NO338986B1 - Enkeldomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor-alfa og anvendelser derav - Google Patents

Enkeldomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor-alfa og anvendelser derav Download PDF

Info

Publication number
NO338986B1
NO338986B1 NO20052769A NO20052769A NO338986B1 NO 338986 B1 NO338986 B1 NO 338986B1 NO 20052769 A NO20052769 A NO 20052769A NO 20052769 A NO20052769 A NO 20052769A NO 338986 B1 NO338986 B1 NO 338986B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
tnf
alpha
binding
polypeptide
single domain
Prior art date
Application number
NO20052769A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20052769L (no
NO20052769D0 (no
Inventor
Karen Silence
Marc Lauwereys
Hans De Haard
Original Assignee
Ablynx Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32830281&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO338986(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/BE2003/000192 external-priority patent/WO2004041862A2/en
Application filed by Ablynx Nv filed Critical Ablynx Nv
Publication of NO20052769D0 publication Critical patent/NO20052769D0/no
Publication of NO20052769L publication Critical patent/NO20052769L/no
Publication of NO338986B1 publication Critical patent/NO338986B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A61K38/166—Streptokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/08—Materials for coatings
    • A61L29/085—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
    • A61L29/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/08—Materials for coatings
    • A61L31/10—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Enkeldomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor-alfa og anvendelser derav
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer polypeptider omfattende et eller flere enkeltdomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa). Foreliggende oppfinnelse angår videre deres anvendelse innen diagnose og terapi. Slike antistoffer kan ha en rammeverksekvens med høy homologi med de humane rammeverksekvensene. Sammensetninger omfattende antistoffer mot tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa) alene eller i kombinasjon med andre medikamenter blir beskrevet.
Bakgrunn for foreliggende oppfinnelse
Tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa) er antatt å spille en viktig rolle i forskjellige forstyrrelser, for eksempel i inflammatoriske forstyrrelser slike som reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis og multippel sklerose. Både TNF-alfa og reseptorene (CD120a, CD120b) har blitt studert i stor detalj. TNF-alfa i sin bioaktive form er en trimer og fordypningen dannet av naboliggende enheter er viktig for cytokin-reseptor-interaksjonen. Flere strategier for å antagonisere virkningen av cytokinet har blitt utviklet og blir i dag benyttet for å behandle forskjellige sykdomstilstander.
En TNF-alfa inhibitor som har tilstrekkelig spesifisitet og selektivitet overfor TNF-alfa kan være en effektiv profylaktisk eller terapeutisk farmasøytisk forbindelse for forhindring eller behandling av forstyrrelser hvor TNF-alfa har blitt implisert som forårsakende middel. WO 9102078 beskriver konvensjonelle fire kjeders antistoffer fremstilt mot TNF-alfa. Fremgangsmåter for behandling av toksisk sjokk (EP 486526), tumor regresjon, inhibering av cytotoksisitet (US 6448380, US 6451983, US 6498237), autoimmune sykdommer slike som RA og Crohn's sykdom (EP 663836, US 5672347, US 5656272), implantat versus vert reaksjon (US 5672347), bakteriell meningitis (EP 585705) ved hjelp av et antistoff overfor TNF-alfa har blitt beskrevet.
Enda er ingen av de i dag tilgjengelige medikamentene fullstendig effektive behandlingen av autoimmune sykdommer, og de fleste er begrenset av alvorlig toksisitet. I tillegg, er det ekstremt vanskelig og en langvarig prosess å utvikle en ny kjemisk enhet (NCE) med tilstrekkelig kraft og selektivitet overfor slike målsekvenser. Antistoff-baserte terapeutika, på den andre siden har signifikant potensial som medikamenter på grunn av at de har utmerket spesifisitet overfor sine mål og en lav iboende toksisitet. I tillegg, kan utviklingstiden bli redusert betydelig sammenlignet med utviklingen av nye kjemiske enheter (NCE's). Konvensjonelle antistoffer er imidlertid vanskelige å fremskaffe mot multimere proteiner hvor reseptor-bindingsområdet til liganden er innekapslet i en fordypning, slik som tilfellet er med TNF-alfa. Tung kjede antistoffer beskrevet i foreliggende oppfinnelse som er avledet fra Camelidae, er kjent å ha fordypingsbinding egenskaper (W097/49805; Lauwereys et al, EMBO J. 17,5312, 1998)). Derfor er slike tungkjede antistoffer i seg selv passende for å binde til reseptorbinding områder fra slike ligands som TNF. I tillegg er slike antistoffer kjent å vær stabile over lange tidsperioder, hvorved deres lagringstid økes (Perez et al, Biochemistry, 40,74, 2001). Videre, kan slike tungkjede antistoff fragmenter bli masseprodusert i fermentorer ved bruk av billige ekspresjonssystemer sammenlignet med fermentering av mammalske cellekulturer, slike som gjær eller andre mikroorganismer (EP 0 698 097).
Anvendelsen av antistoffer avledet fra kilder slike som mus, sau, geit, kanin etc, og humaniserte derivater derav som en behandling for tilstander som krever en modulering av inflammasjon er problematisk av flere grunner. Tradisjonelle antistoffer er ikke stabile ved romtemperatur og må bli nedkjølt for fremstilling og lagring, noe som krevere nødvendig avkjølt laboratorieutstyr, lagring og transport, som bidrar mot tid og kostnader. Kjøling er noen ganger ikke praktisk i utviklingsland. Videre er fremstilling eller småskalaproduksjon av nevnte antistoffer kostbar på grunn av de mammalske cellulære systemene som er nødvendige for ekspresjon av intakte og aktive antistoffer som krever høye nivåer av støtte i form av tid og utstyr, og utbyttet er meget lavt. Videre vil den store størrelsen til konvensjonelle antistoffer, begrense vevspenetreringen, for eksempel, inn i det inflammerte vevet. Videre har tradisjonelle antistoffer en bindingsaktivitet som avhenger av pH, og passer således ikke i miljøer på utsiden av vanlig fysiologisk pH-område, slik som ved behandling av gastrisk blødning, gastrisk kirurgi. Videre er tradisjonelle antistoffer ustabile ved lav eller høy pH og passer således ikke for oral administrasjon. Imidlertid, har det blitt vist at Camelidae-antistoffer motstår barske betingelser, slike som ekstrem pH, denaturerende reagenser og høy temperaturer (Dumoulin et al, Protein Science 11,500, 2002), noe som gjør dem passende for levering ved oral administrasjon. Videre, har tradisjonelle antistoffer en bindingsaktivitet, som avhenger av temperatur, og er således upassende for bruk i analyzer eller sett utført ved temperaturer utenfor biologisk aktive temperaturområder (f.eks. 37±20°C).
Polypeptid-terapeutika og spesielt antistoff-baserte terapeutika har signifikant potensial som medikamenter på grunn av at de har sterk spesifisitet overfor sine mål og en lav iboende toksisitet. Imidlertid, er det kjent av fagmannen at et antistoff som har blitt fremskaffet for et terapeutisk nyttig mål krever videre modifikasjon for å fremstille det for human terapi, for å unngå en uønsket immunologisk reaksjon i et menneske etter administrasjon til dette. Modifikasjonsprosessen er vanligvis kalt "humanisering". Det er kjent av fagmannen at antistoffer dyrket i andre arter enn i mennesket, krever humanisering for å gjøre antistoffet terapeutisk nyttig i mennesker ((1) CDR grafting: Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech : 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Veneering: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). WO 02057445 og WO 03035694 beskriver hvilke aminosyrerester som er kritiske posisjoner for å øke løseligheten til tung-kjede antistoffer. Det er et behov for en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer som unngår behovet for betydelig humanisering, eller som fullstendig unngår behovet for humanisering. Der er et behov for en ny klasse antistoffer som har definerte rammeverkregioner eller aminosyrerester og som kan bli administrert til et menneske uten kravet om betydelig humanisering, eller i det hele tatt behov for humanisering.
En annen viktig ulempe ved konvensjonelle antistoffer er at de er komplekse, store molekyler og derfor er relativt ustabile, og de er sensitive for nedbrytning av proteaser. Dette betyr at konvensjonelle antistoffmedikamenter ikke kan bli administrert oralt, sublingvalt, topicalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon fordi de ikke er resistente overfor den lave pH på alle disse stedene og i blodet og/eller på grunn av deres store størrelse. De må bli administrert ved injeksjon (intravenøst, subkutant, etc.) for å overvinne noen av disse problemene. Administrasjon ved injeksjon krever spesialisttrening for å benytte en hypodermisk sprøyte eller nål korrekt og sikkert. Videre krever det sterilt utstyr, en væskeformulering av det terapeutisk polypeptidet, pakking i glass av nevnte polypeptid i en steril og stabil form og, for individet, et passende sted til å sette nålen. Videre, erfarer individer vanligvis fysisk og psykologisk stress før og etter mottak av en injeksjon.
Derfor er der et behov for en fremgangsmåte for leveringen av terapeutiske polypeptider som unngår behovet for injeksjon som ikke kun er tids-/kostnadssparende, men som også vil være mer passende og mer komfortabelt for individet.
Enkeltdomene antistoff-baserte terapeutika har signifikant potensial som medikamenter på grunn av at de har sterk spesifisitet overfor sine mål og en lav iboende toksisitet. Imidlertid, ytterligere forbedring av deres indre og funksjonelle affinitet, kan fore til mange fordeler for en pasient, slik som redusert dose av det terapeutiske middelet, hurtigere terapi, og reduserte bieffekter.
Målene ved foreliggende oppfinnelse
Det er et mål ved foreliggende oppfinnelse å fremskaffe polypeptider omfattende et eller flere enkeltdomene antistoffer som binder til TNF-alfa, homologer av nevnte polypeptider, funksjonelle deler av homologer av nevnte polypeptider. Nevnte polypeptider modifiserer den biologiske aktiviteten til TNF-alfa etter binding. Slike polypeptider kan binde i den reseptor-binding fordypning av TNF-alfa, eller kan ikke binde i den reseptorbindende fordypningen. Slike polypeptider er enkeltdomene antistoffer.
Det er et ytterligere mål ved foreliggende oppfinnelse å fremskaffe enkeltdomene antistoffer som kan være en hvilken som helst av typen, eller et hvilket som helst fremtidig enkeltdomene antistoff. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, tung kjede antistoffer, antistoffer naturlig fri for lette kjeder, enkeltdomene antistoffer avledet fra konvensjonelle 4-kjedede antistoffer, konstruerte antistoffer og enkeltdomene skaffold andre enn de avledet fra antistoffer. Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er et enkeltdomene antistoff som benyttet heri, et naturlig forekommende enkeltdomene antistoff kjent som tung kjede antistoff fri for lette kjeder (WO 9404678). Av avklaringsgrunner, vil dette variable domene avledet fra et tungkjede antistoff fri for lett kjede, bli kalt VHH eller nanolegeme for å skille det fra det konvensjonelle VH av firekjedede immunoglobuliner. Et slikt VHH-molekyl kan bli avledet fra antistoffer dyrket i Camelidae arter, for eksempel fra kamel, lama, dromedar, alpaka og guanaco.
Det er et ytterligere mål ved foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte for administrering av anti-TNF-alfa polypeptider intravenøst, subkutant, oralt, sublingualt, topicalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon.
Det er et ytterligere mål av foreliggende oppfinnelse å øke bindingsaffiniteten til monovalente enkeltdomene antistoffer.
Oppsummering av foreliggende oppfinnelse
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid omfattende minst ett anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoff innbefattende
(a) en sekvens representert ved SEQ ID NO: 1, eller
(b) en homolog sekvens som representerer en sekvensidentitet på mer enn 85% hvor foreldresekvensen er representert av SEQ ID NO: 1; hvor den homologe sekvensen inneholder de hydrofobe FR2 restene som typisk finnes i konvensjonelle antistoffer av humant opphav og en argininrest ved posisjon 103 (nummerering i henhold til Kabat).
En annen utførelsesform av beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor hvori et enkeltdomene antistoff tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 1 til 16 og 79 til 84.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, ytterligere omfattende minst ett enkeltdomene antistoff rettet mot et serum protein.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor hvori nevnte serum protein er en hvilken som helst av serum albumin, serum immunoglobuliner, tyroksin-binding protein, transferrin, eller fibrinogen.
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor hvori et enkeltdomene anti-serum protein enkeltdomene antistoff tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 26 til 29 og 85 til 97.
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor tilsvarende en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 30 til 43.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor ytterligere omfattende minst ett enkeltdomene antistoff valgt blant gruppen omfattende anti-IFN-gamma enkeltdomene antistoff, anti-TNF-alfa reseptor enkeltdomene antistoff og anti-IFN-gamma reseptor enkeltdomene antistoff.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, hvori antallet enkeltdomene antistoffer rettet mot TNF- er minst to.
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor tilsvarende en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 73 til 76.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, hvori minst ett enkeltdomene antistoff er et humanisert Camelidae VHHs.
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor hvori et humanisert Camelidae VHH tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 17 til 19 og 21 til 24.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en sammensetning omfattende et anti-TNF- alfa polypeptid som beskrevet ovenfor og minst ett enkeltdomene antistoff fra gruppen bestående av anti-IFN-gamma enkeltdomene antistoff, anti-TNF-alfa reseptor enkeltdomene antistoff og anti-IFN-gamma reseptor enkeltdomene antistoff, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor hvori minst ett anti-IFN- gamma enkeltdomene antistoff tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 44 til 72.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor hvori minst ett enkeltdomene antistoff er et Camelidae VHH.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en nukleinsyre som koder for t anti-TNF- alfa polypeptid som beskrevet ovenfor.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for identifisering av et middel som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, til Tumor nekrose faktor-alfa omfattende trinnene: (a) bringe i kontakt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor med et mål som er Tumor nekrose faktor alfa, i nærvær og fravær av en kandidat modulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptid og mål, og
(b) måling av bindingen mellom polypeptidet og mål fra trinn (a), hvori en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidat modulator, i forhold til bindingen i fravær av nevnte kandidat modulator identifisert nevnte kandidat modulator som et middel som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor og Tumor nekrose faktor-alfa.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for identifisering av et middel som modulerer Tumor nekrose faktor-alfa-medierte forstyrrelser via bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor til Tumor nekrose faktor-alfa omfattende: (a) bringe i kontakt an anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor med et mål som er Tumor nekrose faktor alfa, i nærvær og fravær av en kandidatmodulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptid og mål, og (b) måling av bindingen mellom polypeptidet og mål fra trinn (a), hvori en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidat modulator, i forhold til bindingen i fravær av nevnte kandidatmodulator, for identifisering av nevnte kandidatmodulator som et middel som modulerer Tumor nekrose faktor alfa-medierte forstyrrelser.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for identifisering et middel som modulerer bindingen av Tumor nekrose faktor alfa til sin reseptor ved bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor to Tumor nekrose faktor-alfa omfattende: (a) bringe i kontakt an anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor med et mål som er Tumor nekrose faktor-alfa, i nærvær og fravær av en kandidat modulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptid og mål, og (b) måling av bindingen mellom polypeptidet og mål fra trinn (a), hvori en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidat modulator, i forhold til bindingen i fraværet av nevnte kandidat modulator identifiserer nevnte kandidat modulator som et middel som modulerer bindingen av Tumor nekrose faktor-alfa til sin reseptor.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et sett for skreening for midler som modulerer Tumor nekrose faktor-alfa-medierte forstyrrelser omfattende et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, og Tumor nekrose faktor-alfa.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, eller en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er relatert til inflammatoriske prosesser.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å gå gjennom gastrisk miljø uten at stoffet blir inaktivert.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff levert til den vaginale eller rektale trakt.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser mottakelig for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff levert til nesen, øvre respirasjonstrakten og/eller lungen.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser mottakelig for modulering by et TNF-alfa modulerende stoff levert til tarmmucosa, hvori nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til tarmmucosa.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser mottakelig for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å passere vevet under tungen effektivt.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, for bruk ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser mottakelig for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til effektivt å passere huden.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, et sett som beskrevet ovenfor, en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, en sammensetning som beskrevet ovenfor, et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor hvori nevnte forstyrrelser er en hvilken som helst av inflammasjon, reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisktarmsyndrom, multippel sklerose, Addison's sykdom, Autoimmun hepatitis, Autoimmun parotitis, Diabetes Type I, Epididymitis, Glomerulonephritis, Graves' sykdom, Guillain-Barre syndrom, Hashimoto's sykdom, hemolytisk anemi, Systemic lupus erythematosus, mannlig infertilitet, Multippel sklerose, Myasthenia Gravis, Pemphigus, Psoriasis, Reumatisk feber, Reumatoid artritis, Sarcoidosis, Scleroderma, Sjogren's syndrom, Spondyloarthropathies, Thyroiditis, og Vasculitis.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en sammensetning omfattende en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor, og en passende farmasøytisk bærer.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for diagnostisering av en forstyrrelse kjennetegnet ved dysfunksjonen til Tumor nekrose faktor-alfa omfattende: (a) bringe i kontakt en prøve med et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, (b) detektering av binding av nevnte polypeptid til nevnte prøve, og (c) sammenligning av bindingen detektert i trinn (b) med en standard, hvori en forskjell i binding i forhold til nevnte prove er diagnostisk for en forstyrrelse kjennetegnet ved dysfunksjon av Tumor nekrose faktor-alfa.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et sett for skreening for en forstyrrelse som angitt ovenfor, ved bruk av en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et sett for skreening for en forstyrrelse som angitt ovenfor omfattende et isolert anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor omfattende trinnene: (a) fremskaffelse av dobbelttrådig DNA som koder for en Camelidae VHH rettet mot Tumor nekrose faktor alfa, og
(b) kloning og ekspresjon av DNA utvalgt i trinn (b).
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor omfattende: (a) dyrking av vertsceller omfattende nukleinsyre som er i stand til å kode for et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor, under betingelser som tillater ekspresjonen av polypeptidet, og
(b) utvinne det produserte polypeptidet fra kulturen.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, hvori nevnte vertsceller er bakterielle eller gjær.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et sett for skreening for en hvilken som helst av inflammasjon, reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarmsyndrom eller multippel sklerose omfattende et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet ovenfor.
Kort beskrivelse av figurer og tabeller
Figur 1 Oppstilling av anti-human TNF VHH's som beskrevet i Eksempel 1 Figur 2 Fortynningsserier av anti-human TNF-alfa VHHs som testet i ELISA ifølge Eksempel 1. Figur 3 Antagonistisk effekt av VHH som bestemt ved cytotoksisitetsanalyse i human cellelinje KYM ifølge Eksempel 1. Figur 4 In vitro reseptor bindingsanalyse av villtype VHH#12B og mutant A74S+Y76N+K83R+P84A Figur 5 In vitro reseptor bindingsanalyse av villtype VHH#12B og mutant 1E + Q5LA74S + Y76N + K83R + P84A
Figur 6 Binding i ELISA av villtype VHH#3E og mutant VHH's
Figur 7 In vitro reseptor binding analyse av villtype VHH#3E og mutant VHH's Figur 8 Oppstilling av antagonistisk anti-mus TNF'er som beskrevet i Eksempel 3. Figur 9 Antagonistisk effekt av anti-mus TNF VHH som bestemt i cytotoksisitetsanalyse ved bruk av murin cellelinje L929 ifølge Eksempel 3. Figur 10 EcoRI-Hindlll insert av vektor pAX11 (pUC119 ryggrad) for produksjon av bi- valent eller bi-spesifikt VHH. Figur 11 Coomassie-farget PAGE (15%) av MAC-renset mono- (spor8), bi-(sporl), tri- (spor 2,3 og 5) og tetravalent (spor 4,6 og 7) anti-TNFa VHH. Figur 12 Kromatogram av analysen ved gelfiltrering på Superdex 75HR av det mono-, bi-, tri og tetravalente VHH. Figur 13 Sammenligning av de antagonistiske karakteristikkene til den mono-, bi-, tri-and tetravalente formen av anti-human TNF VHH med de klinisk benyttede produktene Remicade og Enbrel. Figur 14 Antagonistisk oppførsel til mono- og bivalent VHH's rettet mot mus-TNFalfa. Figur 15 Coomassiefarget PAGE av VHH-Fc-fusjon avledet fra human lgG1 beskrevet i Eksempel 4. Figur 16 Antagonistisk effektivitet av VHH-Fc fusjon avledet fra VHH#3E sammenlignet med bivalent format av VHH#3E som bestemt i bioanalyse. Figur 17 ELISA av referanse og pepsin-behandlet TNF3E ved pH 2.2, pH 3.2 og pH 4.2 (100% er signalet målt ved en 1/100 fortynning)
Figur 18 Eksperimentell setting
Tabell 1 Aminosyre sekvensliste av peptidene ifølge aspekter av foreliggende oppfinnelse rettet mot TNF-alfa.
Tabell 2 Liste over mutagenreaksjoner, mutagene primere og templater benyttet for mutagenese av VHH#12B.
Tabell 3 Liste over mutagenesereaksjoner, mutagene primere og templater benyttet for mutagenese av VHH#3E.
Tabell 4 Oversikt av humaniserte og villtype VHH
Tabell 5 Anti-mus serumalbumin/anti TNF-alfa
Tabell 6 Aminosyresekvensliste av VHH's rettet mot human IFN-gamma. Tabell 7 Sekvenser av bivalente (BIV 3E, BIV#m3F), trivalent (TRI3E) eller tetravalent (TETRA 3E) VHH rettet mot TNF-alfa.
Tabell 8 Fraksjonelle homologier mellom aminosyresekvensene for anti-mus serum albumin VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse.
Tabell 9 Fraksjonelle homologier mellom anti-TNF-alfa VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse.
Tabell 10 Prosenter for homologier mellom anti-IFN-gamma VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse.
Tabell 11 Behandlingsplan
Detaljert beskrivelse
Foreliggende oppfinnelse angår et anti-tumor nekrose faktor-alfa (TNF-alfa) polypeptid, minst et anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoff, som definert i hovedkravet, omfattende et eller flere enkeltdomene antistoffer som er rettet mot TNF-alfa. Foreliggende oppfinnelse angår også nukleinsyrer som er i stand til å kode for nevnte polypeptider.
Enkeltdomene antistoffer er antistoffer hvis komplementære bestemmende regioner er del av et enkeltdomene polypeptid. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, tung kjede antistoffer, antistoffer naturlig fri for lette kjeder, enkeltdomene antistoffer avledet fra konvensjonelle 4-kjedede antistoffer, konstruerte antistoffer og enkeltdomene skaffold andre enn de avledet fra antistoffer. Enkeltdomene antistoffer kan være en hvilken som helst av typene, eller et hvilket som helst fremtidig enkeltdomene antistoff. Enkeltdomene antistoffer kan være avledet fra hvilke arter som helst inkludert, men ikke begrenset til mus, menneske, kamel, lama, geit, kanin, storfe. Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er et enkeltdomene antistoffer som benyttet heri et naturlig forekommende enkeltdomene antistoff kjent som tung kjede antistoff fri for lette kjeder. Slike enkeltdomene antistoffer er beskrevet i for eksempel WO 94/04678. Av avklaringsgrunner, er dette variable domenet avledet fra et tungkjedet antistoff som er naturlig fri for lette kjeder, kjent heri som et VHH eller nanolegeme for å skille det fra konvensjonelle VH av firekjedede immunoglobuliner. Et slikt VHH molekyl kan bli avledet fra antistoffer dyrket i Camelidae arter, for eksempel i kamel, dromedar, lama, alpaca og guanaco. Andre arter bortsett fra Camelidae kan produsere tungkjede antistoffer som er naturlig fri for lett kjede; slike VHHs er også aspekter ved foreliggende beskrivelse.
VHHs, ifølge foreliggende oppfinnelse, og som kjent for fagmannen er tungkjede variable domener avledet fra immunoglobuliner som er naturlig fri for lette kjeder slike som de avledet fra Camelidae som beskrevet i WO 94/04678 (og referert heri som VHH domener eller nanolegemer). VHH molekyler er omkring 10x mindre enn IgG molekyler. De er enkle polypeptider og er meget stabile, motstår ekstrem pH- og temperaturbetingelser. Videre, er de resistente overfor virkningen av proteaser, noe som ikke er tilfelle for konvensjonelle antistoffer. Videre, gir vitro ekspresjon av VHHs høye utbytter av riktig foldede funksjonelle VHHs. I tillegg, vil antistoffer generert i Kamelids gjenkjenne epitoper andre enn de som blir gjenkjent av antistoffer generert in vitro ved anvendelsen av antistoffbiblioteker eller via immunisering av pattedyr som er forskjellig fra Camelider (WO 9749805). Som sådan, kan anti-TNF-alfa VHH's vekselvirke mer effektivt med TNF-alfa enn konvensjonelle antistoffer, og derved blokkere dets interaksjon med TNF-alfa reseptoren mer effektivt.
Ifølge foreliggende oppfinnelse, TNF-alfa er avledet fra hvilke som helst arter. Eksempler på arter som er relevant for foreliggende oppfinnelse omfatter kanin, geit, mus, rotter, kyr, kalver, kamel, lama, ape, esel, marsvin, kylling, sau, hunder, katter, hester, og foretrukket mennesker.
TNF-alfa er også et fragment av TNF-alfa, som er i stand til å fremkalle en immunrespons. TNF-alfa er også et fragment av TNF-alfa, som er i stand til å binde seg til a enkeltdomene antistoff dyrket mot fullengde TNF-alfa.
Et enkeltdomene antistoff rettet mot TNF-alfa betyr enkeltdomene antistoff som er i stand til å binde seg til TNF-alfa med en affinitet på mer enn 10"<6>M.
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF polypeptid, hvori enkeltdomene antistoffet omfatter Camelidae VHH rettet mot TNF-alfa.
Det et eller flere enkeltdomene antistoffet av anti-TNF polypeptidet som er rettet mot et TNF-alfa kan ha den samme sekvensen. Alternativt kan de ha forskjellig sekvens. Det er beskrevet her at et anti-TNF polypeptid omfatter anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoffer som ikke id et hele tatt deler samme sekvens, men som er rettet mot det samme målet, ett eller flere antigener derav.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse beskrevet og/eller angitt i kravene er et anti-TNF-alfa polypeptid, hvori et enkeltdomene antistoff tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 1 til 16 og 79 til 84 som vist i TabelH. Nevnte sekvenser er avledet fra Camelidae tungkjede antistoffer (VHHs) som er rettet mot TNF-alfa.
Foreliggende oppfinnelse angår videre et anti-TNF-alfa polypeptid, hvori nevnte enkeltdomene antistoff er et VHH rettet mot TNF-alfa, hvori VHH tilhører en klasse som har human-like sekvenser. Klassen er kjennetegnet ved at VHHs bærer en aminosyre fra gruppen bestående av glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, metionin, serin, treonin, asparagin, eller glutamin i posisjon 45, slike som, for eksempel, L45 og en tryptofan i posisjon 103, ifølge Kabat-nummereringen. Den nye klassen av Camelidae enkelt-domene antistoffer beskrevet i foreliggende oppfinnelse (TabelM, Eksempel 1) er representert ved VHH#2B (SEQ ID NR.: 3) og VHH#12B (SEQ ID Nr. 14) inneholdende de hydrofobe restene i FR2 i kombinasjon med den hydrofobe resten tryptofan i posisjon 103.
En annen human-liknende klasse av Camelidae enkeltdomene antistoffer representert ved sekvenser VHH#1 A (SEQ ID NR. 1), VHH#4B (SEQ ID NR. 12), VHH#8-29 (SEQ ID NR. 81), VHH#8^1 (SEQ ID NR. 82), VHH#8-42 (SEQ ID NR. 83) og VHH#8^4 (SEQ ID NR. 84) (TabelM, Eksempel 1) har blitt beskrevet i W003035694 og inneholder den hydrofobe FR2 resten som typisk blir funnet i konvensjonelle antistoffer av human opprinnelse eller fra andre arter, men kompenserer dette tapet i hydrofilisitet ved den ladede argininresten i posisjon 103 som erstatter den konserverte tryptofanresten som er til stede i VH fra dobbelkjede antistoffer. Som sådan viser peptider som hører til disse to klassene en høy aminosyresekvenshomologi med humane VH rammeverkregioner og nevnte peptider kan bli administrert til mennesker direkte uten forventning om en uønsket immun respons ved dette, og uten byrden med ytterligere humanisering. Foreliggende oppfinnelse angår også nukleinsyrer som er i stand til å kode for nevnte polypeptider.
Derfor tillater et aspekt av foreliggende oppfinnelse som beskrevet og/eller angitt i kravene, direkte administrasjon av et anti-TNF-alfa polypeptid, hvori enkeltdomene antistoffene hører til de humaniserte klassene av VHH, og omfatter en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr: 1, 3,12, 14,81, 82,83, og 84 til en pasient med behov for dette.
En hvilken som helst av VHHene som benyttet ved foreliggende oppfinnelse kan være av den tradisjonelle klassen eller av klassene av human-like Camelidae-antistoffer. Nevnte antistoffer kan være rettet mot hele TNF- alfa eller et fragment derav, eller et fragment av en homolog sekvens derav. Disse polypeptider inkluderer fullengde Camelidae antistoffer, nemlig Fc og VHH domener, kimeriske versjoner av tungkjede Camelidae antistoffer med et humant Fc domene eller VHH's i seg selv eller avledede fragmenter.
Anti-serum albumin VHH's kan vekselvirke på en mer effektiv måte med serum albumin enn konvensjonelle antistoffer som er kjent å være et bærerprotein. Som et bærerprotein kan noen av epitopene av serum albumin kan være utilgjengelig ved bundne proteiner, peptider og mindre kjemiske forbindelser. Da VHH's er kjent å binde til "uvanlige" eller ikke-konvensjonelle epitoper, slike som groper (WO 97/49805), kan affiniteten for slike VHH's til sirkulerende albumin være øket.
Foreliggende oppfinnelse angår også funnet at et anti-TNF polypeptid som beskrevet heri videre omfattende et eller flere enkeltdomene antistoffer rettet mot et eller flere serum proteiner til et individ, har overraskende signifikant forlenget halveringstid i sirkulasjonen til nevnte individ sammenlignet med halveringstiden til anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoffet når det ikke er en del av nevnte konstrukt. Eksempler på slike polypeptider satt opp i Tabell 5 ved SEQ ID Nr.: 30 til 43. Videre, ble nevnte polypeptider funnet å inneha de samme fordelaktige egenskapene til enkeltdomene antistoffer slike som at høy stabilitet forblir intakt i mus, ekstrem pH motstand, høy temperatur stabilitet og høy mål affinitet.
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid ytterligere omfattende et eller flere enkeltdomene antistoffer rettet mot et eller flere serum proteiner, nevnte anti-TNF alfa polypeptid omfatter en sekvens tilsvarende en hvilken som helst representert ved SEQ ID Nr.: 30 til 43 (Tabell 5).
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid, hvori et anti-serum protein enkeltdomene antistoff tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 26 til 29 og 85 til 97 som vist i Tabell5. Serum proteinet kan være et hvilket som helst passende protein funnet i serum til individet. Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er serum proteinet serum albumin, serum immunoglobuliner, tyroksin-bindende protein, transferrin, eller fibrinogen. Avhengig av den tiltenkte anvendelsen slik som den nødvendige halveringstid for effektive behandling og/eller kompartimentalisering av mål antigenet, kan VHH-partneren bli rettet mot serumproteinene ovenfor.
Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri videre omfattende minst ett polypeptid valgt blant gruppen bestående av et anti- IFN-gamma polypeptid, et anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid.
Det er en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse at et enkeltdomene antistoff rettet mot IFN- gamma tilsvarer en sekvens representert til en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 44 til 72 som vist i Tabell 6.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er et enkeltdomene antistoff rettet mot TNF-alfa reseptor. Nevnte enkeltdomene antistoff kan være et Camelidae
VHH.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er et enkeltdomene antistoff rettet mot IFN-gamma reseptor. Nevnte enkeltdomene antistoff kan være et Camelidae VHH.
Et annet aspekt av oppfinnelsen er en effektiv mengde av et anti-TNF-alfa polypeptid som videre innbefatter minst et polypeptid valgt fra gruppen bestående av anti-IFN-gamma polypeptid, anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og en anti-IFN-gamme reseptor polypeptid, slike polypeptider er forbundet med hverandre som beskrevet under, for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, ved administrering til en pasient, an autoimmun lidelse eller tilstand som angitt her.
Slike multi-spesifikke konstrukter kan ha forbedret kraft som inflammatorisk terapeutiske forbindelser over mono-spesifikke konstrukter.
Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en sammensetning omfattende et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri og minst ett polypeptid valgt blant gruppen bestående av anti- IFN-gamma polypeptid, anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ.
Et aspekt ved oppfinnelsen er en effektiv mengde av et anti-TNF-alfa polypeptid og minst et polypeptid valgt fra gruppen bestående av anti-IFN-gamma polypeptid, anti-TFN-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid, for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, ved administrering til et individ samtidig, separat eller sekvensielt, av en autoimmun lidelse.
Et annet aspekt beskrevet her er et sett inneholdende et anti-TNF-alfa polypeptid og et minst et polypeptid valgt blant gruppen bestående av anti-IFN-gamma polypeptid, anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ. Det er også beskrevet at settet kan bli benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er også beskrevet at settet kan bli benyttet for å behandle sykdommene som angitt heri.
Ved samtidig administrasjon menes at polypeptidene blir administrert til et individ på samme time. For eksempel, som en blanding av polypeptidene eller en sammensetning omfattende nevnte polypeptider. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til en oppløsning administrert intravenøst, en tablett, væske, topikal krem, etc, hvori hvert preparat omfatter polypeptidene av interesse.
Ved separat administrasjon menes at polypeptidene blir administrert til et individ ved den samme time eller hovedsakelig ved den samme time. Polypeptidene er til stede i settet som separate, ublandede preparater. For eksempel, kan forskjellige polypeptider være til stede i settet som individuelle tabletter. Tablettene kan bli administrert til individet ved svelging av begge tablettene samtidig, eller en tablett rett etter den andre.
Ved sekvensiell administrasjon menes polypeptidene blir administrert til et individ sekvensielt. Polypeptidene er til stede i settet som separate, ublandede preparater.
Der er et tidsintervall mellom doser. For eksempel, kan et polypeptid bli administrert opp til 336,312, 288,264, 240,216, 192,168, 144,120, 96,72, 48,24, 20, 16,12, 8,4, 2,1, eller 0,5 timer etter den andre komponenten.
Ved sekvensiell administrasjon, kan et polypeptid bli administrert en gang, eller et hvilket som helst antall ganger og i forskjellige doser før og/eller etter administrasjon av et annet polypeptid. Sekvensiell administrasjon kan bli kombinert med samtidig eller sekvensiell administrasjon.
De medisinske anvendelsene av anti-TNF-alfa polypeptidet beskrevet nedenfor, gjelder også sammensetningene omfattende et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri og minst ett polypeptid valgt blant gruppen bestående av anti-IFN-gamma polypeptid, anti- TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ som beskrevet ovenfor.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, kan et anti-IFN-gamma polypeptid anti-TNF-alfa et enkeltdomene antistoff rettet mot IFN-gamma. Nevnte enkeltdomene antistoff kan være et Camelidae VHH.
Det er en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse at et enkeltdomene antistoff rettet mot IFN- gamma tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr.: 44 til 72 som vist i Tabell 6.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er anti-TNF-alfa et enkeltdomene antistoff rettet mot TNF-alfa reseptor. Nevnte enkeltdomene antistoff kan være et Camelidae VHH.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, et anti-IFN-gamma reseptor polypeptid anti- TNF-alfa et enkeltdomene antistoff rettet mot IFN-gamma reseptor. Nevnte enkeltdomene antistoff kan være et Camelidae VHH.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, hvori antallet av enkeltdomene antistoffer rettet mot TNF- alfa er to eller flere. Slike multivalent anti-TNF-alfa polypeptider har fordelen av uvanlig høy funksjonell affinitet for målet, de viser mye høyere enn forventet inhibitoriske egenskaper sammenlignet med deres monovalente motparter.
De multivalent anti-TNF-alfa polypeptidene har funksjonelle affiniteter som er flere størrelsesordener større enn de opphavelige monovalent anti-TNF-alfa polypeptidene. Oppfinnerne har funnet at de funksjonelle affinitetene til disse multivalent polypeptidene er mye høyere enn de rapportert i den kjente teknikken for bivalente og multivalente antistoffer. Overraskende, viser anti-TNF-alfa polypeptider beskrevet her, som er forbundet til hverandre direkte (SEQ ID Nr. 77 og 78) eller via en kort linkersekvens de høye funksjonelle affinitetene som er forventet teoretisk med multivalent konvensjonelle firekjedede antistoffer.
Oppfinnerne har funnet at slik stor øket funksjonell aktivitet kan bli detektert foretrukket med antigener sammensatt av multidomene og multimere proteiner, enten i direkte bindingsanalyser eller i funksjonelle analyse, f.eks. cytotoksisitetanalyser.
En annen utførelsesform beskrevet her er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, hvori antallet enkeltdomene antistoffer rettet mot TNF- alfa er to eller flere, hvor nevnte anti-TNF-alfa polypeptid omfatter en sekvens tilsvarende en hvilken som helst representert ved SEQ ID Nr.: 73 til 76.
Enkeltdomene antistoffene kan bli forbundet for a danne en hvilken som helst av polypeptidene beskrevet heri omfattende mer enn ett enkeltdomene antistoff ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken eller en hvilken som helst fremtidig fremgangsmåte. For eksempel, kan de bli forbundet ved kjemiske tverrbinding ved reagering av aminosyrerester med et organisk derivatisende middel slik som beskrevet av Blattler et al, Biochemistry 24,1517-1524 ; EP294703. Alternativt, kan enkeltdomene antistoffet være fused genetisk ved DNA-nivå, dvs. Et dannet polynukleotidkonstrukt som koder for det fullstendige polypeptidkonstruktet omfattende et eller flere anti-mål enkeltdomene antistoffer og et eller flere anti-serum protein enkeltdomene antistoffer. En fremgangsmåte for fremstilling av bivalente eller multivalente VHH polypeptidkonstrukter er beskrevet i PCT patentsøknad WO 96/34103. En måte sammenføyning av multiple enkeltdomene antistoffer er via den genetiske veien ved sammenføyning av enkeltdomene antistoff-kodende sekvenser enten direkte eller via en peptidlinker. For eksempel, kan den C-terminale enden av det første enkeltdomene antistoffet være forbundet til den N-terminale enden av det neste enkeltdomene antistoffet. Denne sammenføyningsmåten kan bli utvidet til å forbinde videre enkeltdomene antistoffer for konstruksjonen og produksjonen av tri-, tetra-, etc. funksjonelle konstrukter.
Ifølge et aspekt beskrevet her, er enkeltdomene antistoffene er forbundet til hverandre direkte, uten bruk av en linker. I motsetning til å sammenføye store konvensjonelle antistoffer hvor en linkersekvens er nødvendig for å opprettholde bindingsaktiviteten i de to subenhetene, kan polypeptider b bli forbundet direkte (SEQ ID Nr. 77 og 78) for derved å unngå potensielle problemer med linkersekvensen, slike som antigenisitet når administrert til et humant individ, instabilitet i linkersekvensen som fører til dissosiasjon av subenhetene.
Ifølge et annet aspekt beskrevet her, er enkeltdomene antistoffer forbundet til hverandre via en peptid linkersekvens. Slike linkersekvenser kan være en naturlig forekommende sekvens eller en unaturlig forekommende sekvens. Linkersekvensener forventet å være ikke-immunogene overfor individet til hvilket anti-TNF-alfa polypeptid blir administrert. Linkersekvensen kan fremskaffe tilstrekkelig fleksibilitet til det multivalente anti-TNF-alfa polypeptidet, og på samme time være resistent overfor proteolytisk degradering. Et ikke-begrensende eksempel på en linkersekvenser er en som kan bli avledet fra hengsleregionen til VHHs beskrevet i WO 96/34103.
Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan multivalent enkeltdomene antistoffer omfattende mer enn to enkeltdomene antistoffer, bli linket til hverandre enten direkte eller via en linkersekvens. Slike konstrukter er vanskelig å fremstille med konvensjonelle antistoffer og på grunn av steriske hindringer ved store subenheter, funksjonalitet vil bli tapt eller sterkt redusert, heller enn å øke betydelig som sett med VHH's ifølge foreliggende oppfinnelse sammenlignet med det monovalente konstruktet (se Figur 12 for gelfiltreringsanalyser for slike multivalente VHH konstrukter).
Polypeptidkonstruktene beskrevet heri kan bli utført av fagmannen ifølge fremgangsmåter som er kjent i teknikken eller en hvilken som helst fremtidig fremgangsmåte. For eksempel, kan VHHs bli fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken slike som ved immunising av en kamel og fremskaffelse av hybridomas fra dette, eller ved kloning av et bibliotek av enkeltdomene antistoffer ved bruk av molekylærbiologiske teknikker som er kjent i teknikken og etterfølgende utvelgelse ved bruk av fagdisplay.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en homolog sekvens av et fullengde anti-TNF-alfa polypeptid. Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en funksjonell del av et fullengde anti-TNF-alfa polypeptid. Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en homolog sekvens av et fullengde anti-TNF- alfa polypeptid. Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en funksjonell del av en homolog sekvens av et fullengde anti- TNF-alfa polypeptid. Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse kan et anti-TNF-alfa polypeptid omfatte en sekvens av et anti-TNF-alfa polypeptid.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse kan et enkeltdomene antistoff brukt til å danne et anti- TNF-alfa polypeptid være et komplett enkeltdomene antistoff (f.eks. et VHH) eller en homolog sekvens derav. Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen i et spesifikt aspekt: et anti-TNF-alfa polypeptid innbefattende minst et anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoff innbefattende:
(a) en sekvens representert ved SEQ ID NO: 1, eller
(b) en homolog sekvens som representerer en sekvensidentitet på mer enn 85% hvor foreldresekvensen er representert av SEQ ID NO: 1, hvor de homologe sekvensen inneholder de hydrofobe FR2 restene som typisk finnes i konvensjonelle antistoffer av humant opphav og en argininrest ved posisjon 103 (nummerering i henhold til Kabat).
Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan et enkeltdomene antistoff brukt til å danne polypeptidet konstrukt være en funksjonell del av et komplett enkeltdomene antistoff. Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan et enkeltdomene antistoff brukt til form polypeptidet konstrukt være en homolog sekvens av et komplett enkeltdomene antistoff. Ifølge et annet aspekt beskrevet her, kan et enkeltdomene antistoff brukt til form polypeptidet konstrukt være en funksjonell del av en homolog sekvens av et komplett enkeltdomene antistoff.
Som benyttet heri, kan homolog sekvens av foreliggende oppfinnelse omfatte addisjoner, delesjoner eller substitusjoner av en eller flere aminosyrer, som ikke betydelig endrer funksjonelle karakteristikker til polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Antallet aminosyredelesjoner eller -substitusjoner er fortrinnsvis opp til 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13,14, 15,16, 17,18, 19,20, 21,22, 23,24, 25,26, 27,28, 29,30, 31,32, 33,34, 35,36, 37,38, 39,40, 41,42, 43,44, 45,46, 47,48, 49,50, 51,52, 53,54, 55,56, 57,58, 59,60, 61,62, 63,64, 65,66, 67,68, 69 eller 70 aminosyrer.
En homolog sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et polypeptid modifisert ved addisjon, delesjon eller substitusjon av aminosyrer, nevnte modifikasjon endrer ikke betydelig de funksjonelle karakteristikker sammenlignet med det umodifiserte polypeptidet.
En homolog sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et polypeptid modifisert ved addisjonen, delesjonen eller substitusjonen av aminosyrer, hvor nevnte modifikasjon ikke betydelig endrer de funksjonelle karakteristikker sammenlignet med det umodifisert polypeptid.
En homolog sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse kan være en sekvens som eksiterer i andre Camelidae arter slike som, for eksempel, kamel, dromedar, lama, alpaca, guanaco etc.
Hvor homologe sekvenser indikerer sekvensidentitet, betyr det en sekvens som har en høy sekvensidentitet (mer enn 85%, 90%, 95% eller 98% sekvensidentitet) med morsekvens og er foretrukketkarakterisert vedtilsvarende egenskaper som morsekvensen, nemlig affinitet, hvor nevnte identitet er beregnet ved bruk av kjente fremgangsmåter.
Alternativt, kan en homolog sekvens også være en hvilken som helst aminosyresekvens som er resultat av tillatte substitusjoner ved et hvilket som helst antall posisjoner i morsekvensen ifølge formelen nedenfor: Ser substituert med Ser, Thr, Gly, og Asn;
Arg substituert med en av Arg, His, Gin, Lys, og Glu ;
Leu substituert med en av Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, og Val;
Pro substituert med en av Pro, Gly, Ala, og Thr;
Thr substituert med en av Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, og Gin ;
Ala substituert med en av Ala, Gly, Thr, og Pro;
Val substituert med en av Val, Met, Tyr, Phe, Ile, og Leu;
Gly substituert med en av Gly, Ala, Thr, Pro, og Ser;
Ile substituert med en av Ile, Met, Tyr, Phe, Val, og Leu;
Phe substituert med en av Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val, og Leu;
Tyr substituert med en av Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val, og Leu;
His substituert med en av His, Glu, Lys, Gin, Thr, og Arg;
Gin substituert med en av Gin, Glu, Lys, Asn, His, Thr, og Arg;
Asn substituert med en av Asn, Glu, Asp, Gin, og Ser;
Lys substituert med en av Lys, Glu, Gin, His, og Arg;
Asp substituert med en av Asp, Glu, og Asn;
Glu substituert med en av Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His, og Arg;
Met substituert med en av Met, Phe, lie, Val, Leu, og Tyr.
En homolog nukleotidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse kan referere til nukleotidsekvenser med mer enn 50,100, 200,300, 400,500, 600,800 eller 1000 nukleotider som er i stand til å hybridisere til reverse-komplementet av nukleotidsekvensen som er i stand å kode for morsekvensen, under stringente hybridiseringsbetingelser (slike som de beskrevet av Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York). Som benyttet heri, refererer en funksjonell del til en sekvens av et enkeltdomene antistoff som er av tilstrekkelig størrelse slik at vekselvirkningen av interesse blir oppretthold med affinitet på 1 x 10-<6>M eller bedre.
Alternativt, omfatter en funksjonell del en delvis delesjon av den fullstendige aminosyresekvensen og fremdeles opprettholdelse av bindingssetet og proteindomenet som er nødvendig for bindingen av og vekselvirkningen med målet.
Som beskrevet heri, referer en funksjonell del til mindre enn 100% av den fullstendige sekvens (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1 % etc), men omfatter 5 eller flere aminosyrer eller 15 eller flere nukleotider.
Mål som nevnt heri, slik som TNF-alfa, TNF-alfa reseptor, serum proteiner (f.eks. serum albumin, serum immunoglobuliner, tyroksin-bindende protein, transferrin, fibrinogen) og IFN-gamma, IFN-gamma reseptor, kan være fragmenter av nevnte mål. Således er et mål også et fragment av nevnte mål, som er i stand til fremkalle en immunrespons. Et mål er også et fragment av nevnte mål, som er i stand til å binde seg til et enkeltdomene antistoff dyrket mot fullengde mål.
Et fragment som benyttet heri referer til mindre enn 100% av sekvensen (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etc. ), men omfattende 5,6, 7,8, 9,10, 12,13, 14,15, 16,17, 18,19, 20,21, 22,23, 24,25 eller flere aminosyrer. Et fragment er av tilstrekkelig lengde dersom vekselvirkningen er interesse blir oppretthold med affinitet på 1 x 10-<6>M eller bedre.
Et fragment som benyttet heri, referer også til eventuelle insertsjoner, delesjoner og substitusjoner av en eller flere aminosyrer som ikke betydelig endrer evnen til målet til å binde til et enkeltdomene antistoff dyrket mot villtype målet. Antallet aminosyrers insertsjoner, delesjoner eller substitusjoner er fortrinnsvis opp til 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13,14, 15,16, 17,18, 19,20, 21,22, 23,24, 25,26, 27,28, 29,30, 31,32, 33,34, 35,36, 37,38, 39,40, 41,42, 43,44, 45,46, 47,48, 49,50, 51,52, 53,54, 55,56, 57,58, 59,60, 61,62, 63,64, 65,66, 67,68, 69 eller 70 aminosyrer.
En homolog sekvens av foreliggende oppfinnelse kan inkludere et anti-TNF-alfa polypeptid som har blitt humanisert. Humaniseringen av antistoffer av den nye klassen av VHHs vil ytterligere redusere muligheten for uønskede immunologisk reaksjon i et menneske etter administrasjon.
En utførelsesform beskrevet her angår en fremgangsmåte for fremstilling av modifiserte polypeptider basert på lamaantistoffer ved bestemmelse av aminosyrerestene til antistoffets variable domene (VHH) som kan være modifisert uten reduksjon av opprinnelig affinitet av domenet for antigen og samtidig reduksjon av dets immunogenisitet med hensyn på en heterolog art; anvendelsen av VHHs som har modifikasjoner ved de identifiserte restene som er nyttige for administrasjon til heterologe arter; og VHH modifisert på denne måten.
Mer spesifikt, beskriver foreliggende oppfinnelse fremstillingen av modifisert VHHs, som er modifisert for administrasjon til mennesker, de resulterende VHH som sådan, og anvendelsen av slike "humaniserte" VHHs i behandlingen av sykdommer i mennesker. Ved humaniserte er det ment muterte slik at immunogenisiteten etter administrasjon i humane pasienter er liten eller ikke eksiterende. Humanising av et polypeptid, ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter et trinn ved å erstatte en eller flere av Camelidae aminosyrene med deres humane motparter funnet i den humane konsensussekvensen, uten at polypeptidet mister sin typiske karakter, dvs. Humaniseringen påvirker ikke signifikant antigenets bindingskapasitet til det resulterende polypeptidet. Slike fremgangsmåter er kjent av fagmannen.
Humanisering av Camelidae enkeltdomene antistoffer krever introduksjonen og mutagenese av en begrenset mengde av aminosyrer i en enkel polypeptidkjede. Dette er i motsetning til humanisering av scFv, Fab, (Fab) 2 og IgG, som krever introduksjonen av aminosyreendringer i to kjeder, den lette og den tunge kjeden og konservering i sammensetningen av begge kjedene.
Som et ikke begrensende eksempel, ble polypeptidet ifølge VHH#12B inneholdende human-liknende rester i FR2 humanisert. Humanisering krever mutagenese av rester i FR1 i posisjon 1 og 5 som ble introdusert ved primeren benyttet for repertoirlloning og forekommer ikke naturlig i lamasekvensen. Mutagenese av disse restene resulterte ikke i tap av bindings- og/eller inhiberingsaktivitet. Humanisering krever også mutagenese av rester i FR3 i posisjon 74,76, 83,84, 93. Mutagenese av de restene resulterte ikke i et dramatisk tap av bindings- og/eller inhiberingsaktivitet (se Figur 4). Kombinasjon av mutasjonene av FR1 og FR3 påvirket derfor ikke bindings og/eller inhiberingsaktivitet (Figur 5).
Humanisering krever også mutagenese av rester i FR4 i posisjon 108. Mutagenese av Q108L resulterte i lavere produksjonsnivåer i Escherichia coli. Posisjon 108 er eksponert for løsemiddel i kamelid VHH, mens i humane antistoffer er denne posisjonen begravet ved VH-VL grensesnittet (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). I isolert VHs er posisjon 108 eksponert for løsemiddel. Introduksjonen av et ikke-polar hydrofobe Leu i steder for polart uladet Gin kan ha en drastisk effekt på egenfolding/stabilitet til molekylet.
Som et ikke begrensende eksempel, ble polypeptidet representert i VHH#3E inneholdende Camelid hallmark-rester i posisjon 37,44, 45 og 47 med hydrofil karakteristikk, humanisert. Erstatning av de hydrofile restene med humane hydrofobe rester i posisjoner 44 og 45 (E44G og R45L), hadde ikke en effekt på binding og/eller inhibrering. Imidlertid, ble tap av bindings og/eller inhibrering aktivitet observert når F37V og F47W ble introdusert. Modelleringsdata bekreftet at den kritiske rest 37 opprettholdt integriteten til CDR3 sløyfekonformasjonen og således aktiviteten (se Figur 6) (all nummerering ifølge Kabat).
SEQ ID Nr: 3 og 14 viser mer enn 90% aminosyresekvenshomologi med humane VH rammeverkregioner og derfor kan nevnte VHH bli administrert til pasienter direkte uten forventing om en immunrespons fra dette, og uten den videre byrden ved humanisering. Derfor tillater et aspekt beskrevet her den direkte administrasjon av polypeptidet omfattende SEQ ID NR.: 3 og 14, homologe sekvenser derav, eller en funksjonell del av en homolog sekvens derav til en pasient som har behov for dette.
En utførelsesform beskrevet her er en fremgangsmåte for humanisering av et VHH omfattende trinnene erstatning av en hvilken som helst av de følgende restene enten alene eller i kombinasjon:
FR1 posisjon 1,5, 28 og 30,
hallmarkaminosyren i posisjon 44 og 45 i FR2,
FR3 rester 74,75, 76,83, 84,93 og 94,
og posisjoner 103,104, 108 og 111 i FR4 ;
nummerering ifølge Kabat-nummerering.
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid, eller en nukleinsyre som koder for nevnte polypeptid for bruk i behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser som er relatert til inflammatoriske prosesser. TNF-alfa er involvert i inflammatoriske prosesser, og blokkeringen av TNF-alfa virkning kan ha en anti- inflammatorisk effekt, som er sterkt ønskelig i visse sykdomstilstander slike som, for eksempel, Crohn's sykdom. Våre eksempler demonstrerer VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse som binder TNF-alfa og videre, blokkerer binding til TNF-alfa reseptoren.
Anti-TNF-alfa polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelige mot autoimmune sykdoms, slike som Addison's sykdom (adrenal), autoimmune sykdommer i øret (øret), autoimmune sykdommer i øyet (øye), autoimmun hepatitis (lever), Autoimmun parotitis (ørekjertler), Crohn's sykdom (tarmene), Diabetes Type I (pancreas), Epididymitis (epididymis), Glomerulonephritis (nyre), Graves' sykdom (tyroidea), Guillain-Barre syndrom (nerveceller), Hashimoto's sykdom (tyroidea), Hemolytisk anemia (rode blodceller), Systemisk lupus erythematosus (multiple vev), mannlig infertilitet (sperm), Multippel sklerose (nerveceller), Myasthenia Gravis (nevromuskulære forbindelser), Pemphigus (primært hud), Psoriasis (hud), Reumatisk feber (hjertet og ledd), Reumatoid artritis (leddlining), Sarcoidosis (multiple vev og organer), Scleroderma (hud og bindevev), Sjøgren's syndrom (eksokrine kjertler, og andre vev), Spondyloarthropathies (aksial skjelett, og andre vev), Thyroiditis (tyroida), Vasculitis (blodkar). I parentes står vevene påvirket av sykdommen. Denne listen over autoimmune sykdommer er ment som eksempel og ikke fullstendig.
Autoimmune tilstander for hvilke anti-TNF-alfa polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelige inkluderer, for eksempel, AIDS, atopisk allergi, bronchial astma, eksem, lepra, schizofreni, arvelig depresjon, transplantasjon av vev og organer, kronisk utmattelses syndrom, Alzheimers sykdom, Parkinson's sykdom, myocardial infarkt, slag, autisme, epilepsi, Arthus's fenomen, anafylaksi, og alkohol- og narkotikaavhengighet. I de ovenfor identifiserte autoimmune tilstander, er det påvirkede vevet det primære mål, i andre tilfeller er det det sekundære mål. Disse tilstandene er delvis eller hovedsakelig autoimmune syndromer. Derfor, ved behandling av dem, er det mulig å benytte de samme fremgangsmåter, eller aspekter av de samme fremgangsmåter som er beskrevet heri, noen ganger i kombinasjon med andre fremgangsmåter.
Polypeptider og nukleinsyres ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert til et individ ved konvensjonelle ruter, slike som intravenøst. Imidlertid, er en spesialegenskap ved anti-TNF-alfa polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse at de penetrerer barrierer slik som vevsmembraner og/eller tumorer og virker lokalt og virker lokalt på disse og er tilstrekkelig stabile til å motstå ekstreme miljøer slik som i magen. Derfor, angår et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse leveringen av anti-TNF-alfa polypeptider.
Et individ kan ifølge foreliggende oppfinnelse være et hvilket som helst pattedyr som er mottakelig for behandling ved terapeutisk polypeptider.
Oral levering av anti-TNF-alfa polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse resulterer i fremskaffelsen av slike molekyler i en aktiv form i colon ved lokalstedet som er påvirket av forstyrrelsen. Disse stedene kan være sterkt inflammert og inneholde TNF-alfa-fremstillende celler. Anti-TNF-alfa polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som binder til TNF-alfa kan nøytralisere TNF-alfa lokalt, unngå distribusjon gjennom hele kroppen og således begrense negative bi-effekter. Genetisk modifiserte mikroorganismer, slik som Micrococcus lactis er i stand til å utskille antistoff eller funksjonelle deler derav. Slike modifiserte mikroorganismer kan bli benyttet som bærere for lokal produksjon og levering av antistoffer eller funksjonelle deler derav i tarmen. Ved å benytte en stamme som produserer et anti-TNF-alfa polypeptid, kan inflammatorisk tarmsyndrom bli behandlet.
Et annet aspekt beskrevet her omfatter levering av anti-TNF polypeptider ved å benytte overflateekspresjon på eller sekresjon fra ikke-invasive bacterier, slike som Gram-positive vertsorganismer som Lactococcus spee. ved bruk av en vektor slik som beskrevet i WO00/23471.
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for bruk i behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å passere det gastriske miljøet uten at stoffet blir inaktivert.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som forårsaker inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, uleerative colitis, inflammatorisk tarmsyndrom, og multippel sklerose. Som kjent av fagmannen, straks man har tilgang til nevnte polypeptidkonstrukt, kan formuleringsteknologien bli benytt for å frigid en maksimal mengde av polypeptidet på det rette stedet (i magen, i kolon etc). Denne fremgangsmåten for levering er viktig for behandling, forhindring og/eller lettelser av symptomene på forstyrrelser hvis mål er lokalisert i tarmsystemet.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet her, for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller lettelse, ved oral administrering til et individ, av symptomene på en forstyrrelse som er mottakelig for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å passere det gastriske miljøet uten at den bli inaktivert.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering av et TNF-alfa modulerende stoff til tarmsystem uten at nevnte stoff blir inaktivert, ved oral administrering til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering av et TNF-alfa modulerende stoff til blodstrømmen til et individ uten at stoffet blir inaktivert, ved oral administrering til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for bruk ved behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomer eller forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som forårsaker inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarm syndrom, og multippel sklerose. I et ikke begrensende eksempel, omfatter formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, i form av en gel, krem, stikkpiller, film, eller i form av en svamp eller en vaginal ring som sakte frigir den aktive ingrediensen over time (slike formuleringer blir beskrevet i EP 707473, EP 684814, US 5629001).
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet her, for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering av et TNF-alfa modulerende stoff til den vaginale og/eller rektale trakt uten at nevnte stoff blir inaktivert, ved administrering til den vaginale og/eller rektale trakt til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering av et TNF-alfa modulerende stoff til blodstrømmen til et individ uten at nevnte stoff blir inaktivert, ved administrering til den vaginale og/eller rektale trakt til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, for bruk i behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til nesen, øvre respirasjonstrakten og/eller lungene.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som forårsaker inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarmsyndrom, og multippel sklerose. I et ikke begrensende eksempel, omfatter en formulering ifølge foreliggende oppfinnelse, et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri i form en nesespray (f.eks. en aerosol) eller inhalator. Da polypeptidkonstrukt er lite, kan det nå sitt mål mye mer effektivt enn terapeutiske IgG-molekyler.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet her for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller lettelse, ved administrering til et individ, ved inhalasjon gjennom munnen eller nesen, av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til den øvre respirasjonstrakten og lungene.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til nesen, den øvre respirasjonstrakten og/eller lungen, uten at nevnte polypeptid blir inaktivert.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering et TNF-alfa modulerende stoff til nesen, øvre respirasjonstrakten og lungen uten inaktivering, ved administrering til nesen, den øvre respirasjonstrakten og/eller lungen til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering av et TNF-alfa modulerende stoff til blodstrømmen til et individ uten inaktivering ved administrering til nesen, øvre respirasjonstrakten og/eller lungen til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for bruk i behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til tarmmucosa, hvori nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til tarmmucosa. På grunn av deres lille størrelse, kan et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri passere tarmmucosa og nå blodstrømmen mer effektivt i individer som lider av forstyrrelser som forårsaker en økning i permeabiliteten til tarmmucosa, for eksempel Crohn's sykdom.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet her for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller lettelse, ved oral administrering til et individ, av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til tarmmucosa, hvori nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten av tarmmucosa.
Denne prosessen kan ytterligere bli øket ifølge et videre aspekt av foreliggende oppfinnelse - anvendelsen av aktive transportbærere. Ifølge dette aspektet av foreliggende oppfinnelse, blir VHH sammenføyd med en bærer som øker overføringen i tarmveggen inn i blodstrømmen. I et ikke begrensende eksempel, er denne "bæreren" en andre VHH som blir brukt til det terapeutiske VHH. Slike fusjonskonstrukter blir fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken. "Bærer" -VHH binder spesifikt til en a reseptor på tarmveggen som induserer en aktiv overføring gjennom veggen.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering et TNF-alfa modulerende stoff til tarmmucosa uten at det blir inaktivert, ved administrering oralt til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering et TNF-alfa modulerende stoff til blodstrømmen til et individ uten at det blir inaktivert, ved administrering oralt til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse.
Denne prosessen kan bi ytterligere øket ved et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse - anvendelsen av aktive transportbærere. Ifølge dette aspektet av foreliggende oppfinnelse, blir et anti-TNF- alfa polypeptid som beskrevet heri sammenføyd med en bærer som øker overføringen gjennom tarmveggen inn i blodstrømmen. I et ikke begrensende eksempel, er denne "bæreren" et VHH som blir brukt som nevnte polypeptid. Slike fusjonskonstrukter blir fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken. "Bærer"-VHH binder spesifikt til en reseptor på tarmveggen som induserer en aktiv overføring over veggen.
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for bruk i behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å passere gjennom vevet under tungen effektivt.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som forårsaker inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarm syndrom, og multippel sklerose. En formulering av nevnte polypeptidkonstrukt som beskrevet heri, for eksempel, en tablett, spray, dråpe blir plassert under tungen og adsorbert av mucusmembranene inn i det kapillære nettverket under tungen.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet her, for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene, ved sublingval administrering til et individ, på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å passere gjennom vevet under tungen effektivt, ved sublingual administrering til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til å pass gjennom vevet under tungen.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering et TNF-alfa modulerende stoff til vevet under tungen uten at det blir inaktivert, ved administrering sublingvalt til et individ av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering et TNF-alfa modulerende stoff til blodstrømmen til et individ uten at det blir inaktivert, ved administrering oralt til et individ et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for bruk i behandling, forhindring og/eller lettelse av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til effektivt å passere gjennom huden.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som forårsaker inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarm syndrom, og multippel sklerose. En formulering av nevnte polypeptid konstrukt, foreksempel, en krem, film, spray, dråpe, plaster, blir anbrakt på huden og passerer gjennom.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet her, for bruk ved en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller lettelse, ved topisk administrering til et individ, av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til pass gjennom huden effektivt.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering et TNF-alfa modulerende stoff på huden uten at det blir inaktivert, ved administrering topikalt til et individ an anti-TNF- alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for levering av et TNF-alfa modulerende stoff til blodstrømmen til et individ, ved administrering topikalt til et individ et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, omfatter anti-TNF-alfa polypeptidet ytterligere et bærer enkeltdomene antistoff (f.eks. VHH) som virker som en aktiv transportbærer for transport av nevnte anti-TNF-alfa polypeptid, fra lungelumen til blodet.
Et anti-TNF-alfa polypeptid videre omfattende en bærer som binder spesifikt til en reseptor som er til stede på den mucosale overflaten (bronkiale epitelceller) for å resultere i den aktive transporten av polypeptidet fra lungelumen til blodet. Bærer enkeltdomene antistoffet kan bli brukt til polypeptidkonstruktet. Slike fusjonskonstrukter kan bli fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken og er beskrevet heri. "Bærer"enkeltdomene antistoffet binder spesifikt til en reseptor på den mucosale overflaten og induserer en aktiv overføring over overflaten.
Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for å bestemme hvilke enkeltdomene antistoffer (f.eks. VHHs) som blir aktivt transportert inn i blodstrømmen etter nasal administrasjon. Tilsvarende kan et nativt eller immun VHH fag-bibliotek, bli administrert nasalt, og etter forskjellige tidspunkter etter administrasjon, kan blod eller organer bli isolert for å fange opp fag som har blitt aktivt transportert inn i blodstrømmen. Et ikke begrensende eksempel på en reseptor for aktiv transport fra lungelumen til blodstrømmen er Fc-reseptoren N (FcRn). Et aspekt av foreliggende oppfinnelse inkluderer VHH- molekyler identifisert ved fremgangsmåten. Slike VHH kan så bli benyttet som en bærer-VHH for leveringen av et terapeutisk VHH til det tilsvarende mål i blodstrømmen etter nasal administrasjon.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse, kan man benytte et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, for å screene for midler som modulerer bindingen av polypeptidet til TNF- alfa. Når identifisert i en analyse som måler binding eller nevnte polypeptid erstatning alene, må midler bli utsatt for funksjonell testing for å bestemme om de vil modulere virkningen av antigenet in vivo. Eksempler på screening-analysere er gitt nedenfor primært med hensyn på SEQ ID NR.: 3, selv om hvilke som helst anti-TNF-alfa polypeptider som beskrevet heri kan være passende.
I et eksempel på displasementeksperiment, blir fag eller celler som uttrykker TNF-alfa eller et fragment derav inkubert i bindingsbuffer med, for eksempel, et polypeptid representert ved SEQ ID NR.: 3 som har blitt merket, i nærvær eller fravær av økende konsentrasjoner av en kandidatmodulator. For å validere og kalibrere analysen, kan kontroll konkurransereaksjoner ved bruk av økende konsentrasjoner av nevnte polypeptid og som er umerket, bli utført. Etter inkubering blir celler grundig vasket og bundet, merket polypeptid blir målt som passende for det gitte merket (f.eks., scintillasjonstelling, fluorescens, etc). En reduksjon på minst 10% i mengden av market polypeptid bundet i nærvær av kandidatmodulator indikerer fortrengning av bindingen av kandidatmodulatoren. Kandidatmodulatorer er anset å binde spesifikt i denne eller andre analyser beskrevet heri dersom de erstatter 50% av merket polypeptid (ikke-mettende polypeptidose) ved en konsentrasjon på 1 M eller mindre.
Alternativt kan binding eller fortrenning av binding bli målt ved overflate plasmon resonans ("surface plasmon resonance" (SPR)). Overflate plasmon resonansanalyser kan bli benyttet som en kvantitativ fremgangsmåte for å mål binding mellom to molekyler ved endringen av massen nær en immobilisert sensor forårsaket av bindingen eller tap av binding av, for eksempel, polypeptidet representert ved SEQ ID NR.: 3 fra den vandige fasen til TNF-alfa immobilisert i en membran på sensoren. Denne endringen i masse blir målt som resonansenheter versus tid etter injeksjon eller fjerning av nevnte polypeptid eller kandidatmodulator og blir målt ved bruk av en Biacore Biosensor (Biacore AB). TNF-alfa kan for eksempel være immobilisert på en sensorchip (for eksempel, forskningsgrad CM5 chip; Biacore AB) i et tynnfilm lipidmembran ifølge fremgangsmåter beskrevet av Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sei. 24: 213-219) Sarrio et al. viste at SPR kan bli brukt til detektere ligandbinding til GPCR A (1) adenosinreseptor som var immobilisert i et lipidlag på chippen (Sarrio et a/., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174). Betingelser for bindingen av SEQ ID Nr: 3 til TNF-alfa i en SPR analyse kan bli fininnstilt av fagmannen ved bruk av de samme betingelser som rapportert av Sarrio et al. som et startpunkt.
SPR kan analysere for bindingsmodulatorer på minst o måter. Først, kan et polypeptid representert ved SEQ ID NR.: 3, for eksempel, bli pre-bundet til immobilisert TNF-alfa fulgt av injeksjon av kandidatmodulator ved en konsentrasjon i området fra 0,1 nM to 1 nM. Fortrengning av bundet polypeptid kan bli kvantifisert, noe som tillater deteksjon av modulatorbinding. Alternativt, kan det membran-bundne TNF-alfa bli pre-inkubert med en kandidatmodulator og utfordret med for eksempel, et polypeptid representert ved SEQ ID NR.: 3. En forskjell i bindingsaffinitet mellom nevnte polypeptid og TNF-alfa pre-inkubert med modulatoren, sammenlignet med den mellom nevnte polypeptid og TNF-alfa i fravær av modulatoren vil demonstrere binding eller fortrengning av nevnte polypeptid i nærvær v modulator. I begge analyzer vil en reduksjon på 10% eller mer i mengden av nevnte polypeptid bundet i nærvær av kandidatmodulator, i forhold til mengden av nevnte polypeptid bundet i fravær av kandidatmodulator indikere at kandidatmodulatoren inhiberer vekselvirkningen mellom TNF-alfa og nevnte polypeptid.
En annen fremgangsmåte for detektering inhibrering av binding av, for eksempel, et polypeptid representert ved SEQ ID NR.: 3, til TNF-alfa benytter fluorescence resonans energi overføring (FRET). FRET er et kvantemekanisk fenomen som opptrer mellom en fluorescencedonor (D) og fluorescensakseptor
(A) som er meget nær hverandre (vanligvis < 100 Å separasjon) dersom emisjonsspekteret til D overlapper med eksitasjonsspekteret til A. Molekylene
som skal testes, f.eks. et polypeptid representert ved SEQ ID NR.: 3 og et TNF-alfa blir market med et komplementært par av donor- og akseptorfluoroforer. Mens de er bundet tett sammen av TNF-alfa : polypeptid-vekselvirkning, vil fluorescencen utstrålt etter eksitasjon av donorfluoroforen vil ha en forskjellig bølgelengde fra den utstrålt som respons på den eksitasjonsbølgelengden når nevnte polypeptid og TNF-alfa ikke er bundet, noe som gir mulighet for kvantifisering av bundne versus ikke bundne molekyler ved måling av emisjonsintensitet ved hver bølgelengde. Donorfluoroforer som kan benyttes for markering av TNF-alfa er velkjent i teknikken. Av spesiell interesse er varianter av A. Victoria GFP kjent som Cyan FP (CFP, Donor (D)) og Yellow FP (YFP, Acceptor (A)). Som et eksempel, kan YFP-varianten bli fremstilt som et fusjonsprotein med TNF-alfa. Vektorer for ekspresjonen av GFP-varianter som fusjoner (Clontech) så vel som fluorofor-merkede reagenser (Molekylær Probes) er kjent i teknikken. Tilsetningen av en kandidatmodulator til blandingen av fluorescens-merket polypeptid og YFP-TNF-alfa vil resulter i en inhibering av energioverføring som kommer frem ved for eksempel, en reduksjon i YFP fluorescence i forhold til en prøve uten kandidatmodulatoren. I en analyse ved bruk av FRET for deteksjonen av TNF-alfa: polypeptidvekselvirkning, indikerer en 10% eller større reduksjon i intensiteten av fluorescentemisjon ved akseptorbølgelengden i prøver inneholdende en kandidatmodulator, i forhold til prøver uten kandidatmodulatoren, at kandidatmodulatoren hemmer TNF-alfa : polypeptidvekselvirkningen.
En prøve som benyttet heri kan være hvilke som helst biologisk prøve inneholdende TNF-alfa slike som klinisk (f.eks. cellefraksjoner, helblod, plasma, serum, vev, celler, etc), avledet fra kliniske, jordbruks-, retts-, forsknings. , eller andre mulig prøver. De kliniske prøvene kan være from human eller animalsk opprinnelse. Den analyserte prøven kan være fra naturen være både faststoff eller væske. Det er klart at når faste materialer blir benyttet, må disse først oppløses i et passende løsemidel.
En variasjon av FRET benytter fluorescencequenching for å måle molekylære vekselvirkninger. Et molekyl i vekselvirkningsparet kan bli market med en fluorofor, og den andre med et molekyl quencher fluorescencen fra fluoroforen når den blir brakt i nærhet av denne. En endring i fluorescence etter eksitasjon er indikativ på en endring i assosiasjonen til molekylet merket med fluorofor: quencherparet. Generelt, er en økning i fluorescence til det merkede TNF-alfa indikativt på at anti-TNF-alfa polypeptidet som bærer quencheren har blitt erstattet. For quenchinganalyser indikerer en 10% eller større økning i intensiteten avfluorescentemisjon i prøver inneholdende en kandidatmodulator, i forhold til prøver uten kandidatmodulatoren, at kandidatmodulatoren inhiberer TNF-alfa: anti-TNF-alfa polypeptid-vekselvirkningen.
I tillegg til overflate plasmon resonans og FRET fremgangsmåter, er fluorescencepolarisering nyttig for å kvantifisere binding.
Fluorescencepolariseringsverdien for et fluorescent-merket molekyl avhenger av rotasjonskorrelasjonstiden eller tumblingraten. Komplekser, slike som de dannet ved TNF-alfa-assosiering med et fluorescent-merket anti-TNF-alfa polypeptid, har høyere polariseringsverdier enn ikke kompleksdannet, market polypeptid. Inklusjonen aven kandidatinhibitor for TNF-alfa: anti-TNF-alfa polypeptid-vekselvirkningen resulterer i en reduksjon i fluorescencepolarisasjonen, i forhold til en blanding uten kandidatinhibitoren, dersom kandidatinhibitoren ødelegger eller hemmer vekselvirkningen av TNF-alfa med nevnte polypeptid. Fluorescencepolarisasjon passer bra for identifikasjon av mindre molekyler som ødelegger dannelsen av TNF-alfa : anti-TNF-alfa polypeptidkomplekser. En reduksjon på 10% eller mer i fluorescencepolarisasjon i prøver inneholdende en kandidatmodulator, i forhold til fluorescencepolarisasjon i en prøve som mangler kandidatmodulatoren, indikerer at kandidatmodulatoren hemmer TNF-alfa : anti-TNF-alfa polypeptidvekselvirkningen.
Et annet alternative for måling av TNF-alfa : anti-TNF-alfa polypeptide-vekselvirkningene benytter en biosensoranalyse. ICS biosensorer har blitt beskrevet i teknikken (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, og Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997,387, 580). I denne teknologien blir en assosiasjon av TNF-alfa og et anti-TNF-alfa polypeptid koplet til lukkingen av de gramacidin-fasiliterte ionekanalene i suspenderte membranbilag og således til en målbar endring i ledningsevnen (tilsvarende til impedansen) til biosensoren. Denne tilnærmingen er lineær over seks størrelsesordener i endring og er ideelt tilpasset for storskala output skreening av små molekylære kombinatoriske biblioteker. En 10% eller større endring (økning eller reduksjon) i ledningsevne i en prøve inneholdende en kandidatmodulator, i forhold til ledningsevnen til en prøve som mangler kandidatmodulatoren, indikerer at kandidatmodulator inhiberer vekselvirkningen av TNF-alfa og nevnte polypeptid. Det er viktig å notere at ved analyzer som tester vekselvirkning av TNF-alfa med et anti-TNF-alfa polypeptid, er det mulig at en modulator av vekselvirkningen ikke trenger å vekselvirke direkte med domenet (ene) til proteinet som fysisk vekselvirker med nevnte polypeptid. Det er også mulig at en modulator vil vekselvirke ved et sted som er borte fra vekselvirkningsstedet og for eksempel forårsake en konformasjonsendring i TNF-alfa. Modulatorer (inhibitorer eller agonister) som virker på denne måten er likevel av interesse som midler for å modulere bindingen av TNF-alfa til sin reseptor.
En hvilken som helst av bindingsanalysene beskrevet kan bli brukt til bestemme nærværet av et middel i en prøve, f.eks., en vevsprøve, som binder til TNF-alfa, eller som påvirker bindingen av for eksempel, et polypeptid representert ved SEQ ID NR.: 3 til TNF-alfa. For å gjøre så, blir et TNF-alfa reagert med nevnte polypeptid i nærvær eller fravær av prøven, og polypeptidbindingen blir målt som passende for bindingsanalysen som blir brukt. En reduksjon på 10% eller mer i bindingen av nevnte polypeptid indikerer at prøven inneholder et middel som modulerer bindingen av nevnte polypeptid til TNF-alfa. Naturligvis, kan den ovenfor generaliserte fremgangsmåte lett bli benyttet for skreening for kandidatmodulatorer som endrer bindingen mellom hvilke som helst anti-TNF- alfa polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, eller en homolog sekvens derav, og TNF-alfa eller et fragment derav.
En celle som er nyttig ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis valgt blant gruppen bestående av bakterielle celler slike som, for eksempel, E coli, gjærceller slike som, foreksempel, S. cerevisiae, P. pastoris, insektceller eller mammalske celler.
En celle som er nyttig ifølge foreliggende oppfinnelse kan være hvilke som helst celler inn i hvilke en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende et anti-TNF-alfa ifølge foreliggende oppfinnelse, eller en homolog sekvens derav ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli introdusert slik at polypeptidet blir uttrykt ved naturlige nivåer, som definert heri. Fortrinnsvis har et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som blir uttrykt i en celle, normal eller nær normal farmakologi, som definert heri. Mest foretrukket, omfatter et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som blir uttrykt i en celle, nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvens SEQ ID NO: 1 angitt i Tabell 1 eller koder for en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med aminosyresekvensen SEQ ID NO: 1 vist i Tabell 1.
Ifølge en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, er en celle valgt blant gruppen bestående av COS7-celler, en CHO celle, en LM (TK-) celle, en NIH-3T3 celle, HEK-293 celle, K-562 celle eller en 1321 N1 astrocytoma celle, men også andre transfekterbare cellelinjer.
Generelt betyr "terapeutisk effektiv mengde","terapeutisk effektive dose" og "effektiv mengde", mengden som er nødvendig for å oppnå det ønskede resultat eller resultatene (modulere TNF-alfa binding; behandling eller forhindring av inflammasjon). Fagmannen vil forstå at kraften og derfor en "effektiv mengde" kan variere for de forskjellige forbindelsene som modulerer TNF-alfa binding som blir benyttet i foreliggende oppfinnelse. Fagmannen vil enkelt kunne vurdere kraften til forbindelsene.
Som benyttet heri, refererer uttrykket "forbindelse" til et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, en sammensetning, eller en nukleinsyre som koder for nevnte polypeptid eller et middel identifisert ifølge skreeningsfremgangsmåtene beskrevet heri eller nevnte polypeptid omfattende et eller flere derivatiserte aminosyrer.
Ved "farmasøytisk akseptabel" er det ment et materiale som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket, dvs. materialet kan bli administrert til et individ sammen med forbindelsen uten å forårsake noen uønskede biologisk effekter eller vekselvirkning på en ødeleggende måte med en hvilken som helst av de andre komponentene ei den farmasøytiske sammensetningen i hvilken den er inneholdt.
Anti-TNF-alfa polypeptider som beskrevet heri er nyttige for behandling eller forhindring av betingelser i et individ og omfatter administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse eller sammensetning.
Anti-TNF polypeptider av foreliggende oppfinnelse er nyttige for behandling eller forhindring betingelser som er relatert til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarm syndrom og multippel sklerose i et individ og omfatter administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse eller sammensetning som binder TNF-alfa.
Anti-TNF-alfa polypeptider som beskrevet heri, er nyttige for behandling eller forhindring betingelser i et individ og omfatter administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse i kombinasjon med en annen, slik som, for eksempel, aspirin.
Anti-TNF-alfa polypeptidene som beskrevet heri, er nyttige for behandling eller forhindring betingelser som er relatert til reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarm syndrom og multippel sklerose i et individ og omfatter administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse i kombinasjon med en annen, slik som, for eksempel, aspirin. Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til administrasjonen av formuleringer omfattende en enkel forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er beskrevet her å fremskaffe kombinasjonsbehandlinger hvori en formulering blir administrert til en pasient som trenger dette, som omfatter mer enn en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.
Betingelser mediert av TNF-alfa inkluderer, men er ikke begrenset reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerative colitis, inflammatorisk tarm syndrom og multippel sklerose.
En forbindelse som er nyttig i foreliggende oppfinnelse kan bli formulert som farmasøytiske sammensetninger og administrert til en mammalsk vert, slik som en human pasient eller et husdyr i forskjellige former tilpasset til den valgte administrasjonsvei, dvs. oralt eller parenteralt, intranasalt ved inhalering, intravenøst, intramuskulært, topikalt eller subkutan vei.
En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli administrert ved bruk av genterapifremgangsmåter for levering. Se, f.eks. U. S. Patent Nr. 5,399, 346. Ved bruk av en genterapi fremgangsmåte for levering, kan primære celler transfektert med genet for forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse bli vidt transfektert med vevsspesifikke promoterer til målspesifikke organer, vev, implantater, tumorer, eller celler.
Foreliggende forbindelse kan således bli administrert systemisk, f.eks., oralt, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer slike som en inert fortynner eller en assimilerbar spiselig bærer. De kan være innelukket i gelatinkapsler med hardt eller mykt skall, kan være presset til tabletter, eller kan være inkorporert direkte i maten i pasientens diet. For oral terapeutisk administrasjon, kan den aktive forbindelse være kombinert med en eller flere eksipienter og benyttet i form spiselige tabletter, buccale tabletter, trokeer, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, oblater, og liknende. Slike sammensetninger og preparater må inneholde minst 0,1 % av aktive forbindelse. Prosentdelen i sammensetningene og preparatene kan naturligvis bli variert og kan hensiktsmessig være mellom omkring 2 til omkring 60 % av vekten til en gitt doseringsenhet. Mengden av aktive forbindelse i slike terapeutisk nyttige sammensetninger er slike at et effektive doseringsnivå vil bli oppnådd.
Tablettene, trokeene, pillene, kapslene og lignende kan også inneholde det følgende: bindemidler slik som gum tragacanth, acacia, maisstivelse eller gelatin; eksipienter slik som dikalsiumfosfat; et disintegreringsmiddel slik som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og likende; et smøremiddel slik som magnesiumstearat; og et søtningsmiddel, slik som sukrose, fruktose, laktose eller aspartam eller et smaksmiddel slik som peppermynte, vintergrønnolje eller kirsebærsmak, kan bli tilsatt. Når doseringsenheten er en kapsel, kan den i tillegg til materialene ovenfor, inneholde en væskebærer, slik som en vegetabilsk olje eller en polyetylenglykol. Forskjellige andre materialer kan være til stede, slik som belegg eller for å modifisere den fysiske formen til den til den faste doseringsformen. For eksempel kan tabletter, piller eller kapsler være belagt med gelatin, voks, skjellakk eller sukker og liknende. En sirup eller eliksir kan inneholde den aktive forbindelsen, sukrose eller fruktose som et søtningsmiddel, metyl- og propylparabener som konserveringsmidler, et fargestoff og smak som kirsebær eller appelsinsmak. Naturligvis må hvilke som helst materialer som blir benyttet for fremstillingen av hvilke doseringsformer som helst, være farmasøytisk akseptabel og hovedsakelig ikke-toksisk i de benyttede mengdene. I tillegg, kan den aktive forbindelsen bli inkorporert i vedvarende frigivings preparater og anordninger.
Den aktive forbindelsen kan også bli administrert intravenøst eller intraperitonealt ved infusjon eller injeksjon. Oppløsninger av den aktive forbindelse eller dets salter kan bli fremstilt i vann, eventuelt blandet med et ikke-toksisk overflateaktivt middel.
Dispersjoner kan også bli fremstilt i glyserol, flytende polyetylenglykoler, triacetin, og blandinger derav og i oljer. Under vanlige betingelser for lagring og anvendelse, inneholder disse preparatene et konserveringsmiddel for å forhindre veksten av mikroorganismer.
De farmasøytisk doseringsformene som passer for injeksjon eller infusjon kan inkludere sterile vandige løsninger eller dispersjoner eller sterile pulvere omfattende den aktive ingrediensen som er tilpasset for den ekstemorære fremstillingen av sterile injiserbar eller infuserbare løsninger eller dispersjoner, eventuelt innekapslet i liposomer. I alle tilfeller må den endelige doseringsformen være sterile, flytende og stabil under betingelsene for fremstilling og lagring.
Den flytende bæreren eller vehikkelen kan være et løsemiddel eller et flytende dispersjonsmedium omfattende, for eksempel, vann, etanol, en polyol (for eksempel, glycerol, propylenglykol, flytende polyetylenglykoler, og liknende), vegetabilske oljer, ikke-toksiske glycerylestere, og passende blandinger derav. Den passende fluiditeten kan bli oppretthold, for eksempel, ved dannelsen av liposomer, ved opprettholdelsen av den krevede partikkelstørrelsen for dispersjoner eller ved anvendelsen av overflateaktive midler. Forhindringen av virkningen av mikroorganismer kan bli oppnådd ved forskjellige antibakterielle og antifungale midler, foreksempel, parabener, klorobutanol, fenol, sorbinsyre, thimerosal, og liknende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotoniserende midler, foreksempel, sukkere, buffere eller natriumklorid.
Forlenget absorpsjon av de injiserbare sammensetningene kan bli virkeliggjort ved anvendelsen i sammensetningene av midler som forsinkerabsorpsjon, for eksempel, aluminium monostearat og gelatin.
Sterile injiserbar oppløsninger blir fremstilt ved inkorporering av den aktive forbindelsen i den nødvendige mengden i det passende løsemiddelet med forskjellige av de andre ingrediensene som er angitt ovenfor, ifølge behov, fulgt av filtersterilisering. Ved sterile pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare oppløsninger, er de foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling vakuumtørkings- og frysetørkingsteknikker, som gir et pulver av den aktive ingrediensen pluss hvilke som helst ytterligere ingredienser som er til stede i de på forhånd sterilfiltrerte oppløsningene.
For topikal administrasjon, kan foreliggende forbindelse bli anvendt i ren form, dvs. når de er væsker. Imidlertid, vil det generelt være ønskelig administrere dem på huden som sammensetninger eller formuleringer, i kombinasjon med en dermatologisk akseptabel bærer, som kan være et faststoff eller en væske.
Nyttige faste bærere omfatter findelte faststoffer slik som talk, leire, mikrokrystallinsk cellulose, silica, alumina og liknende. Nyttig flytende bærere inkluderer vann, hydroksyalkyler eller glykoler eller vann-alkohol/glykolblandinger, i hvilke foreliggende forbindelse kan være oppløst eller dispergert ved effektive nivåer, eventuelt ved hjelp av ikke-toksiske overflateaktive midler. Adjuvanter slike som parfymer og ytterligere antimikrobielle midler kan bli tilsatt for å optimalisere egenskapene for en gitt anvendelse. Den resulterende væskesammensetningen kan bli påført fra absorbentputer, brukt til å impregnere bandasjer og sårforbindinger, eller sprayet på de påvirkede området ved bruk av en pumpe-type eller aerosolsprayer.
Fortykkere slik som syntetiske polymerer, fettsyrer, fettsyresalter og estere, fettalkoholer, modifiserte celluloser eller modifiserte mineralmaterialer kan også bli benyttet med flytende bærere for å danne smørbare pastaer, geler, salver, såper og liknende, for påføring direkte på huden til brukeren.
Eksempler på nyttige dermatologiske sammensetninger som kan bli benyttet for levering av forbindelsen til huden er kjent i teknikken; for eksempel, se Jacquet et al. (U. S. Pat. Nr. 4,608, 392), Geria (U. S. Pat. Nr. 4,992, 478), Smith et al.
(U. S. Pat. Nr. 4,559, 157) og Wortzman (U. S. Pat. Nr. 4,820, 508).
Nyttige doseringer av forbindelsen kan bli bestemt ved sammenligning av deres in vitro aktivitet, og in vivo aktivitet i dyremodeller. Fremgangsmåter for ekstrapoleringen av effektive doseringer i mus, og andre dyr, til mennsker som er kjent i teknikken,; for eksempel, se U. S. Pat. Nr. 4,938, 949.
Generelt vil konsentrasjonen av forbindelsen (ene) i en væskesammensetning, slik som en hudkrem, være fra omkring 0.1-25 vekt %, foretrukket fra omkring 0.5-10 vekt %. Konsentrasjonen i en halvfast eller fast sammensetning slik som en gel eller et pulver vil være omkring 0.1-5 vekt %, foretrukket omkring 0.5-2. 5 vekt %.
Mengden av forbindelsen, eller et aktivt salt eller derivat derav, som er krevet for bruk i behandling, vil variere ikke bare med det spesielt valgte saltet, men også administrasjonsveien, naturen til tilstanden som blir behandlet og alderen og tilstand til pasienten og til sist bli bestemt av ansvarlig lege eller kliniker. Doseringen av forbindelsen vil også variere avhengig av målcelle, tumor, vev, implantat, eller organ.
Den ønskede dosen kan enkelt bli gitt i en enkel dose eller som oppdelte doser administrert ved passende intervaller, for eksempel, som to, tre, fire eller flere sub-doser per dag. Sub-dose kan i seg selv være ytterligere oppdelt, f.eks. i et antall adskilte lost adskilte administrasjoner, slik som flere inhalasjoner fra en insufflator eller ved påføring av et flertall draper i øyet.
Et administrasjonsregime kan omfatte langtids daglig behandling. Ved "lang-tids " er det ment minst to uker og foretrukket, flere uker, måneder eller års varighet. Nødvendige modifikasjoner i doseringsområdet kan bli bestemt av fagmannen ved bruk av kun rutineeksperimenter gitt læren heri. Se Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W., ed. 4), Mack Publishing Co. , Easton, PA. Doseringen kan også bli justert av den individuelle legen i fall hvilke som helst komplikasjoner.
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer et middel som er en modulator for TNF-alfa/TNF-alfa-reseptor vekselvirkninger.
Kandidatmiddelet kan være et syntetisk middel eller en blanding av midler, eller kan være et naturlig produkt (f.eks. planteekstrakt eller kultursupernatant). Et kandidatmittel ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter små molekyler som kan bli syntetisert, et naturlig ekstrakt, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider etc.
Kandidat modulatormidler fra store biblioteker av syntetiske eller naturlige midler kan bli screenet. Tallrike midler blir i dag benyttet for tilfeldig og direkte syntese av sakkarider, peptider, og nukleinsyrebaserte midler. Syntetiske middelbiblioteker er kommersielt tilgjengelig fra et antall firma, inkludert Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), og Microsource (New Milord, CT). Et sjeldent kjemisk bibliotek er tilgjengelig fra Aldrich (Milwaukee, Wl). Kombinatoriske biblioteker er tilgjengelige og kan bli fremstilt. Alternativt, er biblioteker av naturlige midler i form av bakterielle, fungale, plante og animalske ekstrakter tilgjengelige fra f.eks. , Pan Laboratories (Bothell, WA) eller MycoSearch (NC), eller kan lett produseres ved fremgangsmåter som er velkjent i teknikken. Videre, blir naturlige og syntetisk produserte biblioteker og midler lett modifisert ved konvensjonelle kjemiske, fysisk, og biokjemiske midler.
Nyttig midler kan bli funnet innen tallrike kjemiske klasser. Nyttige midler kan være organiske forbindelser, eller små organiske forbindelser. Små organiske forbindelser har en molekylvekt på mer enn 50, men mindre enn omkring 2,500 Dalton, foretrukket mindre enn omkring 750, mere foretrukket mindre enn omkring 350 Dalton. Eksempler på klasser inkluderer heterocycler, peptider, sakkarider, steroider, og liknende. Forbindelsene kan være modifisert for å øke effektivitet, stabilitet, farmasøytisk kompatibilitet, og liknende. Strukturell identifikasjon av et middel kan bli brukt til å identifisere, generere, eller screene ytterligere midler. For eksempel, hvor peptidmidler blir identifisert, kan de bli modifisert på mange forskjellige måter for å øke deres stabilitet, slik som anvendelse av en ikke-naturlig aminosyre, slik som en D-aminosyre, spesielt D-alanie, ved funksjonalisering av amino- eller karboksylterminalen, f.eks. for aminogruppen, acylering eller alkylering, og for karboksylgruppen, esterifisering eller amidering eller liknende.
For primær skreening, er en nyttig konsentrasjon for et kandidatagent ifølge foreliggende oppfinnelse fra omkring 10 mM til omkring 100 uM eller mer (dvs. 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M etc). Den primære skreeningkonsentrasjon vil bli benyttet som en over grense, sammen med ni ytterligere konsentrasjoner, hvori de ytterligere konsentrasjonene blir bestemt ved reduksjon av den primære skreeningkonsentrasjon med halv-log intervaller (f.eks. for 9 ytterligere konsentrasjoner) for sekundære screeninger eller for generering av konsentrasjonskurver.
Høy gjennomløps skreeningsett
Et høy gjennomløps skreeningsett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter alle de nødvendige midler og medier for utførelse av deteksjonen av et middel som modulerer TNF- alfa/TNF-alfa reseptor vekselvirkninger ved å vekselvirke med TNF-alfa i nærvær av et polypeptid, foretrukket ved en konsentrasjon i området fra 1 nM til 1 mM.
Settet omfatter det følgende. Rekombinante celler ifølge foreliggende oppfinnelse, omfattende og uttrykkende nukleotidsekvensen som koder for TNF-alfa, som blir dyrket ifølge settet på en fast støtte, slik som en mikrotiterplate, mer foretrukket en 96 brønners mikrotiterplate, ifølge fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen, spesielt som beskrevet i WO 00/02045. Alternativt blir TNF-alfa tilført i en renset form for å bli immobilisert på, foreksempel, en 96 brønners mikrotiterplate av fagmannen. Alternativt blir TNF-alfa levert i settet pre-immobilisert på, for eksempel, en 96 brønners mikrotiterplate. TNF-alfa kan være hele TNF-alfa eller et fragment derav.
Modulatormidler ifølge foreliggende oppfinnelse, ved konsentrasjoner fra omkring 1 pM til 1 mM eller mer, blir tilsatt til definerte brønner i nærvær av en passende konsentrasjon av anti-TNF-alfa polypeptid, en homolog sekvens derav, en funksjonell del derav eller en funksjonell del av en homolog sekvens derav, hvor nevnte konsentrasjon av nevnte polypeptid foretrukket er i området f ra 1 u M til 1 mM. Sett kan inneholde et eller flere anti- TNF-alfa polypeptider i henhold til oppfinnelsen.
Bindingsanalyser blir utført ifølge fremgangsmåtene som allerede er beskrevet heri og resultatene blir sammenlignet med basislinjenivået til, for eksempel TNF-alfa for å binde seg til et anti-TNF-alfa polypeptid, et homolog sekvens derav, en funksjonell del derav eller en funksjonell del av en homolog sekvens derav, men i fravær av tilsatt modulatormiddel. Brønner som viser minst 2 ganger, foretrukket 5 ganger, mer foretrukket 10 ganger og mest foretrukket 100 ganger eller mer økning eller reduksjon i TNF-alfa-polypeptid binding (for eksempel) sammenlignet med aktivitetsnivået i fravær av modulator, blir valgt for de videre analysene.
Andre nyttige sett ifølge foreliggende oppfinnelse
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer sett som er nyttige for skreening for modulatorer av TNF-alfa/TNF- alfa reseptorbinding, så vel som sett som er nyttige for diagnose av forstyrrelserkarakterisert veddysfunksjon av TNF-alfa. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også sett som er nyttige for skreening for modulatorer av forstyrrelser så vel som sett for deres diagnose, hvor nevnte forstyrrelser erkarakterisert veden eller flere prosesser som involverer TNF-alfa. Sett som er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkludere et isolert TNF-alfa. Alternativt, eller i tillegg, kan et sett omfatte celler som er transformert til å uttrykke TNF-alfa. Ifølge en ytterligere utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte et polynukleotid som koder for TNF-alfa. Ifølge enda en ytterligere utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte spesifikke primere som er nyttig for amplifisering av TNF-alfa. Sett som er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte et isolert TNF-alfa polypeptid, en homolog derav, eller en funksjonell del derav. Et sett ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte celler som er transformert til å uttrykke nevnte polypeptid.
Sett kan inneholde mer enn ett polypeptid. Ifølge en ytterligere utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte et polynukleotid som koder for TNF-alfa. Ifølge enda en ytterligere utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte de spesifikke primerne som er nyttige for amplifisering av et makromolekyl slike som, for eksempel, TNF-alfa. Alle sett ifølge foreliggende oppfinnelse vil omfatte de angitte elementene eller kombinasjoner av elementer ot pakkematerialer for disse. Sett vil også omfatte instruksjoner for bruk.
EKSEMPLER
Foreliggende oppfinnelse bli illustrert ved de følgende ikke begrensende eksemplene.
Eksempel 1: Eksempel på Camelidae antistoffer mot human tumor nekrosefaktor alfa
1) Immunisering og bibliotekkonstruksjoner
En lama (Lama glama) ble immunisert med human TNF-alfa. For immunisering, ble cytokinet formulert som en emulsjon med en passende, dyrevennlig adjuvant (Specoll, CEDI Diagnostics B. V.). Antigencocktailen ble administrert ved double-spot injeksjoner intramuskulært I halsen. Dyret mottok 6 injeksjoner av emulsjonen, inneholdende 100 ug TNF-alfa ved ukentlige intervaller. Ved forskjellige tidspunkter under immuniseringen, ble 10-ml blodprøver tatt fra dyret og serum ble fremstilt. Induksjonen av en antigenspesifikk humoral immunrespons ble bekreftet ved bruk av serumprøvene i et ELISA eksperiment med TNF (data ikke vist). Fem dager etter den siste immuniseringen, ble en blodprøve på 150 ml tatt. Fra denne prøven, ble konvensjonelle og tungkjede antistoffer (HcAbs) fraksjonert (Lauwereys et al. 1998) og benyttet i en ELISA, som avslørte at HcAbs var ansvarlig for den antigenspesifikke humorale immunresponsen (data ikke vist). Perifere blod lymfocytter (PBLs), som den genetiske kilden for lama tungkjede immunoglobulinene (HcAbs), ble isolert fra den 150-ml blodprøven ved bruk av en Ficoll-Paque-gradient (Amersham Biosciences) for å gi 5x10<8>PBLs. Den maksimale diversitet av antistoffer er forventet å være lik antallet av samplede B-lymfocytter, som er omkring 10 % av antallet av PBLs (5x10<7>). Fraksjonen av tungkjede antistoffer i lama er opp til 20 % av antallet B-lymfocytter. Derfor, ble den maksimale diversitet av HcAbs i den
150 ml blodprøven beregnet som 10<7>forskjellige molekyler. Totalt RNA (omkring 400 ug) ble isolert fra disse cellene ved bruk av en sur guanidinium-tiocyanat-ekstraksjon (Chomczynski og Sacchi, 1987).
cDNA ble fremstilt på 100 ug totalt RNA med M-MLV Reverse Transcriptase (Gibco BRL) og oligo-dT-primer eller hexanukleotid randomprimere (Amersham Biosciences) som beskrevet tidligere (de Haard et al., 1999). cDNA ble renset med en fenol/kloroform ekstraksjon kombinert med en etanolfelling og etterfølgende benyttet som templat for spesifikt å amplisere VHH-repertoaret.
VHH-repertoaret ble amplifisert ved bruk av oligo-dT primet cDNA som templat med en enkelt degenerert frameworkl (FR1) primer ABL013 (5'-AAGGTBCAR-CTGCAGGASTCYGG- 3') (SEQ ID Nr. 98), for introduksjon av et Pstl restriksjonssete (uthevet), i kombinasjon med oligo-dT primeren som er beskrevet i EP01205100.9. Denne amplifiseringen gir to fragmenter på 1650 bp og 1300 bp, hvor det siste er produktet som er avledet fra de CH1-deleterte HcAb genene. Det minste PCR-produktet ble renset på gel og etterfølgende kuttet med Pstl og BstEII. BstEII- setet opptrer hyppig innen FR4 av tungkjedeavledet VHH kodende DNA- fragmenter.
Alternativt, ble VHH-repertoaret amplifisert i en hengsleavhengig tilnærming ved bruk av to IgG spesifikke oligonukleotidprimere. I en enkel PCR-reaksjon ble en kort (5'-
TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3') (Seq. Id. Nr. 100) hengsleprimer som var kjent å være spesifikk overfor HcAbs kombinert med FR1-primeren ABL013 (se ovenfor). Et Pstl og Noti (fet, understreket) restriksjonssete ble introdusert innen henholdsvis FR1 og hengsleprimerne, for å tillate kloning. Deretter, ble DNA-fragmenter ligert inn i Pstl-BstEII- eller Pstl-Notl-kuttet fagemidvektor pAX004, som er identisk med pHEN1 (Hoogenboom et a/., 1991), men koder for et karboksyterminalt (His) 6-og c-myc-merke for henholdsvis rensing og deteksjon. Ligeringsblandingen ble avsaltet på et Microcon-filter (YM-50, Millipore) og elektroporert inn i E. coli TG1 celler for å oppnå et bibliotek inneholdende 1,8x10<7>kloner. De transformerte cellene ble dyrket over natten ved 37°C på en enkel 20x20 cm plate med LB inneholdende 100 ug/ml ampicillin og 2 % glukose. Koloniene ble skrapet fra plater ved bruk av 2xTY-medium og lagret ved -80°C i 20 % glycerol.
Som kvalitetskontroll ble prosenten av insert-inneholdende kloner bekreftet på 24 kloner for hvert bibliotek ved PCR ved bruk av en kombinasjon av vektorbaserte primere. Disse analysene viste at 95 % av klonene inneholdt et VHH som koder for insertet. Variabiliteten ble undersøkt ved Hinfl fingerprintanalyser av det amplifiserte VHH fragmentet av disse 24 klonene, noe som viste at alle klonene faktisk var forskjellige (data ikke vist).
2 ) Utvelgelse av antagonistisk anti- TNF VHH' er
Fag ble fremstilt fra begge bibliotekene. For å ta vare på det polyklonale fagrepertoaret, ble biblioteker dyrket til logaritmisk fase (OD600 = 0.5) ved 37°C i 2xTY inneholdende 100 , ug/ml ampicillin og 2 % glukose og deretter superinfisert med M13K07 hjelpefag i 30 minutter ved 37°C. Infiserte celler ble pelletert i 5 minutter ved 4000 rpm og resuspendert i 2xTY inneholdende 100 ug/ml ampicillin og 25 ug/ml kanamycin.
Bacteriofag ble propagatert ved vekst over natten ved 37°C og 250 rpm. Overnattede kulturer ble sentrifugert 115 minutter ved 4500 rpm og fag ble felt med en femtedels volum av en [20% polyetylenglykol 6000,1. 5 M NaCI]-oppløsning ved inkubasjon i 30 minutter på is. Fag ble pelletert ved sentrifugering i 15 minutter ved 4000xg og 4°C.
Etter resuspensjon av fagene i PBS, ble cellerester pelletert ved sentrifugering i 1 minutt ved maksimal hastighet (15000xg) i mikrosentrifugerør. Supernatant inneholdende fagpartiklene ble overført til nye rør og igjen ble fag presipitert som beskrevet ovenfor. Fag ble oppløst i PBS og separert fra gjenværende cellerester som nevnt ovenfor. Titeren av fag som bestemt ved infeksjon av logaritmiske TG1-celler fulgt av utsåing på selektivt medium.
Biblioteket ble valgt ved bruk av in vitro biotinylert TNF-alfa. Biotinyleringen ble utført som beskrevet av Magni et al (Anal Biochem 2001,298, 181-188). Inkorporeringen av biotin i TNF ble evaluert ved SDS-PAGE analysene og deteksjon med Extravidin-alkaliskfosfatase-konjugat (Sigma). Funksjonaliteten til det modifiserte proteinet ble evaluert for dets evne å binde til den fast fase belagte rekombinante p75 reseptor.
VHH ble valgt ved å fange biotinylert TNF-alfa (10 til 400 ng per brønn i løpet av 2 timer ved romtemperatur) på streptavidinbelagte mikrotiterplater (belagt med 100 ul of 10 ug/ml streptavidin i løpet av 16 timer ved +4°C). Antagonistisk VHH ble oppnådd ved eluering med et overskudd av reseptor, enten det ekstracellulær ligandbindende domenet eller med celler som uttrykker reseptoren. Etter 2 timer inkubering av fag med innfanget cytokin, ble de ikke-spesifikke fag vasket bort, mens spesifikke fag som viser antagonistisk VHH ble eluert i 30 minutter med reseptor (ekstracellulært domene av CD120b eller p75; 10 uM) eller med celler som fremviser reseptor (>10<5>KYM celler per brønn). Høy anrikning, dvs. Forholdet mellom antallet fag eluert med reseptor og de eluert med serum albumin (50 ug per brønn), på mer enn en faktor 20 antyder suksessfull utvelgelse av TNF-alfa-spesifikke kloner. Alternativt, I stedet for eluering med reseptor ble en standard prosedyre benyttet, I hvilken en lav pH forårsaker denaturering av VHH og/eller antigen (0.1 M glycinbuffer pH 2.5). Log fase dyrking av E. coli celler ble infisert med det eluerte og nøytraliserte fag og utsådd på selektive medier.
Individuelle kloner ble plukket ut og dyrket på mikrotiterplate for fremstillingen av VHH i kultursupernatant. ELISA skreening med TNF-alfa fanget på Extravidin-belagte plater avslørte omkring 50% positive kloner. Hinfl-fingerprint-analysene viste at 13 forskjellige kloner var valgt, hvilke ble dyrket og indusert i 50 ml-skala. Sekvensen av nevnte kloner er vist i tabell 1.
Fem kloner, betegnet VHH#1A, #2B, #3E, #3G, #7B og #;12B, med forskjellige sekvenser (Figur 1) blekarakteriserti større detalj. VHH#3E, #3G og #7B er enkelt-domene antistoff-fragmenter som bærer den typiske hydrofile resten i posisjon 45 (arginin) og fenylalanin til tryptofansubstitusjon i posisjon 47 i FR2, noe som bekrefter den fordelaktige karakteristikken med hensyn på oppløselighet. VHH#1A inneholder de hydrofobe FR2 restene som typisk blir funnet i dobbelkjede antistoffer av human opprinnelse eller fra andre arter, men som kompenserer dette tapet i hydrofilisitet ved den ladete argininresten i posisjon 103 som erstatter den konserverte tryptofanrest som er til stede i VH fra dobbeltkjede antistoffer (WO 03/035694). En ny klasse humaniserte Camelidae enkelt-domene antistoffer beskrevet i foreliggende oppfinnelse er representert ved VHH#2B og VHH#12B, som inneholder de hydrofobe restene i FR2 i kombinasjon med den hydrofobe resten tryptofan i posisjon 103. Større mengder antistofffragmenter ble uttrykt ved dyrking i 50 ml skala og renset ved IMAC ved bruk av TALON resin (Clontech). Etter dialyse mot PBS for å fjerne eluenten imidazol, ble mengden av VHH som bestemt ved OD280; omkring 300 ug VHH, oppnådd fra hver klone.
Dette materialet ble benyttet for bestemmelse av sensitiviteten for deteksjon av (biotinylert) TNF i ELISA. For dette formålet ble en streptavidin (10, ug/ml) belagt mikrotiterplate benyttet for innfanging av biotinylert TNF (1 ug/ml), VHH ble fortynnet i 0.2 % casein/PBS og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Bundet VHH ble detektert med anti-MYC mAB 9E10 (0.5Mg/ml) og anti-mus AP konjugat (1000-ganger fortynnet, Sigma). Resultatene er vist i Figur 2.
3) Bestemmelse av antagonistisk effekt i cytotoksisitetsanalyse med KYM cellelinje
TNF-alfa-indusert cytostasis/cytotoksisitet som bestemt ved den kolorimetriske MTT analysen som beskrevet av Vandenabeele og kolleger (Vandenabeele, P.
, Declercq, W., Vercammen, D. , Van de Craen, M. , Grooten, J. , Loetscher, H. , Brockhaus, M., Lesslauer, W. , Fiers, W. (1992) Functional characterization of the human tumor necrose factor receptor p75 in a transfected rat/mouse T cell hybridoma. J. Exp. Med. 176,1015-1024.). MTT (3-(4, 5-cimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyl tetrazolium bromid) er et blekt gult substrat som blir spaltet av levende celler for å gi et mørkeblått formazanprodukt. Denne prosessen krever aktive mitokondrier, og selv nylig døde celler spalter ikke signifikante mengder av
MTT. KYM celler (Sekiguchi M, Shiroko Y, Suzuki T, Imada M, Miyahara M, Fujii G. (1985) Characterization of a human rhabdomyosarcoma cell strain in tissue culture. Biomed. Pharmacother. 39,372-380.) ble sådd ut i 96 brønners mikrotiterplater og dyrket i nærvær eller fravær av TNF-alfa (0.216 ng/ml eller omkring 5 pM av trimer). I tillegg til TNF ble variable mengder av antistoff (VHH eller Remicade) inkluderer! under dyrking. For analysen ble MTT tilsatt til kulturmediet ved en endelig konsentrasjon på 500 ug/ml og platene ble inkubert ved 37°C for å oppnå spalting av MTT ved mitokondriale enzymer. Det dannede produktet, som fremkom som sorte, uklare krystaller på bunnen av brønnen, ble oppløst ved tilsetning av sur isopropanol (40 nM HCI i isopropanol) eller DMSO. Absorbansen ble målt ved 570 nm.
MTT analysen (Figur 3) viser at VHH#1A, som har arginin i posisjon 103 i kombinasjon med de human-liknende hydrofobe restene i FR2, har en moderat antagonistisk effekt (IC50-100 nM). VHH#7B med de karakteristiske hydrofile rester i FR2 forhindrer ikke binding av TNF-a til sin ligand trass i dens sensitive deteksjon av cytokinet i ELISA (kurve ikke vist). Derimot er, VHH#3E og #3G med hydrofil FR2 hallmark-rester meget kraftige antagonistiske VHH's (IC50 på 20 nM). VHH#3E og #3G har en høy grad av homologi og er klonalt relatert (Harmsen et al., Mol. Immunol. 37,579-590), men VHH#3E er enda kraftigere, trolig på grunn av det faktum at det her en høyere affinitet enn VHH#3G (Figur 2). Det (kimeriske) monoklonale antistoffet Remicade er meget kraftig, (IC50 på 80 pM), men dets avledede Fab fragmentet har mistet det meste av denne aktiviteten (IC50 er 3 nM, 30 ganger mindre enn intakt mAB). Dette viser klart at adivitetseffekten til vekselvirkningen mellom antistoffet og cytokinet: mAB med to bindingsseter vekselvirker mer effektivt med det trimere TNF-molekylet via kooperativ binding. VHH-fragmenter er strengt monovalente og derfor ble det spekulert på om økningen av avidivitet ved genetisk kobling av VHH-gener kunne øke deres antagonistiske effekt (se Eksempel 4).
Disse eksperimentene viser at en ny klasse av human-like VHH har bona fide binding og funksjonell karakteristikk, noe som derved muliggjør deres anvendelse for terapeutiske anvendelser.
Eksempel 2: Humanisering of VHH#12B og VHH#3E ved seterettet mutagenese
1) Homologi mellom VHH# 3EA/ HH# 12B og human kimlinie tung kjede V- region DP^7
Oppstilling av VHH#12B og en human VH3 kimlinjesekvens (DP-47) avslørte en høy grad av homologi:
4 AA endringer i FR1 i posisjon 1,5, 28 og 30
5 AA endringer i FR3 i posisjon 74,76, 83,84 og 93
1 AA endring i FR4 i posisjon 108
som representert i de følgende sekvensoppstillingene:
En spesifikk inhibitor for TNF-alfa cytokinet, med høy homologi med det humane kim linje genet DP-47 var derfor en ideell kandidat for ytterligere humanisering og evaluering av påvirkningen av mutagenese på inhibrering av kapasiteten i ELISA.
Oppstilling av VHH#3E og en human VH3 kimlinje (DP-47) viste nærværet av hydrofile aminosyrerester i FR2 av VHH#3E sammenlignet med hydrofobe rester i DP-47.
Evaluering av effekten av substituering av de hydrofile med hydrofobe rester som tilstedeværende i human VH er viktig, siden majoriteten av kamelid VHH-sekvenser inneholder hydrofile rester.
2) Mutagenese av VHH# 12B
VHH#12B ble mutert ved å benytte en non-PCR basert sete-rettet mutagenesefremgangsmåte som beskrevet av Chen og Ruffner og kommersialisert av Stratagene (Quickchange site- directed mutagenese). Plasmid DNA ble benyttet som templat i kombinasjon med 2 mutagene primere for å introdusere den ønskede mutasjon(ene). De 2 primere er hver komplementære med de motsatte strenger av templatplasmid DNAet. I en polymerasereaksjon ved bruk av Pfu DNA polymerasen, ble hver streng forlenget fra primersekvensen under et syklisk program ved bruk av et begrenset antall sykluser. Dette resulterte i en blanding av villtype og muterte strenger. Kutting med Dpnl resulterer i seleksjon av mutert in vitro syntesisert DNA streng, siden kun templatestrengen er sensitiv for kutting. DNA ble presipitert og transformert til E coli og analysert for den ønskede mutasjonen ved sekvensanalyser. De genererte mutant-VHH's og de mutagene primere er opplistet i Tabell 2.
Plasmid ble fremstilt fra mutantkloner og ble transformert inn i WK6 elektrokompetente celler. En enkel koloni ble benyttet for å starte en overnattkultur i LB-inneholdende 2% glukose og 100 ug/ml ampicillin. Denne overnattkulturen ble fortynnet 100- ganger i 300 ml TB medium inneholdende 100Mg/ml ampicillin, og inkubert ved 37°C inntil OD600nm= 2, når 1 mM IPTG og 5 mM MgS04(endelige konsentrasjoner) ble tilsatt og kulturen ble inkubert i 3 ytterligere timer ved 37°C.
Kulturer ble sentrifugert i 20 minutter ved 4,500 rpm ved 4°C. Pelleten ble frosset over natten eller i 1 time ved -20°C. Deretter ble pint ved romtemperatur i 40 minutter, re-suspendert i 20 ml PBS/1mM EDTA/1M NaCI og ristet på is i 1 time.
Periplasmisk fraksjon ble isolert ved sentrifugering i 20 minutter ved 4°C ved 4,500 rpm. Supernatanten inneholdende VHH ble satt på TALON (ClonTech) og renset til homogenitet. Utbyttet av VHH ble bestemt ved bruk av den beregnede ekstinksjonskoeffisienten.
Alle mutant VHH's ble uttrykt sammenlignbart med villtypen. Mutantene ble analysert for deres inhiberingskapasitet i en in vitro reseptor bindingsanalyse. En mikrotiterplate ble belagt over natten ved 4°C med Enbrel (Wyeth) ved 2 ug/ml i PBS. Platen ble vasket fem ganger med PBS-Tween og blokkert i 1 time ved romtemperatur med PBS inneholdende 1% casein. Platen ble vasket fem ganger med PBS-Tween.
Biotinylert human TNF-alfa (80 ug/ml) ble pre-inkubert med en fortynningsserie av mutant eller villtype VHH#12B i 1 t ved RT og blandingen ble inkubert i 1 t ved romtemperatur i brønnene i microtiterplaten. Platen ble vasket fem ganger med PBS- Tween. Bundet humant TNF-a ble detektert ved bruk av Extravidin-AP (1/1,000 fortynning) og paranitrofenylfosfat (pNPP). Signaler ble målt etter 30 minutter ved 405 nm.
Resultatene er vist i Figur 4 og 5. IC50 øket 3 ganger fra 66 nM (villtype) til 200 nM (mutant Q1E+Q5L+A74S+Y76N+K83R+P84A). Mutasjon I posisjon T93A resulterte i tap av inhibrering (data ikke vist). Posisjonene som fremdeles måtte bli humanisert er: E28, E30 og Q108. Imidlertid, er E28 og E30 del av den H1 kanoniske struktur og således del av CDR1 ifølge Chothia num mereringssystem et.
Aminosyresekvensene til mutant VHHs er vist i Tabell 4 SEQ ID Nr: 17 til 19.
3) Mutagenese of VHH# 3E
VHH#3E ble mutert ved å benytte en non-PCR basert sete-rettet mutagenesefremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Det oppnådde mutant VHH's og de mutagene primere er listet i Tabell 3.
Alle mutant VHH's ble uttrykt sammenlignbart med villtypen. De rensede mutant VHH's ble analysert for binding i ELISA og inhiberingskapasitet i reseptorbindingsanalyse identisk med fremgangsmåten beskrevet ovenfor.
Resultatene av ELISA er vist i Figur 6, de fra reseptorbindingsanalysen i Figur 7.
Aminosyresekvensene til mutant VHHs er vist i Tabell 4 SEQ ID Nr 21 til 24.
Eksempel 3: Isolering av antagonistisk VHH mot mus TNF-alfa
1) Utvelgelse of anti- mus TNF- alfa VHH
For å utføre effektivitetsstudier i musemodeller for IBD eller Crohn's sykdom, ble mus TNF spesifikke VHH selektert. For dette ble en lama immunisert med mus TNF- alfa som beskrevet i Eksempel 1. RNA ble ekstrahert fra PBL's tatt 4 og 10 dager etter den siste immuniseringen, så vel som fra en biopsi tatt fra en lymfeknute etter dag 4. Totalt RNA ble konvertert i enten random primet eller oligo-dT primet cDNA og benyttet som templat for amplifiseringen av VHH som koder for gensegmenter ved bruk av lg avledede primere eller en kombinasjon av oligo-dT primer og en enkel lg primer (se eksempel 1). Et bibliotek inneholdende 8.5 x 10<7>kloner ble generert med lg-primerne fra de første PBL's, og et bibliotek med 7 x 106 kloner for den andre PBL-prøven og 5.8 x 10<8>kloner for lymfeknuten. Ved bruk av kombinasjonen av oligo-dT primeren og lg primerbibliotekene fra den første PBL, ble det fremstilt prøver inneholdende 1.2 x 10<8>kloner, fra den andre prøven av PBL's et bibliotek med 5.7 x 10<7>kloner og lymfenodeavledet bibliotek innehold 2 x 10<8>kloner. Bibliotekene ble oppsamlet avhengig av den anvendte kombinasjonen av primere og de resulterende to bibliotekene ble dyrket for propagandering av fag som beskrevet tidligere. Utvelgelser ble utført på biotinylert mus TNF-alfa fanget på belagt streptavidin, bundet fag ble evaluert ved kombinasjon med den humane human reseptor p75, som er kjent å kryssreagere med mus TNF-alfa. To distinkte mus TNF-alfa spesifikke VHH (VHH#m3F og VHH#m9E) ble valgt blant biblioteket oppnådd ved amplifisering med lg avledede primere, mens to nært relaterte VHH's ble oppnådd fra biblioteket konstruert ved PCR med oligo-dT primer og lg-primer (Figur 8).
2) Bestemmelse av antagonistisk effektivitet i c<y>totoksisitetsanal<y>se med L929 cellelinje ( Figur 9)
De samme type analyse som beskrevet i Eksempel 1 ble benyttet, men med den murine celllinje L929. VHH#m3F og VHH#m4B (Figur 9) viste seg å være 10 ganger kraftigere enn de to andre VHH's.
Eksempel 4: Forsterking av den antagonistiske effekten ved økning av aviditeten ved bruk av multivalente Camelidae antistoffer 1) Antagonistisk effektivitet of bi-, tri- og tetravalent VHH mot human og mus TNF- alfa
E. coli produksjonsvektor pAX11 (Figur 10) som tillater to-trinns kloningen av bivalent eller bispesifik VHH, ble utformet. Den karboksyterminale VHH ble kolnet først med Pstl og BstEII, mens i det andre trinnet, den andre VHH ble satt inn ved Sfil og Noti, hvilket ikke kutter inn i det første genfragmentet. Prosedyre unngår styrking av nye seter ved amplifisering og således risikoen for introdusering av PCR-feil.
Med denne vektoren ble det bivalente derivat av det antagonistiske anti-humane TNF-alfa VHH#3E generert. Plasmid-vektoren som koder for det bivalente VHH ble benyttet for å generere et tri- og tetramersk derivat, hvilket ble fulgt av delvis kutting av plasmidet med BstEII, som opptrer i begge VHH-gensegmentene. Den lineariserte vektoren ble renset fra gelen, deretter de-fosforylert og benyttet som akseptor for kloning av BstEII fragmentet på omkring 350 bp som var blitt oppnådd ved komplett kutting av det samme plasmid.
Ligering av BstEII fragmentet alene før tilsetning til vektoren øker innsettingen av multimert VHH som koder for gensegmenter. Etter transformasjon i E. coli TG1 ble de resulterende klonene screenet ved PCR med M13Rev og M13Fwd primere; siden BstEII er en asymmetrisk kutter (5 nt overheng) ble kun korrekt orienterte inserter oppnådd, som bekreftet ved kutting av plasmidene med Pstl alene (350 bp) eller dobbelkutting med EcoRi og Hindlll (1000 bp for bivalent (BIV3E, SEQ ID Nr: 73), 1350 bp for trivalent (TRI 3E, SEQ ID Nr: 74) og 1700 bp for tetravalent (TETRA 3E, SEQ ID Nr: 75), data ikke vist). Sekvensene er opplistet i Tabell 7.
Klonene ble dyrket og indusert i 50 ml skala, periplasmiske fraksjoner fremstilt og benyttet for IMAC rensing med TALON-resin. Analysene av de rensede produktene på Coomassie farget PAGE avslørte gode produksjonsnivåer (mellom 2 og 10 mg per liter cellekultur) av intakt multivalent VHH (se Figur 11). Den molekylære tilsynekomsten av det IMAC-rensede VHH ble bestemt ved gelfiltrering på en Superdex 75HR kolonne og som forventet kom molekylene med høyere aviditeter tidligere fra kolonnen (se Figur 12).
Den antagonistiske effektiviteten ble analysert ved den cellebaserte analysen ved anvendelse av KYM celler. Cellene ble utsådd på microtiterplater og dyrket i nærvær eller fravær av TNF- alfa (1.29 ng/ml eller omkring 25 pM of trimer). Analysene (Figur 13) avslørte at de monovalente molekylene benyttet I denne studien hadde den dårligste antagonistiske karakteristikken, noe som er reflektert ved deres IC50 verdier: Fab avledet fra det chimeriske antistoffet Remicade har en IC50 på 2 nM og for VHH#3E er det 12 nM (se også Figur 3). Aviditeten til de benyttede molekylene viste seg å ha en dramatisk påvirkning på den antagonistiske effektiviteten slik det ble observert med det bivalente IgG molekylet Remicade, som er 4 ganger mer effektivt (IC50 50 pM) enn Fab. TNF-alfa er et trimert molekyl, som vekselvirker med en dimer reseptor og det kan derfor bli forventet at aviditeten til IgG tillater den gjensidige bindingen til to epitoper på cytokinet og støtten for dannelse av større komplekser, som beskrevet tidligere (Santora et al, Anal. Biochem. 299,119-129).
Overraskende har økningen i aviditet til VHH fra monomer til dimer en mye mer spektakulær effekt enn observert med Remicade, siden IC50 til dimeren (30 pM) er 400 ganger lavere enn for monomeren. Økning av aviditet fører dessuten til en enda bedre antagonistisk oppførsel: det trimere VHH har en IC50 på 20 pM og det tetravalente formatet 6 pM. Alle formater med høyere aviditet til VHH er mer effektive enn Remicade, mens det tetravalente formatet er enda bedre enn Enbrel, som består av det ekstracellulære domenet av reseptoren p75 sammenkoblet til Fc av en IgG og har derfor en bivalent bindingsmodus.
Den samme uventede effekt av aviditet på antagonistisk oppførsel ble observert med VHH generert mot mus TNF (Figur 14). Den samme typen cytotoksisitetsanalyse ble utført ved bruk av MTT som substrat og mus TNF-alfa (65 pg/ml eller 1.3 pM), men med den murine cellelinjen L929, som uttrykker den musespesifikke reseptoren. Tre forskjellige antagonistiske (monovalent) VHH ble identifisert kodet 9E og 3F, av hvilke de to første hadde IC50 på 25 nM og den siste 2 nM (se også Eksempel 3). Omdanning av 3F til det bivalente format (BIV#m3F, SEQ ID Nr: 76) ga en 1000 ganger økning i IC50 (2 pM), noe som igjen demonstrerer at den økede aviditeten til antistoffet fører til en uventet forbedring i den antagonistiske karakteristikken.
2 ) Sammenligning med VHH- Fc fusjon
VHH#3E, rettet mot humant TNF, ble klonet via Pstl og BstEII i en tilpasset vektor avledet fra pCDNA3, for derved å generere en genetisk fusjon til den CH1-deleterte Fc-delen av humant lgG1. Etter bekreftelse ved sekvensering, ble plasmidkonstruktet transfektert til myeloma cellelinjen NSO. Den fremstilte cellelinjen ble dyrket og VHH- Fc fusjon ble utskilt i kultursupernatanten. Produktet ble renset med en anti- human Fc VHH resin og analysert på en Coomassie-farget gel (Figur 15). I nærvær of DTT var fusjonen synlig som et 45 kDa protein, i fraværet av DTT kan det dimere molekylet med en molekylvekt på 90 kDa bli observert. Dette dimere produktet er et resultat av bindingen av to kjeder ved to disulfidbroer, som stammer fra cysteinrester lokalisert i hengsleregionen.
VHH-fusjonen ble testet i bioanalysen med den humane cellelinjen KYM og viste seg å være 5 ganger mindre effektiv enn den bivalent VHH trass i det faktum at begge molekyler har den samme aviditet og at de begge stammer fra VHH#3E (Figur 16). Sannsynligvis kan sterisk hindring av den store Fc-halen forårsake dette avviket.
Eksempel 5: Beregning av homologier mellom anti-mål-enkeltdomene antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse
Graden av aminosyresekvenshomologi mellom anti-mål enkeltdomene antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse ble beregnet ved bruk av Bioedit Sekvens Alignment Editor.
Beregningene indikerer at andelen av identiske rester mellom alle sekvensene slik de er satt opp av ClustalW. (Thompson, J. D. , Higgins, D. G. og Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position spesific gap penalties an weight matrix choice. Nucleic Acids Research, submitted, June 1994). Tabell 8 indikerer fraksjonshomologien mellom anti-serum albumin VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse. Tabell 9 indikerer fraksjonshomologien mellom anti-TNF-alfa VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse. Tabell 10 indikerer prosentvis homologi mellom anti-IFN-gamma VHHs ifølge foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 6: Ekspresjon av et VHH-CDR3 fragment av VHH#3E
CDR3 regionen av VHH#3E ble amplifisert ved å benytte en sense-primer lokalisert i framework 4 regionen (Forover:
For å klone CDR-3 fragmentet i pAX10, ble en andre runde PCR amplifisering utført med de følgende primere for å introdusere de ønskede restriksjonssetene:
PCR reaksjonene ble utført I 50 ml reaksjon volum ved bruk av 50 pmol av hver primer. Reaksjonsbetingelsene for den primære PCR var 11 min ved 94 °C, fulgt av 30/60/120 sec ved 94/55/72 °C i 30 sykluser, og 5 min ved 72°C. Alle reaksjoner ble utført 2.5 mM MgCb, 200 mM dNTP og 1.25U AmpliTaq God DNA Polymerase (Roche Diagnostics, Brussels, Belgia).
Etter spalting med Sfi1 og Noti ble PCR produktet klonet i pAX10
Eksempel 7: Stabilitetstesting av antistofffragmenter spesifikk for humant TN Fa
Oralt administrerte proteiner ble utsatt for denaturering ved den sure pH i magen så vel som for degradering av pepsin. Vi hadde valgt betingelsene for å studere motstanden til VHH#3E overfor pepsin som er antatt å etterligne miljøet i magesekken. VHH#3E, et VHH spesifikt for humant TNFa ble produsert som rekombinant protein i E. coli og renset til homogenitet ved IMAC og gelfiltreringskromatografi. Proteinkonsentrasjonen etter rensing ble bestemt spektrofotometrisk ved å benytte den beregnede molare ekstinksjonskoeffisienten ved 280nm. Fortynnede oppløsninger ved 100 mikrogram/ml ble fremstilt i Mclivainebuffer (J. Biol. Chem. 49,1921, 183) ved henholdsvis pH 2, pH 3 og 4. Disse oppløsningene ble deretter inkubert i 15 minutter ved 37°C, før tilsetningen av svinemagemucosa pepsin ved e forhold på 1/30 w/w. Seksti minutter etter tilsetning av proteasen ble en prøve tatt og umiddelbart fortynnet 100 ganger i PBS pH 7.4 inneholdende 0. 1 % casein for å inaktivere pepsinet. Syv videre 3 gangers fortynninger ble fremstilt fra denne prøven for undersøkelse av nærværet av funksjonelle antistofffragmenter ved ELISA. Identiske fortynninger fremstilt fra en prøve tatt før tilsetning av proteasen tjente som en referanse. I ELISA-analysen ble biotinylert TNF a tatt opp i brønner på en mikrotiterplate belagt med neutravidin. For både den pepsin-behandlede og referanseprøver ble tilsvarende serielle fortynninger av prøvene fremstilt og 100 mikroliter av disse fortynningene ble tilsatt til brønnene. Etter inkubering i 1 time ble platene vasket. For deteksjonen av VHH-binding til det oppfangede TNFa ble et polyklonalt kanin anti-VHH antiserum (R42) og et anti-kanin IgG alkalisk fosfatasekonjugat benyttet. Etter vasking ble platene utviklet med paranitrofenylfosfat. Dataene plottet i Figur 17 viser tilsvarende kurver for alle prøvene utsatt for digestive betingelser så vel som for referanseprøver. Dette indikerer at VHH#3E hovedsakelig opprettholder sin funksjonelle aktivitet under alle de valgte betingelser.
Eksempel 8: Oral administrasjon of et anti-humant TNFa spesifikt VHH i mus
En antistoffoppløsning inneholdende det anti-humant TNFa spesifikke VHH#3E (100 mikrogram per milliliter i 100 ganger fortynnet PBS) ble fremstilt. Tre mus ble først hindret i å drikke vann i 12 timer og deretter tillatt fri aksess til antistoffoppløsningen i løpet av de neste to timene. Etterpå ble musene avlivet og deres magesekker dissekert. Umiddelbart ble innholdet i magesekkene oppsamlet ved spyling av magesekkene med 500 mikroliter PBS inneholdende 1 % BSA. Dette spylematerialet ble deretter brukt til fremstille serielle tregangers fortynninger, med start ved en 1/5 fortynning fra det ufortynnede materialet. Ett hundre mikroliter av disse prøvene overført til individuelle brønner i en mikrotiterplate belagt med humant TNFa. Etter inkubering i 1 time og følgende grundig vasking, ble nærværet av immuno-reaktivt materiale undersøkt med et polyklonalt kanin anti-VHH antiserum (R42) fulgt av inkubering ned et anti-kanin alkalisk-fosfatasekonjugat. ELISA ble utviklet med paranitrofenylacetat. ELISA-signalene oppnådd eter 10 minutter viste klart nærværet av funksjonelt VHH#3E i magespylingene fra disse musene. Ved sammenligning med standardkurven bestemte vi konsentrasjonen av det funksjonelle antistoffragmentet i magespylingsvæsken å være 1.5, 12.6 og 8.6 mikrogram/ml for de tre testede musene.
Eksempel 9: Effektivitet i en dyremodell for IBD
1) Dyremodell for kronisk colitis
Effektiviteten til bivalente VHH-konstrukter tilført via forskjellige administrasjonsveier ble undersøkt i en DSS (dextrannatriumsulfat) indusert modell for kronisk colitis i BALB/c mus. Denne modellen ble opprinnelig beskrevet av Okayasu et al. [Okayasu et al. Gastroenterology 1990; 98: 694-702] og modifisert av Kojouharoff et. al. [G. Kojouharoff et al. Clin. Exp. Immunol. 1997; 107: 353-8]. Dyrene ble anskaffet fra Charles River Laboratories, Tyskland, ved en alder på 11 uker og holdt i et dyreanlegg inntil de nådde en kroppsvekt mellom 21 og 22 g. Kronisk colitis ble indusert i dyrene ved fire DSS behandlingssykluser. Hver syklus bestod av et DSS behandlingsinterval (7 dager) hvor DSS ble gitt med drikkevann ved en konsentrasjon på 5 % (w/v) og gjenvinningsinterval (12 dager) uten nærvær av DSS i drikkevannet. Den siste gjenvinningsperioden forlenget fra 12 til 21 dager for å fremskaffe en inflammasjonsstatus som heller representerte en kronisk enn en akutt inflammasjon ved behandlingstiden.
Etter det siste gjenvinningsintervallet, ble musene tilfeldig utvalgt i grupper på 8 mus og behandling med VHH-konstrukter ble startet. Behandlingsintervallet var 2 uker. En uke etter avslutningen av behandlingsintervallet ble dyrene avlivet, tarmen ble dissekert og undersøkt histologisk. Den eksperimentelle settingen er vist skjematisk i Figur 18.
2 ) VHH behandlingsplan
Under VHH-behandlingsperioden ble musene (8 dyr per gruppe) ble behandlet daglig i 14 etterfølgende dager med bivalent VHH#3F (VHH#m3F-VHH#m3F ; SEQ ID Nr. 76) ved intra- gastrisk eller intra-venøs applikasjon av 100 pg bivalent VHH 3F. En ytterligere gruppe av dyr ble behandlet rektalt med det bivalente VHH#3F annen hver dag i en periode på 14 dager. I alle behandlingsgruppene ble en dose på 100 ug av det bivalente VHH#3F applisert ved en konsentrasjon på 1 mg/ml i en bufret oppløsning. De negative kontrollgruppene mottok 100 ul PBS under ellers identiske betingelser. Behandlingsplanen er vist i Tabell 11.
3) Resultater
Etter at musene var avlivet, ble kroppsvekten bestemt og colon ble dissekert. Lengden av den dissekerte colon ble bestemt og histologien til colon ble undersøkt ved Haematoxilin-Eosin (HE) farging (standard betingelser). Som
sammenlignet med de negative kontrollene (PBS behandling) viste gruppene behandlet med bivalent nanolegeme 3F en avbrutt colonlengde så vel som en forbedret histologisk skår [G. Kojouharoff et al. Clin. Exp. Immunol. 1997; 107: 353-8] noe som demonstrerer effektivitet til behandlingen.

Claims (29)

1. Et anti-TNF-alfa polypeptid omfattende minst ett anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoff, omfattende (a) en sekvens representert ved SEQ ID NO: 1, eller (b) en homolog sekvens som viser en sekvensidentitet på mer enn 85% med modersekvensen representert ved SEQ ID NO: 1; hvor nevnte homologe sekvens inneholder de hydrofobe FR2 restene som typisk blir funnet i konvensjonelle antistoffer av human opprinnelse og en argininrest i posisjon 103 (nummerering ifølge Kabat).
2. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge krav 1, hvor minst et anti-TNF-alfa enkeltdomene antistoff videre er humanisert.
3. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge krav 1 eller 2, videre omfattende minst ett enkeltdomene antistoff rettet mot et serumprotein.
4. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge krav 3, hvor nevnte serum protein er et hvilket som helst av serum albumin, serum immunoglobuliner, tyroksin-bindende protein, transferrin, eller fibrinogen.
5. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, ytterligere omfattende minst ett enkeltdomene anti-serum protein enkeltdomene antistoff fra en gruppe bestående av anti-IFN-gamma enkeltdomene antistoff, anti-TNF-alfa reseptor enkeltdomene antistoff og anti-IFN- gamma reseptor enkeltdomene antistoff.
6. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor antallet enkeltdomene antistoffer rettet mot TNF-alfa er minst to.
7. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvor det minst ene enkeltdomene antistoffet er et humanisert Camelidae VHH.
8. En sammensetning omfattende et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 og minst ett enkeltdomene antistoff fra gruppen bestående av anti-IFN- gamma enkeltdomene antistoff, anti-TNF-alfa reseptor enkeltdomene antistoff og anti- IFN-gamma reseptor enkeltdomene antistoff, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ.
9. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 7, eller en sammensetning ifølge krav 8 hvor minst ett anti-IFN-gamma enkeltdomene antistoff tilsvarer en sekvens representert ved en hvilken som helst av SEQ ID Nr: 44 til 72.
10. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller en sammensetning ifølge krav 8, hvor minst ett enkeltdomene antistoff er et Camelidae VHH.
11. En nukleinsyre som koder for et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10.
12. En fremgangsmåte for identifisering av et middel som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, til Tumor necrose faktor-alfa omfattende trinnene: (a) bringe i kontakt et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 med et mål som er Tumor nekrose faktor alfa, i nærvær og fravær av en kandidatmodulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptid og mål, og (b) måling av bindingen mellom polypeptidet og målet fra trinn (a), hvor en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidat modulator, i forhold til bindingen i fravær av nevnte kandidatmodulator identifiserer nevnte kandidatmodulator som et middel som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 og Tumor nekrosefaktor- alfa.
13. En fremgangsmåte for identifisering av et middel som modulerer Tumor nekrosefaktor-alfa- medierte forstyrrelser ved bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 til Tumor nekrosefaktor-alfa omfattende: (a) bringe i kontakt et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 med et mål som er Tumor nekrosefaktor alfa, i nærvær og fravær av en kandidatmodulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptid og mål, og (b) måling av bindingen mellom polypeptidet og målet fra trinn (a), hvor en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidat modulator, i forhold til bindingen i fravær av nevnte kandidatmodulator identifiserer nevnte kandidatmodulator som et middel som modulerer Tumor nekrosefaktor alfa-medierte forstyrrelser.
14. En fremgangsmåte for identifisering av et middel som modulerer bindingen av Tumor nekrosefaktor alfa til sin reseptor ved bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 til Tumor nekrosefaktor-alfa omfattende: (a) bringe i kontakt et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 med et mål som er Tumor nekrosefaktor-alfa, i nærvær og fravær av en kandidatmodulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptid og mål, og (b) måling av bindingen mellom polypeptidet og målet fra trinn (a), hvor en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidat modulator, i forhold til bindingen i fravær av nevnte kandidatmodulator identifiserer nevnte kandidatmodulator som et middel som modulerer bindingen av Tumor nekrosefaktor-alfa til sin reseptor.
15. Et sett for skreening for midler som modulerer Tumor nekrosefaktor-alfa-medierte forstyrrelser omfattende et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, Tumor nekrosefaktor-alfa og pakkematerialer for dette og bruksanvisning.
16. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse i behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er relatert til inflammatoriske prosesser.
17. Anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse i behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til passere gjennom det gastriske miljøet, uten at stoffet blir inaktivert.
18. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
19. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse ved behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff levert til nesen, den øvre respirasjonstrakten og/eller lungen.
20. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse i behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff levert til tarmmucosa, hvor nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til tarmmucosa.
21. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse i behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til effektivt å passere vevene under tungen.
22. Et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en nukleinsyre ifølge krav 11, eller en sammensetning ifølge krav 8, for anvendelse i behandling og/eller forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser mottakelig for modulering ved et TNF-alfa modulerende stoff som er i stand til effektivt å passere huden.
23. En fremgangsmåte ifølge krav 13, et sett ifølge krav 15, et anti-TNF-alfa polypeptid, en nukleinsyre eller sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 16 til 22, hvor nevnte forstyrrelser er en hvilken som helst av inflammasjon, reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerativ colitis, inflammatorisk tarm syndrom, multippel sklerose, Addison's sykdom, Autoimmun hepatitis, Autoimmun parotitis, Diabetes Type I, Epididymitis, Glomerulonephritis, Graves' sykdom, Guillain- Barre syndrom, Hashimoto's sykdom, Hemolytisk anemi, Systemisk lupus erytematosus, mannlig infertilitet, Multippel sklerose, Myasthenia Gravis, Pemphigus, Psoriasis, Rheumatisk feber, Reumatoid artritis, Sarcoidosis, Scleroderma, Sjogren's syndrom, Spondyloarthropathies, Thyroiditis, og Vasculitis.
24. En sammensetning omfattende en nukleinsyre eller middel ifølge krav 11, et anti-TNF- alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, eller en sammensetning ifølge krav 8, og en passende farmasøytisk vehikkel.
25. En in vitro fremgangsmåte for diagnostisering av en forstyrrelsekarakterisertved dysfunksjonen til Tumor nekrose faktor-alfa omfattende: a) bringe i kontakt en prøve med et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge krav 1 til 7, 9 eller 10, (b) detektering av binding av nevnte polypeptid til nevnte prøve, og (c) sammenligning av bindingen detektert i trinn (b) med en standard, hvor en forskjell i binding i forhold til nevnte prøve er diagnostisk for en forstyrrelsekarakterisert veddysfunksjon av Tumor nekrose faktor-alfa.
26. Et sett for skreening for en forstyrrelse, hvor forstyrrelsen er en hvilken som helst av hvor nevnte forstyrrelser er en hvilken som helst av inflammasjon, reumatoid artritis, Crohn's sykdom, ulcerativ colitis, inflammatorisk tarm syndrom, multippel sklerose, Addison's sykdom, Autoimmun hepatitis, Autoimmun parotitis, Diabetes Type I, Epididymitis, Glomerulonephritis, Graves' sykdom, Guillain- Barre syndrom, Hashimoto's sykdom, Hemolytisk anemi, Systemisk lupus erytematosus, mannlig infertilitet, Multippel sklerose, Myasthenia Gravis, Pemphigus, Psoriasis, Rheumatisk feber, Reumatoid artritis, Sarcoidosis, Scleroderma, Sjogrer<V>s syndrom, Spondyloarthropathies, Thyroiditis, og Vasculitis hvor settet omfatter et isolert anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, pakkematerialer for dette, og bruksanvisning.
27. En fremgangsmåte for fremstilling av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kraven 1 til 7, 9 eller 10, omfattende trinnene: (a) fremskaffelse av et DNA som koder for et Camelidae VHH rettet mot Tumor nekrosefaktor alfa, (b) kloning og uttrykking av DNAet valgt i trinn (a).
28. En fremgangsmåte for fremstilling av et anti-TNF-alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10, omfattende: (a) dyrking av vertsceller omfattende nukleinsyre som koder for et anti-TNF- alfa polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, 9 eller 10 under betingelser som tillater ekspresjon av polypeptidet, og, (b) gjenvinning av det produserte polypeptidet fra kulturen.
29. En fremgangsmåte ifølge krav 28, hvor nevnte vertsceller er bakterier eller gjær.
NO20052769A 2002-11-08 2005-06-08 Enkeldomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor-alfa og anvendelser derav NO338986B1 (no)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42506302P 2002-11-08 2002-11-08
US42507302P 2002-11-08 2002-11-08
EP03447005 2003-01-10
EPPCT/EP03/06581 2003-06-23
EPPCT/EP03/07313 2003-07-08
PCT/BE2003/000192 WO2004041862A2 (en) 2002-11-08 2003-11-07 Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20052769D0 NO20052769D0 (no) 2005-06-08
NO20052769L NO20052769L (no) 2005-07-14
NO338986B1 true NO338986B1 (no) 2016-11-07

Family

ID=32830281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20052769A NO338986B1 (no) 2002-11-08 2005-06-08 Enkeldomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor-alfa og anvendelser derav

Country Status (7)

Country Link
US (5) US20090238829A1 (no)
EP (6) EP1558645B1 (no)
KR (1) KR101103218B1 (no)
AU (4) AU2003286003B2 (no)
BR (1) BRPI0316092B8 (no)
NO (1) NO338986B1 (no)
WO (1) WO2004041867A2 (no)

Families Citing this family (251)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1517921E (pt) * 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
WO2004015425A1 (en) 2002-08-07 2004-02-19 Umc Utrecht Holding B.V. Modulation of platelet adhesion based on the surface exposed beta-switch loop of platelet glycoprotein ib-alpha
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
JP2006524036A (ja) * 2002-11-08 2006-10-26 アブリンクス エン．ヴェー． 腫瘍壊死因子αを標的とする単一ドメイン抗体およびその使用
US20100003253A1 (en) * 2002-11-08 2010-01-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
AU2003286003B2 (en) * 2002-11-08 2011-05-26 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
US20060034845A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
CN102584997A (zh) * 2002-11-08 2012-07-18 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子-α的单结构域抗体及其用途
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
EP2390270A1 (en) 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
PT1639011E (pt) 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
CA2569240A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Drug fusion comprising a polypeptide drug and an immunoglobulin heavy chain variable domain specific for serum albumin
CN1942203A (zh) * 2004-06-04 2007-04-04 金克克国际有限公司 使用抗体重链的筛选方法
KR20130019457A (ko) 2004-07-26 2013-02-26 다우 글로벌 테크놀로지스 엘엘씨 균주 조작에 의한 개선된 단백질 발현 방법
WO2006040153A2 (en) * 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease
US20080249285A1 (en) * 2004-12-02 2008-10-09 Wilhelmus Josephus Johanna Hermans Method For Affinity Purification
WO2006059110A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Plad domain peptides with increased serum half life due to conjugation to domain antibodies
BRPI0518622A2 (pt) * 2004-12-02 2008-12-02 Domantis Ltd usos de antagonistas de receptor do tipo 1 de interleucina-1(il-1r1) para a fabricaÇço de um medicamento para o tratamento de uma doenÇa respiratària; composiÇço farmacÊutica que compreende um antagonista do il-1r1 e um veÍculo fisiologicamente aceitÁvel e dispositivo de liberaÇço de medicamento
CN101128487B (zh) * 2004-12-02 2012-10-10 杜门蒂斯有限公司 靶向血清白蛋白和glp-1或pyy的双特异性结构域抗体
AU2006205900B8 (en) 2005-01-14 2012-04-05 Ablynx N.V. Methods and assays for distinguishing between different forms of diseases and disorders characterized by thrombocytopenia and/or by spontaneous interaction between Von Willebrand Factor (vWF) and platelets
AU2006249144B2 (en) 2005-05-18 2011-11-17 Ablynx Nv Improved NanobodiesTM against Tumor Necrosis Factor-alpha
NZ563392A (en) 2005-05-20 2009-12-24 Ablynx Nv Improved Nanobodies(TM) for the treatment of aggregation-mediated disorders
US8361462B2 (en) 2005-09-01 2013-01-29 National Research Council Of Canada Anti-apoptotic protein antibodies
AU2006297304B2 (en) 2005-09-29 2012-05-17 Medimmune, Llc Method of identifying membrane LG specific antibodies and use thereof for targeting immunoglobulin-producing precursor cells
EP1785434A1 (en) * 2005-11-11 2007-05-16 Ludwig-Maximilians-Universität München Targeting and tracing of antigens in living cells
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
EP1966242A1 (en) * 2005-12-06 2008-09-10 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor
JP2007172129A (ja) * 2005-12-20 2007-07-05 Sony Corp 不揮発性メモリアクセス制御装置および不揮発性メモリ制御システム
GB0601513D0 (en) * 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
EA017417B1 (ru) * 2006-02-01 2012-12-28 Сефалон Астралия Пти Лтд. КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
GB0611116D0 (en) 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
US20110182904A1 (en) 2006-09-05 2011-07-28 Deborah Zimmerman Antibodies to bone morphogenic proteins and receptors therefor and methods for their use
SG178712A1 (en) 2006-10-02 2012-03-29 Medarex Inc Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof
PL2698166T3 (pl) 2006-10-10 2016-03-31 Regenesance B V Hamowanie układu dopełniacza służące do lepszej regeneracji nerwów
AU2007306340A1 (en) * 2006-10-11 2008-04-17 Ablynx N.V. Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and use thereof
US20100129354A1 (en) * 2006-10-27 2010-05-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
MX2009005776A (es) 2006-12-01 2009-06-10 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se enlazan al cd 22 y sus usos.
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
WO2008074004A2 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
WO2008074839A2 (en) 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
US9512236B2 (en) 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
EP2514767A1 (en) 2006-12-19 2012-10-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the ADAM family and polypeptides comprising the same for the treatment of ADAM-related diseases and disorders
EP2121745A2 (en) 2007-02-26 2009-11-25 Oxford Genome Sciences (UK) Limited Proteins
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
PL2308514T3 (pl) 2007-03-23 2013-11-29 To Bbb Holding B V Koniugaty do ukierunkowanego dostarczania leku poprzez barierę krew-mózg
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
CN101688213A (zh) 2007-04-27 2010-03-31 陶氏环球技术公司 用于快速筛选微生物宿主以鉴定某些在表达异源蛋白质方面具有改善的产量和/或质量的菌株的方法
WO2008142165A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against growth factor receptors and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with growth factors and their receptors
WO2008153926A2 (en) 2007-06-05 2008-12-18 Yale University Inhibitors of receptor tyrosine kinases and methods of use thereof
US10214588B2 (en) 2007-07-03 2019-02-26 Ablynx N.V. Providing improved immunoglobulin sequences by mutating CDR and/or FR positions
EP2650311A3 (en) 2007-11-27 2014-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
GB2470328A (en) 2008-03-05 2010-11-17 Ablynx Nv Novel antigen binding dimer complexes, methods of making and uses thereof
DK2274008T3 (da) 2008-03-27 2014-05-12 Zymogenetics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til hæmning af PDGFRBETA og VEGF-A
CN102056945A (zh) 2008-04-07 2011-05-11 埃博灵克斯股份有限公司 针对Notch途径的单可变结构域
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
JP6034023B2 (ja) 2008-05-16 2016-11-30 アブリンクス エン．ヴェー． Ｃｘｃｒ４及び他のｇｐｃｒに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物
US8444976B2 (en) 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
EP2316030B1 (en) 2008-07-25 2019-08-21 Wagner, Richard W. Protein screeing methods
KR101581986B1 (ko) 2008-10-29 2016-01-04 아블린쓰 엔.브이. 단일 도메인 항원 결합 분자의 제형
CA2739352C (en) 2008-10-29 2021-07-13 Wyeth Llc Methods for purification of single domain antigen binding molecules
CA2737045C (en) * 2008-11-20 2017-11-14 Bruce Kabakoff Therapeutic protein formulations
CA2750581A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oxford Biotherapeutics Ltd. Pta089 protein
WO2010085590A1 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Biosynexus Incorporated Opsonic and protective antibodies specific for lipoteichoic acid gram positive bacteria
US10005830B2 (en) 2009-03-05 2018-06-26 Ablynx N.V. Antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
WO2011026948A1 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
BRPI1009232B1 (pt) 2009-03-05 2022-05-03 E.R. Squibb & Sons, Llc. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo, composição que os compreende, molécula de ácido nucleico, hibridoma e métodos para a preparação de um anticorpo anti-cadm1
NZ595461A (en) 2009-04-10 2013-01-25 Ablynx Nv Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
SG10201401604VA (en) 2009-04-20 2014-08-28 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies Specific To Cadherin-17
AU2010243551B2 (en) 2009-04-30 2015-03-26 Ablynx Nv Method for the production of domain antibodies
US9187568B2 (en) 2009-05-07 2015-11-17 Stallergenes S.A. Use of IgG1 immunoglobulins and/or ligands of the CD32 receptor for treating inflammatory diseases and manifestations via the mucosal route
DK2438087T3 (en) 2009-06-05 2017-08-28 Ablynx Nv TRIVALENT NANOBODY CONSTRUCTIONS AGAINST HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (HRSV) FOR PREVENTION AND / OR TREATMENT OF AIR INFECTIONS
HUE051430T2 (hu) 2009-07-10 2021-03-01 Ablynx Nv Eljárás variábilis domének elõállítására
EP2459053A2 (en) 2009-07-28 2012-06-06 F. Hoffmann-La Roche AG Non-invasive in vivo optical imaging method
UY32920A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis
UY32917A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de unión a dll-4
WO2011042398A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
EP2470569A1 (en) 2009-10-13 2012-07-04 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies against epha10
WO2011051327A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Small antibody-like single chain proteins
WO2011054007A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Ror1 as therapeutic and diagnostic target
US9644022B2 (en) 2009-11-30 2017-05-09 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (HRSV) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
US8962807B2 (en) 2009-12-14 2015-02-24 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use
WO2011083140A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
CN102781959A (zh) 2010-02-05 2012-11-14 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合血清白蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽
MX2012009318A (es) 2010-02-10 2012-09-07 Novartis Ag Metodos y compuestos para el crecimiento muscular.
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
PL2533761T3 (pl) 2010-02-11 2019-09-30 Ablynx N.V. Sposoby i kompozycje do wytwarzania aerozoli
AR080446A1 (es) 2010-03-03 2012-04-11 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta (beta amiloide)
US8937164B2 (en) 2010-03-26 2015-01-20 Ablynx N.V. Biological materials related to CXCR7
EP2553449A2 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Substitute therapy for glucocorticoids
US9101674B2 (en) 2010-03-29 2015-08-11 Vib Vzw Targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
US9556273B2 (en) 2010-03-29 2017-01-31 Vib Vzw Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
JP6145404B2 (ja) 2010-05-07 2017-06-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト エクスビボでの細胞の検出のための診断的方法
RU2012149227A (ru) 2010-05-20 2014-06-27 Аблинкс Нв Биологические материалы, относящиеся к her3
WO2011161263A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Pharmaceutical compositions for cutaneous administration
US20120225081A1 (en) 2010-09-03 2012-09-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vegf-binding molecules
US20120244141A1 (en) 2010-09-28 2012-09-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Stratification of cancer patients for susceptibility to therapy with PTK2 inhibitors
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
WO2012056000A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Ablynx Nv Method for the production of immunoglobulin single variable domains
KR101832040B1 (ko) 2010-11-08 2018-04-04 노파르티스 아게 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드
SI2646470T1 (sl) 2010-11-30 2017-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Protitelesa proti receptorjem antitransferina in njihova uporaba za prenos terapevtskega enoverižnega variabilnega fragmenta (scfv) prek krvno-možganske pregrade
WO2012120004A1 (en) 2011-03-07 2012-09-13 F. Hoffmann-La Roche Ag In vivo selection of therapeutically active antibodies
US20140099264A1 (en) 2011-03-07 2014-04-10 F. Hoffman-La Roche Ag Means and methods for in vivo testing of therapeutic antibodies
JP6181040B2 (ja) 2011-03-28 2017-08-16 アブリンクス エン．ヴェー． 二特異性抗ｃｘｃｒ７免疫グロブリン単一可変ドメイン
US9468679B2 (en) 2011-03-28 2016-10-18 Ablynx N.V. Method for producing solid formulations comprising immunoglobulin single variable domains
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US20130078247A1 (en) 2011-04-01 2013-03-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
WO2012152823A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 Ablynx Nv Method for the production of immunoglobulin single variable domains
AU2012264809B2 (en) 2011-05-27 2017-05-04 Ablynx Nv Inhibition of bone resorption with RANKL binding peptides
US9580480B2 (en) 2011-05-31 2017-02-28 Massachusetts Institute Of Technology Cell-directed synthesis of multifunctional nanopatterns and nanomaterials
IN2014CN00437A (no) 2011-06-23 2015-04-03 Ablynx Nv
PE20140756A1 (es) 2011-06-28 2014-07-04 Oxford Biotherapeutics Ltd Anticuerpos que se unen a bst1
ME02632B (me) 2011-06-28 2017-06-20 Oxford Biotherapeutics Ltd Terapeutski i dijagnostički cilj
EP3311837A1 (en) 2011-09-23 2018-04-25 Ablynx NV Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling
EP2747783B1 (en) 2011-09-30 2017-06-14 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
IL291571B1 (en) 2012-02-27 2024-04-01 Ablynx Nv CX3CR1 binding polypeptides
PT2831111T (pt) 2012-03-30 2019-05-31 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de ligação a ang2
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
JP6411333B2 (ja) 2012-05-24 2018-10-24 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ 腫瘍関連マクロファージのターゲティングおよびｉｎｖｉｖｏイメージング用抗マクロファージマンノース受容体単一可変ドメイン
US11339208B1 (en) 2012-05-31 2022-05-24 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Camelidae single-domain antibodies against Yersinia pestis and methods of use
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
KR102237799B1 (ko) 2012-11-14 2021-04-08 더블유.알. 그레이스 앤드 캄파니-콘. 생물학적 활성 물질 및 비-정렬된 무기 산화물을 함유하는 조성물
WO2014087010A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Ablynx N.V. IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
CA2899693C (en) 2013-01-30 2023-03-14 Vib Vzw Novel chimeric polypeptides for screening and drug discovery purposes
PT2953973T (pt) 2013-02-05 2019-10-25 Univ Brussel Vrije Agentes de ligação do receptor muscarínico de acetilololina e usos
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
US9617339B2 (en) 2013-03-15 2017-04-11 Vib Vzw Method of imaging a cardiovascular disease with an anti-macrophage mannose receptor immunoglobulin single variable domain
EP2992101B1 (en) 2013-04-29 2018-10-10 Agrosavfe N.V. Agrochemical compositions comprising antibodies binding to sphingolipids
NL1040254C2 (en) 2013-05-17 2014-11-24 Ablynx Nv Stable formulations of immunoglobulin single variable domains and uses thereof.
EP3079668A1 (en) 2013-12-09 2016-10-19 Durect Corporation Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same
EP2883883A1 (en) 2013-12-16 2015-06-17 Cardio3 Biosciences S.A. Therapeutic targets and agents useful in treating ischemia reperfusion injury
PT3248986T (pt) 2014-05-16 2022-04-05 Ablynx Nv Domínios variáveis de imunoglobulina
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
EP3194976B1 (en) 2014-07-22 2020-04-01 Vib Vzw Methods to select agents that stabilize protein complexes
EP3718574A1 (en) 2014-07-29 2020-10-07 Vrije Universiteit Brussel Radio-labelled antibody fragments for use in the prevention and/or treatment of cancer
EP3180037A1 (en) 2014-07-29 2017-06-21 Vrije Universiteit Brussel Radio-labelled antibody fragments for use in the prognosis, diagnosis of cancer as well as for the prediction of cancer therapy response
US20170267784A1 (en) 2014-10-23 2017-09-21 Singh Molecular Medicine, Llc Single domain antibodies directed against intracellular antigens
KR102207382B1 (ko) * 2014-10-23 2021-01-27 싱 몰레큘러 메디신, 엘엘씨 세포내 항원에 대해 지향된 단일 도메인 항체
EP3215624B1 (en) 2014-11-05 2023-11-29 Biotalys NV Transgenic plant comprising a polynucleotide encoding a variable domain of heavy-chain antibody
JP6862343B2 (ja) 2014-12-19 2021-04-21 アブリンクス エン．ヴェー． システイン結合ナノボディダイマー
KR102622281B1 (ko) 2015-03-31 2024-01-08 소리소 파마슈티컬스 인크. 폴리펩티드
CA2985700C (en) 2015-05-13 2022-06-28 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on cd3 reactivity
ES2754427T3 (es) 2015-05-13 2020-04-17 Ablynx Nv Polipéptidos de reclutamiento de células T basados en la reactividad de TCR alfa/beta
IL293719B2 (en) 2015-05-21 2023-07-01 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
EP3325020B1 (en) 2015-07-17 2022-01-12 Vrije Universiteit Brussel Radiolabelled antibody fragments for use in treating cancer
TWI746473B (zh) 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
SG11201803976VA (en) 2015-11-27 2018-06-28 Ablynx Nv Polypeptides inhibiting cd40l
UA122079C2 (uk) 2015-12-04 2020-09-10 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6
EP3435982A1 (en) 2016-03-31 2019-02-06 VHsquared Limited Compositions
US11243214B2 (en) 2016-04-22 2022-02-08 Université Libre de Bruxelles Biomarker expressed in pancreatic beta cells useful in imaging or targeting beta cells
WO2017182605A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Université Libre de Bruxelles A new biomarker expressed in pancreatic beta cells useful in imaging or targeting beta cells
US20190127447A1 (en) 2016-05-02 2019-05-02 Ablynx N.V. Treatment of rsv infection
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
AU2017267793B2 (en) 2016-05-20 2024-01-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2018007442A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Ablynx N.V. Treatment of il-6r related diseases
WO2018029182A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Ablynx N.V. Il-6r single variable domain antibodies for treatment of il-6r related diseases
CN107814845B (zh) 2016-09-14 2021-02-09 浙江特瑞思药业股份有限公司 新的抗pd-1纳米抗体及其应用
WO2018050833A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
CA3043515A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Ablynx Nv T cell recruiting polypeptides capable of binding cd123 and tcr alpha/beta
MX2019006043A (es) 2016-11-23 2019-09-26 Harpoon Therapeutics Inc Proteína de unión de antígeno prostático específico de membrana.
BR112019010602A2 (pt) 2016-11-23 2019-12-17 Harpoon Therapeutics Inc proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso
WO2018099968A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Ablynx N.V. Treatment of infection by respiratory syncytial virus (rsv)
CN111499750B (zh) * 2016-12-04 2022-02-08 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的高中和活性纳米抗体及其应用
EP3589725A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Vib Vzw Means and methods for oral protein delivery
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
WO2018192974A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 Université Libre de Bruxelles Biomarkers and targets for proliferative diseases
WO2018206734A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Vib Vzw Glycosylation of variable immunoglobulin domains
JP7209936B2 (ja) 2017-05-12 2023-01-23 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｍｓｌｎ標的三重特異性タンパク質及びその使用方法
KR102376863B1 (ko) 2017-05-12 2022-03-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 메소텔린 결합 단백질
EA201992808A1 (ru) 2017-05-31 2020-05-14 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх ПОЛИПЕПТИДЫ, ПРЕПЯТСТВУЮЩИЕ ПЕРЕДАЧЕ Wnt СИГНАЛОВ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
JP7249961B2 (ja) 2017-06-02 2023-03-31 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３およびアグリカンに結合するポリペプチド
WO2018220235A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Merck Patent Gmbh Mmp13 binding immunoglobulins
AR112069A1 (es) 2017-06-02 2019-09-18 Ablynx Nv Inmunoglobulinas que fijan aggrecan
US11261260B2 (en) 2017-06-02 2022-03-01 Merck Patent Gmbh ADAMTS binding immunoglobulins
WO2019016237A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Vib Vzw AGENTS FOR CONNECTING TO SERUM ALBUMIN
KR102569133B1 (ko) 2017-10-13 2023-08-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이적 단백질 및 사용 방법
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
US11873347B2 (en) 2017-10-31 2024-01-16 Vib Vzw Antigen-binding chimeric proteins and methods and uses thereof
WO2019155041A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Vib Vzw Gβγ COMPLEX ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019166622A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 Vrije Universiteit Brussel Human pd-l1-binding immunoglobulins
WO2019179389A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel anti-egfr antibody polypeptide
CN112384527B (zh) 2018-03-23 2023-06-27 布鲁塞尔自由大学 Wnt信号传递激动剂分子
EP3773665A1 (en) 2018-03-27 2021-02-17 UMC Utrecht Holding B.V. Targeted thrombolysis for treatment of microvascular thrombosis
MX2020010323A (es) * 2018-04-03 2021-01-08 Ngm Biopharmaceuticals Inc Agentes de union al componente del complemento c3 (c3) y metodos para su uso.
CN108409841B (zh) * 2018-04-10 2021-06-04 北京康亿鸿科技发展有限公司 用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白及应用
CN108535493B (zh) * 2018-04-10 2020-11-03 北京康亿鸿科技发展有限公司 特异性过敏原IgE的检测方法
JP7425049B2 (ja) 2018-09-25 2024-01-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法
EP3636657A1 (en) 2018-10-08 2020-04-15 Ablynx N.V. Chromatography-free antibody purification method
CN113508134A (zh) * 2019-02-22 2021-10-15 安维达生物科技公司 白蛋白结合抗体及其用途
US20220276244A1 (en) 2019-04-29 2022-09-01 Confo Therapeutics N.V. Chimeric proteins and methods to screen for compounds and ligands binding to gpcrs
EP3962599A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 Vib Vzw Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator stabilizing agents
EP3976650A1 (en) 2019-05-28 2022-04-06 Vib Vzw Cancer treatment by targeting plexins in the immune compartment
WO2020239934A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Vib Vzw Cd8+ t-cells lacking plexins and their application in cancer treatment
CA3144566A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
EP3986571A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
WO2021078786A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Vib Vzw Nanodisc-specific antigen-binding chimeric proteins
MX2022005678A (es) 2019-11-11 2022-10-18 Ibi Ag Innovative Bio Insecticides Ltd Nanocuerpos para el control de insectos y usos de los mismos.
WO2021102063A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Anwita Biosciences, Inc. Cytokine fusion proteins, and their pharmaceutical compositions and therapeutic applications
US20220411495A1 (en) 2019-11-27 2022-12-29 Vib Vzw Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
WO2021123360A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Vib Vzw Nanobody exchange chromatography
WO2021140205A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Confo Therapeutics N.V. Methods for generating antibodies and antibody fragments and libraries comprising same
WO2021156490A2 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders
AU2021224851A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 Harpoon Therapeutics, Inc. FLT3 binding proteins and methods of use
IL295892A (en) 2020-02-25 2022-10-01 Vib Vzw Leucine-rich repeat kinase 2 allosteric modulators
WO2021198396A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Biotalys NV Anti-fungal polypeptides
US20230279115A1 (en) 2020-04-22 2023-09-07 Mabwell (shanghai) Bioscience Co., Ltd. Single variable domain antibody targeting human programmed death ligand 1 (pd-l1) and derivative thereof
KR20230065931A (ko) * 2020-05-15 2023-05-12 우니베르시다드 오스뜨랄 데 칠레 나노항체 생성을 위한 신속 단일-단계 구배 방법 (rapid single-step gradient method for the generation of nanoantibodies)
WO2021229104A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
CN111875706B (zh) * 2020-07-16 2021-03-30 广州康盛生物科技股份有限公司 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
WO2022023583A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Biotalys NV Expression host
CN116171384A (zh) * 2020-08-19 2023-05-26 匹兹堡大学 联邦高等教育系统 冠状病毒纳米抗体及其使用和鉴定方法
CA3196737A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Massimiliano Mazzone Combination of p2y6 inhibitors and immune checkpoint inhibitors
WO2022063957A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Biomarker for anti-tumor therapy
IL301581A (en) 2020-09-25 2023-05-01 Ablynx Nv Polypeptides comprising single immunoglobulin variable sites targeting 13-IL and OX40L
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
WO2022117572A2 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2022129572A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting il-6 and tnf-alpha
WO2022129637A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Ablynx Nv T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity
GB202020502D0 (en) 2020-12-23 2021-02-03 Vib Vzw Antibody composistion for treatment of corona virus infection
EP4267618A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 Vib Vzw Non-blocking human ccr8 binders
CA3206304A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Vib Vzw Human ccr8 binders
EP4267621A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 Vib Vzw Murine cross-reactive human ccr8 binders
US20240101647A1 (en) 2021-02-05 2024-03-28 Vib Vzw Sarbecovirus binders
CN117794566A (zh) 2021-02-05 2024-03-29 Vib研究所 沙贝病毒结合剂
WO2022175392A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Vib Vzw Inhibition of slc4a4 in the treatment of cancer
EP4294516A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders
WO2022199804A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Vib Vzw Nek6 inhibition to treat als and ftd
WO2022242892A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
WO2022268993A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Vib Vzw Means and methods for selection of specific binders
CN117580865A (zh) 2021-06-29 2024-02-20 山东先声生物制药有限公司 Cd16抗体及其应用
WO2023016828A2 (en) 2021-07-30 2023-02-16 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation
CA3227972A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Shandong Simcere Biopharmaceutical Co., Ltd. Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and applications thereof
WO2023057601A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Biotalys NV Anti-fungal polypeptides
WO2023111266A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Ablynx Nv POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TCRαβ, CD33 AND CD123
WO2023135198A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Vib Vzw Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery
WO2023148291A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Biotalys NV Methods for genome editing
WO2023148397A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Vib Vzw Engineered stabilizing aglycosylated fc-regions
WO2023198848A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2023213751A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Umc Utrecht Holding B.V Single domain antibodies for the detection of plasmin-cleaved vwf
WO2023222825A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vib Vzw Sarbecovirus spike s2 subunit binders
WO2024003376A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Alk-Abelló A/S Displacers of ige-fceri
WO2024008755A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Vib Vzw Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024068744A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002078A1 (en) * 1989-08-07 1991-02-21 Peptide Technology Ltd Tumour necrosis factor binding ligands
WO2002057445A1 (en) * 2000-05-26 2002-07-25 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
WO2003035694A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Functional heavy chain antibodies, fragments thereof, library thereof and methods of production thereof

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4559157A (en) 1983-04-21 1985-12-17 Creative Products Resource Associates, Ltd. Cosmetic applicator useful for skin moisturizing
LU84979A1 (fr) 1983-08-30 1985-04-24 Oreal Composition cosmetique ou pharmaceutique sous forme aqueuse ou anhydre dont la phase grasse contient un polyether oligomere et polyethers oligomeres nouveaux
US5672347A (en) * 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4946788A (en) 1985-06-11 1990-08-07 Ciba-Geigy Corporation Purified immunoglobulin-related factor, novel monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, processes and applications
US4714759A (en) 1985-12-02 1987-12-22 Whitaker Jr Robert B Immunotoxin therapy of allergy
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4940782A (en) 1987-06-08 1990-07-10 G. D. Searle & Co. Monoclonal antibodies against IgE-associated determinants, hybrid cell lines producing these antibodies, and use therefore
EP0294703B1 (en) 1987-06-10 1995-05-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations
US4820508A (en) 1987-06-23 1989-04-11 Neutrogena Corporation Skin protective composition
US4962035A (en) 1987-12-01 1990-10-09 President And Fellows Of Harvard College DNA encoding IgE receptor alpha-subunit or fragment thereof
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5422258A (en) 1987-12-31 1995-06-06 Tanox Biosystems, Inc. Methods for producing high affinity anti-human IgE-monoclonal antibodies which binds to IgE on IgEabearing B cells but not basophils
US5428133A (en) 1987-12-31 1995-06-27 Tanox Biosystems, Inc. Chimeric anti-human IgE-monoclonal antibody which binds to secreted IgE and membrane-bound IgE expressed by IgE-expressing B cells but notto IgE bound to FC receptors on basophils
US5231026A (en) 1987-12-31 1993-07-27 Tanox Biosystems, Inc. DNA encoding murine-human chimeric antibodies specific for antigenic epitopes of IgE present on the extracellular segment of the membrane domain of membrane-bound IgE
US5252467A (en) 1987-12-31 1993-10-12 Tanox Biosystems, Inc. Method of making antibodies to antigenic epitopes of IGE present on B cells but not basophil cell surface or secreted, soluble IGE
US4992478A (en) 1988-04-04 1991-02-12 Warner-Lambert Company Antiinflammatory skin moisturizing composition and method of preparing same
US5770198A (en) * 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5644034A (en) * 1989-08-07 1997-07-01 Peptide Technology Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
US5843440A (en) * 1990-10-03 1998-12-01 Redcell Canada, Inc. Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics
WO1992005801A1 (en) * 1990-10-04 1992-04-16 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Primate erythrocyte bound monoclonal antibody heteropolymers
WO1993000077A1 (en) 1991-06-21 1993-01-07 University Of Cincinnati Orally administrable therapeutic proteins and method of making
CA2113813C (en) 1991-08-14 2005-04-12 Paula M. Jardieu Immunoglobulin variants for specific fc epsilon receptors
ES2162823T5 (es) 1992-08-21 2010-08-09 Vrije Universiteit Brussel Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.
DE69333484T2 (de) * 1992-09-24 2005-03-24 Novartis Ag Umgestaltete monoklonale Antikörper gegen ein Immunglobulinisotyp
CA2151742C (en) 1993-02-22 1999-05-25 Alfred A. Amkraut Compositions for oral delivery of active agents
GB9311454D0 (en) 1993-06-03 1993-07-21 Agricultural & Food Res Pharmaceutical compositions
AU1441395A (en) * 1993-12-21 1995-07-10 St. Louis University Ocular diagnostics and therapies
DE69530316T2 (de) * 1994-11-30 2004-02-12 Ajinomoto Co., Inc. Antithrombose mittel und gegen den von willebrand-faktor gerichtete monoklonale antikörper
US6096871A (en) * 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0739981A1 (en) * 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6410690B1 (en) * 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
ZA966075B (en) 1995-07-27 1998-01-19 Genentech Inc Protein formulation.
GB9518323D0 (en) 1995-09-07 1995-11-08 Steidler Lothar Materials and methods relating to the attachment and display of substances on cell surfaces
US7368111B2 (en) * 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
CA2258518C (en) 1996-06-27 2011-11-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
US6417337B1 (en) * 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
US6361938B1 (en) 1996-11-08 2002-03-26 Elan Corporation, Plc Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same
US5994511A (en) * 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
DE29712318U1 (de) * 1997-07-07 1997-10-02 Arnold Guenter Schälmesser
US6670453B2 (en) * 1997-10-27 2003-12-30 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent antigen-binding proteins
EP0954978B1 (en) 1998-03-12 2011-11-30 VHsquared Limited New products comprising inactivated yeasts or moulds provided with active antibodies
CZ121599A3 (cs) * 1998-04-09 1999-10-13 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu
EP1123314B1 (en) 1998-10-20 2004-02-18 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Use of a cytokine-producing lactococcus strain to treat colitis
JP2002529373A (ja) * 1998-10-23 2002-09-10 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル，インコーポレイテッド コンホメーション特異的抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体
WO2000040262A1 (en) * 1999-01-05 2000-07-13 The Flinders University Of South Australia Novel agents and methods for treatment and diagnosis of ocular disorders
US6419934B1 (en) * 1999-02-24 2002-07-16 Edward L. Tobinick TNF modulators for treating neurological disorders associated with viral infection
DE19912637A1 (de) * 1999-03-20 2000-09-21 Aventis Cropscience Gmbh 2,4-Diamino-1,3,5-triazine, Verfahren zur Herstellung und Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
KR101222450B1 (ko) 1999-03-25 2013-01-16 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
WO2000065057A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins
ATE292475T1 (de) * 1999-09-16 2005-04-15 Unilever Nv Abgabesystem für ein mittel gegen schuppen
TWI373343B (en) * 2000-02-10 2012-10-01 Abbott Gmbh & Co Kg Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
EP1134231B1 (en) 2000-03-14 2009-04-15 Unilever N.V. Antibody heavy chain variable domains against human dietary lipases, and their uses
US7097840B2 (en) * 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
WO2001080883A1 (en) * 2000-04-26 2001-11-01 Elusys Therapeutics, Inc. Bispecific molecules and uses thereof
WO2001089567A1 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Idec Pharmaceuticals Corporation Identification of unique binding interactions between certain antibodies and the human b7.1 and b7.2 co-stimulatory antigens
AU2002211658A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 Uab Research Foundation Human anti-epidermal growth factor receptor single-chain antibodies
WO2002039121A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for detecting the efficacy of anticancer treatments
ES2552281T3 (es) * 2001-05-11 2015-11-26 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Proteínas de unión específica y usos de las mismas
DE60237282D1 (de) * 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US7084257B2 (en) * 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
US20050037358A1 (en) 2001-12-21 2005-02-17 Serge Muyldermans Method for cloning of variable domain sequences
PT1517921E (pt) * 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
EP1546203B1 (en) * 2002-08-01 2012-06-20 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20060034833A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Els Beirnaert Single domain antibodies directed against interferron-gamma and uses therefor
US20060034845A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
CN102584997A (zh) * 2002-11-08 2012-07-18 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子-α的单结构域抗体及其用途
AU2003286003B2 (en) * 2002-11-08 2011-05-26 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
WO2005044858A1 (en) * 2003-11-07 2005-05-19 Ablynx N.V. Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
US20100003253A1 (en) * 2002-11-08 2010-01-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
JP2006524036A (ja) 2002-11-08 2006-10-26 アブリンクス エン．ヴェー． 腫瘍壊死因子αを標的とする単一ドメイン抗体およびその使用
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
ES2387809T3 (es) * 2004-03-19 2012-10-02 Imclone Llc Anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano
BRPI0518622A2 (pt) * 2004-12-02 2008-12-02 Domantis Ltd usos de antagonistas de receptor do tipo 1 de interleucina-1(il-1r1) para a fabricaÇço de um medicamento para o tratamento de uma doenÇa respiratària; composiÇço farmacÊutica que compreende um antagonista do il-1r1 e um veÍculo fisiologicamente aceitÁvel e dispositivo de liberaÇço de medicamento
US20100129354A1 (en) * 2006-10-27 2010-05-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002078A1 (en) * 1989-08-07 1991-02-21 Peptide Technology Ltd Tumour necrosis factor binding ligands
WO2002057445A1 (en) * 2000-05-26 2002-07-25 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
WO2003035694A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Functional heavy chain antibodies, fragments thereof, library thereof and methods of production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20090238829A1 (en) 2009-09-24
AU2003286003A1 (en) 2004-06-07
AU2003283137B8 (en) 2010-07-29
BR0316092A (pt) 2005-09-27
US20170107302A1 (en) 2017-04-20
NO20052769L (no) 2005-07-14
AU2003286004A1 (en) 2004-06-07
AU2003286002B2 (en) 2011-06-16
WO2004041867A2 (en) 2004-05-21
EP1558647B1 (en) 2015-06-10
AU2003283137A1 (en) 2004-06-07
EP2267027A2 (en) 2010-12-29
KR20050072814A (ko) 2005-07-12
WO2004041867A3 (en) 2004-08-12
AU2003286004A8 (en) 2004-06-07
US20120251540A1 (en) 2012-10-04
EP1558645B1 (en) 2011-07-27
AU2003286002A1 (en) 2004-06-07
EP1558646A2 (en) 2005-08-03
BRPI0316092B1 (pt) 2018-10-30
AU2003283137B2 (en) 2010-07-01
EP2267032A3 (en) 2011-11-09
US20150064182A1 (en) 2015-03-05
EP1558647A2 (en) 2005-08-03
AU2003286003B2 (en) 2011-05-26
US20110178277A1 (en) 2011-07-21
NO20052769D0 (no) 2005-06-08
BRPI0316092B8 (pt) 2021-05-25
EP1558650A2 (en) 2005-08-03
EP2267027A3 (en) 2011-07-20
EP2267032A2 (en) 2010-12-29
EP1558645A2 (en) 2005-08-03
KR101103218B1 (ko) 2012-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9371381B2 (en) Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor-alpha and uses therefor
NO338986B1 (no) Enkeldomene antistoffer rettet mot tumor nekrose faktor-alfa og anvendelser derav
CA2505316C (en) Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
CA2608770C (en) Improved nanobodies against tumor necrosis factor-alpha
ES2551682T3 (es) Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
KR20070084069A (ko) Ｔｎｆｒ1에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 사용 방법
JP2013018785A (ja) 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
JP2006523090A (ja) リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
JP2022538089A (ja) 組成物
US20060034833A1 (en) Single domain antibodies directed against interferron-gamma and uses therefor
CN1735629B (zh) 针对肿瘤坏死因子-α的单结构域抗体及其用途
JP2008504356A6 (ja) 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
JP2008504356A (ja) 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
MX2007004113A (es) Antagonistas y metodos para usar los mismos.
KR20050024397A (ko) 리간드

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired