NO335919B1 - Immunogen sammensetning, samt anvendelse derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et nytt preparat omfattende en kombinasjon av kreft-antigen eller et derivat derav og et kombinert adjuvanspreparat omfattende et immunostimulerende oligonukleotid og et saponin. Antigenet er fortrinnsvis et Her 2 neu-derivat eller et prostata-antigen og følgelig er preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelige for behandling og forebygging hos mennesker som uttrykker slike antigener.

Til tross for enorme investeringer av finansielle og humane ressurser er kreft fortsatt én av hovedårsakene til død. For eksempel er kreft den ledende årsak til død hos kvinner mellom alderen 35 og 74. Brystkreft er den mest vanlige ondartede sykdom hos kvinner og forekomsten av utvikling av brystkreft er stigende. Det er beregnet at én av ni kvinner vil bli diagnostisert med sykdommen. Standard metoder for å kurere brystkreft har sentrert rundt en kombinasjon av kirurgi, stråling og kjemoterapi. Disse metoder har resultert i noen dramatisk suksesser ved visse ondartede sykdommer. Imidlertid er brystkreft som oftest uhelbredelig når diagnostisert etter et visst stadium. Alternative metoder for tidlig diagnose og terapi er nødvendig.

Immunostimulerende oligonukleotider inneholdende umetylerte CpG dinukleotider ("CpG") og er kjent på området som adjuvantia når administrert via både systemisk og mukosal rute (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. lmmunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie og Davis, J. lmmunol., 1998, 161 (9):4463-6). CpG er en forkortelse for cytosin-guanosin-dinukleotid-motiver til stede i DNA. Historisk ble det observert at DNA-fraksjonen av BCG kunne utøve en anti-tumor effekt. I ytterligere undersøkelser ble syntetiske oligonukleotider avledet fra BCG-gensekvenser vist å være i stand til å fremkalle immunostimulerende effekter (både in vitro og in vivo). Opphavmennene til disse undersøkelser konkluderte med at visse palindrome sekvenser, omfattende et sentralt CG-motiv, hadde denne aktivitet. Den sentrale rolle til CG-motivet ved immunostimulering ble senere belyst i en publikasjon av Krieg, Nature 374, s.546 1995. Detaljert analyse har vist at CG-motivet må være i en viss sekvens-sammenheng og at slike sekvenser er vanlige i bakteriell DNA, men er sjelden i virveldyr DNA. Den immunostimulerende sekvens er ofte: Purin, Purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin; hvor dinukleotid CG-motivet ikke er metylert, men andre umetylerte CpG-sekvenser er kjent å være immunostimulerende og kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse.

I visse kombinasjoner av de seks nukleotider er en palindrom sekvens til stede. Mange av disse motiver, enten som repetisjoner av ett motiv eller en kombinasjon av forskjellig motiver, kan være til stede i samme oligonukleotid. Tilstedeværelse av ett eller flere av disse immunostimulerende sekvens-inneholdende oligonukleotider kan aktivere forskjellige immun-subsett, omfattende naturlige dreperceller (som produsere interferon y og har cytolytisk aktivitet) og makrofager (Wooldrige et al Vol 89 (nr. 8), 1977). Selv om andre umetylerte CpG-inneholdende sekvenser som ikke har denne konsensus sekvens nå har vært vist å være immunomodulerende.

CpG, når formulert i vaksiner, blir generelt administrert i fri løsning sammen med fritt antigen (WO 96/02555; McCluskie og Davis.ovenfor) eller kovalent konjugert til et antigen (PCT-publikasjon Nr. WO 98/16247) eller formulert med en bærer så som aluminiumhydroksyd ((hepatitt overflate-antigen) Davis et al., ovenfor; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).

Adjuvans-kombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte minst ett enterobakterielt lipopolysakkarid-avledet adjuvans.

Det har lenge vært kjent at enterobakterielt lipopolysakkarid (LPS) er en kraftig stimulator av immunsystemet, selv om dets anvendelse i adjuvantia er innskrenket av dets toksiske effekter. Et ikke-toksisk derivat av LPS, monofosforyl-lipid A (MPL), produsert ved fjerning av kjerne-karbohydrat-gruppen og fosfatet fra det reduserende ende glukosamin, er beskrevet av Ribi et al (1986, Immunology og Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, s.407-419) og har den følgende struktur:

En ytterligere detoksifisert versjon av MPL er et resultat av fjerning av acyl-kjeden fra 3-stillingen av disakkarid-ryggraden og er betegnet 3-0-deacylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL). Det kan renses og fremstilles ved metodene angitt i GB 2122204B, hvilken referanse også beskriver fremstilling av difosforyl lipid A og 3-0-deacylerte varianter derav. En foretrukket form av 3D-MPL er i form av en emulsjon som har en liten partikkelstørrelse mindre enn 0,2 |j,m i diameter og dens fremstillingsmetode er beskrevet i WO 94/21292. Vandige preparater omfattende monofosforyl-lipid A og et overflateaktivt middel er beskrevet i WO 98/43670A2.

De akterielle lipopolysakkarid-avledede adjuvantia som skal formuleres i adjuvans-kombinasjoner ifølge foreliggende oppfinnelse, kan renses og prosesseres fra bakterielle kilder eller alternativt kan de være syntetiske. For eksempel er renset monofosforyl-lipid A beskrevet i Ribi et al 1986 (ovenfor) og 3-0-deacylert monofosforyl- eller difosforyl-lipid A avledet fra Salmonella sp. er beskrevet i GB 2220211 og US 4912094. Andre rensede og syntetiske lipopolysakkarider er beskrevet (WO 98/01139; US 6,005,099 og EP 0 729 473 B1; Hilgers et al., 1986, IntArch. Allergy. lmmunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1 ):141-6; og EP 0 549 074 B1). Spesielt foretrukne bakterielle lipopolysakkarid-adjuvantia er3D-MPL og p(1-6)-glukosamin-disakkaridene beskrevet i US 6,005,099 og EP 0 729 473 B1.

WO 0009159 A1, WO 9961056 A2 og WO 0044899 A1 beskriver sammensetninger omfattende immunostimulatoriske oligonukleotider. WO 0009159 A1 beskriver spesielt oligonukleotider så som CpG motiv. WO 9961056 A2 beskriver spesielt immunostimulatoriske oligonukleotider omfattende et CpG motiv for indusering av mukosal immunitet.

LPS-derivater som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse er de immunostimulanter som er lignende i struktur med den til LPS eller MPL eller 3D-MPL. I et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan LPS-derivater være et acylert monosakkarid, som er en sub-del av ovenstående struktur av

MPL.

Et foretrukket disakkarid-adjuvans er et renset eller syntetisk lipid A med den følgende formel:

r

oe

OV'P-0 WLX^ vH -

H ./ H u V

hvor R2 kan være H eller P03H2; R3 kan være en acyl kjede eller p-hydroksymyristoyl eller a 3-acyloksyacyl residue som har formelen:

i

CmO

CHj

CH—O

<CHi>r *4

CH)

whtNh R<4>- — O—(CH!)*—CH),

and wherein X tixl Y have a value of from 0 up to about

20.

hvor R4 = -CO-(CH2)x-CH3

og hvor X og Y har en verdi fra 0 opp til ca. 20.

Kombinasjoner av 3D-MPL- og saponin-adjuvantia avledet fra barken av Killaja Saponaria molina er beskrevet i EP 0 761 231B. WO 95/17210 beskriver et adjuvans-emulsjonssystem basert på squalen, a-tocopherol og polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (TWEEN80), formulert med immunostimulanten QS21, eventuelt med 3D-MPL.

Saponiner er kjent som adjuvantia i vaksiner for systemisk administrering. Adjuvans- og hemolytisk aktivitet til individuelle saponiner er i stor utstrekning undersøkt på området (Lacaille-Dubois og Wagner, ovenfor). For eksempel er Quil A (utvunnet fra barken av det sydamerikanske tre Killaja Saponaria Molina) og fraksjoner derav beskrevet i US 5,057,540 og "Saponiner as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev TherDrug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; og EP 0 362 279 B1.

Partikkelformede strukturer, betegnet Immune Stimulerende Komplekser (ISCOMS), omfattende fraksjoner av Quil A er hemolytiske og har vært anvendt ved fremstilling av vaksiner (Morein, B., EP 0 109 942 B1). Disse strukturer er rapportert å ha adjuvans-aktivitet (EP 0 109 942 B1; WO 96/11711).

De hemolytiske saponiner QS21 og QS17 (HPLC-rensede fraksjoner av Quil A) er beskrevet som kraftige systemiske adjuvantia og metoden for deres produksjon er beskrevet i US-patent nr,5,057,540 og EP 0 362 279 B1. Også beskrevet i disse referanser er anvendelse av QS7 (en ikke-hemolytisk fraksjon av Quil-A) som virker som et kraftig adjuvans for systemiske vaksiner. Anvendelse av QS21 er ytterligere beskrevet i Kensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437). Kombinasjoner av QS21 og polysorbat eller cyklodekstrin er også kjent (WO 99/10008). Partikulære adjuvans-systemer omfattende fraksjoner av Quil A, så som QS21 og QS7 er beskrevet i WO 96/33739 og WO 96/11711.

Andre saponiner som har vært anvendt ved systemiske vaksinasjons-undersøkelser omfatter de utvunnet fra andre plantearter så som Gypsophila og Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

Saponiner er også kjent å ha vært anvendt i mukosalt påførte vaksine-undersøkelser, som har møtt variabel suksess ved induksjon av immunresponser. Quil-A saponin har tidligere vært vist å ha ingen effekt på induksjon av en immunrespons når antigen blir administrert intranasalt (Gizurarson et al. 1994. Vaccine Research 3, 23-29). Mens andre forfattere har anvendt dette adjuvans med suksess (Maharaj et al., Can. J. Microbiol, 1986, 32(5):414-20; Chavali og Campbell, Immunobiology, 174(3):347-59). ISCOM omfattende Quil A saponin har vært anvendt i intragastriske og intranasale vaksinepreparater og vist adjuvans-aktivitet (Mel Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317-322; Mel Mowat og Donachie, Immunology Today, 12, 383-385).

QS21, den ikke-toksiske fraksjon av Quil A, er også beskrevet som et oralt eller intranasalt adjuvans (Sumino et al., J. Virol., 1998, 72(6):4931-9; WO 98/56415).

Saponiner er beskrevet i: Lacaille-Dubois, M og Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponiner. Phytomedicine vol 2 s. 363-386). Saponiner er steroide eller triterpene glykosider bredt fordelt i plante- og det marine dyre-riket. Saponiner er registrert å danne kolloidale løsninger i vann som skummer ved risting og å utfelle kolesterol. Når saponiner er nær celle-membraner skaper de pore-lignende strukturer i membranen som forårsaker at membranen brister. Hemolyse av erytrocytter er et eksempel på dette fenomen, som er en egenskap til visse, men ikke alle, saponiner.

Foreliggende oppfinnelse angår det overraskende funn at kombinasjoner av immunostimulerende oligonukleotider (CpG) og saponin og eventuelt et lipopolysakkarid er ekstremt kraftige adjuvantia. Følgelig tilveiebringes en vaksine-kombinasjon omfattende en kombinasjon av saponin og et immunostimulerende oligonukleotid og eventuelt et lipopolysakkarid med kreft-antigen eller derivat derav. I en foretrukket utførelsesform omfatter adjuvanspreparatet et saponin, fortrinnsvis QS21, et immunostimulerende oligonukleotid og 3D-MPL.

Fortrinnsvis kan vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse videre omfatte en bærer. I en foretrukket form av foreliggende oppfinnelse virker oligonukleotidene i adjuvanset og vaksinepreparatene synergistisk med de samlede saponin/lipopolysakkarid for fremkalling av antigen-spesifikke immunresponser som fører til forbedret tumor-regresjon. Preparatene er kraftig for fremkalling av immunresponser konvensjonelt forbundet med Th1-type immunsystem. Følgelig er adjuvanskombinasjonene ikke bare egnet for immunoforebygging av sykdommer, men også for immunoterapi av sykdommer så som kreft.

Preparatene inneholder et anti-tumor antigen og er anvendelige for immunoterapeutisk behandling av kreft. For eksempel er adjuvanspreparatet anvendelig med tumoravvisende antigener så som de for prostata-, bryst-, kolorektal-, lunge-, bukspyttkjertel, nyre- eller melanom-kreft. Eksempler på antigener omfatter MAGE 1 , 3 og MAGE 4 eller andre MAGE antigener så som beskrevet i WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (også kjent som NY Eos 1) SAGE og HAGE (WO 99/53061) eller GAGE (Robbins og Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, s. 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (presentert 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, s.293. Disse antigener er faktisk uttrykt i en rekke tumortyper så som melanom, lungekarsinom, sarkom og blærekarsinom.

MAGE-antigener for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse kan uttrykkes som et fusjonsprotein med en ekspresjons-enhancer eller en immunologisk fusjonspartner. I én utførelsesform er derivatet et fusjonsprotein omfattende et antigen fra MAGE-proteinfamilien bundet til en heterolog partner, fortrinnsvis MAGE 3. Proteinene kan være kjemisk konjugerte, men er fortrinnsvis uttrykt som rekombinante fusjonsproteiner som tillater at økede nivåer blir produsert i et ekspresjonssystem sammenlignet med ikke-kondensert protein. Således kan fusjonspartneren assistere i å tilveiebringe T-hjelper-epitoper (immunologisk fusjonspartner), fortrinnsvis T-hjelper-epitoper gjenkjent av mennesker eller assistere i å uttrykke proteinet (ekspresjons-enhancer) i høyere utbytter enn det native rekombinante protein. Fortrinnsvis vil fusjonspartneren være både en immunologisk fusjonspartner og ekspresjonsforbedrende partner.

I en foretrukket form av foreliggende oppfinnelse, er den immunologiske fusjonspartner avledet fra protein D, et overflateprotein fra den gram-negative bakterie, Haemophilus influenza B (W091/18926). Fortrinnsvis omfatter protein D-derivatet omtrent den første 1/3 av proteinet, spesielt omtrent de første N-terminale 100-110 aminosyrer. Fortrinnsvis er protein D-derivatet lipidert. Fortrinnsvis er de første 109 rester av Lipoprotein D-fusjonspartneren omfattet på N-terminus for å gi vaksinekandidat-antigen med ytterligere eksogene T-celle-epitoper og øke ekspresjonsnivå i E-coli (virker således også som en ekspresjons-enhancer). Den lipide halen sikrer optimal presentasjon av antigenet for antigenpresenterende celler.

Andre fusjonspartnere omfatter det ikke-strukturelle protein fra influensa-virus, NS1 (hemagglutinin). Typisk anvendes de N-terminale 81 aminosyrer, selv om forskjellig fragmenter kan anvendes forutsatt at de omfatter T-hjelper-epitoper.

Den immunologiske fusjonspartner proteinet er kjent som LYTA. Fortrinnsvis blir den C-terminale del av molekylet anvendt. Lyta er avledet fra Streptococcus pneumoniae som syntetiserer en N-acetyl-L-alanin-amidase, amidase LYTA, (kodet av lytA gen {Gene, 43 (1986) side 265-272} et autolysin som spesifikt nedbryter visse bindinger i peptidoglykan-ryggraden. Det C-terminale domene LYTA-proteinet er ansvarlig for affiniteten til cholin eller til noen cholin-analoger så som DEAE. Denne egenskap er utnyttet for utvikling av E.coli C-LYTA som uttrykker plasmider anvendelige for ekspresjon av fusjonsproteiner. Rensning av hybride proteiner inneholdende C-LYTA-fragmentet ved deres amino-terminus er beskrevet {Biotechnology: 10, (1992) side 795-798}. Som anvendt her anvender en foretrukket utførelsesform repetisjonsdelen av Lyta-molekylet funnet i den C-terminale enden som starter ved rest 178. En spesielt foretrukket form omfatter restene 188 - 305.

De immunologiske fusjonspartnere angitt ovenfor er også fordelaktige til å hjelpe ekspresjon. Spesielt blir slike fusjoner uttrykt i høyere utbytter enn native rekombinante MAGE-proteiner. Slike konstruksjoner er beskrevet i WO99/40188.

Andre tumor-spesifikke antigener er egnet for anvendelse med adjuvansene ifølge foreliggende oppfinnelse og omfatter, men er ikke begrenset til tumor-spesifikke gangliosider så som GM2 og GM3 eller konjugater derav til bærerproteiner; eller nevnte antigen kan være et eget peptid-hormon så som hel-lengde gonadotropin-hormon-frigjørende hormon (GnRH, WO 95/20600), et kort 10 aminosyre langt peptid, anvendelig ved behandling av mange kreftformer eller for immunokastrasjon.

Andre prostata-antigener anvendes, så som prostata-spesifikt antigen (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735 -1740 1998), PSMA eller, i en foretrukket utførelsesform et antigen kjent som Prostase.

Prostase er en prostata-spesifikk serinprotease (trypsin-lignende), 254 aminosyre lang, med en konservert serinprotease katalytisk triade H-D-S og en amino-terminal pre-propeptidsekvens, som indikerer en potensiell sekretorisk funksjon (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular doning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, i Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1999) 96, 3114-3119). Et antatt glykosyleringssete er beskrevet. Den antatte struktur er meget lignende andre kjente serinproteaser, som viser at det modne polypeptid folder til et enkelt domene. Det modne protein er 224 aminosyrer langt, med én A2-epitop vist å være naturlig prosessert.

Prostase-nukleotidsekvens og utledet polypeptidsekvens og homologer er beskrevet i Ferguson, et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1999, 96, 3114-3119) og i internasjonale patentsøknader Nr. WO 98/12302 (og også det tilsvarende bevilgede patent US 5,955,306), WO 98/20117 (og også de tilsvarende bevilgede patenter US 5,840,871 og US 5,786,148) (prostata-spesifikk kallikrein) og WO 00/04149 (P703P).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer immunogen sammensetning, idet den omfatter et cancer-antigen valgt fra gruppen: i) et antigen fra MAGE proteinfamilien koblet til en heterolog fusjonspartner;

ii) P501S;

iii) Cripto;

iv) Her-2/neu antigen derivatet manglende en vesentlig del av Her-2/neu transmembran domenen,

en adjuvantsammensetning omfattende et saponin, sammen med et immunostimulatorisk oligonukleotid, og et lipopolysakkarid valgt fra gruppen

a) Monofosforyl Lipid A

b) 3-O-Deacylert Monofosforyl Lipid A

c) Difosforyl Lipid A. Idet saponinet er QS21 og det

immunostimulatoriske polypeptidet inneholder minst to CpG motiver.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en immunogen sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor det immunostimulatoriske oligonukleotidet er valgt fra gruppen:

Foreliggende oppfinnelse omfatter også sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor saponinet er formulert for å danne ISCOMS eller liposomer. Idet saponinet er tilstede i en olje eller vann emulsjon. Videre, idet den omfatter vesentlig hele det ekstracellulære domenet av Her-2/neu. Idet Her-2/neu molekylet mangler en funksjonell transmembran domene og i tillegg omfatter fosforyleringsdomenen til Her-2/neu.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av en kombinasjon av et saponin, et immunostimulatorisk oligonukleotid, et lipopolysakkarid valgt fra gruppen:

a) Monofosforyl Lipid A

b) 3-O-Deacylert Monofosforyl Lipid A

11

c) Difosforyl Lipid A, og

et cancer-antigen valgt fra gruppen:

i) et antigen fra MAGE protein familien koblet til en heterolog fusjonspartner;

ii) P501S;

iii) Cripto;

iv) Her-2/neu antigen derivatet som mangler en vesentlig del av Her-2/neu transmembran domenen,

for fremstilling av et medikament for behandling eller profylakse av tumorer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig preparater omfattende prostase-protein-fusjoner basert på prostase-protein og fragmenter og homologer derav ("derivater"). Slike derivater er egnet for anvendelse i terapeutiske vaksine-preparater som er egnet for behandling av prostata tumorer. Typisk vil fragmentet inneholde minst 20, fortrinnsvis 50, mer foretrukket 100 påfølgende aminosyrer som beskrevet i de ovenfor angitte patenter og patentsøknader.

Et mutert prostase-antigen kan oppnås hvor mutasjonen forekommer i det aktive sete av proteinet. Prostase-antigen- derivat eller fragmenter og homologer derav bærer en mutasjon i det aktive sete av proteinet, for vesentlig å redusere eller fortrinnsvis eliminere dets protease biologiske aktivitet. Foretrukne mutasjoner involvere erstatning av Histidin og Aspartat katalytiske rester i serinproteasen. Prostasen kan inneholde en Histidin-Alanin-mutasjon i det aktive sete, for eksempel ved rest 71 i prostasesekvensen (Ferguson, et al.

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1999, 96, 3114-3119). Tilsvarende er mutasjon i homologe proteiner, for eksempel som beskrevet i WO 00/041949 spesielt omfattet. For eksempel svarer denne mutasjon til stilling 43 i P703P. Denne mutasjon kan føre til en betydelig reduksjon i den katalytiske effektivitet (uttrykt som enzymatisk spesifikk aktivitet) av proteinet. Fortrinnsvis er reduksjonen i den katalytiske effektivitet minst med en faktor på 10<3>, mer foretrukket minst

med en faktor på 10<6>. Proteinet som har gjennomgått en histidin-alanin-mutasjon er heretter referert til som<*>(stjerne).

Prostasen er enten mutert eller ikke-mutert, del av et fusjonsprotein, omfattende tumor-assosiert prostase eller fragment eller homologer derav og et heterologt protein eller del av et protein som virker som en fusjonspartner. Proteinet og fusjonspartneren kan være kjemisk konjugert, men er fortrinnsvis uttrykt som rekombinante fusjonsproteiner i et heterologt ekspresjonssystem.

Det tilveiebringes et prostase fusjonsprotein eller fragment eller homologer derav bundet til en immunologisk fusjonspartner som kan assistere i å tilveiebringe T-hjelper-epitoper. Således kan fusjonspartneren virke gjennom en beredskap hjelpereffekt bundet til sekresjon av aktiveringssignaler av et stort antall av T-celler spesifikke for det fremmede protein eller peptid, og derved forbedrer induksjon av immunitet til prostase-komponenten sammenlignet med det ikke-kondenserte protein. Fortrinnsvis er den heterologe partner valgt å være gjenkjennbar av T-celler hos en hoveddel av mennesker.

I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et prostaseprotein eller fragment eller homologer derav bundet til en fusjonspartner som virker som en ekspresjons-enhancer. Således kan fusjonspartneren assistere i å hjelpe ekspresjonen av prostase i et heterologt system, ved å tillate at økede nivåer blir produsert i et ekspresjonssystem sammenlignet med det native rekombinante protein.

Fortrinnsvis vil fusjonspartneren være både en immunologisk fusjonspartner og en ekspresjons-enhancer partner. Følgelig tilveiebringes fusjonsproteiner omfattende en mutert tumor-spesifikk prostase eller et fragment derav bundet til en fusjonspartner. Fortrinnsvis virker fusjonspartneren både som en immunologisk fusjonspartner og som en ekspresjons-enhancer partner. Fusjonspartneren kan være det ikke-strukturelle protein fra influensa-virus, NS1 (hemagglutinin) eller fragment derav. Typisk blir de N-terminale 81 aminosyrer anvendt, selv om forskjellige fragmenter kan anvendes forutsatt at de omfatter T-hjelper-epitoper (C. Hackett, D. Horowitz, M. Wysocka & S. Dillon, 1992, J. Gen. Virologi, 73, 1339-1343). Når NS1 er den immunologiske fusjonspartner har det den ytterligere fordel at den tillater at høyere ekspresjonsutbytter oppnås. Spesielt er slike fusjoner uttrykt i høyere utbytter enn de native rekombinante prostase proteiner.

Fusjonsproteinet kan omfatte de N-terminale 81 aminosyrer av NS1 ikke-strukturelt protein kondensert til de 5 til 226 karboksy-terminale aminosyrer. Alternative ekspresjonspartnere omfatter for eksempel protein D, er fragmenter derav og C-Lyta som anvendt i sammenheng med MAGE-antigener.

Et ytterligere foretrukket prostata-antigen er kjent som P501S, sekvens ID nr. 113 i W098/37814. Immunogen-fragmenter og deler derav omfattende minst 20, fortrinnsvis 50, mer foretrukket 100 påfølgende aminosyrer er beskrevet i den ovenfor angitte patentsøknad. Se for eksempel PS108 (WO98/50567).

Andre prostata-spesifikke antigener er kjent fra WO 98/37418 og WO/004149. Et annet er STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999.

Andre tumor-assosierte antigener anvendelige i sammenheng med foreliggende oppfinnelse omfatter: Plu -1 J Biol. Chem 274 (22) 15633 -15645, 1999, HASH -1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21 61 -70,US patent 5654140) Criptin US-patent 5 981 215. I tillegg omfatter antigener spesielt relevante for vaksiner i terapi for kreft også tyrosinase og survivin.

Mucin-avledede peptider så som Mud, se for eksempel US 5,744,144 US 5,827, 666 WO 8805054, US 4,963,484. Spesielt aktuelle er Mue 1 avledede peptider som omfatter minst én repetisjonsenhet av Mue 1-peptidet, fortrinnsvis minst to slike repetisjoner og som blir gjenkjent av SM3-antistoffet (US 6 054 438). Andre mucin-avledede peptider omfatter peptid fra Mue 5.

Foreliggende oppfinnelse er også anvendelig i kombinasjon med brystkreft-antigener så som Her 2 neu, mammaglobin (US patent 5,668,267) eller de beskrevet i WO/00 52165, W099/33869, W099/19479, WO 98/45328. Her 2 neu-antigener er beskrevet bl.a. i US patent 5,801,005. Fortrinnsvis omfatter Her 2 neu helt ekstracellulært domene (omfattende omtrent aminosyrer 1 -645) eller fragmenter derav og minst en immunogen del av eller omtrent hele det intracellulære domene (de C-terminale 580 aminosyrer). Spesielt bør den intracellulære delen omfatte fosforyleringsdomenet eller fragmenter derav. Slike konstruksjoner er beskrevet i WO 00/44899. En spesielt foretrukket konstruksjon er kjent som ECD PD, en annen er kjent som ECD APD Se WO 00/44899.

Her 2 neu som anvendt her kan avledes fra rotte, mus eller menneske.

Her 2 neu-antigenet kan være hele Her 2 neu-antigen som mangler et funksjonelt transmembran-domene eller deler derav. Foretrukne deler omfatter det ekstracellulære domenet. I en utførelsesform tilveiebringes et fusjonsprotein omfattende et ekstracellulært domene bundet til en del av det intracellulære domene som beskrevet i WO 00/44899 (og inntatt her ved referanse).

Foreliggende oppfinnelse angår preparater som er i stand til å modulere, fortrinnsvis fremkalle eller forsterke, immunitet mot proteinproduktet av Her 2 neu onkogenekspresjon, omfattende mot ondartede sykdommer hos et varmblodig dyr hvor et amplifisert Her 2 neu gen med en ondartet sykdom ikke krever at protein-ekspresjonsproduktet av genet er til stede på tumoren. For eksempel kan overekspresjon av genet medvirke til initiering og tidlige stadier av tumordannelse, men proteinekspresjonen kan deretter være redusert eller fraværende. Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å fremkalle eller forsterke en effektiv immunrespons for å omdanne en Her 2 neu positiv tumor til Her 2 neu negativ, i tillegg til å forhinde etablering av Her 2 neu positive tumorer og utløse regresjon av eksisterende Her 2 neu positive tumorer.

De følgende forkortelser blir anvendt gjennom hele spesifikasjonen: "ECD" angir det ekstracellulære domenet, "ICD" angir det intracellulære domenet, "PD" angir fosforyleringsdomenet (dvs. domenet som er fosforylert) som er innenfor det intracellulære domene, "APD" angir et fragment av fosforyleringsdomenet som er innen fosforyleringsdomenet og "KD" angir kinasedomenet som er innen det intracellulære domene. Produktet av ekspresjon av Her 2 neu-genet er referert til her som "Her 2 neu proteinet," også kjent og referert til som "p185" eller "c-erbB2".

"Her 2 neu ECD-ICD fusjonsprotein," også referert til her som "ECD-ICD" eller "ECD-ICD-fusjonsprotein," angir et fusjonsprotein (eller fragmenter derav) omfattende det ekstracellulære domenet (eller fragmenter derav) og det intracellulære domenet (eller fragmenter derav) av Her 2 neu-proteinet. Disse representerer foretrukne antigener for anvendelse i sammenheng med

foreliggende oppfinnelse. Som anvendt her omfatter ECD-ICD-fusjonsprotein ikke en vesentlige del av Her 2 neu transmembran-domenet og fortrinnsvis ikke noe av Her 2 neu transmembran-domenet.

Betegnelsene "Her 2 neu ECD-ICD fusjonsprotein" og "Her 2 neu ECD-PD fusjonsprotein" og deres relaterte betegnelser skal også forstås å referere til fragmenter derav, homologer derav og funksjonelle ekvivalenter derav (kollektivt referert til som "varianter"), så som de hvor én eller flere aminosyrer som, i foretrukne utførelsesformer, enten (i) øker fremkalling eller forbedring av en immunrespons sammenlignet med Her 2 neu- proteinet eller (ii) ikke vesentlig påvirker fremkalling eller forbedring av en immunrespons sammenlignet med Her 2 neu-protein (f.eks. variant stimulerer en respons av hjelper-T-celler eller cytotoksiske T-celler eller stimulerer produksjon av antistoffer). Spesifikke, eksempler på varianter omfattende eksempler på fragmenter, homologer og funksjonelle ekvivalenter av Her 2 neu ECD-ICD fusjonsproteinet og Her 2 neu ECD-PD fusjonsproteinet er beskrevet mer detaljert her. Varianter kan være "hovedsakelig identisk med" eller "hovedsakelig lignende" et fusjonsprotein omfattende native polypeptid-komponenter og beholder evnen til å stimulere en immunrespons.

Her 2 neu PD er 268 aminosyrer i lengde, er intracellulær og kan fosforyleres av proteintyrosinkinaser. Regionen har ingen identitet med den tilsvarende del av andre tyrosinkinase-reseptorer. Således gjør spesifisiteten og entydigheten av dette domene det spesielt foretrukket for anvendelse som en tumorvaksine. Imidlertid er ekspresjon av dette domene alene i bakterie- og pattedyr-celler problematisk. For eksempel er det resulterende PD-protein meget labilt og er ikke egnet for storskala produksjon. I én utførelsesform anvendes således fortrinnsvis en fusjon omfattende hele eller en del av det intracellulære domene eller fosforyleringsdomenet til hele eller en del av det Her 2 neu ekstracellulære domene. ECD-ICD- fusjonsproteinene og ECD-PD-fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er oppløselige, blir utskilt og er stabile i dyrkningsmedier.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse vil være anvendelige mot hvilken som helst krefttypekarakterisert vedtumor-assosiert antigen-ekspresjon, så som Her 2 neu-ekspresjon. I tillegg til å tillate øket ekspresjon av det intracellulære domene eller fosforyleringsdomenet eller varianter derav, som et fusjonsprotein med det ekstracellulære domenet eller dens varianter, gir ECD-ICD- og ECD-PD-fusjonsproteiner et forbedret vaksinepreparat.

Et vaksinepreparat kan dannes omfattende et adjuvanspreparat, hvor nevnte adjuvans omfatter et saponin og et immunostimulerende oligonukleotid og et Her 2 neu-antigen som mangler dets transmembran-domene. Her 2 neu-molekylet, kan være fra rotte, mus, menneske eller en hybrid derav. Fortrinnsvis omfatter Her 2-molekyl hovedsakelig hele det ekstracellulære domenet. Med hovedsakelig hele menes at ikke mer enn 100 aminosyrer er deletert fra det ekstracellulære domenet, fortrinnsvis mindre enn 75, mer foretrukket mindre enn 50 aminosyrer. Det er foretrukket at hele det ekstracellulære domene er til stede. Det ekstracellulære domenet i human Her 2 neu-konstruksjon ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter fortrinnsvis hovedsakelig alle de N-terminale 600 aminosyrer, mer foretrukket de N-terminal 630 aminosyrer, mer foretrukket ca. 650 aminosyrer. Human ICD går fra aminosyre 676 til Val 1255. Fosforyleringsdomenet er lokalisert i den N-terminale del av ICD. Det er foretrukket at konstruksjonene anvendt ved foreliggende oppfinnelse omfatter fosforyleringsdomenet, men ikke et funksjonelt transmembran-domene. Fortrinnsvis er transmembrandomenet fullstendig deletert.

Konstruksjoner som er spesielt egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse er beskrevet i WO/0044899.

Det er en foretrukket utførelsesform at Her 2 neu-antigenet blir formulert med 3D-MPC, QS21 og CpG Oligonukleotid sammen med en liposom- eller olje-i-vann-emulsjon-bærer. Slike preparater produserer både en humoralt og cellulært mediert respons. Sammenlignet med adjuvanspreparat omfattende bare QS21 og 3D-MPL, ga preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse, hos mus en fordelaktig sterkere TH 1-respons. Preparater med bare CpG ga ikke en betydelig cellemediert immunrespons.

Preparatene kan inneholde antigener assosiert med tumor-støtte-mekanismer (f.eks. angiogenese, tumor-invasjon) for eksempel tie 2, VEGF.

De foretrukne oligonukleotider for anvendelse i adjuvantia eller vaksiner inneholder fortrinnsvis to eller flere dinukleotid CpG-motiver separert med minst tre, mer foretrukket minst seks eller flere nukleotider. Oligonukleotidene er typisk deoksynukleotider. I en foretrukket utførelsesform er internukleotid i oligonukleotidet fosforoditioat eller mer foretrukket en fosforotioat-binding, selv om fosfodiester og andre internukleotid-bindinger er innenfor heri, omfattende oligonukleotider med blandede internukleotid-bindinger. Metoder for å produsere fosforotioat-oligonukleotider eller fosforoditioat er beskrevet i US 5,666,153, US 5,278,302 og WO95/26204.

Eksempler på foretrukne oligonukleotider har de følgende sekvenser. Sekvensene inneholder fortrinnsvis fosforotioat-modifiserte internukleotid-bindinger.

Alternative CpG-oligonukleotider kan omfatte de foretrukne sekvenser ovenfor ved at de har ubetydelige delesjoner eller addisjoner dertil. CpG-oligonukleotidene anvendt ved foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres ved hvilken som helst metode kjent på området (f.eks. EP 468520). Hensiktsmessig kan slike oligonukleotider syntetiseres ved å anvende en automatisert syntetisator. De er typisk mellom 10-50 baser i lengde.

Oligonukleotidene anvendt ved foreliggende oppfinnelse er typisk

deoksynukleotider. I en foretrukket utførelsesform er internukleotid-bindingen i oligonukleotidet fosforoditioat eller mer foretrukket fosforotioat-binding, selv om fosfodiestere er innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Oligonukleotid omfattende forskjellige internukleotid-bindinger er omfattet, f.eks. blandet

fosforotioat fosfodiestere. Andre internukleotid-bindinger som stabiliserer oligonukleotidet kan anvendes.

Saponinene som kan anvendes i adjuvans-kombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de avledet fra barken av Killaja Saponaria Molina, betegnet Quil A og fraksjoner derav, beskrevet i US 5,057,540 og "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; og EP 0 362 279 B1. Spesielt foretrukne fraksjoner av Quil A er QS21, QS7 og QS17.

P-escin er et annet foretrukket hemolytisk saponin for anvendelse i adjuvanspreparatene heri. Escin er beskrevet i Merck Index (12. ed: post 3737) som en blanding av saponiner som forekommer i kimen til hestekastanjetreet, Lat: Aesculus hippocastanum. Dets isolering er beskrevet ved kromatografi og rensning (Fiedler, Arzneimittel- Forsch. 4, 213 (1953)) og ved ionebyttingsharpikser (Erbring et al., US 3,238,190). Fraksjoner av escin, og

, er renset og vist å være biologisk aktive (Yoshikawa M, et al. ( Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8): 1454-1464)). P-escin er også kjent som aescin.

Et annet foretrukket hemolytisk saponin for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse er Digitonin. Digitonin er beskrevet i Merck Index (12. Ed., post 3204) som et saponin, avledet fra frøene fra Digitalis purpurea og renset i henhold til metoden beskrevet av Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc, 1934, 23, 664; og Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621. Dets anvendelse er angitt å være et klinisk reagens for kolesterol-bestemmelse.

Adjuvanskombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte en bærer, slik at saponinet eller CpG eller lipopolysakkaridet kan være forbundet med en spesiell bærerenhet for å forbedre adjuvansiteten av kombinasjonen. Spesielt foretrukne systemiske vaksiner omfatter for eksempel et bærer-molekyl.

CpG anvendt i adjuvanskombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i fri løsning eller kan være kompleksert til spesielle bærere så som mineralsalter (for eksempel, men ikke begrenset til, aluminium- eller kalsiumsalter), liposomer, ISCOM, emulsjoner (olje-i-vann, vann-i-olje, vann-i-olje-i-vann), polymerer (så som, men ikke begrenset til, polymelkesyre, polyglykolsyre, polyfosfazin, polyaminosyre, alginat, chitosan) eller mikropartikler. Fortrinnsvis er nevnte bærere kationiske. Sammensetningene kan videre omfatte et antigen som kan være forbundet med CpG-bærer- komplekset eller kan være ikke forbundet med CpG-bærer-komplekset. I dette tilfellet kan antigenet være fri suspensjon eller forbundet med en separat bærer.

Saponinene heri kan være separate i form av miceller eller kan være i form av store ordnede strukturer så som ISCOM (EP 0 109 942 B1) eller liposomer (WO 96/33739) når formulert med kolesterol og lipid eller i form av en olje-i-vann-emulsjon (WO 95/17210). Saponinene kan fortrinnsvis være forbundet med et metallsalt, så som aluminiumhydroksyd eller aluminiumfosfat (WO 98/15287). Alternativt kan saponinet være forbundet med en partikkelformig bærer så som chitosan. Saponinet kan også være i en tørr tilstand så som et pulver. De endelige preparater i formen som de blir administrert til den mukosale overflate hos den vaksinerte er fortrinnsvis hemolytisk av natur. Saponinet kan, men trenger ikke være assosiert fysisk med antigenet enten gjennom direkte binding eller ved co-interaksjon med samme partikulære bærermolekyl (GB9822712,7; WO 98/16247).

CpG og saponin og lipopolysakkarid i adjuvansene eller sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan selv være separate eller assosierte. For eksempel kan CpG og saponin være i fri suspensjon eller kan være assosiert via en bærer, mer foretrukket en partikkelformig bærer så som aluminiumhydroksyd eller ved et kationisk liposom eller ISCOM.

En foretrukket adjuvans-kombinasjon heri er sammensatt av én eller flere CpG-oligonukleotider inneholdende minst 3, fortrinnsvis minst 6 nukleotider mellom to tilstøtende CG-motiver, sammen med QS21 og en partikkelformig bærer valgt fra gruppen omfattende en olje-i-vann emulsjon eller DQ. Det er foretrukket at lipopolysakkaridet er et di- eller monofosforyl-lipidderivat, fortrinnsvis 3-de-0 acylert, spesielt 3-de-0 acylert monofosforyl Lipid A. Mest foretrukket omfatter adjuvanskombinasjonen CpG 2006 (SEKV ID NR: 4) eller CpG 1758 (SEKV ID NR: 2) eller CpG 1826 (SEKV ID NR: 1) blandet med QS21 og en partikkelformig bærer valgt fra gruppen omfattende en olje-i-vann-emulsjon eller DQ. Følgelig omfatter spesielt foretrukne sammensetninger for eksempel slike adjuvanskombinasjoner og et antigen. Den foretrukne sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse blir anvendt for å danne systemiske immunresponser etter administrering til et individ gjennom systemisk rute.

Adjuvanskombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte en olje-basert emulsjon. Olje-emulsjon-adjuvantia har vært kjent i mange år, omfattende arbeid på Freunds komplette og ukomplette mineralolje-emulsjon-adjuvantia. Siden den tid er meget arbeid utført for å utforme stabile og veltolererte alternativer til disse kraftige, men reaktogene, adjuvanspreparater.

Mange enkel- eller multifase emulsjonssystemer er beskrevet. Olje-i-vann-emulsjon-adjuvantia er per se foreslått å være anvendelige som adjuvans-preparater (EP O 399 843B) og også kombinasjoner av olje-i-vann-emulsjoner og andre aktive midler er beskrevet som adjuvantia for vaksiner (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Andre olje-emulsjon-adjuvantia er beskrevet, så som vann-i-olje-emulsjoner (US 5,422,109; EP 0 480 982 B2) og vann-i-olje-i-vann-emulsjoner (US 5,424,067; EP 0 480 981 B).

Olje-emulsjon-adjuvantia for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse kan være naturlige eller syntetiske og kan være mineralske eller organiske. Eksempler på mineralske og organiske oljer vil være kjent for fagfolk på området.

For at et hvilket som helst olje-i-vann-preparat skal være egnet for human administrering, omfatter oljefasen av emulsjonssystemet fortrinnsvis en metaboliserbar olje. Betydningen av betegnelsen metaboliserbar olje er velkjent på området. Metaboliserbar kan defineres som " i stand til å bli transformert ved metabolisme" (Dorland's lllustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25. ed. (1974)). Oljen kan være hvilken som helst vegetabilsk olje, fiskeolje, animalsk olje eller syntetisk olje, som ikke er toksisk for mottageren og kan transformeres ved metabolisme. Nøtter (så som jordnøttolje), frø og korn er vanlige kilder for vegetabilske oljer. Syntetiske oljer er også del av foreliggende oppfinnelse og kan omfatte kommersielt tilgjengelige oljer så som NEOBEE® og andre. Squalen (2,6,10,15,19,23-heksametyl-2,6,10,14,18,22-tetrakosaheksaen) er en umettet olje som finnes i store mengder i hailever-olje og i lavere mengder i olivenolje, hvetekim-olje, riskliolje og gjær, og er en spesielt foretrukket olje for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Squalen er a metaboliserbar olje ved det faktum at det er et mellomprodukt i biosyntese av kolesterol (Merck Index, 10. Ed. post no,8619).

Spesielt foretrukne olje-emulsjoner er olje-i-vann-emulsjoner og spesielt squalen-i-vann-emulsjoner.

I tillegg omfatter de mest foretrukne oljeemulsjon-adjuvantia en antioksydant, som fortrinnsvis er oljen ct-tocopherol (vitamin E, EP 0 382 271 B1).

WO 95/17210 og WO 99/11241 beskriver emulsjons-adjuvantia basert på squalen, a-tocopherol og TWEEN 80, eventuelt formulert med immunostimulantene QS21 og/eller 3D-MPL. WO 99/12565 beskriver en forbedring av disse squalen-emulsjoner ved tilsetning av en sterol i oljefasen. I tillegg kan et triglycerid, så som tricaprylin (C27H50O6), tilsettes til oljefasen for å stabilise emulsjonen (WO 98/56414).

Størrelsen av oljedråper i en stabil olje-i-vann emulsjon er fortrinnsvis mindre enn 1 mikron, kan være i området hovedsakelig 30-600 nm, fortrinnsvis hovedsakelig rundt 30-500 nm i diameter og mest foretrukket hovedsakelig 150-500 nm i diameter og spesielt ca. 150 nm i diameter som målt ved foton-korrelasjonsspektroskopi. I denne henseende bør 80% av oljedråpene etter antall være innenfor de foretrukne områder, mer foretrukket mer enn 90% og mest foretrukket mer enn 95% av oljedråpene etter antall er innenfor de definerte størrelsesområder. Mengdene av komponentene til stede i olje-emulsjonene heri er konvensjonelt i området fra 2 til 10% olje, så som squalen; og når til stede, fra 2 til 10% alfa-tocopherol; og fra 0,3 til 3% overflateaktivt middel, så som polyoksyetylen-sorbitan-monooleat. Fortrinnsvis er forholdet av olje: alfa-tocopherol lik eller mindre enn 1 ettersom dette gir en mer stabil emulsjon. Span 85 kan også være til stede i et nivå på ca. 1 %. I noen tilfeller kan det være fordelaktig at sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse også inneholde et stabiliseringsmiddel.

Metoden for produksjon av olje-i-vann-emulsjoner er velkjent for fagfolk på området. Vanligvis omfatter metoden blanding av oljefasen med et overflateaktivt middel så som en PBS/TWEEN80™ løsning, fulgt av homogenisering ved anvendelse av en homogenisator; det vil være klart for fagfolk på området at en metode som omfatter passering av blandingen to ganger gjennom en sprøytenål ville være egnet for homogenising av små volumer av væske. Likeledes kan emulgeringsprosess i mikrofluidisator

(M110S microfluidics machine, maksimum 50 omløp, i en periode på 2 minutter ved maksimum inngangstrykk på 6 bar (utgangstrykk på ca. 850 bar)) tilpasses av fagfolk på området for å produsere mindre eller større volumer av emulsjon. Denne tilpasning kan oppnås ved rutinemessig eksperimentering omfattende måling av den resulterende emulsjon inntil et preparat av oppnådd med olje-dråper med den nødvendige diameter.

Adjuvanskombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som både systemisk eller mukosalt adjuvans. Sammensetningene kan administreres gjennom systemisk eller parenteral rute så som intramuskulær, intradermal, transdermal, subkutan, intraperitoneal eller intravenøs administrering. En foretrukket administreringsvei er via den transdermal rute, for eksempel ved hudplastere.

Sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å beskytte eller behandle et pattedyr mottagelig for eller som lider av sykdom, ved hjelp av administrering av nevnte vaksine ved intramuskulær, intraperitoneal, intradermal, transdermal, intravenøs eller subkutan administrering. Metoder for systemisk administrering av vaksinepreparatene kan omfatte konvensjonelle sprøyter og nåler eller anordninger utformet for ballistisk levering av faststoff-vaksiner (WO 99/27961) eller nålløs trykk-væske jet-anordning (US 4,596,556; US 5,993,412) eller transdermale plastere (WO 97/48440; WO 98/28037). Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å forbedre immunogenisiteten av antigener påført på huden (transdermal eller transkutan levering WO 98/20734 ; WO 98/28037). Det er mulig å fremkalle en immunrespons hos et individ, omfattende administrering av en vaksine omfattende et antigen og immunostimulerende oligonukleotid, et saponin og en bærer, til individet, hvor vaksinen blir administrert via parenteral eller systemisk rute. Foretrukne metoder for å fremkalle en immunrespons omfatter administrering av en vaksine mot, for eksempel et Her 2 neu-derivat, med et saponin avledet fra Quil A, så som QS21 og en bærer, så som en olje-i-vann-emulsjon, et kolesterol-inneholdende liposom eller alun.

Alternativt kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å beskytte eller behandle et pattedyr mottagelig for eller som lider av sykdom, ved hjelp av administrering av nevnte vaksine via en mukosal rute, så som oral/fordøyelse eller nasal rute. Alternative mukosale ruter er intravaginal og intrarektal. Den foretrukne mukosale administreringsvei er via den nasal rute, betegnet intranasal vaksinering. Metoder for intranasal vaksinering er velkjente på området, omfattende administrering av en dråpe, spray eller tørr pulverisert form av vaksinen til nese-svelg-kanalen til individene som skal immuniseres.

Sammensetningene heri representerer en klasse av mukosale adjuvantia egnet for anvendelse for mennesker for å erstatte systemisk vaksinasjon med mukosal vaksinasjon. Rene saponiner så som Quil A eller derivater derav, omfattende QS21; Escin; Digitonin; eller Gypsophila eller Chenopodium kinoa saponiner i kombinasjon med immunostimulerende oligonukleotider, kan anvendes som adjuvantia for mukosal administrering av antigener for å oppnå en systemisk immunrespons.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for formulering av vaksiner, hvilke vaksiner kan administreres via systemetisk eller mukosal rute. Når vaksinene blir anvendt for mukosal administrering omfatter adjuvanskombinasjonen fortrinnsvis et hemolytisk saponin.

For mukosal administrering omfatter preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis et hemolytisk saponin. Hemolytisk saponin eller saponin-preparat, innen betydningen ved foreliggende oppfinnelse, skal bestemmes med referanse til det følgende forsøk. 1. Friskt blod fra marsvin blir vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) 3 ganger i en bordsentrifuge. Etter resuspensjon til det opprinnelige volum blir blodet ytterligere fortynnet 10 ganger i PBS. 2. 50 ul av denne blodsuspensjon blir satt til 800 ul PBS inneholdende to-ganger fortynninger av overflateaktivt middel eller saponin. 3. Etter 8 timer blir hemolyse bedømt visuelt eller ved å måle den optiske densiteten av supernatanten. Tilstedeværelsen av en rød supernatant, som absorberer lys ved 570 nm indikerer tilstedeværelsen av hemolyse. 4. Resultatene er uttrykt som konsentrasjonen av den første saponin-fortynning ved hvilken hemolysis ikke lenger forekommer.

For formålene ifølge foreliggende oppfinnelse er saponin-adjuvanspreparatet er hemolytisk hvis det lyser erytrocytter i en konsentrasjon på mindre enn 0,1 %. Som referanse er hovedsakelig rene prøver av Quil A, QS21, QS7, Digitonin og R-escin alle hemolytiske saponiner som definert i dette forsøket. Innen den naturlige eksperimentelle variabilitet av et slikt biologisk forsøk, har saponinene ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis en hemolytisk aktivitet, på omtrent mellom 0,5-0,00001 %, mer foretrukket mellom 0,05-0,00001%, enda mer foretrukket mellom 0,005-0,00001% og mest foretrukket mellom 0,001-0,0004%. Ideelt bør nevnte saponiner ha en hemolytisk aktivitet lignende (dvs. innen en ti-ganger forskjell) til den av QS21.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres via oral rute. I slike tilfeller kan det farmasøytisk akseptable tilsetningsmiddel også omfatte alkaliske buffere eller enteriske kapsler eller mikrogranuler. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres via vaginal rute. I slike tilfeller kan de farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler også omfatte emulgeringsmidler, polymerer så som CARBOPOL<®>og andre kjente stabiliseringsmidler for vaginale kremer og suppositorier. De kan også administreres via rektal rute. I slike tilfeller kan tilsetningsmidlene også omfatte vokser og polymerer kjent på området for å danne rektal suppositorier.

Preparater med mer enn ett saponin i adjuvanskombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også dannes. For eksempel kombinasjoner av minst to av den følgende gruppe som omfatter QS21, QS7, Quil A, p-escin eller digitonin. I tillegg kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte kombinasjoner av mer enn ett immunostimulerende oligonukleotid.

Alternativt kan preparatene kombineres med vaksine-konstituenter sammensatt av chitosan eller andre polyckationiske polymerer, polylaktid og polylaktid-co-glykolid-partikler, poly-N-acetyl-glukosamin-basert polymer matriks, partikler sammensatt av polysakkarider eller kjemisk modifiserte polysakkarider, liposomer og lipid-baserte partikler, partikler sammensatt av glycerol-monoestere, etc. Saponinene kan også formuleres i nærvær av kolesterol for å danne partikkelformige strukturer så som liposomer eller ISCOM. Videre kan saponinene formuleres sammen med en polyoksyetylen-eter eller -ester, i enten en ikke-partikulær løsning eller suspensjon eller i en partikulær struktur så som et paucilamellært liposom eller ISCOM. Saponinene kan også formuleres med tilsetningsmidler så som Carbopol<R>for å øke viskositet eller kan formuleres i en tørr pulver form med et pulver-tilsetningsmiddel så som laktose.

Spesielt foretrukket adjuvantia er kombinasjoner av 3D-MPL og QS21 (EP 0 671 948 B1), olje-i-vann-emulsjoner omfattende 3D-MPL og QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) eller 3D-MPL formulert med andre bærere (EP 0 689 454 B1) i kombinasjon med CpG-oligonukleotidene som her beskrevet. Mengden av CpG eller immunostimulerende oligonukleotider i adjuvansene eller foreliggende oppfinnelse er generelt liten, men avhengig av vaksinepreparatet kan være i området 1-1000 ug pr. dose, fortrinnsvis 1-500 ug pr. dose og mer foretrukket mellom 1 til 100 ug pr. dose.

Mengden av saponin for anvendelse i adjuvansene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i området 1-1000 ug pr. dose, fortrinnsvis 1-500 ug pr. dose, mer foretrukket 1-250 ug pr. dose og mest foretrukket mellom 1 til 100 ug pr. dose. Forholdet av CpG:saponin (vekt/vekt) vil derfor være i området 1:1000 til 1000:1 og vil typisk være i området 1:100 til 100:1 og fortrinnsvis i området 1:10 til 1:1 eller 1:1 til 10:1 og mest foretrukket 1:1, 4:1 eller 10:1.

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for både profylaktiske og terapeutiske formål. Følgelig tilveiebringes anvendelse av en kombinasjon av et saponin, et lipopolysakkarid og et CpG-molekyl ved fremstilling av en vaksine for forebygging og behandling av kreft, spesielt bryst-og prostata-karsinomer. Det er mulig å danne en vaksine eller adjuvans-kombinasjon, omfattende et lipopolysakkarid, et saponin og CpG, som her beskrevet for anvendelse som et medikament. Vaksine-fremstilling er generelt beskrevet i New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978.

Det er mulig å forhindre et individ fra å pådra seg en sykdom valgt fra gruppen omfattende prostata-, bryst-, kolorektal-, lunge-, bukspyttkjertel-, nyre- , eggstokk- eller melanom-kreft; omfattende administrering av et preparat som hovedsakelig beskrevet her gjennom systemetisk rute til nevnte individ.

Det er videre mulig å danne et mukosalt vaksinepreparat omfattende et antigen og et hemolytisk saponin og behandle et individ mottagelig for eller som lider av en sykdom ved administrering av et preparat som hovedsakelig her beskrevet til en mukosal overflate av nevnte individ.

Videre er det beskrevet en metode for å fremkalle en systemisk antigen-spesifikk immunrespons hos et pattedyr, omfattende administrering til en mukosal overflate av nevnte pattedyr, av et preparat omfattende et antigen og et hemolytisk saponin. Eksempler på egnede farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler for anvendelse i kombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter vann, fosfatbufret saltvann, isotoniske bufferløsninger.

Eksempel 1:

• ECD-PD ble produsert i CHO-celler i henhold til metodene ifølge WO 00/44899. Preparatene ble testet på mus og kaniner.

• Preparater ble sammenlignet mot flere kontroller.

SBAS1+SBAS7:

ECD-PD formulert med CpG oligonukleotid 2006 3D-MPL, QS21 i liposomer.

SBAS1-formulering

Omfatter QS21 i liposomer og 3D-MPL forbundet med liposomene ble fremstilt i henhold til metodene ifølge EP 0822831.

SBAS1+SBAS7-formulering

Til preparatet ovenfor ble satt CpG oligonukleotid 2006. Antigenet ble blandet til adjuvanspreparatet før anvendelse.

SBAS7 + SBAS2-baserte formuleringer ( mus)

For én dose på 50 ul av vaksine, ble ECD-PD- protein (25 ug) fortynnet i 10 ganger konsentrert PBS pH 6,8 og H20 før påfølgende tilsetning av en olje-i-vann-emulsjon omfattende SB62: som blir fremstilt ved og omfatter 5% squalen 5% tocopherol 2,0% Tween 80; partikkelstørrelsen var 180 nm Fremstilling av emulsjon SB62 (2 ganger konsentrat)

Tween 80 blir oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS), hvilket gir en 2% løsning i PBS. For å gi 100 ml to ganger konsentrat emulsjon blir 5 g av DL alfa-tocopherol og 5 ml squalen virvlet for å blandes grundig. 90 ml PBS/Tween løsning blir tilsatt og blandet grundig. Den resulterende emulsjon blir deretter ført gjennom en sprøyte og til slutt mikrofluidisert ved anvendelse av en M110S microfluidics maskin. De resulterende olje-dråper har en størrelse på omtrent 180 nm. 3D-MPL (10 ug), QS21 (10 ug). 50 ug CpG ODN 2006 ble deretter tilsatt fulgt 30 minutter senere av tilsetning av 50 ug/ml tiomersal som konserveringsmiddel. Alle inkuberinger ble utført ved romtemperatur med agitering.

SBAS 2 preparater ble fremstilt som ovenfor, men uten tilsetning av CpG-oligonukleotid.

SBAS7 er CpG oligonukleotid 2006

SBAS7 + SBAS2-baserte formuleringer (Kanin)

For én dose på 500 ul av vaksine ble ECD-PD- protein (100 ug) fortynnet i 10 ganger konsentrert PBS pH 6,8 og H20 før påfølgende tilsetning av SB62 250 ul, 3D-MPL (100 pg), QS21 (100 ug) og 500 ug av CpG ODN 2006 fulgt 30 minutt senere av tilsetning av 50 ug/ml tiomersal som konserveringsmiddel. Alle inkuberinger ble utført ved romtemperatur med agitering.

Eksempel 2: Tumor-utfordringsforsøk

Grupper av F1 (C57 x Balb c) mus (8 mus/gruppe) ble injisert med 1/10 av human dose av antigen (25 ug) på dager 0-14-28-42 og utfordret på dag 56 med TC1-celler som uttrykker Her2 med nær 2 10e6 TC1 Her2 celle/dyr administrert subkutant.

TC1-celler for halvparten av dyremilt ble oppsamlet på dag 56 og dyrene tappet blod av.

Som vist i figur 1 forbedrer tilsetning av et CpG-oligonukleotid til et 3D-MPL/QS21-preparat synergistisk tumorregresjon og bare disse preparater frembragte fullstendig tumorregresjon i musene.

Eksempel 3: Immunogenisitet av ECD-PD i forskjellig adjuvantia i kaniner 6 grupper på 4 kaniner ble immunisert på dager 0, 21 og 42 med henholdsvis 100 pg ECD-PD i AS02, AS01, AS05, AS06 (CpG 2006 absorbert på alun), AS07 og AS02B+AS07.

Serologi ble analysert 14 dager etter III og tabell 1 viser at preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse var bedre enn andre preparater testet til å fremkalle høye titer antistoff-responser.

Eksempel 4: Immunogenisitet av Her 2 neu, ECD-PD i voksne Rhesus-aper

Voksne Rhesus-aper ble immunisert med ECD-PD i forskjellige adjuvans-formuleringer:

Vaksinasjon fremkalte en høyere antistoff-respons for formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse (AS)2 + AS07). Se figur 1.

Videre analyse viste at antistoff-responsen var polyklonal og demonstrerer en hemmende aktivitet på in vitro vekst av en human brystkreft-cellelinje (SKBR3) som overuttrykker Iter 2 neu-molekylet. Herceptin, et monoklonalt antistoff for behandling av Her 2 neu-uttrykkende tumorer er i stand til å hemme veksten av denne cellelinjen.

Antistoffene dannet etter aktiv vaksinasjon med preparatet ble således sett å være funksjonelle.

Eksempel 5: Immunisering av mus med ECD-PD-antigen

Dette forsøket ble utformet for å undersøke en rekke adjuvans-preparater med antigenet som er en fusjon av det ekstracellulære domenet av Her 2

neu bundet til fosforyleringsdomenet (ECD-PD), som ble produsert i CHO-celler i henhold til metodene ifølge WO 00/44899.

De tocol-inneholdende olje-i-vann-emulsjoner anvendt i gruppene ovenfor anvendte D, L, -tocopherol (CAS No. 10191-41-0; kjemisk navn: (2RS,4'RS, 8'RS)-2, 5, 7, 8-tetrametyl-2-(4', 8', 12'-trimetyl-tridecyl)-6-kromanol)); som er kommersielt tilgjengelig fra ROCHE™. Hvis til stede var tocol til stede i en olje-i-vann-emulsjon omfattende 2,5% etter volum, i kombinasjon med squalen 2,5% etter volum. Begge oljer ble blandet og polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80™) ble tilsatt, før mikrofluidisering (M110S microfluidics maskin, maksimum 50 omløp, i en periode på 2 minutter ved maksimum inngangstrykk på 6 bar (utgangstrykk på ca. 850 bar) som beskrevet i WO 95/17210). Følgelig ble grupper 3, 6 og 9 basert på tocol-emulsjonen ovenfor med tilsetning av vandig QS21, 3D-MPL eller CpG.

QS21 og 3D-MPL hvis til stede i noen av vaksinegruppene ovenfor ble inkludert med 5 ug/dose; CpG (OLIGO 4 (SEKV ID NR:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) ble tilsatt med 50 ug dose.

Ajuvansene anvendt for gruppe 2, 5, 10 ble fremstilt i henhold til teknikker beskrevet i EP 0 822 831 B1 (hvis innhold inntas her ved referanse). Gruppe 11 omfattet 3D-MPL i membranen av et liposome. Kort angitt ble 3D-MPL, dioleoylfosfatydyl-cholin og kolesterol blandet sammen og mikrofluidisert til unilamellære liposomer (som beskrevet i EP 0 822 831 B1 - med utelatelse av QS21).

Adjuvansene anvendt i grupper 4, 7 og 8 var i vandig suspensjon eller løsning.

Vaksinasjonsprosedyre

Grupper av B6F1-mus ble vaksinert ved fire anledninger (i 50 ul volumer), intramuskulært, med 14 dagers mellomrom. 14 dager etter den 4. vaksinedose, ble musene utfordret subkutant med 2X106 TC1 tumorcelle som uttrykker Her 2 neu.

Her 2 neu-TC1-tumorcellelinjer ble produsert ved transduksjon av TC1-celler med retrovirale vektorer som koder for Her 2 neu. Etter en seleksjonsperiode med blastocydin, ble resistente kloner isolert og screenet ved FACS for Her 2 neu-ekspresjon. Klonen med den høyeste Her 2 neu-ekspresjon ble valgt og en utfordringsdose på 2X106 ble identifisert å ha en lignende vekstkinetikk som villtype TC1-celler og, å gi opphav til utvikling av tumor i 100% av kontrolldyrene.

Størrelsen av de individuelle tumorer ble målt to ganger pr. uke og uttrykt som et gruppegjennomsnitt.

Resultater

Figur 3 viser tumorvekst-resultatene for grupper 1, 2, 4, 5 og 6. Figur 4 viser tumorvekstresultatene for grupper 1, 5, 6, 7 og 11. Figur 5 viser tumorvekstresultatene for grupper 1, 5, 6, 8, 9 og 10. De eneste vaksiner som fremkalte en fullstendig regresjon av tumoren var vaksine inneholdende både et immunostimulerende oligonukleotid og et saponin. Figurer 6 og 7 viser lymfoproliferasjon av splenocytter in vitro etter inkubering med 5ug/ml immunogen (ECD-PD) eller ekstracellulært domene (ECD) eller intracellulært domene (ICD) eller Her 2 neu. Figurer 8 og 9 viser den humorale immunrespons på immunogenet (ECD-PD) som total lg som målt ved ELISA (FIG. 8) eller IgG isotype-fordeling innen disse responser (FIG. 9).

Konklusjon:

Etter 3 injeksjoner er antistoff-induksjon

AS02B+AS07A > AS01B > AS02B = AS06 = AS05 > AS07A

Generell konklusjon

Adjuvanset testet (AS1, AS2, AS7) har lignende effekt. Imidlertid er kombinasjonen av AS1 og AS7 eller AS2 og AS7 mer effektive adjuvantia. CMI er klart vist etter 4 vaksinasjoner av dyr som mottar det samlede adjuvans på hele molekylet ECD-PD, men også på hver del separat (ECD og ICD). Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er meget effektive til å fremkalle tumor-regresjon.

Eksempel 6: Immunisering of mus med P703P antigen

Dette forsøket ble utformet for å undersøke en rekke adjuvans-preparater med antigenet som er en fusjon av antigenet prostase (Ferguson, et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1999, 96, 3114-3119)) og det N-terminale 1-81 fragment av NS1 fra influensavirus (P703P-NS1).

De tocol-inneholdende olje-i-vann emulsjoner anvendt i gruppene ovenfor anvendte D, L, a-tocopherol (CAS No. 10191-41-0; kjemisk navn: (2RS,4'RS, 8'RS)-2, 5, 7, 8-tetrametyl-2-(4\ 8', 12'-trimetyl-tridecyl)-6-kromanol)), som er kommersielt tilgjengelig fra ROCHE™. Hvis til stede var tocol til stede i en olje-i-vann-emulsjon omfattende 2,5% etter volum, i kombinasjon med squalen 2,5% etter volum. Begge oljer ble blandet og polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80™) ble tilsatt, før mikrofluidisering (M110S microfluidics maskin, maksimum 50 omløp, i en periode på 2 minutter ved maksimum inngangstrykk på 6 bar (utgangstrykk på ca. 850 bar) som beskrevet i WO 95/17210). Følgelig ble grupper 5 og 6 basert på tocol-emulsjonen ovenfor med tilsetning av vandig QS21, 3D-MPL og/eller CpG.

QS21 og 3D-MPL hvis til stede i noen av vaksinegruppene ovenfor var inkludert med 5ug/dose; CpG (OLIGO 4 (SEKV ID NR:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) ble tilsatt med 50 ug dose.

Adjuvansene anvendt for gruppe 3 og 4 ble fremstilt i henhold til teknikker som beskrevet i EP 0 822 831 B1 (hvis innhold inntas her ved referanse).

Vaksinasjonsprosedyre

Grupper av B6F1 mus ble vaksinert ved fire anledninger (i 50 ul volumer), intramuskulært, med 14 dagers mellomrom.

Resultater

Figurer 10 og 11 viser in vitro lymfoproliferasjon av splenocytter etter andre og 14 dager etter fjerde vaksinasjon, etter in vitro inkubering med 3ug/ml immunogen (NS1-P703P) eller pichia-uttrykt P703P (15 ug/ml) eller et ikke-spesifikt NS1 -OspA-fusjonsprotein. Figurer 12 og 13 viser den humorale immunrespons på immunogenet (NS1-P703P) som total lg som målt ved midtpunkt titer ELISA (FIG. 10) eller IgG isotype-fordeling innen disse responser (FIG. 11).

Claims (10)

1. Immunogen sammensetning, idet den omfatter et cancer-antigen valgt fra gruppen: i) et antigen fra MAGE proteinfamilien koblet til en heterolog fusjonspartner; ii) P501S; iii) Cripto; iv) Her-2/neu antigen derivatet manglende en vesentlig del av Her-2/neu transmembran domenen, en adjuvantsammensetning omfattende et saponin, sammen med et immunostimulatorisk oligonukleotid, og et lipopolysakkarid valgt fra gruppen a) Monofosforyl Lipid A b) 3-O-Deacylert Monofosforyl Lipid A c) Difosforyl Lipid A.

2. Sammensetning ifølge krav 1, idet saponinet er QS21.

3. Immunogen sammensetning ifølge krav 1 eller 2, hvor det immunostimulatoriske polypeptidet inneholder minst to CpG motiver.

4. Immunogen sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor det immunostimulatoriske oligonukleotidet er valgt fra gruppen:

5. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor saponinet er formulert for å danne ISCOMS eller liposomer.

6. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor saponinet er tilstede i en olje eller vann emulsjon.

7. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, omfattende vesentlig hele det ekstracellulære domenet av Her-2/neu.

8. Sammensetning ifølge krav 7, hvor Her-2/neu molekylet mangler en funksjonell transmembran domene.

9. Sammensetning ifølge krav 7 eller 8, som i tillegg omfatter fosforyleringsdomenen til Her-2/neu.

10. Anvendelse av en kombinasjon av et saponin, et immunostimulatorisk oligonukleotid, et lipopolysakkarid valgt fra gruppen: a) Monofosforyl Lipid A b) 3-O-Deacylert Monofosforyl Lipid A c) Difosforyl Lipid A, og et cancer-antigen valgt fra gruppen: i) et antigen fra MAGE protein familien koblet til en heterolog fusjonspartner; ii) P501S; iii) Cripto; iv) Her-2/neu antigen derivatet som mangler en vesentlig del av Her-2/neu transmembran domenen, for fremstilling av et medikament for behandling eller profylakse av tumorer.