KR100212953B1 - 카이토산올리고당 산염을 유효 성분으로 하는 어병치료제 - Google Patents

Abstract

[목적]

카이토산은 물에 불용성이기 때문에 수용성 카이토산을 제공함을 목적으로 한다.

[구성]

카이토산올리고당과 농염산을 60~80℃에서 교반하면서 반응시켜 수용성 카이토산올리고당 산염을 제조한다.

Description

카이토산올리고당 산염을 유효 성분으로 하는 어병치료제

제1도는 인공감염 후 카이토산올리고당 산염의 약욕처리 효과를 나타내는 그래프이다.

제2도는 스쿠치카 섬모충에 감염된 공시어의 카이토산올리고당 산염에 의한 치료 효과를 나타내는 그래프이다.

제3도는 스쿠치카 섬모충의 카이토산올리고당 산염에 의한 세포 사멸 과정을 나타내는 확대 사진이다.

[발명의 이용 분야]

본원 발명은 카이토산올리고당 산염을 유효 성분으로 하여 어류의 효과적인 질병 치료와 상처 부위의 신속한 회복을 목적으로 하는 어병치료제에 관한 것이다.

[종래의 기술]

어류 양식에 있어서 폐사량 감소와 건강하고 라르게 키우는 것이 생산 원가를 줄이는데 가장 중요하다.

이러한 점을 해결하기 위하여 어류 질병의 원인, 사육 환경 악화 요인, 방어력 저하 요인, 어종별 질병의 종류 및 증상을 파악하여 예방 대책을 강구함과 동시에 효율적인 치료 방법을 수립하여야 한다.

현재 해산어에 출현하여 대량폐사를 유발하는 세균, 곰팡이, 바이러스 및 기생충의 감염예방 및 구제용으로 사용되는 수산용 약품으로는 설파모노메톡신(surf famonomethoxine sodium), 설파다이 메톡신(surfadimethoxine sodium), 설피소졸(sulfisozol), 설파메라진(sulfamerazine). 등의 설파제와 옥시테트라사이클린(oxytetracycline HCl), 테트라사이클린(tetracycline), 클로로테트라사이클린(chlorotetracycline HCl), 암피실린(ampicillin trihydrate), 아목실린(amoxyllintrihydrate), 독시사이클린(doxycycline hydrate), 에리스로마이신(erythromycine thiocyanate), 스피라마이신(spiramycine enbonate), 키타사마이신(kitasamycin), 클로암페니콜(chloramphenicol) 등의 항생물질과 이들의 복합 항균제, 옥소린산(oxolinic acid), 훌루메퀸(flumequine), 파기란산(piromidic acid), 날리딘산(nalidinic acid)의 화학요법제, 엘바쥬(nifurstyrenate sodium)의 니트로후란제, 비티올(bithinol), 트리클로로폰(trichlorofon)과 같은 구살충제가 있다.

이들 약품을 이용하여 자체 성질 및 필요에 따라 약욕 및 경구 방식으로 일정양을 투여하여 넙치의 플렉시박터 균주(Flexibacter maritimus)에 의한 부식병 및 활주세균증, 비브리오균주(Vibrio anguillarum)에 의한 비브리오병, 연쇄구균(Streptococcus sp.)에 의한 연쇄구균증, 에드워드 균주(Edwardsiella tarda)에 의한 복부팽만 및 탈장 증세를 일으키는 에드워드증, 비브리오 균주(Vibrio sp.)에 의한 장관백탁증, 트리코디나(Trichodina), 스쿠치카(Scutiocilate), 막구류(Hymenostoniata) 등의 섬모충류에 의한 상피세포 붕괴를 유발시키는 질병과, 이크티오포누스 호페리(Ichtyophonus hoferi)와 같은 원충류에 의한 질병들을 치료하고 있다.

또한 돔류, 방어, 조피볼락 및 농어등 대표적인 양식 어류에는 이와 동일 또는 유사한 질병들이 만연하고 있으며 결국 합병 증세를 나타내고 대량폐사를 일으켜 막대한 경제적 손실이 발생한다.

대부분의 해산어 어병구제에는 상기 언급한 약제들을 사용하고 있으며 바이러스 또는 일부 기생충과 같은 병원체에 대해서는 수온 조절 및 담수약욕등 극단적인 방법을 사용하고 있으나 특별한 완전 방제 대책이 현재까지 수립되지 않고 있다.

근본적으로 중요한 것은 발병 원인 병원체의 정확한 규명 없이 약제를 오남용할 경우나 예방을 위해서 소량의 약제를 계속해서 투약할 경우 새로운 내성균의 출현을 초래하게 되고, 이에 따른 사용량 증가로 인한 양식 경비 상승은 물론 어체내 잔류성 문제로 소비자인 국민의 건강에 심각한 위험을 가져올 수 있다.

또한 양식현장에서 다발하며 대량폐사를 일으키는 스쿠치카증의 유일한 초보적인 치료 수단으로 상용되고 있는 포르말린액은 환경 규제 물질이기 때문에 최소량으로 사용되어야 하나 이를 이용한 치료 목적의 약품욕처리를 할 경우 약제를 포함하고 있는 대량의 약식수가 바다로 유입됨으로 양식장 주위의 환경 파괴의 가능성을 무시할 수 없다.

또한, 종래에 있어서 카이토산은 물에 불용성이기 때문에 약산 등으로 녹여서 사용해야 하는 문제점이 있다.

[본원 발명이 해결하려는 과제]

상기와 같이 카이토산은 물에 불용성이기 때문에 약산 등으로 녹여서 사용해야 하는 문제점을 해결하기 위해 물에 용해하는 카이토산올리고당 산염을 제공하고 이를 어병치료제로 사용함을 목적으로 한다.

[본원 발명이 체결하려는 기술 수단]

위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 카이토산올리고당과 농염산, 좋기로는 2N 염산을 60~80℃에서 교반하면서 반응시켜 카이토산올리고당 산염을 제조함을 특징으로 한다.

상기 카이토산올리고당 산염을 물에 녹여서 해수에 첨가했을 때의 pH를 6.4∼6.6 이 되도록 조정한다.

[실시예]

이하 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

[(1)카이토산올리고당 산염의 제조]

본원 발명에 사용된 카이토산올리고당 산염의 조제는 탈아세틸화도 85∼90%, cps 400~500의 일반 카이토산에 0.01~0.1 당량의 NaBO₃를 첨가한 후 50∼60℃에서 반응시키고 물로 여과 세척한 다음 cps 1.5~2.0의 분말상태 저분자 카이토산 1kg 을 15ℓ 탈이온수에 충분히 분산시켰다. 여기에 1ℓ의 0.5N HCl을 2시간 동안 서서히 낙하 첨가하여 용액화시키고 최종농도 2N의 HCl이 되도록 추가적으로 고농도 HCl을 첨가한 후 60~80℃로 온도를 조절하여 24시간 동안 교반하였다.

이를 여과하여 불순물을 제거하고 표준 물질과 박막크로마토그라피(Thin Layer Chromatography)를 수행하여 카이토산올리고당 산염의 출현을 확인한 다음 순수 아세톤으로 낙하 첨가하여 발생된 결정을 여과하여 분말을 획득하였다. 이를 분말 1g당 9ml 의 증류수를 혼합하여 완전히 용해시킨 후 여러 가지 농도로 해수에 첨가시 pH가 6.4~6.6으로 조절되게 하기 위하여 pH를 4.0과 6.0으로 조절하고 5배량의 아세톤을 첨가하여 재결정하고 여과하여 얻어진 분말을 건조하였다.

중합도 1~16의 카이토산올리고당 산염은 동일 량의 물과 메탄을 혼합 용액에 완전히 용해되었을 경우 TSK GEL Amide-80 column 을 이용한 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 분자량을 확인한 후 본원의 카이토산올리고당 산염을 얻었다.

[(2)항균성 검정을 위한 어병균주의 선택]

항균성 검정을 위한 어병균주는 양식 환경에서 가장 빈번하는 대표적인 세균병원균 종류를 선발하였다. 지느러미의 반점이 특징으로 증상이 진행되면서 복부 및 항문의 뚜렷한 반점과 출혈반이 관찰되는 병으로서 뱀장어의 기적병의 주원인균인 Aeromonas hydrophila ATCC7966, 주로 치어부터 성어에 이르기까지 넙치에 감염되어 높은 누적 폐사율을 일으키는 병원균으로 복부팽만 및 탈장증세를 일으키는 Edwardsiella tarda Edk-2, 비늘탈락, 지느러미붕괴 및 결손이 확대되면서 궤양을 형성하는 비브리오병의 원인 균인 Vibrio anguillarum PT-493, 안구돌출, 안구백탁, 안구출혈, 아가미 뚜껑 및 아가미 연조골 간막의 충혈이나 발진을 일으키며 넙치의 경우 간 및 소화관의 염증 반응 또는 복수충만 등의 증세를 나타내는 연구구균증의 Streptococcus sp. NG8266, 각막염, 안구출혈 등을 일으키는 Staphylococcus sp. HR-1을 사용하였다.

Aeromonas hydrophila ATCC7966 균주를 제외한 4균주는 부경대학교 어병학과에서 분리동정된 균주들이다.

[(3)항균성 검정을 위한 배지의 조제 및 병원 세균의 배양]

Nutrient broth(NB)에 1%(w/v)의 NaCl을 첨가한 배지(NBN)를 121℃에서 15분 동안 가압 살균한 후 세균의 배양을 위한 기본 배지로 사용하였다. Streptococcus sp. NG8266 및 Vibrio anguillarum PT-493의 경우는 종배양을 위하여 Brain Heart Infusion(BHI) 배지를 사용하였다.

본 배양을 위한 배지 조제는 121℃에서 15분 동안 가압살균한 2배 농도의 NB배지(pH 6.5)에 pH 6.5로 조정된 카이토산올리고당 산염 1% 용액과 살균 증류수를 첨가하여 카이토산올리고당 산염이 최종농도 0.5%(w/v), 0.1%(w/v), 0.02%(w/v) 및 0.004%(w/v)가 되게 하였으며 대조구용 배지는 무첨가 NBN 배지를 사용하였다.

본 배양은 하룻밤 배양한 종배양액을 0.1%(v/v) 접종하고 Vibrio anguillarum의 경우 26℃, 그외 균주 Aeromonas hydrophila ATCC7966, Edwardsiella tarda Edk-2, Streptococcus sp. NG8266 및 Staplylococcus sp. HR-1은 37℃로 하여 200rpm으로 24시간 동안 회전 진탕 배양하였다. 해수조건하에서 항균활성 검정은 증류수 대신 여과해수를 사용하여 모든 배지를 조제한 것 이외에는 동일한 방식으로 수행하였다.

[(4)어병세균에 대한 항균활성 측정]

하룻밤 배양한 종배양액을 본배양 배지에 ml당 세균수 10⁵~10⁶이 되게 접종한 후 Vibrio anguillarum PT-493의 경우 26℃에서, Aeromonas hydrophila ATCC7966, Edwardsiella tarda Edk-2, Streptococcus sp. NG8266 및 Staphylococcus sp. HR-1은 37℃에서 분당회전속도 200rpm 으로 하여 진탕 배양하였다.

12시간 후 파장 600nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 현탁도를 측정하여 미생물의 생육정도를 확인하였으며 농도별 카이토산올리고당 산염의 어병세균 생육저지도를 대조구 현탁도에서 카이토산올리고당 산염이 첨가된 배지에서의 현탁도 차이 값을 대조구 현탁도에 대한 백분율로 표 1에 나타내었다.

증류수 배지와 해수배지 상에서 항균 활성이 상대적으로 저하된 것은 해수중에 존재하는 이온 성분에 의한 카이토산올리고당 산염의 일부가 킬레이팅 반응으로 항균력이 상쇄된 것으로 추측된다.

[(5)해수 환경에서 카이토산올리고당 산염의 항균력]

균주별로 NBN 및 BHI 배지에서 배양한 배양액 1ml 를 미세 원심분리기로 15,000rpm에서 30초 동안 원심 분리하여 얻어진 세포 침전물을 살균한 여과 해수로 2회 세척하고 최종적으로 여과 해수 1ml에 현탁시켰다. 현탁액을 10 ~10 세균수/ml로 회석한 후 카이토산올리고당 산염 용액을 최종농도 0.5%(w/v), 0.1%(w/v), 0.02%(w/v) 및 0.004%(w/v)되게 첨가하여 혼합하였다.

혼합액을 일반적인 해수 온도인 22℃에서 저속(50rpm)으로 회전 진탕하면서 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간 및 24시간 후에 각각 0.1ml를 적정 배지에 직접 도말하여 생육한 균체수와 100배 희석액의 0.1ml를 도말하여 생육한 균체수로부터 비교 확인한 생균수 감소율을 표 2에 나타내었다.

세균의 사멸 속도는 균주별로 차이가 있으나 동일하게 미생물과 카이토산올리고당 산염과의 접촉 후 2~3시간 경과하였을때 까지 생균수 감소가 급속하게 진행되었고 이후 균체수의 변동이 없는 것으로 보아 해수 환경에서 약욕하는 경우 3시간 처리로 투여 농도에서 목적을 달성할 수 있음을 확인할 수 있었으며 발병 농도 이하로 균체수를 저하시키기 위해서는 일정 기간 반복 처리의 필요성이 있음을 알 수 있다.

[(6)카이토산올리고당 산염의 어류에 대한 안정성 검정]

카이토산올리고당 산염 용액이 건강 어체와 직접 접촉(약욕)할 경우에 유발되는 유해 농도를 산출하여 치료 농도와 안정성을 확보하기 위하여 0.2톤 순환식 간이 수조에 0.1톤의 해수를 입수시킨 후 카이토산올리고당 산염 용액을 100배 회석률로 최종 농도 0.004, 0.02, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 5.0 및 10.0%(w/v)로 각각 첨가하여 공시어로서 넙치 체장 2~3cm, 5~7cm, 10~13cm 및 15∼18cm의 넙치 20마리를 각 0.2톤 간이 수조에 투입하였다. 1시간, 3시간, 24시간 및 240시간 경과 후 폐사율의 정도를 조사하였다.

경구 투여에 따른 안정성 농도 산출 확인을 위해서 치자어용 사료로서 일본협화발효공업주식회사 제품인 초기 사료 1.0g을 2~3cm 공시어에 1회 투여하는 양으로 하여 1일 4회 급이하였고, 5~7cm 공시어군에는 일본 임겸산업주식회사 제품 EP(Evaporated Pellet)사료 취어 2호 2g을 1회 투여하는 양으로 1일 3회 급이하였으며, 동일 회사제품 EP사료 취어 3호를 10~13cm와 15~18cm 공시어군에는 각각 10g을 1회 투여량으로 하여 1일 2회 급이하였다.

EP사료와 카이토산올리고당 산염 용액과의 혼합은 약욕조건과 동일하며 혼합방법은 카이토산올리고당 산염을 사료 무게의 0.1배량의 물에 용해시키고 이를 사료에 반복 분무함으로써 완전히 점착시킨 후에 60℃에서 강제 송풍 건조기로 건조시켜 급이용으로 하였다. 약욕처리 및 경구투여시 처리 농도와 시간과의 상관 관계를 표 3에 나타내었다.

결과적으로 실시예 1의 (5)로부터 각어병균주에 대한 카이토산올리고당 산염의 항균 활성은 균주와 접촉후 2~3시간 경과하였을 때 대부분의 효과가 발효되므로 3시간 기준으로 약욕안정성 농도와 비교할 때 2~3cm 공시어군의 경우 0.1%(w/v) 이하, 5~7cm 공시어군의 경우 0.2%(w/v) 이하, 10~13cm 와 15∼18cm 공시어군의 경우 동일하게 0.5%(w/v) 이하로 약욕수행시 안전함을 확인하였다.

경구 투여는 급이 사료에 대하여 10%(w/w) 까지 첨가하였을때 전혀 약해 현상을 발견할 수 없었으며 대조구에 비하여 경구투여군이 왕성한 활력을 나타내었고 먹이손실도도 낮게 관찰되었다.

약욕처리의 경우의 약해는 사용되는 카이토산올리고당 산염의 실중량이 경구투여보다 절대적으로 많은 양이므로 아가미의 새변(gill filament)으로 상당량이 유입되어 간세포에 일부 장애를 일으키는 것으로 진단되었으나 섭이활동이 약화되었을 경우 또는 외부 강염 방제의 일환으로 안정 농도에서 제한적으로 사용될 수 있다.

[실시예 2]

[인공 감염된 넙치의 카이토산올리고당 산염에 의한 치료 효과]

10~13cm 크기 넙치 100미를 공시로 하여 5종류의 어병세균을 복강 주사로 인공 감염시킨 후 카이토산올리고당 산염을 0.1%(w/v)되게 해수에 혼합하여 감염직후부터 3시간 동안 약욕처리 하였다.

일시에 수조내 해수를 순환시키고 익일 동일 시간대에 동일시간 동안 3일 연속 수행하였을 때 10일 경과후 폐사율이 어병균주에 따라 15~30% 정도 감소하는 효과를 나타내어 이의 결과를 대조구와 비교하여 제1도에 나타내었다.

제1도는 5종류의 어병균주로 복강주사로 인공감염시킨 후 약욕처리 하였을 경우 폐사율이 감소되었다는 의미한다. 즉, black bar는 무처리군의 대조구이고 white bar는 카이토산올리고당 산염으로 약욕처리하였을 때 대조군과 비교하면 치료효과가 있다는 것을 의미한다.

[실시예 3]

[카이토산올리고당 산염에 의한 스쿠치카 섬모충의 세포 사멸]

스쿠치카는 섬모충의 일종으로 10여년 전부터 주요 양식어종인 넙치의 체표에 기생하여 근육 괴사를 진행시키고 세균성 질병과의 합병증을 유발시키며 뇌까지 침입하여 대량 폐사를 일으키는 주요 방제 대상이다.

그러나 발병 초기 단계에서 환경 유해 물질인 포르말린액으로 약욕처리를 할 경우 일부 구제는 가능하나 완전 치유에는 특별한 방법이 없는 실정이다. 이러한 난치성 질병에 대한 카이토산올리고당 산염의 효과를 확인하기 위하여 병어의 환부로부터 스쿠치카충과 0.1%(v/v)의 카이토산올리고당 산염과 직접 접촉시켰다.

접촉 직후 활발했던 운동성이 급격히 저하되었으며 시간이 경과됨에 따라 수축포가 확장되면서 유선 형체에서 원형체로 변화되는 과정이 관찰되었고 약 1시간 경과 후에는 세포가 완전히 파괴되었다. 이의 세포 파열 과정을 제3도에 나타내었다.

제3도는 자연상태에서 감염된 공시어체로부터 스쿠치카 섬모충(이 기생충은 실험실에서 인공생육이 곤란함)을 채취하고 이와 카이토산올리고당 산염과 접촉시켰을 경우 섬모충 세포의 파괴 사멸과정을 경과 시간별로 촬영한 사진이다. 즉 현재 구제약이 없는 스쿠치카충에 대한 카이토산올리고당 산염의 효과를 암시하고 있음을 입증하는 것이다.

[실시예 4]

[스쿠치카증에 자연 감염된 넙치의 치료 효과]

성어 생산을 위한 개인 소유 육상 축양장에서 근육 괴사 및 비정상적인 유영등의 전형적인 스쿠치카 섬모충의 감염 증세를 나타내는 넙치의 근육 및 뇌조직 적출물로부터 현미경 검사로 그 존재를 확인하였다.

평균체중 98g, 평균체장 17cm인 넙치 중간어 약 10만 마리에 대한 누적 폐사율이 30% 이상 진행된 상황이었으며, 이미 고농도의 포르말린액 약욕처리 및 담수욕 등 극단적인 구제 노력을 하였으나 증상 진행 및 약해에 따른 강한 스트레스로 1일 폐사수가 약 1000마리 이상되는 심각한 상태였다.

실시예 3에서 얻어진 결과를 바탕으로 해수 저장능력 50톤 크기의 순환식 수조에 스쿠치카증이 진행되고 있는 5000마리의 넙치를 입식 시키고 적정 수량 20톤으로 조절한 후 카이토산올리고당 산염을 최종농도 0.1%(w/v)되게 혼합하여 약욕으로 24시간 동안 처리하였다. 이후 40톤의 해수량으로 정상 유지하고 생사료 200kg에 카이토산올리고당 산염 1kg을 혼합하여 최종 함량 0.5%(w/w)되게 MP(moisture pellet) 상태로 제조한 후 1회당 10kg의 사료를 1일 3회 급이하였다.

이와 같이 3일간 연속급이를 수행하였을 때 근육 및 뇌조직에 스쿠치카 섬모충이 더 이상 존재하지 않았고 붕괴조직 또한 서서히 회복 재생되는 것을 확인하였으며 최초 처치 후 5일 경과하였을 때 더 이상의 폐사는 진행되지 않았다. 이에 대한 결과를 제2도에 나타내었다.

제2도는 스쿠치카증에 걸린 넙치를 약욕과 경구투여를 연속적으로 처리하여 치료효과를 나타낸 결과이다. 즉 발병하여 카이토산올리고당 처리전에는 1일 평균 넙치 1만 마리당 약 220 마리가 폐사되었으나 약욕처리 후에는 약 200마리로 감소하였으며 경구투여 1, 2, 3일 후에는 폐사율이 급격히 감소하였음을 나타내는 그래프이다.

[발명의 효과]

카이토산올리고당은 염산에 용해시켜야 하는 불편이 있었으나, 카이토산올리고당 산염은 수용성이기 때문에 사용하기가 아주 편리하고 어병치료제로 탁월한 효과가 있다.

Claims (8)

1. 카이토산올리고당 산염을 유효 성분으로 하는 어병치료제.
2. 제1항에 있어서, 단량체 1~16개로 구성된 카이토산올리고당 산염을 유효 성분으로 하는 어병치료제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카이토산올리고당 산염을 최고 0.1~0.5wt%로 약욕처리한 것을 특징으로 하는 어병치료제.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카이토산올리고당 산염을 0.004∼10.0wt% 되게 사료에 혼합하여 경구 투여함을 특징으로 하는 어병치료제.
5. 제1항에 있어서, Aeromonas속, Edwardsiella속, Streptococcus속, Staphylococcus속 및 Vibrio속을 포함하는 어병균주를 대상으로 하는 어병치료제.
6. 제1항에 있어서, 스쿠치카 섬모충을 포함하는 어병기생충을 대상으로 하는 어병치료제.
7. 제1항에 있어서, 넙치, 돔, 우럭, 방어 및 농어를 포함하는 양식어류를 대상으로 하는 어병치료제.
8. 제1항에 있어서, 카이토산올리고당 산염을 해수에 투입했을 때의 pH가 6.4~6.6 임을 특징으로 하는 어병치료제.