PL208755B1 - Kompozycja immunogenna oraz zastosowanie połączenia saponiny, oligonukleotydu immunostymulującego i lipopolisacharydu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna oraz zastosowanie połączenia saponiny, oligonukleotydu immunostymulującego i lipopolisacharydu do wytwarzania leku.

Kompozycja jest nowym preparatem zawierającym połączenie antygenu nowotworowego lub jego pochodnej i złożonej kompozycji adiuwantowej zawierającej oligonukleotyd immunostymulujący i saponinę .

Antygenem jest korzystnie pochodna Her-2/neu lub antygen prostaty, a zatem preparaty według wynalazku są użyteczne w leczeniu i profilaktyce ludzi eksprymujących takie antygeny.

Kompozycja adiuwantowa dodatkowo zawiera lipopolisacharyd.

Pomimo znacznego zaangażowania środków pieniężnych i ludzi, rak pozostaje jedną z głównych przyczyn śmierci. Przykładowo, rak jest wiodącą przyczyną śmierci kobiet pomiędzy 35 a 74 rokiem życia. Rak sutka jest najczęstszym nowotworem u kobiet i częstość zapadalności na raka sutka wzrasta. Szacuje się, że u jednej na dziewięć kobiet zostanie zdiagnozowana ta choroba. Typowe podejścia w leczeniu raka sutka skupiały się na połączeniu operacji chirurgicznej, naświetlań i chemioterapii. Podejścia te prowadziły do pewnych zdecydowanych sukcesów w przypadku niektórych nowotworów. Jednakże rak sutka jest najczęściej nieuleczalny, gdy zostanie zdiagnozowany po pewnym stadium rozwoju. Potrzebne są alternatywne podejścia w stosunku do wczesnego diagnozowania i terapii.

Immunostymulujące oligonukleotydy zawierające niemetylowane dinukleotydy CpG („CpG”) są znanymi adiuwantami przy podawaniu drogą ogólnoustrojową i dośluzówkową (WO 96/02555, EP 468520, Davis i in., J. Immunol, 1998, 160 (2): 870-876; McCluskie i Davis, J. Immunol., 1998, 161 (9): 4463-6). CpG jest skrótem odpowiadającym motywom dinukleotydów cytozyna-guanina obecnych w DNA.

W przeszłości stwierdzono, że frakcja DNA BCG może wywierać działanie przeciwnowotworowe. W dalszych badaniach wykazano, że syntetyczne oligonukleotydy pochodzące z sekwencji genu BCG są zdolne do wywoływania efektów immunostymulujących (zarówno in vitro i in vivo). Autorzy tych badań wywnioskowali, że aktywność tę wykazują pewne sekwencje palindromiczne zawierające centralny motyw CG. Centralna rola motywu CG w immunostymulacji została później wyjaśniona w publikacji Krieg, Nature 374, str. 546, 1995.

Szczegółowa analiza wykazała, że motyw CG powinien być w pewnym kontekście sekwencji, oraz że takie sekwencje są powszechne w DNA bakteryjnym, ale rzadkie w DNA kręgowców.

Sekwencją immunostymulującą jest często: Puryna, Puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna; przy czym motyw dinukleotydu CG jest niemetylowany, ale inne niemetylowane sekwencje CpG są także znane z działania immunostymulującego i mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem.

W pewnych połączeniach sześciu nukleotydów obecna jest sekwencja palindromiczna. Niektóre z tych motywów albo jako powtórzenia jednego motywu, albo połączenia róż nych motywów, mogą być obecne w jednym oligonukleotydzie.

Obecność jednego lub większej liczby oligonukleotydów zawierających tę sekwencję immunostymulującą może aktywować różne podzbiory immunologiczne, włącznie z komórkami NK (które wytwarzają interferon γ i wykazują działanie cytolityczne) oraz makrofagami (Wooldrige i in., tom 89 (nr 8), 1977). Jednakże, obecnie wykazano, że inne sekwencje zawierające niemetylowany CpG, nie zawierające tej sekwencji konsensusowej, są immunomodulujące.

CpG formułowane w szczepionki ogólnie podaje się w wolnym roztworze razem z wolnym antygenem (WO 96/02555; McCluskie i Davis, jak wyżej) lub kowalencyjnie sprzęgnięte z antygenem (publikacja PCT nr WO 98/16247) albo formułowane z nośnikiem, takim jak wodorotlenek glinu ((antygen powierzchniowy zapalenia wątroby) Davis i in., jak wyżej; Brazolot-Millan i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95 (26), 15553-8).

Połączenia adiuwantowe, które można stosować zgodnie z wynalazkiem obejmują w korzystnych postaciach, co najmniej jeden adiuwant pochodzący z lipopolisacharydu pałeczek jelitowych.

Od dawna wiadomo, że lipopolisacharyd (LPS) pałeczek jelitowych jest silnym stymulatorem układu immunologicznego, jednakże jego zastosowanie w adiuwantach było ograniczone przez efekty toksyczne.

Nietoksyczna pochodna LPS, monofosforylolipid A (MPL), wytwarzany przez usunięcie rdzeniowej grupy węglowodanowej i fosforanu z redukującego końca glikozaminy, została opisana przez

PL 208 755 B1

Ribi i in. (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p 407-419) i ma następującą strukturę:

Kolejna detoksykowana wersja MPL jest wynikiem usunięcia łańcucha acylowego z pozycji 3 szkieletu disacharydowego i została nazywana 3-O-Deacylowanym monofosforylolipidem A (3D-MPL). Można ją oczyszczać i wytwarzać sposobem opisanym w GB 2122204B, gdzie ujawniono także wytwarzanie difosforylolipidu A i jego wariantów 3-O-deacylowanych. Korzystną postacią 3D-MPL jest postać emulsji o niewielkim rozmiarze cząstek, o średnicy poniżej 0,2 μm, przy czym taki sposób wytwarzania ujawniono w WO 94/21292. Wodne preparaty zawierające monofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny opisano w WO 98/43670A2.

Adiuwanty pochodzące z bakteryjnych lipopolisacharydów do formułowania w połączeniach adiuwantowych można oczyszczać i poddawać obróbce ze źródeł bakteryjnych albo też mogą one być syntetyczne. Przykładowo, oczyszczony monofosforylolipid A opisano w Ribi i in., 1986 (jak wyżej), oraz 3-O-Deacylowany monofosforylo- lub difosforylolipid A pochodzący z Salmonella sp. opisano w GB 2220211 i US 4912094. Opisano inne oczyszczone i syntetyczne lipopolisacharydy (WO 98/01139; US 6005099 i EP 0729473B1; Hilgers i in., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79 (4): 392-6; Hilgers i in., 1987, Immunology, 60 (1): 141-6 oraz EP 0549074B1). Szczególnie korzystnymi adiuwantami z lipopolisacharydów bakteryjnych są 3D-MPL i disacharydy β(1-6) glukozaminy opisane w US 6005099 i EP 0729473B1.

W związku z tym, pochodne LPS, które można stosować zgodnie z wynalazkiem są tymi immunostymulatorami, które mają strukturę podobną do LPS lub MPL lub 3D-MPL. W innej postaci pochodną LPS może być acylowany monosacharyd, który jest częścią składową powyższej struktury

MPL.

Korzystny adiuwant disacharydowy jest oczyszczonym lub syntetycznym lipidem A o poniższym wzorze:

PL 208 755 B1 w którym R² oznacza H lub PO₃H₂; R³ oznacza łańcuch acylowy lub grupę β-hydroksymirystoilową lub 3-acyloksyacylową o wzorze:

ę=o

CH, i ²

CH-O_X (CHA ch₃ w którym o

A ¹¹

R = —c-(cą)—ch₃ gdzie x i y oznaczają wartości od 0 do około 20. Połączenia adiuwantów 3D-MPL i saponinowych pochodzących z kory Quillaja Saponaria Molina opisano w EP 0761231B. W WO 95/17210 ujawniono układ emulsyjny adiuwantów oparty na skwalenie, α-tokoferolu i monooleinianie polioksyetylenosorbitanu (TWEEN80), formułowanych z immunostymulantem QS21, ewentualnie wraz z 3D-MPL.

Saponiny są znane jako adiuwanty w szczepionkach do podawania ogólnoustrojowego. Adiuwantową i hemolityczną aktywność poszczególnych saponin dokładnie zbadano (Lacaille-Dubois i Wagner, jak wyżej). Przykładowo, Quil A (pochodząca z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) oraz jej frakcje ujawniono w US 5057540 i „Saponins as vaccine adiuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55 oraz EP 0362279 B1.

Struktury w postaci cząstek, nazywane immunologicznymi kompleksami stymulującymi (ISCOMS), zawierające frakcje Quil A mają działanie hemolityczne i zostały zastosowane do wytwarzania szczepionek (Morein, B., EP 0109942B1). Podano, że struktury te mają aktywność adiuwantową (EP 0109942B1; WO 96/11711).

Hemolityczne saponiny QS21 i QS17 (oczyszczone metodą HPLC frakcje Quil A) opisano jako silne adiuwanty ogólnoustrojowe, przy czym sposób ich wytwarzania ujawniono w opisach patentowych US 5057540 i EP 0362279 B1. W tych pozycjach literaturowych opisano także zastosowanie QS7 (niehemolitycznej frakcji Quil-A), która działa jako silny adiuwant szczepionek ogólnoustrojowych. Zastosowanie QS21 dalej opisano w Kensil i in., (1991, J. Immunology, tom 146, 431-437). Połączenia QS21 i polisorbatu lub cyklodekstryny są także znane (WO 99/10008). Układy adiuwantowe składające się z cząstek i zawierające frakcje Quil A, takie jak QS21 i QS7, opisano w WO 96/33739 i WO 96/11711.

Inne saponiny, które stosowano w badaniach ze szczepieniem ogólnoustrojowym, obejmują te pochodzące z innych gatunków roślin, takich jak Gypsophila i Saponaria (Bomford i in., Vaccine, 10 (9): 572-577, 1992).

Wiadomo także, że saponiny stosowano w badaniach szczepionek podawanych dośluzówkowo, które zapewniały zmienną skuteczność w indukcji odpowiedzi immunologicznych. Poprzednio wykazano, że saponina Quil-A nie wpływa na indukcję odpowiedzi immunologicznej, gdy antygen podaje się donosowo (Gizurarson i in., 1994, Vaccine Research 3, 23-29). Jednakże in. autorzy stosowali ten adiuwant z powodzeniem (Maharaj i in., Can. J. Microbiol, 1986, 32 (5): 414-20; Chavali i Campbell, Immunobiology, 174 (3): 347-59). ISCOM zawierające saponinę Quil A stosowano w preparatach szczepionek do podawania dożołądkowego i donosowego i wykazywały one aktywność adiuwantową (McI Mowat i in., 1991, Immunology, 72,317-322; McI Mowat i Donachie, Immunology Today, 12, 383-385).

QS21, nietoksyczną frakcję Quil A, także opisano jako adiuwant doustny lub donosowy (Sumino i in., J. Virol., 1998, 72(6): 4931-9; WO 98/56415).

Saponiny opisano w: Lacaille-Dubois, M i Wagner H. (1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine tom 2 str. 363-386). Saponiny są glikozydami steroidowymi lub triterpenowymi powszechnymi w królestwach roślin i zwierząt morskich. Opisano, że saponiny tworzą koloidalne roztwory w wodzie, które pienią się pod wpływem wytrząsania i wytrącają cholesterol. Gdy saponiny znajdą się w pobliżu błon komórkowych tworzą w błonie struktury podobne do porów, które powodują rozerwanie błony. Hemoliza erytrocytów jest przykładem tego zjawiska, który stanowi właściwość pewnych, ale nie wszystkich, saponin.

PL 208 755 B1

Wynalazek jest oparty na zaskakującym ustaleniu, że połączenia immunostymulujących oligonukleotydów (CpG) i saponin oraz ewentualnie lipopolisacharydów są wyjątkowo skutecznymi adiuwantami.

Wynalazek dotyczy kompozycji immunogennej, charakteryzującej się tym, że zawiera antygen nowotworowy wybrany z grupy:

(i) antygenu z rodziny białka MAGE sprzężonego z heterologicznym partnerem fuzyjnym, (ii) P501S, (iii) Cripto i (iv) pochodnych antygenu Her-2/neu pozbawionych zasadniczej części domeny transbłonowej Her-2/neu;

oraz kompozycję adiuwantową zawierającą saponinę, oligonukleotyd immunostymulujący i lipopolisacharyd wybrany z grupy:

(a) monofosforylolipidu A, (b) 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i (c) disfosforylolipidu A.

Korzystnie kompozycja jako saponinę zawiera QS21.

Korzystna jest kompozycja według wynalazku, w której oligonukleotyd immunostymulujący zawiera co najmniej dwa motywy CpG.

Szczególnie korzystna jest kompozycja według wynalazku, w której oligonukleotyd immunostymulujący jest wybrany z grupy:

SEQ ID NO: 1 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

SEQ ID NO: 2 - TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

SEQ ID NO: 3 - ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC AAC ACG

SEQ ID NO: 4 - TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

SEQ ID NO: 5 - TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668).

Korzystna jest kompozycja według wynalazku, w której saponina jest sformułowana w postać ISCOMS lub liposomów.

Korzystna jest również kompozycja według wynalazku, w której saponina jest obecna w emulsji typu olej w wodzie.

Korzystna jest kompozycja według wynalazku, która zawiera zasadniczo całą domenę zewnątrzkomórkową Her-2/neu.

Korzystna jest kompozycja według wynalazku, w której cząsteczka Her-2/neu jest pozbawiona funkcjonalnej domeny transbłonowej.

Korzystna kompozycja według wynalazku, która dodatkowo zawiera domenę fosforylacji Her-2/neu.

Wynalazek dotyczy również zastosowania połączenia saponiny, oligonukleotydu immunostymulującego i lipopolisacharydu wybranego z grupy:

(a) monofosforylolipidu A, (b) 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i (c) disfosforylolipidu A;

oraz antygenu nowotworowego wybranego z grupy:

(i) antygenu z rodziny białka MAGE sprzężonego z heterologicznym partnerem fuzyjnym, (ii) P501S, (iii) Cripto i (iv) pochodnych antygenu Her-2/neu pozbawionych zasadniczej części domeny transbłonowej Her-2/neu;

do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworów.

W kompozycji wedł ug wynalazku wykorzystuje się połączenie szczepionkowe zawierają ce połączenie saponiny i immunostymulującego oligonukleotydu oraz lipopolisacharydu z antygenem nowotworowym lub jego pochodną. Preparat adiuwantowy może zawierać saponinę, korzystnie QS21, oligonukleotyd immunostymulujący i 3D-MPL.

Szczepionka według wynalazku może ponadto zawierać nośnik. Oligonukleotydy w kompozycjach adiuwantowych i szczepionkowych mogą działać synergistycznie z połączeniem saponina/lipolisacharyd, w indukcji odpowiedzi immunologicznych specyficznych względem antygenu prowadzących do wzmożonej regresji nowotworu. Preparaty są zdolne do wywoływania odpowiedzi immunologicznych zazwyczaj związanych z układem immunologicznym typu Th1. Zatem, połączenia

PL 208 755 B1 adiuwantowe są nie tylko odpowiednie do immunoprofilaktyki chorób, ale także do immunoterapii takich chorób jak rak.

Preparaty zawierają antygen przeciwnowotworowy i są użyteczne do immunoterapeutycznego leczenia nowotworów. Przykładowo preparat adiuwantowy znajduje zastosowanie z antygenami odrzucania nowotworu, takiego jak rak prostaty, sutka, jelita grubego, płuc, trzustki, nerek lub czerniaka. Przykładowe antygeny obejmują MAGE 1, 3 i MAGE 4 lub inne antygeny MAGE, takie jak ujawniono w WO99/40188, PRAME, BAGE, LAGE (również znane jako NY Eos 1) SAGE i HAGE (WO 99/53061) lub GAGE (Robbins i Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, str. 628-636; Van den Eynde i in., International Journal of Clinical & Laboratory Research (złożony 1997); Correale i in., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, str. 293. Faktycznie, te antygeny ulegają ekspresji w szerokim zakresie typów nowotworów, takich jak czerniak, rak pł uca, mię sak lub rak pę cherza moczowego.

Antygeny MAGE do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą być eksprymowane jako białko fuzyjne ze wzmacniaczem ekspresji lub immunologicznym partnerem fuzyjnym. W jednej postaci wynalazku, pochodna jest białkiem fuzyjnym zawierającym antygen z rodziny białka MAGE sprzężony z heterologicznym partnerem, korzystnie MAGE 3. Biał ka mogą być chemicznie sprzężone, ale korzystnie są eksprymowane jako zrekombinowane białka fuzyjne umożliwiające wytwarzanie w układzie ekspresyjnym wyższych poziomów w porównaniu z niesfuzowanym białkiem. Zatem partner fuzyjny może pomagać w dostarczaniu epitopów T pomocniczych (immunologiczny partner fuzyjny), korzystnie epitopów T pomocniczych rozpoznawanych przez ludzi lub pomagać w ekspresji białka (wzmacniacz ekspresji) z większą wydajnością w porównaniu z natywnym zrekombinowanym białkiem.

Korzystnie, partner fuzyjny będzie immunologicznym partnerem fuzyjnym i partnerem wzmacniającym ekspresję.

W korzystnej postaci wynalazku immunologiczny partner fuzyjny pochodzi z białka D, białka powierzchniowego bakterii Gram-ujemnej, Haemophilus influenza B (WO91/18926).

Korzystnie, pochodna białka D zawiera około pierwszą 1/3 część białka, w szczególności około 100-110 pierwszych N-końcowych aminokwasów.

Korzystnie, pochodna białka D jest lipidowana.

Korzystnie, pierwsze 109 reszt partnera fuzyjnego lipoproteiny D jest zawartych na N-końcu, aby dostarczyć antygenowi będącemu kandydatem na szczepionkę dodatkowych egzogennych epitopów komórek T i zwiększyć poziom ekspresji w E. coli (tym samym działających również jako wzmacniacz ekspresji). Ogon lipidowy zapewnia optymalną prezentację antygenu komórce prezentującej antygen.

Inni partnerzy fuzyjni obejmują niestrukturalne białko wirusa grypy, NS1 (hemaglutyninę). Zazwyczaj wykorzystuje się 81 aminokwasów N-końcowych, jednakże można także stosować inne fragmenty pod warunkiem, ze zawierają one epitopy T pomocnicze.

W innej postaci immunologiczny partner fuzyjny jest białkiem znanym jako LYTA. Korzystnie stosuje się C-końcową część cząsteczki. Lyta pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, który syntetyzuje amidazę N-acetylo-L-alaninową, amidazę LYTA {kodowaną przez gen lytA [Gene, 43 (1986) str. 265-272]} autolizynę specyficznie rozkładającą pewne wiązania w szkielecie peptydoglikanu. C-końcowa domena białka LYTA odpowiada za powinowactwo do choliny lub pewnych analogów choliny, takich jak DEAE. Właściwość tę wykorzystano do opracowania plazmidów ekspresyjnych E. coli C-LYTA użytecznych do ekspresji białek fuzyjnych. Oczyszczanie białek hybrydowych zawierających fragment C-LYTA na swoim N-końcu opisano [Biotechnology: 10, (1992) str. 795-798]. Jak tutaj zastosowano, korzystna postać wykorzystuje powtarzającą się część cząsteczki Lyta znajdywaną na C-końcu, rozpoczynając od reszty 178. Szczególnie korzystna postać obejmuje reszty 188-305.

Immunologiczni partnerzy fuzyjni wymienieni powyżej są także korzystni w ułatwianiu ekspresji. W szczególnoś ci takie biał ka fuzyjne są eksprymowane z wię kszą wydajno ś cią niż natywne zrekombinowane białka MAGE. Takie konstrukty ujawniono w WO99/40188.

Inne antygeny specyficzne dla nowotworów są odpowiednie do stosowania z opisanymi adiuwantami i obejmują, ale nie tylko, gangliozydy specyficzne względem nowotworów, takie jak GM2 i GM3 oraz ich koniugaty z białkami nośnikowymi; bądź też wspomniany antygen może być własnym hormonem peptydowym, takim jak pełnej długości hormon uwalniający hormon gonadotropinę (GnRH, WO 95/20600), krótki peptyd o długości 10 aminokwasów, użyteczny w leczeniu wielu nowotworów lub kastracji immunologicznej.

PL 208 755 B1

Można również wykorzystywać inne antygeny prostaty, takie jak antygen specyficzny względem prostaty (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95 (4) 1735-1740 1998), PSMA lub w korzystnej postaci antygen znany jako prostaza.

Prostaza jest specyficzną dla prostaty proteazą serynową (trypsyno-podobną), o 254 aminokwasach, z konserwowaną katalityczną triadą proteazy serynowej H-D-S i N-końcową sekwencją prepropeptydu, wskazującą potencjalną funkcję wydzielniczą (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood i K. Wand, „Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgenregulated serine protease with prostate restricted expression”, w Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Opisano domniemane miejsce glikozylacji. Przewidywana struktura jest bardzo podobna do innych znanych proteaz serynowych, co pokazuje, że dojrzały polipeptyd zwija się do pojedynczej domeny. Dojrzałe białko ma długość 224 aminokwasów, z jednym epitopem A2, co do którego wykazano, że jest naturalnie obrabiany.

Sekwencję nukleotydową prostazy i wydedukowaną sekwencję peptydową oraz homologi ujawniono w Ferguson i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) i międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 98/12302 (a także w odpowiadającym opisie patentowym US 5955306), WO 98/20117 (a także w odpowiadających opisach patentowych US 5840871 i 5786148) (kallikreina specyficzna względem prostaty) i WO 00/04149 (P703P).

Można wytwarzać preparaty zawierające fuzję białka prostazy opartą na białku prostazy i jego fragmentach lub homologach („pochodnych”). Takie pochodne są odpowiednie do stosowania w preparatach szczepionek terapeutycznych, które są odpowiednie do leczenia nowotworów prostaty. Zazwyczaj fragment zawiera co najmniej 20, korzystnie 50, a najkorzystniej 100 sąsiadujących aminokwasów, jak ujawniono w powyżej cytowanych opisach patentowych i zgłoszeniach patentowych.

W jednej postaci dostarcza się zmutowany antygen prostazy, w którym mutacja występuje w miejscu aktywnym białka. Pochodna antygenu prostazy lub jej fragmenty i homologi niosą mutację w miejscu aktywnym białka, aby zasadniczo zmniejszyć lub korzystnie wyeliminować aktywność biologiczną prostazy. Korzystne mutacje obejmują zastąpienie katalitycznych reszt histydyny i asparaginianu proteazy serynowej. W korzystnej postaci, prostaza zawiera mutację histydyna-alanina w miejscu aktywnym, np. w reszcie 71 sekwencji prostazy (Ferguson, i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119). Odpowiednio, uwzględnia się odpowiadające mutacje w białkach homologicznych, np. jak ujawniono w WO 00/041949. Przykładowo mutacja ta odpowiada pozycji 43 w P703P. Mutacja ta może prowadzić do istotnego zmniejszenia wydajności katalitycznej (wyrażonej w specyficznej aktywności enzymatycznej) białka.

Korzystnie, katalityczna wydajność jest obniżona o czynnik 10³, korzystniej o czynnik 10⁶. Białko, w którym zaszła mutacja histydyny do alaniny jest tutaj oznaczane jako * (gwiazdka).

W jednej postaci, mutowana lub niemutowana prostaza stanowi część biał ka fuzyjnego, zawierającego związaną z nowotworem prostazę lub jej fragment albo homolog oraz heterologiczne białko lub część białka działającego jako partner fuzyjny. Białko lub partner fuzyjny mogą być chemicznie sprzęgnięte, ale korzystnie są eksprymowane jako zrekombinowane białka fuzyjne w heterologicznym układzie ekspresyjnym.

W korzystnej postaci wynalazku stosuje się biał ko fuzyjne prostazy lub jego fragment albo homologi, sprzężone z immunologicznym partnerem fuzyjnym, który może ułatwiać dostarczanie epitopów T pomocniczych. Zatem, partner fuzyjny może działać przez towarzyszący efekt pomocniczy sprzężony z wydzielaniem sygnałów aktywacji przez dużą liczbę komórek T specyficznych względem obcego białka lub peptydu, tak wzmacniający indukcje odporności na składnik prostazowy w porównaniu z niesfuzowanym białkiem. Korzystnie, partner heterologiczny jest wybrany tak, by był rozpoznawalny przez komórki T u większości ludzi.

W innej postaci można stosować białka prostazy lub jego fragment, lub homolog sprzężony z partnerem fuzyjnym, który dział a jako wzmacniacz ekspresji. Partner fuzyjny moż e pomagać w uł atwianiu ekspresji prostazy w układzie heterologicznym, umożliwiającym produkcję na zwiększonym poziomie w układzie ekspresyjnym w porównaniu z natywnym zrekombinowanym białkiem.

Korzystnie, partner fuzyjny jest zarówno immunologicznym partnerem fuzyjnym, jak i partnerem wzmacniaczem ekspresji. Tak więc, przydatne są białka fuzyjne zawierające zmutowaną prostazę specyficzną dla nowotworu lub jej fragment, sprzężony z partnerem fuzyjnym.

Korzystnie, partner fuzyjny działa zarówno jako immunologiczny partner fuzyjny, jak i partner wzmacniacz ekspresji. Zatem, w korzystnej postaci partner fuzyjny jest niestrukturalnym białkiem z wirusa grypy, NS1 (hemaglutynina) lub jego fragmentem. Zazwyczaj stosuje się 81 N-końcowych ami8

PL 208 755 B1 nokwasów, jednakże można stosować także inne fragmenty, pod warunkiem, że zawierają one epitopy T pomocnicze (C. Hackett, D. Horowitz, M. Wysocka i S. Dillon, 1992, J. Gen. Virology, 73, 1339-1343). Gdy NS1 jest immunologicznym partnerem fuzyjnym, jego dodatkową zaletę stanowi to, że umożliwia on osiągnięcie wyższej wydajności ekspresji. W szczególności, takie fuzje ulegają ekspresji z większą wydajnością niż natywne zrekombinowane białka prostazy.

W najkorzystniejszej postaci, partner fuzyjny zawiera 81 N-końcowych aminokwasów niestrukturalnego białka NS1 sfuzowane z 5 do 226 C-końcowymi aminokwasami. Alternatywne wzory ekspresji obejmują np. białko D i jego fragmenty oraz C-Lyta stosowane w kontekście antygenów MAGE.

Kolejny korzystny antygen prostazy jest znany jako P501S, SEQ ID NO 113 z W098/37814. Jego immunogenne fragmenty i części zawierające co najmniej 20, korzystnie 50, korzystniej 100 sąsiadujących aminokwasów ujawniono w wyżej wymienionym zgłoszeniu patentowym, patrz np. PS108 (WO 98/50567).

Inne specyficzne antygeny prostazy są znane z WO 98/37418 i WO/004149. Innym jest STEAP, PNAS 96, 14523 145287-12, 1999.

Do innych antygenów związanych z nowotworami, użytecznych w kontekście wynalazku, należą: Plu-1 - J. Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999; HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon i in., Bioessays 199, 21 61-70, opis patentowy US 5654140); Criptin - opis patentowy US 5981215. Dodatkowo, antygeny szczególnie odpowiednie do szczepionek w leczeniu raka obejmują tyrozynazę i surwiwinę.

Peptydy pochodzące od mucyny, takie jak Muc1, opisano np. w US 5744144, US 5827666, WO 8805054, US 4963484. W szczególności bierze się pod uwagę peptydy pochodzące od Muc1, które zawierają co najmniej jedną jednostkę powtarzalną peptydu Muc1, korzystnie co najmniej dwie takie jednostki oraz które są rozpoznawane przez przeciwciało SM3 (US 6054438). Inne peptydy pochodzące z mucyny obejmują peptydy z Muc5.

Wynalazek jest także użyteczny w połączeniu z antygenami raka sutka, takimi jak Her-2/neu, mammaglobina (opis patentowy US 5668267) oraz ujawnionymi w WO/0052165, WO99/33869, WO99/19479, WO 98/45328. Antygeny Her-2/neu ujawniono, między innymi, w opisie patentowym US 5801005. Korzystnie, Her-2/neu zawiera całą domenę zewnątrzkomórkową (obejmującą w przybliżeniu aminokwasy 1-645) lub jej fragmenty oraz co najmniej immunogenną część całej domeny wewnątrzkomórkowej, obejmującej około 580 aminokwasów C-końca. W szczególności wewnątrzkomórkowa część powinna zawierać domenę fosforylacji lub jej fragmenty. Takie konstrukty ujawniono w WO 00/44899. Szczególnie korzystny konstrukt jest znany jako ECD PD, a drugi jest znany jako

ECD ΔPD, patrz WO 00/44899.

Zastosowany tutaj Her-2/neu może pochodzić ze szczura, myszy lub człowieka.

Antygen Her-2/neu może być pełnej długości antygenem Her-2/neu pozbawionym swojej funkcjonalnej domeny transbłonowej lub jej części. Korzystne części zawierają domenę zewnątrzkomórkową. W korzystniejszej postaci dostarcza się białko fuzyjne zawierające domenę zewnątrzkomórkową sprzężoną z częścią domeny wewnątrzkomórkowej, jak ujawniono w publikacji WO 00/44899.

Wynalazek dotyczy preparatów zdolnych do modulowania, korzystnie wywoływania lub wzmacniania, odporności przeciw białkowemu produktowi ekspresji onkogenu Her-2/neu, włącznie z nowotworami zwierząt stałocieplnych, gdzie zamplifikowany gen Her-2/neu ze złośliwością nie wymaga obecności białkowego produktu ekspresji genu na nowotworze. Przykładowo, nadekspresja genu może być związana z inicjacją lub wczesnymi etapami tworzenia nowotworu, a ekspresja białka może być w konsekwencji obniżona lub nieobecna. Preparaty te można stosować do wywoływania lub wzmocnienia skutecznej odpowiedzi immunologicznej zmieniającej nowotwór Her-2/neu dodatni w Her-2/neu ujemny, oprócz zapobiegania rozwojowi nowotworów Her-2/neu dodatnich i wywoływania regresji istniejących nowotworów Her-2/neu dodatnich.

W opisie stosowano następujące skróty: „ECD” oznacza domenę zewnątrzkomórkową, „ICD” oznacza domenę wewnątrzkomórkową, „PD” oznacza domenę fosforylacji (czyli domenę, która jest fosforylowana), która występuje w domenie wewnątrzkomórkowej, ,^PD” oznacza fragment domeny fosforylacji, który występuje w obrębie domeny fosforylacji, a „KD” oznacza domenę kinazową która występuje w obrębie domeny wewnątrzkomórkowej. Produkt ekspresji genu Her-2/neu jest oznaczony tutaj jako „białko Her-2/neu”, także znany i nazywany jako „p185” lub „c-erbB2”.

„Białko fuzyjne Her-2/neu ECD-ICD”, nazywane tutaj także „ECD-ICD” lub „białko fuzyjne ECD-ICD” oznacza białko fuzyjne (lub jego fragmenty) zawierające domenę zewnątrzkomórkową (lub jej fragmenty) oraz domenę wewnątrzkomórkową (lub jej fragmenty) białka Her-2/neu. Stanowią one

PL 208 755 B1 korzystne antygeny do stosowania w kontekście wynalazku. Stosowane tu określenie białko fuzyjne ECD-ICD nie zawiera zasadniczej części domeny transbłonowej Her-2/neu, a korzystnie nie zawiera wcale domeny transbłonowej Her-2/neu.

Określenia „białko fuzyjne Her-2/neu ECD-ICD” i „białko fuzyjne Her-2/neu ECD-PD” oraz określenia do nich pokrewne, także należy rozumieć jako dotyczące ich fragmentów, homologów oraz ich funkcjonalnych odpowiedników (łącznie nazywanych „wariantami”), takie jak te, w których jeden lub większa liczba aminokwasów, które w korzystnych postaciach wynalazku:

(i) zwiększają wywoływanie lub wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z białkiem Her-2/neu lub (ii) nie wpływają w istotny sposób na wywołanie lub wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z biał kiem Her-2/neu (np. wariant stymuluje odpowiedź przez komórki T pomocnicze lub T cytotoksyczne albo stymuluje wytwarzanie przeciwciał ).

Konkretne, nieograniczające przykłady wariantów obejmujących przykładowe fragmenty, homologi i funkcjonalne odpowiedniki białka fuzyjnego Her-2/neu ECD-ICD i białka fuzyjnego Her-2/neu ECD-PD opisano tutaj bardziej szczegółowo. Warianty mogą być „zasadniczo identyczne” lub „zasadniczo podobne” do białka fuzyjnego zawierającego składniki natywnego polipeptydu i zachowują zdolność do pobudzania odpowiedzi immunologicznej.

Her-2/neu PD ma długość 268 aminokwasów, jest białkiem wewnątrzkomórkowym i może być fosforylowane przez białkowe kinazy tyrozynowe. Obszar nie dzieli identyczności z odpowiadającą mu częścią innych receptorów kinazy tyrozynowej. W związku z tym, specyficzność i unikatowość tej domeny czyni ją szczególnie korzystną do stosowania jako szczepionkę przeciwnowotworową. Jednakże, ekspresja samej tej domeny w komórkach bakteryjnych i ssaczych jest problematyczna. Przykładowo powstałe białko PD jest bardzo labilne i nie jest odpowiednie do produkcji na dużą skalę. Zatem, w jednej postaci wykorzystuje się fuzję zawierającą pełnej długości domenę wewnątrzkomórkową lub jej część lub domenę fosforylacji oraz pełnej długości domenę zewnątrzkomórkową Her-2/neu lub jej część. Białka fuzyjne ECD-ICD i białka fuzyjne ECD-PD są rozpuszczalne, wydzielane i stabilne w pożywkach hodowlanych.

Szczepionki według wynalazku będą użyteczne przeciw dowolnemu nowotworowi charakteryzującemu się ekspresją antygenu związanego z nowotworem, taką jak ekspresja Her-2/neu. Dodatkowo poza umożliwieniem zwiększonej ekspresji domeny wewnątrzkomórkowej lub domeny fosforylacji lub ich wariantów, jako białka fuzyjnego z domeną zewnątrzkomórkową lub jej wariantami, białka fuzyjne ECD-ICD i ECD-PD dostarczają ulepszony preparat szczepionki.

Zgodnie z tym, wynalazek dostarcza preparat szczepionki zawierający kompozycję adiuwantową, który to adiuwant obejmuje saponinę i oligonukleotyd immunostymulujący oraz antygen Her-2/neu pozbawiony swojej domeny transbłonowej. Cząsteczka Her-2/neu może być szczurza, mysia lub ludzka albo może być ich hybrydą.

Korzystnie, cząsteczka Her-2/neu zawiera zasadniczo całą swoją domenę zewnątrzkomórkową. Określenie „zasadniczo całą” oznacza, że nie więcej niż 100 aminokwasów zostało wydeletowanych z domeny zewnątrzkomórkowej, korzystniej mniej niż 75, korzystniej mniej niż 50 aminokwasów.

Korzystne, obecna jest cała struktura domeny zewnątrzkomórkowej. Domena zewnątrzkomórkowa w konstrukcie ludzkiego Her-2/neu zawiera korzystnie zasadniczo wszystkie 600 N-końcowych aminokwasów, korzystniej 630 N-końcowych aminokwasów, korzystniej około 650 N-końcowych aminokwasów. Ludzka ICD rozciąga się od aminokwasu 676 do Val 1255. Domena fosforylacji jest umiejscowiona w N-końcowej części ICD.

Korzystne jest, aby konstrukty stosowane zgodnie z wynalazkiem zawierały domenę fosforylacji, ale nie zawierały funkcjonalnej domeny transbłonowej.

Korzystnie, domena transbłonowa jest całkowicie wydeletowana.

Konstrukty, które są szczególnie odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem ujawniono w WO/0044899.

W korzystnej postaci antygen Her-2/neu formuł uje się z 3D-MPC, QS21 i oligonukleotydem CpG, razem z nośnikiem liposomowym lub emulsją typu olej w wodzie. Takie preparaty wywołują zarówno odpowiedź humoralną, jak i pośredniczoną komórkowo. W porównaniu z preparatami adiuwantowymi, zawierającymi tylko QS21 i 3D-MPL, preparat według wynalazku wywoływał u myszy korzystnie silniejszą odpowiedź TH1. Preparaty zawierające tylko CpG nie wytwarzały istotnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej komórkowo.

PL 208 755 B1

Preparaty mogą zawierać antygeny związane z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory (np. z angiogenezą, naciekaniem przez nowotwór), np. tie 2, VEGF.

Korzystne oligonukleotydy do stosowania w adiuwantach lub szczepionkach według wynalazku korzystnie zawierają dwa lub większą liczbę motywów dinukleotydów CpG rozdzielonych co najmniej trzema, korzystniej co najmniej sześcioma lub większą liczbą nukleotydów. Oligonukleotydy według wynalazku są zazwyczaj deoksynukleotydami. W korzystnej postaci wiązanie międzynukleotydowe w oligonukleotydzie jest wią zaniem fosforoditianowym, korzystniej wią zaniem fosforotianowym, z tym, że wiązania fosfodiestrowe i inne wiązania międzynukleotydowe są objęte zakresem wynalazku, włącznie z oligonukleotydami z mieszanymi wiązaniami międzynukleotydowymi. Sposoby wytwarzania oligonukleotydów fosforotianowych lub fosforoditianowych opisano w US 5666153, US 5278302 i WO95/26204.

Przykładowe korzystne oligonukleotydy mają następujące sekwencje. Sekwencje korzystnie zawierają zmodyfikowane fosforotianowe wiązania międzynukleotydowe.

OLIGO 1 (SEQ ID NO: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID NO: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID NO: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID NO: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Alternatywne oligonukleotydy CpG mogą obejmować powyższe korzystne sekwencje zawierające nieistotne delecje lub addycje. Oligonukleotydy CpG stosowane zgodnie z wynalazkiem można syntetyzować dowolną znaną metodą (np. EP 468520). Dogodnie, takie oligonukleotydy można syntetyzować z użyciem automatycznego syntezatora. Ich długość zazwyczaj wynosi 10-50 zasad.

Oligonukleotydy stosowane zgodnie z wynalazkiem są zazwyczaj deoksynukleotydami. W korzystnej postaci wiązaniem międzynukleotydowym w oligonukleotydzie jest wiązanie fosforoditianowe, korzystniej wiązanie fosforotianowe, jednakże fosfodiestery są również możliwe do stosowania. Uwzględnia się także oligonukleotydy zawierające różne wiązania międzynukleotydowe, np. mieszane fosforotianowe fosfodiestery. Można stosować inne wiązania międzynukleotydowe, które stabilizują oligonukleotyd.

Saponiny, które można stosować w połączeniach adiuwantowych według wynalazku obejmują pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina, nazywaną Quil A oraz jej frakcje, opisane w US 5057540 oraz „Saponins as vaccine adiuvants”, Kensil, C. R., Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst., 1996, 12 (1-2): 1-55; oraz EP 0362279B1. Szczególnie korzystnymi frakcjami Quil A są QS21, QS7 i QS17.

β-Escyna jest inną korzystną hemolityczną saponiną do stosowania w kompozycjach adiuwantowych według wynalazku. Escynę opisano w Merck Index (12 wydanie: pozycja 3737) jako mieszaninę saponin występujących w nasionach drzewa kasztanowca zwyczajnego, łacińska nazwa: Aesculus hippocastanum. Jak opisano, wyodrębnia się ją przez chromatografię i oczyszczanie (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) oraz na żywicach jonowymiennych (Erbring i in., US 3238190). Frakcje escyny, α i β, oczyszczono i wykazano ich aktywność biologiczną (Yoshikawa M. i in., [Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) sierpień 1996; 44 (8): 1454-1464)). β-Escyna jest także znana jako aescyna.

Inną korzystną saponiną hemolityczną do stosowania zgodnie z wynalazkiem jest digitonina. Digitoninę opisano w Merck Index (12. wydanie, pozycja 3204) jako saponinę pochodzącą z Digitalis purpurea i oczyszczoną według procedury opisanej w Gisvold i in., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; oraz Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621. Jej zastosowanie opisano jako odczynnik kliniczny do oznaczania cholesterolu.

Połączenia adiuwantowe stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą ponadto zawierać nośnik, taki jak saponina lub CpG, lub lipopolisacharyd może być związany z jednostką nośnikową w postaci cząstek, aby wzmocnić adiuwantowość połączenia. Szczególnie korzystne szczepionki do podawania ogólnoustrojowego przykładowo zawierają cząsteczkę nośnika.

CpG stosowany w połączeniach adiuwantowych może występować w wolnym roztworze lub może być skompleksowany z nośnikiem w postaci cząstek, takim jak sole mineralne (przykładowo, ale nie tylko, sole glinu lub wapnia), liposomy, ISCOM, emulsje (typu olej w wodzie, woda w oleju, woda w oleju w wodzie), polimery (takie jak, ale nie tylko, poli(kwas mlekowy), poli(kwas glikolowy), polifosfazyna, poliaminokwas, alginian, chitozan) lub mikrocząstki.

Korzystnie, wspomniane nośniki są kationowe. Szczepionki według wynalazku zawierają ponadto antygen, który może być ewentualnie związany z kompleksem nośnik-CpG lub może nie być

PL 208 755 B1 związany z kompleksem nośnik-CpG. W tym przypadku antygen może być wolną zawiesiną lub związany z osobnym nośnikiem.

Saponiny stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą być oddzielone w postaci miceli lub mogą być w postaci dużych uporządkowanych struktur, takich jak ISCOM (EP 0109942B1) lub liposomy (WO 96/33739), gdy są formułowane z cholesterolem i lipidami albo w postaci emulsji typu olej w wodzie (WO 95/17210). Saponiny mogą być korzystnie związane z solą metalu, taką jak wodorotlenek glinu lub fosforan glinu (WO 98/15287). Alternatywnie, saponina może być związana z nośnikiem w postaci cząstek, takim jak chitozan. Saponina może być także w stanie suchym, takim jak proszek. Końcowe preparaty w postaci do podawania do powierzchni śluzówkowej szczepionego osobnika mają korzystnie charakter hemolityczny. Saponina może być ewentualnie związana fizycznie z antygenem albo przez bezpośrednie wiązanie lub przez współoddziaływanie z tą samą cząsteczką nośnika w postaci cząstek (GB9822712.7; WO 98/16247).

CpG i saponina oraz lipopolisacharyd w adiuwantach lub szczepionkach według wynalazku mogą same być oddzielone lub związane. Przykładowo, CpG i saponina może być w wolnej zawiesinie lub może być związana przez nośnik, korzystniej nośnik w postaci cząstek, takich jak wodorotlenek glinu lub przez kationowy liposom albo ISCOM.

Korzystne połączenie adiuwantowe składa się z jednego lub większej liczby oligonukleotydów CpG zawierających co najmniej 3, korzystniej co najmniej 6 nukleotydów pomiędzy dwoma przyległymi motywami CG razem z QS21 i nośnikiem w postaci cząstek wybranym z grupy obejmującej emulsję typu olej w wodzie lub DQ. Korzystnie, lipopolisacharyd stanowi di- lub monofosforylowana pochodna lipidu, korzystnie 3 de-O acylowana, w szczególności 3 de-O acylowany monofosforylolipid A. Najkorzystniej kompozycja adiuwantowa zawiera CpG 2006 (SEQ ID NO: 4) lub CpG 1758 (SEQ ID NO: 2) lub CpG 1826 (SEQ ID NO: 1), zmieszany z QS21 oraz nośnik w postaci cząstek wybrany z grupy obejmują cej emulsję typu olej w wodzie lub DQ. Zatem szczególnie korzystne szczepionki zawierają przykładowo takie połączenia adiuwantowe i antygen. Korzystna szczepionka według wynalazku jest stosowana do wywoływania ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych po podaniu pacjentowi drogą ogólnoustrojową.

Połączenia adiuwantowe mogą zawierać emulsję na bazie oleju. Adiuwanty w postaci emulsji olejowych są znane od wielu lat, włącznie z pracą nad emulsjami oleju mineralnego kompletnego i niekompletnego adiuwanta Freunda. Od tego czasu wiele prac przeprowadzono w celu zaprojektowania stabilnych i dobrze tolerowanych wariantów w stosunku do tych silnych, ale reaktogennych, preparatów adiuwantowych.

Opisano wiele jedno- lub wielofazowych układów emulsyjnych. Emulsje typu olej w wodzie jako takie zaproponowano jako użyteczne kompozycje adiuwantowe (EP 0399843B), jak również połączenia emulsji typu olej w wodzie i innych środków czynnych opisano jako adiuwanty do szczepionek (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Opisano inne adiuwanty w postaci emulsji olejowych, takie jak emulsje typu woda w oleju (US 5422109; EP 0480982B2) oraz emulsje typu woda w oleju w wodzie (US 5424067; EP 0480981B).

Adiuwanty jako emulsje olejowe do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą być naturalne lub syntetyczne oraz mogą być mineralne lub organiczne. Przykłady olejów mineralnych i organicznych będą oczywiste dla fachowca.

Aby kompozycja typu olej w wodzie była odpowiednia do podawania ludziom, faza olejowa układu emulsyjnego korzystnie zawiera olej ulegający metabolizmowi. Znaczenie określenia ulegający metabolizmowi olej jest dobrze znane. Ulegający metabolizmowi można zdefiniować jako „zdolny do przemiany na drodze metabolizmu” (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25. wydanie (1974)). Olejem może być dowolny olej roślinny, olej rybi, olej zwierzęcy lub olej syntetyczny, który jest nietoksyczny dla biorcy i jest zdolny do przemiany na drodze metabolizmu. Orzechy (a z nich olej arachidowy), nasiona, ziarna są powszechnymi źródłami olejów roślinnych. Oleje syntetyczne także są przydatne i mogą obejmować oleje dostępne w handlu, takie jak NEOBEE^® i inne. Skwalen (2,6,10,15,19,23-heksametylo-2,6,10,14,18,22-tetrakozaheksaen) jest nienasyconym olejem obecnym w dużej ilości w oleju z wątroby rekina oraz w mniejszej ilości w oleju z oliwek, oleju z kiełków pszenicy, oleju z otrębów ryżowych oraz w drożdżach i jest szczególnie korzystnym olejem do stosowania zgodnie z wynalazkiem. Skwalen jest metabolizowalnym olejem z racji tego, że jest związkiem pośrednim w biosyntezie cholesterolu (Merck Index, 10. wydanie, pozycja nr 8619).

Szczególnie korzystnymi emulsjami olejowymi są emulsje typu olej w wodzie, a zwłaszcza emulsje skwalenu w wodzie.

PL 208 755 B1

Ponadto najkorzystniejsze adiuwanty typu emulsji olejowych zawierają przeciwutleniacz, którym jest korzystnie olej α-tokoferolowy (witamina E, EP 0382271B1).

W WO 95/17210 i WO 99/11241 ujawniono adiuwanty w postaci emulsji opartych na skwalenie, α-tokoferolu i TWEEN 80, ewentualnie formułowane z immunostymulatorami QS21 i/lub 3D-MPL. W WO 99/12565 ujawniono ulepszenie tych emulsji skwalenu przez dodanie sterolu do fazy olejowej. Dodatkowo trigliceryd, taki jak trikaprylina (C27H5006), można dodać do fazy olejowej w celu stabilizacji emulsji (WO 98/56414).

Wielkość kropelek oleju obecnych w trwałej emulsji olej w wodzie korzystnie wynosi poniżej 1 μm i może wynosić w zakresie zasadniczo 30-600 nm, korzystnie mieć średnicę zasadniczo około 30-500 nm, a najkorzystniej mieć średnicę zasadniczo 150-500 nm, a zwłaszcza mieć średnicę około 150 nm, co mierzy się metodą spektroskopii korelacji fotonów. W tym aspekcie liczbowo 80% kropel oleju powinno znajdować się w korzystnym zakresie, korzystniej liczbowo ponad 90% i najkorzystniej ponad 95% kropel oleju powinno znajdować się w podanych zakresach wielkości. Ilości składników obecnych w emulsjach olejowych są takie, że dogodnie zawiera ona 2-10% oleju, takiego jak skwalen; oraz, gdy jest on obecny, 2-10% α-tokoferolu i 0,3-3% środka powierzchniowo czynnego, takiego jak monooleinian polioksyetylenosorbitanu.

Korzystnie, stosunek olej:a-tokoferol jest równy 1 lub jest mniejszy, gdyż to zapewnia bardziej trwałą emulsję. Span 85 może być także obecny w ilości około 1%. W niektórych przypadkach korzystne może być, aby szczepionki według wynalazku ponadto zawierały stabilizator.

Sposób wytwarzania emulsji olej w wodzie jest dobrze znany fachowcom. Zwykle ten sposób polega na mieszaniu fazy olejowej ze środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak roztwór PBS/TWEEN80^™, następnie homogenizację za pomocą homogenizatora, przy czym dla fachowca oczywiste będzie, że w celu zhomogenizowania niewielkich objętości cieczy odpowiedni będzie sposób polegający na przepuszczaniu mieszaniny dwukrotnie przez igłę strzykawkową. Z równym powodzeniem fachowiec może przystosować sposób emulgowania w mikrofluidyzatorze (aparat mikrofluidyzujący M110S, maksimum 50 przejść, w ciągu 2 minut przy maksymalnym ciśnieniu na wejściu 0,6 MPa (ciśnienie na wyjściu około 85 MPa), aby wytwarzać mniejszą lub większą objętość emulsji. To przystosowanie można osiągnąć przez rutynowe doświadczenia obejmujące pomiary powstałej emulsji aż do uzyskania preparatu z kroplami oleju o wymaganej średnicy.

Połączenia adiuwantowe można stosować jako adiuwanty zarówno ogólnoustrojowe, jak i dośluzówkowe. W szczególnej postaci wynalazku dostarcza się ogólnoustrojową szczepionkę do podawania drogą ogólnoustrojową lub pozajelitową, taką jak podawanie domięśniowe, śródskórne, przezskórne, podskórne, dootrzewnowe lub dożylne. Korzystna droga podawania jest drogą przezskórną, np. w postaci plastrów na skórę.

Ogólnoustrojowe preparaty szczepionek według wynalazku można stosować do ochrony lub leczenia ssaka podatnego lub cierpiącego na chorobę, przez podawanie tej szczepionki domięśniowe, dootrzewnowe, śródskórne, przezskórne, dożylne lub podskórne. Sposoby ogólnoustrojowego podawania preparatów szczepionki mogą obejmować stosowanie zwykłych strzykawek i igieł lub urządzeń zaprojektowanych do balistycznego podawania stałych szczepionek (WO 99/27961) lub bezigłowego ciśnieniowego urządzenia wtryskującego ciecz (US 4596556; US 5993412) lub plastrów na skórę (WO 97/48440; WO 98/28037). Wynalazek można także stosować do wzmacniania immunogenności antygenów stosowanych na skórę (dostarczanie przezskórne lub przeznaskórkowe WO 98/20734; WO 98/28037). Można także stosować urządzenie dostarczające do podawania ogólnoustrojowego, wstępnie wypełnione kompozycją szczepionki lub adiuwantu. Możliwy jest sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej u pacjenta, polegający na podawaniu pacjentowi szczepionki zawierającej antygen i oligonukleotyd immunostymulujący, saponinę i nośnik, przy czym szczepionkę podaje się drogą pozajelitową lub ogólnoustrojową. Korzystne sposoby indukowania odpowiedzi immunologicznej obejmują podawanie szczepionki przeciw np. pochodnej Her-2/neu, z saponiną pochodzącą z Quil A, taką jak QS21 oraz nośnikiem, takim jak emulsja typu olej w wodzie, liposomy zawierające cholesterol lub ałun.

Alternatywnie, preparaty szczepionki według wynalazku można stosować do ochrony lub leczenia ssaka podatnego lub cierpiącego na chorobę, przez podawanie tej szczepionki drogą dośluzówkową, taką jak droga doustna/pokarmowa lub donosowa. Alternatywnymi drogami dośluzówkowymi są droga dopochwowa i doodbytnicza. Korzystną śluzówkową drogą podawania jest droga donosowa, nazywana szczepieniem donosowym. Sposoby szczepienia donosowego są dobrze znane, włącznie z podawaniem szczepionki w postaci kropelkowej, rozpylonej lub suchego proszku do części nosowej

PL 208 755 B1 gardła szczepionego pacjenta. Preparaty szczepionkowe rozpylone lub w postaci aerozoli także stanowią postać wynalazku. Preparaty dojelitowe, takie jak kapsułki lub granulki odporne na działanie soku żołądkowego do podawania doustnego, czopki do podawania doodbytniczego lub dopochwowego, także stanowią postać wynalazku.

Połączenia adiuwantowe stosowane zgodnie z wynalazkiem reprezentują grupę adiuwantów śluzówkowych odpowiednich do podawania ludziom, aby zastąpić szczepienie ogólnoustrojowe przez szczepienie dośluzówkowe. W korzystnej postaci wynalazku czyste saponiny, takie jak Quil A lub jej pochodną, włącznie z QS21; escyną; digitoniną; lub saponinami Gypsophila lub Chenopodium quinoa w połączeniu z oligonukleotydami immunostymulującymi można stosować jako adiuwanty do podawania śluzówkowego antygenów do osiągnięcia ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej.

Połączenia adiuwantowe stosuje się w formułowaniu szczepionek, które to szczepionki można podawać drogą ogólnoustrojową lub śluzówkową. Korzystnie, gdy szczepionki są stosowane do podawania śluzówkowego, połączenia adiuwantowe zawierają saponinę hemolityczną.

Do podawania śluzówkowego korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera saponinę hemolityczną. Hemolityczną saponinę lub preparat saponiny, w znaczeniu określonym w opisie, należy oznaczyć zgodnie z następującym testem.

1. Świeżą krew świnek morskich przemywa się roztworem soli buforowanym fosforanami (PBS) trzykrotnie w wirówce laboratoryjnej. Po przeprowadzeniu w zawiesinę do początkowej objętości krew rozcieńcza się następnie dziesięciokrotnie PBS.

2. 50 μΐ tej zawiesiny krwi dodaje się do 800 μΐ PBS zawierającego dwukrotne rozcieńczenia środka powierzchniowo czynnego lub saponinę.

3. Po 8 godzinach hemolizę określa się wzrokowo lub przez pomiar gęstości optycznej supernatantu. Obecność czerwonego supernatantu, który absorbuje światło przy 570 nm, oznacza obecność hemolizy.

4. Wyniki wyraża się jako stężenie pierwszego rozcieńczenia saponiny, przy którym nie występuje hemoliza.

Dla celów wynalazku preparat adiuwantowy saponiny jest hemolityczny, gdy liza erytrocytów zachodzi przy stężeniu niższym niż 0,1%. Dla porównania, zasadniczo czyste próbki Quil A, QS21, QS7, digitoniny i β-escyny są wszystkie hemolitycznymi saponinami, co określono w tym teście. Uwzględniając naturalną zmienność doświadczalną takiego testu biologicznego, opisane saponiny korzystnie mają aktywność hemolityczną wynoszącą około 0,5-0,00001%, korzystniej 0,05-0,00001%, jeszcze korzystniej 0,005-0,00001%, a najkorzystniej 0,001-0,0004%. Idealnie wspomniane saponiny powinny mieć aktywność hemolityczną podobną (to znaczy w zakresie dziesięciokrotnej różnicy) z QS21.

Szczepionki według wynalazku można także podawać drogą doustną. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka może także obejmować bufory alkaliczne lub jelitowe kapsułki lub mikrogranulki. Szczepionki według wynalazku można także podawać drogą dopochwową. W takich przypadkach, farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki mogą także zawierać środki emulgujące, takie polimery jak CARBOPOL^® oraz inne znane stabilizatory do dopochwowych kremów i czopków. Szczepionki według wynalazku można także podawać drogą doodbytniczą. W takich przypadkach zaróbki mogą także zawierać woski i polimery znane w dziedzinie wytwarzania czopków doodbytniczych.

Preparaty zawierające więcej niż jedną saponinę w połączeniach adiuwantowych także stanowią postać wynalazku, np. połączenia co najmniej dwóch z poniższej grupy obejmującej QS21, QS7, Quil A, β-escynę lub digitoninę. Dodatkowo, kompozycje według wynalazku mogą zawierać połączenia więcej niż jednego oligonukleotydu immunostymulującego.

Alternatywnie, preparaty można łączyć z nośnikami szczepionek, złożonymi z chitozanu lub innych polimerów polikationowych, cząstek polilaktydu i polilaktydu-co-glikolidu, matrycy polimerowej opartej na poli-N-acetyloglukozaminie, cząstek złożonych z polisacharydów lub chemicznie modyfikowanych polisacharydów, liposomów i cząstek na bazie lipidów, cząstek złożonych z monoestrów glicerylowych, itd. Saponiny można także formułować w obecności cholesterolu z wytworzeniem struktur w postaci cząstek, takich jak liposomy lub ISCOM. Ponadto, saponiny można formułować razem z eterem lub estrem polioksyetylenowym albo w roztworze niezawierającym cząstek, albo w zawiesinie, lub w postaci cząstek o strukturze, takiej jak małowarstwowy liposom lub ISCOM. Saponiny można także formułować z zaróbkami, takimi jak Carbopol^®, aby zwiększyć lepkość, albo można formułować w postaci suchego proszku z proszkową zaróbką, taką jak laktoza.

PL 208 755 B1

Szczególnie korzystnymi adiuwantami są połączenia 3D-MPL i QS21 (EP 0671948B1), emulsje typu olej w wodzie zawierające 3D-MPL i QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) lub 3D-MPL formułowany z innymi nośnikami (EP 0689454B1), w połączeniu z oligonukleotydami CpG, co tutaj opisano.

Ilość CpG lub oligonukleotydów immunostymulujących w adiuwantach lub szczepionkach według wynalazku jest ogólnie niewielka, ale zależnie od preparatu szczepionki może wynosić 1-1000 μg na dawkę, korzystnie 1-500 μg na dawkę, a najkorzystniej 1-100 μg na dawkę.

Ilość saponiny do stosowania w opisanych adiuwantach wynosi 1-1000 μg, korzystnie 1-500 μg na dawkę, korzystniej 1-250 μg na dawkę, a najkorzystniej 1-100 μg na dawkę. Stosunek CpG:saponina (wag.) powinien zatem mieścić się w zakresie od 1:1000 do 1000:1, zazwyczaj powinien mieścić się w zakresie 1:100 do 100:1, korzystniej w zakresie 1:10 do 1:1 lub 1:1 do 10:1, a najkorzystniej 1:1, 4:1 lub 10:1.

Preparaty według wynalazku można stosować zarówno w celach profilaktycznych, jak i leczniczych. Zgodnie z tym, dostarcza się zastosowanie połączenia saponiny, lipopolisacharydu i cząsteczki CpG do wytwarzania szczepionki do profilaktyki i leczenia raka, zwłaszcza raka sutka i prostaty. Możliwy jest zatem sposób leczenia ssaka podatnego lub cierpiącego na chorobę zakaźną lub nowotwór lub alergię lub chorobę autoimmunologiczną. W kolejnej postaci wynalazek dostarcza szczepionkę lub połączenie adiuwantowe, zawierające lipopolisacharyd, saponinę i CpG, jak tutaj opisano, do stosowania jako lek. Wytwarzanie szczepionki ogólnie opisano w New Trends and Developments in Vaccines, red. Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978.

Możliwy jest zatem sposób zapobiegania u osobnika zapadnięcia na chorobę wybraną z grupy obejmującej nowotwory prostaty, sutka, jelita grubego, płuc, trzustki, nerek, jajnika lub czerniak; polegający na podawaniu temu osobnikowi kompozycji zasadniczo tutaj opisanej drogą ogólnoustrojową.

Alternatywnie, wynalazek dostarcza kompozycję szczepionki śluzówkowej zawierającą antygen i hemolityczną saponinę. Możliwy jest zatem sposób leczenia osobnika podatnego na lub cierpiącego na chorobę przez podawanie temu osobnikowi kompozycji zasadniczo tutaj opisanej do powierzchni śluzówkowej.

Możliwy jest także sposób wywoływania u ssaka ogólno-ustrojowej odpowiedzi immunologicznej specyficznej względem antygenu, polegający na podawaniu do powierzchni śluzówkowej wspomnianego ssaka kompozycji zawierającej antygen i hemolityczną saponinę. Ponadto możliwy jest także sposób wytwarzania szczepionki lub adiuwantu, polegający na pobraniu saponiny i pobraniu cząstki CpG i zmieszaniu ich z antygenem.

Przykłady odpowiednich dopuszczalnych farmaceutycznie zaróbek do stosowania w opisanych połączeniach obejmują wodę, roztwór soli buforowany fosforanami i izotoniczne buforowane roztwory.

P r z y k ł a d 1

ECD-PD wytworzono w komórkach CHO zgodnie ze sposobem opisanym w WO 00/44899. Preparaty testowano na myszach i królikach.

Preparaty porównano z kilkoma środkami kontrolnymi.

SBAS1 + SBAS7

ECD-PD formułowano z oligonukleotydem CpG 2006 3D-MPL, QS21 w liposomach.

Preparat SBAS1

Zawierający QS21 w liposomach i 3D-MPL związany z liposomami wytworzono zgodnie z procedurami EP 0822831.

Preparat SBAS1 + SBAS7

Do powyższego preparatu dodano oligonukleotyd CpG 2006. Antygen zmieszano z adiuwantem przed użyciem.

Preparaty oparte na SBAS7 + SBAS2 (mysich)

Do jednej dawki 50 μl szczepionki, białko ECD-PD (25 μg) rozcieńczono w dziesięciokrotnie stężonym PBS pH 6,8 i H2O przed dodaniem następnie emulsji typu olej w wodzie zawierającej SB62, którą przygotowano przez zmieszanie 5% skwalenu, 5% tokoferolu, 2,0% tween 80; rozmiar cząstek wynosił 180 nm.

Wytwarzanie emulsji SB62 (dwukrotne stężenie)

Tween 80 rozpuszczono w roztworze soli buforowanej fosforanami (PBS) do uzyskania 2% roztworu w PBS. Aby uzyskać 100 ml dwukrotnie stężonej emulsji 5 g DL-a-tokoferolu i 5 ml skwalenu zmieszano w aparacie Vortex w celu dokładnego wymieszania. Dodano 90 ml roztworu PBS/Tween i całość dokładnie wymieszano. Następnie powstałą emulsję przepuszczono przez strzykawkę i ostaPL 208 755 B1 tecznie poddano mikrofluidyzacji z użyciem aparatu do mikrofluidyzacji M11OS. Powstałe kropelki oleju miały wielkość około 180 nm. Następnie dodano 3D-MPL (10 μg), QS21 (10 μg), 50 μg CpG ODN 2006, a po 30 minutach dodano 50 μg/ml tiomersalu jako środka konserwującego. Wszystkie inkubacje prowadzono w temperaturze pokojowej w trakcie mieszania.

Preparaty SBAS2 otrzymano w sposób opisany powyżej, ale bez dodatku oligonukleotydu CpG. SBAS7 jest oligonukleotydem CpG 2006.

Preparaty oparte na SBAS7 + SBAS2 (króliczym)

Do jednej dawki 500 μl szczepionki, białko ECD-PD (100 μg) rozcieńczono w dziesięciokrotnie stężonym PBS pH 6,8 i H₂O przed kolejnym dodaniem 250 μl emulsji SB62, 3D-MPL (100 μg), QS21 (100 μg) i 500 μg CpG ODN 2006, a następnie po 30 minutach dodano 50 μg/ml tiomersalu jako środka konserwującego. Wszystkie inkubacje prowadzono w temperaturze pokojowej w trakcie mieszania.

P r z y k ł a d 2. Doświadczenia z prowokacją nowotworową

Grupom myszy F1 (C57 x Balb c) (8 myszy/grupę) wstrzyknięto 1/10 dawki dla ludzi antygenu (25 μg) w dniach 0-14-28-42 i prowokowano dnia 56 komórkami TC1 eksprymującymi Her2 w dawce około 2 x 10 komórek TC1 Her2/zwierzę podskórnie.

Komórki TC1 dla 1/2 śledzion zwierząt pobrano dnia 56 i od zwierząt pobrano krew.

Jak przedstawiono na fig. 1, dodanie oligonukleotydu CpG do preparatu 3D-MPL/QS21 synergistycznie wzmacnia ustępowanie nowotworu i tylko te preparaty doprowadziły do kompletnej regresji nowotworu u myszy.

P r z y k ł a d 3. Immunogenność ECD-PD w różnych adiuwantach u królików

Sześć grup po cztery króliki immunizowano w dniach 0, 21 i 42, odpowiednio 100 μg ECD-PD w AS02, AS01, AS05, AS06 (CpG 2006 adsorbowany na ałunie), AS07 i AS02B + AS07.

Analizę serologiczną wykonano dnia 14 po III dawce i w tabeli 1 wykazano, że preparaty według wynalazku były lepsze od innych badanych preparatów w podnoszeniu wysokiego miana odpowiedzi przeciwciał.

T a b e l a 1

	Przed	14 po III
AS02B	50	96923
AS01B	173	196637
AS5	144	76221
AS6	142	74180
AS07A	480	3904
AS02B + AS07A	94	362713

P r z y k ł a d 4. Immunogenność Her-2/neu, ECD-PD u dorosłych małp rezusów

Dorosłe małpy rezusy immunizowano ECD-PD w różnych preparatach adiuwantowych:

AS02B - QS21, 3D-MPL, emulsja typu olej w wodzie

AS01 - QS21, 3D-MPL w liposomach

AS05 - QS21 w liposomach

AS06 - CpG 2006, ałun

AS07 - CpG 2006

AS02B + AS07 - szczegóły, patrz przykład 1

Szczepienie wywołało wyższą odpowiedź przeciwciał w przypadku preparatów według wynalazku (AS2 + AS07), patrz fig. 1.

Dalsza analiza wykazała, że odpowiedź przeciwciał była poliklonalna i wykazywała aktywność hamowania wzrostu in vitro ludzkiej linii komórkowej raka piersi (SKBR3) nadeksprymującej cząsteczkę Iter 2 neu. Herceptyna, przeciwciało monoklonalne do traktowania nowotworów eksprymujących Her-2/neu, jest także zdolna do hamowania wzrostu tej linii komórkowej.

Zatem stwierdzono, że przeciwciała wytworzone po czynnym zaszczepieniu preparatem były funkcjonalne.

PL 208 755 B1

P r z y k ł a d 5. Immunizacja myszy antygenem ECD-PD

Doświadczenie to zaprojektowano w celu zbadania zbioru preparatów adiuwantowych z antygenem, który jest fuzją domeny zewnątrzkomórkowej Her-2/neu sprzężonej z domeną fosforylacji (ECD-PD), którą wytworzono w komórkach CHO według sposobu opisanego w WO 00/44899.

Grupa	Antygen (25 pg)	Adiuwant
1	ECD-PD	brak (sól buforowana fosforanami (PBS))
2	ECD-PD	liposomy z QS21 i 3D-MPL w błonie
3	ECD-PD	tokol zawierający emulsję typu olej w wodzie z QS21 i 3D-MPL
4	ECD-PD	CpG
5	ECD-PD	liposomy z QS21 i 3D-MPL w błonie + CpG
6	ECD-PD	tokol zawierający emulsję typu olej w wodzie z QS21 i 3D-MPL + CpG
7	ECD-PD	3D-MPL + CpG
8	ECD-PD	QS21 + CpG
9	ECD-PD	tokol zawierający emulsję typu olej w wodzie + CpG
10	ECD-PD	liposomy z QS21 w błonie + CpG
11	ECD-PD	liposomy z 3D-MPL w błonie + CpG
	W emulsjach olej w wodzie zawierających tokol stosowanych w powyższych grupach stosowa-

no D,L,a-tokoferolol (CAS nr 10191-41-0; nazwa chemiczna: (2RS,4'RS,8'RS)-2,5,7,8-tetrametylo-2-(4',8',12'-trimetylotridecylo)-6-chromanol)); dostępny w handlu z ROCHE™. Gdy tokol był obecny w emulsji typu olej w wodzie, stanowił jej 2,5% obj., w połączeniu z 2,5% obj. skwalenu. Obydwa oleje zmieszano, dodano monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (Tween 80™) przed mikrofluidyzacją (aparat mikrofluidyzujący M110S, maksimum 50 przejść, przez okres 2 minut przy maksymalnym ciśnieniu na wejściu 0,6 MPa (ciśnienie na wyjściu około 85 MPa), jak opisano w WO 95/17210). Zgodnie z tym grupy 3, 6 i 9 były oparte na powyższej emulsji tokolu z dodatkiem wodnego QS21, 3D-MPL lub CpG.

QS21 i 3D-MPL, gdy były obecne w którejkolwiek z powyższych grup szczepionek, wprowadzono w ilości 5 μg/dawkę; CpG (OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) dodano w ilości 50 μg/dawkę.

Adiuwanty stosowane dla grup 2, 5, 10 przygotowano w sposób opisany w EP 0822831B1 (którego treść włączono tu przez powołanie). Grupa 11 zawierała 3D-MPL w błonie liposomu. W skrócie, 3D-MPL, dioleoilofosfatydylocholinę i cholesterol zmieszano ze sobą i poddano mikrofluidyzacji do jednowarstewkowych liposomów (jak opisano w EP 0822831B1 - z pominięciem QS21).

Adiuwanty zastosowane w grupach 4, 7 i 8 były w wodnej zawiesinie lub roztworze.

Procedura szczepienia

Grupy myszy B6F1 zaszczepiono czterokrotnie (objętościami po 50 μθ, domięśniowo, z 14-dniowymi przerwami. Czternaście dni po czwartej dawce szczepionki, myszy prowokowano podskórnie 2 x 10⁶ komórek nowotworowych TC1 eksprymujących Her-2/neu.

Linie komórkowe Her-2/neu-TC1 wytworzono przez transdukcję komórek TC1 retrowirusowymi wektorami kodującymi Her-2/neu. Po okresie selekcji blastocydyną, odporne klony wyizolowano i zbadano metodą FACS pod względem ekspresji Her-2/neu. Wybrano klon z najwyższą ekspresją Her-2/neu i dawkę prowokacyjną 2 x 10⁶ zidentyfikowano jako wykazującą podobną kinetykę wzrostu do komórek TC1 typu dzikiego oraz wywołującą rozwój nowotworu u 100% zwierząt kontrolnych. Wielkość poszczególnych nowotworów mierzono dwa razy na tydzień i wyrażano jako średnią z grupy.

Wyniki

Figura 3 przedstawia wyniki wzrostu nowotworu dla grup 1, 2, 4, 5 i 6.

Figura 4 przedstawia wyniki wzrostu nowotworu dla grup 1, 5, 6, 7 i 11.

Figura 5 przedstawia wyniki wzrostu nowotworu dla grup 1, 5, 6, 8, 9 i 10. Jedynymi szczepionkami, które wywołały całkowitą regresje nowotworu były szczepionki zawierające zarówno oligonukleotyd immunostymulujący, jak i saponinę.

Figury 6 i 7 przedstawiają limfoproliferację splenocytów in vitro po inkubacji z 5 μg/ml immunogenu (ECD-PD) lub domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) lub domeny wewnątrzkomórkowej (ICD) Her-2/neu.

PL 208 755 B1

Figury 8 i 9 przedstawiają humoralną odpowiedź na immunogen (ECD-PD) w odniesieniu do całkowitej Ig zmierzonej metodą ELISA (fig. 8) lub rozkład izotypów IgG w tych odpowiedziach (fig. 9).

Wnioski

Po trzech wstrzyknięciach indukcja przeciwciał była:

AS02B + AS07A > AS01B > AS02B = AS06 = AS05 > AS07A Ogólne wnioski

Badane adiuwanty (AS1, AS2, AS7) wywierały podobny wpływ. Jednakże, połączenia AS1 i AS7 lub AS2 i AS7 był y skuteczniejszymi adiuwantami.

CMI wyraźnie wykazano po czterech zaszczepieniach u zwierząt otrzymujących połączony adiuwant na bazie całej cząsteczki ECD-PD, ale także na każdej części osobno (ECD lub ICD).

Preparaty według wynalazku są bardzo skuteczne w wywoływaniu regresji nowotworu.

P r z y k ł a d 6. Immunizacja myszy antygenem P703P

Doświadczenie to zaprojektowano, aby zbadać szereg preparatów adiuwantowych z antygenem w postaci fuzji antygenu Prostazy (Ferguson, i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119)) i N-koń cowego 1-81 fragmentu NS1 z wirusa grypy (P703P-NS1).

Grupa	Antygen (25 pg)	Ad i u want
1	P703P-NS1	brak (sól buforowana fosforanami (PBS))
2	P703P-NS1	CpG
3	P703P-NS1	liposomy z QS21 w błonie + CpG
4	P703P-NS1	liposomy z QS21 i 3D-MPL w błonie + CpG
5	P703P-NS1	emulsja olej w wodzie zawierająca tokol z QS21 i 3D-MPL + CpG
6	P703P-NS1	emulsja olej w wodzie zawierająca tokol + CpG

W emulsjach olej w wodzie zawierają cych tokol stosowanych w powyż szych grupach stosowano D,L,a-tokoferolol (CAS nr 10191-41-0; nazwa chemiczna: (2RS,4'RS,8'RS)-2,5,7,8-tetrametylo-2-(4',8',12'-trimetylotridecylo)-6-chromanol); dostępny w handlu z ROCHE™.

Gdy tokol był obecny w emulsji typu olej w wodzie, stanowił jej 2,5% obj., w połączeniu z 2,5% obj. skwalenu.

Obydwa oleje zmieszano, dodano monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (Tween 80™) przed mikrofluidyzacją (aparat mikrofluidyzujący M110S, maksimum 50 przejść, w ciągu 2 minut przy maksymalnym ciśnieniu na wejściu 0,6 MPa (ciśnienie na wyjściu około 85 MPa), jak opisano w WO 95/17210). Zgodnie z tym, grupy 5 i 6 były oparte na powyższej emulsji tokolu z dodatkiem wodnego

QS21, 3D-MPL i/lub CpG.

QS21 i 3D-MPL, gdy były obecne w którejkolwiek z powyższych grup szczepionek wprowadzono w ilości 5 pg/dawkę; CpG (OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) dodano w ilości 50 pg/dawkę.

Adiuwanty zastosowane dla grup 3 i 4 przygotowano w sposób opisany w EP 0822831B1 (którego treść włączono tu przez powołanie).

Procedura szczepienia

Grupy myszy B6F1 zaszczepiono czterokrotnie (objętościami 50 pl) domięśniowo, z przerwami 14-dniowymi.

Wyniki

Figury 10 i 11 przedstawiają in vitro limfoproliferację splenocytów po drugim szczepieniu i 14 dni po czwartym szczepieniu, po in vitro inkubacji z 3 pg/ml immunogenu (NS1-P703P) lub P703P eksprymowanego w pichia (15 pg/ml) lub niespecyficznego białka fuzyjnego NSl-OspA.

Figury 12 i 13 przedstawiają humoralną odpowiedź immunologiczną na immunogen (NS1-P703P) w odniesieniu do całkowitej Ig zmierzonej jako środkowe miano ELISA (fig. 10) lub dystrybucję izotypów IgG w tych odpowiedziach (fig. 11).

PL 208 755 B1

Wykaz sekwencj i <110> SmithKline Beecham Biologicals sa <120> Szczepionki <130> B45245 <160> 5 <170> FastSEQ dla Windows Wersja 4.0 <210> 1 <211> 20 <212>’ DNA <213> Sekwencj a sztuczna <22 0>

<223> Syntetyczny oligonukleotyd <400> l tccaćgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213>Sekwencja sztuczna <220>

<223> Synthetic oligonucleotice <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Syntetyczny oligonukleotyd <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213>Sekwencja sztuczna <220>

<223> Syntetyczny oligonukleotyd <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Syntetyczny oligonukleotyd <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims (10)

1. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że zawiera antygen nowotworowy wybrany z grupy:

i) antygenu z rodziny białka MAGE sprzężonego z heterologicznym partnerem fuzyjnym, ii) P501S, iii) Cripto i iv) pochodnych antygenu Her-2/neu pozbawionych zasadniczej części domeny transbłonowej Her-2/neu;

oraz kompozycję adiuwantową zawierającą saponinę, oligonukleotyd immunostymulujący i lipopolisacharyd wybrany z grupy:

a) monofosforylolipidu A,

b) 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i

c) disfosforylolipidu A.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako saponinę zawiera QS21.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że oligonukleotyd immunostymulujący zawiera co najmniej dwa motywy CpG.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że oligonukleotyd immunostymulujący jest wybrany z grupy:

SEQ ID NO: 1 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826),

SEQ ID NO: 2 - TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758),

SEQ ID NO: 3 - ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC AAC ACG,

SEQ ID NO: 4 - TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006),

SEQ ID NO: 5 - TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668).

5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że saponina jest sformułowana w postać ISCOMS lub liposomów.

6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że saponina jest obecna w emulsji typu olej w wodzie.

7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera zasadniczo całą domenę zewnątrzkomórkową Her-2/neu.

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka Her-2/neu jest pozbawiona funkcjonalnej domeny transbłonowej.

9. Kompozycja według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że dodatkowo zawiera domenę fosforylacji Her-2/neu.

10. Zastosowanie połączenia saponiny, oligonukleotydu immunostymulującego i lipopolisacharydu wybranego z grupy:

a) monofosforylolipidu A,

b) 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i

c) disfosforylolipidu A;

oraz antygenu nowotworowego wybranego z grupy:

i) antygenu z rodziny białka MAGE sprzężonego z heterologicznym partnerem fuzyjnym, ii) P501S, iii) Cripto i iv) pochodnych antygenu Her-2/neu pozbawionych zasadniczej części domeny transbłonowej Her-2/neu;

do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworów.