NO884348L - Pichia-transformasjon. - Google Patents

Pichia-transformasjon.

Info

Publication number
NO884348L
NO884348L NO88884348A NO884348A NO884348L NO 884348 L NO884348 L NO 884348L NO 88884348 A NO88884348 A NO 88884348A NO 884348 A NO884348 A NO 884348A NO 884348 L NO884348 L NO 884348L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
suspension
solution
dna
concentration
Prior art date
Application number
NO88884348A
Other languages
English (en)
Other versions
NO884348D0 (no
Inventor
James Michael Cregg
Kevin James Barringer
Original Assignee
Phillips Petroleum Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Phillips Petroleum Co filed Critical Phillips Petroleum Co
Publication of NO884348D0 publication Critical patent/NO884348D0/no
Publication of NO884348L publication Critical patent/NO884348L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

Oppfinnelsen angår molekularbiologi og genteknikk.
Nærmere bestemt angår en side ved oppfinnelsen en fremgangsmåte til å gjøre gjærceller av slekten Pichia kompetente for transformasjon med DNA som er fremmed i forhold til cellene. En annen side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til transformasjon av slike celler med slik DNA.
Et viktig trinn i genteknikken for å få celler til å utføre
en ønsket funksjon, såsom produksjon av et ønsket protein,
er å transformere cellene med et DNA som innbefatter den genetiske informasjon som er nødvendig for at cellene skal utføre funksjonen. Før cellene kan transformeres med et DNA må de imidlertid behandles for å gjøres kompetente for transforma-sjonen .
Transformasjon av gjærceller byr på spesielle problemer, fordi slike celler har cellevegger foruten plasmamembraner som bar-rierer mot inntrengning av DNA.
En vanlig fremgangsmåte til transformasjon av gjærceller er først å danne sfæroplaster fra cellene ved enzymatisk digerering av celleveggene fra cellene, deretter behandling av sfæroplastene for å transformere dem med det ønskede DNA og til slutt behandling av de transformerte sfæroplaster for å regenerere de hele celler, fullstendige med cellevegger.
En typisk transformasjonsprosess som anvender sfæroplaster
av celler av den metylotrofe gjærart Pichia pastoris, er beskrevet av Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
Anvendelsen av sfæroplaster for transformasjon av gjærceller byr på en rekke ulemper forbundet med den osmotiske følsomhet av sfæroplaster og behovet for først å fremstille sfæroplaster og deretter på nytt å danne hele celler fra dem. Som er erkjen-nelse av disse problemer, har anstrengelser vært gjort innen faget for å konstruere fremgangsmåter til transformering av hele gjærceller.
Således har Ito et al., J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983), rapportert en fremgangsmåte for å gjøre kompetente for transformasjon og transformere hele celler av Saccharomyces cerevisiae. Fremgangsmåten i henhold til Ito et al. omfatter inkubasjon av hele celler av Saccharomyces cerevisiae i en vandig oppløsning, buffret på en pH-verdi på ca. 8 av et salt av
et alkalimetall for å gjøre cellene kompetente for transformasjon, inkubering av de kompetente, hele celler i en oppløsning igjen buffret til en pH-verdi på ca. 8 med det DNA med hvilket cellene skal transformeres og et salt av et alkalimetall,
tilsetning av polyetenglykol til DNA-oppløsningen som bader cellene, hvilken polyetenglykol har en midlere molekylvekt på ca. 4000, å bringe polyetenglykolkonsentrasjonen på ca.
35% (w/v), inkubasjon av cellene i den resulterende oppløsning og varmesjokkbehandling (heat shocking) av cellene ved suspensjon av oppløsningen i et vannbad ved 42°C i 5 min og deretter returnere oppløsningen til værelsestemperatur. Blant saltene
av alkalimetaller som ble utprøvet av Ito et al. ved 0,1 M konsentrasjon i både oppløsningen for å gjøre cellene kompetente for transformasjon og transformasjonsoppløsningen (før tilsetning av polyetenglykol), førte litiumklorid til 4-8 ganger flere transformanter pr. mikrogram transformasjons-DNA enn natriumklorid. Videre, blant de litiumsalter som ble utprøvet, gav litiumklorid et betydelig lavere antall transformanter pr. mikrogram transformasjons-DNA enn litiumacetat, litiumnitrat og litiumsulfat, som alle gav tilnærmet det samme antall transformanter. Ito et al. rapporterte at sirkelformet plasmid-DNA transformerte alkalimetallsalt-behandlede hele
celler mer effektivt enn linearisert plasmid-DNA, og at celler fra middels- til sen-logfasekulturer, når de ble behandlet med et alkalimetallsalt, ble transformert mer effektivt enn celler fra sen-log til stasjonære fasekulturer. Ito et al.
rapporterte maksimal transformasjonsvirkningsgrad når for-holdet mellom konsentrasjonen av celler behandlet med saltet av et alkalimetall og konsentrasjonen av alkalimetallsaltet
11 12
var mellom 10 og 10 celler pr. mol.
Davidow et al., Curr. Genet. 10, 39-48 (1985), rapporterte
en fremgangsmåte til å gjøre kompetent for transformasjon og transformering av hele celler fra gjæren Yarrowia lipolytica. Fremgangsmåten ifølge Davidow et al. omfatter inkubasjon av hele celler av Yarrowia lipolytica ved ca. 10 g celler pr. ml i en vandig oppløsning, buffret ved en pH-verdi på
ca. 7,5 av 0,1 M litiumacetat for å gjøre cellene kompetente for transformasjon, inkubasjon av de kompetente, hele celler i en oppløsning igjen buffret til en pH-verdi på ca. 7,5 av det DNA med hvilket cellene skal transformeres, heterologt bærer-DNA (E. coli-DNA) Haelll-digerert til et størrelses-område på mindre enn kilobasepar og 0,1 M litiumacetat, tilsetning til den DNA-oppløsning som bader cellene av en opp-løsning av 0,1 M litiumacetat buffret til en pH-verdi på ca. 7,5 og inneholdende ca. 40% (w/v) polyetenglykol med en midlere molekylvekt på ca. 4000, for å bringe polyetenglykolkonsentrasjonen på ca. 35% (w/v) i den DNA-holdige oppløsning, inkubasjon av den resulterende oppløsning og underkastelse av cellene i polyetenglykoloppløsningen for et varmesjokk ved suspensjon av oppløsningen ved 37°C i noen minutter. I motsetning til Ito et al. rapporterte Davidow et al. at sirkulært plasmid-DNA transformerte litiumacetat-behandlede hele celler mindre effektivt enn linearisert plasmid-DNA. I likhet med Ito et al. fant Davidow et al. at celler fra kulturer i senere stadier av vekst gav flere transformanter pr. mikrogram transformerende DNA enn celler fra kulturer i tidligere veksttrinn. Davidow et al. rapporterte at ikke med-enn ca.
50 mikrogram av det Haelll-digererte bærer-DNA pr. mikrogram
transformerende DNA i betydelig grad øket antallet transformanter som ble oppnådd pr. mikrogram transformerende DNA og lydbehandlet (sonicated) E. coli-DNA (størrelsesområde 0,5-9 kbp) som bærer som forelå i en mengde av 10 mikrogram pr. mikrogram transformerende DNA førte til bare halvparten så mange transformanter pr. mikrogram transformerende DNA som Haelll-digerert E. coli-DNA (størrelsesområde mindre enn 1 kbp) som bærer som også forelå i en mengde av 50 mikrogram pr. mikrogram transformerende DNA.
De avvikende resultater oppnådd av Ito et al. og Davidow et al. viser uforutsigbarheten av virkningsgraden for en hvilken som helst spesiell gjærart for fremgangsmåter til å gjøre kompetente for transformasjon og transformere hele celler. Hvorvidt fremgangsmåter som er funnet å være effektive for en gjærart, vil være effektive for andre arter som fremgangsmåtene ikke er blitt utprøvet på, er faktisk meget usikkert. Hvilke egenskaper av celleveggene og tilhørende membraner som virker inn på kompetanse for transformasjon og transformasjonsvirkningsgrad er fortsatt uklart for alle arter og særlig gjærarter. Det antas at de kjemiske og fysiske egenskaper av cellevegger og membraner avviker vesentlig blant gjærarter, men hvordan disse forskjeller kan virke inn på fremgangsmåter for å gjøre gjærarter kompetente for transformasjon eller for å transformere dem, og virkningsgraden med hvilken en hvilken som helst spesiell fremgangsmåte vil fungere for en spesiell art, forblir ukjent.
Jo lengre fra hverandre to gjærarter står taksonomisk sett, desto mindre sannsynlig er det at observasjoner angående metoder til transformasjon av hele celler utført med en av artene, vil gjelde for den annen. Spesielt er ingen ting kjent i faget om transformasjonsmetoder for hele celler anvendt på metylotrofe gjærarter, såsom arter av Pichia pastoris. Metylotrofe gjærarter avviker betydelig i en rekke egenskaper innbefattet egenskaper som er aktuelle for fremgangsmåter til å gjøre celler kompetente for transformasjon og for å transformere dem, i forhold til ikke-metylotrofe gjærater, såsom S. cerevisiae og Y. lipolytica.
Det er nå funnet at hele celler av metylotrofe arter av slekten Pichia kan gjøres kompetente for transformasjon ved inkubasjon i en buffret oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat. Videre er det, uventet, funnet at slike celler som er gjort kompetente for transformasjon ved en slik fremgangsmåte, kan fryses og lagres i den frosne tilstand inntil bruk, med liten reduksjon i den virkningsgrad med hvilken cellene kan transformeres. Frossen lagring er vanskelig med sfæroplaster av slike celler, slik at mange praktiske fordeler ved slik lagring ikke kunne realiseres for slike celler forut for den foreliggende oppfinnelse.
Det er også funnet at hele celler at metylotrofe arter av slekten Pichia, etter å være blitt gjort kompetente for transformasjon ved inkubasjon i en buffret oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat, kan transformeres med et ønsket DNA ved inkubasjon med en buffret oppløsning av dette DNA
og litiumklorid eller litiumsulfat, fulgt av tilsetning til oppløsningen inntil en konsentrasjon på mellom 20 og 50%
(w/v), fortrinnsvis 35% (w/v), av polyetenglykol med en midlere molekylvekt på mellom 3000 og 5000 dalton, fortrinnsvis 3350 dalton, og etterfølgende inkubasjon av den polyeten-glykolholdige oppløsning og deretter varmesjokkbehandling av oppløsningen. Det er videre funnet, ganske uventet, at denne transformasjonsmetode har visse betydelige fordeler over fremgangsmåter for transformasjon av slike celler som anvender sfæroplaster av cellene. Spesielt gir fremgangsmåten som anvender hele celler transformanter som, fordi de ikke er innleiret i agar, vokser betydelig hurtigere enn transformanter fremstilt ved bruk av sfæroplaster.
Den foreliggende oppfinnelse omfatter en ny og uventet fordelaktig fremgangsmåte til fremstilling av hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia som er kompetent for transformasjon, hvilken fremgangsmåte omfatter å opprettholde de nevnte celler i suspensjon i minst ca. 45 min ved en konsentrasjon på o mellom ca. 5 x 10 7 og 5 x 10 8, fortrinnsvis ca. 5 x 10 g celler pr. ml i en vandig oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat ved en konsentrasjon på mellom 50 mM og 500 mM, hvilken oppløsning holdes på en temperatur mellom 27°C og 33°C og er buffret ved en pH-verdi på mellom 7 og 8, fortrinnsvis ca. 7 .
Oppfinnelsen omfatter videre en ny og fordelaktig fremgangsmåte til å transformere hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia med et ønsket DNA, hvilken fremgangsmåte omfatter:
(1) å skaffe celler av arten som er blitt gjort kompetente for transformasjon ved en fremgangsmåte som omfatter å holde de nevnte celler i suspensjon i minst ca. 45 min ved en konsentrasjon på o mellom 5 x 10 7 og 5 x 10 8 celler pr. ml i en første vandig oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat ved en konsentrasjon på mellom 50 mM og 500 mM, hvilken nenvte første oppløsning holdes på en temperatur på mellom 27°C og 33°C og er buffret på en pH-verdi på mellom 7 og 8; (2) å fremstille en annen suspensjon av celler ved å kombi-nere (a) en første suspensjon av de nevnte kompetente celler ved en konsentrasjon på o mellom 5 x 10 7 og 5 x 10 8 celler pr. ml i en annen vandig oppløsning omfattende et salt av litium, som er det samme som det første salt av litium, ved en konsentrasjon på mellom 50 mM og 500 mM og buffret på en pH-verdi på mellom 6 og 8, med (b) en tredje vandig oppløsning med et volum som er mindre enn 0,2 ganger så stort som den første suspensjon, hvilken tredje oppløsning er buffret på en pH-verdi på mellom 7 og 8 og omfatter mellom 1 ng og 20^ug av det ønskede DNA pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning, forutsatt at dersom den nevnte mengde av det nevnte ønskede DNA er mindre enn ca. 10 pq pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning, omfatter den nevnte tredje oppløs-ning en masse av bærer-DNA på 10 p. q, videre forutsatt at mengdene av det nevnte ønskede DNA og den nevnte bærer-DNA er slik at mengden av den nevnte bærer-DNA ikke overstiger 50 p. q pr. liter av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning; (3) å inkubere minst en porsjon av den nevnte annen suspensjon fremstilt i trinn (2) på mellom 27°C og 33°C i minst 10-60 min, fortrinnsvis ca. 30 min; (4) å fremstille en tredje suspensjon av de nevnte celler
ved blanding, for å opprette stort sett homogen polyetenglykol-konsentrasjon i den nevnte tredje suspensjon, minst en porsjon av porsjonen av den nevnte annen suspensjon inkubert i henhold
til trinn (3) med en fjerde vandig oppløsning som har et volum på mellom 5 og 10 ganger, fortrinnsvis 7 ganger volumet av den porsjon av den nevnte inkuberte annen suspensjon, med hvilken den fjerde oppløsning blandes, idet den nevnte fjerde oppløsning stort sett består av 20-50% (w/v), fortrinnsvis 35%, polyetenglykol med midlere molekylvekt på mellom 3000
og 5000 dalton, fortrinnsvis 3350 dalton, i en oppløsning med den samme sammensetning som den nevnte annen oppløsning; (5) å inkubere minst en porsjon av den tredje suspensjon fremstilt i trinn (4) på mellom 27°C og 33°C i minst 10-60 min, fortrinnsvis ca. 30 min; og (6) å varmesjokkbehandle minst en porsjon av den porsjon av den tredje suspensjon som inkuberes i henhold til trinn (5).
Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis
på celler av den metylotrofe art Pichia pastoris. Videre blir fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis anvendt på en auxotrof mutantstamme av Pichia pastoris, hvor den genetiske basis av mutasjonen eller mutasjonene er tilstrekkelig godtkarakterisertog for hvilken gener er blitt isolert som er i stand til, ved transformasjon inn i mutantstammen, å komple-mentere den mutante fenotype av stammen og derved skaffe transformanter som er prototrofe for den fenotype som svarer til den auxotrofe mutasjon, og kan velges på basis-av slik prototrofi. En rekke slike auxotrofe mutantstammer av P. pastoris er kjent i faget, innbefattet stamme GS115, en histidinkrevende stamme, på grunn av en mutasjon i HIS4-genet og stamme PPF1, en histidin- og argininkrevende stamme på grunn av mutasjoner i HIS4- og ARG4-genene.
Kulturer av stammer GS115 og PPFl ble deponert under betingelsene i henhold til Budapest-avtalen om deponering av mikro-organismer for patentsøknader (Budapest Treaty on the Inter-national. Recognition of the Deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure), henholdsvis den 31. august
1984 og 22. oktober 1985, ved the Northern Regional Research
Laboratory Culture Depository, De Forente Staters landbruks-departement, Peoria, Illinois, USA. De deponerte kulturer av begge stammer ble akseptert av deponeringsstedet under betingelsene i avtalen. Deponeringen av kulturen av stamme GS115 ble gitt deponeringsnummer Y-15851. Deponeringen av kulturen av stamme PPFl ble gitt deponeringsnummer Y-18017.
Skjønt fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for
å fremstille transformanter som velges ved bruk av en dominerende selekterbar markør, såsom G418-resistens, skaffet av et heterologt gen på DNA som transformeres inn i cellene som skal transformeres, er det funnet at transformasjonsvirkningsgraden (dvs. antall transformanter som fås pr. enhet masse av ønsket DNA pr. celle som anvendes i den annen suspensjon) er meget lavere når seleksjonen anvender en dominerende selekterbar markør enn når den er basert på komplementering av en auxotrof mutasjon.
Transformasjonsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes med praktisk talt et hvilket som helst DNA som det ønskes,
og som er istand til å bli, transformert inn i en celle av
en metylotrof art av Pichia pastoris for å meddele den nevnte celle en ønsket fenotype, såsom evnen til å uttrykke et ønsket protein. Som fagfolk vil forstå, inneholder slikt DNA vanligvis fra 20 til 5 kilobasepar. I virkeligheten vil et slikt ønsket DNA vanligvis være kortene enn ca. 20 kilobasepar,
og vil innbefatte et gen som meddeler transformanter en fenotype ved hvilken de kan velges fra utransformerte celler samt et gen som kan uttrykkes i transformantene for å produsere et protein, hvilket skaffer den ønskede fenotype av de transformerte celler. Et ønsket DNA som skal transformeres inn i cellene i henhold til oppfinnelsen, kan være et sirkulært plasmid som kan opprettholdes i transformanter med stabilitet som i det minste er tilstrekkelig til å, på målbar måte, meddele transformantene den ønskede fenotype, eller et linearisert plasmid eller annet lineært DNA som kan integreres inn i genomet av transformantene, fortrinnsvis ved et på forhånd valgt locus deri, som f.eks. locuset av det viktigste alkohol-
oksidasegen (AOXl-gen), og, som integrert DNA, meddele transformantene den ønskede fenotype. Eksempler på ønskede DNA-mate-rialer og fremgangsmåter til å identifisere transformanter dermed, er kjent i faget. Det er funnet at virkningsgraden av transformasjon med transformasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen er meget høyere med linearisert plasmid-DNA enn med sirkelformet DNA.
Alkalimetallsalter for bruk i henhold til oppfinnelsen er litiumklorid og litiumsulfat. Litiumklorid er mest foretrukket.
Et hvilket som helst salt som kan buffre oppløsningene og suspensjonene som anvendes i henhold til oppfinnelsen på en pH-verdi på 7-8, fortrinnsvis ca. 7, og som er ikke-giftig for cellene som skal transformeres, kan anvendes i henhold til oppfinnelsen. Fagfolk kjenner til mange slike salter.
Det som er mest foretrukket er Tris-HCl, på en konsentrasjon mellom 1 mM og 100 mM. Oppløsningene og suspensjonene som anvendes i oppfinnelsen innbefatter fortrinnsvis også "EDTA", ved hvilket skal forstås kollektivt alle former, fullstendig protonatisert og anioniske, av etendiamintetraacetat, ved en konsentrasjon på mellom 0,1 mM og 10 mM.
Det polyetenglykol som anvendes i transformasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en midlere molekylvekt på mellom 3000 og 4000 dalton, helst 3350.
Det bærer-DNA som anvendes i transformasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen, valgfritt i alle transformasjoner i henhold til fremgangsmåten, men nødvendigvis når konsentrasjonen av ønsket DNA er mindre enn 10 ;ag pr, ml av den nevnte første suspensjon (som er kombinert med den tredje oppløsning for å fremstille den annen suspensjon), er DNA som er fremmed for Pichia, såsom E. coli-DNA, laksesperm-DNA, sildesperm-DNA eller lignende. Bærer-DNA, slik det vil forstås av fagfolk, underkastes skjærbehandling ved en fremgangsmåte såsom lyd-behandling eller digerering med et restriksjonsenzym. Skjønt slikt DNA kan ha fra 15 til 0,5 kilobasepar, har bærer-DNA fortrinnsvis en midlere størrelse på mindre enn ca. 1 kilobasepar. Et for tiden foretrukket bærer-DNA er E. coli-DNA digerert fullstendig med restriksjonsenzymet Haelll.
Oppfinnelsen skal nå belyses i detalj i de følgende eksempler.
EKSEMPEL I
Fremstilling av kompetente celler for transformasjon
En 50 ml<1>s kultur av Pichia pastoris ble dyrket i YPD (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% dekstrose) ved 30°C med risting og cellene ble høstet ved logaritmisk fase, dvs. en OD^qq på ca. 1 (ca. 5 x 10^ til ca. 5 x 10^ celler pr. ml). Celler som ble høstet ved logaritmisk fase ble mer effektivt transformert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen enn de som var i sen logaritmisk eller stasjonær fase (i motsetning til observasjonene gjort av Ito et al. og Davidow et al., som angitt ovenfor). Høsting ble utført ved sentrifugering av kulturen ved 5-10°C ved 1500 x g i 10 min, og supernatanten ble kassert.
Cellepelleten fra høstingen ble vasket én gang ved suspensjon
i 10 ml sterilt vann, fulgt av sentrifugering som angitt i avsnittet ovenfor. Igjen ble supernatanten kassert.
Pelleten ble deretter vasket ved at den ble suspendert i steril TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA), fulgt av sentrifugering ved 5-10°C ved 1500 x g i 10 min. Igjen ble supernatanten kassert.
Cellene ble deretter suspendert i et volum av TE-buffer supplert med 0,1 mM LiCl for å bringe cellene på en konsentrasjon av 1,5 x 10 gceller pr. ml. Denne suspensjon ble inkubert ved 30°C i 1 time i en risteluft-inkubator (shaking air incu-bator) (200-250 omdreininger pr. min). Inkubasjonsperioder kortere enn 45 min er funnet å redusere transformasjonsvirkningsgraden med en faktor på 10-20, sammenlignet med perioder på 1 time eller lengre. Inkubasjonsperioder på inntil 2 timer er funnet å ikke ha noen vesentlig innvirkning på transforma-sjonsfrekvensen sammenlignet med inkubasjoner på 1 time.
Etter inkubasjonen var cellene kompetente for transformasjon og kunne anvendes straks for transformasjon, kunne lagres over nattel ved 4°C uten nevneverdig tap av transformasjonsvirkningsgrad eller kunne lagres for lengre perioder som følger: For å lagre de kompetente celler i frossen tilstand, høstes cellene etter inkubasjonen som beskrevet i det foregående avsnitt ved sentrifugering ved 5-10°C ved 1500 x g i 10 min og deretter kasseres supernatanten. Pelleten resuspenderes deretter i et volum som bringer konsentrasjonen av celler til 2,5 x 10 g celler pr. ml av en oppløsning av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl, fremstilt som 15% (v/v) i dimetylsulfoksid. Den resulterende suspensjon overføres til sterile rør i 0,5 ml's porsjoner og rørene fryses på tørris og lagres ved -70°C.
Frosne kompetente celler ble fremstilt for transformasjon
ved at et rør med celler ble tatt ut av fryseren og tint på
is. Den tinte oppløsning ble deretter sentrifugert i en mikro-fuge av laboratorietypen (benchtop) for å pelletere celler og supernatanten ble kassert. Deretter ble pelleten vasket ved suspensjon i et volum'som var slik at konsentrasjonen av cellene ble bragt på o 1,5 x 10 8 celler pr. ml av en oppløsning av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl, bragt på 15% (v/v) i dimetylsulfoksid fulgt av sentrifugering ved 5-10°C ved 1500
x g i 10 min og kassering av supernatanten. Pelleten ble deretter resuspendert i et volum som bragte konsentrasjonen av celler på o 1,5 x 10 8 celler pr. ml av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl.
Kompetente celler, frosset og tint og preparert for transformasjon som beskrevet i dette eksempel, har tilnærmet en fem-dobbelt reduksjon i transformasjonsvirkningsgrad uavhengig av lengden av lagringen.
Fagfolk vil innse at de forskjellige vasketrinn som er beskrevet i dette eksempel, skjønt de er i overensstemmelse med god mikrobiologisk praksis og muligens er nyttige for opp-rettholdelse av transformasjonsvirkningsgraden av kompetente celler, ikke er nødvendige for å gjøre cellene kompetente.
Det trinn som er nødvendig for å gjøre cellene kompetente
er inkubasjonen i minst 45 min ved en temperatur i området 27-33°C, fortrinnsvis 30°C, av suspensjonen av cellene i TE-buffer supplert med LiCl.
pH-verdien av de TE-buffrede oppløsninger som er beskrevet i disse eksempler, er fortrinnsvis ca. 7,4, men kan ligge i området 7-7,8 uten. vesentlig ugunstige virkninger på trans-formas j onsvirkningsgraden eller annet.
EKSEMPEL II
Tranformasjon av celler
Til et sterilt 12 x 75 mm polypropenrør ble der tilsatt: 10
p. q Haelll-digerert E. coli-DNA som bærer-DNA og Ing - 20^g av det ønskede DNA (fortrinnsvis linearisert plasmid DNA med endepunkter til å dirigere DNA til integrasjon ved et på forhånd bestemt locus av den transformerte stammes genom) i mindre enn 20 _ul TE-buffer og 100^ul kompetente celler (ca. 1,5 x 10 celler) i TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl. Blandingen ble deretter inkubert ved 30°C (27-33°C) i 30 min (fra 10
min til 1 time). Etter inkubasjonen ble 0,7 ml av en oppløs-ning av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl, bragt på 40% (v/v) med polyetenglykol av midlere molekylvekt på 3350 dalton ("PEG2350")'satt til inkubasjonsblandingen og den resulterende suspensjon ble svirret ganske kort for å dispergere PEG homogent. Den PEG-holdige suspensjon ble deretter inkubert ved 30°C i 30 min i et stasjonært vannbad. Til slutt ble suspensjonen underkastet varmesjokk ved neddykking ved 37°C (35-39°C) i 5 min (2-10 min) i et stasjonært vannbad, fulgt av kassering av supernatanten. Til slutt, før sortering for transformanter, ble pelleten resuspendert i 0,1 ml sterilt vann.
Sortering for transformanter kan utføres ved at den endelige suspensjon av celler i vann spres på en selektiv plate (f.eks. i tilfellet for P. pastoris-stammen GS115 transformert med et ønsket DNA som komplementerer HIS4-mutasjonen, agar med 0,67% gjærnitrogenbase, uten aminosyrer, pluss 2% glukose), inkubasjon av platen i 3 dager ved 30°C og deretter identifi-sering av trnasformanter ved veksten av kolonier på platen.
Transformerte kolonier kan utvinnes for ytterligere analyse eller for bruk ved tilsetning av sterilt vann til platen og deretter avskrapning av koloniene fra agaroverflaten og over-føring av disse til rør.
EKSEMPEL III
Ved bruk av fremgangsmåten i eksempel II, ble celler av Pichia pastoris GS115 og Pichia pastoris PPFl transformert med de variasjoner som er angitt med plasmid betegnet pYJ30 (NRRL nr. B-15890 pYJ30 i E. coli) enten ikke-kuttet eller kuttet med Stul. Cellene ble benyttet straks etter at de var blitt gjort kompetente på samme måte som i eksempel I. De følgende transformasjonsvirkningsgrader ble oppnådd.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til å gjøre hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia kompetente for transformasjon, karakterisert ved at de nevnte celler opprettholdes i suspensjon i en tid på 45-120 min ved en celle-konsentrasjon i områo det 5 x 10 7 - 5 x 10 8 celler pr. ml i en vandig oppløsning av et ikke-giftig salt av et alkalimetall valgt fra LiCl og Li2 SO^ i en konsentrasjon på 50-500 mM, og den nevnte oppløsning holdes på en temperatur i området 27-33°C og buffres på en pH-verdi i området 6-8, fortrinnsvis 7-8.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte vandige oppløsning buffres med Tris-HCl ved en konsentrasjon på 1-100 mM og omfatter EDTA med en konsentrasjon på 0,1-10 mM og har en pH-verdi på 7,4.
3. Fremgangsmåte til transformasjon av hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia med et ønsket DNA, karakterisert ved at (1) der skaffes en første suspensjon med 5 x 10^ 5 x 10 g kompetente celler pr. ml i en første vandig oppløsning som har en konsentrasjon på 50-500 mM av et ikke-giftig alkalimetallsalt valgt fra LiCl og Li2 S04 og som er buffret på en pH-verdi av 6-8; (2) der fremstilles en annen suspensjon av kompetente celler ved kombinasjon av (a) den nevnte første suspensjon av de nevnte kompetente celler i en annen vandig oppløsning omfattende det samme alkalimetallsalt som det som anvendes i trinn (1) og (b) en tredje vandig oppløsning med et volum på mindre enn 0,2 ganger volumet av den nevnte første suspensjon, hvilken tredje vandige oppløsning er buffret på en pH-verdi av 7-8 og omfatter mellom 1 ng og 20 p. q ønsket DNA pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning; (3) minst en porsjon av den nevnte annen suspensjon fremstilt i trinn (2) inkuberes ved en temperatur på 27-33°C i et tidsrom på 10-60 min; (4) en tredje suspensjon av de nevnte celler fremstilles ved at man blander, for etablering av stort sett homogen poly-etenglykolkonsentrasjon i den nevnte tredje suspensjon, i det minste en porsjon av porsjonen av den nevnte annen suspensjon, inkubert som angitt i trinn (3) med en fjerde vandig oppløsning som har et volum som er 5-10 ganger så stort som volumet av den porsjon av den nevnte inkuberte annen suspensjon med hvilken den fjerde oppløsning blandes, hvilken fjerde oppløsning består stort sett av 20-50% (w/w) polyetenglykol med en midlere molekylvekt på 3000-5000 dalton i en oppløsning med den samme sammensetning som den nevnte annen oppløsning; (5) minst en porsjon av den nevnte tredje suspensjon fremstilt i trinn (4) inkuberes ved en temperatur på 27-33°C i en tid på 10-60 min; og (6) minst en porsjon av den porsjon av den tredje suspensjon som inkuberes i henhold til trinn (5) underkastes varme-sj okkbehandiing.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3 , karakterisert ved at de nevnte celler er blitt gjort kompetente ved en fremgangsmåte som angitt i krav 1.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at hver av de nevnte annen og tredje oppløsninger som er buffret med Tris-HCl med en konsentrasjon på 1-100 mM, omfatter EDTA med en konsentrasjon på 0,1-10 mM og har en pH-verdi på 7,0-7,8.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at konsentrasjonen av g celler i den nevnte første suspensjon er 1,0 x 10 - 2,5 x
10 g celler pr. ml, mengden av ønsket DNA i den nevnte tredje oppløsning er_fra 1 ng til 20 p. g pr. ml av den nevnte første suspensjon, den nevnte tredje oppløsning omfatter tilnærmet 10 p. q av bærer-DNA og varmesjokkbehandlingen består stort sett av å inkubere en porsjon av den nevnte tredje suspensjon som er inkubert i henhold til trinn (5) ved en temperatur på 35-39°C i en tid på 2-10 min, fulgt av redusering av tem-peraturen av den nevnte varmesjokkbehandlede porsjon til under ca. 3 3°C.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at når mengden av ønsket DNA er mindre enn tilnærmet 10 p. q pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning, omfatter den nevnte tredje oppløsning en masse av bærer-DNA på 10 p. q og videre at mengden av det nevnte bærer-DNA ikke overstiger 50^u g pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at de transformerte celler ifølge trinn (6) utvinnes fra den nevnte tredje suspensjon og deretter sorteres for transformanter.
9. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den nevnte Pichia-art er Pichia pastoris.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 og 5 eller 6, karakterisert ved at cellene av Pichia pastoris er av en stamme som har en auxotrof mutasjon, hvor det ønskede DNA er et lineært DNA som kan integrere ved et på forhånd valgt locus i Pichia pastoris-genomet og som omfatter et gen for en selekterbar markør som komplementerer den nevnte auxotrofe mutasjon, og hvor, etter varmesjokkbehand-lingstrinnet, transformatene velges på basis av prototrofi for den fenotype som skyldes den nevnte auxotrofe mutasjon, særlig hvor den nevnte Pichia pastoris er GS115 (NRRL Y-15851), eller den nevnte Pichia pastoris er.PPFl (NRRL Y-18017).
NO88884348A 1987-10-19 1988-09-30 Pichia-transformasjon. NO884348L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/110,148 US4929555A (en) 1987-10-19 1987-10-19 Pichia transformation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO884348D0 NO884348D0 (no) 1988-09-30
NO884348L true NO884348L (no) 1989-04-20

Family

ID=22331463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO88884348A NO884348L (no) 1987-10-19 1988-09-30 Pichia-transformasjon.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4929555A (no)
EP (1) EP0312934A3 (no)
JP (1) JPH01128790A (no)
AU (1) AU596546B2 (no)
DK (1) DK579988A (no)
IL (1) IL87980A0 (no)
NO (1) NO884348L (no)

Families Citing this family (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197548B1 (en) 1990-04-02 2001-03-06 Medeva Pharma Limited Transformed Pichia expressing the pertactin antigen
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
JPH06500470A (ja) * 1990-09-04 1994-01-20 メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生
WO1992009698A1 (en) 1990-11-26 1992-06-11 Genetics Institute, Inc. Expression of pace in host cells and methods of use thereof
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
DE69232666T2 (de) * 1991-04-01 2003-03-20 Merck & Co., Inc. Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung
JPH07502404A (ja) * 1991-12-23 1995-03-16 ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド 幹細胞阻害タンパク質
ATE279516T1 (de) 1993-03-08 2004-10-15 Merck & Co Inc Menschliche neuronale nikotin-acetylcholin- rezeptor-verbindungen und methoden ihres einsatzes
WO1994024284A1 (en) 1993-04-20 1994-10-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Human n-methyl-d-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor
US5912122A (en) * 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US6001581A (en) * 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
WO1995013299A1 (en) * 1993-11-08 1995-05-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5629167A (en) 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
US5712249A (en) * 1994-09-08 1998-01-27 Ciba-Geigy Corporation Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
ATE421527T1 (de) 1997-08-27 2009-02-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Molekular-mimetika von meningokokkus b epitopen
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
PT1047784E (pt) 1998-01-14 2009-12-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Antigénios de neisseria meningitidis
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
EP2261346A3 (en) 1998-05-01 2012-01-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
WO2000022130A2 (en) 1998-10-15 2000-04-20 Chiron Corporation Metastatic breast and colon cancer regulated genes
JP2003524389A (ja) 1998-12-16 2003-08-19 カイロン コーポレイション ヒトサイクリン依存的キナーゼ（ｈＰＮＱＡＬＲＥ）
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
EP2278007B1 (en) 1999-04-30 2014-04-16 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Conserved neisserial antigens
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
EP2308974A3 (en) 1999-10-14 2011-08-10 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
CA2954411A1 (en) 1999-10-29 2001-05-03 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Neisserial antigenic peptides
PT1248841E (pt) 2000-01-10 2008-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Genes expressos diferencialmente no cancro da mama
DK1897555T3 (da) 2000-01-17 2014-10-13 Novartis Vaccines & Diagnostic Kompletteret OMV-vaccine mod meningococcus
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
DK1522590T3 (da) 2000-06-28 2009-12-21 Glycofi Inc Fremgangsmåde til fremstilling af modificerede glykoproteiner
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
JP4092194B2 (ja) 2000-06-30 2008-05-28 フランダース インターユニバーシティ インスティテュート フォア バイオテクノロジー （ヴィーアイビー） ピキアパストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質糖鎖修飾
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
SG165981A1 (en) 2000-10-27 2010-11-29 Chiron Srl Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
WO2002059337A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Georgetown University School Of Medicine Anti-apoptopic gene scc-s2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081640A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene shinc-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081641A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002303261A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2003048306A2 (en) 2001-11-16 2003-06-12 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
NZ546711A (en) 2001-12-12 2008-06-30 Chiron Srl Immunisation against chlamydia trachomatis
DE60233347D1 (de) * 2001-12-19 2009-09-24 Univ Chicago Schnellreifende fluoreszierende proteine und verfahren zu deren anwendung
US7244565B2 (en) * 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7138512B2 (en) * 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
CA2482485A1 (en) * 2002-04-15 2003-10-30 Merck & Co., Inc. Matrix analysis of gene expression in cells (magec)
US20030228317A1 (en) * 2002-05-22 2003-12-11 Prafulla Gokhale Gene BRCC-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2003099848A2 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Restoragen Inc. Method for universal enzymatic production of bioactive peptides
AU2003231862A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-12 Restoragen, Inc. Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides
WO2003099854A2 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Nps Allelix Corp. Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides
AU2003239863A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-12 Restoragen Inc. Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides
DE60330564D1 (de) 2002-05-24 2010-01-28 Restoragen Inc Verfahren und konstrukte zur expression von clostripain mit hoher ausbeute
US7252933B2 (en) 2002-06-26 2007-08-07 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast
ATE466875T1 (de) 2002-11-15 2010-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis
US7118901B2 (en) * 2002-12-18 2006-10-10 Roche Diagnostics Operations, Inc. Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7419801B2 (en) * 2003-08-08 2008-09-02 Arriva Pharmaceuticals, Inc. Methods of protein production in yeast
CA2536635C (en) 2003-08-25 2015-05-12 Funzyme Biotechnologies Sa Novel fungal proteins and nucleic acids encoding same
US20070274988A1 (en) * 2003-10-10 2007-11-29 Five Prime Therapeautics, Inc. Kiaa0779, Splice Variants Thereof, and Methods of Their Use
ATE530165T1 (de) * 2003-11-14 2011-11-15 Baxter Int Alpha1-antitrypsin-zusammensetzungen und behandlungsverfahren unter verwendung dieser zusammensetzungen
SI1704234T1 (sl) * 2003-11-21 2012-08-31 Nps Pharma Inc Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov
ES2337684T3 (es) * 2003-12-05 2010-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Carboxipeptidasa b recombinante y su purificacion.
JP4896745B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-14 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒトインターフェロンポリペプチドおよびこれらの使用
PT1736541E (pt) 2004-03-29 2013-01-31 Galpharma Co Ltd Nova proteína galectina 9 modificada e sua utilização
US7250298B2 (en) * 2004-04-07 2007-07-31 The University Of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
EP1771205B1 (en) * 2004-06-18 2016-10-26 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
CA2569381A1 (en) * 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US20070105768A1 (en) * 2004-11-10 2007-05-10 Rajiv Nayar Dry recombinant human alpha 1-antitrypsin formulation
MX2007007580A (es) * 2004-12-22 2007-12-11 Ambrx Inc Hormona del crecimiento humana modificada.
US8080391B2 (en) 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
US7385028B2 (en) 2004-12-22 2008-06-10 Ambrx, Inc Derivatization of non-natural amino acids and polypeptides
CA2590429C (en) * 2004-12-22 2014-10-07 Ambrx, Inc. Compositions of aminoacyl-trna synthetase and uses thereof
WO2006071840A2 (en) * 2004-12-22 2006-07-06 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
ES2400582T3 (es) 2005-03-21 2013-04-10 Virobay, Inc. Compuestos de alfa cetoamida como inhibidores de cisteína proteasa
EP1891107B1 (en) 2005-05-12 2011-07-06 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
CA2609205A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
EP1937824B1 (en) * 2005-08-18 2013-03-13 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF tRNA AND USES THEREOF
MY146082A (en) * 2005-09-14 2012-06-29 Sanofi Aventis Deutschland Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin
WO2007053732A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Promoter polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
CN104710503B (zh) * 2005-11-08 2023-04-25 Ambrx 公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
US20090018029A1 (en) * 2005-11-16 2009-01-15 Ambrx, Inc. Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids
SG170116A1 (en) * 2005-12-14 2011-04-29 Ambrx Inc Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP2054431B1 (en) 2006-06-09 2011-08-31 Novartis AG Conformers of bacterial adhesins
KR20090051227A (ko) * 2006-09-08 2009-05-21 암브룩스, 인코포레이티드 척추동물 세포를 위한 하이브리드 서프레서 ｔＲＮＡ
AU2007292893B2 (en) * 2006-09-08 2012-03-01 Ambrx, Inc. Suppressor tRNA transcription in vertebrate cells
AU2007292903B2 (en) * 2006-09-08 2012-03-29 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or Fc scaffolds and their uses
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
US8288110B2 (en) * 2006-12-04 2012-10-16 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Biomarkers for detecting cancer
JP2010523084A (ja) * 2007-03-30 2010-07-15 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾ｆｇｆ−２１ポリペプチド
SG177941A1 (en) 2007-04-03 2012-02-28 Oxyrane Uk Ltd Glycosylation of molecules
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
JP4789012B2 (ja) * 2007-05-07 2011-10-05 株式会社ナガエ 物干装置
SG185263A1 (en) 2007-09-28 2012-11-29 Portola Pharm Inc Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same
US8268783B2 (en) 2007-09-28 2012-09-18 Portola Pharmaceuticals, Inc. Antidotes for factor Xa inhibitors and methods of using the same
CA2971794C (en) 2007-10-04 2020-03-24 Zymogenetics, Inc. B7 family member zb7h6 and related compositions and methods
WO2009059305A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
US8946148B2 (en) 2007-11-20 2015-02-03 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
WO2009073511A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
CA2712606A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
FR2927254B1 (fr) * 2008-02-12 2010-03-26 Lesaffre & Cie Utilisation de substances actives naturelles dans des compositions cosmetiques ou therapeutiques
US9200270B2 (en) * 2008-03-03 2015-12-01 Abbvie Inc. Methods for transforming yeast
JP2011523560A (ja) 2008-06-02 2011-08-18 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート インク． Ｘｂｐ１ペプチド、ｃｄ１３８ペプチドおよびｃｓ１ペプチド
NZ600382A (en) 2008-07-23 2013-11-29 Ambrx Inc Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
CN102232085A (zh) 2008-09-26 2011-11-02 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
KR101732054B1 (ko) 2008-09-26 2017-05-02 암브룩스, 인코포레이티드 비천연 아미노산 복제 의존성 미생물 및 백신
ITMI20090946A1 (it) 2009-05-28 2010-11-29 Novartis Ag Espressione di proteine ricombinanti
CN102625712B (zh) 2009-07-15 2017-07-25 博尔托拉制药公司 用于因子xa抑制剂的解毒剂的单位剂量制剂及其使用方法
CA2775938C (en) 2009-09-29 2021-08-10 Oxyrane Uk Limited Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose
CN102834509A (zh) 2009-11-19 2012-12-19 奥克西雷恩英国有限公司 生成哺乳动物样复合n-聚糖的酵母菌株
AU2010334383B2 (en) 2009-12-21 2014-10-02 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
AU2010341518B2 (en) 2009-12-21 2014-01-09 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
JP2013515080A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているウシのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
FR2954349A1 (fr) 2009-12-22 2011-06-24 Agronomique Inst Nat Rech Sulfatase modifiant selectivement les glycosaminoglycanes
US8617856B2 (en) * 2010-01-07 2013-12-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Fatty acid-producing hosts
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
SG10201506443TA (en) 2010-08-17 2015-10-29 Ambrx Inc Modified relaxin polypeptides and their uses
WO2012027494A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Bispecific targeting reagents
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
US9347050B2 (en) 2010-09-29 2016-05-24 Oxyrane Uk Limited Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated N-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
BR112013007263A2 (pt) 2010-09-29 2016-06-14 Oxyrane Uk Ltd desmanosilação de n-glicanos fosforilados
MX368546B (es) 2011-05-20 2019-10-07 Alderbio Holdings Llc Producción en alta pureza de proteínas multi-subunitarias tales como anticuerpos en microbios transformados tal como pichia pastoris.
CN103890178A (zh) 2011-08-19 2014-06-25 奥尔德生物控股有限责任公司 转化微生物如巴斯德毕赤酵母中多亚基蛋白如抗体的高滴度和高纯度生成的多拷贝方案
KR20140114818A (ko) 2011-12-30 2014-09-29 옥시레인 유케이 리미티드 재조합 단백질들의 분해를 감소시키기 위한 방법들 및 물질들
JP2015507929A (ja) 2012-02-14 2015-03-16 ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 第Ｘａ因子阻害剤に対する組み換え拮抗剤を製作するためのプロセス
US9249399B2 (en) 2012-03-15 2016-02-02 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for treatment of pompe's disease
US20140073022A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Production of polyhydroxyalkanoates with a defined composition from an unrelated carbon source
EP3919069A1 (en) 2012-11-05 2021-12-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Xbp1, cd138, and cs1 peptides, pharmaceutical compositions that include the peptides, and methods of using such peptides and compositions
EP2964758B1 (en) 2013-03-05 2020-05-27 Oxyrane UK Limited Production of catalytically active type i sulfatase
KR102202477B1 (ko) 2013-03-15 2021-01-13 룬드벡 시애틀 바이오파마슈티컬즈, 인크. 효모 및 기타 형질전환 세포에서 폴리펩티드의 고수율 발현을 위한 온도 전환
EP3754012A1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring
CN105143243B (zh) 2013-03-21 2020-03-13 国家科学和工业研究组织 三螺旋蛋白的纯化
WO2015031950A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified bacterial collagen-like proteins
US9708630B1 (en) 2013-10-08 2017-07-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Cells and methods for producing fatty alcohols
TWI705071B (zh) 2014-10-24 2020-09-21 美商必治妥美雅史谷比公司 經修飾之fgf-21多肽及其用途
WO2016120764A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides
WO2016186948A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Gfp-derived fusion tags for protein expression
US10301653B2 (en) 2015-07-06 2019-05-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use
US10287338B2 (en) 2015-07-10 2019-05-14 Miran NERSISSIAN Factor VIII protein compositions and methods of treating of hemophilia A
CA3001364A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Genzyme Corporation Improved flare (flow cytometry attenuated reporter expression) technology for rapid bulk sorting
EP3393501B1 (en) 2015-12-24 2023-06-07 Oxyrane UK Limited Human alpha-n-acetylgalactosaminidase polypeptide
US10421951B2 (en) 2016-06-22 2019-09-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Gene construct encoding mutant thioesterase, mutant thioesterase encoded thereby, transformed host cell containing the gene construct, and method of using them to produce medium-chain fatty acids
SG11201903018WA (en) 2016-10-07 2019-05-30 Genzyme Corp Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production
MX2019008449A (es) 2017-02-08 2019-09-09 Bristol Myers Squibb Co Polipetidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos.
KR20200047660A (ko) 2017-09-01 2020-05-07 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 암의 치료를 위한 bcma 및 taci 항원에 특이적인 면역원성 펩타이드
EP3700930A1 (en) 2017-10-25 2020-09-02 The Regents of the University of California Antibodies against cdcp1 for the treatment and detection of cancer
EP3505181B1 (en) 2017-12-28 2021-07-07 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center Preparation of enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis iiid
US20220118018A1 (en) 2019-03-06 2022-04-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T cell receptors specific to b-cell maturation antigen for treatment of cancer
EP4010379A4 (en) 2019-08-08 2023-12-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREPARING FACTOR XA AND ITS DERIVATIVES
US20230183759A1 (en) 2020-05-20 2023-06-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Cells and methods for producing methyl ketones
JP2024518537A (ja) 2021-05-12 2024-05-01 サーキュラー インダストリーズ ホールディング プライベート リミテッド 脂肪酸原料からアセトン及び／又はイソプロパノールを産生するための組換え酵母
NL2031833B1 (en) 2022-05-11 2023-11-17 Univ Leiden Immunotherapeutic compositions and adjuvants
WO2024032891A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Vib Vzw Glyco-engineered yeast for therapeutic protein production

Also Published As

Publication number Publication date
IL87980A0 (en) 1989-03-31
US4929555A (en) 1990-05-29
JPH01128790A (ja) 1989-05-22
EP0312934A3 (en) 1990-03-28
AU596546B2 (en) 1990-05-03
AU2376788A (en) 1989-04-20
DK579988A (da) 1989-04-20
NO884348D0 (no) 1988-09-30
EP0312934A2 (en) 1989-04-26
DK579988D0 (da) 1988-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO884348L (no) Pichia-transformasjon.
CA1297438C (en) Transformation of yeasts of the genus pichia
EP0226752B1 (en) Method for high-level expression of polypeptides in yeast of the genus Pichia
US4837148A (en) Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
Robinson et al. Transformation of the bioherbicide Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene by electroporation of germinated conidia
Wernars et al. Cotransformation of Aspergillus nidulans: a tool for replacing fungal genes
Mutasa et al. Molecular organisation of an A mating type factor of the basidiomycete fungus Coprinus cinereus
NO854333L (no) Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia.
DE69637359T2 (de) Nucleinsäuresequenz xlnR des Regulators XylR des xylanolytischen Biosyntheseweges aus Aspergillus niger
Haas et al. Development of an integrative DNA transformation system for the yeast Candida tropicalis
Friel et al. Separate and combined disruptions of two exo-β-1, 3-glucanase genes decrease the efficiency of Pichia anomala (strain K) biocontrol against Botrytis cinerea on apple
Van Dijk et al. Tagging Hansenula polymorpha genes by random integration of linear DNA fragments (RALF)
Calmels et al. High efficiency transformation of Tolypocladium geodes conidiospores to phleomycin resistance
JP2559689B2 (ja) ヤロウイア・リポリテイカの形質転換方法
US9458469B2 (en) Method for obtaining improved strains of yeast
CA2137824C (en) Yeast strains expressing the lactic ldh gene, and vectors which can be used for obtaining said strains
JP2001501475A (ja) カンジダ・ウチリスにおけるトランスフォーメーション系
DE3788764T2 (de) Penicilliumtransformanten und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Ushio et al. Construction of a host-vector system in the osmophilic haploid yeast Zygosaccharomyces rouxii
Miret et al. Polyamines and cell wall organization in Saccharomyces cerevisiae
Simon et al. A rapid and efficient procedure for transformation of intact Saccharomyces cerevisiae by electroporation
Curran et al. Protoplast fusion in Saccharomyces cerevisiae
Gjermansen Mutagenesis and genetic transformation of meiotic segregants of lager yeast
Boylan et al. Saccharomyces cerevisiae centromere CEN11 does not induce chromosome instability when integrated into the Aspergillus nidulans genome
JPH0771472B2 (ja) 尿素非生産性実用醸造酵母