JPH01128790A - ピキアの形質転換 - Google Patents

ピキアの形質転換

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JPH01128790A
JPH01128790A JP63263825A JP26382588A JPH01128790A JP H01128790 A JPH01128790 A JP H01128790A JP 63263825 A JP63263825 A JP 63263825A JP 26382588 A JP26382588 A JP 26382588A JP H01128790 A JPH01128790 A JP H01128790A
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JP
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cells
suspension
aqueous solution
dna
solution
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JP63263825A
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English (en)
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James M Cregg
ジェームス・マイケル・クレッグ
Kevin J Barringer
ケヴィン・ジェームス・バリンジャー
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Phillips Petroleum Co
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Phillips Petroleum Co
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は分子生物学および遺伝子工学に関するものであ
る。
より詳細には、一つの態様において本発明は、ピキア（
Ｐｉｃｈｉａ）属酵母細胞を細胞外由来のＤＮＡによる
形質転換可能にする方法に関するものである。
他の態様では、本発明は該細胞を該ＤＮ＾で形質転換す
る方法に関するものである。
（従来の技術） 細胞に、望みのタンパク質の産生などの所望の機能を実
施させるための、遺伝子工学における必須の工程は、該
機能を実施する細胞に必要な遺伝的情報を含むＤＮＡを
該細胞に形質転換することである。しかし、細胞をＤＮ
Ａで形質転換する前に、形質転換可能な状態にするだめ
の処理を行わなければならない。
酵母細胞の形質転換は、該細胞が原形質膜に加えて、Ｄ
ＮＡの流入に対する障壁となる細胞壁を有するため、特
別な問題をはらんでいる。
酵母細胞の形質転換のための一般的な方法の一つは、ま
ず、該細胞の細胞壁を酵素で消化することによって細胞
からスフェロプラストを形成させ、次に、望みのＩＩＮ
Ａでスフェロプラストの形質転換処理を行い、最後に、
形質転換したスフェロプラストが細胞壁を持つ完全な細
胞として再生するための処理を行うことである。メチロ
トローフ酵母の一種であるピキア・パストリスＰｉｃｈ
ｉａ　　ａｓｔｏｒｉｓ）細胞のスフェロプラストを用
いる典型的な形質転換法は、フレラグ（Ｃｒｅｇｇ）他
、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、５゜３３７６−３３
８５　（１９８５）に示されている。
酵母細胞の形質転換にスフェロプラストを用いることは
、スフェロプラストの浸透圧感受性、および、まずスフ
ェロプラストを調製し次に完全な細胞を再生する必要性
に関連した多くの欠点を含んでいる。これらの問題をふ
まえて、本分野において、完全な酵母細胞への形質転換
法を開発する努力が行われてきた。
こうして、イトウら、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５
３，１６３−１６８（１９８３））は、サツカロミセス
・セレビシェμ恒９」ｙ１ジ竺屡ユり猛ハ佳創旦り−の
完全な細胞を形質転換可能にする方法および形質転換法
を報告した。
イトウらの方法は、およそｐＨ８に緩衝化したアルカリ
金属塩の水溶液中でサツカロミセス・セレビシェ完全細
胞をインキュベートして、細胞を形質転換可能にするこ
と；再度ｐＨ約８に緩衝化した溶液中で、形質転換可能
となった完全細胞を、細胞に形質転換するためのＤＮＡ
およびアルカリ金属塩とともにインキュベートすること
；細胞を含むＤＮＡ溶液に、平均分子量的４０００のポ
リエチレンクリコールを添加して、ポリエチレンクリコ
ール濃度をおよそ３５％（ｗ／ｖ）にすること；得られ
た溶液中の細胞をインキュベートすること；および、４
２℃のウォーターバス中に５分間溶液を置くことにより
細胞にヒートショックをかけ、溶液を室温に戻すことか
ら成っている。０．１Ｍの濃度で形質転換可能な細胞を
調製するための溶液および形質転換溶液（ポリエチレン
クリコールの添加前）を用いた場合、形質転換ＤＮＡ　
１マイクログラムあたり、イトウらにより試験されたア
ルカリ金属塩のなかでは塩化リチウムが、塩化ナトリウ
ムの４倍から８倍の形質転換体を与えた。さらに、試さ
れたリチウム塩のうち、酢酸リチウム、硝酸リチウム、
硫酸リチウムでは形質転換ＤＮＡ　１マイクログラムあ
たりほぼ同数の形質転換体を生じ、塩化リチウムの場合
は明らかに少ない形質転換体を生じた。
イトウらは、線状プラスミドＯＮ＾よりも環状プラスミ
ドＤＮＡのほうがより効率よ（アルカリ金属塩処理完全
細胞を形質転換すること、対数増殖後期から定常期の培
養液由来の細胞よりも対数増殖中期から後期の培養液由
来の細胞の方がアルカリ金属塩処理した場合により効率
よく形質転換されることを報告した。イトウらは、アル
カリ金属塩の濃度に対する、アルカリ金属塩で処理され
る細胞の濃度の比が、およそ１０１１からおよそ１０１
２細胞１モルの間にある場合に形質転換効率が最も高い
ことを報告した。
ダビドウ（Ｄａｖｉｄｏｗ）ら、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ
、１０．３９−４８（１９８５）は、酵母ヤロウィア・
リポリチカ（Ｖａｒｒｏ匈ｉａ月１司ヱｔｉｃ搬−の完
全細胞を形質転換可能にする方法、および形質転換法を
報告した。ダビドウらの方法は、およそｐｎ　７．５に
緩衝化したＯ、　ＬＭの酢酸リチウム水溶液中の、およ
そ１０’細胞／ｍｌのヤロウィア・リポリチカ完全細胞
をインキュベートして、形質転換可能な細胞にすること
；再度ｐＨ約７．５に緩衝化した溶液中で、形質転換可
能となった完全細胞を、該細胞を形質転換するＤＮＡ　
、１キロ塩基対以下の範囲にＨａｅｌｌ＋で切断した不
均一なキャリアＤＮＡ　（大腸菌ＤＮＡ）、およそ０，
１門酢酸リチウムとともにインキュベートすること；細
胞を含む該ＤＮＡ溶液に、およそ４０Ｘ　（＋１／ν）
の平均分子量的４０００のポリエチレンクリコールを含
むｐＨをおよそ７．５に緩衝化した０、１Ｍ酢酸リチウ
ム溶液を添加し・ＤＮＡを含む溶液のポリエチレンクリ
コール濃度を約３５％にすること；得られたン容液をイ
ンキュベートすること；および、ポリエチレンクリコー
ル溶液中の細胞を、３７℃で数分間置くことによりヒー
トショックをかけることからなる。イトウらの方法に反
して、ダビドウらは、酢酸リチウム処理した完全細胞の
形質転換効率は、環状プラスミドＯＮへの方が線状プラ
スミドＤＮＡよりも低いと報告している。イトウらと同
様に、ダビドウらは増殖初期段階の培養液由来の細胞よ
りも、増殖後期の培養液由来の細胞の方が、形質転換Ｏ
Ｎへ１マイクログラムあたりより多くの形質転換体を与
えることを見いだした。ダビドウらは、形質転換ＤＮＡ
　１マイクログラムあたり約５０マイクログラム以上の
Ｈａｅｌｌｌ切断キャリアＤＮＡの存在が、形質転換Ｄ
ＮＡ　１マイクログラムあたり得られる形質転換体数を
顕著に増加させること；および、ソニケーションをかけ
た大腸菌ＤＮＡ　　（鎖長範囲０．５−０．９Ｋｂ９）
をキャリアとして形質転換ＤＮＡ　１マイクログラムあ
たり１０マイクログラム存在させた場合、Ｈａｅｌｌｌ
切断キャリアＤＮＡ　（鎖長範囲ＩＫｂρ以下）を形質
転換ＤＮＡ　１マイクログラムあたり５０マイクログラ
ム存在させた場合の半分の形質転換転換体しか得られな
いことを報告した。
イトウらとダビドウらの結果の相違は、完全細胞を形質
転換可能にする方法およびその形質転換法の効率が、酵
母の特定の種によっては予測できないことを示している
。実際、ある種の酵母には効果的であるとされた方法が
、その方法のまだ試されていない別の種に対して効果的
であるか否かは甚だ不備である。形質転換の有能性およ
び形質転換効率に影響のある細胞壁および関連した膜の
性質は、全ての種、および、特に酵母の種によって不明
確である。細胞壁および膜の化学的・物理的性質は酵母
の種間で顕著に異なると考えられているが、その相違が
酵母を形質転換可能にする方法あるいは形質転換法、お
よび、ある特定の方法が特定の種に機能する効率にどの
様に影客するかは不明である。
酵母の二つの種が分類学的に遠いほど、一方の種で行わ
れた完全細胞形質転換法に関する観察が他方の種でも通
用する可能性は低くなると思われる。特に、ピキア・バ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａ　　ａｓｔｏｒｉｓ）種などの
メチロトローフ酵母に適用される完全細胞形質転換法に
関しては、本分野では何も知られていない。メチロトロ
ーフ酵母は、細胞を形質転換可能にする工程およびそれ
を形質転換する過程に関連する性質を含む、多数の点で
、Ｓ、セレビシェおよびＹ、リポリチカなどの非メチロ
トローフ酵母と明らかに異なっている。
（発明の構成） 本発明者らは、ピキア属のメチロトローフ種の完全細胞
が、塩化リチウムあるいはスルホン化リチウムの緩衝液
中でのインキュベーシヨンにより、形質転換可能となる
ことを見いだした。本発明者らはさらに、予期しないこ
とであったが、形質転換効率はわずかに低下するが、上
記の過程で形質転換可能となった細胞を使用時まで凍結
保存することができることを発見した。凍結保存は該細
胞のスフェロプラストでは困難であり、そのため本発明
以前には、該細胞の上記保存法の多くの実際的な利点は
実現され得なかった。
本発明者ら↓よまた、ピキア属のメチロトローフ種の完
全細胞を塩化リチウムあるいはスルホン化リチウムの緩
衝溶液中でのインキュベーシヨンニよって形質転換可能
とした後に、１）ＮＡおよび塩化リチウムあるいはスル
ホン化リチウムの緩衝溶液とインキュベートし、平均分
子量が約３０００〜５０００ドルトン、好ましくは３３
５０ドルトンのポリエチレングリコールの、２０Ｘ（ｗ
／ｖ）〜約５０χ、好ましくは約３５χ１／ν）の濃度
の溶液を加え、該ポリエチレングリコールを含む溶液を
インキュベートし、つづいて該溶液をヒートショックに
かけることにより、望みのＤＮＡで形質転換できること
を見いだした。
本発明者らはさらに、この形質転換法が、細胞のスフェ
ロプラストを用いて形質転換する方法と比較して、いく
つかの顕著な利点を有することを偶然発見した。特に、
完全細胞法は細胞が寒天に埋め込まれないため、スフェ
ロプラストを用いた形質転換体よりも明らかに速く増殖
する形質転換体が得られる。
本発明はピキア属のメチロトローフ種の完全細胞を形質
転換可能にするための新しい、また予想外に有利な方法
に関するものであり、該方法は、濃度が約５０ｍＭ〜５
００ｍＭの塩化リチウムあるいは硫酸リチウム水溶液中
で、＊ｏ’〜５×１０８、好ましくは約５×１０１′細
胞／…ｌの濃度で該細胞懸濁液を少なくとも約４５分間
置くことを含み、該溶液は約２７゛Ｃ〜３３℃の間に保
たれ、ｐｌ＋は約６〜８、好ましくは約７〜８、より好
ましくは約７に緩衝化される。
本発明はさらに、望みのＤＮＡでピキア属のメチロトロ
ーフ種の完全細胞を形質転換するための新しく、有利な
方法に関するものであり、該方法は工 以下の行程からなる： ｉ）約２７℃〜約３３℃に維持され、ｐＨが６から８、
好ましくは約７〜約８に緩衝化されている、約５０１〜
約５００ｍＭの濃度の塩化リチウムあるいはスルホン化
リチウムの第一の水溶液中で、約５×１０７〜約５Ｘ１
０８細胞／ｍｌの濃度で、該細胞懸濁液を少なくとも４
５分間置くことからなる方法によって、形質転換可能と
なった核種の細胞を得ること；！ｉ　）　（ａ）約５０
１〜約〜約５００ｍＭの濃度で、ｐＨが約６〜約８に緩
衝化された最初のリチウム塩と同じリチウム塩を含む第
二の水溶液中に、およそ５×１０７から５×１０７細胞
／ｍｌの濃度の該形質転換可能細胞の第一の懸濁液を添
加したものと、 （ｂ）該第一の懸濁液の０．２倍以下の体積の第三の水
溶液と混合することによって第二の細胞懸濁液を調製ご
とであって、該第三の水溶液は、ｐＨ約７〜約８に緩衝
化され、該第三の水溶液と混合される該第一の懸濁液１
ｍｌあたり約１ｎｇ〜約２０ＩＩｇの望みのＤＮＡを含
み、該ＤＮＡ　量が該第三の水？′ｆ！液と混合した第
一の懸濁Ｗ１．ｌｌ１１あたり約１０μＧ以下である場
合には、該第三の水溶液は１０μｇのキャリアＤＮＡを
含むものとし、さらに該望みのＤＮＡと該キャリアＤＮ
Ａの量は該キャリアＤＮＡの量が該第三の水溶液と混合
した該第一の懸濁液１ｍｌあたり５０μｇを越えないも
のとする； くとも一部を約２７℃〜約３３℃の間で、少なくとも約
１０分〜６０分、好ましくは約３０分間インキュベート
すること； ｉｖ）第三の懸濁液中のポリエチレングリコール濃度を
実質的に均一にするために行程ｉｉ）でインキュベート
した第二の懸濁液の少なくとも一部を、第四の溶液と混
合するインキュベートした第二の懸濁液の体積の約５０
〜約ＩＯ倍、好ましくは約７倍の体積の第四の溶液と混
合することによって、該細胞の第三懸濁液を調製するこ
とであって、該第四の溶液は実質的に、該第二の溶液と
同じ組成の溶液であって、平均分子量が約３０００から
約５０００しくは３５Ｘからなる； 工 ｖ）Ｊ？程ｉｖ）で調製した該第三の懸濁液の少なくと
も一部を、約２７℃〜約３３℃で少なくとも約１０分〜
６０分、好ましくは約３０分インキュベートすること；
および、 ｖｉ）Ｊ’程Ｖ）でインキュベートした第三の懸濁液の
少なくとも一部をヒートションクにかけること。
本発明の方法は、メチロトローフ種ピキア・パストリス
の細胞に適用することが好ましい。さらに、本発明の方
法は、変異株への形質転換の際にその株の変異表現型を
相補できる遺伝子が単離されていて、それにより栄養要
求性変異に対応する表現型に対して示す原栄養性によっ
て選択できる形質転換体を与えるような、変異の遺伝的
基礎が十分よく解析されているピキア・パストリスの栄
養要求性変異株に適用することが好ましい。ＨＩ３４遺
伝子の変異によるヒスチジン要求性株ＧＳ１１５、旧Ｓ
４およびＡＲＧ４遺伝子の変異によるヒスチジンおよび
アルギニン要求性株ＰＰＦＩを含む多くのこのようなＰ
、パストリスの栄養要求性変異が本分野では知られてい
る。
特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブダ
ペスト条約（ｔｈｅ　Ｂｕｄａｐｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ
　ｏｎｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｆ　
ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓＩＩｌｓ　　ｆｏｒ　Ｐｕｒ
ｐｏｓｅｓ　ｏｆ　ＰａｔｅｎｔＰｒｏｃｅｄｕｒｅ）
の規定にしたがい、菌株ＧＳ１１５およびＰＰＦＩは、
それぞれ１９８４年８月３１日および１９８５年１０月
２２日に米国イリノイ州ペオリアの米国農業省の北部研
究実験用株寄託施設（ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｔｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）に寄託され
た。双方の菌株の寄託は、上記条約に従って上記寄託施
設に受理された。菌株ＧＳ１１５の寄託は寄託番号Ｙ−
１５８５１を与えられた。菌株ＰＰＦＩの寄託は寄託番
号Ｙ−１８０１７を与えられた。寄託試料の−Ｓからの
入手に関する全ての制限は、本出願に米国特許が発行さ
れる際、あるいはそれに先立ち最終的に解除されるであ
ろう 本発明の方法は、形質転換される細胞へ形質転換される
ＤＮＡ上の異種遺伝子によって提供される、６４１８耐
性などのような優性の選択可能なマーカーを用いて選択
される形質転換体を調製することに適用できるが、栄養
要求性変異の相補に基づいた選択よりも、優性選択マー
カーを用いる選択の方が非常に低い形質転換効率（すな
わち、第二〇懸濁液で使用された細胞あたりの望みのＤ
ＮＡの単位量あたり得られた形質転換体数）を示すこと
が見いだされた。
本発明の形質転換法により、ピキア・パストリスのメチ
ロトローフ種の細胞に形質転換されることが期待され、
形質転換が実行できる実質的に全てのＤＮＡを用いて、
望みのタンパク質を発現する能力などの望みの表現型を
該細胞に与えることができる。本分野の当業者には理解
されるように、上記のようなりＮＡは通常およそ２０キ
ロ塩基対から０．５キロ塩基対から成っている。事実上
、通常はそのような望みのＩ）ＮＡはおよそ２０キロ塩
基対よりも短く、形質転換されていない細胞から形質転
換体を選択することができるような表現型を形質転換体
に与える遺伝子、および形質転換体で発現されて形質転
換された細胞に望みの表現型を付与するタンパク質を産
生ずる遺伝子を含んでいる。本発明で細胞に形質転換さ
れるＤＮＡとしては形質転換体に望みの表現型を少なく
とも十分認識される程度に付与するような安定性をもっ
て形質転換体に維持されるような環状プラスミド、ある
いは形質転換体のゲノム、好ましくは、例えば主要アル
コールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ遺伝子）座など予
め選択された座位に挿入することができ、挿入されたＤ
ＮＡとして形質転換体に望みの表現型を与えるような直
鎖状プラスミドあるいは他の鎖状ＤＮＡが使用可能であ
る。望みのＤＮＡの例、およびそれによる形質転換体の
同定法は本分野では既知である。本発明の形質転換法を
用いた形質転換効率は環状ＤＮＡよりも直鎖状プラスミ
ドＤＮＡの方が非常に高いことが示された。
本発明で使用されるアルカリ金属塩は、塩化リチウムお
よび硫酸リチウムである。塩化リチウムが最も好ましい
。
本発明で使用される溶液および懸濁液のｐＨを約７〜８
、好ましくは約７に緩衝化でき、形質転換する細胞に毒
性のない全ての塩は本発明において使用可能である。本
分野の当業者はそのような塩を多数挙げられるであろう
。好ましいものの一つは、約１ｍＭ　〜約１００ｍＭの
濃度のＴｒｉｓ−ＨＣＩである。
本発明で使用される溶液および懸濁液はまた、約０．１
ｍＭから１０ｍＭの濃度で’ＥＤＴＡ”を含むことが好
ましく、それにより、エチレンジアミン四酢酸が完全に
プロトン付加されて陰イオンとなる、全ての形態を総体
として含むことを意図する。
本発明の形質転換法で使用するポリエチレングリコール
は、平均分子量が約３０００〜約４０００ドルトンであ
ることが好ましく、約３３５０であることが、より好ま
しい。
本発明の形質転換法で用いるキャリアＯＮ＾は、本発明
の方法による全ての形質転換において必須ではないが、
望みのＤＮＡ　？ａ度が上記第一の懸濁液（第三の溶液
と混合して第二の懸濁液となるもの）１ｍｌあたり１０
μｇ以下の場合には必須であり、大腸菌ＤＮＡ　、サケ
精子ＤＮＡ　、ニシン精子ＤＮＡあるいはそれらの類似
物などのピキア以外からのＤＮＡである。本分野の当業
者には理解されるように、キャリアＤＮＡは、ソニケー
ションや制限酵素による消化などの工程によって切断す
る。このようなりＮＡは、約１５〜０．５キロ塩基対と
なりうるが、キャリアＤＮＡは平均鎖長が約１キロ塩基
対以下であることが好ましい。最も好ましいキャリアＤ
ＮＡは、制限酵素１ａｅｌｌ＋で完全に切断した大腸菌
ＤＮＡである。
本発明を以下の実施例中で詳細に説明する。
Ｅ方　１３質転　可能細胞の調製 ピキア・バストリスを５０ｍ　ｌのＹＰＤ　　（１２酵
母抽出物、２χ　ペプトン、２χ　デキストロース）中
で、３０℃で振とう培養し、対数増殖期、すなわち００
６゜。
が約１（約５×１０７〜５×１０７細胞／　ｍ　１　）
で集菌した。対数増殖期で集菌した細胞は本発明の方法
により、（イトウら、およびダビドウら、前出の観察と
は異なり）対数増殖後期あるいは定常期の細胞よりも効
率よく形質転換される。集菌は５℃から１０℃で１５０
０　Ｘ　ｇで１０分間遠心することによって行い、上清
を除いた。
集菌した細胞のペレットは、ＩＱｍｌの滅菌水に懸濁し
、前段落と同様に遠心して、−回洗浄した。
再度上清を除いた。
次に、ペレットを滅菌したＴＥＩＩ街液（１抛Ｍ　Ｔｒ
ｉｓｔｓｏｏ　ｘ　ｇで１０分間遠心することにより洗
浄した。
再度、上清を除いた。
つづいて、細胞をＯ，１Ｍ　ＬｉＣｌを添加したＴＥＩ
Ｉ衝液で、細胞濃度が約１．５　ＸＩＯ”細胞／ｍｌと
なるように懸濁した。この懸濁液を振とうエアインキュ
ヘーターで、３０℃で１時間インキュベートした（２０
０−２５Ｏｒｐｍ＞　、インキュベート時間を４５分以
下にした場合の形質転換効率は、１時間以上の場合と比
較して１０倍から２０倍低下することが見いだされてい
る。２時間までのインキュベーションは、１時間の場合
と比較して、形質転換効率に関して顕著な影響は見られ
なかうた。
インキュベーシヨン後、該細胞は形質転換可能であり、
直ちに形質転換に使用でき、顕著に形質転換効率が低下
する事なく４℃で一晩保存することが可能であり、また
以下のようにしてより長時間保存することができた： 形質転換可能細胞を凍結保存するためには、上述のイン
キュベーシツン後、５　’Ｃから１０℃で、１５００　
ｘ　ｇで１０分間遠心して集菌し、上清を除去する。次
にジメチルスルホキシド中に１５％（ｖ／ｖ）とした０
、ＩＭ　ＬｉＣｌを添加したＴＥｔｌ街液で、細胞濃度
が２．５　ＸＩＯ’細胞／細胞７声ｌように再懸濁した
。
得られた懸濁液を０．５１づつ滅菌したチューブに分注
し、ドライアイスで凍結して一７０℃で保存した。
凍結した形質転換可能細胞は、チューブをフリーザーか
ら取り出して、氷上で融解して、形質転換のために調製
した。融解した溶液を卓上遠心機で遠心し、細胞をペレ
ットにして上清を除いた。
次に、ペレットを、ジメチルスルホキシド中に１５％（
ｖ／ｖ）とした０、１Ｍ　ＬｉＣｌを含むＴＥＩＩ衝液
細胞濃度が１．５　ＸＩＯ”細胞／　ｍ　ｌとなるよう
に懸濁し、５℃からｌＯｏＣで、１５００　Ｘ　ｇで１
０分間遠心し、上清を除くことによって洗浄した。つづ
いて、ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＣｌを添加したＴＥ緩
衝液で、細胞濃度が１．５　ＸＩＯ＠細胞／細胞７取ｌ
ように再懸濁した。
本実施例で示したように、凍結し、融解して形質転換の
ために調製した形質転換可能細胞は、保存期間の長さに
関わらず、形質転換効率が約５分の１に低下していた。
本分野の当業者には理解されるように、本実施例で述べ
た多様な洗浄過程は、良い微生物学上の習慣として行わ
れており、おそらく形質転換可能細胞の形質転換効率を
維持するのに有用であろうが、細胞を形質転換可能にす
るためには必須ではない。細胞を形質転換可能、にする
ために必要な工程は、ＬｉＣｌを添加したＴＥバッファ
ー中の細胞懸濁液を２７℃から３３℃の範囲、望ましく
は３０℃で、少なくとも４５分間インキユヘートするこ
とである。
本実施例で述べたＴＥ緩衝液のｐＨは、約７．４である
ことが好ましいが、形質転換効率などに顕著な悪影響を
与えることなく、約７．０から７．８の範囲にする事が
可能である。
ｆａｉｌ　　　のノ　云 滅菌した、１２　Ｘ　７５ｍａ＋ポリプコポリンチュー
ブに以下のものを加える：キャリアＤＮＡとして、１０
ｇ　ｇ　　Ｈａｅｌｌｌで切断した大腸菌［ＩＮＡ　、
　ＴＥＩＩ衝’ｔａ２０μｍ以下に溶解したｌｎｇ〜２
０μｇの望みのＤＮＡ（形質転換される株のゲノムのあ
らかじめ選択された部位にＤＮＡが挿入されるようにす
るための末端を含む直鎖状プラスミドＤＮＡが望ましい
）、および０．１Ｍ　ＬｉＣｌを添加したＴＥ緩衝液に
懸濁した１００μｍの形質転換可能細胞（およそ１．５
　×１０７細胞）。次に、混合液を３０℃（２７’Ｃ〜
３３℃）で３０分間（１０分間から１時間）インキュベ
ートする。
インキュベーション後、平均分子ｆｆ１３３５０ドルト
ンノポリエチレングリコ−ル（”ＰＥＧ、１ｆｆｓｏ”
）４０！（Ｖ／Ｖ）とした、０．１Ｍ　　ＬｉＣｌを添
加したＴＥ緩衝液０．７ｍｌをインキュベーションした
混合液に加え、得られた懸濁液を短時間ポルテックスに
かけ、ＰＥＧを均一にした。ＰＥＧを含む懸ＥＪ？ｆｉ
、を、次に、水槽中に、３０分間３０゛Ｃで静置した。
最後に、静止した水槽中で懸濁液を３７℃（３５℃〜３
９℃）で５分間（２分〜１０分）置いて、ヒートンヨン
クをかけ、上清を除いた。
最終的に、形質転換体のスクリーニングの前に、ペレッ
トを０．１ｍｌ　の滅菌水に再懸濁した。
形質転換体のスクリーニングは、最後の水に懸濁した細
胞を選択培地（例えば、Ｐ、バストリス株ＧＳ１１５に
旧Ｓ４変異を相補する望みのＤＮＡを形質転換する場合
には、０．６７Ｘ酵母窒素ベース（アミノ酸を含まない
）と２％グルコースを含む寒天）に拡げ、プレートを３
０℃で３日間インキユヘートし、プレート上のコロニー
の増殖によって形質転換体を同定することによって行う
。
さらなる解析あるいは使用のために、形質転換体のコロ
ニーは、プレートに滅菌水を加え、寒天表面からコロニ
ーを掻き取り、チューブに移すことによって回収するこ
とができる。
丈膳汎↓ 実施例２の方法にしたがって、ピキア・パストリスＧＳ
１１４およびピキア・パストリスＰＰＦＩの細胞を、Ｐ
ＹＪ３０（ＮＲＲＬ　　Ｎｏ、Ｂ−１５８９０ＰＹＪ３
０大腸閑中）と呼ばれるプラスミド由来のＤＮＡを５ｊ
ｕｌで切断したもの、あるいは切断していないもので形
質転換した。細胞は、実施例１の方法で形質転換可能と
した後、直ちに使用した。以下の形質転換効率が得られ
た。
宿主　　０Ｄ６ｏｏ”　望みのＤＮＡ２）塩３）　形質
転換体数ＧＳ１１５　　　１　　　　　　　　　　　八
　　　　Ｏ，ＩＭ　　ＬｉＣｌ３６８９ＰＰＰＩ　　　
　Ｏ，９２５Ａ　　　　Ｏ，ＩＭ　ＬｉＣｌ２２９ＧＳ
１１５　　１．２３　　　　　　Ａ　　　　Ｏ，ＩＭ　
ＬｉＣｌ　　　　２０５６ＧＳＬ１５　１．２３　　　
　　Ｂ　　　Ｏ，’１Ｍ　ＬｉＣｌ　　　　６０１ＧＳ
１１５　１．２３　　　　　Ａ　　　０．ＩＭ　Ｌｉ（
ＯＡｃ）　　１６４ＧＳ１１５　１．２３　　　　Ｂ　
　　Ｏ，ｌＴＩい（０＾ｃ）　　　１６ＧＳ１１５　　
１．２３　　　　　　八　　　０．１Ｍ　ＬｉｚＳｏ、
　　　２４００ＧＳ１１５　　１．２３　　　　　　Ｂ
　　　　０．１Ｍ　ＬｉｚＳｏ４　　２１５ＧＳ１１５
　　０．２７　　　　　　Ａ　　　　Ｏ，１門ＬｉＣｌ
　　　　３１００ＧＳ１１５０．５４八〇、１ＭＬｉＣ
ｌ１５６０ＧＳ１１５　　１．０５　　　　　　　Ａ　
　　　Ｏ，１門　ＬｉＣｌ１５８９ＧＳ１１５　　２．
２５　　　　　　　Ａ　　　　０．ＩＭ　ＬｉＣｌ’５
９０ＧＳＬ１５　　１．２５　　　　　　　Ａ　　　　
０．０５Ｍ　　ＬｉＣｌ４９９４ＧＳ１１５　　１．２
５　　　　　　　Ａ　　　　　Ｏ，１Ｍ　　ＬｉＣｌ　
　　　　５１０８ＧＳ１１５　　１．２５　　　　　　
　Ａ　　　　　Ｏ，２５Ｍ　　ＬｉＣｌ３６６６ＧＳ１
１５　　１．２５　　　　　　　Ａ　　　　０．５Ｍ　
ＬｉＣｌ５６３ＧＳ１１５　　１．２５　　　　　　　
Ａ　　　　　Ｏ，７５Ｍ　　ＬｉＣｌｌＧＳ１１５１．
２５八１．０ＭＬｉＣｌ３１）　形質転換法のために集
菌した時点の培養液の００゜ ２）　“Ａ″　は５ｔｕｂテ切断したＰＹＪ３０　、　
”Ｂ’は環状の切断していないＰＹＪ３０　。
３）　形質転換の工程で用いた全ての溶液で、同一の塩
および同一の濃度を使用した。
本発明は、本明細書では特定の例をもって説明している
が、本分野の当業者には、本発明の思想の範囲内で多様
な修飾、および変法を見いだすであろう。そのような修
飾および変法は、上記の特許請求の範囲および発明の詳
細な説明の範囲に含めるものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメチロトローフ種の細
    胞を、ＬｉＣｌとＬｉ＿２ＳＯ＿４とから選択された毒
    性のないアルカリ金属塩を５０ｍＭ〜約５００ｍＭの間
    の濃度で含む水溶液中に５×１０＾７〜５×１０＾８細
    胞／ｍｌの範囲の細胞濃度で懸濁して維持すること、該
    溶液は約２７℃〜３３０℃の範囲の温度に維持され、且
    つ約６〜約８の間のｐＨに緩衝化されていることからな
    るピキア属のメチロトローフ種の完全細胞を形質転換可
    能にする方法。 ２、種がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
    ｒｉｓ）である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、水溶液は約１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のトリス−
    ＨＣｌで緩衝化され、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ濃度の
    ＥＤＴＡを含み、ｐＨが７．４である、特許請求の範囲
    第２項記載の方法。 ４、ピキア・パストリスがＧＳ１１５（ＮＲＲＬＹ−１
    ５８５１）である、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、ピキア・パストリスがＰＰＦ１（ＮＲＲＳＹ−１８
    ０１７）である、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、細胞を懸濁液中で４５分〜１２０分間維持する、特
    許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項記載の方
    法。 ７、ｉ）ＬｉＣｌおよびＬｉ＿２ＳＯ＿４から選択され
    た毒性のないアルカリ金属塩を約５ｍＭ〜約５００ｍＭ
    の濃度で含み、ｐＨが約６〜約８に緩衝化された水溶液
    中に、５×１０＾７〜５×１０＾８形質転換可能細胞／
    ｍｌで懸濁した第一の懸濁液を調製すること； ｉｉ）（ａ）工程ｉ）で用いたものと同じアルカリ金属
    塩を含む水溶液中に該形質転換可能細胞を含む該第一の
    懸濁液と、 （ｂ）該懸濁液の０．２倍以下の体積の第三の水溶液、
    該第三の水溶液はｐＨが約７から約８に緩衝化されてお
    り該第三の溶液と混合した該第一の懸濁液１ｍｌあたり
    望みのＤＮＡを約１ｎｇ〜約２０μｇ含む、 とを混合することによって、第二の形質転換可能細胞懸
    濁液を調製すること； ｉｉｉ）工程ｉｉ）で調製した第二の懸濁液の少なくと
    も一部を約２７℃〜約３３℃で、約１０分〜６０分間イ
    ンキュベートすること； ｉｖ）工程ｉｉｉ）でインキュベートした第二の懸濁液
    の一部の少なくとも一部と、 第四の水溶液、該第四の水溶液は、それに混合するイン
    キュベートした第二の懸濁液の一部の体積の約５倍〜約
    １０倍の体積を持ち、第二の水溶液と同じ組成の溶液中
    に平均分子量約３０００〜約５０００ドルトンのポリエ
    チレングリコール約２０％（ｗ／ｖ）〜約５０％（ｗ／
    ｖ）を実質的に含んでいる、と混合し、実質的に均一な
    ポリエチレングリコール濃度として第三の細胞懸濁液を
    調製すること；ｖ）工程ｉｖ）で調製した該第三の懸濁
    液の少なくとも一部を約２７℃〜約３３℃の間で、少な
    くとも約１０分〜約６０分間インキュベートすること；
    および、 ｖｉ）工程ｖ）でインキュベートした第三の懸濁液の一
    部の少なくとも一部をヒートショックにかけること； からなる、望みのＤＮＡでピキア属のメチロトローフ種
    の完全細胞を形質転換するための方法。 ８、種がピキア・パストリスである、特許請求の範囲第
    ７項記載の方法。 ９、細胞が特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか
    １項記載の方法によって形質転換可能となったものであ
    る、特許請求の範囲第７項あるいは第８項記載の方法。 １０、第二の水溶液および第三の水溶液のそれぞれは、
    約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度のトリス−ＨＣｌで緩
    衝化され、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度のＥＤＴＡ
    を含み、且つｐＨが約７．０〜約７．８の間である、特
    許請求の範囲第８項あるいは第９項記載の方法。 １１、第一の懸濁液中の細胞濃度が約１．０×１０＾８
    〜約２．５×１０＾８細胞／ｍｌであり、第三の水溶液
    中の望みのＤＮＡ量が第一の懸濁液１ｍｌあたり約１ｎ
    ｇ〜約２０μｇであり、第三の水溶液が約１０μｇのキ
    ャリアＤＮＡを含み、およびヒートショックが本質的に
    工程ｖ）でインキュベートした第三の懸濁液の一部を約
    ３５℃〜約３９℃の温度で約２分〜約１０分間インキュ
    ベートし該ヒートショックをかけたものを約３３℃以下
    の温度にする、特許請求の範囲第７項、第８項、第９項
    あるいは第１０項記載の方法。 １２、ピキア・パストリスの細胞が栄養要求性変異を有
    する株であり、望みのＤＮＡがピキア・パストリスのゲ
    ノム中のあらかじめ選択された座位に挿入されることが
    でき、且つ該栄養要求性変異を相補する選択マーカーの
    ための遺伝子を含んだ直鎖状ＤＮＡであり、およびヒー
    トショック工程の後に、形質転換体を栄養要求性変異に
    よる表現型に対する原栄養性に基づいて選択する、特許
    請求の範囲第８項ないし第１１項のいずれか１項記載の
    方法。 １３、望みのＤＮＡ量が第三の溶液と混合した第一の懸
    濁液１ｍｌあたり約１０μｇ以下の場合に、第三の溶液
    は１０μｍのキャリアＤＮＡを含み、さらに該キャリア
    ＤＮＡ量が該第三の溶液と混合した第一の懸濁液１ｍｌ
    あたり５０μｇを越えない、特許請求の範囲第７項ない
    し第１２項のいずれか１項記載の方法。 １４、キャリアＤＮＡが前記溶液と混合した第一の懸濁
    液１ｍｌあたり５０μｇを越えない、特許請求の範囲第
    １３項記載の方法。 １５、工程ｉｖ）の形質転換された細胞を第三の懸濁液
    から回収し、形質転換体のスクリーニングをする、特許
    請求の範囲第７項〜第１４項のいずれか１項記載の方法
    。
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