PT2068918E - Composição para vacina contendo adjuvante sintético - Google Patents

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PT2068918E PT07875082T PT07875082T PT2068918E PT 2068918 E PT2068918 E PT 2068918E PT 07875082 T PT07875082 T PT 07875082T PT 07875082 T PT07875082 T PT 07875082T PT 2068918 E PT2068918 E PT 2068918E
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antigen
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glucosamine
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Steven G Reed
Darrick Carter
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Description

ΡΕ2068918 1 DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO PARA VACINA CONTENDO ADJUVANTE SINTÉTICO"
DECRARAÇÃO DE INTERESSE PÚBLICO
Esta invenção foi realizada parcialmente com suporte governamental, no âmbito da Bolsa N°. AI-250038, concedida pelo National Institute of Health. O governo possui certos direitos nesta invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com a área de composições farmacêuticas e de vacinas. Mais especificamente, as realizações aqui descritas relacionam-se com composições farmacêuticas e de vacinas, assim como com os métodos profiláticos e terapêuticos relacionados, em que as composições compreendem um adjuvante lipidico glucopiranosil (GLA).
Descrição da Técnica Relacionada 0 sistema imune dos organismos superiores tem sido caracterizado como conseguindo distinguir entre ΡΕ2068918 elementos exteriores (ou "non-self") e componentes familiares, ou "self", de modo que os agentes exteriores desencadeiam respostas imunes, enquanto que os componentes "self", são ignorados ou tolerados. As respostas imunes têm sido tradicionalmente caracterizadas ou como resposta humorais, em que anticorpos especificos para antigénios são produzidos por linfócitos B diferenciados, conhecidos como células do plasma, ou respostas mediadas por células, em que diversos tipos de linfócitos T atuam eliminando antigénios por diversos mecanismos. Por exemplo, as células T auxiliares CD4+, que são capazes de reconhecer antigénios especificos podem responder libertando mediadores solúveis, como as citoquinas, para recrutar mais células do sistema imune para participar numa resposta imune. Também as células T citotóxicas CD8+, que são capazes de reconhecimento de antigénios especificos, podem responder ligando-se e destruindo ou lesionando uma célula ou partícula portadora de antigénio. Sabe-se, na técnica imunológica, proporcionar certas vacinas de acordo com uma variedade de formulações, geralmente com a finalidade de induzir uma resposta imune desejada, num hospedeiro.
Diversas estratégias para provocar respostas imunes especificas através da administração de uma vacina a um hospedeiro, incluem a imunização com patógenos infecciosos inativados por calor ou vivos, atenuados, tais como virus, bactérias ou certos patógenos eucariotas; a imunização com um agente infeccioso não virulento capaz de dirigir a expressão de material genético codificando o(s) ΡΕ2068918 antigénio(s) para o qual a resposta imune é desejada; e imunização com vacinas subunitárias contendo imunogéneos isolados (como proteínas) de um patógeno particular, de modo a induzir imunidade contra o patógeno (ver, e.g., Liu, 1998, Nature Medicine, 4(5 supl.):515). Para alguns antigénios podem existir um ou mais tipos de imunidade desejada, para os quais nenhuma destas abordagens é particularmente eficaz, incluindo o desenvolvimento de vacinas que sejam eficazes na proteção imunológica de um hospedeiro contra virus de imunodeficiências humanas ou outros patógenos infeciosos, cancro, doença autoimune ou outras condições clinicas.
Sabe-se, desde há muito, que o lipopolisacarídeo enterobacteriano (LPS) é um potente estimulador do sistema imune, apesar de a sua utilização em adjuvantes ter sido impedida pelos seus efeitos tóxicos. Um derivado não tóxico do LPS, o monofosforil lipido A (MPL), produzido pela remoção do grupo carbohidrato do núcleo e do fosfato do terminar redutor da glucosamina, foi descrito por Ribi et al. (1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp. NY, p407-419).
Uma outra versão não tóxica do MPL resulta da remoção da cadeia acilo na posição 3 da coluna de dissacarideo, e é conhecido por monofosforil lipido A 3-0-desacetilado (3D-MPL). Pode ser purificado e preparado segundo os métodos ensinados na GB 2122204B, cuja referência também revela a preparação de difosforil lipido 4 ΡΕ2068918 A e das suas variantes 3-0-desacetiladas. Por exemplo, o 3D-MPL tem sido preparado sob a forma de uma emulsão possuindo um pequeno tamanho de partículas, com um diâmetro inferior a 0,2 μιη, e o seu método de manufatura é revelado na WO 94/21 292. Formulações aquosas compreendendo o monofosforil lipido A e um surf actante, foram descritas na WO9843670A2.
Adjuvantes derivados de lipopolissacarídeos bacterianos a serem formulados em combinações adjuvantes, podem ser purificados e processados a partir de fontes bacterianas, ou, alternativamente, podem ser sintéticos. Por exemplo, o monofosforil lipido A purificado é descrito em Ribi et al., 1986 (supra) e a 3-O-desacetilado monofosforil ou o difosforil lipido A derivado de Salmonella sp. é descrito na GB 2220211 e na U.S. Pat. N°. 4 912 094. Os 3D-MPL e ο β(1 — 6) glucosamina dissacarideos, assim como outros lipopolissacarídeos purificados e sintéticos já foram descritos (WO 98/01139; U.S. Pat, N°. 6 005 099 e EP 0 729 473 Bl, Hilgers et al., 1986, Int . Arch. Allergy Immunol., 79(4) :392 — 6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1); 141-6 e EP 0549 074 Bl). Combinações de adjuvantes 3D-MPL e saponina derivada da casca de Quillaja Saponaria molina foram descritas na EP 0 761 231B. A WO 95/17210 revela um sistema adjuvante em emulsão, com base em esqualeno, α-tocoferol e monooleato de poliosietileno sorbitano (TWEEN™-80), formulado com o imunoestimulante QS21 e incluindo, opcionalmente, 3D-MPL. Apesar da acessibilidade de tais combinações, a utilização de 5 ΡΕ2068918 adjuvantes derivados de produtos naturais é acompanhada por elevados custos de produção, inconsistência de lote para lote, dificuldades associadas com a produção em larga escala e incerteza em relação à presença de impurezas nos elementos de composição de uma dada preparação.
Existe, claramente, uma necessidade de vacinas melhoradas e, em particular, de vacinas que contenham, beneficamente, adjuvantes quimicamente definidos, de elevada pureza, que exibam consistência entre lotes e que possam ser manufaturados eficientemente a uma escala industrial, sem introdução de contaminantes não desejados ou estruturalmente indefinidos. A presente invenção proporciona composições e métodos para tais vacinas e oferece outras vantagens relacionadas.
Maeda et al., "Adjuvant Activities of Synthetic Lipid A Subunit Analogues and its Conjugates with MuramYl Dipeptide Derivatives", Vaccine, vol. 7, n°. 3, 1989, páginas 275-281, XP000993028, ISSN 0264-410X. Kanegasaki et al., "Biological Activities of Analogs of Lipid A Based Chemically on the Revised Strutural Model Comparison of Mediator-Inducing Immunomodulating and Endotoxic Activities", European Journal of Biochemistry, vol. 143, n°. 2, 1984, páginas 237-242, XP002498330; ISBN 0014-2956, revelam um sintético análogo do monofosforil lípido A com actividade adjuvante.
No primeiro aspecto da presente invenção, ΡΕ2068918 proporciona-se uma composição para vacina, compreendendo: (a) um antigénio; e (b) um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), em que o GLA tem a fórmula:
em que: R1, R3, R5 e R6 são Cn-C2o alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
Num segundo aspecto da presente invenção, proporciona-se uma composição para utilização na elicitação ou melhoramento de uma desejada resposta imune especifica a um antigénio, num sujeito, compreendendo a composição (a) um antigénio; e (b) um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) , em que o antigénio é derivado de ou é imunologicamente reactivo com, (i) pelo menos um patógeno infeccioso, (ii) pelo menos um epitopo, biomolécula, célula 7 ΡΕ2068918 ou tecido que esteja associado a uma doença autoimune, elicitando ou melhorando, por consequência, uma resposta imune especifica para o antigénio, em que o GLA tem a fórmula:
em que: R1, R3, R5 e R6 são Cn-C2o alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
Noutro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune, compreendendo: (a) um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (b) um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e em que o GLA tem a fórmula: 8 ΡΕ2068918
em que: R1, R3, R5 e R6 são Cn-C2o alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
Num outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um "kit" compreendendo: (a) uma composição incluindo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável; e (b) um antigénio, num segundo recipiente, em que a composição imunológica não está em contacto com o antigénio, e em que o GLA tem a fórmula: 9 ΡΕ2068918
em que: R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado. A presente invenção, nas suas diversas realizações dirije-se a composições e sua utilização em métodos que empregam, com vantagem, o adjuvante sintético glucopiranosil lípido (GLA), como estabelecido nas reivindicações, como adjuvante e componente de vacina. De acordo com uma realização da invenção aqui descrita, proporciona-se uma composição para vacina compreendendo um antigénio um adjuvante glucopiranosil lípido (GLA), como estabelecido nas reivindicações.
Noutras realizações, proporciona-se uma composição para vacina compreendendo (a) um antigénio; um adjuvante glucopiranosilo lípido (CLA), como estabelecido nas reivindicações e um agonista do receptor tipo "toll" (TLR) , sendo, em algumas realizações o agonista TLR 10 ΡΕ2068918 seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Noutra realização é proporcionada uma composição para vacina coompreendendo: um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações e pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina. Noutra realização, é proporcionada uma composição para vacina compreendendo um antigénio; um adjuvante glucopiranosilo lipido (GLA) , como estabelecido nas reivindicações e um veículo que inclui um óleo ou ISCOMATRIX™. Noutra realização é proporcionada uma composição para vacina compreendendo um antigénio; um adjuvante glucopiranosilo lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações e um ou mais de: (i) pelo menos um agonista TLR, (ii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um modificador imune de double stem (double stem loop imune modifier -dSLIM). Em algumas outras realizações, (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é seleccionado de tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o 11 ΡΕ2068918 modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado entre resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod. Noutra realização é proporcionada uma composição para vacina compreendendo: um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações; e, pelo menos um co-adjuvante ou um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um detergente e um copolimero em blocos ou um polimero biodegradável, e o veiculo farmaceuticamente aceitável compreende um veiculo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma, um nvossoma, um niossoma e uma microparticula. Numa realização particular, onde é utilizado um lipossoma ou um veículo similar, o GLA está na estrutura laminar do lipossoma ou está encapsulado. Noutra realização particular, em que é utilizada uma microparticula, a microparticula é uma com base em, ou compreendendo lípidos gordos poliméricos.
Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolimero em blocos ou o polímero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Noutras realizações é proporcionada uma composição para vacina compreendendo: um construto de 12 ΡΕ2068918 expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; e um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA). Numa realização, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus que é seleccionado entre um adenovirus, um virus adeno-associado, um herpesvirus, um lentivirus, um poxvirus e um retrovirus.
De acordo com algumas de todas as realizações acima descritas que incluem um agonista TLC, o agonista TLC é capaz de libertar um sinal biológico por interacção com pelo menos um TLR que é seleccionado entre TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8 e TLR-9. Em certas outras realizações, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolissacarideo, peptidoglicano, polyl:c, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a de elongação e iniciação ribossomal eucariota homólogo de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Numa realização particular, em que é utilizado um agonista TLR-7 e/ou TLR-8, o agonista TLR-7 e/ou TLR-8 está aprisionado numa vesicula.
De acordo com as realizações da invenção acima descritas, o GLA tem a fórmula: 13 ΡΕ2068918
em que: R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquilo; e R2 e R4 são Ci2~ C20 alquilo.
De acordo com algumas de todas as realizações acima descritas, a composição para vacina é capaz de provocar uma resposta imune num hóspede. Em algumas outras realizações, a resposta imune é especifica para o antigénio. De acordo com algumas de todas as realizações acima descritas, o antigénio é capaz de provocar uma resposta imune num hospedeiro, que é seleccionada entre resposta humoral e resposta mediada por células. De acordo com algumas de todas as realizações acima descritas, a composição para vacina é capaz de provocar num hóspede, pelo menos uma resposta imune que é seleccionada entre resposta linfócito T, tipo TH1, linfócito T, tipo TH2, resposta linfócito T citotóxico (CTL), resposta anticorpo, resposta citoquina, uma resposta linfoquina, uma resposta quimioquina e uma resposta inflamatória. De acordo com algumas de toda as realizações acima descritas, a composição para vacina é capaz de provocar num hóspede uma resposta imune que é seleccionada entre (a) produção de uma ou mais citoquinas, em que a citoquina é seleccionada entre ΡΕ2068918 interferão gama (IFN-γ), factor alfa de necrose tumoral (TNF-α) , (b) produção de uma ou mais interleucinas, em que a interleucina é seleccionada entre IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e L-23, (c) produção de uma ou mais quimioquinas, em que a quimioquina é seleccionada entre ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, RANTES, CCL4 e CCL5, e (d) uma resposta por linfócitos, que é seleccionadaa entre uma resposta células T memória, resposta célula B memória, resposta célula T, resposta célula T efectora, resposta célula T citotóxica e resposta célula B efectora.
De acordo com algumas de todas as realizações acima descritas, o antigénio é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso, que é seleccionado entre uma bactéria, um virus e um fungo.
Em algumas realizações, a bactéria é uma Actinobactéria, e em algumas outras realizações, a Actinobactéria é uma micobactéria. Em algumas outras realizações relacionadas, a micobactéria e seleccionada entre M. tuberculosis e M. leprae. Em algumas outras realizações relacionadas, a micobactéria e seleccionada entre Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia e Bordetella.
Em algumas outras realizações relacionadas, o virus é seleccionado entre um virus herpes simplex, um virus da imunodeficiência humana (HIV), um virus da imunodeficiência felina (FIV), citomegalovírus, Virus da 15 PE2068918
Varicella Zoster, vírus da hepatite, Vírus de Epstein Barr (EBV), vírus sincitial respiratório, vírus do papiloma humano (HPV) e um citomegalovírus. De acordo com algumas de todas as realizações acima descritas, o antigénio é derivado de um vírus da imunodeficiência humana, que em algumas outras realizações é seleccionado entre HIV-1 e HIV-2.
Em algumas outras realizações relacionadas, o fungo é seleccionado entre Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides e Pneumocystis. Em algumas outras realizações relacionadas, o fungo é uma levedura, que, em algumas outras realizações é uma Candida e em que algumas ainda outras realizações, a Candida é seleccionada entre C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. parapsilosis.
De acordo com algumas entre todas as realizações acima descritas, o antigénio é derivado de um parasita, que em certas outras realizações, é um protozoário, que, em algumas outras realizações é seleccionado entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale. Em algumas outras realizações, o parasita é seleccionado entre Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba díspar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia, Leishmania, Enterobius 16 ΡΕ2068918 vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp., Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica, Taenia saginata e Taenia solium.
De acordo com algumas entre todas as realizações acima descritas, o antigénio é derivado de, pelo menos, uma célula cancerosa. Em algumas outras realizações, a célula cancerosa é originária de um tumor sólido primário, em algumas outras realizações, a célula cancerosa é originária de um tumor que é metástico ou tumor sólido secundário e em algumas outras realizações, a célula cancerosa é originária de um cancro que é um tumor circulante ou um tumor de ascite. Em algumas realizações relacionadas, a célula cancerosa é originária de um cancro que é seleccionado entre cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro da mama, cancro da próstata, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, pseudomixoma peritonei, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma do cólon, cancro pancreático, carcinoma de células escamosas, carcinoma das células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinomas, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma das 17 ΡΕ2068918 células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional e tumor de Wilms. Em algumas outras realizações relacionadas, a célula cancerosa é originária de um tumor que é seleccionado entre tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oliodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e doenças de cadeias pesadas.
De acordo com algumas entre todas as realizações acima descritas, o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido que esteja associado com uma doença autoimune. Em algumas outras realizações, o epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com uma doença autoimune é seleccionado entre snRNP, quando a doença autoimune é lupus eritematoso , pelo menos um entre tiroglobulina, receptor tirotropinico e uma célula do epitélio da tiróide, quando a doença autoimune é doença de Graves, uma plaqueta quando a doença autoimune é púrpura trombocitopénica, pelo menos um dos antigénios de pênfigo, desmoglein-3, desmoplaquina, envoplaquina e antigénio 1 penfigóide boloso, quando a doença autoimune é pênfigo, proteina mielinica básica quando a doença autoimune é esclerose múltipla, célula beta do ilhéu pancreático quando 18 ΡΕ2068918 a doença autoimune é diabetes de tipo 1 e um receptor de acetilcolina quando a doença autoimune é miastenia gravis.
Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune, compreendendo um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune, compreendendo um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações; um agonista tipo "tool" do receptor (TLR) e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Numa outra realização, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, PolylrC, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune compreendendo: um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações; pelo menos um coadjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente 19 ΡΕ2068918 aceitável. Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune compreendendo: um antigénio; um adjuvante glucopiranosilo lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações e um veiculo farmaceuticamente aceitável que inclui um óleo ou ISCOMATRIX™. Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune compreendendo: (a) um antigénio; (b) um adjuvante glucopiranosilo lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações; (c) um ou mais de: (i) pelo menos um coadjuvante; (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um modificador imune de double stem (double stem loop imune modifier - dSLIM) ; e (d) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas outras realizações, (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado entre resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod.
Noutra realização é proporcionada uma composição 20 ΡΕ2068918 farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune, compreendendo: um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações; e, pelo menos um, co-adjuvante e um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um copolimero em blocos ou um polimero biodegradável, e um detergente, e o veiculo farmaceuticamente aceitável compreende um veiculo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma e uma microparticula. Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF e IFN-gama, o copolimero em blocos ou o polimero biodegradável é seleccionado entre Pluronic® L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Noutra realização é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune, compreendendo: um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações; e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas outras realizações, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus que é seleccionado entre um adenovirus, 21 ΡΕ2068918 um vírus adeno-associado, um herpesvírus, um lentivírus, um poxvírus e um retrovírus.
De acordo com algumas outras realizações das composições farmacêuticas acima descritas, o antigénio e o GLA estão em contacto um com o outro e de acordo com outras ainda realizações das composições farmacêuticas acima descritas, o antigénio e o GLA não contactam um com o outro. Em algumas outras realizações em que o antigénio e o GLA não contactam um com o outro, estão presentes em recipientes separados. Noutras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir ou melhorar uma resposta imune compreendendo uma primeira composição incluindo um antigénio e um primeiro veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável; e uma segunda combinação compreendendo um adjuvante glucopiranosil lípido (GLA) e um segundo veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, não estando o antigénio e o GLA em contacto um com o outro. Numa outra realização, o antigénio e o GLA estão presentes em recipientes separados. Em algumas realizações relacionadas, o primeiro veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável é diferente do segundo veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Noutras realizações relacionadas, o primeiro veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável não é diferente do segundo veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Noutra realização é proporcionado um método de utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou 22 ΡΕ2068918 prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio e (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Noutra realização é proporcionado um método de utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) um agonista do receptor tipo "toll" (TLR) , em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Numa outra realização, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o ΡΕ2068918 adjuvante glucopiranosil lípido (GLA); e (c) pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado do grupo que consiste em saponinas e miméticos da saponina, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) um veiculo que inclui pelo menos um óleo ou ISCOMATRIX™, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA); e (c) um ou mais de: (i) pelo menos um co-adjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um "double stem loop imune modifier" (dSLIM), em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a 24 ΡΕ2068918 doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Em algumas outras realizações, (i) o coadjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que 0 alcaloide de uma planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado entre resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod.
Noutra realização é proporcionado um método de utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) pelo menos um co-adjuvante e um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um detergente e um copolimero em blocos ou um polimero biodegradável, e um detergente, e o veiculo farmaceuticamente aceitável compreende um veiculo que é seleccionado do grupo que consiste em fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um ΡΕ2068918 lipossoma e uma micropartícuia, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolimero em blocos ou o polimero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Noutra realização é proporcionado um método de utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter a doença infecciosa, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com a doença infecciosa, tratando assim, ou evitando, a doença infecciosa. Numa outra realização, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus que é seleccionado entre um adenovírus, um virus adeno-associado, um ΡΕ2068918 herpesvírus, um lentivírus, um poxvírus e um retrovírus. De acordocom algumas outras realizações que se relacionam com os métodos acima descritos, o antigénio é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso que é seleccionado de um virus, uma bactéria, um fungo.
Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; e (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) um agonista do receptor tipo "toll", em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Em algumas outras realizações, o agonista TLR né seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, 27 ΡΕ2068918
Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) um veículo que inclui pelo menos um óleo ou ISCOMATRIX™, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em 28 ΡΕ2068918 risco de ter uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) um ou mais de: (i) pelo menos um coadjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos "double stem loop imune modifier" (dSLIM), em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Em algumas outras realizações, (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongaçao e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod.
Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter, uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para ΡΕ2068918 vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA); e (c) pelo menos um coadjuvante ou um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um detergente e um copolimero em blocos ou um polimero biodegradável, e o veiculo farmaceuticamente aceitável compreende um veiculo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma, e uma microparticula, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Numa outra realização, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolimero em blocos ou o polímero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter, uma doença autoimune, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; e (b) o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA) , 30 ΡΕ2068918 em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, tratando assim, ou evitando, a doença autoimune. Numa outra realização, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus que é seleccionado entre um adenovirus, um virus adeno-associado, um herpesvirus, um lentivirus, um poxvírus e um retrovirus.
Em algumas das realizações acima descritas, a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune, a doença autoimune é seleccionada enter diabetes de tipo 1, artrite reunatóide, esclerose múltipla, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, doença de Crohn, doença de Graves, purpura trombocitopénica e pênfigo. Em algumas outras das acima descritas realizações relacionadas com um método para tratamento ou prevenção de uma doença autoimune, o epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com a doença autoimune, é seleccionado entre snRNP, quando a doença autoimune é lupus eritematoso, pelo menos um entre tiroglobulina, receptor tirotropinico e uma célula do epitélio da tiróide, quando a doença autoimune é doença de Graves, uma plaqueta quando a doença autoimune é púrpura trombocitopénica, pelo menos um dos antigénios de pênfigo, desmoglein-3, desmoplaquina, envoplaquina e antigénio 1 penfigóide boloso, quando a doença autoimune é pênfigo, proteína mielínica básica quando a doença autoimune é ΡΕ2068918 esclerose múltipla, célula beta do ilhéu pancreático quando a doença autoimune é diabetes de tipo 1 e um receptor de acetilcolina quando a doença autoimune é miastenia gravis.
De acordo com outras realizações é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; e (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro. De acordo com outras realizações é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) um agonista do receptor tipo "toll", em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com o cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro. Em algumas outras realizações, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, PolylrC, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. De acordo com outras realizações é 32 ΡΕ2068918 proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter um cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado o cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro.
De acordo com outras realizações, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter um cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) um veiculo que inclui pelo menos um óleo ou ISCOMATRIX™, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com o cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro. De acordo com outras realizações, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter um cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) um ou 33 ΡΕ2068918 mais de: (i) pelo menos um co-adjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um "double stem loop imune modifier" (dSLIM), em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com o cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro. Em algumas outras realizações, (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod. De acordo com outra realização, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter, cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) pelo menos um co-adjuvante ou um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um copolímero em blocos ou um polimero biodegradável r um detergente, incluindo o 34 ΡΕ2068918 veículo farmaceuticamente aceitável um veículo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma, e uma micropartícula, em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com o cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro. Numa outra realização, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolímero em blocos ou o polímero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
De acordo com outras realizações, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito tendo, ou suspeito de estar em risco de ter cancro, compreendendo o método, a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; e (b) o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA), em que o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com o cancro, tratando assim, ou evitando, o cancro. Numa outra realização, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus que é 35 ΡΕ2068918 seleccionado entre um adenovírus, um vírus adeno-associado, um herpesvírus, um lentivírus, um poxvírus e um retrovírus.
Em algumas outras realizações, as utilizações acima descritas em métodos para tratar ou evitar o cancro, o antigénio é derivado de, pelo menos uma, célula cancerosa, gue, em algumas das realizações é originária de um tumor primário sólido, em algumas outras realizações é originária de um cancro que é um tumor sólido secundário e, ainda noutras realizações é originária de um cancro que é um tumor circulante ou um tumor de ascite. Em algumas realizações, as células cancerosas têm origem num cancro que é seleccionado entre cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro da mama, cancro da próstata, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, pseudomixoma peritonei, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma do cólon, cancro pancreático, carcinoma de células escamosas, carcinoma das células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinomas, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma das células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional e tumor de Wilms. Em algumas outras realizações relacionadas, a célula cancerosa é originária de um tumor que é seleccionado entre tumor testicular, 36 ΡΕ2068918 carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oliodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e doenças de cadeias pesadas.
De acordo com algumas outras realizações de qualquer uma das utilizações descritas acima nos métodos de tratamento ou prevenção de doença infecciosa, doença autoimune ou cancro, o passo de administração é realizado uma vez, enquanto que em outras realizações de tais métodos, o passo de administração é realizado pelo menos duas vezes, e algumas outras realizações, é efectuado pelo menos três vezes e ainda em algumas outras realizações, é realizado quatro ou mais vezes. De acordo com algumas outras realizações de qualquer uma das utilizações descritas acima nos métodos de tratamento ou prevenção de doença infecciosa, doença autoimune ou cancro, antes do passo de administração, o sujeito é sensibilizado (Primed) com um agente sensibilizante que é seleccionado entre um extracto bacteriano, uma vacina com virus vivo, pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando o antigénio. Numa outra realização, o extracto bacteriano é derivado do Bacillus de Calmet-Guerin (BCG). 37 ΡΕ2068918
Noutra realização, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA). Noutra realização, proporciona-se um método para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) um agonista do receptor tipo "toll". Em algumas outras realizações, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) pelo menos um coadjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina. Noutra realização é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) um veiculo 38 ΡΕ2068918 que inclui pelo menos um óleo ou ISCOMATRIX™. De acordo com outras realizações, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) um ou mais de: (i) pelo menos um co-adjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um "double stem loop imune modifier" (dSLIM). Em algumas outras realizações, (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod.
Noutra realização, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) um antigénio; (b) 39 ΡΕ2068918 o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA); e (c) pelo menos um co-adjuvante ou um veículo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um copolímero em blocos ou um polímero biodegradável e um detergente, incluindo o veículo farmaceuticamente aceitável um veículo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma, e uma micropartícula. Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolímero em blocos ou o polímero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Noutra realização, é proporcionada a utilização do GLA da invenção num método para desencadear ou melhorar uma resposta imune específica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição para vacina que inclui (a) pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; e (b) o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA). Noutras realizações, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai, o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus que é seleccionado entre um adenovirus, um virus adeno-associado, um herpesvírus, um lentivírus, um poxvirus e um retrovirus. 40 ΡΕ2068918
Em algumas outras realizações relacionadas, o agonista TLC, quando presente, é capaz de libertar um sinal biológico por interacção com pelo menos um TLR que é seleccionado entre TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8 e TLR-9. Em certas outras realizações, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolissacarideo, peptidoglicano, polyl:c, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a de elongação e iniciação ribossomal eucariota homólogo de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C.
Nas realizações das acima descritas para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, o GLA tem a fórmula:
em que: R1, R3, R5 e R6 são Cn-C2o alquilo; e R2 e R4 são Ci2-C2o alquilo.
Em algumas outras realizações das acima descritas utilizações em métodos para desencadear ou melhorar uma 41 ΡΕ2068918 desejada resposta imune específica para um antigénio, num sujeito, a composição para vacina é capaz de desencadear uma resposta imune num hóspede. Em algumas outras realizações, a resposta imune é específica para o antigénio. Em algumas outras realizações dos acima descritos métodos para desencadear ou melhorar uma desejada resposta imune específica para um antigénio, num sujeito, o antigénio é capaz de provocar uma resposta imune num hospedeiro, que é seleccionada entre resposta humoral e resposta mediada por células. Em algumas outras realizações dos acima descritos métodos para iniciar ou melhorar uma resposta desejada, específica para um antigénio, num sujeito, a composição para vacina é capaz de provocar num hóspede, pelo menos uma resposta imune que é seleccionada do grupo que consiste em: linfócito T, tipo TH1, linfócito T, tipo TH2, resposta linfócito T citotóxico (CTL) , resposta anticorpo, resposta citoquina, uma resposta linfoquina, uma resposta quimioquina e uma resposta inflamatória. Em algumas outras realizações dos acima descritos métodos para iniciar ou melhorar uma resposta desejada, específica para um antigénio, num sujeito, a composição para vacina é capaz de provocar num hóspede pelo menos uma resposta imune que é seleccionada do grupo que consiste em (a) produção de uma ou mais citoquinas, em que a citoquina é seleccionada entre interferão gama (IFN-γ), factor alfa de necrose tumoral (TNF-α), (b) produção de uma ou mais interleucinas, em que a interleucina é seleccionada entre IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e L-23, (c) produção de uma 42 ΡΕ2068918 ou mais quimioquinas, em que a quimioquina é seleccionada entre ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, RANTES, CCL4 e CCL5, e (d) uma resposta por linfócitos, que é seleccionada entre uma resposta célula T memória, resposta célula B memória, resposta célula T, resposta célula T efectora, resposta célula T citotóxica e resposta célula B efectora.
De acordo com outras realizações é proporcionado um método para preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) um antigénio e (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); De acordo com algumas outras realizações é proporcionado um método para preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) um antigénio, (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e (c) um agonista do receptor tipo "toll". Em algumas outras realizações, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. De acordo com algumas outras realizações é proporcionado um método para preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina. De acordo com algumas outras realizações, é proporcionado um método para preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) um veiculo que ΡΕ2068918 inclui pelo menos um óleo ou ISCOMATRIX™. De acordo com algumas outras realizações, é proporcionado um método para preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) ; e (c) um ou mais de: (i) pelo menos um coadjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um "double stem loop imune modifier" (dSLIM). Em algumas outras realizações, (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod. De acordo com com algumas outras realizações, é proporcionado um método para preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) um antigénio; (b) o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA); e (c) pelo menos um co-adjuvante ou um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado do grupo que consiste em uma citoquina, um copolímero em blocos ou um polímero biodegradável e um detergente, incluindo o veículo farmaceuticamente aceitável um veículo que é 44 ΡΕ2068918 seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma, e uma micropartícula. Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolímero em blocos ou o polímero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
De acordo com algumas outras realizações, é proporcionado um método de preparação de uma composição para vacina, compreendendo a mistura de (a) pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio; e (b) o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA). Em algumas outras realizações, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai o qual, em algumas outras realizações, está presente num virus, que é seleccionado entre um adenovírus, um vírus adeno-associado, um herpesvírus, um lentivírus, um poxvírus e um retrovírus. Em algumas realizações, o GLA não é 3'-de-O-acetilado. Em algumas realizações, o GLA inclui: (i) um esqueleto diglucosamina possuindo um terminal glucosamina redutor, ligado a um terminal glucosamina não redutor, através de uma ligação éter entre a posição 1 da hexosamina do terminal não redutor e posição 6 da hexosamina do terminal glucosamina redutor; (ii) um grupo O-fosforilo ligado à posição 4 do terminal glucosamina não 45 ΡΕ2068918 redutor; e (iii) até seis cadeias de acilo gordo; em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao 3-hidróxilo do terminal redutor da glucosamina, através de uma ligação ester, em que uma ou mais cadeias de ácido gordo estão ligadas ao 2-amino do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação amida, e compreendendo uma cadeia tetradecanoilo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester, e em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao 3-hidróxilo do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação ester e incluindo uma cadeia tetradecanoilo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester. Em algumas realizações, o agonista TLC é capaz de libertar um sinal biológico por interacção com pelo menos um TLR que é seleccionado entre TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8 e TLR-9. Em certas outras realizações, o agonista TLR é seleccionado entre lipopolissacarídeo, peptidoglicano, polyl:c, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a de elongação e iniciação ribossomal eucariota homólogo de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C.
De acordo com algumas realizações doa acima descritos métodos de preparação de uma composição para vacina, o GLA tem a fórmula: 46 ΡΕ2068918
em que: R1, R3, R5 e R5 são Cu-C2o alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo.
Em algumas outras realizações o passo de mistura compreende o emulsionamento e noutras realizações, o passo de mistura inclui a formação de partículas, que em algumas realizações inclui micropartículas. Ainda noutras realizações, o passo de mistura compreende a formação de um precipitado que inclui todo, ou uma porção, do antigénio e ou todo, ou uma parte, do GLA.
Em algumas outras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo: um adjuvante glicopiranosil lípido (GLA), como estabelecido nas reivindicações e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas outras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glicopiranosil lípido (GLA), como estabelecido nas 47 ΡΕ2068918 reivindicações, e um agonista do receptor tipo "toll" (TLR) . Em algumas realizações o agonista TLR seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Em algumas outras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações e pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina. Em algumas outras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações e um veiculo que inclui um óleo ou ISCOMATRIX™. Em algumas outras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo:(a) um adjuvante glucopiranosilo lipido (GLA), como estabelecido nas reivindicações e (b) um ou mais de: (i) pelo menos um co-adjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um "double stem loop imune modifier" (dSLIM).
Em algumas outras realizações, (i) o coadjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é seleccionado de tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, ΡΕ2068918
Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarídeo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado entre resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod.
Em algumas outras realizações é proporcionada uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações e pelo menos um coadjuvante ou um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que: o co-adjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um detergente e um copolimero em blocos ou um polimero biodegradável, e o veiculo farmaceuticamente aceitável compreende um veiculo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma e uma microparticula. Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-α e IFN-gama, o copolimero em blocos ou o polimero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polyl:C, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Em algumas outras realizações é proporcionada a utilização do GLA da invenção, num método de alteração da 49 ΡΕ2068918 resposta imunológica num hospedeiro, compreendendo: a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) como estabelecido nas reivindicações e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, alterando assim a resposta imunológica num hospedeiro. Em algumas outras realizações, proporciona-se um método de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, compreendendo: a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), e (b) um agonista do receptor tipo "toll" (TLR), alterando assim a resposta imunológica num hospedeiro. Em algumas outras realizações o agonista TLR é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, Polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C. Em algumas outras realizações proporciona-se um método de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, compreendendo: a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), e pelo menos um co-adjuvante, que é seleccionado entre saponinas e miméticos da saponina, alterando assim a resposta imunológica num hospedeiro. Em algumas outras realizações proporciona-se a utilização do GLA da invenção num método de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, compreendendo: um adjuvante glucopiranosilo lipido (GLA) e um veiculo que inclui um ΡΕ2068918 óleo ou ISCOMATRIX™, alterando assim a resposta imunológica num hospedeiro. Em algumas outras realizações, proporciona-se a utilização do GLA da invenção num método de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, compreendendo: a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica imunologicamente adjuvante, compreendendo o adjuvante glucopiranosil lipido (GLA) e um ou mais de: (i) pelo menos um co-adjuvante, (ii) pelo menos um agonista TLR, (iii) pelo menos um modificador da resposta imune imidazoquinolina e (iv) pelo menos um "double stem loop imune modifier" (dSLIM), alterando assim a resposta imunológica num hospedeiro. Em algumas outras realizações, o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado entre alúmen, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide de uma planta é seleccionado de tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, (ii) o agonista TLR, quando presente, é seleccionado entre lipopolisacarideo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a da elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C, e (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado entre resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod.
Em algumas outras realizações, proporciona-se a utilização do GLA da invenção num método de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, compreendendo: a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica ΡΕ2068918 imunologicamente adjuvante, compreendendo o adjuvante glucopiranosil lípido (GLA) e pelo menos um co-adjuvante ou um veículo farmaceuticamente aceitável, em que: o coadjuvante é seleccionado entre uma citoquina, um detergente e um copolímero em blocos ou um polímero biodegradável, e o veículo farmaceuticamente aceitável compreende um veículo que é seleccionado entre fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, uma emulsão água-em-óleo, um lipossoma e uma micropartícula, alterando assim a resposta imunológica num hospedeiro. Em algumas outras realizações, a citoquina é seleccionada entre GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-a e IFN-gama, o copolímero em blocos ou o polímero biodegradável é seleccionado entre Pluronic L121, CRL1005, PLGA, PLA, PLG e polylrC, e o detergente é seleccionado do grupo que consiste em saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina.
Em algumas outras realizações das utilizações acima descritas de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, o passo de administração é efectuado uma, duas, três, quatro ou mais vezes. Em algumas outras realizações dos métodos acima descritas de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, a alteração da resposta imunológica no hospedeiro compreende a indução ou melhoramento de uma resposta imune. Em algumas outras realizações dos métodos acima descritas de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, a alteração da resposta imunológica no hospedeiro compreende uma sub-regulação da resposta imune. Em algumas outras realizações 52 ΡΕ2068918 dos métodos acima descritas de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, o método compreende também a administração simultânea ou sequencial e em qualquer ordem, de um antigénio derivado de, ou que é imunologicamente reactivo com, pelo menos um patógeno infeccioso associado com uma doença infecciosa contra a qual é desejado induzir, ou melhorar, uma resposta imunológica. Em algumas outras de tais realizações, o passo de administração do antigénio é efectuado uma, duas, três, quatro ou mais vezes. Em algumas outras realizações dos métodos acima descritas de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, o método compreende também a administração simultânea ou sequencial e em qualquer ordem, de um antigénio derivado de, ou que é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido que esteja associado a uma doença autoimune e contra a qual seja desejada uma sub-regulação da resposta imunológica. Em algumas outras de tais realizações, o passo de administração do antigénio é efectuado uma, duas, três, quatro ou mais vezes. Em algumas outras realizações dos métodos acima descritas de alteração da resposta imunológica num hospedeiro, o método compreende a administração simultânea ou sequencial e em qualquer ordem, de um antigénio derivado de, ou que é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido que esteja associado a um cancro e contra o qual seja desejada uma indução ou melhoramento da resposta imunológica. Em algumas outras tais realizações, o passo de administração do antigénio é efectuado uma, duas, três, quatro ou mais vezes. 53 ΡΕ2068918
Em outra realização é proporcionado um "kit", compreendendo: uma composição adjuvante imunológica, como descrito acima, num primeiro recipiente; e um antigénio num segundo recipiente, em que a composição adjuvante imunológica não está em contacto com o antigénio. Noutra realização, é proporcionado um "kit" compreendendo: uma composição adjuvante imunológica, como descrito acima, num primeiro recipiente; e pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio, num segundo recipiente, em que a composição adjuvante imunológica não está em contacto com o construto de expressão recombinante. Em algumas outras realizações do "kit" descrito, o antigénio é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso seleccionado entre uma bactéria, um vírus, uma levedura e um protozoário. Em algumas outras realizações do "kit" descrito, o antigénio é derivado de pelo menos uma célula cancerosa. Em algumas outras realizações relacionadas do "kit" descrito, o antigénio é derivado de, ou é imunologicamente reactivo com, pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido que esteja associado com uma doença autoimune.
Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes com base na descrição detalhada e desenhos anexos que se seguem. Adicionalmente, são estabelecidas certas referências, descrevendo com maior detalhe alguns aspectos desta invenção, e que são, consequentemente, totalmente incorporados por referência. ΡΕ2068918
BREVE DESCRIÇÃO DOS DIVERSOS DESENHOS A Figura 1 mostra dados de HPLC demonstrando o número e quantidades de materiais contaminantes em MPL-AF e GLA-AF. Estes cromatogramas foram recolhidos utilizando um sistema Agilent 1100 e um detector ESA Corona CAD. O método foi realizado utilizando um gradiente de metanol para clorofórmio, numa culuna Waters Atlantis C18. As injecções incluíram 2,5 μg de GLA e MPL, respectivamente, e 0,27 μρ de fosfocolina sintética (POPC), utilizada como agente solubilizante. A Figura 2 mostra dados de ELISA, demonstrando níveis de citoquinas e quimioquinas expressos por macrofagos humanos da linha de células Mono Mac 6 (painéis a - e) e DC derivado de PBMC (painéis f-g) , em resposta a estimulação com GLA. As células foram cultivadas a 1x105 células/poço, com uma formulação de GSK Biologicals MPL® (MPL-AF), GLA (GLA-AF) ou apenas veículo AF, durante 24 horas. Os níveis de ΜΙΡ-lb, IP-10, IL-6, IL-23 e IL-lb nos sobrenadantes foram medidos por ELISA sandwich. A Figura 3 mostra os dados de ELISA demonstrando os níveis de produção de anticorpos anti-Fluzone, induzidos em murganhos, uma semana após cada imunização (i.e., no dia 7, painel A, e no dia 28, painel B), utilizando duas doses diferentes de vacina Fluzone formulada com GLA-AF ou GLA-SE, em comparação apenas com Fluzone. Os painéis A e B mostram os títulos de Ab por ELISA, de murganhos imunizados 55 ΡΕ2068918 duas vezes, com três semanas de intervalo, com 20 mL (1,8 μg) ou 2 mL (0,18 mg) de vacina Fluzone (Flu) , numa formulação contendo GLA-AF, GLA-SE ou sem adjuvante, uma semana após a primeira (A) ou a segunda (B) injecção. O painel C mostra titulos do anticorpo neutralizante (HAI) no soro dos murganhos, após a segunda imunização. A Figura 4 mostra dados de ELISA demonstrando niveis de produção de anticorpo anti-SMT, induzido em murganhos, uma semana após a terceira imunização, utilizando apenas antigénio SMT ou formulado com GLA-SE. Imunizaram-se murganhos C57BL/6 três vezes, com três semanas de intervalo, com antigénio SMT (10 μg por animal, por cada imunização) formulado numa emulsão estável contendo GLA (GLA-SE; 20 μρ por animal, por cada imunização), ou injectados apenas com proteína SMT. Recolheu-se o soro por sangramento, uma semana após cada imunização e examinaram-se por ELISA os níveis séricos de anticorpos IgGl e IG2c, específicos para SMT. Mostram-se as médias e os SEM das titulações terminais recíprocos. A Figura 5 mostra dados de ELISA demonstrando os níveis de produção de anticorpo anti-Leish-llOf, induzido em murganho, uma semana após a primeira imunização, utilizando antigénio Leish-llOf, formulado com diferentes quantidades de GLA (40, 20, 5 ou 1 μg) , em comparação com controlos salinos. Imunizaram-se murganhos Balb/c três vezes, com duas semanas de intervalo, com o antigénio Leish-llOf (10 μρ por animal, por cada imunização), 56 ΡΕ2068918 formulado numa emulsão estável contendo 40, 20, 5 ou 1 mg de GLA (GLA-SE) ou injectados sol solução salina. Os soros foram recolhidos por sangramento, uma semana após cada imunização, e os níveis séricos de anticorpos IgGl e IG2c, específicos para o Leish-llOf foram examinados por ELISA. Mostram-se as médias e os SEM das titulações terminais recíprocos para os soros recolhidos 7 dias após a primeira imunização. A Figura 6 mostra os dados de ELISA demonstrando os níveis de produção da citoquina IFN-g anti-Leish-llOf, induzidos em murganhos, uma semana após a terceira imunização, utilizando antigénio Leish-llOf formulado com diferentes quantidades de GLA e controlos salinos. Esplenócitos de murganhos Balb/c imunizados três vezes, com intervalos de duas semanas, com antigénio Leish-llOf (10 μg), formulado em emulsão estável contendo 40, 5 ou 1 μg de MPL (MPL-SE) ou GLA (GLA-SE) ou de murganhos injectados com solução salina, foram cultivados durante 3 dias, in vivo, apenas em meio, ou em meio contendo 10 mg/mL de Leish-llOf, ou 3 mg/mL de Concanavalina A (ConA). Mediram-se os níveis de IFN-g nos sobrenadantes por ELISA. São mostradas as médias e os SEM. A Figura 7 mostra dados ICS demonstrando as frequências de produção de citoquinas IFN-g, IL-2 e TNF específicas para a ID83 por células T CD4+ e CD8+, indizido em murganhos, uma semana após a terceira imunização utilizando apenas ID83 ou adjuvado com formulações contendo 57 ΡΕ2068918 GLA (GLA-SE), GLA+CpG (GLA/CpG-SE) ou GLA+GDQ (GLA/GDQ-SE). Esplenócitos de murganhos C57BL/6, imunizados três vezes, com três semanas de intervalo, com proteína de fusão ID83 de M. tuberculosis (8 μg) , formulada com GLA-SE, GLA/CpG-SE, GLA/Gardiquimod (GDQ)-SE, ou injectados com salina, foram cultivados in vitro durante 12 horas, em meio contendo 10 mg/mL de ID83. Os níveis celulares de IL-2, TNF e IFN-g em células T agrupadas (gated) CD3+CD4+ ou CD3+CD8+ foram detectados por coloração intracelular e medidos por citometria de fluxo num BD LSRII FACS.
Na Figura 8, o painel A mostra dados de ICS, demonstrando a frequência de produção da citoquina IFN-g específica para a ML0276 por células T CD4+, induzida em murganho, uma semana após a terceira imunização, utilizando antigénio ML0276 formulado em formulações aquosas contendo CpG, Imiquimod (IMQ) ou numa emulsão estável em óleo contendo (GLA (GLA-SE) ou as três misturadas em conjunto, em comparação com controlos salinos e sem tratamento. Esplenócitos de murganhos C57BL/6, imunizados três vezes, com três semanas de intervalo, com antigénio ML0276 de M. leprae (10 μg) , formulado com CpG, Imiquimod (IMQ),GLA-SE, uma combinação dos três, ou injectados com salina, foram cultivados in vitro durante 12 horas, em meio contendo 10 mg/mL de ML0276. O painel A mostra os níveis celulares de IFN-g em células T CD3+CD4+, detectados por coloração intracelular e medidos por citometria de fluxo num BD LSRII FACS. O painel B mostra a dremagem celular dos nódulos linfáticos, correlacionada com a protecção. 58 ΡΕ2068918
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção, nas suas diversas realizações, proporciona composições para vacina, composições adjuvantes e métodos relacionados, que incluem a utilização de um adjuvante glucopiranosil lipido sintético (GLA). 0 GLA proporciona um adjuvante imunológico sintético que, vantajosamente em relação aos adjuvantes da técnica anterior, e em particular, em relação aos produtos adjuvantes naturais, pode ser preparado de forma substancialmente homogénea. Adicionalmente, o GLA pode ser preparado ecicientemente e economicamente por meio de manufactura de sintese química em larga escala, ao contrário dos adjuvantes derivados de produtos naturais. Como adjuvante sintético, que é sintetizado quimicamente a partir de materiais de partida definidos, para se obter um produto quimicamente definido exibindo constância qualitativa e quantitativa de lote para lote, o GLA oferee assim benefícios sem precedentes, incluindo o melhoramento do controlo de qualidade do produto. Surpreendentemente, apesar do lipido A 3-acilado, monofosforilado ter sido associado com algumas toxicidades, verificou-se que quando a posição 2 da amina contém uma única cadeia acilo, a molécula retém um perfil aceitável de segurança. Além disso, a síntese de tais compostos é simplificada porque a desacetilação na posição 3 apresenta desafios técnicos. Assim, a invenção oferece outras vantagens em termos de segurança e facilidade de síntese. 59 ΡΕ2068918
Tal como aqui descrito, as composições contendo GLA e métodos para a sua utilização, incluem, em algumas realizações, apenas a utilização do GLA, com um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, para adjuvante da actividade imunológica, "adjuvante", incluindo a administração do GLA a um sujeito, totalmente independente de, e/ou separada temporalmente e/ou espacialmente, da administração ao sujeito de um ou mais antigénios contra os quais o início ou melhoramento de uma resposta imune (e.g., uma resposta específica ao antigénio) no sujeito, é desejado. Outras realizações incluem a utilização de GLA numa composição para vacina que também inclui um ou uma pluralidade de antigénios contra os quais é desejada uma resposta imune desencadeada ou melhorada por tal vacina. Tal como aqui descrito, estas composições para vacina podem, em algumas realizações relacionadas, incluir também um ou mais agonistas tipo "toll" do receptor (TLR) e um ou uma pluralidade de um ou mais co-adjuvantes, um modificador imidazoquinolina da resposta imune e um "double stem loop immune modifier" (dSLIM). Noutras realizações relacionadas, a composição para vacina pode incluir GLA e um ou mais construtos de expressão recombinantes compreendendo cada um um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácidos nucleicos que codificam o antigénio contra o qual tal desencadeamento ou melhoramento da resposta imune (e.g., uma resposta específica ao antigénio) no sujeito, é desej ado. 60 ΡΕ2068918
GLA
Como também notado acima, como quimicamente sintetizado, o adjuvante GLA pode ser preparado de forma substancialmente homogénea, o que se refere a uma preparação de GLA que é, pelo menos 80%, preferencialmente, pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 95% e mais preferencialmente ainda, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% pura, em relação à molécula de GLA, que compreende (i) um esqueleto diglucosamina possuindo um terminal glucosamina redutor, ligado a um terminal glucosamina não redutor, através de uma ligação éter entre a posição 1 da hexosamina do terminal não redutor e a posição 6 da hexosamina do terminal glucosamina redutor; (i i) um grupo O-fosforilo ligado à posição 4 do terminal glucosamina não redutor; e (iii) até seis cadeias de acilo gordo; em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao 3-hidróxilo do terminal redutor da glucosamina, através de uma ligação ester, em que uma ou mais cadeias de ácido gordo estão ligadas ao 2-amino do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação amida, e compreendendo uma cadeia tetradecanoílo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester, em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao 3-hidróxilo do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação ester e incluindo uma cadeia tetradecanoilo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester. A determinação do grau de ΡΕ2068918 pureza de uma dada preparação de GLA pode ser facilmente efectuada pelos familiarizados com as metodologias apropriadas de quimica analítica, tais como as análises por cromatografia gasosa, cromatografia liquida, espectroscopia de massa e/ou ressonância magnética nuclear. 0 GLA, tal como aqui utilizado, pode possuir a seguinte fórmula estrutural geral:
em que Rl, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquilo e R2 e R4 são C12-C20 alquilo. 0 GLA pode ser obtido comercialmente a, por exemplo, Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL; produto número 699800, em que Rl, R3, R5 e R6 são undecilo e R2 e R4 são tridecilo). "Alquilo" significa um hidrocarboneto alifático com cadeia linear ou ramificada, ciclico ou não ciclico, saturado ou insaturado, contendo de 1 a 20 átomos de carbono e, em algumas realizações, contendo de 11 a 20 átomos de carbono. Alquilos representativos, saturados e de 62 ΡΕ2068918 cadeia linear incluem: metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, e outros do mesmo tipo, incluindo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc., enquanto que os alquilos saturados e ramificados incluem isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, e outros do mesmo tipo. Alquilos cíclicos saturados representativos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo e outro do mesmo tipo; os as quilos cíclicos insaturados incluem ciclopentenilo, ciclohexenilo e outros semelhantes. Os alquilos cíclicos são também aqui referidos como "homociclos" ou "anéis homocíclicos". Os alquilos insaturados contêm pelo menos uma ligação dupla ou tripla entre átomos adjacentes de carbono (referidos como um "alcenilo" ou "alcinilo", respectivamente). Alcenilos representativos, de cadeia linear e ramificada, incluem etilenilo, propilenilo-l-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo e outros do mesmo tipo; alcinilos representativos, de cadeia linear e ramificada, incluem acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-l-butinilo e outros semelhantes.
Assim, em certas realizações aqui contempladas, o GLA pode ter qualquer uma das estruturas acima descritas e, em algumas realizações, pode ser expressamente contemplado que GLA pode, e em algumas outras realizações é expressamente contemplado que GLA não pode, ter qualquer 63 ΡΕ2068918 estrutura de um adjuvante lipídico que seja revelado em uma ou mais das U.S. Pat. N°. 6 544 518, EP 1531158, WO 2001/036433, WO 97/11708, WO 95/14026, U.S. 4 987 237, JP 63010728, JP 07055906, WO 2000/013029, U.S.5 530 113, U.S. 5 612 476, U.S. 5 756 718, U.S. 5 843 918, WO 96/09310, Pub. U.S. 2004/161776, Pub. U.S. N°. 2003/170249, Pub. U.S. N° . 2002/176867, WO 2002/032450, WO 2002/028424, WO 2002/016560, WO 2000/042994, WO 2000/025815, WO 2000/018929, JP 10131046, WO 93/12778, EP 324455, DE 3833319, U.S. 4 844 894, U.S. 4 629 722. Assim, em algumas realizações, o GLA não é 3'-de-0 acetilado.
Antigénio
Um antigénio para utilização em algumas realizações das aqui descritas composições e métodos para vacina empregando GLA, pode ser qualquer epitopo, molécula (incluindo uma biomolécula) , complexo molecular (incluindo complexos moleculares contendo biomoléculas), conjuntos subcelulares, células ou tecidos alvo contra os quais a elicitação ou melhoramento da imunoreactividade num sujeito, é desejada. O termo antigénio referir-se-à, frequentemente, a um antigénio polipeptídico de interesse. Contudo, antigénio, tal como aqui utilizado, também pode referir-se a um construto recombinante que codifique um antigénio polipeptídico de interesse (e.g., um construto de expressão). Em algumas realizações preferidas, o antigénio pode ser, ou pode ser derivado de, , ou pode ser imunologicamente reactivo com, um patógeno e/ou um epitopo, 64 ΡΕ2068918 biomolécula, célula ou tecido que esteja associado com infecção, cancro, doença autoimune, alergia, asma ou qualquer outra condição em que a estimulação de uma resposta imune especifica para o antigénio deva ser desejável ou benéfica.
Preferencialmente, e em algumas realizações, as formulações para vacina da presente invenção, contêm um antigénio ou uma composição antigénica capaz de provocar uma resposta imune contra um patógeno humano ou de outro mamífero, podendo ou antigénio ou a composição antigénica incluir uma composição derivada de um vírus, tal como o HIV-1 (tal como tat, nef, gpl20 ou gpl60), vírus do herpes humano , como o gD ou seus derivados ou proteína Immediate Early, como a ICP27 do HSV1 ou HSV2, citomegalovirus (especialmente Humano, tal como gB ou seus derivados), Rotavirus (incluindo os vírus vivos atenuados), vírus de Epstein Barr (tal com gp350 ou seus derivados), vírus da Varicella Zóster (tais como gpl II e IE63) ou de um vírus da hepatite, como o vírus da hepatite B (por exemplo, antigénio da superfície do Hepatite B ou um seu derivado), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E, ou outros patógenos virais, tais como os paramixovirus: : vírus sincitial respiratório (tais como as proteínas F e G ou seus derivados), vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da papeiravirus do papiloma humano (por exemplo, HPV6, 11, 16, 18, etc.), flaviviroses (e.g., vírus da febre amarela, vírus do Dengue, encefalite da carraça, vírus da encefalite japonesa) ou vírus da 65 ΡΕ2068918 influenza (vírus inteiro vivo ou inactivado, fragmentos do vírus da influenza, cultivado em ovos ou células MDCK, ou virosomas da gripe (como descritos por Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920), ou suas proteínas, purificadas ou recombinantes, tais como proteínas HA, NP, NA ou M, ou suas combinações).
Em algumas outras realizações preferidas, as formulações para vacina da presente invenção comtêm um antigénio ou composição antigénica capaz de provocar uma resposta imune contra um patógeno humano ou de outro mamífero, em o antigénio ou a composição antigénica pode incluir uma composição derivada de um ou mais patógenos bacterianos, tais como de Neisseria spp., incluindo N. gonorrhea e N.meningitidis (por exemplo, polissacarídeos da cápsula e seus conjugados, proteínas de ligação à transferritina, proteínas de ligação à lactoferrina, PilC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo, proteínas M ou seus fragmentos, protease C5A, ácidos lipoteicóicos), S. agalactidae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp., incluindo M. catarrahalis, também conhecida como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de peso molecular elevado ou baixo); Bordetella spp., incluindo B. pertussis (por exemplo perfactina, toxina de pertussis, ou seus derivados, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fímbrias), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis (por exemplo, ESAT6, Antigénio 85A, B ou C) , M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. 66 ΡΕ2068918 smegmatis; Legionella spp., incluindo L. pneumophila; Escherichia spp., incluindo E. coli enterotóxica ( por exemplo, factores de colonização toxina termolábil ou seus derivados, toxina termoestável ou seus derivados), E.coli enterohemorrrágica, E. coli enteropatogénica (por exemplo, toxinas do tipo shiga ou seus derivados); Vibrio spp., incluindo V. cholera (por exemplo, toxina da cólera ou seus derivados); Shigella spp., incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., incluindo Y. enterocolitica (por exemplo uma proteina Υορ), Y. pestis, Y, pseudotuberculosis; Campylobacter spp., incluindo (por exemplo toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli; Salmonella spp., incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp., incluindo H. pylori (por exemplo, urease, catalase, toxina vacuolante); Pseudomonas spp., incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo, toxina do tétano e seus derivados), C. botulinum (por exemplo, toxina botulinica e seus derivados), C. difficile (por exemplo, toxinas A ou B de clostridium e seus derivados); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulinica e seus derivados); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina diftérica e seus derivados) ; Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 67 ΡΕ2068918 andersonii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica Humana; Rickettsia spp., incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo, MOMP, proteinas de ligação à heparina), C. pneumoniae (por exemplo, MOMP, proteinas de ligação à heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as raras proteinas exteriores da membrana), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou outros patogénicos bacterianos.
Em algumas outras realizações preferidas, as formulações para vacina da presente invenção contêm um antigénio ou uma composição antigénica capaz de estimular uma reposta imune contra uma patógeno humano ou de outro mamifero, podendo o referido antigénio ou composição antigénica incluir uma composição derivada de um ou mais parasitas (ver, e.g., John, D.T. e Petri, W.A., Markell and Voge's Medicinal Parasitology, 9a Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis Parasitology for Veterinarians, 8o Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia), tais como Plasmodium spp., incluindo P.falciparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp, incluindo T. cruzi; Gardia spp., incluindo G. lamblia; Leishmania spp., incluindo L. major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. 68 ΡΕ2068918 vaginalis; ou de um helminta capaz de infectar um mamífero, tal como : (i) infecções por nemátodos (incluindo, mas não se limitando a, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis e Strongyloides stercoralis); (ii) infecções por tremátodos (incluindo, mas não se limitando a, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp., Fasciola hepática, Fasciola magna, Fasciola gigântica); e (iii) infecções por cestodos (incluindo, mas não se limitando a, Taenia saginata e Taenia solium). Algumas realizações podem, consequentemente, contemplar composições para vacina que incluem um antigénio derivado de Schisostoma spp., Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium e/ou Schistosoma japonicum, ou derivados de levedura, tal como Cândida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.
Outros antigénios preferidos específicos preferidos para M. tuberculosis são, por exemplo, Th Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCCl (WO 99/51748). As proteína para a M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e suas variantes, em que pelo menos dois, preferencialmente três polipéptidos de M. tuberculosis estão fundidos numa proteína maior. As fusões preferidas incluem Ral2-TbH9-Ra35, Erdl4-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erdl4DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erdl4-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI- 69 ΡΕ2068918 MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99151748).
Os antigénios mais preferidos para Chlamydia incluem, por exemplo, As Proteínas de Elevado Peso Molecular (HWMP) (WO 99/17741), 0RF3 (EP 366 412), e proteínas putativas da membrana (Pmps). Outros antigénios de Chlamydia para a formulação de vacina podem ser seleccionados do grupo descrito na WO 99128475). As vacinas bacterianas preferidas compreende antigénios derivados de Streptococcus Spp., incluindo S. pneumoniae (por exemplo, polissacarídeos da cápsula e seus conjugados, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de ligação a colina) e a proteína antigénica Pneumolisina (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et ai., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) e seus derivados mutantes desintoxicados (WO 90/06951; WO 99/03884). Outras vacina bacterianas preferidas incluem antigénios derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo, PRP e seus conjugados) , H. influenzae não tipificável, por exemplo, OMP26, adesinas com elevado peso molecular, P5, P6, Proteína D e lipoproteína D, fimbrina e péptidos derivados da fimbrina (U.S. Pat N°. 5 843 363) ou múltiplas variantes de cópia ou suas proteínas de fusão.
Os derivados do antigénio de superfície da Hepatite B são bem conhecidos na arte e incluem, inter alia, os antigénios PreSl e Pars2 estabelecidos nos Pedidos de Patente Europeia EP-A414 374; EP-A-0304 578 e EP 198474. Num aspecto preferido, A formulação para vacina da invenção 70 ΡΕ2068918 compreende o antigénio HIV-1, gpl20, especialmente quando expresso em células CHO. Noutra realização, a formulação para vacina da invenção compreende gD2t, como aqui acima definido.
Numa realização preferida da presente invenção, as vacinas contendo o adjuvante reivindicado, compreendem antigénio derivado do Virus do Papiloma Humano (HPV), considerado responsável pelas verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros) e as viroses por HPV responsáveis pelo cancro do colo do útero (HPV 16, HPV18 e outros). As formas particularmente preferidas de vacina profilática ou terapêutica para as verrugas genitais incluem partículas LI ou capsómeros e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antigénios seleccionados do HPV 6 e proteínas E6, E7, LI e L2 do HPV 11. Algumas formas preferidas de proteínas de fusão incluem L2E7, como revelado na WO 96/26277, e proteina D(l/3)-E7, revelada na GB 9717953,5 (PCT/EP98/05285). Uma composição preferida para vacina profilática ou terapêutica contra infecção ou cancro do colo do útero por HPV, pode incluir antigénios do HPV 16 ou 18Por exemplo, monómeros LI ou L2 de antigénio, ou antigénios LI ou L2 apresentados conjuntamente como uma partícula de tipo vírus (VLP), ou a proteína LI presente sozinha numa VLP ou estrutura capsomérica. Tais antigénios, partículas de tipo virus e capsómeros são conhecidos per se. Ver, por exemplo, W094/00152, WO94/20137, WO94/05792 e WO93/02184. 71 ΡΕ2068918
Adicionalmente, podem ser incluídas proteínas "early", sós ou como proteínas de fusão, tais como E7, E2 ou, preferencialmente, F5, por exemplo; as realizações particularmente preferidas incluem uma VLP compreendendo proteínas de fusão L1E7 (WO 96/11272). Os antigénios HPV 16 particularmente preferidos compreendem as proteínas "early" E6 ou F7 em fusão com uma proteína veículo D, para formar as fusões Proteína D-E6 ou E7 do HPV16, ou suas combinações; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96/26277). Alternativamente, as proteínas "early" E6 e E7 do HPV 16 ou 18 , podem estar presentes numa única molécula, preferencialmente, uma fusão Proteína D-E6/E7. Tal vacina pode opcionalmente conter uma ou ambas as proteínas E6 e E7 do HPV 18, preferencialmente na forma de fusão Proteína D-E6, Proteína D-E7 ou uma proteína de fusão Proteína D E6/E7. A vacina da presente invenção pode adicionalmente incluir antigénios de outras estirpes de HPV, preferencialmente das estirpes HPV 31 ou 33.
As vacinas da presente invenção podem ainda conter antigénios derivados de parasitas que causam a Malária. Por exemplo, os antigénios preferidos de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. A RTS é uma proteína híbrida contendo substancialmente toda a porção do terminal C da proteína circumporozoite (CS) do P. falciparum, ligava via quatro amino ácidos da porção preS2 do antigénio de superfície daHepatita B, ao antigénio de superfície (S) do vírus da hepatite B. A sua estrutura completa é revelada no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/EP92/02591, ΡΕ2068918 publicado como WO 93/10152, reivindicando prioridade a partir do pedido de patente UK N°. 9124390.7. Quando expresso em leveduras, a RTS é produzida como uma partícula de lipoproteína e quando é co-expressa com o antigénio S do HBV produz uma partícula mista conhecida como RTS,S.
Os antigénios TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/GB89/00895, publicado como WO 90/01496. Uma realização preferida da presente invenção é uma vacina contra a malária, em que a preparação antigénica compreende uma combinação dos antigénios RTS,S e TRAP. Outros antigénios de plasmódio que são prováveis candidatos a componentes de uma vacina multi-estádio contra a malária, são MSP1, AMAI, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum e os seus análogos em Plasmodium spp.
Assim, algumas das realizações aqui desvendadas contemplam um antigénio que é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso, tal com uma bactéria, um vírus ou um fungo, incluindo uma Actinobacteria, como M. tuberculosis ou M. Leprae ou outra micobactéria, uma bactéria, tal como um membro dos géneros Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia ou Bordetella; um vírus, como o vírus do herpes simplex, um vírus da imunodeficiência humana (HIV), um vírus da imunodeficiência felina (FIV), citomegalovirus, Virus da Varicella Zoster, virus da hepatite, Vírus de Hepstein Barr (EBV), Vírus sincitial respiratório, vírus do 73 ΡΕ2068918 papiloma humano (HPV e um citomegalovirus; HIV, tais como HIV-1 ou HIV-2; um fungo, como um Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides e Pneumocysti, ou uma levedura, incluindo espécies de Candida, como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. parapsilosis; um parasita, como um protozoário, um Plasmódium, incluindo P. falciparum, P. vivax, P. malar iae e P. ovale; ou outro parasita, tal como um ou mais de Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematoblum, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba díspar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia e Leishmania.
Por exemplo, nas realizações para vacina contendo GLA, contendo antigénios derivados de Borrelia spp., os antigénios podem incluir ácido nucleico, um antigénio derivado do patógeno ou preparações antigénicas, proteínas ou péptidos produzidos recombinantemente e proteínas de fusão quimérica. Um de tais antigénios é OspA. 0 OspA pode ser uma proteína totalmente madura numa forma lipidifiçada, em virtude da sua biosíntese numa célula hospedeira (lipo-OspA) ou, alternativamente, pode ser um derivado não lipodifiçado. Tais derivados não lipidifiçados incluem a proteína de fusão não lipidificada NSl-OspA, que possui os primeiros 81 amino ácidos N terminais da proteína não estrutural (NS!) do vírus da influenza, e a proteína OSPA completa, e outra, a MDP-OspA, uma forma não lipidificada - 74 - ΡΕ2068918 de OspA suportando três amino ácidos N-terminais adicionais. São conhecidas na arte composições e métodos para identificação de sujeitos possuindo, ou suspeitos de estarem em risco de vir a possuir, uma infecção com um patógeno infeccioso, como aqui descrito.
Por exemplo, casos de tuberculose pela bactéria Mycobacterium tuberculosis (TB). A bactéria ataca geralmente os pulmões, espinha e cérebro. Se não for correctamente tratada, a TB pode ser fatal. A doença passa de uma pessoa para a outra pelo ar, quando uma pessoa infectada tosse ou espirra. EM 2003, foram relatados mais de 14 000 casos de TB nos Estados Unidos.
Apesar de a tuberculose geralmente poder ser controlada, utilizando uma longa terapia com antibióticos, tal tratamento não é suficiente para evitar o alastramento da doença e existem preocupações em relação à selecção de potenciais antibiótico para estirpes resistentes. Os indivíduos infectados podem ser assintomáticos, mas contagiantes, duante algum tempo. Adicionalmente, apesar de ser crítico o cumprimento do regime de tratamento, o comportamento dos pacientes é difícil de monitorizar. Alguns pacientes não completam o calendário de tratamento, o que pode conduzir a uma ineficácia do tratamento e ao desenvolvimento de resistência aos fármacos (e.g., Patente U.S. 7 087 713). 75 ΡΕ2068918
Actualmente, a vacinação com bactérias viva é o método mais eficiente para induzir protecção imunitária contra a tuberculose. A micobactéria mais vulgarmente empregue para esta finalidade é o Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), uma estirpe não virulenta de Mycobacterium bovis.
Contudo, a segurança e eficácia do BCG é fonte de controvérsia e alguns países, como os Estados Unidos, não vacinam o público em geral. 0 diagnóstico é normalmente efectuado utilizando um teste cutâneo, que envolve a exposição intradérmica ao PPD (derivado Purificado de Proteína) de tuberculina. As respostas de células T especificas para o antigénio resultam em endurecimento, que pode ser medido, do local de injecção, 48-72 horas após a injecção, o que indica a exposição a antigénios da micobactéria. A sensibilidade e especificidade têm, contudo, sido um problema com este teste e indivíduos vacinados com BCG não são distinguíveis dos indivíduos infectados (e.g., Patente U.S. 7 087 713).
Apesar de ter sido demonstrado que os macrófagos actuam como principais obreiros da imunidade contra M. tuberculosis, as células T são os indutores predominantes de tal imunidade. O papel essencial das células T na protecção contra M. tuberculosis é ilustrado pela ocorrência frequente de M. tuberculosis em pacientes com SIDA, devido à deplecção de células T CD4, associadas com a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Tem-se demonstrado que as células T CD4, reactivas à Micobactéria são potentes produtores de interferão-gama 76 ΡΕ2068918 (IFN-gama), que, por sua vez, se demonstrou desencadear os efeitos anti-micobacterianos em murganhos. Apesar do papel do IFN-gama em seres humanos ser menos claro, estudos demonstraram que 1,25-dihidroxi-itamina D3, só ou combinação com o IFN-gama ou factor alfa de necrose tumural, activa os macrofagos humanos, para inibir a infecção por M. tuberculosis. Adicionalmente, sabe-se que o IFN-gama estimula os macrofagos humanos para produzirem 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De igual modo, tem sido demonstrado que a IL-12 tem um papel no estimulo da resistência à infecção por M. tuberculosis. Para uma revisão da imunologia da infecção por M. tuberculosis, ver Chan e Kaufmann, em Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Pres, Washington, D.C. (1994).
Os compostos e métodos existentes para o diagnóstico de tuberculose ou para indução de imunidade preventiva contra a tuberculose, incluem a utilização de polipéptidos que contêm pelo menos uma porção imunogénica de uma ou mais proteinas da micobactéria e moléculas de DNA codificando tais polipéptidos. Podem ser utilizados "kits" de diagnóstico contendo tais polipéptidos ou sequências de DNA, num reagente de detecção adequado, para detecção da infecção por Micobácterium em pacientes e amostras biológicas. São também proporconados anticorpos dirigidos contra tais polipéptidos. Adicionalmente, tais compostos podem ser formulados em vacinas e/ou composições farmacêuticas para imunização contra infecções por 77 ΡΕ2068918
Mycobacterium (Patentes U.S. N°s. 6 949 246 e 6 555 653) . A malária foi eliminada em muitas partes do mundo nos anos 1960, mas a doença ainda persiste e estão a emergir novas estirpes da doença, resistentes aos fármacos existentes. A malária é um dos principais problemas de saúde pública em mais de 90 paises. Nove em cada dez casos de malária ocorrem na África sub-Sahariana. Mais de um terço da população mundial está em risco e entre 350 a 500 milhões de pessoas são infectadas com malária todos os anos. Quarenta e cinco milhões de mulheres grávidas estão em risco de contrair malária neste ano. De entre os indivíduos já contaminados, mais de um milhão morrem em cada ano, devido ao que é uma doença evitável. A maioria dessas mortes são crianças, em África. A malária é geralmente transmitida quandouma pessoa é picada por uma fêmea infectada de mosquito Anopheles. Para a transmitir, o mosquito teve de ser infectado por ter retirado sangue de outra pessoa já infectada com malária. A malária é causada por um parasita e os sintomas clinicos incluem febre e sintomas semelhantes ao da gripe, tais como calafrios, dor de cabeça, dores musculares e cansaço. Estes sintomas podem ser acompanhados por náusea, vómito e diarreia. A malária também pode provocar anemia e icterícia, devido à perda de glóbulos vermelhos. A infecção com um tipo de malária, Plasmodium falciparum, se não for rapidamente tratada, pode provocar falha renal, apoplexia, confusão mental, coma e morte. 78 ΡΕ2068918 É conhecido um método de diagnóstico in vitro para a malária num indivíduo, compreendendo a colocação de um tecido ou fluido biológico retirado do indivíduo, em contacto com uma molécula de composição polipeptídica, em que a referida molécula ou composição polipeptídica compreende uma ou mais sequências peptidicas portando toda, ou parte, de um ou mais epitopos T das proteínas resultantes da actividade infecciosa por P. falciparum, sob condições que permitam que ocorra uma reacção imunológica in vitro, entre a referida composição e os anticorpos que podem estar presentes no tecido ou no fluido biológico, e a detecção in vitro dos complexos antigénio-anticorpo formados (ver, e.g., Patente U.S. 7 087 231).
Foi descrita a expressão e purificação de um ectodominio AMA-1 recombinante de Plasmodium falciparum (3D7) . Os métodos anteriores produziram uma proteína altamente purificada que retém a dobragem e a ligação dissulfito da molécula nativa. A AMA-1 recombinante é útil como reagente de diagnóstico, assim como para a produção de anticorpos e como proteína para utilização só ou como parte e uma vacina para prevenção da malária (Patente U.S. 7 029 685) . Têm sido descritos na arte polinucleótidos que codificam antigénios peptídicos maláricos específicos para a espécie P. vivax, que são proteínas ou fragmentos de proteínas secretadas para o plasma de um mamífero hospedeiro susceptível, após a infecção, como foram 79 ΡΕ2068918 descritos anticorpos monoclonais ou policlonais, dirigidos contra esses antigénios. Os antigénios peptidicos, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos policlonais, são utilizados em ensaios para o diagnóstico de malária, assim como para determinar se o Plasmodium vivax é a espécie responsável pela infecção (Patente U.S. 6 706 872). Também têm sido descritos antigénios peptidicos maláricos específicos para a espécie P. vivax que são proteínas ou fragmentos de proteínas secretadas para o plasma de um mamífero hospedeiro susceptível, após a infecção, como foram descritos anticorpos monoclonais ou policlonais, dirigidos contra esses antigénios. Os antigénios peptidicos, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos policlonais, são utilizados em ensaios para o diagnóstico de malária, assim como para determinar se o Plasmodium vivax é a espécie responsável pela infecção (Patente U.S. 6 706 872).
Também foi expresso, por um processo que produz uma proteína altamente purificada que retém a dobragem e a ligação dissulfito da molécula nativa, um ectodomínio AMA-1 recombinante de Plasmodium falciparum (3D7). A AMA-1 recombinante é útil como reagente de diagnóstico, para a produção de anticorpos e como vacina (Patente U.S. 7 060 27 6) . São igualmente conhecidas a expressão e purificação de MSP-I42 recombinante de Plasmodium falciparum (3D7), retendo a dobragem e a ligação dissulfito da molécula nativa. O MSP-I42 recombinante é útil como reagente de diagnóstico, para a produção de anticorpos e como vacina 80 ΡΕ2068918 (Patente U.S. 6 855 322).
Os métodos de diagnóstico para a detecção de infecções humanas de malária, para identificar um sujeito tendo ou suspeito de estar em risco de ter uma infecção com um patógeno infeccioso da malária, são, consequentemente conhecidos, de acordo com estas, e discutidas, revelações. Especificamente, por exemplo, combinam-se amostras de sangue com um reagente contendo 3-acetil piridina adenina dinucleótido (APAD), um susbtrato (e.g., sal lactato ou
ácido láctico) e um tampão. Este reagente é designado para detectar a presença de uma única enzima glicolitica produzida pelo parasita da malária. Esta enzima é conhecida como ácido láctico desidrogenase parasita (PLDH). A PLDH é facilmente distinguível da LHD do hospedeiro, utilizando a reagente acima descrito. A combinação do reagente com uma amostra de sangue parasitado, resulta na redução da APAD. Contudo, não é reduzida pela LDH do hospedeiro. A APAD reduzida pode então ser detectada por diversas técnicas, incluindo análises espectrais, fluorimétricas, electroforéticas ou colorimétricas. A detecção da APAD reduzida por uma das formas acima, proporciona uma indicação positiva de infecção malárica (e.g., Patente U.S. 5 124 141). Noutra metodologia para o diagnóstico de malária, um polipeptídeo compreendendo uma sequencia de amino ácidos característica derivada do antigénio GLURP de Plasmodium falciparum, é reconhecida numa amostra de teste por um antigénio específico criado contra, ou reactivo com o polipéptido. (Patente U.S. 5 231 168). 81 ΡΕ2068918 A leishmaniose é uma doença parasitica muito disseminada, com epidemias frequentes no subcontinente Indiano, África e América Latina e constitui uma prioridade da Organização Mundial de Saúde para o desenvolvimento de uma vacina. Sendo um complexo de diferentes doenças, o parasita Leishmania provoca infecções fatais em orgãos internos, assim como uma grave doença cutânea. Uma das mais devastantes formas de leishmaniose é uma infecção desfigurante do nariz e boca. 0 número de casos de leishmaniose está a aumentar e actualmente está fora de controlo em muitas áreas. A leishmaniose está também a causar preocupações em alguns paises desenvolvidos, especificamente na Europa do Sul, como resultado da infecção por HIV. Os fármacos disponíveis são tóxicos, caros e requerem tratamentos longos com injecções diárias. A Leishmania é um protozoário parasita que se instala nos macrófagos ou nos glóbulos brancos do sistema imune. Os parasitas são transmitidos pela picada de pequenos insectos sugadores de sangue (mosca da areia), que são difíceis de controlar, dado que habitam em vastas áreas do planeta. A Leishmaniose visceral é a mais perigosa das três manifestações da doença. Estima-se que ocorram cada ano cerca de 500 000 novos casos de forma visceral (kala-azar ou "a doença assassina") . Mais de 200 milhões de pessoas estão actualmente em risco de contrair leishmaniose visceral. Mais de 90 por cento dos casos de leishmaniose 82 ΡΕ2068918 visceral ocorrem na índia, Bangladesh, Sudão, Brasil e Nepal. A maioria das mortes ocorre em crianças. As que sofrem com a forma cutânea, ficam, frequentemente, permanentemente desfiguradas.
As infecções por Leishmania são dificeis de diagnosticar e tipicamente envolvem a análise histopatológica de amostras tecidulares obtidas por biópsia. Foram, contudo, desenvolvidos diversos ensaios de diagnóstico serológico e imunológico (Patente U.S. 7 008 774; Senaldi et al. (1996), J. Immunol. Methods, 193:9, 5;
Zijlstra et al. (1997), Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 91:671 673; Badaro et al. (1996), J. Inf. Dis., 173: 758 7 61; Choudary, S. et al. (1992), J. Comm. Dis., 24:32 36; Badaro, R. et al. (1986), Am. J. Trop. Med. Hyg., 35:72 78;
Choudhary, A. et al. (1990), Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 84:363 366; e Reed, S.G. et al. (1990), Am. J. Trop.
Med. Hyg., 43:632 639). Os promastigotos libertam produtos metabólicos para o meio de cultura, produzindo um meio condicionado. Estes produtos metabólicos são imunogénicos para o o hospedeiro. Ver Schnur, L.F., et al. (1972) Isrl. J. Med. Sei., 8:932 942; Sergeiev, V.P. et al. (1969) Med. Parasitol., 38:208 212; El-On, J. et al. (1979), Exper.
Parasitol., 47:254 269; e Bray, R.S. et al (1966), Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 60: 605 609; Patente U.S. 6 846 648; Patente U.S. 5 912 166; Patente U.S. 5 719 263;
Patente U.S. 5 411 865).
Cerca de 40 milhões de pessoas em todo o mundo 83 ΡΕ2068918 estão infectadas com HIV, o vírus que provoca SIDA. Cerca de 3 milhões de pessoas morrem, por ano, desda doença, 95 por cento das quais em países em vias de desenvolvimento. Em cada ano, perto de 5 milhões de pessoas são infectadas com HIV. Actualmente, a África sub-sahariana suporta o fardo maior da doença, mas está a alastrar rapidamente a outros países, como a índia, China e Rússia. A epidemia alastra com mais rapidez entre populações minoritárias. Nos Estados Unidos existem mais de 950 000 casos relatados desde 1981. A SIDA atinge as pessoas durante os seus anos mais produtivos. As mulheres, por razões biológicas e sociais, têm um risco aumentado de contrair HIV/SIDA. A SIDA e provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), que destrói e lesiona célulsas do sistema imune do corpo e progressivamente destrói a capacidade de o organismo combater infecções e alguns cancros. O HIV é mais vulgarmente transmitido pela prática de sexo sem protecção, com um parceiro infectado. A solução mais robusta para o problema consiste em evitar a propagação do vírus. Fabricar uma vacina contra o HIV que seja segura, eficaz e económica é uma das formas de atingir este objectivo. Em todo o mundo, menos de uma pesoa em cada cinco em risco elevado de contrair uma infecção por HIV, tem acesso a prevenção eficaz. São conhecidos métodos para diagnóstico de infecções por HIV, incluindo por cultura de vírus, PCR de sequências definidas de ácido nucleico em amostras do 84 ΡΕ2068918 paciente e testes de anticorpos para a presença de anticorpos anti-HIV, no soro dos pacientes (ver, e.g., as Patentes U.S. N°s. 6 979 535, 6 544 728, 6 316 183, 6 261 762, 4 743 540).
De acordo com outras realizações, como aqui revelado, as composições para vacina e formulações e métodos de utilização relacionados, podem incluir um antigénio que é derivado de uma célula cancerora, dado que pode ser útil para o tratamento imunoterápico de cancros. Por exemplo, a formulação adjuvante pode ter utilidade com antigénios de rejeição do tumor, como os paraos cancros da próstata, mama, colorectal, pulmão, pâncreas, renal ou melanoma. Exemplos de antigénios derivados de cancros ou de células cancerosas, incluem MAGE 1, 3 e MAGE 4 ou outros antigénios MAGE, tais como os descritos na WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (também conhecido como NY Eos 1), SAGE e HAGE (WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology, 8, pps. 68-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinicai & Laboratory Research (1997 e 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Câncer Institute, 89, p. 293. Estes exemplos não limitantes de antigénios de cancro são expressos numa grande variedade de tipos de tumores, tais como melanoma, carcinoma do pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga. Ver, e.g., Patente U.S: N°. 6 544 518.
Outros antigénios específicos de tumores são adequados para utilização com GLA, de acordo com as 85 ΡΕ2068918 realizações presentemente reveladas e incluem, mas não se restringem a gangliósidos específicos de tomores ou associados a tumores, tais como GM2 e gm3 ou os seus conjugados com proteínas de transporte; ou um antigénio para utilização numa composição para vacina com GLA, para estimular ou melhorar uma resposta imune anti-cancerosa, pode ser um péptido hormonal do próprio, como o comprimento total da hormona libertadora da hormona gonadotropina (GnRH, WO 95/20600), uma curto péptido com 10 amino ácidos de comprimento, útil no tratamento de muitos cancros. Noutra realização, são utilizados antigénios da próstata, como o antigénio especifico da próstata (PSA), PAP, PSCA (e.g., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 95(4), 1735-1740, 1998), PSMA ou, numa realização preferida, um antigénio conhecido como Prostase (e.g., Nelson et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, (1999), 96: 3114-3119; Ferguson et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1999, 96, 3114-3119; WO 98/12302; Pat. U.S. N°. 5 955 306; WO 98/20117; Pat. U.S. N°s. 5 840871 e 5 786 148; WO 00/04149. Outros antigénios específicos da próstata são conhecidos a partir das WO 98/137418 e WO/004149. Outro é a STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-2, 1999).
Outros antigénios associados a tumores, úteis no contexto da presente invenção, incluem: Plu-1 (J. Biol. Chem., 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al., Bioessays, 199, 21:61-70, Pat. U.S. N°. 5 654 140) e Criptina (Pat. U.S. N°. 5 981 215). Adicionalmente, antigénios particularmente relevantes para vacina, na terapia do cancro, também incluem tirosinase e 86 ΡΕ2068918 survivina.
Os aqui reveladas realizações relacionadas com composições para vacina contendo GLA, compreendendo um antigénio do cancro, serão úteis contra qualquer cancro caracterizado pela expressão de um antigénio associado ao tumor, tal como expressão HER-2/neu ou outrosa antigénios específicos do cancro ou associados ao cancro. 0 diagnóstico de cancro num sujeito possuindo, ou suspeito de estar em risco de possuir cancro, pode ser conseguidopor qualquer uma de uma grande variedade de metodologias aceites na arte, que pode variar, dependendo de uma variedade de factores incluindo apresentação clínica, grau de progressão do cancro, tipo de cancro e outros factores. Exemplos de diagnósticos de cancro incluem exame histopatológico, histocitoquímico, imunohistocito-químico e imunohistopatológico de amostras do paciente (e.g., sangue, pele, biópsia, biópsia de outros tecidos, exemplar cirúrgico, etc), testes de PCR para marcadores (e.g., ácido nucleico) genéticos específicos, os testes serológicos para antigénios circulantes associados ao cancro ou células portando tais antigénios, ou para anticorpos de especificidade definida, ou outras metodologias com as quais os técnicos da matéria estão familiarizados. Ver, e.g., Patentes U.S. N°s. 6 734 172; 6 770 445; 6 893 820; 6 979 730; 7 060 802; 7 030 232; 6 933 123; 6 682 901; 6 587 792; 6 512 102; 7 078 180; 7 070 931; JP5-328975; Waslylyk et al., 1993, Eur. J. Bioch., 87 ΡΕ2068918 211 (7) :18.
As composições e métodos para vacina de acordo com algumas realizações da presente invenção, também podem ser utilizadas para a profilaxia ou terapia de doenças autoimunes, o que inclui doenças, condições ou distúrbios em que o sitema imune do hospedeiro ou sujeito media respostas imunes dirigidas contra "os próprios" tecidos, células, biomoléculas (e.g., péptidos, polipéptidos, proteínas, glicoproteinas, lipoproteinas, proteolipidos, lipidos, glicolipidos, ácidos nucleicos, tais como RNA e DNA, oligossacarideos, polissacarideos, proteoglicanos, gi icosaminoglicanos ou outros do mesmo tipo, e outros componentes moleculares das células e tecidos do sujeito) ou epitopos (e.g., estruturas de reconhecimento definidas, imunologicamente especificas, tais como as reconhecidas por uma região determinate de complementaridade de uma região variável, num anticorpo (SDR) ou por um receptor CDR de uma célula T.
As doenças autoimunes são, assim, caacterizadas por uma resposta imune anormal, envolvendo células ou anticorpos, que são, em qualquer um dos casos, dirigidos contra tecidos autólogos normais. As doenças autoimunes em mamíferos podem geralmente ser classificadas numa de duas categorias diferentes; as doenças mediadas por células (i.e., células T) ou distúrbios mediados por anticorpos. Exemplos não limitantes de doenças autoimunes mediadas por células, incluem esclerose múltipla, artrite reumatóide, ΡΕ2068918 tiroidite de Hashimoto, diabetes de tipo I (surgimento de diabetes juvenil) e uvoretinite autoimune. Os distúrbios autoimunes mediados por anticorpos incluem, mas não se limitam a, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico (ou SLE), doença de Graves, anemia hemolitica autoimune, trombocitopenia autoimune, asma autoimune, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trômbica, esclerose biliar primária e anemia perniciosa. 0 antigénio associado com: lupus eritematoso sistémico, são pequenas proteínas do ácido ribonucleico nuclear (snRNP); na doença de Graves é o receptor tirotropina, tiroglobulina e outros componentes de células do epitélio da tiróide (Akamizu et ai., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997 e
Texier et al., 1992); no pênfigo, são antigénios do pênfigo, tipo cadherina, tais como desmoglein 3 e outras moléculas de adesão (Memar et al., 1996; Stanley, 1995; Plott et al., 1994 e Hashimoto, 1993); e na púrpura trombocitopénica trômbica, são antigénios de plaquetas (ver, e.g., Patente U.S. 6 929 796; Gorski et al. (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch e Lipsky, P.E. (Eds.), Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflamation (Curr. Top. Microbiol. And Immunol.), 2001, Springer, NY). A autoimunidade tem um papel em mais de 80 doenças diferentes, incluindo diabetes tipo I, esclerose múltipla, Lupos, artrite reumatóide, escleroderma e doenças da tiroide. Faltam estimativas quantitativas fiáveis para a morbilidade nas doenças autoimunes. Os estudos mais 89 ΡΕ2068918 recentes, efectuados nos últimos anos da década de 90, revelam que as doenças autoimunes são a terceira principal doença mais comum nos Estados Unidos; e as doenças autoimunes mais comuns afectam mais de 8,5 milhões de Americanos. As estimativas actuais sobre a prevalência da doença, situam-se entre 5 a 8 por cento da população dos Estados Unidos. A maior parte das doenças autoimunes afecta, de forma desproporcionada, mulheres. As mulheres têm uma probabilidade 2,7 vezes superior aos homens de contrair uma doença autoimune. As mulheres são mais susceptiveis às doenças autoimunes; os homens parecem possuir niveis mais elevados de actividade de células "assassinas" naturais, do que as mulheres (Jacobsen et al., Clinicai Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997).
As doenças autoimunes ocorrem quando o sistema imune confunde os próprios tecidos com outros estranhos e monta um ataque nao apropriado. O corpo pode se afectado de diferentes formas por uma doença autoimune, incluindo, por exemplo, os intestino (doença de Crohn) e o cérebro (esclerose múltipla). Sabe-se que autoanticorpo ataca autocélulas ou autotecidos para impedir a sua função e, como resultado, provoca doenças autoimunes, e que o autoanticorpo pode ser detectado no soro do paciente, antes da verdadeira ocorrência de uma doença autoimune (e.g., aparecimento de sinais e sintomas clínicos). A detecção de um autoanticorpo permite, por isso, a descoberta ou o reconhecimento precoce, ou risco, de desenvolvimento de uma doença autoimune. Com base nestes dados, foi descoberta uma 90 ΡΕ2068918 variedade de autoanticorpos contra autoantigénios e os autoanticorpos contra autoantigénios foram medidos em testes clinicos (e.g., Patentes U.S. 6 919 210, 6 596 501, 7 012 134, 6 919 078), enquanto outros diagnósticos autoimunes podem envolver a detecção de metabolitos relevantes (e.g., Pat. U.S. N°. 4 659 659) ou reactividade imunológica (e.g., Pat. U.S. N°s. 4 614 722 e 5 147 785, 4 420 558, 5 298 396, 5 162 990, 4 420 461, 4 595 654, 5 846 758, 6 660 487) .
Em algumas realizações, as composições da invenção serão particularmente aplicáveis no tratamento de um idoso ou de um imunodeprimido, incluindo sujeitos em diálise renal, sujeitos em quimioterapia e/ou terapia com radiações, receptores de transplantes e outros do mesmo tipo. Tais indivíduos, geralmente, exibem uma respostaimune diminuída às vacinas e consequentemente, a utilização das composições da invenção pode melhorar as respostas imunes conseguidas nesses sujeitos.
Noutra realização, o antigénio ou antigénios utilizados nas composições da invenção, incluem antigénio associados com doenças respiratórias, tais como as causadas ou exacerbadas por infecção bacteriana (e.g., por pneumococos), para a profilaxia e terapia de condições como a doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD). A COPD é definida fisiológicamente pela presença de obstrução irreversível ou parcialmente reversível, das vias respiratórias, em pacientes com bronquite crónica e/ou 91 ΡΕ2068918 enfisema (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, Nov.;152(5 Pt 2):S77-121). A exacerbação da COPD é frequentemente causada por infecção bacteriana (e.g., pneumocócica) (Clin. Microbiol. Rev., 2001, Abr.;14(2):336-63).
TLR
Tal como aqui descrito, algumas realizações da presente invenção comtemplam composições para vacina e composições imunologicamente adjuvantes, incluindo composições farmacêuticas que incluem um ou mais agonistas do receptor tipo "toll" (agonista TLR) . Os receptores tipo "toll" (TLR) incluem receptores transmembranares de superfície das células do sistema imune inato, que conferem capacidade de reconhecimento precoce da células hospedeiras, para uma variedade de estruturas moleculares microbianas conservadas, como as que podem estar presentes em ou sobre um grande número de patógenos infecciosos (e.g., Armand et al., 2 0 02, Genome Biol., 3(8): revisões3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996, Science, 272:50; Medzhitov et al., 1997, Curr. Opin. Immunol., 9:4; Luster, 2002, Curr. Opin. Immunol., 14:129; Lien et al., 2003, Nat. Immunol., 3:1162; Medzhitov, 2001, Nat. Rev. Immunol., 1:135; Takeda et al., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21:335; Takeda et al., 2005, Int. Immunol., 17:1; Kaisho et al., 2004, Microbes Infect., 6:1388; Datta et al., 2003, J. Immunol., 170:4102). A indução da transducção do sinal, mediada por 92 ΡΕ2068918 TLR, para potenciar o início de respostas imunes via o sistema imune inato, pode ser afectado por agonistas TLR, que competem com os TLR da superfície celular. Por exemplo, o lipopolisacarídeo (LPS) pode ser um agonista TLR2 ou TLR4 (Tsan et al., 2004, Am. J. Physiol. Cell Phsiol., 286:C739; Lin et al., 2005, Shock, 24:206); a poli(inosina-citidina) (Polyl:C), pode ser um agonista TLR3 (Salem et al., 2006,
Vaccine, 24:5119): as sequências CpG (oligodesoxinucleótidos contendo motivos dinucleotídicos citisina-guanosina ou "CpG", não metilados, e.g., CpG 7909, Cooper et al., 2005, AIDS, 19:1473; CpGlOlOl, Bayer et al., Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27:193; Vollmer et al., Expert Opinion on Biological Therapy, 5:673; Vollmer et al., 2004, Antimicrob. Agents Chemother., 48:2314; Deng et al., 2004, J. Immunol., 173:5148), pode ser um agonista TLR9 (Andaloussi et al., 2006, Glia, 54:526; Chen et al., 2006, J. Immunol., 177:2373); os peptidoglicanos podem ser agonistas TLR2 e/ou TLR6 (Soboll et al., 2006, Biol. Reprod., 75:131; Nakao et al., 2005, J. Immunol., 174:1566); 3M003 (hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)-a,a- dimetil-6,7,8,9-tetrahidro-lH-imidazo-[4,5-c]quinoline-1-etanol, peso mol. 318 Da, de 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, é também a origem dos compostos relacionados 3M001 e 3M002; Gorden et al., 2005, J. Immunol., 174:1259), pode ser um agonista TLR7 (Johansen, 2005, Clin. Exp. Allerg., 35:1591) e/ou um agonista TLR8 (Johansen, 2005); a flagelina pode ser um agonista TLR5 (Feuillet et al., 2006, Proc. Nat. Aca. Sei. USA, 103:12487) e os antigénios da hepatite C, antagonistas TLR7 e/ou TLR9 (Lee et al., 2006, 93 ΡΕ2068918
Proc. Nat. Aca. Sei. USA, 103:1828; Horsmans et al., 2005, Hepatol., 42:724). São conhecidos outros agonistas TLR (e.g., Schirmbeck et al., 2003, J. Immunol., 171:5198) e podem ser utilizados de acordo com algumas das realizações aqui descritas.
Por exemplo, e a titulo de antecedentes (ver, e.g., a U.S. Patent 6 544 518), são conhecidos oligonucleótidos imunoestimulatórios contendo dinucleótidos CpG ("CpG") não metilados, como sendo adjuvantes quando administrados tanto pela via sistémica como mucosa (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol., 1998, 160(2):870-876; McCluskie e Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG é a abreviatura para o motivo dinucleótidico citosina-guanosina, presente no DNA. O papel central do motivo CG em imunoestimulação foi elucidado por Krieg, Nature, 374, p546, 1995. A análise detalhada mostra que o motivo cG tem de estar num certo contexto sequencial, e que tais sequências são vulgares no DNA bacteriano, mas raras no DNA dos vertebrados. A sequência imunoestimulatória é, frequentemente: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; em que o motivo dinucleótidico CG não está metilado, mas são conhecidas como imunoestimulatórias outras sequências CpG não metiladas e que podem ser utilizadas em caertas realizações da presente invenção. A CpG, quando formulada em vacinas, pode ser administrada em solução livre, conjuntamente com o antigénio livre (WO 96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou covalentemente conjugada com um antigénio (Publicação PCT 94 ΡΕ2068918 Ν°. WO 98/16247), ou formulada com um veículo, como o hidróxido de alumínio (e.g., Davis et al., supra, Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95(26), 15553-8).
Os oligonucleótidos preferidos para utilização em adjuvantes ou vacinas da presente invenção, contêm preferencialmente, dois ou mais motivos dinucleotídicos CpG, separados por pelo menos três, mais preferencialmente, seis ou mais, nucleótidos. Numa realização preferida, o internucleótido no oligonucleótido é fosforoditioato ou, mais preferencialmente, uma ligação fosforotioato, apesar de estarem englobadas no âmbito da invenção ligações fosfodiester e outras ligações internucleotídicas, incluindo oligonucleótidos com ligações internucleotídicas mistas. Os métodos para produção de oligonucleótidos com ligações fosforotioato ou fosforoditioato são descritos nas Pat. U.S. N°s. 5 666 153, 5 278 302 e WO95/26204.
Exemplos de oligonucleótidos preferidos têm sequências que são reveladas nas publicações que se seguem; para algumas realizações aqui reveladas, as sequências contêm, preferencialmente, ligações internucleotídicas modificadas, fosforotioato: CPG 7909: Cooper et al., "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HlV-infected adults", AIDS, 2005,
Set., 23,-19(14) :1473-9. 95 ΡΕ2068918
CpG 10101: Bayes et al., "Gateways to clinicai trials", Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol., 2005, Abr.; 27 (3) :193-219.
Vollmer, J., "Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9". Expert Opinion on Biological Therapy, 2055, Maio; 5 (5) : 673-682.
Oligonucleótidos CpG alternativos podem incluir variantes das sequências preferidas descritas nas acima referidas publicações, que podem diferir por possuirem substituições na sequência nucleotidica, inserções, remoções e/ou outras adições inconsequentes. Os oligonucleótidos CpG utilizados em algumas realizações da presente invenção, podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na arte (e.g., EP 468520). Tais oligonucleótidos podem, convenientemente, ser sintetizados utilizando um sintetizador automático. Os oligonucleótidos são, tipicamente, desoxinucleótidos. Numa realização preferida, a ligação internucvleótidica no oligonucleótido é fosforoditioato ou, mais preferencialmente, uma ligação fosforotioato, apesar de os fosfodiesteres se encontrarem também no âmbito das realizações presentemente contempladas. Os oligonucleótidos contendo diferentes ligações internucleótidos, também são contemplados, e.g., mistos de fosforotioatos e fosfodiesteres. Também podem ser utilizadas outras ligações internucleótidos que estabilizem o oligonucleótido. ΡΕ2068918 96
Co-Adjuvantes
Algumas realizações, como aqui proporcionado, incluem composições para vacinas e composições imunologicamente adjuvantes, incluindo composições farmacêuticas que contêm, além do GLA, pelo menos um coadjuvante, que se refere a um componente de tais composições possuindo uma actividade adjuvante, mas que é outro, além do GLA. Um co-adjuvante possuindo tal actividade adjuvante inclui uma composição que, quando administrada a um sujeito, como um ser humano (e.g., um paciente humano), um primata não humano, um mamífero ou outro organismo eucariótico superior, possuindo um sistema imune reconhecido, é capaz de alterar (i.e., aumentar ou diminuir, de forma estatisticamente significativa, e em algumas realizações preferidas, melhorar ou aumentar) a potência e/ou a longevidade da resposta imune, (ver, e.g., Powell e Newman, "Vacine Design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, Nova Iorque). Em algumas realizações aqui reveladas, o GLA e um antigénio desejado, e opcionalmente, um moi mais co-adjuvantes, podem alterar, e.g., auxiliar ou melhorar uma resposta imune dirigida contra o antigénio desejado, que pode ser administrado ao mesmo tempo que o GLA ou pode, na sua administração, ser separado no tempo e/ou espaço (e.g. num local anatómico deferente), mas não se pretende que algumas realizações da invenção sejam assim limitadas e, assim, também é contemplada a administração do GLA numa composição que não inclui um antigénio específico, mas que pode também incluir 97 ΡΕ2068918 um ou mais entre um agonista TLR, um co-adjuvante, um modificador da resposta imune imidazoquinolina e um "double stem loop immune modifier" (dSLIM).
Assim, e como notado acima, os co-adjuvantes incluem outras composições, além do GLA, que possuem efeitos adjuvantes, tais como saponinas e miméticos da saponina, incluindo QS21 e miméticos do QS21 (ver, e.g., Pat. U.S. N°. 5 057 540; EP 0 362 279 Bl; WO 95/17210), alum, alcaloides de plantas, como a tomatina, detergentes, tais como (mas não limitados a) saponina, polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina, uma ou mais citoquinas (e.g., GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama) um modificador da resposta imune imidazoquinolina e um "double stem loop immune modifier" (dSLIM, e.g., Weeratna et al., 2005, Vaccine, 23:5263).
Os detergentes, incluindo saponinas, são indicadas em, e.g., Patente U.S. 6 544 518; Lacaille-Dubois, M. e Wagner, H. (1996, Phytomedicine, 2:363-386),
Pat. U.S. Ν' 3. 5 057 540, Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst ., 1996, 12(1-2):1-55 e EP 0 362 279 Bl. As estruturas particuladas, chamados Complexos de Imuno Estimulação (ISCOMS), compreendendo fracções de Quil A (saponina), são hemoliticas e têm sido utilizadas na manufactura de vacinas (Morein, B., EP 0 109 942 Bl). Estas estruturas têm sido relatadas como possuindo actividade adjuvante (EP 0 109 942 Bl; WO 96/11711). As saponinas hemoliticas QS21 e QS17 (fracções de Quil A purificadas por ΡΕ2068918 HPLC)têm sido descritas como potentes adjuvantes sistémicos, e o método da sua produção é revelado na Pat. U.S. N° 5 057 540 e EP 0 362 279 BI. Também descrita nestas referências é a utilização de QS7 (uma fracção não hemolitica de Quil-A), que actua como um potente adjuvante para vacinas sistémicas. A utilização de Quil-A é também descrita em Kensil et al. (1991, J. Immunology, 146:431-437) . Combinações de QS21 e polisorbato ou ciclodextrina, também são conhecidas (WO 99/10008). Sistemas particulados de adjuvantes, compreendendo fracções de QuilA, como QS21 e QS7, são descritos na WO 96/33739 e na WO 96/11711. Outras saponinas que foram utilizadas em estudos de vacinação sistémica incluem os derivados de outras espécies de plantas, tais como Gypsophila e Saponaria (Bomford et ai., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). A escina é outro detergente relacionado com as saponinas, para utilização nos composições adjuvantes das realizações aqui reveladas. A escina é descrita no Merck index (12a Ed.; entrada 3737), como uma mistura de saponina, ocorrendo nas sementes de castanheiro da india, Aesculus hippocastanum. O seu isolamento é descrito por cromatografia e purificação (fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953) ) e por resinas de troca iónica (Erbring et ai., Pat. U.S. N°. 3 238 190). Foram purificadas fracções de escina (também conhecida como aescina) que se demonstrou serem biologicamente activas (Yoshikawa, M. et al., (Chem. Pharm. Buli. (Toquio), 1996, Agosto; 44(8): 1454-1464)). A digitonina é outro detergente, também descrita no Merck 99 PE2068918 index (12a ed., entrada 3204) como uma saponina, derivada das sementes de Digitalis purpurea, e purificada de acordo com o procedimento descrito por Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoe., 1934, 23, 664 e Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621.
Outros co-adjuvantes para utilização de acordo com algumas das realizações aqui descritas, incluem um copolimero em blocos, que se refere a uma classe de compostos poliméricos com que os técnicos da matéria estarão familiarizados. Exemplos de um copolimero em blocos ou um polimero biodegradável que pode ser incluido numa composição para vacina com GLA ou num adjuvante imunológico com GLA, incluem Pluronic® L121 (BASF Corp., Mount Olive, NJ; ver, e.g., Yeh et al., 1996, Pharm. Res., 13:1693; Patente U.S. N° 5 565 209), CRL1005 (e.g., Triozzi et al., 1997, Clin. Canc. Res., 3:2355), poli(láctico-CO-ácido glicólico) (PLGA), poli(ácido láctico) (PLA), poli-(D,L-lactico-co-glicolido) (PLG) e polyl:C (ver, e.g., Powell e Newman, "Vacine Design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, Nova Iorque).
Algumas realizações contemplam vacinas com GLA e adjuvantes imunológicos com GLA, que incluem um óleo, que, em algumas de tais realizações, podem contribuir para a actividade co-adjuvante e, em outras de tais realizações, podem adicionalmente proporcionar um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. É conhecido um grande número de óleos adequados que podem ser seleccionados para 100 ΡΕ2068918 inclusão nas composições para vacina e composições adjuvantes imunológicas baseadas na presente descrição. Exemplos de tais óleos, a título de ilustração e não de limitação, incluem esqualeno, esqualano, óleo mineral, óleo de oliva, colesterol e um monooleato de manido.
Também são conhecidos na arte modificadores da resposta imune, tal como o modificador de resposta imune imidazoquinolina, e podem ser incluídos como co-adjuvantes em algumas das realizações aqui reveladas. Alguns modificadores de resposta imune imidazoquinolina preferidos incluem, a título de exemplo não limitante, resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod (Hemmi et al., 2002, Nat. Immunol., 3:196; Gibson et al., 2002, Cell. Immunol., 218:74; Gordon et al., 2005, J. Immunol., 174:1259); estes e outros modificadores de resposta imune imidazoquinolina podem, sob condições apropriadas, ter também actividade agonista TLR, como aqui descrito. Outros modificadores da resposta imune são os "double stem loop immune modifiers" à base de ácidos nucléicos (dSLIM). Exemplos específicos de dSLIM que são contemplados para utilização em algumas das presentemente reveladas realizações, podem ser encontrados em Schmidt et al., 2006, Allergy, 61:56; Weihrauch et al., 2005, Clin. Câncer Res., 11 (16) :5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knáblein (editor). John Wiley & Sons, 6 de Dezembro, 2005 (dSLIM discutidos nas páginas 182 a -200) e em Mologen AG (Berlin, FRG: [recuperado online em 18/07/06 em http://www.mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml]. 101 ΡΕ2068918
Como também notado acima, um tipo de co-adjuvante para utilização com GLA, como aqui descrito, pode ser coadjuvantes de alumínio, que são geralmente referidos como "alum". Os co-adjuvantes de alum são baseados no seguinte: oxi-hidróxido de alumínio, hidroxifosfoato de alumínio; ou diversos sais registados. As vacinas que utilizam coadjuvante de alum, podem incluir vacinas para estirpes de tétano, HPV, hepatite A, vírus da polio inactivado e outros antigénios, como aqui descrito. Os co-adjuvantes de alum são vantajosos, dado possuírem um bom registo de segurança, aumentam as respostas dos anticorpos, estabilizam antigénios e são relativamente simples para produção em larga escala (Edelman, 2002, Mol. Biotechnol., 21:129-148; Edelman, R., 1980, Rev. Infect. Dis.r 2:370-383).
Outros co-adjuvantes que podem ser combinados com GLA para uma estimulação imune eficaz, incluem saponinas e miméticos da saponina, incluindo QS21 e compostos estruturalmente relacionados, conferindo efeitos similares e aqui referidos como miméticos QS21. O QS21 foi reconhecido como um co-adjuvante preferido. O QS21 pode incluir uma fracção purificada por HPLC, não tóxica, derivada da casca de Quillaja saponaria Molina. A produção de QS21 é revelada na Pat. U.S. N°. 5 057 540 (ver também as Patentes U.S. N°s. 6 936 255, 7 029 678 e 6 932 972). O GLA pode também, em certas realizações, ser combinado com "complexos imunoestimulantes" conhecidos como ISCOMS (e.g., Patentes U.S. N°s. 6869 607, 6 846 489, 102 ΡΕ2068918 6 027 732, 4 981 684) , incluindo o derivado de saponina, ISCOMATRIX®, que é disponibilizado comercialmente, por exemplo, por Iscotec (Estocolmo, Suécia) e CSL Ltd. (Parkville, Victoria, Austrália).
Construto de Expressão Recombinante
De acordo com algumas realizações aqui reveladas, a composição para vacina com GLA pode conter pelo menos um construto de expressão recombinante, que compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequencia de ácido nucleico que codifica um antigénio. Em algumas outras realizações, o construto de expressão recombinante está presente num vector virai, como um vector adenovirus, virus adeno-associado, herpesvirus, lentivirus, poxvirus ou retrovirus. As composições e métodos para obtenção e utilização de tais construtos de expressão e vectores, são bem conhecidos na arte , para a expressão de antigénios polipeptidicos, como aqui proporcionado, por exemplo, de acordo com Ausubel et ai. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006, John Wiley & Sons, NY. Exemplos não limitantes de construtos de expressão recombinante podem, no geral, ser encontrados, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s. 6 844 192; 7 037 712; 7 052 904; 7 001 770; 6 106 824; 5 693 531; 6 613 892; 6 875 610; 7 067 310; 6 218 186; 6 783 981; 7 052 904; 6 783 981; 6 734 172; 6 713 068; 5 795 577 e 6 770445 e em diversos outros locais, com ensinamentos que podem ser adaptados à expressão dos antigénios polipeptidicos como aqui proporcionado, para ΡΕ2068918 utilização em algumas realizações presentemente reveladas.
Resposta Imune A invenção proporciona, assim, composições para alteração (i.e., aumentar ou diminuir, de forma estatisticamente significativa, por exemplo, em relação a um controlo apropriado, como será familiar para os técnicos da matéria) das respostas imunes num hospedeiro capaz de montar uma resposta imune. Como será do conhecimento das pessoa com conhecimentos vulgares na matéria, uma resposta imune pode ser qualquer alteração activa do estatuto imunológico de um hospedeiro, que pode incluirqualquer alteração na estrutura ou função de um ou mais tecidos, orgãos, células ou moléculas que participem na manutençãoe/ou regulação do estatuto imunológico do hospedeiro. Tipicamente, as respostas imunes podem ser detectadas por qualquer um de uma grande variedade de parâmetros bem conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, determinação in vivo e in vitro de: imunoglobulinas solúveis de anticorpos; mediadores solúveis, tais como citoquinas, linfoquinas, quimioquinas, hormonas, factores de crescimento e outros do mesmo tipo, assim como outros pequenos péptidos, carbohidrato, nucleótido e/ou mediadores lipídicos solúveis; o estado de activação celular alterado, como determinado pelas alterações das propriedades funcionais ou estruturais das células do sistema imunitário, por exemplo, proliferação celular, motilidade alterada, indução de actividades especializadas, como a ΡΕ2068918 expressão de genes específicos ou comportamento citolítico; diferenciação celular por células do sistema imunitário, incluindo a alteração dos perfis de expressão de antigénios de superfície, ou o estabelecimento de apoptose (morte celular programada); ou qualguer outro critério pelo qual se possa detectar a presença de uma resposta imune.
As respostas imunes podem, frequentemente, ser consideradas como, por exemplo, uma discriminação entre as estruturas do organismo e outras exteriores, pelas células e tecidos do sistema imune de um hospedeiro, a níveis molecular e celular, mas a invenção não deve ser limitada por isto. Por exemplo, as respostas imunes podem também incluir mudanças de estado do sistema imune que resultam do reconhecimento imune das próprias moléculas, células ou tecidos, como podem acompanhar qualquer número de condições normais, como as típicas regulações dos componentes do sistema imunitário, ou como podem estar presentes em condições patológicas, como as respostas autoimunes desadequadas observadas em doenças autoimunes e degenerativas. Como outro exemplo, além da indução de sobre-regulação de actividades particulares do sistema imune (tal como a produção de anticorpos e/ou de citoquinas, ou activação da imunidade mediada por células), as respostas imunes também podem incluir supressão, atenuação e outrassub-regulações da imunidade detectável, o que pode ser consequência do antigénio seleccionado, da via de administração do antigénio, da indução de tolerância específica, ou outros factores. 105 ΡΕ2068918 A determinação da indução de uma resposta imune pelas vacinas da presente invenção, pode ser estabelecida por qualquer um de diversos ensaios imunológicos bem conhecidos, com os quais os técnicos com conhecimentos comuns na matéria, estão familiarizados. Tais ensaios incluem, mas não necessitam de se limitarem a, determinação in vivo ou in vitro de: anticorpos solúveis; mediadores solúveis, tais como citoquinas, linfoquinas, quimioquinas, hormonas, factores de crescimento e outros do mesmo tipo, assim como outros pequenos péptidos, carbohidratos, nucleótido e/ou mediadores lipidicos solúveis; estado de activação celular alterado, como determinado pelas alterações das propriedades funcionais ou estruturais das células do sistema imunitário, por exemplo, proliferação celular, motilidade alterada, indução de actividades especializadas, como a expressão de genes específicos ou comportamento citolítico; diferenciação celular por células do sistema imunitário, incluindo a alteração dos perfis de expressão de antigénios de superfície, ou o estabelecimento de apoptose (morte celular programada). Os procedimentos para a realização destes e de outros testes similares são largamente conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, em Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; ver também Current Protocols in Immunology·, ver também, e.g., Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell e Shigii (Eds.), Selected Methods in Celular Immmunology, 1979, Freeman Publishing, São Francisco, CA; Green e Reed, 1998, Science, 281:1309, e ΡΕ2068918 referências ai citadas). A detecção da proliferação de células T reactivas ao antigénio, pode ser conseguida por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, a proliferação das células T pode ser detectada medindo a velocidade da síntese de DNA, e a especificidade antigénica pode ser determinada por controlo do estímulo (tal como, por exemplo, células apresentado um antigénio específico desejado ou um antigénio de controlo ou desencadeando a produção de um antigénio de controlo ou de um antigénio de controlo) a que as células T a reactivas a um antigéni candidato, são expostas. As células T que foram estimuladas para proliferar, exibem um ritmo aumentado de síntese de DNA. Uma forma típica de medir a velocidade de síntese de DNA é, por exemplo, marcando (pulse-labeling) culturas de células T com timidina tritiada, um nucleósido precursor que é incorporado no DNA recém sintetizado. A quantidade de timidina tritiada incorporada pode ser determinada utilizando um espectrofotómetro de cintilação líquida. Outras formas de detectar a proliferação de células T inclem a medição dos aumentos de interleucina-2 (IL-2), fluxo de Ca2+ ou absorção de corantes, como o 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio. Alternativamente, pode ser medida a síntese de linfoquinas (como o interferão gama) ou pode ser quantificado o número relativo de células T que podem responder a um antigénio particular. A detecção da produção de um anticorpo especifico 107 ΡΕ2068918 para um antigénio pode ser conseguida, por exemplo, ensaiando uma amostra (e.g., uma amostra, como soro, plasma ou sangue, contendo uma imunoglobulina) de um hospedeiro tratado com uma vacina, de acordo com a presente invenção, utilizando metodologias in vitro, como o radioimunoensaio (RIA), ensaios de imunoabsorção por ligação a enzimas (ELISA), diálise de equilíbrio ou imunoblotting de fase sólida, incluindo o blotting de Western. Nas realizações preferidas, os ensaios ELISA podem ainda incluir imobilização por captura do antigénio alvo por um anticorpo monoclonal especifico para o antigénio, numa fase sólida, por exemplo, para melhorar a sensibilidade do ensaio. A elaboração de mediadores solúveis (e.g., citoquinas, quimioquinas, linfoquinas, prostaglandinas, etc.), também pode ser facilmente determinada por ensaios de imunoabsorção por ligação a enzimas (ELISA), utilizando, por exemplo, métodos, aparelhos e reagentes disponibilizados pelos distribuidores comerciais (e.g., Sigma, St. Louis, MO; ver também R & D Systems, Catálogo de 2006, R & D Systems, Minneapolis, MN).
Qualquer um de diversos outros parâmetros imunológicos podem ser monitorizados, utilizando ensaios de rotina que são bem conhecidos na arte. Estes podem incluir, por exemplo, citotoxicidade mediada por células dependentes anticorpos, respostas secundárias de anticorpo, in vitro, análise imunocitofluorimétria de fluxo de diversas sub-populações do sangue periférico ou de células mononucleares linfóides, utilizando sistemas de marcadores antigénicos 108 ΡΕ2068918 bem estabelecidos, imunohistoquímica ou outros ensaios relevantes. Este e outros ensaios podem se encontrados, por exemplo, em Rose et al. (Eds.), Manual of Clinicai Laboratory Immunology, 5a Ed., 1997, American Society of Microbiology, Washington, DC.
Assim, é contemplado que as composições de vacina e adjuvante aqui proporcionadas sejam capazes de desencaedar ou melhorar, num hopedeiro, pelo menos uma resposta imune, que é seleccionada entre a resposta de um linfócito T, tipo TH1, resposta de um linfócito T, tipo Th2, resposta de um linfócito T citotóxico (CTL), resposta de um anticorpo, resposta por uma citoquina, resposta por uma linfoquina, resposta por uma quimioquina e uma resposta inflamatória. Em certas realizações, a resposta imune pode incluir pelo menos uma, ou a produção de uma ou de uma pluralidade de citoquinas, em que a citoquina é seleccionada entre interferão-gama (IFN-γ) , factor alfa de necrose tumoral (TNF-α), produção de uma ou diversas interleucinas, em que a interleucina é seleccionada entre IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL- -io, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e IL-23, produção de uma ou diversas quimioquinas, em que a quimioquina é seleccionada entre ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, RANTES, CCL4 e CCL5 e uma resposta linfocitica, que é seleccionada entre resposta de uma célula T memória, resposta de uma célula B memória, resposta de uma célula T efetora, resposta de uma célula T citotóxica e resposta de uma célula B efetora. Ver, e.g., WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6 692 752; U.S. 109 ΡΕ2068918 7 084 256; U.S. 6 977 073; U.S. 6 749 856; U.S. 6 733 763; U.S. 6 797 276; U.S. 6 752 995; U.S. 6 057 427; U.S. 6 472 515; U.S. 6 309 847; U.S. 6,969 704, U.S. 6 120 769; U.S. 5 993 800; U.S. 5 595 888; Smith et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:6951; Kriegler et al., 1988, Cell, 53:45 53; Beutler et al., 1986, Nature, 320:584; U.S. 6 991 791; U.S. 6 654 462; U.S. 6 375 944.
Composições Farmacêuticas
As composições farmacêuticas compreendem, no geral, GLA (disponível em Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Al; produto número 699800 e podem compreender também um ou mais componentes, como aqui proporcionado, que são seleccionados entre antigénio, agonista TLR, coadjuvante (incluindo, opcionalmente, uma citoquina, um modificador da resposta imune imidazoquinolina e/ou um dSLIM), e/ou um construto de expressão recombinante, em combinação com um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Assim, em certos aspectos, a presente invenção é considerada uma "monoterapia" com GLA, em que o GLA, como aqui descrito, é formulado numa composição substancialmente desprovida de outros antigénio e é administrada a um sujeito de modo a estimular uma resposta imune, e.g., uma resposta imune não especifica, com a finalidade de tratar ou prevenir uma doença ou outra condição, tal como uma infecção por um organismo. Noutra realização, por exemplo, 110 ΡΕ2068918 as composições e métodos da invenção empregam um dissacarideo monofosforilado para estimulação de uma resposta imune num sujeito. Noutra realização particular, as composições e métodos empregam a forma 2-monoacilo do Lipido A para estimular uma resposta imune num sujeito. Noutra realização particular, o GLA está na forma de um spray, opcionalmente proporcionado num kit. 0 GLA pode ser preferencialmente formulado numa emulsão estável. Numa realização particular, por exemplo, é proporcionada uma composição compreendendo um derivado do lipido A, numa emulsão estável, substancialmente desprovida de outros antigénios. Noutra realização particular, é proporcionada uma composição compreendendo um derivado de lipido A, 3-acilado monofosforilado, adequado para utilização em mamíferos, em que a posição 2 da amina tem uma cadeia simples de acilo, e que é substancialmente desprovida de outros antigénios.
Em algumas outras realizações, a composição farmacêutica é uma composição para vacina, compreendendo o GLA e um antigénio, podendo ainda incluir um ou mais componenes, como aqui proporcionada, que são seleccionados de agonista TLR, co-adjuvante (incluindo, e.g., uma citoquina, um modificador da resposta imune imidazoquinolina e/ou um dSLIM) e outros do mesmo tipo, e/ou um construto de expressão recombinante, em combinação com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. 111 ΡΕ2068918
Veículos ilustrativos serão os não tóxicos para os receptores, nas dosagens e concentrações empregues. Para as vacinas com base em GLA mais ácido nucleico, ou para vacinas contendo GLA e um antigénio, serão administradosa, tipicamente por via intradérmica, subcutânea intramuscular ou intravenosa, ou por outras vias, cerca de 0,01 g/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
Uma dosagem preferida é de cerca de 1 g/kg a cerca de 1 mg/kg, sendo particularmente preferido desde cerca de 5 g/kg a cerca de 200. g/kg. Será evidente para os técnicos da matéria gue o número e freguência da administração dependerá da resposta do hospedeiro. Os "veículos farmaceuticamente aceitáveis" para utilização terapêutica são bem conhecidos na arte farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.D. Gennaro, ed., 1985). Por exemplo, podem ser utilizadas soluções salinas estéreis e salinas tamponadas com fosfato a um pH fisiológico. Podem ser proporcionados na composição farmacêutica, preservantes, estabilizantes, corantes e até aromatizantes. Por exemplo, podem ser adicionados como preservantes, benzoato de sódio, ácido sórbico e esteres de ácido p-hidroxibenzóico. Ib. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais dos compostos da presente invenção derivados da combinação de tais compostos com um ácido orgânico ou inorgânico (sais de adição e ácido) ou com uma base 112 ΡΕ2068918 orgânica ou inorgânica (sais de adição de base). As composições da presente invenção podem ser utilizadas nas formas de base livre ou de sal, sendo ambas as formas consideradas como englobadas no âmbito da presente invenção.
As composições farmacêuticas podem ter qualquer forma que permita a administração da composição a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar sob a forma de um sólido, liquido ou gás (aerossol). As vias de administração tipicas incluem as, sem limitação, oral, tópica, parenteral (e.g., sublingual ou bucal), sublingual, rectal, vaginal e intranasal (e.g., como uma pulverização). 0 termo parenteral, como aqui utilizado, inclui administração iontoforética (e.g., U.S. 7 033 598; 7 018 345; 6 970 739), sonoforética (e.g., U.S. 4 780 212; 4 767 402; 4 948 587; 5 618 275; 5 656 016; 5 722 397; 6 322 532; 6 018 678), térmica (e.g., U.S. 5 885 211; 6 685 699), transdérmica passiva (e.g., U.S. 3 598 122; 3 598 123; 4 286 592; 4 314 557; 4 379 454; 4 568 343; 5 464 378; U.K. Pat Espec. N° 2232892; U.S. 6 871 477; 6 974 588; 6 676 961), microagulha (e.g., U.S. 6 908 453; 5 457 041, 5 591 139; 6 033 928) e também injecções subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraexternal, intracavernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral ou técnicas de infusão. Numa realização particular, a composição como aqui descrita (incluindo vacina e composições farmacêuticas) é administrada intradérmicamente por uma técnica seleccionada entre iontoforese, microcavitação, sonoforese ou 113 ΡΕ2068918 microagulhas. A composição farmacêutica é formulada de modo a permitir que os ingredientes activos que contém, se tornem biodisponiveis após a administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um paciente tomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem em que, por exemplo, um comprimido pode ser unidade de dosagem unitária e um recipiente com um ou mais compostos da invenção em aerossol pode representar uma pluralidade de unidades de dosagem.
Para administração oral, podem estar presentes um excipiente e/ou um ligante. Exemplos são sacarose, caulino, glicerina, dextrinas de amido, alginato de sódio, carboximetilcelulose e etil celulose. Podem estar presentes agentes corantes e/ou aromatizantes. Pode sem empregue uma camada de revestimento. A composição pode estar na forma de um liquido, e.g., um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. 0 liquido pode destinar-se a administração oral ou para administração por injecção, por exemplo. Quando destinadas a administração oral, as composições preferidas contêm um ou mais entre agentes edulcurantes, preservantes, pigmentos/corantes e melhoradores de sabor. Numa composição destinada a ser administrada por injecção, podem ser incluidos um ou mais entre surfactante, preservante, agente molhante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, 114 ΡΕ2068918 estabilizante e agente isotónico.
Uma composição farmacêutica liquida, como aqui utilizado, seja sob a forma de uma solução, suspensão ou outra forma do mesmo tipo, pode incluir um ou mais dos seguintes veículos ou excipientes: diluentes estéreis, como água para injecção, solução salina, preferencialmente fisiológica salina, solução de Ringer, cloreto de sódio isotónico, óleos fixados, tais como esqualeno, esqualano, óleo mineral, um monooleato de manido, colesterol e/ou mono ou diglicéridos sintéticos, que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, como o álccol benzílico ou metil parabeno; anti-oxidantes, como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelantes, como o ácido etilenediaminetetraacético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla, feitos em vidro ou plástico. Uma composição farmacêutica injectável é, preferencialmente, estéril.
Numa realização particular, uma composição farmacêutica ou para vacina da invenção, compreende uma suspensão aquosa estável com menos de 0,2 me compreende também pelo menos um componente seleccionado do grupo que consiste em fosfolípidos, ácidos gordos, surfactantes, 115 ΡΕ2068918 detergentes, saponinas, lípidos fluoratados e outros do mesmo tipo.
Noutra realização, uma composição da invenção é formulada de forma a poder ser aplicada em aerossol.
Também pode ser desejável incluir outros componentes numa vacina ou composição farmacêutica, tais como veículos de libertação, incluindo, mas não se limitando a, sais de alumínio, emulsões água-em-óleo, veículos oleosos biodegradávesi, emulsões óleo-em-água, microcápsulas biodegradáveis e lipossomas. Exemplos de substâncias imunoestimulatórias adicionais (co-adjuvantes) para utilização em tais veículos, também são descritos acima e podem incluir N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), glucano, IL-12, GM-CSF, interferão gama e IL-12. celulose, glucose,
Apesar de qualquer veículo adequado, conhecido pelos técnicos da matéria, poder ser empregue nas composições farmacêuticas desta invenção, o tipo de veículo variará, dependendo do modo de administração e se é desejada uma libertação controlada. Para administração parenteral, tal como por injecção subcutânea, o veículo compreende, preferencialmente, água, salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode ser empregue qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, 116 ΡΕ2068918 sacarose e carbonato de magnésio. Também podem ser empregues microesferas biodegradáveis (e.g., galactido poliláctico) como veiculos para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas são reveladas, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 4 897 268 e 5 075 109. A esse propósito, é preferivel que a microesfera tenha um tamanho superior a, aproximadamente, 25 microns.
As composições farmacêutica (incluindo as vacinas com GLA e os adjuvantes imunológicos com GLA) podem também conter diluentes, tais como tampões, antioxidantes, como o ácido ascórbico, polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca 19 residuows), proteína, amino ácidos, carbohidratos, incluindo glucose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes, como o EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. Salina tamponada neutra ou salina misturada com albumina não específica de soro, são exemplos de diluentes apropriados. Os produtos podem, preferencialmente, ser formulados como liofilizados, utilizando soluções excipientes apropriadas (e.g., sacarose) como diluentes.
Como descrito acima, em algumas realizações o objecto da invenção inclui composições capazes de libertar moléculas de ácido nucleico codificando os antigénios desejados. Tais composições incluem os vectores virais recombinantes, e.g., retrovírus (ver WO 90/07936, WO 91/02805 WO 93/25234, WO 93/25698 e WO 94/03622) 117 ΡΕ2068918 adenovírus (ver Berkner, Biotechniques, 6:616-6127, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. , 4:403-409, 1993; Vincent et ai., Nat. Genet. 5:130-134, 1993; e Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:215-219, 1994), poxvirus (ver Patente U.S. N°. 4 769 330; Patente U.S. N° . 5 017 487 e WO 89/01973), construtos de expressão recombinante de moléculas de ácido nucleico complexadas com uma molécula policatiónica (ver WO 93/03709) e ácidos nucleicos associados com lipossomas (ver Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7851, 1987). Em algumas realizações, o DNA pode estar ligado a adenovírus morto ou inactivado (ver Curial et ai., Hum. Gene Ther., 3:147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:6094, 1992). Outras composições adequadas incluem DNA-ligando (ver Wu et al., J. Biol. Chem., 264:16985-16987, 1989) e combinações lípido-DNA (ver Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7413-7417, 1989).
Além dos procedimentos in vivo directos. Podem ser utilizados procedimentos ex vivo, em que são removidas células de um hospedeiro, modificadas e colocadas no mesmo ou outro animal hospedeiro. É evidente que se pode utilizar qualquer uma das composições notadas acima para introdução das moléculas codificando um antigénio, em células de tecidos, num contexto ex vivo. Protocolos para métodos virais, físicos e químicos de introdução são bem conhecidos na arte.
Assim, a presente invenção é útil para melhorar 118 ΡΕ2068918 ou iniciar, num hospedeiro,, num paciente ou numa cultura de células, uma resposta imune. Tal como aqui utilizado, o termo "paciente" refere-se a qualquer animal de sangue quente, preferencialmente um ser humano. Um paciente pode ser afligido por uma doença infecciosa, cancro, como o cancro da mama, ou uma doença autoimune, ou pode estar normal (i.e., sem doença e/ou infecção detectável). Uma "cultura de células" é qualquer preparação contendo células imunocompetentes ou células isoladas do sistema imunitário (incluindo, mas não se limitando a, células T, macrófagos, monócitos, células B e células dendriticas). Tais células podem ser isoladas por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas pelos técnicos com conhecimentos normais da matéria (e.g., centrifugação por densidade Ficoll-hypaque). As células podem (mas não necessitam de) ter sido isoladas de um paciente com cancro e podem ser reintroduzidas num paciente, após tratamento.
Em certas realizações, uma composição líquida destinada seja para administração parenteral ou oral, deve conter uma quantidade de composição para vacina com GLA, que permita obter uma dosagem adequada. Tipicamente, esta quantidade é de, pelo menos, 0,01% em peso de um antigénio na composição. Quando destinadas para administração oral, esta quantidade pode variar e situar-se entre 0,1 e cerca de 7 0% em peso da composição. As composições orais preferidas contêm entre cerca de 4% e cerca de 50% de antigénio. As composições e preparações preferidas são preparadas de modo a que uma unidade de dosagem parenteral 119 ΡΕ2068918 contenha entre 0,01 a 1%, em peso, de composição activa. A composição farmacêutica pode destinar- se a administração tópica, caso em que o veículo pode adequadamente incluir um solução, emulsão, pomada ou base em gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolatum, lanolina, polietileno glicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes, como a água e álcool, e emulsionantes e estabilizantes. Agentes espessantes podem estar presentes numa composição farmacêutica para administração tópica. Se destinada a administração transdérmica, a composição pode incluir uma compressa transdérmica ou um dispositivo de iontoforese. As formulações tópicas podem conter uma concentração de antigénio (e.g., composição para vacina com GLA-antigénio) ou GLA (e.g., composição adjuvante imunológica; o GLA é disponibilizado por AVANTI Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; e.g., produto número 699800), entre cerca de 0,1 a cerca de 10% p/v (peso por unidade de volume). A composição pode destinar-se a administração rectal, sob a forma, e.g., de um supositório que fundirá no recto e libertará o fármaco. A composição para administração rectal pode conter uma base oleaginosa, tal como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno glicol. Nos métodos da invenção, as composições para vacina/adjuvantes podem ser administrados através da utilização de inserções, pérolas, formulações de libertação controlada, compressas ou formulações de libertação rápida. Também contemplados em 120 ΡΕ2068918 algumas realizações são kits compreendendo as aqui descritas composições para vacina com GLA e/ou composições imunologicamente adjuvantes com GLA, que podem ser proporcionadas eu um ou mais recipientes. Numa realização, todos os componentes das composições para vacina com GLA e/ou as composições imunologicamente adjuvantes com GLA, estão presentes conjuntamente, num único recipiente, mas as realizações da invenção não se destinam a ser assim limitadas e também contempla dois ou mais recipientes em que, por exemplo, uma composição imunologicamente adjuvante com GLA está separada de, e não em contacto com, o componente antigénico. A titulo de teoria não limitante, julga-se que em alguns casos a administração apenas da composição de adjuvante imunológico GLA pode ser realizada de forma benéfica, enquanto que noutros casos, tal administração pode, com beneficio, ser separada temporalmente e/ou espacialmente (e.g., num local anatómico diferente) da administração do antigénio, enquanto que, ainda noutros casos, a administração ao sujeito é benéficamente conduzida com uma composição para vacina contendo GLA, como aqui descrito e contendo tanto o antigénio como o GLA e, opcionalmente, também outros componentes aqui descritos. O recipiente, de acordo com tais realizações do kit, pode ser qualquer recipiente adequado, vaso, frasco, ampola, tubo cápsula, garrafa, pote, discos, poço num dispositivo com um único poço ou com divversos poços, reservatório, tanque ou outro do mesmo tipo ou outro 121 ΡΕ2068918 dispositivo em que as aqui reveladas composições possam ser colocadas, armazenadas e/ou transportadas e acedidas para remoção do conteúdo. Tipicamente, tal recipiente pode ser feito de um material que seja compatível com a utilização pretendida e a partir do qual a recuperação do conteúdo do recipiente seja facilmente conseguida. Exemplos preferidos de tais recipientes, incluem tubos e ampolas de vidro e/ou plástico, selados ou que possam voltar a ser selados, incluindo os que possuem um septo de borracha ou outro meio de selagem que seja compatível com a retirada do conteúdo, utilizando uma agulha e seringa. Tais recipientes podem, por exemplo, ser feitos de vidro ou de um plástico ou resina quimicamente compatível, que pode ser feito de, ou revestido com, um material que permita a eficiente recuperação do material a partir do recipiente e/ou proteja o material de, e.g., condições degradantes, tais como luz ultravioleta ou temperaturas extremas, ou da introdução de contaminantes indesejados, incluindo contaminantes microbianos. Os recipientes são, preferencialmente, estéreis ou esterilizáveis e feitos de um material que seja compatível com qualquer veículo, excipiente, solvente, veículo ou outros do mesmo tipo, de modo a que possam ser utilizados para suspender ou dissolver as aqui descritas composições para vacina e/ou composições imunologicamente adjuvantes e(ou antigénios e/ou construtos de expressão recombinante, etc.
Podem ser utilizados sistemas em emulsão na formulação das composições da presente invenção. Por 122 ΡΕ2068918 exemplo, têm sido descritos muitos sistemas em emulsão, numa única fase ou multifásicos. Os adjuvantes emulsão óleo-em-água, per se, foram sugeridos como sendo úteis como adjuvantes da composição (EP 0 399 843B), também as combinações de emulsões óleo-em-água com outros agentes activos foram descritos como adjuvantes para vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Foram descritas outras emulsões oleosas adjuvantes, como as emulsões água-em-óleo (Pat. U.S. N°. 5 422 109; EP 0 480 982 B2) e emulsões água-em-óleo-em-água (Pat. U.S. N°. 5 424 067; EP 0 480 981 B) . As emulsões oleosas adjuvantes para utilização na presente invenção, podem ser naturais ou sintéticos e podem ser minerais ou orgânicos. Exemplos de óleos minerais e orgânicos são facilmente aparentes para os técnicos da matéria.
Numa realização particular, a composição da invenção compreende uma emulsão óleo-em-água, em que o GLA está incorporado na fase oleosa. Noutra realização, uma composição da invenção compreende uma emulsão de óleo-em-água em que o GLA está incorporado na fase oleosa e em que está presente um componente adicional, como um coadjuvante, agonista TLR ou outro do mesmo tipo, como aqui descrito.
De modo a que qualquer composição óleo-em-água seja adequada para administração humana, a fase oleosa do sistema de emulsão inclui, preferencialmente, um óleo matabolizável. O significado do termo óleo metabolizável, é 123 ΡΕ2068918 bem conhecido na arte. Metabolizável pode ser definido como "sendo capaz de ser transformado por metabolismo" (Dorland's Ilustrated Medicai Dictionary, W.B. Saunders Company, 25a. Edição (1974)). 0 óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que não seja tóxico para o receptor e seja capaz de ser transformado por metabolismo. Frutos (como o óleo de amendoim), sementes e grãos são origens vulgares de óleos vegetais. Os óleos sintéticos também estão englobados nesta invenção e podem incluir óleos disponíveis comercialmente, tal como NEOBEE® e outros. 0 esqualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno), por exemplo, é um óleo insaturado que é encontrado em grandes quantidades no óleo de figado de tubarão, e em menores quantidades no azeite, óleo de germen de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura, e é um óleo particularmente preferido para utilização nesta invenção. O esqualeno é um óleo metabolizável, devido ao facto de ser um intermediário na biossintese de colesterol (Merck Index, 10a Edição, entrada n°. 8619). Emulsões oleosas particularmente preferidas, são as emulsões óleo-em-água, e em particular, emulsões esqualeno-em-água. Adicionalmente, os adjuvantes mais preferidos das emulsões oleosas da preente invenção, incluem um antioxidante, que é, preferencialmente o óleo alfa-tocoferol (vitamina E, EP 0 382 271 Bl) . As WO 95/17210 e WO 99/11241, revelam adjuvantes para emulsão baseados em esqualeno, alfa-tocoferol e TWEEN® 80, 124 ΡΕ2068918 opcionalmente formuladas com o imunoestimulante QS21 e/ou 3D-MPL (que são discutidos acima). A WO 99/12565 revela um melhoramento destas emulsões de esqualeno, com a adição de um esterol na fase oleosa. Adicionalmente, pode ser adicionado um triglicérido à fase oleosa, como a tricaprilina (C27H50O6), de modo a estabilizar a aemulsão (WO 98/56414) . 0 tamanho das goticulas de óleo encontradas na emulsão estável de óleo em água é, preferencialmente, inferior a 1 micron, podendo estar essencialmente no intervalo de 30-600 nm, preferencialmente essencialmente com cerca de 30-500 nm de diâmetro, mais preferencialmente, essencialmente 150-500 nm de diâmetro e, em particular, cerca de 150 nm de diâmetro, medido por espectroscopia de correlação fotónica. A este respeito, 80% em número das goticulas de óleo devem situar-se nos intervalos preferidos, mais preferencialmente, mais de 90% e ainda mais preferencialmente, mais de 95% em número das goticulas de óleo situam-se nos intervalos de tamanho definidos. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões oleosas da presente invenção são, convencionalmente, no intervalo de 2 a 10% de óleo, como o esqualeno; e, quando presente, 2 a 10% de alfa-tocoferol; e de 0,3 a 3% de surfactante, como o monooleato de polioxietileno sorbitano. Preferencialmente, a relação óleo:alfa tocoferol é igual ou inferior a 1, dado que assim é proporcionada uma emulsão mais estável. Também pode estar presente Span 85, num nivel de cerca de 1%. Em alguns casos, pode ser vantajoso que as 125 ΡΕ2068918 vacinas da presente invenção, contenham também um estabilizante. 0 método de produção de emulsões óleo em água é bem conhecido pelos técnicos da matéria. 0 método compreende, vulgarmente, a mistura da fase oleosa com um surfactante, tal como uma solução PBS/TWEEN80®, seguido por homogenização, utilizando um homogenizador. Por exemplo, um método que inclua a passagem da mistura uma, duas ou três vezes atravéz da agulha de uma seringa deve ser adequado para homogenizar pequenos volumes de liquido. De igual modo, o processo de emulsionamento num microfluidificador (aparelho microfluidificador M110S, máximo de 50 passagens durante um período de 2 minutos, a uma pressão máxima de entrada de 6 bar (pressão de saida de cerca de 850 bar) ) , pode ser adaptado para produzir volumes maiores ou menores de emulsão. Esta adaptação pode ser conseguida por experimentação de rotina, compreendendo a medição da emulsão resultante, até se conseguir uma preparação com goticulas de óleo do diâmetro requerido.
Os Exemplos que se seguem são oferecidos a titulo de ilustração e não a titulo de limitação. 126 ΡΕ2068918 EXEMPLOS Exemplo 1
Formulação Aquosa de GLA
Este exemplo descreve a preparação de uma formulação adjuvante aquosa contendo CLA. A formulação aquosa de GLA (GLA-AF) contém água para injecção (WFI), GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800) e 1-palmitoí1-2-oleíl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC). A formulação foi preparada por adição de uma solução de etanol e POPC a uma quantidade pré-pesada de GLA. Este GLA molhado foi sonificado durante 10 minutos, para dispersar o GLA o máximo possível. Secou-se depois o GLA sob azoto gasoso. Este GLA e POPC seco foi reconstituído com WFI até ao volume correcto. Sonificou-se esta solução a 60°C durante 15-30 minutos, até todo o GLA e POPC estarem em solução. Para armazenagem longa, as formulações de GLA-AF devem ser liofilizadas. O processo consistiu na adição de glicerol à solução, até 2% do volume total. A solução foi depois colocada em frascos, em quantidades de 1-10 mL. Submeteram-se os frascos ao processo de liofilização, que consistiu no congelamento da solução e a sua colocação sob vácuo, para retirar a água congelada por sublimação. 127 ΡΕ2068918
Exemplo 2
Análise do GLA por HPLC
Este exemplo descreve a análise por HPLC de uma formulação aquosa adjuvante, contendo GLADepois da manufactura da formulação (ver Exemplo 1, acima), foram conduzidos certos testes de libertação e estabilidade, para assegurar a qualidade do produto e a reprodutibilidade. Todas as formulações foram testadas quanto à libertação e estabilidade a longo prazo, por Cromatografia Liquida de Elevado Desempenho (HPLC), Difracção Dinâmica de Luz (DLS) e exame visual. Os cromatogramas de HPLC foram realizados utilizando um sistema Agilent 110 e um detector ESA Corona CAD. O método foi efectuado utilizando um gradiente de metanol para clorofórmio, numa coluna Waters Atlantic C18. As injecções incluíram 2,5 μρ de GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800, GLA-AF) ou MPL® (GSK Biologicals, Rixensart, Bélgica, MPL-AF), respectivamente, e 0,27 μρ de fosfocolina sinttica (POPC), que foi utilizada como agente solubilizante. A Figura 1 mostra os dados de HPLC, demonstrando o número e quantidades de materiais contaminantes em MPL-AF e GLA-AF.
Os perfis de HPLC mostraram que o GLA-AF era substancialmente mais pur do que o MPL-AF. Quer dizer, existiam menos picos de contaminantes no GLA-AF do que na formulação adjuvante com LPL-AF. Um material de partida ΡΕ2068918 mais puro é um tremento beneficio para os investigadores, dado que as respostas biológicas obtidas são as do único componente principal utilizado nas formulações com GLA.
Exemplo 3
Formulação de GLA em Óleo
Este exemplo descreve a preparação de um mililitro de uma formulação oleosa contendo o adjuvante GLA. Emulsionou-se o GLA (100 microgramas; Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800) em esqualeno (34,3 mg) com glicerol (22,7 mg), fosfotidilcolina ou lecitina (7,64 mg), Pluronic® F-68 (BASF Corp., Mount Olive, NJ) ou um copolimero em blocos semelhante (0,364 mg), em tampão amónia fosfato 25 milimolar (pH 5,1), utilizando 0,5 mg de D,L-alfa-tocoferol como antioxidante. Processou-se a mistura sob pressão elevada até se formar uma emulsão que não se separou e que tinha um tamanho médio de particulas inferior a 180 nm. A emulsão foi depois esterilizada por filtração, para frascos de vidro unidose e capsulada, para armazenamento de longa duração. Esta preparação pode ser utilizada durante, pelo menos, três anos, quando conservada a 2-8°C.
Exemplo 4
Estimulação de Macrófagos Murinos e Células Dendriticas com
GLA vltro
Este exemplo descreve um modelo in 129 ΡΕ2068918 demonstrando um efeito adjuvante do GLA. Empregaram-se metodologias e reagentes correntes para a cultura de tecidos. Mantiveram-se células murinas J774 e a linha celular de macrófagos RAW267.2 (Americam Type Culture Collection, Manassas, VA) de acordo com as recomendações do fornecedor e cultivaram-se como monocamadas de células aderentes em placas multi-poço. As células dendriticas foram derivadas de células progenitoras de medula óssea, seguindo-se um protocolo de Xiong et al. (J. Biol. Chem., 2004, 279, pp 10776-83). Conseguiram-se diversas concentrações de adjuvante sintético GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800), diluindo uma preparação aquosa de adjuvante em meio de cultura celular (DMEM contendo 10% de soro bovino fetal) e mantiveram-se as células durante 24 horas a 37°C, em atmosfera humidificada, contendo 5% de CO2, antes da colheita dos sobrenadantes, sem células. Ensaiaram-se os fluidos sobrenadantes quanto às citoquinas murinas solúveis, tais como IL-12, IL-6 e quimioquinas, como RANTES, utilizando kits de ensaio ELISA "sandwich" específicos (eBiosciences, San Diego, CA para citoquinas e R&D Systems, Minneapolis, MN, para quimioquinas), de acordo com as instruções do fabricante.
As respostas imunes, dependentes da dose, induzidas pelo GLA-AF em linhas de células macrófagos de murganho e DC murinas primárias, caracterizou-se por secreção de citoquinas, tais como IL-20p40, IL-6 e TNF e quimioquinas, como RANTES. 130 ΡΕ2068918
Exemplo 5
Estimulação de Macrófagos Humanos e Células Dendríticas com
GLA
Este exemplo descreve um modelo in vitro demonstrando os efeitos adjuvantes do GLA. Empregaram-se metodologias e reagentes correntes para a cultura de tecidos.
As células da linha de células de macrófagos humanos Mono Mac 6 (Americam Type Culture Collection, Manassas, VA) foram mantidas de acordo com as recomendações do fornecedor e cultivadas como monocamadas de células aderentes em placas multi-poço. As células dendríticas foram derivadas de células mononucleares de sangue periférico (PMBC), seguindo-se um protocolo padronizado. Conseguiram-se diversas concentrações de adjuvante, tanto do GLA sintético (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800), como do produto natural MPL® (GSK Biologicals, Rixensart, Bélgica) diluindo uma preparação aquosa de adjuvante em meio de cultura celular (DMEM contendo 10% de soro bovino fetal para as MonoMac 6 ou 10% de soro humano paea DC) e mantiveram-se as células durante 24 horas a 37°C, em atmosfera humidificada, contendo 5% de CO2, antes da colheita dos sobrenadantes, sem células. Ensaiaram-se os fluidos sobrenadantes quanto às citoquinas humanas solúveis, tais como IL-Ιβ, IL-23, IL-6 e quimioquinas, como IP-10, RANTES e MIP-Ιβ, utilizando kits de ensaio ELISA "sandwich" específicos (eBiosciences, San 131 ΡΕ2068918
Diego, CA para citoquinas e Invitrogen, Carlsbad, CA, para quimioquinas), de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 2 mostra os dados de ELISA, demonstrando os niveis de citoquinas e quimioquinas expressos pelos macrófagos humanos da linha de células Mono Mac 6 (painéis a - e) e DC derivados de monócitos (painéis f - h) , em resposta à estimulação com GLA. A GLA-AF mostrou-se activa em concentrações 5-500 vezes inferiores, em comparação com a MPL-AF, para todas as citoquinas e quimioquinas testadas. A GLA-AF induziu uma resposta imune dependente da dose, nos macrófagos humanos da linha de células Mono Mac 6 (Figura 2, painéis a - e) e nos DC primários (figura 2, painéis f - h), caracterizada pela secreção de citoquinas, tais como IL-Ιβ, IL-6, IL-23 e quimioquinas, tais como RANTES, IP-10 e MI Ρ-1β.
Exemplo 6
Estimulação de globulos Vermelhos Humanos com GLA
Este exemplo descreve um modelo in vitro demonstrando os efeitos adjuvantes do GLA. Empregaram-se metodologias e reagentes correntes para a cultura de tecidos.
Cultivaram-se células totais de sangue com diversas concentrações, quer do GLA sintético (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800), como 132 ΡΕ2068918 do produto natural MPL® (GSK Biologicals, Rixensart, Bélgica), conseguidas por diluição de uma preparação aquosa de adjuvante em meio de cultura celular (DMEM contendo 10% de soro bovino fetal). Mantiveram-se as células sanguíneas durante 16 horas a 37°C numa atmosfera humidificada, contendo 5% de C02, antes da colheita dos sobrenadantes, sem células. Ensaiaram-se os fluidos sobrenadantes quanto à citoquina humana solúvel, tais como IL-Ιβ, utilizando kits de ensaio ELISA "sandwich" específicos (eBiosciences, San Diego, CA), de acordo com as instruções do fabricante. A GLA-AF induziu uma resposta imune dependente da dose, células totais de sangue, caracterizada pela secreção de citoquina IL-Ιβ. Neste ensaio, 92 nm de GLA foram equivalentes, em potância, a 57 000 nm de MPL-AF.
Exemplo 7
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contra Influenza. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais Balb/c por grupo) duas vezes, com três semanas de intervalo, com a vacina Fluzone (Sanofi-Aventis, Swiftwater, PA) com 1/25 (20 μΡ) e 1/250 (2 μΡ) da dosagem humana, só ou formulada 133 ΡΕ2068918 (i) numa emulsão aquosa contendo GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 20 pg por animal, por cada imunização) , de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 1, acima ("GLA-AF"), ou (ii) com uma emulsão estável contendo GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 20 μρ por animal, por cada imunização), de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima ("GLA-SE"). Recolheu-se o soro por sangramento dos animais, uma semana após cada imunização e examinaram-se por ELISA os niveis totais dos anticorpos IgG no soro, específicos para a Fluzona, de acordo com métodos publicados (id.). Os niveis de anticorpos neutralizantes do virus, no soro, também foram examinados pelo Ensaio de Inibição da Hemaglutinação (HAI), de acordo com métodos publicados.
A Figura 3 mostra os dados de ELISA, demonstrando os niveis de produção de anticorpos anti-Fluzone induzidos nos murganhos, uma semana após cada imunização (i.e., no dia 7, painel A e no dia 28, painel B) , utilizando duas doses diferentes de vacina Fluzone, formulada com GLA-AF ou GLA-SE, comparado apenas com Fluzone. São mostradas as médias e SEM e das titulações terminais reciprocas para cada grupo/ponto temporal. O painel C da figura 3 mostra os dados de HAI, demonstrando os niveis de produção de anticorpos anti-Fluzone induzidos nos murganhos, uma semana após a segunda imunização, utilizando duas doses diferentes de vacina Fluzone, formulada com GLA-AF ou GLA-SE, comparado apenas com Fluzone. São mostradas as médias e SEM 134 ΡΕ2068918 e das titulações terminais reciprocas para cada grupo/ponto temporal.
As titulações de IgG e de anticorpo neutralizante em resposta à vacinação com Fluzone foram aumentadas pela adição de GLA, tanto na formulação aquosa como na oleosa estável. 0 efeito adjuvante do GLA foi mais pronunciado com a dose de 2 μ]1 de vacina Fluzone e induziu respostas humorais especificas para o antigénio semelhantes (GLA-AF) ou superiores (GLA-SE) às de 20 μΕ de vacina Fluzone simples. Estes resultados sugerem que é possivel reduzir a dose de vacina Fluzone adjuvando-a com formulações contendo GLA, induzindo ainda assim títulos muito elevados de IgG e de anticorpos neutralizantes. Isto é particularmente importante no contexto de uma infecção pandémica como a Gripe das Aves.
Exemplo 8
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contendo um antigénio específico de Leishmania. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais C57BL/6 por com o grupo), três vezes, com três semanas de intervalo 135 ΡΕ2068918 antigénio SMT (10 μg por animal, por cada imunização), utilizado só ou formulado numa emulsão estável contendo GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 20 μρ por animal, por cada imunização, de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, GLA-SE). Recolheu-se o soro por sangramento dos animais, uma semana após a terceira imunização e examinaram-se os niveis séricos de anticorpos IgGl e IgG2c específicos para o SMT, por ELISA, de acordo com métodos publicados. A Figura 4 mostra os dados de ELISA demonstrando os níveis da produção de anticorpos anti-SMT induzidos nos murganhos uma semana apósa terceira imunização, utilizando apenas SMT ou formulado com GLA-SE. São mostradas a média e SEM das titulações terminais recíprocas, em cada grupo. A predominância do isotipo IgGl ou IgG2c do anticorpo é associada com as respostas TH2 ou TH1, respectivamente. Foi demonstrado que uma resposta TH1 é necessária para protecção contra infecções por Leishmania. A vacinação apenas com SMT induziu predominantemente anticorpo IgGl específico para o SMT. A vacinação SMT+GLA-SE induziu títulos mais elevados de anticorpo e reverteu o fenotipo para uma resposta predominantemente com anticorpos IgG2c específicos para o antigénio, associado com a protecção contra a doença. 136 ΡΕ2068918
Exemplo 9
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contendo um antigénio especifico de Leishmania. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et ai., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais Balb/C por grupo) três vezes, com duas semanas de intervalo, com o antigénio Leish-llOf (10 mg por animal, por cada imunização), formulado numa emulsão estável contndo diversas quantidades de GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 40, 20, 5 ou 1 μρ por animal, por cada imunização, de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, GLA-SE). Recolheu-se o soro por sangramento dos animais, uma semana após a terceira imunização e examinaram-se os niveis séricos de anticorpos IgGl e IgG2c específicos para o SMT, por ELISA, de acordo com métodos publicados (id.). A Figura 5 mostra os dados de ELISA demonstrando os níveis da produção de anticorpos anti-Leish-llOf induzidos nos murganhos uma semana após a primeira imunização, utilizando o antigénio Leish-llOf formulado com diferentes quantidades de GLA (40, 20, 5 ou 1 μg) , em comparação com o controlo salino. São mostradas a média e 137 ΡΕ2068918 SEM das titulações terminais reciprocas, em cada grupo.
Os títulos dos anticorpos IgGl e IgG2a específicos para Leish-llOf foram dependentes da dose de GLA. Observou-se predominância do anticorpo IgG2a associado a TH1, em todas as concentrações de GLA testadas.
Exemplo 10
Utilização, r In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adj uvante do GLA numa vacina contendo um antigénio específico de Leishmania. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais Balb/C por grupo) três vezes, com três semanas de intervalo, com salina ou com o antigénio Leish-lllf (10 μg por animal, por cada imunização), formulado numa emulsão estável contendo GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 20 μρ por animal, por cada imunização, de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, GLA-SE). Duas semanas depois da última injecção, sacrificaram-se os murganhos e recolheu-se o baço para analisar as respostas das citoquinas IL-4 e IFN-γ dependentes das células T a uma estimulação in vitro por antigénio, por ELISA, de acordo com métodos publicados. 138 ΡΕ2068918 A predominância da citoquina IL-4 ou IFN-g é associada com respostas TH2 ou TH1, respectivamente. Estes e outros autores demonstraram que uma resposta TH1 é necessária para protecção contra infecção por Leishmania. Todos os animais responderam bem a ConA, um portente mitógeno. A vacinação com Leish-lllf+GLA-SE induziu respostas de citoquinas especificas contra o antigénio Leish-lllf, não se tendo observado essas respostas no grupo de controlo salino Quando comparada com a ConA, a vacinação com Leish-lllf+GLA-SE induziu a produção de muito mais IFN-g do que de IL-4, uma relação TH1:TH2 ou fenotipo associado com a protecção contra a doença.
Exemplo 11
Utilização, , In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adj uvante do GLA numa vacina contendo um antigénio específico de Leishmania. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais Balb/C por grupo) três vezes, com duas semanas de intervalo, com salina, com o antigénio Leish-llOf (10 μg por animal, por cada imunização), formulado numa emulsão estável contendo diferentes quantidades de (i) GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 40, 5 ou 1 μρ 139 ΡΕ2068918 por animal, por cada imunização) , de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, (GLA-SE) ou (ii) com MPL® numa emulsão como fornecida pelo fabricante ("MPL-SE", GSK Biologicals, Rixensart, Bélgica). Uma semana depois da última injecção, sacrificaram-se os murganhos e recolheu-se o baço para analisar as respostas da citoquina IFN-γ dependente das células T, a uma estimulação in vitro por antigénio, por ELISA, de acordo com métodos publicados (Id.) . As respostas da citoquina IFN-γ foram associadas a um fenotipo protector TH1, contra infecção por Leishmania. A figura 6 mostra os dados de ELISA demonstrando os niveis de produção de citoquina IFN-γ anti Leish-llOf induzidas nos murganhos, uma semana após a terceira imunização, utilizando o antigénio Leish HOf formulado com diferentes quntidades de GLA e em comparação com um controlo salino. São mostradas as médias e SEM de cada grupo.
Todos os animais responderam bem a ConA, um potente activador celular e mitógeno. A vacinação com Leish-llOf+GLA-SE induziu respostas de citoquina especificas para o antigénio Leish-llOf, de forma dependente da dose, não tendo tais respostas sido observadas no grupo de controlo salino. Em todas as concentrações testadas, o GLA-SE foi mais potente que o MPL-SE, induzindo niveis mais elevados de IFN-γ, secretada por células T especificas para o antigénio. ΡΕ2068918
Em conclusão, a adição de GLA, numa formulação oleosa estável, a uma candidata a vacina contra a Leishmania com antigénio Leish-llOf, induziu, predominantemente, respostas imunes especificas contra o antigénio, de tipo celular (células T) , associado com o fenotipo protector TH1. Adicionalmente, o GLA-SE revelou-se mais potente que o MPL-SE na indução da protecção associada a citoquinas, como a IFN-γ.
Exemplo 12
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adj uvante do GLA numa vacina contendo um antigénio especifico de Leishmania. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais Balb/C por grupo) três vezes, com duas semanas de intervalo, com salina ou com o antigénio Leish-llOf (10 μg por animal, por cada imunização), formulado numa emulsão estável contendo diferentes quantidades de (i) GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 20 μg ou 5 μρ por animal, por cada imunização) , de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, (GLA-SE) ou (ii) com MPL® numa emulsão como fornecida pelo fabricante ("MPL-SE", GSK Biologicals, Rixensart, Bélgica). Uma semana 141 ΡΕ2068918 depois da última injecção, sacrificaram-se os murganhos e recolheu-se o baço para analisar as respostas das citoquinas IFN-γ, IL-2 e TNF, dependentes das células T, a uma estimulação in vitro por antigénio, por coloração intracelular de células (ICS) e citometria de fluxo, de acordo com métodos publicados (Jd.). Estas três citoquinas foram associadas a um fenotipo protector TH1, contra infecção por Leishmania.
Quando avaliado a um nivel celular simples, a frequência de células TCD4+ expressando os três tipos de citoquinas, IFN-γ, IL-2 e TNF, ou uma combinação de IFN-γ e IL-2, foi mais elevada no grupo Leish-llOf+GLA-SE, em comparação com o grupo Leish-llOf+MPL-SE, e isto foi observado tanto nas doses de 20 como de 5 μρ. Foi relatado (Seder et al. ) que elevadas frequências de células T CD4 + expressando as três citoquinas, IFN-γ, IL-2 e TNF, se correlaciona com protecção contra infecções por Leishmania.
Em conclusão, a adição de GLA, numa formulação oleosa estável, a uma candidata a vacina contra a Leishmania com antigénio Leish-llOf, induziu, predominantemente, respostas imunes especificas contra o antigénio, de tipo celular (células T) , associadas com o fenotipo protector TH1. Adicionalmente, o GLA-SE revelou-se mais potente que o MPL-SE na indução da protecção associada a citoquinas, como as IFN-γ, IL-2 e TNF. ΡΕ2068918
Exemplo 13
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contendo um antigénio especifico de Mycobacterium tuberculosis. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.)/ 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais C57BL/6 por grupo), três vezes, com três semanas de intervalo, com o antigénio ID83 (8 μg por animal, por cada imunização) , utilizado só ou formulado numa emulsão estável contendo GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 20 μg por animal, por cada imunização, de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, GLA-SE). Recolheu-se o soro por sangramento dos animais, uma semana após a terceira imunização e os níveis séricos de anticorpos IgGl e IgG2c, específicos para o ID83, foram examinados por ELISA, de acordo com métodos publicados (Id.) . O predomínio do isotipo com o anticorpo IgGl ou IgG2c é associado com respostas TH2 ou TH1, respectivamente. Demonstrou-se que a resposta TH1 é necessárias para protecção contra infecção por Mycobacterium tuberculosis. A vacinação apenas com ID83 induziu, predominantemente, o anticorpo IgGl específico para o 143 ΡΕ2068918 antigénio. Em contraste, a vacinação com ID83+GLA-SE induziu titulos mais elevados de anticorpos e reverteu o fenotipo para uma resposta com anticorpos IgG2c, especifica para o antigénio, associada com a protecção contra a doença.
Exemplo 14
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contendo um antigénio especifico de Mycobacterium tuberculosis. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais C57BL/6 por grupo), três vezes, com três semanas de intervalo, com o antigénio ID83 (8 μρ por animal, por cada imunização) , utilizado só ou formulado numa emulsão estável contendo GLA (GLA-SE) , GLA + CpG (CpGi826í Coley Pharmaceuticals, 25 μρ) (GLA CpG-SE), ou GLA + Gardiquimod (GDQ) (Invivogen, 20 μρ) (GLA/GDQ-SE). Três semanas após a última injecção, sacrificaram-se os murganhos e recolheram-se os baços para analisar as respostas das citoquinas IFN-γ, IL-2 e TNF, dependentes das células T CD4+ e CD8+, a uma estimulação in vitro com antigénio ID83, por ICS e citometria de fluxo, de acordo com métodos publicados. As expressões das citoquinas IFN-γ, IL-2 e TNF têm sido associadas com respostas 144 ΡΕ2068918 protectoras TH1 contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis. A Figura 7 mostra dados de ICS demonstrando as frequências de células T CD4+ e CD8+ produtoras de citoquinas IFN-γ, IL-2 e TNF especificas para o ID83, induzidas nos murganhos, uma semana após a terceira imunização, utilizando apenas ID83 ou adjuvado com formulações contendo GLA (GLA-SE), GLA+CpG (GL/CpG-SE) ou GLA+GDQ (GLA/GDQ-SE).
As frequências de células T CD4+ e CD8 + produtoras de citoquinas IFN-γ, IL-2 e TNF especificas para o ID83, estavam no nivel de base tanto para o grupo salina como para o grupo vacinado apenas com ID83. As células T, tanto CD4+ como CD8+, produtoras de citoquinas especificas para o antigénio ID83, foram induzidas por vacinação com ID83+GLA-SE, e a sua frequência aumentou mais por adição de um segundo ligando TLR, como GDQ (TLR7/8) ou CpG (TLR9). As células T expressando IFN-γ + TNF ou IFN-γ + IL-2 foram as populações predominantes.
Em conclusão, adjuvando um antigénio contra M. tuberculosis, com GLA, melhora-se muitos a resposta celular (células T) especifica para o antigénio, como medido pelas frequências de células T expressando as citoquinas IFN-γ, IL-2 e TNF. Com binando o GLA-SE com oureo ligando TLR, aumenta-se mais a frequência de células produtoras e citoquinas especificas para o antigénio, um fenotipo 145 ΡΕ2068918 associado com protecção contra a doença.
Exemplo 15
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contendo um antigénio especifico de Mycobacterium leprae. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais C57BL/6 por grupo), três vezes, com três semanas de intervalo, com o antigénio ML0276 (10 μg por animal, por cada imunização), adjuvados com formulações aquosas contendo CpG (CpGi826, Coley Pharmaceutical, 25 μρ por animal, por cada
imunização), Imiquimod (IMQ) (3M Pharma, 25 μρ por animal, por cada imunização) ou GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 25 μg por animal, por cada imunização, de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, GLA-SE), uma mistura dos três ou salina, como controlo negativo. Recolheu-se o soro por sangramento dos animais, três semanas após a segunda imunização e examinaram-se os níveis séricos de anticorpos IgG específicos para o ML0276, por ELISA, de acordo com métodos publicados (Jd.).
Os animais do controlo salino não mostravam IgG ΡΕ2068918 específica para o ML0276 e os dos grupos ML0276+CpG e ML0276+IMQ mostravam um nível muito baixo de anticorpos específicos para o antigénio. Em contraste, o ML0276+GLA-SE induziu um nível significativo de IgG específica para o ML0276, que era ainda mais aumentado quando se utilizaram os três adjuvantes conjuntamente.
Exemplo 16
Utilização, In Vivo, de uma Vacina Contendo GLA
Este exemplo descreve um modelo in vivo demonstrando um efeito adjuvante do GLA numa vacina contendo um antigénio específico de Mycobacterium leprae. Empregaram-se metodologias e reagentes imunológicos correntes (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (Eds.), 2006, John Wiley & Sons, NY).
Imunizaram-se murganhos (três animais C57BL/6 por grupo), três vezes, com três semanas de intervalo, com o antigénio ML0276 (10 μρ por animal, por cada imunização), adjuvados com formulações aquosas contendo CpG (CpGi826/ Coley Pharmaceutical, 25 μρ por animal, por cada imunização) , Imiquimod (IMQ) (3M Pharma, 25 μρ por animal, por cada imunização) ou GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; produto número 699800; 25 μρ por animal, por cada imunização, de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3, acima, GLA-SE), uma mistura dos três ou salina, como controlo negativo. Três semanas após a última injecção, sacrificaram-se os murganhos e recolheu-se o baço 147 ΡΕ2068918 para se analisarem as respostas da citoquina IFN-γ dependente das células T CD4+, a uma estimulação in vitro com antigénio ML076, por ICS e citometria de fluxo, de acordo com métodos publicados. A expressão da citoquuina IFN-γ foi associada com repostas protectoras TH1 contra a infecção por M. leprae. A Figura 8, painel A, mostra os dados de ICS demonstrando as frequências de células T CD4+ produtoras de citoquina IFN-γ especifica para o ML0276 induzidaa em murganhos , uma semana após a terceira imunização, utilizando antigénio ML0276 formulado com formulações aquosas contendo CpG, Imiquimod (IMQ) ou com um emulsão oleosa estável contendo GLA (GLA-SE), ou os três em conjunto, em comparação com salina e controlos não injectados. São mostradas as médias de cada grupo. A Figura 8, painel B, mostra os dados demonstrando a celularidade dos nódulos linfáticos que drenam o local da infecção por M. leprae, em murganhos imunizados com o antigénio ML0276, formulado com formulações aquosas contendo CpG ou Imiquimod (IMQ) ou uma emulsão oleosa estável contendo GLA (GLA-SE), ou uma mistura das três, em comparação com salina e controlos não injectados. São mostradas a média e SEM de cada grupo.
Os animais do grupo de controlo salino não mostraram respostas IFN-γ especificas para o ML0276, com uma frequência de base de 0,04% de células positivas. Os dos grupos CpG e IMQ mostravam uma frequência ligeiramente 148 ΡΕ2068918 aumentada de células produtoras de citoquina específica para o antigénio, com 0,17% e 0,11%, respectivamente. Em contraste, um número significativamente elevado de células T CD4+ IFN-y+, específicas para o ML0276 (0,66%) foram observadas quando se utilizou GLA-SE como adjuvante, uma frequência que foi ainda aumentada quando os três adjuvantes foram misturados conjuntamente (2,14%).
Um subconjunto de murganhos foi subsequentemente desafiado com M. leprae e verificou-se que estava protegido por ML076+GLA-SE, como medido pela redução do número de células nos nódulos linfáticos que drenavam o local do desafio, em comparação com os controlos salinos infectados. A vacinação com ML0276+CpG e ML0276+IMQ induziram apenas uma modesta diminuição do número de células, em comparação com a salina.
Em conclusão, os dados suportam o efeito adjuvante do GLA-SE e/ou uma combinação de GLA-SE com ligandos TLR adicionais, quando utilizado com o antigénio ML0276 para a indução de respostas celulares especificas para o antigénio.
Lisboa, 31 de Julho de 2012

Claims (18)

  1. ΡΕ2068918 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para vacina, compreendendo: (a) um antigénio; e (b) um adjuvante glucopiranosil lípido (GLA), em que o GLA possui a fórmula:
    em que: R1, R3, R5 e R6 são Cn-C2o alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
  2. 2. Composição para vacina da reivindicação 1, compreendendo ainda, pelo menos, um componente adicional, seleccionado do grupo que consiste em: (a) um agonista de receptor tipo "toll" (TLR); (b) uma saponina ou um mimético da saponina; (c) um veiculo que compreende pelo menos um entre 2 ΡΕ2068918 um óleo e ISCOMATRIX™; (d) um modificador da resposta imune imidazolo; (e) um "double stem loop imune modifier" (dSLIM); (f) um coadjuvante; e (g) um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  3. 3. Composição para vacina da reivindicação 2, em que: (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em alum, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide da planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina; (ii) 0 agonista TLR, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em lipopolisacarideo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a de elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C; (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod; (iv) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em uma citoquina, um detergente,e um copolimero em blocos ou polímero biodegradável; e 3 ΡΕ2068918 (ν) ο veículo farmaceuticamente aceitável, quando presente, compreende um veículo que é seleccionado do grupo que consiste em fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, um lipossoma e uma micropartícula.
  4. 4. Composição para vacina da reivindicação 1, em que o GLA inclui: (i) um esqueleto diglucosamina possuindo um terminal glucosamina redutor, ligado a um terminal glucosamina não redutor, através de uma ligação éter entre a posição 1 da hexosamina no terminal glucosamina não redutor e a posição 6 da hexosamina no terminal redutor glucosamina; (ii) um grupo O-fosforilo ligado à posição 4 da hexosamina no terminal não redutor da glucosamina; e (iii) até seis cadeias de acilo gordo; em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao hidróxilo 3 do terminal redutor da glucosamina, através de uma ligação ester, em que uma ou mais cadeias de ácido gordo estão ligadas ao amino 2 do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação amida, e compreendendo uma cadeia tetradecanoílo ligada à cadeia alcanoílo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester, e em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao hidróxilo 3 do terminal não redutor da 4 ΡΕ2068918 glucosamina, através de uma ligação ester e incluindo uma cadeia tetradecanoilo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester.
  5. 5. Composição para vacina da reivindicação 1, em que o antigénio compreende pelo menos um antigénio polipeptidico ou pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um antigénio polipeptidico.
  6. 6. Composição para vacina da composição 1, em que o antigénio é derivado de, ou é reactivo com, (i) pelo menos um patógeno infeccioso associado com uma doença infecciosa, (ii) pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com cancro, ou (iii) pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com uma doença autoimune.
  7. 7. Composição para desencadear ou melhorar uma resposta imune especifica para um antigénio, num sujeito, compreendendo a composição (a) um antigénio e (b) um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), em que o antigénio é derivado de, ou é reactivo com, (i) pelo menos um patógeno infeccioso, (ii) pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com cancro, ou (iii) pelo menos um epitopo, biomolécula, célula ou tecido associado com uma doença autoimune, desencadeando ou melhorando, por isso, uma resposta imune desejada especifica para o antigénio, 5 ΡΕ2068918 tendo o GLA a fórmula:
    em que: R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
  8. 8. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 7, compreendendo ainda a composição, pelo menos um componente adicional, seleccionado do grupo que consiste em: (a) um agonista de receptor tipo "toll" (TLR); (b) uma saponina ou um mimético da saponina; (c) um veiculo que compreende pelo menos um entre um óleo e ISCOMATRIX™; (d) um modificador da resposta imune imidazolo; (e) um "double stem loop imune modifier" (dSLIM); (f) um coadjuvante; e (g) um veiculo farmaceuticamente aceitável. 6 ΡΕ2068918
  9. 9. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que: (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em alum, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide da planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina; (ii) O agonista TLR, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em lipopolisacarideo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a de elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C; (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod; (iv) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em uma citoquina, um detergente,e um copolímero em blocos ou polimero biodegradável; e (v) o veiculo farmaceuticamente aceitável, quando presente, compreende um veiculo que é seleccionado do grupo que consiste em fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, um lipossoma e uma micropartícuia. 7 ΡΕ2068918
  10. 10. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o GLA inclui: (i) um esqueleto diqlucosamina possuindo um terminal qlucosamina redutor, liqado a um terminal glucosamina não redutor, através de uma ligação éter entre a posição 1 da hexosamina no terminal glucosamina não redutor e a posição 6 da hexosamina no terminal redutor glucosamina; (ii) um grupo O-fosforilo ligado à posição 4 da hexosamina no terminal não redutor da glucosamina; e (iii) até seis cadeias de acilo gordo; em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao hidróxilo 3 do terminal redutor da glucosamina, através de uma ligação ester, em que uma ou mais cadeias de ácido gordo estão ligadas ao amino 2 do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação amida, e compreendendo uma cadeia tetradecanoilo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester, e em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao hidróxilo 3 do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação ester e incluindo uma cadeia tetradecanoilo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester.
  11. 11. Composição para utilização de acordo com a ΡΕ2068918 reivindicação 7, em que o antigénio compreende pelo menos um antigénio polipeptidico ou pelo menos um construto de expressão recombinante, compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um antigénio polipeptidico.
  12. 12. Composição farmacêutica para utilização na indução ou melhoramento de uma resposta imune, compreendendo: (c) um antigénio; e (d) um adjuvante glucopiranosil lipido (GLA), em que o GLA possui a fórmula:
    em que: R1, R3, R5 e R6 são Cn-C2o alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
  13. 13. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda a 9 ΡΕ2068918 composição, pelo menos um componente adicional, seleccionado do grupo que consiste em: (a) um agonista de receptor tipo "toll" (TLR); (b) uma saponina ou um mimético da saponina; (c) um veiculo que compreende pelo menos um entre um óleo e ISCOMATRIX™; (d) um modificador da resposta imune imidazolo; (e) um "double stem loop imune modifier" (dSLIM); (f) um coadjuvante; e (g) um veículo farmaceuticamente aceitável.
  14. 14. Composição farmacêutica, para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que: (i) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em alum, um alcaloide de uma planta e um detergente, em que o alcaloide da planta é tomatina e o detergente é seleccionado entre saponina, Polysorbate 80, Span 85 e estearil tirosina; (ii) O agonista TLR, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em lipopolisacarideo, peptidoglicano, polyl:C, CpG, 3M003, flagelina, factor 4a de elongação e iniciação ribossomal eucariótica homóloga de Leishmania (LelF) e pelo menos um antigénio da hepatite C; (iii) o modificador de resposta imune imidazoquinolina, quando presente, é seleccionado do grupo 10 ΡΕ2068918 que consiste em resiquimod (R848), imiquimod e gardiquimod; (iv) o co-adjuvante, quando presente, é seleccionado do grupo que consiste em uma citoquina, um detergente,e um copolímero em blocos ou polimero biodegradável; e (v) o veiculo farmaceuticamente aceitável, quando presente, compreende um veiculo que é seleccionado do grupo que consiste em fosfato de cálcio, uma emulsão óleo-em-água, um lipossoma e uma micropartícuia.
  15. 15. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o GLA inclui: (i) um esqueleto diglucosamina possuindo um terminal glucosamina redutor, ligado a um terminal glucosamina não redutor, através de uma ligação éter entre a posição 1 da hexosamina no terminal glucosamina não redutor e a posição 6 da hexosamina no terminal redutor glucosamina; (ii) um grupo O-fosforilo ligado à posição 4 da hexosamina no terminal não redutor da glucosamina; e (iii) até seis cadeias de acilo gordo; em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao hidróxilo 3 do terminal redutor da glucosamina, através de uma ligação ester, 11 ΡΕ2068918 em que uma ou mais cadeias de ácido gordo estão ligadas ao amino 2 do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação amida, e compreendendo uma cadeia tetradecanoílo ligada à cadeia alcanoílo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester, e em que uma ou mais cadeias de acilo gordo estão ligadas ao hidróxilo 3 do terminal não redutor da glucosamina, através de uma ligação ester e incluindo uma cadeia tetradecanoílo ligada à cadeia alcanoilo, com mais de 12 átomos de carbono, através de uma ligação ester.
  16. 16. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 12, para utilização na estimulação de uma resposta imune não especifica, num sujeito.
  17. 17. Um "kit", compreendendo: (a) um veiculo ou uma composição glucopiranosil lípido (GLA): excipiente farmaceuticamente aceitável; e e (b) um antigénio, num segundo recipiente, em que a composição imunológica não está em contacto com o antigénio e em que o GLA possui a fórmula: ΡΕ2068918
    em que: R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquilo; e R2 e R4 são C12-C20 alquilo, ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado.
  18. 18. Composição para vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, ou o "kit" da reivindicação 17, em que o GLA tem R1, R3, R5 e R6 igual a undecilo e R2 e R4 igual a tridecilo. Lisboa, 31 de Julho de 2012
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