NO884348L - Pichia-transformasjon. - Google Patents

Pichia-transformasjon.

Info

Publication number
NO884348L
NO884348L NO88884348A NO884348A NO884348L NO 884348 L NO884348 L NO 884348L NO 88884348 A NO88884348 A NO 88884348A NO 884348 A NO884348 A NO 884348A NO 884348 L NO884348 L NO 884348L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
suspension
solution
dna
concentration
Prior art date
Application number
NO88884348A
Other languages
English (en)
Other versions
NO884348D0 (no
Inventor
James Michael Cregg
Kevin James Barringer
Original Assignee
Phillips Petroleum Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Phillips Petroleum Co filed Critical Phillips Petroleum Co
Publication of NO884348D0 publication Critical patent/NO884348D0/no
Publication of NO884348L publication Critical patent/NO884348L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Description

Oppfinnelsen angår molekularbiologi og genteknikk.
Nærmere bestemt angår en side ved oppfinnelsen en fremgangsmåte til å gjøre gjærceller av slekten Pichia kompetente for transformasjon med DNA som er fremmed i forhold til cellene. En annen side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til transformasjon av slike celler med slik DNA.
Et viktig trinn i genteknikken for å få celler til å utføre
en ønsket funksjon, såsom produksjon av et ønsket protein,
er å transformere cellene med et DNA som innbefatter den genetiske informasjon som er nødvendig for at cellene skal utføre funksjonen. Før cellene kan transformeres med et DNA må de imidlertid behandles for å gjøres kompetente for transforma-sjonen .
Transformasjon av gjærceller byr på spesielle problemer, fordi slike celler har cellevegger foruten plasmamembraner som bar-rierer mot inntrengning av DNA.
En vanlig fremgangsmåte til transformasjon av gjærceller er først å danne sfæroplaster fra cellene ved enzymatisk digerering av celleveggene fra cellene, deretter behandling av sfæroplastene for å transformere dem med det ønskede DNA og til slutt behandling av de transformerte sfæroplaster for å regenerere de hele celler, fullstendige med cellevegger.
En typisk transformasjonsprosess som anvender sfæroplaster
av celler av den metylotrofe gjærart Pichia pastoris, er beskrevet av Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
Anvendelsen av sfæroplaster for transformasjon av gjærceller byr på en rekke ulemper forbundet med den osmotiske følsomhet av sfæroplaster og behovet for først å fremstille sfæroplaster og deretter på nytt å danne hele celler fra dem. Som er erkjen-nelse av disse problemer, har anstrengelser vært gjort innen faget for å konstruere fremgangsmåter til transformering av hele gjærceller.
Således har Ito et al., J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983), rapportert en fremgangsmåte for å gjøre kompetente for transformasjon og transformere hele celler av Saccharomyces cerevisiae. Fremgangsmåten i henhold til Ito et al. omfatter inkubasjon av hele celler av Saccharomyces cerevisiae i en vandig oppløsning, buffret på en pH-verdi på ca. 8 av et salt av
et alkalimetall for å gjøre cellene kompetente for transformasjon, inkubering av de kompetente, hele celler i en oppløsning igjen buffret til en pH-verdi på ca. 8 med det DNA med hvilket cellene skal transformeres og et salt av et alkalimetall,
tilsetning av polyetenglykol til DNA-oppløsningen som bader cellene, hvilken polyetenglykol har en midlere molekylvekt på ca. 4000, å bringe polyetenglykolkonsentrasjonen på ca.
35% (w/v), inkubasjon av cellene i den resulterende oppløsning og varmesjokkbehandling (heat shocking) av cellene ved suspensjon av oppløsningen i et vannbad ved 42°C i 5 min og deretter returnere oppløsningen til værelsestemperatur. Blant saltene
av alkalimetaller som ble utprøvet av Ito et al. ved 0,1 M konsentrasjon i både oppløsningen for å gjøre cellene kompetente for transformasjon og transformasjonsoppløsningen (før tilsetning av polyetenglykol), førte litiumklorid til 4-8 ganger flere transformanter pr. mikrogram transformasjons-DNA enn natriumklorid. Videre, blant de litiumsalter som ble utprøvet, gav litiumklorid et betydelig lavere antall transformanter pr. mikrogram transformasjons-DNA enn litiumacetat, litiumnitrat og litiumsulfat, som alle gav tilnærmet det samme antall transformanter. Ito et al. rapporterte at sirkelformet plasmid-DNA transformerte alkalimetallsalt-behandlede hele
celler mer effektivt enn linearisert plasmid-DNA, og at celler fra middels- til sen-logfasekulturer, når de ble behandlet med et alkalimetallsalt, ble transformert mer effektivt enn celler fra sen-log til stasjonære fasekulturer. Ito et al.
rapporterte maksimal transformasjonsvirkningsgrad når for-holdet mellom konsentrasjonen av celler behandlet med saltet av et alkalimetall og konsentrasjonen av alkalimetallsaltet
11 12
var mellom 10 og 10 celler pr. mol.
Davidow et al., Curr. Genet. 10, 39-48 (1985), rapporterte
en fremgangsmåte til å gjøre kompetent for transformasjon og transformering av hele celler fra gjæren Yarrowia lipolytica. Fremgangsmåten ifølge Davidow et al. omfatter inkubasjon av hele celler av Yarrowia lipolytica ved ca. 10 g celler pr. ml i en vandig oppløsning, buffret ved en pH-verdi på
ca. 7,5 av 0,1 M litiumacetat for å gjøre cellene kompetente for transformasjon, inkubasjon av de kompetente, hele celler i en oppløsning igjen buffret til en pH-verdi på ca. 7,5 av det DNA med hvilket cellene skal transformeres, heterologt bærer-DNA (E. coli-DNA) Haelll-digerert til et størrelses-område på mindre enn kilobasepar og 0,1 M litiumacetat, tilsetning til den DNA-oppløsning som bader cellene av en opp-løsning av 0,1 M litiumacetat buffret til en pH-verdi på ca. 7,5 og inneholdende ca. 40% (w/v) polyetenglykol med en midlere molekylvekt på ca. 4000, for å bringe polyetenglykolkonsentrasjonen på ca. 35% (w/v) i den DNA-holdige oppløsning, inkubasjon av den resulterende oppløsning og underkastelse av cellene i polyetenglykoloppløsningen for et varmesjokk ved suspensjon av oppløsningen ved 37°C i noen minutter. I motsetning til Ito et al. rapporterte Davidow et al. at sirkulært plasmid-DNA transformerte litiumacetat-behandlede hele celler mindre effektivt enn linearisert plasmid-DNA. I likhet med Ito et al. fant Davidow et al. at celler fra kulturer i senere stadier av vekst gav flere transformanter pr. mikrogram transformerende DNA enn celler fra kulturer i tidligere veksttrinn. Davidow et al. rapporterte at ikke med-enn ca.
50 mikrogram av det Haelll-digererte bærer-DNA pr. mikrogram
transformerende DNA i betydelig grad øket antallet transformanter som ble oppnådd pr. mikrogram transformerende DNA og lydbehandlet (sonicated) E. coli-DNA (størrelsesområde 0,5-9 kbp) som bærer som forelå i en mengde av 10 mikrogram pr. mikrogram transformerende DNA førte til bare halvparten så mange transformanter pr. mikrogram transformerende DNA som Haelll-digerert E. coli-DNA (størrelsesområde mindre enn 1 kbp) som bærer som også forelå i en mengde av 50 mikrogram pr. mikrogram transformerende DNA.
De avvikende resultater oppnådd av Ito et al. og Davidow et al. viser uforutsigbarheten av virkningsgraden for en hvilken som helst spesiell gjærart for fremgangsmåter til å gjøre kompetente for transformasjon og transformere hele celler. Hvorvidt fremgangsmåter som er funnet å være effektive for en gjærart, vil være effektive for andre arter som fremgangsmåtene ikke er blitt utprøvet på, er faktisk meget usikkert. Hvilke egenskaper av celleveggene og tilhørende membraner som virker inn på kompetanse for transformasjon og transformasjonsvirkningsgrad er fortsatt uklart for alle arter og særlig gjærarter. Det antas at de kjemiske og fysiske egenskaper av cellevegger og membraner avviker vesentlig blant gjærarter, men hvordan disse forskjeller kan virke inn på fremgangsmåter for å gjøre gjærarter kompetente for transformasjon eller for å transformere dem, og virkningsgraden med hvilken en hvilken som helst spesiell fremgangsmåte vil fungere for en spesiell art, forblir ukjent.
Jo lengre fra hverandre to gjærarter står taksonomisk sett, desto mindre sannsynlig er det at observasjoner angående metoder til transformasjon av hele celler utført med en av artene, vil gjelde for den annen. Spesielt er ingen ting kjent i faget om transformasjonsmetoder for hele celler anvendt på metylotrofe gjærarter, såsom arter av Pichia pastoris. Metylotrofe gjærarter avviker betydelig i en rekke egenskaper innbefattet egenskaper som er aktuelle for fremgangsmåter til å gjøre celler kompetente for transformasjon og for å transformere dem, i forhold til ikke-metylotrofe gjærater, såsom S. cerevisiae og Y. lipolytica.
Det er nå funnet at hele celler av metylotrofe arter av slekten Pichia kan gjøres kompetente for transformasjon ved inkubasjon i en buffret oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat. Videre er det, uventet, funnet at slike celler som er gjort kompetente for transformasjon ved en slik fremgangsmåte, kan fryses og lagres i den frosne tilstand inntil bruk, med liten reduksjon i den virkningsgrad med hvilken cellene kan transformeres. Frossen lagring er vanskelig med sfæroplaster av slike celler, slik at mange praktiske fordeler ved slik lagring ikke kunne realiseres for slike celler forut for den foreliggende oppfinnelse.
Det er også funnet at hele celler at metylotrofe arter av slekten Pichia, etter å være blitt gjort kompetente for transformasjon ved inkubasjon i en buffret oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat, kan transformeres med et ønsket DNA ved inkubasjon med en buffret oppløsning av dette DNA
og litiumklorid eller litiumsulfat, fulgt av tilsetning til oppløsningen inntil en konsentrasjon på mellom 20 og 50%
(w/v), fortrinnsvis 35% (w/v), av polyetenglykol med en midlere molekylvekt på mellom 3000 og 5000 dalton, fortrinnsvis 3350 dalton, og etterfølgende inkubasjon av den polyeten-glykolholdige oppløsning og deretter varmesjokkbehandling av oppløsningen. Det er videre funnet, ganske uventet, at denne transformasjonsmetode har visse betydelige fordeler over fremgangsmåter for transformasjon av slike celler som anvender sfæroplaster av cellene. Spesielt gir fremgangsmåten som anvender hele celler transformanter som, fordi de ikke er innleiret i agar, vokser betydelig hurtigere enn transformanter fremstilt ved bruk av sfæroplaster.
Den foreliggende oppfinnelse omfatter en ny og uventet fordelaktig fremgangsmåte til fremstilling av hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia som er kompetent for transformasjon, hvilken fremgangsmåte omfatter å opprettholde de nevnte celler i suspensjon i minst ca. 45 min ved en konsentrasjon på o mellom ca. 5 x 10 7 og 5 x 10 8, fortrinnsvis ca. 5 x 10 g celler pr. ml i en vandig oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat ved en konsentrasjon på mellom 50 mM og 500 mM, hvilken oppløsning holdes på en temperatur mellom 27°C og 33°C og er buffret ved en pH-verdi på mellom 7 og 8, fortrinnsvis ca. 7 .
Oppfinnelsen omfatter videre en ny og fordelaktig fremgangsmåte til å transformere hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia med et ønsket DNA, hvilken fremgangsmåte omfatter:
(1) å skaffe celler av arten som er blitt gjort kompetente for transformasjon ved en fremgangsmåte som omfatter å holde de nevnte celler i suspensjon i minst ca. 45 min ved en konsentrasjon på o mellom 5 x 10 7 og 5 x 10 8 celler pr. ml i en første vandig oppløsning av litiumklorid eller litiumsulfat ved en konsentrasjon på mellom 50 mM og 500 mM, hvilken nenvte første oppløsning holdes på en temperatur på mellom 27°C og 33°C og er buffret på en pH-verdi på mellom 7 og 8; (2) å fremstille en annen suspensjon av celler ved å kombi-nere (a) en første suspensjon av de nevnte kompetente celler ved en konsentrasjon på o mellom 5 x 10 7 og 5 x 10 8 celler pr. ml i en annen vandig oppløsning omfattende et salt av litium, som er det samme som det første salt av litium, ved en konsentrasjon på mellom 50 mM og 500 mM og buffret på en pH-verdi på mellom 6 og 8, med (b) en tredje vandig oppløsning med et volum som er mindre enn 0,2 ganger så stort som den første suspensjon, hvilken tredje oppløsning er buffret på en pH-verdi på mellom 7 og 8 og omfatter mellom 1 ng og 20^ug av det ønskede DNA pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning, forutsatt at dersom den nevnte mengde av det nevnte ønskede DNA er mindre enn ca. 10 pq pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning, omfatter den nevnte tredje oppløs-ning en masse av bærer-DNA på 10 p. q, videre forutsatt at mengdene av det nevnte ønskede DNA og den nevnte bærer-DNA er slik at mengden av den nevnte bærer-DNA ikke overstiger 50 p. q pr. liter av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning; (3) å inkubere minst en porsjon av den nevnte annen suspensjon fremstilt i trinn (2) på mellom 27°C og 33°C i minst 10-60 min, fortrinnsvis ca. 30 min; (4) å fremstille en tredje suspensjon av de nevnte celler
ved blanding, for å opprette stort sett homogen polyetenglykol-konsentrasjon i den nevnte tredje suspensjon, minst en porsjon av porsjonen av den nevnte annen suspensjon inkubert i henhold
til trinn (3) med en fjerde vandig oppløsning som har et volum på mellom 5 og 10 ganger, fortrinnsvis 7 ganger volumet av den porsjon av den nevnte inkuberte annen suspensjon, med hvilken den fjerde oppløsning blandes, idet den nevnte fjerde oppløsning stort sett består av 20-50% (w/v), fortrinnsvis 35%, polyetenglykol med midlere molekylvekt på mellom 3000
og 5000 dalton, fortrinnsvis 3350 dalton, i en oppløsning med den samme sammensetning som den nevnte annen oppløsning; (5) å inkubere minst en porsjon av den tredje suspensjon fremstilt i trinn (4) på mellom 27°C og 33°C i minst 10-60 min, fortrinnsvis ca. 30 min; og (6) å varmesjokkbehandle minst en porsjon av den porsjon av den tredje suspensjon som inkuberes i henhold til trinn (5).
Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis
på celler av den metylotrofe art Pichia pastoris. Videre blir fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis anvendt på en auxotrof mutantstamme av Pichia pastoris, hvor den genetiske basis av mutasjonen eller mutasjonene er tilstrekkelig godtkarakterisertog for hvilken gener er blitt isolert som er i stand til, ved transformasjon inn i mutantstammen, å komple-mentere den mutante fenotype av stammen og derved skaffe transformanter som er prototrofe for den fenotype som svarer til den auxotrofe mutasjon, og kan velges på basis-av slik prototrofi. En rekke slike auxotrofe mutantstammer av P. pastoris er kjent i faget, innbefattet stamme GS115, en histidinkrevende stamme, på grunn av en mutasjon i HIS4-genet og stamme PPF1, en histidin- og argininkrevende stamme på grunn av mutasjoner i HIS4- og ARG4-genene.
Kulturer av stammer GS115 og PPFl ble deponert under betingelsene i henhold til Budapest-avtalen om deponering av mikro-organismer for patentsøknader (Budapest Treaty on the Inter-national. Recognition of the Deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure), henholdsvis den 31. august
1984 og 22. oktober 1985, ved the Northern Regional Research
Laboratory Culture Depository, De Forente Staters landbruks-departement, Peoria, Illinois, USA. De deponerte kulturer av begge stammer ble akseptert av deponeringsstedet under betingelsene i avtalen. Deponeringen av kulturen av stamme GS115 ble gitt deponeringsnummer Y-15851. Deponeringen av kulturen av stamme PPFl ble gitt deponeringsnummer Y-18017.
Skjønt fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for
å fremstille transformanter som velges ved bruk av en dominerende selekterbar markør, såsom G418-resistens, skaffet av et heterologt gen på DNA som transformeres inn i cellene som skal transformeres, er det funnet at transformasjonsvirkningsgraden (dvs. antall transformanter som fås pr. enhet masse av ønsket DNA pr. celle som anvendes i den annen suspensjon) er meget lavere når seleksjonen anvender en dominerende selekterbar markør enn når den er basert på komplementering av en auxotrof mutasjon.
Transformasjonsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes med praktisk talt et hvilket som helst DNA som det ønskes,
og som er istand til å bli, transformert inn i en celle av
en metylotrof art av Pichia pastoris for å meddele den nevnte celle en ønsket fenotype, såsom evnen til å uttrykke et ønsket protein. Som fagfolk vil forstå, inneholder slikt DNA vanligvis fra 20 til 5 kilobasepar. I virkeligheten vil et slikt ønsket DNA vanligvis være kortene enn ca. 20 kilobasepar,
og vil innbefatte et gen som meddeler transformanter en fenotype ved hvilken de kan velges fra utransformerte celler samt et gen som kan uttrykkes i transformantene for å produsere et protein, hvilket skaffer den ønskede fenotype av de transformerte celler. Et ønsket DNA som skal transformeres inn i cellene i henhold til oppfinnelsen, kan være et sirkulært plasmid som kan opprettholdes i transformanter med stabilitet som i det minste er tilstrekkelig til å, på målbar måte, meddele transformantene den ønskede fenotype, eller et linearisert plasmid eller annet lineært DNA som kan integreres inn i genomet av transformantene, fortrinnsvis ved et på forhånd valgt locus deri, som f.eks. locuset av det viktigste alkohol-
oksidasegen (AOXl-gen), og, som integrert DNA, meddele transformantene den ønskede fenotype. Eksempler på ønskede DNA-mate-rialer og fremgangsmåter til å identifisere transformanter dermed, er kjent i faget. Det er funnet at virkningsgraden av transformasjon med transformasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen er meget høyere med linearisert plasmid-DNA enn med sirkelformet DNA.
Alkalimetallsalter for bruk i henhold til oppfinnelsen er litiumklorid og litiumsulfat. Litiumklorid er mest foretrukket.
Et hvilket som helst salt som kan buffre oppløsningene og suspensjonene som anvendes i henhold til oppfinnelsen på en pH-verdi på 7-8, fortrinnsvis ca. 7, og som er ikke-giftig for cellene som skal transformeres, kan anvendes i henhold til oppfinnelsen. Fagfolk kjenner til mange slike salter.
Det som er mest foretrukket er Tris-HCl, på en konsentrasjon mellom 1 mM og 100 mM. Oppløsningene og suspensjonene som anvendes i oppfinnelsen innbefatter fortrinnsvis også "EDTA", ved hvilket skal forstås kollektivt alle former, fullstendig protonatisert og anioniske, av etendiamintetraacetat, ved en konsentrasjon på mellom 0,1 mM og 10 mM.
Det polyetenglykol som anvendes i transformasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en midlere molekylvekt på mellom 3000 og 4000 dalton, helst 3350.
Det bærer-DNA som anvendes i transformasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen, valgfritt i alle transformasjoner i henhold til fremgangsmåten, men nødvendigvis når konsentrasjonen av ønsket DNA er mindre enn 10 ;ag pr, ml av den nevnte første suspensjon (som er kombinert med den tredje oppløsning for å fremstille den annen suspensjon), er DNA som er fremmed for Pichia, såsom E. coli-DNA, laksesperm-DNA, sildesperm-DNA eller lignende. Bærer-DNA, slik det vil forstås av fagfolk, underkastes skjærbehandling ved en fremgangsmåte såsom lyd-behandling eller digerering med et restriksjonsenzym. Skjønt slikt DNA kan ha fra 15 til 0,5 kilobasepar, har bærer-DNA fortrinnsvis en midlere størrelse på mindre enn ca. 1 kilobasepar. Et for tiden foretrukket bærer-DNA er E. coli-DNA digerert fullstendig med restriksjonsenzymet Haelll.
Oppfinnelsen skal nå belyses i detalj i de følgende eksempler.
EKSEMPEL I
Fremstilling av kompetente celler for transformasjon
En 50 ml<1>s kultur av Pichia pastoris ble dyrket i YPD (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% dekstrose) ved 30°C med risting og cellene ble høstet ved logaritmisk fase, dvs. en OD^qq på ca. 1 (ca. 5 x 10^ til ca. 5 x 10^ celler pr. ml). Celler som ble høstet ved logaritmisk fase ble mer effektivt transformert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen enn de som var i sen logaritmisk eller stasjonær fase (i motsetning til observasjonene gjort av Ito et al. og Davidow et al., som angitt ovenfor). Høsting ble utført ved sentrifugering av kulturen ved 5-10°C ved 1500 x g i 10 min, og supernatanten ble kassert.
Cellepelleten fra høstingen ble vasket én gang ved suspensjon
i 10 ml sterilt vann, fulgt av sentrifugering som angitt i avsnittet ovenfor. Igjen ble supernatanten kassert.
Pelleten ble deretter vasket ved at den ble suspendert i steril TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA), fulgt av sentrifugering ved 5-10°C ved 1500 x g i 10 min. Igjen ble supernatanten kassert.
Cellene ble deretter suspendert i et volum av TE-buffer supplert med 0,1 mM LiCl for å bringe cellene på en konsentrasjon av 1,5 x 10 gceller pr. ml. Denne suspensjon ble inkubert ved 30°C i 1 time i en risteluft-inkubator (shaking air incu-bator) (200-250 omdreininger pr. min). Inkubasjonsperioder kortere enn 45 min er funnet å redusere transformasjonsvirkningsgraden med en faktor på 10-20, sammenlignet med perioder på 1 time eller lengre. Inkubasjonsperioder på inntil 2 timer er funnet å ikke ha noen vesentlig innvirkning på transforma-sjonsfrekvensen sammenlignet med inkubasjoner på 1 time.
Etter inkubasjonen var cellene kompetente for transformasjon og kunne anvendes straks for transformasjon, kunne lagres over nattel ved 4°C uten nevneverdig tap av transformasjonsvirkningsgrad eller kunne lagres for lengre perioder som følger: For å lagre de kompetente celler i frossen tilstand, høstes cellene etter inkubasjonen som beskrevet i det foregående avsnitt ved sentrifugering ved 5-10°C ved 1500 x g i 10 min og deretter kasseres supernatanten. Pelleten resuspenderes deretter i et volum som bringer konsentrasjonen av celler til 2,5 x 10 g celler pr. ml av en oppløsning av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl, fremstilt som 15% (v/v) i dimetylsulfoksid. Den resulterende suspensjon overføres til sterile rør i 0,5 ml's porsjoner og rørene fryses på tørris og lagres ved -70°C.
Frosne kompetente celler ble fremstilt for transformasjon
ved at et rør med celler ble tatt ut av fryseren og tint på
is. Den tinte oppløsning ble deretter sentrifugert i en mikro-fuge av laboratorietypen (benchtop) for å pelletere celler og supernatanten ble kassert. Deretter ble pelleten vasket ved suspensjon i et volum'som var slik at konsentrasjonen av cellene ble bragt på o 1,5 x 10 8 celler pr. ml av en oppløsning av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl, bragt på 15% (v/v) i dimetylsulfoksid fulgt av sentrifugering ved 5-10°C ved 1500
x g i 10 min og kassering av supernatanten. Pelleten ble deretter resuspendert i et volum som bragte konsentrasjonen av celler på o 1,5 x 10 8 celler pr. ml av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl.
Kompetente celler, frosset og tint og preparert for transformasjon som beskrevet i dette eksempel, har tilnærmet en fem-dobbelt reduksjon i transformasjonsvirkningsgrad uavhengig av lengden av lagringen.
Fagfolk vil innse at de forskjellige vasketrinn som er beskrevet i dette eksempel, skjønt de er i overensstemmelse med god mikrobiologisk praksis og muligens er nyttige for opp-rettholdelse av transformasjonsvirkningsgraden av kompetente celler, ikke er nødvendige for å gjøre cellene kompetente.
Det trinn som er nødvendig for å gjøre cellene kompetente
er inkubasjonen i minst 45 min ved en temperatur i området 27-33°C, fortrinnsvis 30°C, av suspensjonen av cellene i TE-buffer supplert med LiCl.
pH-verdien av de TE-buffrede oppløsninger som er beskrevet i disse eksempler, er fortrinnsvis ca. 7,4, men kan ligge i området 7-7,8 uten. vesentlig ugunstige virkninger på trans-formas j onsvirkningsgraden eller annet.
EKSEMPEL II
Tranformasjon av celler
Til et sterilt 12 x 75 mm polypropenrør ble der tilsatt: 10
p. q Haelll-digerert E. coli-DNA som bærer-DNA og Ing - 20^g av det ønskede DNA (fortrinnsvis linearisert plasmid DNA med endepunkter til å dirigere DNA til integrasjon ved et på forhånd bestemt locus av den transformerte stammes genom) i mindre enn 20 _ul TE-buffer og 100^ul kompetente celler (ca. 1,5 x 10 celler) i TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl. Blandingen ble deretter inkubert ved 30°C (27-33°C) i 30 min (fra 10
min til 1 time). Etter inkubasjonen ble 0,7 ml av en oppløs-ning av TE-buffer supplert med 0,1 M LiCl, bragt på 40% (v/v) med polyetenglykol av midlere molekylvekt på 3350 dalton ("PEG2350")'satt til inkubasjonsblandingen og den resulterende suspensjon ble svirret ganske kort for å dispergere PEG homogent. Den PEG-holdige suspensjon ble deretter inkubert ved 30°C i 30 min i et stasjonært vannbad. Til slutt ble suspensjonen underkastet varmesjokk ved neddykking ved 37°C (35-39°C) i 5 min (2-10 min) i et stasjonært vannbad, fulgt av kassering av supernatanten. Til slutt, før sortering for transformanter, ble pelleten resuspendert i 0,1 ml sterilt vann.
Sortering for transformanter kan utføres ved at den endelige suspensjon av celler i vann spres på en selektiv plate (f.eks. i tilfellet for P. pastoris-stammen GS115 transformert med et ønsket DNA som komplementerer HIS4-mutasjonen, agar med 0,67% gjærnitrogenbase, uten aminosyrer, pluss 2% glukose), inkubasjon av platen i 3 dager ved 30°C og deretter identifi-sering av trnasformanter ved veksten av kolonier på platen.
Transformerte kolonier kan utvinnes for ytterligere analyse eller for bruk ved tilsetning av sterilt vann til platen og deretter avskrapning av koloniene fra agaroverflaten og over-føring av disse til rør.
EKSEMPEL III
Ved bruk av fremgangsmåten i eksempel II, ble celler av Pichia pastoris GS115 og Pichia pastoris PPFl transformert med de variasjoner som er angitt med plasmid betegnet pYJ30 (NRRL nr. B-15890 pYJ30 i E. coli) enten ikke-kuttet eller kuttet med Stul. Cellene ble benyttet straks etter at de var blitt gjort kompetente på samme måte som i eksempel I. De følgende transformasjonsvirkningsgrader ble oppnådd.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til å gjøre hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia kompetente for transformasjon, karakterisert ved at de nevnte celler opprettholdes i suspensjon i en tid på 45-120 min ved en celle-konsentrasjon i områo det 5 x 10 7 - 5 x 10 8 celler pr. ml i en vandig oppløsning av et ikke-giftig salt av et alkalimetall valgt fra LiCl og Li2 SO^ i en konsentrasjon på 50-500 mM, og den nevnte oppløsning holdes på en temperatur i området 27-33°C og buffres på en pH-verdi i området 6-8, fortrinnsvis 7-8.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte vandige oppløsning buffres med Tris-HCl ved en konsentrasjon på 1-100 mM og omfatter EDTA med en konsentrasjon på 0,1-10 mM og har en pH-verdi på 7,4.
3. Fremgangsmåte til transformasjon av hele celler av en metylotrof art av slekten Pichia med et ønsket DNA, karakterisert ved at (1) der skaffes en første suspensjon med 5 x 10^ 5 x 10 g kompetente celler pr. ml i en første vandig oppløsning som har en konsentrasjon på 50-500 mM av et ikke-giftig alkalimetallsalt valgt fra LiCl og Li2 S04 og som er buffret på en pH-verdi av 6-8; (2) der fremstilles en annen suspensjon av kompetente celler ved kombinasjon av (a) den nevnte første suspensjon av de nevnte kompetente celler i en annen vandig oppløsning omfattende det samme alkalimetallsalt som det som anvendes i trinn (1) og (b) en tredje vandig oppløsning med et volum på mindre enn 0,2 ganger volumet av den nevnte første suspensjon, hvilken tredje vandige oppløsning er buffret på en pH-verdi av 7-8 og omfatter mellom 1 ng og 20 p. q ønsket DNA pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning; (3) minst en porsjon av den nevnte annen suspensjon fremstilt i trinn (2) inkuberes ved en temperatur på 27-33°C i et tidsrom på 10-60 min; (4) en tredje suspensjon av de nevnte celler fremstilles ved at man blander, for etablering av stort sett homogen poly-etenglykolkonsentrasjon i den nevnte tredje suspensjon, i det minste en porsjon av porsjonen av den nevnte annen suspensjon, inkubert som angitt i trinn (3) med en fjerde vandig oppløsning som har et volum som er 5-10 ganger så stort som volumet av den porsjon av den nevnte inkuberte annen suspensjon med hvilken den fjerde oppløsning blandes, hvilken fjerde oppløsning består stort sett av 20-50% (w/w) polyetenglykol med en midlere molekylvekt på 3000-5000 dalton i en oppløsning med den samme sammensetning som den nevnte annen oppløsning; (5) minst en porsjon av den nevnte tredje suspensjon fremstilt i trinn (4) inkuberes ved en temperatur på 27-33°C i en tid på 10-60 min; og (6) minst en porsjon av den porsjon av den tredje suspensjon som inkuberes i henhold til trinn (5) underkastes varme-sj okkbehandiing.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3 , karakterisert ved at de nevnte celler er blitt gjort kompetente ved en fremgangsmåte som angitt i krav 1.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at hver av de nevnte annen og tredje oppløsninger som er buffret med Tris-HCl med en konsentrasjon på 1-100 mM, omfatter EDTA med en konsentrasjon på 0,1-10 mM og har en pH-verdi på 7,0-7,8.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at konsentrasjonen av g celler i den nevnte første suspensjon er 1,0 x 10 - 2,5 x
10 g celler pr. ml, mengden av ønsket DNA i den nevnte tredje oppløsning er_fra 1 ng til 20 p. g pr. ml av den nevnte første suspensjon, den nevnte tredje oppløsning omfatter tilnærmet 10 p. q av bærer-DNA og varmesjokkbehandlingen består stort sett av å inkubere en porsjon av den nevnte tredje suspensjon som er inkubert i henhold til trinn (5) ved en temperatur på 35-39°C i en tid på 2-10 min, fulgt av redusering av tem-peraturen av den nevnte varmesjokkbehandlede porsjon til under ca. 3 3°C.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at når mengden av ønsket DNA er mindre enn tilnærmet 10 p. q pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning, omfatter den nevnte tredje oppløsning en masse av bærer-DNA på 10 p. q og videre at mengden av det nevnte bærer-DNA ikke overstiger 50^u g pr. ml av den nevnte første suspensjon kombinert med den nevnte tredje oppløsning.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at de transformerte celler ifølge trinn (6) utvinnes fra den nevnte tredje suspensjon og deretter sorteres for transformanter.
9. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den nevnte Pichia-art er Pichia pastoris.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 og 5 eller 6, karakterisert ved at cellene av Pichia pastoris er av en stamme som har en auxotrof mutasjon, hvor det ønskede DNA er et lineært DNA som kan integrere ved et på forhånd valgt locus i Pichia pastoris-genomet og som omfatter et gen for en selekterbar markør som komplementerer den nevnte auxotrofe mutasjon, og hvor, etter varmesjokkbehand-lingstrinnet, transformatene velges på basis av prototrofi for den fenotype som skyldes den nevnte auxotrofe mutasjon, særlig hvor den nevnte Pichia pastoris er GS115 (NRRL Y-15851), eller den nevnte Pichia pastoris er.PPFl (NRRL Y-18017).
NO88884348A 1987-10-19 1988-09-30 Pichia-transformasjon. NO884348L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/110,148 US4929555A (en) 1987-10-19 1987-10-19 Pichia transformation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO884348D0 NO884348D0 (no) 1988-09-30
NO884348L true NO884348L (no) 1989-04-20

Family

ID=22331463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO88884348A NO884348L (no) 1987-10-19 1988-09-30 Pichia-transformasjon.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4929555A (no)
EP (1) EP0312934A3 (no)
JP (1) JPH01128790A (no)
AU (1) AU596546B2 (no)
DK (1) DK579988A (no)
IL (1) IL87980A0 (no)
NO (1) NO884348L (no)

Families Citing this family (169)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197548B1 (en) 1990-04-02 2001-03-06 Medeva Pharma Limited Transformed Pichia expressing the pertactin antigen
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
WO1992004363A1 (en) * 1990-09-04 1992-03-19 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
ATE158816T1 (de) 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
CA2105064A1 (en) * 1991-04-01 1992-10-02 Martin Anthony Gleeson Genes which influence pichia proteolytic activity, and uses therefor
WO1993013206A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 British Bio-Technology Limited Stem cell inhibiting proteins
JP3628691B2 (ja) * 1993-03-08 2005-03-16 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体組成物およびそれらの使用方法
DE69431432T2 (de) 1993-04-20 2003-04-24 Merck & Co Inc Untereinheiten von menschlichen n-methyl-d-aspartat rezeptoren, diese kodierende nukleinsäure und dessen verwendung
US6001581A (en) * 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US5912122A (en) 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
GB2287941B (en) * 1993-11-08 1998-01-28 Salk Inst Biotech Ind Human alpha2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5629167A (en) 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
US5712249A (en) * 1994-09-08 1998-01-27 Ciba-Geigy Corporation Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
DK1007546T3 (da) 1997-08-27 2009-03-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Molekylære mimetika af meningokok-B-epitoper
BR9813930A (pt) 1997-11-06 2006-12-19 Chiron Spa antìgeno neisserial
EP1047784B2 (en) 1998-01-14 2015-03-18 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neissera meningitidis antigens
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
NZ532665A (en) 1998-05-01 2005-11-25 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions
WO2000022130A2 (en) 1998-10-15 2000-04-20 Chiron Corporation Metastatic breast and colon cancer regulated genes
DE69939599D1 (de) 1998-12-16 2008-10-30 Novartis Vaccines & Diagnostic MENSCHLICHE CYCLIN-ABHÄNGIGE KINASE (hPNQALRE)
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
NZ571167A (en) 1999-04-30 2010-05-28 Novartis Vaccines & Diagnostic Fragments from Neisseria protein ORF 953 and their use in medicaments and diagnostic reagents
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
EP1305412A2 (en) 1999-10-14 2003-05-02 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
EP2975127A1 (en) 1999-10-29 2016-01-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Neisserial antigenic peptides
ES2311016T3 (es) 2000-01-10 2009-02-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Genes expresados diferencialmente en cancer de mama.
EP2275129A3 (en) 2000-01-17 2013-11-06 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Outer membrane vesicle (OMV) vaccine comprising N. meningitidis serogroup B outer membrane proteins
KR100787073B1 (ko) * 2000-06-28 2007-12-21 글리코파이, 인크. 변형된 당단백질의 제조방법
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
US7863020B2 (en) 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US6803225B2 (en) 2000-06-30 2004-10-12 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in Pichia pastoris
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
SG165981A1 (en) 2000-10-27 2010-11-29 Chiron Srl Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
WO2002059337A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Georgetown University School Of Medicine Anti-apoptopic gene scc-s2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
AU2002303262A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene shinc-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081641A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081639A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
ATE420964T1 (de) 2001-11-16 2009-01-15 Biogen Idec Inc Polycistronische expression von antikörpern in cho zellen
EP2335723A1 (en) 2001-12-12 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Immunisation against chlamydia trachomatis
ATE439368T1 (de) * 2001-12-19 2009-08-15 Univ Chicago Schnellreifende fluoreszierende proteine und verfahren zu deren anwendung
US7138512B2 (en) * 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7244565B2 (en) * 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
EP1497434A4 (en) * 2002-04-15 2005-08-24 Merck & Co Inc MATRIX ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN CELLS
US20030228317A1 (en) * 2002-05-22 2003-12-11 Prafulla Gokhale Gene BRCC-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
CA2485695A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Fred W. Wagner Method for universal enzymatic production of bioactive peptides
CA2485703A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Fred W. Wagner Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides
CA2485701A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Fred W. Wagner Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides
WO2003100022A2 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Restoragen, Inc. Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides
AU2003239894A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Restoragen Inc. Methods and constructs for high yield expression of clostripain
US7252933B2 (en) 2002-06-26 2007-08-07 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast
PT2279746E (pt) 2002-11-15 2013-12-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Proteínas de superfície de neisseria meningitidis
ATE494367T1 (de) * 2002-12-18 2011-01-15 Hoffmann La Roche Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7419801B2 (en) * 2003-08-08 2008-09-02 Arriva Pharmaceuticals, Inc. Methods of protein production in yeast
US7354734B2 (en) * 2003-08-25 2008-04-08 Funzyme Biotechnologies Sa Fungal proteins and nucleic acids encoding same
US20070274988A1 (en) * 2003-10-10 2007-11-29 Five Prime Therapeautics, Inc. Kiaa0779, Splice Variants Thereof, and Methods of Their Use
PL1684719T3 (pl) * 2003-11-14 2012-11-30 Baxalta Inc Kompozycje alfa 1-antytrypsyny i sposoby leczenia z zastosowaniem takich kompozycji
WO2005067368A2 (en) * 2003-11-21 2005-07-28 Nps Allelix Corp. Production of glucagon like peptide 2 and analogs
CA2486195C (en) * 2003-12-05 2012-03-06 Stephan Glaser Recombinantly expressed carboxypeptidase b and purification thereof
AU2005319099B2 (en) * 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
CN104292321A (zh) 2004-03-29 2015-01-21 株式会社嘉尔药物 新的半乳凝素9 突变体蛋白质及其用途
WO2005100387A1 (en) * 2004-04-07 2005-10-27 The University Of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
CA2568952C (en) * 2004-06-18 2019-05-21 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
MX2007000728A (es) * 2004-07-21 2007-03-15 Ambrx Inc Polipeptidos biosinteticos que utilizan amino acidos no naturalmente codificados.
US20070105768A1 (en) * 2004-11-10 2007-05-10 Rajiv Nayar Dry recombinant human alpha 1-antitrypsin formulation
JP4990792B2 (ja) * 2004-12-22 2012-08-01 アンブレツクス・インコーポレイテツド アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの組成物およびこの使用
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
JP5425398B2 (ja) 2004-12-22 2014-02-26 アンブレツクス・インコーポレイテツド 非天然アミノ酸及びポリペプチドを含む組成物、非天然アミノ酸及びポリペプチドに関連する方法並び非天然アミノ酸及びポリペプチドその使用
NZ555386A (en) * 2004-12-22 2011-01-28 Ambrx Inc Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
EA017874B1 (ru) 2005-03-21 2013-03-29 Вайробей, Инк. Производные альфа-кетоамидов в качестве ингибиторов цистеинпротеаз
WO2006124667A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
ATE529442T1 (de) * 2005-06-03 2011-11-15 Ambrx Inc Verbesserte humane interferon-moleküle und ihre verwendungen
CN103103238B (zh) * 2005-08-18 2016-08-10 Ambrx公司 一种在细胞中制造在特定位置处具有所选氨基酸的抗体或抗体片段多肽的方法
ES2370657T3 (es) * 2005-09-14 2011-12-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Escisión de precursores de insulinas mediante una variante de tripsina.
WO2007053732A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Promoter polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
AU2006311568B2 (en) * 2005-11-08 2010-11-11 Ambrx, Inc. Accelerants for the modification of non-natural amino acids and non-natural amino acid polypeptides
EP1951890A4 (en) * 2005-11-16 2009-06-24 Ambrx Inc PROCESSES AND COMPOSITIONS WITH NON-NATURAL AMINO ACIDS
DK1968635T3 (en) * 2005-12-14 2014-12-15 Ambrx Inc Compositions and Methods of, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
ATE522541T1 (de) 2006-06-09 2011-09-15 Novartis Ag Bakterielle adhäsine konformere
MX2009002526A (es) * 2006-09-08 2009-04-16 Ambrx Inc Transcripcion de tarn supresor en celulas de vertebrados.
EP2615108B1 (en) * 2006-09-08 2016-10-26 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and thier uses
DK2061878T3 (da) * 2006-09-08 2014-04-07 Ambrx Inc Hybridsuppressor-trna for hvirveldyrceller
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
US8288110B2 (en) * 2006-12-04 2012-10-16 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Biomarkers for detecting cancer
ATE554785T1 (de) 2007-03-30 2012-05-15 Ambrx Inc Modifizierte fgf-21 polypeptide und ihre verwendung
WO2008120107A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Oxyrane (Uk) Limited Glycosylation of molecules
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
JP4789012B2 (ja) * 2007-05-07 2011-10-05 株式会社ナガエ 物干装置
EP2915564B1 (en) 2007-09-28 2020-11-04 Portola Pharmaceuticals, Inc. Antidotes for factor XA inhibitors and methods of using the same
WO2009046407A2 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Zymogenetics, Inc. B7 FAMILY MEMBER zB7H6 AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS
WO2009059305A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
EP2930182A1 (en) 2007-11-20 2015-10-14 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
WO2009073511A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
FR2927254B1 (fr) * 2008-02-12 2010-03-26 Lesaffre & Cie Utilisation de substances actives naturelles dans des compositions cosmetiques ou therapeutiques
WO2009114093A2 (en) * 2008-03-03 2009-09-17 Abbott Laboratories Methods for transforming yeast
CA2726804C (en) 2008-06-02 2021-12-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Xbp1, cd138, and cs1 peptides
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
MX2011003196A (es) 2008-09-26 2011-04-27 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
CN102232085A (zh) 2008-09-26 2011-11-02 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
EP3121271B1 (en) 2009-03-30 2019-07-24 Portola Pharmaceuticals, Inc. Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same
ITMI20090946A1 (it) 2009-05-28 2010-11-29 Novartis Ag Espressione di proteine ricombinanti
WO2011008885A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Portola Pharmaceuticals, Inc. Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same
WO2011039634A2 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Universiteit Gent Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose
EP2501805B1 (en) 2009-11-19 2019-02-20 Oxyrane UK Limited Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans
EP2515932A2 (en) 2009-12-21 2012-10-31 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
FR2954349A1 (fr) 2009-12-22 2011-06-24 Agronomique Inst Nat Rech Sulfatase modifiant selectivement les glycosaminoglycanes
US8617856B2 (en) * 2010-01-07 2013-12-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Fatty acid-producing hosts
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
HUE045845T2 (hu) 2010-08-17 2021-12-28 Ambrx Inc Módosított relaxin polipeptidek és felhasználásuk
WO2012027494A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Bispecific targeting reagents
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
CA2812870C (en) 2010-09-29 2020-06-09 Oxyrane Uk Limited Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
BR112013007263A2 (pt) 2010-09-29 2016-06-14 Oxyrane Uk Ltd desmanosilação de n-glicanos fosforilados
MX368546B (es) 2011-05-20 2019-10-07 Alderbio Holdings Llc Producción en alta pureza de proteínas multi-subunitarias tales como anticuerpos en microbios transformados tal como pichia pastoris.
CN103890178A (zh) 2011-08-19 2014-06-25 奥尔德生物控股有限责任公司 转化微生物如巴斯德毕赤酵母中多亚基蛋白如抗体的高滴度和高纯度生成的多拷贝方案
CA2859303A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins
JP2015507929A (ja) 2012-02-14 2015-03-16 ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 第Ｘａ因子阻害剤に対する組み換え拮抗剤を製作するためのプロセス
EP3628326B1 (en) 2012-03-15 2024-02-28 Oxyrane UK Limited Methods and materials for treatment of pompe's disease
US20140073022A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Production of polyhydroxyalkanoates with a defined composition from an unrelated carbon source
CN105377288B (zh) 2012-11-05 2019-11-15 达纳-法伯癌症研究所股份有限公司 Xbp1、cd138和cs1肽的组合物制备药物的用途
WO2014136065A2 (en) 2013-03-05 2014-09-12 Oxyrane Uk Limited Production of catalytically active type i sulfatase
US9518082B2 (en) 2013-03-15 2016-12-13 Alderbio Holdings Llc Antibody purification and purity monitoring
DK2971037T3 (da) * 2013-03-15 2019-10-14 Alder Biopharmaceuticals Inc Temperaturændring til ekspression med højt udbytte af polypeptider i gær og andre transformerede celler
WO2014146175A1 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Purification of triple helical proteins
TWI738631B (zh) 2013-09-09 2021-09-11 德商贏創運營有限公司 經修飾之細菌類膠原蛋白蛋白質
US9708630B1 (en) 2013-10-08 2017-07-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Cells and methods for producing fatty alcohols
EA036697B1 (ru) 2014-10-24 2020-12-09 Бристол-Майерс Сквибб Компани Модифицированные полипептиды fgf-21 и их применение
WO2016120764A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides
US9920102B2 (en) 2015-05-15 2018-03-20 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Fusion tags for protein expression
US10301653B2 (en) 2015-07-06 2019-05-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use
US10287338B2 (en) 2015-07-10 2019-05-14 Miran NERSISSIAN Factor VIII protein compositions and methods of treating of hemophilia A
SG11201802829YA (en) 2015-10-09 2018-05-30 Genzyme Corp Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production
US11040114B2 (en) 2015-12-24 2021-06-22 Oxyrane Uk Limited Human alpha-N-acetylgalactosaminidase polypeptide
US10421951B2 (en) 2016-06-22 2019-09-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Gene construct encoding mutant thioesterase, mutant thioesterase encoded thereby, transformed host cell containing the gene construct, and method of using them to produce medium-chain fatty acids
US20180119192A1 (en) 2016-10-07 2018-05-03 Genzyme Corporation Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production
CA3052639A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
EP3675897A1 (en) 2017-09-01 2020-07-08 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Immunogenic peptides specific to bcma and taci antigens for treatment of cancer
WO2019084319A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 The Regents Of The University Of California ANTIBODIES AGAINST CDCP1 FOR THE TREATMENT AND DETECTION OF CANCER
EP3505181B1 (en) 2017-12-28 2021-07-07 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center Preparation of enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis iiid
EP3941938A1 (en) 2019-03-06 2022-01-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T cell receptors specific to b-cell maturation antigen for treatment of cancer
EP4153765A1 (en) 2020-05-20 2023-03-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Cells and methods for producing methyl ketones
EP4337776A1 (en) 2021-05-12 2024-03-20 Circular Industries Holding Pte Ltd. Recombinant yeasts for producing acetone and/or isopropanol from fatty acid feedstocks
NL2031833B1 (en) 2022-05-11 2023-11-17 Univ Leiden Immunotherapeutic compositions and adjuvants
WO2024032891A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Vib Vzw Glyco-engineered yeast for therapeutic protein production

Also Published As

Publication number Publication date
IL87980A0 (en) 1989-03-31
AU596546B2 (en) 1990-05-03
EP0312934A3 (en) 1990-03-28
DK579988A (da) 1989-04-20
AU2376788A (en) 1989-04-20
EP0312934A2 (en) 1989-04-26
DK579988D0 (da) 1988-10-18
US4929555A (en) 1990-05-29
NO884348D0 (no) 1988-09-30
JPH01128790A (ja) 1989-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO884348L (no) Pichia-transformasjon.
Rambosek et al. Recombinant DNA in filamentous fungi: progress and prospects
EP0560401B1 (en) DNA fragment encoding an AOX
CA1297438C (en) Transformation of yeasts of the genus pichia
CA1273882A (en) Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
Spencer et al. Genetic improvement of industrial yeasts
Robinson et al. Transformation of the bioherbicide Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene by electroporation of germinated conidia
Wernars et al. Cotransformation of Aspergillus nidulans: a tool for replacing fungal genes
NO854333L (no) Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia.
DE69637359T2 (de) Nucleinsäuresequenz xlnR des Regulators XylR des xylanolytischen Biosyntheseweges aus Aspergillus niger
Haas et al. Development of an integrative DNA transformation system for the yeast Candida tropicalis
Friel et al. Separate and combined disruptions of two exo-β-1, 3-glucanase genes decrease the efficiency of Pichia anomala (strain K) biocontrol against Botrytis cinerea on apple
JP2559689B2 (ja) ヤロウイア・リポリテイカの形質転換方法
CA2137824C (en) Yeast strains expressing the lactic ldh gene, and vectors which can be used for obtaining said strains
US9458469B2 (en) Method for obtaining improved strains of yeast
Ushio et al. Construction of a host-vector system in the osmophilic haploid yeast Zygosaccharomyces rouxii
Hsieh et al. Development of a LAC4 promoter‐based gratuitous induction system in Kluyveromyces lactis
Miret et al. Polyamines and cell wall organization in Saccharomyces cerevisiae
Simon et al. A rapid and efficient procedure for transformation of intact Saccharomyces cerevisiae by electroporation
Curran et al. Protoplast fusion in Saccharomyces cerevisiae
Heinemann et al. [13] Transmission of plasmid DNA to yeast by conjugation with bacteria
Gjermansen Mutagenesis and genetic transformation of meiotic segregants of lager yeast
Morgan Yeast strain improvement by protoplast fusion and transformation
Lee et al. Stability and expression of a plasmid‐containing killer toxin cDNA in batch and chemostat cultures of saccharomyces cerevisiae
Boylan et al. Saccharomyces cerevisiae centromere CEN11 does not induce chromosome instability when integrated into the Aspergillus nidulans genome