PL141490B1 - Method of isolating plasma or serum from whole blood - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania plazmy lub surowicy z krwi calkowitej przez fil¬ tracje przez warstwe z wlókien szklanych.Wydzielanie plazmy lub surowicy z krwi ma w klinicznej chemii wybitne znaczenie,, poniewaz pra^ ktycznie tylko na plazmie i surowicy mozna prze¬ prowadzic bez zaklócen analize rozpuszczonych skladników krwi.Normalna i najbardziej stosowana forma oddzie¬ lania plazmy lub surowicy od erytrocytów jest wi¬ rowanie. Jest ono jednakze problematyczne, szcze¬ gólnie przy stosowaniu malych próbek, równiez rozdzielenie supernatantu od osadu krwi nie za¬ wsze jest proste tak, ze do -tego w literaturze po¬ daja caly szereg srodków pomocniczych, np. opis patentowy RFN nrl DE-AS 25 59 242.Szczególnym zagadnieniem jest stosowanie krwi calkowitej do badania przy uzyciu szybkosciowych srodków diagnostycznych.Szybkosciowymi srodkami diagnostycznymi sa odczynniki zawierajace chlonne i peczniejace nosni¬ ki, przewaznie z bibuly filtracyjnej, na które na¬ nosicie mala ilosc, np. krople badanego plynu i na których na podstawie przewaznie bardzo krótkiej reakcji nastepuje zmiana zabarwienia, która albo ocenia sie wizualnie, albo mierzy za pomoca foto¬ metru reemisyjnego,. Ze wzgledu na to, ze metne i zalbarwione roztwory, jak krew przeszkadzaja w odczycie, czyniono próby udostepnienia szybkoscio¬ wych srodków diagnostycznych do bezposredniego 10 15 20 25 30 stosowania krwi calkowitej. Mozna tu na przyklad wymienic powlekanie papierków testowych pól- przepuszczalnymi membranami, pipis patentowy St.Zjed. Ameryki 3 092.465 oraz zastosowania pecznie¬ jacych w wodzie filmów, do których moga prze¬ nikac tylko rozpuszczone skladniki krwi, a nie erytrocyty, opis patentowy RFN nr DE-AS 15 98 153. Te obydwa sposoby sa w zasadzie uzy¬ teczne, ale tylko przy testach na niskoczasteczkowe skladniki krwi, jak np. glukoze lub mocznik. Wy¬ zej czasteczkowych skladników krwi, jak np. lipi¬ dów albo przylaczonych do protein surowicy sub- stratów, jak np. bilirubiny, nie mozna oznaczac w ten sposób, poniewaz nie sa one w stanie prze¬ niknac do filmu wzglednie przejsc przez pólprze- puszczalna membrane. Poza tym znane jest stoso¬ wanie do oddzielania krwinek filtrów membrano¬ wych (opisy patentowe RFN nr DE-AS 22 22 951 i nr DE-OS 29 22 958. Niedogodnosc tych srodków diagnostycznych polega na tym, ze przez filtry membranowe krew moze przenikac tylko bardzo powoli i w malej ilosci, gdyz one latwo zapychaja sie i reakcja trwa dlugo.Wedlug opisów patentowych RFN nr DE-OS 29 08 721 i 29 08 722 limfocyty wzglednie leukocyty mozna wydzielic z krwi droga saczenia jej przez warstwe utworzona z wlókien sztucznych o prze¬ cietnej srednicy wlókien 5—20 \l wzglednie 3—10 \i.Ze wzgledu na to, ze erytrocyty przewaznie prze¬ chodza przez filtr z plazma, filtry te nie nadaja sie 141 490141 490 3 do uzyskwiania plazmy. Poza tym czysto abstrak¬ cyjne wymienione sa wlókna weglowe, szklane i metalowe.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu do wydzielania plazmy lub surowicy z krwi calkowi¬ tej, który bez wiórowania., szybko i pewnie roz¬ dziela male ilosci krwi przeznaczonych do celów diagnostycznych. iStwierdzono, ze wydzielenie plazmy wzglednie surowicy z krwi calkowitej prowadzi sie szybko i prosto oraz w dostatecznej ilosci przez przesa¬ czenie krwi przez warstwe z wlókien szklanych samych albo w mieszaninie z innymi wlóknami.Fakt ten nalezy uznac o tyle bardziej zaskakujacy, ze w wymienionym wyzej opisie patentowym RFN nr DE-AS 22 22 951 podane jest juz stosowanie mat z wlókien szklanych, jednak do oddzielenia ery¬ trocytów bezwzglednie konieczne jest dodatkowe zastosowanie filtrów membranowych.Warstwa filtracyjna do wydzielania, plazmy lub surowicy z ^ krwi calkowitej wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze stanowia ja wlókna szklane 01 srednicy 0,2—5 jx, korzystnie 0,5—2,5 \i, zwlaszcza 0,5—1„5|ji i gestosci 0,1—0,5 g/cm8. Obje¬ tosc oddzielajacej sie plazmy lub surowicy wynosi , w tym przypadku najwyzej 50?/ó, przewaznie mniej niz 30% chlonnosci warstwy wlókien szklanych.[Wlókna szklane stosuje sie jako luzno ulozone, jak równiez w postaci bibuly, runa lub filcu, albo tez zewnetrznie uformowane w kazdym pozadanym ksztalcie.Tak uformowane wlókna szklane sluza do po¬ krycia, jednego z wyzej opisanych szybkosciowych przyrzadów diagnostycznych tak, ze ten przyrzad diagnostyczny, do zastosowania którego dotychczas konieczne bylo uprzednie uzyskanie surowicy lub plazmy, jest teraz odpowiedni do bezposredniego stosowania krwi.Ponadto stosuje sie takze wypelnione wlóknami szklanymi kolumny, nucze filtracyjne albo inne odpowiednie naczynia..Wymienione wyzej wlókna szklane moga skla¬ dac sie z wlókien o róznorodnej srednicy. Jako material szklany stosuje sie szklo boro-krzemiano¬ we zawierajace alkalia albo wolne od alkalii, albo tez czyste szklo kwarcowe. Wlókien szklanych z dmonych technicznych szkiel, np. z wolnych od boru szkiel alkalicznych, szkla krysztalowego, szkla olo¬ wiowego oraz innych, o koniecznych wymiarach nie ma- w handlu i z tego wzgledu nie mozna ich zbadac, ale wychodzi sie z zalozenia, ze one rów¬ niez sa odpowiednie. Przecietna srednica wlókien szklanych wynosi 0,2—5 ja, korzystnie 0,5—2,5 |a, a zwlaszcza 0,5—1,5 fi. Zaleznie od sposobu wytwo¬ rzenia srednice wlókien moga byc silnie rozrzu¬ cone, jednakze tylko wyjatkowo moga przekraczac górna granice wynoszaca okolo 10 \jl Dlugosc wló¬ kien ograniczona jest sposobem ich ukladania. Za¬ leznie od rodzaju ulozenia wlókien gestosc ich warstwy wynosi 0,1—0,5 g/cm3, zwykle 0,2—0,4 g/cm8.Wlókna szklane ewentualnie miesza sie wzajem¬ nie albo tez z wlóknami z innych materialów,, przez co poprawia sie ich wewnetrzna spoistosc. Nadaja sie tu na przyklad wlókna syntetyczne, jak poiie- 15 20 30 35 40 50 55 60 65 strowe, poliamidowe oraz inne, ale tez wlókna z polietylenu, polipropylenu oraz innych dajacych sie formowac na cieplo tworzyw sztucznych. Dodatki moga wykazywac tez wyzsze srednice, a mia¬ nowicie 10—20 ,[x, o ile ich ilosc nie jest duza tak, aby wplywala na rozdzielanie krwi przez drobniej¬ sze wlókna szklane wedlug wynalazku.Ponadto wlókna szklane mozna wzmocnic przez dodanie spoiw nieorganicznych, np. szkla wodne¬ go, albo spoiw organicznych, np. polioctanu winy¬ lu, polipropionianu winylu, poliestrów kwasu akry¬ lowego oraz innych, którymi wlókna szklane zo¬ staja sklejone w miejscach styku.Szczególnie korzystna jest kombinacja warstw wlókien szklanych wedlug wynalazku z przyrza¬ dami diagnostycznymi.Wlókna szklane w tych przyrzadach diagnostycz¬ nych zawieraja ewentualnie odczynniki, które za¬ pobiegaja hemolizie erytrocytów, albo odczynniki, które hamuja albo przyspieszaja krzepniecie, jak równiez odczynniki, które potrzebne sa w war¬ stwie wskaznikowej z innych wzgledów. Te ostat¬ nie odczynniki mozna oczywiscie umieszczac takze we wszystkich warstwach,, które znajduja sie mie¬ dzy wlóknem szklanym i warstwa wskaznikowa.Budowe przyrzadu diagnostycznego zawierajace¬ go warstwe filtracyjna wedlug wynalazku objasnia fig. 1. Na sztywnym podlozu 2 naklejona jest warstwa reakcyjna 1 szybkosciowego srodka diag¬ nostycznego'. Tuz nad warstwa reakcyjna znajduje sie cienka, przepuszczalna dla cieczy, warstwa rozdzielcza 4, która stanowi siatka z tkanych lub sfilcowanych wlókien z tworzyw sztucznych i któ¬ ra po obydwu stronach warstwy reakcyjnej w la¬ twy do oderwania sposób przyklejona jest do po¬ dloza tak, ze na dluzszej czesci podloza pozostaje latwy do ujecia uchwyt 4a. Na warstwe reakcyjna nalozona jest bibula z wlókien szklanych 3, utrwa¬ lona w swym polozeniu przez dalsza siatke 5, która jest przyklejona1, jak warstwa rozdzielcza 4, po obydwu stronach warstwy reakcyjnej.Warstwe reakcyjna 1 stanowi impregnowany, chlonny nosnik albo peczniejaca lub porowata folia z tworzywa sztucznego. Jako podloze 2 sluzy prze¬ waznie grubsza folia z tworzywa sztucznego, twar¬ dy karton, plytka szklana lub inny trwaly nosnik.Po naniesieniu kropli krwi 8 na górna strone szybkosciowego przyrzadu diagnostycznego w bi¬ bule z wlókien szklanych, zostaje oddzielona plaz¬ ma od erytrocytów i leukocytów. W ten sposób oddzielona plazma- przenika przez warstwe roz¬ dzielcza 4 do strefy reakcyjnej 1 srodka diagno¬ stycznego. Po odpowiednim czasie, w którym plaz¬ ma przeniknela do strefy reakcyjnej, chwyta sie wolny koniec warstwy rozdzielczej i oddziela, wraz z bibula z wlókien szklanych oraz siatka 5. Na¬ stepnie warstwe reakcyjna, w której nastepuje reakcja wykrywania, ocenia sie wizualnie lub za pomoca fotometru reemisyjnego.Dalsza mozliwa budowe szybkosciowego przy¬ rzadu diagnostycznego zawierajacego warstwe fil¬ tracyjna wedlug wynalazku przedstawia fig. 2, przy czym dodatkowo do opisanej wyzej budowy wpro¬ wadza sie jedna lub kilka przepuszczalnych dla kazdego rodzaju plynu warstw 6 tak, ze znajduja *5 141 490 6 sie one albo powyzej (fig. 2a), albo ponizej (fig. 2b) bibuly z wlókien szklanych. Te dodatkowe warst¬ wy mozna nasycac odczynnikami, które albo sa latwo' rozpuszczalne i razem z plazma przechodza do strefy reakcyjnej, albo sa mniej rozpuszczalne i moze przebiegac jeden lub kilka wstepnych eta¬ pów reakcji wykrywania juz na zewnatrz ostatecz¬ nej strefy reakcyjnej 1.(Fig. 3 przedstawia budowe (fig. 3a -1- rzut bocz¬ ny, fig. 3b — widok z góry) przyrzadu diagnostycz¬ nego w którym bibula z wlókien szklanych 3 na¬ klejona jest bezposrednio na 'podloze 2. Na czesc bibuly z wlókien szklanych nalozona jest warstwa reakcyjna 1. Na .pozostala wolna czesc bibuly z wlókien szklanych nanosi sie krew 8. Plazma uwolniona w bibule z wlókien szklanych od ery¬ trocytów dyfunduje sie w bibule tej warstwy re¬ akcyjnej i do jej wnetrza. Powstajace podczas re¬ akcji zabarwienia obserwuje sie i ocenia od gór¬ nej strony szybkosciowego srodka diagnostycznego.Warstwe reakcyjna naklada sie na bibule z wló¬ kien szklanych bezposrednio przez nadrukowanie albo powlekanie. Mozna ja równiez nakleic na bi¬ bule z wlókien szklanych stosujac posrednio no¬ snik. ' ¦ " (Fig. 4 i 5 przedstawiaja przyrzad diagnostyczny zbudowany w ten sposób, ze na podlozu 2 nakle¬ jone sa najpierw chlonny material 9, jak np. bi¬ bula celulozowa lub runo z tworzywa sztucznego i powyzej tego materialu bibula z wlókien szkla¬ nych 3 oraz warstwa reakcyjna 1. Przy tyim chlon¬ ny material 9 moze zajmowac taka sama powie¬ rzchnie jak warstwa reakcyjna "(fig. 5) albo wiek¬ sza powierzchnie tak, ze material 9 posiada wolna powierzchnie (fig. 4). Krew nakrapia sie na wolna powierzchnie.chlonnego materialu {fig, 4) albo bez¬ posrednio obok chlonnego materialu (fig. 5) i stad zostaje ona szybko wchlonieta i zassana pod bi¬ bule z wlókien szklanych. Nastepnie, dzieki wsia- kliwosci bibuly z wlókien szklanych, krew wessana zostaje przezen do góry,, przy czym nastepuje od¬ dzielanie erytrocytów i plazma przechodzi do war¬ stwy reakcyjnej 1. Reakcje obserwuje sie, jak na fig. 3, od górnej strony szybkosciowego srodka diagnostycznego.Fig. 6 przedstawia budowe przyrzadu diagnosty¬ cznego, odpowiedniego do bezposredniego stosowa¬ nia krwi calkowitej. Jest on skonstruowany w ten sposób, ze na sztywnym podlozu 2 nalozone sa obok siebie chlonna warstwa 9, np. z bibuly celulozowej lub z zawierajacego celuloze runa z tworzywa sztu¬ cznego oraz warstwa wlókien szklanych 3. Oby¬ dwie warstwy powinny wykazywac scisla stycz¬ nosc. Na powierzchni chlonnej warstwy 9 znajdu¬ ja sie potrzebne dla szybkosciowego srodka diag¬ nostycznego odczynniki wykrywajace, które mozna nalozyc, np. przez powleczenie "sposobem wedlug opisu patentowego RFN nr DE-OS 2910134. Przy nalozeniu kropli krwi na "bardziej oddalony od strefy reakcyjnej koniec warstwy z wlókien szkla¬ nych odbywa sie oddzielenie plazmy od 'erytrocy¬ tów tak, ze najpierw plazma przechodzi do chlon¬ nej warstwy 9 i zostaje przez nia natychmiast wchloniejta. Dzieki silom kapilarnym plazma uda¬ je sie nastepnie do warstwy reakcyjnej 1, gdzie odbywa sie reakcja wykrywania, dostrzegalna np. przez widoczna od góry zmiane barwy.Inna wersje budowy przyrzadu diagnostycznego przedstawia fig. 7. Na podloze 2 nakleja sie bi¬ bule z wlókien szklanych 3, przy czym podloze w miejscu styku posiada jeden lub kilka otworów.Na druga strone bibuly z wlókien szklanych nakla¬ da sie bezposrednio lub przez naklejenie warstwe reakcyjna 1. Krew 8 nanosi sie w przyrzadzie diag¬ nostycznym w ten sposób, zeby mogla przejsc przez otwór (albo otwory) na bibule z wlókien szklanych 3. Oddzielona w niej plazma przechodzi do war¬ stwy reakcyjnej 1 i prowadzi do reakcji, która oce¬ nia sie na jej powierzchni wizualnie lub za pomo¬ cz fotometru reeimisyjnego. Przy tym warstwa re¬ akcyjna jest zabezpieczona przezroczysta warstwa oslonowa 7.Warstwa reakcyjna 1 moze byc zarówno np. warstwa nadrukowana na mate z wlókien szkla¬ nych, jak tez element wielowarstwowy, w którym warstwy imoga zawierac rózne odczynniki i/albo moga spelniac kilka funkcji, jak rip. przedstawione w opisie patentowym RFN nr DE-OS 20.22 058.Fig. 8a przedstawia w rzucie bocznym, a fig. 8b w widoku z góry budowe przyrzadu diagnostyczne¬ go, w którym skladajaca sie z wlókien szklanych warstwa 3, jak równiez jedna lub kilka potrzeb¬ nych do reakcji warstw 6 znajdujac, sie razem w sporzadzonej uprzednio formie 12. Krew nanosi sie na warstwe z wlókien szklanych. Oddzielona plazma przechodzi nastepnie do warstwy reakcyj¬ nej 1, przy czym reakcje wskaznikowa ocenia sie wizualnie lub za pomoca fotometru reemisyjnego na stronie przeciwnej do warstwy wlókien szkla¬ nych.Ze wzgledów kreslarsko-technicznych rózne war¬ stwy narysowane sa czesciowo z przestrzenia po¬ srednia. W praktycznym wykonaniu warstwy leza je^na na drugiej tak, ze ciecze moga swobodnie przechodzic. Poza tym warstwy reakcyjne 1 i 6 sa poprzecznie rozdzielone, aby zaznaczyc, ze moga one skladac sie takze z kilku lezacych jedna na drugiej warstw.Rozdzielenie krwi przyrzadami przedstawionymi an fig. 3a, 3b, 4 i 6 mozna znacznie poprawic, je-" zeli na wlókna szklane 3 obok albo w warstwie reakcyjnej 1 umiesci sie hydrofobowa bariere 15, która czesciowo wchodizi w objetosc wlókien szkla¬ nych 3. Fig. 3c, 3d, 6a oraz 6b pokazuja te bariere 15 i poza tym odpowiadaja budowie wedlug fig. 3, 4 i 6. Ta bariera 15 nie tylko najpierw zapobie¬ ga rozposcieraniu sie krwi 8 na powierzchni war¬ stwy z wlókien szklanych i zanieczyszczeniu strefy wskaznikowej, ale poprawia ona zdecydowanie takze dzialanie rozdzielcze wlókien szklanych.Dlatego mozna pracowac ze wzglednie malymi bibulami z wlókien szklanych 3, na skutek czego potrzeba znacznie mniejszych ilosci krwi. Bariery mozna nakladac tradycyjnym sposobem, np. za pomoca dysz albo wirników. Hydrofobowym ma¬ terialem na bariere moze byc np. topliwy klej albo tradycyjny klej rozpuszczalnikowy, albo wosk.Fig. 9 przedstawia budowe przyrzadu diagnosty¬ cznego zawierajacego warstwe filtracyjna wedlug wynalazku, który bez wirowania oddziela plazme 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60141 4 7 od erytrocytów krwi calkowitej i przygotowuje ja do celów diagnostycznych. Stanowi on rurke albo naczynie 13, które posiada przedstawiony ksztalt i wypelnione jest wlóknami szklanymi 14. Krew 8 wlewa sie do naczynia od góry i na drodze jej na 5 dól wlókna szklane oddzielaja plazme od erytrocy¬ tów. Zbierajaca sie w dolnej czesci naczynia 13 plazma zostaje wchlonieta np. przez kapilare "end- -to-end" albo odciagnieta i bezposrednio doprowa¬ dzona do innego srodka diagnostycznego. 10 Inna budowe przyrzadu diagnostycznego przed¬ stawia fig. 10, przy czym naczynie 13 odpowiednie do oddzielania erytrocytów moze wykazywac ksztalt strzykawki tlokowej", która w dolnej czesci jest szczelnie wypelniona wlóknami szklanymi 14. 15 Krew 8 nanosi sie do górnej otwartej czesci na¬ czynia. Po rozdzieleniu erytrocytów i plazmy, przy czyim plazma zbiera sie w dolnej- czesci naczynia, przez wprowadzenie i ostrozne naciskanie tloka 17 mozna najpierw plazme wycisnac ze strzykawki. 20 ' Sposób wedlug wynalazku mozna tez prowadzic, stosujac jak pokazano na fig. 11, naczynie 13, któ¬ re podzielone jest na dwie czesci przepuszczajacym w jednym kierunku zaworem 16 i wypelnione opi¬ sanymi wyzej wlóknami szklanymi. Krew 8 poda- 25 je sie na góre naczynia, a plazma po oddzieleniu od erytrocytów zbiera sie w dolnej czesci naczynia które opróznia sie przez scisniecie go. Przy tym zawór 16 zapobiega powrotnemu przeplywowi plaz¬ my do górnej czesci, zawierajacej krwinki. 30 Sposób wedlug wynalazku przeprowadza sie w przyrzadzie diagnostycznym przedstawionym na fig. 1, przy czym naklejona na podloze 2 warstwe reak¬ cyjna 1 stanowi okreslony material chlonny tak, ze przy naniesieniu krwi okreslona objetosc plaz- 35 my przenika do warstwy 1. Po oddzieleniu warstw 3, 4 i 5 mozna plazme, to znaczy przeznaczona do analizy substancje wyeluowac rozpuszczalnikiem.Eluowanie plazmy i analize mozna przeprowadzic natychmiast albo, zaleznie od analizowanej sub- 40 stancji, w pózniejszym czasie i w innym miejscu.Jezeli analize nalezy przeprowadzic dopiero pózniej, moze byc korzystne najpierw wysuszenie plazmy, przykladowo cieplym powietrzem albo przez od- 4S parowanie ze stanu zamrozenia. Poza tym mozli¬ wy jest taki sposób, ze oddzielnie od obszaru na¬ noszenia próby przewidziane sa jedna lub kilka stref, zawierajacych odczynniki tak, ze przy elu- owaniu rozpuszczalnikiem zostaje wyeluowana jed¬ noczesnie cala mieszanina reakcyjna.Jezeli barwne reakcje maja byc oceniane nie tylko wizualnie, lecz mierzone w fotometrach ~re- emisyjnych, korzystne jest przykrycie warstwy re¬ akcyjnej 1 warstwa oslonowa 7, aby uniknac za¬ brudzenia urzadzenia pomiarowego. Jezeli warstwa reakcyjna 1 jest film mniej wiecej wedlug opi¬ sów patentowych RFN nr DE-OS 29 10 134 i nr DE-PS 15 98 153, wówczas korzystnie naklada sie ja bezposrednio na warstwe oslonowa 7 i potem montuje obie razem. Mozliwa postac wykonania przedstawia fig. 3e. Warstwe oslonowa 7 mozna oczywiscie stosowac takze na inne postacie wy¬ konania, jak to pokazane jest na rysunku 7a, który poza tym odpowiada budowie wedlug ry- ^ sunkii7. 65 / 8 Poza tym okazalo sie korzystne urzadzenie, w którym warstwy reakcyjnej 1 nie doprowadza sie od razu do kontaktu z wlóknami szklanymi 3 wzglednie z chlonna warstwa 9, lecz dopiero wów¬ czas, gdy wymienione warstwy zostana calkowicie napelnione plazma wzglednie surowica. Korzysc te¬ go urzadzenia polega na tym, ze plazma wzglednie surowica moze kontaktowac sie z warstwa reakcyj¬ na 1 w uprzednio oznaczonym dokladnym czasie.Ponadto kontakt ten nastepuje na calej powierz¬ chni tak, ze wykluczone sa efekty chromatografii, jakie moga wystepowac w poprzednich urzadze¬ niach. Fakt, ze miedzy podaniem krwi 8 i rozpo¬ czeciem reakcji w warstwie reakcyjnej 1 moze uplynac uprzednio okreslony czas, ma duze zna¬ czenie przy reakcjach, które musza przebiegac w szczególnie kontrolowanych warunkach. Przy ozna¬ czaniu enzymów, które musi przebiegac w szcze¬ gólnie stalej temperaturze, reakcja moze rozpo¬ czac sie dopiero wtedy, gdy srodek diagnostyczny jest wystarczajaco termostatowany. Równiez w strefach 3 i 9, w których zbiera sie plazma, umie¬ szcza sie odczynniki, które przeznaczona do wy¬ krywania substancje przeprowadzaja w okreslony stan, zalezny od czasu reakcji, to znaczy moze przebiegac reakcja wstepna. Przykladem tego jest aktywowanie kinazy kreatynowej N-acetylocyste- ina.Fig. 12,13 i 14 przedstawiaja rózne mozliwe urza¬ dzenia, przy czym fig. 13 hydrofobowa bariera 15 sluzy jednoczesnie jako wzmocnienie warstw 1 i 7.Oznaczenia i sklady pozostalych warstw odpowia¬ daja fig. 3^6.Na fig. 14 pokazane jest zastosowanie hydrofo¬ bowej siatki 18 miedzy warstwa reakcyjna 1 i wlóknami szklanymi 3 wzglednie warstwa chlonna 9. Ta hydrofobowa siatka zabezpiecza urzadzenie przed niezamierzonym lekkim kontaktem, a kontakt cieczy moze nastepowac dopiero przy silniejszym nacisku. To przyczynia sie do polepszonej przy¬ datnosci.Warstwa reakcyjna 1 sklada sie z dwu lub kil¬ ku róznych od siebie warstw, które moga zawie¬ rac albo jednakowa substancje o róznych zakresach stezenia, albo rózne substancje, gdy odpowiednio dobierze sie receptury. Poza tym mozliwe sa tez urzadzenia, w których jednoczesnie rózne war¬ stwy reakcyjne zwilzone sa plazma, która pochodzi w miejsca nakropienia. Mozliwe sa tu najrózno- rodniejsze postacie, a mianowicie podluzne, koliste i podobne.Na fig. 15a—17«b przedstawione sa niektóre mo¬ zliwe urzadzenia, przy czym rózne obwody testowe róznia sie od la—Id, a pozostale odpowiadaja po¬ wyzszym figurom.Rozdzielenie krwi mozna równiez poprawic, gdy na wlókna szklane 3 w miejscu nakropienia krwi naniesie sie dalsza warstwe z wlókien szklanych 3a* Przy tym warstwy 3 i 3a moga skladac sfe z tego samego materialu, ale mozna tez na 3a wy¬ brac material o innej grubosci wzglednie o innej srednicy wlókien. Fig. 18 i 19 przedstawiaja mo¬ zliwe urzadzenia, które zreszta odpowiadaja fig. 3 i 12.Ponizsze przyklady blizej objasniaja wynalazek.141490 9 Przyklad I. Cholesterolowe paski testowe.W 70 ml wody rozpuszcza sie nastepujace sklad¬ niki: 0,117 g metylohydroksypropylocelulozy {Culminal MHPC 8000) 7,000 g TiO, 0,138 g KH2P04 0,479 g Na2HP04-H20 3400 U esterazy cholesterolowej 5000 U oksydazy cholesterolowej 7X104 U peroksydazy 0,476 g dioktylosulfobursztynianu sodowego.Nastepnie wrabia sie kolejno, az do ujednorod¬ niania 14,0 g celulozy i 8,4 g polipropionianu wi¬ nylu w postaci dyspersja.Wreszcie dodaje sie 0,66 g 3,3',5,5'-tetrametylo- benzydyny, rozpuszczonej w 1,6 ml acetonu.Gladka folie z tworzywa sztucznego pokrywa sie otrzymana masa na grubosc okolo 300 |jl i po wy¬ suszeniu w temperaturze 60—70°C tnie na paski o szerokosci 6 mm. Paski te nakleja sie nastepnie na folie poliestrowa razem z siatka nylonowa o gru¬ bosci 60 |a i równiez pocieta na paski o szerokosci 6 mm bibula z wlókien szklanych (filtr z wlókien szklanych nr 3362 filrmy Schleicher & Schiill, gru¬ bosc bibuly 0,47 mm, gestosc 0,27 g/cm8, prze¬ cietna srednica wlókien okolo 2,5 p). Wreszcie tnie sie na paski o szerokosci 6 mm.Na górna strone paska testowego nakrapda sie 40 fil krwi i po uplywie minuty usuwa przez zer¬ wanie bibule z wlókien szklanych z reszta krwi razem z siatka. Potem, w ciagu 3 minut na obsza¬ rze testowym tworzy sie zabarwienie na skutek re¬ akcji, które odpowiada zabarwieniu, jakie otrzy¬ muje sie, gdy zamiast krwi nakropi sie odwirowana plazme takiej samej krwi.Przyklad II. Test cholesterolowy. 10 10 20 25 30 35 Wreszcie dodaje sie i rozprowadza do ujednarod- nienia 20,0 g ziemi okrzemkowej.Otrzymana mase reakcyjna nanosi sie za pomo¬ ca maszyny do sitodruku (tkanina: 190 ji) paskami o szerokosci 6 mm na bibule z wlókien szklanych (np. filtr z wlókien szklanych nr 85/90 firmy Ma- /cherey, Nagel & Co) w postaci opisanej w przy¬ kladzie I. Zadrukowana bibule z wlókien szklanych suszy sie w temperaturze 60—80°C i tnie na paski o szerokosci 12 mm tak, aby zadrukowana strefa reakcyjna stanowila polowe paska. Pasek ten na¬ kleja sie na koniec folii poliestrowej i te tnie ]5o- przeoznie do bibulek z wlókien szklanych na paski o szerokosci 6 mim. Krew w ilosci 40 \n nakrapia sie na krawedz nie pokrytej foibuly z wlókien szkla¬ nych odwrócona od warstwy reakcyjnej. Wówczas plazma dyfunduje pod strefe reakcyjna. Zaleznie od stezenia cholesterolu we krwi, strefa reakcyj¬ na przyjmuje zabarwienie niebieskie o róznym na¬ tezeniu. Intensywnosc zabarwienia odpowiada in¬ tensywnosci, jaka otrzymuje sie, gdy zamiast krwi nakropi sie surowice lub plazme uzyskana z takiej samej krwi.W analogiczny sposób mozna zastosowac takze bibuly przedstawione w tablicy I.Przyklad III. Test cholesterolowy Mase reakcyjna, skladajaca sie z nastepujacych skladników: 16,0 g celulozy M+N Ac 10 86,0 g 0,2% roztworu metylohydroksypro- pylocelulozy (Culminal MHPC 8000) 0,32 g srodka zwilzajacego (Marlon) 0,68 g srodka zwilzajacego (dioktylosulfo- bursztynian sodowy) 12^0 g polipropionianu winylu w postaci dyspersji (Propiofan 70 D) Tablica I Bibuly filtracyjne z wlókien szklanych do oddzielania plazmy Wytwórca Machery & Nagel Nuclepore Schleicher & Schiill Schleicher & Schiill W 250 ml wody rozpuszcza sie niki: 0,45 g 1,55 g 1,5X10* U 1 X10*U 3 X10* U 2,0 g 6,9 g KH2PO4 Na2HP04-H20 Typ 85/90 BF P 300 mtr 9 3362 Przecietna Srednica STecnica wlókien wMdftn S-0 1—3 3^-1 1—7 nasteujace sklad- ^ esterazy cholesterolowej oksydazy cholesterolowej peroksydazy 60 dioktylosulfobursztynianu sodowego alginianu sodowego (Algipon) fr) 3,2 1,5 3,4 2,5 0,48 g 10,0 g 9600 U 7200 U 1,04X10* U 0,01 g Gramatura tetfm*) 87 2l5 67 127 Bibula Gru/bosc (jim) 350 .89 269 472 tetrametylobenzydyny dwutlenku tytanu esterazy cholesterolowej oksydazy cholesterolowej peroksydazy kwasu galusowego nanosi sie warstwa grubosci 0,2 mm ns Gestosc (g/cm8) 0,249 0,275 0,247 0,269 1 hydrofo- po czym dodaje jeszcze 2,0 g 3,3',5,5'-tetraimetylobenzydyny, rozpuszczonej w 15 ml acetonu. bowe runo poliestrowe (Reemay 2033 firmy Du 65 Pont), suszy w temperaturze 60°C i tnie na paski o szerokosci 6 mm. Nastepnie tak otrzymany pa-141 490 11 12 sefc oraz pasek bibuly z wlókien szklanych (np. filtr 3362 firmy Schleiicher & Schull) o szerokosci 12 mm nakleja sie obok siebie na twardy pasek plastikowy tak, aby pasek z wlókien szklanych stykal sie bardzo scisle z pokrytym runem. Tak otrzymany pasek plastikowy tnie sie poprzecznie na paski o szerokosci 6 mm i otrzymuje paski testowe, w przypadku których po nakropieniu oko¬ lo 50 pi krwi calkowitej na oddalona od runa re¬ akcyjnego strone filtra z wlókien szklanych po krótkim czasie tylko czysta plazma przechodzi do runa reakcyjnego i prowadzi do reakcji o barwie niebieskiej, której intensywnosc wzrasta ze steze¬ niem cholesterolu we krwi.Przyklad IV. Oddzielne uzyskiwanie plazmy Zwezajace sie stozkowp w dól naczynie z two¬ rzywa sztucznego (koniec z tworzywa sztucznego tlokowej pipety; dlugosc 5 cm, grubosc 0,5 cm) na¬ pelnic sie luzno do 2$ wlóknami szklanymi po¬ danymi w tablicy II. przy czym otrzymuje sie ge¬ stosc nasypowa 0,1—0,4 g/om*. Gdy górna, wolna czesc naczynia napelni sie krwia, surowica dyfunduje do spiczastego konca naczynia, do któ¬ rego mozna doprowadzic kapilare "end-to-end" o - pojemnosci 15 pi i napelnic ja surowica. Uzyskana w ten sposób plazme mozna bezposrednio poddac kazdemu dowolnemu badaniu analitycznemu.Wyniki badan zdolnosci rozdzielczej erytrocytów od plazmy róznych wlókien szklanych przedsta¬ wione 6a w tablicy II, Przyklad V. Skutecznosc hydrofobowej ba¬ riery W celu objasnienia skutecznosci hydrofobowej bariery 15, wytworzono urzadzenia wedlug fig. 14, które skladaja sie z przezroczystej poliweglanowej folii nosnej 2 o szerokosci 6 mm i grubosci 0,3 mm, chlonnej warstwy 9 o wymiarach 9X6 mm z bi¬ buly o grubosci 0,09 mm z wlókien szklanych, hy¬ drofobowej siatki nylonowej 18 o grubosci 0,075 mm i przeswiecajacej folii oslonowej 7. W chlonnym kontakcie z warstwa 9 umocowana jest na nosni¬ ku bibula z wlókien szklanych 3 (Schleicher & Schull, nr 3362, grubosc 0,47 mm) o szerokosci 6 mm i dlugosciach podanych w tablicy III. Kaz¬ dorazowo polowe tych urzadzen zaopatruje sie w miejscu zetakniecia miedzy warstwami 3, 9 i 18 w bariere 15 o szerokosci okolo 2 mm i grubosci 0,1 mm, wykonana z wosku parafinowego.Aby stwierdzic otrzymywanie plazmy, na srodek bibuly z wlókien szklanych 3 nanosi sie podane w tablicy III ilosci krwi i po uplywie 30 sekund oznacza sie nawilzenie chlonnej warstwy 9, jak równiez ewentualnie przesycenie (glebokosc wnik¬ niecia erytrocytów do warstwy 9). Przedstawione w tablicy III wyniki wykazuja, ze przez hydrofo¬ bowa bariere uzyskuje sie lepsze rozdzielenie i cal¬ kowite nasycenie tak, ze juz. z. bardzo mala obje¬ toscia krwi, na przyklad z krwia wlosniczkowa z opuszka palca, mozna przeprowadzic taki test. Ba¬ dania przeprowadzano kazdorazowo pieciokrotnie i w tablicy III podane sa wynika srednie. 10 15 lic i wlók tug p olnos W ) dot 50 55 60 Tablica II Badanie zdolnosci rozdzielczej róznych wlókien szklanych w urzadzeniu doswiad¬ czalnym wedlug przykladu IV Wlókna szklane: wlasciwosci, zdolnosc rozdzielcza erytrocyty/plazma Johns-Mannvill0 USA 100 102 104 106 108 A 108 B 110 112 VEB Trisola NRD U 60 U 70 U 80 U 90 U 100 U 156 F Srednica (|im) Zakres *) 0,2 —0,29 0,3 —0,33 0,34—0,48 0,49—0,58 0,51—0,64 0,59—0,88 0,65—0,76 0,77—0,93 0,94—1,19 1,2 —1,44 0,89^2,16 1,45—2,49 2,17—3,10 2,6 —3,8 2,5 --1,0 Wartosc srednia 0,25 0,32 0,4 0,54 0,58 0,74 0,71 0,85 1,07 1,312 1,53 1,97 2,6 3,2 3,3 Dlugosc wftókien Klmi) 300 800 1000 1200 1900 Powierz¬ chnia (mVg) 5,1 4,5 3,12 8,6 . — 1,72 0,71 — 0,49 €,40 Rozdzielenie erytrocyty/ /plazma + + + '+ + + + + + + +¦+ ++.+ +I+. +:++ . + + + + — — ~~* + — izadowalajace, + 4- — dobre, + -H+ — bardzo dobre, wynik ujemny *) — 80a/o wlókien lezy w tym zakresie13 141 490 Tablica III 14 Wymiary bibuly z wlókien szkla¬ nych (3) Nakropiona objetosc krwi <|Al 6X6 mm 7X6 mm 8X6 mm 25 30 35 29 35 41 33 40 47 Procentowe nawilzenie warstwy 9 z hydrofobowa bariera Plazma Krew X n=5 X n=5 88 97 99 86 100 100 96 100 100 Procentowe nawilzenie warstwy 9 bez hydrofobowej bariery Plazma Krew X n=5 X n=5 77 72 83 82 87 97 79 92 100 12 22 18 3 21 31 0 0 13 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wydzielania plazmy lub surowicy z 20 krwi calkowitej przez filtracje przez warstwe z wlókien szklanych, znamienny tym, ze jako war¬ stwe filtracyjna stosuje sie wlókna szklane o sred¬ niej srednicy wynoszacej 0,2—5 \x, korzystnie 0,5— 2,5 [a, zwlaszcza 0,5—1,5 |jl i gestosci 0,1—0,5 g/cm8. 25 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wlókna szklane stosuje sie w polaczeniu z synte¬ tycznymi wlóknami organicznymi, albo wlókna szklane wzmacniane wzglednie sklejone ze soba nieorganicznymi lub organicznymi spoiwami. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wlókna szklane stosuje sie jako luzno ulozone jak równiez w postaci bibuly, runa albo filcu.Fig. 1 vi 8 i 3r-3 *4a Fig.2a [ 5 £ l£ -4a Fig. 2b 5 /C '3r Mv. 3V V -4ao 1414 11 Fig. 7 1 3 8 ¦X- .11 Fig. 7a ==5 m, Fig. 12 |_ 7 1 8 =3V I 3 2 UN¬ ISCI 7 1 15 Q ^ Fig. 13 I V- Fig. 8a Fig. 8b 7 1 8 18 £=l=if\ Fig. 14 C zzszzzzsz * Fig. 9 .13 -14 Fig.10 16 14 13 -14 Fig.11 Fig. 15a Fig. 15b 1a i L ( 1b i i 1a 1b I 3 r \ \ 2 / 3 / 1a,b 7 8 7 1c,d Fig. 16a C Fig.16b 15 / \ S \ / 7^ 1a 1b NT 1c 1d PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wydzielania plazmy lub surowicy z 20 krwi calkowitej przez filtracje przez warstwe z wlókien szklanych, znamienny tym, ze jako war¬ stwe filtracyjna stosuje sie wlókna szklane o sred¬ niej srednicy wynoszacej 0,2—5 \x, korzystnie 0,5— 2,5 [a, zwlaszcza 0,5—1,5 |jl i gestosci 0,1—0,5 g/cm8. 25 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wlókna szklane stosuje sie w polaczeniu z synte¬ tycznymi wlóknami organicznymi, albo wlókna szklane wzmacniane wzglednie sklejone ze soba nieorganicznymi lub organicznymi spoiwami. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wlókna szklane stosuje sie jako luzno ulozone jak równiez w postaci bibuly, runa albo filcu. Fig. 1 vi 8 i 3r-3 *4a Fig.2a [ 5 £ l£ -4a Fig. 2b 5 /C '3r Mv. 3V V -4ao 1414 11 Fig. 7 1 3 8 ¦X- .11 Fig. 7a ==5 m, Fig. 12 |_ 7 1 8 =3V I 3 2 UN¬ ISCI 7 1 15 Q ^ Fig. 13 I V- Fig. 8a Fig. 8b 7 1 8 18 £=l=if\ Fig. 14 C zzszzzzsz * Fig. 9 .13 -14 Fig.10 16 14 13 -14 Fig.11 Fig. 15a Fig. 15b 1a i L ( 1b i i 1a 1b I 3 r \ \ 2 / 3 / 1a,b 7 8 7 1c,d Fig. 16a C Fig.16b 15 / \ S \ / 7^ 1a 1b NT 1c 1d PL