KR20070114230A

KR20070114230A - 백신

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Publication number: KR20070114230A
Application number: KR1020077026150A
Authority: KR
Inventors: 나탈리 가르콘; 캐더린 마리 기슬라인 제랄드; 진 스테펜
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-16
Publication date: 2007-11-29
Also published as: SI1326638T1; PL208755B1; EP1326638B1; EP1326638B9; CA2425358A1; BR0114786A; CN1481255A; DK1326638T3; CA2425358C; AU4433702A; ES2295229T3; NO335919B1; CZ20031093A3; JP2004511527A; HU229642B1; EP1326638A2; MXPA03003408A; CN100548373C; HUP0402067A2; IL155282A0

Abstract

본 발명은 암 항원으로 사용하기 위한 신규한 애쥬번트 제형을 제공한다. 애쥬번트는 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

Description

백신 {VACCINES}

본 발명은 암 항원 또는 이들의 유도체의 배합물 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 사포닌을 포함하는 배합된 애쥬번트 조성물을 포함하는 신규한 제형에 관한 것이다. 항원은 바람직하게는 Her 2 neu 유도체 또는 전립선 항원이고, 결과적으로 본 발명의 제형은 상기 항원을 발현하는 인간의 치료 및 예방에 유용하다. 바람직한 구체예에서, 애쥬번트 조성물은 추가적으로 리포폴리사카라이드를 포함한다.

막대한 자금 및 인적 자원의 투자에도 불구하고, 암은 사망의 주요한 원인 중 하나로 남아 있다. 예를 들어, 암은 35세 내지 74세 여성의 사망의 첫번째 원인이다. 유방암은 여성의 가장 일반적인 악성 종양이고, 유방 암의 발병율은 증가중이다. 9명의 여성 중 1명이 이 질병으로 진단될 것으로 추정된다. 유방암을 치료하기 위한 표준 접근법은 외과술, 방사선치료 및 화학치료의 조합을 중심으로 행해진다. 이러한 접근법은 특정 악성 종양에서 일부의 경우 상당히 성공적이었다. 그러나, 유방암은 특정 단계를 넘은 유방암으로 진단될 경우에 거의 치료가 불가능하다. 초기 진단 및 치료를 위한 대안적인 접근법이 필요하다.

메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드("CpG")를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 전신 경로 및 점막 경로 둘 모두에 의해 투여될 경우에 애쥬번트인 것으로 당 기술 분야에 공지되어 있다(참조: WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). CpG는 DNA에 존재하는 시토신-구아노신 디뉴클레오티드 모티프에 대한 약어이다. 역사적으로 BCG의 DNA 부분은 항종양 효과를 보이는 것으로 관찰되었다. 추가의 연구에서, BCG 유전자 서열로부터 유도된 합성 올리고뉴클레오티드는 (시험관내 및 생체내 둘 모두에서) 면역자극성 효과를 유도할 수 있음이 제시되었다. 이들 연구의 저자들은 중앙 CG 모티프를 포함하는 특정 회문식 서열(palindromic sequence)이 이들 활성을 가진다고 결론지었다. 면역 자극에서 CG 모티프의 주요 역할은 후에 크리그(Krieg, Nature 374, p546, 1995)에 의한 간행물에서 밝혀졌다. 상세한 분석에 따르면, CG 모티프는 특정 서열 환경에 있어야 하고 이러한 서열은 박테리아 DNA에는 흔하지만, 척추동물 DNA에는 드물다고 한다. 면역자극성 서열은 종종 퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘이고, 여기서 디뉴클레오티드 CG 모티프는 메틸화되지 않았고 다른 메틸화되지 않은 CpG 서열은 면역자극성인 것으로 공지되어 있고 본 발명에 사용될 수 있다.

6개 뉴클레오티드의 특정 조합에, 회문식 서열이 존재한다. 몇몇 이들 모티프는 하나의 모티프의 반복 또는 상이한 모티프의 조합으로 동일한 올리고뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 이들 면역자극성 서열이 하나 이상 존재하는 것은, 천연 살세포(인터페론 γ를 생성하고 세포 용해 활성을 가짐) 및 마크로파지를 포함하는 다양한 면역 서브세트를 활성화할 수 있다(참조: Wooldrige et al., Vol 89(no.8), 1977). 하지만, 이러한 컨센서스 서열(consensus sequence)을 가지지 않는 다른 메틸화되지 않은 CpG 함유 서열은 현재 면역조절성인 것으로 나타났다.

CpG는 백신으로 제형화될 경우에, 일반적으로 유리 항원과 함께(참조: WO 96/02555) 또는 공유결합에 의해 항원에 컨쥬게이션(conjugation)되어(참조: PCT 공개 번호 제 WO 98/16247호) 유리 용액 중에서 투여되거나, 수산화알루미늄과 같은 담체와 함께 제형화된다(참조: (Hepatitis surface antigen) Davis et al., 상기와 같음; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998 95(26), 15553-8).

본 발명은 면역자극성 올리고뉴클레오티드(CpG) 및 사포닌, 및 선택적으로 리포폴리사카라이드 배합물이 매우 유효한 애쥬번트라는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 선택적으로 리포폴리사카라이드의 배합물을 암 항원 또는 이들의 유도체와 함께 포함하는 백신 배합물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 애쥬번트 제형은 사포닌, 바람직하게는 QS21, 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 3D-MPL을 포함한다.

본 발명의 애쥬번트 배합물은, 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 장내박테리아 리포폴리사카라이드 유도된 애쥬번트를 포함한다. 장내박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)는, 이의 애쥬번트로서의 용도가 이의 독성 효과로 인해 축소됨에도 불구하고, 면역 시스템의 유효한 자극제라는 것이 오랫동안 공지되어 왔다. 중심 탄수화물 기와 인산염을 환원 말단 글루코사민으로부터 제거하여 생산된 LPS의 비독성 유도체인 모노포스포릴 리피드 A(MPL)가 리비 등(Ribi et al)에 의해 설명된 바 있고(참조: 1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Pulb. Corp., NY, p407-419), 이는 하기 구조를 가진다:

추가로 독성이 제거된 MPL의 형태는 디사카라이드 주쇄의 3번 위치로부터 아실 쇄를 제거하여 얻어지고, 이를 3-O-데아실화된 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)라고 한다. 이는 GB 2122204B에서 교시된 방법에 의해 정제되고 제조될 수 있고, 이 문헌은 또한 디포스포릴 리피드 A 및 이들의 3-O-데아실화된 변형체의 제조 방법을 공개하고 있다. 3D-MPL의 바람직한 형태는 지름이 0.2㎛ 미만인 작은 입자 크기를 가지는 에멀젼의 형태이고, 이의 제조 방법은 WO 94/21292에 설명되어 있다. 모노포스포릴 리피드 A 및 계면활성제를 포함하는 수성 제형은 WO 98/43670A2에 기술되어 있다.

본 발명의 애쥬번트 배합물로 제형화된 박테리아 리포폴리사카라이드 유도된 애쥬번트는 박테리아 공급원으로부터 정제되고 가공될 수 있거나, 대안적으로 이들은 합성될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노포스포릴 리피드 A는 문헌(Ribi et al, 1986, 상기와 같음)에 기술되어 있고, 살모넬라균(Salmonella sp.)로부터 유래된 3-O-데아실화된 모노포스포릴 또는 디포스포릴 리피드 A가 GB 2220211 및 US 4912094에 기술되어 있다. 다른 정제 리포폴리사카라이드 및 합성 리포폴리사카라 이드가 설명된 바 있다(WO 98/01139; US 6,005,099 및 EP 0 729 473 B1; Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 70(4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141-6; 및 EP 0 549 074 B1). 특히 바람직한 박테리아 리포폴리사카라이드 애쥬번트는 3D-MPL 및 β(1-6) 글루코사민 디사카라이드이고, 이는 US 6,005,099 및 EP 0 729 473 B1에 기술되어 있다.

따라서, 본 발명에서 사용될 수 있는 LPS 유도체는 LPS, MPL, 또는 3D-MPL의 구조와 그 구조가 유사한 면역자극제이다. 본 발명의 다른 면에서, LPS 유도체는 아실화된 모노사카라이드일 수 있고, 이는 MPL의 상기 구조의 하위 부분이다.

바람직한 디사카라이드 애쥬번트는 하기 화학식의 정제되거나 또는 합성된 리피드 A이다:

상기 식에서, R2는 H 또는 PO3H2일 수 있고, R3는 아실 쇄 또는 하기 식을 가지는 β-히드록시미리스토일 또는 3-아실옥시아실 잔기일 수 있다:

상기 식에서 R⁴는

이고, X 및 Y는 0 이상 약 20 이하의 값을 가진다.

3D-MPL 및 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quilaja Saponaria molina)의 수피로부터 유래된 사포닌 애쥬번트의 배합물이 EP 0 761 231B에 설명되어 있다. WO 95/17210은 면역자극제 QS21, 선택적으로 3D-MPL과 함께 제형화된, 스쿠알렌, α-토코페롤, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(TWEEN80)에 기초한 애쥬번트 에멀젼 시스템을 공개하고 있다.

사포닌은 전신 투여를 위한 백신 중의 애쥬번트로서 알려져 있다. 개별적인 사포닌의 애쥬번트 활성 및 용혈성 활성은 당 기술분야에서 집중적으로 연구되어 왔다(참조: Lacaille-Dubois 및 Wagner, 상기와 같음). 예를 들어, 퀼(Quil) A(남아프리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나로부터 유래됨) 및 이의 분획은 US 5,057,540, 문헌("Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2): 1-55), 및 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다.

퀼 A의 분획을 포함하는 면역 자극 복합체(Immune Stimulating Complexs, ISCOMS)라고 불리는 미립자 구조는 용혈성이고, 백신의 제조에 사용되어 왔다(참조: Morein, B., EP 0 109 942 B1). 이들 구조는 애쥬번트 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다(참조: WO 96/11711).

용혈성 사포닌 QS21 및 QS17(퀼 A의 HPLC 정제 분획)은 유효한 전신성 애쥬번트로서 설명된 바 있고, 이들의 생산 방법이 미국 특허 제 5,057,540호 및 EP 0 362 279 B1에 설명되어 있다. 또한, 이들 참고 문헌에 전신성 백신에 대한 유효한 애쥬번트로서 작용하는 QS7(퀼 A의 비용혈성 분획)의 용도가 설명되어 있다. Q21의 용도는 추가로 문헌(Kensil et al., 1991, J. Immunology vol 146, 431-437)에 설명되어 있다. QS21 및 폴리소르베이트 또는 시클로덱스트린의 배합물이 또한 공지되어 있다(참조: WO 99/10008). 퀼 A의 분획, 예를 들어 QS21 및 QS7을 포함하는 미립자 애쥬번트 시스템이 WO 96/33739 및 WO 96/11711에 기술되어 있다.

전신성 백신 접종 연구에서 사용되어 온 다른 사포닌은 깁소필라(Gypsophila) 및 사포나리아(Saponaria)와 같은 다른 식물 종으로부터 유래된 것들을 포함한다(참조: Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992).

사포닌은 또한 점막으로 적용되는 백신 연구에서 사용되어 온 것으로 알려져 있고, 이 점막으로 적용되는 백신은 면역 반응을 유도하는 데 있어 변동적인 성공율을 보였다. 과거, 퀼-A 사포닌은 항원이 비강내로 투여되는 경우에 면역 반응의 유도에 효과를 보이지 않는 것으로 나타났다(참조: Gizurarson et al., 1994, Vaccine Research 3, 23-29). 반면에 다른 저자들은 이들 애쥬번트를 사용하여 성공한 바 있다(참조: Maharaj et al., Can.J.Microbiol, 1986, 32(5):414-20; Chavali and Campbell, Immunobiology, 174(3):347-59). 퀼 A 사포닌을 포함하는 ISCOM은 위내 및 비강내 백신 제형으로 사용되어 왔고, 애쥬번트 활성을 보였다(참 조: Mcl Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317-322; Mcl Mowat and Donachie, Immunology Today, 12, 383-385).

퀼(Quil) A의 비독성 분획인 QS21은 또한 경구 또는 비강내 애쥬번트로서 설명된 바 있다(참조: Sumino et al., J.Virol., 1998, 72(6):4931-9; WO 98/56415).

사포닌은 문헌(Lacaille-Dubois, M and Wagner H., 1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins, Phytomedicine vol 2 pp363-386)에 교시되어 있다. 사포닌은 식물 및 해저 동물계에 널리 분포된 스테로이드 또는 트리테르펜 글리코시드이다. 사포닌은 진탕시에 포말을 형성하는 수중 콜로이드 용액을 형성하고, 콜리스테롤을 침전시킨다는 점에서 주목된다. 사포닌이 세포막에 가까이 있을 경우에, 이들은 막이 파열되도록 하는 막 중의 포어(pore)-유사 구조를 생성한다. 적혈구의 용혈은 이러한 현상의 일례이고, 이는 전부는 아니지만 특정 사포닌의 특성이다.

바람직하게는, 본 발명의 백신은 추가로 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 애쥬번트 및 백신 조성물 중의 올리고뉴클레오티드는 항원 특이적 면역 반응의 유도에 있어 배합된 사포닌/리포폴리사카라이드와 상승적으로 작용하여 종양 퇴화를 증강시킨다. 제형은 Th1 타입 면역 시스템과 통상적으로 관련된 면역 반응의 유도에 유효하다. 따라서, 애쥬번트 배합물은 질병의 면역예방 뿐만 아니라 암과 같은 질병의 면역치료에 적합하다.

제형은 항종양 항원을 함유하여 암의 면역치료적 처치를 위해 유용하다. 예를 들어, 애쥬번트 제형은 전립선암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 신장암 또는 흑색종암과 같은 종양 거부 항원에 유용성을 가진다. 항원의 예로는 MAGE 1, 3, 및 MAGE 4 또는 WO99/40188에 공개된 다른 MAGE 항원, PRAME, BAGE, Lage(또한 NY Eos 1으로도 공지됨) SAGE 및 HAGE(참조: WO 99/53061) 또는 GAGE(참조: Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)이 포함된다. 사실, 이들 항원은 흑색종암, 폐암종, 육종 및 방광암종과 같은 광범한 종양 타입에서 발현된다.

본 발명에 사용하기 위한 MAGE 항원은 면역 융합 파트너 또는 발현 증강제와의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 유도체는 이종 파트너에 연결된 MAGE 단백질 패밀리, 바람직하게는 MAGE 3으로부터의 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 이 단백질은 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있지만, 바람직하게는 재조합 융합 단백질로 발현되어 비융합 단백질에 비하여 발현 시스템에서 증가된 수준으로 발현될 수 있다. 이와 같이, 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프 (면역 융합 파트너), 바람직하게는 인간에 의해 인지되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 돕거나, 천연의 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질을 발현하는 것을 돕는다(발현 증강제). 바람직하게는 융합 파트너는 면역 융합 파트너 및 발현 증강 파트너 둘 모두일 것이다.

본 발명의 바람직한 형태에서, 면역 융합 파트너는 그람음성 박테리아, 헤모필러스 인플루엔자 B(Haemophilus influenza B)(WO91/18926)의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유래된다. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 대략적으로 단백질의 앞쪽 1/3, 특히, 대략적으로 N-말단으로부터 100 내지 110개 아미노산을 포함한다. 바람직하게는 단백질 D 유도체는 지질화(lipidation)된다. 바람직하게는 리포단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기는 N-말단 상에 포함되어 추가적인 외인성 T-세포 에피토프를 가진 백신 후보 항원을 제공하고 대장균에서의 발현 수준을 증가시킨다(따라서, 발현 증강제로서도 작용). 지질 꼬리는 항원의 항원 제시 세포로의 최적 제시를 확보한다.

다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스의 비구조성 단백질, NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 통상적으로 N 말단의 81개 아미노산이 사용되지만, 상이한 단편이 T-헬퍼 에피토프를 포함한다면 이들 단편이 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 면역 융합 파트너는 LYTA로서 공지된 단백질이다. 바람직하게는 분자의 C 말단 부분이 사용된다. Lyta는 N-아세틸-L-알라닌 아미다제, 아미다제 LYTA(lytA 유전자에 의해 코딩됨), 펩티도글리칸 주쇄에서 특정 결합을 특이적으로 분해하는 오토라이신을 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니 애(Streptococccus pneumoniae)로부터 유래된다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 친화성을 가지는 원인이 된다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발을 위하여 연구된 바 있다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 기술되어 있다(참조: Biotechnology: 10, 1992, page 975-798). 본원에서 사용된 바와 같이, 바람직한 구체예는 잔기 178에서 출발하는 C 말단 단부에서 발견되는 Lyta 분자의 반복 부분을 사용한다. 특히 바람직한 형태는 잔기 188-305를 혼입한다.

상기 기술된 면역 융합 파트너는 또한 발현을 보조하는데 이점을 가진다. 특히, 상기 융합체는 천연 재조합 MAGE 단백질보다 높은 수율로 발현된다. 이러한 구조물은 Wo 99/40188에 공개되어 있다.

다른 종양-특이적 항원은 본 발명의 애쥬번트와 함께 사용되기에 적합하고, 종양 특이적 강글리오시드(ganglioside) 예를 들어 GM2 및 GM3 또는 이들의 담체 단백질과의 컨쥬게이트(conjugate)를 포함하나 이에 제한되지는 않거나; 상기 항원은 많은 암의 치료 또는 면역학적거세에 유용한 10개 아미노산의 짧은 펩티드인 전장 고나도트로핀(Gonadotrophin) 호르몬 방출 호르몬(GnRH, WO 95/20600)과 같은 자기 펩티드 호르몬일 수 있다.

추가의 구체예에서, 다른 전립선 항원 예를 들어, 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, PSCA(참조: PNAS 95(4) 1735-1740, 1998), PSMA가 사용되거나, 바람직한 구체예에서 프로스타제라고 알려진 항원이 사용된다.

프로스타제는 잠재적인 분비성 기능을 나타내는 보존성 세린 프로스타제 촉매 삼개체(triad) H-D-S 및 아미노 말단 프리 프로펩티드 서열을 가지는 254개 아미노산 길이의 전립선-특이적 세린 프로테아제(트립신 유사)이다(참조: P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 1999, 96, 3114-3119). 추정 글리코실화 부위가 설명되었다. 예상 구조는 다른 공지된 세린 프로테아제와 매우 유사하고, 이는 성숙한 폴리펩티드가 단일 도메인으로 폴딩(folding)된다는 것을 제시한다. 성숙한 단백질은 천연적으로 가공된 것으로 보이는 1개의 A2 에피토프를 가지는 224개 아미노산 길이이다.

프로스타제 뉴클레오티드 서열 및 연역된 폴리펩티드 서열 및 동족체는 문헌(Ferguson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) 및 국제 특허 출원 WO 98/12302(또한, 대응 특허 US 5,955,306), WO 98/20117(또한, 대응 특허 US 5,840,871 및 US 5,786,148)(전립선 특이적 칼리크레인(Kallikrein)) 및 WO 00/04149(P703P)에 공개되어 있다.

본 발명은 프로스타제 단백질 및 이의 단편 및 동족체("유도체")에 기초한 프로스타제 단백질 융합체를 포함하는 제형을 제공한다. 이러한 유도체는 전립선 종양 치료에 적합한 치료 백신 제형에 사용하기에 적합하다. 통상적으로 단편은 상기 인용된 특허 및 특허 출원에 공개된 20개 이상, 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 100개의 연속된 아미노산을 함유할 것이다.

하나의 구체예에서, 단백질의 활성 부위에서 돌연변이가 일어나는 변이된 프로스타제 항원을 제공한다. 이 프로스타제 항원 유도체 또는 이들의 단편 및 동족체는 단백질의 활성 부위에 돌연변이를 가져서, 이것의 프로스타제 생물학적 활성을 실질적으로 감소시키거나 바람직하게 제거한다. 바람직한 돌연변이는 세린 프로테아제의 히스티딘 및 아스파르테이트 촉매 잔기를 교체하는데 관여한다. 바람직한 구체예에서, 프로스타제는 활성 부위 예를 들어, 프로스타제 서열의 71번 잔기에서 히스티딘-알라닌 돌연변이를 함유한다(참조: Ferguson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119). 예를 들어 WO 00/041949에 공개된 동족체 단백질의 대응 돌연변이가 명시적으로 고려된다. 예를 들어 이 돌연변이는 P703P의 43번 위치에 해당한다. 상기 돌연변이는 단백질의 촉매 효율(촉매 특이적 활성으로 표현)에 상당한 감소를 가져올 수 있다. 바람직하게는 촉매 효율의 감소는 10³배 이상, 보다 바람직하게는 10⁶배 이상이다. 히스티딘 알라닌 돌연변이를 거친 단백질은 이하에서는 *(별모양)으로 언급된다.

하나의 구체예에서, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 프로스타제는 융합 단백질의 부분이고, 융합단백질은 종양 관련 프로스타제 또는 이들의 단편 또는 동족체 및 융합 파트너로서 작용하는 단백질의 부분 또는 이종 단백질을 포함한다. 단백질 및 융합 파트너는 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있으나, 바람직하게는 이종 발현 시스템에서 재조합 융합 단백질로서 발현된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 보조할 수 있는 면역 융합 파트너와 결합된, 프로스타제 융합 단백질 또는 이들의 단편 또는 동족체가 제공된다. 따라서, 융합 파트너는, 외래 단백질 또는 펩티드에 특이적인 많은 T 세포에 의해 활성화 시그날 분비와 연계된 구경꾼 헬퍼 효과를 통하여 작용할 수 있고, 따라서 비융합 단백질과 비교하여 프로스타제 성분에 대한 면역성의 유도를 증강시킨다. 바람직하게는, 이종 파트너는 대다수의 인간의 T 세포에 의해 인지될 수 있도록 선택된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 발현 증강제로 작용하는 융합 파트너에 연결된 프로스타제 단백질 또는 이들의 단편 또는 동족체를 제공한다. 이와 같이, 융합 파트너는 이종 시스템에서 프로스타제의 발현을 돕는 것을 보조할 수 있어, 천연 재조합 단백질에 비하여 발현 시스템에서 증가된 수준으로 생성될 수 있도록 한다.

바람직하게는, 융합 파트너는 면역 융합 파트너 및 발현 증강제 파트너 둘 모두일 것이다. 따라서, 본 발명은 융합 파트너와 결합된 변이된 종양-특이적 프로스타제 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 융합 파트너는 면역 융합 파트너 및 발현 증강제 파트너 둘 모두로서 작용한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 형태에서, 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스의 비구조 단백질, NS1(헤마글루티닌) 또는 이들의 단편이다. 통상적으로, N-말단의 81개 아미노산이 사용될 수 있지만, 상이한 단편이 T 헬퍼 에피토프를 포함한다면 이들이 사용될 수 있다(참조: C. Hackett, D. Horowitz, M. Wysocka & S. Dillon, 1992, J. Gen. Virology, 73, 1339-1343). NS1이 면역 융합 파트너인 경우에, 이는 보다 높은 발현 수율을 달성할 수 있도록 하는 추가적인 이점을 가진다. 특히, 상기 융합체는 천연 재조합 프로스타제 단백질 보다 더 높은 수율로 발현된다.

가장 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 5개 내지 226개 카르복시 말단 아미노산에 융합된 NS1 비구조 단백질의 N-말단의 81개 아미노산을 포함한다. 대안적인 발현 파트너는 예를 들어 단백질 D 및 이의 단편, 및 MAGE 항원과의 관계에서 사용되는 C-Lyta를 포함한다.

추가의 바람직한 프로스타제 항원은 WO98/37814의 서열 번호 113인 P501S로서 공지된다. 면역원성 단편 및 이의 부분은 상기 인용된 특허 출원에서 공개된 바와 같이 적어도 20개, 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 100개의 연속된 아미노산을 포함한다. 예를 들어 PS108을 참조할 수 있다(참조: WO 98/50567).

다른 프로스타제 특이적 항원은 WO 98/37418 및 WO/004149에 공지되어 있다. 다른 것은 STEAP이다(참조: PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).

본 발명과 관련하여 유용한 다른 종양 관련 항원은, Plu-1(참조: J. Biol. Chem. 274(22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, 크립토(Cripto)(참조: Salmon et al, Bioassays 199, 21 61-70, 미국 특허 제 5654140호), 및 크립틴(Criptin)(미국 특허 제 5 981 215호)를 포함한다. 추가적으로, 암 치료용 백신에 특히 적합한 항원은 또한 티로시나아제(tyrosinase) 및 설비빈(survivin)을 포함한다.

Muc1과 같은 뮤신 유래 펩티드는 예를 들어 US 5744,144, US 5827,666, WO 8805054, US 4,963,484를 참조할 수 있다. 특히, Muc 1 펩티드의 하나 이상의 반복 단위, 바람직하게는 둘 이상의 반복 단위를 포함하고, SM3 항체에 의해 인지되 는(US 6 054 438) Muc 1 유래 펩티드를 고려할 수 있다. 다른 뮤신 유래 펩티드는 Muc 5의 펩티드를 포함한다.

본 발명은 또한 Her 2 neu, 맘마글로빈(참조: 미국 특허 제 5668267호), 또는 WO/0052165, WO99/33869, WO99/19479, WO98/45328에서 공개된 것들과 같은 유방 암 항원과 배합되어 유용하다. Her 2 neu 항원이 특히 미국 특허 제 5,801,005호에 공개되어 있다. 바람직하게는 Her 2 neu 항원은 대략적으로 전체 세포외 도메인(약 1개 내지 645개 아미노산을 포함) 또는 이들의 단편, 및 전체 세포내 도메인(C 말단의 580개 아미노산) 또는 최소한 이의 면역원성 부분을 포함한다. 특히, 세포내 부분은 포스포릴화 도메인 또는 이들의 단편을 포함하여야 한다. 상기 구조물은 WO 00/44899에 공개되어 있다. 특히 바람직한 구조물은 ECD PD로서 공지되어 있고, 제 2 구조물은 ECD ΔPD로서 공지되어 있다. WO 00/44899를 참조할 수 있다.

본원에서 사용된 Her 2 neu는 래트, 마우스, 또는 인간으로부터 유래될 수 있다.

Her 2 neu 항원은 기능적 막횡단 도메인 또는 이들의 부분이 없는 완전한 Her 2 neu 항원일 수 있다. 바람직한 부분은 세포외 도메인을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, WO 00/44899에 공개된 (그리고 본원에 참고로 통합된) 세포내 도메인의 부분과 연결된 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공된다.

본 발명은, 온혈 동물에서 악성종양에 대하여, 악성을 보이는 증폭된 Her 2 neu 유전자가 유전자의 단백질 발현 산물이 종양에 존재하는 것을 필요로 하지 않 는 경우를 포함하여, Her 2 neu 종양유전자 발현의 단백질 산물에 대한 면역성을 조절할 수 있는 제형, 바람직하게는 유발하거나 증강시킬 수 있는 제형에 관한 것이다. 예를 들어, 유전자의 과발현은 종양 형성의 시작 및 초기 단계와 관련될 수 있으나, 후속하여 단백질 발현이 감소되거나 없을 수 있다. 본 발명은, Her 2 neu 양성 종양의 확립을 막을 수 있고 존재하는 Her 2 neu 양성 종양의 퇴화를 야기하는 것 이외에, Her 2 neu 양성을 Her 2 neu 음성으로 전환시키는 효과적인 면역 반응을 유발하거나 증강시키는데 사용될 수 있다.

하기 약어는 명세서 전체를 통하여 사용된다: "ECD"는 세포외 도메인을 의미하고, "ICD"는 세포내 도메인을 의미하고, "PD"는 세포내 도메인 내에 있는 포스포릴화 도메인(예를 들어 포스포릴화된 도메인)을 의미하고, "ΔPD"는 포스포릴화 도메인 내에 있는 포스포릴화 도메인의 단편을 의미하고, "KD"는 세포내 도메인 내에 있는 키나아제 도메인의 단편을 의미한다. Her 2 neu 유전자의 발현의 산물은 본원에서 "Her 2 neu 단백질"이라 하고, 이는 또한 "p185" 또는 "c-erbB2"로서 공지되어 있다.

본원에서 "ECD-ICD" 또는 "ECD-ICD 융합 단백질"로서도 언급되는 "Her 2 neu ECD-ICD 융합 단백질"은 Her 2 neu 단백질의 세포외 도메인 (또는 이들의 단편) 및 세포내 도메인 (또는 이들의 단편)을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 이들은 본 발명과 관련하여 사용되는 바람직한 항원을 나타낸다. 본원에서 사용되는 ECD-ICD 융합 단백질은 Her 2 neu 막횡단 도메인의 상당한 부분을 포함하지 않고, 바람직하게는 Her 2 neu 막횡단 도메인을 포함하지 않는다.

용어 "Her 2 neu ECD-ICD 융합 단백질" 및 "Her 2 neu ECD-PD 융합 단백질" 및 이들과 관련된 용어는 또한 이들의 단편, 동족체 및 이들의 기능적 등가물(총괄적으로 "변이체"를 의미)을 의미하는 것으로 이해되고, 예를 들어 여기서 하나 이상의 아미노산은 본 발명의 바람직한 구체예에서 (i) Her 2 neu 단백질과 비교하여 면역 반응의 유발 또는 증강을 증가시키거나, (ii) Her 2 neu 단백질과 비교하여 면역 반응의 유발 또는 증강에 실질적으로 영향을 미치지 않는다(예를 들어, 변이체는 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포에 의한 반응을 자극하거나 항체의 생성을 자극한다). Her 2 neu ECD-ICD 융합 단백질 및 Her 2 neu ECD-PD 융합 단백질의전형적인 단편, 동족체 및 기능적 등가물을 포함하는 변이체의 한정되지 않는 특정 예가 본원에 보다 상세하게 기술되어 있다. 변이체는 천연 폴리펩티드 구성요소를 포함하는 융합 단백질과 "상당히 동일"하거나 "상당히 유사"할 수 있고, 면역 반응을 자극할 수 있는 능력을 보유한다.

Her 2 neu PD는 268개의 아미노산 길이를 가지고, 세포내에 있고, 단백질 티로신 키나아제에 의해 포스포릴화될 수 있다. 이 영역은 다른 티로신 키나아제 수용체의 대응 부분과 일치하지 않는다. 따라서, 상기 도메인의 특이성 및 유일성은 종양 백신으로 사용되는 데 특히 바람직하게 한다. 그러나, 박테리아 및 포유류 세포에서 상기 도메인만의 발현은 문제가 있다. 예를 들어, 생성된 PD 단백질은 매우 불안정하여 대규모 생산에 적절하지 않다. 따라서, 하나의 구체예에서 본 발명은 바람직하게는 세포내 도메인의 전체 또는 일부, 또는 Her 2 neu 세포외 도메인 전체 또는 일부에 대한 포스포릴화 도메인을 포함하는 융합체를 사용한다. 본 발명의 ECD-ICD 융합 단백질 및 ECD-PD 융합 단백질은 용해성이고 분비되며 배양 배지에서 안정하다.

본 발명의 백신은 Her 2 neu 발현과 같은 종양 관련 항원 발현을 특징으로 하는 임의의 암에 대하여 유용할 것이다. 세포외 도메인 또는 이의 변이체와의 융합 단백질로서 세포내 도메인 또는 포스포릴화 도메인, 또는 이들의 변이체의 발현의 증가를 가능하게 하는 것 외에, ECD-ICD 및 ECD-PD 융합 단백질은 개선된 백신 제형을 위하여 제공된다.

따라서, 본 발명은 애쥬번트 조성물을 포함하는 백신 제형을 제공하고, 이 애쥬번트는 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 막횡단 도메인이 없는 Her 2 neu 항원을 포함한다. Her 2 neu 분자는 래트, 마우스, 인간의 것, 또는 이들의 하이브리드일 수 있다. 바람직하게는, Her 2 neu 분자는 세포외 도메인을 실질적으로 전부 포함한다. 실질적으로 전부라는 것은 100개 이하, 바람직하게는 75개 미만, 보다 바람직하게는 50개 미만의 아미노산이 세포외 도메인으로부터 결실되었다는 것을 의미한다. 전체 세포외 도메인이 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 인간 Her 2 neu 구조물 중 세포외 도메인은 바람직하게는 실질적으로 모든 N 말단의 600개 아미노산, 보다 바람직하게는 N 말단의 630개 아미노산 보다 바람직하게는 약 650개 아미노산을 포함한다. 인간 ICD는 아미노산 676번으로부터 1255번 발린에 이른다. 포스포릴화 도메인은 ICD의 N 말단 부분에 위치한다. 본 발명에 사용되는 구조물은 포스포릴화 도메인을 포함하지만 기능적 막횡단 도메인은 포함하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는 막횡단 도메인은 모두 함께 결 실된다. 본 발명에 사용하기에 특히 적합한 구조물은 WO/0044899에 공개되어 있다. Her 2 neu 항원은 리포좀 또는 수중유 에멀젼 담체와 함께 3D-MPC, QS21, 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 제형화된다. 상기 제형은 체액성 및 세포성 매개 반응 둘 모두를 생성한다. 단지 QS21 및 3D-MPL을 포함하는 애쥬번트 제형과 비교하여, 본 발명의 제형은 마우스에서 보다 강한 TH1 반응을 제시한다. CpG만의 제형은 현저한 세포 매개 면역 반응을 생성하지 않았다.

제형은 종양-지지 메카니즘(예를 들어, 혈관생성, 종양 침투)와 관련된 항원예를 들어, tie 2, VEGF를 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 애쥬번트 또는 백신용 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 3개 이상, 보다 바람직하게는 6개 이상 뉴클레오티드에 의해 분리된, 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드간 결합은 포스포로디티오에이트 결합이거나 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스테르 및 다른 뉴클레오티드간 결합은 혼합된 뉴클레오티드간 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 범위 내이다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생성하는 방법은 US 5,666,153, US5,278,302, 및 WO95/26204에 설명되어 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드의 예는 하기 서열을 가진다. 서열은 바람직하게는 포스포로티오에이트 개질된 뉴클레오티드간 연결을 함유한다.

대안적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 중요하지 않게 서열이 결실되거나 첨가된 상기 바람직한 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 사용되는 CpG 올리고뉴클레오티드는 당 기술 분야에 공지된 임의의 방법(예를 들어 EP 468520)에 의해 합성될 수 있다. 편리하게, 이러한 올리고뉴클레오티드는 자동 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 이들은 통상적으로 10 내지 50개 염기 길이이다.

본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 결합은 포스포로디티오에이트이거나, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스테르가 본 발명의 범위 내에 속한다. 상이한 뉴클레오티드간 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 예를 들어 혼합된 포스포로티오에이트 포스포디에스테르가 고려될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 안정화하는 다른 뉴클레오티드간 결합이 사용될 수 있다.

본 발명의 애쥬번트 배합물에서 사용될 수 있는 사포닌은 퀼 A라고 하는 퀼라자 사포나리아 몰리나의 수피로부터 유래된 것들 및 이의 분획을 포함한다. 이들은 US 5,057,540, 문헌("Saponins as vaccine adjunamts", Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2): 1-55), 및 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다. 퀼 A의 특히 바람직한 분획은 QS21, QS7 및 QS17이다.

β-에신(β-Escin)은 본 발명의 애쥬번트 조성물에 사용하기 위한 다른 바람직한 용혈성 사포닌이다. 에신은 머크 인덱스(Merk index, 12^th ed: entry 3737)에 떡갈나무(라틴어: Aesculus hippocastanum)의 종자에 나타나는 사포닌의 혼합물로서 기술되어 있다. 이들의 분리는 크로마토그래피 및 정제(참조: Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213, 1953), 및 이온 교환 수지(참조: Erbring et al., US 3,238,190)에 의해 설명된다. 에신의 분획, □및 □는 정제되었으며 생물학적으로 활성을 가지는 것으로 보인다(참조: Yoshikawa M, et al., Chem Pharm Bull(Tokyo) 1996, Aug: 44(8):1454-1464). β-에신은 또한 아에신(aescin)으로 공지되어 있다.

본 발명에 사용되는 다른 바람직한 용혈성 사포닌은 디기토닌(Digitonin)이다. 디기토닌은 머크 인덱스(12^th ed: entry 3737)에 사포닌으로 기술되어 있고, 이는 디기탈리스 펄퓨레아(Digitalis purpurea)의 종자에서 유래되고 문헌(Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; 및 Ruhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1995, 301, 621)에 기술된 방법에 따라 정제된다. 이의 용도는 콜레스테롤 측정을 위한 임상 시약으로서 설명된다.

본 발명의 애쥬번트 배합물은 추가로 담체를 포함할 수 있어, 사포닌 또는 CpG, 또는 리포폴리사카라이드가 미립자 담체 물질과 결합되어 배합물의 애쥬번트 성을 증강시킬 수 있다. 특히 바람직한 전신성 백신은 예를 들어 담체 분자를 포함한다.

본 발명의 애쥬번트 배합물에 사용되는 CpG는 유리 용액 중에 있을 수 있거나, 무기염(예를 들어 알루미늄 염 또는 칼슘 염, 다만 이에 제한되지 않음), 리포좀, ISCOM, 에멀젼(수중유, 유중수, 수중유 중 수), 중합체(예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리포스파진, 폴리아미노산, 알지네이트, 키토산, 다만 이에 제한되지 않음), 또는 미세입자과 같은 미립자 담체와 복합체를 이룰 수 있다. 바람직하게는 상기 담체는 양이온성이다. 본 발명의 백신은 CpG-담체 복합체와 결합할 수 있거나 CpG-담체 복합체와 결합할 수 없는 항원을 추가로 포함한다. 이 경우에, 항원은 유리 현탁액이거나 분리된 담체와 결합될 수 있다.

본 발명의 사포닌 형성 부분은 미셀(micelle)의 형태로 분리될 수 있거나, 콜레스테롤 및 지질과 제형화될 경우에 ISCOM(참조: EP 0 109 942 B1) 또는 리포좀(참조: WO 96/33739)와 같은 큰 정렬 구조의 형태 또는 수중유 에멀젼의 형태(참조: WO 95/17210)일 수 있다. 사포닌은 바람직하게는 금속 염 예를 들어 수산화 알루미늄 또는 인산 알루미늄과 결합할 수 있다(참조: WO 98/15287). 대안적으로 사포닌은 키토산과 같은 미립자 담체와 결합할 수 있다. 사포닌은 또한 분말과 같은 건조 상태에 있을 수 있다. 백신 접종자의 점막 표면으로 투여되는 형태의 최종 제형은 바람직하게는 사실상 용혈성이다. 사포닌은 직접적인 결합을 통하거나 동일한 미립자 담체 분자와의 공동 상호작용에 의하여 항원과 물리적으로 결합되거나 결합되지 않을 수 있다(참조: GB9822712.7; WO 98/16247).

본 발명의 애쥬번트 또는 백신 중의 CpG 및 사포닌 및 리포폴리사카라이드는 분리되거나 결합될 수 있다. 예를 들어, CpG 및 사포닌은 유리 현탁액 중에 있거나 담체, 보다 바람직하게는 수산화알루미늄과 같은 미립자 담체를 통하여 또는 양이온성 리포좀 또는 ISCOM에 의해 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 애쥬번트 배합물은, 수중유 에멀젼 또는 DQ를 포함하는 군으로부터 선택된 QS21 및 미립자 담체와 함께, 2개의 인접한 CG 모티프 사이에 3개 이상 바람직하게는 6개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 하나 이상의 CpG 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 리포폴리사카라이드가 디포스포릴 리피드 유도체 또는 모노포스포릴 리피드 유도체, 바람직하게는 3 데-O 아실화, 특히 3 데 O 아실화 모노포스포릴 리피드 A인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 애쥬번트 배합물은 QS21과 혼합된 CpG 2006(서열번호 4) 또는 CpG 1758(서열번호 2) 또는 CpG 1826(서열번호 1), 및 수중유 에멀젼 또는 DQ를 포함하는 군으로부터 선택된 미립자 담체를 포함한다. 이와 같이, 특히 바람직한 백신은 예를 들어 애쥬번트 배합물 및 항원을 포함한다. 본 발명의 바람직한 백신은 전신 경로를 통하여 개체에 투여된 후에 전신성 면역 반응을 일으키는 데 사용된다.

본 발명의 애쥬번트 배합물은 오일에 기초한 에멀젼을 포함할 수 있다. 오일 에멀젼 애쥬번트는 프로인트(Freunds) 완전 및 불완전 무기 오일 에멀젼 애쥬번트에 대한 작업을 포함하여 수년동안 공지되어 왔다. 그 때 이후로 많은 작업이 수행되어 상기 유효하고 반응성있는 애쥬번트 제형에 대한 안정하고 내성이 우수한 대체물을 고안하였다.

많은 단상 또는 다상 에멀젼 시스템이 설명된 바 있다. 수중유 에멀젼 애쥬번트는 그 자체로 애쥬번트 조성물(참조: EP O 399 843B)로서 유용한 것으로 제안된 바 있고, 또한 수중유 에멀젼 및 다른 활성 작용제의 배합물이 백신에 대한 애쥬번트로서 설명된 바 있다(참조: WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). 다른 오일 에멀젼 애쥬번트 예를 들어 유중수 에멀젼(참조: US 5,422,109; EP 0 480 982 B2) 및 수중유 중 수 에멀젼(참조: US 5,424,067; EP 0 480 981 B)이 설명된 바 있다.

본 발명에 사용되는 오일 에멀젼 애쥬번트는 천연적이거나 합성된 것일 수 있고, 무기물 또는 유기물일 수 있다. 무기 및 유기 오일의 예는 당업자에게 용이하게 명백하다.

임의의 수중유 조성물이 인간에게 투여하기에 적합하도록 하기 위해서는, 에멀젼 시스템의 오일 상은 바람직하게는 대사될 수 있는 오일을 포함한다. 대사될 수 있는 오일의 의미는 당기술 분야에 널리 공지되어 있다. "대사될 수 있는"이란 "대사작용에 의하여 변형될 수 있는"이라고 정의될 수 있다(참조: Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition, 1974). 오일은 임의의 식물성 오일, 어류 오일, 동물성 오일, 또는 합성 오일일 수 있고, 이는 투여자에게 비독성이고, 대사작용에 의해 변형될 수 있다. 견과류(예를 들어 땅콩 오일), 종자, 및 곡류가 식물성 오일의 일반적인 공급원이다. 합성 오일 또한 본 발명의 부분이고, 이는 NEOBEE®등과 같은 구입가능한 오일을 포함할 수 있다. 스쿠알렌(2, 6, 10, 15, 19, 23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔) 은 상어 간 오일에서 대량 발견되고, 올리브 오일, 맥아 오일, 미강 오일 및 효모에서 소량 발견되는 불포화 오일이고, 본 발명에 사용되기에 특히 바람직한 오일이다(참고: 머크 인덱스, 10th Edition, entry no. 8619). 스쿠알렌은 콜레스테롤의 생합성에서의 중간체라는 점에서 대사될 수 있는 오일이다(참고: 머크 인덱스, 10th Edition, entry no. 8619).

특히 바람직한 오일 에멀젼은 수중유 에멀젼이고 특히 수중 스쿠알렌 에멀젼이다.

또한, 본 발명의 가장 바람직한 오일 에멀젼은 항산화제이고, 이는 바람직하게는 오일 α-토코페롤(비타민 E, EP 0 382 271 B1)이다.

WO 95/17210 및 WO 99/11241은, 선택적으로 면역자극제 QS21 및/또는 3D-MPL과 함께 제형화된 스쿠알렌, α-토코페롤, 및 TWEEN 80에 기초한 에멀젼 애쥬번트를 공개한다. WO 99/12565는 오일 상으로 스테롤을 첨가하여 상기 스쿠알렌 에멀젼을 개선한 것을 공개한다. 추가적으로, 트리글리세리드 예를 들어 트리카프릴린(C₂₇H₅₀O₆)이 에멀젼을 안정화하기 위하여 오일상에 첨가될 수 있다(참조: WO 98/56414).

안정한 수중유 에멀젼 내에서 발견되는 오일 소적의 크기는 바람직하게는 1 마이크론 미만이고, 이는 광자 상관 분광법에 의해 측정된 경우에 실질적으로 지름이 30 내지 600nm의 범위내이고, 바람직하게는 실질적으로 약 30 내지 500nm이고, 가장 바람직하게는 실질적으로 150 내지 500nm이고, 특히 약 150nm이다. 이와 관 련하여, 오일 소적의 80%(개수)가 바람직한 범위 내이어야 하고, 보다 바람직하게는 그 개수가 90%를 초과하는 오일 소적이, 가장 바람직하게는 그 개수가 95%를 초과하는 오일 소적이 규정된 크기 범위 내이어야 한다. 본 발명의 오일 에멀젼에 존재하는 화합물의 양은 통상적으로 2 내지 10%가 오일 예를 들어 스쿠알렌이고, 알파 토코페롤은 이것이 존재하는 경우 2 내지 10%이고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트와 같은 계면활성제는 이것이 존재하는 경우에 0.3% 내지 3%이다. 바람직하게 오일:알파 토코페롤의 비율은 1이하이며, 이때 알파 토코페롤이 보다 안정한 에멀젼을 제공한다. 스판 85는 또한 약 1% 수준으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 백신이 추가로 안정화제를 함유하는 것이 유리할 것이다.

수중유 에멀젼을 생성하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 방법은 PBS/TWEEN80^TM 용액과 같은 계면활성제와 오일 상을 혼합하고, 다음에 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 균질화하는 것을 포함하고, 주사기 바늘을 통해 혼합물을 2회 통과시키는 것을 포함하는 방법이 적은 부피의 액체를 균질화하는데 적절하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 동일하게, 마이크로플루이다이저(microfluidiser, M110S 마이크로플루이딕스 머쉰, 최대 6바의 압력 주입시(약 850바의 배출 압력) 2분동안 최대 50회 통과)에서 에멀젼화 방법은 당업자에 의해 개조되어 보다 적거나 많은 부피의 에멀젼을 생성할 수 있다. 이러한 개조는, 요구되는 지름의 오일 소적이 제조될 때까지 생성된 에멀젼을 측정하는 것을 포함하는 통상의 실험에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 애쥬번트 배합물은 전신성 또는 점막성 애쥬번트 둘 모두로서 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 형태에서, 전신 또는 비경구 경로, 예를 들어 근내, 피내, 경피성, 피하, 복막내 또는 정맥내 투여를 통하여 투여되는 전신성 백신이 제공된다. 바람직한 투여 경로는 경피성 경로 예를 들어 피부 패치를 통하여이다.

본 발명의 전신성 백신 제조물은 근내, 복막내, 피내, 경피성, 정맥내, 또는 피하 투여에 의하여 상기 백신을 투여함에 의하여 질병에 감수성이 있거나 질병에 걸린 포유류를 보호하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 백신 제조물의 전신성 투여 방법은 통상적인 주사기 및 바늘 또는 고체 백신의 탄도 투여를 위하여 고안된 장치(참조: WO 99/27961), 또는 바늘없는 압력 액체 제트 장치(참조: US 4,596,556; US 5,993,412), 또는 경피성 패치(WO 97/48440; WO 98/28037)를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 피부에 적용된 항원의 면역원성을 증강시키는데 사용될 수 있다(경피성 또는 경피 투여 WO 98/20734; WO 98/28037). 따라서, 본 발명은 본 발명의 백신 또는 애쥬번트 조성물로 사전에 충전된 전신성 투여를 위한 전달 장치를 제공한다. 따라서, 항원, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 사포닌, 및 담체를 포함하는 백신을 개체에게 투여(여기서, 백신은 비경구 또는 전신성 경로에 의해 투여됨)하는 것을 포함하여, 개체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다. 면역 반응을 유도하는 바람직한 방법은, Q21과 같은 퀼 A로부터 유래된 사포닌, 및 수중유 에멀젼 예를 들어 리포솜 함유 콜레스테롤 또는 백반과 같은 담체와 함께, 예를 들어 Her 2 neu 유도체에 대한 백신을 투여하는 것을 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 백신 제조물은 경구/소화 또는 비강 경로와 같은 점막 경로를 통하여 상기 백신을 투여함에 의하여 질병에 감수성이 있거나 질병에 걸린 포유류를 보호하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 대안적인 점막 경로는 질내 및 직장내 투여이다. 투여의 바람직한 점막 경로는 비강내 백신 접종이라고 불리는 비강내 경로를 통해서이다. 비강내 백신 접종 방법은 면역화될 개체의 비인두로 백신의 소적, 스프레이, 또는 건조 분말 형태를 투여하는 것을 포함하여 당기술분야에 널리 공지되어 있다. 분무되거나 에어로졸화된 백신 제형도 또한 본 발명의 일부이다. 위 저항성 캡슐과 같은 장내 제형, 경구 투여를 위한 과립, 직장 또는 질내 투여를 위한 좌약도 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명의 애쥬번트 배합물은 점막 백신 접종으로 전신성 백신 접종을 대체하는 인간용으로 적절한 점막 애쥬번트 군을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 형태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드와 배합된 QS21, 에신, 디기토닌 또는 깁소필라(Gypsophila) 또는 체노포디움 퀴노아(Chnopodium quinoa) 사포닌을 포함하여, 퀼 A와 같은 순수한 사포닌 또는 이의 유도체는 항원의 점막 투여를 위한 애쥬번트로서 사용되어 전신성 면역 반응을 수행할 수 있다.

본 발명의 애쥬번트 배합물은 백신 제형에 사용되고, 백신은 전신성 또는 점막성 경로를 통하여 투여될 수 있다. 바람직하게는, 백신이 점막성 투여를 위하여 사용되는 경우에 애쥬번트 배합물이 용혈성 사포닌을 포함한다.

점막성 투여를 위하여, 바람직하게는 본 발명의 조성물은 용혈성 사포닌을 포함한다. 용혈성 사포닌 또는 사포닌 제조물은 본 발명의 의미내에서 하기 검정 을 참조하여 결정될 것이다.

1. 기니아 피그로부터 얻은 신선한 혈액을 데스크-탑 원심분리기에서 인산염완충염수(PBS)로 3회 세척한다. 본래 부피로 재현탁시킨 후에, 혈액을 추가로 PBS 중에서 10배 희석시킨다.

2. 상기 혈액 현탁액 50㎕를 계면활성제 또는 사포닌의 2배 희석액을 함유하는 PBS 800㎕에 첨가한다.

3. 8시간 후에, 상청액의 광학 밀도를 측정하거나 시각적으로 용혈 현상을 검정한다. 570nm에서 빛을 흡수하는 적색 상청액의 존재는 용혈 현상을 가리킨다.

4. 결과는 용혈 현상이 더 이상 일어나지 않는 첫번째 사포닌 희석액의 농도로서 표현된다.

본 발명의 목적을 위하여, 사포닌 애쥬번트 제조물은, 이것이 0.1% 미만의 농도에서 적혈구를 용해하는 경우에 용혈성이다. 참고로, 퀼 A, QS21, QS7, 디기토닌, 및 β-에신의 실질적으로 수순한 샘플은 모두 상기 검정에서 정의된 용혈성 사포닌이다. 상기 생물학적 검정 고유의 실험적 변수내에서, 본 발명의 사포닌은 바람직하게는 약 0.5 내지 0.00001%, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.00001%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.00001%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 0.0004%의 용혈 활성을 가진다. 이상적으로, 상기 사포닌은 QS21의 용혈 활성과 유사한 활성(예를 들어 10배 차이내)을 가져야 한다.

본 발명의 백신은 또한 경구 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 약제학적으로 허용되는 부형제는 또한 알칼리성 완충액 또는 장내 캡슐 또는 미세과립을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 또한 질내 경로에 의해서 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 약제학적으로 허용되는 부형제는 또한 에멀젼화제, CARBOPOL^®과 같은 중합체 및 질내 크림 및 좌약의 다른 공지된 안정화제를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 또한 직장 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 부형제는 또한 직장 좌약을 형성하기 위하여 당기술 분야에 공지된 왁스 및 중합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 애쥬번트 배합물 중의 하나 이상의 사포닌의 제조는 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 예를 들어, QS21, QS7, 퀼 A, β-에신 또는 디기토닌을 포함하는 군 중 2개 이상의 배합물. 추가적으로, 본 발명의 조성물은 1개 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 배합물을 포함할 수 있다.

대안적으로, 제형은 키토산, 또는 다른 폴리양이온성 중합체, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜리드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민-기초한 중합체 매트릭스, 폴리사카라이드 또는 화학적으로 개질된 폴리사카라이드로 구성된 입자, 리포좀 및 지질-기초한 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자 등으로 구성된 백신 비히클(vehicle)과 배합될 수 있다. 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재 하에 제형화되어 리포솜 또는 ISCOM과 같은 미세 구조를 형성할 수 있다. 또한, 사포닌은, 비미립자 용액 또는 현탁액, 또는 파우실라멜라(paucilamelar) 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미립자 구조로 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 제형화될 수 있다. 사포닌은 또한 Carbopol^®과 같은 부형제로 제형화되어 점성을 증가시 키거나, 락토오스와 같은 분말 부형제와 함께 건조 분말 형태로 제형화될 수 있다.

특히 바람직한 애쥬번트는, 본원에 기술된 바와 같이 3D-MPL 및 QS21(참조: EP 0 671 948 B1), 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 수중유 에멀젼(참조: WO 95/17210, WO 98/56414), 또는 CpG 올리고뉴클레오티드와 배합된 다른 담체(참조: EP 0 689 454 B1)와 제형화된 3D-MPL의 배합물들이다. 본 발명의 애쥬번트 또는 백신 중의 CpG 또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 양은 일반적으로 적지만, 백신 제형에 따라 용량 당 1 내지 1000㎍, 바람직하게는 1 내지 500㎍, 보다 바람직하게는 1 내지 100㎍의 범위 내일 수 있다.

본 발명의 애쥬번트 중에 사용되는 사포닌의 양은 용량 당 1 내지 1000㎍, 바람직하게는 1 내지 500㎍, 보다 바람직하게는 1 내지 250㎍, 가장 바람직하게는 1 내지 100㎍의 범위 내일 수 있다. CpG:사포닌(w/w)의 비율은 따라서 1:1000 내지 1000:1의 범위 내이고, 통상적으로는 1:100 내지 100:1의 범위 내이고, 바람직하게는 1:10 내지 1:1 또는 1:1 내지 10:1의 범위 내이고, 가장 바람직하게는 1:1, 4:1, 또는 10:1의 범위 내일 것이다.

본 발명의 제형은 예방 및 치료 목적 둘 모두를 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 사포닌, 리포폴리사카라이드 및 CpG 분자의 암, 특히 유방 암종 및 전립선 암종의 예방 및 치료를 위한 백신 제조용 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 감염성 질병 또는 암, 또는 알레르기, 또는 자가면역 질병에 감수성이거나 이러한 질병에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 측면에서, 본원에서 약제로서의 용도로 설명된 리포폴리사카라이드, 사포닌 및 CpG를 포함하는 백 신 또는 애쥬번트 배합물을 제공한다. 백신 제조물은 전체적으로 문헌(참조: New Trends and Deveopments in Vaccines, edited by voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A, 1978)에 설명되어 있다.

따라서, 본 발명은, 개체의 전신성 경로를 통하여 본원에서 실질적으로 설명된 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 개체가 전립선암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 자궁암 또는 흑색종암을 포함하는 군으로부터 선택된 질병에 걸리는 것을 예방하는 방법을 제공한다.

대안적으로, 항원 및 용혈성 사포닌을 포함하는 점막성 백신 조성물이 본 발명에 의해 제공된다. 따라서, 개체의 점막 표면에, 본원에서 실질적으로 기술된 조성물을 투여하여 질병에 감수성이 있거나 질병에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 항원 및 용혈성 사포닌을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 점막 표면에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 전신성 항원 특이적 면역 반응을 유발하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 사포닌을 취하고 CpG 분자를 취하여 이들을 항원과 혼합시키는 것을 포함하여 백신 또는 애쥬번트의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 배합물에 사용되기에 적절한 약제학적으로 허용되는 염의 예에는 물, 인산염 완충 염수, 등장 완충액이 포함된다.

실시예 1:

ㆍECD-PD를 WO 00/44899의 방법에 따라 CHO 세포에서 생성시켰다.

제형을 마우스와 토끼에서 시험하였다.

ㆍ제형을 많은 대조군과 비교하였다.

SBAS1+SBAS7:

CpG 올리고뉴클레오티드 2006 3D-MPL, 리포좀 중의 QS21과 제형화된 ECD-PD.

SBAS1 제형

리포솜 중의 QS21 및 리포솜과 결합된 3D-MPL을 포함하여 EP 0822831의 방법에 따라 제조하였다.

SBAS1+SBAS7 제형

제형에 상기 CpG 올리고뉴클레오티드 2006을 첨가하였다. 항원을 사용 전에 애쥬번트 제형에 혼합하였다.

SBAS1+SBAS7-기초 제형 (마우스)

백신 50㎕의 1회 용량에 대하여, ECD-PD 단백질(25㎍)을 10배 농축된 PBS(pH 6.8) 및 H₂O 중에 희석시킨 후, SB62를 포함하는 수중유 에멀젼을 연속적으로 첨가하였다: SB62를 포함하는 수중유 에멀젼은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 2.0% 트윈 80으로 제조하여 이를 포함하고; 입자 크기는 180nm이었다.

에멀젼 SB62(2배 농축)의 제조

트윈 80을 인산염 완충 염수(PBS) 중에 용해하여 PBS 중의 2% 용액을 제공하였다. 100㎖의 2배 농축 에멀젼을 제공하기 위하여, DL 알파 토코페롤 5g 및 스쿠알렌 5㎖을 볼텍싱(vortexing)하여 완전히 혼합하였다. PBS/트윈 용액 90㎖을 첨가하고 완전히 혼합시켰다. 다음에, 생성된 에멀젼은 주사기를 통해 통과시키고, 최종적으로 M11OS 마이크로플루이딕스 머쉰을 사용하여 마이크로유체화시켰다. 생성된 오일 소적은 약 180nm의 크기를 가진다. 그 후, 3D-MPL(10㎍), QS21(10㎍), 50㎍ CpG ODN 2006을 첨가하고, 30분 후에, 보존제로 50㎍/㎖ 티오멀살(thiomersal)을 첨가하였다. 모든 인큐베이션은 교반과 함께 실온에서 수행되었다.

SBAS 2 제형을 CpG 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것을 제외하고 상기와 같이 제조하였다.

SBAS7은 CpG 올리고뉴클레오티드 2006이다.

SBAS7+SBAS2-기초 제형 (토끼)

백신 500㎕의 1회 용량에 대하여, ECD-PD 단백질(100㎍)을 10배 농축된 PBS(pH 6.8) 및 H₂O 중에 희석시킨 후, SB62 250㎕, 3D-MPL(100㎍), QS21(100㎍) 및 500㎍의 CpG ODN 2006을 연속적으로 첨가하고, 30분 후에, 50㎍/㎖ 티오멀살을 보존제로 첨가하였다. 모든 인큐베이션은 교반과 함께 실온에서 수행되었다.

실시예 2: 종양 챌린지(challenge) 실험

F1(C57×Balb c) 마우스 군(8마리 마우스/군)에 1, 14, 28, 42일째에 항원의 인간용 용량(25㎍)의 1/10을 주사하고, 56일 째에 Her 2를 발현하는 TC1 세포를 거의 2×10⁶ TC1 Her 2 세포/동물로 피하로 투여하여 챌린징(challenging)하였다.

1/2 동물 비장에 대한 TC1 세포를 56일째에 수집하고 동물을 방혈시켰다.

도 1에 도시된 바와 같이, CpG 올리고뉴클레오티드를 3D-MPL/QS21 제형에 첨 가하는 것은 종양 퇴행을 상승적으로 증강시키고, 이들 제형만이 마우스에서 거의 완전한 종양 퇴행을 야기하였다.

실시예 3: 토끼에서의 상이한 애쥬번트 중의 ECD-PD의 면역원성

4마리 토끼의 6개 군을 각각 0, 21 및 42일째에 AS02, AS01, AS05, AS06 (백반에 흡착된 CpG 2006), AS07 및 AS02B+AS07 중 ECD-PD 100㎍으로 면역화하였다.

3회 투여 후 14일째에 혈청을 분석하였고, 표 1은 본 발명의 제형이 높은 역가의 항체 반응을 일으키는 데 시험된 다른 제형보다 우수함을 제시한다.

	면역화 전	3회 투여 후 14일째
AS02B	50	96923
AS01B	173	196637
AS5	144	76221
AS6	142	74180
AS07A	480	3904
AS02B+AS07A	94	362713

실시예 4: 성체 레서스 원숭이에서의 Her 2 neu, ECD-PD의 면역원성

성체 레서스 원숭이를 다양한 애쥬번트 제형 중의 ECD-PD로 면역화하였다:

AS02 B - 수중유 에멀젼 중의 QS21, 3DMPL

AS01 - 리포솜 중의 QS21 3D-MPL

AS05 - 리포솜 중의 QS21

AS06 - CpG 2006 백반

AS07 - CpG 2006

AS02B+AS07 - 상세한 내용은 실시예 1을 참조.

본 발명의 제형들에서 보다 높은 항체 반응을 유발하는 백신 접종은 (AS)2+AS07)이었다. 도 1을 참조할 수 있다.

추가로, 분석은 항체 반응이 다클론성이라는 것을 제시하고, Her 2 neu 분자를 과발현하는 인간 유방암 세포주(SKBR3)의 시험관내 증식에 대한 억제 활성을 증명한다. Her 2 neu 발현 종양의 치료를 위한 단클론성 항체인 헤르셉틴(Herceptin)은 상기 세포주의 성장을 억제할 수 있다.

따라서, 제형으로 능동적 백신 접종한 후에 생성되는 항체는 작용성인 것으로 나타났다.

실시예 5: ECD-PD 항원을 이용한 마우스 면역화

이 실험은 포스포릴화 도메인(ECD-PD)에 연결된 Her 2 Neu의 세포외 도메인의 융합체인 항원을 가지는 애쥬번트 제형의 범위를 조사하기 위해 설계된 것으로, WO 00/44899의 방법에 따라 CHO 세포 중에서 생성되었다.

군	항원 (25㎍)	애쥬번트
1	ECD-PD	없음 (인산염 완충 염수(PBS))
2	ECD-PD	막 중에 QS21과 3D-MPL을 갖는 리포솜
3	ECD-PD	QS21과 3D-MPL을 갖는 토콜 함유 수중유 에멀젼
4	ECD-PD	CpG
5	ECD-PD	막 중에 QS21과 3D-MPL을 갖는 리포솜 + CpG
6	ECD-PD	QS21과 3D-MPL를 갖는 토콜 함유 수중유 에멀젼 + CpG
7	ECD-PD	3D-MPL + CpG
8	ECD-PD	QS21 + CpG
9	ECD-PD	토콜 함유 수중유 에멀젼 + CpG
10	ECD-PD	막 중에 QS21을 갖는 리포솜 + CpG
11	ECD-PD	막 중에 3D-MPL을 갖는 리포솜 + CpG

상기 군에 이용된 토콜 함유 수중유 에멀젼으로 D,L,α-토코페롤(CAS No. 10191-41-0; 화학명: (2RS,4'RS, 8'RS)-2,5,7,8-테트라메틸-2-(4',8',12'-트리메틸-트리데실)-6-크로만올)을 이용하였고; 이것은 ROCHE™으로 시판된다. 만약 존재한다면, 토콜은 2.5 부피%의 스쿠알렌과 배합된, 2.5 부피%를 포함하는 수중유 에멀젼 중에 존재한다. 두 오일을 혼합하고, 마이크로유체화(M110S 마이크로플루이다이저, 6바(bar)의 최대 압력 주입시에 2분간(약 850바의 배출 압력), 최대 50회 통과, WO 95/17210에 기술됨)에 앞서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(트윈 80™)을 첨가하였다. 따라서, 군 3, 6 및 9는 수성 QS21, 3D-MPL 또는 CpG를 첨가시킨 상기 토콜 에멀젼을 기초로 하였다.

만약 존재한다면, 상기 모든 백신 군 중의 QS21과 3D-MPL은 5㎍/용량으로 포함된다; CpG (OLIGO 4 (서열번호:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT)를 50㎍ 용량으로 첨가하였다.

군 2, 5, 10에 사용된 애쥬번트를 EP 0 822 831 B1에 설명된 기술에 따라 제조하였다 (그 내용은 본원에 참고로 통합됨). 군 11은 리포솜의 막 중에 3D-MPL을 포함한다. 간단히 말해서, 3D-MPL, 디올레오일 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤을 함께 혼합하고, 단일층 리포솜으로 마이크로유체화시켰다 (EP 0 822 831 B1에 설명된 바에 따라 제조 - QS21 제외).

군 4, 7 및 8에 이용된 애쥬번트는 수성 현탁액 또는 수용액이다.

백신접종 방법

B6F1 마우스 군을 4회(50㎕ 부피로), 14일 간격으로, 근내 백신접종하였다. 4번째 백신 투여 후 14일 째, Her 2 neu를 발현하는 2 x 10⁶ TC1 종양 세포를 이용하여 마우스를 피하 챌린징시켰다.

Her 2 neu-TC1 종양 세포주를 Her 2 neu를 코딩하는 레트로바이러스 벡터에 의한 TC1 세포의 형질도입에 의해 생성하였다. 블라스토시딘(blastocydin)을 이용한 선별 기간 후에, 내성 클론을 분리하여 Her 2 neu 발현에 대하여 FACS로 스크리닝하였다. 가장 높은 Her 2 neu 발현을 보이는 클론을 선택하여 2×10⁶의 챌린지 용량이 야생형 TC1 세포와 유사한 성장 속도론을 가지고 대조군 동물 100%에 대해서 종양을 발병시킨다는 것을 확인하였다.

개개 종양의 크기를 1주일에 2회 측정하고 군의 평균으로 표현하였다.

결과

도 3은 군 1, 2, 4, 5 및 6의 종양 성장 결과를 표시한다. 도 4는 군 1, 5, 6, 7 및 11의 종양 성장 결과를 도시한다. 도 5는 군 1, 5, 6, 8, 9 및 10의 종양 성장 결과이다. 종양의 완전한 퇴행을 유발하는 유일한 백신은 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 사포닌 둘 모두를 함유하는 백신이었다.

도 6와 7은 5㎍/ml의 면역원(ECD-PD) 또는 세포외 도메인(ECD) 또는 세포내 도메인(ICD) 또는 Her 2 Neu와 함께 인큐베이션한 후의 시험관내 비장세포의 림프구증식을 나타낸 것이다.

도 8과 9는 ELISA에 의해 측정된 총 Ig의 관점에서 면역원(ECD-PD)에 대한 체액성 면역 반응(도 8) 또는 이들 반응내에서 IgG 동종형 분포(도 9)를 도시한 것이다.

결론:

3회 주사 후에, 항체 유도는 AS02B+AS07A > AS01B > AS02B = AS06 =AS05 > AS07A 순이었다.

총 결론:

시험된 애쥬번트(AS1, AS2, AS7)은 유사한 효과를 가졌다. 그러나, AS1와 AS7 또는 AS2와 AS7의 배합물은 보다 효과적인 애쥬번트였다. CM1은 4회 백신 접종 후에 전체 분자 ECD-PD와 조합된 애쥬번트를 투여받은 동물에서 명백하게 나타났고, 각 부분(ECD 및 ICD)와 각각 조합된 애쥬번트를 투여받은 동물에서도 또한 명백하게 나타났다. 본 발명의 제형은 종양 퇴행을 유도하는데 매우 효과적이었다.

실시예 6: P703P 항원을 이용한 마우스의 면역화

이 실험은 항원 프로스타제(참조: Ferguson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) 및 인플루엔자 바이러스에서 유래된 NS1의 N 말단의 1-81 단편(P703P-NS1)의 융합체인 항원을 갖는 애쥬번트 제형의 범위를 조사하기 위해 고안된 것이다.

군	항원 (25㎍)	애쥬번트
1	P703P-NS1	없음 (인산염 완충 염수(PBS))
2	P703P-NS1	CpG
3	P703P-NS1	막 중에 QS21을 갖는 리포솜 + CpG
4	P703P-NS1	막 중에 QS21과 3D-MPL를 갖는 리포솜 + CpG
5	P703P-NS1	QS21과 3D-MPL을 갖는 토콜 함유 수중유 에멀젼 + CpG
6	P703P-NS1	토콜 함유 수중유 에멀젼 + CpG

상기 군에 이용된 토콜 함유 수중유 에멀젼으로 D,L,α-토코페롤(CAS No. 10191-41-0; 화학명: (2RS,4'RS, 8'RS)-2,5,7,8-테트라메틸-2-(4',8',12'-트리메틸-트리데실)-6-크로만올)을 이용하였고; 이것은 ROCHE™으로 시판된다. 만약 존재한다면, 토콜은 2.5 부피%의 스쿠알렌과 배합된, 2.5 부피%를 포함하는 수중유 에멀젼 중에 존재한다. 두 오일을 혼합하고, 마이크로유체화(M110S 마이크로플루이다이저, 6바(bar)의 최대 압력 주입시에 2분간(약 850바의 배출 압력), 최대 50회 통과, WO 95/17210에 기술됨)에 앞서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(트윈 80™)을 첨가하였다. 따라서, 군 5와 6은 수성 QS21, 3D-MPL 및/또는 CpG를 첨가시킨 상기 토콜 에멀젼을 기초로 하였다.

만약 존재한다면, 상기 모든 백신 군 중의 QS21과 3D-MPL은 5㎍/용량으로 함유된다; CpG (OLIGO 4 (서열번호:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT)를 50㎍ 용량으로 첨가하였다.

군 3과 4에 이용된 애쥬번트를 EP 0 822 831 B1에 설명된 기술에 따라 제조하였다 (그 내용이 본원에 참고로 통합됨).

백신접종 방법

B6F1 마우스 군을 4회(50㎕ 부피), 14일 간격으로, 근육내로 백신 접종하였다.

결과

도 10과 11은, 3㎍/ml의 면역원(NS1-P703P) 또는 피치아(pichia) 발현된 P703P(15㎍/ml) 또는 비특이적인 NS1-OspA 융합 단백질과 함께 시험관내 인큐베이션 한 후, 두번째 백신 접종 후와 네번째 백신접종 이후 14일 째에 비장세포의 시험관내 림프구증식을 도시한 것이다.

도 12과 13은 중간값 역가 ELISA에 의해 측정한 총 Ig의 관점에서 면역원(NS1-P703P)에 대한 체액성 면역 반응(도 10) 또는 이들 반응내에서 IgG 동종형 분포(도 11)를 도시한다.

도 1은 다양한 애쥬번트 중의 ECD-PD의 항종양 효과를 도시한다.

도 2는 레서스 원숭이에서의 AS02B 중의 ECD-PD를 투여한 후의 중간값을 도시한다.

도 3은 군 1, 2, 4, 5 및 6의 종양 성장 결과를 표시한다.

도 4는 군 1, 5, 6, 7 및 11의 종양 성장 결과를 도시한다.

도 5는 군 1, 5, 6, 8, 9 및 10의 종양 성장 결과이다.

도 12과 13은 면역원(NS1-P703P)에 대한 체액성 면역 반응을 도시한다.

도 14는 백신접종에 의해 유발된 항-NS1-P703 이소타입의 분포를 도시한다.

<110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a. <120> Vaccines <150> GB 0025573.7 <151> 2000-10-18 <150> GB 0025574.5 <151> 2000-10-18 <150> US 09/690,921 <151> 2000-10-18 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial immunostimulatory oligonucleotide <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial immunostimulatory oligonucleotide <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial immunostimulatory oligonucleotide <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial immunostimulatory oligonucleotide <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial immunostimulatory oligonucleotide <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims

i) 이종 융합 파트너와 결합된 MAGE 단백질 패밀리로부터의 항원;

ii) 이종 융합 파트너와 결합된 프로스타제 항원;

iii) 이종 융합 파트너와 결합되거나 결합되지 않은, 프로스타제의 20개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 프로스타제 단편;

iv) P501S;

v) 크립토; 및

vi) Her-2/neu 막횡단 도메인의 실질적인 부분이 없는 Her-2/neu 항원 유도체로부터 선택된 암 항원, 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드와 함께 사포닌을 포함하는 애쥬번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물:
제 1항에 있어서, 리포폴리사카라이드를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 사포닌이 QS21임을 특징으로 하는 조성물.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 하기 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물:

i) 모노포스포릴 리피드 A

ii) 3-O-데아실화된 모노포스포릴 리피드 A

iii) 디스포스포릴 리피드 A.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 2개 이상의 CpG 모티프를 함유함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 하기 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물:

서열 번호 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

서열 번호 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

서열 번호 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

서열 번호 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

서열 번호 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌이 ISCOM 또는 리포솜을 형성하도록 제형화됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌이 수중유 에멀젼으로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, Her 2 neu의 세포외 도메인을 실질적으로 전부 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 8항에 있어서, Her 2 neu 분자에 기능적 막횡단 도메인이 없음을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, Her 2 neu의 포스포릴화 도메인을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
안전하고 유효한 양의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, Her 2 neu 또는 전립선 특이적/종양 항원을 발현하는 암에 걸리거나 이에 감수성이 있는 환자를 치료하는 방법.
안전하고 유효한 양의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, MAGE, 프로스타제, P501S 또는 크립토 중 어느 하나를 발현하는 암에 걸리거나 이에 감수성이 있는 환자를 치료하는 방법.
사포닌, 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 하기 군으로부터 선택된 암 항원의 배합물의 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 제조용 용도:

i) 이종 융합 파트너와 결합된 MAGE 단백질 패밀리로부터의 항원;

ii) 이종 융합 파트너와 결합된 프로스타제 항원;

iii) 이종 융합 파트너와 결합되거나 결합되지 않은, 프로스타제의 20개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 프로스타제 단편;

iv) P501S;

v) 크립토; 및

vi) Her-2/neu 막횡단 도메인의 실질적인 부분이 없는 Her-2/neu 항원 유도체.
하기 군으로부터 선택된 암 항원을 사포닌 및 CpG 분자와 혼합시키는 것을 포함하여, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법:

i) 이종 융합 파트너와 결합된 MAGE 단백질 패밀리로부터의 항원;

ii) 이종 융합 파트너와 결합된 프로스타제 항원;

iii) 이종 융합 파트너와 결합되거나 결합되지 않은, 프로스타제의 20개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 프로스타제 단편;

iv) P501S;

v) 크립토; 및

vi) Her-2/neu 막횡단 도메인의 실질적인 부분이 없는 Her-2/neu 항원 유도체.