NO324131B1 - Fremgangsmate for fremstilling av alginat som har et hoyt mannuronsyre-innhold - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av alginat som har et hoyt mannuronsyre-innhold Download PDFInfo
- Publication number
- NO324131B1 NO324131B1 NO20015874A NO20015874A NO324131B1 NO 324131 B1 NO324131 B1 NO 324131B1 NO 20015874 A NO20015874 A NO 20015874A NO 20015874 A NO20015874 A NO 20015874A NO 324131 B1 NO324131 B1 NO 324131B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- alginate
- mannuronic acid
- solution
- extraction
- acid
- Prior art date
Links
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 63
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 49
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 11
- AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N D-mannopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N 0.000 title claims description 28
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241001474374 Blennius Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000011343 solid material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 description 19
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 9
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 8
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 6
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 4
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 4
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 4
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 4
- 241000512260 Ascophyllum Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 3
- MSXHSNHNTORCAW-MPGIDXPLSA-M sodium;(3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].O[C@@H]1OC(C([O-])=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O MSXHSNHNTORCAW-MPGIDXPLSA-M 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000172184 Durvillaea antarctica Species 0.000 description 2
- 241000195522 Fucales Species 0.000 description 2
- 241001466453 Laminaria Species 0.000 description 2
- 241001512709 Lessonia <stramenopiles> Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011362 coarse particle Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N (2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N 0.000 description 1
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 241000589149 Azotobacter vinelandii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N D-Guluronic Acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N 0.000 description 1
- 241000304827 Durvillaea potatorum Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 125000005613 guluronic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0084—Guluromannuronans, e.g. alginic acid, i.e. D-mannuronic acid and D-guluronic acid units linked with alternating alpha- and beta-1,4-glycosidic bonds; Derivatives thereof, e.g. alginates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
- A23L29/256—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin from seaweeds, e.g. alginates, agar or carrageenan
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angir en fremgangsmåte for fremstilling av alginat som har et høyt mannuronsyre-innhold. Foreliggende oppfinnelse angår nærmere bestemt en modifisert prosedyre for fremstilling av alginat som har et høyt mannuronsyre-innhold, hvor de innledende pre-ekstraksjon trinn av algene blir modifisert ved justering av pH for å gjenvinne en separat alginatfraksjon med et meget høyt mannuronsyre-innhold. Med denne modifiserte prosedyren, inneholder typisk alginatfraksjonen når den er gjenvunnet fra det innledende pre-ekstraksjon trinn, minst 80 mol% mannuronsyre i alginatet.
Alginater blir isolert fra marine brunalger. Alginat blir også produsert i jordbakterier så som Azotobacter vinelandii og Azotobacter crococcum og mange forskjellig Pseudomonas sp. Brunalger er imidlertid generelt kilden for kommersielt tilgjengelige alginater.
Alginater blir anvendt i matvarer og i farmasøytiske, dental, kosmetiske og andre industrielle produkter. De vanligste industrielle applikasjoner er basert på deres hydrokolloidale og polyelektrolytiske natur, som danner basis for de gel-dannende, fortykkende, stabiliserende, svellende og viskositet-frembringende egenskaper.
Alginater er salter av alginsyre, en lineær, heteropolysakkarid bestående
av (1-4)-bundet-p-D-mannuronsyre, betegnet som M og a-L-guluronsyre, betegnet som G. Disse to uronsyrer har de følgende formler:
Polymerene eksisterer som homopolymersekvenser av mannuronsyre, betegnet M-blokker, homopolymersekvenser av guluronsyre betegnet G-blokker og blandete sekvenser av mannuron og guluronsyre-enheter, betegnet MG-blokker eller alternerende blokker.
De følgende skjema representerer en illustrasjon av strukturen til alginater:
Alginater inneholder vanligvis alle tre typer blokker og en blokk består typisk av tre til tretti monomer-enheter. Fordelingen av blokkene avhenger av typen alger som alginatet blir isolert fra, så vel som alderen og del av planten. For eksempel kan alginat fra stilken ha en forskjellig sekvens og blokksammensetning sammenlignet med alginat isolert fra bladene. Årstiden når algene blir høstet påvirker også blokksammensetning og sekvens. I henhold til vanlig kunnskap, finnes det høyeste G-innhold i stiken til gammel Lhyperboæa. Blad fra samme arter har et noe lavere G-innhold og kortere G-blokker, men innholdet er fortsatt høyere enn for de fleste andre arter. Kommersielt tilgjengelige alginater har vanligvis et G-innhold på 25%-70%.
Kilder som har et høyt innhold av M-blokker er for eksempel arter av brunalgefamiliene Durvillea, Laminaria, Lessonia, Fucales og Ascophyllum,. spesielt er fruktlegemene til Ascophyllum om våren rik på mannuronsyre.
Det er vist at alginater som er rike i mannuronsyre har immun-stimulerende aktivitet som beskrevet i US-patent 5 169 840.
Norsk patent nr. 305 033, som tilsvarer til US-patent 6 121 441 beskriver en prosedyre for å produsere uronsyreblokker fra alginat. Dette patent vedrører imidlertid en fraksjonert frigjøring av de forskjellige blokk-fraksjonene; G, M og MG på en industrielt velegnet måte der væskevolumene holdes lave. Også betingelsene beskrevet for den fraksjonerte utfellingsprosedyren er optimalisert for å oppnå rene fraksjoner.
Andre preparative prosesser for fremstilling av poly-M-alginater, hvor innholdet av mannuronsyre er 80 % (FM=0,80) er kjent fra Rosell, K.G. og Srivastava, L.M., Can. J. Bot, 62 (1984), p. 2229-2236 , Craigie, J.S. et al,
Carbohydr.Polym., 4 (1984), p. 237-252 og Wedlock, D.J. et al., Food
Hydrocolloids, 4 (1990), p,41-47.
En enkel modifikasjon av pre-ekstraksjonstrinnet til en industriell prosess som i foreliggende oppfinnelse, er imidlertid ikke beskrevet. Foreliggende oppfinnelse som separat gjenvinner eller beholder en fraksjon av et alginat med et høyt mannuronsyre-innhold representerer derfor en enkel og økonomisk måte for produksjon sammenlignet med prosessene i tidligere teknikk.
I PCT/US91/00475 er et alginat-sårhelingpreparat som inneholder mannuronsyre og metoder for dets anvendelse beskrevet. Preparatet omfatter biopolymerer så som alginater med minst 70 mol% B-D-mannuronsyre (M). I henhold til denne publikasjon, side 2, linje 17, er det noen få algekilder som som er i stand til å produsere alginat med et G-innhold på mindre enn 30%. Imidlertid er bakterier angitt som den foretrukne kilde for høy-M-holdig alginat. Foreliggende oppfinnelse atskiller seg vesentlige fra denne lære ved at den beskriver en modifisert industriell prosess for produksjon av alginat og videre at denne modifiserte prosess opprettholder et alginatfraksjon med et høyt mannuronsyre-innhold som ellers mistes i den industrielle standard ekstraksjonsprosessen.
Den standard industrielle prosessen for produksjon av vann-ekstraherbart alginat er nå forbedret ved modifikasjonen av pre-ekstraksjonstrinnet eller det såkalte svelletrinnet. Dette trinnet er modifisert til å bli utført ved visse pH-verdier.
En modifikasjon som er vist i eksempel 2 for referanse er justering av pH til lavere enn ca. 2,3 for å forbedre det totale utbyttet av mannuronsyre-innholdet i alginatsalt-sluttproduktet med minst 10 mol%. Dette resulterer i produksjon av et alginat som har et M-innhold på minst 70 mol%. Eller, alternativt ifølge foreliggende oppfinnelse, blir pH holdt høyere enn ca. 2,3 i pre-ekstraksjonstrinnet noe som overraskende resulterer i en oppløselig alginatfraksjon med et meget høyt mannuronsyre-innhold, på minst 80 mol% av M. Denne oppløselige alginatfraksjonen kan gjenvinnes i en separat fraksjon før initieringen av ekstraksjonstrinnet i standardprosedyren som angitt nedenfor: Trinn 1: Pre-ekstraksjon eller svelling of algemateriale Trinn 2: Ekstraksjon av algemateriale
Trinn 3: Sikting
Trinn 4: Filtrering
Trinn 5: Utfelling med syre eller kalsiumsalt
Trinn 6: Syrevasking
Trinn 7: Tørking av alginsyre og eventuelt
Trinn 8: Nøytralisering av alginsyre og
Trinn 9: Tørking av kalsiumalginat
Mulig mellomliggende vasketrinn med fortynnede syreløsninger kan utføres mellom de forskjellige trinnene 1-9 ovenfor.
I foreliggende oppfinnelse blir pH i pre-ekstraksjonstrinnet (svelletrinnet) holdt på en pH høyere enn, eller "omkring 2,3" som betyr, slik det er anvendt her, 2,3+/-0,1.
I foreliggende oppfinnelse, når den mannuronsyre-rike fraksjonen blir gjenvunnet separat, blir pH i pre-ekstraksjonstrinnet holdt på en pH høyere enn ca. 2,3 og væskefraksjonen blir isolert fra suspensjonen fra pre-ekstraksjons- eller svelletrinnet ved filtrering eller hvilken som helst annen standard separasjonsmetode som sentrifugering eller sikting. Deretter kan alginatet eventuelt utfelles fra væskefraksjonen på en hvilken som helst konvensjonell måte med alkohol, syre eller salt, så som etanol, saltsyre, svovelsyre eller kalsiumklorid.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvor pH blir holdt på en pH høyere enn ca. 2,3 i pre-ekstraksjonstrinnet, førte til et utbytte i området 0,05-10 vekt%,
fortrinnsvis innen 2%-6 vekt% av den mannuronsyre-rike fraksjonen som angitt i tabell 2, på side 7. Alginatet som er gjenvunnet har et M-innhold på minst 80 mol%. Foreliggende oppfinnelse gir således en økonomisk og enkel metode for produksjon av et alginat med høyt innhold av mannuronsyre, som er et alginatprodukt spesielt egnet for medisinske, veterinærmedisinske og dietetiske applikasjoner.
Kort beskrivelse av figuren
Figur 1 viser den generelle prosessen for produksjon og separat gjenvinning av en fraksjon av alginat som har et meget høyt mannuronsyre-innhold.
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av alginat som har et mannuronsyre-innhold på minst 80 mol%, kjennetegnet ved at nevnte alginat blir produsert ved: a) tilsetning av ferske eller tørkede alger eller tang til vann under omrøring, i et forhold på henholdsvis 1:3 til 1:20, ved en pH høyere enn ca. 2,3, mens det
opprettholdes en temperatur over 20 °C i minst 30 minutter og
b) separering av nevnte oppløste alginat fra det faste materialet i suspensjonen i trinn a) ved en standard separasjonsmetode så som filtrering, og eventuelt
c) gjenvinning av nevnte alginat fra oppløsningen.
Alginatfraksjonen blir isolert fra det faste materiale ved filtrering eller
hvilken som helst annen egnet standard separasjonsmetode så som sentrifugering eller sikting og alginat som har et mannuronsyre-innhold blir eventuelt gjenvunnet fra løsningen ved utfelling med syre, salt eller alkohol.
Utgangsmaterialet ifølge foreliggende oppfinnelse er alger eller tang, spesielt brunalger, som blir behandlet med formaldehyd, for å fiksere fenolene og preservere algene. Videre kan algene vaskes med syre for å fjerne de meget viskøse fukoglykanene. Kommersielt tilgjengelige alginater, fortrinnsvis tørkede og malte alger av artene Durvillea kan anvendes, men også ferske, hele eller uoppmalte alger fra Durvillea, Laminaria, Lessonia, Ascophyllum eller Fucales er egnet som utgangsmaterialer i foreliggende prosess.
Oppfinnelsen er illustrert ved de følgende eksempler.
Eksempel 1
Modifisert prosess hvor pH er høyere enn 2,3 i "pre-ekstraksjons"- trinnet Beskrivelse av fremgangsmåten:
Råmaterialet fra forskjellig Durvillea arter, D. potatorum (malt) som prøve 1 og D. antarctica (ikke malt) som prøve 2 ble tilsatt vann i mengdene angitt i tabellen nedenfor og omrørt for hånd fra tid til annen ved en temperatur på 55 °C i 3,5 timer. Etter lagring ved omgivelsestemperatur over natt, ble algene ekstrahert en andre gang ved 55 °C i 1 time, deretter ble 2,5 ml formaldehyd tilsatt og ekstraksjonen fortsatt i 1 time.
"Pre-ekstraksjons" trinnet
Filtrering
Suspensjonen ble deretter siktet på et 60-mesh filter og vasket to ganger med et overskudd av vann. Løsningen ble deretter filtrert med filterhjelpemiddel på en vakuumtrakt og deretter på et membranfilter.
Syreutfelling
Løsningen fikk deretter avkjøles til 10 °C og ble deretter tilsatt NaCI til en 0,5 % - konsentrasjon. Deretter ble dråper med fortynnet 5,5M saltsyre forsiktig tilsatt under omrøring med magnet til pH 1,8. Et hvitt presipitat ble dannet. Suspensjonen ble, etter oppbevaring ved 10 °C i 30 minutter, siktet på en 120 mesh filterduk og pressed forsiktig for hånd hvilket resulterer i en deigete, gul masse, som ble omdannet til fine fibre etter pressing.
Nøytralisering
Alt det sure materialet ble overført til et 250 ml kar og tilsatt vann for å bringe opp til 200 ml, før det ble nøytralisert til pH 7 med fast soda-aske under magnetisk omrøring.
Filtrering
Løsningen ble nok én gang filtrert på en 0,8 mikron filtermembran av cellulosenitrat.
Alkoholutfelling
Filtratet ble avkjølt til 10 °C og utfelt med isopropylalkohol i forholdet 1:1. Fibrene som ble dannet ble vasket én gang med 70 volum % isopropylalkohol og deretter en andre gang med 100 volum % isopropylalkohol.
Tørking
Fibrene ble trukket ut med en pinsett og deretter frysetørket.
Resultater er gitt i tabell 1.
Tabell 2 viser utbyttene av mannuronsyre fra andre tangprøver produsert som i eksempel 1.
Eksempel 2 - Referanseeksempel
Modifisert prosess hvor pH er under 2,3 i pre-ekstraksjon trinnet
Beskrivelse av fremgangsmåten:
En prøve fra august 1996 av Durvillea antarctica malt til partikler større enn 70 mesh, ble anvendt som utgangsmaterialet.
Pre-ekstraksjons (svelling) trinn ved pH < 2,3
30 gram tørkede alger ble veiet i et kar. 100 ml 0,2 M HCI ble tilsatt og materialet ble fortynnet med vann til et volum på 500 ml. Etter noen få minutter med omrøring øket pH til > 2,3 og syre ble satt til for å holde pH lavere enn 2,3, etter 2 minutter var 2,5 ml 0,2M HCI tilsatt (pH1,8). Materialet svellet svært lite når pH ble holdt konstant under pH 2,3 ved pH 1,8, sammenlignet med svellingen i rent vann. Etter pre-ekstraksjon (svelling) i 1 time, ble materialet siktet på en 60 mesh filtrerduk, presset for hånd og overført til et kar.
Alkaliekstraksjon
500 ml vann og 50 ml soda-aske/natriumhydroksyd-løsning ble deretter satt til det resulterende materialet og ekstrahert ved 55 °C i 1 time. Materialet svellet meget raskt og ble tykk som en deig eller tremasse. Den ble lagret ved omgivelsestemperatur inntil neste dag. Deretter ble materialet ekstrahert videre i 1 time ved 55 °C og deretter malt på en blandeenhet. Total masse ble veiet til 549 gram.
Sikting og filtrering
150 gram av materialet ble fortynnet med 700 gram vann under omrøring. Løsningen ble deretter filtrert på filterpapir etter tilsetning av filterhjelpemiddel ved hjelp av vakuum fra vannsug.
Syreutfelling
Mengden filtrat ble veiet til 564 gram og ble avkjølt til 10°C.
Den ble tilsatt natriumklorid til 0,5 % og pH ble regulert til 1,6 med dråper fortynnet saltsyre (1:1). Et mykt presipitat ble dannet. Materialet ble deretter siktet på en 120-mesh filtrerduk og pressed forsiktig for hånd.
Nøytralisering
Materialet ble deretter suspendert i vann og fortynnet til et volum på ca. 200 ml ved en temperatur på 20 °C. pH i løsningen ble nøytralisert til 7 med fast soda-aske-pulver under anvendelse av en magnetisk rører.
Alkoholutfelling
Løsningen ble utfelt med like deler isopropylalkohol-løsning ved omrøring med en glasstav. De utfelte fibre ble vasket én gang med 70 volum% isopropylalkohol-løsning. Deretter vasket igjen med ren 100 volum % isopropylalkohol.
Tørking
Etter sikting og pressing på en 120-mesh filtrerduk, ble fibrene trukket ut med en pinsett og deretter frysetørket natten over i vakuum.
Resultat
Utbyttet ble veiet til 1,04 gram alginat, som tilsvarer 3,46 vekt % av Durvillea Antarctica utgangsmaterialet. Innholdet av M var 77 % og blokk-fordelingen i alginatet målt ved NMR som følger.
Eksempel 3
Modifisert prosess hvor pH er høyere enn 2,3 og salt blir tilsatt i "pre-ekstraksjons"-trinnet
Det er mulig ytterligere å øke innholdet av mannuronsyre ved å tilsette salt i "pre-ekstraksjons"-trinnet.
Beskrivelse av fremgangsmåten;
"Pre-ekstraksjon" trinn
20 gram Durvillea antarctica (malt til grove partikler > 70 mesh) alger fra Chile august 1996, ble tilsatt 500 ml vann og en viss mengde NaCI og ble ekstrahert under omrøring på en Jar- testmaskin, med en omrøringshastighet på 140 opm i 2 timer og ved en temperatur på 20 °C. Saltet ble tilsatt til en konsentrasjon i løsningen (vekt%), som angitt i tabell 3.
Sikting
Materialet ble deretter siktet på en 400 mesh filtrerduk og presset for hånd. Den siktede løsning ble veiet og pH målt som gitt i tabell 4.
Filtrering
Den siktede løsning ble deretter filtrert i vakuum (vannsug-pumpe) på en trakt med filterpapir. Viskositeten av den filtrerte løsningen ble målt med et glassrør og resultatene er gitt i tabell 5.
Syreutfelling
Filtratet ble avkjølt til under 15°C og hver av prøvene ble tilsatt dråper av 5,5 M saltsyre inntil pH nådde 1,8 - 2,0, under omrøring med en magnetisk rører. Et fiberformet presipitat ble dannet. Fellingen ble deretter siktet på en 400-mesh filtrerduk og presset for hånd.
Nøytralisering
Alginsyren ble deretter fortynnet med vann og nøytralisert med fast soda-aske til pH 6-7 under omrøring inntil den var fullstendig oppløst.
Alkoholutfelling
Løsningen ble deretter avkjølt og utfelt med like deler av isopropylalkohol. Deretter ble det vasket med 70 volum% isopropylalkohol og gjentatte ganger vasket med ren 100 volum % isopropylalkohol.
Tørking
De utfelte fibre ble trukket ut med en pinsett og overført til et kar og frysetørket natten over i vakuum.
Resultater
Resultatene er vist i tabell 6, hvor mengden av utbytte ble beregnet under den antagelse at intet alginat ble mistet og at alt alginat blir oppløst i vannet tilsatt.
Eksempel 4
Modifisert prosess hvor pH er over pH 2,3 og salt blir tilsatt i "pre-ekstraksjons"- trinnet
Beskrivelse av fremgangsmåten:
Innholdet av mannuronsyre i den separate fraksjon ble ytterligere øket ved tilsetning av CaCI2. Utgangsmaterialet var D. antarctica fra Chile som ble malt til grove partikler med en størrelse > 70 mesh.
"Pre-Ekstraksjon"
Mengdene og betingelsene for "pre-ekstraksjons"-trinnet er angitt i tabell 7. "Pre-ekstraksjonen"(ekstraksjon) ble utført under omrøring på en Jar-tester med ca. 140 opm.
Filtrering
Materialet ble deretter siktet på et 400-mesh filter og presset for hånd. Løsningen ble deretter oppvarmet til ca. 30°C og filtrert med papir på vakuumsug-kolbe.
Syreutfelling
Løsningen ble deretter avkjølt til 10°C og tilsatt natriumklorid til 0,5 %. Deretter ble 5,5 M HCI tilsatt dråpevis, med forsiktig magnetisk omrøring inntil pH 1,8. Et hvitt presipitat ble dannet. Materialsuspensjonen ble deretter oppbevart i 30 minutter og siktet på en 400-mesh filtrerduk og presset forsiktig for hånd. Materialet var en deigete gul masse, som ble til fine skinnende fibre etter pressing.
Nøytralisering
Det sure materialet ble deretter overført til et 250 ml kar og tilsatt vann for å bringe volumet opp til 200 ml og deretter nøytralisert til pH 7 med fast soda-aske under magnetisk omrøring.
Alkoholutfelling
Filtratet ble deretter avkjølt til 10 °C og utfelt under omrøring med
100 volum % isopropylalkohol i et forhold pål: 1. Store fibre ble utfelt.
Fibrene ble vasket to ganger med 70 volum% isopropylalkohol og til slutt med 100 volum% isopropylalkohol.
Tørking
Fibrene ble deretter trukket ut med en pinsett og deretter frysetørket natten over i vakuum.
Resultater
Resultatene er gitt i tabellene 9 og 10 som viser utbyttene og økningen i innhold av mannuronsyre i alginatet med mer enn 80% M, fra maksimum 91 % M når salt ikke ble tilsatt (se tabell 2), til et maksimum på 95% M når salt ble satt til i "pre-ekstraksjons"- trinnet.
Eksempel 5 - Referanse eksempel
Beskrivelse av en standard fremgangsmåte for fremstilling av alginat med et meget høyt mannuronsyre-innhold.
Ferske Ascophyllum nodosum alger fra Karmøy, Norge ble anvendt som utgangsmateriale.
Pressing
50 kg alger ble presset på en rullepresse av typen "Haller" med en kapasitet på 280 kg alger pr. time. Totalt 300 ml ekstrakt ble oppsamlet.
Filtrering
Ekstraktet ble filtrert på grovt filterpapir med anvendelse av vannsug.
Syreutfelling
Et volum på 255 g ble tilsatt 1,5 % NaCI og deretter dråpevis 5,5 M fortynnet saltsyre inntil pH 1,5 ble nådd. Gule flokker ble utfelt og ble siktet fra løsningen på en 400 mesh filtrerduk og presset for hånd.
Nøytralisering
Flokkene ble oppløst ved tilsetning av 50 ml vann og fast soda-aske til pH 9. Løsningen ble deretter filtrert med sort bånd filtrerpapir.
Alkoholutfelling
Løsningen ble utfelt med like mengder av isopropylalkohol.
Det utfelte materialet ble siktet på en 400-mesh filtrerduk og vasket én gang med aceton. Materialet ble deretter tørket i 4 timer ved 105 °C.
Resultater
Resultatene er gitt i tabell 11 nedenfor
Mannuronsyre-innholdet av alginatet fremstilt i referanse-eksempel 5, var 94,4 % M-blokker og 91,8% MM-blokker.
Claims (6)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av alginat som har et mannuronsyre-innhold på minst 80 mol%, karakterisert ved at nevnte alginat blir produsert ved: a) tilsetning av ferske eller tørkede alger eller tang til vann under omrøring, i et forhold på henholdsvis 1:3 til 1:20, ved en pH høyere enn ca. 2,3, mens det opprettholdes en temperatur over 20 °C i minst 30 minutter og b) separering av nevnte oppløste alginat fra det faste materialet i suspensjonen i trinn a) ved en standard separasjonsmetode så som filtrering, og eventuelt c) gjenvinning av nevnte alginat fra oppløsningen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1; karakterisert ved at pH er regulert til en verdi mellom 2,3 og 7.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved atpHeri området 5 til 7.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at temperaturen blir holdt ved 55 °C og ekstraksjonstiden ifølge krav 1 a) er 5,5 timer.
5. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at alginat blir gjenvunnet fra løsningen ifølge krav 1c) ved utfelling.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at ekstraksjonstrinnet ifølge krav 1a) ytterligere omfatter tilsetning av salt, så som CaCI2 eller NaCI innen et konsentrasjonsområde på 0,1-5 vekt% av løsning.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20015874A NO324131B1 (no) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | Fremgangsmate for fremstilling av alginat som har et hoyt mannuronsyre-innhold |
| PCT/NO2002/000431 WO2003046199A2 (en) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | Process for the production of alginate having a high mannuronic acid-content |
| AT02799859T ATE540982T1 (de) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | Verfahren zur herstellung von alginat mit hohem mannuronsäuregehalt |
| EP02799859A EP1461363B1 (en) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | Process for the production of alginate having a high mannuronic acid-content |
| CNB028237072A CN100467492C (zh) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | 具有高甘露糖醛酸含量的藻酸盐的制备方法 |
| CNA2009100034736A CN101514235A (zh) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | 具有高甘露糖醛酸含量的藻酸盐的制备方法 |
| AU2002364492A AU2002364492A1 (en) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | Process for the production of alginate having a high mannuronic acid-content |
| CA2467510A CA2467510C (en) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | Process for the production of alginate having a high mannuronic acid-content |
| US10/497,213 US7838641B2 (en) | 2001-11-30 | 2002-11-21 | Process for the production of alginate having a high mannuronic acid-content |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20015874A NO324131B1 (no) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | Fremgangsmate for fremstilling av alginat som har et hoyt mannuronsyre-innhold |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20015874D0 NO20015874D0 (no) | 2001-11-30 |
| NO20015874L NO20015874L (no) | 2003-06-02 |
| NO324131B1 true NO324131B1 (no) | 2007-09-03 |
Family
ID=19913091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20015874A NO324131B1 (no) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | Fremgangsmate for fremstilling av alginat som har et hoyt mannuronsyre-innhold |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7838641B2 (no) |
| EP (1) | EP1461363B1 (no) |
| CN (2) | CN101514235A (no) |
| AT (1) | ATE540982T1 (no) |
| AU (1) | AU2002364492A1 (no) |
| CA (1) | CA2467510C (no) |
| NO (1) | NO324131B1 (no) |
| WO (1) | WO2003046199A2 (no) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050087902A1 (en) * | 2003-10-28 | 2005-04-28 | Isaac Farr | Alginate-based materials, methods of application thereof, and systems for using the alginate-based materials |
| CN100425623C (zh) * | 2006-09-28 | 2008-10-15 | 青岛明月海藻集团有限公司 | 一种啤酒专用藻酸丙二醇酯的生产方法 |
| US20090060943A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | O'mara Brendan Joseph | Syndrome X Composition and Method of Lowering Blood Pressure and Glycemic Index |
| PT2268142T (pt) | 2007-11-27 | 2017-06-02 | Algipharma As | Utilização de oligómeros alginados no combate aos biofilmes |
| WO2009134368A2 (en) * | 2008-04-29 | 2009-11-05 | Marshall University Research Corporation | Methods of producing bacterial alginates |
| RU2582938C2 (ru) | 2009-06-03 | 2016-04-27 | АльгиФарма АС | Альгинатные олигомеры для применения в преодолении множественной лекарственной устойчивости у бактерий |
| CA2838953C (en) * | 2011-06-13 | 2015-01-06 | Al-G Technologies Inc. | Compositions, articles, apparatuses, methods and systems relating to algae biomass |
| NL2012987B1 (en) * | 2014-06-12 | 2016-07-04 | Univ Delft Tech | Biopolymer extraction. |
| CL2015001932A1 (es) | 2015-07-07 | 2015-11-20 | Jose Zaldivar Larrain Francisco | Material que comprende una mezcla de algas pardas, material celulósico y adhesivo, y proceso para su elaboración. |
| WO2018121581A1 (zh) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | 上海绿谷制药有限公司 | 多糖的臭氧降解方法 |
| CN107880150A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-04-06 | 四川大学 | 一种提高海藻酸盐中古洛糖醛酸单元含量的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2128551A (en) * | 1934-01-11 | 1938-08-30 | Algin Corp Of America | Method of treating seaweed |
| GB862702A (en) | 1958-11-03 | 1961-03-15 | Marcus Friedrich Karl | Improvements in or relating to methods for the production of alginic acid and alginates from algae |
| US3396158A (en) * | 1964-11-02 | 1968-08-06 | Norsk Inst For Tang Og Tarefor | Preparation of alginic acid by extraction of algae |
| US5596084A (en) * | 1994-10-05 | 1997-01-21 | Monsanto Company | Alginate gels |
| NO305033B1 (no) * | 1997-05-09 | 1999-03-22 | Algipharma As | Fremgangsmate for fremstilling av uronsyreblokker fra alginat |
| DE19836960A1 (de) | 1998-08-14 | 2000-02-17 | Ulrich Zimmermann | Verfahren zur Gewinnung hochgereinigter Alginate |
| KR100501584B1 (ko) | 2000-02-03 | 2005-07-18 | (주)케이비피 | 저분자 폴리만유로네이트의 제조방법, 혈청지질개선제로서의 이의 신규 용도 및 이를 함유하는 기능성식품 및 건강 보조 식품 |
| JP2002119226A (ja) | 2000-10-13 | 2002-04-23 | Yoko Shiga | 褐藻類の溶解およびその成分の抽出法と生成物の利用法 |
-
2001
- 2001-11-30 NO NO20015874A patent/NO324131B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-11-21 EP EP02799859A patent/EP1461363B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-21 CN CNA2009100034736A patent/CN101514235A/zh active Pending
- 2002-11-21 CA CA2467510A patent/CA2467510C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-21 WO PCT/NO2002/000431 patent/WO2003046199A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-11-21 AT AT02799859T patent/ATE540982T1/de active
- 2002-11-21 CN CNB028237072A patent/CN100467492C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-21 AU AU2002364492A patent/AU2002364492A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-21 US US10/497,213 patent/US7838641B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1596270A (zh) | 2005-03-16 |
| CA2467510C (en) | 2011-07-12 |
| CN101514235A (zh) | 2009-08-26 |
| AU2002364492A8 (en) | 2003-06-10 |
| US20050038237A1 (en) | 2005-02-17 |
| US7838641B2 (en) | 2010-11-23 |
| EP1461363A2 (en) | 2004-09-29 |
| ATE540982T1 (de) | 2012-01-15 |
| EP1461363B1 (en) | 2012-01-11 |
| CA2467510A1 (en) | 2003-06-05 |
| WO2003046199A3 (en) | 2003-08-14 |
| NO20015874D0 (no) | 2001-11-30 |
| CN100467492C (zh) | 2009-03-11 |
| AU2002364492A1 (en) | 2003-06-10 |
| NO20015874L (no) | 2003-06-02 |
| WO2003046199A2 (en) | 2003-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU770140B2 (en) | Polysaccharide compositions and uses thereof | |
| NO324131B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av alginat som har et hoyt mannuronsyre-innhold | |
| MXPA97000916A (en) | Preparation of inul products | |
| NO141412B (no) | Blanding inneholdende carragenan som ved opploesning i vann gir klare, elastiske vanngeler | |
| Bagde et al. | Extraction of pectin from orange peel and lemon peel | |
| JP5196075B2 (ja) | 高粘弾性かつ高強度寒天及びその製造法 | |
| CN100457782C (zh) | 葡甘聚糖生产方法 | |
| CN111491516A (zh) | 基于马铃薯蛋白的纤维结构和包含其的食品 | |
| EP0991669A1 (en) | Methods of obtaining selected pectin fractions, such fractions and their use | |
| CN105859911B (zh) | 一种透明质酸分离纯化的方法 | |
| AU2021106433A4 (en) | A method for preparing a food thickener from jackfruit perianth and ocimum americanum seed mucilage | |
| Humm | Agar: A Pre-War Japanese Monopoly | |
| CN115368419B (zh) | 板栗种仁寡糖提取物及其提取纯化方法 | |
| Mohamed et al. | Extraction and characterization of sodium alginates extracted from Sargassum muticum and Turbinaria conoides | |
| RU2357611C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357577C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357573C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2101294C1 (ru) | Способ получения пектина из надземных частей амаранта | |
| RU2357598C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357605C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357612C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357603C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357578C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357591C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака | |
| RU2357594C1 (ru) | Способ выработки восстановленного табака |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |