KR100322511B1 - 알긴산 올리고당 유도체를 이용한 적조소멸제 및 어병치료제 - Google Patents

알긴산 올리고당 유도체를 이용한 적조소멸제 및 어병치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알긴산 올리고당 유도체를 이용한 적조소멸제 및 어병치료제에 관한 것으로, 알긴산을 가수분해시켜 제조된, 당체수가 1 내지 16이고 분자량 범위가 192 내지 3072인 알긴산 올리고당 유도체(alginate polygalacturonite oligomer derivative)를 유효성분으로 하는 적조소멸제 및 어병치료제는, 천연고분자 물질인 알긴산으로부터 적조소멸 또는 적조생물사멸 효과 뿐 아니라 어병세균에 대한 항균효과 및 어류기생출 사멸 효과가 뛰어날 알긴산 올리고당 유도체로 제조한 것으로 적조소멸제 또는 적조생물사멸제로 사용할 수 있고, 또한 어병세균에 대한 항균제 또는 어류기생충 제제로도 사용할 수 있다.

Description

알긴산 올리고당 유도체를 이용한 적조소멸제 및 어병치료제{RED TIDE REMOVER AND REMEDY FOR DISEASE OF FISHES USING ALGINATE POLYGALACTURONITE OLIGOMER DERIVATIVES}
본 발명은 알긴산 올리고당 유도체를 이용한 적조소멸제 및 어병치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연 고분자 물질인 알긴산을 가수분해시켜 제조된 적조생물사멸 효과와 어병치료 효과를 갖는 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 적조소멸제 및 어병치료제에 관한 것이다.
알긴산과 알긴산-올리고당 제조에 관한 연구 동향을 살펴 보면, 화학적인 방법 및 아르기나제 효소를 이용하여 알긴산으로부터 알긴산-올리고당을 제조하는 방법이 1976년에 알려진 후 제조 부분은 많은 진척이 있었으나, 활용성 부분 연구는 미진하여 최근에야 항균 효과와 관련된 적용 가능성이 제시되고 있는 정도이다. 즉, 알긴산 및 알긴산-올리고당의 분리 및 정제를 위한 표준 생산법은 아직 확립되어 있지 않고 이들의 기능성 부분에 대한 연구는 미진한 상황이다.
최근 알긴산을 이용한 산업화를 시도한 외국의 한 예로서는 "치어용 양어사료의 점도"를 높이기 위해 적용한 경우(일본 공개특허공보 소60-199353, 穉魚用飼料)를 들 수 있다. 여기에서는, 양이온성 물질과 음이온성 수용성 고분자물질을 반응시켜 만든 불용성 물질로 치어의 영양물을 포매하여 직경 0.1∼3 mm의 과립이나 펠렛을 만들어 치어용 사료로 사용하고 있다. 이 사료를 이용한 경우, 장어나 넙치 치어의 성장률이 보통 사료를 사용한 것 보다 약 1.4 배까지 증가하여, 일간산의 가축 사료 및 인간 식품 첨가물로의 가능성을 제시하였다.
알긴산을 이용한 어류에서의 항균성 부분에 적용된 보고를 살펴보면, [Skjermoet al., Immunostimulation of juvenile turbot(Scophthalmus maximus L.) using an alginate with high mannuronic acid content administered via the live food organism Artemia.Fish and Shellfish Immunology, 5(7): 531-534, 13ref, 1995], 치어 먹이인 알테미어에 알긴산을 첨가하여 장기간 경구투여한 후 비브리오 균(Vibrio anguillarum)을 인공감염시켰을 때 생존률이 증가하였는데, 이는 알긴산이 어류 체내의 면역시스템을 촉발한 경우인 것으로 발표되어 있어 항균성에 대한 적용부분이 그 용도로서 확대될 수 있음을 시사하고 있다.
또한, 최근에 북어문(北御門) 등은 두 종류의 비브리오 균(Vibriospp.)으로 부터 분리한 효소를 이용하여 폴리마누레이트(polymannurate) 및 폴리글루네이트 (polygluronate)에 반응시켜 제조한 알긴산 올리고당을 가지고 항균 실험을 한 결과, 일부 일반 세균과 장내 세균에 대하여 정균작용을 약간 보였다는 보고를 한 바 있다.
현재 어류의 대량 폐사에 관련된 주요 기생충은 스쿠티카충으로, 그 감염시 구제 방법으로는 포르말린, 과산화수소 및 담수 처리에 의한 방법(최 등, 남해 양식산 넙치 치어에 기생한 스쿠티카 섬모충(Scuticociliatids) 동태 및 구제에 관하여.한국어병학회지, 10(1): 21-29, 1997) 이외에는 뚜렷한 처리 방법이 없는 실정이다.
스쿠티카 섬모충(Scuticociliatids)은 어체의 표피 혹은 체내에 기생하는 원생섬모충으로서 1985년경에 그 발생이 보고된 이래, 1988년 이후 국·내외적으로 어류 양식장에서 대량 폐사를 일으키는 대표적인 기생충으로 알려져 있다(乙竹 充등, ヒラメParalichthys olivaceus穉魚のスク-チカ纖毛蟲(膜口類)症,養殖年報, 9: 65-68, 1986).
이 스쿠티카 섬모충은 길이 20-45 ㎛로서 럭비공 모양이며 충체 가장자리는 섬모로서 활발하게 움직이는 특징을 가지고 있다. 이 충에 감염되면, 어류는 먹이섭취가 불량해지고 체색은 전체적으로 흑화 현상을 나타내는데, 감염이 심한 경우는 표피의 부분적인 백화, 체표, 지느러미 및 아가미 안쪽의 발적과 부식, 아가미 빈혈 등이 나타난다고 보고되고 있다(Fischthal, J. H., Aperitrichous protozoan, on hatchery book about Prog. Fish-oult, 11: 122-124, 1949). 또한, 이들은 병어의 지느러미 체표 비늘과 진피 아래의 결합조직, 뇌 등에 높은 밀도로 침입하고 있어 현미경 관찰로도 쉽게 관찰된다.
최근에는 리(Lee) 등에 의해서, 스쿠티카 섬모충에 오염된 어류 체내에서 스쿠티카 섬모충의 분포는 혈관, 신경 조직, 피하 표피 조직 및 척추강과 아가미 조직에 이르며, 이들 스쿠티카 섬모충에 의해 광범위한 조직 손상 피해가 야기된다는 사실이 발표되었다(Histopathological changes in fingerlings of Japanessflounder,Paralichthys olivaceus, with severeScuticociliatosis.J. Fish Pathol., 7(1): 151-160, 1994).
현재 해산어에 출현하여 대량폐사를 유발하는 세균, 곰팡이, 바이러스 및 기생충의 감염 예방 및 구제용으로 사용되는 수산용 약품으로는 설파모노메톡신 (sulfamonomethoxine sodium), 설파다이메톡신(sulfadimethoxine sodium), 설피소졸(sulfisozol), 설파메라진(sulfamerazine) 등의 설파제, 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline HCl), 테트라사이클린(tetracycline), 클로로테트라사이클린 (chlorotetracycline HCl), 암피실린(ampicillin trihydrate), 아목시실린 (amoxyllin trihydrate), 독시사이클린(doxycycline hydrate), 에리스로마이신 (erythromycine thiocyanate), 스피라마이신(spiramycine enbonate), 키타사마이신 (kitasamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 등의 항생물질, 그리고 이들의 복합 항균제인 옥소린산(oxolinic acid), 훌루메퀸(flumequine), 피로미딕산 (piromidic acid), 날리딕산(nalidinic acid) 등의 화학요법제, 엘바쥬 (nifurstyrenate sodium)의 니트로후란제, 비티놀(bithinol), 트리클로로폰 (trichlorofon)과 같은 구살충제가 있다.
이들 약품을 이용하여 자체 성질 및 필요에 따라 약욕 및 경구 방식으로 일정량을 투여하여 넙치의 플렉시박터 균주(Flexibacter maritimus)에 의한 부식병 및 활주세균증, 비브리오 균주(Vibrio anguillarum)에 의한 비브리오병, 연쇄구균 (Streptococcusspp.)에 의한 연쇄구균증, 에드워드 균주(Edwardsiella tarda)에 의한 복부팽만 및 탈장증세를 일으키는 에드워드증, 비브리오 균주(Vibriosp.)에의한 장관백탁증, 트리코디나(Trichodina), 막구류(Hymenostoniata) 등의 섬모충류에 의한 상피세포 붕괴를 유발시키는 질병, 그리고 이크치오포누스 호페리 (Ichtyophonus hoferi)와 같은 원충류에 의한 질병들을 치료하고 있다.
또한 돔류, 방어, 조피볼락, 농어 등 대표적인 양식어류에도 이와 동일 또는 유사한 질병들이 만연하고 있으며, 결국 합병증세를 나타내고 대량폐사를 일으켜 막대한 경제적 손실이 발생한다. 대부분의 해산어의 어병 구제에는 상기 언급한 약제들을 사용하고 있으며 바이러스 또는 일부 기생충과 같은 병원체에 대해서는 포르말린, 수온 조절 및 담수약욕 등 극단적인 방법을 사용하고 있으나, 특별한 완전 방제 대책이 현재까지 수립되지 않고 있다.
여기에서, 근본적으로 중요한 것은 발병 원인 병원체의 정확한 규명 없이 약제를 오남용할 경우나 예방을 위해 소량의 약제를 계속해서 투약할 경우, 새로운 내성균 출현이 초래되고 이에 따른 사용량 증가로 인한 양식경비 상승은 물론 어체내 잔류성 문제로 소비자인 국민의 건강에 심각한 위험을 가져올 수 있다는 점이 다. 또한 양식현장에서 다발하며 대량폐사를 일으키는 스쿠티카증의 유일한 초보적인 치료수단으로 상용되고 있는 포르말린액은 환경 규제물질이기 때문에 최소량으로 사용되어야 하며, 이를 이용한 치료목적의 약욕처리를 할 경우 약제를 포함하고 있는 대량의 양식수가 바다로 유입되므로 양식장 주위의 환경 파괴 가능성을 무시할 수 없게 된다.
한편, 적조방제를 위해서 현재 사용되고 있는 것은 황토 살포 방법으로, 육상의 황토를 비축하였다가 적조가 발생했을 때 배를 이용하여 황토를 물과 섞어 바다로 뿌려 적조생물을 침전시키는 방법이다. 그러나, 이러한 황토 살포 방법을 계속 사용할 경우 육상에서는 황토개발에 따른 비용 및 환경 파괴 문제가 발생하며, 또한 바다로 계속 황토를 유입시킬 경우 바다의 저질상을 변화시켜 저서생물의 천이 등 생태계의 변화를 유발할 가능성도 있게 된다. 적조생물 방제를 위해 황토 이외에 개발된 제품(세균 혹은 약품)은 매우 미미한 실정에 있으며, 아직까지 현장에 적용되지 않고 있는 실정이다.
본 발명은 이상에서 언급한 문제점들을 해소하기 위한 것으로, 알긴산의 물성을 효과적으로 조절함으로써 생태계를 교란하는 등의 환경문제를 유발하지 않으면서 적조생물을 사멸시켜 적조를 소멸시킬 수 있는 적조소멸제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 알긴산 물성을 효과적으로 조절하여 어병세균에 대한 항균제를 제공하고, 동일한 물질을 이용한 어병기생충 제제를 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 알긴산을 가수분해시켜 제조된, 당체수가 1 내지 16이고 분자량 범위가 192 내지 3072인 알긴산 올리고당 유도체(alginate polygalacturonite oligomer derivative)를 유효성분으로 하는 적조소멸제를 제공한다.
여기에서 알긴산은 다시마 등의 해조류로부터 추출할 수 있으며, 알긴산을가수분해하는 방법으로는 20 내지 100 ℃의 산성 용액 또는 알카리 용액에 알긴산을 투입한 다음 교반하여 가수분해시키는 방법이나, 아르기나제 효소를 이용하여 알긴산을 가수분해할 때는 pH를 8 내지 10 범위 내로 하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000 이하인 알긴산을 적조소멸제로 사용할 수 있다. 이때, 알긴산과 알긴산 올리고당 유도체는, 양물질의 혼합물에서 알긴산 올리고당 유도체 함유량이 60 % 이상으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 어병세균에 대한 항균제는, 알긴산을 가수분해시켜 제조된 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 한다.
여기에서도, 알긴산 올리고당 유도체를 적조소멸제로 사용하는 경우와 마찬가지로, 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000 이하인 알긴산을 어병세균에 대한 항균제로 사용할 수 있고, 양물질의 혼합물에서 알긴산 올리고당 유도체 함유량이 60 % 이상으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 어류기생충 제제는, 알긴산을 가수분해시켜 제조된 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 한다.
이 경우에도 어병세균에 대한 항균제의 경우와 마찬가지로, 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000 이하인 알긴산을 어류기생충 제제로 사용할 수 있고, 양물질의 혼합물에서 알긴산 올리고당 유도체 함유량이 60 % 이상인 것이 바람직하다.
이와 같이, 본 발명에 따른 알긴산 올리고당 유도체는 적조생물을 사멸시켜적조를 소멸시키는 한편, 어병세균에 대하여도 항균효과를 발휘하여 어병의 치료제로서 사용할 수 있으며, 어류기생충을 사멸시키는 효과도 있다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 실시예와 효과 시험예를 통하여 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 전체에서 분자량 감소를 나타내는 수치인 점도는 브룩필드 점도계(미국)를 사용하여 100 rpm으로 측정하였고, 측정시 사용하는 알긴산 유도체 용액은 600 ㎖가 되도록 3차 탈이온수 용액에 0.5 %(w/w) 알긴산을 완전 용해시켜 기포가 제거된 후 25 ℃ 조건에서 측정하였으며, 측정간 측정 스핀들은 1∼4 번을 사용하여 측정하였다.
그리고, 최초 사용된 알긴산의 순도를 확인하기 위한 총 우로닌산(uronic acid) 함량 측정은 하우그(Haug)와 라르센(Larsen)(Haug, A. and B. Larsen, Quantitive determination of the uronic acid composition of alginate,Acta. Chem. Scand., 16, 1908-1918, 1962)의 표준 가수 분해 방법에 의해 실시하였다.
화학적 가수분해와 효소에 의한 가수분해에 의한 시간별 분자량 변화에 대한 분자량 분포도 분석은 GPC(gel permeation chromatography) 분석 시스템(JASCO, Model LC-90, Jasco Co., 일본)를 이용하였는데 분석조건은 다음과 같다.
① 장치
시스템: JASCO GPC, Model (LCSS-905)
펌프: PU-980
검출기: RI-930
주입기: Rheodyne 7125
오븐: CO-965
② 조건
컬럼: Asahipak GS-220 HQ+GS-320 HQ+ GS-520HQ+GS-620HQ(7.6mm IDx300mm L)
이동상: 탈이온수에 0.1 M NaCl 첨가용액을 사용
유속: 1 ㎖/분
컬럼 온도: 40 ℃
주입량: 200 ㎕
③ 샘플분석
MW Maker: Pullulan (MW 853000, 95400, 23700, 5800), 키토산-올리고당(MW 322.32, 483, 706, 876)
알긴산 올리고당 유도체: 0.1 %(m/v) 용액(0.45 ㎕ 멤브레인 여과후 사용)
또한, 각 pH 값은 100 ㎖ 탈이온수에 1 g의 제조된 등급화별 알긴산 올리고당 유도체를 투여하고 교반한 다음 충분히 용해되었을 때 pH 미터로 측정한 것이고, 전체 알긴산 계열 유도체의 pH 범위는 6.94∼7.5 였다.
실시예 1. 알긴산의 추출
본 발명과 관련한 알긴산 올리고당 유도체를 제조하기 위하여 기초 물질로 사용되는 알긴산은 다음과 같이 추출, 정제하였다: 먼저, 일반 채취되는 다시마를 미세하게 분쇄한 후 이를 자연건조 하였다. 건조된 다시마 분말로부터 다시마가 가지고 있는 요오드를 제거한 알긴산과 요오드가 제거되지 않은 알긴산을 제조하였다. 즉, 속슬렛(Soxhlet) 추출장치에서 아세톤 등의 유기용매를 사용하여 요오드를 추출한 후, 잔류 다시마 분말을 NaHCO3용액으로 추출하여 해조류가 보유하고 있는 알긴산류를 분리하고, 메탄올을 이용하여 분말결정화한 다음 동결건조하여 요오드가 제거된 고분자 알긴산 분말을 얻었다. 추출된 요오드는 알긴산을 가수분해한 후 적정량을 다시 투여하여 각 실시예에 적용하였다. 한편, 요오드를 보유시킨 알긴산은 유기용매 추출법을 사용하지 않았다.
본 발명에서 확인하고자 하는 적조플랑크톤류, 어병 기생충 및 어병균의 항미생물 효과를 나타낼 수 있는 물성치의 조절을 위해 고분자 알긴산 분해를 위하여 사용한 효소로는 아르기나제(Sigma사, Lot No.: A2137)를 구입하여 사용하였으며, 사용한 효소의 역가치는 12,500 units/g이였다.
실시예 2. 산성 용액에서 알긴산 올리고당 유도체의 제조
0.5 ℓ삼구 플라스크에 2 N-HCl 용액 0.3 ℓ를 넣고 온도를 80∼100 ℃로 가온한 후, 여기에 고분자 알긴산 3 g을 투여한 후 교반하여 가수분해 시켰다. 시간별로 가수분해 반응을 정지시키기 위하여 10 N-NaOH와 3 N-HCl 용액으로 pH를 5로 조절하여 가수분해 및 반응을 종결시키고, 이후 여과하여 분말 형태의 중간 가수분해물인 알긴산을 분리하고 반응액을 제거하였다. 그리고, 여과된 중간물을 넣은 후 추가적으로 일반 여과 해수 및 3차 탈이온수로 1 % 용액(w/v)이 되게 하여 충분히 분산시킨 후 다시 pH를 7∼9로 조절하였다.
최종적으로 시간별 획득된 용액상의 저분자화 알긴산 및 알긴산 올리고당 유도체를 얻었다.
실시예 3. 알칼리 용액에서 알긴산 올리고당 유도체의 제조
3 ℓ비이커에 여과 해수 및 3 차 탈이온수 2 ℓ를 충전하고 pH를 12로 조절한 후 상온에서 추가적으로 20 g의 고분자 알긴산을 넣고 완전용해하였다. 0.5 ℓ 삼구 플라스크에 pH 12로 조절된 고분자 알긴산 용해 용액을 300 ㎖를 투여한 다음, 온도를 65∼85 ℃로 각각 달리하여 가온하고 교반하여 가수분해시켰다. 시간별로 가수분해 반응을 정지시키기 위하여 10 N-NaOH와 3 N-HCl 용액으로 pH를 7∼9로 조절하여 가수 분해된 저분자 알긴산 반응액을 획득하였다. 추가적으로 일반 여과 해수 및 3차 탈이온수로 1 % 용액(w/v)이 되게 하여 다시 pH를 7∼9로 조절하였다. 최종적으로 시간별 획득된 용액상의 저분자화 알긴산 및 알긴산 올리고당 유도체를 얻었다.
다음 표 1은 화학적 가수분해법을 이용한 알긴산의 시간 경과별 분자량 감소를 확인한 분석표이다.
(주)* 올리고당 생성(10 당체 이하의 함유량이 70 % 이상)
실시간 결과의 표준편차: 평균±5 ∼평균±0.5
실시예 4. 아르기나제 효소에 의한 알긴산 올리고당 유도체의 제조
3차 탈이온수 2 ℓ를 3 ℓ비이커에 투입하고 온도를 37 ℃, pH는 9.5로 조절한 다음 여기에 고분자 알긴산을 30 g 넣어 1 %(w/v) 용액이 되게 교반하여 용해 시키고, 이를 0.5 ℓ3구 플라스크에 300 ㎖ 분취한 후 여기에 아르기나제 25, 15, 5, 2.5, 0.5를 첨가하여 가수분해를 실시하였다.
pH 9.5, 온도 37 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4시간, 5 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 15 시간, 18 시간, 24 시간 각각 반응시켰다. 각 시간별로 효소반응을 정지시키기 위하여 각각의 3구 둥근 플라스크를 80℃에서 30 분 동안 살균처리하여 효소의 활성을 정지시킨 후 침전물을 여과하여 제거하고, 최종적으로 시간별 획득된 용액상의 저분자화 알긴산 및 알긴산 올리고당 유도체을 제조하고, 이들 각각의 분자량을 점도로 측정하였다. 다음 표 2는 효소를 이용한 알긴산의 시간경과별 분자량 감소를 확인한 분석표이다.
(주)* 올리고당 생성(10당체 이하의 함유량이 70 % 이상)
실시간 결과의 표준편차: 평균±7 ∼평균 ±0.5
효과시험예: 어류 기생충 및 알긴산 올리고당 유도체의 준비
본 발명에서 사용하고자 하는 스쿠티카 섬모충(Scuticociliatids)은, 스쿠티카 섬모충에 감염된 체장 5∼20 cm의 양식 넙치(Paralichthys olivaceus)중 20 개체를 수집하고, 이들 개체의 상처 부위에서 분리·채취하여 본 실험에 사용하였다. 분리·채취시 스쿠티카 섬모충(Scuticociliatids)은 항생물질이 첨가되지 않은 Eagle's MEM(Gibco)에 10 % FBS를 첨가한 배지에 수집하고 즉시 시험 재료로서 사용하였다. 항기생충 효과를 확인하기 위한 알긴산 유도체는, 상기 실시예 2∼4에서 획득된 것중 최초의 물성(450cps)을 보유한 알긴산 유도체와, 각 유도체중 일반 알긴산의 성격을 보유한 8.6∼13 cps 범위의 물성치를 갖는 것과, 알긴산 올리고당체 (1∼16 당체)의 함량이 70 % 이상인 1.2 cps로 알긴산 올리고화된 물성을 보유한 것만을 선정하였다. 다음 표 3은 본 발명에 따라 얻어진 알긴산 올리고당 유도체를 분자량별로 분류한 GPC분석 결과표이다.
(주)* 알긴산 올리고당체의 구성이 2∼16 개 당체 함유량으로 정하였음.
1. 알긴산 올리고당 유도체의 스쿠티카 섬모충(Scuticociliatids) 사멸 효과
채집된 스쿠티카 섬모충을 일반 해수 10 ㎖를 넣은 튜브에 3.4x104개체/㎖로 조절하여 수용하고 17 ℃의 실온에서 정지하였다. 그리고, 제조된 알긴산 올리고당 유도체를 종류별로 준비하여 표 3에 나타낸 분자량별 물성을 갖는 유도체를 농도별로 설정하는 한편, 알긴산 올리고당 유도체가 첨가되지 않은 대조군을 설정하였다. 또한, 동일한 알긴산 유도체를 0.1 % 첨가한 실험군과 0.05 %, 0.04 %, 0.01 %, 0.008 %를 각각 첨가한 5개 실험군으로 실험군을 설정하고, 알긴산 올리고 당 유도체를 투여하기 전(0분), 투여 후 1 분부터 2, 3, 4, 5, 30 분, 1 시간, 3 시간 및 10 시간까지 시간 경과별로 0.1 ㎖씩 분취하여, 현미경 하에서 전체 개체수에 대한 사멸 개체수를 3 회 계수하여 이를 평균치(Mean±S.E)로 환산하였으며,동시에 CC 카메라를 현미경에 부착하여 시간경과에 따른 스쿠티카 섬모충의 운동성 및 형태의 변형을 관찰하였다.
먼저, AHO-3를 대상으로 한 경우에는 다음 표 4에 기재된 바와 같이, 0.1 % 알긴산 유도체 첨가군은 첨가 후 5 분 이내에 어체 조직 침입 및 괴사를 일으키는 전체 스쿠티카충의 사멸 효과를 보여주었다. 그리고, 0.05 % 처리군은 30∼40 분, 0.01 % 처리군은 2 시간 이상 경과시 100 % 사멸효과가 인정되었다. 그러나, 0.01 % 보다 낮은 농도로 첨가된 경우는 사멸 효과가 인정되지 않았다.
한편, AHO-1 및 AHO-2를 대상으로 한 경우에서는 항기생충 효과가 나타나지 않았다.
그리고 사멸 과정에 미치는 알긴산 올리고당 유도체의 효과를 확인하기 위하여 병어의 환부로부터 스쿠티카충을 0.03 %(v/v) 이상 농도의 알긴산 올리고당 유도체와 직접 접촉시켰다. 그 결과, 접촉 직후 스쿠티카 섬모충의 활발했던 운동성이 급격히 저하되었으며, 시간이 경과됨에 따라 수축포가 확장되면서 유선형체에서 원형체로 변화되는 과정이 관찰되었고, 전체적으로 2 시간 이상 경과 후에는 이 기생충이 완전히 파괴되었다.
다음 표 4는 알긴산 올리고당 유도체(AHO-3)의 농도별 처리시 시간 경과에 따른 스쿠티카 섬모충의 사멸 효과 검정 결과로, 누적수치로 나타낸다.
(주) 1. 유의성 검토: (P<0.01)
2. 평균 오차 범위: ±5 ∼±24
2.어병균에 대한 항균 효과
(1) 항균성 검정을 위한 어병균주의 선택
항균성 검정을 위한 어병균주는 양식환경에서 가장 빈번하게 출현하는 대표적인 세균병원균 종류를 선발하였다. 즉, 지느러미의 반점이 특징으로 증상이 진행되면서 복부 및 항문에 뚜렷한 반점과 출혈반이 관찰되는 병으로서 뱀장어 기적병의 주원인균인Aeromonas hydrophilaATCC 7966, 주로 치어부터 성어에 이르기까지 넙치에 감염되어 높은 누적폐사율을 일으키는 병원균으로 복부팽만 및 탈장증세를 일으키는Edwardsiella tardaEdk-2, 비늘 탈락, 지느러미 붕괴 및 결손이 확대되면서 궤양을 형성하는 비브리오병의 원인균인Vibrio anguillarumPT-493, 안구 돌출, 안구 백탁, 안구 출혈, 아가미 두껑 및 아가미 연조골 간막의 충혈이나 발진을 일으키며 넙치의 경우 간 및 소화관의 염증 반응 또는 복수충만 등의 증세를 나타내는 연쇄구균증의Streptococcussp. NG8266, 각막염, 안구 출혈 등을 일으키는Staphylococcussp. HR-1 등을 사용하였다.Aeromonas hydrophilaATCC 7966 균주를 제외한 4 균주는 부경대학교 어병학과에서 분리동정된 균주들이다.
(2) 항균성 검정을 위한 배지의 조제 및 병원세균의 배양
Nutrient broth(NB)에 1 %(w/v)의 NaCl을 첨가한 배지(NBN)를 121 ℃에서 15분 동안 가압살균하여 세균 배양을 위한 기본 배지로 사용하였다.Streptococcussp. NG8266 및Vibrio anguillarumPT-493의 경우는 종 배양을 위하여 Brain Heart Infusion(BHI) 배지를 사용하였다. 본 배양을 위한 배지는 121 ℃에서 15 분 동안 가압살균한 2배 농도의 NB 배지(pH 6.5)에 pH 6.5로 조정된 알긴산 올리고당 유도체 1 % 용액과 살균증류수를 첨가하여 알긴산 올리고당 유도체가 최종농도 0.5 %(w/v), 0.1 %(w/v), 0.02 %(w/v) 및 0.004 %(w/v)가 되도록 제조하였다. 대조군용배지는 무첨가 NBN 배지를 사용하였다.
본 배양은 하룻밤 배양한 종배양액을 0.1 %(v/v) 농도로 접종하고Vibrio anguillarumPT-493의 경우 26 ℃, 그외 균주Aeromonas hydrophilaATCC 7966,Edwardsiella tardaEdk-2,Streptococcussp. NG8266 및Staplylococcussp. HR-1은 37 ℃로 하여 200 rpm으로 24 시간 동안 회전 진탕 배양하였다. 시간별 생존하는 세균은 영양고체배지에 도말 및 배양하여 나타나는 콜로니수를 확인하였으며, 최초 알긴산 올리고당 제제 투여 전을 기준으로 백분율로 환산하였다.
(3) 세균에 대한 항균활성 측정
하룻밤 배양한 종배양액을 본 배양 배지에 ㎖ 당 세균수 105∼106이 되게 접종하여Vibrio anguillarumPT-493의 경우 26 ℃에서,Aeromonas hydrophilaATCC7966,Edwardsiella tardaEdk-2,Streptococcussp. NG8266 및Staphylococcussp. HR-1은 37 ℃에서 분당회전속도 200 rpm으로 하여 진탕 배양하고, 12 시간 후 파장 600 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 현탁도를 측정하여 미생물의 생육 정도를 확인하였다.
표 5는 알긴산 올리고당 유도체의 어병균주에 대한 항균 활성(%, 제제 투여 12 시간 후 OD 측정)을 나타낸 것으로, 대조군 현탁도와 알긴산 올리고당 유도체가 첨가된 배지에서의 현탁도의 차이값을 대조구 현탁도에 대한 백분율로 그 생육 저지도를 나타내었다.
(4) 해수환경에서 알긴산 올리고당 유도체의 항균력
균주별로 NBN 및 BHI배지에서 배양한 배양액 1 ㎖를 미세원심분리기로 15,000 rpm에서 30 초 동안 원심분리하여 얻어진 세포침전물을 살균한 여과해수로 2 회 세척하고 최종적으로 여과해수 1 ㎖에 현탁시켰다. 현탁액을 104∼105세균수/㎖로 희석한 후 알긴산 올리고당 유도체 용액을 최종 농도 0.5 %(w/v), 0.1%(w/v), 0.02 %(w/v) 및 0.004 %(w/v)가 되도록 첨가하여 혼합하였다. 혼합액을 일반적인 해수온도인 22 ℃에서 저속(50 rpm)으로 회전진탕하면서 1 시간, 2 시간, 4시간, 6 시간 및 12 시간 경과 후 각각 0.1 ㎖를 적정배지에 직접 도말하여 생육한 균체수와, 100 배 희석액의 0.1 ㎖를 도말하여 생육한 균체수로부터 비교확인한 생균수 감소율을 하기 표 6에 나타내었다.
여기에서 보면, 세균의 사멸속도는 균주별로 차이가 있으나 동일하게 미생물과 알간산 올리고당 유도체와의 접촉 후 1 시간이 경과할 때까지 생균수 감소가 급속하게 진행되고 이후 균체수 변동이 없는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 해수환경에서 약욕하는 경우 3 시간 처리로 투여농도에서 목적을 달성할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 발병 농도 이하로 균체수를 저하시키기 위해서는 일정 기간 반복처리의 필요성이 있음을 알 수 있었다.
다음 표 6은 어병균에 대한 농도 및 시간별 알긴산 올리고당 유도체의 항균성 검정 결과(%)를 나타낸 것이다.
(주) 1. 생균수의 평균편차 : ±8∼12%
2. -: 측정하지 않았음
3. 알긴산 올리고당 유도체에 의한 적조생물의 사멸
본 발명된 알긴산 올리고당 유도체를 이용한 적조생물 사멸 시험을 위해 선정된 적조생물은 최근 몇 년 동안 우리나라 남해 연안 일대의 적조를 유발하고 있는Cochlodonium polykrikoides와 적조생물의 하나인Gymnodinium sanguineum이다.
이러한 적조생물 제어에 대한 알긴산 올리고당 유도체의 효과를 확인하기 위하여 실험실에서 배양하고 있는Cochlodonium polykrikoides와 현장에서 바로 채집한Gymnodinium sanguineum과 알긴산 올리고당 유도체와 접촉시켰다. 그 결과, 알긴산 올리고당 유도체의 농도에 따른 적조생물 사멸 효과를 나타낸 것이다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 천연고분자 물질인 알긴산으로부터 적조소멸 또는 적조생물사멸 효과 뿐 아니라 어병세균에 대한 항균 효과 및 어류기생충 사멸 효과가 뛰어난 알긴산 올리고당 유도체로 제조하여 적조소멸제 또는 적조생물사멸제로 사용할 수 있고, 또한 어병세균에 대한 항균제 또는 어류기생충 제제로도 사용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 알긴산을 가수분해시켜 제조된, 당체수가 1 내지 16이고 분자량 범위가 192 내지 3072인 알긴산 올리고당 유도체(alginate polygalacturonite oligomer derivative)를 유효성분으로 하는 적조소멸제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 알긴산은 다시마로부터 추출한 것임을 특징으로 하는 적조소멸제.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 알긴산을 가수분해하는 방법으로는, 20 내지 100 ℃온도의 산성 용액 또는 알카리 용액에 알긴산을 투입한 다음 교반하여 가수분해시키는 방법인 것을 특징으로 하는 적조소멸제.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 알긴산을 가수분해하는 방법으로는, 아르기나제 효소를 이용하여 알긴산을 가수분해하는 방법인 것을 특징으로 하는 적조소멸제.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 아르기나제 효소를 이용하여 알긴산을 가수분해할 때의 pH를 8 내지 10 범위 내로 하여 가수분해함을 특징으로 하는 적조소멸제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균 분자량이 8,000 이하인 알긴산을 유효성분으로 하는 적조소멸제.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 알긴산과 알긴산 올리고당 유도체는, 양 물질의 혼합물에서 알긴산 올리고당 유도체 함유량이 60 % 이상인 것을 특징으로 하는 적조소멸제.
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