CN113508134A - 白蛋白结合抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了抗白蛋白构建体,所述抗白蛋白构建体各自包含抗白蛋白单结构域抗体(sdAb)部分。所述抗白蛋白构建体还可包含治疗剂,诸如抗原结合部分或细胞因子。本公开还提供了制备和使用所述抗白蛋白构建体的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月22日提交的美国临时申请第62/809,475号的优先权的权益,其公开内容以引用方式全文并入本文。
技术领域
本公开涉及包含抗白蛋白单结构域抗体(sdAb)部分的抗白蛋白构建体及其制备方法和用途。
序列表参考
本说明书与于2020年2月21日创建的字节大小为117,812的名称为216A003WO01_SEQLIST_ST25.txt的计算机可读形式(CRF)的序列表一起提交,其内容以引用方式全文并入本文。
背景技术
由于血清半衰期较短,许多治疗剂,特别是生物制品诸如肽、多肽和多核苷酸的应用具有局限性。由于血清半衰期较短,一些治疗剂无法达到期望功效。并且一些治疗剂必须以高频率和/或更高剂量施用,以便维持治疗效果所需的血清水平。频繁的全身施用这种治疗剂通常伴随不良副作用。例如,特别是静脉内施用治疗剂时,患者对频繁的全身注射表现出相当大的不适,与给药相关的感染风险高,并且可能需要住院或频繁去医院。此外,在长期治疗中,每日静脉注射可产生相当大的副作用,诸如组织瘢痕形成和由反复刺穿血管引起的血管病变。类似问题对于所有频繁的全身给药的治疗剂都是已知的,例如,向糖尿病患者施用胰岛素或向多发性硬化患者施用干扰素药物。所有这些因素都会导致患者依从性下降和医疗体系成本增加。因此,需要开发具有延长的血清半衰期的治疗剂。
发明内容
本公开提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白单结构域抗体(sdAb)部分,其中该sdAb部分包括:包含SEQ IDNO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
本公开还提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括:包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体。
本公开还提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
本公开还提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
本公开提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括CDR1、CDR2和CDR3,该CDR1、CDR2和CDR3分别包含重链可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列,该重链可变结构域具有SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项所示的序列。
本公开提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括CDR1、CDR2和CDR3,该CDR1、CDR2和CDR3分别包含重链可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列,该重链可变结构域具有SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中任一项所示的序列。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中的任一项具有至少约80%的序列同一性的变体。在某些实施方案中,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ IDNOs:1-9、45-53和105-115中的任一项具有至少约80%的序列同一性的变体。在某些实施方案中,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
本公开提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含第一多肽,该第一多肽包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一项的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NOs:11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一项的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一项的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一项的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ IDNOs:11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一项的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一项的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:(1)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(2)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(4)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(5)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(6)包含SEQID NO:25的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(7)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(8)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;或(9)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:(1)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(2)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(4)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(5)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(6)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(7)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(8)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;或(9)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体。
本公开提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽,该第一多肽包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
本公开提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含第一多肽,该第一多肽包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括CDR1、CDR2和CDR3,该CDR1、CDR2和CDR3分别包含重链可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列,该重链可变结构域具有SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项所示的序列。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ ID NOs:1-9和45-53中的任一项具有至少约80%的序列同一性的变体。在某些实施方案中,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
本公开提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括:包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据本文所述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据本文所述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:(1)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQID NO:117的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(2)包含SEQ IDNO:118的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(3)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(4)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(5)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(6)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(7)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;(8)包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;或(9)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据本文所述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:(1)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(2)包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(3)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(4)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(5)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(6)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(7)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;(8)包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体;或(9)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR2,以及包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体。
本公开提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
本公开提供了一种抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
本公开提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括CDR1、CDR2和CDR3,该CDR1、CDR2和CDR3分别包含重链可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列,该重链可变结构域具有SEQ ID NOs:99-101、103-115、149和150中任一项所示的序列。
本公开提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含第一多肽部分,该第一多肽部分包含与白蛋白结合的抗白蛋白sdAb部分,其中该sdAb部分包括CDR1、CDR2、CDR3,该CDR1、CDR2和CDR3分别包含重链可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列,该重链可变结构域具有SEQ ID NOs:105-115中任一项所示的序列。
在某些实施方案中,根据本文所述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQID NOs:99-101、103-115、149和150中的任一项具有至少约80%的序列同一性的变体。在某些实施方案中,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据本文所述构建体中的任一种构建体,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ ID NOs:105-115中的任一项具有至少约80%的序列同一性的变体。在某些实施方案中,该sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该白蛋白是人血清白蛋白(HSA)、恒河猴血清白蛋白(RhsA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)或鼠血清白蛋白(MuSA)。在某些实施方案中,该白蛋白是人血清白蛋白。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该构建体以约10-6M至约10-10M范围内的KD与白蛋白结合。在某些实施方案中,构建体以约10-6M至约10-8M范围内的KD与白蛋白结合。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该构建体在约7的pH下以约10-6M至约10-10M范围内的KD与白蛋白结合。在某些实施方案中,该构建体在约7的pH下以约10-6M至约10-8M范围内的KD与白蛋白结合。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该构建体在约5.5的pH下以约10-6M至约10-10M范围内的KD与白蛋白结合。在某些实施方案中,该构建体在约5.5的pH下以约10-6M至约10-8M范围内的KD与白蛋白结合。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,与白蛋白结合的该sdAb部分是骆驼科的、嵌合的、人的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该构建体还包含融合至第一多肽的第二多肽。在某些实施方案中,该第二多肽融合至该第一多肽的氨基末端(N末端)。在某些实施方案中,该第二多肽融合至该第一多肽的羧基末端(C末端)。在某些实施方案中,该第二多肽经由第一接头融合至该第一多肽。在某些实施方案中,该第一接头是可切割的。在某些实施方案中,该第一接头是不可切割的。在某些实施方案中,该构建体还包含融合至第一多肽和/或第二多肽的第三多肽。在某些实施方案中,该第三多肽经由第二接头融合至该第一多肽或该第二多肽。在某些实施方案中,该第二接头是可切割的。在某些实施方案中,该第二接头是不可切割的。在某些实施方案中,该第二多肽和/或该第三多肽包含抗原结合部分。在某些实施方案中,该抗原结合部分与肿瘤抗原结合。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自间皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR和CD20。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA和BCMA。在某些实施方案中,该第二多肽和/或该第三多肽包含细胞因子。在某些实施方案中,该细胞因子选自IL-21、IL-7、IL-15、与IL-15Rα或其片段结合的IL-15、IL-33和IL-22。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该构建体还包含信号肽。
在某些实施方案中,根据上述构建体中的任一种构建体,该构建体中的该第二多肽和/或该第三多肽的血清半衰期比在不存在该抗白蛋白sdAb部分的情况下的该第二多肽和/或该第三多肽长至少3倍。
本公开提供了一种包含上述构建体中的任一种构建体的药物组合物。
本公开提供了一种治疗个体中的疾病或病症的方法,其包括向个体施用有效量的上述构建体或组合物中的任一种构建体或组合物。在某些实施方案中,该个体是人。
附图说明
图1显示了在:(i)重组人IL-21(rhIL-21)(30ng/mL),(ii)小鼠IL-21-抗HSA构建体C1(SEQ ID NO:99)(60ng/mL),(iii)人IL-21抗HSA构建体C2(SEQ ID NO:100)(60ng/mL)或(iv)rhIL-15C5(SEQ ID NO:102)/hIL-15Rα-抗HSA构建体C6(SEQ ID NO:103)的组合(60ng/mL);以及在0.2ng/mL、2ng/mL、20ng/mL或200ng/mL的抗间皮素抗体B1存在时NK细胞针对N87细胞的ADCC活性,其中抗体B1包含SEQ ID NO:92的CDR1,SEQ ID NO:93的CDR2,以及SEQ ID NO:94的CDR3。
图2显示了在:(i)rhIL-21(30ng/mL),(ii)mIL-21-抗HSA构建体C1(60ng/mL),(iii)hIL-21-抗HSA构建体C2(60ng/mL)或(iv)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C6的组合(60ng/mL);以及0.2ng/mL、2ng/mL、20ng/mL或200ng/mL的抗间皮素抗体B1存在时NK细胞针对H226细胞的ADCC活性。
图3显示了在不同浓度的(i)重组人IL-15(rhIL-15),(ii)mIL-21-抗HSA构建体C1,(iii)hIL-21-抗HSA构建体C2,(iv)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C6的组合,或(v)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C7(SEQ ID NO:104)的组合;以及存在3ng/mL的抗间皮素抗体B1存在时NK细胞针对N87细胞的ADCC活性。
图4显示了在不同浓度的(i)rhIL-15(rhIL-15),(ii)mIL-21-抗HSA构建体C1,(iii)hIL-21-抗HSA构建体C2,(iv)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C6的组合,或(v)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C7(SEQ ID NO:104)的组合;以及存在20ng/mL的抗间皮素抗体B1存在时NK细胞针对H226细胞的ADCC活性。
图5显示了在MC38同系小鼠模型中在抗小鼠PD-1抗体存在或不存在时mIL-21-抗HSA构建体C1的抗肿瘤活性。
图6显示了hIL-21-抗HSA构建体C2在小鼠中的药代动力学曲线。
图7显示了hIL-21-抗HSA构建体C3(SEQ ID NO:149)和hIL-21-抗HSA构建体C4(SEQ ID NO:150)的药代动力学曲线。
具体实施方式
本公开涉及包含抗白蛋白sdAb的抗白蛋白构建体及其制备方法和用于治疗疾病或病症的用途。
因此,本公开的一个方面提供了一种包含抗白蛋白sdAb部分的抗白蛋白构建体。在某些实施方案中,该抗白蛋白构建体包含第二多肽。在某些实施方案中,该第二多肽包含治疗剂,诸如细胞因子或与肿瘤抗原结合的抗原结合部分。
还提供了组合物(诸如药物组合物)、试剂盒和制品,其各自包含本文所述的抗白蛋白构建体;及其制备方法和使用本文所述的抗白蛋白构建体治疗疾病或病症(诸如癌症)的方法。
此外,提供了组合物、试剂盒和制品,其各自包含本文所述的双特异性抗体;及其制备方法和用途。
I.定义
为了便于理解本文所阐述的公开内容,下面定义了多个术语。
通常,本文所用的命名法和本文所述的生物化学、生物学、分子生物学、细胞生物学、免疫学和药理学的实验室程序是本领域公知且常用的。除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语通常具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“抗白蛋白构建体”和“抗白蛋白蛋白质”在本文中可互换使用,例如,指与白蛋白特异性结合的多肽。
“分离的”抗体或构建体是从其(例如,天然的或重组的)生产环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体或构建体。优选地,分离的抗体或构建体不与来自其生产环境的基本上所有其他组分结合。分离的抗体或构建体的生产环境的污染组分,诸如由重组转染细胞产生的污染组分,为通常会干扰抗体或构建体的研究、诊断或治疗用途的物质,并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质物质。在优选的实施方案中,抗体或构建体被纯化至:(1)大于抗体或构建体的95重量%,在某些实施方案中,大于抗体或构建体的99重量%;(2)足以通过使用旋转杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度;或(3)使用考马斯蓝或银染色经非还原或还原条件下的SDS-PAGE确认达到均一。分离的抗体或构建体包括重组细胞内原位的抗体,因为抗体的天然环境的至少一种组分不存在。然而通常情况下,分离的抗体或构建体通过至少一个纯化步骤制备。
全长抗体包括两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常含有三个高度可变的环,称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR,包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3;重链(HC)CDR,包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以按照Kabat、Chothia或Al-Lazikani的惯例来定义或划分(Al-Lazikani 1997;Chothia 1985;Chothia1987;Chothia 1989;Kabat 1987;Kabat 1991)。重链或轻链的三个CDR插入侧翼延伸段(称为框架区(FR))之间,框架区比CDR更加高度保守,并形成支架以支撑超变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合,但表现出各种效应子功能。抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列被分类。抗体的五种主要类别或同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要抗体类别被分成亚类,诸如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用,指与抗体片段相对的基本上完整形式的抗体。具体地,全长4链抗体包括具有含Fc区的重链和轻链的抗体。全长重链抗体包括重链可变结构域(诸如VHH)和Fc区。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如,人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下,完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体最可变的部分(相对于相同类别的其他抗体)并且含有抗原结合位点。仅来自骆驼科物种的重链抗体具有单个重链可变区,称为“VHH”。因此VHH是特殊类型的VH。
如本文所用,术语“抗原结合片段”指抗体片段,包括例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包括一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包括完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合的相同抗原结合。在某些实施方案中,抗原结合片段包括来自特定的人抗体并嫁接到一个或多个不同的人抗体的框架区的一个或多个CDR。
术语“Fv”指含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密且非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域折叠后产生六个超变环(重链和轻链各3个环),为抗原结合贡献氨基酸残基并为抗体赋予抗原结合特异性。然而,即使是单可变结构域(或只包括特异于某抗原的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,但亲和力低于整个结合位点。
术语“单链Fv”、“sFv”或“scFv”指包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在某些实施方案中,scFv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头,使得scFv形成用于抗原结合的期望结构。参见Plückthun,The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第113卷,第269-315页(1994年)。
术语“重链抗体”或“HCAb”指包括重链但缺乏通常存在于4链抗体中的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。sdAb能够单独与抗原结合而不与对应的含CDR的多肽配对。在一些情况下,单结构域抗体改造自骆驼科HCAb,并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”(重链抗体的重链的可变结构域)。骆驼科sdAb是最小的已知抗原结合抗体片段之一。参见,例如Hamers-Casterman等人,Nature,第363卷:第446-448页(1993年);Greenberg等人,Nature,第374卷:第168-173页(1995年);Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond.),第8卷:第1013-1026页(2013年)。基本的VHH从N末端到C末端具有以下结构:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中FR1至FR4分别指框架区1至4,并且其中CDR1至CDR3分别指互补决定区1至3。
术语“超变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域的序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常,单结构域抗体包括三个HVR(或CDR):HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3(或CDR3)在三种HVR中最具多样性,并被认为在赋予抗体精细特异性中发挥独特作用。参见,例如Hamers-Casterman等人,Nature,第363卷:第446-448页(1993年);Sheriff等人,Nature Struct.Biol.,第3卷:第733-736页(1996年)。
术语“CDR”或“互补决定区”指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由以下期刊进行描述:Kabat等人,J.Biol.Chem.,第252卷:第6609-6616页(1977年);Kabat等人,美国卫生与公众服务部,“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991年);Chothia等人,J.Mol.Biol.,第196卷:第901-917页(1987年);Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,第273卷:第927-948页(1997年);MacCallum等人,J.Mol.Biol.,第262卷:第732-745页(1996年);Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,第45卷:第3832-3839页(2008年);Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,第27卷:第55-77页(2003年);以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,第309卷:第657-670页(2001年);其中定义包括当相互比较时重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的子集。不过,涉及抗体或其嫁接抗体或变体的CDR时,任一定义的应用均处于如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖上文引用的每一个参考文献所定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中以供对比。CDR预测算法和界面在本领域中是已知的,包括,例如,Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,第45卷:第3832-3839页(2008年);Ehrenmann等人,Nucleic Acids Res.,第38卷:第D301-D307页(2010年);Adolf-Bryfogle等人,Nucleic Acids Res.,第43卷:第D432-D438页(2015年)。
表1.CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人的命名法(见上文)
2残基编号遵循Chothia等人的命名法(见上文)
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法(见上文)
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法(见上文)
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名法(见上文)
表述“可变结构域残基编号参照Kabat”或“氨基酸位置编号参照Kabat”及其变型指采用Kabat等人(见上文)的编号系统中抗体编译重链可变结构域或轻链可变结构域。使用该编号系统,实际的线性氨基酸序列可包含更少或更多的氨基酸,对应于可变结构域FR或HVR的缩短或插入。例如,重链可变结构域可包括H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat系统的残基52a)和重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat系统的残基82a、82b和82c等)。通过对抗体序列与“标准”Kabat编号序列进行的同源区比对,可确定给定抗体的Kabat残基编号。
除非另有说明,本文中免疫球蛋白重链中残基的编号参照Kabat等人(见上文)的EU索引编号。“Kabat的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的CDR残基以外的可变结构域残基。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体,其各自含有最少的非人抗体来源的序列。就大部分而言,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体超变区(HVR)的残基被来自非人物种(供体抗体)超变区的残基置换,非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物,这些物种的超变区具有所需的抗体特异性和亲和力。在某些实施方案中,人免疫球蛋白的某些框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。在某些实施方案中,人源化抗体可包括受体抗体或供体抗体中不存在的残基。在某些实施方案中,人源化抗体包括基本上全部的至少一个(例如两个)可变结构域,其中每个可变结构域中的全部或基本上全部的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环,并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施方案中,人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,例如人免疫球蛋白Fc。参见Jones等人,Nature,第321卷:第522-525页(1986年);Riechmann等人,Nature,第332卷:第323-329页(1988年);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,第2卷:第593-596页(1992年)。
术语“氨基酸序列同一性百分比(%)”指候选抗体或构建体中与被比较的抗体或构建体中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。在某些实施方案中,使用序列比较计算机程序MUSCLE确定%氨基酸序列同一性值。Edgar,Nucleic Acids Res.,第32卷:第1792-1797页(2004年);Edgar,BMC Bioinformatics,第5卷:第113页(2004年)。
术语“恒定结构域”指免疫球蛋白分子的一部分,该部分相对于免疫球蛋白中含抗原结合位点的另一部分即可变结构域具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CL结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链基于其恒定区的氨基酸序列被指定为两种不同类型(κ和λ)之一。
人IgG Fc区的CH1结构域,也称为“H1”结构域的“C1”,通常从基于EU编号系统的约氨基酸118延伸至约氨基酸215。
术语“铰链区”指IgG中对应于基于EU编号系统的人IgG1的Glu216至Pro230的区域。Burton,Molec.Immunol.,第22卷:第161-206页(1985年)。
人IgG Fc区的CH2结构域,也称为“H2”结构域的“C2”,通常从基于EU编号系统的约氨基酸231延伸至约氨基酸340。
人IgG Fc区的CH3结构域,也称为“C3”或“H3”结构域,包括Fc区中C末端和CH2结构域之间的残基,即从基于EU编号系统的抗体序列的约氨基酸341至C末端,通常在IgG的氨基酸446或氨基酸447。
术语“Fc区”或“片段可结晶区”指免疫球蛋白重链的C末端区。人IgG重链Fc区通常从基于EU编号系统的Cys226或Pro230延伸至C末端。在某些实施方案中,Fc区的C末端赖氨酸被除去。适用于本文所述抗体或构建体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG3和IgG4的Fc区。
术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体的Fc区结合的受体。在某些实施方案中,FcR是人FcR。在某些实施方案中,FcR是天然人FcR。在某些实施方案中,FcR是与IgG抗体(例如γ受体)结合的FcR。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,第9卷:第457-492页(1991年);Capel等人,Immunomethods,第4卷:第25-34页(1994年);de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.,第126卷:第330-341页(1995年)。在某些实施方案中,FcR是FcγRI受体、FcγRIIA受体(“活化受体”)、FcγRIIB受体(“抑制受体”)、FcγRII受体或FcγRIII受体;或其等位基因变体或选择性剪接形式。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。参见Annu.Rev.Immunol.,第15卷:第203-234页(1997年)。
如本文所用,当第一抗体或其片段抑制与第一抗体或其片段等摩尔浓度的第二抗体或其片段的靶抗原结合至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%时,第一抗体或其片段与第二抗体或其片段“竞争”结合靶抗原,或反之亦然。基于抗体的交叉竞争对抗体进行“分箱”的高通量方法描述于WO 03/48731中。
如本文所用,术语“细胞因子”应理解为是指任何蛋白质或肽、其类似物或功能性片段,它们能够在哺乳动物中刺激或诱导针对预选细胞类型(例如,癌细胞或病毒感染的细胞)的杀细胞免疫应答。因此,预期可将多种细胞因子纳入本公开中。有用的细胞因子包括,例如,肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、淋巴因子(L)、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN),这些细胞因子包括能够刺激或诱导这种杀细胞免疫应答的它们的物种变体、截短类似物。有用的肿瘤坏死因子包括,例如,TNFα。有用的淋巴因子包括,例如,LT。有用的集落刺激因子包括,例如,GM-CSF和M-CSF。有用的白细胞介素包括,例如,IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL22和IL-33。有用的干扰素包括,例如,IFN-α、IFN-β和IFN-γ。术语“细胞因子”也应理解为包括野生型细胞因子的任何变体(诸如IL-21、IL-7和IL-15),其包括修饰并保持其任何期望功能的至少重要部分(诸如至少约50%)。
术语“受试者”指动物,包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用,例如,指哺乳动物受试者,诸如人。在一个实施方案中,受试者是人。
术语“治疗”指包括减轻或消除病状、疾病或病症,或与该病状、疾病或病症相关的一种或多种症状;或减轻或根除该病状、疾病或病症本身的病因。
术语“预防”指包括延迟和/或排除病状、疾病或病症和/或其伴随症状的发作的方法;阻止受试者获得病状、疾病或病症;或降低受试者患病状、疾病或病症的风险。
术语“减轻”指缓解或减少病状、疾病或病症的一种或多种症状(例如,疼痛)。该术语还可以指减少与活性成分有关的副作用。有时,受试者从预防剂或治疗剂中获得的有益效果无法治愈病状、疾病或病症。
术语“接触”指将治疗剂和细胞或组织放在一起,从而由于这种接触而发生生理和/或化学效应。接触可以在体外、离体或体内发生。在一个实施方案中,治疗剂与细胞培养物中的细胞接触(体外)以确定治疗剂对细胞的作用。在另一个实施方案中,治疗剂与细胞或组织的接触包括向具有待接触的细胞或组织的受试者施用治疗剂。
术语“治疗有效量”或“有效量”指包括施用的足以预防所治疗的病状、疾病或病症的一种或多种症状的发展或在一定程度上减轻所治疗的病状、疾病或病症的一种或多种症状的化合物的量。术语“治疗有效量”或“有效量”还指足以引起研究人员、兽医、医生或临床医生正寻求的生物分子(例如蛋白质、酶、RNA或DNA)、细胞、组织、系统、动物或人类的生物或医学反应的化合物的量。
术语“IC50”或“EC50”指在测量最大反应的试验中50%抑制该反应所需的化合物的量、浓度或剂量。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理上可接受的载体”或“生理上可接受的赋形剂”指药学上可接受的材料、组合物或溶媒,诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。在一个实施方案中,每种组分在与药物制剂的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”,并且适用于与受试者(例如人或动物)的组织或器官接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症,并且与合理的益处/风险比相称。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版;Allen编辑;Pharmaceutical Press:London,2012年;Handbook of PharmaceuticalExcipients,第8版;Sheskey等人编辑;Pharmaceutical Press:London,2017年;Handbookof Pharmaceutical Additives,第3版;Ash and Ash编辑;Synapse InformationResources,2007年;Pharmaceutical Preformulation and Formulation,第2版;Gibson编辑;Drugs and the Pharmaceutical Sciences 199;Informa Healthcare,New York,NY,2009年。
术语“约”或“近似”指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差,其部分取决于如何测量或确定该值。在某些实施方案中,术语“约”或“近似”指在1、2或3个标准偏差内。在某些实施方案中,术语“约”或“近似”指在给定值或范围的25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%内。
在癌症的上下文中,术语“治疗”包括以下任一项或全部:抑制癌细胞的生长,抑制癌细胞的复制,减轻总体肿瘤负荷,以及改善与疾病相关的一种或多种症状。
II.抗白蛋白构建体
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与白蛋白特异性结合的单结构域抗体(sdAb)部分。
在另一个实施方案中,提供了一种分离的抗白蛋白构建体,其包含与白蛋白特异性结合的sdAb部分。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体以约10-6M至约10-10M或约10-6M至约10-8M范围内的KD与白蛋白结合。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体以如下范围内的KD与白蛋白结合:约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-6M至约10-10M、约10-6M至约10-12M、约10-6M至约10-8M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-5M至约10- 11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、约10-5M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M或约10-6M至约10-8M。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约7的pH下以约10-6M至约10-10M或约10-6M至约10-8M范围内的KD与白蛋白结合。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约7的pH下以如下范围内的KD与白蛋白结合:约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-6M至约10-10M、约10-6M至约10-12M、约10-6M至约10-8M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10- 5M至约10-11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、约10-5M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M或约10-6M至约10-8M。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约5.5的pH下以约10-6M至约10-10M或约10-6M至约10-8M范围内的KD与白蛋白结合。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约5.5的pH下以如下范围内的KD与白蛋白结合:约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-6M至约10-10M、约10-6M至约10-12M、约10-6M至约10-8M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10- 5M至约10-11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、约10-5M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M或约10-6M至约10-8M。
本文提供的抗白蛋白构建体与白蛋白结合的KD可通过本领域已知的方法测定,包括但不限于ELISA、放射性配体结合测定(RIA)、表面等离子体共振(SPR)技术、亲和层析、荧光能量共振转移(FRET)和等温滴定量热法(ITC)。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体与白蛋白结合的Kon范围为:约102M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、约102M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约107M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约106M-1s-1或约104M-1s-1至约106M-1s-1。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体与白蛋白结合的Koff范围为:约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1或约10-3s-1至约10-5s-1。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约7的pH下与白蛋白结合的Kon范围为:约102M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、约102M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约107M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约106M-1s-1或约104M-1s-1至约106M-1s-1。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约7的pH下与白蛋白结合的Koff范围为:约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1或约10-3s-1至约10-5s-1。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约5.5的pH下与白蛋白结合的Kon范围为:约102M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、约102M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约107M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约106M-1s-1或约104M-1s-1至约106M-1s-1。
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体在约5.5的pH下与白蛋白结合的Koff范围为:约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1或约10-3s-1至约10-5s-1。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与本文所述的抗白蛋白sdAb构建体中任一种构建体竞争性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分。在某些实施方案中,使用ELISA测定来确定该竞争性结合。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包含SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包含SEQ IDNOs:1-9、45-53和105-115中任一项的氨基酸序列。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140的CDR3。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包含SEQ IDNOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQID NO:10、13、16、19、22、25、28、31或34的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32或35的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33或36的氨基酸序列的CDR3。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包含SEQ IDNOs:105-115中任一项的氨基酸序列。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白构建体,其包含与抗白蛋白sdAb构建体竞争性地特异性结合白蛋白的抗白蛋白sdAb部分,该抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQID NO:116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140的CDR3。
A.抗白蛋白单结构域抗体部分
sdAb与常规4链抗体的不同之处在于具有单个单体抗体可变结构域,诸如重链可变结构域(VHH),其可在没有轻链帮助的情况下显示对抗原的高亲和力。骆驼科VHH已知是具有近似15kDa分子量的最小功能性抗原结合片段。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一项的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NOs:11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一项的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一项的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一项的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NOs:11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一项的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一项的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31和34中任一项的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NOs:11、14、17、20、23、26、29、32和35中任一项的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33和36中任一项的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:11的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:23的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:29的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:32的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQID NO:35的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(诸如1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:122或127的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:123或128的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:122或127的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ IDNO:123或128的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:122或127的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ IDNO:123或128的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体;以及包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。在某些实施方案中,氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ IDNOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中的任一项具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的变体。
在另一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中的任一项具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9、45-53和105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ ID NOs:1-9和45-53中的任一项具有至少约80%(诸如至少为80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一项)的序列同一性的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在一个实施方案中,抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域或其变体,该抗白蛋白sdAb部分在CDR(诸如SEQ ID NOs:1-9和45-53中的任一项的CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3)中包含氨基酸取代。
在另一个实施方案中,抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域或其变体,该抗白蛋白sdAb部分包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的CDR1、CDR2和CDR3,并且在FR(诸如SEQ ID NOs:1-9和45-53中的任一项的FR1、和/或FR2、和/或FR3、和/或FR4)中包含氨基酸取代。
在又一个实施方案中,抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的结构域或其变体,该抗白蛋白sdAb部分在CDR和FR两者中都包含氨基酸取代。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的氨基酸序列的VHH结构域。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包含SEQ ID NOs:1-9和45-53中任一项的CDR1、CDR2和CDR3。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其与SEQ ID NOs:105-115中的任一项具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的变体。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域,或其在该VHH结构域中包含至多约3个(在一个实施方案中,1个、2个或3个)氨基酸取代的变体。
在一个实施方案中,抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域或其变体,该抗白蛋白sdAb部分在CDR(诸如SEQ ID NOs:105-115中的任一项的CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3)中包含氨基酸取代。
在另一个实施方案中,抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域或其变体,该抗白蛋白sdAb部分包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的CDR1、CDR2和CDR3,并且在FR(诸如SEQ ID NOs:105-115中的任一项的FR1、和/或FR2、和/或FR3、和/或FR4)中包含氨基酸取代。
在又一个实施方案中,抗白蛋白sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域或其变体,该抗白蛋白sdAb部分在CDR和FR两者中都包含氨基酸取代。
在又一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包括:包含SEQ ID NOs:105-115中任一项的氨基酸序列的VHH结构域。
在再一个实施方案中,提供了一种抗白蛋白sdAb部分,其包含SEQ ID NO:105-115中任一项的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方案中,抗白蛋白sdAb部分是骆驼科的、嵌合的、人的、部分人源化的或完全人源化的。
单结构域抗体
在一个实施方案中,本文所述的抗白蛋白构建体是抗白蛋白sdAb。
示例性sdAb包括但不限于来自重链抗体的重链可变结构域(例如骆驼科中的VHH(重链抗体的重链可变结构域)或软骨鱼中的VNAR(鲨鱼新抗原受体的可变结构域))、源自常规4链抗体、人源化重链抗体和由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体的单结构域(诸如VH或VL)。
在某些实施方案中,本文所述的sdAb源自小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔或牛。
在某些实施方案中,本文所述的sdAb源自天然存在的单结构域抗原结合分子,称为缺乏轻链的重链抗体,也称为重链抗体或“HCAb”。参见,例如WO 94/04678和Hamers-Casterman等人,Nature,第363卷:第446-448页(1993年)。为了清楚起见,源自天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH,以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分。在某些实施方案中,VHH源自在骆驼科物种,例如骆驼、美洲驼、骆马、单峰驼、羊驼或原驼中产生的抗体。
在某些实施方案中,本文所述的sdAb源自存在于软骨鱼中的免疫球蛋白的可变区。在某些实施方案中,本文所述的sdAb源自存在于鲨鱼血清中的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR(“IgNAR”)可变区的单结构域抗体的方法描述于WO 03/014161和Streltsov,Protein Sci.,第14卷:第2901-2909页(2005年)。
在某些实施方案中,本文所述的sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的或体外产生的(例如,通过噬菌体展示选择的)。在某些实施方案中,sdAb框架区的氨基酸序列通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”而改变。骆驼化是指用存在于重链抗体VHH结构域中相应位置的一个或多个氨基酸残基置换或取代来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。优选将这种“骆驼化”取代插入到形成和/或存在于VH-VL界面和/或本文定义的所谓骆驼科标志残基的氨基酸位置。参见例如WO 94/04678,Davies和Riechmann,FEBS Lett.,第339卷:第285-290页(1994年);Davies和Riechmann,Protein Engin.,第9卷:第531-537页(1996年);Riechmann,J.Mol.Biol.,第259卷:第957-969页(1996年);Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods,第231卷:第25-38页(1999年)。
在某些实施方案中,本文所述的sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。参见例如US 2009/0307787A1、US 2015/0289489A1、US 2010/0122358A1、US8,754,287和WO 2004/049794。在某些实施方案中,本文所述的sdAb具有成熟的亲和力。
在某些实施方案中,本文所述的包含针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH结构域的sdAb获自骆驼VHH序列的原初或免疫文库。参见例如WO 99/37681、WO 01/90190、WO03/025020和WO 03/035694。在某些实施方案中,使用源自原初或免疫VHH文库的改良的合成或半合成文库,例如,通过技术诸如随机诱变和/或CDR改组从原初或免疫VHH文库获得的VHH文库。参见例如WO 00/43507。
在某些实施方案中,本文所述的sdAb由常规4链抗体产生。参见例如EP 0 368684;WO 06/030220;WO 06/003388;Ward等人,Nature,第341卷:第544-546页(1989年);Holt等人,Trends Biotechnol.,第21卷:第484-490页(2003年)。
由于sdAb的独特性质,比起常规VH和VL、scFv和常规抗体片段(诸如Fab或(Fab')2),使用VHH结构域作为单一抗原结合蛋白或结构域(即作为较大蛋白、多肽或构建体的一部分)提供了许多更为显著的优点:1)仅需要单个结构域就能以高亲和力与抗原结合,不需要第二结构域,也不需要确保这两个结构域以正确的空间构象和构型存在(例如,在折叠期间不需要使重链和轻链配对,也不需要使用特别设计的接头,诸如用于scFv的接头);2)VHH结构域或sdAb可以由单个基因表达,不需要翻译后折叠或修饰;3)VHH结构域或sdAb可以容易地改造成多价和/或多特异性形式(诸如本文所述的抗白蛋白构建体);4)VHH结构域或sdAb具有高度可溶性,因此降低了其聚集的趋势(与例如,Ward等人,Nature,第341卷:第544-546页(1989)年中描述的源自小鼠的“dAb”相比);5)VHH结构域或sdAb对热、pH或蛋白酶高度稳定;6)VHH结构域或sdAb即使在大规模生产(诸如使用微生物发酵)时也容易且相对便宜,无需使用哺乳动物表达系统(如生产,例如常规抗体片段所需);7)与常规4链抗体及其抗原结合片段相比,VHH结构域或sdAb相对较小(近似15kDa或比常规IgG小10倍),因此具有高(较高)组织穿透能力,例如,对于实体瘤和致密组织;8)VHH结构域或sdAb可表现出所谓的“腔结合特性”(由于与常规VH结构域相比其延伸的CDR3环),并因此可接近常规4链抗体或其抗原结合片段不可接近的靶标或表位。例如,已表明VHH结构域或sdAb可以抑制酶。参见例如WO 1997/049805;Transue等人,Proteins,第32卷:第515-522页(1998年);Lauwereys等人,EMBO J.,第17卷:第3512-3520页(1998年)。
白蛋白
白蛋白(例如,人血清白蛋白或HSA)已经用于增加生物药物的血清半衰期。参见例如Dennis等人,J.Biol.Chem.,第277卷:第35035-35043页(2002年);Adams等人,MABS,第8卷:第1336-1346页(2016年)。例如,已经使用了HSA。HSA是血液中最丰富的蛋白质,广泛分布于组织中,具有非急性功能。HSA的半衰期为19天。因此,在一个实施方案中,本文所用的白蛋白(例如,HSA)用于增加药物(诸如本文所述的抗白蛋白构建体)的半衰期。
在某些实施方案中,该白蛋白选自HSA、恒河猴血清白蛋白(RhsA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)和鼠血清白蛋白(MuSA)。在某些实施方案中,该白蛋白是HSA。
HSA的一些同种型列于下表2中。参见,UniProtKB-P02768(ALBU_HUMAN)。在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体与SEQ ID NO:54、55、56或57结合。
表2.人丝氨酸白蛋白的同种型
在某些实施方案中,HSA与SEQ ID NO:54、55、56或57的氨基酸序列至少90%相同。在某些实施方案中,HSA与SEQ ID NO:54、55、56或57的氨基酸序列至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%相同。在某些实施方案中,HSA与SEQ ID NO:54、55、56或57相比具有不超过10个氨基酸的差异。在某些实施方案中,HSA与SEQ ID NO:54、55、56或57相比具有不超过5、4、3、2或1个氨基酸的差异。在某些实施方案中,HSA与SEQID NO:54、55、56或57的不同之处在于,例如,具有保守突变或非保守区中的突变,并具有与SEQ ID NO:54、55、56或57的HSA基本上相同的生物学功能。
在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白构建体与上述白蛋白中的任一种白蛋白结合。在某些实施方案中,该抗白蛋白构建体与SEQ ID NO:54、55、56或57的白蛋白结合。
嵌合或人源化抗体
在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白sdAb部分是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如,US 4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第81卷:第6851-6855页(1984年)。在一个实施方案中,嵌合抗体包含非人可变区(例如,源自骆驼科物种诸如美洲驼的可变区)和人恒定区。在另一个实施方案中,嵌合抗体是“类别转换”抗体,其中类别或亚类已经从其亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中,嵌合抗体是人源化抗体。通常,非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常,人源化抗体包含一个或多个可变结构域,其中HVR,例如CDR(或其部分)源自非人抗体,FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体还任选地包含人恒定区的至少一部分。在某些实施方案中,人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如,HVR残基所源自的抗体)的相应残基取代,例如,以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述见,例如,Almagro和Fransson,Front.Biosci.,第13卷:第1619-1633页(2008年)。可用于人源化的人框架区包括但不限于使用“最佳拟合”方法选择的框架区;源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区;人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区;以及源自筛选FR文库的框架区。
在某些实施方案中,修饰抗白蛋白sdAb,诸如人源化抗白蛋白sdAb,而不减少结构域对抗原的天然亲和力,同时降低该抗白蛋白sdAb对异源物种的免疫原性。例如,可以确定美洲驼抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基,并且例如框架区中的一个或多个骆驼科氨基酸被它们存在于人共有序列中的人对应物置换,而该多肽不丧失其典型特征,即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科单结构域抗体的人源化需要在单一多肽链中引入和诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成对比,该人源化需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸改变并保持这两条链的组装。
包含VHH结构域的sdAb可被人源化以具有人样序列。在某些实施方案中,本文所用VHH结构域的FR区包含至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的与人VH框架区的氨基酸序列同源性中的任一同源性。一类示例性的人源化VHH结构域的特征在于,根据Kabat编号,VHH在45位置携带选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的氨基酸(例如L45)并且在103位置携带色氨酸。因此,属于这一类的多肽显示与人VH框架区的高氨基酸序列同源性,并且所述多肽可直接施用至人而不期望由此产生不必要的免疫应答,并且没有进一步人源化的负担。
WO 03/035694中描述了另一类示例性的人源化骆驼科单结构域抗体,其含有通常存在于人源或来自其他物种的常规抗体中的疏水性FR2残基,但是通过在103位置上带电荷的精氨酸残基取代双链抗体VH中存在的保守色氨酸残基来补偿亲水性的丧失。因此,属于这两类的肽显示与人VH框架区的高氨基酸序列同源性,并且所述肽可直接施用至人而不期望由此产生的不必要的免疫应答,并且没有进一步人源化的负担。
人结构域抗体
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白sdAb部分是人抗体(称为人结构域抗体或人DAb)。人抗体可使用本领域已知的各种技术来生产。参见例如Chen,Mol.Immunol.,第47卷:第912-21页(2010年)。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如US 2009/0307787A1、US 8,754,287、US 2015/0289489A1、US2010/0122358A1和WO 2004/049794。
人抗体(例如,人DAb)可通过向转基因动物施用免疫原来制备,该转基因动物已经被修饰以产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体来响应抗原攻击。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座,其取代内源免疫球蛋白基因座,或其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,内源免疫球蛋白基因座通常被失活。从转基因动物获得人抗体的方法综述见Lonberg,Nat.Biotech.,第23卷:第1117-1125页(2005年)。可进一步修饰由此类动物产生的完整抗体的人可变区,例如,通过与不同的人恒定区组合。
人抗体(例如,人DAb)也可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系是本领域已知的。
人抗体(例如,人DAb)也可通过分离选自源自人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。从抗体文库选择人抗体的技术描述如下。
一种用于获得针对特定抗原或靶标的VHH序列的技术涉及适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即以便引起针对所述抗原或靶标的免疫应答和/或重链抗体),从含有(核酸序列编码的)所述VHH序列的所述转基因哺乳动物中获得合适的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B细胞样品),然后使用本身已知的任何合适的技术(诸如本文所述的任何方法或杂交瘤技术)从所述样品开始产生针对所述抗原或靶标的VHH序列。例如,为此,可使用表达重链抗体的小鼠和进一步的方法和技术,其描述于WO 02/085945、WO 04/049794、WO 06/008548和Janssens等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第103卷:第15130-15135页(2006年)。例如,此类表达重链抗体的小鼠可表达具有任何合适的(单)可变结构域的重链抗体,诸如来自天然来源的(单)可变结构域(例如,人(单)可变结构域、骆驼科(单)可变结构域或鲨鱼(单)可变结构域),以及例如合成的或半合成的(单)可变结构域。
源自文库的抗体
本公开的抗体可通过筛选具有所需活性的抗体的组合文库来分离。例如,本领域已知有多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选具有所需结合特征的抗体的此类文库。用于构建单结构域抗体文库的方法已有描述,例如,参见US 7,371,849。
在某些噬菌体展示方法中,通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以筛选抗原结合噬菌体,如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,第12卷:第433-455页(1994年)中所述。类似地,可通过PCR克隆VHH基因库,在噬菌体文库中随机重组,并筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示抗体片段(scFv片段或Fab片段)。免疫来源的文库提供了针对免疫原的高亲和性抗体,而无需构建杂交瘤。另选地,如Griffiths等人,EMBO J.,第12卷:第725-734页,1993年中所述,可(例如,从人身上)克隆原初文库以提供针对广泛的非自身抗原以及自身抗原的单一来源的抗体,而无需任何免疫。最后,也可通过从干细胞克隆未重排的V基因片段,并使用含有用于编码高度可变CDR3区并在体外完成重排的随机序列的PCR引物,来合成制备原初文库,如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,第227卷:第381-388页(1992年)中所述。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
生物活性
1.血清半衰期
在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白sdAb部分的生物活性通过其延长包含抗白蛋白sdAb部分的抗白蛋白构建体的血清半衰期的能力来确定。在某些实施方案中,当施用至个体时,抗白蛋白构建体的半衰期为至少约15天、约14天、约13天、约12天、约11天、约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1小时。抗白蛋白构建体可通过各种途径施用,例如,静脉内、口服、皮下或腹膜内施用。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体的血清半衰期比参考构建体的血清半衰期长(诸如至少长约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体的血清半衰期是参照构建体的血清半衰期的至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在某些实施方案中,参考构建体不具有抗白蛋白sdAb部分,但包含与抗白蛋白构建体相同的其他功能部分。
2.稳定性
在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白sdAb部分的生物活性可以通过其改善包含抗白蛋白sdAb部分的抗白蛋白构建体的稳定性的能力来确定。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体具有比参照构建体更高的稳定性。在某些实施方案中,参考构建体不具有抗白蛋白sdAb部分,但包含与抗白蛋白构建体相同的其他功能部分。
在某些实施方案中,该稳定性包括热稳定性。
在某些实施方案中,该稳定性通过抗白蛋白构建体在限定条件下储存后保持可接受程度的化学结构或生物学功能的程度来评估。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体在储存限定量的时间后,即使不维持其化学结构或生物学功能的100%,也具有高稳定性。在某些实施方案中,在储存限定量的时间后,能维持如本文所述的抗白蛋白构建体的结构或功能的约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%可被认为具有高稳定性。
稳定性尤其可通过确定在限定温度下储存限定量的时间后保留在制剂(液体或重构的)中的天然(非聚集或非降解)抗白蛋白构建体的百分比来测量。天然抗白蛋白构建体的百分比尤其可通过体积排阻色谱(例如,体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC))来确定,因而天然意味着非聚集和非降解。在某些实施方案中,在某一给定温度下储存限定量的时间后,在制剂中可检测到至少约90%(诸如,至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的天然形式的抗白蛋白构建体。在某些实施方案中,在室温(约25℃)下至少约6小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时、至少约26小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时或至少约48小时后,在制剂中可检测到至少约90%(诸如,至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的天然形式的抗白蛋白构建体。
稳定性尤其可通过确定在限定温度下储存限定量的时间后制剂(液体或重构的)中以聚集体形式形成的抗白蛋白构建体的百分比来确定,其中稳定性与形成的聚集体的百分比成反比。聚集的抗白蛋白构建体的百分比尤其可通过体积排阻色谱(例如,体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC))来确定。在某些实施方案中,在某一给定温度下储存限定量的时间后,制剂中存在少于约10%(优选少于约5%)的作为聚集体存在的抗白蛋白构建体。在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白构建体基本上没有聚集,例如,在某一给定温度下储存限定量的时间后,例如,在室温(约25℃)下储存至少约6小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时、至少约26小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时或至少约48小时后,在制剂中检测到至多约6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%的聚集体形式的抗白蛋白构建体。
测量抗白蛋白构建体与其靶标的结合亲和力也可用于评估稳定性。例如,如果在例如室温(约25℃)下储存限定量的时间(例如,6小时、12小时、24小时、36小时或48小时)后,抗原结合结构域具有的亲和力是所述储存之前抗体的结合亲和力的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高,则本公开的抗白蛋白构建体可被认为是稳定的。结合亲和力可通过任何方法确定,例如ELISA或等离子体共振。可直接测量抗白蛋白构建体与这种细胞的结合,例如通过FACS分析。
3.临床特性
在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白sdAb部分的生物活性通过其改善包含抗白蛋白sdAb部分的抗白蛋白构建体的临床特性的能力来确定。在某些实施方案中,相对于参照构建体,本文所述的抗白蛋白构建体具有改善的临床特性。在某些实施方案中,参考构建体不具有抗白蛋白sdAb部分,但包含与抗白蛋白构建体相同的其他功能部分。在某些实施方案中,与参考构建体相比,抗白蛋白构建体表现出改善的细胞毒性活性。在某些实施方案中,与参照构建体相比,抗白蛋白构建体表现出更高的抗肿瘤作用(诸如降低肿瘤负荷和/或改善存活)。
a)细胞毒性
本文所述的抗白蛋白构建体对细胞的细胞毒性(诸如ADCC活性)可用许多测定法来测试。例如,表达可被抗白蛋白构建体识别的抗原的癌细胞系和效应细胞(例如PBMC细胞)在96孔板中混合在一起。加入不同浓度的抗白蛋白构建体。温育后,可测定EC50(代表ADCC活性)。
在某些实施方案中,与参照构建体相比,抗白蛋白构建体表现出改善的针对细胞的ADCC活性。在某些实施方案中,细胞特异性抗白蛋白构建体的EC50不超过参照构建体的约50%、40%、30%、20%、10%或更低。在某些实施方案中,该细胞是肿瘤细胞。
b)治疗癌症
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体治疗个体中的癌症(例如,通过抑制肿瘤生长)。在某些实施方案中,与参照构建体相比,抗白蛋白构建体表现出增强的抗癌作用。例如,在某些实施方案中,与参照构建体相比,抗白蛋白构建体的施用使肿瘤负荷降低(诸如肿瘤体积降低至少约10%、20%、30%、40%或50%)。在某些实施方案中,该癌症是实体瘤。在某些实施方案中,该癌症是液体瘤。
B.各自包含抗白蛋白sdAb部分的构建体
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体包含第一多肽和第二多肽,该第一多肽包含抗白蛋白sdAb部分。
抗白蛋白融合蛋白
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体包含融合至包含抗白蛋白sdAb部分的第一多肽的第二多肽。
在某些实施方案中,该第二多肽包含抗原结合部分。在某些实施方案中,该抗原结合部分与肿瘤抗原结合。在某些实施方案中,肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中,肿瘤是液体瘤。在某些实施方案中,肿瘤是选自间皮瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、头颈癌、肝癌、食道癌、胃癌和结肠直肠癌的癌症。在某些实施方案中,该癌症表达高水平的肿瘤抗原。例如,在某些实施方案中,该癌症表达的水平是参照组织的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在某些实施方案中,该参照组织是在同一个体中不包含癌细胞的组织。
在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自间皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR和CD20。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA和BCMA。
在某些实施方案中,该肿瘤抗原是间皮素。在某些实施方案中,该抗原结合部分包括单链抗体,该单链抗体包含重链可变区(抗MSLN VH),其中该抗MSLN VH包含CDR1、CDR2和CDR3,其中:a)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:NO:94的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR中总共包含至多3个、2个或1个氨基酸取代的变体;或b)包含SEQ ID NO:95氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:96氨基酸序列的CDR2,以及包含GRY的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR中总共包含至多3个、2个或1个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,该抗原是免疫检查点蛋白。在某些实施方案中,该免疫检查点蛋白选自PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、CD27、4-1BB和B7H4。
在某些实施方案中,该抗原结合部分是抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段可与癌细胞上表达的多肽、多肽片段或抗原的表位免疫特异性结合。在一个实施方案中,该抗体与人癌抗原结合。在某些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段与癌抗原的胞外结构域(ECD)结合。在某些实施方案中,该抗体与癌抗原的ECD中的表位结合。在某些实施方案中,该癌抗原在实体瘤癌细胞上表达。
与本文提供的癌抗原结合的抗体可以是但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单链Fvs(scFv)(例如,包括单特异性和双特异性)、骆驼化抗体或其人源化变体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体和其表位结合片段。
在某些实施方案中,本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有与癌抗原(例如,实体瘤癌抗原)免疫特异性结合的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或亚类。在一个具体实施方案中,本文提供的抗体是IgG抗体,诸如IgG1抗体。
本公开还包括抗体的变体和衍生物,包括保留与癌抗原表位特异性结合的能力的抗体片段。示例性片段包括Fab片段;Fab';F(ab')2;双特异性Fab;包含可变区的单链Fab链(也称为sFv);二硫键连接的Fv或dsFv;骆驼化VH;双特异性sFv;双抗体;以及三抗体。抗体的衍生物还包括抗体结合位点的一个或多个CDR序列。当存在两个或更多个CDR序列时,CDR序列可在支架上连接在一起。在某些实施方案中,本文提供的抗体包括单链Fv(“scFv”)。已经开发了用于产生抗体片段的各种技术,如在上述部分中简要描述的。
在某些实施方案中,抗原结合部分是与肿瘤抗原结合的单可变结构域抗体(sdAb)(诸如VHH抗体)。某些类型的生物体(骆驼科动物和软骨鱼)具有高亲和力的单V样结构域,其作为它们免疫系统的一部分安装在Fc等价结构域结构上。Woolven等人,Immunogenetics,第50卷:第98-101页(1999年);Streltsov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第101卷:第12444-12449页(2004年)中所述。V样结构域(骆驼科动物中称为VHH,鲨鱼中称为V-NAR)通常显示长的表面环,从而允许穿透靶抗原的腔。它们还通过掩蔽疏水表面贴片来稳定分离的VH结构域。
在某些实施方案中,第二多肽包含细胞因子、生长因子或蛋白质激素。
在某些实施方案中,第二多肽包含细胞因子。在某些实施方案中,该细胞因子选自IL-21、IL-7、IL-15、与IL-15Rα或其片段结合的IL-15、IL-33和IL-22。在某些实施方案中,第二多肽包含IL-21。在某些实施方案中,该IL-21是人IL-21。在某些实施方案中,该IL-21包含SEQ ID NO:97或98的氨基酸序列,或其与SEQ ID NO:97或98具有至少80%(诸如至少约为80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一项)的同一性的变体。在某些实施方案中,该IL-21是在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的S124和S133之间缺少约1至约10个氨基酸的变体。
在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5、R9、K73或R76位置用分别除R、R、K和R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R9位置用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQID NO:97的氨基酸序列中的K73位置用除K之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R76位置用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。
在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5、R9、K73和/或R76位置各自独立地用分别除R、R、K和R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的两个、三个或四个取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQID NO:97的氨基酸序列中的R5位置和R9位置各自独立地用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置和K73位置各自独立地用分别除R和K之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置和R76位置各自独立地用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R9位置和K73位置各自独立地用分别除R和K之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R9位置和R76位置各自独立地用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包括在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的K73位置和R76位置各自独立地用分别除K和R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置、R9位置和K73位置各自独立地用分别除R、R和K之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置、R9位置和R76位置各自独立地用除R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置、K73位置和R76位置各自独立地用分别除R、K和R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQID NO:97的氨基酸序列中的R9位置、K73位置和R76位置各自独立地用分别除R、K和R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。在某些实施方案中,IL-21是突变蛋白,其包含在SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的R5位置、R9位置、K73位置和R76位置各自独立地用分别除R、R、K和R之外的二十种天然氨基酸中的一种氨基酸进行的取代。
在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中R5A、R5E、R5N、R9A、R9E、R9N、K73A、K73E、K73N、R76A、R76E或R76N的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中R5A、R5E或R5N的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中R9A、R9E或R9N的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中K73A、K73E或K73N的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中R76A、R76E或R76N的取代的突变蛋白。
在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中R5A、R5E、R9A、R9E、K73A、K73E、R76A或R76E的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ IDNO:97的氨基酸序列中R5A或R5E的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQID NO:97的氨基酸序列中R9A或R9E的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中K73A或K73E的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中R76A或R76E的取代的突变蛋白。
在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中(i)R5N和(ii)M7S或M7T的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中(i)R9N和(ii)R11S或R11T的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中(i)K73N和(ii)K75S或K75T的取代的突变蛋白。在某些实施方案中,IL-21是包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中(i)K76N和(ii)K78S或K78T的取代的突变蛋白。
在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NOs:97、98和151至167中任一项的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:151的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:158的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:162的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ IDNO:163的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQID NO:166的氨基酸序列。在某些实施方案中,IL-21具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
其他IL-21序列包括US 2019/0046611 A1中描述的那些序列,其公开内容全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中,IL-21是糖基化的。在另一个实施方案中,IL-21是N-糖基化的。
在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NXT或NXS的氨基酸序列的N-糖基化位点,其中各X独立地为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y。在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NXT或NXS的氨基酸序列的N-糖基化位点,其中各X独立地为H、K、L或M。
在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NHT、NHS、NKT、NKS、NLT、NLS、NMT或NMS的氨基酸序列的N-糖基化位点。在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NHT或NHS的氨基酸序列的N-糖基化位点。在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NKT或NKS的氨基酸序列的N-糖基化位点。在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NLT或NLS的氨基酸序列的N-糖基化位点。在某些实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NMT或NMS的氨基酸序列的N-糖基化位点。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NHT或NHS的氨基酸序列的N-糖基化位点,该N-糖基化位点起始于SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的5位置。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NMT或NMS的氨基酸序列的N-糖基化位点,该N-糖基化位点起始于SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的9位置。在又一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NLT或NLS的氨基酸序列的N-糖基化位点,该N-糖基化位点起始于SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的73位置。在又一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含具有NKT或NKS的氨基酸序列的N-糖基化位点,该N-糖基化位点起始于SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的76位置。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含氨基酸取代R5N,其中5位置的天冬酰胺是N-糖基化的。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含氨基酸取代R9N,其中9位置的天冬酰胺是N-糖基化的。在又一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含氨基酸取代K73N,其中73位置的天冬酰胺是N-糖基化的。在再一个实施方案中,N-糖基化IL-21包含氨基酸取代R76N,其中76位置的天冬酰胺是N-糖基化的。在某些实施方案中,N-糖基化IL-21具有SEQ IDNOs:160至167中任一项的氨基酸序列。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21具有一个聚糖。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21具有一个与天冬酰胺残基侧链中的氮原子相连的聚糖。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21具有两个聚糖。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21具有两个聚糖,其中至少一个聚糖与天冬酰胺残基侧链中的氮原子相连。在又一个实施方案中,N-糖基化IL-21具有两个聚糖,每个聚糖都与天冬酰胺残基侧链中的氮原子相连。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21具有三个聚糖。在一个实施方案中,聚糖是N-聚糖。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是寡甘露糖型。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是复合型。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是氢化物型。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是双触角复合型。在另一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是三触角复合型。在又一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是四触角复合型。
在一个实施方案中,N-糖基化IL-21上的N-聚糖是Szabo等人,J.Proteome.Res.,2018年,第17卷,第1559-1574页中描述的聚糖中的一种聚糖,其公开内容全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中,IL-21还包括一个或多个额外的取代、缺失和/或插入;和/或一个或多个额外的翻译后修饰。
在某些实施方案中,本文提供的融合蛋白具有对SEQ ID NO:167的人IL-21Rα的结合解离常数,范围为约1pM至约200nM、约10pM至约100nM、约20pM至约50nM或约50pM至约20nM。
在某些实施方案中,第二多肽融合至包含抗白蛋白sdAb部分的第一多肽的N末端。在某些实施方案中,第二多肽融合至第一多肽的C末端。在某些实施方案中,第二多肽融合至第一多肽的N末端和C末端。在某些实施方案中,第一多肽融合至第二多肽的N末端和C末端。
在某些实施方案中,第二多肽经由第一接头融合至第一多肽。在某些实施方案中,该第一接头是肽接头。在某些实施方案中,该第一接头是可切割的。在某些实施方案中,该第一接头是基质金属蛋白酶、豆荚蛋白、蛋白裂解酶或尿激酶敏感型接头。在某些实施方案中,该第一接头选自SEQ ID NOs:73-91。在某些实施方案中,该第一接头是不可切割的。在某些实施方案中,该第一接头选自GSG和SEQ ID NOs:58-72。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体包含a)包含抗白蛋白sdAb部分的第一多肽;b)第二多肽,其中该第二多肽融合至该第一多肽(“第二肽-ALBM”);以及c)融合至该第二肽-ALBM的第三多肽。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体包含a)包含抗白蛋白sdAb部分的第一多肽;b)包含细胞因子的第二多肽,其中该第二多肽融合至该第一多肽(“细胞因子-ALBM”);以及c)融合至该细胞因子-ALBM的第三多肽。在某些实施方案中,该细胞因子选自IL-21、IL-7、IL-15、与IL-15Rα或其片段结合的IL-15、IL-33和IL-22。在某些实施方案中,该第三多肽包含抗原结合部分。在某些实施方案中,该抗原是肿瘤抗原。在某些实施方案中,该抗原选自间皮素(“MSLN”)、GPA33、Her-2、EGFR和CD20。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA和BCMA。在某些实施方案中,该第三多肽包含第二细胞因子。在某些实施方案中,该第一细胞因子和该第二细胞因子各自独立地选自IL-7、IL-15、与IL-15Rα或其片段结合的IL-15、以及IL-21。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体包含a)包含抗白蛋白sdAb部分的第一多肽;b)包含抗原结合部分的第二多肽,其中该第二多肽融合至该第一多肽(“ABM-ALBM”);以及c)融合至该ABM-ALBM的第三多肽。在某些实施方案中,该抗原是肿瘤抗原。在某些实施方案中,该抗原选自间皮素(“MSLN”)、GPA33、Her-2、EGFR和CD20。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA和BCMA。在某些实施方案中,该第三多肽包含第二抗原结合部分。在某些实施方案中,该第二抗原是肿瘤抗原。在某些实施方案中,该第三多肽包括成像剂。在某些实施方案中,该第三多肽包括细胞因子。在某些实施方案中,该细胞因子选自IL-21、IL-7、IL-15、与IL-15Rα或其片段结合的IL-15、IL-33和IL-22。
在某些实施方案中,第二多肽融合至第一多肽的N末端。在某些实施方案中,第二多肽融合至第一多肽的C末端。在某些实施方案中,第二多肽融合至第一多肽的N末端和C末端。在某些实施方案中,第一多肽融合至第二多肽的N末端和C末端。在某些实施方案中,第二多肽经由如本文所述的第一接头融合至第一多肽。在某些实施方案中,第三多肽融合至第二肽-ALBM的N末端。在某些实施方案中,第三多肽融合至第二肽-ALBM的C末端。在某些实施方案中,第三多肽融合至第二肽-ALBM的N末端和C末端。在某些实施方案中,第二肽-ALBM融合至第三多肽的N末端和C末端。在某些实施方案中,第三多肽经由第二接头融合至第二肽-ALBM。在某些实施方案中,该第二接头是肽接头。在某些实施方案中,该第一接头是不可切割的,该第二接头是可切割的。在某些实施方案中,该第一接头和该第二接头都是不可切割的。在某些实施方案中,该第一接头和该第二接头都是可切割的。在某些实施方案中,该第一接头和/或该第二接头是基质金属蛋白酶、豆荚蛋白、蛋白裂解酶或尿激酶敏感型接头。在某些实施方案中,该第一接头和/或该第二接头各自独立地选自SEQ ID NOs:73-91。在某些实施方案中,该第一接头和/或该第二接头各自独立地选自SEQ ID NOs:58-72。在某些实施方案中,该第一接头和/或该第二接头各自独立地选自SEQ ID NOs:58-91。
在某些实施方案中,构建体还包含信号肽。
在一个实施方案中,本文提供了一种融合蛋白,该融合蛋白包含白细胞介素-21结构域、VHH单结构域抗体结构域和任选的肽接头;其中该白细胞介素-21结构域的C末端直接或经由该肽接头连接至该VHH单结构域抗体结构域的N末端。
在另一个实施方案中,本文提供了一种融合蛋白,该融合蛋白包含白细胞介素-21结构域,其具有SEQ ID NOs:97、98和151至168中任一项的氨基酸序列;VHH单结构域抗体结构域,其具有SEQ ID NOs:1至9、45至53和105至115中的氨基酸序列;以及任选的肽接头,其具有GSG或SEQ ID NOs:58至73中的氨基酸序列;其中该白细胞介素-21结构域的C末端直接或经由该肽接头连接至该VHH单结构域抗体结构域的N末端。
接头
上述抗白蛋白构建体可包含一个或多个接头(诸如上述的第一接头和第二接头)。
在某些实施方案中,第一接头和/或第二接头是肽接头。用于抗白蛋白构建体的肽接头的长度、柔性程度和/或其他特性可对以下特性具有一些影响,这些特性包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。例如,可选择较长的肽接头以确保两个相邻的结构域不会在空间上彼此干扰。在一些实施方案中,肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸),使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如,甘氨酸-丝氨酸双联体可为合适的肽接头。
肽接头可具有任何合适的长度。在某些实施方案中,肽接头的长度是至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多氨基酸中的任一项。在某些实施方案中,肽接头的长度不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少氨基酸中的任一项。在某些实施方案中,肽接头的长度是约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长度、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一项。
在某些实施方案中,第一接头的长度是约一至四十(诸如一至三十五、一至三十、一至二十五、一至二十、四至二十或四至十六)个氨基酸。
在某些实施方案中,第一接头和/或第二接头是非肽接头。
其他接头考虑因素包括对所得化合物的物理或药代动力学特性的影响,诸如可溶性、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少稳定以及有计划的降解)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合的调节、掺入胶束或脂质体的能力等。
1.肽接头
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如,源自重链抗体的铰链区的序列可用作接头。参见例如WO 1996/34103。
肽接头可具有任何合适的长度。在某些实施方案中,肽接头的长度是至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多氨基酸中的任一项。在某些实施方案中,肽接头的长度不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少氨基酸中的任一项。在某些实施方案中,肽接头的长度是约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长度、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一项。
这种肽接头的基本技术特征是所述肽接头不具有任何聚合活性。肽接头的特征,包括不促进二级结构,是本领域已知的,并且描述于例如Dall'Acqua等人,Biochem.,第37卷:第9266-9273页(1998年);Cheadle等人,Mol.Immunol.,第29卷:第21-30页(1992年);Raag和Whitlow,FASEB,第9卷:第73-80页(1995年)。就“肽接头”而言,特别优选的氨基酸是Gly。此外,也不促进任何二级结构的肽接头是优选的。结构域彼此之间的连接可通过例如基因工程提供。用于制备融合的和可操作地连接的融合蛋白组分并在哺乳动物细胞或细菌中表达这些组分的方法是本领域公知的。参见例如WO 99/54440;Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates和WileyInterscience,N.Y.,1989年和1994年或Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001年。
肽接头可以是稳定的接头,其不可被蛋白酶,特别是基质金属蛋白酶(MMP)切割。在某些实施方案中,接头选自GSG和SEQ ID NOs:58-72。
在某些实施方案中,接头是可切割的。在某些实施方案中,接头是基质金属蛋白酶、豆荚蛋白、蛋白裂解酶或尿激酶敏感型接头。在某些实施方案中,接头选自SEQ ID NOs:73-91。
接头也可为柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括,例如,(GS)n、(GSGS)n(SEQ ID NO:65)、(GGSG)n(SEQ ID NO:66)、(GGGGS)n(SEQID NO:60),其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的,因此能够用作组分之间的中性系链。甘氨酸比丙氨酸进入明显更多的phi-psi空间,并且比具有较长侧链的残基限制性小得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.,第11卷:第173-142页(1992年))。普通技术人员将认识到,抗体融合蛋白的设计可包括全部或部分柔性的接头,使得接头可包括柔性接头部分以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分,以提供期望的抗体融合蛋白结构。
2.非肽接头
上述组分的偶联可通过将结合两种分子的任何化学反应来实现,只要这两种组分都保留它们各自的活性,即分别与细胞因子受体、白蛋白或靶抗原结合。这种连接可包括多种化学机制,例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。在某些实施方案中,结合是共价结合。共价结合可通过直接缩合现有侧链或通过掺入外部桥联分子来实现。在这种情况下,许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白质分子。例如,代表性的偶联剂可包括有机化合物,诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和己二胺。该列举不是为了穷举本领域已知的各种偶联剂,而是更常见的偶联剂的示例。参见例如Killen和Lindstrom,J.Immunol.,第133卷:第2549-2553页(1984年);Jansen等人,Immunol.Rev.,第62卷:第185-216页(1982年);Vitetta等人,Science,第238卷:第1098-1104页(1987年)。
可用于本公开的接头描述于文献中(参见例如Ramakrishnan等人,Cancer Res.,第44卷:第201-208页(1984年)),描述了MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。在某些实施方案中,本文使用的非肽接头包括:(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐);(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.,目录号21558G);(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.,目录号21651G);(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.,目录号2165-G);以及(v)与EDC缀合的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺(Pierce Chem.Co.,目录号24510)。
上述接头含有的组分具有不同属性,因此可能导致融合蛋白具有不同的物理化学特性。例如,烷基羧酸的磺基-NHS酯比芳族羧酸的磺基-NHS酯更稳定。含有NHS-酯的接头比磺基-NHS酯的溶解度低。此外,接头SMPT含有空间位阻二硫键,并且可形成具有增加的稳定性的抗体融合蛋白。二硫键通常比其他键更不稳定,因为二硫键在体外被切割,导致可用的抗体融合蛋白更少。磺基-NHS尤其可增强碳二亚胺偶联物的稳定性。当碳二亚胺偶联物(诸如EDC)与磺基-NHS联合使用时,形成比单独的碳二亚胺偶联反应更抗水解的酯。
C.抗白蛋白构建体变体
在某些实施方案中,考虑了本文提供的抗白蛋白构建体的氨基酸序列变体。例如,可能期望在抗白蛋白构建体的全部或任何组分中改善抗白蛋白构建体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过向编码抗白蛋白构建体的核酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成制备抗白蛋白构建体的氨基酸序列变体。此类修饰包括,例如,在抗白蛋白构建体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体,前提条件是最终构建体具有期望的特征。
1.取代、插入、缺失和变体
在某些实施方案中,提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗白蛋白构建体变体。取代诱变的目的位点包括白蛋白结合分子和/或抗原结合部分的HVR和FR。保守取代示于表3。在“示例性取代”的标题下提供了更实质性的改变,并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可将氨基酸取代引入到抗白蛋白构建体的组分中,并筛选具有所需活性的产物,该所需活性例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表3.氨基酸取代
原始残基 | 示例性取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val、Leu、Ile | Val |
Arg(R) | Lys、Gln、Asn | Lys |
Asn(N) | Gln、His、Asp、Lys、Arg | Gln |
Asp(D) | Glu、Asn | Glu |
Cys(C) | Ser、Ala | Ser |
Gln(Q) | Asn、Glu | Asn |
Glu(E) | Asp、Gln | Asp |
Gly(G) | Ala | Ala |
His(H) | Asn、Gln、Lys、Arg | Arg |
Ile(I) | Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 | Leu |
Leu(L) | 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe | Ile |
Lys(K) | Arg、Gln、Asn | Arg |
Met(M) | Leu、Phe、Ile | Leu |
Phe(F) | Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val、Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr、Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp、Phe、Thr、Ser | Phe |
Val(V) | Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸 | Leu |
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组:
(1)疏水:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu和Ile;
(2)中性亲水:Cys、Ser、Thr、Asn和Gln;
(3)酸性:Asp和Glu;
(4)碱性:His,Lys和Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly和Pro;以及
(6)芳族:Trp、Tyr和Phe。
非保守取代将需要使这些分类之一的成员交换为另一个类别的成员。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如,人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常,选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如,增加的亲和力和/或降低的免疫原性)具有修饰(例如,改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文所述的那些技术)方便地产生。简言之,使一个或多个HVR残基突变,将变体抗体展示在噬菌体上,并筛选特定的生物学活性(例如,结合亲和力)。
改变(例如,取代)可在HVR中进行,例如以改善抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点”中进行,即在由在体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基中进行(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.,第207卷:第179-196页(2008年),和/或SDR(a-CDR),并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并从二级文库中重新选择进行的亲和力成熟已经描述于,例如,Hoogenboom等人,Methods Mol.Biol.,第178卷:第1-37页(2001年)中所述。在亲和力成熟的某些实施方案中,通过多种方法(例如,易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建次级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法,其中几个HVR残基(例如,一次4-6个残基)是随机的。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定参与抗原结合的HVR残基。CDR-H3和CDR-L3尤其经常被靶向。
在某些实施方案中,取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内,只要这种改变基本上不会降低抗体结合抗原的能力。例如,可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如,本文提供的保守取代)。这种改变可以在HVR“热点”或CDR之外。
一种用于鉴定可被靶向用于诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”,如在Cunningham和Wells,Science,第244卷:第1081-1085页(1989年)中所述。在该方法中,鉴定一个残基或一组靶残基(例如,带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如,丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入进一步的取代,表明对初始取代的功能敏感性。另选地或附加地,抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。这种接触残基和相邻残基可以作为取代的候选物而被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为从一个残基到含有一百或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如,用于ADEPT)或多肽的融合。
2.衍生物
在某些实施方案中,本文提供的抗白蛋白构建体可进一步修饰以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适于抗白蛋白构建体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于,聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性,在制造上可能具有优势。聚合物可具有任何分子量,并且可为支链的或非支链的。与抗白蛋白构建体相连的聚合物的数目可以变化,并且如果连接了多于一种聚合物,则它们可以是相同或不同的分子。通常,用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于考虑因素来确定,包括但不限于待改善的抗白蛋白构建体的特定特性或功能,抗白蛋白构建体衍生物是否将用于在限定条件下的治疗。
在某些实施方案中,提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗白蛋白构建体和非蛋白质部分的缀合物。在某些实施方案中,非蛋白质部分是碳纳米管。Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第102卷:第11600-11605页(2005年)中所述。辐射可具有任何波长,并且包括但不限于不伤害普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀死接近抗白蛋白构建体非蛋白质部分的细胞的温度的波长。
III.药物组合物
本公开还提供了包含本文所述的任一种抗白蛋白构建体和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可通过将本文所述的具有所需纯度的抗白蛋白构建体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编辑(1980年))混合以冻干制剂或水溶液的形式来制备。
药物组合物优选是稳定的,其中本文所述的抗白蛋白构建体在储存时基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的,并且综述见Peptide and Protein Drug Delivery,第247-301页,Lee编辑,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.出版社,1991年,和Jones,Adv.Drug Delivery Rev.,第10卷:第29-90页(1993年)。可在选定温度下在选定时间段内测量稳定性。为了快速筛选,制剂可在40℃下保持2周至1个月,此时测量稳定性。当制剂要在2-8℃下储存时,通常制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月,并且/或者在2-8℃下稳定至少2年。当制剂要在30℃下储存时,通常制剂应在30℃下稳定至少2年,并且/或者在40℃下稳定至少6个月。例如,在储存期间的聚集程度可以用作蛋白质稳定性的指标。在某些实施方案中,本文所述的抗白蛋白构建体的稳定制剂可包含少于约10%(优选少于约5%)的作为聚集体存在于制剂中的抗白蛋白构建体。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的,并且包括缓冲剂;抗氧化剂,其包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠;防腐剂;等渗剂(例如,氯化钠);稳定剂;金属络合物(例如,Zn-蛋白络合物);螯合剂,诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
生理上可接受的载体的示例包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,其包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵;苯扎氯铵或苄索氯铵;苯酚、丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子,诸如钠;金属络合物(例如,Zn-蛋白质络合物);和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
缓冲剂用于将pH控制在优化治疗效果的范围内,尤其是在稳定性取决于pH的情况下。缓冲液优选地以约50mM至约250mM范围内的浓度存在。适用于本公开的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐,例如柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐和乙酸盐。另外,缓冲液可包含组氨酸和三甲胺盐诸如Tris。
加入防腐剂以延缓微生物生长,并且这些防腐剂通常以0.2%-1.0%(w/v)的范围存在。防腐剂的添加可例如促进多用途(多剂量)制剂的生产。适用于本公开的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵;卤化(例如,氯化、溴化、碘化)苄烷铵、苄索氯铵;硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在有时称为“稳定剂”的张力剂以调节或维持组合物中液体的张力。当张力剂与大型带电生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时,它们通常称为“稳定剂”,因为它们可与氨基酸侧链的带电基团相互作用,从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量,张力剂可以0.1重量%至25重量%,优选1重量%至5重量%之间的任何量存在。优选的张力剂包括多元糖醇,优选三元或更多元糖醇,诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的赋形剂包括可用作以下一种或多种的药剂:(1)填充剂、(2)增溶剂、(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附到容器壁上的药剂。此类赋形剂包括:多元糖醇(如上文所列举);氨基酸,诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸;有机糖或糖醇,诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如肌醇)和聚乙二醇;含硫还原剂,诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠;低分子量蛋白质,诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;单糖(例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖);二糖(例如乳糖、麦芽糖和蔗糖);三糖,诸如棉子糖;以及多糖,诸如糊精或葡聚糖。
存在非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白免受搅动诱导的聚集,其还允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗性蛋白或抗体变性。非离子表面活性剂以约0.05mg/mL至约1mg/mL,优选约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存在。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65或80)、泊洛沙姆(184或188)、多元醇、聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(-20或-80)、聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50或60、甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子去污剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将药物组合物用于体内给药,这些药物组合物必须为无菌的。可通过无菌滤膜过滤使药物组合物无菌。本文的药物组合物通常置于具有无菌入口的容器,例如静脉注射溶液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶中。
给药途径是根据已知且公认的方法,诸如通过在较长时间内以合适的方式单次或多次推注或输注,例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注,局部施用或通过持续释放或延时释放手段吸入。在某些实施方案中,药物组合物在局部诸如肿瘤内或玻璃体内施用。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适示例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质,这些基质呈成形物品,例如薄膜或微胶囊形式。缓释基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如,聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本文的药物组合物还可含有多于一种治疗特定适应症所必需的活性化合物,优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的活性化合物。另选地或附加地,组合物可包括细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。
活性成分还可包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中,包封于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液或纳米颗粒和纳米胶囊)中或包封于粗乳液中。这些技术公开于“Remington's Pharmaceutical Sciences”第18版中。
本文公开的抗白蛋白构建体可配制为免疫脂质体。含有抗白蛋白构建体的脂质体通过本领域已知的方法制备,这些方法描述于诸如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第82卷:第3688-3692页(1985年);Hwang等人,Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.,第77卷:第4030-4034页(1980年);US 4,485,045和US 4,544,545。具有延长的循环时间的脂质体公开于US 5,013,556中。
特别有用的脂质体可用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法来产生。将脂质体通过限定孔径的过滤器挤出以得到具有期望直径的脂质体。
在某些实施方案中,药物组合物容纳在单次使用的小瓶中,诸如单次使用的密封小瓶中。在某些实施方案中,药物组合物容纳在多次使用的小瓶中。在某些实施方案中,药物组合物散装容纳在容器中。在某些实施方案中,药物组合物是冷冻保存的。
IV.治疗方法
本公开的一个方面提供了使用本文所述的抗白蛋白构建体或药物组合物治疗个体中的疾病或病症的方法。
在某些实施方案中,提供了一种治疗个体中的疾病或病症的方法,其包括向个体施用有效量的如本文所述的构建体或药物组合物。在某些实施方案中,提供了一种治疗个体中的疾病或病症的方法,其包括向个体施用有效量的抗白蛋白构建体,该抗白蛋白构建体包含第一多肽和第二多肽,该第一多肽包含抗白蛋白sdAb部分,其中该第二多肽包含治疗剂。在某些实施方案中,治疗剂包含抗原结合部分(诸如与肿瘤抗原结合的抗体或其片段)。在某些实施方案中,该抗原是肿瘤抗原。在某些实施方案中,肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中,肿瘤是液体瘤。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自间皮素(“MSLN”)、GPA33、Her-2、EGFR、CD20、CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA和BCMA。在某些实施方案中,药剂是免疫检查点蛋白。在某些实施方案中,治疗剂包括细胞因子。在某些实施方案中,该细胞因子选自IL-21、IL-7、IL-15、与IL-15Rα或其片段结合的IL-15、IL-33和IL-22。
疾病或病症
本文所述的方法可用于治疗疾病或病症。在某些实施方案中,该疾病或病症是癌症、炎性病症或感染。
在某些实施方案中,该疾病或病症是炎性疾病。在某些实施方案中,该疾病选自溃疡性结肠炎、克罗恩病,或溃疡性回肠炎,和肠移植物抗宿主病。
在某些实施方案中,该疾病或病症是癌症。在某些实施方案中,该癌症是实体瘤。在某些实施方案中,该癌症是液体瘤。在某些实施方案中,该癌症选自间皮瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、白血病(诸如急性骨髓性白血病)、头颈癌、肝癌、肾癌、肾脏癌、食道癌、胃癌和结肠直肠癌。在某些实施方案中,该癌症选自间皮瘤、肺癌、卵巢癌和胃癌。
联合疗法
在某些实施方案中,方法还包括施用第二药剂。在某些实施方案中,该第二药剂包括治疗性抗体、免疫检查点抑制剂、第二细胞因子、化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂或免疫细胞。
在某些实施方案中,该第二药剂是治疗性抗体。在某些实施方案中,该治疗性抗体与肿瘤抗原结合。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自间皮素、GPA33、Her-2、EGFR和CD20。在某些实施方案中,该肿瘤抗原选自CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA和BCMA。
在某些实施方案中,该肿瘤抗原是间皮素。在某些实施方案中,该第二药剂是抗间皮素抗体或其片段。在某些实施方案中,该抗间皮素抗体或其片段包含单链抗体,该单链抗体包含抗间皮素重链可变区(抗MSLN VH),其中该抗MSLN VH包括CDR1、CDR2和CDR3,其中:a)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3,或在CDR中总共包含至多3个、2个或1个氨基酸取代的变体;或b)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR2和包含GRY的氨基酸序列的CDR3,或其在CDR中总共包含至多3个、2个或1个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中,该第二药剂是免疫检查点调节剂。在某些实施方案中,该免疫检查点调节剂是选自PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、白蛋白、GITR、TIM3、LAG3、CD27和B7H4的免疫检查点蛋白的抑制剂。
在某些实施方案中,该免疫检查点蛋白是PD-1。在某些实施方案中,该第二药剂是抗PD-1抗体或其片段。
在某些实施方案中,该第二药剂是第二细胞因子。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体中的细胞因子是IL-21,并且其中第二细胞因子选自IL-7、IL-15和与IL-15Rα或其半衰期延长的变体结合的IL-15。
在某些实施方案中,该第二药剂是免疫细胞。在某些实施方案中,该免疫细胞包括T细胞或NK细胞。在某些实施方案中,该免疫细胞包括表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞、表达修饰的T细胞受体(TCR)的T细胞或从肿瘤中分离的T细胞。
在某些实施方案中,该第二药剂是酪氨酸激酶抑制剂。
在某些实施方案中,该第二药剂是化学治疗剂(诸如索拉非尼)。
给药方案
抗白蛋白构建体和/或第二药剂可使用任何合适的剂量和施用途径施用给个体。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体和/或第二药剂经胃肠外施用给个体。给药途径是根据已知且公认的方法,诸如通过在一段时间内以合适的方式单次或多次推注或输注,例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内、关节内、肿瘤内或口腔途径注射或输注。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体和第二药剂同时、并行或依次施用至个体。
确定合适的剂量或给药途径是本领域普通技术人员熟知的。动物实验为确定用于人类诊断应用的有效剂量提供了可靠的指导。有效剂量的种间比例缩放可按照在Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人编辑,Pergamon Press,NewYork,1989年,第42-46页中的Mordenti和Chappell制定的“The Use of InterspeciesScaling in Toxicokinetics”原则进行。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体以约每三周一次至约每周两次(诸如约每三周一次至约每两周一次、约每两周一次至约每周一次或约每周一次至约每周两次)的频率施用。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体以不少于约每三周一次、约每两周一次、约每周一次或约每周两次的频率施用。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体以不多于约每三周一次、约每两周一次、约每周一次或约每周两次的频率施用。在某些实施方案中,抗白蛋白构建体以约每三周一次、约每两周一次、约每周一次或约每周两次的频率施用。
在某些实施方案中,每个治疗周期施用抗白蛋白构建体至少约一周至六个月(诸如一周至两周、三周或四周,一周至一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月,一个月至两个月、三个月、四个月、五个月或六个月,三个月至四个月、五个月或六个月)。
在某些实施方案中,抗白蛋白构建体每次施用的量为约100ng/kg至约10mg/kg(例如约100ng/kg至约500ng/kg、约500ng/kg至约1μg/kg、约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约500μg/kg、约500μg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg或约5mg/kg至约10mg/kg)。
在某些实施方案中,第二药剂(诸如与间皮素结合的治疗性抗体或PD-1的抑制剂)以约每月一次至约每周两次(诸如约每月一次至每月两次、每月三次或每月四次,约每两周一次,约每三周一次,约每周一次或每周两次)的频率施用。
在某些实施方案中,第二药剂(诸如与间皮素结合的治疗性抗体或PD-1的抑制剂)每次施用的量为约100ng/kg至约100mg/kg(例如约100ng/kg至约500ng/kg、约500ng/kg至约1μg/kg、约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约500μg/kg、约500μg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg或约50mg/kg至约100mg/kg)。
VI.制备方法
本文所述的抗白蛋白构建体可使用本领域已知的或如本文所述的任何方法来制备。参见例如实施例1-5。在某些实施方案中,提供了一种生产抗白蛋白构建体的方法,该方法包括:(a)在有效表达编码的抗白蛋白构建体的条件下培养包含编码本文所述的抗白蛋白构建体的分离的核酸或载体的宿主细胞;以及(b)从所述宿主细胞中获得表达的抗白蛋白构建体。在某些实施方案中,步骤(a)的方法还包括生产包含编码本文所述的抗白蛋白构建体的分离的核酸或载体的宿主细胞。
已经描述了制备sdAb的方法。参见例如Els Pardon等人,Nat.Protoc.,第9卷:第674-693页(2014年)。sdAb(诸如VHH)可使用本领域已知的方法来获得,诸如通过免疫骆驼科物种(诸如骆驼或美洲驼)并从中获得杂交瘤,或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆单结构域抗体文库并随后通过使用未选择文库的单个克隆的ELISA或通过使用噬菌体展示进行选择。
为了重组生产sdAb,分离编码单结构域抗体的核酸并将其插入可复制载体中以进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单结构域抗体的DNA易于使用常规方法(例如,通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离和测序。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于所用的宿主细胞。通常,优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)来源的。在某些实施方案中,编码本文所述的抗白蛋白构建体的分离的核酸包含编码SEQ ID NOs:1-9、45-53、99-101、103-115、149和150中任一项的核酸序列。
1.原核细胞中的重组生产
a)载体构建
编码本公开的抗体的多核苷酸序列可使用标准重组技术来获得。所需的多核酸序列可从抗体产生细胞(诸如杂交瘤细胞)中分离并测序。另选地,多核苷酸可使用核苷酸合成仪或PCR技术来合成。一旦获得编码多肽的序列,就将其插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可获得的且已知的许多载体可用于本公开的目的。合适载体的选择主要取决于要插入载体中的核酸和要用载体转化的特定宿主细胞的大小。每种载体含有多种组分,这取决于载体的功能(异源多核苷酸的扩增和/或表达)及载体与其所在的特定宿主细胞的相容性。载体组分通常包括但不限于复制起点、选择性标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。
通常,来源于与宿主细胞相容的物种的含有复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。
此外,与宿主微生物相容的含有复制子和控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主有关的转化载体。例如,噬菌体(诸如GEMTM-11)可用于制备重组载体,该重组载体可用于转化易感宿主细胞(诸如大肠杆菌LE392)。
本公开的表达载体可包含编码多肽组分中的每种组分的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5')的非翻译调控序列,其调节顺反子的表达。原核启动子通常分为两类,诱导型和组成型。诱导型启动子是响应培养条件的变化(例如营养物质的存在与否或温度的变化)启动顺反子在其控制下的转录水平增加的启动子。
由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是公知的。可通过限制酶消化从源DNA中除去启动子并将分离的启动子序列插入本公开的载体中,将所选启动子可操作地连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导目的基因的扩增和/或表达。在某些实施方案中,使用异源启动子,因为与天然靶多肽启动子相比,它们通常容许所表达的目的基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、半乳聚糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子(诸如tac或trc启动子)。然而,在细菌中起作用的其他启动子(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。这些启动子的核酸序列已经公开,从而使得技术人员能够使用接头或衔接子可操作地将它们连接至编码靶轻链和重链的顺反子以提供任何所需的限制性位点。Siebenlist等人,Cell,第20卷:第269-281页(1980年)。
在一个方面,重组载体内的每个顺反子包含指导表达的多肽跨膜转运的分泌信号序列组分。通常,信号序列可以是载体的组分,也可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。为了本公开的目的而选择的信号序列应该是由宿主细胞识别并加工(即,由信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别并且不加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞,信号序列被原核信号序列取代,该原核信号序列例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本公开的某些实施方案中,用于表达系统的两个顺反子的信号序列是STII信号序列或其变体。
在某些实施方案中,根据本公开的抗白蛋白构建体的生产可在宿主细胞的细胞质中进行,并且因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在某些实施方式中,多肽组分(诸如编码任选地融合至第一抗原结合部分的第二抗原结合部分的VH结构域的多肽和编码任选地融合至第一抗原结合部分的第二抗原结合部分的VL结构域的多肽)被表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性抗体。某些宿主菌株(例如,大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件,从而允许表达的蛋白质亚基的正确折叠和组装。Proba和Pluckthun,Gene,第159卷:第203-207页(1995年)。
本公开提供了表达系统,其中可调节表达的多肽组分的定量比以使分泌且适当组装的本公开的抗体的产率最大化。这种调节至少部分地通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。US 5,840,523中公开了一种用于调节翻译强度的技术。这种技术利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。对于给定的TIR,可产生具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体,从而提供了一种方便的、调节该因素以获得特定链的所需表达水平的手段。TIR变体可通过常规的诱变技术产生,这些技术导致可改变氨基酸序列的密码子改变,尽管核酸序列中的沉默改变是优选的。TIR的改变可包括,例如夏因-达尔加诺序列的数目或间距的改变,以及信号序列的改变。一种产生突变信号序列的方法是在编码序列的起始处产生“密码子库”,该编码序列不改变信号序列的氨基酸序列(即,改变是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现;另外,一些氨基酸(诸如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸)具有多个第一和第二位置,这可增加制造库的复杂性。
优选地,产生一组载体,其中每个顺反子具有一定范围的TIR强度。这个有限的组提供了在各种TIR强度组合下每条链的表达水平以及所需蛋白质产物的产率的比较。可通过定量报告基因的表达水平来确定TIR强度,如US 5,840,523中详细描述的。基于翻译强度比较,选择所需的各个TIR在本发明的表达载体构建体中组合。
b)原核宿主细胞
适于表达本公开的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌,诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的示例包括埃希氏菌属(例如,大肠杆菌)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌、假单胞菌属(例如,铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌、变形菌属、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌或副球菌属。在某些实施方案中,使用革兰氏阴性细胞。在某些实施方案中,大肠杆菌细胞用作宿主。大肠杆菌菌株的示例包括菌株W3110及其衍生物,包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(US 5,639,635)。其他菌株及其衍生物,诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些示例是说明性的而非限制性的。通常需要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择合适的细菌。例如,当使用公知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410提供复制子时,大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种可合适地用作宿主。
通常,宿主细胞应当分泌最少量的蛋白水解酶,并且可期望将另外的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
c)蛋白质生产
宿主细胞用上述表达载体进行转化,并在视诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的情况而进行改良的常规营养培养基中培养。转化是指将DNA引入原核宿主,以使该DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。根据所用的宿主细胞,使用适于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。所用的另一种技术是电穿孔。
用于生产本公开的抗体的原核细胞在本领域已知的并且适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的示例包括Luria肉汤(LB)加必需营养补充物。在某些实施方案中,培养基还含有选择剂,该选择剂基于表达载体的构建来选择,以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如,将氨苄青霉素加入到培养基中,以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐源之外的任何必需的补充物也可以适当浓度单独引入或作为与另一种补充物或培养基的混合物(诸如复合氮源)引入。任选地,培养基可含有一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐、二硫赤藓醇和二硫苏糖醇的还原剂。原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如,对于大肠杆菌生长,优选的温度范围为约20℃至约39℃,更优选为约25℃至约37℃,甚至更优选为约30℃。培养基的pH可为约5至约9的范围内任何pH,这主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌,pH优选为约6.8至约7.4,更优选为约7.0。
如果在本公开的表达载体中使用诱导型启动子,则在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本公开的一个方面,PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此,将转化的宿主细胞培养在磷酸盐限制性培养基中以进行诱导。优选地,磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基。可根据所用的载体构建体使用多种其他诱导物,如本领域已知的。
将本公开的表达的抗白蛋白构建体分泌到宿主细胞的周质中并从宿主细胞的周质回收。蛋白质回收通常包括破坏微生物,通常通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解等手段进行。一旦细胞被破坏,可通过离心或过滤除去细胞碎片或整个细胞。蛋白质可例如通过亲和树脂层析进一步纯化。另选地,蛋白质可被转运到培养基中并在其中分离。可从培养物中除去细胞,并过滤和浓缩培养物上清液,以进一步纯化产生的蛋白质。表达的多肽可使用通常众所周知的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹分析进一步分离和鉴定。
另选地,通过发酵方法进行大量蛋白质生产。各种大规模补料分批发酵方法可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1,000升的容量,优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物,尤其是葡萄糖(优选的碳/能源)。小规模发酵通常是指在体积容量不超过约100升并且范围可为约1升至约100升的发酵罐中的发酵。
在发酵过程中,通常在细胞在合适的条件下生长至所需密度,例如OD550为约180-220(在此阶段细胞处于早期稳定期)之后开始诱导蛋白质表达。可根据所用的载体构建体使用多种诱导物,如本领域已知的和上文所述的。细胞可在诱导前生长较短的时间。细胞通常诱导约12-50小时,尽管可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本公开的抗体的生产产率和质量,可改进各种发酵条件。例如,为了改善分泌多肽的正确组装和折叠,可使用过表达伴侣蛋白的另外的载体,诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的肽基脯氨酰顺反异构酶),来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白有利于细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的适当折叠和溶解性。
为了使表达的异源蛋白(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白)的蛋白水解最小化,本发明可使用缺乏蛋白水解酶的某些宿主菌株。例如,可修饰宿主细胞株以在编码已知细菌蛋白酶(诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中产生遗传突变。
缺乏蛋白水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株可用作编码本公开的抗体的表达系统中的宿主细胞。
d)蛋白质纯化
进一步纯化本文生产的抗白蛋白构建体以获得基本上均一的制剂以用于进一步的测定和使用。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是合适的纯化方法的示例:免疫亲和柱或离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅或阳离子交换树脂(诸如DEAE)层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在某些实施方案中,将固定在固相上的蛋白A用于包含本公开Fc区的抗体的免疫亲和纯化。蛋白A是以高亲和力与抗体的Fc区结合的来自金黄色葡萄球菌的41kD细胞壁蛋白。Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,第62卷:第1-13页(1983年)。固定有蛋白A的固相优选为包括玻璃或二氧化硅表面的柱,更优选为可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中,柱已经涂覆有试剂(诸如甘油)以防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相以除去与固相非特异性结合的污染物。最后,通过洗脱从固相回收目的抗体。
2.真核细胞中的重组生产
对于真核表达,载体组分通常包括但不限于以下项中的一种或多种:信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主的载体也可以是编码信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽的插入物。选择的异源信号序列优选为由宿主细胞识别并加工(即,由信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中,哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹gD信号)是可用的。
这种前体区域的DNA在阅读框中与编码本发明抗体的DNA连接。
b)复制起点
通常,哺乳动物表达载体不需要复制组分的起点(SV40起点通常仅因为其含有早期启动子而使用)。
c)选择基因组分
表达和克隆载体可含有选择基因,也称为可选择标记。典型的选择基因编码:(a)赋予对抗生素或其他毒素,例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性的蛋白质;(b)补充营养缺陷的蛋白质;或(c)提供不能从复合培养基中获得的关键营养物,例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因的蛋白质。
选择方案的一个示例利用药物来阻止宿主细胞的生长。成功用异源基因转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质,从而在该选择方案中存活。这种显性选择的示例使用药物新素、霉酚酸和潮霉素。
适用于哺乳动物细胞的可选择标记的另一个示例是能够鉴定有能力摄取编码本公开抗体的核酸的细胞的可选择标记,诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶或鸟氨酸脱羧酶。
例如,首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时,合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
另选地,可通过在含有用于可选择标记的选择剂诸如氨基糖苷抗生素(例如,卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的细胞生长来选择用编码多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一种可选择标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)。
d)启动子组分
表达和克隆载体通常含有由宿主生物识别并且可操作地连接至编码所需多肽序列的核酸上的启动子。事实上,所有真核基因都具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富含AT的区域。在许多基因转录起始上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区,其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核生物的3'末端是AATAAA序列,其可以是将polyA尾加到编码序列3'末端的信号。所有这些序列都可插入真核表达载体中。
其他适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子(诸如tac启动子)。然而,其他已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也含有可操作地连接至编码抗体的DNA的夏因-达尔加诺(S.D.)序列。
哺乳动物宿主细胞中载体的多肽转录受例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒,最优选猿猴病毒40(SV40))的基因组、从异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、从热休克启动子获得的启动子的控制,条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地以SV40限制性片段获得,该限制性片段还含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子方便地以HindIII E限制性片段获得。US 4,419,446公开了一种使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。US 4,601,978中描述了一种该系统的改进。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下的小鼠细胞中人干扰素cDNA的表达还参见Reyes等人,Nature,第297卷:第598-601页(1982年)。另选地,劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
e)增强子元件组分
通常通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核生物对编码本公开的抗体的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而,通常使用来自真核胞病毒的增强子。示例包括复制起点后期(100-270bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后期的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可剪接到载体中多肽编码序列的5'或3'位置,但优选位于启动子的5'位点。
f)转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)的表达载体也含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区获得并偶尔从真核或病毒DNA或cDNA的3'非翻译区获得。这些区域含有转录为编码多肽的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞,包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651);人胚胎肾细胞系(为在悬浮培养物中生长而亚克隆的293或293细胞,Graham等人,J.Gen.Virol.,第36卷:第59-74页(1977年));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第77卷:第4216-4620页(1980年));小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,第23卷:第243-252页(1980年));猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCCCRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺瘤(MMT060562,ATCC CCL51);TR1细胞(Mather等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,第383卷:第44-68页(1982年));MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝癌细胞系(Hep G2)。
宿主细胞用上述用于抗体生产的表达或克隆载体转化,并在视诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的情况而进行改良的常规营养培养基中培养。
h)培养宿主细胞
用于生产本公开的抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。可商购获得的培养基,诸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),Sigma),RPMI-1640(Sigma)和杜氏改良Eagle培养基((DMEM),Sigma)适于培养宿主细胞。培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必需的补充物。培养条件(诸如温度和pH)是先前用于选择表达的宿主细胞,并且对于普通技术人员是显而易见的条件。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时,抗体可在细胞内、在周质间隙中产生,或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生,作为第一步,例如通过离心或超滤除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)。Carter等人,Biotechnology(N.Y.),第10卷:第163-167页(1992年)描述了一种分离分泌到大肠杆菌周质间隙的抗体的方法。简言之,在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻细胞浆约30分钟。细胞碎片可通过离心除去。当抗体分泌到培养基中时,通常首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器(例如,Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)来浓缩来自此类表达系统的上清液。在上述步骤中的任一步骤中可包括蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解,并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的蛋白质组合物,其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于含有1、2或4条重链的人免疫球蛋白的抗体。推荐将蛋白G用于所有小鼠同种型和人类3。亲和配体所连接的基质最通常为琼脂糖,但也可使用其他基质。机械稳定的基质诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯与琼脂糖相比,可实现更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时,Bayerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体,也可使用其他蛋白质纯化技术,例如离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)肝素SEPHAROSETM层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后,可使用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液,优选在低盐浓度(例如,约0-0.25M盐)下进行包含目的抗体和污染物的混合物的低pH疏水相互作用层析。
3.多克隆抗体
多克隆抗体通常通过多次皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。使用双功能或衍生药剂,例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R和R1独立地为低级烷基)将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质,例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合可能是有用的。可使用的佐剂的示例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A,合成的海藻糖二棒分枝菌酸酯)。免疫方案可由本领域技术人员选择而无需过度的实验。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合,并在多个位点皮内注射该溶液,来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后,通过在多个位点皮下注射,用初始量的1/5至1/10的在弗氏完全佐剂中的肽或缀合物加强免疫动物。七至十四天后,对动物取血并测定血清的抗体滴度。加强免疫动物直至滴度达到平台期。缀合物也可在重组细胞培养物中作为蛋白融合物制备。此外,聚集剂诸如明矾适于增强免疫应答。关于骆驼免疫也参见实施例1。
4.单克隆抗体
单克隆抗体获自基本上同源的抗体种群,即除了可能以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如,异构化、酰胺化)之外,构成该种群的各个抗体是相同的。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。例如,可使用首先由Kohler等人,Nature,第256卷:第495-497页(1975年)描述的杂交瘤方法或可通过重组DNA抗体方法(US 4,816,567)来制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中,如上文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物(诸如仓鼠或美洲驼)以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。另选地,淋巴细胞可在体外免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986年))。关于骆驼免疫也参见实施例1。
免疫剂通常将包括抗原蛋白或其融合变体。通常,如果需要人源细胞,则使用外周血淋巴细胞(“PBL”),或者如果需要非人哺乳动物来源细胞,则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生细胞系融合,以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986年),第59-103页。
永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞,特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常,使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并在其中生长,该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如,如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基),这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的永生骨髓瘤细胞是那些有效融合,支持选择的抗体生成细胞稳定高水平地生产抗体,并且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的细胞。其中,优选的是鼠骨髓瘤细胞系,例如获自美国加利福尼亚州圣地亚哥沙克研究所细胞分布中心的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系,以及获自美国弗吉尼亚州马纳萨斯美国典型培养物保藏中心的SP-2细胞(及其衍生物,例如X63-Ag8-653)。
测定杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地,通过免疫沉淀或通过体外结合测定(诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。优选地,可通过免疫沉淀或通过体外结合测定(诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定单克隆抗体的结合亲和力和特异性。这些技术和测定是本领域已知的。例如,可通过Munson等人,Anal.Biochem.,第107卷:第220-239页(1980年)的Scatchard分析来确定结合亲和力。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,可通过有限稀释方法对克隆进行亚克隆,并通过标准方法培养(Goding,同上)。用于此目的合适培养基包括,例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可作为肿瘤在哺乳动物体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如,蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当分离。
也可通过重组DNA方法来制备单克隆抗体。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法(例如,通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离和测序。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦DNA分离,就可将其置于表达载体中,然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中,以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。
在另一个实施方案中,可从使用描述于McCafferty等人,Nature,第348卷:第552-554页(1990年)中的技术产生的抗体噬菌体库中分离抗体。Clackson等人,Nature,第352卷:第624-628页(1991年)和Marks等人,J.Mol.Biol.,第222卷:第581-597页(1991年)分别描述了使用抗体噬菌体库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组生产高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等人,Biotechnology(N.Y.),第10卷:第779-783页(1992年),以及作为构建非常大的噬菌体库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,第21卷:第2265-2266页(1993年))。因此,这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
也可例如,通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列(US 4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.,U.S.A.,第81卷:第6851-6855页(1984年)),或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列中的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接来修饰DNA。通常,此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域,或取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域,以产生包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对另一个抗原具有特异性的另一个抗原结合位点的嵌合二价抗体。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的,其制备方法是本领域公知的。例如,一种方法包括免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区的任何位点被截短,以防止重链交联。另选地,相关的半胱氨酸残基可被另一种氨基酸残基取代或缺失以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规技术来消化抗体以产生其片段,特别是Fab片段。
也可使用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的方法)在体外制备嵌合或杂交抗体。例如,可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适用于此目的试剂的示例包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯。
关于单克隆sdAb的生产也参见实施例1。
5.人源化抗体
非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如抗体的Fv、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合子序列),其含有最少的非人免疫球蛋白来源的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体CDR的残基被来自非人物种(供体抗体)CDR的残基置换,非人物种诸如小鼠、大鼠、兔、骆驼科动物或美洲驼,这些物种的CDR具有所需的特异性、亲和力和结合能力。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基置换。人源化抗体也可包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。通常,人源化抗体可包含基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域,其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区,并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。在某些实施方案中,人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。参见Jones等人,Nature,第321卷:第522-525页(1986年);Riechmann等人,Nature,第332卷:第323-329页(1988年);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,第2卷:第593-596页(1992年)。
用于人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常,人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“导入”残基,其通常取自“导入”可变结构域。人源化可基本上按照Winter及其同事,Jones等人,Nature,第321卷:第522-525页(1986年)的方法进行;Riechmann等人,Nature,第332卷:第323-327页(1988年);Verhoeyen等人,Science,第239卷:第1534-1536页(1988年)的方法进行,也可通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行。因此,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(US4,816,567),其中基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。实际上,人源化抗体通常是人抗体,其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法,针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变结构域序列。然后将最接近啮齿类动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)。Sims等人,J.Immunol.,第151卷:第2296-2308页(1993年);Chothia等人,J.Mol.Biol.,第196卷:第901-917页(1987年)。另一种方法使用来源于轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。
更重要的是,抗体人源化的同时保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现这个目标,根据优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员通常可获得的并且熟悉的。可获得说明和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方法,可从受体和导入序列中选择和组合FR残基,以便获得所需的抗体特征,诸如增加的对靶抗原的亲和力。通常,CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
在某些实施方案中,修饰sdAb,诸如人源化sdAb,而不减少结构域对抗原的天然亲和力,同时降低该sdAb对异源物种的免疫原性。例如,可确定美洲驼抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基,并且例如框架区中的一个或多个骆驼科氨基酸被它们存在于人共有序列中的人对应物置换,而该多肽不丧失其典型特征,即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科sdAb的人源化需要在单一多肽链中引入和诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成对比,该人源化需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸改变并保持这两条链的组装。
6.人抗体
作为人源化的另选方案,可产生人抗体。例如,现在可能产生转基因动物(例如小鼠),这些转基因动物在免疫后能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生完整的人抗体库。例如,已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区域(JH)基因的纯合子缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中导致在抗原攻击后人抗体的产生。
另选地,噬菌体展示技术可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库生产人抗体和抗体片段。McCafferty等人,Nature,第348卷:第552-553页(1990年);Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.第227卷:第381-388页(1992年)。根据此技术,将抗体V结构域基因以正确框架克隆到丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中,并在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝,所以基于抗体功能特性的选择也导致对编码表现出这些特性的抗体的基因的选择。因此,噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行。几种来源的V基因区段可用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature,第352卷:第624-628页(1991年)。可基本上按照Marks等人,J.Mol.Biol.,第222卷:第581-597页(1991年)或Griffith等人,EMBO J.,第12卷:第725-734页(1993年)中描述的技术构建来自未免疫人供体的V基因库,并且分离针对不同抗原(包括自身抗原)阵列的抗体。也参见US 5,565,332和US 5,573,905。
Cole等人(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985年))和Boerner等人(J.Immunol.,第147卷:第86-95页(1991年))的技术也可用于制备人单克隆抗体。类似地,可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物,例如内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠中来制备人抗体。在攻击后,观察到人抗体产生与人类在各个方面的抗体产生(包括基因重排、组装和抗体库)都非常相似。此方法描述于例如US 5,545,807;US 5,545,806;US 5,569,825;US 5,625,126;US 5,633,425;和US 5,661,016;和Marks等人,Biotechnology(N.Y.),第10卷:第779-783页(1992年);Lonberg等人,Nature,第368卷:第856-859页(1994年);Morrison,Nature,第368卷:第812-813页(1994年);Fishwild等人,Nat.Biotechnol.,第14卷:第845-851页(1996年);Neuberger,Nat.Biotechnol.,第14卷:第826页(1996年);Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,第13卷:第65-93页(1995年))。例如,在某些实施方案中,可通过免疫人HCAb小鼠产生人抗体(例如人DAb)。例如,可通过免疫转基因小鼠产生HCAb(例如sdAb-Fc融合蛋白),在该转基因小鼠中,已经消除了内源鼠抗体表达,并且已经引入了人转基因。HCAb小鼠公开于US 8,883,150;US 8,921,524;US 8,921,522;US 8,507,748;US 8,502,014;US 2014/0356908;US 2014/0033335;US 2014/0037616;US 2014/0356908;US 2013/0344057;US 2013/0323235;US 2011/0118444;和US 2009/0307787;所有这些文献都公开了关于重链抗体及它们在转基因小鼠中的产生,它们全部通过引用并入本文。免疫HCAb小鼠,并将所得致敏脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤。然后,通过用人序列置换鼠CH2和CH3区域,可使所得HCAb完全人源化。
最后,也可通过体外活化的B细胞(参见US 5,567,610和US 5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术,包括噬菌体展示文库来产生人抗体(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,第227卷:第381-388页(1992年);Marks等人,J.Mol.Biol.,第222卷:第581-597页(1991年))。
VII.制品和试剂盒
在某些实施方案中,提供了含有用于治疗个体中的疾病或病症的材料的制品,用于将抗白蛋白构建体施用至个体中。制品可包括容器和关于该容器或与该容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括,例如瓶子、小瓶和注射器。容器可由多种材料形成,诸如玻璃或塑料。通常,容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症的组合物并且可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的抗白蛋白构建体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗特定病症。标签或包装说明书还包括用于将抗白蛋白构建体施用至患者的说明书。包括本文所述的组合疗法的制品和试剂盒也考虑在内。
包装说明书是指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于涉及此类治疗性产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。在某些实施方案中,包装说明书指示组合物用于治疗疾病或病症(诸如癌症或炎性疾病)。
另外,制品还可包括第二容器,该第二容器包括药学上可接受的缓冲液,诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可包括从商业和用户角度来看所需的其他材料,包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针头和注射器。
还提供了用于各种目的的试剂盒,例如用于治疗本文所述的疾病或病症(诸如癌症或炎性疾病),用于将抗白蛋白构建体施用至个体,任选地与制品组合。本公开的试剂盒包括含有抗白蛋白构建体组合物(或单位剂型和/或制品)的一个或多个容器,并且在某些实施方案中,还包括另一种药剂(诸如本文所述的药剂)和/或用于根据本文所述的任何方法使用的说明书。试剂盒还可包括选择适于治疗的个体的描述。本公开的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装说明书(例如,试剂盒中包括的纸片)上的书面说明,但机器可读说明(例如,磁或光存储盘上携带的说明)也是可接受的。
例如,在某些实施方案中,试剂盒包括含有抗白蛋白构建体的组合物。在某些实施方案中,试剂盒包括a)含有抗白蛋白构建体的组合物,以及b)有效量的如本文所述的至少一种其他药剂。在某些实施方案中,试剂盒包括a)含有抗白蛋白构建体的组合物,以及b)用于将抗白蛋白构建体组合物施用至个体以进行治疗的说明书。在某些实施方案中,试剂盒包括a)含有抗白蛋白构建体的组合物,b)有效量的如本文所述的至少一种其他药剂,以及c)用于将抗白蛋白构建体组合物和其他药剂施用至个体以进行治疗的说明书。抗白蛋白构建体和其他药剂可存在于分开的容器中或存在于单个容器中。例如,试剂盒可包括一种特定的组合物或两种或更多种组合物,其中一种组合物包括抗白蛋白构建体并且另一种组合物包括另一种药剂。
本发明的试剂盒具有合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子和软包装(例如,密封的Mylar或塑料袋)。试剂盒可任选地提供另外的组分,诸如缓冲液和解释性信息。因此,本公开还提供了制品,其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、罐子和软包装。
与抗白蛋白构建体组合物的使用相关的说明书通常包括关于剂量、给药方案和用于预期治疗的给药途径的信息。容器可为单位剂量、散装包装(例如,多剂量包装)或亚单位剂量。例如,可提供含有足够剂量的如本文所公开的抗白蛋白构建体的试剂盒以提供对个体的长期有效治疗,诸如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间中的任何一者。试剂盒也可包括多个单位剂量的抗白蛋白构建体和药物组合物以及使用说明书,并且以足以在药房(例如医院药房和复合药房)中储存和使用的量包装。
本领域技术人员将认识到,在本公开的范围和精神内,若干实施方案是可能的。现参考以下非限制性实施例更详细地描述本公开。以下实施例进一步说明本公开,但当然不应理解为以任何方式限制其范围。
实施例
以下实施例旨在为本公开的示例,因此不应被认为以任何方式限制本公开的范围。
实施例1.抗HSA单结构域抗体的产生
用小鼠(Sigma,#A9731)表达的人血清白蛋白(HSA)来免疫美洲驼以产生抗HSA单结构域抗体(VHH抗体)。免疫后,分离外周单核细胞(PBMC)以用于RNA提取。用编码抗体基因的mRNA/cDNA来构建VHH抗体噬菌体展示文库。通过与抗原的多轮亲和结合来筛选构建的噬菌体展示文库。通过亲和力测量(RED96)来鉴定阳性克隆。对阳性克隆的抗体基因测序,并将这些基因克隆到载体(EMD Millipore,#CS221284)中以用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达。
表4列出了根据上述方法产生的示例性抗HSA单结构域(例如VHH)抗体(例如抗体A1至A18)。这些示例性VHH抗体的CDR序列列于表5中。在这些抗体中,抗体A8与人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白相互作用。抗体A1至A7和A9与人和食蟹猴血清白蛋白相互作用。
表4.抗HSA VHH抗体的氨基酸序列
表5.抗HSA VHH抗体的CDR序列
实施例2.人源化抗HSA单结构域抗体的产生
将抗HSA单结构域抗体(sdAb)的各美洲驼序列针对数据库进行比对,以鉴定最佳匹配的人IGHV3种系。当多个种系具有相似的同源性时,使用编号系统中FR2的52位置的氨基酸的相似性来确定采用哪个种系作为人源化支架。然后采用来自所选种系的FR1和FR3作为“人源化”FR1和FR3。对于FR2,除了42和52位置之外,大部分人序列都被采用,在这两个位置上保留了各自的美洲驼序列。表6示出了抗HSA抗体中的每一者的示例性人FR区序列。对于人FR4,人源化抗体A1-A9、A19和A20各自独立地具有WGQGTQVTVSS(SEQ IDNO:145)、WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:146)或SGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:147)的氨基酸序列。在一个实施方案中,对于人FR4,人源化抗体A1-A9各自具有WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列。在另一个实施方案中,对于人FR4,人源化抗体A19具有WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:146)的氨基酸序列。在另一个实施方案中,对于人FR4,人源化抗体A19具有SGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:147)的氨基酸序列。
表6.人源化抗HSA VHH抗体的框架区
实施例3.抗白蛋白抗体的结合解离常数(KD)
评价VHH抗白蛋白抗体在不同pH值时(例如pH7.4或pH5.5)与人、猴和小鼠血清白蛋白相互作用以模拟酸化核内体的pH的能力。简言之,将VHH抗白蛋白抗体融合至人IgG1-Fc上。然后将表达的蛋白质加载到蛋白A生物传感器(RED96)上。接着将生物传感器浸入含有三种或更多种不同浓度,例如50nM、100nM或200nM,或100nM、200nM或400nM的人、猴或小鼠血清的溶液中。用整体拟合分析主要实验数据以确定结合解离常数(KD)。结果总结于表7(pH 5.5)和表8(pH7.4)中,其中A代表不大于10nM的值,B代表大于10nM但不大于100nM的值,C代表大于100nM但不大于500nM的值。
表7.在pH5.5时抗白蛋白抗体对人和猴血清白蛋白的结合解离常数(KD)
Ab No. | 人 | 猴 |
A8 | A | B |
A10 | B | B |
A20 | B | B |
表8.在pH7.4时抗白蛋白抗体对人、猴和小鼠血清白蛋白的结合解离常数(KD)
NA—未检测到结合
表8中的结果显示,抗体A19,一种抗体A8的人源化抗白蛋白抗体,保留了其与人、猴和小鼠血清白蛋白的结合。表7和表8中的结果还显示,抗白蛋白抗体在低pH时保留它们与人和猴血清白蛋白的结合,表明此类抗体适用于酸性环境(例如酸化的核内体)。
实施例4.IL-21抗HSA构建体的分子克隆
IL-21抗HSA构建体表达载体的构建在此举例说明。通过基因合成,使用基因合成(ThermoFisher Scientific)来获得编码全长人IL-21(SEQ ID NO:97)的cDNA序列。优化这些基因的密码子使用以用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。使人IL-21的C末端通过肽接头与抗HSA VHH抗体的N末端融合。通过组装克隆(New EnglandBioLabs,#E5520S)或类似的体外重组方法将编码人IL-21、肽接头和抗HSA VHH抗体的DNA序列无缝组装在一起。将IL-21-抗HSA融合蛋白的寡核苷插入表达载体CET1019-AS-Puro(EMD Millipore,#CS221284)中以用于CHO细胞表达。表9列出了人IL-21的序列。表10列出了适用于IL-21-抗HSA构建体的示例性肽接头。
表9.白细胞介素-21(IL-21)
表10.肽接头
实施例5.IL-21-抗白蛋白构建体的表达和纯化
编码IL-21抗白蛋白构建体的DNA序列在EXPICHO-STM细胞(GIBCOTM,#A29127)中瞬时表达。简言之,在第-1天,将EXPICHO-STM以3×106个细胞/mL-4×106个细胞/mL的密度接种于通气的Erlenmeyer摇瓶中的EXPICHOTM表达培养基(GIBCO,#A2910001)中,并置于含8%CO2的37℃培养箱中的125rpm定轨摇床上。在第0天,将质粒DNA与EXPIFECTAMINETMCHO试剂混合。然后将混合物缓慢加入细胞中。16小时后,将细胞转移至含5%CO2的32℃培养箱中。在第1天和第5天向细胞添加EXPICHOTM培养基(GIBCOTM,#A29129)两次。在第8-12天收获CHO细胞,以通过亲和柱纯化。
实施例6.IL-21-抗HSA构建体:与重组人IL-21相似的IL-21信号传导效力
将Pfeiffer细胞维持在含有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640中。将Pfeiffer细胞(100,000)用指定浓度的重组人IL-21(rhIL-21)(SEQ ID NO:97)、小鼠IL-21-抗HSA构建体C1(SEQ ID NO:99)或人IL-21-抗HSA构建体C2(SEQ ID NO:100)在含有10mM HEPES的Hanks平衡盐溶液中在37℃、5%CO2下处理30分钟。根据制造商的说明书使用磷酸-STAT3(Tyr705)均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio)来测量磷酸-STAT3。665nm/620nm的信号比乘以1,000,作图并使用剂量响应曲线拟合(Graphpad Prism)以计算EC50。结果总结于表11中,表明IL-21抗HSA构建体C1和C2以及重组hIL-21具有相似的效力。在表11中,构建体C1是小鼠IL-21-抗HSA融合蛋白,其包含SEQ ID NO:148的小鼠IL-21(mIL-21)部分、SEQ ID NO:8的抗HSA抗体部分和(GSG)4的肽接头(SEQ ID NO:58);其中该mIL-21的C末端通过该肽接头连接至该抗HSA抗体的N末端。构建体C2(SEQ ID NO:100)是人IL-21-抗HSA融合蛋白,其包含SEQ ID NO:97的人IL-21(hIL-21)部分、SEQ ID NO:8的抗HSA抗体部分和(GSG)4(SEQ ID NO:58)的肽接头;其中该hIL-21的C末端通过该肽接头连接至该抗HSA抗体的N末端。
表11.不同IL-21变体的EC50
实施例7.ADCC活性
将NCI-N87和NCI-H226癌细胞系维持在含有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640中。在第0天,将NCI-N87细胞(每孔10,000个)和NCI-H226细胞(每孔5,000个)铺板于96孔平底板的培养基中。在第1天,使用ROSETTESEPTMNK分离试剂盒(StemcellTechnologies)从人白细胞层分离NK细胞。然后将NK细胞(每孔100,000个)与指定处理物一起加入癌细胞中。
NCI-N87和NCH-H226细胞分别在37℃、5%CO2下培养24小时或48小时后,用4%多聚甲醛固定细胞,并用SYTOXTMOrange将细胞核染色。通过使用CYTATIONTM1(Biotek)计数每个孔中剩余的癌细胞核的数目来计算剩余癌细胞的数目。细胞计数越低表明NK介导的细胞杀伤越好。
如图1和图2所示,当与抗MSLN B1组合时,mIL-21-抗HSA构建体C1(SEQ ID NO:99)和hIL-21-抗HSA构建体C2(SEQ ID NO:100)增强了NK细胞ADCC活性。IL-21抗HSA构建体C1和C2的ADCC增强的程度与rhIL-21相似。在图1和图2中,抗MSLN B1,一种单结构域抗MSLN抗体,包含SEQ ID NO:92的CDR1、SEQ ID NO:93的CDR2和SEQ ID NO:94的CDR3。C5代表SEQ IDNO:102的人IL-15。构建体C6(SEQ ID NO:103)代表IL-15Rα-抗HSA构建体,其包含人IL-15Rα(hIL-15Rα)的片段(SEQ ID NO:102)和SEQ ID NO:8的抗HSA抗体部分以及(G4S)4的肽接头(SEQ ID NO:60)。
如图3和图4所示,当与抗MSLN B1组合时,IL-21-抗HSA构建体(i)C1,(ii)C2,(iii)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C6组合,和(iv)rhIL-15C5/hIL-15Rα-抗HSA构建体C7组合显示了完全的ADCC效力,可降至0.6ng/mL或更低。构建体C7(SEQ ID NO:104)代表IL-15Rα-抗HSA构建体,其包含人IL-15Rα的片段和SEQ ID NO:8的抗HSA抗体部分以及(G4S)4的肽接头(SEQ ID NO:60)。
实施例8.同系基因小鼠模型中的体内抗肿瘤活性
在第0天,将MC38鼠结肠癌细胞(3×106个细胞)皮下植入C57BL/6小鼠的侧腹。在第4、8、12和16天,用PBS、抗mPD-1(100μg)、mIL-21-抗HSA构建体C1(25μg)、抗mPD-1(100μg)和mIL-21-抗HSA构建体C1(25μg)或抗mPD-1(100μg)和mIL-21-抗HSA构建体C1(5μg)处理小鼠。在指定的天数使用卡尺测量肿瘤大小,然后计算肿瘤体积。
如图5所示,mIL-21-抗HSA构建体C1单一疗法显著减缓了肿瘤生长。mIL-21-抗HSA构建体C1和抗mPD-1的组合消除或缩小了所有小鼠中的肿瘤。
实施例9.hIL-21-抗HSA构建体C2的小鼠PK研究
在时间0时,向Balb/c小鼠腹膜内注射hIL-21-抗HSA构建体C2。在指定的时间点,通过隐静脉采血(100μL)。将血液置于EDTA采血管中,置于冰上,离心。然后将血浆转移到1.5mL试管中,冷冻并于-80℃储存。为了测量hIL-21浓度,将血浆样品解冻并根据制造商说明书使用人IL-21ELISA(Invitrogen)进行测试。如图6所示,基于体外剂量响应数据,认为有效的IL-21浓度维持至少3-4天。确定了hIL-21-抗HSA构建体C2在3μg剂量和30μg剂量时的PK参数,并总结于表12中。
表12.hIL-21-抗HSA构建体C2在小鼠中的PK参数
实施例10.IL-21抗HSA构建体在转基因小鼠中的PK研究
向转基因表达人血清白蛋白和人新生儿Fc受体并敲除小鼠白蛋白和小鼠新生儿Fc受体的转基因小鼠(Genoway)施用hIL-21-抗HSA构建体C3(SEQ ID NO:149)(3μg)或hIL-21-抗HSA构建体C4(SEQ ID NO:150)(3μg)。1、24、48、96、168和336小时后,采集小鼠的血液并使用EDTA作为抗凝剂将其处理成血浆。使用商品化的ELISA试剂盒(Thermo Fisher)分析样品的IL-21浓度。确定了hIL-21-抗HSA构建体C3和C4在3μg剂量时的PK参数,并总结于表13中。与抗HSA A19相比,当与抗HSA A20缀合时,IL-21的Cmax和t1/2更大。
表13.IL-21抗HSA构建体C3和C4在转基因小鼠中的PK参数
以下序列表提供了本文所述的序列。
序列表
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提供上述实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用所要求保护的实施方案的完整公开内容和描述,而不是为了限制本文所公开的范围。本领域技术人员显而易见的修改应在所附权利要求的范围内。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文,如同每个此类出版物、专利或专利申请都被具体地并单独地指示为通过引用并入本文。
Claims (51)
1.一种分离的抗白蛋白构建体,所述分离的抗白蛋白构建体包含单结构域抗体(sdAb)部分,所述sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138中任一项的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;包含SEQ ID NOs:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139中任一项的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及包含SEQID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140中任一项的氨基酸序列CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;其中所述抗白蛋白构建体与白蛋白结合。
2.根据权利要求1所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括:包含SEQ ID NOs:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138中任一项的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NOs:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139中任一项的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NOs:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140中任一项的氨基酸序列的CDR3;或其在CDR区包含至多约3个氨基酸取代的变体。
3.根据权利要求1或2所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括:
(1)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(2)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(4)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(5)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(6)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(7)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(8)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(9)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(10)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(11)包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(12)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(13)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(14)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(15)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(16)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
(17)包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;或
(18)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR1,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;
包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR2,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体;以及
包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR3,或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括:
(1)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3;
(2)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3;
(3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR3;
(4)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3;
(5)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3;
(6)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3;
(7)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3;
(8)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3;
(9)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3;或
(10)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3。
5.根据权利要求4所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括:
(1)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR3;
(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3;或
(3)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR1;
包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2;以及
包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分是骆驼科的、嵌合的、人的或人源化的。
7.根据权利要求6所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分是人源化的。
8.根据权利要求6或7所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分还包括:具有SEQ IDNO:37、38、39或141的氨基酸序列的FR1;具有SEQ ID NO:40、41、42、142或143的氨基酸序列的FR2;具有SEQ ID NO:43、44或144的氨基酸序列的FR3;和/或具有SEQ ID NO:145、146或147的氨基酸序列的FR4。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括:具有SEQ ID NOs:1至9、45至53、99至101、103至115、149和150中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域;或其与SEQ ID NOs:1至9、45至53、99至101、103至115、149和150中任一项具有至少约80%的序列同一性的变体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:1至9、45至53、114和115中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括具有SEQ ID NOs:45至53、114和115中任一项的氨基酸序列的重链可变结构域。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述sdAb部分包括具有SEQ ID NO:52、114或115的氨基酸序列的重链可变结构域。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述白蛋白是人血清白蛋白、恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白和鼠血清白蛋白。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
15.根据权利要求14所述的抗白蛋白构建体,其中所述人血清白蛋白具有SEQ ID NO:54、55、56或57的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述构建体在约7的pH下以约10-6M至约10-10M的KD与所述白蛋白结合。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述构建体在约5.5的pH下以约10-6M至约10-10M的KD与所述白蛋白结合。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗白蛋白构建体,所述抗白蛋白构建体还包含第二多肽部分。
19.根据权利要求18所述的抗白蛋白构建体,其中所述第二多肽部分的C末端与所述sdAb部分的N末端融合。
20.根据权利要求18所述的抗白蛋白构建体,其中所述第二多肽部分的N末端与所述sdAb部分的C末端融合。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述第二多肽部分通过肽接头与所述sdAb部分融合。
22.根据权利要求21所述的抗白蛋白构建体,其中所述肽接头是可切割的。
23.根据权利要求21或22所述的抗白蛋白构建体,其中所述肽接头包含SEQ ID NOs:73至91中任一项的氨基酸序列。
24.根据权利要求21所述的抗白蛋白构建体,其中所述肽接头是不可切割的。
25.根据权利要求21或24所述的抗白蛋白构建体,其中所述肽接头包含SEQ ID NO:58至72中的任一项的氨基酸序列。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述第二多肽部分包含抗原结合部分。
27.根据权利要求26所述的抗白蛋白构建体,其中所述抗白蛋白构建体通过所述抗原结合部分与肿瘤抗原结合。
28.根据权利要求27所述的抗白蛋白构建体,其中所述肿瘤抗原是间皮素、GPA33、Her-2、EGFR或CD20。
29.根据权利要求27或28所述的抗白蛋白构建体,其中所述肿瘤抗原是间皮素。
30.根据权利要求27至30中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述抗原结合部分包含单结构域抗体部分,所述单结构域抗体部分包括:包含SEQ ID NO:92或95的氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:93或96的氨基酸序列的CDR2;以及包含SEQ ID NO:94或GRY的氨基酸序列的CDR3。
31.根据权利要求27所述的抗白蛋白构建体,其中所述肿瘤抗原是CEA,MUC16,MUC1,AFP,EPCAM,CD19,CD21,CD22,CD30,CD33,CD37,CD45,PSMA或BCMA。
32.根据权利要求18至25中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述第二多肽部分包含细胞因子或其片段的氨基酸序列。
33.根据权利要求32所述的抗白蛋白构建体,其中所述细胞因子是IL-7、IL-15、IL-21、IL-22或IL-33;或其片段。
34.根据权利要求32或33所述的抗白蛋白构建体,其中所述细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21;或其片段。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述细胞因子是IL-7。
36.根据权利要求32至34中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述细胞因子是IL-15。
37.根据权利要求1或36所述的抗白蛋白构建体,所述抗白蛋白构建体具有SEQ ID NO:101的氨基酸。
38.根据权利要求32至34中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述细胞因子是IL-21。
39.根据权利要求1或38所述的抗白蛋白构建体,所述抗白蛋白构建体具有SEQ ID NO:99、100、149或150的氨基酸序列。
40.根据权利要求18至25中任一项所述的抗白蛋白构建体,其中所述第二多肽部分包含细胞因子受体或其片段的氨基酸序列。
41.根据权利要求36所述的抗白蛋白构建体,其中所述细胞因子受体是IL-15Rα。
42.根据权利要求1或41所述的抗白蛋白构建体,所述抗白蛋白构建体具有SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。
43.一种药物组合物,所述药物组合物包括根据权利要求1至42中任一项所述的抗白蛋白构建体和药学上可接受的赋形剂。
44.根据权利要求43所述的药物组合物,其中所述药物组合物是单一剂型。
45.根据权利要求43或44所述的药物组合物,其中所述药物组合物是固体。
46.根据权利要求43或44所述的药物组合物,其中所述药物组合物是胃肠外剂型。
47.根据权利要求46所述的药物组合物,其中所述药物组合物是静脉内剂型。
48.根据权利要求43、44、46和47中任一项所述的药物组合物,其中所述药物组合物是溶液。
49.一种治疗、防止或减轻受试者中癌症的一种或多种症状的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至42中任一项所述的抗白蛋白构建体或根据权利要求42至48中任一项所述的药物组合物。
50.根据权利要求49所述的方法,其中所述癌症是胃癌或肺鳞癌。
51.根据权利要求49或50所述的方法,其中所述受试者是人。
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