PT2268142T - Utilização de oligómeros alginados no combate aos biofilmes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE OLIGÓMEROS ALGINADOS NO COMBATE AOS BIOFILMES" A presente invenção refere-se ao combate de biofilmes. Em particular a presente invenção refere-se à utilização de uma classe particular de oligómeros de alginato possuindo pelo menos 70% resíduos gulurunato (G) , para combater biofilmes, incluindo ambas as superfícies bióticas e abióticas. Deste modo, são proporcionadas as utilizações médicas e não médicas e métodos, para combater infeção por biofilme ou para combater formação de biofilme em superfícies inanimadas e. g. para desinfeção e propósitos de limpeza. A invenção é baseada na descoberta surpreendente de que certos oligómeros de alginato i. e os que possuem pelo menos 70% resíduos G, são capazes de interagir com e interferir com o biofilme.

Em termos gerais um biofilme é uma coleção, ou comunidade, de microrganismos rodeados por uma matriz de polímeros extracelulares (também conhecida na técnica como um glicocálice). Estes polímeros extracelulares são tipicamente polissacáridos, nomeadamente polissacáridos produzidos pelos próprios organismos, mas estes podem conter outros biopolímeros também. Um biofilme seria tipicamente ligado a uma superfície, que pode ser inerte ou viva, mas tem sido também observado que os biofilmes se podem formar a partir dos microrganismos ligados uns aos outros ou em qualquer interface. Geralmente, deste modo, um biofilme é caracterizado como uma comunidade multicelular altamente organizada de microrganismos enclausurados, ou rodeados por, uma matriz do polímero extracelular, geralmente uma matriz de polissacárido, e geralmente em associação próxima com uma superfície ou interface. Este modo de crescimento é protetor para os microrganismos, e torna-os de difícil remoção ou erradicação (por exemplo, como discutido a seguir, recalcitrante ou resistente a agentes antimicrobianos ou defesa do hospedeiro ou mecanismos de eliminação). Crê-se que, de acordo com a presente invenção, esses oligómeros de alginato podem interagir com a matriz do polímero do biofilme e deste modo enfraquece o biofilme. Como discutido a seguir, os biofilmes causam problemas significativos comerciais, industriais e médicos, em termos de infeções. A contaminação, incrustação e deterioração etc., e deste modo a presente invenção proporciona uma vantagem significativa permitindo ou facilitando o combate a estes biofilmes, e tornando-os mais susceptíveis à remoção ou redução, e. g. mais susceptíveis ao efeito de agentes antimicrobianos (incluindo desinfetantes ou antibióticos) ou de facto no caso de uma infeção, à resposta imunitária do hospedeiro infetado. A eficácia de agentes antimicrobianos, terapêutico e não terapêutico e incluindo particularmente antibióticos, pode deste modo ser melhorada.

Os biofilmes são encontrados ubiquamente numa ampla variedade de superfícies ou interfaces (e. g. interfaces água/sólido e água/gás (por exemplo água/ar)) se as condições que conduzem a colonização microbiana existirem. Basicamente, formar-se-á um biofilme sempre que existirem microrganismos e um interface ou superfície, particularmente uma superfície exposta a água ou humidade e os biofilmes são agora reconhecidos como o estado natural do crescimento microbiano nestas superfícies ou interfaces. Em termos básicos, como notado acima, um biofilme é o arranjo complexo e organizado de colónias microbianas numa superfície, ou numa interface, que podem ocorrer particularmente na presença de água ou humidade. A organização destas colónias resulta da capacidade dos microrganismos produzirem uma matriz celular organizada em que as células são "embutidas". Esta matriz é formada por biopolímeros produzidos pelos microrganismos sendo os polissacáridos tipicamente o polímero predominante.

Os microrganismos numa comunidade em biofilme apresentam propriedades ao nível celular (fenótipo) que não são partilhados pelos seus equivalentes planctónicos (sem flutuantes). De facto, crê-se que os microrganismos num biofilme são profundamente diferentes de células planctónicas não flutuantes. Outras diferenças podem ser também observadas ao nível da comunidade e são atribuídas aos efeitos da matriz extracelular. Talvez o mais notável é o fenómeno normalmente observado de que os microrganismos num ambiente de biofilme não apresentam as mesmas suscetibilidades aos agentes antimicrobianos, e. g. antibióticos, antifúngicos e microbicidas, e defesas imunitárias do hospedeiro ou mecanismos de eliminação. Pensa-se que esta resistência é devida ao efeito barreira da matriz extracelular e/ou uma alteração fenotípica nos próprios micróbios. Por exemplo, uma vez que se formem os biofilmes, os anticorpos não ligam mais aos microrganismos (e. g. bactérias) no biofilme. As experiências mostraram os anticorpos densamente incrustados no lado de fora do biofilme, mas não no próprio biofilme. Os estudos da actividade de glóbulos brancos do sangue contra biofilmes demonstraram observações semelhantes. A produção de toxinas pode também ser diferente entre um micróbio planctónico e o seu equivalente residente numa colónia de biofilme sugerindo alterações fenotípicas nos micróbios. Crê-se também que os microrganismos em biofilmes podem crescer mais lentamente, e como resultado incorporar agentes antimicrobianos mais lentamente.

Os biofilmes formam-se rapidamente em superficies ambientais aquáticas e uma colónia microbiana estabelecida em qualquer superfície exposta a água (qualquer superfície "molhada") existirá quase de certeza como uma estrutura de biofilme. Além disso está agora a tornar-se evidente e crescentemente documentado que os biofilmes podem também formar-se em casos de infeções microbianas i. e. no ou num hospedeiro infetado. Deste modo a formação de biofilme pode também ocorrer numa superfície "fisiológica" ou "biológica", que está numa superfície animada ou biótica, ou numa superfície ou num organismo hospedeiro infetado (e. g. um indivíduo animal humano ou não humano), por exemplo numa superfície do corpo ou tecido interno ou externo. Crê-se cada vez mais que esta formação de biofilme (ou infeção) em tecidos corporais contribui para várias doenças infecciosas, incluindo por exemplo endocardite da válvula nativa (válvulas cardíacas mitral, aórtica, tricúspide, pulmonar), otite média aguda (ouvido médio), prostatite bacteriana crónica (próstata), fibrose cística (pulmões), pneumonia (trato respiratório), periodontite (tecidos que suportam o dente, e. g. gengiva, ligamento periodontal, osso alveolar). Obviamente, ambos estes nichos de biofilme estão presentes quando os dispositivos médicos são implantados e a formação de biofilme nestes dispositivos implantados ("no interior") pode levar a problemas clínicos com infeção nestes sítios, tais como endocardite de válvula prostética e infeção relacionada com dispositivo, por exemplo com dispositivos intra-uterinos, lentes de contacto, próteses (e. g. articulações prostéticas) e em sítios de cateterização, por exemplo com cateteres centrais venosos ou urinários.

Um problema significativo e risco com esta infeção por biofilmes é que os microrganismos (ou mais particularmente microcolónias) podem partir ou destacar-se do biofilme, e entrar noutros tecidos, incluindo significativamente a circulação. Estes microrganismos derivados de biofilme circulante podem causar outras infeções e levam a significativos problemas clínicos, particularmente com os microrganismos destacados circulantes podem ter todos as características de resistência da comunidade parental.

Uma infeção por biofilme desenvolve-se tipicamente gradualmente e pode ser lenta para produzir sintomas evidentes. Uma vez estabelecidos, no entanto, os biofilmes são como notado acima difíceis de eliminar e uma infeção por biofilme será tipicamente persistente, e raramente resolvida por mecanismo de defesa ou imunitários do hospedeiro, mesmo em indivíduos com respostas imunitárias saudáveis inatas e adaptativas. As respostas ativas do hospedeiro podem ser efetivamente prejudiciais, por exemplo imunidade mediada por células (e. g. neutrófilos invasores) podem causar danos colaterais ao tecido vizinho saudável do hospedeiro. As infeções por biofilme respondem apenas transientemente a terapia com antibiótico. Deste modo, enquanto as células planctónicas microbianas podem ser eliminadas por anticorpos ou fagócitos, e são suscetíveis a anti-microbianos, os microrganismos em biofilmes tendem a ser resistentes a anticorpos, fagócitos e anti-microbianos. Os fagócitos são atraídos para o biofilme, mas a fagocitose é frustrada. As enzimas fagocíticas são no entanto libertados e podem danificar tecido à volta do biofilme. As bactérias planctónicas podem ser libertadas a partir do biofilme e esta libertação pode causar a disseminação e infeção aguda no tecido na vizinhança.

As superficies do corpo ou tecido que estão mortos ou danificados (e. g. necróticos ou inflamados) são particularmente susceptíveis a infeção por biofilme. As feridas são susceptíveis a infeção e a formação de biofilme pode ocorrer em feridas que não saram numa num curto período de tempo. As feridas são um ambiente ideal para a formação de biofilmes devido à sua suscetibilidade a colonização bacteriana e a disponibilidade do substrato e a superfície pra a ligação ao biofilme. Problematicamente, a infeção de uma ferida retarda frequentemente a cicatrização e deste modo torna essa ferida mais suscetível à formação de biofilme e estabelecimento de infeção. As feridas em que a cicatrização é atrasada (as denominadas feridas crónicas) representam sítios de preocupação particular no que respeita a formação de biofilme. Uma ferida crónica é um estado inflamatório, com níveis elevados de citoquinas proinflamatórias. 0 efeito destas citoquinas é produzir um enriquecimento da área com células imunitárias (neutrófilos e macrófagos). Se este sistema de defesa é de qualquer forma atrasado (como nas feridas crónicas), as bactérias ou outros microrganismos têm tempo para se ligar à superfície e entrar o modo de crescimento do biofilme. Tem sido crescente a evidência de que as feridas crónicas e agudas podem ser sítios de infeção por biofilme, com a evidência de diversas comunidades microbianas ou populações em feridas, particularmente feridas crónicas, incluindo bactérias anaeróbicas em feridas crónicas. As infeções em feridas crónicas partilham dois importantes atributos com outras infecções por biofilmes: infeção persistente que não é eliminada pelo sistema imunitário do hospedeiro mesmo em indivíduos com reacções imunitárias saudáveis inatas e adaptativas, e resistência aumentada a agentes antimicrobianos sistémicos e tópicos. De acordo com o exposto, a infecção com base em biofilme é muito difícil de tratar e a contaminação por biofilme é muito difícil de erradicar. As desbridação frequente é um dos tratamentos mais clinicamente eficaz para ajudar a cicatrizar feridas crónicas. Este é um tratamento eficaz, em parte, porque remove fisicamente o biofilme da ferida. Isto é semelhante, em princípio, para resolver infeções a partir de dispositivos médicos colonizados por biofilme (e. g. cateteres)- em que a terapia por antibiótico é ineficaz a abordagem mais eficaz é remover ou substituir o dispositivo infectado por biofilme.

As feridas crónicas são um problema de saúde importante em todo o mundo e representa uma utilização significativa de recursos clínicos. Três tipos principais de ferida crónica são úlceras de pé de diabéticos, úlceras de perna venosa e úlceras de pressão, embora outras feridas, incluindo feridas cirúrgicas, podem tornar-se crónicas. 0 cuidado com esta ferida impõe enormes custos em materiais e para o doente, e deste modo um tratamento antibiofilme eficaz, ou efetivamente qualquer tratamento que auxilie ou facilite o tratamento de biofilmes, e assim acelere ou facilite a cicatrização de feridas, terá um impacto muito significativo.

Mais geralmente, dada a ampla ocorrência de biofilmes e os problemas médicos, ambientais, industriais ou outros comerciais que causam, quaisquer meios de melhorar ou permitir o combate de biofilmes seriam muito importantes, clinicamente e comercialmente.

Existe deste modo a necessidade de novos métodos de combater biofilmes, em situações clinicas e industriais ou comerciais, e a presente invenção é dirigida para responder a esta necessidade.

Hu, X.; et al., 2005, Journal of Applied Phycology, Vol 17(1), 57-60 descreve a atividade antibacteriana de produtos de alginate despolimerizado por liase.

Kitamikado, M., et al., 1993, Nippon Suisan Gakkaishi, Vol 59 (2), 315-320 descreve a ação bacteriostática de oligossacáridos preparados a partir de alginato por degradação enzimática. A EP 0506326 descreve a utilização de beta 1-4 poliuronatos ligados diequitorialmente para a estimulação de citoquina e subsequentes efeitos antibacteriológicos.

Moskowitz, S. M., 2004, Journal of Clinical Microbiology vol 42(5), 1915-1922 descreve um ensaio de suscetibilidade a biofilme clinicamente realizável para isolados de Pseudomanas aeriginosa de doentes com fibrose cística.

Em particular, e como notado acima, verificou-se que uma classe particular de alginatos, nomeadamente oligómeros de alginato possuindo pelo menos 70% de resíduos G, são eficazes como agentes antibiofilme. Estes oligómeros de alginato podem interagir com os polímeros extracelulares do biofilme, e deste modo enfraquecê-los, permitindo ou facilitando a sua remoção ou clivagem (ou disrupção), e/ou facilitando o acesso de agentes antimicrobianos ao biofilme, permitindo deste modo a sua eficácia contra o biofilme. Consequentemente, de acordo com a presente invenção é proposto um novo método ou meio para combater o biofilme envolvendo a utilização destes oligómeros de alginato.

No que se segue, as referências a "um oligómero de alginato" ou "oligómeros de alginato" no contexto da invenção são referências a oligómeros de alginato possuindo pelo menos 70% de resíduos G, a menos que especificamente explicitado de outra forma.

Os alginatos são polímeros lineares de ácido β-D-manurónico ligado em (1-4) (M) e/ou o seu epímero C-5 ácido α-L-gulurónico (G) . Os alginatos de estrutura primária podem variar amplamente. Os resíduos M e G podem ser organizados como blocos de homopolímeros de resíduos contíguos M ou G, como blocos de resíduos M e G alternantes e resíduos M ou G únicos podem ser encontrados interespaçados por estas estruturas em bloco. Uma molécula de alginato pode compreender algumas ou todas estas estruturas e estas estruturas podem não ser uniformemente distribuídas ao longo do polímero. No extremo, existe um homopolímero de ácido gulurónico (poliguluronato) ou um homopolímero de ácido manurónico (polimanuronato).

Os alginatos foram isolados a partir de algas castanhas marinhas (e. g. certas espécies de Durvillea, Lessonia e Laminaria) e bactérias tais como Pseudomonas aeruginosa e Azotobacter vinelandii. Outras pseudomonas (e. g. Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, e Pseudomonas mendocina) retêm na capacidade genética para produzir alginatos mas no selvagem não produzem níveis detetáveis de alginato. Por mutação estas pseudomonas não produtoras podem ser induzidas para produzir estavelmente grandes quantidades de alginato. 0 alginato é sintetizado como polimanuronato e os resíduos G são formados pela acção de epimerases (especificamente epimerases C-5) nos resíduos M no polímero. No caso de alginatos extraídos a partir de algas, os resíduos G são predominantemente organizados como blocos G porque as enzimas envolvidas na biossíntese de alginato em algas introduzem preferencialmente o G na vizinhança de outro G, convertendo deste modo as tiras de resíduos M nos blocos G. A elucidação destes sistemas biossintéticos permitiu a produção de alginatos com estruturas primárias específicas (WO 94/09124, Gimmestad, M et al, Journal of Bacteriology, 2003, Vol 185(12) 3515-3523 e WO 2004/011628).

Os alginatos são tipicamente isolados a partir de origens naturais como polímeros de elevado peso molecular (e. g. um peso molecular médio no intervalo de 300 000 a 500 000 Daltons. É conhecido, no entanto, que estes grandes polímeros de alginato pode ser degradado, ou clivado, e. g. por hidrólise química ou enzimática para produzir estruturas de alginato de baixo peso molecular. Os alginatos que são utilizados industrialmente tipicamente têm um peso molecular médio no intervalo de 100 000 a 300 000 Daltons (i. e. estes alginatos são ainda considerados como sendo grandes polímeros) embora os alginatos com um peso molecular médio de aproximadamente 35 000 Daltons foram utilizados em fármacos.

Verificou-se agora que os oligómeros de alginato possuindo pelo menos 70% de resíduos G têm a capacidade de interferir com a matriz extracelular de biofilmes. Sem desejar estar ligado por qualquer particular teoria, crê-se que esta interferência cause a degradação da matriz extracelular do biofilme e isso leva assim à rutura física do biofilme. A degradação também aumenta a exposição dos microrganismos no filme (ou seus componentes imunogénicos, e. g. estruturas LPS e peptidoglicano) às defesas imunitárias de um hospedeiro infetado e/ou quaisquer agentes antimicrobianos que foram, ou vão ser aplicados. A degradação também reduz a intimidade da reção entre a matriz extracelular e os microrganismos e isto leva a um aumento na sensibilidade do microrganismo a agentes antimicrobianos ao nível fenotípico. A invenção proporciona deste modo um método para combater o biofilme que não está dentro de ou no corpo de um animal humano ou não humano, compreendendo o referido método o contacto do referido biofilme com um oligómero de alginato, em que o oligómero de alginato possui pelo menos 70% de resíduos G. A invenção proporciona ainda um oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme num indivíduo, em que o oligómero de alginato possui pelo menos 70% de resíduos G. A invenção proporciona ainda a utilização de um oligómero de alginato na preparação de um medicamento para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme num indivíduo em que o oligómero de alginato possui pelo menos 70% de resíduos G.

Como notado acima, os alginatos ocorrem tipicamente como polímeros com um peso molecular médio de pelo menos 35 000 Daltons i. e. aproximadamente 175 a 190 resíduos monómeros, embora tipicamente bastante maiores e um oligómero de alginato de acordo com a presente invenção pode ser definida como um material obtido por fraccionamento (i. e. redução de tamanho) de um polímero de alginato, normalmente um alginato que ocorre naturalmente. Um oligómero de alginato podem ser considerado como sendo um alginato de um peso molecular médio inferior a 35 000 Daltons (i. e. inferior a aproximadamente 190 ou inferior a 175 resíduos monómeros), em particular um alginato com um peso molecular médio inferior a 30 000 Daltons (i. e. inferior a aproximadamente 175 ou inferior a 150 resíduos monómeros) mais particularmente um peso molecular médio inferior a 25 000 ou 20 000 Daltons (i. e. inferior a aproximadamente 135 ou 125 resíduos monómeros ou inferior a aproximadamente 110 ou 100 resíduos monómeros).

Visto alternativamente, um oligómero geralmente compreende 2 ou mais unidades ou resíduos e um oligómero de alginato para utilização de acordo com a invenção irá tipicamente conter 2 a 100 resíduos monómeros, preferencialmente 2 a 75, preferencialmente 2 a 50, mais preferencialmente 2 a 40, 2 a 35 ou 2 a 30, i. e. um oligómero de alginato para utilização de acordo com a invenção terá tipicamente um peso molecular médio de 350 a 20 000 Daltons, preferencialmente 350 a 15 000 Daltons, preferencialmente 350 a 10 000 Daltons e mais preferencialmente 350 a 8000 Daltons, 350 a 7000 Daltons, ou 350 a 6 000 Daltons.

Alternativamente, o oligómero de alginato pode ter um grau de polimerização (DP), ou um número médio de grau de polimerização (DPn) de 2 a 100, preferencialmente 2 a 75, preferencialmente 2 a 50, mais preferencialmente 2 a 40, 2 a 35 ou 2 a 30.

Como notado acima, os biofilmes tipicamente formam-se nas superfícies ou interfaces e o biofilme que é tratado de acordo com a presente invenção pode estar em qualquer superfície ou interface. Consequentemente, o biofilme alvo pode estar em qualquer superfície animada ou inanimada (ou biótico ou abiótico) , i.e. qualquer superfície viva, ou superfície derivada de material vivo (e. g. tecido morto ou danificado e. g. tecido necrótico) (o termo "animado" é aqui utilizado para incluir qualquer superfície viva ou qualquer superfície derivada de material vivo, em particular uma superfície viva que morreu), ou qualquer superfície inerte ou não viva (uma superfície que não estava previamente viva ou animada). O termo "em contacto" inclui qualquer meio de distribuir o oligómero de alginato no biofilme, diretamente ou indiretamente, e assim qualquer meio de aplicar o oligómero de alginato ao biofilme ou expor o biofilme ao oligómero de alginato e. g. aplicando o oligómero de alginato diretamente no biofilme, ou administrando o oligómero de alginato a um indivíduo com uma infeção por biofilme. Será entendido deste modo que os métodos in vitro e in vivo são incluídos.

Mais particularmente o biofilme estará em contacto com uma quantidade eficaz do oligómero de alginato, mais particularmente uma quantidade do oligómero de alginato eficaz para combater o biofilme.

Um oligómero de alginato irá conter, como notado acima, (ou compreender) resíduos ou unidades ácido guluronato ou gulurónico (G) e/ou ácido manuronato ou manurónico (M) . Um oligómero de alginato de acordo com a invenção será preferencialmente composto unicamente, ou substancialmente unicamente (i. e. consiste essencialmente em) resíduos de uronato/ácido urónico, mais particularmente unicamente ou substancialmente unicamente de resíduos G e/ou M. Alternativamente expresso, no oligómero de alginato utilizado na presente invenção, pelo menos 80%, mais particularmente pelo menos 85, 90, 95 ou 99% dos resíduos monómeros podem ser resíduos de uronato/ácido urónico, ou, mais particularmente os resíduos G e/ou M. Por outras palavras, preferencialmente o oligómero de alginato não incluirá outros resíduos ou unidades (e. g. outros resíduos de sacáridos, ou mais particularmente outros resíduos de ácido urónico/uronato). O oligómero de alginato é preferencialmente um oligómero linear.

Como já indicado, um oligómero de alginato para utilização de acordo com a presente invenção contém pelo menos 70% resíduos G (i. e. pelo menos 70% dos resíduos monómeros do oligómero de alginato serão os resíduos G). As específicas formas de realização inclui deste modo oligómeros de alginato com resíduos G (e. g. contendo) 70 a 100% (guluronato).

Preferencialmente pelo menos 75%, mesmo mais particularmente pelo menos 80, 85, 95 ou 99% dos resíduos monómeros são guluronato. Numa forma de realização, o oligómero de alginato pode ser um oligoguluronato (i. e. um homooligómero de G, ou 100% G).

Numa outra forma de realização preferida, os alginatos da invenção acima descritos têm uma estrutura primária em que a maioria dos resíduos G estão nos denominados blocos G. Preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70 ou 75%, e mais preferencialmente pelo menos 80, 85, 90 ou 95% dos resíduos G únicos estão nos blocos G. Um bloco G é uma sequência contígua de pelo menos dois resíduos G, preferencialmente pelo menos 3 resíduos contíguos G, mais preferencialmente pelo menos 4 ou 5 resíduos contíguos G, mais preferencialmente pelo menos 7 resíduos contíguos G.

Em particular pelo menos 90% dos resíduos G estão ligados por 1-4 a outro resíduo G. Mais particularmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, e mais preferencialmente pelo menos 99% dos resíduos G do alginato são ligados 1-4 a outro resíduo G. O oligómero de alginato utilizado na invenção é preferencialmente um 3- a 35-mero, mais preferencialmente um 3- a 28-mero, em particular um 4- a 25-mero, especialmente um 6- a 22-mero, em particular um 8- a 20-mero, especialmente um 10- a 15-mero, e. g. possuindo um peso molecular no intervalo de 350 a 6400 Daltons ou 350 a 6000 Daltons, preferencialmente 550 a 5500 Daltons, preferencialmente 750 a 5000 Daltons, e especialmente 750 a 4500 Daltons.

Pode ser um único composto ou pode ser uma mistura de compostos, e. g. de uma gama de graus de polimerização. Como notado acima, os resíduos monoméricos no oligómero de alginato, podem ser os mesmos ou diferentes e nem todos precisam de ser portadores de grupos eletricamente carregados embora seja preferido gue a maioria o seja (e. g. pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 80% mais preferencialmente pelo menos 90%) . É preferido gue uma maioria substancial, e. g. pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% dos grupos carregados tenham a mesma polaridade. No oligómero de alginato, a proporção de grupos hidroxilo para grupos carregados é preferencialmente pelo menos 2:1, mais especialmente pelo menos 3:1. O oligómero de alginato da invenção pode ter um grau de polimerização (DP) , ou um número médio de grau de polimerização (DPn) , de 3-28, 4-25, 6-22, 8-20 ou 10-15, ou 5 a 18 ou 7 a 15 ou 8 a 12, especialmente 10. A distribuição de peso molecular é preferencialmente um em gue não mais do gue 5% de moles tem um DP de dois superior ao limite superior relevante para DPn. Do mesmo modo é preferido gue não mais do gue 5% de moles tenha um DP abaixo de um número dois inferior ao limite inferior relevante para o DPn. Os oligómeros de alginato adeguados são descritos em W02007/039754, W02007/039760, e WO 2008/125828.

Os oligómeros de alginato representativos adeguados têm um DPn no intervalo 5 a 30, uma fracção de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,80, uma fração manuronato (Fm) não superior a 0,20, e pelo menos 95 mole% de DP não superior a 25.

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio de grau de polimerização no intervalo de 7 a 15 (preferencialmente 8 a 12), uma fração guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,85 (preferencialmente pelo menos 0,90), uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,15 (preferencialmente não superior a 0,10), e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização Inferior a 17 (preferencialmente inferior a 14) .

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio de grau de polimerização no intervalo 5 a 18 (especialmente 7 a 15) , uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,80 (preferencialmente pelo menos 0,85, especialmente pelo menos 0,92), uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,20 (preferencialmente não superior a 0,15, especialmente não superior a 0,08), e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 20 (preferencialmente inferior a 17) .

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio grau de polimerização no intervalo 5 a 18, uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,92, uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,08, e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 20.

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio grau de polimerização no intervalo 5 a 18 (preferencialmente 7 a 15, mais preferencialmente 8 a 12, especialmente cerca de 10), uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,80 (preferencialmente pelo menos 0,85, mais preferencialmente pelo menos 0,90, especialmente pelo menos 0,92, mais especialmente pelo menos 0,95), uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,20 (preferencialmente não superior a 0,15, mais preferencialmente não superior a 0,10, especialmente não superior a 0,08, mais especialmente não superior a 0,05), e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 20 (preferencialmente inferior a 17, mais preferencialmente inferior a 14).

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio grau de polimerização no intervalo 7 a 15 (preferencialmente 8 a 12), uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,92 (preferencialmente pelo menos 0,95), uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,08 (preferencialmente não superior a 0,05), e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 17 (preferencialmente inferior a 14) .

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio de grau de polimerização no intervalo 5 a 18, uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,80, uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,20, e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 20.

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio grau de polimerização no intervalo 7 a 15, uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,85, uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,15, e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 17.

Outros oligómeros de alginato adequados têm um número médio grau de polimerização no intervalo 7 a 15, uma fração de guluronato/galacturonato (Fg) de pelo menos 0,92, uma fração de manuronato (Fm) não superior a 0,08, e possuindo pelo menos 95% de moles com um grau de polimerização inferior a 17. O oligómero de alginato será tipicamente portador de uma carga e assim os contra-iões para o oligómero de alginato podem ser quaisquer iões fisiologicamente toleráveis, especialmente os normalmente utilizados para substâncias fármaco carregadas, e. g. sódio, potássio, amónio, cloreto, mesilato, meglumina, etc. Os iões que promovem a gelação de alginato e. g. iões metálicos do grupo 2 podem também ser utilizados.

Enquanto o oligómero de alginato pode ser um material sintético produzido a partir da polimerização de um número apropriado de resíduos de guluronato e manuronato, os oligómeros de alginato utilizados na invenção podem convenientemente ser obtidos, produzidos ou derivados, de fontes naturais tais como as mencionadas acima, nomeadamente materiais naturais fontes de alginato. A clivagem de polissacárido em oligossacárido para produzir o oligómero de alginato utilizável de acordo com a presente invenção pode ser efetuada utilizando técnicas convencionais de lise de polissacárido tais como digestão enzimática e hidrólise ácida. Os oligómeros podem então ser separadas cromatograficamente a partir dos produtos de clivagem de polissacárido utilizando uma resina de troca iões ou por precipitação fracionada ou solubilização ou filtração. Os documentos US 6 121 441 e WO 2008/125828, que estão explicitamente aqui incorporados por referência na sua totalidade, descreve um processo adequado para preparação dos oligómeros de alginato utilizados na invenção. Mais informação e discussão podem ser encontradas em por exemplo "Handbooks of Hydrocolloids", Ed. Phillips and Williams, CRC, Boca Raton, Flórida, USA, 2000.

Os oligómeros de alginato podem também ser quimicamente modificados, incluindo mas não se limitando a modificação para adicionar grupos carregados (tais como glicanos carboxilados ou carboximetilados) e oligómeros de alginato modificados para alterar a flexibilidade (e. g. por oxidação por periodato).

Os oligómeros de alginato (por exemplo oligoácidos gulurónicos) adequados para utilização de acordo com a invenção podem convenientemente ser produzidos por hidrólise ácida de ácido alginico a partir de, nas se limitando a, Laminaria hyperbora e Lessonia nigrescens, dissolução a pH neutral, adição de ácido mineral reduz o pH para 3,4 para precipitar o oligómero de alginato (ácido oligogulurónico), lavando com ácido fraco, ressuspensão a pH neutral e liofilização.

Os alginatos para a produção de oligómeros de alginato da invenção podem também ser obtidos diretamente a partir de fontes bacterianas adequados bacterianas e. g. Pseudomonas aeruginosa ou Azotobacter vinelandii, embora as se espere que as fontes de algas sejam mais adequadas contando com o facto de que os alginatos produzidos nestes organismos tendem a ter estruturas primárias em que a maioria dos resíduos G são arranjados em blocos G em vez de resíduos únicos. 0 dispositivo molecular envolvido na biossíntese do alginato em Pseudomonas fluorescens e Azotobacter vinelandii foi clonado e caracterizado (WO 94/09124; Ertesvâg, H., et al, Metabolic Engineering, 1999, Vol 1, 262-269; WO 2004/011628; Gimmestad, M., et al (supra); Remminghorst and Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol 28, 1701-1712; Gimmestad, M. et al, Journal of Bacteriology, 2006, Vol 188(15), 5551-5560) e alginatos de estruturas primárias à medida podem ser facilmente obtidas por manipulação destes sistemas. O conteúdo em G em alginatos (por exemplo um material fonte de alginato) pode ser aumentado por epimerisação, por exemplo com epimerases de manurano C-5 de A.vinelandii ou outras enzimas epimerase. Deste modo, por exemplo a epimerização in vitro pode ser realizada com epimerases isoladas de Pseudomonas ou Azotobacter, e. g. AlgG de Pseudomonas fluorescens ou Azotobacter vinelandii ou as enzimas AlgE (AlgEl a AlgE7) de Azotobacter vinelandii. A utilização de epimerases de outros organismos que têm a capacidade de produzir alginato, particularmente algas, é também especificamente contemplada. A epimerização in vitro de alginatos G inferiores com epimerases AlgE de Azotobacter vinelandii é descrita em detalhe em Ertesvâg et al (supra) e Strugala et al (Gums and Stabilisers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84 - 94) . A epimerização com uma ou mais epimerases AlgE de Azotobacter vinelandii para além da AlgE4 é preferida uma vez que estas enzimas são capazes de produzir estruturas com bloco G. As versões mutadas ou homólogas de outros organismos estão também especificamente contempladas como utilizáveis. 0 documento WO 94/09124 descreve enzimas epimerase de manuronano C-5 recombinantes ou modificadas (enzimas AlgE) por exemplo codificadas por seguências epimerase em gue as seguências de DNA gue codificam os diferentes domínios ou módulos das epimerases foram misturados ou removidos e recombinados. Alternativamente, os mutantes enzimas epimerase gue ocorrem naturalmente, (AlgG ou AlgE) podem ser utilizados, obtidos por exemplo por mutagénese dirigida ao sítio ou aleatória dos genes AlgG ou AlgE.

Uma diferente abordagem é a criação de organismos Pseudomonas e Azotobacter gue estão mutados em alguns ou todos os seus genes de epimerase de maneira a que esses mutantes produzem alginatos da estrutura necessária da produção do oligómero de alginato, ou mesmo oligómeros de alginato da estrutura e tamanho necessários (ou peso molecular). A produção de vários organismos Pseudomonas fluorescens com genes AlgG mutados é descrita em detalhe no documento WO 2004/011628 e Gimmestad, M., et al, 2003 (supra). A produção de vários organismos de Azotobacter vinelandii com genes AlgE mutados é revelada em Gimmestad, M., et al, 2006 (supra). O especialista pode ser capaz de utilizar esta aprendizagem para produzir novos mutantes que produzirão oligómeros de alginato da invenção sem trabalho adicional.

Uma outra abordagem é remover ou inativar os genes de epimerase endógenos de um organismo Azotobacter ou um organismo Pseudomonas e depois introduzir um ou mais genes de epimerase exógeno, que podem ou não podem ser mutados (i . e. pode ser do tipo selvagem ou modificado) e cuja expressão pode ser controlada, por exemplo por utilização de "promotores controláveis" indutiveis ou outros. Ao selecionar combinações apropriadas de genes, os alginatos de estrutura primária pré-determinada pode ser produzida.

Ainda uma outra abordagem será a introdução de alguma ou de toda a maquinaria de biossintese do alginato de Pseudomonas e/ou Azotobacter num organismo não produtor de alginato (e. g. E. coli) e para induzir a produção de alginato a partir destes organismos geneticamente modificadas.

Quando estes sistemas com base em cultura são utilizados, a estrutura primária do alginato ou oligómero de alginato pode ser influenciada pelas condições de cultura. Está bem dentro das capacidades do especialista ajustar os parâmetros de cultura tais como temperatura, osmolaridade, níveis de nutrientes/fontes e parâmetros atmosféricos de modo a manipular a estrutura primária dos alginatos produzidos por um organismo particular.

As referências aos "resíduos G/G" e "resíduos M/M" ou ao ácido gulurónico ou ácido manurónico, ou guluronato ou manuronato são para ser lidas independentemente como referências ao ácido gulurónico/guluronato e ácido manurónico/manuronato (especificamente a-L-ácido gulurónico/guluronato e ácido β-D-manurónico/manuronato), e incluir ainda derivados destes em que uma ou mais cadeias laterais disponíveis ou grupos foram modificados sem resultar em atividade anti-biofilme que é substancialmente inferior à do polímero não modificado. Grupos comuns modificadores de sacáridos incluirão grupos acetilo, sulfato, amino, desoxi, álcool, aldeído, cetona, éster e anidro. Os oligómeros de alginato podem também ser guimicamente modificados para adicionar grupos carregados (tais como glicanos carboxilados ou carboximetilados), e para alterar a flexibilidade (e. g. por oxidação de periodato). 0 especialista estará atento ainda a outras modificações químicas adicionais que podem ser feitas às subunidades de monossacárido de oligossacáridos e estes podem ser aplicados aos alginatos da invenção.

Por "biofilme" entende-se uma comunidade de microrganismos caracterizados por uma predominância de células sésseis que estão ligadas a um substrato ou interface ou uns aos outros, (algumas células móveis podem também estar presentes) e que são embutidas numa matriz de polímeros extracelulares (mais especificamente polímeros extracelulares que estes produziram) caracterizado por os microrganismos desta colónia exibirem um fenótipo alterado no que respeita à taxa de crescimento e transcrição do gene (por exemplo em comparação com as suas contra-partes "não biofilme" ou de flutuação livre ou planctónicas). 0 termo "combate ao biofilme" é aqui amplamente utilizado para incluir qualquer efeito na rutura, redução, ou clivagem de um biofilme (i. e. "atacar" um biofilme existente) ou tornando-o muito mais suscetível ao efeito de um agente antimicrobiano ou uma resposta imunitária do hospedeiro, assim como inibição, redução, ou retardamento da formação de um biofilme. Deste modo o "combate" inclui qualquer tratamento de um biofilme que tem um efeito negativo no biofilme. 0 "combate ao biofilme" inclui deste modo medidas reacionais ou tratamentos. 0 combate ao biofilme inclui deste modo a eliminação de um biofilme, uma redução no tamanho do biofilme, uma redução no número de micróbios numa colónia de biofilme, uma redução ou cessação na taxa de crescimento de um biofilme, uma redução na ou cessação da taxa de expansão do número de micróbios numa colónia de biofilme, uma redução na integridade física de um biofilme, um aumento na sensibilidade dos micróbios numa colónia de biofilme a um agente antimicrobiano ou mecanismos de imunitário de defesa do hospedeiro e um aumento na permeabilidade de um biofilme a um agente antimicrobiano ou mecanismo imunitário de defesa do hospedeiro.

Os oligómeros de alginato da invenção podem ser deste modo utilizados clinicamente, e. g. no tratamento de uma infeção por biofilme, ou pode ser utilizado na limpeza ou descontaminação de qualquer superfície, e. g. de uma superfície comercial ou industrial. 0 tamanho, estrutura, integridade, e número de microrganismos num biofilme podem ser analisados por qualquer método conveniente. Por exemplo, a microscopia electrónica de varrimento e transmissão é frequentemente utilizada para avaliar o tamanho, integridade e estrutura de um biofilme. A coloração histoquímica dos microrganismos e/ou os componentes da matriz extracelular é também rotina (e. g. corante BODIPY™ 630/650-X SE para os componentes da matriz de biofilmes de Pseudomonas e o corante Fm™ 1-43 para as membranas celulares de Pseudomonas) e podem ser utilizados para avaliar a quantidade de micróbios e a estrutura e integridade do biofilme visualmente ou com assistência de dispositivos de separação celular, microscópios confocais ou microscópios de epifluorescência. 0 ensaio MBEC, Moskowitz SM, et al (2004) J Clin Microbiol, 42: 1915-1922 e descrito em mais detalhe nos Exemplos pode ser utilizado para avaliar a sensibilidade dos microrganismos num biofilme a um agente antimicrobiano. Donlan e Costerton, 2002, Clin. Mic. Rev., Vol 15(2), 167-193 proporciona exemplos adicionais.

Os biofilmes que podem ser combatidos de acordo com a invenção não são limitados em termos dos microrganismos nos biofilmes como o oligómero de alginato da invenção, inter alia, dirige-se à matriz extracelular. Consequentemente, o biofilme pode compreender qualquer classe, género ou espécie de microrganismo, nomeadamente qualquer microrganismo que pode formar um biofilme. Estes microrganismos incluem tipicamente bactérias, incluindo qualquer género ou espécie de bactérias. Deste modo, as bactérias podem ser gram positivas ou gram negativas, ou não responsivas ao teste de gram. Estas podem ser aeróbicas ou anaeróbicas. As bactérias podem ser patogénicas ou não patogénicas, ou bactérias de deterioração ou indicadoras. Exemplos de géneros ou espécies de bactérias incluem, mas não são limitadas a, Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacilus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobiospirilum, Anaerorhabdus, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Artrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bifidobacterium, Bilophila Branhamella, Borrelia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacilus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Burkholder ia, Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium, Campilobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella,

Cedecea, Celulomonas, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chryseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Delftia, Dermabacter, Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Edwardsiella, Eggertella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Erysipelotrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella, Exiguobacterium, Facklamia, Fill factor, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Globicatella, Gemella, Gordona, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella, Kurtia, Kytococcus, Lactobacilus, Lactococcus, Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Metilobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia, Oligella, Orientia, Paenibacilus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Porphyrimonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia Rochalimaea Roseomonas, Rotia, Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewanella, Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirilum, Staphilococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacilus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella,

Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xantomonas, Xenorhabdus, Yersinia, e Yokenella; e. g. gram-positive bacteria such as, M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, M. bovis strain BCG, BCG substrains, M. avium, M. intracelulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium subspécie paratuberculosis, Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Staphilococcus equi, Streptococcus piogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacilus antracis, B. subtilis, Nocardia asteroides, Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes, e espécies Enterococcus e bactérias Gram-negativas tais como Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacilus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia coli, E. hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobacterium nucleatum, Cowdria ruminantium.

Deste modo, como exemplo representativo, o biofilme podem conter bactérias do género Staphilococcus, Pseudomonas, Legionella, Mycobacterium, Proteus, Klebsiella, Fusobacterium ou outras bactérias entéricas ou coliformes.

Os biofilmes podem também conter fungos, incluindo por exemplo os dos géneros Candida, Aspergilus,

Pneumocystis, Penicillium e Fusarium. As espécies fúngicas representativas incluem, mas não estão limitadas a, Candida albicans, Candida dubliniensis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergilus fumigatus, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermitidis, Pneumocystis carinii, Penicillium marneffei, Alternaria alternata.

Também podem estar contidos num biofilme algas e espécies de algas representativas incluem Chaetophora, Chlorella prototecoides, Coleochaete scutata, Coleochaete soluta, Cyanidioschyzon merolae Aphanochaete, Gloeotaenium, Oedogonium, Oocystis, Oscillatoria, Paradoxia multisitia, Phormidium, Chroococcus, Aphanotece, Fragilaria, Cocconeis, Navicula, Cymbella, Phaeodactilum assim como cianobactérias (algas azuis-verdes) e diátomos tais como Nitzschia palea.

Os biofilmes podem também conter outros organismos tais como, por exemplo, parasitas, e. g. protozoários tais como espécies de Toxoplasma e. g. Toxoplasma gondii, espécies de Plasmodium tais como Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae. Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, espécies de Leishmania tais como Leishmania major, Schistosoma tais como Schistosoma mansoni e Entamoeba histolytica . É comum para urn biofilme compreender uma colónia mista de microrganismos e deste modo o biofilme combatido pelos oligómeros de alginato de acordo com a invenção podem compreender qualquer número das espécies acima mencionadas. Preferencialmente pelo menos dois, mais preferencialmente pelo menos 5 e mais preferencialmente pelo menos 10.

Preferencialmente a colónia de biofilme compreende micróbios de pelo menos um dos géneros seguintes: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteroides, Pseudomonas, Legionella, Staphilococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholderia, Fusobacterium e Mycobacterium, por exemplo, Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia e Streptococcus Pyogenes .

Como notado acima o biofilme pode estar presente numa superfície. A superfície não é limitada e inclui gualguer superfície em gue um microrganismo pode ocorrer, particularmente, como notado acima, numa superfície exposta a água ou humidade. A superfície pode ser biótica ou abiótica, e superfícies inanimadas (ou abióticas) incluem gualguer superfície gue pode ser exposta ao contacto microbiano ou contaminação. Deste modo são particularmente incluídas superfícies de maguinaria, nomeadamente maguinaria industrial, ou gualguer superfície exposta a um ambiente aguático (e. g. eguipamento marinho, ou navios ou barcos ou partes ou componentes destes), ou qualquer superfície exposta a qualquer parte do ambiente, e. g. canalização em edifícios. Estas superfícies inanimadas expostas a contacto microbiano ou contaminação incluem em particular qualquer parte de: maquinaria ou equipamento de processamento de alimento ou bebida, preparação, armazenamento ou distribuição, equipamentos de ar condicionado, maquinaria industrial, e. g. em fábricas de processamento químico ou biotecnológico, tanques de armazenamento e equipamento médico e cirúrgico. Qualquer dispositivo ou equipamento para levar ou transportar ou distribuir materiais, que podem ser expostos a água ou humidade é suscetível a formação de biofilme. Estas superfícies incluirão particularmente canalizações (cujo termo é aqui utilizado amplamente para incluir qualquer conduta ou linha). As superfícies representativas inanimadas ou abióticas incluem, mas não são limitadas a equipamento de processamento de alimentos, armazenamento, distribuição ou preparação ou superfícies, tanques, transportadores, chãos, drenos, refrigerantes, congeladores, superfícies de equipamentos, paredes, válvulas, cintos, canos, condutas de ar condicionado, dispositivos de arrefecimento, linhas de distribuição de alimentos ou bebida, trocadores de calor, cascos de barcos ou qualquer parte da estrutura de um barco que está exposta a água, linhas de água dentais, condutas de perfuração de petróleo, lentes de contacto e caixas de armazenamento. Como notado acima, o equipamento médico ou cirúrgico ou dispositivos representam uma classe particular da superfície em que uma biofilme se pode formar. Isto pode incluir qualquer tipo de linha, incluindo cateteres (e. g. cateteres centrais venosos e cateteres urinários), dispositivos prostéticos e. g., válvulas cardíacas, articulações artificiais, dentes falsos, coroas dentais, capas dentárias e implantes de tecido mole (e. g. implantes da mama, nádegas e lábios). Qualquer tipo de dispositivo médico implantável (ou "interno") é incluído (e. g. stents, dispositivos intrauterinos, pacemakers, tubos de intubação, próteses ou dispositivos prostéticos, linhas ou catéteres) . Um dispositivo médico "interno" pode incluir um dispositivo em que qualquer parte deste está contida no corpo, i. e. o dispositivo pode ser totalmente ou parcialmente interno. A superfície pode ser feita de qualquer material. Por exemplo pode ser metal, e. g. alumínio, aço, aço inoxidável, crómio, titânio, ferro, ligas destes, e semelhantes. A superfície pode também ser plástico, por exemplo, poliolefina (e. g., polietileno, (Peso Molecular Ultra-Elevado) polietileno, polipropileno, poliestireno, poli(met)acrilato, acrilonitrilo, butadieno, ABS, butadieno acrilonitrilo, etc.), poliéster (e. g., tereftalato de polietileno, etc.), e poliamida (e. g., nylon), combinações destes, e semelhantes. Outros exemplos incluem copolímero acetal, polifenilsulfona, polissulfona, politermide, policarbonato, polieteretercetona, fluoreto de polivinilideno, poli (metilmetacrilato) e poli (tetrafluoroetileno) . A superfície pode também ser tijolo, azulejo, cerâmica, porcelana, lã, vinilo, linóleo, ou carpete, combinações destes, e semelhantes. As superfícies podem também ser alimentos, por exemplo, carne de vaca, aves, porco, vegetais, frutos, peixe, marisco, combinações destes, e semelhantes.

Uma superfície biótica ou animada pode incluir qualquer superfície ou interface no corpo. Pode como notado acima consequentemente ser visto como uma superfície "fisiológica" ou "biológica". Pode ser qualquer superfície interna ou externa ao corpo, incluindo qualquer tecido, que pode incluir tecido hematológico ou hemotopoiético (e. g. sangue). Como discutido acima, o tecido morto ou a morrer (e. g. necrótico) ou danificado (e. g. inflamado ou com rutura ou corte) é particularmente suscetível ao crescimento de biofilme e este tecido é incluído no termo "animado" ou "biótico". A superfície pode ser uma superfície de mucosa ou não mucosa.

As superfícies representativas bióticas incluem, mas não são limitadas a qualquer superfície na cavidade oral, e. g. dente, gengiva, fenda gengival, bolsa periodontal, trato reprodutivo (e. g. cérvix, útero, trompas de Falópio), o peritoneu, ouvido médio, próstata, trato urinário, intima vascular, conjuntivo, tecido corneai, o trato respiratório, tecido do pulmão (e. g. brônquico e alveolar), válvulas cardíacas, trato gastrointestinal, pele, escalpe, unhas e o interior de feridas, particularmente feridas crónicas, que podem ser feridas tópicas ou internas.

Num aspeto a superfície não será de mucosa, ou mais particularmente não terá um revestimento de muco hiperviscoso. 0 especialista será capaz de determinar quando a mucosa numa determinada superfície é hiperviscoso. Numa forma de realização a superfície não será a superfície de um tecido secretor de muco. Mais particularmente numa tal forma de realização a superfície não será a superfície de um tecido revestido por muco. 0 especialista saberá do seu conhecimento geral que os tecidos que segregam muco e os que são revestidos por muco.

Será consequentemente observado que a invenção proporciona utilizações médicas dos oligómeros de alginato como aqui definido, para o tratamento de uma infeção por biofilme presente num indivíduo (e. g. a infeção por biofilme com qualquer microrganismo, incluindo bactérias, vírus, fungos ou parasitas tais como protozoários). A infeção pode ser uma infeção patogénica. Os exemplos representativos dos microrganismos que podem causar infeção são descritos acima. As infeções causadas por Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes, Pseudomonas, Legionella, Staphilococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholderia, Fusobacterium e Mycobacterium, por exemplo,

Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderla cepacia e Streptococcus Pyogenes são notados. As infeções causadas por Pseudomonas, e. g. Pseudomonas aeruginosa, são de particular nota. 0 termo "num indivíduo" é aqui utilizado amplamente para incluir a infeção por biofilme que ocorre dentro de um indivíduo ou num indivíduo, e. g. numa superfície externa do corpo. A infeção por biofilme pode ser crónica (i. e. pode ser uma infeção crónica por biofilme), e. g. uma infeção que persistiu durante pelo menos 5 ou pelo menos 10 dias, particularmente pelo menos 20 dias, mais particularmente pelo menos 30 dias, mais particularmente pelo menos 40 dias. As infeções crónicas manifestam-se frequentemente como infeção por biofilmes, mas uma infeção por biofilme não necessita de ser uma infeção crónica como aqui definido.

Neste aspeto da invenção a infeção por biofilme pode ocorrer numa superfície interna ou externa do indivíduo (i. e. uma superfície biótica como discutido acima) e/ou uma superfície de um dispositivo médico, particularmente um dispositivo médico implantável ou "interno". O indivíduo pode ser qualquer indivíduo animal humano ou não humano, mas mais particularmente pode ser um vertebrado, por exemplo um indivíduo mamífero, um indivíduo aviário, um peixe ou um réptil. Os indivíduos humanos são preferidos, mas o indivíduo pode ser, por exemplo, qualquer animal de criação ou doméstico, ou por exemplo um animal num zoo. Deste modo os animais representativos incluem cães, gatos, coelhos, murganhos, cobaias, hamsters, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, vacas, aves e peixes. As utilizações veterinárias da invenção são assim cobertas. 0 indivíduo pode ser visto como um doente.

Uma infeção por biofilme pode ocorrer em qualquer indivíduo mas alguns indivíduos serão mais suscetíveis a infeção que outros. Os indivíduos que são suscetíveis a infeção por biofilme incluem, mas não são limitadas a, indivíduos cuja barreira epitelial e/ou endotelial é enfraquecida ou comprometida, indivíduos cujas defesas com base em secreção na infeção com microrganismos foram anuladas, interrompidas, enfraquecidas ou debilitados, e os indivíduos que são imunocomprometidos, imunodeficientes ou imunossuprimidos (i. e. um indivíduo no qual qualquer parte do sistema imunitário não está a trabalhar normalmente, ou está a trabalhar subnormalmente, por outras palavras em qualquer parte da resposta imunitária, ou uma atividade imunitária é reduzida ou impedida, seja devido a doença ou intervenção clínica ou outros tratamentos, ou de qualquer maneira).

Exemplos representativos de indivíduos que são susceptíveis a infeção por biofilme incluem, mas não estão limitados a, os indivíduos com uma infeção pré-estabelecida (e. g. com bactérias, vírus, fungos ou parasitas tais como protozoários), especialmente indivíduos com HIV, indivíduos com sépsia e indivíduos com choque séptico; indivíduos com imunodeficiência, e. g. indivíduos que se preparam para, sofrer ou recuperar de quimioterapia e/ou radioterapia, indivíduos em transplante de órgãos (e. g. medula óssea, fígado, pulmão, coração, válvula cardíaca, rim, etc.) (incluindo doentes com autoenxerto, aloenxerto e xenoenxerto), indivíduos com SIDA; indivíduos residentes numa instituição de cuidados de saúde, e. g. hospital, especialmente indivíduos em cuidados intensivos ou cuidados críticos (í. e. estas unidades relacionadas a provisão de suporte de vida ou sistemas de suporte de órgãos de doentes) ; os indivíduos que sofrem de trauma; os indivíduos com queimaduras, indivíduos com feridas agudas e/ou crónicas; indivíduos neonatais; indivíduos idosos; indivíduos com cancro (aqui amplamente definidos para incluírem qualquer estado neoplásico; maligno ou não maligno), especialmente aqueles com cancros do sistema imunitário (e. g. leucemias, linfomas e outros cancros hematológicos); indivíduos que sofrem de estados autoimunitários tais como artrite reumatóide, diabetes mellitus tipo I, doença de Crohn, especialmente aqueles que sofrem tratamento de imunossupressão para estas doenças; indivíduos com secreção epitelial ou endotelial reduzida ou anulada (e. g. muco, lágrimas, saliva) e/ou eliminação por secreção (e. g. indivíduos com cílios com mau funcionamento em tecido de mucosa e/ou doentes com muco hiperviscoso (e. g. fumadores e indivíduos com COPD, bronquite, fibrose cística, enfisema, cancro do pulmão, asma, pneumonia ou sinusite) e indivíduos equipados com um dispositivo médico.

Deste modo, indivíduos em cuja infeção por biofilmes pode particularmente ser combatida de acordo com a presente invenção incluem doentes que permaneceram com dificuldades, devido a baixa perfusão, trauma repetitivo, baixa nutrição, baixa oxigenação ou disfunção de glóbulos brancos.

De particular interesse são indivíduos que sofreram trauma físico. 0 trauma em si pode causar um enfraquecimento ou comprometer a barreira epitelial e/ou endotelial do indivíduo ou o indivíduo pode tornar-se imunocomprometido em resposta ao trauma (uma resposta ao choque). 0 termo "trauma" refere-se amplamente ao ataque celular por corpos estranhos e/ou lesão física de células. Incluídos nos corpos estranhos estão os microrganismos, matéria particulada, agentes químicos, e semelhantes. Incluídas entre as lesões físicas estão as lesões mecânicas; lesões térmicas, tais como as resultantes de calor ou frio excessivos; lesões elétricas, tais como as causadas pelo contacto com fontes de potencial elétrico; e lesão por radiação causada, por exemplo, por exposição prolongada, extensa a infravermelhos, radiações ultravioleta ou ioni zantes.

Também de particular interesse são indivíduos que têm uma queimadura. Qualquer queimadura, em particular uma queimadura grave, tem um impacto significativo na integridade da barreira epitelial e/ou endotelial do indivíduo e o indivíduo fica frequentemente imunocomprometido em resposta à queimadura (um resposta ao choque).

Os agentes causadores de queimaduras típicos são extremos de temperatura (e. g. fogo e líquidos e gases a temperatura extrema), eletricidade, químicos corrosivos, fricção e radiação. A extensão e duração da exposição, em conjunto com a intensidade/força do agente, resulta em queimaduras de gravidade variada. 0 escaldamento (i. e. trauma associado com líquidos e/ou gases a elevada temperaturas) é considerado uma queimadura. A gravidade da queimadura epidérmica é normalmente classificada de duas maneiras. A mais comum é a classificação pelo grau. As queimaduras de primeiro grau são normalmente limitadas a eritema (vermelhidão) na área geral da lesão e uma placa branca no sítio da lesão. 0 trauma celular destas queimaduras estendem-se apenas até à epiderme. As queimaduras de segundo grau também apresentam eritema na área geral da lesão mas com bolhas superficiais da epiderme. 0 trauma celular das queimaduras de segundo grau envolve a derme superficial (papilar) e pode também envolver camada profunda da derme (reticular). As queimaduras de terceiro grau são aquelas em que a epiderme é perdida com lesão da hipoderme. A lesão é tipicamente extrema incluindo carbonização. Por vezes as escaras estão presentes (secas, tecido necrótico negro). As queimaduras de terceiro grau podem requerer enxerto. Nas queimaduras de quarto grau ocorre a lesão catastrófica da hipoderme, e. g. a hipoderme é completamente perdida, com lesão que se estende até ao tecido subjacente de músculo, tendão, e ligamento. Carbonização e escaras são observadas. 0 enxerto é necessário se a queimadura não se mostrar fatal.

Outro sistema de classificação comum é a classificação por espessura. As queimaduras de "espessura superficial" correspondem a queimaduras de primeiro grau. 0 espetro das queimaduras de segundo grau é coberta por duas classes de queimaduras de "espessura parcial". As queimaduras "de espessura parcial-superficiais" são as que afetam a epiderme apenas até a derme papilar. As queimaduras " de espessura de profundidade parcial" são as que afetam a derme atá à derme reticular. As queimaduras "de espessura total" correspondem às queimaduras de terceiro e quarto grau.

Algumas lesões físicas, e. g. algumas queimaduras, e ataques celulares por corpos estranhos resultam na formação de uma ferida. Mais especif icamente uma ferida pode ser considerada como sendo uma brecha em, ou desnudado de um tecido. As feridas podem também se causadas por uma lesão de formação espontânea tais como uma úlcera na pele (e. g. uma úlcera venosa, diabética ou pressão), uma fissura anal ou uma úlcera na boca.

As feridas são tipicamente definidas como agudas ou crónicas. As feridas agudas são feridas que prosseguem por ordem através dos três estádios reconhecidos do processo de cicatrização (i. e. o estádio inflamatório, o estádio prolif erativo e a fase de remodelação) sem uma duração prolongada. As feridas crónicas, no entanto, são as feridas que não completam a sequência ordenada de eventos bioquímicos do processo de cicatrização porque a ferida se instalou em um dos estádios da cicatrização. Normalmente, as feridas crónicas são instaladas na fase inflamatória. De acordo com um aspeto particular da presente invenção, uma ferida crónica é uma ferida que não cicatrizou em pelo menos 40 dias, particularmente pelo menos 50 dias, mais particularmente pelo menos 60 dias, mais particularmente pelo menos 70 dias.

Como discutido acima, as feridas são um ambiente ideal para infeção, incluindo a infeção por biofilme, e particularmente infeção crónica por biofilme, devido à falta de uma barreira epitelial e a disponibilidade de substrato e superfície de colonização e ligação a biofilme. Problematicamente, a infeção de uma ferida retarda ainda mais frequentemente a cicatrização e deste modo torna a ferida mais suscetível à formação de biofilme e estabelecimento de infeção. Os oligómeros de alginato da invenção são deste modo eficazes no tratamento de infeção por biofilme em feridas e o tratamento de feridas crónicas representa um aspeto preferido da presente invenção.

Deste modo, numa forma de realização da invenção os oligómeros de alginato possuindo pelo menos 70% de resíduos G são utilizados no tratamento de infeção por biofilme, particularmente infecção crónica por biofilme, presente nos indivíduos acima mencionados, em particular em indivíduos com doenças ou distúrbios respiratórios e. g. fibrose cística, feridas, queimaduras e/ou traumas, compreendendo o referido tratamento a administração ao indivíduo de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um oligómero de alginato como aqui definido.

Num aspeto de particular importância, os oligómeros de alginato podem ser utilizados para tratar a infeção por biofilme presente em feridas, e. g. queimaduras, por exemplo no tratamento de feridas infetadas, e. g. queimaduras.

Através da capacidade para tratar a infeção por biofilme de feridas os oligómeros de alginato aqui definidos podem remover um dos obstáculos à cicatrização da ferida e deste modo os oligómeros de alginato definidos acima são também eficazes na promoção da cicatrização de feridas agudas e crónicas.

Através da promoção da cicatrização entende-se que o tratamento acelera o processo de cicatrização da ferida em questão (i. e. a progressão da ferida ao longo dos três estádios reconhecidos do processo de cicatrização). A aceleração do processo de cicatrização pode manifestar-se como um aumento na taxa de progressão através de um, dois ou todos os estádios da cicatrização (i. e. o estádio inflamatório, o estádio proliferativo e/ou a fase de remodelação) . Se a ferida é uma ferida crónica que se instalou num dos estádios de cicatrização a aceleração pode manifestar-se como o reinicio do processo linear, sequencial de cicatrização após a instalação. Por outras palavras, o tratamento desloca a ferida de um estado de não cicatrização para um estado em que a ferida começa a progredir ao longo dos estádios de cicatrização. Essa progressão após o reinicio pode estar numa taxa normal ou mesmo numa taxa inferior em comparação com a taxa de cicatrização de uma ferida aguda normal.

Os oligómeros de alginato podem ser utilizados para tratar a infeção por biofilmes sempre que possam ocorrer no corpo. Deste modo, em outra forma de realização, a infeção por biofilme pode ser uma infeção de um dispositivo médico, particularmente um dispositivo médico interno.

Como notado acima, os biofilmes ocorrem nos dentes, por exemplo na forma de placa dental. Os oligómeros de alginato podem ser utilizados de acordo com a presente invenção como agentes de saúde oral, por exemplo no controlo da placa dental, e. g. para a remover, ou reduzir ou para reduzir ou retardar o seu desenvolvimento. Estes podem também ser utilizados no tratamento de infeções ou doença infecciosa que podem ocorrer na cavidade oral, por exemplo gengivite e periodontite.

Como notado acima o tratamento de infeção por biofilmes dos pulmões e do trato respiratório e de todas as áreas do corpo são geralmente cobertas pela presente invenção, em uma forma de realização, as utilizações médicas da invenção não são dirigidas para o tratamento de (i) biofilmes no trato respiratório de doentes que sofrem de DPOC (doenças pulmonares obstrutivas crónicas), em particular o sinos e os pulmões, em particular no tratamento de fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crónica, enfisema, bronquite e sinusite; (ii) no ouvido médio de doentes que sofrem de cera no ouvido; ou (iii) no trato reprodutivo de doentes femininos com dificuldades de fertilidade; ou (iv) no trato digestivo de doentes com mau funcionamento do trato digestivo (e. g. obstipação).

Em formas de realização específicas da invenção os oligómeros de alginato podem ser utilizados no tratamento de endocardite nativa da válvula, otite média aguda, prostatite bacteriana crónica, pneumonia, placa dental, periodontite, infeção por biofilmes em doenças respiratórias, que podem incluir fibrose cística e asma, e infeção relacionada com o dispositivo associado com dispositivo médicos implantáveis ou prostéticos e. g. endocardite de válvula prostética ou infeção de linhas ou catéteres ou articulações artificiais ou substituições de tecido.

Uma quantidade "farmaceuticamente eficaz" do alginato é a quantidade de alginato que proporciona um efeito mensurável no biofilme a que se dirige (como definido acima) e/ou um efeito mensurável no estado o qual se dirige. Esta quantidade pode ser determinada com referência a práticas convencionais para decidir quantidades de dosagem e o especialista será capaz de detetar a evidência de tratamento bem sucedido a partir desta experiência e com o auxílio de testes de rotina disponíveis para este que são concebidos para monitorizar o tamanho biofilme, estrutura, integridade e número de colónias (por exemplo os acima descritos) e os testes concebidos para monitorizar o estado a que se dirige.

As doses adequadas de oligómero de alginato irão variar de indivíduo para indivíduo e pode ser determinada pelo profissional médico ou veterinário de acordo com o peso, idade e sexo do indivíduo, a gravidade do estado, o modo de administração e também o oligómero de alginato particular selecionado. Tipicamente os oligómeros de alginato da invenção serão aplicados ao biofilme numa concentração local até 10%, preferencialmente até 6%, mais preferencialmente até 4% e mais preferencialmente até 2%. "Tratamento" quando utilizado em relação a infeção por biofilme (i. e. em relação ao tratamento de um estado médico/infeção num indivíduo em oposição ao utilizado em relação ao próprio biofilme) é aqui utilizado amplamente para incluir qualquer efeito terapêutico, i. e. qualquer efeito benéfico no estado ou em relação à infeção por biofilme. Deste modo não é apenas incluída a erradicação ou eliminação da infeção, ou cura do indivíduo ou infeção, mas também um melhoramento na infeção ou estado do indivíduo. Deste modo é incluído por exemplo, uma melhoria em qualquer sintoma ou sinal da infeção, ou em qualquer indicador clinicamente aceite da infeção/estado (por exemplo uma diminuição no tamanho da ferida ou uma aceleração do tempo de cicatrização). O tratamento inclui deste modo terapia curativa e paliativa, e. g. uma infeção/estado pré-existentes ou diagnosticados, i. e. um tratamento reaccional. "Tratamento" como aqui utilizado também inclui a limitação, ou redução de um estado existente, ou um ou mais destes sintomas, por exemplo relativamente ao estado ou sintoma antes do tratamento. 0 tratamento inclui deste modo explicitamente qualquer atraso no desenvolvimento do estado ou sintoma existente, ou redução ou limitação no desenvolvimento ou progressão do estado ou sintoma. É também descrito como os oligómeros de alginato podem ser tomados como um tratamento profilático, por exemplo para prevenir, ou pelo menos minimizar o risco de infeção por biofilme (e. g. por um patogénico). Isto é de particular utilidade no cuidado de doentes hospitalizados como o risco de contracção de uma infeção nosocomial (normalmente conhecida como infeção relacionada/adquirida em hospital ou infeção associada a cuidados de saúde), e. g. Staphilococcus aureus, Staphilococcus aureus (MRSA) Resistentes a Meticilina, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis e Enterococcus Resistentes a Vancomicina, podem ser minimizados com urn regime profiláctico dos oligómeros de alginato aqui definidos. Isto é também de particular utilidade no cuidado de indivíduos que sofrem de trauma, indivíduos com uma queimadura e indivíduos com feridas, todos os quais, como discutido acima, são mais suscetíveis a infeção com patogénicos do que um indivíduo que não é afectado do mesmo modo.

Geralmente, os indivíduos com necessidade de tratamento de acordo com a invenção serão diagnosticados como sofrendo do estado a que se dirige, ou identificados como possuindo uma infeção por biofilme. É ainda adicionalmente descrito como os oligómeros de alginato podem ser tomados como um tratamento profilático para prevenir, ou pelo menos minimizar o risco, de desenvolver uma infeção por biofilme, incluindo por exemplo a infeção de feridas, endocardite da válvula nativa, otite média aguda, prostatite bacteriana crónica, periodontite, infeções do trato respiratório e pulmões (e. g. fibrose cística ou outras doenças respiratórias, placa dentária, pneumonia, ou infeção de um dispositivo médico (e. g. interno).

Numa forma de realização vantajosa da invenção os oligómeros de alginato podem ser utilizados em conjunto ou combinação com um agente antimicrobiano. No contexto de uma utilização médica, esse agente pode ser qualquer agente antimicrobiano clinicamente útil e particularmente um antibiótico. No contexto de utilizações não clínicas, o agente antimicrobiano podem de novo ser qualquer agente antimicrobiano utilizado para estes propósitos, e. g. qualquer desinfetante ou agente antissético ou de limpeza ou de esterilização. Os agentes podem ser utilizados separadamente, ou em conjunto na mesma composição, simultaneamente ou sequencialmente ou separadamente, e. g. em qualquer intervalo de tempo desejado.

Deste modo como exemplo representativo, o agente antimicrobiano pode ser utilizado após os oligómeros de alginato, mas uma utilização prévia ou simultânea pode ser benéfica em algumas circunstâncias.

Qualquer agente antimicrobiano que se dirige a pelo menos um dos microrganismos no biofilme a que se destina pode ser utilizado. A selecção do agente antimicrobiano precisará obviamente de ser apropriado para a superfície que sofre o tratamento, mas por exemplo os agentes antimicrobianos, e. g. antibióticos, antifúngicos, antisséticos podem ser utilizados e/ou condições de esterilização tais como a irradiação (e. g. UV, raios X, gama), extremos de temperatura, e extremos de pH.

Os antibióticos representativos incluem, mas não estão limitados a aminoglicósidos (e. g. amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina); os carbecefems (e. g. loracarbef); a Ia geração de cefalosporinas (e. g. cefadroxilo, cefazolina, cefalexina); 2a geração cefalosporinas (e. g. cefaclor, cefamandole, cefalexina, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima); 3a geração de cefalosporinas (e. g. cefixime, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona); 4a geração de cefalosporinas (e. g. cefepima); os macrólidos (e. g. azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, troleandomicina); as monobactamas (e. g. aztreonam); as penicilinas (e. g. amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina); os polipéptidos antibióticos (e. g. bacitracina, colistina, polimixina B) ; as quinolonas (e. g. ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina) ; as sulfonamidas (e. g. mafenida, sulfacetamida, sulfametizole, sulfasalazina, sulfisoxazole, trimetoprim-sulfametoxazole); as tetraciclinas (e. g. demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina); os carbapenemos (e. g. imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ-601); cloranfenicol; clindamicina, etambutol; fosfomicina; isoniazida; linezolida; metronidazole; nitrofurantoina; pirazinamida; quinupristina/dalfopristina; rifampina; espectinomicina; e vancomicina. Os antibióticos vancomicina, tobramicina, meropenem, ciprofloxacina, piperacilina, colistina, aztreonam, ciprofloxacina e azitromicina são preferidos.

Os antisséticos representativos incluem, mas não estão limitados a lixiviação com cloro (hipoclorito de sódio), compostos de amónio quaternários (e. g. cloreto de benzalcónio, brometo de cetiltrimetilamónio, cetilpiridineo), peróxido de hidrogénio, compostos de fenol (e. g. TCP), álcoois (e. g. etanol) , Virkon™, compostos de iodo (e. g. povidonpiodo), compostos de prata (e. g. nano/microparticulas elementares de prata).

Os antifúngicos representativos incluem, mas não estão limitados aos polienos (e. g. natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina; os imidazoles (e. g. miconazole, cetoconazole, clotrimazole, econazole, bifonazole, butoconazole, fenticonazole, isoconazole, oxiconazole, sertaconazole, sulconazole, tioconazole); os triazoles (e. g. fluconazole, itraconazole, isavuconazole, ravuconazole, posaconazole, voriconazole, terconazole); as alilaminas (e. g. terbinafina, amorolfina, naftifina, butenafina); e as equinocandinas (e. g. anidulafungina, caspofungina, micafungina). 0 agente antimicrobiano pode convenientemente ser aplicado antes, simultaneamente com ou após o alginato. Convenientemente o agente antimicrobiano é aplicado a substancialmente ao mesmo tempo que o alginato ou depois. Por exemplo, o agente antimicrobiano é aplicado pelo menos 1 hora, preferencialmente pelo menos 3 horas, mais preferencialmente pelo menos 5 e mais preferencialmente pelo menos 6 horas depois o oligómero de alginato é administrado. Para otimizar o efeito antimicrobiano do agente antimicrobiano o agente microbiano pode ser dado (e. g. administrado ou distribuído) repetidamente em pontos de tempo apropriados para o agente utilizado. 0 especialista é capaz de conceber uma dosagem ou regime de utilização adeguados. Em tratamentos de longo prazo o alginato pode também ser utilizado repetidamente. Isto pode ser tão freguente como o agente antimicrobiano, mas será tipicamente menos freguente. A freguência necessária dependerá da localização da infeção por biofilme, composição de colónia e do antimicrobiano utilizado e o especialista é capaz de optimizar a dosagem ou padrões de utilização para otimizar resultados

Numa forma de realização vantajosa, o agente antimicrobiano pode ser utilizado ou aplicado após remoção física ou redução (e. g. debrisdação) do biofilme da superfície.

Após a remoção de, ou de uma tentativa para remover, o biofilme, a superfície pode ser colocada em contacto com os oligómeros de alginato entre as 0 e 24 horas, particularmente 2 e 12 horas, mais particularmente 4 e 8 horas, mais particularmente 5 e 7 horas, e. g. 6 horas. Depois disto, um agente antimicrobiano pode, se desejado, ser aplicado. Este cenário pode ser desejável ou particularmente aplicável num guadro clínico. No caso das feridas infetadas com biofilme a duração da incubação pode ser convenientemente concebido para corresponder a alterações programadas do curativo da ferida. A remoção física do biofilme pode ser realizada com qualquer meio cirúrqico, mecânico ou químico adequado. Convenientemente isto pode ser a utilização de composições de um líquido, gel, gel-sol, semi-sólido ou gás aplicado à pressão ao biofilme, sonicação, laser, ou por implemento abrasivo. Uma composição utilizada na própria remoção ou como uma solução de lavagem antes, durante ou depois pode convenientemente conter o oligómero de alginato.

Consequentemente, numa forma de realização específica é proporcionada uma solução aquosa estéril de desbridação da ferida ou uma solução de desbridação de feridas estéril à base de óleo contendo um oligómero de alginato como aqui definido e contendo ainda pelo menos uma enzima proteolítica e/ou pelo menos uma fase sólida abrasiva, em que a referida composição é uma solução aquosa estéril ou uma solução estéril à base de óleo. As enzimas proteolíticas adequadas incluem colagenase, tripsina, pepsina ou elastase. As fases sólidas abrasivas adequadas incluem sílica coloidal, pedra-pomes moída, planta ou concha de animal moída. A utilização em combinação ou conjunto com outros agentes de rutura de biofilme pode ser benéfica. Os destruidores de biofilme incluem, mas não estão limitados a proteases, e. g. proteases de serina, metaloproteases e proteases de cisteína (exemplos destes tipos de proteases são listados em EP0590746); nucleases, e. g. DNase I e II, RNase A, Η, I, II, III, P, PhyM, R; lipases e enzimas capazes de degradação de polissacáridos, gelsolina, um agente de redução tiol, uma acetilcisteína, um polissacárido não carregado de baixo peso molecular (e. g. dextrano), ou um ácido poliamino aniónico (e. g. poli ASP ou poli GLU).

Pode ser feita uma menção particular de liase de alginato, e a utilização combinada disto com um oligómero de alginato como aqui definido representa uma possível forma de realização específica deste aspeto da invenção. A utilização em combinação ou conjunção com agentes imunoestimulatórios pode também ser benéficas no tratamento de biofilmes numa situação clínica. Estes agentes imunoestimuladores podem convenientemente ser utilizados em pontos de tempo correspondentes aos descritos acima em relação com os agentes antimicrobianos e podem opcionalmente ser utilizados em combinação com um oligómero de alginato e um agente antimicrobiano. Os agentes imunoestimuladores adequados incluem, mas não estão limitados a citoquinas e. g. TNF, IL-1, IL-6, IL-8 e alginatos imunoestimuladores, tais como alginatos com elevado conteúdo em M como descrito por exemplo nos documentos US 5 169 840, WO91/11205 e W003/045402, mas incluindo qualquer alginato com propriedades imunoestimuladoras.

Utilização dos oligómeros de alginato em combinação ou conjunção com fatores de crescimento, e. g. PDGF, FGF, EGF, TGF, hGF e as enzimas podem também ser benéficas nas utilizações médicas da invenção. Exemplos representativos de enzimas adequadas incluem mas não estão limitados a proteases, e. g. proteases de serina, metaloproteases e proteases cisteína (exemplos destes tipos de proteases são listados em EP0590746); nucleases, e. g. DNase I e II, RNase A, Η, I, II, III, P, PhyM, R; lipases e enzimas capazes de degradar polissacáridos. A utilização dos oligómeros de alginato em combinação ou conjunção com uma gente de redução de viscosidade de mucosa fisiologicamente tolerável pode também ser benéfico, e. g. uma enzima de clivagem de ácido nucleico (e. g. uma DNase tal como DNase I), gelsolina, um agente de redução de tiol, uma acetilcisteina, cloreto de sódio, um polissacárido não carregado de baixo peso molecular (e. g. dextrano), arginina (ou outros precursores de óxido nítrico ou estimuladores de síntese), ou um ácido poliamino aniónico (e. g. poli ASP ou poli GLU) . Ambroxol, romhexina, carbocisteína, domiodol, eprazinona, erdosteína, letosteína, mesna, neltenexina, sobrerol, stepronina, tiopronina são mucolíticos específicos de nota. A utilização de uma DNase é especialmente preferida.

Como discutido acima, os oligómeros de alginato podem ser utilizados opcionalmente com quaisquer outros agentes terapeuticamente ativos pode ser desejado utilizar, e. g. um agente antiinflamatório. A utilização combinada de um oligómero de alginato com um outro agente terapeuticamente ativo (e. g. um agente antimicrobiano ou antiinflamatório) pode vantajosamente permitir a dose (e. g. a dose usual ou normal) do outro agente terapeuticamente ativo para ser reduzido e. g. pode ser utilizado na sua dose normal ou usual ou a uma dose baixa, por exemplo até 50% (ou até 50%) da sua dose normal. A invenção inclui a utilização de um único oligómero de alginato ou uma mistura (multiplicidade/pluralidade) de diferentes oligómeros de alginato. Deste modo, por exemplo, uma combinação de diferentes oligómeros de alginato (e. g. dois ou mais) pode ser utilizada.

No caso de utilização médica, os alginatos da invenção pode ser administrada ao indivíduo em qualquer forma conveniente ou por qualquer meio conveniente, e. g. por vias tópicas, orais, parentéricas, entéricas, parentéricas ou por inalação. Preferencialmente o alginato será administrado por vias tópicas, orais ou parentéricas ou por inalação. 0 especialista será capaz de formular os alginatos da invenção nas composições farmacêuticas que são adaptadas para estas vias de administração de acordo com qualquer dos métodos convencionais conhecidos na técnica e amplamente descritos na literatura. Meramente como diretiva, os Exemplos 11 e 12 descrevem duas possíveis composições (uma composição tópica e um líquido de desbridação).

Existe deste modo também aqui proporcionada uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de uma infeção por biofilme compreendendo um oligómero de alginato como aqui definido em conjunto com pelo menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 ingrediente ativo pode ser incorporado, opcionalmente em conjunto com outros agentes ativos, com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes convencionais, para produzir preparações galénicas convencionais tais como comprimidos, pílulas, pós (e. g. pós inaláveis), lozenges, saquetas, hóstia, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como num sólido ou num meio líquido), sprays (e. g. sprays nasais), composições para utilização em nebulizadores, unguentos, cápsulas de gelatina mole e dura, supositórios, soluções estéreis injetáveis, pós estéreis empacotados, e semelhantes.

Exemplos de adequados veículos, excipientes, e diluentes são lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia, fosfato de cálcio, alginatos inertes, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água de xarope, água, água/etanol, água/glicol, água/polietileno, água de sal hipertónico, glicol, propilenoglicol, metilcelulose, metil-hidroxibenzoatos, propil-hidroxibenzoatos, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou substâncias gordas tais como gordura forte ou misturas adequadas destas. Os excipientes e diluentes preferidos são manitol e água de sal hipertónico (salino).

As composições podem adicionalmente incluir agentes lubrificantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensão, agentes de conservação, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, e semelhantes.

Como discutido acima, os oligómeros de alginato propostos para utilização de acordo com a invenção podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos, por exemplo para serem administrados em conjunto, numa única formulação ou composição farmacêutica, ou separadamente (i. e. para administração separada, sequencial ou simultânea). Deste modo, os alginatos da invenção podem ser combinados com um segundo (ou mais) agente terapeuticamente ativo, e. g. num kit farmacêutico ou como um produto combinado ("combinação") .

Deste modo um outro aspeto da presente invenção proporciona um produto contendo um oligómero de alginato como agui definido e um segundo agente ativo como uma preparação combinada para utilização separada, simultânea ou sequencial no tratamento de uma infeção por biofilme presente num indivíduo.

Os agentes terapeuticamente ativos adicionais podem ser incluídos nas composições farmacêuticas, como discutido em relação com as terapias de combinação acima.

As formas parentericamente administráveis, e. g., soluções intravenosas, devem ser estéreis e livres de agentes fisiologicamente inaceitáveis, e devem ter uma baixa osmolaridade para minimizar a irritação ou outros efeitos adversos após administração e deste modo as soluções devem preferencialmente ser isotónicas ou ligeiramente hipertónicas, e. g. água de sal hipertónica (salino) . Os veículos adequados incluem veículos aquosos normalmente utilizados para administração de soluções parentéricas tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer Lactado e outras soluções tais como estão descritas na Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 e 1461-1487 (1975) e The National Formulary XIV, 14t ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). As soluções podem conter conservantes, agentes antimicrobianos, tampões e antioxidantes convencionalmente utilizados para soluções parentéricas, excipientes e outros aditivos que são compatíveis com os biopolímeros e que não interferem com a preparação, armazenamento ou utilização de produtos.

Para administração tópica, o oligómero de alginato pode ser incorporado em cremes, unguentos, géis, pensos transdérmicos e semelhantes. Os oligómeros de alginato podem também ser incorporados em ligaduras médicas, por exemplo ligaduras de feridas e. g. ligaduras de tecido (e. g. pano) ou ligaduras não tecido (e. g. géis ou ligaduras com um componente de gel). A utilização do polímero de alginatos em ligaduras é conhecida, e estas ligaduras, ou efetivamente quaisquer ligaduras, podem adicionalmente incorporar os oligómeros de alginato da invenção.

Consequentemente, é deste modo também aqui proporcionado uma ligadura de ferida compreendendo um oligómero de alginato (que pode ser qualquer oligómero de alginato como aqui definido).

Outros sistemas tópicos que pretendem adequados são sistemas de distribuição de fármaco in situ, por exemplo géis em que matrizes sólidas, semi-sólidas, amorfas ou gel líquido cristalino são formadas in situ e que podem compreender o oligómero de alginato. Estas matrizes podem convenientemente ser concebidos para controlar a libertação do oligómero de alginato a partir da matriz, e. g. a libertação pode ser atrasada e/ou sustida durante um determinado período de tempo. Estes sistemas podem formar géis apenas após contacto com tecidos ou fluidos biológicos. Tipicamente o géis são bioadesivos. A distribuição em qualquer sítio do corpo que pode reter ou ser adaptado para reter a composição pré-gel pode ser alcançada por esta técnica de distribuição. Estes sistemas são descritos no documento WO 2005/023176.

Para aplicação em superfícies orais, bucais e dentárias, as pastas de dentes e lavagens bocais são mencionadas especificamente. Deste modo, é assim também proporcionado um cuidado de saúde oral, ou de higiene oral, composição, compreendendo um oligómero de alginato (que pode ser qualquer oligómero de alginato como aqui definido), particularmente uma lavagem bocal ou pasta de dentes.

Como notado acima, uma composição preferida utilizada na invenção é uma composição de desbridação que é utilizada num processo de desbridação para remover biofilme, por exemplo de um tecido. Tipicamente esta composição será líquida, mas composições de géis, gel-sol, ou semi-sólidas podem ser utilizadas. A composição pode ser utilizada para desbridar o biofilme (e. g. por aplicação ao tecido sob pressão) e/ou pode ser utilizado para banhar o tecido antes, durante e/ou depois da desbridação por outros meios tais como por processos cirúrgicos, mecânicos ou químicos. 0 especialista é rapidamente capaz de formular composições de desbridação de acordo com a invenção.

No caso de biofilmes numa superfície inanimada, o oligómero de alginato pode ser aplicado à superfície a ser tratada em qualquer composição ou formulação conveniente, ou por qualquer meio conveniente. Deste modo o oligómero de alginato pode estar na forma líquida, gel, gel-sol, semi-sólido ou forma sólida (e. g. soluções, suspensões, homogenados, emulsões, pastas, pós, aerossóis, vapores). Tipicamente as composições para tratamento de biofilmes desta superfície inanimada será uma composição não farmaceuticamente aceitável. A seleção da forma da composição será ditada pela estrutura de biofilme e composição em colónia e localização. Por exemplo, se a localização do biofilme é uma linha de fluido pode ser conveniente para aplicar uma composição fluida. Pode também ser preferido utilizar uma composição que persiste na superfície a ser tratada mas que não desaparece do fluido de utilização normal, e. g. um gel adesivo. 0 especialista é prontamente capaz de preparar composições adequadas a partir do seu conhecimento geral comum. Por exemplo, o oligómero de alginato pode ser adicionado a uma formulação de cor e aplicada à superfície a ser tratada, e. g. um casco de barco ou outras partes de uma estrutura de barco que está exposta a água, ou de um edifício ou qualquer parte deste, um tanque (e. g. um tanque de armazenamento ou processamento) ou efetivamente qualquer parte de qualquer maquinaria industrial. Estas composições podem convenientemente compreender também um agente antimicrobiano, como descrito acima, e. g. lixivia clorada, TCP, etanol, Virkon™, povidona-iodo, compostos de prata etc. Como as composições não precisam de ser farmaceuticamente aceitáveis, os antimicrobianos mais duros podem ser utilizados sujeitos a considerações de lesão de superfície, contaminação ambiental, segurança do utilizador e contaminação da superfície tratada e a interação com os outros componentes da composição.

As composições utilizadas na invenção podem ser formuladas de maneira a proporcionar a libertação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após administração ao indivíduo/superfície empregando procedimentos bem conhecidos na técnica. As composições adesivas são também preferidas. As formulações de libertação de adesivos, sustentada e/ou atrasada podem ser particularmente convenientes. São também aqui descritos produtos suscetíveis a colonização do biofilme cujas superfícies suscetíveis foram prétratadas com um oligómero de alginato como aqui definido. Os exemplos não limitantes de produtos e superfícies suscetíveis a colonização por biofilme são descritos acima. Pode ser feita menção particular de processamento de alimentos ou bebidas, equipamento de armazenamento ou dispensa e dispositivos médicos. 0 pré-tratamento pode ser conseguido por qualquer meio conveniente, por exemplo qualquer forma da aplicação do oligómero de alginato à superfície, nomeadamente o revestimento da superfície, e. g. liofilização, polímero de revestimento com um polímero que incorpora o oligómero de alginato, e pintura, envernizamento ou lacagem com pintura, formulações de verniz ou laca contendo o oligómero de alginato. Esta composição de "revestimento" (e. g. uma tinta, verniz ou laca) contendo um oligómero de alginato representa um outro aspeto da presente invenção. Alternativamente, o oligómero de alginato pode ser incorporado no material da superfície que é preparada. Esta abordagem é adequada a superfícies preparadas a partir de polímeros tais como plásticos e silicones, e. g. os dispositivos médicos descritos acima.

Uma forma de realização específica da invenção proporciona um dispositivo médico implantável compreendendo uma superfície inanimada que é revestida com um oligómero de alginato como aqui definido. A invenção será posteriormente descrita com referência aos Exemplos não limitantes que se seguem em que:

Figura 1 mostra o crescimento bacteriano em Pseudomonas biofilmes, produzidos durante a noite e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (0, 1%, 2% ou 6%) durante a noite, a 0 h, 6 h e 24 h depois de tratamento durante a noite com amicacina (4096-0 pg/mL).

Figura 2 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes de Pseudomonas, produzido durante a noite e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (0, 1%, 2% ou 6%) durante a noite, a 0 h, 6 h e 24 h depois de tratamento durante a noite com oxitetraciclina (4096-0 pg/mL).

Figura 3 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes de Pseudomonas produzidos com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (0, 1%, 2% ou 6%) durante a noite, a 0 h, 6 h e 24 h depois de tratamento durante a noite com oxitetraciclina (4096-0 pg/mL).

Figura 4 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes de Pseudomonas, produzidos com mucina (2,5 g/L) durante 6 h e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (0 ou 6%) durante a noite, a 0, 6 e 24 h depois de tratamento durante a noite com amicacina, tobramicina, oxitetraciclina ou 'amicacina + oxitetraciclina' (4096-0 pg mL_1) .

Figura 5 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes de Pseudomonas PAOl, produzido durante 6 h sem mucina e depois tratados com fragmentos G (0 ou 6%) sem mucina, a 0 h, 6 h e 24 h depois de tratamento durante a noite com amicacina (4096-0 pg/mL) ou tobramicina (1024-0 pg/ml).

Figura 6 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes de Pseudomonas PAOl, produzidos com mucina (2,5 g/L) durante 6 h e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e 'G-block #0802' (0 ou 6%) durante a noite, a 0, 6 e 24 h depois de tratamento durante a noite com amicacina (4096-0 pg ml-1) ou tobramicina (1024-0 pg rnL-1) .

Figura 7 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes da estirpe de Staphilococcus aureus ATCC 6538, produzidos com mucina (2,5 g/L) durante 6 h e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (0 ou 6 %) durante a noite, a 0, 6 e 24 h depois de tratamento durante a noite com oxitetraciclina (4096-0 pg rnL-1) .

Figura 8 mostra o crescimento bacteriano em MRSA do isolado de biofilmes de ferida '1103', produzido com mucina (2,5 g/L) durante 6 h e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (0 ou 6%) adicionados durante a noite, às 0 h, 6 h e 24 h depois do tratamento durante a noite com tobramicina (1024-0 pg/mL).

Figura 9 mostra o efeito de fragmentos G e a mucina na ligação de Candida albicans ATCC 90028 e Candida dubliniensis CD36T em biofilmes produzidos com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G a 0 ou 2% durante a noite.

Figura 10 mostra as micrografias electrónicas de biofilmes de Pseudomonas produzidas com mucina (2,5 g/L) durante 6 h e depois tratados com mucina (2,5 g/L) e fragmentos G a 0 ou 2% durante 24 h.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Materiais e Métodos Convencionais

Estirpes bacterianas

Duas estirpes da coleção de culturas Pseudomonas aeruginosa PA01 (ATCC 15682, um isolado de ferida) e Staphilococcus aureus (ATCC 6538) foram utilizados para os ensaios MBEC em paralelo com o isolado clinico de uma úlcera da perna venosa crónica, S. aureus (MRSA) '1103'. Duas estirpes do tipo Candida, C. albicans ATCC 90028 e C. dubliniensis CD36T foram utilizadas para os ensaios de ligação.

Químicos e meios bacterianos.

As colónias bacterianas foram cultivadas em agar de sangue base N°2, (BA; Labl5, LabM, Bury, UK) suplementadas com 5% de sangue de ovelha e foram utilizados para inocular o caldo de triptona de soja (TSB, CM0129, Oxoid, Basingstoke, UK) para crescimento durante a noite. Os biofilmes foram produzidos em caldo Mueller-Hinton com ajuste de catiões (CAMHB; Labll4, LabM). Todos os antibióticos utilizados foram de grau farmacêutico (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) e incluíram amicacina, oxitetraciclina e tobramicina. A glicoproteína mucina gástrica de porco (purificado por Jeff Pearson, Universidade de Newcastle) e oligómeros de alginato CF-5/20 ("fragmentos G"; 2600 Da, %G 90-95) e bloco G #0802 (6400 Da, %G 91) foram proporcionados por Algipharma AS, Sandvika, Noruega.

Ensaio de concentração mínima para erradicação do biofilme (MBEC). O método MBEC utilizado foi adaptado de Moskowitz SM, et al (2004) J Clin Microbiol 42:1915-1922. Após recuperação a partir do armazenamento a -80 °C, o isolados bacterianos foram cultivados em BA e assim cultivados durante a noite em TSB. Após diluição das culturas bacterianas a 0,5 McFarland em CAMHB com ou sem mucina (2,5 g/L), 100 pL foram transferidos para os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano. No Exemplo 3, as culturas bacterianas foram diluídas para 0,5 de McFarland em CAMHB com mucina (2,5 g/L) e alginato e 100 mL foram transferidos para os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano.

As placas foram depois envolvidas em parafilme para prevenir a desidratação e incubadas a 37 °C para permitir a formação de biofilme. Os tempos de incubação e condições variadas como a seguir descrito.

Após a formação do biofilme, as células planctónicas e os sobrenadantes foram removidos e cada poço foi então lavado com salino tamponado com fosfato estéril (PBS) . Após lavagem, as células foram tratadas com combinações de alginatos e/ou antibióticos com ou sem mucina (2,5 g/L) em 100 pL de CAMHB. As placas foram depois envolvidas em parafilme e incubadas a 37 °C com inclinação suave. Os tempos de incubação e condições variaram como descrito a seguir. Os antibióticos e intervalos de concentração utilizados são a seguir apresentados.

Os poços foram lavados com PBS e 100 mL de cada concentração de uma diluição seriada de antibiótico em CAMHB foram então adicionados em duplicado. As placas foram de novo envolvidas em parafilme e incubadas a 37 °C com inclinação suave durante a noite.

Em todos os ensaios MBEC o número final de células foi avaliado como se segue. Os poços foram lavados com PBS e os biofilmes ressuspensos em 100 mL de CAMHB por pipetagem vigorosa. A densidade ótica a 620 nm (OD620) foi medida num leito de microplacas (FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) imediatamente (0 h) e após incubação a 37 °C a 6 h e 24 h. O valor MBEC é a concentração de antibiótico gue inibe todo o crescimento de bactérias na amostra de teste. O crescimento bacteriano é medido por um aumento na absorvência da amostra. Deste modo, a redução no valor de MBEC é uma indicação de que a sensibilidade da amostra para o antibiótico foi aumentada (i. e. menos antibiótico é necessário para prevenir o crescimento bacteriano).

Antibióticos e intervalos de concentração utilizados.

Ensaio concentração minima de erradicação de biofilme erradicação (MBEC) sem mucina.

Pseudomonas aeruginosa PAOl (ATCC 15682) foi utilizada para determinar os valores MBEC sem a adição de mucina. O protocolo de MBEC foi seguido como descrito acima, mas sem a adição de mucina ao meio de crescimento. Dois antibióticos, amicacina e tobramicina foram testados.

Ensaios de ligação de levedura 0 ensaio de ligação utilizado foi adaptado a partir de Djordjevic et al., (2002) Appl Environ Microbiol 68:2950-2958. C. albicans ATCC 90028 e C. dubliniensis CD36T foram as estirpes de Candida utilizadas para os ensaios de ligação. As Candida foram cultivadas em agar de dextrose de Sabourauds (Lab33, LabM) e durante a noite os caldos de cultura foram cultivados em meio liquido de Sabouraud (Lab9, LabM). Após adição de 5 mL de cultura durante a noite, 95 mL de CAMHB com adição de mucina (2,5 g/L) e fragmentos G (nas concentrações de 0, 2%, 6% ou 10%) foram adicionados aos poços. As placas foram envolvidas em parafilme e incubadas a 37 °C durante a noite para permitir a formação de biofilme.

As células planctónicas e o sobrenadante foi removido dos poços antes da lavagem dos biofilmes resultantes (3x) com dH20 estéril. As placas foram depois secas a 56 °C durante 45 min. Cada poço foi depois corado com 150 μΐ de 1% (v/v) de violeta de cristal (em água) durante 45 min. As placas foram de novo lavadas (3x) com dH20, antes da adição de 200 μΐ de 95% de etanol. Após 5 min., 100 μΐ de cada poço foram transferidos para uma nova placa de microtitulação. A OD foi então medida num leitor de placas a 540 nm.

Crescimento de biofilmes para imagiologia

Após recuperação do armazenamento a -80 °C, os isolados bacterianos foram cultivados em BA e depois cultivados durante a noite em TSB. Após diluição das culturas bacterianas para 0,5 de McFarland em CAMHB com mucina (2,5 g/1), 100 μΐ foram transferidos para os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano. As placas foram então envolvidas em parafilme para prevenir a desidratação e incubadas a 37°C durante 6 h para permitir a formação de biofilme. Após formação de biofilme, as células planctónicas e o sobrenadante foram removidos e cada poço foi depois lavado com salino tamponado com fosfato estéril (PBS). Após lavagem, as células foram tratadas com fragmentos G e mucina (2,5 g/1) em 100 μΐ de CAMHB. As placas foram depois envolvidas em parafilme e incubadas a 37 °C durante 24 h com inclinação suave.

Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM) de biofilmes de Pseudomonas. O glutaraldeído (2%) foi adicionado aos biofilmes tratados com fragmentos G e fixado à temperatura ambiente durante 24 horas. As amostras foram desidratadas numa série graduada de concentrações de etanol, secas num secador de ponto crítico (Balzers CPD 030, Alemanha), montados em tubos de alumínio, revestidos com ouro num pulverizador (EMscope model AE 1231, UK) , e depois visualizados num microscópio electrónico de varrimento (FEI-Philips XL-20, Holanda).

Microscopia confocal de biofilmes não perturbados utilizando BODIPY® 630/650-X SE

Os biofilmes tratados com fragmento G foram lavados com água destilada estéril e corados com o corante BODIPY® 630/650-X SE (BODIPY® 630/650-X SE, Invitrogen Ltd) que cora seletivamente os componentes da matriz (EPS) em biofilmes de Pseudomonas.

Foi adicionado BODIPY® 630/650-X SE (100 μΐ (10 mg/ml)) a cada amostra de biofilme. A preparação foi incubada no escuro durante 1 hora e depois analisada por CLSM.

Exemplo 2 - Medição de valores MBEC para biofilmes de Pseudomonas aeruginosa durante a noite pré-tratadas com fragmentos G O ensaio MBEC descrito acima foi seguido. Os biofilmes foram produzidos em placas durante a noite sem mucina. Depois de uma lavagem com PBS, os biofilmes foram incubados com 0, 1, 2 ou 6% de fragmentos G e mucina durante a noite. Após lavagem com PBS as células foram incubadas durante a noite com antibióticos (amicacina ou oxitetraciclina) e sem mucina. Os resultados são apresentados graficamente nas Figuras 1 e 2 e tabulados nas Tabelas 2 e 3 a seguir. Como pode ser observado, o pré-tratamento durante a noite do biofilme com fragmentos G causa reduções em 6 h e 24 h dos valores MBEC para a amicacina ou oxitetraciclina. Os valores MBEC para a amicacina e oxitetraciclina às 6 h foram diminuídos para metade por fragmentos G a 1% e para um guarto por fragmentos G a 2 e 6%. Os valores MBEC às 24 h para oxitetraciclina foram diminuídos para metade por todas as concentrações de fragmentos G. Os valores MBEC às 24 h para amicacina foram reduzidos embora não fosse possível guantificar esta redução. Isto indica gue um pré-tratamento durante a noite com fragmentos G aumenta a sensibilidade da Pseudomonas aeruginosa em biofilmes a estes antibióticos.

Tabela 2 - Sumário dos valores MBEC às 6 horas após exposição durante a noite a antibiótico. Biofilmes de Pseudomonas produzidos durante a noite. Mucina (2,5 g/L) e fragmentos G a 0, 1%, 2% ou 6% foram adicionados a biofilmes estabelecidos. Valores expressos como pg/mL de antibiótico

Tabela 3 - Sumário dos valores MBEC às 24 horas após exposição durante a noite a antibiótico. Biofilmes de Pseudomonas produzidos durante a noite. Mucina (2,5 g/L) e fragmentos G a 0, 1%, 2% ou 6% foram adicionados a biofilmes estabelecidos. Valores expressos como pg/mL de antibiótico.

Chave

Exemplo 3 - Medição de valores MBEC para biofilmes de Pseudomonas aeruginosa produzidos na presença de fragmentos G 0 ensaio MBEC descrito acima foi seguido. Os biofilmes foram produzidos em placas durante a noite na presença de mucina e 0, 1, 2 ou 6% de fragmentos G. Após lavagem, os biofilmes foram expostos a oxitetraciclina (sem mucina) durante a noite. Os resultados são apresentados graficamente na Figura 3 e tabulados nas Tabelas 4 e 5 a seguir. Como pode ser observado, em todas as concentrações de fragmentos G testadas, os biofilmes produzidos na presença de fragmentos G diminuíram para metade os valores MBEC às 24 h. os valores MBEC às 6 h foram diminuídos para metade quando foram utilizados fragmentos G a 2% e 6%. Os fragmentos G a 1% falharam na redução. Estes dados mostram que Pseudomonas aeruginosa em biofilmes produzidos na presença de fragmentos G são mais suscetíveis a oxitetraciclina do que Pseudomonas aeruginosa em biofilmes produzidos na ausência de fragmentos G.

Tabela 4 - Sumário dos valores MBEC às 6 horas após exposição durante a noite a antibiótico. Biofilmes de Pseudomonas produzidos durante a noite. Mucina (2,5 g/L) e fragmentos G a 0, 1%, 2% ou 6% foram adicionados a biofilmes estabelecidos. Valores expressos como pg/mL de antibiótico.

Tabela 5 - Sumário dos valores MBEC às 6 horas após exposição durante a noite a antibiótico. Biofilmes de Pseudomonas produzidos durante a noite. Mucina (2,5 g/L) e fragmentos G a 0, 1%, 2% ou 6% foram adicionados a biofilmes estabelecidos. Valores expressos como pg/mL de antibiótico.

Chave

Exemplo 4- Medição dos valores MBEC para biofilmes de Pseudomonas aeruginosa produzidos durante 6 h e pré-tratadas com fragmentos G 0 ensaio MBEC descrito acima foi seguido com mucina presente. Os biofilmes foram produzidos na presença de mucina durante 6 horas de incubação, lavados e incubados com fragmentos G e mucina durante a noite. Após lavagem com PBS as culturas foram expostas a antibióticos (amicacina, tobramicina, oxitetraciclina ou uma combinação de amicacina e oxitetraciclina) sem mucina. Os resultados são apresentados graficamente na Figura 4 e na forma tabulada nas Tabelas 6 e 7. Como pode ser observado, o pré-tratamento de biofilmes às 6 h com fragmentos G a 6% causaram os valores MBEC às 6 para todos os antibióticos testados para pelo menos um quarto, i.e. a sensibilidade de Pseudomonas aeruginosa nestes biofilmes a estes antibióticos foi pelo menos quadruplicada. De facto, os fragmentos G a 6% provocam às 6 h a descida do valor MBEC para oxitetraciclina para 1/8 do valor de controlo. Os valores MBEC às 24 h para amicacina e tobramicina foram diminuídos para metade. 0 valor MBEC às 24 h para oxitetraciclina e a mistura amicacina/oxitetraciclina não apresentou alterações nos valores MBEC.

Tabela 6 - Sumário dos valores MBEC às 6 h após exposição durante a noite a antibiótico. Biofilmes de Pseudomonas produzidos em meio com mucina adicionada durante 6 h, expostos a fragmentos G a 0 ou 6% durante a noite e depois expostos a antibióticos. Valores expressos como pg mL_1 de antibiótico.

Tabela 7 - Sumário dos valores MBEC às 24 h após exposição durante a noite a antibiótico. Biofilmes de Pseudomonas produzidos em meio com mucina adicionada durante 6 h, expostos a fragmentos G a 0 ou 6% durante a noite e depois expostos a antibióticos. Valores expressos como pg/mL de antibiótico.

Chave

Exemplo 5 - Medição de valores MBEC para biofilmes de Pseudomonas aeruginosa produzidos durante 6 h sem mucina e pré-tratadas com fragmentos G sem mucina 0 protocolo do Exemplo 4 foi repetido utilizando tobramicina e amicacina mas sem a adição de mucina. Os resultados são apresentados na Figura 5. Como pode ser observado, na ausência de mucina os fragmentos G foram ainda capazes de diminuir para metade os valores MBEC em todos menos os valores MBEC às 24 h para amicacina. Isto é uma indicação de que a mucina não desempenha um papel significativo nos efeitos observados nos Exemplos acima.

Exemplo 6 - Medição dos valores MBEC para biofilmes de Pseudomonas aeruginosa produzidos durante 6 h e pré-tratadas com um oligómero de alginato diferente 0 ensaio MBEC descrito no Exemplo 4 foi repetido com um oligómero de alginato alternativo, bloco G (#0802) (6400 MW, em comparação com fragmentos G CF-5/20, 2600 MW) e utilizando tobramicina e amicacina. O valor MBEC às 24 h para amicacina é diminuído para um quarto por pré-tratamento do biofilme com bloco G a 6% (#0802) . O mesmo tratamento resultou na diminuição para metade do valor MBEC às 24 h para a tobramicina. Estes dados mostram que um outro oligómero de alginato pode estimular um aumento na sensibilidade de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa PA01 a tobramicina e amicacina.

Exemplo 7 - Medição de valores MBEC para biofilmes às 6 h contendo outras bactérias pré-tratadas com fragmentos G O efeito de fragmentos G em biofilmes de Staphilococcus aureus foi investigado utilizando o ensaio MBEC descrito no Exemplo 4 e oxitetraciclina. Como pode ser observado na Figura 7, pré-tratamento de biofilmes contendo S. aureus ATCC 6538 com fragmentos G a 6% diminuído para metade os valores MBEC às 6 e 24 h para oxitetraciclina.

Como pode ser observado na Figura 8, o pré-tratamento de biofilmes contendo o MRSA isolado de ferida '1103' com fragmentos G a 6% diminuídos para metade o valor MBEC às 24 h para a tobramicina. Estes dados mostram que outras bactérias encontradas normalmente em biofilmes, podem ser tornados mais susceptíveis a oxitetraciclina e tobramicina por pré-tratamento desses biofilmes com fragmentos G.

Exemplo 8-0 efeitos dos fragmentos G na ligação de leveduras em biofilme 0 efeito dos fragmentos G na ligação de Candida albicans e Candida dubliniensis em biofilme foi investigada utilizando o ensaio de ligação descrito acima. Uma diminuição na ligação de ambas as espécies de Candida foi observada quando os biofilmes contendo estas leveduras foram formadas na presença de fragmentos G a 2% e mucina em comparação com o controlo com apenas mucina. (Figura 9) . Estes dados mostram que os fragmentos G podem afetar a ligação das células de levedura no desenvolvimento de biofilmes.

Exemplo 9 - Análise microscópica da estrutura do biofilme de Pseudomonas e efeitos dos fragmentos G A estrutura geral dos biofilmes de Pseudomonas foi seguida utilizando Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM). A Figura 10 mostra o efeito de fragmentos G a 2% na estrutura de biofilme. O polissacárido extracelular (EPS) que reveste as superfícies celulares parece ser interrompido com fragmentos G a 2%.

Exemplo 10- Análise microscópica da estrutura do biofilme de Pseudomonas e efeitos de fragmentos G 0 efeito de fragmentos G na estrutura da matriz do biofilme de Pseudomonas foi investigado utilizando microscopia confocal de biofilmes não perturbados marcados com o corante fluorescente BODIPY® 630/650-X SE. Este corante cora seletivamente os componentes da matriz (EPS) em biofilmes de Pseudomonas. A ligeira fragmentação da matriz do biofilme foi aparente com uma crescente concentração de fragmentos G quando comparado com o controlo de 'apenas mucina' .

Exemplo 11 - Composição tópica compreendendo oligómero de alginato

Um exemplo de uma composição tópica (uma loção corporal hidratante para a pele) compreendendo um oligómero de alginato é preparado com os ingredientes que se seguem.

Fase óleo:

Fase aquosa:

Exemplo 12 - Composição de desbridação compreendendo oligómero de alginato

Um exemplo de uma composição de desbridação líquida compreendendo um oligómero de alginato é preparada com os seguintes ingredientes.

Claims (18)

REIVINIDCAÇÕES

1. Método para combater biofilme que não está em ou no corpo de um animal humano ou não humano, compreendendo o referido método o contacto do referido biofilme com um oligómero de alginato, em que o oligómero de alginato tem pelo menos 70% resíduos G.

2. Método da reivindicação 1, em que o referido biofilme está numa superfície inanimada.

3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o biofilme está numa superfície seleccionada a partir de superfícies de processamento de alimentos ou bebidas, preparação, maquinaria ou equipamento de armazenamento ou distribuição, superfícies de equipamento de ar condicionado, superfícies de maquinaria industrial, superfícies de tanques de armazenamento, superfícies equipamento médico ou cirúrgico, superfícies de equipamento aquático/marinho ou as superfícies de edifícios e outras estruturas, e preferencialmente em que a superfície é seleccionada a partir de processamento de alimentos, armazenamento, equipamento ou superfícies de distribuição ou preparação, tanques, transportadores, chão, escoadores, arrefecimentos, congeladores, superfícies de equipamento, paredes, válvulas, correias, tubagem, condutas de ar condicionado, equipamento de arrefecimento, linhas de distribuição de alimentos ou bebidas, trocadores de calor, cascos de barco, linhas de água dentárias, condutas de perfuração de petróleo, lentes de contacto, caixas de armazenamento de lentes de contacto, cateteres, dispositivos prostéticos ou dispositivos médicos implantáveis.

4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o oligómero de alginato (i) tem um peso molecular médio inferior a 35 000 Daltons, preferencialmente inferior a 30 000, 25 000 ou 20 000 Daltons; (ii) tem um número médio de grau de polimerização de 2 a 100, preferencialmente 2 a 75, 2 a 50, 2 a 35, ou 2 a 30 ; (iii) é um 3- a 35-mero, 3- a 28-mero, 4- a 25-mero, 6- a 22-mero, 8- a 20-mero, ou 10- a 15-mero; (iv) tem pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de resíduos G; e/ou (v) tem uma estrutura primária em que pelo menos 90% dos resíduos G são ligados 1-4 a outro resíduo G.

5. Oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme presente num indivíduo, em que o oligómero de alginato tem pelo menos 70% de resíduos G.

6. Utilização de um oligómero de alginato na preparação de um medicamento para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme presente num indivíduo em que o oligómero de alginato tem pelo menos 70% de resíduos G.

7. Oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme da reivindicação 5 ou na utilização da reivindicação 6 em que o oligómero de alginato (i) tem um peso molecular médio inferior a 35 000 Daltons, preferencialmente inferior a 30 000, 25 000 ou 20 000 Daltons; (ii) tem um número médio de grau de polimerização de 2 a 100, preferencialmente 2 a 75, 2 a 50, 2 a 35, ou 2 a 30; (iii) é um 3- a 35-mero, 3- a 28-mero, 4- a 25-mero, 6- a 22-mero, 8- a 20-mero, ou 10- a 15-mero; (iv) tem pelo menos 80, 85, 90 ou 95% resíduos G; e/ou (v) tem uma estrutura primária em que pelo menos 90% dos resíduos G são ligados 1-4 a outro resíduo G.

8. O oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme ou utilização de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que o biofilme está na ou à superfície interna ou externa do corpo, e preferencialmente em que a superfície interna ou externa do corpo é seleccionada a partir de uma superfície na cavidade oral, do trato reprodutivo, do trato urinário, do trato respiratório, do trato gastrointestinal, do peritoneu, do ouvido médio, da próstata, da íntima vascular, conjuntivo, tecido da córnea, tecido do pulmão, válvulas cardíacas, pele, escalpe, unhas ou interior das feridas.

9. 0 oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme ou utilização de qualquer uma das reivindicações 5 a 8 em que o indivíduo é um indivíduo seleccionado a partir de um indivíduo com uma infeção pré-estabelecida, um indivíduo imunocomprometida, um indivíduo sob cuidado intensivo ou crítico, um indivíduo que sofreu trauma, um indivíduo com uma queimadura, um indivíduo com uma ferida aguda e/ou crónica, um indivíduo neonatal, um indivíduo idoso, um indivíduo com cancro, um indivíduo que sofre de uma condição autoimunitária, um indivíduo com secreção epitelial ou endotelial reduzida ou eliminada e/ou eliminação da secreção ou um indivíduo equipado com um dispositivo médico, e preferencialmente em que o indivíduo é selecionado a partir de um indivíduo com uma condição seleccionada a partir de HIV, sepsia, choque séptico, SIDA, um cancro do sistema imunitário, artrite reumatóide, diabetes mellitus tipo I, doença de Crohn, COPD, bronquite, fibrose cística, enfisema, cancro do pulmão, asma, pneumonia e sinusite, um indivíduo em preparação para, a sofrer, ou a recuperar a partir de uma quimioterapia e/ou radioterapia, um indivíduo em transplante de órgãos, um indivíduo residente numa instituição de cuidados de saúde ou um fumador.

10. Oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme ou utilização como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 5 a 9 em que o referido oligómero de alginato é utilizado para tratar a infeção por biofilme em feridas e/ou queimaduras ou num dispositivo médico interno.

11. Oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme ou utilização como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 5 a 10 em que o oligómero de alginato é utilizado no tratamento de placa dentária, gengivite, periodontite, endocardite da válvula nativa, otite média aguda, prostatite bacteriana crónica, pneumonia, asma ou infeção relacionada com dispositivo associado com dispositivo médicos implantáveis e/ou prostéticos ou substituições de tecido.

12. Método, oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme ou utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o referido oligómero de alginato é utilizado em combinação com um agente antimicrobiano, e preferencialmente em que o agente microbiano é um antibiótico ou um agente antifúngico ou um antisséptico, desinfetante, gente de esterilização ou limpeza.

13. Método, oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme ou utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o oligómero de alginato é utilizado em combinação com pelo menos um outro agente de rotura de biofilme e/ou agente de redução de viscosidade de mucosa, preferencialmente seleccionado a partir de proteases, nucleases, lipases, enzimas capazes de degradação de polissacáridos, gelsolina, agente de redução de tióis, uma acetilcisteina, cloreto de sódio, ou um ácido poliaminoácido aniónico, e um óxido nítrico ou estimulador de síntese, e particularmente em que o referido oligómero de alginato é utilizado em combinação com uma liase de alginato e/ou uma enzima DNase.

14. Método, oligómero de alginato para utilização no tratamento de uma infeção por biofilme, ou utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o referido oligómero de alginato é utilizado em combinação com um outro agente terapeuticamente ativo, preferencialmente um agente imunoestimulador, um fator de crescimento ou um agente anti-inflamatório.

15. Produto contendo um oligómero de alginato como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 7 e um segundo agente ativo como uma preparação combinada para utilização separada, simultânea ou sequencial no tratamento de infeção por biofilme presente num indivíduo, preferencialmente em que o agente ativo é como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 14.

16. Produto da reivindicação 15 na forma de uma solução salina hipertónica, uma solução inalável, um pó inalável, um spray nasal, uma composição de desbridação, uma composição tópica, uma pasta de dentes ou uma lavagem da boca.

17. Dispositivo médico implantável compreendendo uma superfície inanimada que é revestida com um oligómero de alginato como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 7.

18. Solução de desbridação de ferida aquosa estéril ou uma solução de desbridação de ferida à base de óleo estéril contendo um oligómero de alginato como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 7 e contendo ainda pelo menos uma enzima proteolítica e/ou pelo menos uma fase sólida abrasiva, em que a referida composição é uma solução aquosa estéril ou uma solução estéril à base de óleo.