PT1759704E

PT1759704E - Compostos metálicos mistos ou sulfatados como ligandos de fosfato

Info

Publication number: PT1759704E
Application number: PT06013811T
Authority: PT
Inventors: Maurice Webb; Norman Bryson Roberts; Benjamin Joseph Rankin
Original assignee: Ineos Healthcare Ltd
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2011-01-24
Also published as: CY1111199T1; CN1911245A; HU227666B1; PT1015002E; AU9173398A; BR9812223A; CA2303820A1; KR100997504B1; EP1759704B1; PL194211B1; DE69835217D1; PL339079A1; HUP0900652A2; HK1098390A1; ATE332699T1; EP1015002A1; CY1106174T1; NZ503136A; WO1999015189A1; US20110014301A1

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSTOS METÁLICOS MISTOS OU SULFATADOS COMO LIGANDOS DE FOSFATO"

Esta invenção refere-se a compostos metálicos, especialmente compostos metálicos livres de alumínio, para aplicação farmacêutica, especialmente como ligandos de fosfato. O documento WO-A-94/09798 divulga misturas ou complexos contendo cálcio e sulfato para utilização numa vasta gama de aplicações farmacêuticas. As misturas ou complexos são composições inorgânicas deriváveis de turfa, na forma de soluções aquosas ou de materiais de singenite sintética (CaSO4.K2SO4.H2O). Não existe referência à sua capacidade de ligação ao fosfato. 0 documento GB 1336866 refere-se a compósitos de hidróxidos metálicos com uma estrutura em camada de cristal e um processo para a sua preparação.

Em doentes com insuficiência renal em hemodiálise (dos quais existem 6000000 pelo mundo inteiro), as concentrações de fosfato no plasma sanguíneo podem aumentar drasticamente e tal hiperfosfatemia pode resultar na deposição de fosfato de cálcio nos tecidos moles. Actualmente, os níveis de fosfato no plasma são reduzidos pela ingestão oral de ligandos de fosfato orgânico e inorgânico. O tratamento mais comum no RU é com o gel de hidróxido de alumínio ("Aludrox" a 4 g/dia) que forma um fosfato 1 de alumínio insolúvel. No entanto, isto resulta depois em complicações tóxicas devido à acumulação de Al, e. g. redução na produção de hemoglobina, insuficiência na reparação natural e produção de osso e possível insuficiência da função neurológica/cognitiva. Foram conseguidas melhorias na capacidade de ligação de fosfato compararativamente ao gel de hidróxido de alumínio, com outros compostos de alumínio, tais como hidróxido de óxido de alumínio microcristalino (boemite) e determinados hidrotalcitos; Ookubo et al, Journal Pharmaceutical Sciences (Novembro 1992), 81(11),1139-1140. No entanto, tais compostos continuam a resultar numa quantidade intolerável de acumulação de alumínio em doentes com insuficiência renal. Sabe-se também como utilizar compostos de cálcio com solubilidade fraca a pH 6-9, e. g., carbonato, hidróxido, óxido e/ou sulfato de cálcio numa forma médica resistente aos sucos gástricos. No entanto, sabe-se que, por exemplo, com carbonato de cálcio, é necessária uma dosagem superior devido à sua capacidade in vivo, relativamente baixa, para remover o fosfato, tais dosagens superiores sendo, também, difíceis de administrar. Isto pode provocar outras complicações associadas com a ingestão elevada de cálcio. Foi também proposto (documento WO-A-92/01458) controlar os niveis de fosfato no soro em doentes a sofrer ou com predisposição para a hiperfosfatemia por contacto do fosfato ingerido com um composto oxi-ferroso seleccionado de óxidos, oxi-hidróxidos férricos e hidróxidos. De um modo semelhante, Spengler et al., Nephrol. Dial. Transplant. (1996), 11, 808-812, sugere o tratamento de hiperfosfatemia com um complexo dextrano modificado com óxido-hidróxido de ferro (III). No entanto, nos testes conduzidos, foram administradas quantidades de dosagem extremamente elevadas a animais. No entanto, muitas preparações inorgânicas são ligandos de fosfato eficientes apenas ao longo de uma gama de pH limitada, especialmente uma gama de pH ácido 2 de cerca de 3-5. Tais ligandos de fosfato actuais, eficazes a pH 3, não se ligariam necessariamente, de um modo eficaz, a um pH superior, e. g., á7, que é obtido no tracto inferior, e. g., duodeno e abaixo, e onde, pelo menos, alguma da ligação do fosfato pode ocorrer. Além disso, os ligandos particularmente alcalinos poderão tamponar o pH do estômago para um nível elevado ao qual eles não terão uma capacidade de ligar fosfato.

Assim, existe uma necessidade urgente e generalizada por um ligando de fosfato que não liberte alumínio na corrente sanguínea, que não proporcione efeitos secundários de longo termo, que possa ser administrado em dosagens relativamente inferiores e que seja eficazes ao longo de uma vasta gama de pH desde, diga-se, de 2-8.

De um modo surpreendente, verificou-se que certos compostos metálicos mistos, que são livres de alumínio, podem ligar pelo menos 30% em peso do peso total do fosfato presente ao longo de uma gama de pH de cerca de 2-8.

Assim, de acordo com um primeiro aspecto, a invenção proporciona um composto metálico misto para utilização como um medicamento, em que o composto metálico misto é livre de alumínio e contém os metais de ferro(III) e, pelo menos, um de magnésio, cálcio, lantânio e cério, e contém, pelo menos, um dos aniões hidroxilo e carbonato, em que o composto metálico misto tem uma capacidade de ligação ao fosfato de, pelo menos, 30% em peso do peso total do fosfato presente, ao longo de uma gama de cerca de 3 a 7.

Tais compostos metálicos mistos contêm ferro (III) e, pelo menos, um de magnésio, cálcio, lantânio e cério. 3

De um modo preferido, os compostos metálicos mistos contêm, adicionalmente, pelo menos, um de sulfato, cloro e óxido.

Acredita-se que os carbonatos de hidróxido de metal mistos preferidos contendo cada, um de magnésio e ferro, são de estrutura hidrotalcita. Para tais compostos metálicos mistos, é geralmente preferido utilizar hidrotalcitas não envelhecidas, que não foram submetidas a operação de secagem.

No entanto, é ainda mais preferido utilizar composto metálico misto de cálcio férrico mistos que parece ser igualmente eficaz não envelhecida ou não.

De um modo ainda mais preferido, a proporção de Ca2+:Fe3+ é, pelo menos, 2:1., de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 3:1.

Um composto preferido alternativo contém Ca2+, Mg2+ e Fe3+, de um modo mais preferido, numa proporção de 3:3:2.

As formas de realização preferidas da invenção serão agora descritas em maior detalhe com referência aos seguintes Exemplos (que incluem também testes comparativos) e representações gráficas. Em cada uma das Fig. 1, 2, 6, 7 e 8, as ordenadas (eixo dos yy) referem-se à percentagem de fosfato ligado e a abcissa (eixo dos xx) ao pH. Nas Figuras, 4 A Fig 1 mostra o efeito do pH e envelhecimento na percentagem de ligação de fosfato de compostos metálicos mistos. Na Fig. 1, 0 Mg: Fe 3:1 prep 2 não envelhecida • Mg: Fe 3:1 prep 2 não envelhecida Δ Mg: Fe 2:1 prep 1 não envelhecida A Mg: Fe 2:1 prep 1 envelhecida □ Ca: Fe 3:1 não envelhecida Ca: Fe 3:1 envelhecida ★ Ca:Fe:Mg não envelhecida ☆ Ca:Mg:Fe envelhecida A Fig. 2 mostra o efeito do pH e secagem na percentagem de ligação de : fosfato dos compostos metálicos mistos. Na Fig. 2, 0 Mg: Fe 3:1 prep 3 húmida • Mg: Fe 3:1 prep 3 seca Δ Mg: Fe 2:1 prep 2 húmida A Mg: Fe 3:1 prep 2 seco □ Ca:Fe 3:1 Húmido Ca:Fe 3:1 Seco ★ Ca:Fe:Mg húmido ☆ Ca:Mg:Fe seco A Fig. 3 mostra o efeito do aumento de peso do composto na percentagem de fosfato ligado a pH 3. Na Fig, 3, 5

A-A

Mg(OH)2 Δ - Δ Mg:Fe 2:1 Prep 1 não envelhecida, húmida o-o CT100

CaFe 3:1 Envelhecido, húmido ·-· Altacita liquida lavada AI (OH) 3 A Fig. 4 mostra o efeito do aumento de peso do composto na percentagem de fosfato ligado a pH 7. Na Fig. 4,

CaFe 3:1 Envelhecido húmido 0-0 CTlOO ·-· Altacita liquida lavada AI(OH)3 A Fig. 5 mostra o periodo de tempo de ligação de fosfato na comida. Na Fig. 5, o AI(OH)3 □ CT Fe:Mg 2:1 não envelhecida não lavada A Ce(OH)3 ▼ Altacita liquida não lavada O Mg(OH)2

Leite de magnésia (1,8 g Mg(OH)3) ★ CTlOO lavado A Fig. 6 mostra o efeito da ligação de fosfato por preparações de ferro férrico e cálcio ao longo da gama de pH 3-8. Na Fig. 6, 6

Ca :Fe proporção 1:1 Δ-Δ Ca :Fe proporção 2:1 0-0 Ca :Fe proporção 3:1 da prep 1 ·-· Ca :Fe proporção 3:1 da prep 2 > 1 > Ca :Fe proporção 5:1 Ca :Fe proporção 3:1 (dos sais de cloreto) T-T Ca :Fe proporção 3:1 (com o ppt anterior dos metais) A Fig. 7 mostra o efeito da ligação de fosfato pelas preparações de ferro férrico e magnésio e ferro férrico, magnésio e cálcio ao longo da gama de pH 3-8. Na Fig. 7, Δ-Δ Mg:Fe 2:1 Prep 1 A-A Mg:Fe 2:1 Prep 2 0-0 Mg:Fe 3:1 Prep 1 ·-· Mg:Fe 3:1 Prep 2 Mg:Fe 3:1 Prep 3 Mg:Fe 3:1 Prep 4 Ca:Mg:Fe 3:3:2 A Fig. 8 mostra o efeito da ligação de fosfato por hidróxido de aluminio, hidróxido de magnésio e carbonato de cálcio ao longo da gama de pH de 3-8. Na Fig. 8, A-A Hidróxido de magnésio T-T Carbonato de cálcio 0-0 Hidróxido de aluminio 7 A Fig. 9 mostra a excreção individual e média (± 1 SEM) de fosfato pela urina para os ratos de controlo e os tratados com compostos de ligação de fosfato. Em particular, na Fig. 9, os valores individuais da excreção de fosfato pela urina (pmol/24 horas) foram representados graficamente para os controlos (Δ) e animais tratados com A1(0H)3 (), CaC03 (□), CTFeCa (·), Mg (OH) 2 (o), CT100 (♦) e CTFeMg (O). A média (± SEM) para cada grupo é representada por pontos com barras de desvio padrão. *p<0,05 comparado com os grupos de animais tratados com A1(0H)3; e A Fig. 10 mostra a média (± 1 SEM) do fosfato fecal solúvel (g_1 de peso seco) como uma percentagem do fosfato fecal solúvel total (solúvel e insolúvel) (g_1 de peso seco) para os ratos controlo e os tratados com compostos de ligação a fosfato. Na Fig. 10, *p <0,05 comparado com o controlo e animais tratados com

CaC03 Δ p<0,05 comparado com animais tratados com CaC03 EXEMPLO 1 ~ INVESTIGAÇÃO PRELIMINAR.

Os compostos listados na Tabela 1 abaixo, conhecidos como sendo ligandos de fosfato eficazes, foram seleccionados para investigação. Na Tabela 1, os valores indicam a percentagem respectiva da capacidade de ligação de fosfato a cada de pH 3, pH 7 e pH 8, n indicando o número de ensaios realizados para cada composto. Na tabela, o CT100 é hidrotalcita de fórmula

Al2Mg6OHi6.CO3.4H2O, comercialmente disponível de Crosfield

Limited (RU) e CT2000 é o composto CT100 na forma de uma pasta não seca. A capacidade de ligação do fosfato foi medida por mistura de 3,2 mmol do composto com 25 mL de tampão fosfato 20 mmol L”1, durante 30 min, a 25 °C. Para todos os compostos excepto para o CT2000, cujos compostos eram pós secos, os compostos foram simplesmente pesados e doseados. Para CT2000, a pasta foi doseada numa quantidade tal que proporcionasse um equivalente de 1 g de um pó seco para um peso constante a 40 °C. O fosfato de sódio e o hidrogenofosfato de sódio foram misturados para proporcionar as respectivas soluções de fosfato a pH 3, 7 e 8 (sendo adicionado HC1 para proporcionar pH 3). O ligando foi separado da solução por centrifugação (5 min, 3000 rpm) e filtração através de filtros de 0,22 pm, para proporcionar um sobrenadante, cujo conteúdo em fosfato foi depois medido utilizando um autoanalizador 911 da Hitachi com Boehringer quimica da Mannhiem. Os resultados são apresentados na Tabela 1, em que n se refere ao número de observações e os valores como a % de fosfato precipitado da solução, calculado como se segue: 100- [(x/y). 100] onde

x Y mmol de mmol de fosfato em solução após precipitação; fosfato em solução sem precipitação. e 9

Tabela 1

Composto pH 3 pH 7 pH 8 AI(OH)3(n=4) 14,7+1,8 6,2+0,4 2,7+1,6 CaC03 (n=4) 15,3+0,5 9,7+1,8 2,4+1,8 Mg(OH)2(n=4) 61,1+7,5 45,7+5,9 12,5+3,7 Ce(OH)3(n=3) 69,8+7,5 57,8+8,9 60,5+1,5 CT100 (n=3) 94,6+1,6 91,5+2,5 91,7+0,3 CT2000 (n=3) 90,7+1,2 87,2+0,0 82,3+1,4

Como pode ser observado a partir da Tabela 1, cada dos materiais do tipo hidrotalcita tem uma capacidade de ligação de fosfato consideravelmente superior ao longo de uma gama ampla de pH.

As curvas de relação de dosagem para os compostos CT e AI (OH) 3 com tampão fosfato a pH 3, 5 e 7 mostraram que os compostos CT ligam, pelo menos, duas vezes mais fosfato que um peso equivalente de A1(0H)3. 0 AI(OH)3 libertou tanto quanto 20000-41000 pg L_1 de Al3+. Além disso, embora os compostos CT tenham libertado uma quantidade consideravelmente baixa (17-66 pg L_1), será muito pouco provável que proporcione efeitos secundários em regimes de tempo-dosagem longos.

No entanto, como indicado por Ookubu (supra); continua a ser necessário incluir Al3+ no interior da estrutura de um composto de ligação de fosfato. No entanto, num teste semelhante ao descrito acima, verificou-se, de um modo surpreendente, que um composto preparado de um modo semelhante ao utilizado para 10 preparar CT100 (ver Exemplo 3 abaixo) mas substituindo uma quantidade equivalente de Fe3+, proporcionou uma excelente capacidade de ligação de fosfato, especialmente a pH 3 onde foi alcançada uma capacidade de ligação de fosfato de ~70%, sem o risco de libertação de qualquer alumínio.

EXEMPLO 2 ~ COMPARAÇAO DE HIDROXICARBONATOS METÁLICOS MISTOS,

Compostos testados: (1) um hidroxicarbonato contendo uma proporção de 2:1 de Mg:Fe (2) um hidroxicarbonato contendo uma proporção de 3:1 de Mg:Fe (3) um hidroxicarbonato contendo uma proporção de 3:1 de Ca:Fe (4) um hidroxicarbonato contendo uma proporção de 3:3:2 de Ca:Mg:Fe (5) CT100, uma hidrotalcita de fórmula Al2Mg6 (OH) i6C03.4H20, disponível comercialmente de Crosfield Limited. (6) Altalcita, uma hidrotalcita da mesma fórmula que o CHOO, disponível comercialmente de Roussell, na forma de uma pasta aquosa (7) hidróxido de magnésio (8) hidróxido de alumínio 11 Métodos para Determinar a Capacidade de Ligação de Fosfato

Como indicado abaixo, foram adoptados os seguintes métodos de medicação da capacidade de ligação de fosfato: Método 1 - foi adicionado 1 grama de cada composto ligando de fosfato (tendo em conta a hidratação do composto do bolo húmido) a 25 mL, tampão de fosfato de sódio 40 mmol ΙΓ1 ajustado para pH 3, pH 5 ou pH 7, como descrito no Exemplo 3 abaixo. As amostras foram agitadas para garantir homogeneidade e agitadas delicadamente à temperatura ambiente, durante 30 minutos. Após centrifugação durante 5 min a 3000 rpm, o sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,22 pm da millipore. Foi determinado o fosfato solúvel no sobrenadante. Foi calculada a percentagem de fosfato ligado pela hidrotalcita Método 2 - Como o método 1, mas utilizando 20 mmol LT1 de tampão fosfato. Método 3 - Leite (250 mL), flocos de milho (50 g), pão (2 fatias) e marmite (5 g) foram misturas num homogeneizador Stomacher, durante 30 minutos, contendo HC1 0,01 M (de modo a estimular as condições encontradas no estômago). Foi removida uma aliquota de 20 mL de comida e centrifugada. O fosfato foi medido no sobrenadante. Foram adicionadas duas gramas do composto ligando de fosfato a um volume de pasta da comida e misturado durante mais 30 minutos. Foi retirada uma aliquota do alimento e foi medido o fosfato no sobrenadante após centrifugação. Foram retiradas outras aliquotas de mistura após mais 30 e 90 minutos. 12

Em cada um dos métodos acima, para cada um dos compostos (1)-(4), onde foi doseado um pó seco como o ligando de fosfato, o ligando de fosfato foi medido para uma determinada dosagem após a secagem para peso constante, a 40 °C. Quando foi doseado o bolo húmido (ou adicionada Altalcita (6)), foi utilizada uma quantidade equivalente a um peso seco constante a 40 °C. Para ligandos comercialmente disponíveis conhecidos, foi utilizado um peso conhecido do material fornecido.

Resultados

Experiência 1: Efeito do pH e Envelhecimento na Percentagem de Ligação do Fosfato por Compostos Metálicos Mistos

Os compostos de ligação de fosfato foram preparados na forma de uma pasta húmida. Foram obtidas amostras não envelhecidas por filtração e lavagem da pasta húmida para formar um bolo húmido que foi testado desta forma, enquanto as amostras envelhecidas foram obtidas por aquecimento da pasta húmida para 80 °C durante duas horas antes da filtração do bolo, que foi depois testado. Foi investigada, deste modo, a percentagem de ligação de fosfato aos compostos envelhecidos ou não envelhecidos, ao longo da gama de pH de 3-7. Método 1 foi utilizado para medir a capacidade de ligação de fosfato. Os resultados são mostrados na Fig. 1. O composto Ca:Fe 3:1 (3) ligou quase 100% do fosfato independentemente do pH. Não se verificou diferença entre o composto envelhecido e o composto não envelhecido. 13

Os compostos Mg:Fe (1) e (2) numa proporção de 2:1 (prep 1) e 3:1 (prep 2) respectivamente, ligam o fosfato independentemente do pH, ao longo de uma gama de 3-7. Os compostos não envelhecidos demonstraram ser melhores ligandos de fosfato do que os compostos envelhecidos a pH 3-7. 0 composto Ca:Mg:Fe (3) liga também o fosfato independentemente do pH; mais uma vez o não envelhecido foi melhor do que o composto envelhecido.

Experiência 2: Efeito do pH e Secagem na Percentagem de Ligação de Fosfato de Compostos Metálicos Mistos

Foi investigada a percentagem de ligação de fosfato dos compostos quando utilizados no pó seco ou húmido (bolo) ao longo da gama de pH de 3-7. Método 1 foi utilizado para medir a capacidade de ligação de fosfato. Os resultados são mostrados na Fig. 2.

Os compostos não envelhecidos foram comparados na sua forma húmida (bolo) ou após secagem para peso constante. Foi utilizado um grama de peso de cada composto para comparação (hidratação do composto húmido (bolo) foi considerada para, e. g., se a hidrotalcita for 20% em peso seco (calculada num peso seco constante a 40 °C), foram utilizadas 5 gramas).

Em todos os casos, excepto o composto Ca:Fe 3:1 (3), onde não se verificam diferenças, a forma húmida (bolo) do composto foi um ligando de fosfato melhor do que a forma em pó seco. Quer na forma húmida ou seca, todos os compostos (1)-(4) ligam o 14 fosfato independentemente do pH. São obtidos resultados semelhantes quando se utiliza compostos envelhecidos uma vez que o composto húmido liga mais fosfato do que o composto em pó seco.

Experiência 3: Efeito da Quantidade Aumentada de Composto Lingado de Fosfato em Percentagem de Ligação de Fosfato para Vários Compostos a pH 3 0 Método 2 foi utilizado para medir a capacidade de ligação de fosfato. Os resultados são mostrados na Fig. 3. A pH 3, Mg(OH)2, o composto (7), foi o melhor ligando de fosfato. No entanto, outros estudos demonstraram que esta ligação é dependente de pH, não ligando praticamente nenhum fosfato a pH 8. Deste modo teria utilização limitada in vivo.

Os compostos Mg:Fe 2:1 (1), Ca:Fe 3:1 (2) e CT100 (5) todos ligam até 60-70% do fosfato. De um modo interessante, o CT100 liga -50% mais fosfato a qualquer peso do que o Altalcita (6), apesar de apresentarem uma fórmula molecular idêntica. O AI(OH)3, o ligando de fosfato utilizado com mais frequência para controlar os niveis de fosfato no soro, foi relativamente ineficaz na gama de pesos testados.

Experiência 4: Efeito da Quantidade Aumentada de Composto Ligando de Fosfato na Percentagem de Ligação de Fosfato para Vários Ligandos a pH 7 15 Método 2 foi utilizado para determinar a capacidade de ligação do fosfato. Os resultados são mostrados na Fig. 4. A pH 7, o composto Mg:Fe 3:1 (2) foi o melhor ligando de fosfato ao longo da gama de pesos estudados. 0 CT100 (5) liga, pelo menos, duas vezes mais fosfato do que o Altalcita (6) em qualquer peso estudado.

Experiência 5: Ligação do Fosfato na Comida 0 Método 3 foi utilizado para determinar a capacidade de ligação do fosfato. Os resultados são mostrados na Fig. 5.

Os resultados mostram que na comida, o CT100 (5) foi o melhor ligando de fosfato, seguido pelo composto Fe:Mg 2:1 (2). De novo, o hidróxido de aluminio (8) foi ineficaz. De um modo interessante, o hidróxido de magnésio (7), o melhor ligando de fosfato a pH 3, não é o melhor quando utilizado em comida. Isto é, provavelmente, devido ao efeito tampão da comida, sendo o pH inicial da pasta - 5. Deste modo, mostra a dependência do pH ao utilizar o hidróxido de magnésio como um ligando de fosfato.

Sumário

No global, os resultados demonstraram: • Os compostos Mg:Fe e Ca:Fe (1 )-(4) foram ligandos de fosfato eficientes ao longo de uma gama de pH que é mais provável de se encontrar no tracto gastrointestinal. 16 • A ligação do fosfato pelos compostos MgFe e MgCaFe (1), (2) e (4) mas não o composto CaFe (3) foi reduzido pelo envelhecimento dos compostos. • A secagem dos compostos MgFe e MgCaFe (1), (2) e (4) mas não do composto CaFe (3) reduziu a sua ligação de fosfato. • 0 composto de hidrotalcita conhecido CT100 (5) liga o fosfato na comida em estudos in vitro. Reduz também a excreção de fosfato urinário quando administrado in vivo a indivíduos normais. No entanto, como os novos compostos (1)-(4) ligam o fosfato em água, pelo menos, tão bem quanto o CT100 (5) e algumas vezes melhor do que o A1(0H)3 (8), seria de esperar que eles ligassem também o fosfato in vivo. Estes compostos têm o benefício acrescentado de não libertação de alumínio. • Estes novos compostos (1)-(4) têm um potencial terapêutico no controlo dos níveis de fosfato no soro em doentes com insuficiência renal em fase terminal.

EXEMPLO 3 ~ OUTRAS INVESTIGAÇÕES DA CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE FOSFATO Método de Preparação e Determinação

Nas seguintes experiências, todos os químicos foram de grau GPR, obtidos da BDH. Os filtros da Millipore foram obtidos da Amicon, High Wycombe. 17

Ml. Produção de preparações de metal co-precipitado

Todas as preparações foram sintetizadas utilizando o seguinte método que, para uma proporção de 3:1 de Mg2+:A13+, tem os catiões M2+:M3+ respectivos, resultou na produção de hidrotalcita Al2Mg6 (OH) 16CO3.4H20. A utilização de cálcio ou magnésio como o catião M2+ e ferro férrico como o catião m3+ permitem variações no tema acima a ser alcançado. Alterando a proporção dos catiões M2+:M3+ para 1:1, 2:1, 3:1 e 5:1, podem ser produzidas diferentes composições de materiais. No entanto, todos os compostos têm C032- como o anião permutável.

Para uma proporção 3:1 de M2+:M3+, foi dissolvido o sal contendo 2 moles de M3+ e sal contendo 6 moles de M2+ em 4 litros de água desionizada. Em 4 litros separados, foram dissolvidas 16 moles de NaOH e 5 moles de Na2CC>3. Ambas as soluções foram bombeadas utilizando uma bomba peristáltica num frasco com uma capacidadede ~2 litros e constantemente misturado. A taxa de adição de soluções foi tal que a solução misturada tinha um pH de 10,0-10,5. Após ter sido descartado o primeiro litro, período no qual foi estabelecido um equilíbrio, foram recolhidos 3-4 litros de pasta que transbordou. Esta foi depois filtrada a vácuo utilizando um Buchner, lavada com água desionizada e filtrada de novo, proporcionando um "bolo" húmido.

Os nomes da preparação e as composições da solução/suspensão utilizados para a sua produção são mostrados na Tabela 2. Devido à insolubilidade do sulfato de cálcio, quando utilizado como o 18 sal de M2+, foi necessária agitação constante para prevenir que assente. M2. Produção de uma mistura de precipitado metálico

Os metais nas soluções/suspensões descritas na Tabela 1 foram precipitados ao mesmo tempo pela adição de hidróxido de sódio. Foi também preparada uma preparação por precipitação do cálcio e ferro em separado com hidróxido de sódio, os precipitados foram depois misturados. Para isto, o Fe2(S04)3 (1 mole) e o NaOH (6 moles) foram misturados em 4 litros de H20 desionizada. Nos 4 litros de água separados, o CaS04 (6 moles), NaOH (12 moles) e Na2C03 (5 moles) foram misturados. Estas duas suspensões foram colocadas no frasco com uma capacidade de -2 litros e misturados constantemente.

Provou ser impossível alterar a taxa de adição das suspensões precipitadas de modo a que a mistura tenha um pH de 10,0 - 10,5. O pH da mistura flutuou entre -11,5 e 12,5. Após ter sido descartado o primeiro litro, foram recolhidos os 3-4 litros de pasta que transbordaram. Este foi depois filtrado a vácuo utilizando um Buchner, lavado com água desionizada e de novo filtrados proporcionando um "bolo" húmido. M3. Determinação da composição metálica

As preparações foram lavadas e secas, para peso seco constante, num forno a -40 °C. Foi titulado um grama contra HC1 1 M até ser atingido um pH constante de 1. As concentrações de iões M2+ e M3+ em solução foram medidos. Para o ferro e cálcio, 19 foi utilizado um autoanalizador Hitachi 911 com quimica da Boehringer Mannheim, enquanto para o magnésio foi utilizada espectroscopia de absorção atómica fotométrica. NB. Embora os métodos de análise adoptados aqui sejam de elevada precisão, o método de amostragem foi tal de modo a proporcionar apenas uma avaliação inicial aproximada da composição actual; nos resultados apresentados abaixo, comparar as proporções previstas a partir dos materiais de partida (assumindo 100% de rendimento) com aquelas das preparações finais medidas deste modo. M4. Medição da Ligação de fosfato A ligação de fosfato para os compostos preparados acima, quando doseados como um pó seco, foi medida em cada caso a uma dosagem de 1,0 grama de peso seco (determinado pela secagem para peso constante a 40 °C) . Quando foi doseado um bolo húmido, foi adicionada uma quantidade equivalente a 1 g de peso seco. Foi também determinada a ligação de fosfato dos ligandos convencionais, hidróxido de magnésio, hidróxido de alumínio e carbonato de cálcio, nestes casos utilizando 1 g de material como fornecido. A capacidade de ligar o fosfato foi determinada ao longo de uma gama de pH de 3-8, aproximadamente a gama de pH encontrado no tracto gastrointestinal normal. Foram produzidos tampões de fosfato de sódio 40 mmol L_1 a pH 5, pH 7 e pH 8 por mistura dos volumes apropriados de soluções de Na2HP04 40 mmol LA1 e NaH2P04 40 mmol IA1. Foi produzida uma solução de fosfatos a pH 3 por adição de HC1 1 M a uma solução de NaH2P04 a 40 mmol LA1. 20

As preparações foram suspensas em 25 mL de tampão de fosfatos 40 mmol L_1 e bem misturado para garantir a homogeneidade. Esta suspensão foi, depois, agitada delicadamente à temperatura ambiente, durante 30 minutos, seguido por centrifugação a 3000 rpm durante 5 min. Após filtração do sobrenadante através de filtros de 0,22 pm da millipore, foi medido o fosfato solúvel utilizando um autoanalizador 911 da Hitachi com química da Boehringer Mannheim. A ligação de fosfato foi calculada como uma percentagem do presente na solução original.

As composições de soluções utilizadas para produzir as preparações co-precipitadas de metal são mostradas na Tabela Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Composição das soluções utilizadas para produzir as preparações de co-precipitado de metal

Nome do Material Moles do sal de m2+ Moles do sal de M3+ Moles de NaOH Moles de Na2C03 Mg:Fe 2:1 (Prep 1) 4 Mole de MgS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 12 5 Mg:Fe 2:1 (Prep 2) 4 Mole de MgS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 12 5 Mg:Fe 3:1 (Prep 1) 6 Mole de MgS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 16 5 Mg:Fe 3:1 (Prep 2) 6 Mole de MgS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 16 5 21 (continuação)

Nome do Material Moles do sal de m2+ Moles do sal de M3+ Moles de NaOH Moles de Na2C03 Mg:Fe 3:1 (Prep 3) 6 Mole de MgS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 16 5 Mg:Fe 3:1 (Prep 4) 6 Mole de MgS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 16 5 Ca:Fe 1:1 2 Mole de CaS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 8 5 Ca:Fe 2:1 4 Mole de CaS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 12 5 Ca: Fe 3:1 (Prep D 6 Mole de CaS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 16 5 Ca:Fe 3:1 (Prep 2) 6 Mole de CaS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 16 5 Ca:Fe 5:1 10 Mole de CaS04 1 Mole Fe2 (S04) 3 24 5 Ca:Fe 3:1 (preparado com sais de cloreto) 6 Mole de CaCl2 2 Mole de FeCl2 16 5 Ca:Mg:Fe 3:3:2 3 Mole de MgS04 3 Mole de CaS04 1 Mole de Fe2 (S04) 3 16 5

Resultados

Foram obtidos os seguintes resultados.

Rl. Composições metálicas previstas e medidas das preparações

Para determinar se a proporção de iões metálicos nas soluções originais estão também presentes na preparação final, 22 todos os materiais foram hidrolisados com HC1 1 M e foram medidas as concentrações de iões metálicos em solução. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. Isto demonstra que os compostos preparados como acima eram, de facto, compostos metálicos mistos.

Tabela 3: Composições metálicas previstas e medidas das preparações

Nome do Material Proporção de M^+:MJ+ Proporção de M:d+:MJ+ prevista determinada Mg:Fe 2:1 (Prep 2) 2:1 1, 7:1 Mg:Fe 3:1 (Prep 1) 2:1 2,4:1 Mg:Fe 3:1 (Prep 2) 3:1 2,2:1 Mg:Fe 3:1 (Prep 3) 3:1 2,2:1 Mg:Fe 3:1 (Prep 4) 3:1 2.3:1 Ca:Fe 1:1 1:1 1,3:1 Ca:Fe 2:1 2:1 1,6:1 Ca:Fe 3:1 (Prep 2) 3:1 2,6:1 Ca:Fe 5:1 5:1 1,3:1 Ca:Fe 3:1 3:1 1,4:1 (preparado com sais de Cl) Ca:Fe 3:1 (mistura 3:1 1,1:1 de metais após ppt") Ca:Mg:Fe 3:3:2 2,9:2,3:2 23 R2, Ligação de Fosfato R2.1 Preparações contendo ferro férrico e cálcio

As preparações contendo diferentes proporções de ferro férrico e cálcio foram testadas para a sua capacidade para ligar o fosfato. A reprodutibilidade dos resultados foi demonstrada relativamente a uma proporção de Ca2+:Fe3+ prevista de 3:1 e esta é mostrada na Tabela 4 abaixo, enquanto os resultados obtidos para diferentes proporções são mostrados na Fig. 6 e Tabela 5 abaixo.

Nos gráficos mostrados na Fig. 6, os valores representados graficamente são a média de duas experiências separadas. (i) Uma proporção prevista de 3:1 de Ca2+ :Fe3+

Foram sintetizadas duas preparações diferentes de ferro férrico e cálcio com uma proporção prevista de 3:1. Quando a preparação 2 foi hidrolisada, as análises elementares mostraram que a proporção de ferro férrico para cálcio medida era de 2,6:1. Não existia amostra suficiente da preparação 1 para hidrólise. A ligação do fosfato por cada preparação foi testada em duas experiências separadas ao longo da gama de pH de 3-8. A ligação foi reproduzida para ambas as preparações a cada pH (Tabela 4). Pelo menos, 96% do fosfato presente na solução foi ligado por cada preparação a cada pH (Fig. 5, Tabela 4). 24

Tabela 4: Reprodutibilidade da ligação de fosfato para preparações com uma proporção prevista de 3:1 de Ca2+:Fe3+

Percentagem de ligação de fosfato a pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 Prep 1 (exp. 1 ) 97 98 98 97 Prep 1 (exp. 2) 96 96 97 97 Prep 2 (exp. 1 ) 98 99 100 100 Prep 2 (exp. 2) 100 99 100 99 (ii) Uma proporção prevista de 1:1 de Ca2+:Fe3+

Foi sintetizada uma preparação de ferro férrico e cálcio com uma proporção prevista de 1:1. A análise elementar do material hidrolisado mostrou que a proporção medida de ferro férrico para cálcio como era de 1,3:1.

Mais de 50% do fosfato presente em solução foi ligado pela preparação a pH 3-8 (Fig. 6, Tabela 5). A ligação do fosfato foi dependente do pH. O material ligou 28% menos fosfato a pH 8 do que a pH 3. (iii) Uma proporção prevista de 2:1 de Ca2+:Fe3+

Foi sintetizada uma preparação de ferro férrico e cálcio com uma proporção prevista de 2:1. A análise elementar do material hidrolisado mostrou que a proporção medida de ferro férrico para cálcio era de 1,6:1. 25

Pelo menos 97% do fosfato presente na solução foi ligado ao longo da gama de pH de 3-8 (Fig. 6, Tabela 5). Não se verificou dependência de pH na ligação. (iv) Uma proporção prevista de 5:1 de Ca2+:Fe3+

Foi sintetizada uma preparação de ferro férrico e cálcio com uma proporção prevista de 5:1. A análise elementar do material hidrolisado mostrou que a proporção medida de ferro férrico para cálcio era de 1,5:1.

Pelo menos 95% do fosfato presente na solução foi ligado ao longo da gama de pH 3-8 (Fig. 6, Tabela 5) . Não se verificou dependência de pH na ligação. (v) Uma proporção prevista de 3:1 de Ca2+:Fe3+ preparada utilizando sais de cloreto de metal

Devido à insolubilidade do sulfato de cálcio, foi preparada uma preparação utilizando o sal solúvel, cloreto de cálcio. Foi sintetizada uma preparação de ferro férrico e cálcio com uma proporção de 3:1. A análise elementar do material hidrolisado mostrou que a proporção medida de ferro férrico para cálcio era de 1,4:1.

Mais de 60% do fosfato presente em solução foi ligado ao longo da gama de pH 3-8 (Fig. 6, Tabela 5). A ligação de fosfato foi dependente do pH, com 31% menos de precipitado a pH 8 do que a pH 3. 26 (vi) Uma proporção prevista de 3:1 de Ca2+:Fe3+ preparada por precipitação do cálcio e ferro antes da mistura

Foi preparada uma preparação para determinar se a precipitação do ferro férrico e cálcio dos seus sulfatos antes da mistura iria produzir um material de ligação de fosfato. Este composto foi preparado como no método M2. A proporção prevista de ferro férrico para cálcio foi de 3:1 embora a proporção medida após a hidrólise ácida tenha sido de 1,1:1.

Mais de 75% do fosfato presente em solução foi ligado ao longo da gama de pH de 3-8 (Fig. 6, Tabela 5) . A ligação foi dependente de pH para um grau mais pequeno a pH 8, foi ligado menos 8% de fosfato do que a pH 3.

Tabela 5: Ligação de fosfato pelas preparações contendo férrico e cálcio a pH 3-8

Percentagem de ligação de fosfato Proporção prevista de Ca2+Fe3+ pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 1:1 75 72 63 54 2:1 99 95 99 98 3: 1* 98 99 100 100 5:1 97 96 99 98 3:1 (preparado com sais de cloreto) 92 87 72 64 3:1 (com pptn anterior de metais) 85 84 80 78 *Preparação 2 (exp. 1) da Tabela 4 também incluído para comparação 27 R2.2 Preparações contendo magnésio e ferro férrico

Foram testadas várias preparações contendo diferentes proporções de ferro férrico para magnésio, para a sua capacidade para ligar o fosfato. A reprodutibilidade dos resultados foi demonstrada em cada caso, e estes resultados são mostrados nas Tabelas 6-8 abaixo, enquanto a comparação dos resultados é mostrada na Fig. 7. (í) Uma proporção prevista de 3:1 de Mg2+:Fe3+

Foram sintetizadas quatro preparações de férrico e magnésio com a proporção prevista de 3:1. A preparação 1 tinha uma proporção real de 2,4:1 de Mg2+:Fe3+ Preparações 2, 3 e 4 tinham proporções medidas de Mg2+:Fe3+ de 2,2:1, 2,2:1 e 2,3:1, respectivamente. A preparação 1 ligou, pelo menos, 60% do fosfato ao longo da gama de pH de 3-7. As preparações 2, 3 e 4 ligaram, pelo menos, 40%, 50% e 30% do fosfato, respectivamente, ao longo da gama de pH de 3-8 (Fig. 7, Tabela 6). A ligação de fosfato pela preparação 4, foi reprodutível (Tabela 6). Uma falta de material significa que as experiências de ligação nas preparações 1, 2 e 3 foram efectuadas uma só vez.

As três preparações estudadas ao longo da gama de pH de 3-8 mostram todas, dependência de pH na sua ligação de fosfato. As preparações 2 e 3 ligaram 44% e 29% menos fosfato, respectivamente, a pH 8 relativamente a pH 3. A preparação 4 ligou uma média de 21% menos de fosfato a pH 8 do que a pH 3. 28

Tabela 6: Ligação de fosfato para as preparações com uma proporção prevista de 3:1 de Mg2+:Fe3+

Percentagem de ligação de fosfato a pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 Prep 1 60 58 61 - Prep 2 79 76 55 44 Prep 3 75 73 63 53 Prep 4 (exp. 1) 41 40 34 37 Prep 4 (exp. 2) 45 39 36 32 (i) Uma proporção prevista de 2:1 de Mg2+:Fe3+

Foram sintetizadas duas preparações de ferro férrico e magnésio com uma proporção prevista de 2:1. A análise elementar da preparação 2, após hidrólise, mostrou a proporção de ferro férrico para magnésio medida como sendo 1,7:1. Não estava disponível amostra suficiente para estudar a composição elementar da preparação 1. A preparação 1 ligou mais do que 60% do fosfato ao longo da gama de pH de 3-7. A preparação 2 ligou, de um modo reprodutível, mais de 30% do fosfato ao longo da gama de pH de 3-8 (Tabela 7, Fig. 7) . Este foi dependente de pH com uma média de 27% menos de fosfato sendo ligado a pH 8 do que a pH 3. 29

Tabela 7: Ligação de fosfato para as preparações com a proporção prevista de 2:1 de Mg2+:Fe3+

Percentagem de ligação de fosfato a pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 Prep 1 77 75 65 - Prep 2 (exp. 1) 50 48 41 37 Prep 2 (exp. 2) 42 39 38 30 2.3 Uma preparação contendo ferro férrico, cálcio e magnésio (i) Uma proporção prevista de 3:3:2 de Ca2+ :Mg2+ :Fe3+

Foi sintetizada uma preparação de ferro férrico, magnésio e cálcio com uma proporção prevista de 3:3:2. Quando esta foi hidrolisada, a análise elementar mostrou que a proporção medida de ferro férrico para magnésio para cálcio era de 2,9:2,3:2.

Este composto ligou mais do que 45% do fosfato em solução ao longo da gama de pH de 3-8 (Fig. 7) . Duas experiências em separado mostraram que a ligação de fosfato foi reprodutível (Tabela 8). A ligação foi dependente de pH com uma média de 36% menos de fosfato precipitado a pH 8 do que a pH 3. 30

Tabela 8: Ligação de fosfato para a preparação com uma proporção prevista de 3:3:2 de Ca2+:Mg2+:Fe3+

Percentagem de ligação de fosfato pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 Exp. 1 80 77 65 54 Exp. 2 80 78 64 48 R2.4 Ligação de Fosfato por compostos convencionais

Os compostos hidróxido de alumínio, hidróxido de magnésio e carbonato de cálcio foram também testados para a sua capacidade para ligar o fosfato. 0 método foi previamente descrito em M4.

Todos os compostos foram testados duas vezes e mostraram ligação de fosfato reprodutível ao longo da gama de pH estudada e os resultados são mostrados na Fig. 8 e Tabela 9 abaixo. Na Fig. 8, os valores representados graficamente são a média de duas experiências individuais para cada composto.

Como pode ser observado, a ligação de fosfato foi dependente de pH com uma média 2,4 vezes superior na ligação por A1(0H)3 a pH 3 relativamente a pH 8. 0 Mg(OH)2 liga uma média de 3,7 vezes mais fosfato a pH 3 do que a pH 8. 0 CaC03 liga uma média de 5,9 vezes mais fosfato a pH 3 do que a pH 8. 31

Tabela 9: Ligação de fosfato por A1(0H3), Mq(OH)2 e CaC03

Percentagem de ligação de fosfato a pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 AI(OH)3 20 19 18 9 AI(OH)3 30 25 23 12 Mg(OH)2 81 82 54 17 Mg(OH)2 87 80 58 28 CaC03 69 63 30 8 CaC03 72 70 43 16

Exemplo 4 - Sulfato de Cálcio Como Ligando de Fosfato

Os seguintes compostos que não estão no âmbito da presente invenção foram testados como ligandos de fosfato: 1. Sulfato de cálcio anidro tratado com hidróxido de sódio 2. sulfato de cálcio anidro 3. CaS04, 2H20. 4. Co-precipitado férrico/ferroso 5. Precipitado férrico 1. Sulfato de cálcio anidro tratado com hidróxido de sódio

Este foi preparado por mistura de sulfato de cálcio anidro (CaS04) (0,1 moles) com hidróxido de sódio (NaOH) (0,2 moles) em 32 100 mL de água desionizada durante 30 minutos, à temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada durante 2 min a 3000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O residuo foi lavado por mistura com 100 mL de água, durante 5 minutos, seguido por centrifugação, durante 2 min a 3000 rpm. O sobrenadante foi removido e o processo de lavagem foi repetido mais três vezes. O sólido resultante foi aquecido para peso seco constante a 60 °C. 2. Sulfato de cálcio anidro

Foi utilizado pó de sulfato de cálcio anidro seco comercialmente disponível. 3. Di-hidrato de sulfato de cálcio

Foi utilizado pó de di-hidrato de cálcio comercialmente disponível. 4. Co-precípítado férrico/ferroso

Este foi preparado por co-precipitação de sulfato ferroso FeS04 e sulfato férrico Fe2(S04)3 com hidróxido de sódio para obter um composto óxido de ferro hidratado. A proporção prevista de Fe2+:Fe3+ foi de 3:1. 33 5. Precipitado férrico

Este foi preparado por mistura de sulfato férrico (Fe2(SO4) 3) (0,1 moles) com hidróxido de sódio (NaOH)(0,3 moles) em 100 mL de água desionizada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada, durante 5 min, a 3000 rpm e o sobrenadante foi removido. O precipitado foi lavado por mistura com 100 mL de água durante 5 minutos, seguido por centrifugação, durante 5 min, a 3000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o processo de lavagem foi repetido mais 3 vezes. O precipitado foi aquecido para peso seco constante a 60 °C.

Ligação de fosfato A capacidade de ligação de fosfato de cada um dos materiais acima foi medida como descrito acima no Exemplo 3, utilizando um grama de cada composto em 25 mL de solução de fosfato 40 mmol L“ 1, pH 3-8.

Os resultados são mostrados na Tabela 10 abaixo. 34

Tabela 10: Ligação de fosfato ao longo da gama de pH de 3-8 por sulfato de cálcio tratado alcalinamente, sulfatos de cálcio anidro e hidratado e composto Fe2+:Fe3+ com uma proporção prevista de 3:1 e um composto Fe3+

Percentagem de ligação de fosfato a Composto pH 3 pH 5 pH 7 pH 8 Tratado com CaSC>4 100 100 100 100 CaS04 anidro 2 7 47 55 CaS04.2H20 0 0 57 89 Fe2+:FeJ+ 3:1 26 18 33 - FeJ+ 56 59 56 41 A partir da tabela acima, pode ser observado inicialmente que os compostos metálicos mistos contêm, de um modo preferido, cada um de catiões férricos e, pelo menos, um catião de magnésio, cálcio, lantano e cério e, pelo menos, um anião de hidroxilo e carbonato e, opcionalmente, pelo menos, um de sulfato, cloreto e óxido, têm uma excelente capacidade de ligação de fosfato a um tampão com pH relevante para condições fisiológicas no tracto gastrointestinal.

Em particular, mostram uma excelente capacidade de ligação de fosfato ao longo de uma gama de pH de 2-8, especialmente, 3-7, e são, com certeza, capazes de ligar fosfato na região do estômago (tracto superior) onde o pH seria, normalmente, cerca de 3-4, até 7, possivelmente dependendo do pH do próprio ligando e também no tracto inferior, por exemplo, no duodeno ou jujueno, onde o pH é provavelmente ^7. 35

Tendo em conta esta capacidade de ligação elevada, são possíveis dosagens inferiores.

Além disso, para o mesmo peso de composto de ligação de fosfato, um composto misto de cálcio/férrico contém menos ião férrico do que o composto correspondente contendo apenas ferro. Isto permite uma dosagem pequena in vivo de ferro para, pelo menos, a mesma capacidade de ligação de fosfato, aumentando, assim, a tolerância provável de um doente para a dosagem administrada. A capacidade de ligação de fosfato do composto misto magnésio/férrico é também acentuadamente menos dependente de pH quando comparado com o hidróxido de magnésio. Além disso, o magnésio tende a estabilizar, conduzindo a uma libertação esperada inferior deste, quando administrado in vivo, com efeitos secundários esperados reduzidos, tais como hipermagnesemia. Do mesmo modo, o ferro tende a estabilizar, conduzindo a uma libertação esperada deste inferior in vivo, com uma redução esperada na formação do radical livre in vivo muitas vezes encontrada com iões Fe3+, conduzindo assim a menos lesão do tecido membranar.

Foi também verificado, de um modo particularmente surpreendente, que o acima também se aplica ao sulfato de cálcio após o seu tratamento com uma solução alcalina. 36

EXEMPLO 5 HIDROXICARBONATO METÁLICO MISTURADO COMO

LIGANDOS DE FOSFATO - ESTUDO IN VIVO EM RATOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Os seguintes químicos, a não ser que seja indicado o contrário, foram de grau GPR da BDH/Merck (Poole, RU) : CaS04, Fe2 (S04) 3.xH20 (grau técnico), MgS04, CaC03, NaOH, ácido nítrico a 70% (redestilado, 99,99% de pureza). O Al(OH)3 e Mg(OH)2 foram obtidos da Sigma (Poole RU). O CT100 foi obtido da Crosfield Ltd (Warrington, RU).

Os ligandos de fosfato foram incorporados na dieta de manutenção de rato convencional, rato/murganho N° 1 obtido da Lilico (Betchworth, Surrey RU).

Produção de compostos CT O CTFeCa e CTFeMg eram hidroAltalcitas misturados com uma proporção prevista de Mg2+ ou Ca2+:Fe3+ de 3:1, produzidos no laboratório seguindo um processo laboratorial convencional para preparações de hidroxi-carbonato metálico como descrito no Exemplo 3 (M2) . Este sulfato de metal2+, 6 moles e sulfato de metal3+, 2 moles, foram dissolvidos em 4 litros de H20 desionizada. Num frasco separado, foram dissolvidas 16 moles de NaOH e 5 moles de Na2C03 em 4 litros de H20 desionizada. As duas soluções foram bombeadas utilizando bombas peristálicas num frasco com uma capacidade de ~2 litros, a taxa de adição da solução foi tal que quando misturada, a suspensão resultante tinha um pH de 10,0 - 10,5. Após descartar o primeiro litro, periodo este em que foi estabelecido o equilíbrio, foram 37 recolhidos 3-4 litros de pasta que transbordou. Este foi filtrado a vácuo utilizando um frasco Buchner e lavado com 1 litro de água desionizada três vezes. Para permitir a incorporação no alimento de rato, o "bolo" húmido foi seco para peso seco constante a 50 °C e moido com um almofariz e pilão.

Estudos in vivo no rato vinte e oito ratos (estirpe Sprague-Dawley), com uma gama de pesos de 275-307 gramas, foram divididos em sete grupos, cada um contendo quatro animais (nas Tabelas 11-14, n=4). Os ligandos de fosfato foram incorporados no alimento do rato a uma concentração de 1% (p/p). Cada grupo de ratos foi alimentado com uma dieta única, ad libitum, durante sete dias e com acesso ilimitado a água desionizada. Os animais foram depois pesados e transferidos para gaiolas de contenção, durante 24 horas, onde receberam 18 gramas de dieta de controlo e acesso ilimitado a água. Foi recolhida a urina total durante 24 horas e as fezes foram recolhidas durante este período. No final dos períodos de tratamento, os animais foram novamente pesados e foi obtida uma amostra de sangue via a artéria carótida, após anestesia com pentobarbitona de sódio (Sagatal) 0,1 mL/lOOg de peso corporal de uma solução a 60 mg/mL.

Preparação de fezes e urina

Devido ao design das gaiolas de contenção, as fezes do rato ficaram inevitavelmente contaminadas com a comida de controlo da dieta e existiu também uma ligeira contaminação da urina. Antes da análise, a comida foi, deste modo, separada da urina por 38 centrifugação, durante 5 minutos, a 1500 rpm. O sedimento de comida foi descartado. A comida particulada contaminada foi removida das fezes utilizando forcepes e a amostra fecal foi pesada.

As amostras fecais totais de cada animal foram misturadas para garantir uma homogeneidade e duplicadas as aliquotas de um grama pesadas. A percentagem de hidratação das fezes foi calculada após liofilização para peso constante.

Para medição do fosfato fecal total e teor em ião metálico, as fezes liofilizadas foram trituradas com um almofariz e pilão e 200 mg hidrolizadas por aquecimento para 70 °C, durante 4 horas, com 7 mL de ácido nítrico concentrado em tubos de teste de polipropileno. As fezes digeridas foram diluídas para 50 mL com água desionizada em recipientes de Nalgen de 125 mL lavados com ácido.

Para medição do fosfato fecal solúvel e teor em ião metálico, uma aliquota de 1,5 gramas das fezes foi suspenso em 15 mL de água desionizada. Após homogeneização e centrifugação a 3000 rpm durante 45 minutos, o sobrenadante foi filtrado através de lã de vidro para remover o material particulado contaminante e armazenado a -20 °C. Métodos analíticos O fosfato, ferro e cálcio foram determinados nas soluções de fezes digeridas, urina e soro utilizando química convencional de Boehringher Mannheim num autoanalizador Hitachi 911. O magnésio foi medido em soluções de fezes digeridas, urina e soro 39 utilizando espectometria de absorção atómica fotométrica de chama. Foi determinado o alumínio da urina e soro utilizando espectometria de absorção atómica em câmara de grafite.

Foram avaliadas as diferenças entre os grupos de tratamento utilizando o teste t de student, com p<0,05 sendo considerado significativo.

Processo

Todos os animais foram pesados diariamente durante o período de estudo, para garantir que a comida modificada pela adição dos compostos de ligação de fosfato não afectava o ganho de peso. Durante o período de equilíbrio de sete dias, os grupos de animais tratados com CTFeCa, CTFeMg, Mg(OH)2, CaC03 ou CT100 mostraram uma gama de ganho de peso médio de 38-53 gramas. Os ratos tratados com A1(0H)3 mostraram um ganho de peso de 3 gramas. 0 grupo de controlo demonstrou uma relutância em comer a dieta RMI convencional (sem a adição de ligandos de fosfato). Após quatro dias, foi necessário alterar-lhes a dieta de controlo (Lilico). Estes animais de controlo mostraram uma perda de peso média de 17,5 gramas durante este período de sete dias. 0 fosfato solúvel foi determinado na dieta Lilico e verificou-se como sendo 6,8 pmol g”1, semelhante à dieta RMI sem a adição dos ligandos, 7,5 pmol g-1.

Após serem alimentados com as dietas modificadas durante 7 dias, os animais foram transferidos para gaiolas de contenção para recolha das fezes e urina total excretadas durante 24 horas. Para garantir que qualquer contaminação de fezes e urina na comida era semelhante para os grupos diferentes, foram 40 administradas, a cada animal, 18 gramas restritas de dieta de controlo (Lilico). Durante este período, os animais de controlo ganharam uma média de 3 gramas em peso. Outros grupos de animais mostraram uma perda de peso média de 2 -22 gramas.

Resultados

Medição da Excreção de Fosfato na Urina e Fezes. A absorção de fosfato reduzida alcançada quando uma dosagem do composto inorgânico é ingerido com a comida ingerida é manifestada por um teor em fosfato na urina baixo, um toer em fosfato fecal total elevado e uma proporção baixa de teor em fosfato fecal solúvel:teor fecal em fosfato total (Tabela 11).

As diferenças na concentração de fosfato na urina entre grupos de animais poderão ser explicadas pelas diferenças significativas no volume da urina. A excreção de fosfato renal foi, deste modo, expresso como total (pmol) por 24 horas. Os animais tratados com Al(OH)3 e CaC03 excretaram 1259 ± 279 pmol de fosfato e 857 ± 25 pmol de fosfato (média ± SEM) respectivamente (Figura 9, Tabela 11). Estes valores foram significativamente superiores aos ratos tratados com CTFeCa, CTMgFe, CT100 ou Mg(OH)2 média 71 ± 44 pmol, 13 ± 4 pmol, 26 ± 11 pmol e 65 ± 53 pmol de fosfato, respectivamente. Nenhum grupo tratado com compostos de ligação de fosfato mostrou uma diferença significativa na excreção de fosfato urinário relativamente aos controlos, média de 466 + 188 pmol. isto pode ser explicado pela baixa ingestão de comida pelos animais de controlo, demonstrado pela sua perda de peso média ao longo do estudo. 41

Para indicar se os ligandos de fosfato estavam a precipitar o fosfato no tracto gastrointestinal do rato, foi medido o fosfato fecal total (ligado e solúvel) e o fosfato fecal solúvel (não ligado). Para controlar as variações de entrada fecal e hidratação fecal entre grupos, o fosfato fecal foi expresso como pmol de fosfato g_1 de peso seco de fezes. 0 peso seco do fosfato em g_1 Total (solúvel e insolúvel) das fezes não diferiu significativamente entre qualquer um dos grupos de tratamento. As fezes dos animais tratados com CTFeCa continham significativamente menos fosfato solúvel do que os controlos ou os animais tratados com CaC03 (Tabela 11) . 0 fosfato solúvel médio em g_1 por peso seco de fezes como uma percentagem do fosfato total médio em g_1 do peso seco da fezes foi de 41,9%, 44,8%, 55,9%, 60,7% e 45,0% para animais tratados com CTFeCa,

Mg(OH)2, AI(OH)3, CT100 e CTFeMg respectivamente. O fosfato solúvel consistiu de 79,0% do total no grupo controlo e 85,5% do total no grupo tratado com CaC03 (Figura 10) . Estes resultados demonstraram a eficácia dos compostos CT como ligandos, diminuindo o fosfato disponível relativamente aos controlos e animais tratados com CaC03. 42

Tabela 11

Excreção média de fosfato pelas fezes e urina (± 1 SEM) para ratos de controlo e aqueles tratados com compostos de ligação de fosfato. Controlo AI(OH)3 CaC03 CTFeCa Fosfato na urina pmol (n=4) 466 ± 188* 1259 ± 279 857 ± 25 72 ± 44* Fosfato total nas fezes pmol g” 1 de peso seco de fezes (n=4) 150 ± 32 188 ± 26 213 ± 16 181 ± 12 Fosfato fecal solúvel pmol g"1 de peso seco de fezes (n=4) 120 ± 6 96 + 9 181 ± 9Δ 73 ± 12φ Mg(OH)2 CT100 CTFeMg Fosfato na urina pmol (n=4) 65 ± 53* 26 ± 11* 13±4* Fosfato fecal total pmol g"1 de peso seco de fezes (n=4) 183 ± 17 181 ± 40 206 ± 34 Fosfato fecal solúvel pmol g"1 de peso seco de fezes (n=4) 87 ± 14 100 ± 15 128 ± 8 * p<0,05 comparado com os animais tratados com A1(0H)3 e CaC03. Δρ<0,05 comparado com todos os grupos φ p<0,05 comparado com o Controlo e animais tratados com CTFeMg. 43

Medição da Extracgão e Retenção de Metal

Excreção de alumínio pela urina, concentração de alumínio no soro

As concentrações de alumínio no soro e urina foram medidas utilizando espectroscopia de absorção atómica de câmara de grafite. Para os animais a tomar A1(0H)3 ou CT100, as concentrações de alumínio no soro não foram significativamente superiores ao alumínio no soro dos animais de controlo (Tabela 12). Surpreendentemente, os animais tratados com CTFeCa e CTFeMg apresentaram as concentrações de alumínio no soro médias mais elevadas, ambas significativamente superiores aos animais tratados com Mg(OH)2, A1(0H)3, CaC03 ou controlos.

Devido às diferenças significativas no volume de urina total entre os grupos de animais diferentes, o alumínio foi expresso como pg excretado. Para os animais tratados com A1(0H)3, a excreção média de Al3+ pela urina foi, pelo menos, 2 vezes superior do que nos animais tratados com qualquer outro ligando de fosfato (Tabela 12) . Os animais tratados sem ligandos (dieta de controlo) excretaram, de um modo surpreendente, mais alumínio do que os animais tratados com A1(0H)3.

Medição da excreção de cálcio pela urina, concentração de cálcio no soro A excreção de cálcio pela urina total de animais tratados com CaC03 não foi significativamente diferente dos controlos ou animais tratados com CTFeCa ou A1(0H)3. Os animais tratados com 44

CaC03 excretaram significativamente mais cálcio do que os animais tratados com Mg(OH)2, CT100 ou CTFeMg (Tabela 13).

Os animais de controlo e aqueles tratados com A1(0H)3 apresentaram concentrações de cálcio no soro significativamente superiores aos animais aos quais foi administrado qualquer outro tratamento (Tabela 13). Os ratos tratados com CaC03 tinham significativamente mais cálcio no soro do que aqueles tratados com Mg(OH)2, CT100 ou CTFeCa.

Medição da excreção de magnésio pela urina A excreção de magnésio pela urina após tratamento com os compostos CT100 e CTFeMg foi superior, embora não significativo, quando comparado com os animais de controlo (Tabela 14) . Após a administração de Mg(OH)2, a excreção de magnésio pela urina foi significativamente superior ao grupo controlo ou animais tratados com qualquer outro ligando.

Medição da concentração de ferro na urina e soro

Em todas as amostras de urina de todos os grupos de tratamento, a concentração de ferro estava no limite de detecção do método empregue (>1 pmol 1_1) . A libertação de ferro a partir dos ligandos de fosfato foi de considerar e, deste modo, as concentrações de ferro no soro foram medidas em todos os animais. No entanto, não se verificou diferença significativa na concentração de ferro no soro entre qualquer um dos grupos de tratamento (Tabela 14). 45

Tabela 12:

Excreção média (±ISEM) de alumínio pela urina, concentração média (± 1 SEM) de alumínio no soro para ratos de controlo e aqueles tratados com compostos de ligação de fosfatos. Tratamento Alumínio na urina pg (todos n=4) Alumínio no soro pmol r1 Controlo 1,23 ± 0,05a 0,45 ± 0,04 AI(OH)3 1,07 ± 0,38β 0,38 ± 0,03 CaC03 0,50 ± 0,21 0,33 ± 0,05 CTFeCa 0,18 ± 0,12 0,66 ± 0,07* Mg(OH)2 0,17±0,07 0,35 + 0,08, CT100 0,26 ± 0,09 0,65 ± 0,24 CTFeMg 0,31 +0,09 0,65 ± 0,05* *P<0,05 comparado com Mg(OH)2, Al(OH)3, CaC03 e animais tratados com controlo A p<0,05 comparado com Mg(OH)2, Al(OH)3, CaC03, CTFeMg, CT100 e animais tratados com CTFeCa B p<0,05 comparado com Mg(OH)2, Al(OH)3, CTFeMg, CT100 e animais tratados com CTFeCa

Tabela 13:

Excreção média (± 1 SEM) de cálcio pela urina, concentração média (± 1 SEM) de cálcio no soro para ratos de controlo e aqueles tratados com compostos de ligação de fosfato. Tratamento Cálcio na urina pmol Cálcio no soro mmol 1 1 Controlo 317 ± 94 3,29 ±0,16 (n=3)α AI(OH)3 539 ± 242 3,27 ± 0,07 (n=3)α CâC03 472 ± 17* 2,93 ± 0,09 (n=4)β CTFeCa 333 ± 80 2,48 ± 0,10 (n=4) Mg(OH)2 360 ± 62 2,58 ± 0,05 (n=3) CT100 314 ± 20 2,54 ± 0,07 (n=4) CTFeMg 300 ± 34 2,69 ± 0,07 (n=4) *p>0,05 comparado com CT100, Mg(OH)2 e animais tratados com CTFeMg α p>0,05 comparado com CTFeCa,_Mg(OH)2, CT100 e animais tratados com CTFeMg βρ<0,05 comparado com Mg(OH)2, CT100 ou animais tratados com CTFeCa 47

Tabela 14:.

Excreção média (± 1 SEM) de magnésio pela urina, concentração média (± 1 SEM) de ferro no soro para ratos de controlo e aqueles tratados com compostos de ligação de fosfato Tratamento Magnésio na urina pmol (todos Ferro no soro mmol n=4) r1 Control 6,3 ± 1,8 37,8 ± 11,2 (n=3) AI(OH)3 9,7 ± 0,6 38,5 ± 15,9 (n=3) CaC03 8,7 ± 1,8 41,9 ± 10,8 (n=4) CTFeCa 5,9 ± 1,2 23,9 ± 5,1 (n=4) Mg(OH)2 17,3 ± 2,3* 29,4 ± 7,9 (n=3) CT100 1 o +1 CM σι 39,5 ± 10,8 (n=4) CTFeMg 11,4 ±0,7 48,5 ± 12,5 (n=3) * p<0,05 comparado com todos os grupos

Discussão dos resultados

Como os ligandos de fosfato são administrados em doses relativamente elevadas durante períodos longos de tempo, a libertação de iões metálicos, absorção e toxicidade são a principal preocupação. A concentração de alumínio no soro em animais tratados com A1(0H)3 ou CT100 não foi significativamente superior ao animais tratados com qualquer outro ligando. Isto está de acordo com um estudo humano que não demonstrou aumento de alumínio no soro, medido durante sete horas após administração de 6 gramas de hidrotalcita (CT100) [Van der Voet and de Wolff, Clin. Tox. (1986-87), 24, 545-553]. Como apenas -0,1% de uma dose de alumínio ingerido é absorvido [Powell e Thompson, Proc. Nutr. Soc., (1993) 52, 241 - 253], as alterações 48 no volume de soro grande estão no limite de determinação com precisão.

Foi, deste modo, medida a excreção de alumínio pela urina como um indicador da absorção intestinal. Os animais tratados com AI(OH)3 excretaram, pelo menos, 2 vezes mais alumínio do que aqueles tratados com qualquer outro ligando e quatro vezes mais do que os ratos tratados com CT100. As conclusões tiradas foram que os benefícios relativos de CT100 em termos de libertação de alumínio estão, no entanto, limitados devido à excreção urinária elevada dos controlos. A libertação e absorção de ferro a partir dos ligandos CTFeCa e CTFeMg foi de preocupação, uma vez que o teor em ferro corporal é regulado pela absorção a partir do tracto gastrointestinal [McCance e Widdowson, Lancet, (1937) 2, 680-684] . Não existe via fisiológica através da qual possa ser excretado e as perdas diárias são baixas, perdas pela urina <0,1 mg, pele 0,2-0,3 mg e fezes 0,6 mg [Bothwell, Nutr. Ron. (1995), 53, 237-245]. Os animais tratados com CTFeCa ou CTFeMg não mostraram um aumento de ferro no soro em comparação aos animais tratados com ligandos não contendo ferro ou contados e, como esperado, a excreção de ferro pela urina estava no limite de detecção em todos os grupos.

Em comparação aos animais tratados com qualquer dos outros ligandos, verificou-se, pelo menos, um aumento de 66% e 113% no ferro fecal solúvel em animais tratados com CTFeCa ou CTFeMg, respectivamente. Se este era absorvível estava para além do âmbito deste estudo, uma vez que factores complexos incluindo a dieta e capacidade de armazenamento de ferro, influenciam a captura de ferro não-heme [Bothwell, Supra: Cook, Am. J. Clin. 49

Nutr. (1990), 51, 301-308]. No entanto, como vários doentes em hemodiálise são anémicos, um aumento na carga de ferro pode ser benéfica [Remussi and Rossi, em The Kidney (Ed. Brenner, BM), w. B. Saunders, Philadelphia, (1996), Capitulo 50, pp 2170 - 2186].

Diferentes sais de magnésio demonstraram ter eficácia como ligandos de fosfato. O carbonato de magnésio tem demonstrado ser um ligando eficaz [0'Donovan et. al., Lancet, (1986), 51, 880 — 881] enquanto o hidróxido de magnésio tem demonstrado ser ineficaz ou fracamente tolerado [Guillot et al., Nephron, (1982), 30, 114-117j_ Oe et ai., Colin. Nephrol, (1987), 28, 180-185] . Deve-se ter cuidado para evitar a sobre administração devido aos efeitos laxativos do magnésio. Neste estudo nenhum dos grupos de animais tratados com Mg(OH)2, CT100 ou CTFeMg mostraram um aumento na hidratação fecal em comparação aos controlos, sugerindo que a dose foi bem tolerada pelos animais. Os níveis de magnésio na urina e no soro não estavam elevados nos animais tratados com CTFeMg ou CT100, sugerindo que a absorção de Mg a partir destes compostos foi reduzida.

Em suma, o CT100, CTFeMg e CTFeCa são todos ligandos de fosfato com elevada capacidade quando administrados in vivo a ratos a doses baixas. Este estudo indicou que têm, provavelmente toxicidade limitada, embora sejam necessários estudos de longo prazo para avaliar a absorção do ferro, alumínio e magnésio. Estes compostos podem ser alternativas eficazes aos ligandos de fosfato prescritos actualmente.

Lisboa, 28 de Dezembro de 2010 50

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto metálico misto para utilização como medicamento, em que o composto metálico misto é livre de aluminio e contém os metais ferro (III) e, pelo menos, um de magnésio, cálcio, lantano e cério e contém, pelo menos, um de aniões hidroxilo e carbonato, em que o composto metálico misto tem uma capacidade de ligação de fosfato de, pelo menos, 30% em peso do peso total do fosfato presente, ao longo de uma gama de pH de 3 a 7.
2. Composto metálico misto, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto metálico misto tem uma capacidade de ligação de fosfato de, pelo menos, 30% em peso do peso total do fosfato presente, a um pH de 3, 5 ou 7, como medido através dos seguintes métodos: (a) adicionar 1 grama do referido composto metálico misto a 25 mL de uma solução tampão de fosfato de sódio 20 mmol LT1, homogeneizar e agitar delicadamente, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, centrifugar a 3000 rpm, durante 5 minutos, filtrar através de um filtro da millipore de 0,22 pm e medir o fosfato solúvel no sobrenadante assim produzido, (b) adicionar 1 grama do referido composto metálico misto a 25 mL de solução tampão de fosfato de sódio 40 mmol L-1, homogeneizar e agitar delicadamente à temperatura ambiente, durante 30 minutos, centrifugar a 3000 rpm, durante 5 minutos, filtrar através de um filtro 1 de 0,22 μιη da millipore e medir o fosfato solúvel no sobrenadante assim produzido.
3. Composto metálico misto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o composto metálico misto tem uma capacidade de ligação de fosfato de, pelo menos, 30% em peso do peso total do fosfato presente a pH 3, 5 ou 7, como medido pelo seguinte método de teste: adicionar 1 grama do referido composto metálico misto sólido a 25 mL de solução de fosfato de sódio 40 mmol L_1, homogeneizar e agitar gentilmente, à temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugar a 3000 rpm, durante 5 minutos, filtrar através de um filtro de 0,22 pm da millipore e medir o fosfato solúvel no sobrenadante assim produzido.
4. Composto metálico misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o composto metálico misto contém, adicionalmente, pelo menos, um de sulfato, cloreto e óxido.
5. Composto metálico misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o composto metálico misto é um hidroxicarbonato contendo magnésio e ferro (III) e com uma estrutura de hidrotalcita.
6. Composto metálico misto, de acordo com a reivindicação 5, em que o composto metálico misto é não envelhecido. 2 Composto metálico misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o composto metálico misto é um co-precipitado. Lisboa, 28 de Dezembro de 2010 1/10 Figura 1: Efeito do pH e envelhecimento na percentagem de ligação de fosfato pelos compostos metálicos mistos 100 ft X X od (0d •H o 4-> (ΰ m O m Q)d Sod tf dc QJ υ M 0) tr

0 Mg: Fe 3: 1 prep 2 não envelhecida • Mg: F e 3: 1 prep 2 envelhecida Mg: Fe 2: 1 prep 2 não envelhecida Λ Mg: Fe 2: 1 prep 2 envelhecida a Ca : Fe 3: 1 não envelhecida * Ca :Fe 3: 1 envelhecida * Mg:F e: : Mg não envelhecida * Mg:F e: : Mg envelhecida 3 τ-r 4- 5 6 ~t7 pH 2/10 Figura 2: Efeito do pH e secagem na percentagem de ligação de fosfato dos compostos metálicos mistos □ Ca:Fe 3:1 Húmida * Ca:Fe 3:1 Seca •k Ca:Fe:Mg Húmida * Ca:Mg:Fe seca o Mgfe 3:1 prep 3 Húmida • Mg:Fe 3:1 prep 3 Seca λ Mg:Fe 2:1 prep 2 Húmida X Mg:Fe 2:1 prep 2 Seca 100 -t S-— o Ό tf d -H i—I O -Otf m m o mω Ό e 0) díf -Ocωυ Mω Cú 75 -

50 - 25 -

0 J τ 3 4 5 6 pH 3/10 Figura 3: Efeito do aumento de peso do composto na percentagem de ligação de fosfato a pH 3 100 -7 Mg (OH) 2 Δ-Δ Mg:Fe 2:1 Prep 1 não envelhecida húmida o - o CT100 I-· Ca:Fe 3:1 Envelhecida Húmida • - # Altacita liquida lavada *-* AI (OH) 3

o Ό 75 -ns d H o 4-> ns m O m o 50 - d S o d> nJ 4-) c o υ M o> tf 25 - ~i-1-1-1 i 0.1 0-2 0.3 0.4 0.5 Peso do composto 4/10 Figura 4: Efeito do aumento de peso do composto na percentagem de fosfato ligado a pH 3

Peso do composto 5/10 Figura 5: Tempo de ligação do fosfato na comida qA1(OH)3 qCT Mg:Fe 2:1 Prep 1 não envelhecida húmida Percentagem de fosfato ligado

0 30 60 90 120 tempo minutos 6/10 Figura 6: Ligação de fosfato pelas preparações de ferro férrico e cálcio ao longo da gama de pH 3-8 100 η

90 - o do tn •H o U O m co O Q) d e Q) do 4-> G <D O U Q) íf 80 - 70 - 60 -

□ Caie α-δ Caie o-o Caie ·—· CaFe v-v Caie Caie ύ—ύ Caie -1- proporção proporção proporção proporção proporção proporção proporção l 1 1:1 2:1 3:1 3:1 5:1 3:1 3:1 prep prep

(a partir de sais (com ppt anterior de cloreto) de metais) T T 3 4 5 6 7 8 pH 7/10 Figura 7: Ligação de fosfato pelas preparações de magnésio ferro férrico, e cálcio, magnésio e ferro férrico ao longo da gama de pH 3-8 100 1

o-o Mgíe 3:1 Prep 1 ·-· Mg:Fe 3:1 Prep 2 o-o Mgfe 3:1 Prep 3 -* Mg:Fe 3:1 Prep 4 Ca:Mg:Fe 3:3:2 o Ό tf tn •H i—I o 4-1 tf m CQ o tn (D n e ω tn tf 4-> o cd o í-4 Q) tf τ 3 τ-r 4 5 η- r 7 a pH 6 8/10 Figura 8: Ligação de fosfato por hidróxido de aluminio, hidróxido de magnésio e carbonato de cálcio ao longo da gama de pH de 3-8 100 1 A—A Hidróxido de magnésio r—r Carbonato de cálcio 0 1 o Hidróxido de alumino

o d tf 75 - d H o .o tf m CQ o m d) 50 - £ ω d tf 4J G 0) o M d) ff 25 -

a pH 9/10 Figura 9: Excreção média (± 1 SEM) e individual de fosfato pela urina para os ratos de controlo e os tratados com compostos de ligação de fosfato Os valores individuais de excreção de fosfato pela urina (pmol/24 horas) foram representados graficamente para os controlos (Δ) e os animais tratados com Al(OH)3 () CaC03 (□), CTFeCa (·), Mg (OH) 2 (o), CT100 (♦) e CTFeMg (0). A média (± SEM) para cada grupo é representada por pontos com barras de erro padrão *p<0,05 em comparação aos grupos de animais tratados AI(OH)3. O <t 4J O U O X 0) o 4J tf 4-1 cn o ω Ό H O s 3. 2500 -| 2000 -1500 -1000 -500 . 250 . 200 . 150 . 100 . 50 . I I T B

o

Tratamento 0 10/10 Figura 10 Fosfato fecal solúvel médio (± 1 SEM) (q-1 de peso seco como uma percentagem total do solúvel e não insolúvel) e fosfato fecal (g-1 de peso seco) para os ratos de controlo e aqueles tratados com compostos de ligação de fosfato. *p<0,05 comparado com o controlo e animais tratados com CâC03 Δρ<0,05 comparado com animais tratados com CaC03 100

Tratamento