CN1481255A - 疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供和癌抗原一起使用的新型佐剂制剂。所述佐剂包含皂苷和免疫刺激性寡核苷酸。
Description
本发明涉及一种新制剂,所述新制剂包含癌抗原或其衍生物和包含免疫刺激性寡核苷酸和皂苷的联合佐剂组合物的组合。所述抗原优选为Her 2 neu衍生物或者前列腺抗原,因此本发明的所述制剂具有治疗和预防表达这些抗原的人的用途。在一个优选的实施方案中,所述佐剂组合物另外包含脂多糖。
尽管投入大量的财力和人力资源,癌症仍然是导致死亡的一个主要原因。比如,癌症是导致35-74岁女性死亡的主要原因。乳癌是女性中最常见的恶性肿瘤,而乳癌发病率在上升。估计9个女性中有1个将被诊断患有所述疾病。治疗乳癌的标准方法以外科手术、放疗和化疗的组合为中心。这些方法的结果是对某些恶性肿瘤的治疗取得了一些引人注目的成功。然而,当超过某阶段才被诊断时,乳癌是最经常不可治愈的。需要早期诊断和治疗替代方法。
已知含有未甲基化CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸当通过系统和粘膜两种途径给予时是佐剂(WO 96/02555,EP 468520,Davis等,J.Immunol,1998,160(2):870-876:McCluskie和Davis,J.Immunol,1998,161(9):4463-6)。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。从历史的角度来讲,观察到BCG的DNA部分能够发挥抗肿瘤效应。在进一步的研究中,表明衍生于BCG基因序列的合成寡核苷酸能够诱发免疫刺激效应(在体外以及在体内)。这些研究的作者推断,包括一个中心CG基序的某些回文序列带有这种活性。所述CG基序在免疫刺激中的中心作用后来在出版物Krieg,Nature 374,第546页1995中得以阐明。详细的分析已经表明,CG基序必须处于某种序列环境中,并且这样的序列在细菌DNA中是常见的,但在脊椎动物DNA中是罕见的。所述免疫刺激性序列通常是:嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶;其中二核苷酸CG基序未被甲基化,但已知其它未甲基化CpG序列有免疫刺激性,并且可以用于本发明。
在所述六核苷酸的某些组合中,存在回文序列。或者作为一种基序的重复或者作为不同基序的组合的这些基序中的几种,可以存在于同一寡核苷酸中。含有这些免疫刺激性序列中一种或多种的寡核苷酸的存在,可以激活各种免疫亚群,包括自然杀伤细胞(所述细胞产生干扰素γ并且具有溶细胞活性)和巨噬细胞(Wooldrige等Vol 89(no.8),1977)。虽然现在已经表明,不具有这种共有序列的其它含未甲基化CpG的序列是免疫调节性的。
CpG当配制到疫苗中时,一般在自由溶液中与游离抗原一起给予(WO 96/02555;McCluskie和Davis,参见上文),或者与抗原共价缀合(PCT公布号WO 98/16247),或者与诸如氢氧化铝的载体一起配制((肝炎表面抗原)Davis等,参见上文;Brazolot-Millan等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,1998,95(26),15553-8)。
在优选的实施方案中,本发明的佐剂组合包括至少一种肠杆菌脂多糖衍生佐剂。
长期以来已知肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的一种有效的刺激物,虽然其在佐剂中的应用由于其毒性效应而一直被缩减。Ribi等(1986,Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins,PlenumPubl.Corp.,NY,第407-419页)已经描述了通过从还原末端葡糖胺除去核心糖基团和除去磷酸酯而产生的LPS的一种无毒衍生物-单磷酰脂质A(MPL),MPL具有以下结构:
一种进一步解毒形式的MPL通过从二糖主链的3位除去酰基链而产生,称为3-O-去酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。它可以用GB2122204B中所述的方法来纯化和制备,该文献也公开了二磷酰脂质A及其3-O-去酰化变体的制备。一种优选形式的3D-MPL为直径小于0.2μm的小粒径的乳液形式,其生产方法公开于WO 94/21292中。在WO 9843670A2中描述了包含单磷酰脂质A和表面活性剂的水性制剂。
待配制到本发明的佐剂组合中的细菌脂多糖衍生佐剂可以从细菌来源纯化和加工,或者它们可以是合成的。例如,在Ribi等1986(参见上文)中描述了纯化单磷酰脂质A,而在GB 2220211和US 4912094中描述了来源于沙门氏菌(Salmonella sp.)的3-O-去酰化单磷酰或二磷脂脂质A。其它纯化的和合成的脂多糖已有描述(WO 98/01139;US6,005,099和EP 0 729 473 B1;Hilgers等,1986.Int.Arch.Allergy.Immunol.,79(4):392-6;Hilgers等,1987,Immunology,60(1):141-6;和EP 0 549 074 B1)。特别优选的细菌脂多糖佐剂是US 6,005,099和EP 0729 473 B1中描述的3D-MPL和β(1-6)葡糖胺二糖。
因此,可以用于本发明的LPS衍生物是在结构上与LPS或MPL或3D-MPL相似的那些免疫刺激剂。在本发明的另一方面,所述LPS衍生物可以是酰化单糖,它是MPL上述结构的亚部分。
在EP 0 761 231B中描述了3D-MPL和来源于皂树QuillajaSaponaria moulina树皮的皂苷佐剂的组合。WO 95/17210公开了一种基于与免疫刺激剂QS21一起配制、任选与3D-MPL一起配制的角鲨烯、α-生育酚和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(TWEEN80)的佐剂乳液系统。
已知皂苷为供系统给药用的疫苗中的佐剂。在本领域中已经广泛地研究了各种皂苷的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner,参见上文)。例如,在US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”,Kensil,C.R.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2):1-55;和EP 0 362279 B1中描述了Quil A(来源于南美皂树Quillaja Saponaria Molina的树皮)及其级分。
包含Quil A级分的称为免疫刺激复合物(Immune StimulatingComplexes)(ISCOMS)的颗粒性结构具有溶血性,已经用于疫苗的生产(Morein,B.,EP 0 109 942 B1)。据报道这些结构具有佐剂活性(EP 0 109942 B1;WO 96/11711)。
溶血性皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化级分)已被描述为有效的系统性佐剂,其生产方法公开于美国专利第5,057,540号和EP 0362 279 B1中。在这些参考文献中也描述了作为系统疫苗用有效佐剂的QS7(Quil-A的一种非溶血性级分)的应用。QS21的应用在Kensil等(1991.J.Immunology vol 146,431-437)中有进一步的描述。QS21和聚山梨醇酯或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。包含Quil A级分诸如QS21和QS7的颗粒性佐剂系统描述于WO 96/33739和WO96/11711中。
已经用于系统疫苗接种研究的其它皂苷包括来源于其它植物种例如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的那些皂苷(Bomford等,Vaccine,10(9):572-577,1992)。
也已知皂苷已经用于粘膜应用的疫苗的研究,这些研究已经在诱发免疫应答方面取得不同程度的成功。先前已经表明,当鼻内给予抗原时,Quil-A皂苷对于诱发免疫应答不起作用(Gizurarson等1994.Vaccine Research 3,23-29)。同时,其它作者已经成功使用该佐剂(Maharaj等Can.J.Microbiol,1986,32(5):414-20;Chavali和Campbell,Immunobiology,174(3):347-59)。包含Quil-A皂苷的ISCOM已经应用于胃内疫苗制剂和鼻内疫苗制剂中,并且表现出佐剂活性(McI Mowat等1991,Immunology,72,317-322;McI Mowat和Donachie,ImmunologyToday,12,383-385)。
Quil A的无毒性级分QS21也被描述为口服佐剂或者鼻内佐剂(Sumino等J.Vrol.,1998,72(6):4931-9;WO 98/56415)。
Lacaille-Dubois,M和Wagner H.(1996.A review of the biologicaland pharmacological activities of saponins.Phytomedicine第2卷,第363-386页)讲授了皂苷。皂苷是广泛分布于植物界和海洋动物界的类固醇或者三萜糖苷。指出皂苷用于在水中形成摇动起泡的胶体溶液,并且用于沉淀胆固醇。当皂苷接近细胞膜时,它们在膜中产生孔状结构而引起膜破裂。红细胞溶血就是这种现象的实例,这是某些皂苷的性质,而不是所有皂苷的性质。
本发明涉及惊人的发现:免疫刺激性寡核苷酸(CpG)和皂苷和任选的脂多糖组合是极有效的佐剂。因此,提供包含皂苷和免疫刺激性寡核苷酸以及任选的含癌抗原或者其衍生物的脂多糖的组合的疫苗组合。在一个优选的实施方案中,所述佐剂制剂包含优选为QS21的皂苷、免疫刺激性寡核苷酸和3D-MPL。
本发明的疫苗最好还包含载体。在本发明的一个优选形式中,所述佐剂和疫苗组合物中的所述寡核苷酸与联合的皂苷/脂多糖一起协同作用,诱发导致增强肿瘤消退的抗原特异性免疫应答。所述制剂对于诱发常规与Th1型免疫系统相关的免疫应答有效。因此,所述佐剂组合不仅适合于疾病的免疫预防,而且适合于诸如癌症的疾病的免疫治疗。
所述制剂包含抗肿瘤抗原,可用于癌症的免疫治疗性治疗。例如,所述佐剂制剂可应用于肿瘤排斥抗原,例如前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑素瘤的抗原。示例性抗原包括MAGE1、3和MAGE 4、或者例如在WO 99/40188中公开的其它MAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(也称为NY Eos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami,1996,Current Opinions in Immunology 8,第628-636页;Van den Eynde等,International Journal of Clinical &Laboratory Research(1997年提交);Correale等(1997),Journal of theNational Cancer Institute 89,第293页)。实际上这些抗原在各种各样的肿瘤类型例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中表达。
用于本发明的MAGE抗原可以作为带有表达增强子或免疫学融合配偶体的融合蛋白表达。在本发明的一个实施方案中,所述衍生物是包含与异源配偶体优选MAGE3连接在一起、来自MAGE蛋白家族的抗原的融合蛋白。所述蛋白可以是化学缀合的,但是优选作为重组融合蛋白表达,以便与非融合蛋白比较允许在表达系统以提高的水平产生。因此融合配偶体可有助于提供T辅助表位(免疫学融合配偶体),优选为人类所识别的T辅助表位,或者有助于以比所述天然重组蛋白更高的产量表达蛋白(表达增强子)。优选所述融合配偶体将既是免疫学融合配偶体又是表达增强配偶体。
在本发明的一个优选形式中,所述免疫学融合配偶体得自蛋白D,蛋白D是革兰氏阴性菌乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO 91/18926)。优选所述蛋白D衍生物包含大约所述蛋白的前1/3部分,特别是大约N末端前100-110个氨基酸。优选所述蛋白D衍生物是脂质化的。优选脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含于N末端中以给所述疫苗候选抗原提供额外的外源T细胞表位,并提高在大肠杆菌中的表达水平(因而也起着表达增强子的作用)。脂质尾部确保最佳提呈所述抗原给抗原提呈细胞。
其他融合配偶体包含来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。通常应用N末端的81个氨基酸,虽然也可以使用不同片段,前提是它们包含T辅助表位。
在另一个实施方案中,所述免疫学融合配偶体是称为LYTA的蛋白。优选使用分子的C末端部分。Lyta得自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae),合成N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶—酰胺酶LYTA(由lytA基因编码{Gene,43(1986)第265-272页},它是一种特异性降解肽聚糖主链上的某些键的自溶素。LYTA蛋白的C末端结构域负责对胆碱或者诸如DEAE的某些胆碱类似物的亲和性。已经利用这种特性开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基末端包含C-LYTA片段的杂种蛋白的纯化已有描述{Biotechnology:10,(1992)第795-798页}。如本文所用,一个优选的实施方案利用处于C末端起始于残基178的Lyta分子的重复部分。特别优选的形式掺入残基188-305。
上面提到的免疫学融合配偶体也有利于帮助表达。具体而言,所述融合体以比天然重组MAGE蛋白更高的产量表达。这类构建体在WO 99/40188中公开。
其它肿瘤特异性抗原适合于和本发明的佐剂一起使用,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于肿瘤特异性神经节苷脂诸如GM2以及GM3或其与载体蛋白的缀合物;或者所述抗原可以是自身肽类激素,例如全长促性腺素释放激素(GnRH,WO 95/20600),这是一种10个氨基酸长的短肽,可用于治疗许多癌症,或者可用于免疫去势(immunocastration)。
在再一个优选实施方案中利用其他前列腺抗原,诸如以下的抗原:前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4)1735-17401998)、PSMA或者在一个优选实施方案中称为Prostase的抗原。
Prostase是一种前列腺特异性丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶样),长254个氨基酸,具有一个保守的丝氨酸蛋白酶催化三联体H-D-S和一个表明有潜在的分泌功能的氨基末端前原肽序列(P.Nelson,Lu Gan,C.Ferguson,P.Moss,R.Gelinas,L.Hood和K.Wand,“Molecular cloningand characterisation of prostase,an androgen-regulated serine protease withprostate restricted expression”,载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96,3114-3119)。已经描述了一个推定的糖基化位点。预测的结构非常类似其它已知的丝氨酸蛋白酶,表明成熟多肽折叠成一个单一的结构域。所述成熟蛋白长224个氨基酸,具有一个表明是经天然加工的A2表位。
Prostase的核苷酸序列和导出的多肽序列以及同源物公开于Ferguson,等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,3114-3119)和国际专利申请WO 98/12302(也是相应的授权专利US 5,955,306)、WO98/20117(也是相应的授权专利US 5,840,871和US 5,786,148)(前列腺特异性激肽释放酶)和WO 00/04149(P703P)。
本发明提供包含基于prostase蛋白及其片段和同源物(“衍生物”)的prostase蛋白融合体的制剂。这类衍生物适用于治疗性疫苗制剂,所述制剂适用于治疗前列腺肿瘤。通常,所述片段将含有至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸,如在上述引用的专利和专利申请中公开的。
在一个实施方案中,提供一种突变prostase抗原,其中的突变发生在所述蛋白的活性位点上。Prostase抗原衍生物或者其片段和同源物在所述蛋白的活性位点上带有突变,以基本上减弱或者优选地消除它的蛋白酶生物活性。优选的突变包括取代所述丝氨酸蛋白酶的组氨酸和天冬氨酸催化残基。在一个优选的实施方案中,prostase包含活性位点例如在prostase序列的残基71上的一个组氨酸-丙氨酸突变(Ferguson,等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,3114-3119)。清楚地考虑了同源蛋白中相应的突变,例如WO 00/041949公开的那些突变。例如该突变与P703P中的43位对应。该突变可导致所述蛋白的催化效率(以酶的比活表示)显著降低。优选催化效力至少降低为原来的103分之一,更优选至少降低为原来的106分之一。经受组氨酸-丙氨酸突变的蛋白在此后用*(星号)表示。
在一个实施方案中,突变型Prostase或者非突变型Prostase是融合蛋白的部分,所述融合蛋白包含肿瘤相关Prostase或者其片段或者同源物,以及作为融合配偶体的异源蛋白或者蛋白部分。所述蛋白和融合配偶体可以化学缀合,但是优选在异源表达系统中作为重组融合蛋白表达。
在本发明的一个优选实施方案中,提供与免疫学融合配偶体连接的prostase融合蛋白或者其片段或同源物,所述免疫学融合配偶体可有助于提供T辅助表位。因此所述融合配偶体可通过与大量的对所述外源蛋白或者外源肽特异性的T细胞的分泌活化信号相关的旁观者辅助效应而起作用,从而与非融合蛋白相比增强诱发针对prostase成分的免疫。所述异源配偶体优选选择为多数人的T细胞可识别的。
在另一个实施方案中,本发明提供与作为表达增强子的融合配偶体连接的prostase蛋白或者其片段或者同源物。因此所述融合配偶体可有助于在异源系统中prostase的表达,与天然重组蛋白相比允许在表达系统中产生提高水平的prostase。
优选所述融合配偶体将既是免疫学配偶体,又是表达增强配偶体。因此,本发明提供包含与融合配偶体连接的突变型肿瘤特异性prostase或其片段的融合蛋白。优选所述融合蛋白既作为免疫学融合蛋白,又作为表达增强配偶体。因此,在本发明的一个优选形式中,所述融合配偶体是来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)或其片段。通常利用N末端的81个氨基酸,虽然可以使用不同片段,条件是它们包含T辅助表位(C.Hackett,D.Horowitz,M.Wysocka和S.Dillon,1992,J.Gen.Virology,73,1339-1343)。当NS1是免疫学融合配偶体时,它具有另外的优点,因为它允许获得更高的表达量。具体而言,该融合体以比天然重组prostase蛋白更高的表达量表达。
在最优选的实施方案中,所述融合蛋白包含与5-226个羧基末端氨基酸融合的NS1非结构蛋白的N末端81个氨基酸。可供选择的表达配偶体包括如蛋白D或其片段和在MAGE抗原环境中利用的C-Lyta。
再一种优选的前列腺抗原称为P501S,WO 98/37814SEQ ID no113。如上述引用的专利申请中公开的,免疫学片段及其部分包含至少20个、优选50个、更优选100个连续的氨基酸。参见例如PS 108(WO98/50567)。
从WO 98/37418和WO/004149了解到其它前列腺特异性抗原,另一种是STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999。
可用于本发明的其它肿瘤相关抗原包括:Plu-1,J Biol.Chem 274(22)15633-15645,1999;HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等Bioessays 199,21 61-70,美国专利5654140);Criptin,美国专利5 981215。此外,与癌症治疗疫苗特别相关的抗原也包括酪氨酸酶和survivin。
粘蛋白衍生肽如Muc1参见例如US 5744,144、US 5827,666、WO8805054、US 4,963,484。具体考虑的是为SM3抗体(US 6 054 438)所识别的Muc1衍生肽,它包含Muc1肽的至少一个重复单元,优选至少包含两个这样的重复。其它粘蛋白衍生肽包括来自Muc5的肽。
本发明与诸如Her 2 neu、mammaglobin(美国专利5668267)的乳癌抗原或者在WO/00 52165、WO 99/33869、WO 99/19479、WO 98/45328中公开的那些抗原联合也是有用的。Her 2 neu抗原在美国专利5,801,005中和其它物质一起被公开。优选Her 2 neu包含整个胞外结构域(包含大约氨基酸1-645)或者其片段,以及胞内结构域的至少一个免疫原性部分或者大约整个胞内结构域(C末端580个氨基酸)。具体而言,所述胞内部分应该包含磷酸化结构域或者其片段。WO 00/44899中公开了这类构建体。一种特别优选的构建体称为EGD PD,第二种称为ECD APD,参见WO 00/44899。
这里所用的Her 2 neu可以来自大鼠、小鼠或者人类。
Her 2 neu抗原可以是缺乏功能性跨膜结构域的完整Her 2 neu抗原或其部分。优选的部分包含所述胞外结构域。在一个更优选的实施方案中,提供包含与胞内结构域的部分连接的胞外结构域的融合蛋白,如WO 00/44899所公开的(并且通过引用结合到本文中)。
本发明涉及能够调节、优选诱发或者增强针对Her 2 neu癌基因表达的蛋白产物的免疫的制剂,所述表达包括温血动物恶性肿瘤的表达,而在所述恶性肿瘤中伴随恶性肿瘤扩增的Her 2 neu基因并不要求所述基因的蛋白表达产物存在于肿瘤上。例如,所述基因的过量表达可能与肿瘤形成的开始和早期阶段有关,但是该蛋白表达可能随后减少或者停止。本发明除了可用于预防Her 2 neu阳性肿瘤的建立并且诱发已有的Her 2 neu阳性肿瘤消退之外,还可用于诱发或者增强有效的免疫应答,而使Her 2 neu阳性肿瘤转化为Her 2 neu阴性。
下面的缩写用于本说明书全文中:“ECD”是指胞外结构域,“ICD”是指胞内结构域,“PD”是指位于胞内结构域中的磷酸化结构域(即被磷酸化的结构域),“ΔPD”是指位于磷酸化结构域中的磷酸化结构域片段,而“KD”是指位于胞内结构域中的激酶结构域。Her 2neu基因表达的产物在这里表示为“Her 2 neu蛋白”,也称为“p185”或者“c-erbB2”。
“Her 2 neu ECD-ICD融合蛋白”在这里也表示为“ECD-ICD”或者“ECD-ICD融合蛋白”,是指包含Her 2 neu蛋白的胞外结构域(或者其片段)和胞内结构域(或者其片段)的融合蛋白(或者其片段)。这些代表应用于本发明的优选抗原。当用于本文时,EGD-ICD融合蛋白不包含Her 2 neu跨膜结构域的实质部分,并且优选不包含任何Her 2 neu跨膜结构域。
“Her 2 neu ECD-ICD融合蛋白”和“Her 2 neu ECD-PD融合蛋白”这两个术语以及它们相关的术语也认为是指它们的片段、它们的同源物以及它们的功能性等同物(统称为“变异体”),例如在本发明的优选实施方案中包含或者(i)与Her 2 neu蛋白比较提高免疫应答的诱发作用或者增强作用,或者(ii)与Her 2 neu蛋白比较基本上不影响免疫应答的诱发或者增强(例如变异体通过辅助T细胞或者细胞毒性T细胞刺激应答或者刺激抗体产生)的一个或者多个氨基酸的那些变异体。这里更详细描述了具体的、非限定性的变异体实例,所述变异体包括Her2 neu ECD-ICD融合蛋白和Her 2 neu ECD-PD融合蛋白的示例性片段、同源物和功能性等同物。变异体可以与包含天然多肽成分的融合蛋白“基本相同”或者“基本相似”,并且保留刺激免疫应答的能力。
Her 2 neu PD长度为268个氨基酸,是胞内的,而且可以被蛋白质酪氨酸激酶磷酸化。该区与其它酪氨酸受体的相应部分没有同一性。因此,该结构域的特异性和独特性使其特别优选用作肿瘤疫苗。然而,仅该结构域在细菌和哺乳动物细胞中表达是有问题的。例如,所产生的PD蛋白很不稳定而且不适宜于大规模生产。在一个实施方案中,本发明因此优选使用包含所述胞内结构域或磷酸化结构域的全部或其部分与Her 2 neu胞外结构域的全部或部分的融合体。本发明的ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白是可溶性的、分泌型的,而且在培养基中是稳定的。
本发明的疫苗将可用于对抗任何以肿瘤相关抗原的表达例如Her2 neu的表达为特征的癌症。除使得胞内结构域或者磷酸化结构域或者其变异体表达增强之外,作为和胞外结构域的融合蛋白或者其变异体,ECD-ICD和ECD-PD融合蛋白提供了改良的疫苗制剂。
因此,本发明提供一种包含佐剂组合物的疫苗制剂,所述佐剂包含皂苷和免疫刺激性寡核苷酸以及缺失跨膜结构域的Her 2 neu抗原。Her 2 neu分子可以来自大鼠、小鼠、人类或者其杂种。优选Her 2 neu分子包含基本上全部的胞外结构域。“基本上全部”的意思是不超过100个氨基酸、优选少于75个、更优选少于50个氨基酸从胞外结构域中缺失。优选存在完整的胞外结构域。本发明的人Her 2 neu构建体中的胞外结构域优选包含基本上全部N末端600个氨基酸,更优选N末端630个氨基酸,更优选大约650个氨基酸。所述人ICD从氨基酸676延伸至Val 1255。所述磷酸化结构域位于ICD的N末端部分上。优选用于本发明的构建体包含磷酸化结构域,但不包含功能性跨膜结构域。优选一起缺失所述跨膜结构域。
WO/0044899公开了特别适用于本发明的构建体。
一个优选的实施方案是,在水乳液载体中,将Her 2 neu抗原与3D-MPC、QS21和CpG寡核苷酸以及脂质体或者水包油型乳液载体一起配制。这类制剂既产生体液免疫又产生细胞免疫。与只包含QS21和3D-MPL的佐剂制剂比较,本发明的制剂在小鼠中有利地诱发更强的TH1应答。只包含CpG的制剂不产生显著的细胞介导的免疫应答。
所述制剂可以包含与肿瘤支持机制(如血管发生、肿瘤入侵)相关的抗原,如tie2,VEGF。
供本发明佐剂或疫苗使用的优选寡核苷酸最好包含两个或两个以上被至少3个、更优选至少6个或6个以上核苷酸隔开的的二核苷酸CpG基序。本发明的寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个优选实施方案中,所述寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)键,或者更优选是硫代磷酸酯键,虽然磷酸二酯键和其它核苷酸间键合在本发明的范围内,包括具有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在US 5,666,153、US 5,278,302和WO 95/26204中有描述。
优选寡核苷酸的实例具有以下序列。所述序列优选含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键合。OLIGO 1(SEQ ID NO:1):TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)OLIGO 2(SEQ ID NO:2):TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO:3):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO:4):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)OLIGO 5(SEQ ID NO:5):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
可供选择的CpG寡核苷酸可以包含其中具有不重要的缺失或添加的上述优选序列。本发明中使用的CpG寡核苷酸可以用本领域已知的任何方法合成(例如EP 468520)。利用自动合成仪,可以方便地合成这类寡核苷酸。它们的长度通常为10-15个碱基。
本发明中使用的寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个优选实施方案中,所述寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代磷酸酯键,或者更优选是硫代磷酸酯键,虽然磷酸二酯在本发明的范围内。考虑了包含不同核苷酸间键合的寡核苷酸,例如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。可以使用稳定所述寡核苷酸的其它核苷酸间键。
可用于本发明的佐剂组合的皂苷包括在US 5,057,540和"Saponins as vaccine adjuvants",Kensil,C.R.,Crit Rev Ther Drug CarrierSyst,1996,12(1-2):1-55;和EP 0 362 279 B1中描述的,得自皂树Quillaja Saponaria moulina树皮的称为Quil A的那些皂苷以及其级分。特别优选的Quil A级分是QS21、QS7和QS17。
β-七叶皂苷是另一种用于本发明的佐剂组合物中的优选的溶血性皂苷。Merck索引(第十二版,3737条目)描述七叶皂苷是存在于七叶树Lat:Aesculus hippocastanum种子中的一种皂苷混合物。描述了通过层析和纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))以及离子交换树脂(Erbring等US 3,238,190)将其分离。七叶皂苷的级分□和□已被纯化,并且表现出生物活性(Yoshikawa M,等(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996 Aug;44(8):1454-1464))。β-七叶皂苷也称为七叶树皂苷(aescin)。
用于本发明的另一个优选溶血性皂苷是毛地黄皂苷。Merck索引(第十二版,3204条目)描述毛地黄皂苷是一种得自毛地黄(Digitalispurpurea)的种子的皂苷并根据Gisvold等,J.Am.Pharm Assoc.,1934,23,664;和Ruhenstroth-Bauer,Physio.Chers.,1955,301,621描述的方法纯化。描述其用途是作为用于测定胆固醇的临床试剂。
本发明的佐剂组合还可以包含载体,使得所述皂苷或者CpG或者脂多糖可以与一种颗粒性载体实体结合,提高所述组合的佐剂性。特别优选的系统性疫苗例如包含一种载体分子。
本发明佐剂组合中使用的CpG可以处于自由溶液中,或者可以与颗粒性载体例如无机盐(例如但不限于铝盐或钙盐)、脂质体、ISCOM、乳液(水包油型、油包水型、水包油包水型)、聚合物(例如但不限于聚乳酸、聚羟基乙酸、聚磷腈(polyphosphazine)、聚氨基酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖)或微粒复合。优选所述载体是阳离子的。本发明的疫苗还包含一种抗原,所述抗原可以与CpG载体复合物结合,或者不与CpG载体复合物结合。在这种情况下,所述抗原可以自由悬浮或者与一种单独的载体结合。
构成本发明部分的皂苷可以是分散的胶束形式,或者当与胆固醇或脂质配制时可以为如ISCOMs(EP 0 109 942 B1)或者脂质体(WO96/33739)的大而有序的结构形式,或者是水包油型乳液的形式(WO95/17210)。可以优选皂苷与金属盐如氢氧化铝或者磷酸铝结合(WO98/15287)。可供选择地,皂苷可以与颗粒性载体如脱乙酰壳多糖结合。皂苷也可以为诸如干粉的干燥状态。给予受接种者粘膜表面的最终制剂形式优选其性质为溶血性的。皂苷可以与或者不与所述抗原或通过直接键合或通过与相同的颗粒性载体分子相互作用而物理结合(GB 9822712.7;WO 98/16247)。
本发明的佐剂或者疫苗中的CpG和皂苷以及脂多糖可以是各自分开的或者是结合的。例如,CpG和皂苷可以在自由悬浮液中或者可以经由载体,更优选经由颗粒性载体如氢氧化铝结合,或者通过阳离子型脂质体或ISCOM结合。
按照本发明的一种优选佐剂组合由一种或多种在两个相邻GC基序之间含有至少3个、优选至少6个核苷酸的CpG寡核苷酸、以及QS21和选自水包油型乳液或者DQ的颗粒性载体所组成。优选脂多糖是二磷酰脂质衍生物或单磷酰脂质衍生物,优选是3脱氧酰化的,特别是3脱氧酰化单磷酰脂质A。更优选所述佐剂组合包含与QS21混合的CpG 2006(SEQ ID NO:4)或CpG 1758(SEQ ID NO:2)或CpG1826(SEQ ID NO:1)和选自水包油型乳液或者DQ的颗粒性载体;因此,特别优选的疫苗例如包含这类佐剂组合和抗原。本发明的优选疫苗用于在通过系统性途径给予个体后产生系统性免疫应答。
本发明的佐剂组合可以包含一种基于油的乳液。人们已经了解油乳液许多年了,包括对弗氏完全和不完全矿物油乳化佐剂的研究。从那时起,已经进行了许多工作以设计这些有效的、但具反应原性的佐剂制剂的稳定而且耐受性良好的替代品。
许多单相或多相乳液体系已有描述。已指出水包油型乳化佐剂本质上可用作为佐剂组合物(EP O 399 843B),水包油型乳液和其它活性剂的组合也被描述为疫苗佐剂(WO 95/17210;WO 98/56414;WO99/12565;WO 99/11241)。其它油乳化佐剂已有描述,例如油包水型乳液(US 5,422,109;EP 0 480 982 B2)和水包油包水型乳液(US 5,424,067;EP 0 480 981 B)。
用于本发明的油乳化佐剂可以是天然的或者合成的,且可以是无机的或者有机的。对于本领域的技术人员来说,矿物油和有机油的实例将是显而易见的。
为了使任何水包油组合物适合于给予人类,所述乳液体系的油相优选包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域众所周知的。可代谢可以定义为“能够通过代谢作用被转化”(Dorland’s Illustrated MedicalDictionary,W.B.Sanders Company,25th edition(1974))。所述油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油,对于受体而言是无毒的,并且能够通过代谢作用被转化。坚果(例如花生油)、种子和谷粒是常见的植物油来源。合成油也是本发明的部分,可以包括市售的油例如NEOBEE以及其它油。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四烷六烯)是一种在鲨鱼鱼肝油中大量存在的不饱和油,而在橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中以较低量存在,它是用于本发明的特别优选的油。鉴于角鲨烯是胆固醇生物合成的中间体(Merck index,10thEdition,entry no.8619)的这一事实,角鲨烯是一种可代谢油。
特别优选的油乳液是水包油型乳液,特别是水包角鲨烯乳液。
另外,本发明的最优选油乳化佐剂包含优选为油α-生育酚(维生素E,EP 0 382 271 B1)的抗氧化剂。
WO 95/17210和WO 99/11241公开了基于任选与免疫刺激剂QS21和/或者3D-MPL配制的角鲨烯、α-生育酚和TWEEN 80的乳化佐剂。WO 99/12565公开了向所述油相加入固醇而改良这些角鲨烯乳液。另外,为了使乳液稳定,可以向所述油相加入甘油三酯如三辛精(C27H50O6)(WO 98/56414)。
在稳定的水包油型乳液中存在的油珠大小优选低于1微米,可以大体上在30-600nm范围内,优选直径大体上在30-500nm左右,最优选直径大致为150-500nm,特别是通过光子相关光谱学测定直径约为150nm。在这一方面,按数目计80%的油珠应该在所述优选范围内,更优选按数目计超过90%、最优选超过95%的油珠在所限定的大小范围内。在本发明油乳液中存在的所述成分的量通常为2-10%范围内的油,例如角鲨烯;并且当存在时,为2-10%α生育酚;和0.3-3%表面活性剂,例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。油和α-生育酚之比优选等于或小于1,因为这一比率提供了更为稳定的乳液。也可以存在大约1%水平的Span 85。在某些情况下,可能有利的是本发明的疫苗还含有稳定剂。
生产水包油型乳液的方法是本领域技术人员熟知的。通常,所述方法包括将所述油相和表面活性剂如PBS/TWEEN80TM溶液混合,然后用均化器均化,包括使所述混合物两次通过注射器针头的方法适合于将小体积液体均化,这对于本领域技术人员而言是显而易见的。同样,本领域技术人员可以改进在微流化床中的乳化法(M110S微流控机(microfluidics machine),最多50道(pass),在6巴最大输入压(输出压约850巴)下2分钟),来产生更小或更大体积的乳液。这种改进可以通过常规实验来完成,包括测量所得的乳液,直至获得具有所需直径油珠的制剂。
本发明的佐剂组合可以作为系统性佐剂或者粘膜佐剂使用。在本发明的一个特定形式中,提供通过系统性途径或者肠胃外途径诸如肌内、皮内、透皮、皮下、腹膜内或静脉内给药途径给予的系统性疫苗。优选的给药途径是透皮途径,例如由皮肤贴剂给予。
通过肌内、皮内、经皮、皮下、腹膜内或者静脉内给予药,本发明的系统性疫苗制剂可用于保护或者治疗易患病或患病的哺乳动物。所述疫苗制剂的系统性给药方法可以包括常规注射器和针,或者设计用于发射递送固体疫苗的设备(WO 99/27961),或者无针压力液体喷射设备(US 4,596,556;US 5,993,412),或者透皮贴剂(WO 97/48440;WO98/28037)。本发明也可以用于增强应用于皮肤的抗原的免疫原性(经皮或者透皮递药WO 98/20734;WO 98/28037)。因此本发明提供用于系统给药、预填充本发明的疫苗或佐剂组合物的递药设备。从而提供用于诱发个体的免疫应答的方法,包括给予个体包含抗原和免疫刺激性寡核苷酸、皂苷和载体的疫苗,其中所述疫苗是经由肠胃外途径或者系统性途径给予的。诱发免疫应答的优选方法包括与衍生于QuilA的皂苷例如QS21以及如水包油型乳液载体、包含胆固醇的脂质体或明矾的载体一起给予针对例如Her 2 neu衍生物的疫苗。
另一方面,通过例如口服/消化道或鼻途径的粘膜途径给予,本发明的疫苗制剂可用于保护或者治疗易得病或者患病的哺乳动物。可供选择的粘膜途径是阴道内途径和直肠内途径。优选的粘膜给药途径是经由鼻途径,称为鼻内接种。鼻内接种的方法在本领域是众所周知的,包括给予小滴、喷雾剂或干粉形式的疫苗于要免疫个体的鼻咽中。粉雾剂型或气雾剂型疫苗制剂也构成本发明的部分。诸如用于口服给予的胃耐受胶囊和颗粒剂的肠溶制剂和供直肠给予或阴道给予用的栓剂也构成本发明的部分。
本发明的佐剂组合代表适用于人类应用以用粘膜接种取代系统性接种的一类粘膜佐剂。在本发明的一个优选形式中,诸如Quil A的纯皂苷或其衍生物,包括QS21;七叶皂苷;毛地黄皂苷;丝石竹属或者Chenopodium quinoa皂苷与免疫刺激性寡核苷酸组合,可以作为经粘膜给予抗原以获得系统性免疫应答用的佐剂。
本发明的佐剂组合用于配制疫苗,所述疫苗可以经由系统性途径或粘膜途径给予。当所述疫苗用于粘膜给予时,所述佐剂组合优选含有溶血性皂苷。
本发明的组合物供粘膜给予用时优选包含溶血性皂苷。在本发明的含义内的溶血皂性苷或皂苷制剂参考以下测定确定。
1.在台式离心机中用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤得自豚鼠的鲜血3次。在重悬浮至初始体积后,进一步在PBS中10倍稀释所述血液。
2.向800μl含PBS的表面活性剂或皂苷2倍稀释液中加入50μl所述血悬浮液。
3.8小时后,目测或者通过测定上清液的光密度评定溶血作用。吸收570nm光的红色上清液的存在,表明发生溶血作用。
4.以不再发生溶血作用时首个皂苷稀释液的浓度表示结果。
为了本发明的目的,如果所述皂苷佐剂制剂在小于0.1%的浓度下溶解红细胞,那么它是溶血性的。作为参考,QuilA、QS21、QS7、毛地黄皂苷和β-七叶皂苷的基本纯的样品都是在该测定中所定义的溶血性皂苷。在这种生物学测定的固有实验变异性内,优选本发明的皂苷具有大约在0.5-0.00001%之间,更优选在0.05-0.00001%之间,甚至更优选在0.005-0.00001%之间,而最优选在0.001-0.0004%之间的溶血活性。理想的是,所述皂苷应该具有与QS21相似(即十倍差异之内)的溶血活性。
本发明的疫苗也可以经由口服途径给予。在这些情况下,所述药用可接受赋形剂也可以包含碱性缓冲液,或者肠溶胶囊或者微粒。本发明的疫苗也可以经由阴道途径给予。在这些情况下,所述药用可接受赋形剂也可以包含乳化剂、诸如CARBOPOL的聚合物、以及其它已知的阴道乳油和栓剂的稳定剂。本发明的疫苗也可以经由直肠途径给予。在这些情况下,所述赋形剂也可以包含在本领域中用于形成直肠栓剂用的蜡和聚合物。
本发明所述佐剂组合中的多于一种皂苷的制剂也构成本发明的部分。例如,含有QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或者毛地黄皂苷中的至少两种的组合。另外,本发明的所述组合物可以包含一种以上免疫刺激性寡核苷酸的组合。
另一方面,所述制剂可以与疫苗载体组合,所述疫苗载体包括脱乙酰壳多糖或其它聚阳离子聚合物、聚交酯和聚丙交酯乙交酯共聚物颗粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺的聚合物基质、由多糖或者化学修饰的多糖组成的颗粒、脂质体和基于脂质的颗粒、由甘油一酯组成的颗粒等等。所述皂苷也可以在有胆固醇的情况下配制以形成诸如脂质体或ISCOMs的颗粒结构。而且,所述皂苷可以和聚氧乙烯醚或者聚氧乙烯酯一起配制为无颗粒溶液或悬浮液、或者诸如paucilamelar脂质体或者ISCOM的颗粒结构。所述皂苷也可以和诸如Carbopol的赋形剂一起配制以提高粘度,或者可以与诸如乳糖的粉状赋形剂一起配制为干粉形式。
特别优选的佐剂是下述物质的组合:3D-MPL和QS21(EP 0 671948 B1),包含3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95117210,WO98/56414),或者与本文所描述的CpG寡核苷酸联合的和其它载体(EP 0689 454 B1)配制的3D-MPL。本发明的佐剂或者疫苗中CpG或者寡核苷酸通常为小量,但是根据疫苗制剂,其含量可以在1-1000μg/剂范围内,优选1-500μg/剂,更优选1-1001μg/剂。
用于本发明佐剂中的皂苷的量可以在1-1000μg/剂范围内,优选1-500μg/剂,更优选1-250μg/剂,最优选1-100μg/剂。因此,CpG∶皂苷(w/w)之比将在1∶1000-1000∶1范围内,通常将在1∶100-100∶1范围内,优选在1∶10-1∶1或1∶1-10∶1范围内,最优选为1∶1、4∶1或10∶1。
本发明的制剂既可以用于预防目的,也可用于治疗目的。因此,提供皂苷、脂多糖和CpG分子的组合在用于癌症(特别是乳癌和前列腺癌)的预防和治疗的疫苗生产中的应用。因此,本发明提供一种治疗易感或患有传染病或癌症或者变态反应或自身免疫病的哺乳动物的方法。在本发明的再一方面,提供一种如本文所述的用作药物的疫苗或佐剂组合,所述疫苗或佐剂组合包含脂多糖、皂苷和CpG。疫苗的制备在New Trends and Developments in Vaccines,Voller等编著,University Park Press.Baltimore,Maryland,U.S.A.1978中有全面的描述。
因此本发明提供预防个体感染选自下述疾病的方法:前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或者黑素瘤;所述方法包括通过系统性途径给予所述个体大体上如本文所述的组合物。
另一方面,本发明提供一种包含抗原和溶血性皂苷的粘膜疫苗。因此,提供通过向易感或者患有疾病的个体的粘膜表面给予大体上如本文所述的组合物来治疗所述个体的方法。
此外,描述一种诱发哺乳动物中系统性抗原特异性免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物的粘膜表面给予包含抗原和溶血性皂苷的组合物。还提供生产疫苗或者佐剂的方法,所述方法包括取皂苷,取CpG分子,并且将它们和抗原混合。
用于本发明的组合中的合适药用可接受赋形剂的实例包括水、磷酸缓冲盐溶液、等渗缓冲液。
实施例1
按照WO 00/44899的方法在CHO细胞中生产ECD-PD。在小鼠和兔子中试验所述制剂。
将制剂与多种对照比较。
SBAS1+SBAS7:
ECD-PD和CpG寡核苷酸2006、3D-MPL、脂质体中的QS21配制。
SBAS1制剂
含脂质体中的QS21以及与所述脂质体结合的3D-MPL,按照EP0822831的方法制备。
SBAS1+SBAS7制剂
向上述制剂加入CpG寡核苷酸2006。在使用前将所述抗原和所述佐剂制剂混合。
基于SBAS7+SBAS2的制剂(小鼠)
对于一剂50μl的疫苗,在连续加入含SB62的水包油型乳液之前,将所述ECD-PD蛋白(25μg)稀释在10倍浓缩的PBS pH6.8和H2O中,制备所述乳液,所述乳液包含5%的角鲨烯、5%的生育酚、2.0%的tween80,粒径为180nm。
乳液SB62(2倍浓度)的制备
将Tween 80溶解于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,以给出2%PBS溶液。为了提供100ml 2倍浓缩的乳液,搅动5g DLα-生育酚和5ml角鲨烯使其完全混合。加入90ml PBS/Tween溶液,完全混合。然后使所得乳液经过注射器,最后采用M11OS微流控机(microfluidics machine)微流化。所得油珠的大小大约为180nm,然后加入3D-MPL(10μg)、QS21(10μg)、50μg CpG ODN 2006,30分钟之后,加入50μg/ml硫柳汞作为防腐剂。所有的保温均在室温搅拌下进行。
如上述制备SBAS2制剂,但不加入CpG寡核苷酸。
SBAS7是寡核苷酸2006。
基于SBAS7+SBAS2的制剂(兔子)
对于一剂500μl的疫苗,在连续加入250μl SB62、3D-MPL(100μg)、QS21(100μg)和500μg CpG ODN 2006之前,将ECD-PD蛋白(100μg)稀释于10倍浓缩的PBS pH6.8和H2O中,30分钟之后,加入50μg/ml硫柳汞作为防腐剂。所有的保温均在室温搅拌下进行。
实施例2:肿瘤攻击实验
在第0-14-28-42天,以人用剂量1/10的抗原(25μg)注射各组F1(C57×Balb c)小鼠(8只小鼠/组),在第56天,用表达Her2的TC1细胞以接近2×106个TC1 Her2细胞/动物通过皮下给予进行攻击。
在第56天,收集1/2所述动物的脾的TC1细胞,给所述动物放血。
如图1所示,向3D-MPL/QS21制剂中加入CpG寡核苷酸,协同增强了肿瘤消退,而且只有这些制剂使小鼠肿瘤完全消退。
实施例3:在不同佐剂中的ECD-PD在兔子中的免疫原性。
在0、21和42天,分别用100μg在AS02、AS01、AS05、AS06(吸附在明矾上的CpG 2006)、AS07和AS02B+AS07中的ECD-PD免疫6组兔子(4只/组)。
在第三次免疫后14天分析血清学性质,表1表明本发明的制剂在诱发高效价抗体应答方面优于其它制剂。表1
实施例4:Her 2 neu、ECD-PD在成年恒河猴中的免疫原性。
免疫前 第三次免疫后14天 | |
AS02BAS01BAS5AS6AS07AAS02B+AS07A | 50 96923173 196637144 76221142 74180480 390494 362713 |
用在各种佐剂制剂中的ECD-PD免疫成年恒河猴。AS02 B - 在水包油型乳液中的QS21,3DMPLAS01 - 在脂质体中的QS21 3DMPLAS05 - 在脂质体中的QS21AS06 - CpG 2006明矾AS07 - CpG 2006AS02B+AS07 - 详见实施例1
在本发明的制剂(AS02+AS07)中,接种诱发更强的抗体应答。参见图1。
进一步分析表明抗体应答是多克隆的,说明了对过量表达所述Iter2 neu分子的人乳癌细胞系(SKBR3)体外生长的抑制活性。Herceptin是一种用于治疗Her 2 neu表达肿瘤的单克隆抗体,它能够抑制该细胞系的生长。
因此,可见用所述制剂主动接种后产生的抗体是功能性的。
实施例5:用ECD-PD抗原免疫小鼠
这一实验设计用抗原研究各种各样的佐剂制剂,所述抗原是与磷酸化结构域连接的Her 2 Neu胞外结构域的融合体(ECD-PD),该融合体依照WO 00/44899的方法在CHO细胞中生产。组别 抗原(25μg) 佐剂1 ECD-PD 无(磷酸缓冲盐溶液(PBS))2 ECD-PD 在膜中具有QS21和3D-MPL的脂质体3 ECD-PD 具有QS21和3D-MPL的含母育酚水包油型乳液4 ECD-PD CpG5 ECD-PD 在膜中具有QS21和3D-MPL的脂质体+CpG6 ECD-PD 具有QS21和3D-MPL的含母育酚水包油型乳液
+CpG7 ECD-PD 3D-MPL+CpG8 ECD-PD QS21+CpG9 ECD-PD 含母育酚水包油型乳液+CpG10 ECD-PD 在膜中具有QS21的脂质体+CpG11 ECD-PD 在膜中具有3D-MPL的脂质体+CpG
在上述组别中使用的含母育酚水包油型乳液使用D,L,α-生育酚(CAS No.10191-41-0;化学名称:(2RS,4’RS,8’RS)-2,5,7,8-四甲基-2-(4’,8’,12’-三甲基-十三烷基)-6-二氢苯并呋喃醇));它以ROCHETM市售。如果存在母育酚,则所述母育酚存在于水包油型乳液中,所述乳液包含与2.5%(体积)角鲨烯组合的2.5%(体积)母育酚。将这两种油混合,加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80TM),然后进行微流化(M110S微流控机,最多50道,在6巴最大输入压(输出压约为850巴)下达2分钟,如WO 95/17210中所述)。因此,第3组、第6组和第9组基于添加含水QS21、3D-MPL或者CpG的上述母育酚乳液。
如果在任一种以上疫苗组中存在QS21和3DM-MPL,则它们以5μg/剂存在;以50μg剂量加入CpG(OLIGO 4(SEQ ID NO:4):TCGTCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT)。
第2组、第5组、第10组使用的佐剂依照EP 0 822 831 B1(所述文献的内容通过引用结合到本文中)中所述技术来制备。第11组在脂质体膜中包含3D-MPL。简而言之,将3D-MPL、二油酰磷脂酰胆碱和胆固醇混合在一起,然后微流化为单室脂质体(如EP 0 822 831 B1中所述,但除去QS21)。
第4组、第7组和第8组中使用的佐剂为水性悬浮液或者水溶液。
疫苗接种方法
给各组B6F1小鼠以14天的间隔肌内接种疫苗4次(以50μl的体积)。给予第4剂疫苗后14天,用2×106表达Her 2 Neu的TC1肿瘤细胞皮下攻击小鼠。
通过用编码Her 2 Neu的逆转录病毒载体转导TC1细胞,产生Her2 Neu-TC1肿瘤细胞系。在使用blastocydin的选择期后,分离出抗性克隆,并且通过FACS,根据Her 2 Neu的表达筛选所述克隆。选择出具有最高Her 2 Neu表达的克隆,鉴定2×106的攻击剂量具有与野生型TC1细胞相似的生长动力学,并且导致在100%的对照动物中产生肿瘤。
1周两次测量各个肿瘤的大小,并且以组平均值来表示。
结果
图3显示了第1、2、4、5和6组的肿瘤生长结果。图4显示了第1、5、6、7和11组的肿瘤生长结果。图5显示了第1、5、6、8、9和10组的肿瘤生长结果。诱发肿瘤完全消退的仅有的疫苗是包含免疫刺激性寡核苷酸和皂苷的疫苗。
图6和图7显示了在与5μg/ml免疫原(ECD-PD)或者胞外结构域(ECD)或者胞内结构域(ICD)或者Her 2 Neu一起孵育后体外脾细胞的淋巴组织增生。
图8和图9显示了依据通过ELISA测量的总Ig(图8)或者依据这些应答中IgG同种型分布(图9)的抗免疫原(ECD-PD)的体液免疫应答。
结论
3次注射后,所述抗体的诱发:AS02B+AS07A>AS01B>AS02B=AS06=AS05>AS07A。
总体结论
所测试的佐剂(AS1,AS2,AS7)具有相似结果。然而,AS1和AS7或者AS2和AS7的组合是更有效的佐剂。在接受所述组合佐剂的动物中进行4次接种疫苗之后,清楚地显示了对完整分子ECD-PD以及对单独的每个部分(ECD和ICD)的CMI。本发明的所述制剂对于诱发肿瘤消退很有效。
实施例6:用P703P抗原免疫小鼠
该实验设计用来用抗原研究各种各样的佐剂制剂。所述抗原是抗原Prostase(Ferguson,等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,3114-3119))和流感病毒NS1的N末端1-81片段的融合体(P703P-NS1)。
组别 | 抗原(25μg) | 佐剂 |
1 | P703P-NS1 | 无(磷酸缓冲盐溶液(PBS)) |
2 | P703P-NS1 | CpG |
3 | P703P-NS1 | 在膜中具有QS21的脂质体+CpG |
4 | P703P-NS1 | 在膜中具有QS21和3D-MPL的脂质体+CpG |
5 | P703P-NS1 | 具有QS21和3D-MPL的含母育酚水包油型乳液+CpG |
6 | P703P-NS1 | 含母育酚水包油型乳液+CpG |
在上述组别中使用的含母育酚水包油型乳液使用D,L,α-生育酚(CAS No.10191-41-0;化学名称:(2RS,4’RS,8’RS)-2,5,7,8-四甲基-2-(4’,8’,12’-三甲基-十三烷基)-6-二氢苯并呋喃醇));它以ROCHETM市售。如果存在母育酚,则所述母育酚存在于水包油型乳液中,所述乳液包含与2.5%(体积)角鲨烯组合的2.5%(体积)母育酚。将这两种油混合,加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80TM),然后进行微流化(M110S微流控机,最多50道,在6巴最大输入压(输出压约为850巴)下达2分钟,如WO 95/17210中所述)。因此,第5组和第6组基于添加含水QS21、3D-MPL和/或CpG的上述母育酚乳液。
如果在任一种以上疫苗组中存在QS21和3DM-MPL,则它们以5μg/剂存在;以50μg剂量加入CpG(OLIGO 4(SEQ ID NO:4):TCGTCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT)。
第3组和第4组使用的佐剂依照EP 0 822 831 B1(所述文献的内容通过引用结合到本文中)中所述技术来制备。
疫苗接种方法
给各组B6F1小鼠以14天的间隔肌内接种疫苗4次(以50μl的体积)。
结果
图10和图11显示了第2次疫苗接种后和第4次疫苗接种后14天、在与3μg/ml免疫原(NS1-P703P)或者毕赤酵母(pichia)表达的P703P(15μg/ml)或者非特异性NS1-OspA融合蛋白一起孵育后的脾细胞体外淋巴组织增生。
图12和图13显示了依据通过中点效价(mid point titre)ELISA测量的总Ig(图10)或者依据这些应答中IgG同种型分布(图11)的抗所述免疫原(P703P-NS1)的体液免疫应答。
Claims (14)
1.一种免疫原性组合物,所述组合物包含癌抗原以及一种包含与免疫刺激性寡核苷酸一起的皂苷的佐剂组合物,所述癌抗原选自:
与异源融合配偶体连接的MAGE抗原、与异源融合配偶体连接的prostase抗原;包含prostase的至少20个连续氨基酸的prostase片段、突变型prostase;
P5015;
Cripto;
缺乏相当大部分Her 2 neu跨膜结构域的Her 2 neu衍生物。
2.一种权利要求1的组合物,所述组合物还包含脂多糖。
3.一种权利要求1的组合物,其中所述皂苷是QS21。
4.一种权利要求2或3中任一项的组合物,其中所述脂多糖选自:
i单磷酰脂质A
ii3-O-去酰化单磷酰脂质A
iii二磷酰脂质A。
5.一种权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少两个CpG基序。
6.一种权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫刺激性寡核苷酸选自:SEQ ID No 1-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)SEQ ID No 2-TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)SEQ ID No 3-ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGSEQ ID No 4-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)SEQ ID No 5-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)。
7.一种权利要求1-6中任一项的组合物,其中配制所述皂苷以形成ISCOMS或脂质体。
8.一种权利要求1-6中任一项的组合物,其中所述皂苷存在于水包油型乳液中。
9.一种权利要求1-8中任一项的组合物,所述组合物包含基本上Her 2 neu的整个胞外结构域。
10.一种权利要求8的组合物,其中所述Her 2 neu分子缺乏功能性跨膜结构域。
11.一种权利要求1-10的组合物,所述组合物另外包含Her 2 neu的磷酸化结构域。
12.一种治疗患有或易患表达Her 2 neu或前列腺特异性抗原/肿瘤抗原的癌患者的方法,所述方法包括给予安全有效量的权利要求1-11中任一项的组合物。
13.一种治疗患有或易患表达MAGE、prostase、P501S或Cripto中任一种的癌患者的方法,所述方法包括给予安全有效量的权利要求1-11中任一项的组合物。
14.皂苷、免疫刺激性寡核苷酸和抗原的组合在生产治疗或预防肿瘤的药物中的应用,所述抗原选自;
与异源融合配偶体连接的MAGE抗原、
与异源融合配偶体连接的prostase抗原、包含prostase的至少20个连续氨基酸的prostase片段、突变型prostase;
P501S;
Cripto;
缺乏Her 2 neu跨膜结构域基本部分的Her 2 neu衍生物。
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