BRPI0819613B1 - método in vitro de combate a biofilme, uso de oligômeros de alginato, bem como produto, dispositivo médico implantável e composição de desbridamento estéril à base de óleo ou estéril aquosa compreendendo os mesmos. - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO IN VITRO DE COMBATE A BIOFILME, USO DE OLIGÔMEROS DE ALGINATO, BEM COMO PRODUTO, DISPOSITIVO MÉDICO IMPLANTÁVEL E COMPOSIÇÃO DE DESBRIDAMENTO ESTÉRIL À BASE DE ÓLEO OU ESTÉRIL AQUOSA COMPREENDENDO OS MESMOS.

(73) Titular: ALGIPHARMA IPR AS, Sociedade Norueguesa. Endereço: Industriveien 33, n-1337 sandvika, NORUEGA (NO) (72) Inventor: EDVAR ONSOYEN; ROLF MYRVOLD.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 11/12/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 11/12/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO IN VITRO DE COMBATE A BIOFILME, USO DE OLIGÔMEROS DE ALGINATO, BEM COMO PRODUTO, DISPOSITIVO MÉDICO IMPLANTÁVEL E COMPOSIÇÃO DE DESBRIDAMENTO ESTÉRIL À BASE DE ÓLEO OU ESTÉRIL AQUOSA COMPREENDENDO OS MESMOS.

A presente invenção refere-se a um método de combate a biofilmes. Em particular a presente invenção se refere ao uso de uma classe particular de alginatos, e em particular alguns oligômeros de alginato, para combater biofilmes, inclusive tanto superfícies bióticas como abióticas. Assim, são proporcionados tanto usos médicos como não-médicos e métodos, para combater a infecção por biofilme ou combater a formação de biofilme sobre superfícies inanimadas, por exemplo, para propósitos de desinfecção e limpeza. A invenção se baseia na descoberta surpreendente que alguns oligômeros de alginato são capazes de interagir e interferir no biofilme.

Em termos gerais, um biofilme é uma coleção ou comunidade de micro-organismos cercados por uma matriz de polímeros extracelulares (também conhecidos na técnica como glicocálix). Esses polímeros extracelulares são tipicamente polissacarídeos, especialmente polissacarídeos produzidos pelos próprios organismos, porém esses podem conter outros biopolímeros também. Um biofilme será tipicamente fixado a uma superfície, que pode ser inerte ou viva, porém também foi observado que os biofilmes podem ser formados de micro-organismos fixados uns aos outros ou em qualquer interface. Geralmente, portanto, um biofilme é caracterizado como uma comunidade multicelular altamente organizada de micro-organismos encerrados, ou circundados por uma matriz de polímero extracelular, geralmente uma matriz de polissacarídeo, e geralmente em estreita associação com uma superfície ou interface. Tal modo de crescimento é protetor aos microorganismos, e torna difícil sua remoção ou erradicação (por exemplo, como discutido adicionalmente abaixo, recalcitrante ou resistente a agentes antimicrobianos ou defesa do hospedeiro ou mecanismos de depuração). Acredita-se, de acordo com a presente invenção, que os oligômeros de alginato podem interagir com a matriz polimérica do biofilme, e assim enfraquecer o biofilme. Como discutido adicionalmente abaixo, os biofilmes causam proSegue-se folha 1a

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1a blemas comerciais, industriais e médicos significativos em termos de infec-

Petição 870180031554, de 18/04/2018, pág. 19/37 venção fornece uma vantagem significativa ao permitir ou facilitar o combate de tais biofilmes, inclusive tanto reduzindo como impedindo sua formação, e tornando-os mais suscetíveis à remoção ou redução, por exemplo, mais suscetíveis ao efeito de agentes antimicrobianos (inclusive desinfetantes ou antibióticos) ou de fato no caso de uma infecção, à resposta imune do hospedeiro infectado. A eficácia de agentes antimicrobianos, tanto terapêuticos como não-terapêuticos e inclusive particularmente antibióticos, pode ser, desse modo, aumentada.

Os biofilmes são encontrados ubiquitariamente em uma ampla variedade de superfícies ou interfaces (por exemplo, interfaces água/sólido e água/gás (por exemplo, água/ar)) se houver condições conducentes à colonização microbiana. Basicamente, um biofilme irá se formar onde houver micro-organismos e uma interface ou superfície, particularmente uma superfície exposta à água ou umidade e os biofilmes agora são identificados como o estado natural de crescimento microbiano sobre tais superfícies ou interfaces. Em termos básicos, como observado acima, um biofilme é o complexo e disposição organizada de colônias microbianas sobre uma superfície, ou em uma interface, que pode ocorrer particularmente na presença de água ou umidade. A organização dessas colônias resulta da capacidade de os microorganismos produzirem uma matriz extracelular organizada onde as células são incrustadas. Essa matriz é formada de biopolímeros produzidos pelos micro-organismos com polissacarídeos tipicamente o polímero predominante.

Os micro-organismos em uma comunidade de biofilme exibem propriedades no nível celular (fenótipo) que não são compartilhadas por seus equivalentes planctônicos (de flutuação livre). Na verdade, acredita-se que os micro-organismos em um biofilme são profundamente diferentes de células planctônicas de flutuação livre. Diferenças adicionais também podem ser observadas no nível de comunidade e são atribuídas aos efeitos da matriz extracelular. Talvez o fenômeno comumente observado mais notável seja que os micro-organismos em um ambiente de biofilme não exibem as mesmas suscetibilidades a agentes antimicrobianos, por exemplo, antibióti cos, fungicidas e microbicidas, e defesas imunológicas do hospedeiro ou mecanismos de depuração. Acredita-se que essa resistência se deve ao efeito de barreira da matriz extracelular e/ou uma alteração fenotípica nos próprios micróbios. Por exemplo, uma vez que os biofilmes são formados, os 5 anticorpos não se fixam mais aos micro-organismos (por exemplo, bactérias) dentro do biofilme. Experimentos mostraram anticorpos espessamente encrostados sobre a parte externa do biofilme, porém não dentro do próprio biofilme. Estudos sobre a atividade de leucócitos contra biofilmes demonstraram descobertas similares. A produção de toxinas também deve ser diferen10 te entre um micróbio planctônico e seu equivalente situado em uma colônia de biofilme sugerindo alterações fenotípicas nos micróbios. Também acredita-se que os micro-organismos em biofilmes podem se desenvolver mais lentamente, e como resultado absorvem agentes antimicrobianos mais lentamente.

Os biofilmes se formam facilmente em superfícies de ambientes aquáticos e uma colônia microbiana estabelecida sobre qualquer superfície exposta à água (qualquer superfície úmida) irá se apresentar certamente como uma estrutura de biofilme. Ademais, agora vem se tornando evidente e cada vez mais documentado que os biofilmes também podem se formar no 20 caso de infecções microbianas, ou seja, dentro ou em um hospedeiro infectado. Assim, a formação de biofilme também pode ocorrer em uma superfície fisiológica ou biológica, ou seja, sobre uma superfície viva ou biótica, ou uma superfície ou em um organismo do hospedeiro infectado (por exemplo, um animal humano ou não-humano), por exemplo, em uma superfície de 25 tecido ou corpo interna ou externa. Acredita-se que tal formação de biofilme (ou infecção) sobre tecidos corporais contribui cada vez mais para várias doenças infecciosas, inclusive, por exemplo, endocardite em válvulas nativas (válvulas mitral, aórtica, tricúspide, válvulas cardíacas), otite média aguda (ouvido médio), prostatite bacteriana crônica (próstata), fibrose cística (pul30 mões), pneumonia (trato respiratório), periodontite (tecidos que sustentam os dentes, por exemplo, gengiva, ligamento periodoníal, osso alveolar). Naturalmente, esses nichos de biofilme estão presentes quando dispositivos mé dicos forem implantados e a formação de biofilme sobre tais dispositivos implantados puder resultar em problemas clínicos com infecção em tais sítios, como endocardite em válvula prostética e infecção relacionada a dispositivo, por exemplo, com dispositivos intra-uterinos, lentes de contato, próteses (por exemplo, próteses articulares) e em sítios de cateterização, por exemplo, com cateteres venosos centrais ou urinários.

Um problema e risco significativo com tais infecções por biofilme é que os micro-organismos (ou mais particularmente microcolônias) podem se decompor ou se separar do biofilme, e entrar em outros tecidos, inclusive significativamente à circulação. Tais micro-organismos derivados de biofilme circulante podem causar infecções adicionais e resultar em problemas clínicos significativos, particularmente como os micro-organismos circulantes separados e podem possuir todas as características de resistência da comunidade de origem.

Uma infecção por biofilme tipicamente se desenvolve gradualmente e pode ser lenta para produzir sintomas visíveis. Uma vez estabelecidos, entretanto, os biofilmes são como observados acima difíceis de remover e uma infecção por biofilme será tipicamente persistente, e raramente resolvida por defesa do hospedeiro ou mecanismos imunológicos, mesmo em indivíduos com respostas imunes inatas e adaptativas saudáveis. As respostas de hospedeiro ativas podem ser, de fato, prejudiciais, por exemplo, a imunidade mediada por células (por exemplo, neutrófilos invasores) pode causar dano colateral ao tecido do hospedeiro saudável adjacente. As infecções por biofilme respondem apenas transitoriamente à terapia com antibiótico. Assim, enquanto as células microbianas planctônicas podem ser eliminadas por anticorpos ou fagócitos, e são suscetíveis a microbicidas, os micro-organismos em biofilmes tendem a ser resistentes a anticorpos, fagócitos e microbicidas. Os fagócitos são fixados ao biofilme, porém a fagocitose ó impedida. As enzimas fagocíticas são, contudo, liberadas e podem danificar o tecido em volta do biofilme. As bactérias planctônicas podem ser liberadas do biofilme e tal liberação pode causar disseminação e infecção aguda em tecido adjacente.

As superfícies de corpo ou tecido que morrem ou são danificadas (por exemplo, necróticas ou inflamadas) são particularmente suscetíveis à infecção por biofilme. As feridas são suscetíveis à infecção e a formação de biofilme pode ocorrer em feridas que não cicatrizam em um curto período de tempo. As feridas são um ambiente ideal para a formação de biofilmes devido à sua suscetibilidade à colonização bacteriana e à disponibilidade de substrato e superfície para fixação de biofilme. De forma problemática, a infecção de uma ferida geralmente atrasa a cura e desse modo torna aquela ferida mais suscetível à formação de biofilme e infecção estabelecida. As feridas onde a cura é atrasada (autodenominadas feridas crônicas) representam sítios de interesse particular com relação à formação de biofilme. Uma ferida crônica está em um estado inflamatório, com níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias. O efeito dessas citocinas é produzir um formigamento da área com células imunes (neutrófilos e macrófagos). Se esse sistema de defesa for de alguma forma atrasado (como em feridas crônicas), bactérias ou outros micro-organismos têm tempo de se fixar à superfície e entrar no modo de crescimento de biofilme. Há indícios cada vez mais crescentes que tanto feridas crônicas como agudas podem ser sítios de infecção por biofilme, com evidência de diversas comunidades ou populações microbianas em feridas, particularmente feridas crônicas, inclusive bactérias anaeróbicas dentro de feridas crônicas. As infecções de feridas crônicas compartilham dois atributos importantes com outras infecções por biofilme: infecção persistente que não é eliminada pelo sistema imunológico do hospedeiro mesmo em indivíduos com reações imunológicas inatas e adaptativas saudáveis, e resistência aumentada a agentes antimicrobianos sistêmicos e tópicos. Consequentemente, a infecção baseada em biofilme é muito difícil de tratar e a contaminação de biofilme é muito difícil de ser erradicada. O desbridamento frequente é um dos tratamentos clinicamente mais eficazes para ajudar a curar feridas crônicas. Esse é um tratamento eficaz, em parte, pois esse remove fisicamente o biofilme da ferida. Isso é similar em princípio a infecções resolutivas de dispositivos médicos in-dwelling colonizados por biofilme (por exemplo, cateteres)- quando a terapia com antibiótico for inefi6 caz a abordagem mais eficaz é remover ou substituir o dispositivo infectado por biofilme.

As feridas crônicas são um grande problema de saúde em todo o mundo e representam um consumo significativo em recursos clínicos. Três tipos principais de ferida crônica são úlceras de pé diabético, úlceras de perna venosa e úlceras de pressão, embora outras feridas, inclusive feridas cirúrgicas, possam se tornar crônicas. O tratamento de tal ferida exige grandes custos materiais e hospitalares, e consequentemente um tratamento antibiofilme eficaz, ou na verdade qualquer tratamento que auxiliou ou facilitou o tratamento de biofilmes, e assim acelerou ou facilitou a cura da ferida, poderia ter um impacto muito significativo.

Mais geralmente, determinada a grande ocorrência de biofilmes e os problemas médicos, ambientais, industriais ou outros que esses causam, qualquer meio de aprimorar ou permitir o combate a biofilmes poderia ser muito importante, tanto clínica como comercialmente.

Portanto, há a necessidade de novos métodos de combate a biofilmes, tanto em situações clínicas como industriais ou comerciais, e a presente invenção pretende atender essa necessidade.

Em particular, e como observado acima, foi verificado que uma classe particular de alginatos, ou seja, alguns oligômeros de alginato são eficazes como agentes anti-biofilme. Os oligômeros de alginato podem interagir com os polímeros extracelulares do biofilme, e com isso enfraquecêlos, permitindo ou facilitando sua remoção ou degradação (ou dissolução), e/ou facilitando o acesso de agentes antimicrobianos ao biofilme, com isso aumenta-se sua eficácia contra o biofilme. Consequentemente, de acordo com a presente invenção propõe-se um novo método ou meio para combater biofilme que envolve o uso de oligômeros de alginato.

Os alginatos são polímeros lineares de ácido β-D-manurônico (M) ligado (1-4) e/ou seu ácido α-L-gulirônico (G) de epímero C-5. A estrutura primária de alginatos pode variar bastante. Os resíduos M e G podem ser organizados como blocos homopoliméricos de resíduos M ou G contíguos, como blocos de resíduos M e G alternados e resíduos M ou G simples po dem ser encontrados entre-espaçando essas estruturas de bloco. Uma molécula de alginato pode compreender algumas ou todas essas estruturas e tais estruturas não devem ser uniformemente distribuídas por todo o polímero. Em extremo, há um homopolímero de ácido gulurônico (poliguluronato) ou um homopolímero de ácido manurônico (polimanuronato).

Os alginatos foram isolados de algas marinhas marrons (por exemplo, algumas espécies de Durvillea, Lessonia e Laminaria) e bactérias como Pseudomonas aeruginosa e Azotobacter vinelandii. Outras espécies de pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, e Pseudomonas mendocina) mantêm a capacidade genética de produzir alginatos, porém essas não produzem níveis detectáveis de alginato. Mediante mutação, essas pseudomonas não-produtoras podem ser induzidas a produzir quantidades estavelmente grandes de alginato.

O alginato é sintetizado como polimanuronato e resíduos de G são formados pela ação de epimerases (especificamente C-5 epimerases) nos resíduos M no polímero. No caso de alginatos extraídos de algas, os resíduos G são predominantemente organizados como blocos G, pois as enzimas envolvidas na biossíntese de alginato em algas, de preferência, introduzem no G adjacente outro G, convertendo assim os estiramentos de resíduos M em blocos G. A elucidação desses sistemas biossintéticos permitiu a produção de alginatos com estruturas primárias específicas (WO 94/09124, Gimmestad, M et al., Journal of Bacteriology, 2003, Vol 185(12) 3515-3523 e WO 2004/011628).

Os alginatos são tipicamente isolados de fontes naturais como polímeros de alto peso molecular (por exemplo, um peso molecular médio na faixa de 300.000 a 500.000 Dáltons. Sabe-se, entretanto, que tais grandes polímeros de alginato podem ser degradados, ou separados, por exemplo, por hidrólise química ou enzimática para produzir estruturas de alginato de peso molecular inferior. Os alginatos que são usados de maneira industrial tipicamente possuem um poso molecular médio na faixa de 100.000 a 300.000 Dáltons (ou seja,, tais alginatos ainda são considerados polímeros grandes), embora os alginatos de um peso molecular médio de aproxima8 damente 35.000 Dáltons sejam usados em produtos farmacêuticos.

Foi verificado que os oligômeros de alginato possuem a capacidade de interferir na matriz extracelular de biofilmes. Sem se ater a nenhuma teoria particular, acredita-se que essa interferência faz com que a matriz extracelular do biofilme se degrade e isso resulte na dissolução física do bioftime. A degradação também aumenta a exposição dos microorganismos dentro do biofilme (ou seus componentes imunogênicos, por exemplo, LPS e estruturas de peptidoglicano) às defesas imunológicas de um hospedeiro infectado e/ou quaisquer agentes antimicrobianos que foram, ou serão aplicados. A degradação também reduz a intimidade da relação entre a matriz extracelular e os micro-organismos e isso resulta em um aumento na sensibilidade do micro-organismo a agentes antimicrobianos em um nível fenotípico.

Portanto, a invenção fornece um método de combate a biofilme, *

sendo que o dito método compreende colocar o dito biofilme em contato com um oligômero de alginato. Como observado acima, os alginatos tipicamente se apresentam como polímeros de um peso molecular médio de ao menos 35.000 Dáltons, ou seja, aproximadamente 175 a 190 resíduos de monômero, embora tipicamente muito mais e um oligômero de alginato de acordo com a presente invenção pode ser definido como um material obtido por fracionamento (ou seja, redução de tamanho) de um polímero de alginato, comumente um alginato naturalmente ocorrente. Um oligômero de alginato pode ser considerado um alginato de um peso molecular médio menor que 35.000 Dáltons (ou seja, menor que aproximadamente 190 ou menor que 175 resíduos de monômero), em particular um alginato de um peso molecular médio menor que 30.000 Dáltons (ou seja, menor que aproximadamente 175 ou menor que 150 resíduos de monômero) mais particularmente um peso molecular médio menor que 25.000 ou 20.000 Dáltons (ou seja, menor que aproximadamente 135 ou 125 resíduos de monômero ou menor que aproximadamente 110 ou 100 resíduos de monômero).

Alternativamente observado, um oligômero geralmente compreende 2 ou mais unidades ou resíduos e um oligômero de alginato para uso de acordo com a invenção irá conter tipicamente 2 a 100 resíduos de monômero, de preferência, 2 a 75, de preferência, 2 a 50, com mais preferência, 2 a 40, 2 a 35 ou 2 a 30, ou seja, um oligômero de alginato para uso de acordo com a invenção terá tipicamente um peso molecular médio de 350 a 20.000 Dáltons, de preferência, 350 a 15.000 Dáltons, de preferência, 350 a 10.000 Dáltons e, com mais-preferência, 350 a 8000 Dáltons, 350 a 7000 Dáltons, ou 350 a 6.000 Dáltons.

Alternativamente, o oligômero de alginato pode possuir um grau de polimerização (DP), ou um grau médio de polimerização (DPn) de 2 a 100, de preferência, 2 a 75, de preferência, 2 a 50, com mais preferência, 2 a 40, 2 a 35 ou 2 a 30.

Conforme observado acima, os biofilmes tipicamente formados sobre as superfícies ou interfaces e o biofilme que é tratado de acordo com a presente invenção podem estar sobre qualquer superfície ou interface. Consequentemente, no método da invenção o biofilme pode estar sobre qualquer superfície animada ou inanimada (ou biótica ou abiótica), ou seja, qualquer superfície viva, ou superfície derivada de material vivo (por exemplo, tecido morto ou danificado, por exemplo, tecido necrótico) (o termo animado é usado aqui para incluir qualquer superfície viva ou qualquer superfície derivada de material vivo, em particular uma superfície viva que morreu), ou qualquer superfície inerte ou não-viva (uma superfície que não estava anteriormente viva ou animada).

O termo contatar inclui qualquer meio de aplicar o oligômero de alginato ao biofilme, seja direta ou indiretamente, e assim qualquer meio de aplicação do oligômero de alginato ao biofilme ou exposição do biofilme ao oligômero de alginato, por exemplo, aplicação do oligômero de alginato diretamente ao biofilme, ou administração do oligômero de alginato a um indivíduo com uma infecção por biofilme. Portanto, será avaliado que tanto métodos in vitro e in vivo estão incluídos.

Mais particularmonto o biofilme será colocado em contato com uma quantidade eficaz do oligômero cie alginato, mais particularmente uma quantidade do oligômero de alginato eficaz para combater o biofilme.

Um oligômero de alginato irá, conforme observado acima, conter (ou compreender) resíduos ou unidades de guluronato ou ácido gulurônico (G) e/ou manuronato ou ácido e ácido manurônico (M). Um oligômero de alginato de acordo com a invenção será, de preferência, composto somente, ou substancialmente somente (ou seja, consiste essencialmente em) de resíduos de uronato/ácido urônico, mais particularmente somente, ou substancialmente somente de resíduos G e/ou M. Alternativamente expressos, no oligômero de alginato de uso na presente invenção, ao menos 80%, mais particularmente ao menos 85, 90, 95 ou 99% dos resíduos de monômero podem ser resíduos de uronato/ácido urônico, ou, mais particularmente resíduos G e/ou M. Em outras palavras, de preferência, o oligômero de alginato não irá compreender outros resíduos ou unidades (por exemplo, outros resíduos de sacarídeo, ou mais particularmente outros resíduos de ácido urônico/uronato).

O oligômero de alginato é, de preferência, um oligômero linear.

Mais particularmente, em uma modalidade preferida ao menos 30% dos resíduos de monômero do oligômero de alginato são resíduos G (ou seja, guluronato ou ácido gulurônico). Em outras palavras, o oligômero de alginato irá conter ao menos 30% de resíduos de guluronato (ou ácido gulurônico). As modalidades específicas incluem, desse modo, oligômero de alginatos com (por exemplo, contendo) 30 a 70% de resíduos de G (guluronato) ou 70 a 100% de resíduos de G (guluronato). Assim, um oligômero de alginato representativo para uso de acordo com a presente invenção pode conter ao menos 70% de resíduos de G (ou seja, ao menos 70% dos resíduos de monômero do oligômero de alginato serão G resíduos).

De preferência, ao menos 60%, mais particularmente ao menos 70% ou 75%, ainda mais particularmente ao menos 80, 85, 95 ou 99% dos resíduos de monômero são guluronato. Em uma modalidade, o oligômero de alginato pode ser um oligoguluronato (ou seja, um homo-oligômero de G, ou 100% G).

Em uma modalidade preferida adicional, os alginatos descritos acima da invenção possuem uma estrutura primária onde a maior parte dos resíduos de G está em autodenominados blocos G. De preferência, ao menos 50%, com mais preferência, ao menos 70 ou 75%, e com mais preferência, ao menos 80, 85, 90 ou 95% dos resíduos de G simples estão em blocos G. Um bloco G é uma sequência contígua de ao menos dois resíduos de G, de preferência, ao menos 3 resíduos de G contíguos, com mais preferência, ao menos 4 ou 5 resíduos de G contíguos, com mais preferência, ao menos 7 resíduos de G contíguos.

Em particular ao menos 90% dos resíduos de G são ligados 1 -4 a outro resíduo de G. Mais particularmente, ao menos 95%, com mais preferência, ao menos 98%, e com mais preferência, ao menos 99% dos resíduos de G do alginato são ligados 1-4 a outro resíduo de G.

O oligômero de alginato de uso na invenção possui, de preferência, 3 a 35-meros, com mais preferência, 3 a 28-meros, em particular 4 a 25meros, especialmente 6 a 22-meros, em particular 8 a 20-meros, especialmente 10 a 15-meros, por exemplo, com um peso molecular na faixa de 350 a 6400 Dáltons ou 350 a 6000 Dáltons, de preferência, 550 a 5500 Dáltons, de preferência, 750 a 5000 Dáltons, e especialmente 750 a 4500 Dáltons.

Esse pode ser um composto único ou pode ser uma mistura de compostos, por exemplo, de uma faixa de graus de polimerização. Como observado acima, os resíduos monoméricos no oligômero de alginato podem ser iguais ou diferentes e nem todos precisam transportar grupos eletricamente carregados, embora seja preferido que a maioria (por exemplo, ao menos 60%, de preferência, ao menos 80%, com mais preferência, ao menos 90%) o faça. Prefere-se que uma maioria substancial, por exemplo, ao menos 80%, com mais preferência, ao menos 90% dos grupos carregados possua a mesma polaridade. No oligômero de alginato, a razão de grupos hidroxila para grupos carregados é, de preferência, ao menos 2:1, mais especialmente ao menos 3:1.

O oligômero de alginato da invenção pode possuir um grau de polimerização (DP), ou grau médio de polimerização (DPn), de 3 a 28, 4 a

25, 6 a 22, 8 a 20 ou 10 a 15, ou 5 a 18 ou 7 a 15 ou 8 a 12, especialmente

10.

A distribuição de peso molecular é, de preferência, tal que não mais de 5% em mol possuam um DP de dois maior que o limite superior relevante de DPn. Também prefere-se que não mais de 5% em mol possuam um DP abaixo de dois menor que o limite inferior relevante de DPn. Os oligômeros de alginato adequados são descritos nos W02007/039754, W02007/039760, e WO 2008/125828, cujas descrições estão explicitamente incorporadas aqui a título de referência em sua totalidade.

Os oligômeros de alginato adequados representativos possuem um DP_n na faixa de 5 a 30, uma fração de guluronato/galacturonato (F_G) de ao menos 0,80, uma fração de manuronato (F_M) de não mais que 0,20, e ao menos 95% em mol DP de não mais que 25.

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 7 a 15 (de preferência, 8 a 12), uma fração de guluronato/galacturonato (F_G) de ao menos 0,85 (de preferência, ao menos 0,90), uma fração de manuronato (F_M) de não mais que 0,15 (de preferência, não mais que 0,10), e com ao menos 95% rnols com um grau de polimerização de menos de 17 (de preferência, menos de 14).

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 5 a 18 (especialmente 7 a 15), uma fração de guluronato/galacturonato (F_G) de ao menos 0,80 (de preferência, ao menos 0,85, especialmente ao menos 0,92), uma fração de manuronato (F_M) de não mais que 0,20 (de preferência, não mais que 0,15, especialmente não mais que 0,08), e com ao menos 95% rnols com um grau de polimerização menor que 20 (de preferência, menor que 17).

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 5 a 18, uma fração de guluronato/ga!acturonato (F_G) de ao menos 0,92, uma fração de manuronato (F_M) de não mais que 0,08, e com ao menos 95% em mol com um grau de polimerização menor que 20.

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 5 a 18 (de preferência, 7 a 15, com mais preferência, 8 a 12, especialmente cerca de 10), uma fração de guluro13 nato/galacturonato (F_G) de ao menos 0,80 (de preferência, ao menos 0,85, com mais preferência, ao menos 0,90, especialmente ao menos 0,92, mais especialmente ao menos 0,95), uma fração de manuronato (Fm) de não mais que 0,20 (de preferência, não mais que 0,15, com mais preferência, não mais que 0,10, especialmente não mais que 0,08, mais especialmente não mais que 0,05), e com ao menos 95% rnols com um grau de polimerização menor que 20 (de preferência, menor que 17, com mais preferência, menor que 14).

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 7 a 15 (de preferência, 8 a 12), uma fração de guluronato/galacturonato (F_G) de ao menos 0,92 (de preferência, ao menos 0,95), uma fração de manuronato (F_M) de não mais que 0,08 (de preferência, não mais que 0,05), e com ao menos 95% em mol com um grau de polimerização menor que 17 (de preferência, menor que 14).

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 5 a 18, uma fração de guluronato/galacturonato (F_g) de ao menos 0,80, uma fração de manuronato (Fm) de não mais que 0,20, e com ao menos 95% em mol com um grau de polimerização menor que 20.

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 7 a 15, uma fração de guluronato/galacturonato (F_g) de ao menos 0,85, uma fração de manuronato (FM) de não mais que 0,15, e com ao menos 95% em mol com um grau de polimerização menor que 17.

Os oligômeros de alginato adequados adicionais possuem um grau médio de polimerização na faixa de 7 a 15, uma fração de guluronato/galacturonato (F_g) de ao menos 0,92, uma fração de manuronato (FM) de não mais que 0,08, e com ao menos 95% em mol com um grau de polimerização menor que 17.

O oligômero de alginato irá tipicamente transportar uma carga e então os contraions do oligômero de alginato podem ser qualquer íon fisiologicamente tolerável, especialmente aqueles comumente usados para subs14 tâncias de fármaco carregadas, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cloreto, mesilato, meglumina, etc. Os íons que promovem a gelificação de alginato, por exemplo, íons de metal do grupo 2 também podem ser usados.

Embora o oligômero de alginato possa ser um material sintético gerado a partir da polimerização de números adequados de resíduos de guluronato e manuronato, os oligômeros de alginato de uso na invenção podem ser convenientemente obtidos, produzidos ou derivados, de fontes naturais como aquelas mencionadas acima, ou seja, materiais de fonte de alginato natural.

A divagem de polissacarídeo para oligossacarídeo para produzir o oligômero de alginato usável de acordo com a presente invenção pode ser realizada utilizando técnicas de lise de polissacarídeo convencionais como digestão enzimática e hidrólise ácida. Os oligômeros podem ser então separados dos produtos de degradação de polissacarídeo de maneira cromatográfica utilizando uma resina de troca iônica ou por precipitação fracionada ou solubilização ou filtração. US 6.121.441 e WO 2008/125828, que estão aqui explicitamente incorporados a título de referência em sua totalidade, descrevem um processo adequado para preparar os oligômeros de alginato de uso na invenção. Informações e discussões adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em Handbooks of Hydrocolloids, Ed. Phillips and Williams, CRC, Boca Raton, Florida, USA, 2000, tal manual está aqui explicitamente incorporado a título de referência em sua totalidade.

Os oligômeros de alginato também podem ser quimicamente modificados, inclusive, porém sem caráter limitativo, modificação para adicionar grupos carregados (como glicanos carboxilados ou carboximetilados) e os oligômeros de alginato modificados para alterar a flexibilidade (por exemplo, por oxidação de periodato)

Os oligômeros de alginato (por exemplo, ácidos oligogulurônicos) adequados para uso de acordo com a invenção poclem ser convenientemente produzidos por hidrólise ácida de ácido algínico e, porém sem caráter limitativo, de Laminaria hyparbora e Lessonia nigrescens, a dissolução em pH neutro, adição de ácido mineral reduzem o pH para 3,4 cie modo a precipitar o oligômero de alginato (ácido oligogulurônicos), lavagem com ácido fraco, ressuspensão em pH neutro e secagem por congelamento.

Os alginatos para a produção de oligômeros de alginato da invenção também podem ser obtidos diretamente a partir de fontes bacterianas adequadas, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa ou Azotobacter vinelandii, embora espera-se .que fontes de algas sejam mais adequadas devido ao fato de que os alginatos produzidos nesses organismos tendem a possuir estruturas primárias onde a maior parte dos resíduos de G foca disposta em blocos G em vez de resíduos simples.

O aparelho molecular envolvido em biossíntese de alginato em Pseudomonas fluorescens e Azotobacter vinelandii foi clonado e caracterizado (WO 94/09124; Ertesvag, H., et al., Metabolic Engineering, 1999, Vol 1 , 262-269; WO 2004/011628; Gimmestad, M., et al. (supra); Remminghorst and Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol 28, 1701-1712; Gimmestad, M. et al., Journal of Bacteriology, 2006, Vo1 188(15), 5551-5560) e os alginatos de estruturas primárias ajustadas podem ser facilmente obtidos mediante a manipulação desses sistemas.

O teor de G de alginatos (por exemplo, um material de fonte de alginato) pode ser aumentado por epimerização, por exemplo, com manurano C-5 epimerases de A.vinelandiiou outras enzimas de epimerase. Assim, por exemplo, a epimerização in vitro pode ser realizada com epimerases isoladas de Pseudomonas ou Azotobacter, por exemplo, AlgG de Pseudomonas fluorescens ou Azotobacter vinelandii ou as enzimas AlgE (AlgE1 a AlgE7) de Azotobacter vinelandii. O uso de epimerases de outros organismos que possuem a capacidade de produzir alginato, particularmente algas, também é especificamente contemplado. A epimerização in vitro de alginatos de baixo teor de G com epimerases AlgE Azotobacter vinelandii é descrita em detalhes em Ertesvag et al. (supra) e Strugala et al. (Gums and Stabilisers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84 - 94). A epimerização com uma ou mais epimerases AlgE Azotobacter vinelandii em vez de AlgE4 é preferida visto que essas enzimas são capazes cie produzir estruturas de bloco G. As versões modificadas ou homólogos de outros or ganismos também são especificamente contempladas para uso. WO 94/09124 descreve enzimas manuronano C-5 epimerase recombinantes ou modificadas (enzimas AlgE) por exemplo, codificadas por sequências de epimerase onde as sequências de DNA que codificam os domínios ou módulos diferentes das epimerases foram misturadas ou deletadas e recombinadas. Alternativamente, os mutantes de enzimas epimerase naturalmente ocorrentes, (AlgG ou AlgE) podem ser usados, obtidos, por exemplo, por mutagênese sítio dirigida ou aleatória dos genes AlgG ou genes AlgE.

Uma abordagem diferente é criar organismos Pseudomonas e Azotobacter que são modificados em alguns ou todos os seus genes de epimerase de tal maneira que aqueles mutantes produzam alginatos da estrutura exigida de produção de oligômero de alginato, ou ainda oligômeros de alginato da estrutura e tamanho exigidos (ou peso molecular). A geração de inúmeros organismos Pseudomonas fluorescens com genes AlgG modificados é descrita em detalhes no WO 2004/011628 e Gimmestad, M., et al., 2003 (supra). A geração de inúmeros organismos Azotobacter vinelandii com genes AlgE modificados é descrita em Gimmestad, M., et al., 2006 (supra). O versado na técnica poderia ser capaz de utilizar esse ensinamento para produzir novos mutantes que poderiam produzir oligômeros de alginato da invenção sem carga exagerada.

Uma abordagem adicional é deletar ou inativar os genes de epimerase endógenos de um organismo Azotobacter ou Pseudomonas e então introduzir um ou mais genes de epimerase exógenos, que podem ou não ser modificados (ou seja, podem ser do tipo selvagem ou modificados) e cuja expressão pode ser controlada, por exemplo, pelo uso de promotores induzíveis ou outros promotores controláveis. Mediante a seleção adequada de combinações de genes, alginatos de estrutura primária predeterminada podem ser produzidos.

Ainda uma abordagem adicional poderia ser introduzir algum ou todo o mecanismo de biossíntese de alginato de Pseudomonas e/ou Azotobacter em um organismo não-produtor de alginato (por exemplo, E. coli) e induzir a produção de alginato a partir desses organismos geneticamente modificados.

Quando esses sistemas baseados em cultura forem usados, a estrutura primária do alginato ou oligômero de alginato pode ser influenciada pelas condições de cultura. Está bem dentro das capacidades do versado na técnica ajustar os parâmetros de cultura como temperatura, osmolaridade, níveis/fontes de nutrientes e parâmetros atmosféricos para manipular a estrutura primária dos alginatos produzidos por um organismo particular.

Referências a resíduos de G/G e resíduos de M/M ou a ácido gulurônico ou ácido manurônico, ou guluronato ou manuronato devem ser interpretadas de maneira intercambiável como referência a ácido gulurônico/guluronato e ácido manurônico/manuronato (especificamente ácido a-Lgulurônico/guluronato e ácido β-D-manurônico/manuronato), e incluem ainda derivados desses onde uma ou mais cadeias laterais ou grupos disponíveis foram modificadas sem resultar em atividade antibiofilme que é substancialmente menor que aquela do polímero não-modificado. Grupos modificadores de sacarídeo comuns poderíam incluir grupos acetila, sulfato, amino, desóxi, álcool, aldeído, cetona, éster e anidro. Os oligômeros de alginato também podem ser quimicamente modificados para adicionar grupos carregados (como glicanos carboxilados ou carboximetilados), e para alterar a flexibilidade (por exemplo, por oxidação de periodato). O versado na técnica poderia estar ciente de modificações químicas adicionais que podem ser feitas nas subunidades de monossacarídeo de oligossacarídeos essas podem ser aplicadas aos alginatos da invenção.

Por biofilme entende-se uma comunidade de micro-organismos caracterizada por uma predominância de células sésseis que são fixadas a um substrato ou interface ou umas às outras (algumas células móveis também podem estar presentes) e que são incorporadas em uma matriz de polímeros extracelulares (mais especificamente polímeros extracelulares que essas produziram) caracterizada pelo fato de que os micro-organismos dessa colônia exibem um fenctipo alterado com relação à taxa de crescimento e transcrição genética (por exemplo, como comparado com suas contrapartes não-biofilme ou de flutuação livre ou planctônicas).

O termo combate ao biofilme é usado amplamente aqui para incluir qualquer efeito na dissolução, redução, ou degradação de um biofilme (ou seja, ataque a um biofilme existente) ou para tornar o mesmo mais suscetível ao efeito de um agente antimicrobiano ou uma resposta imunológica do hospedeiro, bem como inibir, reduzir, atrasar ou impedir a formação de um biofilme. Assim, combater inclui qualquer tratamento de um biofilme que possui um efeito negativo sobre o biofilme.

Combate ao biofilme inclui, desse modo, medidas ou tratamentos preventivos e reacionários. O combate ao biofilme, portanto, inclui a prevenção de formação de um biofilme, a eliminação de um biofilme, uma redução no tamanho do biofilme, uma redução no número de micróbios em uma colônia de biofilmes, uma redução ou cessação na taxa de crescimento de um biofilme, uma redução ou cessação da taxa de expansão no número de micróbios em uma colônia de biofilmes, uma redução na integridade física de um biofilme, um aumento na sensibilidade dos micróbios em uma colônia de biofilmes a um agente antimicrobiano ou mecanismo de defesa imunológica do hospedeiro e um aumento na permeabilidade de um biofilme a um agente antimicrobiano ou mecanismo de defesa imunológica do hospedeiro.

O método da invenção pode ser, desse modo, usado clinicamente, por exemplo, no tratamento de uma infecção por biofilme, ou esse pode ser usado na limpeza ou descontaminação de qualquer superfície, por exemplo, de uma superfície comercial ou industrial.

O tamanho, estrutura, integridade, e número de microorganismos em um biofilme podem ser analisados por qualquer método conveniente. Por exemplo, a microscopia eletrônica de transmissão e varredura é geralmente usada para avaliar o tamanho, integridade e estrutura de um biofilme. A coloração histoquímica dos micro-organismos e/ou dos componentes de matriz extracelular também é rotineira (por exemplo, corante BOD|py® 630/650-X SE para componentes de matriz de biofilmes Pseudomonas e corante Fft/P 1-43 para membranas celulares Pssudomonas) e pode ser usada para avaliar o número de micróbios e estrutura de biofilme e integridade visualmente ou com o auxílio de dispositivos de classificação celular, microscópios confocais ou microscópios de epifluorescência. O ensaio MBEC, Moskowitz SM1 et al. (2004) J Clin Microbiol, 42: 1915-1922 descrito em mais detalhes nos Exemplos pode ser usado para avaliar a sensibilidade de micro-organismos em um biofilme a um agente antimicrobiano. Donlan e Costerton, 2002, Clin. Mic. Rev., Vo1 15(2), 167-193 fornece exemplos adicionais.

Os biofilmes que podem ser combatidos de acordo com a invenção não são limitados em termos dos micro-organismos nos biofilmes visto que o oligômero de alginato da invenção, inter alia, marca a matriz extracelular. Consequentemente, o biofilme pode compreender qualquer classe, gênero ou espécie de micro-organismo, ou seja, qualquer micro-organismo que pode formar um biofilme. Tais micro-organismos incluem tipicamente bactérias, inclusive qualquer gênero ou espécie de bactérias. Assim, as bactérias podem ser gram positivas ou gram negativas, ou teste gram nãoresponsivas. Essas podem ser aeróbicas ou anaeróbicas. As bactérias podem ser patogênicas ou não-patogênicas, ou bactérias deteriorantes ou indicadoras. Exemplos de gêneros ou espécies de bactérias incluem, porém sem caráter limitativo, Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bifidobacterium, Bilophila Branhamella, Borre lia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Delftia, Dermabacter, Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialisier, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranuium, Edwardsiella, Eggerthella, Ehriichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Er winia, Erysipelothrix, Escheríchia, Eubacteríum, Ewingella, Exiguobacteríum, Facklamia, Filifactor, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Globicatella, Gemella, Gordona, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella, Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycobacteríum, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia, Oligella, Oríentia, Paenibacillus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Photobacteríum, Photorhabdus, Plesiomonas, Porphyrimonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia Rochalimaea Roseomonas, Rothia, Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacteríum, Sphingomonas, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia, e Yokenella-, por exemplo, bactérias gram-positivas como espécies M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, M. bovis strain BCG, BCG substrains, M. avium, M. intracellular, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium subspecies paratuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus anthracis, B. subtilis, Nocardia asteroides, Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes, e Enterococcus e bactérias Gram-negativas como Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi,

Brucella abortus, Chlamydi trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Escheríchia coli, Neiserría meningitidis, Neiserría gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia coli, E. hirae, Burkholdería cepacia, Burkholdería pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum, Cowdria ruminantium.

Assim, a título de exemplo representativo, o biofilme pode conter bactérias do gênero Staphylococcus, Pseudomonas, Legionella, Mycobacterium, Proteus, Klebsiella, Fusobacterium ou outras bactérias entéricas ou coliformes.

Os biofilmes também podem conter fungos, inclusive, por exemplo, dos gêneros Candida, Aspergillus, Pneumocystis, Penicillium e Fusaríum. As espécies de fungos representativas incluem, porém sem caráter limitativo, Candida albicans, Candida dubliniensis, Cryptococcus neoformans, Histoplama capsulatum, Aspergillus fumigatus, Coccidiodes immitis, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermitidis, Pneomocystis carnii, Penicillium marneffi, Alternaria alternate.

Algas também podem estar contidas em um biofilme e espécies de algas representativas incluem Chaetophora, Chlorella protothecoides, Coleochaete scutata, Coleochaete soluta, Cyanidioschyzon merolae Aphanochaete, Gloeotaenium, Oedogonium, Oocystis, Oscillatoria, Paradoxia multisitia, Phormidium, Chroococcus, Aphanothece, Fragillaría, Cocconis, Navicula, Cymbella, Phaeodactylum bem como cianobacterias (algas azuisesverdeadas) e diatomáceas como Nitzschia palea.

Os biofilmes também podem conter outros organismos como, por exemplo, parasitas, por exemplo, protozoários como a espécie Toxoplasma, por exemplo, espécie Toxoplasma gondii, Plasmodium como espécie Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae. Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania como Leishmania major, Schistosoma como Schistoso.ma mansonie Entamoeba histolytica.

É comum um bioíilme compreender uma colônia misturada de micro-organismos e assim o biofilme combatido pelos oligômeros de alginato de acordo com a invenção pode compreender qualquer número das espécies mencionadas acima. De preferência, ao menos duas, com mais preferência, ao menos 5 e, com mais preferência, ao menos 10.

De preferência, a colônia de biofilmes compreende micróbios de ao menos um dos seguintes gêneros: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes, Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholdería, Fusobacteríum and Mycobacteríum, for instance, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholdería cepacia e Streptococcus Pyogenes.

Como observado acima o biofilme pode estar presente sobre uma superfície. A superfície não é limitada e inclui qualquer superfície sobre qual um micro-organismo se instala, particularmente, como observado acima, uma superfície exposta à água ou umidade. A superfície pode ser biótica ou abiótica, e as superfícies inanimadas (ou abióticas) incluem qualquer superfície que pode ser exposta ao contato ou contaminação microbiana. Assim, as superfícies estão particularmente incluídas na maquinaria, especialmente maquinaria industrial, ou qualquer superfície exposta a um ambiente aquático (por exemplo, equipamento marítimo, ou navios ou barcos ou suas partes ou componentes), ou qualquer superfície exposta a alguma parte do ambiente, por exmeplo, tubos ou em construções. Tais superfícies inanimadas expostas ao contato ou contaminação microbiana incluem em particular qualquer parte de: maquinaria ou equipamento de processamento, preparação, armazenamento ou distribuição de alimentos ou bebidas, aparelho de condicionamento de ar, maquinaria industrial, por exemplo, em usinas de processamento químico ou biotecnológico, tanques de armazenamento e equipamento médico ou cirúrgico. Qualquer aparelho ou equipamento para conduzir ou transportar ou entregar materiais, que pode ficar exposto à água ou umidade está suscetível à formação de biofilme. Tais superfícies irão incluir particularmente tubos (tal termo é ampiamente usado aqui para incluir qualquer conduto ou tubulação). As superfícies inanimadas ou abióticas re presentativas incluem, porém sem caráter limitativo, equipamento de processamento, armazenamento, distribuição de alimentos ou superfícies, tanques, transportadores, pisos, escoadouros, refrigeradores, congeladores, superfícies de equipamentos, paredes, válvulas, correias, tubos, condutos de condicionamento de ar, aparelho de resfriamento, montagens de distribuição de alimentos ou bebidas, trocadores de calor, cascos de navios ou qualquer parte de uma estrutura de um barco que fica exposta à água, equipamentos odontológicos, condutos de perfuração de poços de petróleo, lentes de contato e caixas de armazenamento. Como observado acima, equipamentos ou dispositivos médicos ou cirúrgicos representam uma classe particular de superfície sobre a qual um biofilme pode ser formado. Esses podem incluir qualquer tipo de tubo, inclusive cateteres (por exemplo, cateteres venosos centrais e urinários), dispositivos protéticos, por exemplo, válvulas cardíacas, articulações artificiais, dentaduras, coroas dentárias, capas dentárias e implantes de tecidos moles (por exemplo, implantes de mama, nádegas e lábio). Qualquer tipo de dispositivo médico implantável está incluído (por exemplo, stents, dispositivos intrauterinos, marca-passos, tubos de entubação, próteses ou dispositivos protéticos, tubos ou cateteres). Um dispositivo médico implantável pode incluir um dispositivo onde qualquer parte desse está contida dentro do corpo, ou seja, o dispositivo pode ser completa ou parcialmente implantável.

A superfície pode ser feita de qualquer material. Por exemplo, essa pode ser de metal, por exemplo, alumínio, aço, aço inoxidável, cromo, titânio, ferro, ligas desses, e similares. A superfície também pode ser de plástico, por exemplo, poliolefina (por exemplo, polietileno, polietileno (Peso Molecular Ultra-Alto), polipropileno, poliestireno, poli(met)acrilato, acrilonitrila, butadieno, ABS, butadieno acrilonitrila, etc.), poliéster (por exemplo, tereftalato de polietileno, etc.), e poliamida (por exemplo, náilon), combinações desses, e similares. Outros exemplos incluem copolímero de acetal, polifenil sulfona, polissulfona, politermida, poliearbonato, poliéter éter cetona, fluoreto de polivinilideno, poli(metil metacrilato) e poli(tetrafluoroetileno). A superfície também pode ser tijolo, telha, cerâmica, porcelana, madeira, vinila, linóleo, ou tapete, combinações desses, e similares. As superfícies também podem ser alimentos, por exemplo, carne bovina, frango, porco, vegetais, frutas, peixe, molusco, combinações desses, e similares.

Uma superfície biótica ou animada pode incluir qualquer superfície ou interface no ou sobre o corpo. Consequentemente, essa, como observado acima, pode ser vista como uma superfície fisiológica ou biológica. Pode ser qualquer superfície de corpo interna ou externa, inclusive qualquer tecido, que pode incluir tecido hematológico ou hemotopoiético (por exemplo, sangue). Como discutido acima, o tecido morto ou quase morto (por exemplo, necrótico) ou danificado (por exemplo, inflamado ou rompido) é particularmente suscetível ao crescimento de biofilme e tal tecido é abrangido pelo termo animado ou biótico. A superfície pode ser uma superfície mucosa ou não-mucosa.

As superfícies bióticas representativas incluem, porém sem caráter limitativo, qualquer superfície na cavidade oral, por exemplo, dentes, gengiva, fissura gengival, bolsa periodontal, trato reprodutivo (por exemplo, cérvice, útero, tubos falopianos), o peritônio, ouvido médio, próstata, trato urinário, íntima vascular, conjuntiva, tecido da córnea, o trato respiratório, tecido pulmonar (por exemplo, bronquial e alveolar), válvulas cardíacas, trato gastrointestinal, pele, escalpo, unhas e o interior das feridas, particularmente feridas crônicas, que podem ser feridas tópicas ou internas.

Em um aspecto, a superfície não será mucosa, ou mais particularmente não terá uma cobertura de muco hiperviscoso. O versado na técnica será capaz de determinar quando o muco em uma determinada superfície é hiperviscoso. Em uma modalidade, a superfície não será a superfície de um tecido secretor de muco. Mais particularmente em tal modalidade a superfície não será a superfície de um tecido coberto por muco. O versado na técnica saberá a partir de seu conhecimento geral comum quais os tecidos que secretam muco e aqueles que são cobertos por muco.

Consequentemente, será observado que a invenção fornece usos médicos dos oligômeros de alginato, como definido aqui, para o tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme em um indivíduo (por e25 xemplo, infecção por biofilme com qualquer micro-organismo, inclusive bactérias, vírus, fungos ou parasitas como protozoários). A infecção pode ser uma infecção patogênica. Exemplos representativos de micro-organismos que podem causar infecção estão descritos acima. As infecções causadas por Citrobacter, Enterobacter, Escheríchia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes, Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholdería, Fusobacterium and Mycobacterium, for instance, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholdería cepacia e Streptococcus Pyogenes são de interesse. As infecções causadas por Pseudomonas, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, são de interesse particular.

O termo em um indivíduo é amplamente usado aqui para incluir infecção por biofilme que ocorre dentro de um indivíduo ou em um indivíduo, por exemplo, em uma superfície externa do corpo. A infecção por biofilme pode ser crônica (ou seja, pode ser uma infecção por biofilme crônica), por exemplo, uma infecção que persiste durante ao menos 5 ou ao menos 10 dias, particularmente ao menos 20 dias, mais particularmente ao menos 30 dias, mais particularmente ao menos 40 dias. As infecções crônicas geralmente se manifestam como infecções por biofilme, porém uma infecção por biofilme não precisa ser uma infecção crônica, como definido acima.

Nesse aspecto da invenção, a infecção por biofilme pode ocorrer em uma superfície no indivíduo (ou seja, uma superfície biótica como discutido acima) e/ou uma superfície de um dispositivo médico, particularmente um dispositivo médico implantável ou implantável. Consequentemente, nesse aspecto a invenção fornece um oligômero de alginato (que pode ser qualquer oligômero de alginato como definido aqui) para uso no tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme em um indivíduo.

Altemativamente, esse aspecto da invenção fornece o uso de um oligômero de alginato para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme em um indivíduo.

Esse aspecto da invenção também fornece um método para o tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme em um indivíduo, sendo que o dito método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um oligômero de alginato a um indivíduo necessitado desse.

Também proporciona-se o uso de um oligômero de alginato no tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme em um indivíduo.

O indivíduo pode ser qualquer animal humano ou não-humano, porém mais particularmente pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero, uma ave, um peixe ou um réptil. Os indivíduos humanos são preferidos, porém o indivíduo pode ser, por exemplo, qualquer gado ou animal doméstico, ou, por exemplo, um animal de um zoológico. Assim, os animais representativos incluem cães, gatos, coelhos, camundongos, porquinhos-daíndia, hamsters, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, vacas, pássaros e peixes. Os usos veterinários da invenção são, desse modo, cobertos. O indivíduo pode ser visto como um paciente.

Uma infecção por biofilme pode ocorrer em qualquer indivíduo, porém alguns indivíduos serão mais suscetíveis à infecção do que outros. Os indivíduos que são suscetíveis à infecção por biofilme incluem, porém sem caráter limitativo, indivíduos cuja barreira epitelial e/ou endotelial está enfraquecida ou comprometida, indivíduos cujas defesas à base de secreção contra infecção por micro-organismos foram suprimidas, subtraídas ou enfraquecidas, e indivíduos que são imunocomprometidos, imunodeficientes ou imunossuprimidos (ou seja, um indivíduo em que alguma parte do sistema imunológico não está funcionando normalmente, ou está funcionando subnormalmente, em outras palavras, em que alguma parte da resposta imunológica, ou uma atividade imune é reduzida ou comprometida, seja devido à doença ou intervenção clínica ou outro tratamento, ou de qualquer maneira).

Exemplos representativos de indivíduos que são suscetíveis à infecção por biofilme incluem, porém sem caráter limitativo, indivíduos com uma infecção preestabelecida (por exemplo, por bactérias, vírus, fungos ou parasitas como protozoários), especialmente indivíduos com HIV, indivíduos com sepse e indivíduos com choque séptico; indivíduos com imunodeficiên cia, por exemplo, indivíduos que estão se preparando, sendo submetidos ou se recuperando de quimioterapia e/ou radioterapia, indivíduos com órgãos transplantados (por exemplo, medula óssea, fígado, pulmão, coração, válvula cardíaca, rim, etc.) (inclusive pacientes com autoenxerto, aloenxerto e xenoenxerto), indivíduos com AIDS; indivíduos hospitalizados, por exemplo, hospital, especialmente indivíduos em tratamento intensivo ou tratamento crítico (ou seja, aquelas unidades preocupadas com a provisão de sistemas de suporte de vida suporte de órgãos a pacientes); indivíduos que sofrem de trauma; indivíduos com queimaduras, indivíduos com feridas agudas e/ou crônicas; indivíduos recém-nascidos; indivíduos idosos; indivíduos com câncer (amplamente definidos aqui para incluir qualquer condição neoplásica; maligna ou não-maligna), especialmente aqueles com cânceres do sistema imune (por exemplo, leucemias, linfomas e outros cânceres hematológicos); indivíduos que sofrem de condições autoimunes como artrite reumatoide, diabetes melito tipo I, doença de Crohn, especialmente aqueles que são submetidos a tratamento de imunossupressão daquelas doenças; indivíduos com secreção epitelial ou endotelial reduzida ou suprimida (por exemplo, muco, lágrimas, saliva) e/ou depuração de secreção (por exemplo, indivíduos com tecido ciliar de funcionamento insatisfatório em tecido mucoso e/ou pacientes com muco hiperviscoso (por exemplo, fumantes e indivíduos com broncquite COPD1, fibrose cística, enfisema, câncer de pulmão, asma, pneumonia ou sinusite) e indivíduos adaptados com um dispositivo médico.

Assim, indivíduos nos quais infecções por biofilme podem ser particularmente combatidas de acordo com a presente invenção incluem pacientes que continuam comprometidos, seja devido à perfusão insatisfatória, trauma repetitivo, nutrição insatisfatória, oxigenação insatisfatória ou disfunção de leucócitos.

Os indivíduos que foram submetidos a trauma físico são de interesse particular. O trauma por si só deve causar um enfraquecimento ou comprometimento de urna barreira epitelial e/ou endotelial do indivíduo ou o indivíduo pode se tornar imunocomprometido em resposta ao trauma (uma resposta de choque). O termo trauma se refere amplamente ao ataque ce lular por corpos estranhos e/ou lesão física de células. Incluídos entre os corpos estranhos estão micro-organismos, matéria particulada, agentes químicos, e similares. Incluídos entre os danos físicos estão danos mecânicos; danos térmicos, como aqueles resultantes de calor ou frio excessivo; danos elétricos, como aqueles causados por contato com fontes de potencial elétrico; e dano por radiação causado, por exemplo, por exposição prolongada, extensiva a radiações infravermelha, ultravioleta ou ionizante.

Os indivíduos que possuem uma também são de interesse particular. Qualquer queimadura, em particular uma queimadura grave, possui um impacto significativo sobre a integridade da barreira epitelial e/ou endotelial do indivíduo e o indivíduo ficará geralmente imunocompromometido em resposta à queimadura (uma resposta a choque).

Os agentes causadores de queimadura típicos são de temperatura extrema (por exemplo, fogo e líquidos e gases em temperatura extrema), eletricidade, produtos químicos corrosivos, atrito e radiação. A extensão e duração de exposição, juntamente com a intensidade/resistência do agente, resultam em queimadura de gravidade variada. Escaldação (ou seja, trauma associado a líquidos e/ou gases em alta temperatura) é considerado uma queimadura.

A gravidade de queimadura epidérmica é comumente classificada de duas maneiras. A classificação por grau é a mais comum. As queimaduras de primeiro grau são geralmente limitadas a eritema (vermelhidão) na área geral da lesão e uma placa branca nos locais da lesão. O trauma celular dessas queimaduras se estende apenas à profundidade da epiderme. As queimaduras de segundo grau também exibem eritema na área geral da lesão, porém com empolamento superficial da epiderme. O trauma celular de queimaduras de segundo grau envolve a derme superficial (papilar) e também pode envolver a camada profunda da derme (reticular). As queimaduras de terceiro grau são aquelas onde a epiderme é perdida com dano à hipoderme. O dano é tipicamente extremo inclusive carbonização. Às vezes, escaras (tecido necrótico preto e seco) estarão presentes. As queimaduras de terceiro grau podem exigir enxerto. Em queimaduras de quarto grau ocorrem danos terríveis da hipoderme, por exemplo, a hipoderme é completamente perdida, com dano estendendo-se ao músculo adjacente, tendão, e tecido do ligamento. Carbonização e escara são observadas. O enxerto é exigido se for provado que a queimadura não é fatal.

Outro sistema de classificação comum é a classificação por espessura. Queimaduras de espessura superficial correspondem a queimaduras de primeiro grau. O espectro de queimaduras de segundo grau é abrangido por duas classes de queimaduras de espessura parcial. Queimaduras de espessura parcial superficial são aquelas que afetam a epiderme apenas até a derme papilar. Queimaduras profundas de espessura parcial são aquelas que afetam a derme até a derme reticular. Queimaduras de espessura total correspondem a queimaduras de terceiro e quarto graus.

Algumas lesões físicas, por exemplo, algumas queimaduras, e ataques celulares por corpos estranhos resultam na formação de uma ferida. Mais especificamente uma ferida pode ser considerada uma ruptura, ou desepitelização de um tecido. As feridas também podem ser causadas por uma lesão de formação espontânea como uma úlcera cutânea (por exemplo, úlcera venosa, diabética ou de pressão), uma fissura anal ou uma úlcera da boca.

As feridas são tipicamente definidas como agudas ou crônicas. As feridas agudas são feridas que procedem ordenadamente por meio dois três estágios reconhecidos do processo de cura (ou seja, o estágio inflamatório, o estágio proliferativo e a fase de remodelagem) sem um curso de tempo prolongado. Feridas crônicas, entretanto, são aquelas feridas que não completam a sequência ordenada de eventos bioquímicos do processo de cura, pois a ferida parou em um dos estágios de cura. Comumente, as feridas crônicas estagnam na fase inflamatória. De acordo com um aspecto particular da presente invenção, uma ferida crônica é uma ferida que não curou dentro de ao menos 40 dias, particularmente ao menos 50 dias, mais particularmente ao menos 60 dias, mais particularmente ao menos 70 dias.

Como discutido acima, as feridas são um ambiente ideal para infecção, inclusive infecção por biofilme, e particularmente infecção por bio30 filme crônica, devido à falta de uma barreira epitelial e à disponibilidade de substrato e superfície para a colonização e fixação de biofilme. De maneira problemática, a infecção de uma ferida geralmente atrasa ainda mais a cura e, desse modo, torna aquela ferida mais suscetível à formação de biofilme e infecção estabelecida. Os alginatos da invenção são, portanto, eficazes no tratamento e prevenção de infecção por biofilme de feridas e o tratamento de feridas crônicas representa um aspecto preferido da presente invenção.

Portanto, em uma modalidade da invenção proporciona-se um método para o tratamento ou prevenção de infecção por biofilme, particularmente infecção crônica por biofilme nos indivíduos mencionados acima, em particular em indivíduos com doenças ou distúrbios respiratórios, por exemplo, fibrose cística, feridas, queimaduras e/ou traumas, sendo que o dito método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um oligômero de alginato, como definido aqui, ao indivíduo. Em um aspecto de importância particular, os oligômeros de alginato podem ser usados para tratar ou prevenir infecção por biofilme em feridas, por exemplo, queimaduras, por exemplo, no tratamento de feridas infectadas, por exemplo, queimaduras.

Com a capacidade de tratar e prevenir infecção por biofilme de feridas os oligômeros de alginato definidos aqui podem remover um dos obstáculos para a cura da ferida e, portanto, os oligômeros de alginato definidos acima também são eficazes na promoção de cura de feridas agudas e crônicas.

Por promoção de cura entende-se que o tratamento acelera o processo de cura da ferida em questão (ou seja, a progressão da ferida ao longo dos três estágios reconhecidos do processo de cura). A aceleração do processo de cura pode se manifestar como um aumento na taxa de progressão ao longo de um, dois ou todos os estágios de cura (ou seja, o estágio inflamatório, o estágio proliferativo e/ou a fase de remodelagem). Se a ferida for uma ferida crônica que estagnou em um dos estágios de cura, a aceleração deve se manifestar como o recomeço do processo de cura sequencial linear após a estagnação. Em outras palavras, o tratamento transfere a feri da de um estágio de não-cura para um estágio onde a ferida começa a progredir ao longo dos estágios de cura. Essa progressão após o recomeço pode estar em uma taxa normal ou ainda uma taxa mais lenta comparada com a taxa na qual uma ferida aguda normal pode ser curada.

Os oligômeros de alginato podem ser usados para tratar infecções por biofilme sempre que essas possam ocorrer no corpo. Assim, em outra modalidade, a infecção por biofilme pode ser uma infecção de um dispositivo médico, particularmente um dispositivo médico implantável.

Conforme observado acima, os biofilmes ocorrem nos dentes, por exemplo, sob a forma de placa dentária. Os oligômeros de alginato podem ser usados de acordo com a presente invenção como agentes de saúde bucal, por exemplo, no controle de placa dentária, por exemplo, para removê-la, ou reduzir ou impedir a mesma, reduzir ou atrasar seu desenvolvimento. Esses também podem ser usados no tratamento e prevenção de infecções ou doenças infecciosas que podem ocorrer na cavidade bucal, por exemplo, gengivite e periodontite.

Embora, conforme observado acima, o tratamento de infecções por biofilme dos pulmões e trato respiratório e de todas as áreas do corpo seja geralmente abrangido pela presente invenção, em uma modalidade, os usos médicos da invenção não estão direcionados ao tratamento de (i) biofilmes no trato respiratório de pacientes que sofrem de COPD’s (doenças pulmonares obstrutivas crônicas), em particular as cavidades nasais e os pulmões, em particular no tratamento de fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica, enfisema, bronquite e sinusite; (ii) no ouvido médio de pacientes que sofrem de otite média; ou (iii) no trato reprodutivo de pacientes do seco feminino com fertilidade comprometida; ou (iv) no trato digestivo de pacientes com disfunção do trato digestivo (por exemplo, constipação).

Em modalidades específicas da invenção, os oligômeros de alginato podem ser usados no tratamento de endocardite em válvulas nativas, otite média aguda, prostatite bacteriana crônica, pneumonia, placa dentária, periodontite, infecções por biofilme em doenças respiratórias, que podem incluir fibrose cística e asma e infecção relacionada a dispositivos associada com dispositivos médicos implantáveis ou protéticos, por exemplo, endocardite em válvula protética ou infecção de linhas ou cateteres ou articulações artificiais ou restaurações de tecido.

Uma quantidade farmaceuticamente eficaz do alginato é a quantidade de alginato que proporciona um efeito mensurável sobre o biofilme almejado (como definido acima) e/ou um efeito mensurável sobre a condição que é almejada. Essa quantidade pode ser determinada com referência às práticas-padrão de modo a decidir as quantidades de dosagem e o versado na técnica será capaz de detectar a prova de tratamento bemsucedido a partir de sua experiência e com o auxílio de testes rotineiros disponíveis ao mesmo que são projetados para monitorar o tamanho, estrutura, integridade e número de colônias do biofilme (por exemplo, aqueles descritos acima) e testes projetados para monitorar a condição almejada.

As doses adequadas de alginato irão variar de indivíduo para indivíduo e podem ser determinadas pelo médico ou veterinário de acordo com o peso, idade e sexo do indivíduo, a gravidade da condição, o modo de administração e também o oligômero de alginato particular selecionado. Tipicamente, os oligômeros de alginato da invenção serão aplicados ao biofilme a uma concentração local de até 10%, de preferência, até 6%, com mais preferência, até 4% e, com mais preferência, até 2%.

Tratamento quando usado em relação à infecção por biofilme (ou seja, em relação ao tratamento de uma condição/infecção médica em um indivíduo oposto à situação quando esse é usado em relação ao próprio biofilme) é amplamente usado aqui para incluir qualquer efeito terapêutico, ou seja, qualquer efeito benéfico sobre a condição ou em relação à infecção por biofilme. Assim a erradicação ou eliminação da infecção, ou cura do indivíduo ou infecção não só está incluída, como também uma melhora na infecção ou condição do indivíduo. Assim, está incluída, por exemplo, uma melhora em qualquer sintoma ou sinal da infecção, ou em qualquer indicador clinicamente aceito da infecção/condição (por exemplo, uma redução no tamanho da ferida ou uma aceleração de tempo de cura). O tratamento inclui, desse modo, tanto terapia curativa como paliativa, por exemplo, de uma in fecção/condição preexistente ou diagnosticada, ou seja, um tratamento reacionário.

Prevenção, como usado aqui, se refere a qualquer efeito profilático. Isso inclui, desse modo atraso, limitação, redução ou prevenção da condição ou o início da condição, ou um ou mais sintomas dessa, por exemplo, relativa à condição ou sintoma antes do tratamento profilático. A profilaxia inclui, desse modo, explicitamente tanto prevenção absoluta de ocorrência ou desenvolvimento da condição, ou sintoma dessa, como qualquer atraso no início ou desenvolvimento da condição ou sintoma, ou redução ou limitação sobre o desenvolvimento ou progressão da condição ou sintoma.

Especificamente, os alginatos da invenção podem ser administrados como um tratamento profilático, por exemplo, para prevenir, ou ao menos reduzir o risco de infecção por biofilme (por exemplo, por um patógeno). Esse aspecto da invenção é de utilidade particular no tratamento de pacientes hospitalizados, visto que o risco de contrair uma infecção nosocomial (comumente conhecida como infecção relacionada/adquirida em hospital ou infecção associada ao cuidado com a saúde), por exemplo, Staphylococcus aureus, Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis e Vancomycin-Resistant Enterococcus, pode ser reduzido com um regime profilático dos oligômeros de alginato definidos aqui. Esse aspecto da invenção também é de utilidade particular no tratamento de indivíduos que sofrem de trauma, indivíduos com uma queimadura e indivíduos com feridas, todos esses, como discutido acima, são mais suscetíveis à infecção por patógeno do que um indivíduo que não é afetada da mesma maneira.

Geralmente, os indivíduos necessitados de tratamento ou profilaxia de acordo com a invenção serão diagnosticados como aqueles que sofrem ou apresentam risco da condição-alvo, ou identificados com uma infecção por biofilme ou em risco de desenvolver uma infecção por biofilme.

Especificamente, os oligômeros de alginato da invenção podem ser administrados como um tratamento profilático para prevenir, ou ao ma nos reduzir o risco de desenvolver uma infecção por biofilme inclusive, por exemplo, a infecção de feridas, endocardite em válvulas nativas, otite média aguda, prostatite bacteriana crônica, periodontite, infecções do trato respiratório e pulmões (por exemplo, fibrose cística ou outras doenças respiratórias, placa dentária, pneumonia, ou infecção de um dispositivo médico (por exemplo, implantável).

Em uma modalidade vantajosa da invenção, os oligômeros de alginato podem ser usados em conjunto ou combinação com um agente antimicrobiano. No contexto de um uso médico, tal agente pode ser qualquer agente antimicrobiano clinicamente útil e particularmente um antibiótico. No contexto de usos não-clínicos, o agente antimicrobiano pode ser novamente qualquer agente antimicrobiano usado para tais propósitos, por exemplo, qualquer agente desinfetante ou antisséptico ou limpador ou esterilizante. Os agentes podem ser usados separadamente, ou juntos na mesma composição, simultânea ou sequencial ou separadamente, por exemplo, em qualquer intervalo de tempo desejado.

Assim, a título de exemplo representativo, o agente antimicrobiano pode ser usado após o oligômero de alginato, porém um uso anterior ou simultâneo pode ser benéfico em algumas circunstâncias.

Qualquer agente antimicrobiano que almeja ao menos um dos micro-organismos no biofilme-alvo pode ser usado. A seleção do agente antimicrobiano, naturalmente, precisará ser adequada para a superfície submetida ao tratamento, porém, por exemplo, agentes antimicrobianos, por exemplo, antibióticos, fungicidas, antissépticos podem ser usados e/ou condições esterilizantes como irradiação (por exemplo, UV, raio X, gama) extremas de temperatura, e extremas de pH.

Os antibióticos representativos incluem, porém sem caráter limitativo, aminoglicosídeos (por exemplo, amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina); os carbacefemas (por exemplo, loracarbef); as cefalosporinas de 1- geração (por exemplo, cefadroxil, cefazolina, ceíalexina); as cefalosporinas de 2^a geração (por exemplo, cefacíor, cefamandol, cefalexina, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima): as cefa losporinas de 3^â geração (por exemplo, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona); as cefalosporinas de 4- geração (por exemplo, cefepima); os macrolídeos (por exemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, troleandomicina); os monobactamas (por exemplo, aztreonama); as penicilinas (por exemplo, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina); os antibióticos à base de polipeptídeo (por exemplo, bacitracina, colistina, polimixina B); as quinolonas (por exemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina); as sulfonamidas (por exemplo, mafenida, sulfacetamida, sulfametizol, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol); as tetraciclinas (por exemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina); as carbapenemas (por exemplo, imipenema, meropenema, ertapenema, doripenema, panipenema/betamiprona, biapenema, PZ601.); cloranfenicol; clindamicina, etambutol; fosfomicina; isoniazida; linezolida; metronidazol; nitrofurantoína; pirazinamida; quinupristina/dalfopristina; rifampina; espectinomicina; e vancomicina. Os antibióticos vancomicina, tobramicina, meropenema, ciprofloxacina, piperacilina, colistina, aztreonam, ciprofloxacina e azitromicina são preferidos.

Os antissépticos representativos incluem, porém sem caráter limitativo, alvejante à base de cloro (cloridrato de sódio), compostos à base de amônio quaternário (por exemplo, cloreto de benzalcônio, brometo de cetil trimetil amônio, cloreto de cetil piridínio), peróxido de hidrogênio, compostos à base de fenol (por exemplo, TCP), álcoois (por exemplo, etanol), Virkon®, compostos à base de iodo (por exemplo povidona-iodo), compostos à base de prata (por exemplo, nano/micropartículas de prata elementar).

Os fungicidas representativos incluem, porém sem caráter limitativo, polienos (por exemplo, natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina; os imidazóis (por exemplo, miconazol, cetoconazol, clotrimazol, econazol, bifonazol, butoconazol, fenticonazol, isoconazoi, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol); os triazóis (por exemplo, flucona zol, itraconazol, isavuconazol, ravuconazol, posaconazol, voriconazol, terconazol); as alilaminas (por exemplo, terbinafina, amorolfina, naftifina, butenafina); e as equinocandinas (por exemplo, anidulafungina, caspofungina, micafungina).

O agente antimicrobiano pode ser convenientemente aplicado antes, simultaneamente ou após o alginato. Convenientemente, o agente antimicrobiano é aplicado substancialmente ao mesmo tempo que o alginato ou após o mesmo. Por exemplo, o agente antimicrobiano é aplicado ao menos 1 hora, de preferência, ao menos 3 horas, com mais preferência, ao menos 5 e, com mais preferência, ao menos 6 horas após o oligômero de alginato ser administrado. Para otimizar o efeito antimicrobiano do agente antimicrobiano, esse pode ser ministrado (por exemplo, administrado ou aplicado) repetidamente em pontos de tempo adequados para o agente usado. O versado na técnica é capaz de desenvolver uma dosagem ou regime de uso adequado. Em tratamentos a longo prazo o alginato também pode ser usado repetidamente. Essa pode ser tão frequente quanto o agente antimicrobiano, porém será tipicamente menos frequentemente. A frequência exigida irá depender do local da infecção por biofilme, composição de colônia e o antimicrobiano usado e o versado na técnica é capaz de otimizar a dosagem ou padrões de uso para otimizar os resultados.

Em uma modalidade vantajosa, o agente antimicrobiano pode ser usado ou aplicado após a remoção ou redução física (por exemplo, desbridamento) do biofilme da superfície.

Após a remoção, ou uma tentativa de remover, o biofilme, a superfície pode se colocada em contato com os oligômeros de alginato entre 0 e 24 horas, particularmente 2 e 12 horas, mais particularmente 4 e 8 horas, mais particularmente 5 e 7 horas, por exemplo, 6 horas. Após isso, um agente antimicrobiano pode ser aplicado se desejado. Tal cenário pode ser desejável ou particularmenie aplicável em um ambiente clínico. No caso de feridas infectadas por biofilme a duração de incubação pode ser convenientemeníe projetada para corresponder a alterações programadas da bandagem da ferida.

A remoção física do biofilme pode ser realizada com qualquer meio cirúrgico, mecânico ou químico. Convenientemente, esse pode ser o uso de um líquido, gel, gel-sol, composições semissólidas ou gás aplicado por pressão ao biofilme, sonicação, laser, ou por implemento abrasivo. Uma composição usada na própria remoção ou como uma solução de lavagem antes, durante ou após essa pode conter convenientemente o oligômero de alginato.

Consequentemente, em uma modalidade específica proporciona-se uma composição de desbridamento ou lavagem, por exemplo, solução para feridas contendo um oligômero de alginato, particularmente qualquer oligômero de alginato como definido aqui. Tal composição de desbridamento será tipicamente uma solução estéril, particularmente uma solução estéril aquosa ou uma solução estéril à base de óleo, e pode conter adicionalmente enzimas proteolíticas (por exemplo, colagenase, tripsina, pepsina, elastase), uma fase sólida abrasiva (por exemplo, sílica coloidal, pedra-pome moída, planta moída ou concha).

O uso em combinação ou conjunto com outros agentes de dissolução de biofilme pode ser benéfico. Os dissolventes de biofilme incluem, porém sem caráter limitativo, proteases, por exemplo, serina proteases, metaloproteases e cisteína proteases (exemplos desses tipos de proteases são listados na EP0590746, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência); nucleases, por exemplo, DNase I e II, RNase A, Η, I, II, III, P, PhyM, R; lipases e enzimas capazes de degradar polissacarídeos, gelsolina, um agente redutor de tiol, uma acetilcisteína, um polissacarídeo de baixo peso molecular não-carregado (por exemplo, dextrano), ou um poliaminoácido aniônico (por exemplo, poli ASP ou poli GLU).

Faz-se menção particular de alginato liase, e o uso combinado desse com um oligômero de alginato como definido aqui representa uma possível modalidade.específica desse aspecto da invenção.

O uso em combinação ou conjunto com agentes imunoestimulantes também pode ser benéfico no tratamento de biofilmes em uma situação ciínica. Esses agentes imunoestimulantes podem ser convenientemente usados em pontos de tempo correspondentes àqueles descritos acima em relação a agentes antimicrobianos e podem ser opcionalmente usados em combinação com um oligômero de alginato e um agente antimicrobiano. Os agentes imunoestimulantes adequados incluem, porém sem caráter limitativo, citocinas, por exemplo, TNF, IL-1, IL-6, IL-8 e alginatos imunoestimulantes, como alginatos de alto teor de M como descrito, por exemplo, nos US 5.169.840, WO91/11205 e W003/045402 que estão explicitamente incorporados aqui a título de referência em sua totalidade, porém incluindo qualquer alginato com propriedades imunoestimulantes.

O uso dos oligômeros de alginato em combinação ou conjunto com fatores de crescimento, por exemplo, PDGF, FGF, EGF, TGF, hGF e enzimas também pode ser benéfico nos usos médicos da invenção. Exemplos representativos de enzimas adequadas incluem, porém sem caráter limitativo, proteases, por exemplo, serina proteases, metaloproteases e cisteína proteases (exemplos desses tipos de proteases estão listados na EP0590746, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência); nucleases, por exemplo, DNase I e II, RNase A, Η, I, II, III, P, PhyM, R; lipases e enzimas capazes de degradar polissacarídeos.

O uso dos oligômeros de alginato em combinação ou conjunto com um agente redutor de viscosidade mucoso fisiologicamente tolerável também poderia ser benéfico, por exemplo, uma enzima de divagem de ácido nucleico (por exemplo, uma DNase como DNase I), gelsolina, um agente redutor de tiol, uma acetilcisteína, cloreto de sódio, um polissacarídeo de baixo peso molecular (por exemplo, dextrano), arginina (ou outros precursores de óxido nítrico ou estimuladores de síntese), ou um poliaminoácido aniônico (por exemplo, poli ASP ou poli GLU). Ambroxol, romexina, carbocisteína, domiodol, eprazinona, erdosteína, letosteína, mesna, neltenexina, sobrerol, estepronina, tiopronina são mucolíticos específicos de interesse. O uso de uma DNase é especialmente preferido.

Como discutido acima, os oligômeros de alginato podem ser usados opcionalmente com qualquer outro agente terapeuticamente ativo que se deseja utilizar, por exemplo, um ageníe anti-inflamatório. O uso combina39 do de um oligômero de alginato com um agente terapeuticamente ativo adicional (por exemplo, um agente antimicrobiano ou anti-inflamatório) pode permitir vantajosamente que a dose (por exemplo, a dose usual ou normal) do agente terapeuticamente ativo adicional seja reduzida, por exemplo, esse pode ser usado em sua dose normal ou usual ou em uma dose inferior, por exemplo, de até 50%^ou a 50%) de sua dose normal.

A invenção abrange o uso de um único oligômero de alginato ou uma mistura (multiplicidade/pluralidade) de oligômeros de alginato diferentes. Assim, por exemplo, uma combinação de oligômeros de alginato diferentes (por exemplo, dois ou mais) pode ser usada.

No caso de uso médico, os alginatos da invenção podem ser administrados ao indivíduo em qualquer forma conveniente ou por qualquer meio conveniente, por exemplo, por vias tópicas, orais, parenterais, enterais, parenterais ou por inalação. De preferência, o alginato será administrado por vias tópicas, orais ou parenterais ou por inalação.

O versado na técnica será capaz de formular os alginatos da invenção em composições farmacêuticas que são adaptadas para essas vias de administração de acordo com quaisquer métodos convencionais conhecidos na técnica e amplamente descritos na literatura. Apenas para orientação, os Exemplos 11 e 12 descrevem duas composições possíveis (uma composição tópica e um líquido de desbridamento).

A presente invenção, portanto, também proporciona uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme que compreende um oligômero de alginato, como definido aqui, juntamente com ao menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

O ingrediente ativo pode ser incorporado, de maneira opcional juntamente com outros agentes ativos, com um ou mais veículos, diluentes e/ou excipientes convencionais, para produzir preparações galênicas convencionais como comprimidos, pílulas, pós (por exemplo, pós inaláveis), pastilhas, sachês, cápsulas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um meio sólido ou em um meio líquido), sprays (por exemplo, sprays nasais), composições para uso em nebulizadores, pomadas, cápsulas de gelatina macias e duras, supositórios, soluções injetáveis estéreis, pós embalados estéreis, e similares.

Exemplos de veículos, excipientes, e diluentes adequados são lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos inertes, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, xarope à base de água, água, água/etanol, água/glicol, água/polietileno, água salina hipertônica, glicol, propileno glicol, metil celulose, metil hidróxi benzoatos, hidróxi benzoatos de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou substâncias graxas como gordura dura ou misturas adequadas desses. Os excipientes e diluentes preferidos são manitol e água salina hipertônica (solução salina).

As composições podem incluir adicionalmente agentes lubrificantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensão, agentes conservantes, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, e similares.

Como discutido acima, os oligômeros de alginato propostos para uso de acordo com a invenção podem ser usados em combinação com outros agentes terapêuticos, por exemplo, para serem administrados juntamente, em uma única formulação ou composição farmacêutica, ou separadamente (ou seja, para administração separada, sequencial ou simultânea). Assim, os alginatos da invenção podem ser combinados com um segundo (ou outros) agente terapeuticamente eficaz, por exemplo, em um kit farmacêutico ou como um produto combinado (combinação).

Assim, um aspecto adicional da presente invenção fornece um produto contendo um oligômero de alginato como definido aqui e um segundo agente ativo como uma preparação combinada para aplicação separada, simultânea ou sequencial a um biofilme e/ou administração a um indivíduo para uso no combate a biofilme e/ou tratamento ou prevenção de uma infecção por biofilme em um indivíduo ou qualquer condição definida aqui.

Os agentes terapeuticamente ativos adicionais podem ser incluídos nas composições farmacêuticas, como discutido em relação às terapias de combinação acima.

As formas parenteralmente administráveis, por exemplo, soluções intravenosas, devem ser estéreis e isentas de agentes fisiologicamente inaceitáveis, e devem possuir baixa osmolaridade para reduzir a irritação ou outros efeitos adversos mediante administração e, desse modo, devem ser, de preferência, isotônicas ou levemente hipertônicas, por exemplo, água salina hipertônica (solução salina). Os veículos adequados incluem veículos aquosos geralmente usados para administrar soluções parenterais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer-Lactato e outras soluções, como descrito em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 and 1461- 1487 (1975) e National Formulary XIV, 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). As soluções podem conter agentes conservantes, antimicrobianos, tampões e antioxidantes convencionalmente usados para soluções parenterais, excipientes e outros aditivos que são compatíveis com os biopolímeros e que não irão interferir na fabricação, armazenamento ou uso de produtos.

Para administração tópica os oligômeros de alginato podem ser incorporados em cremes, pomadas, géis, adesivos transdérmicos e similares. Os oligômeros de alginato também podem ser incorporados em curativos médicos, por exemplo, coberturas para ferimentos, por exemplo, coberturas tecidas (por exemplo, tecido) ou coberturas não-tecidas (por exemplo, géis ou coberturas com um componente de gel). O uso de polímeros de alginato em coberturas é conhecido, e tais coberturas, ou de fato qualquer cobertura, pode incorporar adicionalmente os oligômeros de alginato da invenção.

Consequentemente, em uma modalidade específica adicional, a invenção fornece ainda uma cobertura adicional, fornece uma cobertura para ferimento que compreende um oligômero de alginato (que pode ser qualquer oligômero de alginato como definido aqui).

Os sistemas tópicos adicionais que são contemplados como a dequados são sistemas de liberação de fármaco in situ, por exemplo, géis onde matrizes de gel cristalinas sólidas, semi-sólidas, amorfas ou líquidas são formadas in situ e podem compreender o oligômero de alginato. Tais matrizes podem ser convenientemente projetadas para controlar a liberação do oligômero de alginato da matriz, por exemplo, a liberação pode ser retardada e/ou sustentada durante um período de tempo selecionado. Tais sistemas podem formar géis apenas mediante contato com tecidos ou fluidos biológicos. Tipicamente, os géis são bioadesivos. A liberação a qualquer local do corpo que pode reter ou pode ser adaptada para reter a composição de pré-gel pode ser almejada por tal técnica de liberação. Tais sistemas estão descritos no documento WO 2005/023176.

Para aplicação a superfícies orais, bucais e dentárias, cremes dentais e enxaguatórios bucais são especificamente mencionados. Assim, em um aspecto particular inclui-se uma composição para saúde oral, ou higiene oral que compreende um oligômero de alginato (que pode ser qualquer oligômero de alginato, como definido aqui), particularmente um enxaguatório bucal ou creme dental.

Como observado acima, uma composição preferida da invenção é uma composição de desbridamento que é usada em um processo de desbridamento para remover o biofilme, por exemplo, de um tecido. Tipicamente tal composição será líquida, porém géis, gel-sol, ou composições semissólidas devem ser usadas. A composição deve ser usada para desbridar o biofilme (por exemplo, mediante a aplicação ao tecido sob pressão) e/ou pode ser usada para lavar o tecido antes, durante e/ou após o desbridamento por outros meios como por processos cirúrgicos, mecânicos ou químicos. O versado na técnica é facilmente capaz de formular composições de desbridamento de acordo com a invenção.

No caso de biofilmes sobre uma superfície inanimada, o oligômero de alginato pode ser aplicado à superfície que será tratada em qualquer composição ou formulação conveniente, ou por qualquer meio conveniente. Assim, o oligômero de alginato pode estar sob a forma de líquido, gel, gel-sol, forma semissólida ou sólida (por exemplo, soluções, suspensões, homogenatos, emulsões, pastas, pós, aerossóis, vapores). Tipicamente, as composições para tratar biofilmes sobre superfícies inanimadas serão uma composição não-farmaceuticamente aceitável. A seleção da forma de composição será ditada pela estrutura de biofilme e composição e localização de colônia. Por exemplo, se a localização do biofilme for uma linha fluida pode ser conveniente aplicar uma composição fluida. Também pode ser preferido utilizar uma composição que continua sobre a superfície que será tratada, porém que não será lixiviada no fluido de uso normal, por exemplo, um gel adesivo. O versado na técnica é facilmente capaz de preparar composições adequadas a partir de seu conhecimento geral comum. Por exemplo, o oligômero de alginato pode ser adicionado a uma formulação de tinta e aplicado à superfície que será tratada, por exemplo, um casco de barco ou outra parte da estrutura de um barco que fica exposta à água, ou a uma construção ou qualquer parte dessa, um tanque (por exemplo, um tanque de armazenamento ou processamento) ou, de fato, qualquer parte de qualquer maquinaria industrial. Tais composições também podem compreender convenientemente um agente antimicrobiano, como descrito acima, por exemplo, alvejante à base de cloro, TCP, etanol, Virkon®, povidona-iodo, compostos à base de prata, etc. Visto que as composições não precisam ser farmaceuticamente aceitáveis, antimicrobianos mais grossos podem ser usados devido às considerações de dano de superfície, contaminação ambiental, segurança do usuário e contaminação da superfície tratada e a interação com outros componentes da composição.

As composições da invenção podem ser formuladas para fornecer uma liberação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após a administração ao indivíduo/superfície ao empregar procedimentos bem conhecidos na técnica. As composições adesivas também são preferidas. As formulações adesivas de liberação sustentada e/ou retardada podem ser particularmente convenientes.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece produtos suscetíveis à colonização de biofilme cujas superfícies suscetíveis foram prétratadas com um oligômero de alginato como definido aqui. Exemplos não44 limitativos de produtos e superfícies suscetíveis à colonização de biofilme são descritos acima. Faz-se menção particular de equipamento de processamento, armazenamento ou distribuição de alimentos ou bebidas e dispositivos médicos. O pré-tratamento pode ser realizado por qualquer meio conveniente, por exemplo, qualquer forma de aplicação do oligômero de alginato à superfície, especialmente de cobertura da superfície, por exemplo, secagem por aspersão, revestimento de polímero com um polímero incorporando o oligômero de alginato, e pintura, envernizamento ou laqueação com formulações de tinta, verniz ou laca contendo o oligômero de alginato. Tal composição de cobertura (por exemplo, uma tinta, verniz ou laca) contendo o oligômero de alginato representa um aspecto adicional da presente invenção. Alternativamente, o oligômero de alginato pode ser incorporado no material a partir do qual a superfície é fabricada. Essa abordagem é adequada a superfícies fabricadas a partir de polímeros como plásticos e silicones, por exemplo, os dispositivos médicos descritos acima.

A invenção será descrita adicionalmente com referência aos seguintes Exemplos não-limitativos nos quais:

a Figura 1 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes Pseudomonas, gerados durante a noite e então tratados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G (0, 1%, 2% ou 6%) durante a noite, a Oh, 6h e 24h após o tratamento noturno com amicacina (4096-0 pg/ml).

A Figura 2 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes Pseudomonas, gerados durante a noite e então tratados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G (0, 1%, 2% ou 6%) durante a noite, a Oh, 6h e 24h após o tratamento noturno com oxitetraciclina (4096-0 pg/ml).

A Figura 3 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes Pseudomonas, gerados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G (0, 1%, 2% ou 6%) durante a noite, a Oh, 6h e 24h após o tratamento noturno com oxitetraciclina (4096-0 pg/ml).

A Figura 4 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes Pseudomonas, gerados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G (0 ou 6%) durante a noite, a Oh, 6h e 24h após o tratamento noturno com amicacina, tobra45 micina, oxitetraciclina ou amicacina + oxitetraciclina (4096-0 pg mr'¹).

A Figura 5 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes Pseudomonas PA01, gerados durante 6 h sem mucina e então tratados com fragmentos de G (0 ou 6%) sem mucina, a Oh, 6h e 24h após o tratamento noturno com amicacina (4096-0 pg/ml) ou tobramicina (1024-0 pg/ml).

A Figura 6 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes Pseudomonas PA01, gerados com mucina (2,5g/l) durante 6 h e então tratados com mucina (2,5g/L) e bloco G #0802 (0 ou 6%) durante a noite, a 0, 6 e 24 h após o tratamento noturno com amicacina (4096-0 pg ml’¹) ou tobramicina (1024-0 pg ml'¹>).

A Figura 7 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes da cepa Staphylococcus aureus ATCC 6538, gerados com mucina (2,5g/l) durante 6 h e então tratados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G (0 ou 6 %) durante a noite, a 0, 6 e 24 h após o tratamento noturno com oxitetraciclina (4096-0 pg ml·¹).

A Figura 8 mostra o crescimento bacteriano em biofilmes 1103 isolados de ferimento MRSA, gerados com mucina (2,5g/L) durante 6 h e então tratados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G (0 ou 6%) durante a noite, a Oh, 6h e 24h após o tratamento noturno com tobramicina (1024-0 pg/ml).

A Figura 9 mostra o efeito dos fragmentos de G e da mucina sobre a fixação de Candida albicans ATCC 90028 e Candida dubliniensis CD36^T em biofilmes gerados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G a 0 ou 2% durante a noite.

A Figura 10 mostra micrografias eletrônicas de biofilmes Pseudomonas gerados com mucina (2,5g/l) durante 6 h e então tratados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G a 0 ou 2% durante 24h.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Materiais e Métodos Padrão

Cepas Bacterianas

Duas cepas de coleção de cultura Pseudomonas aeruginosa PA01 (ATCC 15682, a isolado de ferida) e Staphylococcus aureus (ATCC

6538) foram usadas para os ensaios MBEC ao longo de um isolado clínico de uma úlcera venosa crônica de perna, S. aureus (MRSA) 1103. Duas cepas tipo Candida, C. albicans ATCC 90028 e C. dubliniensis CD36^T foram usadas para os ensaios de fixação.

Produtos Químicos e Mios Bacterianos

As colônias bacterianas se desenvolveram em base de ágar sangue No2, (BA; Lab15, LabM, Bury, UK) suplementada com 5% de sangue de ovelha e foram usadas para inocular o caldo triptona de soja (TSB, CM0129, Oxoid, Basingstoke, UK) para crescimento noturno. Os biofilmes foram gerados em caldo Mueller-Hinton ajustado com cátions (CAMHB; Lab114, LabM). Todos os antibióticos usados possuem grau farmacêutico (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) e incluíam amicacina, oxitetraciclina e tobramicina. A glicoproteína mucina gástrica de porco (purificada por Jeff Pearson, Newcastle University) e oligômeros de alginato CF-5/20 (fragmentos de G; 2600Da, %G 90-95) e bloco G #0802 (6400 Da, %G 91 ) foram fornecidos por Algipharma AS, Sandvika, Norway.

Ensaio de Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme (MBEC).

O método MBEC usado foi adaptado junto à Moskowitz SM, et al. (2004) J Clin Microbiol 42:1915-1922. Após a recuperação de -80°C de armazenamento, os isolados bacterianos se desenvolveram em BA e então desenvolvidos durante a noite em TSB. Após a diluição das culturas bacterianas a 0,5 McFarland em CAMHB com ou sem mucina (2,5g/l), 100 pl foram transferidos para os poços de uma placa microtiter de 96 poços de fundo plano. No Exemplo 3, as culturas bacterianas foram diluídas a 0,5 McFarland em CAMHB com mucina (2,5g/l) e alginato e 100 μΙ foram transferidos para os poços de uma placa microtiter de 96 poços de fundo plano.

As placas foram então enroladas em parafilme para impedir a desidratação e incubadas a 37°C para permitir a formação de biofilme. Os tempos de incubação e condições variaram como descritos abaixo.

Após a formação de biofilme, as células planctônicas e o sobrenadanto foram removidos e cada poço foi então lavado com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Após a lavagem, as células foram tra47 tadas com combinações de alginatos e/ou antibióticos com ou sem mucina (2,5g/l) em 100 μΙ de CAMHB. As placas foram então enroladas em parafilme e incubadas a 37°C com inclinação suave. Os tempos de incubação e condições variaram como descritos abaixo. Os antibióticos e faixas de concentração usados são mostrados abaixo.

Os poços foram lavados com PBS e 100 μΙ de cada concentra- . ção de uma diluição em série de antibiótico em CAMHB foram então adicionados em duplicata. As placas foram novamente enroladas em parafilme e incubadas a 37°C com inclinação suave durante a noite.

Em todos os ensaios MBEC o número de células final foi avaliado da seguinte maneira. Os poços foram lavados com PBS e os biofilmes ressuspensos em 100 μΙ de CAMHB por pipetagem vigorosa. A densidade óptica a 620 nm (OD₆₂o) foi medida em um leitor de microplaca (FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) imediatamente (0 h) e após incubação a 37°C a 6 h e 24 h.

O valor de MBEC é aquela concentração de antibiótico que inibe todo o crescimento das bactérias na amostra de teste. O crescimento bacteriano é medido por um aumento na absorbância da amostra. Portanto, uma redução no valor de MBEC é uma indicação que a sensibilidade da amostra ao antibiótico aumentou (ou seja, é necessário menos antibiótico para impedir o crescimento bacteriano).

Antibióticos e Faixas de Concentração Usadas

Antibiótico	Faixa de concentração (pg/ml·1)
Amicacina	4-4096
Amicacina + Oxitetraciclina	4-4096
Oxitetraciclina	4-4096
Tobramicina	4-4096

Ensaio de Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme (MBEC) sem

Mucina

Pseudomonas aeruginosa PA01 (ATCC 15682) foi usada para determinar os valores de MBEC sem a adição de mucina. O protocolo MBEC foi seguido como dsccriio acima, porém sem a adição de mucina ao meio de crescimento. Dois antibióticos, amicacina e tobramicina foram usados. Ensaio de Fixação de Levedura

O ensaio de fixação usado foi adaptado junto à Djordjevic et al., (2002) Appl Environ Microbiol 68:2950-2958. C. albicans ATCC 90028 e C. dubliniensis CD36^T foram as cepas Candida usadas para os ensaios de fixação. Candida se desenvolveram em ágar dextrose Sabouraud (Lab33, LabM) e culturas de caldo noturnas se desenvolveram em meio líquido Sabouraud (Lab9, LabM). Após a adição de 5 pi de cultura noturna, 95 μΙ de CAMHB com mucina adicionada (2,5g/l) e fragmentos de G (em concentrações de 0, 2%, 6% ou 10%) foram adicionados a poços. As placas foram enroladas em parafilme e incubadas a 37°C durante a noite para permitir a formação de biofilme.

As células planctônicas e o sobrenadante foram removidos dos poços antes da lavagem dos biofilmes resultantes (3x) com dH₂O estéril. As placas foram então secas a 56°C durante 45 min. Cada poço foi então colorido com 150 μΙ 1% (v/v) de violeta cristal (em água) durante 45 min. As placas foram novamente lavadas (3x) com dH₂O, antes da adição de 200 μΙ de 95% de etanol. Após 5 min, 100 μΙ de cada poço foram transferidos para uma nova placa microtitre. OD foi então medido em um leitor de placa a 540 nm.

Crescimento de Biofilmes para Formação de Imagens

Após a recuperação de -80°C de armazenamento, os isolados bacterianos se desenvolveram em BA e então se desenvolveram durante a noite em TSB. Após a diluição das culturas bacterianas a 0,5 McFarland em CAMHB com mucina (2,5g/l), 100 μΙ foram transferidos para os poços de uma placa microtiter de 96 poços de fundo plano. As placas foram então enroladas em parafilme para impedir a desidratação e incubadas a 37°C durante 6 h para permitir a formação de biofilme. Após a formação de biofilme, as células planctônicas e o sobrenadante foram removidos e cada poço foi então lavado com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Após a lavagem, as células foram tratadas com fragmentos de G e mucina (2,5g/l) em 100 μ! de CAMHB. As placas foram então enroladas em parafilme e in49 cubadas a 37°C durante 24 h com inclinação suave.

Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) de Biofilmes Pseudomonas

Glutaraldeído (2%) foi adicionado a biofilmes tratados com fragmento de G e fixado a temperatura ambiente durante 24 horas. As amostras foram desidratadas em uma série classificada de concentrações de etanol, secas em um secador de ponto crítico (Balzers CPD 030, Germany), montado em anteparos de alumínio, revestidas com ouro em um metalizador (EMscope model AE 1231, UK), e então visualizadas em um microscópio eletrônico de varredura (FEI-Philips XL-20, The Netherlands).

Microscopia Confocal de Biofilmes em Repouso Utilizando BODIPY® 630/650-X SE

Os biofilmes tratados com fragmento de G foram lavados com água destilada estéril e coloridos com a cepa BODIPY® 630/650-X SE (BODIPY® 630/650-X SE, Invitrogen Ltd) que colore seletivamente os componentes de matriz (EPS) em biofilmes Pseudomonas.

BODIPY® 630/650-X SE foi adicionado (100 pl (10 pg/ml)) a cada amostra de biofilme. A preparação foi incubada no escuro durante 1 hora e então analisada por CLSM.

Exemplo 2 - Medida de valores MBEC de biofilmes Pseudomonas aeruginosa pré-tratados durante a noite com fragmentos de G

O ensaio MBEC descrito acima foi realizado da seguinte maneira. Os biofilmes foram gerados em placas durante a noite sem mucina. Após uma lavagem com PBS, os biofilmes foram incubados com 0, 1, 2 ou 6% de fragmentos G e mucina durante a noite. Após a lavagem com PBS as células foram incubadas durante a noite com antibióticos (amicacina ou oxitetraciclina) e sem mucina. Os resultados são mostrados graficamente nas Figuras 1 e 2 e mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo. Como pode ser observado, o prétratamento noturno de biofilme com fragmentos de G causa reduções em valores de MBEC em 6h e 24h para amicacina ou oxitetraciclina. Os valores de MBEC em 6h para amicacina e oxitetraciclina foram divididos por dois por 1% de fragmentos de G e divididos por quatro por 2 e 6% de fragmentos de G. Os valores de MBEC em 24h para oxitetraciclina foram divididos por dois por todas as concentrações de fragmentos de G. Os valores de MBEC em 24h para amicacina foram reduzidos embora não seja possível quantificar essa redução. Isso indica que um pré-tratamento noturno com fragmentos de G aumenta a sensibilidade de Pseudomonas aeruginosa em biofilmes a esses antibióticos.

Tabela 2 - Sumário de valores MBEC 6 horas após a exposição noturna ao antibiótico. Biofilmes Pseudomonas gerados durante a noite. Mucina (2,5g/L) e fragmentos de G a 0, 1%, 2% ou 6% foram adicionados a biofilmes estabelecidos. Valores expressos como pg/ml de antibiótico.

[G-FRAG]	Amicacina	Oxitetraciclina
0	2048	512
1%	1024	256
2%	512	128
6%	512	128

Tabela 3 - Sumário de valores MBEC 24 horas após a exposição noturna ao antibiótico. Biofilmes Pseudomonas gerados durante a noite. Mucina (2,5g/L) e fragmentos de G a 0, 1%, 2% ou 6% adicionados a biofilmes estabelecidos. Valores expressos como pg/ml de antibiótico.

[G-FRAG]	Amicacina	Oxitetraciclina
0	>4096	2048
1%	4096	1024
2%	4096	1024
6%	4096	1024

Exemplo 3 - Medida de Valores MBEC para Biofilmes Pseudomonas Aeruginosa Gerados na Presença de Fragmentos e G

O ensaio MBEC descrito acima foi realizado da seguinte maneira. Os biofilmes foram gerados em placas durante a noite na presença de mucina e 0, 1, 2 ou 6% de fragmentos de G. Após a lavagem, os biofilmes foram expostos à oxitetraciclina (sem mucina) durante a noite. Os resultados são mostrados graficamente na Figura 3 e nas Tabelas 4 e 5 abaixo. Como pode ser observado, em todas as concentrações de fragmentos de G testadas, os biofilmes gerados na presença de fragmentos de G dividiram por dois os valores de MBEC em 24h. Os valores de MBEC em 6h foram divididos por dois quando 2% e 6% de fragmentos de G foram usados. 1% de fragmentos de G não consegui causar uma redução. Esses mostram que Pseudomonas aeruginosa em biofilmes gerados na presença de fragmentos 5 de G são mais suscetíveis à oxitetraciclina do que Pseudomonas aeruginosa em biofilmes gerados na ausência de fragmentos de G.

Tabela 4 - Sumário de valores de MBEC 6h após a exposição noturna ao antibiótico. Os biofilmes Pseudomonas gerados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G em 0, 1%, 2% ou 6%. Valores expressos como pg/ml de antibi10 ótico

[G-FRAG]	Oxitetraciclina
0	512
1%	512
2%	256
6%	256

Tabela 5 - Sumário de valores de MBEC 24h após a exposição noturna ao antibiótico. Os biofilmes Pseudomonas gerados com mucina (2,5g/L) e fragmentos de G em 0, 1%, 2% ou 6%. Valores expressos como pg/ml de antibiótico

[G-FRAG]	Oxitetraciclina
0	4095
1%	2048
2%	2048
6%	2048

Importante

Redução em valor de MBEC de 0% de G

Sem alteração em valor de MBEC de 0% de G

Exemplo 4 - Medida de Valores de MBEC para Biofilmes Pseudomonas Aeruginosa Gerados Durante 6h e Pré-tratados com Fragmentos de G

O ensaio de MBEC descrito acima foi realizado com mucina presente nesse. Os biofilmes foram gerados na presença de mucina durante 6 horas de incubação, lavados e incubados com fragmentos de G e mucina durante a noite. Após lavagem com PBS as culturas foram expostas a antibióticos (amicacina, tobramicina, oxitetraciclina ou uma combinação de amicacina e oxitetraciclina) sem mucina. Os resultados são mostrados graficamente na Figura 4 e nas Tabelas 6 e 7. Como pode ser observado, o prétratamento de biofilmes em 6h com 6% de fragmentos de G originou os valores MBEC em 6 h para todos os antibióticos testados divididos por ao menos quatro, ou seja, a sensibilidade de Pseudomonas aeuroginosa nesses biofilmes a esses antibióticos foi ao menos quadruplicada. Na verdade, 6% de fragmentos de G fez com que o valor de MBEC em 6 h para oxitetraciclina caísse para 1/8° do valor de controle. Os valores MBEC em 24h para amicacina e tobramicina foram divididos por dois. O valor de MBEC em 24h para oxitetraciclina e a mistura de amicacina/oxitetraciclina não mostrou alteração em valores de MBEC.

Tabela 6 - Sumário de valores de MBEC 6 h após a exposição noturna ao antibiótico. Biofilmes Pseudomonas, gerados em meio com mucina adicionada durante 6h, expostos a 0 ou 6% de fragmentos de G durante a noite e então expostos a antibióticos. Valores expressos como pg ml·¹ de antibiótico.

[G-FRAG]	Amicacina	Oxitetraciclina	Tobramicina	Amic + Oxi
0	64	512	32	128
6%	16	64	8	64

Tabela 7 - Sumário de valores de MBEC 24 h após a exposição noturna ao antibiótico. Biofilmes Pseudomonas, gerados em meio com mucina adicionada durante 6h, expostos a 0 ou 6% de fragmentos de G durante a noite e então expostos a antibióticos. Valores expressos como pg ml'¹ de antibiótico.

[G-FRAG]	Amicacina	Oxitetraciclina	Tobramicina	Amic + Oxi
0	>4096	1024	512	1024
6%	4096	1024	256	1024

Importante

Redução em valor de MBEC de 0% de G

Sem alteração em valor de MBEC de 0% de G

Exemplo 5 - Medida de valores de MBEC para biofilmes Pseudomonas ae53 ruginosa gerados durante 6h sem mucina e pré-tratados com fragmentos de G sem mucina.

O protocolo do Exemplo 4 foi repetido utilizando tobramicina e amicacina, porém sem a adição de mucina. Os resultados são mostrados na Figura 5. Como pôde ser observado, na ausência de mucina os fragmentos de G ainda são capazes de dividir os valores de MBEC em dois, porém os. valores de MBEC em 24h para amicacina. Isso é uma indicação que a mucina não está exercendo uma função significativa nos efeitos observados nos Exemplos acima.

Exemplo 6 - Medida de valores de MBEC para biofilmes Pseudomonas aeruginosa gerados durante 6h e pré-tratados com um oligômero de alginato diferente

O ensaio de MBEC descrito no Exemplo 4 foi repetido com um oligômero de alginato alternativo, bloco G (#0802) (6400 MW, comparado com fragmentos CF-5/20 G, 2600 MW) e utilizando tobramicina e amicacina. O valor de MBEC em 24h para amicacina é dividido por quatro mediante o pré-tratamento do biofilme com 6% de bloco G (#0802). O mesmo tratamento resultou no valor de MBEC em 24h para tobramicina dividido por dois. Esses dados mostram que um outro oligômero de alginato pode obter um aumento na sensibilidade de Pseudomonas aeruginosa PA01 em biofilmes à tobramicina e amicacina.

Exemplo 7 - Medida de valores de MBEC para biofilmes em 6h contendo outras bactérias pré-tratadas com fragmentos de G

O efeito de fragmentos de G sobre os biofilmes de Staphylococcus aureus foi investigado utilizando o ensaio de MBEC descrito no Exemplo 4 e oxitetraciclina. Como pode ser observado na Figura 7, o pré-tratamento de biofilmes contendo S. aureus ATCC 6538 com 6% de fragmentos de G dividiu os valores de MBEC por dois em 6 e 24 h para oxitetraciclina. Como pode ser observado na Figura 8, o pré-tratamento de biofilmes contendo o isolado de ferida MRSA 1103 com 6% de fragmentos de G dividiu o valor de MBEC por dois em 24 h para tobramicina. Esses dados mostram que outras bactérias comumente encontradas em biofilmes, pode se tornar mais suscetíveis à oxitetraciclina e tobramicina mediante o pré-tratamento daqueles biofilmes com fragmentos de G.

Exemplo 8 - O efeito de fragmentos de G sobre fixação de levedura em biofilme

O efeito de fragmentos G sobre a fixação de Candida albicans e Candida dubliniensis em biofilme foi investigado utilizando o ensaio de fixação descrito acima. Uma redução na fixação de ambas as espécies de Candida foi observada quando biofilmes contendo essas leveduras forem formados na presença de 2% de fragmentos de G e mucina comparada com o controle de apenas mucina. (Figura 9). Esses dados mostram que os fragmentos de G podem afetar a fixação de células de levedura no desenvolvimento de biofilmes.

Exemplo 9 - Análise microscópica de estrutura de biofilme Pseudomonas e efeitos de fragmentos de G

A estrutura total de biofilmes Pseudomonas foi realizada utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM). A Figura 10 mostra o efeito de 2% de fragmentos de G sobre a estrutura de biofilme. O polissacarídeo extracelular (EPS) que cobre as superfícies celulares parece ser dissolvido com 2% de fragmentos de G.

Exemplo 10 - Análise microscópica de estrutura de biofilme Pseudomonas e efeitos de fragmentos de G

O efeito de fragmentos de G sobre a estrutura da matriz de biofilme Pseudomonas foi investigado utilizando microscopia confocal de biofilmes em repouso marcados com o corante fluorescente BODIPY® 630/650-X SE. Esse corante colore seletivamente os componentes de matriz (EPS) em biofilmes Pseudomonas. A fragmentação sutil da matriz de biofilme foi visível com concentração crescente de fragmentos de G quando comparada com controle somente mucina.

Exemplo 11 - Composição tópica que compreende oligômero de alginato Um exemplo de uma composição tópica (uma local corporal hidratante) que compreende um oligômero de alginato é preparado com os seguintes ingredientes.

Fase Oleosa:

Óleo mineral...............................................................................................3%

Ciclometicona............................................................................................4%

Miristato de isopropila.................................................................................3%

Ácido esteárico.........................................................................................1,8%

Álcool cetílico............................................................................................1,0%

Estearato de glicerila................................................................................1,5%

Fase Aquosa:

Carbômero 984.......................................................................................0,10%

Glicerina.....................................................................................................3%

Trietanolamina........................................................................................0,90%

Oligômero de alginato...............................................................................0,1%

Água.....................................................................................................81,60%

Exemplo 12 - Composição de desbridamento que compreende oligômero de alginato

Um exemplo de uma composição de desbridamento líquida que compreende um oligômero de alginato é preparado com os seguintes ingredientes.

Óleo de rícino.........................................................................................77,8%

Bálsamo do Peru de grau refinado...........................................................10%

Colagenase ..............................................................................................0,2%

ZnCI..........................................................................................................0,5%

Água...........................................................................................................5%

Polioxietileno (10 )oleil éter.........................................................................4%

Sílica coloidal..............................................................................................2%

Oligômero de alginato...............................................................................0,5%

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método in vitro de combate a biofilme, caracterizado pelo fato de que compreende colocar o dito biofilme em contato com um oligômero de alginato, em que o oligômero de alginato apresenta pelo menos 70% de resíduos de G.
2. 2. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biofilme está sobre uma superfície inanimada.
3. 3. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a superfície é selecionada a partir de superfícies de transportadores, pisos, escoadouros, refrigeradores, congeladores, paredes, válvulas, correias, tubos, condutos de condicionamento de ar, aparelho de resfriamento, montagens de distribuição de alimentos ou bebidas, trocadores de calor, cascos de navios, equipamentos odontológicos, condutos de perfuração de poços de petróleo, lentes de contato, caixas de armazenamento de lentes de contato, cateteres, dispositivos protéticos ou dispositivos médicos implantáveis.
4. 4. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o oligômero de alginato (i) tem um peso molecular médio inferior a 35.000, 30.000, 25.000 ou 20.000 Daltons;

   (ii) tem um grau médio numérico de polimerização de 2 a 100, 2 a 75, 2 a 50, 2 a 35 ou 2 a 30;

   (iii) possui 3 a 35-meros, de 3 a 28-meros, de 4 a 25-meros, de 6 a 22-meros, de 8 a 20-meros ou de 10 a 15-meros;

   (iv) tem pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de resíduos de G; e/ou (v) tem uma estrutura primária em que pelo menos 90% dos resíduos de G estão ligados 1-4 a outro resíduo de G.
5. 5. Método in vitro de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido oligômero de alginato é usado em combinação com um antibiótico ou um agente antifúngico ou um agente antisséptico, desinfetante, esterilizante ou de limpeza.
6. 6. Método in vitro de acordo com qualquer uma das reivindicações

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   1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido oligômero de alginato é usado em combinação com uma alginato liase e/ou uma enzima DNase.
7. 7. Uso de um oligômero de alginato como definido na reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento no tratamento de uma infecção por biofilme em um indivíduo.
8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a superfície corporal externa é selecionada a partir de uma superfície na cavidade oral, conjuntiva, tecido da córnea, pele, escalpo ou unhas.
9. 9. Uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo selecionado a partir de um indivíduo com uma infecção pré-estabelecida, um indivíduo imunocomprometido, um indivíduo que está sendo submetido a tratamento intensivo ou crítico, um indivíduo que sofre de trauma, um indivíduo com uma queimadura, um indivíduo com uma ferida aguda e/ou crônica, um indivíduo recém-nascido, um indivíduo idoso, um indivíduo com câncer, um indivíduo que sofre de uma condição autoimune, um indivíduo com secreção epitelial ou endotelial reduzida ou suprimida e/ou depuração de secreção ou um indivíduo adaptado com um dispositivo médico.
10. 10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é selecionado a partir de um indivíduo com uma condição selecionada a partir de HIV, sepse, choque séptico, AIDS, um câncer do sistema imune, artrite reumatoide, diabetes melito tipo I, doença de Crohn, COPD, bronquite, fibrose cística, enfisema, câncer pulmonar, asma, pneumonia e sinusite, um indivíduo que está se preparando para, que está sendo submetido, ou se recuperando de quimioterapia e/ou radioterapia, um indivíduo com órgão transplantado, um indivíduo residente em uma instituição de cuidados com a saúde ou um fumante.
11. 11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a infecção por biofilme é uma infecção por Pseudomonas.
12. 12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a infecção por biofilme é uma infecção por Pseudomonas

    Petição 870180141824, de 17/10/2018, pág. 7/13 aeruginosa.
13. 13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o oligômero de alginato é usado no tratamento de placa dentária ou gengivite.
14. 14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que o dito oligômero de alginato é usado em combinação com um antibiótico, um agente fungicida, um agente antisséptico, um agente desinfetante, ou um agente esterilizante ou de limpeza.
15. 15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o oligômero de alginato é usado em combinação com pelo menos um outro agente de dissolução de biofilme e/ou agente redutor de viscosidade mucosa, em que o outro agente de dissolução de biofilme e/ou agente redutor de viscosidade mucosa é selecionado a partir de alginato liase, uma enzima DNase, gelsolina, agentes redutores de tiol, uma acetilcisteína, cloreto de sódio, um polissacarídeo de baixo peso molecular não-carregado, ou um poliaminoácido aniônico, e um precursor de óxido nítrico ou estimulador de síntese.
16. 16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que o dito oligômero de alginato é usado em combinação com um agente imunoestimulador, um fator de crescimento ou um agente anti-inflamatório.
17. 17. Produto, caracterizado pelo fato de que contém um oligômero de alginato como definido na reivindicação 1 ou 4, e um segundo agente ativo como uma preparação combinada para uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de infecção por biofilme em um indivíduo, em que o segundo agente ativo é selecionado dentre (i) um antibiótico, um agente antifúngico, um agente antisséptico, um agente desinfetante, um agente esterilizante, um agente de limpeza, (ii) alginato liase, uma enzima DNase, gelsolina, um agente redutor de tiol, uma acetilcisteína, cloreto de sódio, um polissacarídeo de baixo peso molecular não-carregado, um poliaminoácido aniônico, um precursor de óxido nítrico ou estimulador de síntese,

    Petição 870180141824, de 17/10/2018, pág. 8/13 (iii) um agente imunoestimulador, (iv) um fator de crescimento, ou (v) um agente anti-inflamatório.
18. 18. Produto, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo

    5 fato de que o referido produto está sob a forma de uma solução salina hipertônica, uma solução inalável, um pó inalável, um spray nasal, uma composição de desbridamento, uma composição tópica, um creme dental ou um enxaguatório bucal.
19. 19. Dispositivo médico implantável, caracterizado pelo fato de que

    10 compreende uma superfície inanimada, que foi revestida com um oligômero de alginato como definido na reivindicação 1 ou 4.
20. 20. Composição de desbridamento estéril à base de óleo ou estéril aquosa, caracterizada pelo fato de que contém:

    um oligômero de alginato como definido na reivindicação 1 ou 4; e

    15 pelo menos uma enzima proteolítica e/ou pelo menos uma fase sólida abrasiva.

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