза тку ап оїй іх5 Бе ія дв бух йТа тТВК інши ТО тТВК йеЮ а то пе ЖИВ іїуУуз Жег Бех Бак так АТВ Тут ЖеЖ 15 беж Зет Бек бец ти Бе БІВ
ЗБЕ зва Я ав бек вія Уві Туг тут Сха вія Ак туго тут Ар Ар Кі ТК дек
БІ ак БІЙ іш вар тжкК тТкр Бі бів бір тТяК ТК о їев ту Уві Бек Бет ту ТУ
ЖЖ БІ Зи5 не г НІВ НІ МНіз МіЗ мів Ні
ЖЕ КЕ
«ге т ке ве 55 «ЕЕ БИТ «кіхе щтучнЕ
ФО» «Фа» шщтучне аититтле «Оле та ет ші тр ожХат Суб КТ тів іещб Бе сен сві 88 тт АТа твкКосту ї 5 Же її
Уді Ніз Бвт БТІ ІТ бів іеш уві Бі Бег Бі рт Біц ів ів се
ЕЕ Її а рт ші шію БК Ожві іч тів вк Суз уз зів бвБг бі тує тв БЕ
Зк ка 5 тНг овев тТук СТУ Меї 585 тт В! Ух Бій йів Вк Зі і ув біу вх
БЕ 5 5 і: ткрожет зі тб ОБКів а5й ТАК аа ТВ бтіУ біз Рта тат тет діа
ВЕ 6 як ви щі бів Ббе їу5 і ага те 8ї5 Бе хе ів Зі: тп бек вія Бек ща че тт аія тУуК ви сіб Кі дол йжа бе гу Ап Зі: Аа тт о Аіш о твт
ВЕ ік ЗІЗ тек Впев Сея Аїз Аге ів Бі Бе біх вх аід Меї яв тут тквоБІЖ вій бі тк Бет тУаТ тк жді Шек Жек Бі Зі Зі бЗію Бак БІЖ щіУ їх же Її
Сію шіу бек сік ІК Бі Бі баб б1У сіу Біу Біу бек АБВ ІТВ УВІ їчЕ ї585 БЕ ЕВ меж тк бі» бек ркє бек дет їв: тет ма) тв азів Бі бів зуб щі
ІБК 76 іт 5 тв Меї Зак Ст 1 к5 бек Шек 15 дек сви ів йза бек бі як бід
ЕВ 155 5 іш: йжи тек Єви те ТК тет бів бів зе ро біу Біп Без Ббо і ух івЕ В МЕ іен ет жІїє тет тк від бек так ака Бін дек бі Уві во дов вед жд ві а бе тк ші Бек 5ію Бек сію ТК ав Бе тк ів ТБ жІТВ бек хек ше Ж еВ З хі шій АТА ств Яхю вес вів УВІ те тет Су ЗіБ ав ав тую Щек
ЧЕ ж ТЕ
Тут КО бай ТБ РЕЯ біу вів ЗУ ТК обу цем бін їіви іу5 Бек штЕ
Ех жк ШЕ щік бі бі Бек СТ ЕЇв Уві івф тв оБій Зетк вто аів ІТ Щеї Щек шк В 85 іа бек Бгто соту 015 руб Уві ТВК Жеї тВг Сех ЯКО від 5вУ ву Щек ша 95 БК чаї Бек тк Мет ож ттв тех Біб 615 іуз ву Ту ТК Бетг вт іт
Ох ід 5 ЗЕ дтп тЕВ ОІЇвВ тТУг Я5Ю ТК Бех іе5 ві віз хек Бі ві Ето тУук аг
З зо ЗБ
Бе бек о шіж ек Бі ек біу ТНК бак тук бвг ів тТВК о Іїв ет ет жа Зах ко мет бів тя зі бак Аз ія тт тТУК ТУ Су вію зів» ткв бак бак з5Е зво зах
Ап ока івц ТЕЖ Р Оу Сух шіу ТВг іш ев бі ів: і Бі БІу ва Ух ЗО
Б-іж іш ЖШеу яїу Зік зів шк бат ші ші; Бі Бію бвт сі іх ш1х ще ЗЕУ З55 Я сі дек пт Бі Бі Бі Жак бів мі бів вв вів бів Хек біт аїд «ВК. ЗІ ЗЕ пін ін ат Агя Вта зі дія бек тат і меж яв сСуз уз тр оБаек га ЗЕ «ща сіу тТугк о твг о РБе ТБ ага Тут тТвг о жек нів ТВ таї іт іп вка Ба аз а ща віх жів Су ішмоБтів тр ошів пі тб І11е йай Вк бат ак о Біж тут 58 зБ5 зо тТВК аєм Тук ап зів уз БЕ їу5 йо і уз Діва ТК їв) ТК тв ев
ЗЕ ЖК У ай іу5 Заг Жает 5втг тв дід тУж МЕЖ бій іец баг Бек свв о тМг бак ові
Вк А ак зв бек іх жі БУК тк Сук Віз вко ТУ туг Ява вв НІ Тук бак
БЕН Б ІВ іш дев тут тЕр оштіу шія ші тб оте о беца тт жа! бат шет біу шіу
ЗЕ У ЖЖ век онів Ні5 із Ні: Ні МЕ ва вх «вам кВ «ЕМ Би «ші ЕТ «ах «КІВ» Штучне днтуитіла «Ох я меж пі тв бег Су Ефїв чів 1їек: Ббв о іен сві ія ЖМг о йія тв Сію 3 в її 15
Ві ніж Бек ші ЕІ бій і вм УЖІ ші Шет Зі Втю шій івш і ж веж
ТБ а
Вко вію вів тв Уяї рух Ті хек Сух із АТ ЖЕК вію тк тлк БНе
ЗЕ кра Кк тик Ашк тТУК Зіу МЕТ деп ттрота? бу Бій АТа вго бі іуз Сух їв
З КЕ ще іу тТкв Мет Бі Кге жів вай ТК овБха ТК обіх вів з т Тек віВ
БЕ то ТЕ в
Ст іш БЕ ів 0ІЖ го Бе віз Бе бег ів бі тк Бен Віз ЗЕг ах ЩО ВЕ
ТЕ дія КК ів біз Ба дБ ВЕй іш БУ дай бів аа тт віз тв
ЖЕНЕ ЗЕ ЗЕ
Тук Біне Сех дів Ат іен обі Бе бік АБ АЇв Мет Яхве те теВв опію її5 жа іх5
Єбіп віх Те Зек жаї ту баї Бек бе бі йбіуУ бішЖ Бі Бек бі щіж їх її а іа БО 15 їщй мет тТвк бій Зеат Рез бек Бе ією ТК Уві тет ат Бі Біб іх У іш ВЕ АК
Тв меж бе Су і ух Бви хвг сії дек іеб іш йовж Звк бік ва іх
ЗВ 15 що їуБ дав туК ів от ттротук Бі бів іш ге Ст дів ге БЕБ Еш і ЕМО Ж їн ев Ії Тут ТТБ АЇЖ Шек ТК Ак бів 5Бвт сту уд) вто вхо ака
У іє ВАХ:
Ббе твк обі» бек бі Шек сію ТК Абав о Ббе тк зе тв о Ії11а бек Бек а ВХ те ШЕ та вів віж Бій й і; від Уві тк тут Сух бів Ав дар о тУК ак шЯх Ей Ех ту Вгш ів тву Ре Бі Схв Біу ТБ б У5 ів бІВ ів ії хх Хек БіЖ
Я а й
Біж БІЖ Бі 5БІЕ БІБ БЕ1в УДІ ієБ ТК обів БЕшт вла АТ ІТЕ8 Мет вк
У ВО 5 8ів Бек го бі БЗіш іже Уві ТК Бех тн Суб вга від век Бек Зак
Те 89 ЕМ ді Бек тук Мебї ази та оту бів вів бує бат біЖ ТНК бак Ба іт
Зах ЗА зі аж зга тв ОІ1Їв тут Я ТК Шеє іх чаї вів бат СТЖ УдІ кгОо Тек АКФ
За ВЕ Зк
Ббе пек опію бек бі беє Бі тк бек тую бе зі ев твк ІТ Бек бак
ВЕ З ЖЕ мех бі: ді бі ха зів Від ТК оту Ту Су ЗІ ія тв Бек бек вах ХЕ ЗЕ вжи Бга бе тт рев бів Су Бі ТК ге фвШш СТВ фо ії ме Бім іх ж Як ЗБ біх шіу Зах пів БІ бі Біб Бек ші бі Бі бІЖ бек сі шію шіж
385 ХВ 55 ЯК піт зетг біт пі Бі» Бі ба зів Уві бів ішб зів біз хек обі аї8
ЩІ я пі ге: іх аг Бгз Бі ів ще УВІ гу Мет Зак Сб ів тв о бег
БЗіу тук лит вме ткг о дтд тет тс мет нія тгротаї іУБ Бій га БК ах я 5
БЗіу 35 Сея фев шій ттр ІТ ші Тук ІЛ ажпо ко Бк вто іш тук ча ще Я твг о демй тек вжи шій же ЖМш їі вер ге ВІВ ТВ ре) ТВ ТК вже 5 З чих ЗБЕ їжж Бак шек бек тб Аїд тет Меж пів вв бек бетб фреш тве Жек і
БЕ щО жах тв Баг віх зді тТук тек Су: вія Вуд отук тег вв шо НЕ Тук беж
ОН Ух ЕВ
Кен ав тк тТквоБІіЖ ів іш тв тТвтТ ке твЕ Уаї Щек хек Бі б1у дет нів Ні5 ні Ні5 нів НІ:
Е5О 53 «кіс ВО «Ей» ках «Еш БЕК «СЕ» Штучне витвтія мес шіу тгтв Бек Су ЕЇе ІТе іш Бпе се уші аіа тп АТа лик бі
Уві наз бе зіп ді Зі іек бів бій Жко шаіу вія зіцш іеюш жі вВКщ
КУ їх а
Бко ТУ дід его Уа? Ек іш дек Суз гу Аа баг Зіу Тут тк Бе
ЗБ я я
ТВ Шег тк тТКЕ жЇе аа тер УВІ ее бів» ка вго бі бів ші Кеш
КО БЕ ка
Зіни тка жів пі ав жів туго бо Щег дер бат тТук ТК дя» тТук дед
Вк т ЖЕ З п Ева Ба іт йо» гу ЩІівВ ТК бе: ТК уд) й) губ ЯХвк век Хег шк що я
ТВУ Аїд тек Мет бів їец Бех Бек Ба ТНК бег Зі: Яаа бек вія МЕ
ЗЕ їщЕ ВЗ ту тТук СуУух ТКК Ак бек тер ойка вБіЖ ап Бетг Ріш дер тут тТев Бі іїх а ік жіпоБік Тв тт о їец тк Уві вк зе бі ат БІЖ бів Же бБіж Бі й ї55 вк кза іх Бі дет бі піу зіу шім дек зі ші ві біт бек йше Ті ді 145 ї53 ї55 їі65 мет тв біля Бек Рг бек Бек ів ТК о хЖі тБК АТ бі Біз ів жд і6Е Ії їлЕ
ТвК Меї дау Єуз бух Бек хек сів Зег ів ів дяк Бак біу БВ бів
ІБ їі55 ШК їтж вжи тк їец тім тКр тег сів ів іш вКо бі ів ка то бух іх М ОЕ їв ге: Ії тк ткр ав бетг так АКе СТЮ баг обі Уві Бго БЕ аг
І жі ж
Бе тк обі Бек сту вк вію ТАК Аяв БНе тт оре: тв І3Е бе Бех
ЕЕ «33 -Е5 Я
УЖ бів від пін йо) ес вів Уві тук тує Суз вів дж вро тТук бек я ж Ех. тек Бта ВНе тк Вб спі бах сію ТР ів і ви бів Кі і ет БІту
Ехуку шщЕ ВУЖ ві бі Бі вк зів Бі УВІ ів твг Осій Бек Руб дів жІїв Мвт 5евк шт КЗ вах
Аза бек го б1У БІ: рух Уві ТВК шЖеї тах Сех аг Аа Бек дет дак же Жак ЗЕ
У Шек тк МЕЖ баз тТко Ту ЗВ Сів іт БВ ші ТЕ Жек без Бу
ЗЕ 13 5І5 ЗЕ втгшш отит Іїв Тук Ав ТВ Бех ів Уді йїд Бек вБ'ю Маї вто ту вущ
ЗЕ З ЗЕ
Ве ек Бі Зв зі Бек бі ТВг бек тет Бек ів Ту ЖЇТЄ Хву дет зад зах зБа
ЖЕ ії а13 61 Ащо а вів ТВгОтУК тує Шев боїб бів тТкробек ет
Ез ще ак вВхп о Вкш іви тет РЕ ЗіУ Су Б3У ТВ їв кв оБіШ ів сі віх
Ух жу ЗВ
Сі БішЖ бег ші оту 51 Бі бегб сі Бі Бі ші Бек Бім БІЖ 53Х
ЗЕ ха 5 ОН біж Бек 1 ші оіу шіюЖ Бек бів та ів феш Біт Бій Бек сі віх а5 Ів ЧЕ біМм бен зі ака Бгто пі аів зак ож т Мет бек Суб ї95 ТВК БЕК ях Ех ЗО бів тТжкК тк ра тк Ата ТУ тв Маї Ні тк ді уз БІБ йо вга
ЗЕ яка ях
Єїк вів Се івент тро їїв біу тут їІїе аж Рг Бек Ака шік тик
Ба ах о твг ази тТук асп ів гуд БЕ їз Аза зу ід Ти іец ти ТНК дев «в: Еш чи У
Ку бек Бак Шев ТЕЖ Адж Тек Вех ів ів бат Бет іе)в тк беє ів
ЗЕ щх зак азш о бек ів Уві тує тук Су йїій8 йта тУК ТУ Ар вхв ОнНів тує Бех що дя 2-й їен бю ту ТРршОБІЮ Зій Бію тТВК тВк беж тет ді Бек Жеу ші Сію
БЕЖ ка ВЕЖ «ек онІв Ні іх НІ НЕ НІ в 5 «віше БІ «ії» 535 «гід» ЕТ «ВЕД» «БЕЖ Штучне детитійо «ча БІ мес сію тгробаег Сує Жів тів і: Бе оіев узі? АТа Тв АЇВ тт оБію ї 5 й ї15 ді нія бак іп Уаі зів їв сів 63Б вка БіУ АТ бій ів тУві Акщ
Бгто жі Аж бБау Маї Беш без хек Ку5 гу їв Бак біу тут тв БНе
Зк ча аЕ
ТВЕ бек тук тТКБ ЕТ йзв ттв УВІ Буш бів ага Во бі іп Суз БВ 0. де 55
Зіш тка хтів Зі йа55 Жів Тут Боб Бет азрд зву тТук тТнг Ап тТук дав ще Ж тк БЕ бій іу5 БМе іт АВ їв вів тТвгоБех тйг ох) аз офуб Жак ет шШек
ВЕ ВЕ -Е тТвк Аїа тут Мет дів іви Шеїт Хек Бо тт баг ін Ар о Жег За Ждї
ЩО іш а тУк Тег Су тБгоака бЗетг тв Вкж біу Ап бек Вбе вдв о тТуЖ тв оБіХ 115 2 ЗЕ
Бі» шіЖ Твг о тМК і -х тТвт Уві бек о бет бі БТ Біт піу шег ТУ іх 58 жЕх Ії зві бі Бек щі Зі» Бі Бім ЕТ Бі Сі Бу шіу Бек дк те тд їх ІБ їж їх май тк осів бек рта Бех Хек ів тк чаї їв о АїВ Біу іш їв В ї1Б55 ТЕТ БУК тТнНу ЖМежх дек СУ ух Бег Бек Біб Бек г ез ів й Бек шім дев бів ій і55 ІВ їжа дак ту ещ тк тео Ту вія бів Ку Рго бі зів Бго Бго 55 ї55 ща ІК їев бе: ЕТ тут ттр Азїя Жак ТВг о АКФ шій ат СТУ бв3 Бгто йза вка
ОЗ 15 ВХ
Ба тк обі Бет бТУ бек Біу тВкК о а5ор вна тк івб тих жів бат ат
ТЕЖ В ЖЕ зах чаї вік дів БІіш йо їви Аїв Уві Тук Тут Ск ШТ ЯБа бер Туж бек
Я ЖЕ 55 тТЕУ Бкш Бпе ТЕЖ рБе Зі Суб ШІУ ТК Був іп БТ ЖІіВ їує дек бію іш ТУ ШІ Бех вія Бі УВі іє: тагоБів бат РКО аід Іїе Мех бек ід дет то СТУ 01 тус Мі ТВ мех тк Су Аг Аа дек Хек Жак щщ 95 МО
УЖ Бак тук МЕЖ ла то тек шіК Бі бух вт Ту тТвУ Зег пев і ке
Зх Ж ЗІ5 зЗаш ака тив ІЇв тут йо Тиг о Беє зує Жаі Аля Щек ОТ хв) Вга тук ака
ЗІБ З ЗЗЕ
ББе Бек бі Бек зі ву біб Твк о Жек ту бек їв» тв Ії Зв двг 2-50 ЗБ Ж
МЕеї жів Аїд бін аз ві Аів ТВ" отук тТук був діб зів тр ожЖек Заг
ЗЕ що Зк ап БО ів ту Ве Зі Су С1У тТвК г уз із СТ ів іх шіу 15
ВЕ зт ЗВУ сік Бі Зак бі пі бів ші Бегб ші Бі БТ ТУ бву ТЕ Б1У 1
ЗЕ Бе ша во ші бек сту біз Бі 51 Хек ків чаї Бій іви щі» шій бек шіх Аза що Зх а вів сем йів йко рт Бі Аів бек Жаді Буш МеЖ Бек Суб іуш ТВ бек «І ак Я бі тук тк Вйе тк дтд тук ЛМкК МЕЖ нія тк оба? іш шій вкш вка аа ях бтм шІБ ух іемн обі) те І)ів Шшіу ТК ІїВ Ал РКО бат Ата ші ту
ЗБ же ЗЕ
ТвІ АВ отит ап ОЇ рує БВ і вхр вух йід ТК оіви те тв ер іУ5 дет дет Зак о тВкК іш Тук ЩМеї Біб фев бек бек ів; о твВК баб ші яЕ5 я ах дер лег вів Уві тук тут Суз віз вка тує тут ваз Аа Мміз Тут Бек
БЕ ох Ва івш ав тек тгЮовТтК шій біб тТВЕ Тв веб тв тя бек хек шу Бі хіх БЕ ЕЕ
А У кл «жа їм ЕЕ «жі БТ «Хе штучна. «ШАЖ» йтузне яититіле «Я ВАХ
Мет сіу тер оБву Су КІТ тів бек Бе іши Узі зів тег оаівд ТК обі
Уді ні Зв зр жТЕ ЗаЗ Ме тТВк бів чего ркКо шк бек ів твкК УЕ тт АТа Бі ОТ іт ві ТТ Мет Хвб Се ГУБ Фет бек бів ат ре
БЕЗ Я ях іви доп бек бЗіу йо ші іуз йди тТУК ій ТВ тб о тТук БІВ сів г ух то 5 ва
Бте віх ші Бго ба їі ів ів Хі Тег Тек о йїя бек тВк го БВ ак то Ж ща
Зах сію чаї вге вар ага ве тк осі зак озі Бек зі тб ав вве
ВЕ що нЕ тт іев Так ТЕ Бек Хек Уві бі ів сій бер ей вів жЖаЇ тук тех
Су: Бій Ал йзв тУК Жах тут Вга іде тт оре біу вів ШІ ТВР Бу іещ ім ін іт оту зіу шіу ші Бек іх Бі зіх ві Бек зіу ту їхо ІЗ їж
Сію Бі бат бі Бу ШіжЖ шіу Бек вік бів ої щік бек бів тте віт 145 ї59 ІіБЕ їж іви Уві біп Бег бтх Рта шій івц зуб їх Еко бі дів т ОУВІ їі ух
ІТ бек сСуз іу аїа бак іх Тук тк Бк тБт аа тУК шіжЖ Меї Зх
ІЩЕ ік В туш Хі суб зЗіп йза Рут зІЖ іуз З1ТЖ ів іув тр оЖеж ої тгрої1е їі55 М ОБ
Ап отв дав тк Бі бід Вт тТВК отут АТ бів ЗіБ ре їх шту Яка тА і5 ж
ЕБе аіш Бе бат бе: Біб тк Бек їж дам твк оаза тек ївб бів о Тте
ЖЕ М Ех В вп овак сви їтв вв ЗІ дав тв ваза тв ту Ве Се віз ака їв ж Б СЕ
Сію Бе Біу ап Ал Жеї аз тТук тКв шт Біб Бі ТК Бек о ужі ТК
УВІ Яегт Зек вк зіу бі шіу ді ек ів баї Біб ем ші Бі щек сіб Ата сій ів Аїд вага втє пі аза Хек таї Бу Мет ве бу5 гуд тк ожег ТУ тук тТВЕ РВЕ Тпг о бує тТукК Тв вет нії тр оМаРТ гу вів зе ЗІ Зі ВЕ
Аташ о ру біу Біп саіЖ ївм осів ткрожІЗе сі туг ІТЄ да го бег кв 5 Ж 5 бішж Тук ТК Аж ту ДВ Бій іт БВе ге аю ж Дів таж їєем тк 340 ва ЗБ тНк ой ЕК Бек дек Зак твж діа ту БЕЖ бів ів ек шжвк о ішм ТАК 5 БО 5 пек Бім ар БЗег АТа ді тет Тут Суб вів Ага тує тТУК аАзройаю НІ зтв 75 зва тут бет гц дл тТукК тв БІК їв БіжЖ ТВ тт рек отвУ Удї Шек бат 28 ха ЗЕ ОМ вІЖ бі іУу Біу Бек зіу ші сі Б1у бек зі Її шБІу Бі Бек 1їУ ак ій ІВ віш б3у і Бег бів Бі Уді івв тТВу Бій БІ Рг Аїд Іі Меї Зак
ПЕ я ше
Ата бек ржо пі бі жБ5 УвВ)| ТВгОМеї тве бух ау Аїд Зак Жег Бек 5 Я 5 чУді 5ег тТук Жет йо тка тк сів вій бух Бек бі ТК бБег бу вв з ак я
Ака ТУЮ оІЇЕ тут баз ТВУ Жек зу Бі Аа бше бі в3 Бтео тук аква ях 53 Я -50
ББе зетг бі 5ЕТ Оу Бек Бім тТВК оЗег ту бе ге тв тів Бек бек -еї Сі Ат пів хв А1ш Аів тТвК отут тек бух бів ші ттрошек Зак ще ІК ВЕ вп орто сен тат РБВ бі АТа БіУ тТВКобуж ів СТВ бец їж ші віх іх ве ак ек НІВ НІ Ні НТ НІ ЩІ
ЗИ БВ
«ОО» жу «Каїн БЕ «ев ВКТ «233» Штучна «Еш «ев» Штучне знтитіпю «0» 3
Мет бік тр ожхех сСух лів 118 іє: Бе бе Уа аіз тв ад тк оБту ї Е З їх чаї нія Зек аю ЕЇв Уді Мет тт іш бек вкКоОо его Бек зей твК ож ш ак Ж тВт діа бі бі 5 уді т мех Зек Суз гу БК Зек бій Хек Сех
Зк За як ївц вхи Щек зіУ вла біп іч й тТукК бе тт отв тек Бій бів уз о БЕ що
Бгто сіє вія бік рго ух іву ім Іїв тт тТКроаія бек Так ага ів
ТЕ ЖК Бе ех бі Жаі Рто а535 ага ке тт йіш Бек зі бат ші ТВг о вж р ВКе во ак
ТВ гец ту ІТ Зег Бек Уві БІБ АЇВ Бі рів АЖ УВІ тТеКОТуК ще їпй5 112
Су: біб дж ар тТук бег тут ко їв тв бе пі су ші тТвкК ох їх ії їх5 вве вії Сем іух ЗІ ві сію шіу Бак бі ПТУ Бі вію Шек ші б1у і ї5 їхЕ і5о
Кен УВІ віп бег шіу Рез бів їев ЕЕ» іх РКО пі Біщ тк ВК рух і65 то ЖЕ
ІїВ Жак Сух і уз АТа бак іх тУук тег оББе тб Али туУукК 1 МЕТ в5ж
ЇВ їх ще тв ЖЕ буб Біп дата вго сі ітш сСух бен іш то мех бі тб ІЗВ дп отвк овал ТК Ошіх Біб Бгто твЕ тек аів Тв пі: Рів і у зі Вуд
Ва о аїіш Бе Бек сем зі: ТКт ет іа бег тт Аа тТук іеч бів ІЗв
ШЕ ша ВЕ вк яп ав їн іуз йзж бі йо тт аіа тв тег РЕ Суб ів вк т ев
ЖЕ шк ЕЕ шїУ Бе сі ап абїа Меї Бр отут трі Бій бтіу так ода ЖЖ ТАК ш шк ех чі дес ет 5ву шт Зіу Бі біу бБег бій Уві бій іез Фі» біж Бву
ШЕ вас ВЕ ту віз сів ів аа аг Бгто бі вів бек Уаі і уз Меї Зв Су ру
Тв Бк СТУ тут Тк Бне тт ака тук тн Мет нт тт Уві ух БІК ака БК ЄСТУ шій» б5іЖ ей бів тк шЗе сту тут ЕЇв да РКО Бек Акф ек ДЕ ЩІ -ІЖ Тук тк ап тк дя Бій іт Ра гу азрвік Аа ТВ бешотВж 540 зяЕ ЗБ
ТБВРЕ ве Еує Баг Бек Бек ТБ дід Тук Жеї Бій ше Бек беж фі еф твг
ЗБЕ зва зах дег біб вер 5евг АТа Уві тТуУг тут Су від АК тТуУК Туг в5рБ вар ні ту ЖеК їв; аб тукК тв ові Бі БІУ ТВР ТБ ів тк Уді бек ет а В 5 а іх бік Бі зі яек Зіу Бі бі бБіж бБет вазі Зі бі Б3у Бек зію шіУу вію ші 5вгт бів Іі УяЇ із тТВгт Бій 5ету Рко ід тів Меї хат и че «5 їв Бек вгте біу Бі: ї95 Жві тк МеЕ тМг оСує йуд о Ата Бе дек зах чаі бек тТук Мет аше ткр о Тут сів бі) вт хат Бі тк оБек Бе їв ака ткКО Ії тут ащр тв дет із Уа Кіз бе бі Уві РКО зУкК аж
БЕ як щи Б
Бе Зак бі хек зі бек біж ТВЕР бек тук Бех їв; тк о Іів Бвк Бек
Зк Як я мет бів аіш зів яз вів вів тТнт тек Тук Суб бів бій тбробаек Хе
БО а БІВ ваповко сви тек Ре Зі ів бі ТВ У ізо бі із ів біжЖж БІ
ЖЕБ Ба 5 дет нія Ні Ні Нів НІВ ВІЗ5
«Ж БЕ «ВЕ» Штучне внтшттлю аж аіу їгб яву Су Її Ті іїєБ РБе ївн о Уаї АТа ТК АТХ ТВ ОСТК чаі НІ Жак вже ЕТ ші Мех тк обій бек кое бек дек івБ Отак Уві
Тк аіа Бі Бій у Уді ТВ Веб бег о сСує У Бек Жак іп бек ів:
Зк шо як іен дб. БЕК бі дп вів іт дев тут ів тку тка тУук вів бів іш щік Ж 5
Вка ж і Бін рко Бк зїуз іш ією1ш ХІТ ТУЖ тТгр о АТа бак тв кю У то 5 що
Зет пі Уві Бго 5 аАко Ба тек піу бевгоБІіЖ вк СТУ Таг Або ЕЕ
ТНК ке: тв ЕТ» яв хат ді шів вія 036 варі ве АТ Уві тТук тує
Сув піз Бл Яр тук Жах Тут вка Бе твг рве Є1У век бі тВк ве іви спіФф Бш1в уз зіЖ пі Бім бБіж бек бі шту бі зіу ек сію БІЖ їх жхЕ І зі бі Зк бі іх бі ші БШек бі 635 зі оіу ек Бій ді сів і45 за ЕЕ і івв шій віп Бгто пі із бів ів: УЖі ака бос оту аіш Же ді іт
Іїщ5 Ето Ах іен пек бух гу АТа хвт бік тук ХВ ББа тт о Звк тек ттр тів дав
І5б 855 Ії5 ткр жа! У бів Ак го сі бів біу бек обпім тка ЕТ бі йБа Ії є ше тук шко бег дар Зек тут ТНК да тУг БМ зі" у Ре іт а5Б Еш
ШЕ і ЖЕ
Вів тк іец тв оУаї Зв із вк Бег бек тт вата тек Мет бів ів его Бек вка ТВ Бек бії Ав Зег вії ді тк тТук СЄСьв ТЕГ оду ЗЕ вах Бо ЗБЕ ттр яка Бі вжи яв пе дв тТук ту ші ші 01уУ ТВ ОТ фев тве
БО ак ж
УІ Заг бек бак бік бі ші 1 бек вій жві бів іец ств Бій За я 8
Бі АТ Сів іє ат Ага вто сію іа Заг чаї у Мет бек Сх їв ща ше ще тТвЖ Яек фу тут тМК бе твї вка тег тт Мет ніх тв УТ ія 15 5 530 ХЕ БУ вка Бгто зіу Шіп Бі івм о біш тТеб Ії пі тує ЕТ дай Бо дек Ат зх ЗЕ ЗЕ іш тТукК ть Аж Туг Аж ШІ їУ5 БВе г йвр бух іш ТВ ішВБ ТВ 430 ЗЕ З
ТнЖ Аж Еш Бек Бак шШек ТВт Віа ту Же Бій бер бек баг івф ТАК
ЗЖ В Ви -вг вів дев Зак діяв ті тТУК тТук Суз вія дк туг тую Бр Ва нів туг ЗВГ бец ар тує ТгробБія шів Б3іу тв тв ех так ув! дек Зек 85 БА ЗЕ вм сі ім бі бу щехг бі Біх Біж бі Звеу зіу БЖ Зі Сію щек шіжш
Сі віх іу Бек бій Бі Уа! ів так оЄЗй Явт Був Ав ІТ мет Зак а ЖЕ ЯЗ дів звук вта зі НЕ у Мат так ОЖжеж тт Су ато від Щек Бек Зак чаі бек тук МеЄ аж ттр ту бів Бій Еш Зек шіюж ТВ бет Бе ік
БЕ я Бо дк отгш ІТ ту аз ТК баг і ді ад Бек Бі Уві Ви ТК АкКф ве я Те я
Бе дек Бі яв бтЕ жЖвк бі так Заг тух 5ежк ів Тв тів бак бек
Зх я шк
Мек сів ів бін ав Ав авіа лик тує ту ху БІВ Бі» Те жак Бак
КО ЕК Би
Ап оБгО їви тк Бе бі Аа сі ТВг огуз без ОТ ів іш ію Бу і жа іх ще Жук «Ті: БЖ «ії КТ «-ваЖМ» штучна.
Еш ЩК «вало щшЩтучне днтиткяз
«Ж Же меї Бі тра о бвт Су Іі» І12 івб5 ББе сем ті діа тат аїя тнгосту ї Е ї15 5 чаї НІ бек Асв жів Уа! Бей так Біб дет рРго БЕР бек івш тек Ух тТву аза бі бім і Уві ТК о Мех бек сСух Уа БЕК Бек віп бек фах
ЗБ Бе ЗЯЯ ЗЕ їшн Авв бек щі ва щіп ік ва тег бек тт тка олЖук віп шів ве 58 ІВ ва
Бгто бі Бік Ред Бга іш і вж з ев Ії тух ткр о АТтТа Зек ТВ Яга ах
Е ТЕ ТЕ ща цег ші чаї руб бло ака Ме тк осіб Зек о шіє ек зіу ТЯГ ва вне
ТВЖ веб ОТВК БТ 5ВК Бек УВІ 61» АТ 3 Ар ве ів ді тТук тут
МЕ їх ЩІ ух Бій би азш тТУкК бет Тут Бтб ББВе тВу Вб сту Суз бію ТВК їж іх Іа ІБ бен бі: Щі ув бік бі Бім і бек Блю пт бі бі бек дію ТК іх із5 Ії 53у віх Щек зіх ої бі бів щек Бім ім т зії Бек віп жж?ї бів іч Ки ід ее
Кен бів шія Рго Зі вія бій ів баї ага ко ші Аїд бег Уді іх івн Зветг Сьж гу АТа бек дію ТУук тк о БбБе так Бак ту тгв ТІВ дев
ЕВ їх шк тр Жаї уз вій ва ВЕГО сі бів Се5 їез З: тКв о Ітт1е зі вв їІТе іч ВОК Ох тт Буа бек йзшж Бек туу тт аа тег Би віп обу Ре їу5 зв ж т гІ15 шо діва тВг бен твгК отаї Ав ів Бек Зак бек тк дів Ту Меї біп їви ше ЕВ ше ша
Зак шек Бтба тт Звк бій Ав Хек аіа шві ТК туЄ Сув ТНФ вка бек шк ш5И БЕ ттр ага Біу йзп Бек Ре вро тую тр обБію вій Б3у ТВ ОТГ ої) те оре ЩЕ ж чаї Зв ву Зв дію біт віх шШіх бек шій Узі 15 іа шій Біб аб вк ВО ее тіж Аїа Бій ген ія в вко зіу ід Бех Уві сус Жатж бег Сув іч 5 тТвВг Бек ші тут так РНЕЕ ТЕ де тк тв Мет нія та оба зу іх
Зх хів Зх а йга Бгто Біу ші зішЖ іецй т: тео ІТ бік тТук 13 б5в Р вк ага
ЗІ ах 55
Біт тут ТНК йа5 тУК да сій іїуз5 ЕЕ іт5 азвіш вв ТК фе тв
Же Б Б тв в5Б губ ЕТ Бек бас ТОК АїВ тек МЕЖ бій бе) зак ек ре: ТНК 55 хо ЗЕ щет бів йо аг вій Заї Тук тет Суз АТя Агд о тує тук аБр дз В
ВЕ ЗЕ ЗВ тут дет іец дар о тук то Бі ші біє ТВ ТВ обео тк УВІ Беб Зевк
ВЕ ЗО 55 за -іу Біу піж зі Бек бі Бі сію бі Бек бі ПТУ жіу вію щеб БЖ
Ок ЗЕ За іш ші Біу ек жів ЖІіш Жаї фе» тн бі» Зек Бко АТа тів Меї заг
Ек а дів пет го ПТУ І ів жваі так оМежх тв Ск Ак АТа Бек бек Щек 535 я ча чаї Шетх ту Мет дяп тб» тек бів жів і ух Бек оту пак оЖек Бк Ех
У З 3 вага откв'І1в тук дав тТйх Заг оїуз УВІ! вів вт зі в) то Тук зу жах ЕХ ях ща
Бе бег те баг шт ес Біб Твгобек ту бах вер) лк т дет дек
ЗК ЯКЕ «ВЕ ще біб іх 5'в ах Аїд віз тТвг отУкК ту Су БІВ БІЙ тр ет бек
БО Ок ів ап оте гец тат о вНЕА дію 38 Бім їЙК гу Ге шт їшц оіує БІШЖ БТУ
Ех БІЙ о Б щет Ні НЯ Ні Вт Ніж ЯЗ 532 «ша» БЕ «гіЖМ БЕЗЕ «шіс» вет «ЕВОх «ЕШЖ» Штучне аитмтіла «ах БЕ
Мет шіу тер Зак сСух Ж12 118 ів Ббе їем таї АТа тк дів ТВК ої» ї 5 в 15
МЖІ Ні Жак Яр ЕТ УДі Меє тк осія хек рго бек Бек іемш Тк Уві тТБЖ АТа бі ЗіБ із Уді ТВ Бех хек Суз уз бБепг бек БІВ Хег ог ех
ЗЕ ож. як їви йзв бек Бі взв дій іч дак тик бе твгт тк; о тех бій сів і тв
БО ЕБ жо
Бгто обі бів РКО Рг їе5 іев зех ІТв тТук тк оаїа Зем ТВЖ дк бів
БЕ Я АН о бек бік Уві вкКо вар ага бе твт Бі Зак о біу бег Бі тк о взр вве в 5 ще тТвгорецб тв ІТа 5ет Бек Уа сів Ата сів йБрівв АЖ жа ту Ту
Зо іс КВ
Суз ЗіБ Яша дар о туг Бек Тут ра іїшш Ту РБе Зі АіЖ Бі ТВ ів іїви вів ем і уз БІ БІ БІ віх бек Бім вію щіу сію Шет ші БІЖ
Бім бі бек віт вію зЗіу Бі Щек ші вію Б'у Бі Зек шій Тіж пів 145 ху 155 вка іецз жі бів б5егк Бі РЕЗз бів зев і іш ко Зі БІ: ТВ жВі і х5 їж5 Ех їх
ІТВ Бек Се уз та Бек БІ тТук твК ББЕе твт ав тжК ші МЕЖ ях зва вх що ткв УВІ і Бій азів Бго сім і пі ев ої уз тк оЖМет бі тко ІїВ 155 ви за ап о твК ож тт іх ів во тТвб тк АТ озі ші: Ре і у с1уУ АКгФ ве Аія Бе бат ів Щі ТО ет а1а дек твК дата тек вве і ІТЕ
ТЕ а еВ Ж деп дя зви іУуз аа БІВ 55 ТЕ ів ТБг о тук вКе сСух вів дкш ре 45 В БЕ
Сіу рве сту асп Аїд Мет бе Тук тевОЄТУу 1 ОТ; тв бек уді ТЕ зо І85 та чУді Щек Зак Бе ші і ім бі бек сів жа Біб іец бів вів Зек
ВИ ша5 сіу атіа Бін ів аїа Яга Рг бі вія 5вег отУаі іу5 Меї хаб сСуз г 5 тТвт Бек 5іу тут тт вве тт АРш тТук тТвК меж нія ттроУді фу вів
Ох Зі ЗіБ 25
Вта вт сті бів Сує івц бів то І18 Зі. теж жїв ав го Яег АгЕ
ЗЕ Зо 5 біу тУук пп джип ту Яха Бій фу ББЕе г е5 ар і ув АТ ТК ієБ так
Кк кяя ВЖЕ Ба тТжг дов беж Бек бек Бек ТВ Ала тТук Мет бій ід бек Жак ів стве
ЕВ ЗО ЗБЕ ет Пі вет Жет о АТїа Уві Тут ТК Се Аза вк ЖжК тую АБИ Ази Ні 5 ж ЖЖ ЗВО тук ват їни; йазв тук тр оЄїУ сів сіб тк оте їх тт Уді ек Баг вх 53 55 а зі шіу Бі Зі шк оіу Біу ші Біу ет їх шт Бі ші ек оту
Як З іх
Бі іх Бі Бек вів ЕЕ УаїЇ іх тк іп ХЕ РК АТ тів МЕЖ щає з26 ЗБЕ «50
Ата дек та шту СІМ іє ді ТЕ Мет твт Су ага АТ Же бек об зах я Кк тУщі Жак туУук Мет вла тр отук сів 15 Буш ЗБК біуУ ТК Бек руб ке
БИ 5 Ба ага тгв діє ТУ дяв ТУ Бе зуб Ма: аів БЕР штіу ба? Бгто тт Ага
ББбпе зт ошію Бе і Ек ші ТВК бек тег БЕЖ іже так тів Зек жає
ЗЕ ло яа5 ех пів іш вів Азр ові Аіш ТЕ отУк Тут Су бів бій ткр бек ех
БЕХ жшЗЖ БЕ вп о Бте Єви: тТВт о рРМЕ Бі Суз БіЖ ТВ гу іви зів іен іу ЩІ віЖ -ЕК НІЖ НІ Віз Ні Ні ВІ же БЕ чЕїйМм «ші БЕЬ «тій» ВЕТ «ШУ» Штучне антитіла чем ЖЕ мет ПТУ тб» вт Сує« ЖТШ8 Хі ів: ББа сви уаї аа тт АТ тк ОбТу ї Е за Ех
УЩі Ні Жах ве жів Уа МЕЖ ТВг о БіВ Бек ке Бек бек ів) тм тв тву Аїв 1 ЗІШ бу аЗ ТВ Мет хек сух бує Зек Зак сій Бек і 25 а ЗЕ їв деп бег сту ав пів уєш да тек ім так отр тТук зів БІБ іх а Же ОХ ка шу вів ко вк іх ів ів Іїв ту тт одта Бек тт о Якщобів
Е я ЖЕ ЖАХ ек піу Уві Рез дер жо РЕ тТвкК Є1у бег Бі Бак С1у ТБ Ав вве
Вк 290 вк ту їв тт Еів бек Звгт Уді бів Аза Бін ажв іш Ат Мі тЕгОТУКЄ
ВЖЕ їі Те
С: Бій Ашая вв туК ет Тут РУБ і ше тТВг о БКе ші Ск о1їу ТВ ЕЖ
БЕХ ще ї155 іє зів сей іх зі ші ші бішж ек зу Біу аіж БІ Жак бі ту іш шіу Зак ді 51 Бу віх бак біу біу зі Ту Жак Біб Еів Сі їіч5 53 ІБ ше іем Уві Бій бат і Бто сій збе і У рра ві Біц тб УВІ ж
ІТ дух
ІТе пек сСуз іт вів Бек йпіх ТУК тВкК оБНе тк аа тукК іу Меї вх
Ії її 55 тер жа? їУув бій аа то сіу зу Суз бен оі у тгро Меї ім тур жїв ви тТвг яз ту віх шій Ба тик тУК За іш Бім ре їв віх ака
ЗЕ ЩЕ Ж
Бне дата БЕ ЗБУ іш: бів ТИР БЕК віз Зак тжг вата тук іви сів І1ТЕ в «33 ах ї4ч вже" йод ів іуз аа Біб барв тнк Аза ТВК о тТуг РЕе Суб від де об ее
ЧЕ ак ТЕЖ віх ВБа сі дев вій Жеї Ер ТуУК ткр віх дій СТУ ТВ бек жа так
ЕЖО вк ШК
Уві Вет ву беж ЗТ Біу шіжх бі Бек в'ій Ві вів іши шій ів БЕК сія ала іш іеш Аїз Атш вт Бі Аза ет жаї вух Вет бек бух век тв дек бі Тут тк о РБе тег вує Туг тВЖ Мет нів тт Уві зу і
ЗШ Зі Віх ЗЕ вка вте біж бій С Бей бій тер жі 035 Буг жїе дзея Бта БЕК ака
ВЕБ З зах іш тет ТВ Аж туг аа шій гс5 БЕ гуз длроі ув Вів тк івеюостВК
ВЕ ЯКЕ вк тТвт АБО їв дет Бвб бек тТНгойта тк Жет дій рев бак бвг фей отяк 5 жа Зк дет ів йзр зву аТїа УВІ Тут ТК Суб аз Аг тує тТук др дещо НІВ
ЗУ зи ЗБ тТУуЖ Бвт їв) йзровБує трі Бі бі ТВ тк ге; тв Уві бек Бек
ЗБ Ба ЗЕ Ка піт вБіш шіу іх бЕК зір шіу Бі БЗу бек зі» зіх віу шБію Бет ш1у
Зо ЗІБ ве -ім бі іх Бех з'я Кіз Ма! ією1 тт сій бете РУБ ТЕ Ії ЩВІ Бех б я І
Аів бфек рт шт» З'ю уз Уві тк Же тт Ст Яке ат дет хек век «ах і 55 хі его тух Же аз тка тує ія Зп іуз ву вію ТУ Зах бкб і ше
Ага тго Ії ТУУ йо Тпг бах ів ві Аз бек оту Уві йо тук Ага
Ше Бак сіу бат сту Бек ШіУу ТНК Зак тує ву вб о тп Ії Бек бог
Мет вів Аз стін ваза ві вія ТАК отТук тут буз шій бів Тр оЗек бак що 295 5ІЗ
Ап оБто Сей тт бе сів Се ші» ТВ іш фев оів івм іш ім у хіх Бо ах ат нія Ніж нт НІ нів НІ а ЗЕ «кіл е БЕ «гаї» 535 «іже: вет «ді» туз на. «Еш тузне шятитіла сабо Е
Мет пі тк обех Сує Кіа тів єю Бе іш фа) ата тв ата тако обсте ї 5 жд І5
Мді Ні ЗУ Бар Ії ді Кек ТК обі Зем Бго ет Бек ів ТВгОУВі твт вів ші тіні у маї тк меж его оСух із 5ег о Бек шій Бек орех шою 55 іш аа бег аїіт й Бій іч шва Тут ів ТЕ ОткКБ тТукК віп ів і уз
Б КЕ 55
Кто ві спів Рко Руб у їіеш ів Ії тут тгроАТа Бех тнх акш сів
Б. т я БЕ дет Сіу ді вКе Ахо Ага вне так обі бат бі Зег біфу ТЕ вх НЕ
Тіт я тк ЕТ бетг Зег уд! дів віза Бін Ар шк ід ді туго тк
ВК ве ВЕ уз Біб дбе аж тУкК бат Тут Бо Бе твт ве ої Бек бі тво ув 115 ЕЕ ЗЕ ем СТО ІТ уз Ту 15 вік фу шек ЄїУ ту Зі Б1іу Бебі ТУ і50 135 за ту Бі Бак бін ту зЗіу іх ект бі Бі віу бі Бек шій сЕт бік зах ІБ ІК їБ55 їм сів бів Бгто вію АТ ші іев мЖї ака вка оту ад Бет Маї їх ік іт їТЕ їв о Беат СУ груз Вів ву ші тк тк Бе тт Бек тек ттр тів АБа
Ії і55 КО тТЕв'Жаї іт вів кв Рез віє бій шіж ів бі тт жів біж ЯхвВ ЕЇВ тТук Его» Зак йзв Зег тук ТНМК век тук ав зіп і 5 Бе іух дев ів
Ів віх Фш
Віа тн іец ТКгОтУЯІ дво і хе бек ЗеЄк Бет тйт аїв тТуЖ Меї біп ів
ШЕ я таЕ ЖЕ
Зек бат Бе тв Бек бів вв оЗек зів ді тут тТУК бу ТМ Ага Яег
ЖЕ Б ЖЕ тв ака Біт ап бЕайк РВЕ вх тТук тк ошіУ ШІвБв осі Теж ТК оїеу) тв
ФУ шак ЖУК
ВІ Бек ек Бех ТУ Б3іу бію ш3іу бек бів Уві бій їво ші щів бат іх аїа іш ів аіз ака вто ш3іу Вів БЕг о жаї гу МЕЖ ЖЕК Сежв їі у5
КВ 285 ОХ тк Жак сію тТук тк ве тяг о йако тук твуУ мех нт тр ому! ів сів зах і 15 ав агщоБгоа Бі іп су Бей біз тер о жІїє вію ту Ізе йап Рез Жвк дев 525 аа 535 ші тек лак зи отТУб жи бій іт ББЕ 15 йвр ож та ТК їв тВе а 345 ЖЕ
ТНК дев гу Бек Бек ву тТиг о Аїв тую МЕЖ ів ін ех Бек фен тВг
Зк 65 З5 дек зів дев бе Аа УВІ Туг тег Су ЇВ Аго ту тТуУкК ЕВ доб НІШ
ЗВ ат ЗВО тЕК бак їви аю ТК тТКо Бі вій бію ТИЖ тТвВкоїєв тБг Уа: Бек бак
ЗБЕ жо БЕ НЕ пІіУ бі Бі Бі дЕк біт Бі шію БІ бег бі дію біу ші Хек БЖ сі віх зіу Бек зі Е1е баї ів о тпг ів Бет Буз вія Бі Мет Бек
ЕЕ 5 ла зів Бек Бга віх Біб ів я) так Жеї твВгохух ага дів Хек дек Бех ах За 5
Уві ек тут Меї яп тр отжк вів 013 іїух Бек йпіюЖ тк Бек ро іх
ЖЕ ЗБЕ "ВШ
Яка тгвБ Ії тут дов тнуУ Жег їе5 УЕТ Та Же Зі Маї вко Тек Ав зе: то ЖЕ ЗЕ
Бе дек вік 5аеж ві Бек Біу ТК БЕК тТук 5Зек іш) ТВК ЕЇЕВ Хек Бек
ЕК Я ак
Меж вію із він дев Аїв аїв Так о ТукК тжу муз зів швів Тер бек Бек
КО вик 5 вп Бк ів ту РВЕ БЖ Су вію ТвВКоіує ів ати зіву іє йзіу БІТ зі: ща ЕЕ шет НІ Ні5 НІЖ НІ Ні БІБ
Е5Е «ЕіЄМ 58 «Вік: КЗ «вгісУу БЕХ «віз» Штучна «ЕЕ «ЕБЕ» Штучна витшті ле «Ве Б
МЕЖ еішЖж Тв Бек КУБ І1в Ті їє5 ББе іє ат іа тк Віа тако БІЖ 3 Е їй і15 тді нта баг АБ Ії УВІ меж ТК Тв пет Рго ЗВ г Бак зеш тТВК жа жа ХЕ БЕ
ТвВт Аїа іу сім і у5 шві ТМ мес жаб сух г ух Бек ат шій аб ев
ЗЕ ше як їєв хжи Зек іх вле зів уз й Тук їв тк те о тук Бій Біб вк ща 55 жа
Бте віж зів Рг Бгто і в іє ЇІїе тек тр дія Зак ТНХ да озі вк т 75 ЩО ек вік Маї Бго ази Яга пе твгобіу бек бін ек бі ТВ Ар Бе ще ще 5
ТВ Бе Тит ІТЕ 5евг Бек уві шів АТ біш АБ ів АЇШ УВІ ТЕТ ОТУЄ
ВКМЕ іспЕ КЗ
Ежв еім ши Вер отУкК дек Тек бгб Бе ту ва ві Куб і так гу ї15 їха ІТ
Ківш жів І)в іх зі Ту Біт сім яв ожіу зі з'ію 5іу Бех шіх БіЖ іде із 3 бін вік Зек БІіх Біу йЗіу Бі бек єї Бін Бін біу Бек віп Уді їв іч А 55 КУ
Бен вів бів ко сі 81 бін ів Уві дк вго Бі Аїд бег Уді ів їБ55 іто ЖЕ
Кецп шет Сує іш Аїя бек ші» ТУк тве о ББе ту бек тук Тур ІЗе дав їО їі55 ІВ тЕв'жаї їж шій акшж вго зі шій Су гемо обте тгтр жів біу ва ЕТ їі55 КН «ОБ
ТЕК Бго Бег ар бек тут ТВ а5к тУг дам біпітш Ре із варі
Іс вх ХЕ ів твВг без тМг ота! йжа зує Хек Бек хак ТК Аа ТуУкК Маї Сів ев ж Как ЖЕ ШЕ
Жет Зак БгО тКг бек зЗіз ав Бег Аза хі ту о тукК Су ТТ Ака Зак
ЖЕ Же їЕ тур ага Бі дп хек ра бер Тук тиБостТх шій БІ ТК ТВ о ішвотаК о ве ЖУВ жі Жег бек пек ік 1 Бі 35 дек бів Уа! бів бви бій бів бек
ЖЖ «83 5 5іх Кіа Бім ів Аїв ага Бгто Б3у 18 бек Уа і у: Меї бег Сея і ж
Ве 5 ЗО тв Бек еіїу тук тк орав Тег дка тег тйгоМЕах Ні то Кді і бі1х жук зі ЗІ 2 ака Еге бі вій Су іє; бів ТБ ІЗїв о шію БУК о жТе дяк ВгО Хек ака
ЗЕ5 В ЖЕ бі тт Тв Зап о туК дал іп ія Бе іє ар іє ів ТВ іев тк
ЗЕ Вл
ТВ 355 Еш Беж Зек дет тк Азія тук мех зіпйп іер Бак Бег їв твк
Зх ЗЕ ях бак сіб: вза Бек АТа Уві тТук Тут буз Аів Ага тує ТУук ар ЕВ НІВ вт т ЗВ тт Зегт їз а5р тк тгр осі ій біу ву ТБ ів; твК Уві ес Зек
ЗБЕ За 5 КНУ еще Я «Е ві шіх шіу 5вгобій хів ді ів тв дій бек вто аів тів БрІ Бек ше ЕЕ ща дів бЗег БО пі Бі їх ді Тк мех тв Су Ага Аїд Ху бек жаб я я 55
Уді щек тк Мет дя тв ТУ ів БІБ іш 5шЖ Біт ТИП Шег в і ж ага тка жів ту дала тах дек о іу чі ів хвТ іт Зі Рг тує ака
Бва бек бі БВ іх Бех віх ТВ Бек тує ще іх тВвК тів Бвг оЗетг ж чвВЕ мех бів аіж іш а5е дід атТа ТВ отут ту Суз зів бів тер Бек Зв
ЩО за вій
ВЕ уз їБи ТТ Бе СТ Ку біу ТВ овуз ем от ївц ої ує ву ТУ ет нів НІВ Ні НІ НІВ Мі ша вк «ії» ка «тїЖе Штучна «ФаЖе Штучна внтитіле «Оз що
Мет Біт Тер бат су ЕЇ їі ів: ББе бе за) Та тв Аля тв іх ї Б а ї5 тді НІ бек Асв о Ків ві мес тТвкК бік Бет го Яек Бак без тв ЗВ! тв Аів бі ів ву жі ТВ Бе бат бує жа Зв бек шія бе бек ів лю пек ші бан іп і уз дав Отут бен тт тТЕвОТУЕК ШТ Бі Був
Ба БЕ о:
Бка біу шій Рто РК їУ5 іа ієБ ІїшБ Туг тТкв аїв Бек ті яка 515 в то т75 ва ет біу ві Рго Азр аг вне Тв оФфІіу бБег ТУ бек біт ті йо вве
ЩЕ 50 ВЕ тТвЖ ів тпК жів Яетг бек уві Бій Ала Бін йзв івО ів о шЖаї тТук тут їсо ізЕ МІ ств бів бал ар тує Бек ТЕТ БеБ бен ТВ вКе вію аївоБіх ТК бух їєм іш іви бу ТК ШІЄ СІМ ші 5ег обі Б'Ж ШТЖ вію Бек Бім Ту
З їщ- 133
Сі віЖ бек мі зіу ШІЖ СіЖ шек бі Бір сту оту Бек Бія ВЗ ТВ
Іїч45 ІЗ БЕ 15 ієн тд бій в зі рРгЗ бів іещш і Бу РКО ШТ ім ТВ МВ гу їш5 ЕТО ДУБ
Іїв БЕК Су Бу Аа Зек бі тук тнт ве тт аа теж ші МЕЖ дЖй
ЕВ і їщ ткв Уві гУу5 Бі АТа Бгто Бі іу5 ТУ сем їх тк мех сіє тк жїе вп о тнк вза те бі бій таз тВвкКотУкК Та ЗІБ ЗІ й іч шіж аКщ
Іа АК БЕ
Бе АтТа Ббпе вт іо ЗІ тб бек авіа бек тк о аїв тТук іев бів Іїе 235 СЕ «ча вп вв іец із ав бін а5в ТВК АТ тВЕ туж Ве Се їж Яка ее
ЖЕ БО БЕ
Сіу ББе сіб а5п о аїа Меї а5в тТукК тТкш Бі Бій БІХЖ тТйх еф Уді так що ик Ж
Уві дек хвк бат Бі 51 Бі ші бек їй Еїе таї іенш тв ТВ 5Зек
ЖЕ ви «5
Бгто в'я ї1ів Меї бек ав бек Рго о Бію Бів бе УВІ тп Меї твкК осСух же щЕ ОО ака ів вк ект Бек Уві бе тТук Меї аЕМИ ТКр от їй Є1В фу Зв їі ТК Жак вто уз бла ттр оті Ту бар ту Бек із а! віз ек
ЗЕ Зо жа
Сіу жа! вга тут ага Ре дет Сію ек Біж ек іш ТВжЖ ех Тех ех 546 Зак ж їеч твВг жІЇв Бак зви Меї бі: аа 315 й5р о ата аїЗ ТйК Тут тУК Сух хЕ5 65 ЗБЕ сіп бів тка бек бек а5в бгаз іеб твВкК вве Бію Су іш ТБ Ем В в
ЗВ ак ЩО сін во гу Стіу СТУ бі Бі вк б'ю Бі 5іЖ 5ІЖ хек біу іх Є13уУ 95. вах ща їі дак віх Бі Бі Бі хе бі бі Бі ТУ бе бів жа? бів ів) ах ЗІ ЧЕК сіп бів бек Сі аз бій ів віз дб Був БІ АТа хе Уві і ЕЕ
Я 5 Я дет Суд імя ТОЖ ву ЗІ тт ТМ вне тие вка тук тк ожет нів тв
Я жа
УВі гу вія ака вт 1 бій Су ев єї тКрожїв бі тук Ії да ж 5 «5
Бго беговга сту Туг ТКкК яв Тек дав сів 5 ВБе ге ашрв ох я
ТВ ем ту тв Азов ів ек бек бек тВг ата тук Меї сій іецв ек 5 я жа бек оівв тп Бех бів яр бек яіз Уві Тут тек СУБ АТ Ак тує те
ВЕНУ и ІВ ав БВ Ні ТК БЕК Рец др тує ткровіх біп пТу тнЕ тт ів тнЕ
БІХ ка ЗЕ заз Бек бек іх біб бек НІ Мі НІ НІіБ НІВ НІ вх ЖЕ а «іо» і «ЖІ» Бад «гаї» вв «ВО» «ВВ» Штучне шнититілье «ню БІ
Мет іш ТКА жек Ста Кі тІі6 їв; Ббе ін Уаі АТа тк від тк Ост ї Е Ії ї5 чді нів Жау ар Ії Уві Меж тег 315 бек Вго Зек бек івши тТВвкК ха ту Ата зЗіу ШІ іє баз тт мех бек Св і ув Бег бе віп Щек іє а Я 5 їен дат Бак Бі йди Бій іш джКй тТук іш ти тТкКВОтТУК Біп шів іш
БІ ж 55
БШБте вІЖ бів Вко бо гу івеБ ією жЗв тт тгроАТа Хат тк о АКе бі 5. то ТЕ що чат сік фаі Ко зв Аг БНа тТвК о біУ бек біб 5Зек бі ТР Яжа БЕ
Ес ЩЕ
Тв гвш тк Іїе бек Бех Уді бів іа Сів йшр ів іш Ма! тек отже
ЗКНХ 15 М уз Біб вжи ар тТуг Бах Ту рРкБ Бевз тт вБе пТу Су Бі ТК і їх жи іт
Кеш бі: сен ож бі Біу бі бі Бек ші БЗ'У СТУ зі Бек ші Бі їі Ії і тіж бік ет зі бік ші бі ше б3у бі бі вті Бек шій ІЗе бів і ї50 ЩЕ іх
Евшв Уж Бі 5 Ж біт Рг БІБ їівБ ге уз Рг ЗІУ БІВ ТВОЄ і ув 105 І їх
Іїв бек бух іт вів ву БіЮ Тук тв Бе тк адм тУкК бі Ве дах
І5О: 155 ДЛ тКр Жжаї бу Бій вія Ро ші їз Сх5 іеціжш тгоОо Мет бі тТко ІТ доп тнг ойав теж бі бій ви ТВ, ТУЮ ДІ пі БТ: пе іух ЗУ АК
І гі: в
Ббе дата ре хех іве бір тк бек 315 Зег тк АТа тТук зем 31 же
ЕЕ ЕХ ЖЕ Ж вп ал іец іт вв біц вар ти аа тв Тут Бе Сех та дк ЕЕ ви 345 зщо ЕЕ -іу ЖБЕ Сі дя АТа Мет ав тує твоєї вій БІіу тт Бе уві ТЕ тУді Зег бек Бек зі іх Бі іч щЗег іп жтв Маї бецш те бів Заг
Ккго А1ш Ії МЕІ Явг аїя Хе вго бі 615 і жві ТВгОМЕ Е Тв Су
В ак ЖК акп вія щу бшат Бек Уді Бек тУк Жаї дп ткБ ту бік бій і У Зак ші тВт Бек Ркз іх ага тгроїтів тут дз о тг Бек бу МЖі ів Зах век як ах с-іу ді БгО тук вка Ме хек сік Берг зу бет ої ТЕ Баеб тук Зак 305 ЗЕ БЕ іец тт жі Берк бак Меж сі від Бій йзБ ага ід Таб Ту тек Су
ЗЕ БЕ ЗЕ
-іп шій Зв Зег Явг о вазп Вт ів тт Бе іт Суб бі Те їі Єв
З ЯК БИ
-ім ек ів зі ШІ Бі Бі ек ЗУ зі аію Бі щежг оту бі У 5іу дет бі Бі іх бі дек бі п3У бі ту бе бій Мат шів еш ях я ЧЕ шіп бів як ІМ атТа Бін іемш віз вкщ Бтє сію вія Баг УЗ іу5 Мет
Бех Сух їеЕ ТК ОБУ ші ТУ ТК Ба Тв ака тук Тит Меж нів тив
ЗЕ ЗЕ я чі гу іп ага Бгто бі Біп Се5 єв Біб тв ОІВ бі ту ЕТ АВ
БЕ ак шо
Бгто зег вдо БтіУ туг ТВЕ бал тук дсп бл і жа Вб г ес Вхв ів дів
ЖЕ и ЯлЕ ай тв Бен так тг ЯЗ уз дек Бе Щек тик дій тТук Жет пів іву бек
ЗБЕ Ех «5 дет ке тйК Бек бі дао его вів Маї ту тег о сує Аїд вд тк туК в ЕІ НІ тук БУ іши йжВ тк тиф ші БІВ шіу ТР ОТВе фев отв
УЗ Зет Беу 5іУ 515 Звук Ні НІ НЗ5 НІВ НІВ НІВ
ЗБЕ КЗХ а
«ЕЗї» БИ «їм ВАТ «вії» штучна «ЕК» «ТЕХ» Штузне детитіле «або» п
Мет ві та бек Се ЕТ Ії їеБш Бне іо ді Аївз Тв ВІВ тТМйк Бі 3 5 15 І чві ні Бек аАзрв Іїв Заї Ме твк бів баг РК 5ег бег ів ту Ха
Кз ах ВЕ твг а3іа зі 18 ї5 ві ТВ Меї аг о Сує ж Зв бек БІ? ек бе ще ча з івн вав пет бі дей) 21 ух дя ту ів ТВ ТРЮ тТУуК БІВ бік Був до КЕ ща
Ккго пі бБіп Вго РЕ їз івО ія: ІЗв тую тк о аіш шу ТЖ вка 61 ек то тк щ
Вау нію ВІ вгОо ааб яго вне тк осту Бек зіу 5ег зі ту вер вва
ВЕ ЩЕ Ес тТвтТ ве ТК ЕТе Бвт Бех УЗ із із ів Зв Бе: АТ УВІ тк отуж
ВІН а В
СУ бів За аз Бек Бех тує га бе тВК Ве бів бе сі ТЕ Ежя іев Б'Ю Іі іш ту ЗІ Бі бБію Жак іч біу іх бі Хак сію БТ
Ії ІЗ ЕщО бі ш3іуУу швк пі атУ зіу шпіу дек шім бік Ті ЗіЖ бек віп Ужі вія ї45 ІБ ХЕ іща іев вік ія Рго зі АЖ сіб ів тЕї ака Ро бік іа бек тшіР гу 155 їто5 ЖЖ іє Бег Сус і хз вата Бек ші» Туг о тВвК о БНе тб бег тТук Тер о ІЇВ Ал
АВ ік 5
ТК жа їв бів ака Бго Бію зів біК іш бів те: Б1іе Ту де ІЛ
І5 2 же тткК Ека бек др бек тТуК ТК дов о тУукК дя В БІЙ Бу Рв іч лаяв ік
ТВ ту св) ТЕ Уа) дар і Щек дек ах тк Аїя тек мех зв сем
Ек БЕ ше В пет Заг вто ТК Бек бін ав ек дата жа) Ту те Суя ТУ Ак Бек ш5 Б ЖЕ
Тквр ак сі ай ЖЕК ВВЕ Аа Тек тТКВОбів Бій пі ТВК ОТ ів оте
ВХ -Е5 ж жі ек дек Бек дію Сію Бі шіу Баг бій Іїе ді іван твкК Бі Бек ж Ва ЕЕ
Бго аіз Ії Меж Хвт а|ш хвх рт БІ БІ У ші ТТН Меє твт Сех
За 285 ЗО ка Аїа шек бек вт ді бет тТук Беж Ап тжротук бій бів су5 58 ах зі 5І5 зе їж тк дек Рг ух ага тгтр її тб ар тт бек ге жі Аза бек
ЗЕ ак а піт Уві БО ту ват РВЕ Бак шію бек ові дек ші ТЕ Щек тую ЗВУ вже -а Ж іви отвк хів бак бЗвк Мет бін Аїш сів аж вів вів тТВК о тТУг тук сСюж
З55 хо ЗЕ щей ЗРЕ ЗНО пін ів ів Бі ві бі бі Беаг іч бік Бі ші Зек шіюк шіж у 355 ЗО Зк ща ві Бек шіу віх пі БЗіу Бег б3у Сі іх бію Жег о шіп Мі 518 1 835 ох а Як -іп пів Чек біу ії: Зіш іч вія аг Бо бі йїа бек УВІ іт МЕЖ я Жах ВО цат сСух і тмгобег о біу Ту ТНК вве тк оАко ТК ТБ МЕ Ні тр
ЗЕ Я я чві іух сіп Атя Ртє зіу зіп Суз іез БІБ тт Бі бі тТУукК ІТЕ ВЕВ
ЗО а ЕК шко бек ага Бім Буг ТВК Ав о тУкК аа сій і т5 БЕ ів Зв У 18. я жа ЕІ ча тТвг о івеб тк тТБК Азов уз хау Бек Веб ТК дтТа тук Меї Бій ів ще
Зак іез тк бек зіш й5р Бек аїа Уа! Тук теж Сує АТаа ЯгЕ тує тТуК
БАХ ІК БЕ вер а5о Ні Тук о беаг о ген до ТукК ткрф Сім бів бі тТНЕ ТВ оії8б5 ТВ -Е5 БЕЖ ЕХ
ТВі Зак бек бі б3У Жау Ні нія НІ БІБ ІБ НІВ еВ ЗЕ ря «ій 55 «Ева «іш ЕТ «ФУ «БЕХ» Штучне дитмтіля ит 5 меж шіж тра жвг оСує ІТе тів ів Бе сей ха) аїа ту аіз тк оБіу чк)і ні Зег дор ІїТаа Уа! Меж так обій БШегт Ркз Зак Зв без тк од! тк дів бі іш гу Уві тіж Мех бек Ку іфт Бек дек бій дек ев
ЗЕ а Зк ішц Ба Бак пі зв БІВ іч5 й туК ши та ОтТКМ тек ія БІ і У хЗ ЕЕ ща
Бгто піт вів рес Бгз іїУ5 ів ів) Її Тут тр о АТа Бек ТНК де шів
Вк ТЕ ЕЕ ему дек шіу Уві Рго Ахо йо БЕ тег оБіж бег шіу его бі тб яв вва
ТлВт ке ТНК жТЕ Бек бах ві бів вій біб Арі) АЖ ді Тек отУК
ЩО і05 Ід
Сує ів бшя взв ТУ Бех Тут Веб Ббе так ре Ту Су Бішх ТК ог ув 1: Ах і івн вію І1ЕЄ ух БІ БТ БІ Бі дек бік ту БТ зі Заг о шту бБіж їжа Ек іЖї ві шію бек Зіш бік ші Бі Бег бі Бі бі шбтїу ву шій МАї Бій
А їх ї5 ек іев вік Шія Бгто ЗІ вів Біб івю баї ау Еко 5іУ ів Заг УВІ г 5 ін Бет Сус іх аа Щек Сі Туг тТвкК Бе тбт Бек тую ТЕжвБ ІїЕВ ДеВ
ВЕ і55 іще тер жа: їз щік ага рт сі ів у гшщ обі КО БЕїе 515 вав жІїВ і55 -Е ще тут Бто жах зд Бек ту ТНТ б ТЖЕ ДЕ БІВ із РВЕ іуш й5Б і У
ТІК 215 ЖЕО від ТВ бе: тву хаї ахр іч Ше бек Жет тат аб тух Меї бів в дет Берт Бгто тв бак бів Азр о Бек аїа ві Тек тук Се Те де Щек
Я г БЕ тТЕр ага сшіу айви Бек бе Яр тут ткв'сСтТК БІВ ЗТУ ТК ТНК їі ев ТК 2 БЕ ЖУВ
Зі чег дет ек шт СТ Біб ау Жек бів жїв ха) ез твг їв век
Бгто віза Ізїе Меї Зек вія бБег Бгто діє Січ із Ма? тТВКОмМеї те Сух ше ВЕ а вата аа баг 5вг бек Уві бек Тут Же ап тр отує Бів Бій зує Бек
ЖЕ Зі ЗЕ5 КО ім тк о бет Вго іх. ви: тТтр Ії Туг Ба БР Бек іже ха) дів ек
ЗК З ЗЕ пі Уаі ра ту Яке Ре Щех ші бек бі ет ОЇ ТВг Жак Тук баг 30 ак БЕ
Кен те хів Зетг бек Меї Бін АЗів шіч ар АЇВ ал тп тук тУК Су
ЗЕ ща Зх віп швів ТброБат Бек вав Бгто ів ТВ ОБне сіє Су Сі ТЕ і Бе
ЖЕ ЖЕ ЗО ів ішфоітш Бім пік бі бі Бек Бі Ту Бі шїу ет СТУ БІ сію
ЗЕ ЗВ ще З зі Зек бі Бім пі біу во сію бБіш 1 зі Бек бів Уві бів ев
Ох З І в ошів Жву пі їі бів ів дів Ага Бгто Є1уУ Аїя щег уді ія МевЕ
Уго я ящЗ дек Сує Куб ТВ БЕК бу ТУ так ББе ТВ ака тук ТНК Беж ніх ткв я я ах
Ві і бів ака ко У вів Су5 вові тео ІТш Біу ТУК хв АВ
ЗБ ЕЕ я
Бга баб вга біб ТК Так о йЕЙй Тек дев біпоі У: Бе руб дер іх да
ЖБ5 ЕЕ же БЕ
ТК ів тт ту а5рБ ів Бег Жак бек тТВг о аіа тує Жеє сії їен Хвк
ВЕ 5 ах
Бех ге тТї бБетїт Бі; Ядро Шег за жаї тут ту Сує Аїд Ага ТК ОТуК що ВЕ Ж дв АБ НІВ Тух дек ів: йзв тек теробіу Ш31я ія ТБ ЖБК івц ТНК іх БЕ ще5 ді зак бек шіж ші Бек Мі ЩБІ5 НІВ НІВ НІВ НІ
Ів КЕ вав «Ей ща «Ей» а «Абе ВЕК «гіх» МеЕз щизсніша «ЕЕ ОВУ
З ІТ їУш івч ші віп Бе ші аза Бін фев АТа ако Бгто Бі іш ії х І їх ет УдТ Бех Мет зе бух іу5 ТК одек бі теж ТК РВЕ ту ак: туУж
ТЕ за тт мет ніх ткроха? У сій ака Бтб бін шій ОЇ беви бів тквоІЇЇв
ЗЕ Я З сФту ТУК Ів Ап о вбто 5ег Ато ші тує тв ап тук ваза шій зу Ве
Б БЕ яка їт5 Асрокуб5 АТ БК оіїен тТВгОтТВК Ашв ог уз Бах Бак о бБетг ТВ АТа тек
БЕ ЩА як ща
Жеж сій Кен бе Бег і-й ТНК бек і 5; бек аія УВІ Ту ТЕК Су ів зго УК Буг ав деп мі5 Тук Зек іек ах тує тир віх вів ві
Ки ік їх
Тв тк бен тБу Уді Бек ек 415 «ЕВ ще кгіїх 1 «ЕЕ БЕТ «шіле МщаЕ висів а ВЕ їв бів бів Бех біу вів Сім іже Аза Акад Рго Біу вів Бет ді Бех ї Е їх І
Жмеж зег суб іт ТК Бек шіу Тк твг о Бле тк Агс отут ТвВг Мех із тв УЖ: зуб бій акд ва ші ій еБіх івеб боти ткр о ж1є ші тек о жхї1В
ЗЕ ча ще дова вгта Жак Акд оту ТК тіж дз туб дай шій фу РБЕ і ж БЕ БЕ уж
Б ще да іа так о беи тв ТБг ойзріхв Бек Бег Бах ТБ АТ ТУР МеК бів ЕЕ
ЩЕ т ТБ Зо ех 5ЕєК Кед тА 5ег біш аз» Зек за жі БЖ тУГ СУє Ав аг ту
ЕЕ хх ЖЕ тк ар БВ НІШ ТУг ву ії вБ Ажо ТУК тв БТУ СТБ Бію тк ТНК ої ех б іт її тТБт жа жак вву «КІ а «її» 153 «ЕІЖю вт «абз ще ех тк шій дет би дів І) ех БШеєг АЗа баг ово Бі бів гу жд ії 2 15 ХЕ тТвБт мех тк Сж ага одіж зе шек жег УВІ Зк отук Мет й тв ОТУК шіп вій кеш Заг ожіу ТАК Баг уз іш АКФ ТЕО ОЖЇВ тек дав тТвК Бах я ЯЕ іуз ві Вів Бег оту Уді вто Тук ака ББе хек ЗІ Бек Сі Бек ш3у и хх ва тт дек тук Явт ге: ТТН Ії Хек вт Меї щіш аАТа Бі ар йіа аа щЕ я У ща твт отук тую Ск біз шій тер бек Бек ає» вка ії ве тк вва бі аїд
ЩЕ рОЯ ще
Іо «ат ОБ «ії» Же пнияситще «Ме я
БЕР ІЛе УВІ ам те бік бек бука дек ІТе Меб бер о уаї бак вка бі ї 5 а ІК ів іа УАІ ТВО ЕТЕ ТПУ Сух ек Аха бек Заг вт Уді хат тТуК ЕХ
НІ ТКО Бе стіп бів Бех Вт о бію ТВ бек ко і ук їз ів їЗв оту
ЗЕ За ЗЕ
Веу тк бек деп ів: ад бег бір УК руз вів ака ве кет сію БК 23 5 жк шіу Щек єї тат о5Зек ту Бег ів: тТВК ІТ баг Акж уд аїа Аїв ші шЕ т ЖЕ ва вар оала від Тит о тук тек Су Бій БІБ ваш баг а тую вго Бта тек твЕ вне Біу ту Бі ТВ іуз іеБ СТБ ші і щ
ІК із ч«жісю БВ «Каїн «Есе БЕК «лів Ми тизсміщ5 «ОШе В
Іїв Ужі сви ТВ пів Бех ву бек Іїв Жеї бек заї Бек Бета сію З ї КЕ Що І5 іуз Ві ТК ЕЇВ ТОМ Суз бБег 81 Бек бег бву хаї ек тут Мех ніЗ
ШО ше КУ тер вна вів дій жо вто Бі тик о Жек Був їв ів рез ІТ тТукК аж 35 За ЧЕ
ТНБ бак вав ів аїа ву Сік Уа: го ід вка РЕ Зет бБіу аг обі
ВЖЕ ве що дек шішЖ ТВ дет тукК Бек іш Тв ІЗ бек ака Уаї Вів іа ші: йдеш ек та ТЕ що аів віз ту тжу тТуУК Суб бій бів ву бек дав тує вбго Бгто тевотТве вк ВЕ
Бе бік сіу їх ТВ їв зем Фі ІЗВ тк їпе 105 «Іі БОБ ше За
Ії Жаї їецй тк оБів хви бут Бек Іїв Мебї бек ді Зак Бгто іу 1 ії Б 0 15 іш: ЩЖАЇ тик жІТЕ ТК Су: Зве дія Бет бек бек ді Ек Тук ВевІ НІ тЕв Вб ія зійп губ Рга бі ТвВк обет ка був ів» отгтроЇтв Туг Бек зе з че твг баг всв ів АТа бек біє Уа? Бка ків ака ве бек Біт душ бів ща Ех а ет ші тп щег тТук бек івм тк ІЗ бе ака Уді АТ ав 01 дав а 6 Кк жа
Аїа вія ЗБК тек тк ж Сів 5165 Ява о щшт вай тТук вВкЗз Бго тТУБ ТК ве ще в вне ШіУ бі бі ТЕ фу івш сів ІїЕБ г ух
ЕЕ з «жі Цю
ЖЕ ДО
«вії» ВВ «гіЖ» Мих яшхсм ща жІів аї ви ту біб бек врЄб бек її Меє бат ба! Бек Ртз іх БІВ іуш ВІ ТНК Ете ТК Суб бек віз бву Бек Заг маї дек тТук Меї кі за ЗЕ хо те БНае сів іп бу виз бі ТВК оБет БК ув і ез дак тів Тут бек
Зк ях «Е тнг Бек Яшл ішщ йїа бак ші Уві гз діз ка фе ет ту ага Бі
ВО КЕ БЕ дет щІЖ ТК о жет тує Бек їв: ТВРг Ії Зеаг ага Уаї АТа АЛЕ ів Ар в то ТЕ во
Аїів ата ЗК теж Тук Суб бів біз го Бег бва тує ге ри: тов отв а5 ща ЗЕ
Ба обі іу біжЖ РМ губ івм шт: І18 гу ж їх «іще Б «гі із ех «ФЕЖе дІСпеиФТчнаЕ МОопехула Ж «Ох 01 мет ші Тр о яак Су Жів 112 іє: БВе іш жаї АТа тк о Аія ТВ сту ті НІВ бек др БТ і ух іш бів бів ат бі Ата бій їіез а3за Ак
Сх ак За
Бтшозіх вів Зак Уді руб Мей щвт Суб іт ТБК вк сію ТЕТ ТвВк вне твЕ дкш Тек тБЖ МЕ нія тер оУді і піп вка Бгто пі піп ЗУ їв ща ЖЕ ща сів ткв жів тіж ту Жів дк Бо бек дка бі Ту тк ап ТУ ях вк зх як ща піп гу Бе ів ар їу5 діа Тмт Бек ту тКг ОА ух Шет дет бек
ЕЕ Зх тт Ата тук меж Бі ре) Бег ет без ткг Бек 51 ахр о Бет АТа УЖ
БЕ їіпЕ ЗІ тут Тег СУБ АТВ АтТс ТУК те Ав оЯ5о НІВ тТуК БЕК ід дав тує тКо зх ї-о їх ші бів озіу тк От Бец те жі бек бат Уві 215 б5іу ві щек б1у іщ5О ї55 їО сі бек Бі пт бат Біу ші Жет ЗУ бі ка яв дщр тів ші г ех їж і155 ї55 153 тн Ів бек вго АТа жів Меї дет кла бет рго пі Бім іуш ВР ОТАК ів ї5 ДУБ меш тт сСух АКщ АТа Бек жах бат фВі Зах тут МЕЖ йхв ттв тує БІВ
А іВЕ за щі фу: ак сту ТБг охеу Руз ія ВК о тТКО Бі ТУук да ТНК шеК і 5 іх Ва ШК ді Ата бак пі Фі ВгОо Ту дкш Бе бет біу Зек б5іу джек сію ТЕ
ТА ті5 ТЕ ет тук бах Еви ТВб Ож1я Зег Жак Щех зів ат дів вв азів Віа так тах ши я ша тут тук ку йіпозіюб тр бег Шет вв ко їв ТК РМ шію За Ту зах ЗЕ БЕ тв ГУБ сви дів їв; іуз5 хек ші щі ші 5ТіУ вк БІВ Уві бів ев ж 855 шк сіп шій Звг о шіу га Бім ївез ВТ іуз ко зт йїа Бек мет гу ІЗ дя ТВ ТЕ
Баг бут ух вів ЗвК БІЖ тує бек бе тат ту Бук ТНК МебЄ ак тв а 55 ЗОЗ
ЧУВ іув бій Бек із 515 їз ВЕК і ем о зін ТКр ОЖЕТВ шЛлЛу їеб Ії дар ме Зі БІ За
Бо отук дяеп віЖ ші ТНК Тіз тук вах бій бує ще їт5 Біт БУ 18 зЗЕ5 5 З.
ТУ ке; пт маї ар їу5 Бех Бек бег тп ата тук Мет сі ізщ ішш
Зах Зах БЕ сет їви о тйг Баг він вар бег ів чаї туго Бук Суз ЗІБ йга ВЗ оОТУЖ
Зх ХЕ зе ік БВе хаї ем да ту тто шіж вів Є1у тку ТБ їв те о УВІ Заг
ЗУ Е5 З бет шію б5іу йішж вію Бек Бір ші БІ3Ж шію вк опік Лу ші 53У Беж 55 ве ся, ВЕ за
Аз ІЗа таї ем тек Бл Жек ба бер Іїв Мі Зек Уя) Зек ко БЕХ зі чі із у ждї ТАК же тв Суз бек Аза ек Бет ек Уві) чек тує Жех жа 85 «а ніх ткр вне зів оБ'ю уз гго ші ТВК Жет Рез іх ів осуз Ж1 тТук «ак я 25 бШех Так бак Ап і) Ав Бех с3у ві Жтга авіа атЕ РБе бек ші АЕд
ШЕ 5 Яке
Сіу ек біжЖ ТВ бек те дет іш тТВкК їЗіе бек о йка Уаї Аїв дів сій як м щу 55 дев вів атш ТВ Тук туК Су сів вів вкю Бек й тук вуф Бтш о тКЕ
ЗБЕ ча за тТВк о Бав оСТУ БТУ ШІУ ТК ої уз їев ід Тів ек НІ Мі НІ Ні МІ хо ЗЕ ій на кі» Ії
«вій. кіз
Же «ва» Біспеоцевічзеа золенулаи 153 «Не ОБ ет тіж тр век ке Ії 118 іїею КБе ївец жі Та такої тк ові ії Ех щх І: ча ніж бат да жТв фе зви ів бій Бек зі вів щіцш ів АВ вив вка бік іх баг жаї їх Меб бе Сех Буш ТМ Бек ші Тут Тв Бе з 4 ЗЕ тт ак тик тт Ще Ві тт УВІ іУх ів акад РК Яіх іп БІЖ рев в ВЕ ЕІ
Бім тжв І1е ші тук БЕ1їв й5п Бо бек Ак ші тк тпК йо тТУК вла
Ех т ТЕ Божу іп іже БЕ іт й5О3 і Від ТК оїЕБ ТВ ТБК о дяО іє вк оЗек ек тТВж та ТуК МЕЖ ШТ ій Бех Шак рєш тТВк хет ЗіБ йо Хвк о Аїв Уж ту тТЕг Су Та ага тет тТух дев асю Ні ТУТ Зек ій бо ТУ ТЕ -іу бій Бі тат ТК фей тв Уві бек Бек ді бів Бі сі Зк обіх сів бак ЄїУ шт бек бі Бі Хек БІЖ ЄЗЖ жЖві вла бр БЕЗЕ БІБ і вв ї45 Її ІБ й тТВЕ ів бек вка АТЗ К1іш8 Метї бек дія бек вка віх бій іт жатї отв
ЩЕ іо їТЕ
Мет так осСуз Ако їз бек Хву Бек Уві бек тут Меї йзий ткр о тТук бів
Іо ї8Е ІБ сій іш бек ім ТК обетг Бр і ак ТКо ЕЇВ ТУуК йща ТАК бак іх
Уді Ата ак ші Уа: БгОо туго дк ББе Зег сту бек бі бе віу ТК
ФО 215 ша
Бек тук Щек бе тк Бів Бех Хек Ме Бін АТ зі: йхр від від тв
ШЕ 8 55 Х
Тут тТукК Куб Я зів тгр; бег Хек зв Бур ово тт ме бі ав ші еко -ББ
ТВ іт бе сін іш5 іх Заг бі Бі бі шт Бек бів Уві бів рев
5іп бів дек ші Бк бів ів Єві бу Бто 5іЖ АВ Бег Мет ге ІЗе ши КИЙ ЕЕ
Зег оСуз їз йі8 бшєК бі Ту Шет Бе тт ЗіЖ тут тн Меї аж тка аа шк З чі уз вів Бек ніх Бі їх БМ ївщш бів тив ІЗ шту ів КТе ав
Ов ЗА ЗІ ЗЕ
Бто тук ан ТУ зі тВК тів тТук вок ШІВ ік о вЕє ів ів ге АТд
ВЕ З ЗЕ
ТВк їец тп хУаі ав ія Бек дек бек ТВ о вЗа тую меж бІш і еи їв ах аж ЗБЕ бек вбецї пт ет От й2ор Бек дія шЖаї Тег Бу су АТВ ака Ва ОТУг
Ве хе ЗЕ
Є3» Ббе У! ів лю тут ттв обі бів ші ТВгОтТБЕ ів тіж Уді бек зт ЯтЕ ща
Бек взі'у Шіу зіж ту бег щіУ бі Шіу Бі Звук зіш Бі біу шШіж аг
Зв За 5 а др ІЗіе ві і8Ш ТК жів бек ва Бек тів Жеї Зек Уві Бек реа віх як ЗО І іш бух ті ТВ ЕТ тБпк Су бег за бат ет Зак Жаі бак туго Жах
Ку Ех жа
НІя ткв вне Бій бій із Руб Зі ТБКобеб Бко їж гав ів жів о ТУЮ ча5 жа «ах ет тн У баб ав ів: АВ Бе віх Ві БгОо АТ ви Ра бек Бі ву за ах кі бі дек біу тт Жек тук Жек рес» ТВб хів бБет яка чаї вія Аїв ші
ЗБЕ ЗУ я ЗО азр азів ків тв тк тТуУукК Су Фіз бік Ак ет АК тую вга Бгто ткв
ЗЕ ща че тТВг вве ві ші ату тТвК і ів біб тІ1і8 Б ОНіб Ні Вів НМР ІЗ
БУХ ще РН
НІ
«кім «гаї 520 «жашМ ВКЕТ «БЕ «2ІЖ» БІспПЕсефічна вопекула ї04 «ж М НЕ жек пі тер бен Ст жів тів зе: Бе гео ба) АТа так оАЇв тв ОБУ ї 2 ви її ті Ні бек іп жі бій івец бів бік Бо Біу АТ БІВ ів УЖІ агЕ
Вт бі А дат хУаі іє їєн Шек Суз бує та бек бі Тук тек Бфе 35 «і ще
ТНК Зак тек ТКр ІТЕЄ дал тр МАТ фуз іп дко Ркє Зіу шів шіу гвх ща КЕ ща -Зіч тк жів Біб дя Ії Тук Рг бак Ява Заг тжЕ ТйкК де Тут дя
БЕ то ТЕ до сій те Ббе і туз ла іт ДТ ТАК ев тнг оза1 Ав іч бак бек БЕК тТнНгОоАТЛа тек меж зі івши Бек бек ркз Те ет вію АБО Шет аза в їщ5О їх І тук тук Сх ТБ душ бет тер вка біуУу яп бак Рв дер тут Ттрошіу піп вію Тйг тв і: тк жд! Бек бек вію зі 2ту пі Бек сту втх
Іжа ІЗ ЕЕ сік вію бек сіу бі 01У БІ баг ав їЗе жаї Шес тп о Бія вт вка
Бек бек бен так Уві ТНК АЇВв Сіу 53 гує Уві тк меж Бек сСуз і ув
Звг бек бів беру ів; іє еп бек біу вп зів Еф й ту їв отве і ща
ТЕрд тек вія Зіп іуз Бгто Сі ів РКО Бк і ія о їецй ІЇв Тег тЕВ 155 КМ ЕК ід Заг пк вага бів Зак бій Уж! го вар ага Ве так о діу Жву дію еВ їх шО
Бек бі те йо Бе тик оїєв ТК о жІЗа Бек Хек таї ій АВ 53 Аа
ЗЕ з3в а ша
Бем Аза ві тук тук Се іп ВЕК айв о тук бек Ту Река ББе тнУ вне
Я о ЖЕ іч Бек Бі ТВ іт ів) сі Ії іуз его ді пт сту ші Бет ав їте кт фев бів бів Бек Бі Аза бів ів: вів Ак о рКОо Бі Аїд ву жиБ «5 вес
УВІ гу Майї ек бух їж тк о жЖек біу Тут тет РЖе тк та тук твЕ
Мек нів та Уаі іє зів втд рке бі вів б5іу се бів ткр хів Бію
ТУк жІЇв дя Еко 5вг Ага Сі ТУК ТВг доп ту йяВ СТВ і ух Ве Ех
І ХЕ вар іт Вів ТМ рез ТВ Тег аа і ув Бек Зак Зк тег оаївз тТук щеї
ВХ ха шк іп кеш бак ак во» тк деко сію аю бек АТа Уві тек тує Суз від
БЕ 5
АЕЩ ТЕЕ ТЖК Або ЗБ Мі Ту БУ їі й5Ю ТУК ТКВ БТ бів Бі ТАК
Зк ат З
Ту сев оту ба! 5Звк бек уді сів Бі ші 5еу іх біу Бег ші Бі 385 ЗВ Зк а пек ші Бі Щек опію віх Уа: яв вар тів Біб свои Тв бів Щек БВ м а іх 18 ІТїЕ МЕЖ бат йіз бек бгз ші Бій Бе ді ТК ОМежх тб Су АкКВ ах ща «ДЕ ій Зек бек бат бжі Бек тТук Меї дів тгротт бій бій і м5 Бек шіх
ЯЖЕ В 5
ТНК бек БО іх ге тка тів тег дев тнгоЗек ог ує Уві Аїд бек піу
Б зве Я «ві Ето тк ага Бе Бек сі ек ші Зак зі ТБК Бек Тук Бек і вх
Зах чо ЖЕ ЗБ тТНг Іїв бек 5Зегк мех бій вія сів йев аа та ТК о Тук Тут Сех вів ех ях а шій тЕв Зек Заг а5в Рг ів ТТ ББе біу та ТУ ТК іув ів о Бі
Об ЕК ІВ іеш і Ні НТ НІВ Мія МІ ІЗ хЕ5 БЖ «І» я «ваш» ШО «ії» Штучна послідовність «жде «чом во вію ві Бі бір 5ек о1іу ші шіу бі 5ет БІ бу бі ів дек віх ї х І І «тій» 2 «віт БВ «тіж» Штучна. послідсвність
«Іде «НО» КВ5 сБіу бік вію біЖ бак бі Бі ші бі дет ОТ ТУ БІ Є. баб Ту «рій ЕпЕ «Вії» ІВ «іже» рак «тії» щтучна послідовність «ТЕО «а вдв
Біж Бі Бі пі Бек сію Біб Бек ші бі дет СТУ Біу ет біу злу ї Е 10 ІБ іх Бег «гід» 105 «Вії» Є «23» кхІаї» ів ТВК «о 167
НІ НІЖ НТя НІВ НІ НІВ «Віб» 165 «21ї5 В «вішю вах «ВЕДУ «о» 165 зЗіу бі ву Ні НІВ НІ НІ Мі НІВ

Claims (31)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. З'єднувальний агент, який містить щонайменше два з'єднувальні домени, де перший з'єднувальний домен зв'язується із клаудином (СІОМ), а другий з'єднувальний домен зв'язується з СОЮЗ, де зв'язуючий агент містить варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну (МН) зі специфічністю відносно антигену клаудину (МН(ІСІ ОМ)), варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ) зі специфічністю відносно антигену клаудину (МСГ ОМ)), варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну (МН) зі специфічністю відносно СОЗ (МН(СОЗ)) і варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ) зі специфічністю відносно СОЗ (МІ (С03)), де вказані: () СОМ є СГОМб, і зазначений УН(СІ ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІО МО: 22, або її варіант, або фрагмент, що містять визначальні комплементарності області СОНВІ1, СОВ2 і СОВЗ з вказаного МН, і МС ОМ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 23, або її варіант, або фрагмент, що містять визначальні комплементарності області СОВІ, СОН? і СОВЗ з вказаного МІ і (ї) МН(СОЗ) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 36, або її варіант, або фрагмент, що містять визначальні комплементарності області СОВІ, СОН? і СОВЗ з вказаного МН; ії М (СО3) містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 37, або її варіант, або фрагмент, що містять визначальні комплементарності області СОВІ, СОН? і СОРВЗ з вказаного МІ.
2. З'єднувальний агент за п. 1, який відрізняється тим, що зв'язуючий домен є біспецифічною молекулою.
3. З'єднувальний агент за п. 2, який відрізняється тим, що біспецифічна молекула є біспецифічним антитілом.
4. З'єднувальний агент за п. З, який відрізняється тим, що біспецифічне антитіло є біспецифічним одноланцюговим антитілом.
5. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що зазначений клаудин експресується в раковій клітині.
6. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що зазначений клаудин експресується на поверхні ракової клітини.
7. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що перший з'єднувальний домен зв'язується з позаклітинним доменом зазначеного клаудину.
8. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що зазначений другий з'єднувальний домен зв'язується з епсилон-ланцюгом СОЮЗ.
9. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що зазначений СОЗ експресується на поверхні Т-клітин.
10. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що зв'язування зазначеного з'єднувального агента з СОЗ на Т-клітинах приводить до проліферації й/або активації зазначених Т-клітин, при цьому зазначені активовані Т-клітини переважно вивільняють цитотоксичні фактори, наприклад перфорини й гранзими, і ініціюють цитолізис і апоптоз ракових клітин.
11. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-10, який відрізняється тим, що зазначене зв'язування із клаудином і/або зазначене зв'язування з СЮОЗ є специфічним зв'язуванням.
12. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що зв'язуючий агент знаходиться у форматі повнорозмірного антитіла або фрагмента антитіла.
13. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-12, який відрізняється тим, що зв'язуючий агент містить набір варіабельних доменів антитіла, переважно чотири варіабельні домени Зо щонайменше із двома з'єднувальними доменами, при цьому щонайменше один з'єднувальний домен зв'язується із клаудином і щонайменше один з'єднувальний домен зв'язується з СОЮЗ.
14. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що зв'язуючий агент знаходиться у форматі діатіла, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга, з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга на одному й тому ж поліпептидному ланцюзі таким чином, що два домени не утворюють пари.
15. З'єднувальний агент за п. 14, який відрізняється тим, що діатіло містить два поліпептидних ланцюги, при цьому один поліпептид містить МН(СІ ОМ) і М (СО3), і інший поліпептидний ланцюг містить МН(СОЗ) ії МІСТОМ).
16. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що зв'язуючий агент знаходиться у форматі біспецифічного одноланцюгового антитіла, яке складається із двох молекул 5сСЕм, з'єднаних за допомогою лінкерного пептиду.
17. З'єднувальний агент за п. 16, який відрізняється тим, що варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця в порядку МН(СІОМ)-МІ (СІ ОМ)-УН(СО3)-М (203), МН(СОЗ3)-М (С03)- УН(СІ ОМ)-Му(СІ ОМ) або УН(СО3)-МІ (203)-М (СІ ОМ)-УН(СІ ОМ).
18. З'єднувальний агент за п. 17, який відрізняється тим, що зазначені варіабельні області важкого ланцюга (МН) і відповідні варіабельні області легкого ланцюга (МІ) з'єднані за допомогою довгого пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність ((0(0(055)з або міасаса5рраамо.
19. З'єднувальний агент за п. 17 або 18, який відрізняється тим, що зазначені дві одиниці УН-
МІ. або МІ-МН 5сЕм з'єднані за допомогою короткого пептидного лінкера, переважно пептидного лінкера, що містить амінокислотну послідовність 500005 або с(Оо(оо5.
20. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-19, який відрізняється тим, що зазначений СІ ОМ є СІГОМб, і зазначений з'єднувальний агент містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 42, 43, 44 і 45, або її фрагмент або варіант.
21. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 5-20, який відрізняється тим, що зазначені ракові клітини, які експресують СІ ОМб, являють собою ракові клітини раку, вибраного із групи, яка складається з раку сечового міхура; раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника й теракарциноми яєчника; раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легені (5СІС) і бо недрібноклітинний рак легені (МЗС С), зокрема плоскоклітинний рак легені й аденокарциному;
раку шлунка; раку молочної залози; раку печінки; раку підшлункової залози; раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми; злоякісної меланоми; раку голови й шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми; саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми; раку жовчної протоки; раку сечового міхура, зокрема перехідноклітинної карциноми й папілярного раку; раку нирки, зокрема плоскоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки й папілярну карциному нирки; раку товстої кишки; раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциноми тонкої кишки й аденокарцдиноми клубової кишки; ембріональної карциноми яєчка; плацентарної хоріокарциноми; раку шийки матки; раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка; раку матки; герміноми, такої як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріональноклітинної пухлини яєчка і їх метастатичних форм.
22. З'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняється тим, що зв'язуючий агент містить М-кінцевий сигнал секреції й/або С-кінцеву епітопну гістидинову мітку, переважно епітопну мітку, що містить шість гістидинових залишків.
23. Рекомбінантна нуклеїнова кислота, яка кодує з'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-22.
24. Рекомбінантна нуклеїнова кислота за п. 23, яка знаходиться у формі вектора або у формі
РНК.
25. Клітина-хазяїн для експресії біспецифічного агента, закодованого нуклеїновою кислотою, де клітина-хазяїна містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту за п. 23 або 24.
26. Застосування з'єднувального агента за будь-яким з пп. 1-22, рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 23 або 24 або клітини-хазяїна за п. 25 для лікування або попередження ракового захворювання, яке характеризується тим, що ракові клітини експресують СІ ОМб.
27. Фармацевтична композиція, що містить одне з наступного: (ї) з'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-22, (її) рекомбінантна нуклеїнова кислота за п. 23 або 24, (її) рекомбінантна нуклеїнова кислота, яка кодує зв'язуючий агент за будь-яким з пп. 1-22, (ім) клітина-хазяїн за п. 25, або (м) клітина-хазяїн, яка містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, що кодує зв'язуючий агент за будь-яким з пп. 1-22. Зо
28. Фармацевтична композиція для лікування або профілактики ракового захворювання, що характеризується тим, що ракові клітини експресують СГ ОМб, що містить одне з наступного: (ї) з'єднувальний агент за будь-яким з пп. 1-22, (ії) рекомбінантна нуклеїнова кислота за п. 23 або 24, (ії) рекомбінантна нуклеїнова кислота, яка кодує зв'язуючий агент за будь-яким з пп. 1-22, (ім) клітина-хазяїн за п. 25, або (м) клітина-хазяїн, яка містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, що кодує зв'язуючий агент за будь-яким з пп. 1-22.
29. Фармацевтична композиція за п. 27 або 28, де рекомбінантна нуклеїнова кислота знаходиться у формі вектора або у формі РНК.
30. Спосіб лікування або попередження ракового захворювання, яке характеризується тим, що ракові клітини еспресують СІ ОМб, що включає введення пацієнтові фармацевтичної композиції зап. 27.
31. Застосування за п. 26 або спосіб за п. 30, де зазначений рак вибраний із групи, яка складається з раку сечового міхура; раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника й теракарциноми яєчника; раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легені (ЗСІС) і недрібноклітинний рак легені (М5СІ С), зокрема плоскоклітинний рак легені й аденокарциному; раку шлунка; раку молочної залози; раку печінки; раку підшлункової залози; раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми; злоякісної меланоми; раку голови й шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми; саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми; раку жовчної протоки; раку сечового міхура, зокрема перехідноклітинної карциноми й папілярного раку; раку нирки, зокрема плоскоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки й папілярну карциному нирки; раку товстої кишки; раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциноми тонкої кишки й аденокарциноми клубової кишки; ембріональної карциноми яєчка; плацентарної хоріокарциноми; раку шийки матки; раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка; раку матки; герміноми, такої як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріональноклітинної пухлини яєчка і їх метастатичних форм.
Вісгу ССОМІВ2 х СО3 в , 1 сне 7 я ас Я Мн зсцнне? НІ Модне | 4 Мао цу 5 Ц Вів уУ СОЗ х СЦОМІВ2 Зо у Ми «соз | Меесоз х Унойшнео 7 Міоошназ спектненетсюютєтстй -. У непенепесивлеьвлетьтья г п пет петечінся їЕЯ в я
Фіг. 1 Цитовізис клітин-мішеней МОЗСЯ (8 год - 24 тодінкубації ще ПО) йод
І . і В ко зх -: І Я ка Ж а В З зії ІВ жо: В ; я Ж : й о я ЖК ев ВВ с ЗВ и, ; вюВ Я й З 5 4 ща -к Я ЩО ЕВ Я х там В я-- З 5 В В З в вин а : о за що с БЖ: В В С 3 у ШЕ й З З ов 5 Б 5 В У в НЕ І Еш ВОМ Ж З Б 58 х ОБЕ с ж цій А.В ССС. СС ІВ ОТ овшиа вело дей воло пИЛВ го по подю пе Фіг 2
4 а А 2 3 4 Б 6 7 Да глухо ово Є песто ТОБ здав п тиви 11 ев КН Кн вна. У о и. он ке ее я ПОН КК п и КК ник и КІ Пр ОКО КК у З ро Кок я Похо Ан С ек в; шо ке ок Тк р А Ах ие ПО воно пи М он я КМ Б рн Я ой Бо НВ о ока НК ЕК КК сх і в ВКЛ КОКОН ТВ оман ее МАВ ) мін - ши а ш я о ОО В І пр перо я бло ДЕННЯ ОМ во вх ПАК Кмсеше ДІМА кн соуси яп КК в о В ни в ши мк и рт и ниви А пи і ЕМ І що А и я ко бою яр и Мк М ОК ШОК ВАК вн и а и В кДа етно нт В но оон в Ме кт жт Во ху дово Ме оо ОВ ях с я Кв о ОКОМ Ех ОНА, и я В ВО, кое МК ж КЕ Ве п. ше ОК о у
0. М З і; ПОВ я оон і й --ТВІМАВ (Бадь о і ща 50 шу СО ке А оя о о ОКО х а. пе ех кн А Ки А ІК т Кн но т пев КО ЕМ Еш нн и в Зо КВН ние пив ДОК кн як ДСН ОХ каст інв Дис КМ и В Я М ТОК КЕ у ОО Б, 2 ПО КК ПЕ КЕ о Ас с у З КК кю Фі і З
КюсСекпітини хо ЕЛЕ ж я 512 ; КОКО ОО В ОНИ ! г : ІК Я Са В Ж по о мАЗЗАЕОВЕК 5 ПЕ, ша М я ! її ху и, вен ВЕК КЕКС К КОКО ГК я Ко мостенаьтАВСхоНТЬ р ! Ж ж отити линии і щи . - ток З рака текти НіВ ка ДЕС КеНТр ! К тк Фіннттнн ленні нннтнт нти ще ЕМ З ї Й Е г : худ ї Кз і Е Ко М ри хіббввюви ВНУ нат ж 5 же ! Ка Дей х рідко ПД ті и і 1 фдхенднжня ки пломи ка СУМА . : Мі. «Я 1 С ї Кон НКИ В нт Ж дак ! З х і НЕ дже рук Кол НЯ З і с 5. кое вна АР Конті, ж : : . ДМеюююююсююієкююююююююю юю юю юю юю юю о Бе Е ї - Може ПУЕТ МА ВВЕ во мч УКХ ! З сен. шо Ме дюювйня ПИЗаа нав АР ві як І ов з т її ге х г о КО вас До а щі а ДЕ я Кт я ко Є Б Кеш кагТЯНИ ях І ВОВК ех 00 в По ВЕНИ щи З ППО МННЕМЕКУВХ то ек не Іон ЗАОЛЮВА ЗВІМАВ: ву : п на м о ВОЗ Е ОВ, ї-- добова ВІМАВ І о р СОВКИ ВАВ Ох БО з 7 но фета тов ЦО 1 І Мн Б, ПЕ ВО ВАВ ОО я Мн ФК : г ек реком МАВ де дн а ВАВ ! ; « фр ннкнтнннннннннї же : І 5: За ано Кана: Б дросстррес тн И.. ВИ. ЛИШЕ...
ши. Хом ке НИК АН я з щ що я ве - шк (ресоуекаю ото ОТ Дом я я Ж Я ща щи ко и йо Я КОЖ 12 їЕ хо т се ще с я 7 я ОВ м й я я В я с я а ай
Фіг. Я ик С Тлювни пе ру т т тю дети ооо опт ж ях і т ТЕ КК ТІ роми 1: ОН жк зі ох 1 пов ВУ а 1: ЕНН Я і й чи СС х се Ву Мт: «ХЕ ї я кої ТЕ «ВЕ АС КОМЕЕ: бус -ої у От Ї Дехххккхкфр ххх ууєхккхккхккхкюккк пи . ях Гн ння 0 ВЕ В - ях 1 я що В 1 ай ї і ях фе ОА ВІКУ Ж Н Х М Ж. уд уч уч яд ХЖ и их 1: тонн зма ОЇ Е А дян нн х ЯНВ: МАВ ОО во ї т петит "снааак ї Кн Я. 0000 ШК ЧНО МО ЕММА бе в: с у У УМ Ах у Н з т су нс а ЕК: Б ї ! я нене АНА Же з ж М. М. Кк теки Куккнннкквккаакккккаллаккккалляккккннччянхї - М ХЕ ще що Ж а йлй зв а а ; й Сх :Х 1: їх 53 - и і Ко й мМ я ДУ Ме ке ЩЕ Же Ка Кз М м ШУ Же ще де - - й 5 ТЕ с м ех ту Я п ке р о, і редюю ххх ХУ хх СІЯТИ М незанеко зви вена х НИКИ ПОЕОКККИИИИН як ї ВА ЕТО х ПККККНИ В Кун КИ ДО ин 2 рт КК КК КК Ох р рн Доти ев Ед контр са зе у КО фунт кують ьюььюьвьььяй Ки і пох т оно Но нннотк 1 пу з п ЖОУ: В. з ї У Гео МНЕ ВІВ: я хх ин м а Оз ї «ПП ООнгівиз ТЕМА и я КО рн ех жу. шо ї 1 хуй, я: пк Її ЕХ р іти ТБІМАВ я Ж Же ОК ут пня Тоня, ї : кат ЕІ же х т " 7 Її і ім іш Я НН дн МАН З Мед КУ нн ннтттннтнттк т ннннюнкк кт нкнютнкюнн а 5 008 я ЗЕ С ЗНИНЕЕЗ, Но зе АЕСА с Кот с се: г
Як. Я Кров нені: ВЕЕВНЕВНННННН іноєетвмях ВИВОННННЕ теееномівнає ВВВВВВВ ПЕ Не ЗМОККО Во Вомеа ВВ вх Її В М В хо ння в ОКО СОМ МОН и З Я Б а 3 НО ПОМ Ми МОМ Но ВК кеВ ня М нн в ВІН ни ПРОВО поток стор тт МОМ мою ПО У ПО ХОМ Я Дн З В ВН ооо ох и Інн неон окон вввввх ПІДТИПИ По кох В и Шо й Б ЦІ сі сни МО ОО со опором вовк ППИПИПИИИИИПИ КИ ММ. МО В БМВ их ХНН Фа
А Биціюаю ТЕ ЕД Ти шпон ПнХоМ ня ВВ ххухх рми дккх юю ТО сх. З Ше ІН ОМ. : ЖЖ коки во ОЇ яка ьку І в. ж хх Ж Ве ЖИВ Щ ОО ЖІ ВІЇ дока БТІ ВІЇ ХЕ ї я 0 ВОІВ х : ЖІ І: І ВІ Е : що КОВІ ЗІ ВІ Х ем ЖК ЩІК: В В 1 Ж БІЖИ ВІ ВИ І: У АВ
ХХ . 1 и ЖИ ВИ ВМ ОМ хе ОЇ ВЕ СЕ Ти ве х : ІОВ: ЗБ НЕ В : : ; ГІ ВК ХВ В Я а ще - В ; Б Кі ВО У Ук Ме с «Вияв В.В ях ЗК ХВ ВХ УВА В ВКМ шал ія ВО ОО о жжи а ха З 30 15 зт пе т я бики ТИЙ куту пежи ма ай ПКУ КО МК КОДОМ щу ГЛ КокВ З Ж ОКИС а ще хі Ж й ОХ ко ЖИ ОВ З З Я ЖІ І: зай и Я НЕ у т. ВВ Я: КУ 1 І ЖИ ЖІ ЖІ ВІ: Ж 1 ОІВ: х 1 ЖЕ Я Я дя ЖІ В: ВВ Х С й 552 Пи М х ї МОЖ: ВУ ХЕ Я Х ї жів У БУ ЖІ ОК ЩеОЖА МО В ЕХ Оу АК М " 2 ЗІ ВЕ Не Я КН ЯК х іл У ВЕ КВК Ох с мо ох - В УЗ МІВ У ЕВ І У: Зх хо Ву БВ Як ВВ Ве ВЕ В КВ ХХ, моні ЯВНО МО 5 ОЛІЮ ЕХ ВИ Я ОБО Я духи жня ж жк жжюТАТТ НК, дл ут тьтьттьтжттьтьтюттьтььнтьк ще Как еле п Фіг б
А Значення Сі екопраюя СІМ ЗА КТК Н о ще Ї ДЕЗМА лаеії зтеклізНаих. ЛИ ЕКС В Ес ЗЕ ЕЙ 6 ЖІ ВН че ЩО осо оо де | й ! . ОБО 0 бок двепннової захкає МВ ! . Ко вві | НН а І | ї ПИТИ, Мох ! І пев НЕ 7 | НН зе НИ зх Ті пи ПМК В ВС НУК 8 у нин В дктивація ТМ ЯК подиме спігеної пнхуєацій є оо ку щі В Се У «і КЕ СОИее їх ' Ки З і З що й «й | й - - 2 ВЕ ВК й ев ВЕ яв. ке ов їз Я аа о схе М кН БОЖІ Я КО ШК ча Б чай аю аа є х о « х М Ка оф ж ге «ТЕ
Фіг.
а фннннннннннннннни гуркіт ткткиннтнни п ЩО ГИ ІОНИ ПК. ТЕ ї Є Ум їх ї е ї її фоні Б Кк ЩІ Рош ї о: : Е : ї мо ТОЖ: Її ї яки сим : шкі як ММК т ЖК т ї ІК ї ї ї «Ж Бодя Ж кб луках пос ме сх п Ото йо кум КИ метр тан, пуп тус и ТЕКТИ Ки МЕМ НЖУ 1 хх . Е кі КЕ п ІН : 1 о ов 4 1: Ши КОЖ хі «: ЕЗ ї КОП ї ний РОК: х : МО Ко: 3. ї ї . тк ; : хі ' : ; : : ! : і еО модну СЮ в тхлужо м Ті лижних Ж ккя пан и В ВА : : і: КЕКВ хх х срий. : їх ПОЕМА ВО : її РБИУЕд т МЕ : т Б БЕ 1 їх БЕ тили мив ТЕ Ж о т3 ЛЕМ КК Ж ж кі ПН 1 Ж ЖІ ДУ ЕІ у Хм ВВ 5 ' І ОК І ПТИМУМНТМ В ЗИТМ ЖЖ ох ж: ! Бе 1 У З 1 ПУСК о зллжикі- ожини - й щ їх | ою в КК ує 1 1 з | до АК У Ко 1 є і дол ом и Є У - ! хв о ЕМ З ефе АСУ оокжюй Ф. ХХ сук п шко ЕОМ кож ох с : с: ке х а НЕ Кк е ФВ ек З ккикимхеутюх «ії «че КВ Кркскьх знузакню віх де ТМ пе Н : : : де дод енениннннананннннн Її же В : ГІй : ж я «Фа ла ЩА де тят ТВВДБЯ СОКУ ї е . : М коукож зх ї жк Км Ах ої ян ЗЕМАН в 1 ут ех полиня х їй Ех ІПН к 1 Ж - СА КЕ З У Й ї Б і Е ЖК:
1. їх і Ї СЯ і 1 1: З «хм і моя хх їі 1 НО НУ х. і хя ії : 4 ЩІ Ір ї Др кум ум ААААТАу хитка:
фіг. Я 1 5
Душ хю кохкияі км ежем мохускхх мкм ЕМ с оухкю соки іш хів. Момо Кт скхомехя ся ж 0 ДЖедллллллллаАХААААХАЮАА ВВ плллллкллллллнвкк Х ж Ж Во їж ох а Що СІ Ж жі ШУ КО оч ож шо Ко Кк мії : хо, " ді ОТ ння ож Жощеї я с ї лот 2 ся 57 - СУШІ зе Хо сет т. г Мо х : ФО ее СУК ка о ТЕ - че я доз житя в як КОКО, ЩО овен нн о двафнк ї х дк Ся т « т Ге У Є я Кі -Е ї ке У СН Я КК -х са Ж я х ЩЕ сей - - с: Ко КУ й ФУ Х Є г х з х м ях ях З г е з я хе ураху пуху зх 11 меха гемо Хреене сю пев локко коня Фме ХХ снюм десх із иЗкммюо 000 тех В . - 0 МОЛІ НІЮОМЮ и Дрокку ія пін. М а ен ее пеню. СЮ ЇХ Ж і хо що їжи КО межи р Мо Пеоижи я Ії шо Фо ВО ше хо до х жо Я « хо З к Ж що жо ох ч пн а п Про уболлчулячччят туту вв Я З ях. М Ми х «г У х. є са ї 5 а -Е К5 Зк шо я А ще я Сай я и - 5 Б са КЕ Х й х КЗ а Ка Х я є Е «ЖЕ я КЗ що КУ Ж З Я а є - Ж ж. ПАЖАМАУЄАХИК І Вп Кох . хі щі . о Ж і Ох ц 7 й І ДА шо же Кк ЕВ їх ! Ж 11 .
і 2. : Іі зх г ж рі 5 Ж кі віх: Ж А у по їли Хх ку г ! я т -Х з сих Ку бу тик КК Є як М оо оно о А сівІМіІшцхміВкхкмИС Юма ихХ Й Ж уж мк ку лан зов Депо КУ ки ї МіжЖеужК НЕДУМ Мел уе М пухімнкху хек
Фіг. 10
ХИМКМ ЗК ККюх КУМ ХК «х3 : те ТЕЕЕКОМЮМІ мі хі З. хг. ПЕРЦЮ НХ. ж днях . : ЕН -е ЩОКУ В МВ щ І Хоння ї ке ЦО ЕКАКНІНЮ Ж | 3 х : ' ї я х щ ! Тен ТНХ Ж: ї і їх і З во й Н Ж й і З й ! ох НН ї т : Коли плити ит щ Н хх т у 3 -543 хх М: Де: ї і Дону пеня дн ук рн унннт уд ОК ДЖ лю и ММ тя плоті ототе етно ре Жбеекмх ом ВІ ккху да ую Кук муху Фоми
Ж. боях е З : п» Ех х 8 : 5 ' ше кс ОО х її 1
МЕ. ї І Н У тої і КЕ З ЩЕ: і ВЕ ї і хе фен ОЕ жк ї КІ ХЕ жо 7 ї 1 ЖЕ З ї і хх ї 1 ЗХ м ї пий Ж ж т Тетяни РИ : ХОМ єс Ж їх : х оч ду с пк в ий я КО з ЖК а ж - Е й АХ с хх ж її Кя я ЕЕ щ чі з т Ук чне «Віг. ТО (продовження) ВЕЖУ СИХ КОЗУ Мхжккалакня, о рнтнннннннннннн дрннннАА А ААААААААКА рАААА Аа ркжтжниннх зд МОм МЕ АД шо Мол В М Бя ! Зк і Хана її кам Ж реора ПОГ: оєхєкскекикі)есксєтектмнсннжнкюи Моєксереетсстиєей Мессесетстттостнкний 0 Мосеекетентння : с «І М Ж ХМ хз В ден х МВ ХК СА ХВ ВУ де Дт рент ; адкхлмя Те РОТ г і Ї : це З 1 Ех Б а оно у спек Ї Мікс МОМ 16 Чо Знажр 7 Чаші Гі За З бадмі З ВІ піп т жсжлсжт ніх Уж жовтіють Кенаннкка катки бкнжажцюжютивжикижитий сежскх З кжюююююььсья. Я СЯ М. фік Ж
ОК ДІЯ петееіееечеетееено нене ненотечеен ее охо аа дано паніні ніна кір днесь осісти ськ ж ЖАЖККАЖКАККААЖККЖЖКАЬК ХЕ М ЗНО ВОМ ку В о и Ви ВОМ нн ЗМК ОО и кН Не НО хх КК КО В В нн МН х п ВВ ин я МН У т М и Ва УЗБОН КК ММ о МОХ же НН ОМ А І ШВИ НН МИ КО ЯЗ КК ЖК В ВО ня ВО ООН В ВЕН в ння вон с вве ТК По НН и ВИН М В я БЕН ЗБИВ ПОВ В в М І КК Х ПН А хх ОМ ЗВУ х яти кккдккк кКал тля: чо ВОВИХ ок х ЗВВВВВИВВВ Во ово Мк екв Кк М А КК В НВК ОН о нн ВИН НК НН и я ЗОВ поковок: В ох и НН о, ЗВ в и МНН НН МО о во ох МН и МНН А з КК КВ оно ок в еВВВОВх ОО ДИКО КК КОВКИ Ки и ЗВ. М Ки НН о. дек ТЕ КУМ М МД се кемці Ме фрхозккокохко М. п лу Ж Ес ж м з ї Кк: 5 . х в й х кі Ж в Ж - З Ж шо Ж х жо Ь В. у ж ді: ЗА ЕЙ Вп и ЕЕ БОЖІ Ви І ВІ ВЕ: ВК: о п ПОВ: щі «ПІ КІ ЗК ТК: ВІ ВК: ЖК, ху я В ВКА По хі п ІОВ СВ м М ме ЗНА УНК тт ; ВВХ СВК ОВ ОКХ МНЕ ВЕ СЗНЕ К Х фас еетоіовтсихіт т тевюхі юю во МВВ ММК ІЗЖНАЛХ І... МК МНМА НК. яке ко о ово жів ооо пін Менні фіпллялллячттттттчттятинітих 0 фінти по пух жж уже юю юю ю юю хуя Жінку їх лек
Н.О
А її 24 їх т В 83 я с м о.
я . они вина и ХО З СХ ОМ іх Х МР миа жк о о В їх зе ФО «в ЗК о з о. УМ ель Фіг 4
ЖЖ ВА КВННи фетру ДК ЕТ ре Її ж шк ШИ ОО Зо Н ЩЕ ї. ООН ом Н Е у ря їх рр НАВ я й Ох Ех оре Кл менти Кн Мрфюкреннрвннки БИ ох, ме Ед уки а чо фронт ВК ку рин ! й : пн ВН и 15 я Жіека ВЕБ і ши и : ки их і ї З кити пе я КАК Денний Укдннннннннннн А КН В кову пнллотююютюююнююннях Те ТОНН ЗХ на і З Не шо НТД наве я і | і Омотаж х ПНО : : ІК НЕ о о о в в В Ой кос Оу ява вро Бан : р й - що ЖЕН : щі : й
Ж. і : Б кова ! що ї й Ж вк : В щі : «кока ЗМІ : А і : А ода ї Б й бЕво ЩО зо : хе : Її и ще бч 00 СУЯ що шо В де ЦК с ке й ще Ше - о ООАКХ ВН п. Кн Р с КК ВИ у ек ЩІ М КК до Ек ДЕКО шок ЖК МО дО НК ШОК НО о и А хе ЧК Си ФК дО Ко ЧА Оу Я Фіг 15 я СІК кліті м БО ПЕНННх ОО БОБ У ОБОХ НЕ й по ВЕН й 0 Бод Ке:
и. їх то . . фею ЕТИКИ що І хо. . - . . Френе ДТЕК ін тю фе ууєдує они о Френка А ок ІНК ЕКННХ 1 Пе вх ЗНМ ок ях БИ ин в. им, Пд і з 1 - ВВ ох 1 ВАНН МАВ . я -З фін ЮК Прнневінунттннн ол фр КХх речення
Е.В Піх МЕНА що «0. я: ІДНА ВО НВ Н ШИН З роя Я темними і он Гром Зх рого КЕКВ ВВ КИ Ектуеютук ую юку скюкюсе? Тайн Кекс кю Тонннчннкнннннннннннннникинний «мм КН ДК В дисци ще кл ММ ЖЖ в МО Я ЩІ вико ОЗ ЯНЕ а ВК І ЗЕ с : о) ОК Ж ПО ЗУ де : ек «ее а М А я в Ша КИ ОО ща о в й с ав В в ОКО Кн М Кок ях ЯК ОМ У «Ж ке а ЩЕ ОК а ке ет зе У фіг. 15 Іпродовження! Е Ті пжежнкх щу ї дах сек ЖЕНА пн а а ! 1 кх 1 З КВК ЖЕ. : Її Ще ПОВНЕ ХЕ т пт її пет. сх с я р т М Божко ПРЕ Н т ання питво, фени пре с : з : ше х Трон ЮНІ нн Котів жим 1 Ех ррееееитеттметтекя кА МЖК І : жо те ВАНН МНИХ Б хв : яЕ ше ів во Щ фе мом ЗХ лок МКМ ОВК Ж НН ЩЕ т Сх ффетте нехитру : як ї : т МН І фожметкко КІ з щої КО ї ж т шия Б Ж до ХМ я мМ о ВЕ о ую до: ок : к зх : Фіг 15 придовження)
ек СЬКУ негахмвна лінія шніх Дт уриуидрденИ ОСТ пннж я вет. ож по БНО и КУ ПОЖЕЖ А 100 ВЕВОМОККНЯ фонх ОО ВОВК ох і ВЕНИ: Мои . «фра Ки я 8. ВУХ мА ПОС МАКІКН: ; ОО ін циМК Ж І1Н-- Мити ВИТ Пред Зх Пе ПВА НК Кл вет КВ ВЖК ви, Фмти и М То. ТКУ йо І ВОНИ ; к 15о- ВЕК ши, ПИЛА Ще У пи ЯК плн МО плянюВ
;. з інеті М тд ща : В дагечннн НКВ Вотанн Хо нюкк КК ВХ ї Фен . - ПА ов ік ПІВ : з ОПЕК ї : Тфеєеетня нн х Петя тити ех ее Ек нн о Ж ся жо я Го шо ВМ
ЗЕ. ак дО ВВ ту: : дк Ох за кое й
ЗМ . й мо я Ок Ком сте : МО Ха : УК ши А В КФК цеда К, я 7 я т ОЕ лох КЕ ке з ка иа ска НК шо аю в ОВУ що ме ЯК. КЗ вію с іх ї
Фіг. 15 (продовження) дитмевця ТЕ (24 гом спільної інкубації - 1609-, я оготьмо потиВаНіК Ті. І шк СПІВ ; и шов во ДЕ СТУММООВаюх їх І З с ви ї і в ії х ВИ Ж 5 з Б кі Ж ВИ Ви: жі ВВ ті М Ж о В но в Ви ! ; - Щі ВВЕ И й оійко Же Які ВО би сжюс яю Вк ВВ АВМ Я, кпмоврРНМІ 60400206 6 ВМО б о щаа ля 30 а ЗО пе ОБР вар ко ті ВР Жкгонація 148 годолуєно інеті)
М. СОЯ як ВВ салона якуиваців т. і М ср п й ОЩ ден хі 5 В,
В. Ж Ж мон ТЯ х 1 й Ї Е | ВКА Я: х хм ВИ В 5 і Вл Жов: і ВВ, г їх Х щі пов ВІВ хо пив 1 - і. 5 ВЕ Як я У м х ї - 5 що як г ж НК ги Вовна ось. сЯйс Як. ВЕ яд Я. М. еіклбРнИх 5 00 вобюхо ві ооо фунти 0 филтннннннннннтинннннниттнтнтктитятчятяляляятняя вить евРНуХ Бавак Туз впМуХ Фіг 16
Крива залежності від дози РН де ї-- джут ррттетссовртетенссев і ї юс - : тя і х 1 Її ж Е Й дня Е т р і і
ВИ. Е я й В / / --кі ВРНОЗ (244)
в і. ГУ ! Гм ! сиди акція о до 5 ее БРНУЗ Вч); 5 ОВ. 1 поч полей х ! ЕОМ лм Те ' і СО і і в ! пе ' - , я й ' ! ря ' КЗ ' не о . ї г і Щ у де. ф і 5 їі ! ж / Ї і / 7 х п нн М а 4 ; й а ї й 3 2 5 5 ювів пами) Фі 17 вки кум ФІЛІП Ім хі сему МИХ ел УМХ | МЕ ОКУ ще ОККО МУКЕ Мети ! ТЛ Коди. МЕЖІ З Меттжнт твіти няння т то я тк . Може й я со « кі фо .
що . Ж й х їх Ка боже «Ж.
ша . ' ШОК дод до ї з м їм Еш р А ун Ах о, я . т. х ях ЗОМ ож т В з ; їх х і 7 Во по Н х з ї їх ША Ж. де ях Ф осо Кк АЖ ні их т У К- 5 с Я ОХ х я У - Ж ех Ух Її ще 2 я а оо Ко ш ЯКО зу Ж А НН СЯ зн а и я Ко ї шк Я ПЕОМ ПЕК Бопусееюмемтмє Те лимі Юм ід ОНЕУ МуСКАКИ хм,
схе. нн... Ж... ВАК... в. Ж ху ВВ Азот КоЄ хі Б тт і а Ж дом мох п - Х дм жо жо М зн . ня, Хо хм пикєх є Ж сх х Х ах: ож г сення Ще: С 4 Мох: шк т хо о шо хо ої ,; 5 пів. хі У т ах ї з х хх жк од ДЕ М Ж и 55 Км дО ЯК а шк аа ЕЕ Ко шх що о МСЯХ ОК Ж я ЯК о є що шк З с 15 що З тт їх
Фн.18 в Гокослоняня б Го: ВЕККОВЕНЕЕ а які: яко вІавжк кни ! : ще Короля. ФАК Жах ї З ї и Кон. ВУВАННЯ І й З 5 ті ще ан с фай и в ов а : щі й ! і ще Ії | і в щ З Тай о ДИТ фен нн зби Ід рякінттіднт пір їй в в ЖЕ й вв Ї оливкове кас ідне вчу ВКХДУЯВ Перм клітині: Крива вича Каплан авивря дуддмоннннонвннооооюююмк сон, си ККУ. - С | - еко ї Гессе - о НАННЯ жом кофе жах ХОТИТЕ ТИХ ЩО по лк ТЕТУ ВУКХ я і Ж ощі Он м щ в ач У Н х «М сум до ІЗНВ Е я і Н зни : Я її ож, ЕНН ях ї вв в я Пов гукає янв хар ЗОБІ ЛВ Інсі ке нірхяи «т 3 Ме: ЗБ пвожи ІНоКєтн вкл киян Фіг, 18 (продовження)
МЕ. лродовжЖенняй к
ВО. в : 18 Ж Фо : Я5 В 5 і Е хо ще ї Ж В пн тт ас о Гл ! 22 ; і В ! З 3 і туя З рія Ж ж Ж де - Я Ка си я я як о їх «ЖЕ КО Кай я Я дя С ФУ р «й х Мо я З г Го Е
Фіг. 18 (продовження)
А Ссьвахносій МО я ОК в Ж МК І а о дО ОО ОВ п ПОМ я є нн ОН ОК п: ГО М У М . ТК ОК УВА її: с що. я: Но ІМК о ОК М М ОВ ОКА г що я А с ЗА МОДУ У МКК КОЖ ХО ЗЕ РББДЕНИЗ МОМ В ВК с ОВ І ся 00 с с УЗ о о ВВ В о с о а І МКК о М оо со о Комо З ШМК В А В Я от сду, ОЗ о у що ЗМ, сла Її с шо є ММК М я щОХ о. м КАХ У о п В ОО ВО й С
Фіг. 19 озваменосй ш в В В НН АН А АЛ КК Я Ак НКУ У. ЩЕ - З Б ХО ОКО о с с о КК В С ОВ ВОНО ОК В и В Ма о о. НН А я ос У о МКК» Кк ЇХ НО З аку ДЕООХ В КО їх ОКА я З НО Ко о с ОО у дО т ЕХ МК 5 Ж о БУ М МК ВО М ЗО МУ т и о. МОЖНО се вв ОО Ж 5 З Поки З КОХ ск п СХ що о ее о ша М ОН Ме С ни о 4 ВМО ох Є Мен МЕ ок М СІВ вееАМОСВеНОЗ нн АК ,НИНВІК СА Ко МО 3 У БК ОН, Ух СОМ ТОМ ВК ПО ОО я ЛЕ ко е Ікс ОО ОО пОКМНМО МО М ОО Сі Ома ОВО есоме:
ен. ЕВ коскоас док скан мен кс око с с В и і с с ЕЕ 0 ОО КК пе а ЕЕ КАМ У ОККО че ї Ух
Фіг. 19 (продовження) ОБАВМСИВМАВ шення МАМО нн ОХ т пн. ОО фо ВИ АК Ум В Я Мои Ов ОК НИ СИ о, СОБАК ОМ а а: М Я ХУ о Кв и ОА о ЗВ п В ме с ХХ ОА Я Усім М АСОМ сл ееоосе сови ве о. нн с ОК х КМ и и М ОК КОМ КВ УЗН о КК с ОМ КК МК В ОО о М ВОК ВО ї о. КУ З ІК КВ о с Тих АК І с ХЕ и ДА те ж пух ЗМК ЗОЗ ро ЧТ М Зх ОО
Фіг. 19 (продовження)
й М БЕЕ АВ х С м о З. і Кі і ни сб Но А В СН орки що й й НИВА МЕККА СЕ КК ОК КК Кер свому Ве МНН ех МНН ДМШ уа ВИХ еп хек ам пе КЕКВ РК ВИК В КНТ А ш чек по бно ен РИ АК бле сеча вив ОО В окві УНІ Ви М АК В ЕКОН ПЕВ ПО А ХК З сен м и КК В Кк в Кк КК КК КК КА и Активація ТІ. 48 год спільної інкубації) я ша зктивазані ТЕ і я ОБО , М і СПО Сов ді ПІ БО «| В й і в'я у. ; й З З З ' ще з Я КІ в жк КЕ а Ж | ях. я їх В В С ЩА Ж ап ве ж щ- З Же, З. В ЩІ й що В С иа не ВЕ Я ж КУ ЩО: Жах и ЕВ. ВМ. В Хо як; ЕЕ о в и Ох Ву га о і Я Во щи Ще Ж Я ЩЕ ю х Як 3 ще я що, що хх щі к що їх ще 5 ке в у й ТЕ ях ж ух я В У; Я й ж й ж ! 5 МУ її щи БОБИ ВИ «оф з 5 ж во» я КО «Ж «ка г в КО од КО 7 . : Мої г х і. у учллллллтитя ! птн у Бен рт Й й 1 витиясвамийх!В бишж ВУ УТ. МеНК - Цитолізнос квітинемішеней МозсСя (48 тод спільної імкубації) я 5 ща і Жде ЕОЖМ к, : Ка т зр. х ! ява ПИ - ЩІ з т зойок ше ДЯ дах Я -. БЕ В Б се ВЕ . Ві я як В ж БЕ Б Б З З 5 і в я Бе Б в в ве о ов по жан ше не же же нн жк вх що що с Яд Ж Пт, их жк жк х шк ян ВАН вне х ф От ох ж ж ж КИТ жк вх а ж. о ' КИТ ох же КИТ ж КИТ жк вх а ооо . ЕВ Бе М 8 Б 8 Б 8 55 5 що ' о Пт их жк ж х ТЗ же щи ще жо ще -щи 5 5 555 55 з 55 з 5 ' сн КІ Ян жк ке ще на шк ж Ба В і з ж же КИТ Кт КЗ ПП Во а мк в ще Ма Бк Б 8 Б З Б БЕ ВО ФО дос Я он - « 5 - Я А Я СЯ СЯ НУ СВ ВО ПФ У б х з ху т х чо х 2 Е Я Фо сш а» ОоОщЕ ва 7 фркккючкккюкютккккк фонениннннитннтння пиття плжлнляняжяюнюяжиняяні Вілок ровобу МІ-МеНК
Фіг. 21
МОДСЯ, транеодиковані МТ-МРНК я ТІ. людини дме ув свои мов вивлю МОЗОК "ковір, у юри в и и В га ОО А с ша ПО и БО КО я с " М в о м З ПК КК хв а МН в НО "Ве м Б 3. Он о я В. Ок кн Ну МК я ОВ М Ве ке сов сс ШЕ о А сш. ОО В МИМО ОО пен мк жи ШО В п а Маса; транофіковані МТ-МЕНК --тідьки кантрі по ОМА ЗОБОВ ВН
- 5. не зе. 0. ПО и В без с « МО сом вн ш ШО я 5: с вх у. 3 ви, о 0 МО я с КО ООН она МОБ шо З .
Фіг. 22 А дктивація ТЯ са спільної шнкубації) загальна кітлькоть Дитивація ТПОЯ гово слільної нНкУбації) я зктизованих ЇЇ. 5ВА СОУВе і ТПОСре - аб я р соовоювеня наш ЩО В |і ж У їде В: ЕЕ - ОВ
Й В. Я Ві що В ССС 8 з 5-3 Ех ВЕ а ок й х ' кої. ше шо т
В. 3 85 А ВВ ке ів збе Б: Я и ВК ша В я ВЕ я В й ях п Бас ДН р» Все ВН ЩО си; ВЕ я іа 0 В ща а ще А а Я з М З Є я А. А. Б й, ак ах іс У й ва їх 1 12 о 1ВААВ МТ. мене коми сотртхд : . с ЩО активовані ТЕ Активація ТП. (48 год спільної інкубації» рок ка» СОтб Ж СТІ сова да. з Я согосрявея во т я ок : о Я о Я Як ЗЕ р. м В СЕ 5 | о т Б 5 м ще БОБ: в : В щу а дХ Я Бі з, В та ЩО Х йо ди ши ши Ще
" В. Мово ще й в я й к Вод ох- ПЕ ПИЕЖ Ос в Ж ІБК 3 В - ЩО А ВВЕ 5 ВХ зок кі Д-- КОХ). МКК У ОО А. лов ск ВД КИКАКИ же о 54 44 За а Я УМАВ УТ. заенК фати .
Фіг. 23
Квисдчаие кюлтмн коренем моде вх Ж гав чен СП вч і я в 5 і б г ши «осі і шу і 5 я т ! ті і 5 Ї т і і В ! | же | В 5 А т добі ще 0 БО: я -- В | ШИ Ше б сннянння рост ння ВН ВВ. В... ВХ НИ 4 її 56 126 За ТЕМАВМТ. аеиНк. рю
Фіг. 24 пезвкрерація Т-юуктин ка отв - ї е Бо КУ ' ; їх ' зн х Н ЗвКоХ со Е аа жк ППП Е 1 СІ ПІ В ї зн зх шк ! ян ПІ Е ! жан С щ 1 ян ПІ ж І жк шнх х 1 жк шнх вом жнив з й ! вими ми Ж ! -- жнни ни з е | Ян У В У 5 і жи ВИНх ща Фр овсоо.ЯВНК. еде середня кеююн ВАК ЖИВ «оюютюко ВВА енаонтжтрюнтня ря НЯ остео пу м. АКОк ор ОО дещо и я а а ОК о ж С ШИЯ фФ СЗНИШНИНИ ОЗ М й ака аю сх я а с сх 2 У і сій с С ї У я Же Кия ее - Я а С Ж а й фенннннннтнннннннннннні флжннннннянтннннт титр ун тт увкичи Т-влимни є СОМ КО. пкхмтмн: теж у СОКІВ А ногатисне клини мире КЛІТИНИ
Фіг. 25 ІЄ дктивація ЧІ. (48 под спільної інкубації) Жіаєсмвовані Ті А ще щоорюе- і ГЛ сова в хо НЯ СОФІ х сх, що : іх в ї с: НІ Ще х. їі я й ВВ БОС яке: ОЗ Шее : в: 4 : ШК: шок» М ОО жі ОВО хі ще Б ОВО ОО : в 8 Б В : НО с ВХ а ВВЕ 22 ть Вертов. схннятя В, ЯМ. я як. рий відпопекняи т Й щи и 1 З ВІ. рення фннннннннннтнняннняняняяякткяяюнтянттттти ЗМР ТЕМАВІУТ с исНК в Цитопізне хлітюмх машеней Море 18 год спільної інкубації) КО ва 5
5. зи
Б. я х Щ дк ЗВ ЕН зн Б Бі ЩО ВВЕ ще х я Б я У і З Бе БО Яе і - В В В В я хі віх вки В ВВ Б " й ох Вк Б Бе же ВО що ом пл ЗА 3 МТ Мене імла «НК
Фіг. 26
Активацва ТІ. ЛЯ8 тод спільної інкубації вк активовані ТІ ки - ЩО сом» т о ЕСЕ среб» Во Е В Р СооБАСЮВья хв В Вк О 3 т Е ' ЩЕ: В.
ОВ. х 304 ВО: Е.І. ві Ве: 0 В Мі В ОО: ді В: ВВ: Ще В У ВЕ 5 і я ВХ У ВХ ;
ія. Щи и В й я «Ва МВ кВ З З... Ж о... 5 5 дк о Ек
МТ. меНК ме! 1БМАВТ.МРВИК пметмяХ Цетолізис клітин мішеней Меса (48 год спільної інкубації І мессісеех ше Ж вк ВО жо Ж А КИПИШИТІ нене їі ВО ПЕ ЕХ 1 КИПИШИТІ нене 5 ! НО ШИН ЕІ ВО КЕЕЕ КО Мово ин Я і пово зов С : пово Зо ге ї км зм ш : меновних нене КУ ї овбіюввся В дО ФО дея ВЕ ДЕН ж : ОщЩОВ СО Кон Ден в ЗНО ДВВЕННКНЯ ВІВНИНННХ НЕННЯ но Я З ма фун фути няння
СМТ. МНК мкг ТВА УТ МеРНК раком)
Фіг. 27 ІС Питотане СКОМ'В С нетятиниех клітив Мп СТО од спітьмої нку).
-
Ж. З вона Я в -шк- 5 Ве ТОК В я 5 ВО ПС ВО я Во Х ! же БПП Вик є і я я дО на ях С ях Ї і ях ПЕ ях і і ПК нн жнх 5 і СК нн жнх МОЖ во» нн жнх 5 ще В В 0000 ВВ я : КЕ я Ї ох сіни ВЕСТ де ва ЯКУ АХ : с їх Ба Ф хх х Ж а о Мімовк 100 нет бик
Фіг. 28
З ТТ МК (ВЕАЬ В Є дек в пупарнатвнх ВРЯОЯ 7 т ж Не щащі Могкй У ОНА ї ш щі й І | І Я с Же ке З З ще. Фев А КУ ще зе ож Я о як и ДЕ ок лу Жухом ЗЕЗАХВ Геслат вра ща
Е ж. З Я я їх х ЕВ ке «й п пен нх шо я лян-ев вводи ЯКО БОБЕКЕ НЯ ЯКЕ МОВО шо жо ЕЕ: вантя- в З ярах | луках фор ооо ння» Не Кавові ска і З ЕК ВНУ Зі е З 13 КУ гумаквікв І НМА БА 34 Еазтявінк жен 15 ТУСРНЕ ТЕЖ к жжетевакяєх ля М он рію НМА В я кнітневиму вйшкт 38 ЗБ. зав сегевзаневаетьк Сі зівов | 1,
Фіг. 29 яд нний 5 Ве о ОККО Но я шо Я з ЕНН МЕ КН МЕМ ЗА ВЕ АсАТ НКИ ЗМОВ од НК І КЕ У деТкоміх ренні зпозок: Ї 1 І біковий станах ? КЕ імітаційних мто. ОК «КЕосіклждеюажанкінніннаінннининнчиининииииииижа юю ки 3 і кимір. ВІМАВ з ВМ йо ПВвАВи ЗА У пт пото ппотаоппттпттпепгтттттА МОЛ мюмоочомект ріка ЗБІМАВ ! По тісноти х 7.
ФІГ. 29 (продовження)
Анвпліз на питотоксичність мушачої! сироватки 45 год оопільнеї інкубації) 1 дав зва аз и пав ш : Шинн Зав я З ШИ ВО Б 5 з... В ВВ А Б ог ДО БЕ БВ Ж 1: ВЕ ВН я З ІВ ВО Б 5 с «де НЕ ВЕК ж ЗВНиК жинне Мних ВО оеов жк "я Б Бе ща я З що В ШО Зк ЗББе Ж «ВЕН нн ве сени ХНИ щнне Вре; ШИ ОК БВ
Ж. ГЕ жене ЗХ ж ЗВНиК жинне Мних ВО деев жк а шк Бек Бе де ще БО В де БЕ В х БВ Б Б ак В ще З ДО ЗЕ БВ я Б БВ 5 В ще ЩО З БО І КВН Же ще М ЯКО Же ше Ше: них Звое
О.А Б ЗО ВЕ я В: В Б дО ЗЕ БО вв в Ва я В: В БО шою ж Б ж ІЩЕ ВЕ ве Я В дк ББЖ ж БЕ ВЕ ІЩЕ ВЕ ве ДО Б З БВ БК ж ж Б ж ІНЕ В ВЕ ВЕ як В БО Б ж ж Б ж в дор яккю. Лор ЗВДНЖ ЯВИ ЩК --- НК. ВО -ЯКН СУ ---- ЯК. МНК як. ДМ МНОВ ям ВОВК о м ща фен руттня няня подану нен тт тт БІЛОК ТВІМАВ (нім дні після ін'єкції фен фен фен мен аРнко ВК репліком
Фіг. 30 А ВЕР аа ОМ о о я ох ПИ ВІДНІ ред тет Усні нн Б ВЕНИ НВ, З пики ТИКИ КИТ М ие ШК я ІА Ж ЕНН, ВОНИ МНН ВЕЖА, кі х Ех Її НнЕН БЖ В паяти ВІ ВО МІ и чні МІ ФМ. цен ву Ву Кф В КЕ Іі ВчЙ крони в ОК ов АН шеешееВоєтеєєтеєютиеокюн все М А МІ КЕКВ ню Воююннеюю Донині
Фіг.
БА-І, транефікавані МтаєРНК Візок Би ТЕ конув ПОВ я спос Ве срноЗ ВОНО Х ОВУ ВЕ ОК В В ОК пове З У Во ВВ Ко я МО Ве що г З 0 ; я ше х М и В ШО НЯ БОНН ОО В Ко Ко аве ВЕБ ЗУ ЗКУ А КО Ви У, Ваня Мем НН ни КУ МО о НЕО ее о ВХ он ни ЗБ ОВ КО Во ІС я м ща ОМ оо в мя ВХ НО в о ви ЗНО о ОН ВеХеонНВНХ нн НО ЗК В Вони Зекнвю о е в ВОНО Кт ОО ФО ЗКУ ТВА о ду ЗОМ ВХ КМ Не БОНН Мо ВАЯ и Т Бізогбу. білкові контролі ітвційня ВВ ооо іти ИН ано вве гм: і: МН ВВ М я сен ев в РН -шб 0? М щ 5 ех ВИН Сн У о о я о У ВЕНУ у в НН В ня М а В В ВЕ В и п и ВО НН ВО В КО Кв я ЕК КО ВИ ПО Кк Пенн ння З КОХ Ж КО в не ВоНН и в А У КВК нн Про и в ПОМ НЕ ЗО В НЕ ВООН В н ПОМ І І ПО ВЕК ОВК В ЗВ ПП ПН в ин ЗИ и М ПИ М в М НО В м о и М о НН УМ и НН НН МН КВ хонгропі й Шк РА В пото о НН дродоосоооово НН МО нн Кн В нин ди а М ОВ и ВО В В ОП КЕ КК ПУЕ КЕКВ По в НН НК нн ОБ о ВО В он М НУ ОН и Ви ОВ и ЗОВ я ПН М ВИМИ
Фіг. 32 « А Зктивацня ТІ Те соки слільких жуваЧиИ
М. ШО оснуєоть 4 : БМ пине Кк щі ОПОВ ге вом Ж х я : п Що П : пок ; жа Це й я шо: їд й 3. х г і Ж Ж «в ів ж ЖК. Ж с йоаб ок дв иа як ж Кс ши я х твтЕ ваз РАЯ В сдтнація З Я поси плінької вжудам
Ф. ЩО хохехкт. в ! що не ох : глосж й: пах о що Як шлакюмня ої Ж : : Зоо 2 і У Ж ча о Кк; оон : м : ож ї М й х : у кА їх Кк У с ху ЧЕ Я й а У ЕЙ маш ке ШТ в вАЯ ве
Фіг. 33
Аксжія ті. З Род спільно! Інкусації 534 ЩІ охсомеоюмч ті. і ВЕ осо і воя С ср» її Р пове ті ; ; хм От й їх Н я Я В і в НЕ о кож ВОВК : М за В ж: В їх ія В 5 ВК Б я х я В: Б В с : В: ве: ЩО й 8 ШЕ: ! шини .
, М. Щ5В ще п. с. Ке.-- В Й ОВ В Ж. А со що е фаги 5 д - : - К- п Є МТЯАВМА регі 5 фея фен вет вооктая Й Фіг 34 Крива залежності від концентрації ЗКНОХ - зі яко ді год 1 фетнтежеттттняк -- ЗК тод Кг ит ЕС) з 198 Я ними 8о / І ж і о І / 5 З ж і і т ! с- 5 ! ! шЖ п ії ох. ев і і Гу ве Е - в ; ! ; 7 за» і Ї і, 7 и т, Ж Додон стерня нт : : г і У З а 5 о імп) Фіг: іс 35 Презкрераціє Зхогьн х
8. даті хви ж; я і я
ХХ . ди ЗБК ПО і кі ще хі ве З Ва т ж ща З Б я ще В кі й З Фін сипюеотлеюттттитттння ЯВНО вва Ж стюеотттттисттитвюю я е я я К:й КсЯ " є Ж ок в я та в ще ОО Ж Я ке ож ще а а я ке Я ки є КЗ інн 0 мет нти тую. оУене ЬЮ а, птнумимі 000 бллйем СК ачмм клини ен зжктинм Мне Фіг Зо са КИТА МНЕ ЕН О укл я супер яВ ВНИХ Хе й Ми ї і : хм М БА 5. це Мн КО хі Її 4 і с ТЕ Ї ї і Е З ; У: ВВ: ОКА Ж. орегаюст стосу: ВВ, й я. шоком Ка х. що ща де их сад Б жк я - З КЗ я я в МН Кк ши КОМ хх я У У - я КУ Є он ВЕ нь, ща шх - Е «нан ов нн сх ВЕ за с за й... - ВКМ МАВНИЗ кВ «ЛИЖ ПИИИН МИТИ о т ще за нон ви ШО ОО ОКА І іехавав 4 їх ЕВ кат нка Вам і Ки КАВА Кр ІЗ і инавнй тина ІЙ ГЗК ОК Щ КЕН донна ВНМУ ЩА осонні ВВ НЯ, І? і Іроумаоо рр о А А А АКА А ААУ орд ння М еннсенесснсь БК ВВ В КИ ЕВ оосссессссс ення ЕВАНС Ж КНУ ЖЕО ІДЮ, о ооннчнчнл КОНКУ, КУН ЖЕК нлнячнти 13) 1 внкк секневввнинх Е Ки ВІКІ. 4 т Ух
«р. ЗЕ С па 1.5 3 45 ав: МАК ел Моди кн и ІМ х ТИ Ким ММ шо во за МОМ я 40 ВИН КК КЕ М А Я фс ни ПА Зв КО ще МО Ще то і дв анмгае-нів ідбрнкки ; зразок 14 00 білковий стада 17 змітаційний комір. ЗМ і і ; 13 Кантр. ВІМАЄ в ЯМ : сег їх аРНОИЗ в я і : ід 0 мкг очищеного бика ЗРМИЯ! ;
ФІГ. 37 (продовження)
Ана па цитотонсачність мишачої сироватки (48 тод спільної інкубації двнекнннавяя ж в. - 1 ї- : ВО до ЕН НН е : зле дови ЗВвввООх уеноеннх ння й : ВО о до ЕН Дон мо с НК ДО рез ро-- ння В День дня Диня х : : Ваввиннннне ввненннних Мене орразовись певне Вони ХЕ : І Венновввов пиннвввннвх меннвввннох МИВВВВХ МКК ВввХ ннКвниквнх Х і : Дининнних Диня ПДИПШКИИОВ финкннних дних Дня У : ! КЛИН Денокнннх Кене КИИИИИИ Денокннх нвинннння х я0я нсовіснов КОН ВО Дона ПН ШІ Дон лу : ВЕБ наван рних Вениненних вен пининеннн Верн В : ВЕБ винен винах ППО вен пининеннн мевеннн їх : ВВ вен Вивих наван вен пининеннн мевеннн о і ВІ вен Вивих звнинанних вен пининеннн мевеннн я щ щ і" 0 и Кк. ТА ЯН ММЗ. ЯКОМУ ЯМ рн ВОВНВЯ ВОНО ВО во 28 п і МеНК мРНК реплюсн фут е ето ее ме имеет ептеемееноеточепитепитечнно Білок БРНИЗ (вглат Фі і ЗО і Цитолізас клітин-мішеней МоизсЯа сад двгод Ї і ій з о. ! Ж КЕ Б 5 Ж Я Я В ЕЕ 5 8 5 8 Б 5 8 5 8 55 В т 8: і 15 5 8 Ж я хх Ж Ж В У Б В В 5-х В В Ж: й ж в ВВ. ! В ж Вк ж й ж в ву ВУ в В ж ж ж ж ж В З В , 1 1Ж ББЖ Ж Ж Ж й Б В В я В В Ж хх ж ви, ож г ув В: : Ф 1 ВІВ ж я КВ В же В В ЕВ Ж я хх хх В ВВ: : Ж 1-5 я Б В. 5 ВВ и В ЕВ ВВА: і З в МБ БІВ ЗОВ В ВВ 5 Я Я БК В В В В Б ВВ 1 Ки 1 ВЕ ЖЖ Ж В хх ж В вки вив: ї 2 1 ОК В ЕК В І Ж МВ Ме с и ще В ВІВ В В В хх В В й В ВВ: І їх Ж В ВК Я КВ В В В В В В В Ж я В Ж я я ХВ В: : Ж пох 1 З. я В Ж й МЕ Я 58. 2.838528... 58.28.58 55 ВВ В ОС і Е ме З с МЕ я РЕ Б 3 В В ВЕ ЕВ АВ и Во х 1 Бе КОМ Ж ОК БЖ Ж В Ск Б Б С БК В В вив хх Во ж же В : : а НК д З о я БК КЕ С БЕ КЕ КВ К з ха І В В в Б В Ж зу З В ще с «В ! ї ЛЕ МВС КО БЖ БОМ. 5 М БО В 3. 8 В.В КК т В В Й ВС: ії до КЕ о паза аа ву БЕЗ ЕВ кі і ро І ЕВ В В Ж ХВ В МЕ А МВ В В В Ж ВВ Я ВІ і! І ЕЖ Ще Б Ж МІЖ КВ С ХО Ж МК М М В п МК МО В ЗК с М КК КВК В: їі 5 в ВЕБ ВВ ов ВВІВ! 1 шоп ІЕЕ В КВ МЕ КОЖ Б с КО КВ В БИ МВ В МО С ще Ж В СВ В В ТК ЗУ ВВ В В: і х ЧЕ КЯ 5Е МЖК ОК м КЕ МВ ЕЕ МЕ КВ М В ІВ ЗО СВ КЕ: МЕ КО ЕВ Ж М КЕ КИ ЗВ о: 1 хх В В в: В в В В В В КС ВО ВА І І А КУ ВЕУ ВК ЗИ З жі ТЕ а їв пи Б З с ЗОВ і В І ВЕ ОЗ ОН БЕ МК СК ЯК БЖ СЕ Ж В ож С КЕ БЕ БЕ Ще Я я ВО СВ МВ НЕ КК КК ФК В ЕК ВВ М: Я ж нн З НН ні нев ї ОК З СВ Ж ЩА Ж Б Ж МЕ Бе СК ще оЕ БЕ БЖ ОЗ Ж ВК В ЗВ СВ ІК Ж Ж С ОВ ЕК КВ Ж: ІН БВ ЗК ЗБ БУ БЕ ЗК БК Я С СЕ ЗБ БЖ БЕ У ЗЕ В БЖ В МЕ ОБ 5 СВ ЖК НЕ Я В В В В В ІЙ З С СБ ХК ОК УЖ КК КВ УК КВ СВ ОБ ВЕ В ЕВ ЇВ ЦЕ Я ЩЕ РК КИ З В КВ КВ: с Не: «КЗ ж В ЕВ Ж Б ля я Бе «В, ЩА «їй ж ВАК «Б.В я х: Ко Ж Я. В не: я З й. ІВ - да Ж: ке Я о : зе кін вВ'є ВІД ВІЩ відів в с віді ш я ВІВ ВІ БІВ ІВ КІВІ. І ДІКІБІІ ВІВ ММ МІ ВІТ ВІБВІЖІВІ М ІЖІІВОЯІ КІВ МІВ БОЖЕ: ІВ Ж ТІ ІІ8ІЯ; БЕВЗ ВІВ ЛІВЕ: і і і ЩЕ ї 4 і : : і пюханапраця: кондунг рація; коицентрація концентрація конивитація концентрація: кониентрація с воентраці ! і ооїжяир род роси То обнвмн: ЗО їнНМмн;ро о сиар о: 0 ними шт ї і : ї х : ' М і ; зим : «хе і ак Ї Ба. : Бе : 558? : ха МУ НН і ! ! ; Ідентифікація варіанту і і : Кок нхнлнттеюнмотнняя нт тити інт титя яті жуутуннтя яті зони тут кляті нти няння
Фіг. ЗЗа і Цитолізно клітин-ийвней ЯиасЯ4 війт зад І інки й 55: 6, ! і ХЕ ЕСЕ В В ВВ В В УВК» пити дк тки Мп димтютяну ! 1 «Ж 5 хх 5 5 5 хх З 5 Ж 8 - й - о: у 18 5 5 5 5 5 5 5 5555555 5 - й Я 1 3: І вок ВАВ. ВВ ВВ В у В В о Вождь в ї 15 п Ж х х В Ж Ж х 5 Ж Ж 5 їх - В їх ца х у й х в Ж х к Н 15 8 5 8 85 85 5 5 5583 58:55 8 5 Х «ЕЕ ВАХ: 1 5 33382555 88855555 я ЕВ У Уа. її З я 1 Ж БЖ Б ЕВ я ХК В ВІВ а з жк вх Ж х в Ж й 3 КООКОБЯК ак ЕК Я А КВ В В В НВ ВВ ВС. і ЦИ ЕВ ХВ У ЗК ЕЕ В ЕВ З ЇВ: і ЗВ шва; ХЕ Я У У 5 Б ї х ЗИ НЯ КЕ В В Б КЕ. ІВ. КВ КК В В В в Я В ВЕ С: ї НО Де В В В Ка я В З Я У КБ Ж В: ' х В во КЖ МВ СВ Се КЕ КВ КВ В Я ШЕ Я КВ В 5 В Б Ж Ж В ХЕ КВ ВВ: з апх, Ж ЗВ ОКО 29 ОВ КК ОС КВ ЗК НЯ МОВ СЯ С СВО 58 ік и ще в Ех ЕХ су ВО С Во В вве т І ОК Ж КО хв Б КК КК ОКО КБУ МОБ ОЗ М В Я СЯ З ЕЛ Ж СЯ НЕ НЯ В ВВ їж НЖ В Ж ЗУ ЗВ БУ КВ Ж ЛЕ В В Ж С Я СУ СВ Ж В Ж І Ся КО КЕ хе В СК її «ЖЖ Ж М СВ КВ ОС Ж ОВ Я У Ж В БО В ВХ ЕК Ж ХЕ БВ МН КЕ ЕСЕ С В : ж 05 1. у їж 5 -КЙ - що. я ца -М 38- 5 ЕК х її -К- ЕВ М В -Б КОКОН В КВ ОК Е. -ІЗ ї ЖОВ М ВВ С БВ КН Я Ж СКОБ КЕ ЗБ ОК КВ ШК КВ Й ЗВ ЗВ (Б МК МВ В с КЖ М Ж УЖ В 1 Е ПОКИ КО В СЯ В КИ Б Я 8 Ме ов КО ж ОК ІК З СВ М М ВОМ ЖОВ х Е ІОХВ ОК КО са Ж Ж СБ Б Ж ВВ КИ СК ЖК ЗЕ Б КА Ж ОКО ОХ ЩА Ж КБ ОУВ В ОВ В ії Вих ВЕ СВ СЕ 8.3. Ж 32 КИ 85 38 8 Ж 6 Я ВВ ЗЕ ї ЗСЖ Й Ох НЯ МБО СЕ Б В ТЕ Ж В В Я ВЕ ОБ М Ж КО НЕ МИ З ЗЕ ЩО МН КЕ В Ж х ІОВ КК ВВ В 5Е «КБ НК БВ Я ОА Ся ОК В я А В В В С В ВВ ЖЕ: Я Ж ОЗБ Я 85 8 Б В З СХ СБ СВ КВ СЯ Я 5 З Я В В Ж хх В ще І 5 ВЕ А БК СВ В Я Х не НЯ Я 8 Ж В В Ж В В ВЕ ВВ 6 КЗ Я Я У З, осн шо Мо шо ши м Ми ж и І Ж М Ж в іш З ШО і жи М ше в Ж В й ПНО ЩА ОБ С Бе КК Б ВЕ З Се КК ОО Б А КЕ Б В Я С УК Ко КВ ОХ З КВ МЕ ОВ ІК ЗЕ КК 55 ЗЕ 5 Я 5 8 ТЕ КВ Б С Я В КЖ В Ж ЯК УК Б В З - Я КЕ ЗОВ: І Ж о У кю Кок ж с Ме Б Ж Ук М о Ж ВО МОХ ХХ В ОК С о я о і се 4 й «МЕНЯ СВ СИ 5,Ке КЗ «БК Я Я «БУК НА ТОМ. ВЗ КБ. ЖОВ Ж З ЩЕ Я Б Ж зеіш' віз вів вів'сід швів в во ве візі вів в шва ІЖІВ ВІВ ТІВ ВІВ ІВ ІЕЕ Я ВІ ЕІ ВІДО БІ ВІВ КВІТІВ ВІ ВІ ВІК: ЯКЕ ВЖЕ ВЕ ЕК У КЕ ! і ! : і : : ; ! г Ї пхнИфацІЯ Ї крицеНТрЕція! кохцеємтрацію: концемтрані конуенуюція! концюттихня! концентрація! кокцекувами 1 Бони, бо бмец НИННУ о пеноц Коник ко їкнилу ї ем : ем ї : оо ев їх роя тот оовмко! щу 1 : Ї 1 : . й : і : ідентифіканія варіанту ,
Фіг. 396 ІК фи - тм ше тих петля і ! і : 1 Цитолізиє клітин-мжаеней Мидод Братод о ошлЛяюА о, ї ! ї ц і Шк: нина и о о п о п ОО о о р ! ! : і ї ї й і ї : Ь і і: рев А НН В п в п в ї ї й 5 7 їх : ї В Я : їз ї х Б я : : К З 5 8 ті 18 : . с 5 я В ті ТОЖ ху менти тт кни фо пеня фен нет фр титттттттттттитя млн і: : і Ж я 5 5 З ї їх 5 : Ж Ж хх : х ї Н : В Е я В ж: Я їх ї й у й Ех - 5. (жк: : їв І В Кк ТК: т 5 5 у і ; В ЖК х З з ВЕ ОВ дим рення В ее р В В В тити пенннн рн Я. 1 : В КЕ х Ж ВО «В В іх : й У. В я ХЕ З ХЕ КВ х ВВ: ЕС: В ЩО ок В З МЕ В Ж: їх : 5 їй Ж кх ще В хВ В х ВО: ї : С -К КК я КВ я В ЕЙ В В: Тож б КВ ВВ ВВ ЗД КВ снення норми В НЕ я БІ Ви У НЕ: з ВШ ТЕ мі КВ КН СВ ЗЕ ЕХ Я В ОО Я В ФОН гене От В КВ В КВ ВВЕ 5-В печу атятляття фттнк свде Я 1 : ' В 15 5 Ж: З: З Ж: ВЕ : : і Зх КЕ В БВ її І В іш ВВ Н дж се ВОК ВН КВ НО МВВ АК ЗВ ВК ЗА Ж. ХВ те «ВУЖ середню М ор В ММК, і ІІ ВІ В ВІЗІ ТВ ІЗ БІ ВІЗ ЕТ ЕТ ВІЯ ВІБІКІВІЯ ВВІВ ВІ ВІВ ! ше БРВ ІМ Ж Я ЕЕ ВКА: НЕ : ї : : ! і : : : : киш і т хонуентряція ї хпаценгоамія і конментрація р понцентлаціт : концентрація : хонцектоннія і хонмемтваня Р хенненяця і : чн Кожну Гоїеме Н інн) : Янка ї кана ! палку і кс і : і вом Ро ме ов оо Роми 0 У: Н : КІ . ідентисікація варівнту :
Фіг. з39с р ; Цитопізис клізкноміманей МФ Шоаюд жа.
х : 8 Я "В - Я я 2 : З Ех .
8 у
4 х Ж 5 й з 5 Ж - Кк Ж с Ж ж п х 1 хх 3 т Ж 5 Ж А: жом Ж ж КА 7 В І Е вк ня Вин ВИ вн фен ї 5 ї Ж: я 5 я В В КВ я Ж а щ Кх : І Жокям ї Ж: я Ж: З в кВ У Ж -.. Е КВ : 1 а ї Ж: 1 ЕЕ 5 8 ХО.
В з У КО І: І р їй 8 ж З Я В С 1 СЕ Я ОВ В БЕ тк ВО КВ хе В : ї 2 : ЗО а МОХ 5 КВ Ж В В Я 8 ЩА КЕ 5. ЗХ З КВ ЗВ їх Ей : ї зу СОЯ Ж.
В ЖЖ М ОКОМ МВ МК М КАМ БЖС: о ЕВ 55 555: З 85 ще Бо БВ 53 З 85 585 У Я ЕВ СК Я. : Бк а УК У В т В ту : 5 ТАЖ ОрВ СВ СВ я Я З С В Ж КВ В БЕ Ка ЗВ І З т М ЩК К КВ КУ ПОВ: ' Е 51 с В ЗИ ВО Ж Ме СЖ КВ Ж МИ Б КА С ХВ ВО ДЖ КОЖ СВ Е Я : 8 Ж М М я "ВЕ: ЯК-К-- В.
К- ЖК КС СК и С ' СО ОЗ ЦИ ОКХ БЕ ще їж В ЖЕ ВОК Кк ЗВ КК ОХ ОМА КЖ Ж СЯ т.
МВ ОВ В ' З М СУ " Ха й Ж їж КВ Ж ОВ хз КА КВ ОС Е З ВУ: І: хх ЗЕ В Н шко Кк КОЮ КК М КК ХНА МИ ЯК ХК МИ МКК ВОМ ЖК КАК КК М КК КК ОК А МВ.
МВ. : Віші із В:БІВіЗі віді а від вВ:ВіВ: вів фі вішІдіш і ВІБІВІя ВІ ' КЕКВ УВА В В БЕ Я ! 1 їй: Стій у ІТТ ТЛІ рРІлЛІЖІ ВМРІХЕ ІМРБІРХІ 17181 : : : ! Не М ни Ні я 11 : КОМЦЕНТраЦів комцентраця хонцентрації. юзнцентрація «охуантрація «концентрація конвонтоацю і вануюнтраця! Н їй їнимлі оп Со дим; с (нм; Гобеюну ! Яд; риби НН і ща зак 15? ка я Роже У їж і ! 7 ! ї Гі : : 5 - - Не : ідентифікація варіанту а
Фіг за К
Порівняння величин ЕС5О, отриманих в'єдному й аналізі на токсичність на осмові рюпиферази з використанням аити-СКОМО білків ЮіяоКМ
ЛЕ. Зони ОО пен їм 22020200 ТТ а . їв мдонов 1. Ж ТОВ о В 5 5 Ж Донор з, їй од щоб г пен Я ВВ ВК тя о . ОО сок са ОВ я а Ж КНТ шк в 1-Й В. МВ а Й м їй жим о мм о бе мо 0 ме Ідентифікація ваднанту Порівняння величин ЕС5О, отриманих в одному аналізі на токсичність на семові пюциферази в з використанням анти сССОМ біпк Віверм 4 ди Б п
Ж. Ще дО вдоюра, мод г І БОХНННК ЗМОНН шо КО БО. В донор, Я под 1 свв я ІВ «5 дае дня і в : БО МОН ЗЯ се 0 Мобни НО ЗОНИ СУКНА ЗКННИ СН 8 1 В су ВК М її ШЕ шу з ака «в 00088 вва ва ня ідентифікація варіанту Поврівняннявеличив ЕС, отриманих в'однову с авнапізі на токсичність на основі пюциферази З використанням анти-сіОМО біпків Візер у Е З і змен пн нн нт Ор т Домов З. В тд га й Коомви вдоно» 3, ЗА чод р ш.
її. АН Хна Яни юю. М Бе о М; о ме ме ме ідентифікація варійнту
UAA201805270A 2012-11-13 2013-11-12 Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань UA128182C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2012/004712 WO2014075697A1 (en) 2012-11-13 2012-11-13 Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
EP2013002270 2013-07-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA128182C2 true UA128182C2 (uk) 2024-05-01

Family

ID=49578254

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201805270A UA128182C2 (uk) 2012-11-13 2013-11-12 Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань
UAA201505768A UA117741C2 (uk) 2012-11-13 2013-12-11 З'єднувальний агент для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201505768A UA117741C2 (uk) 2012-11-13 2013-12-11 З'єднувальний агент для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань

Country Status (16)

Country Link
US (4) US10093736B2 (uk)
JP (4) JP6499079B2 (uk)
KR (4) KR102240664B1 (uk)
CN (2) CN110144012A (uk)
AU (2) AU2013347184B2 (uk)
BR (1) BR112015010740B1 (uk)
CA (2) CA2890438C (uk)
HK (1) HK1209434A1 (uk)
IL (2) IL238464B (uk)
MX (4) MX369276B (uk)
NZ (2) NZ707831A (uk)
RU (1) RU2678127C2 (uk)
SG (1) SG11201503593UA (uk)
UA (2) UA128182C2 (uk)
WO (1) WO2014075788A1 (uk)
ZA (1) ZA201502737B (uk)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
NZ734307A (en) * 2009-11-11 2020-05-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies specific for claudin 6 (cldn6)
US10093736B2 (en) 2012-11-13 2018-10-09 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2015014376A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
RU2016122041A (ru) 2013-11-06 2017-12-11 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Новые анти-клаудин антитела и способы их применения
BR112016010025A2 (pt) 2013-11-11 2017-12-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd molécula de ligação de antígeno contendo região variável de anticorpo modificado
CN112979828A (zh) * 2014-07-17 2021-06-18 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
US11154615B2 (en) 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
CN107592807B (zh) 2015-02-26 2022-04-15 Sio2医药产品公司 具有耐划伤且抗静电的涂层的环烯烃聚合物容器
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
US9682047B2 (en) * 2015-07-08 2017-06-20 Therapeutic Solutions International, Inc. Augmentation of oncology immunotherapies by pterostilbene containing compositions
MY189819A (en) 2015-11-27 2022-03-10 Cartherics Pty Ltd Genetically modified cells and uses thereof
SG11201804957VA (en) 2015-12-16 2018-07-30 Gritstone Oncology Inc Neoantigen identification, manufacture, and use
CN109641955B (zh) * 2016-03-22 2022-07-08 国家医疗保健研究所 人源化抗claudin-1抗体及其用途
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
JOP20190055A1 (ar) * 2016-09-26 2019-03-24 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة ضد cd27
US20200131275A1 (en) * 2017-03-29 2020-04-30 Glycotope Gmbh Multispecific antibody constructs binding to muc1 and cd3
CA3074919A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-21 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Rna replicon for expressing a t cell receptor or an artificial t cell receptor
IL301637B2 (en) 2017-09-29 2024-10-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugation of an antibody with a pyrrolobenzodiazepine derivative
JP7227237B2 (ja) 2017-10-10 2023-02-21 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド ホットスポットを利用した新生抗原の特定
CN107739410B (zh) * 2017-10-18 2021-07-30 南京鼓楼医院 CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
JP2021510064A (ja) * 2018-01-05 2021-04-15 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
CN111836644B (zh) * 2018-03-08 2024-07-23 凡恩世制药(北京)有限公司 抗密蛋白18.2抗体及其用途
WO2019217833A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
TWI825098B (zh) 2018-05-18 2023-12-11 德商葛萊高托普公司 抗ｍｕｃ１抗體
WO2019219089A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Bridge Health Bio-Tech Co., Ltd Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
UY38326A (es) 2018-08-03 2020-01-31 Amgen Inc Constructos de anticuerpos para cldn18.2 y cd3
CN110857322A (zh) * 2018-08-22 2020-03-03 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人claudin 18.2单克隆抗体及其应用
WO2020038404A1 (zh) * 2018-08-22 2020-02-27 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人claudin 18.2单克隆抗体及其应用
CN110862454B (zh) * 2018-08-27 2022-12-30 南京圣和药业股份有限公司 一种抗Claudin18_2抗体及其应用
EP3904386A4 (en) * 2018-12-28 2022-09-07 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. ANTIBODIES AND USE THEREOF
CA3134056A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Claudin-6 bispecific antibodies
BR112021018608A2 (pt) * 2019-03-20 2021-11-23 Univ California Anticorpos para claudina-6 e conjugados de fármaco
EP3947468A1 (en) * 2019-03-29 2022-02-09 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-claudin 18.2 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2020211792A1 (zh) * 2019-04-19 2020-10-22 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 肿瘤治疗剂及其应用
BR112021022682A2 (pt) 2019-05-14 2022-02-22 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes do tipo 1
CA3138414A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 Qilu Pharmaceutical Co., Ltd. Antibodyagainst claudin 18a2 and use thereof
US20220241332A1 (en) * 2019-05-29 2022-08-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Therapeutic b-cells engineered to express bispecific t cell engager antibodies
JP7266117B2 (ja) * 2019-05-30 2023-04-27 山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司 クローディン１８．２を標的とする抗体又はキメラ抗原受容体
CN113950485A (zh) * 2019-07-10 2022-01-18 中外制药株式会社 密蛋白-6结合分子及其用途
PE20211147A1 (es) * 2019-08-12 2021-06-28 I Mab Biopharma Us Ltd Anticuerpos anti-claudina 18.2 y anti-4-1bb biespecificos y su uso
CA3149406A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Xueming Qian Novel anti-cldn18.2 antibodies
CN112574307B (zh) * 2019-09-29 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Claudin18.2抗体及其应用
WO2021111003A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 SOTIO a.s. Humanized cldn18.2 antibodies
AU2020410998A1 (en) 2019-12-23 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Tumor-specific Claudin 18.2 antibodies
CN111087465B (zh) * 2019-12-24 2020-12-08 广州医科大学 一种针对密蛋白6的抗体偶联药物及应用
CN111234033B (zh) * 2020-01-21 2021-05-11 南京北恒生物科技有限公司 多链嵌合抗原受体及其用途
WO2021173307A1 (en) * 2020-02-25 2021-09-02 Gensun Biopharma Inc. Trispecific t cell engagers
SG11202104264TA (en) 2020-03-31 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Claudin-6 targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
CN111518209B (zh) * 2020-05-09 2023-07-25 郑州航空港百桥生物科技有限公司 特异性结合人ox40的单克隆抗体及其应用
WO2021237717A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 武汉友芝友生物制药有限公司 抗cldn18.2和cd3的双特异性抗体
CA3182445A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Francisco Leon Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
JP2023542257A (ja) 2020-09-16 2023-10-05 アムジェン インコーポレイテッド 癌の治療のために二重特異性ｔ細胞誘導分子の治療用量を投与する方法
KR20230079165A (ko) * 2020-09-29 2023-06-05 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 항-클라우딘18.2 및 cd3 이특이적 항체 및 이의 용도
WO2022100613A1 (zh) 2020-11-10 2022-05-19 上海齐鲁制药研究中心有限公司 针对密蛋白18a2和cd3的双特异性抗体及其应用
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
CA3199830A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Lukas BAMMERT Tumor-specific claudin 18.2 antibody-drug conjugates
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
US20240247062A1 (en) 2021-06-15 2024-07-25 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind claudin18.2 and cd3
MX2024000678A (es) * 2021-07-15 2024-02-07 BioNTech SE Agentes que codifican elementos de union a cldn6 y cd3 para el tratamiento de canceres positivos para cldn6.
JP2024531944A (ja) * 2021-08-09 2024-09-03 ハーバー バイオメッド（シャンハイ）カンパニー リミテッド Ｃｌｄｎ１８．２標的化抗体、二重特異性抗体、及びそれらの使用
JP7470760B2 (ja) * 2021-09-29 2024-04-18 中外製薬株式会社 がんの治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
WO2023053282A1 (ja) * 2021-09-29 2023-04-06 中外製薬株式会社 がんの治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
EP4448581A2 (en) * 2021-12-13 2024-10-23 Biolegend, Inc. Cd28 binding antibodies and antigen binding fragments thereof
CN115819586B (zh) * 2022-10-13 2023-10-31 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
WO1991009974A1 (en) 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
FR2697752B1 (fr) 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5589579A (en) 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
JP2001501447A (ja) 1996-01-11 2001-02-06 コリクサ コーポレイション 乳癌の処置および診断のための組成物および方法
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
WO2000012708A2 (en) 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
US20030166109A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7160985B2 (en) 1997-10-29 2007-01-09 Genentech, Inc. Pro180 polypeptide
US6852318B1 (en) 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
WO1999064452A1 (en) 1998-06-11 1999-12-16 Smithkline Beecham Corporation Gpr35a receptor
EP1104486A4 (en) 1998-08-04 2002-07-17 Diadexus Llc NEW METHOD FOR DIAGNOSIS, FOLLOW-UP, AND IMAGE OF LUNG CANCER
EP1144629A3 (en) 1998-09-01 2001-11-28 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
CA2343001A1 (en) 1998-09-16 2000-03-23 Zymogenetics, Inc. Stomach polypeptide zsig28
JP2004500011A (ja) 1998-10-06 2004-01-08 キュラゲン　コーポレイション 新規な分泌タンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチド
AU1450900A (en) 1998-10-21 2000-05-08 Arch Development Corporation Methods of treatment of type 2 diabetes
US20030009013A1 (en) 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2004507202A (ja) 1999-03-31 2004-03-11 キュラジェン　コーポレイション ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸；「ｏｒｆｘ」
AU2883700A (en) 1999-06-23 2001-01-09 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP3951035B2 (ja) 1999-09-01 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
US7442776B2 (en) 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies
AU1205901A (en) 1999-10-14 2001-04-23 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, The Tumor antigen derived gene-16 (tadg-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
EP1251863A4 (en) 2000-01-31 2005-03-02 Human Genome Sciences Inc 22 SEPARATE HUMAN PROTEINS
CA2392757A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1259526A2 (en) 2000-01-31 2002-11-27 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1261711A2 (en) 2000-02-22 2002-12-04 Corixa Corporation Compositions and methods for diagnosis and therapy of malignant mesothelioma
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001070979A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001090357A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Genesis Research & Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
ATE363531T1 (de) 2000-08-15 2007-06-15 Immunex Corp Claudin polypeptide
WO2002014500A2 (en) 2000-08-16 2002-02-21 Chiron Corporation Human genes and gene expression products
US20030017468A1 (en) 2000-08-28 2003-01-23 Sei-Yu Chen Compositions and methods relating to lung specific genes
JP2004509617A (ja) 2000-09-08 2004-04-02 シェーリング　コーポレイション 哺乳動物遺伝子；関連試薬および方法
WO2002022684A2 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Incyte Genomics, Inc. Transporters and ion channels
WO2002022885A1 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Thomas Jefferson University Compositions and methods for identifying and targeting stomach and esophageal cancer cells
JP2004520821A (ja) 2000-10-26 2004-07-15 ディアデクサス インコーポレーテッド 肺特異的遺伝子およびタンパク質に関する組成物および方法
AU2002220265A1 (en) 2000-11-03 2002-05-15 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2004526441A (ja) 2001-02-26 2004-09-02 アリーナ・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド 内因性および非内因性型ヒトｇタンパク質共役受容体
WO2002074237A2 (en) 2001-03-19 2002-09-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer
US20030152939A1 (en) 2001-04-09 2003-08-14 Glennda Smithson Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
JP2003000249A (ja) 2001-05-10 2003-01-07 Daiichi Fine Chemical Co Ltd クローディンによるＭＴ−ＭＭＰｓを介したｐｒｏＭＭＰ−２活性化
AU2002330714A1 (en) 2001-05-30 2003-01-02 Biomedical Center In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
SI1448544T1 (sl) 2001-11-19 2007-10-31 Lilly Co Eli Substituirani benzopirani kot selektivni agonistiestrogenskega receptorja beta
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2004029629A1 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Janssen Pharmaceutica N.V. N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
RU2349340C2 (ru) 2002-10-10 2009-03-20 Мерк Патент Гмбх Биспецифические антитела к erb-b и их применение для лечения опухолей
PL218660B1 (pl) * 2002-10-17 2015-01-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
ES2897506T3 (es) 2003-01-09 2022-03-01 Macrogenics Inc Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de utilización de los mismos
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
US7393531B2 (en) 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
US7919089B2 (en) 2003-05-31 2011-04-05 Micromet Ag Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for EpCAM
EP1629012B1 (en) * 2003-05-31 2018-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
AU2004283850C1 (en) 2003-10-16 2011-11-03 Amgen Research (Munich) Gmbh Multispecific deimmunized CD3-binders
BRPI0509411A (pt) 2004-04-16 2007-09-04 Emisphere Tech Inc método para tratar doença maligna, hipercalcemia de malignidade e metástases ósseas osteolìticas, sal de mesilato, composição e método de administração de agente ativo e bisfosfonato
US20050255041A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007027867A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways
JP5384827B2 (ja) 2005-09-08 2014-01-08 株式会社メディネット 抗原提示細胞の活性化処理方法
WO2007035676A2 (en) 2005-09-19 2007-03-29 Veridex., Llc Methods and materials for identifying the origin of a carcinoma of unknown primary origin
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
WO2007071426A1 (en) 2005-12-21 2007-06-28 Micromet Ag Pharmaceutical compositions with resistance to soluble cea
EP1981539B1 (en) 2006-02-09 2014-07-23 Amgen Research (Munich) GmbH Treatment of metastatic breast cancer
TWI388568B (zh) 2006-02-10 2013-03-11 Genentech Inc 抗ｆｇｆ１９抗體及其使用方法
CA2647107A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Anti-tumor cell antigen antibody therapeutics
WO2008013948A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Cell Signaling Technology, Inc. Tyrosine phosphorylation sites
MX2009008307A (es) 2007-02-01 2009-08-25 Veridex Llc Metodos y materiales para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.
US20090004213A1 (en) 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
EP1983002A3 (en) 2007-04-19 2009-03-11 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
WO2008152822A1 (ja) 2007-06-15 2008-12-18 Medinet Co., Ltd. 医薬
WO2009008992A2 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Osi Pharmaceuticals Inc. Combination anti-cancer therapy comprising an inhibitor of both mtorc1 and mt0rc2
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
CN101932333A (zh) * 2007-12-26 2010-12-29 瓦西尼斯公司 抗c35抗体联合疗法和方法
RU2509085C2 (ru) 2008-01-28 2014-03-10 Медиммун Лимитед Стабилизированные антитела против ангиопоэтина-2 и их применение
WO2009155609A1 (en) 2008-06-20 2009-12-23 Oklahoma Medical Research Foundation IMMUNOGENIC MEMAPSIN 2 β-SECRETASE PEPTIDES AND METHODS OF USE
AU2009273540A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Merck Patent Gmbh Method of determination of receptor binding saturation effected by monoclonal antibodies
PL2344539T3 (pl) * 2008-11-07 2015-07-31 Amgen Res Munich Gmbh Leczenie pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej
US20110286916A1 (en) 2008-11-20 2011-11-24 Jose Miguel Aste-Amezaga Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use
CN101584860A (zh) 2009-04-27 2009-11-25 西安杰诺瓦生物科技有限公司 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
WO2010141093A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
NZ734307A (en) 2009-11-11 2020-05-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies specific for claudin 6 (cldn6)
WO2011090005A1 (ja) 2010-01-19 2011-07-28 協和発酵キリン株式会社 大腸癌の治療用医薬および治療方法
AU2011229518B2 (en) 2010-03-16 2015-09-24 Biontech Protein Therapeutics Gmbh Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
EP2655415A4 (en) * 2010-12-22 2016-03-09 Abbvie Inc THREE VARIABLE DOMAIN LINK PROTEINS AND USES THEREOF
WO2012146394A1 (en) * 2011-04-28 2012-11-01 Amgen Research (Munich) Gmbh Dosage regimen for administering a cd19xcd3 bispecific antibody to patients at risk for potential adverse effects
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
US10093736B2 (en) 2012-11-13 2018-10-09 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
TWI501279B (zh) 2014-10-24 2015-09-21 Primax Electronics Ltd 鍵盤
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019100107A (ru) 2019-02-25
KR102643443B1 (ko) 2024-03-06
UA117741C2 (uk) 2018-09-25
CN110144012A (zh) 2019-08-20
ZA201502737B (en) 2017-09-27
US20160272711A1 (en) 2016-09-22
MX2020011716A (es) 2021-01-08
AU2013347184A1 (en) 2015-05-21
MX2019012846A (es) 2019-11-28
NZ746691A (en) 2020-08-28
BR112015010740B1 (pt) 2024-01-30
CA2890438A1 (en) 2014-05-22
JP6499079B2 (ja) 2019-04-10
KR102240664B1 (ko) 2021-04-15
NZ707831A (en) 2018-11-30
AU2013347184A8 (en) 2015-05-28
AU2018211278A1 (en) 2018-08-23
RU2678127C2 (ru) 2019-01-23
JP2021040641A (ja) 2021-03-18
CN105073776B (zh) 2019-04-12
AU2013347184B2 (en) 2018-06-14
CN105073776A (zh) 2015-11-18
JP2019162104A (ja) 2019-09-26
MX2020011710A (es) 2021-01-08
CA2890438C (en) 2022-10-18
HK1209434A1 (en) 2016-04-01
US10717780B2 (en) 2020-07-21
WO2014075788A1 (en) 2014-05-22
KR102381936B1 (ko) 2022-04-01
US10093736B2 (en) 2018-10-09
BR112015010740A2 (pt) 2017-08-22
US20200399370A1 (en) 2020-12-24
SG11201503593UA (en) 2015-06-29
KR20220045063A (ko) 2022-04-12
RU2015122484A (ru) 2017-01-10
US20240228616A1 (en) 2024-07-11
MX2015006003A (es) 2015-12-09
JP2016500059A (ja) 2016-01-07
JP6799101B2 (ja) 2020-12-09
IL238464A0 (en) 2015-06-30
CA3169263A1 (en) 2014-05-22
US20190055311A1 (en) 2019-02-21
KR20210043008A (ko) 2021-04-20
IL282953A (en) 2021-06-30
MX369276B (es) 2019-11-04
KR20150125642A (ko) 2015-11-09
JP2023022247A (ja) 2023-02-14
IL238464B (en) 2021-05-31
AU2018211278B2 (en) 2019-03-28
KR20240033145A (ko) 2024-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128182C2 (uk) Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань
JP7436552B2 (ja) クローディン発現がん疾患の処置のためのクローディン６又はクローディン１８．２とｃｄ３とに結合する二重特異的三価抗体
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
WO2015014376A1 (en) Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
UA111612C2 (uk) Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці
JP2022516770A (ja) 前立腺ネオ抗原及びその使用
EP2920209B1 (en) Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
KR20220141849A (ko) 다발성 골수종에서 발현된 신생항원 및 이의 용도
TWI852977B (zh) 前列腺新抗原及其用途
RU2798990C2 (ru) Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний