NO324461B1 - Blanding som omfatter et anti-tumor-legemiddel konjugert til en vannloselig polymer, anvendelse derav og en implanterbar medisinsk utstyrsenhet omfattende blandingen - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse dreier seg om en blanding som omfatter et anti-tumor-legemiddel konjugert til en vannløselig polymer, anvendelse derav og en implanterbar medisinsk utstyrsenhet omfattende blandingen. Den foreliggende oppfinnelse dreier seg nærmere bestemt om feltet som omhandler farmasøytiske preparater av anti-kreftmidler, slik som paclitaxel (Taxol) og docetaxel (Taxotere), spesielt å gjøre paclitaxel vannløselig ved å binde medikamentet til vannløselige deler.

Paclitaxel, et anti-mikrotubul-middel ekstrahert fra nåler og bark fra stillehavs-barlindtreet, Taxus brevifolia, har vist en oppsiktsvekkende anti-neoplastisk virkning i human kreft i fase I-studier og i tidlige fase II og lll-prøver (Horwitz et al., 1993). Dette har primært blitt rapportert i langtkommen eggstokk- og brystkreft. Signifikant aktivitet har blitt dokumentert i småcelle og ikke-småcelle lungekreft, hode- og halskreft, og i føflekk-kreft med spredning. Imidlertid har en betydelig vanskelighet i utvikling av paclitaxel med henblikk på klinisk prøvebruk, vært at forbindelsen er uløselig i vann.

Docetaxel er semisyntetisk produsert fra 10-deacetyl baccatin III, en ikke-cytotoksisk forløper som er ekstrahert fra nålene til Taxus baccata og forestret med en sidekjede som er kjemisk syntetisert (Cortes and Pazdur, 1995). Ulike kreftcelle-linjer, deriblant bryst-, lunge-, eggstokk- og tykktarm- og endetarmkreft og føflekk-kreft har blitt funnet å være følsomme ovenfor docetaxel. I kliniske prøver har docetaxel blitt benyttet for å oppnå komplette eller delvise responser i bryst-, eggstokk-, hode- og nakkekreft, og i ondartet føflekk-kreft.

Paclitaxel blir vanligvis formulert som en konsentrert løsning som inneholder 6 mg paclitaxel per milliliter Cremophor EL (polyoksyetylert lakserolje) og dehydrert alkohol (50% v/v) og må bli fortynnet videre før tilførsel (Goldspiel, 1994). Mengden Cremophor EL som er nødvendig for å levere de nødvendige doser av paclitaxel er betydelig høyere enn det som tilføres med noen andre medikamenter som formuleres i Cremophor. En rekke toksiske virkninger har blitt tilskrevet Cremophor, deriblant blodåreutvidelse, tung pust og lavt blodtrykk. Dette bæremiddel har også blitt vist å fremkalle alvorlig overfølsomhet i laboratoriedyr og mennesker (Weiss et al., 1990). Faktisk er den maksimale dose paclitaxel som kan tilføres til mus ved i.v. bolusinjeksjon, bestemt av den akutte dødelige toksisitet av Cremophor bæremidlet (Eiseman et al., 1994). I tillegg er det kjent at Cremophor EL, som er et overflate-aktivt middel, fører til utlekking av ftalat bløtgjørere slik som di(2-etylheksyl)ftalat

(DEHP) fra polyvinylkloridposer og de intravenøse tilførselsslanger. DHEP vites å være levertoksisk hos dyr, og er karsinogene hos gangere. Dette preparatet av paclitaxel er også vist å danne fast materiale i løpet av en viss tid, og filtrasjon er derfor nødvendig under tilførsel (Goldspiel, 1994). Spesielle tiltak er derfor nødvendige for å preparere og tilføre paclitaxel-løsninger for at man kan sikre en sikker levering av medikamentet til pasienter, og disse tiltak fører nødvendigvis til høyere kostnader.

Tidligere forsøk på å fremskaffe vannløselig paclitaxel har bestått blant annet av preparering av paclitaxel pro-medikamenter ved å introdusere løsegjørende deler, slik som ravsyre og aminosyrer, ved 2'-hydroksylgruppen eller ved 7-hydroksyl-posisjonen (Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992). Disse pro-medikamenter har imidlertid ikke vist seg å være så kjemisk stabile som nødvendig for utvikling. For eksempel rapporterer Deutsch et al. (1989) om et 2'-suksinatderivat av paclitaxel, men vannløseligheten til natriumsaltet var bare ca. 0,1% og trietanolamin og N-metylglukaminsaltene var løselige bare ved ca. 1% konsentrasjon. I tillegg ble det rapportert at aminosyreesterne var ustabile. Lignende resultater ble rapportert av Mathew et al. (1992). Greenwald et al. rapporterte syntesen av meget vannløselig 2'-og 7-polyetylenglykolestere avtaxol (Greenwald et al., 1994), men ingen data som beskrev anti-tumoraktivitet av disse forbindelser in vivo ble rapportert (Greenwald er al., 1995).

Andre forsøk på å løse disse problemer har dreiet seg om mikroenkapsulering av paclitaxel både i liposomer og i nanosfærer (Bartoni and Boitard, 1990). Det ble rapportert at liposomformuleringen var like effektiv som fri paclitaxel, men bare liposomformulering som inneholdt mindre enn 2% paclitaxel var stabile rent fysisk (Sharma and Straubinger, 1994). Dessverre viste det seg at den nanosfære formuleringen var toksisk. Det er derfor fremdeles et behov for en vannløselig paclitaxelformulering som kan levere effektive mengder av paclitaxel og docetaxel uten de ulemper som fremkalles av medikamentets uløselighet.

Et annet hinder for en utstrakt bruk av paclitaxel er de begrensede resursser som danner basis for paclitaxelproduksjon, noe som fører til at paclitaxelterapi er meget dyrt. En behandlingserie kan for eksempel koste flere tusen dollar. Videre responderer ikke alle tumorer til paclitaxelterapi, og denne ytterligere ulempe kan forårsakes av at paclitaxel ikke kommer inn i tumoren. Det er derfor et umiddelbart behov for effektive formuleringer av paclitaxel og relaterte medikamenter som er vannløselige, og som har lange halveringstider i serum, til behandling av tumorer, autoimmune sykdommer slik som kronisk leddgikt, og også for å forhindre restenose av blodårer som har vært utsatt for skade slik som angioplastikk og innføring av stent.

Den foreliggende oppfinnelse prøver å overvinne disse og andre problemer som er knyttet til tidligere fremgangsmåter, ved å frembringe blandinger som

omfatter et kjemoterapeutisk og anti-angiogent medikament, slik som paclitaxel eller docetaxel, bundet til en vannløselig polymer slik som for eksempel polyglutaminsyre eller polyasparaginsyre. Disse blandinger blir her vist å være overraskende effektive som anti-tumormidler mot flere eksempler på tumormodeller, og forventes å være minst like effektive som paclitaxel eller docetaxel mot enhver av sykdommene eller tilstander der taxaner eller taxoider vites å være effektive. Oppfinnelsens blandinger gir vannløselige taxoider for å overvinne problemene som fremkalles av de uløselige medikamenter selv, og gir også fordelene med kontrollert frisetting slik at tumorer som vist her, kan fjernes i dyremodeller etter en enkel intravenøs tilførsel.

Foreliggende oppfinnelse omfatter i et første aspekt en blanding kjennetegnet av at den omfatter et antitumor-legemiddel konjugert til en vannløselig polymer hvor det nevnte antitumor-legemiddel er paclitaxel, docetaxel, etopsid, teniposid, camptothecin eller epothilon, og hvor nevnte vann-løselige polymer er poly(l-glutaminsyre), poly(d-glutaminsyre) poly(dl-glutaminsyre), poly(d-asparaginsyre), poly(l-asparaginsyre), poly(dl-asparaginsyre), poly(2-hydroksyetyl-l-glutamin), karboksymetyl-dekstran, hyaluronsyre, humant serumalbumin, alginsyre eller en kombinasjon av dette.

I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er blandingen kjennetegnet ved at anti-tumor-midlet er valgt fra paclitaxel, docetaxel og camptothecin.

I andre foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse kjennetegnes blandingen av at nevnte polyaminopolymer videre er definert som en kopolymer med polykaprolakton, polyglykolsyre, polymelkesyre, poly(2-hydroksyetyl-l-glutamin), karboksymetyldekstran, hyaluronsyre, humant serumalbumin, polyalginsyre eller en kombinasjon av dette.

I spesielt foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse kjennetegnes blandingen ved at nevnte polymer har en molekylvekt på fra 5000 til 100000, fortrinnsvis fra 20000 til 80000.

I andre foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse er den vannløselige polymer i blandingen konjugert til 2'- og/eller 7-hydroksyl i paclitaxel eller docetaxel.

Foretrukket omfatter blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse fra 2 til 35%

(vekt/vekt) paclitaxel.

I andre foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er den vannløselige polymer poly(l-glutaminsyre), poly(d-glutaminsyre), poly(dl-glutaminsyre), poly(d-asparaginsyre), poly(l-asparaginsyre eller poly(dl-asparaginsyre).

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse dekkes en anvendelse av blandingen ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament i behandling av kreft, en systemisk autoimmun-sykdom, eller for arteriell restenose eller arteriell okklusjon etterfølgende vaskulært trauma. Foretrukket er nevnte kreft brystkreft, eggstokk-kreft, ondartet melanom, lungekreft, mavesekk-kreft, prostatakreft, tykktarmskreft, hode- og halskreft, leukemi, fibrøst sarkom eller mykvevssarkoma tumor. Foreliggende oppfinnelse omfatter også en implanterbar medisinsk utstyrsenhet spesielt en stent, kjennetegnet ved at nevnte enhet er dekket med en blanding som omfatter paclitaxel konjugert til vannløselig polymer som definert i krav 1 i en mengde som er effektiv i å hemme glattmuskelcelleproliferasjon.

Fremgangsmåtene beskrevet her kan også benyttes for å lage vannløselige polymerkonjugater av andre terapeutiske midler, kontrastmidler og medikamenter, deriblant etopsid, teniposid, fludarabin, doxorubicin, daunomycin, emodin, 5-fluoro-uracil, FUDR, østradiol, camptothecin, retinsyrer, verapamil, epothiloner og syklo-sporin. Spesielt ville de midler som har en fri hydroksylgruppe bli konjugert til polymerene ved kjemiske reaksjoner som er lignende de som beskrives her for paclitaxel. Slik konjugering ville være vel innenfor kompetansen til en kjemiker med rutinekompetanse. Disse midler ville inkludere, men ville ikke være begrenset til, etopsid, teniposid, camptothecin og epothilonene. Som benyttet her betyr konjugert til en vannløselig polymer at medikamentet er bundet kovalent til polymeren.

Det forstås også at den foreliggende oppfinnelses vannløselige konjugater kan tilføres sammen med andre medikamenter, deriblant andre anti-tumor eller anti-kreft medikamenter. Slike kombinasjoner er kjent i faget. Det vannløselige paclitaxel eller docetaxel i den foreliggende oppfinnelse kan i visse behandlingsregimer bli kombinert med et platinamedikament, et antibiotikum slik som for eksempel doxorubicin eller daunorubicin, eller andre medikamenter som benyttes i kombinasjon med Taxol.

Konjugering av kjemoterapeutiske medikamenter til polymerer er en tiltrekkende fremgangsmåte for å redusere systemisk toksisitet og å forbedre den terapeutiske indeks. Polymerer som har molekylmasse større enn 30 kDa diffunderer ikke lett gjennom normale kapillærer og det glomerulære endotel i nyrene, noe som fører til at normalt vev ikke blir utsatt for irrelevant medikamentmediert toksisitet (Maeda and Matsumura, 1989; Reynolds, 1995). På den annen side er det godt beskrevet at ondartede tumorer ofte har ødelagt kapillært endotel og har større permeabilitet enn blodårene i normalt vev (Maeda and Matsumura, 1989; Fidler et al., 1987). Således kan et polymer medikamentkonjugat, som normalt ville forbli i blodbanen, selektivt lekke fra blodårer inn i tumorer, noe som resulterer i tumor-akkumulering av aktivt terapeutisk medikament. I tillegg kan polymermedikament-konjugater fungere som medikamentdepoter og gi langvarig frisetting, og derved føre til at tumorcellene blir eksponert for medikament over et lengre tidsrom. Til sist kan vannløselige polymerer bli benyttet for å stabilisere medikamentene, samt for å løsgjøre forbindelser som ellers er uløselige. Fortiden har en rekke syntetiske og naturlige polymerer blitt undersøkt med henblikk på deres evne til å forbedre tumor-spesifikk levering av medikament (Kopecek, 1990, Maeda and Matsumura, 1989). Imidlertid er bare et fåtall for tiden under klinisk evaluering, deriblant SMANCS i Japan og HPMA-Dox i Storbritannia (Maeda, 1991; Kopecek and Kopeckova, 1993). I den foreliggende beskrivelse blir et taxoid forstått å bety de forbindelser som inkluderer paclitaxel og docetaxel, og andre kjemikalier som har taxan-skjelettet (Cortes and Pazdur, 1995), og kan isoleres fra naturlige kilder slik som barlindtreet, eller fra cellekultur, eller kjemisk syntetiserte molekyler, og foretrukket er en kjemisk forbindelse med den generelle kjemisk formel C47H51NO14, deriblant [2aR-[2aa,4p, 4ocp\6p\9a(aR*,pS*),11a,12a,12aa,12ba]]-p-(benzoylamino)-a-hydroksybenzen-propansyre 6, 12b,bis(acetyloksy)-12-(benzoyloksy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a, 12b-dodecahydro-4,11 -dihydroksy-4a,8,13,13-tetrametyl-5-okso-7,11 -metano-1 H-cyklodeca[3,4]benz-[1,2-b]okset-9-yl-ester. Det blir forstått at paclitaxel og docetaxel hver er mere effektiv enn den andre forbindelse mot visse tumortyper, og at i den foreliggende oppfinnelses praksis blir de tumorer som er mere følsomme overfor et spesifikt taxoid behandlet med det vannløselige taxoidkonjugat.

Paclitaxel kan konjugeres til en vannløselig metallchelator, og blandingen kan da videre omfatte et chelatert metallion. Det chelaterte metallion kan være en ionisk form av enten aluminium, bor, kalsium, krom, kobolt, kobber, dysprosium, erbium, europium, gadolinium, gallium, germanium, holmium, indium, iridium, jern, magnesium, mangan, nikkel, platina, rhenium, rubidium, ruthenium, samarium, natrium, technetium, tallium, tinn, yttrium eller sink. I visse foretrukne utførelser vil det chelaterte metallion være en radioaktiv form, det vil si en radioaktiv isotop av ett av de opplistede metaller. Foretrukne radioaktive nuklider inkluderer, men er ikke begrenset til,<67>Ga,<68>Ga,<111>ln,99<m>Tc,<90>Y,114<m>ln og<193m>Pt.

Vannløselige chelatorer som kan benyttes inkluderer, men er ikke begrenset til, dietylentriaminpenta-eddiksyre (DTPA), etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan-N,N',N",N"'-tetraacetat (DOTA), tetraazacyklotetradecan-N,N',N",N"'-tetraacetat (TETA), hydroksyetyliden-difosfonat (HEDP), dimerkaptosuksinat (DMSA), dietylentriamintetrametylenfosfonsyre (DTTP) og 1-(p-aminobenzyl)-DTPA, 1,6-diamino-heksan-N,N,N',N'-tetraeddiksyre, DPDP, og etylenbis(oksyetylennitrilo)-tetraacetat, der DTPA er den mest foretrukne. En foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse kan også være en blanding som omfatter<111>ln-DTPA-paclitaxel.

I visse utførelser av den foreliggende oppfinnelse kan paclitaxel eller docetaxel være konjugert til en vannløselig polymer, og fortrinnsvis blir polymeren konjugert til hydroksyl i 2' eller 7-posisjon, eller begge, i paclitaxel- eller docetaxel-molekylet. Således blir, når funksjonelle grupper blir benyttet for konjugering av medikament, slik som over med C2'-hydroksylet i paclitaxel, en degraderbar binding, i dette tilfelle en ester, benyttet for å sikre at det aktive medikament blir frigjort fra den polymere bærer. Foretrukne polymerer inkluderer, men er ikke begrenset til, poly(l-glutaminsyre), poly(d-glutaminsyre), poly(dl-glutaminsyre), poly(l-asparaginsyre), poly(d-asparaginsyre), poly(dl-asparaginsyre), kopolymerer av de ovenfor opplistede polyaminosyrer med polykaprolakton, polyglykolsyre og polymelkesyre, samt også poly(2-hydroksyetyl-1-glutamin), karboksymetyl-dekstran, hyaluronsyre, humant serum-albumin og polyalginsyre, med poly-asparaginsyrer og polyglutamin-syrer som de spesielt foretrukne. Polyglutaminsyrene eller polyasparaginsyrene fra den foreliggende oppfinnelse har fortrinnsvis en molekylvekt på ca. 5000 til ca. 100000, med ca. 20000 til ca. 80000 eller til og med ca. 30000 til ca. 60000 som de mest foretrukne.

Det blir forstått at den foreliggende oppfinnelses blandinger kan bli dispergert i en farmasøytisk akseptabel bærerløsning som beskrevet nedenfor. En slik løsning ville være steril eller aseptisk og kan bestå av vann, buffere, isotone midler eller andre ingredienser kjent for de som er øvet i faget, som ikke ville fremkalle allergiske eller andre skadelige reaksjoner når de ble tilført til et dyr eller til et menneske. Derfor kan den foreliggende oppfinnelse også bli beskrevet som en farmasøytisk blanding som omfatter et kjemoterapeutisk eller anti-kreft-medikament slik som paclitaxel eller docetaxel, konjugert til en høymolekylvekts vannløselig polymer. Den farmasøytiske blanding kan inkludere polyglutaminsyrer og polyasparaginsyrer.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å bestemme opptak av et kjemoterapeutisk medikament slik som paclitaxel eller docetaxel, av tumorvev. Denne fremgangsmåten kan omfatte produksjon av et konjugat av medikament og en metall-binder med et bundet metall-ion, skape kontakt mellom tumorvev og blandingen og påvisning av tilstedeværelse av det bundne metallion i tumorvevet. Nærvær av det bundne metallion i tumorvevet demonstrerer opptak av tumorvev. Det bundne metallion kan være en radioaktiv nuklid, og påvisningen kan være ved scintigrafi. Tumorvevet kan også være en del av et dyr eller et menneske, og blandingen ville da bli tilført dette individ.

Fremgangsmåte for å behandle kreft i et individ beskrives. Denne fremgangsmåte inkluderer å fremskaffe en blanding som omfatter et kjemoterapeutisk medikament slik som paclitaxel eller docetaxel, konjugert til en vannløselig polymer og finfordelt i en farmasøytisk akseptabel løsning, og tilføring av løsningen til individet i en mengde som effektivt kan behandle tumor. Foretrukne blandinger omfatter paclitaxel eller docetaxel konjugert til polyglutaminsyrer eller polyasparaginsyrer, og mer fordelaktig til poly(l-glutaminsyre) eller poly(l-asparaginsyre). Oppfinnelsens blandinger er underforstått å være effektive mot enhver type av kreft der det ikke-konjugerte taxoid er vist å være effektivt, og ville inkludere, men ikke være begrenset til, brystkreft, eggstokk-kreft, ondartet føflekk-kreft, lungekreft, mavesekk-kreft, tykktarms-kreft, hode- og hals-kreft eller leukemi.

Fremgangsmåte for å behandle en tumor kan inkludere et estimat av paclitaxel eller docetaxel-opptak i tumor før tilførsel av en terapeutisk mengde av legemidlet eller pro-legemidlet. Denne fremgangsmåte kan består av enhver av de billedskapende teknikkene som er diskutert over, der et metall bundet til et paclitaxel-chelatorkonjugat blir tilført et individ og påvist i en tumor. Dette trinn gir en kostnads- effektiv måte for å bestemme at en spesiell tumor ikke ville forventes å respondere på DTPA-paclitaxelterapi i de tilfeller der legemidlet ikke kommer inn i tumoren. Det antas at dersom en billedteknikk kan benyttes for å forutse responsen til paclitaxel og for å identifisere pasienter som trolig ikke vil respondere, kan betydelige utgifter og viktig tid spares for pasienten. Antagelsen er at dersom det ikke er noen rimelig mengde av kjemoterapeutisk middel nedfelt i tumoren, er sannsynligheten for at tumoren skal respondere på midlet relativt liten.

Det beskrives en fremgangsmåte for å fremskaffe et kroppsbilde av et individ. Kroppsbildet blir fremskaffet ved å tilføre en effektiv mengde av et radioaktivt metallion bundet til et paclitaxel-chelatorkonjugat til et individ og å måle de scintigrafiske signaler fra det radioaktive metall for å fremskaffe et bilde.

Det beskrives i visse brede aspekter også en fremgangsmåte for å forminske minst ett symptom av en systemisk autoimmun sykdom som omfatter tilførsel til et individ som har en systemisk autoimmun sykdom, en effektiv mengde av en blanding som omfatter paclitaxel eller docetaxel konjugert til polyl-l-glutaminsyre eller poly-l-asparaginsyre. Av spesiell interesse i sammenheng med den foreliggende fremstilling er behandling av kronisk leddgikt, som man vet i noen tilfeller responderer på taxol når dette tilføres i den vanlige Cremophor-formulering (US-patent 5,583,153). På samme måte som behandling av tumorer forventes det at effektiviteten til de vannløselige taxoider fra den fore-liggende oppfinnelse ikke vil senkes av konjugering til en vannløselig del, og at det vannløselige pro-legemiddel kan fungere som en kontrollert frisettingsformulering som frisetter det aktive medikament i løpet av en lengre tidsperiode. Derfor blir den foreliggende oppfinnelses blanding forventet å være like effektiv som taxol mot for eksempel kronisk leddgikt, men vil fremby fordelen med en kontrollert frisetting. Det blir også underforstått at den foreliggende oppfinnelses taxoide blandinger kan benyttes i kombinasjon med andre legemidler, slik som en angiogenese-inhibitor (AGM-1470)

(Oliver et al,. 1994) eller metotrexat.

Observasjonen at paclitaxel også hemmer restenose etter ballong-angioplastikk indikerer at de vannløselige paclitaxeler og docetaxeler fra den foreliggende oppfinnelse kan finne en rekke applikasjonsområder i tillegg til direkte parenteral tilførsel (WO 9625176). For eksempel forventes det at vannløselig paclitaxel vil være hensiktsmessig som en overflatedekking på implanterte medisinske utstyrsenheter, slik som slanger, shunter, katetere, kunstiqe implantater, nagler, elektriske implantater slik som pacemakere, og spesielt for arterielle eller venøse stenter, deriblant ballong-ekspanderbare stenter. I disse utførelser forventes det at vannløselig paclitaxel kan være bundet til en implanterbar medisinsk utstyrsenhet, eller alternativt at det vannløselige paclitaxel kan være passivt adsorbert til overflaten av denne implanterbare enhet. For eksempel kan stenter dekkes med polymer-legemiddelkonjugater ved at stenten blir dyppet i polymer-legemiddel-løsning eller at stenten blir sprayet med denne løsning. Passende materialer for det implanterte utstyr bør være biokompatibelt og ikke-toksisk, og kan velges fra metaller slik som nikkel-titaniumlegeringer, stål, eller biokompatible polymerer, hydrogeler, polyuretaner, polyetylener, etylvinylacetat-kopolymerer, etc. I en foretrukket utførelse blir det vannløselige paclitaxel, spesielt et PG-paclitaxelkonjugat, dekket på en stent som skal føres inn i en arterie eller vene etter ballong-angioplastikk. Det beskrives i visse brede aspekter en fremgangsmåte for å hemme arteriell restenose eller arteriell okklusjon etter vaskulært traume, som omfatter tilførsel til et individ som har behov for dette, av en blanding ifølge oppfinnelsen som omfatter paclitaxel eller docetaxel konjugert til poly-l-glutaminsyre eller poly-l-asparaginsyre. I frem-gangsmåtens praksis kan individet være en pasient med kransåre-bypass, blodåre-kirurgi, organtransplantasjon eller kransåre eller arteriell angioplastikk, som eksempler, og blandingen kan tilføres direkte, intravenøst, eller til og med dekket på en stent, og stenten blir implantert ved synet av vaskulær skade.

En av oppfinnelsens utførelser er derfor en implanterbar medisinsk utstyrsenhet, der enheten er dekket med en blanding som omfatter paclitaxel eller docetaxel konjugert til polyglutaminsyrer eller polyasparaginsyrer i en mengde som er effektiv i å hemme glattmuskelcelleproliferasjon. En foretrukket utstyrsenhet er en stent dekket med den foreliggende oppfinnelses blandinger som beskrevet her, og i visse foretrukne utførelser blir stenten adaptert slik at den skal brukes etter ballong-angioplastikk, og der dekkingen effektivt hemmer restenose.

I visse foretrukne utførelser kan oppfinnelsen beskrives som en blanding som omfatter polyglutaminsyrer konjugert til hydroksyl i 2' eller 7-posisjon eller begge i paclitaxelmolekyler, eller til og med en blanding som omfatter polyasparaginsyre bundet til hydroksyl i 2' eller 7-hydroksyl av paclitaxel. Som benyttet her inkluderer termene «en polyglutaminsyre» eller «polyglutaminsyrer» poly(l-glutaminsyre), poly(d-glutaminsyre) og poly(dl-glutaminsyre), og begrepene «en polyasparagin syre» eller «polyasparaginsyrer» inkluderer poly(l-asparaginsyre), poly(d-asparaginsyre) og poly(dl-asparaginsyre).

Dersom ikke definert på annen måte har alle tekniske og vitenskapelige begreper som benyttes her, den samme betydning som de vanligvis har og blir forstått av en med vanlig kunnskap i faget som denne oppfinnelse hører til. Selv om enhver metode eller materiale likt eller ekvivalent til de som er beskrevet her kan benyttes i praksis eller i å teste den foreliggende oppfinnelse, blir de foretrukne fremgangsmåter og materialer nå beskrevet.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

FIG. 1 A. Kjemisk struktur av paclitaxel, PEG-paclitaxel og DTPA-paclitaxel.

FIG. 1B. Kjemisk struktur og reaksjonsskjema for produksjon av PG-paclitaxel. FIG. 2. Effekt av paclitaxel, PEG-paclitaxel og DTPA-paclitaxel på proliferasjon av B16 melanomceller.

FIG. 3. Anti-tumoreffekt av DTPA-paclitaxel på MCa-4 brysttumorer.

FIG. 4. Mediantid (dager) for å oppnå tumordiameter på 12 mm etter behandling med paclitaxel, DTPA-paclitaxel og PEG-paclitaxel. FIG. 5. Gamma-scintigrafi av mus som har MCa-4-tumorer etter intravenøs injeksjon av<111>ln<->DTPA-paclitaxel og<111>ln-DTPA. Pil indikerer tumor. FIG. 6. Hydrolytisk nedbrytning av PG-paclitaxel, bestemt i PBS ved pH 7,4 ved 37°C. --D- representerer prosent paclitaxel som er igjen bundet til løselig PG, ~A~ representerer prosent paclitaxel som frigjøres, --O- representerer prosent metabolitt-1 som er produsert. FIG. 7A. Anti-tumoreffekten til PG-paclitaxel på rotter som har brysttumor fra mus (13762F). -□- representerer responsen til en enkel i.v. dose av PG (0,3 g/kg); -A- representerer respons til paclitaxel (40 mg/kg), -O representerer respons til PG-paclitaxel (60 mg ekvivalenter paclitaxel/kg). FIG. 7B. Anti-tumoreffekten til PG-paclitaxel og paclitaxel på mus som bærer OCa-1 tumorer. -□- representerer responsen til en enkel i.v. dose av PG (0,8 g/kg); -A- representerer responsen til paclitaxel (80 mg/kg), -•- representerer respons til PG-paclitaxel (80 mg ekvivalent paclitaxel/kg), -O- representerer respons til PG-paclitaxel (160 mg ekvivalent paclitaxel/kg). FIG. 7C. Anti-tumoreffekten til PG-paclitaxel på mus som bærer MCa-4 brystkreft-tumorer. -□- representerer responsen til en enkel i.v. dose med saltvann, -A- representerer responsen til en enkel i.v. dose av PG (0,6 g/kg); -♦- representerer respons til PG-paclitaxel (40 mg ekvivalent paclitaxel/kg), -0- representerer respons til PG-paclitaxel (60 mg ekvivalent paclitaxel/kg), -O- representerer respons til PG-paclitaxel (120 mg/kg). FIG. 7D. Anti-tumoreffekt til PG-paclitaxel mot bløtvevs-sarkomtumor (FSa-ll) i mus. -□- representerer responsen til en enkel i.v. dose med saltvann, -0-representerer responsen til en enkel i.v. dose med PG (0,8 g/kg); -O representerer respons til paclitaxel (80 mg/kg), -A- respresenterer respons til PG-paclitaxel (160 mg ekvivalent paclitaxel/kg). FIG. 7E. Anti-tumoreffekten til PG-paclitaxel mot syngenisk leverkrefttumor (HCa-l) i mus. -□- representerer responsen til en enkel i.v. dose med saltvann, -A-representerer responsen til en enkel i.v. dose med PG (0,8 g/kg); -O- representerer respons til PG-paclitaxel (80 mg/kg), -A- representerer respons til PG-paclitaxel (160 mg ekvivalent paclitaxel/kg). FIG. 8. Frisettingsprofil av paclitaxel fra PEG-paclitaxel i fosfatbuffer (pH 7,4). Paclitaxel, -X-; PEG-paclitaxel, -O. FIG. 9. Anti-tumoreffekt av PEG-paclitaxel på MCa-4 brysttumorer. representerer responsen til en enkel i.v. injeksjon med en saltløsning av PEG

(60 mg/mL), -■- representerer respons til Cremophor/alkohol bæremiddel, -O-representerer en enkel dose med 40 mg/kg kroppsvekt av paclitaxel, -•-representerer PEG-paclitaxel ved 40 mg ekvivalent paclitaxel/kg kroppsvekt.

Den foreliggende oppfinnelse kommer fra oppdagelsen av nye, vannløselige formuleringer av paclitaxel og docetaxel, og den overraskende effektivitet disse formuleringer har mot tumorceller in vivo. Paclitaxel konjugert til poly(l-glutaminsyre)

(PG-paclitaxel) tilført til mus som har eggstokk-karsinom (OCa-l) ga betydelig forsinket tumorvekst sammenlignet med den samme dose paclitaxel uten PG.

Mus behandlet med paclitaxel alene eller med en kombinasjon av fritt paclitaxel og PG, viste forsinket tumorvekst initialt, men tumorene vokste tilbake til nivåer som var sammenlignbare med en ubehandlet kontrollgruppe etter 10 dager. Ved den maksimalt tolererbare dose (MTD) av PG-paclitaxel-konjugatet (160 mg ekvivalent paclitaxel/kg) var videre tumorveksten totalt supprimert, tumorene skrumpet inn, og mus som ble observert i 2 måneder etter behandling forble tumorfri (MTD: definert som den maksimale dose som produserte 15% eller mindre av kroppsvekttap innen 2 uker etter en enkel i.v. injeksjon). I en parallell studie ble anti-tumoraktiviteten til PG-paclitaxel undersøkt i rotter med rotte brystadenokarsinom (13762F). Igjen ble komplett tumorutryddelse observert ved 40 til 60 mg ekvivalent paclitaxel/kg av et PG-paclitaxelkonjugat. Disse overraskende resultater demonstrerer at polymer legemiddelkonjugatet PG-paclitaxel effektivt utrydder veletablerte faste tumorer i både mus og rotter etter en enkel intravenøs injeksjon. Videre er PG-paclitaxel, med en halv-levetid på 40 dager ved pH 7,4, et av de mest stabile vannløselige paclitaxel-derivater som er kjent (Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992; Zhao and Kingston, 1991).

DTPA-paclitaxel blir også vist her å være like effektivt som paclitaxel i en in vitro anti-tumor potensanalyse der B16 melanomcellelinjen ble brukt. DTPA-paclitaxel viste ingen signifikant forskjell i anti-tumoreffekt sammenlignet med paclitaxel mot en MCa-4 brysttumor ved en dose på 40 mg/kg kroppsvekt i en enkel injeksjon. Videre ble DTPA-paclitaxel merket med 111 In vist å akkumulere i MCa-4 tumoren, demonstrert ved gamma-scintigrafi, noe som viste at anti-tumor legemidler konjugert til chelatoren er hensiktsmessige og effektive for å billedfremstille tumor.

De nye blandinger og anvendelser fra den foreliggende oppfinnelse gir betydelige fremskritt i forhold til tidligere anvendelser og blandinger, siden de vannløselige paclitaxeler forventes å forbedre effektiviteten av paclitaxel-basert anti-kreftterapi, ved å gi vannløselige paclitaxel-avledede blandinger med kontrollert frisetting. Slike blandinger eliminerer behovet for løsemidler som assosieres med bivirkninger som sees med tidligere paclitaxelblandinger. I tillegg vil radioaktivt merket paclitaxel, som er vist å bevare anti-tumoraktivitet, også å være hensiktsmessige i billedfremstilling av tumorene. Videre tillater den foreliggende oppfinnelse at man bestemmer om et paclitaxel vil bli tatt opp av en spesifikk tumor ved hjelp av scintigrafi, enkel photon emisjonsdatatomografi (SPECT) eller positron emisjons-tomografi (PET). Denne bestemmelse kan deretter bli benyttet for å avgjøre effektiviteten av anti-kreftbehandling. Slik informasjon kan være hjelpsom for den praktiserende lege i utvalg av pasienter som skal gjennomgå paclitaxelbehandling.

Paclitaxel kan bli gjort vannløselig på to måter: ved å konjugere paclitaxel til vannløselige polymerer som fungerer som legemiddelbærere, og ved å derivatisere anti-tumorforbindelsen med vannløseliae chelaterende midler. Den siste tilnærmina gir også en mulighet for å merke med radioaktive nuklider (for eksempel111 In,<90>Y,<166>Ho,<68>Ga,<99m>Tc) med henblikk på billedfremstilling og/eller for strålebehandlings-studier. Strukturene til paclitaxel, polyetylenglykol-paclitaxel (PEG-paclitaxel), polyglutaminsyre-paclitaxelkonjugat (PG-paclitaxel) og dietylentriamin-pentaeddik-syre-paclitaxel (DTPA-paclitaxel) blir vist i FIG. 1.

I visse utførelser kan DTPA-paclitaxel eller andre konjugater av paclitaxel og chelaterende midler, slik som EDTA-paclitaxel, DTTP-paclitaxel eller DOTA-paclitaxel eksempelvis bli laget i form av vannløselige salt (natriumsalt, kaliumsalt, tetrabutylammoniumsalt, kalsiumsalt, treverdig jernsalt, etc). Disse salter vil være hensiktsmessige som terapeutiske midler for behandling av tumorer. For det annet vil DTPA-paclitaxel eller andre paclitaxel-chelaterende midler være hensiktsmessige som diagnostiske midler, som kan, når de er merket med radioaktive nuklider slik som<111>ln eller<99m>Tc, bli benyttet som radioaktive markører for å påvise visse tumorer i kombinasjon med nukleærmedisinsk billedfremstilling. Det skal forstås at andre taxan-derivater i tillegg til paclitaxel (taxol) og docetaxel (Taxotere) kan adapteres til bruk i blandingene og anvendelsene i den foreliggende oppfinnelse, og at alle slike blandinger og anvendelser vil bli omfattet av de vedlagte patentkrav.

Toksisitetsstudier, farmakokinetikk og vevsdistribusjon av DTPA-paclitaxel har vist at LD50(50% letal dose) av DPTA-paclitaxel observert med en enkel intravenøs dose (i.v.) hos mus, er ca. 110 mg/kg kroppsvekt. Direkte sammenligning med paclitaxel er vanskelig å gjøre siden dosevolum-begrensningene som pålegges av den begrensede løselighet til paclitaxel og toksisiteten av bærermediet som er nødvendig med i.v. tilførsel. Basert på den foreliggende presentasjon kan imidlertid en som er øvet i kjemoterapeutisk anvendelse bestemme de effektive og maksimalt tolererte doser i en klinisk studie beregnet på mennesker.

I visse utførelser av oppfinnelsen kan en stent dekket med polymer-paclitaxel-konjugatene bli benyttet for å hindre restenose, dvs. gjenlukking av arterier etter ballong-angioplastikk. Nylige resultater i kliniske prøvinger som har benyttet ballong-ekspanderbare stenter i kransåre-angioplastikk, har vist en signifikant forbedring i blodåre-åpenhet og reduksjon av restenose sammenlignet med standard ballong-angioplastikk (Serruys et al., 1994). Ifølge hypotesen om respons til skade er neointima-dannelse assosiert med øket celleproliferasjon. For tiden er den populære mening at den kritiske prosess som fører til blodåreskader i både spontan og aksellerert aterosklerose proliferasjon av glatte muskelceller (SMC) (Phillips-Hughes and Kandarpa, 1996). Siden SMC fenotypisk proliferasjon etter arteriell skade etterligner proliferasjonen av neoplastiske celler, er det mulig at anti-cancer legemidler kan være hensiktsmessige for å hindre neointima-akkumulering av SMC. Stenter dekket med polymer-koblede antiproliferative midler som har evne til å frigjøre disse midler i løpet av en lang periode i en tilstrekkelig høy konsentrasjon, vil således hindre innvekst av hyperplastisk intima og media inn i karlumen, og derved redusere restenose.

Siden paclitaxel har blitt vist å hindre kollagen-indusert leddbetennelse i en musemodell (Oliver et al., 1994) er den foreliggende oppfinnelses formuleringer også forventet å være hensiktsmessige i behandling av autoimmune og/eller inflammato-riske sykdommer slik som kronisk leddgikt. Paclitaxel-binding til tubulin skifter ekvili-brium til stabile mikrotubul-polymerer, og gjør at dette legemiddel er sterk hemmer av eukaryotisk cellereplikasjon ved å blokkere cellene i den sene G2-mitotiske fase. En rekke mekanismer kan være involvert i hemming av leddbetennelse som paclitaxel gir. For eksempel kan paclitaxels fasespesifikke cytotoksiske virkninger affisere raskt prolifererende betennelsesceller, og paclitaxel hemmer videre celledeling, celle-vandring, kjemotaxis, intracellulær transport og nøytrofil produksjon av hydrogen-peroksyd. I tillegg kan paclitaxel ha anti-angiogen aktivitet ved å blokkere koordinert endotelcellevandring (Oliver et al., 1994). Derfor blir den foreliggende oppfinnelses polymerkonjugerte pro-medikamenter forventet å være like hensiktsmessige som fritt paclitaxel er i behandling av kronisk leddgikt. Den polymerkonjugerte formulering som er beskrevet her, ville også tilby fordelene med forlenget eller vedvarende frisetting av legemiddel, og større vannløselighet. Det er også et aspekt av behandling av leddgikt at formuleringene kan bli injisert eller implantert rett inn i de affiserte leddområder.

De farmasøytiske preparater av paclitaxel eller docetaxel som er passende for injiserbar bruk, inkluderer sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere som kan brukes for preparering av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. I alle tilfeller må formen være steril og må være i form av væske til injeksjon. Den må være stabil under betingelsene for produksjon og lagring, og må bli bevart mot forurensende effekter av mikroorganismer, slik som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsemiddel eller et dispergeringsmedium som inneholder for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glycerol, propylenglykol, og flytendeDolvetvlenalvkol. oa lianendeV ellerDassende blandinaer av disse, oa veaetabilske oljer. Beskyttelse mot mikroorganisme-effekter kan fremkalles ved hjelp av ulike antibakterielle og anti-sopp midler, for eksempel parabener, klorobutanol, fenol, sorbinsyre, timerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å inkludere isotone midler, for eksempel sukker eller natriumklorid.

Sterile injiserbare løsninger blir preparert ved å inkorporere de aktive forbindelser i den ønskede mengde i det passende løsningsmiddel med ulike av de andre ingredienser som er opplistet ovenfor etter behov, etterfulgt av sterilfiltrering. Generelt blir dispersjoner preparert ved å inkorporere de ulike steriliserte aktive ingredienser inn i et sterilt bærermedium som inneholder det basale dispersjons-medium og de nødvendige andre ingredienser fra de som er beskrevet over. I tilfeller med sterile pulvere til preparering av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne preparasjonsmetoder vakuumtørking og frysetørkingsteknikker, som gir et pulver av den aktive ingrediens pluss enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning av denne.

Som brukt her inkluderer «farmasøytisk akseptabel bærer» alle typer løsnings-midler, dispergeringsmidler, dekkingsmidler, antibakterielle og antisoppmidler og isotone midler og lignende. Bruk av slike medier og midler i farmasøytisk aktive substanser er vel kjent i faget. Dersom ikke enhver type konvensjonelle medier eller midler er inkompatible med den aktive ingrediens, blir deres bruk vurdert i de terapeutiske blandinger. Ytterligere aktive ingredienser kan også inkorporeres inn i blandingene.

Frasen «farmasøytisk akseptabel» henviser også til molekylære enheter og blandinger som ikke gir en allergisk eller lignende uønsket reaksjon når de blir tilført et dyr eller et menneske.

Løsningen bør være passende buffret dersom det er nødvendig, og det flytende fortynningsmediet bør først bli gjort isotont med tilstrekkelig saltvann eller glukose for parenteral tilførsel i for eksempel en vandig løsning. Disse spesielle vandige løsninger er spesielt passende for intravenøs og intraperitoneal tilførsel. I denne sammenheng vil sterile vandige løsninger som kan benyttes, være kjent til de med øvelse i faget, i lys av de foreliggende opplysninger.

De følgende eksempler blir inkludert for å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

DTPA-paclitaxel

Syntese av DTPA-paclitaxel:

Til en løsning av paclitaxel (100 mg, 0,117 mmol) i tørr DMF (2,2 ml_) ble det tilsatt dietylentriaminpentaeddiksyreanhydrid (DTPA A) (210 mg, 0,585 mmol) ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved 4°C. Suspensjonen ble filtrert (0,2 |im Millipore-filter) for å fjerne ureagert DTPA-anhydrid. Filtratet ble helt opp i destillert vann, omrørt ved 4°C i 20 minutter, og presipitatet ble samlet. Det grove produkt ble renset ved preparativ TLC på Ci8-kiselgelplater og utviklet i acetonitril/ vann (1:1). Paclitaxel hadde en Rf-verdi på 0,34. Båndet over paclitaxel med en Rf-verdi på 0,65 til 0,75, ble fjernet ved skraping og eluert med en acetonitril/vann (1:1) blanding, og løsningsmidlet ble fjernet for å gi 15 mg DTPA-paclitaxel som produkt (utbytte 10,4%): smp. >226°C dec. UV-spekteret (natriumsalt i vann) viste maksimal absorpsjon ved 228 nm som også er karakteristisk for paclitaxel.

Massespektrum: (FAB) m/e 1229 (M+H)<+>, 1251 (M+Na), 1267 (M+K). 1<1>H NMR-spekteret (DMSO-d6) viste resonans av NCH2CH2N og CH2COOH av DTPA som en kompleks serie med signaler ved henholdsvis 8 2,71-2,96 ppm, og som en multiplett ved 8 3,42 ppm. Resonansen av C7-H ved 4,10 ppm i paclitaxel skiftet til 5,51 ppm, noe som indikerte forestring i 7-posisjonen. Resten av spekteret var i overensstemmelse med paclitaxel's struktur.

Natriumsaltet til DTPA-paclitaxel ble også fremkalt ved å tilsette en løsning av DTPA-paclitaxel i etanol til en ekvivalent mengde av 0,05M NaHC03, etterfulgt av frysetørking for å fremskaffe et vannløselig fast pulver (løselighet >20 mg ekvivalent paclitaxel/ml_).

Hydrolytisk stabilitet av DTPA-paclitaxel:

Den hydrolytiske stabilitet av DTPA-paclitaxel ble studert under aksellererte betingelser. I korthet ble 1 mg DTPA-paclitaxel oppløst i 1 ml_ 0.5M NaHCC>3vandig løsning (pH 9,3) og analysert med HPLC. HPLC-systemet besto av en Waters 150 x 3,9 (i.d.) mm Nova-Pak søyle fylt med Ci84 u.m kiselgel, en Perkin-Elmer isokratisk LC-pumpe, en PE Nelson 900 serie interfase, en Spectra-Physics UV/Vis- detektor og en datastasjon. Elueringsmidlet (acetonitril/metanol/0,02M ammonium-acetat = 4:1:5) ble pumpet med en hastighet på 1,0 mL/min. med UV-deteksjon ved 228 nm. Retensjonstidene til DTPA-paclitaxel og paclitaxel var henholdsvis 1,38 og 8,83 minutter. Området under toppene ble kvantitert og sammenlignet med standardkurver for å bestemme konsentrasjonene av DTPA-paclitaxel og paclitaxel. Den estimerte halveringstid av DTPA-paclitaxel i 0,5M NaHC03-løsning er ca. 16 dager ved romtemperatur.

Effekter av DTPA-paclitaxel på vekst av B16 mus-melanomceller in vitro:

Celler ble sådd ut i 24-brønns plater i en konsentrasjon på 2,5 x 104 celler/mL og dyrket i et 50:50 Dulbecco's modifiserte minimalt essensielt medium (DEM) og F12-medium som inneholdt 10% bovint kalveserum, ved 37°C i 24 timer i en 97% fuktig atmosfære med 5,5% C02. Mediet ble deretter byttet ut med ferskt medium som inneholdt paclitaxel eller DTPA-paclitaxel i konsentrasjoner fra 5 x 10'<9>M til 75 x 10"<9>M. Etter 40 timer ble cellene frigjort ved trypsinisering og tellet i en Coulter teller. Sluttkonsentrasjonene av DMSO (benyttet for å løse opp paclitaxel) og 0.05M natriumbikarbonat-løsning (benyttet for å løse opp DTPA-paclitaxel) i cellemediet, var mindre enn 0,01%. Denne mengde løsningsmiddel hadde ikke noen effekter på cellevekst i kontrollstudier.

Effektene av DTPA-paclitaxel på vekst av B16 melanomceller blir presentert i

FIG. 2. Etter en 40 timers inkubering med ulike konsentrasjoner, ble DTPA-paclitaxel og paclitaxel sammenlignet med henblikk på cytotoksisitet. IC50for paclitaxel og DTPA-paclitaxel er henholdsvis 15 nM og 7,5 nM.

Anti-tumoreffekt på brystkreft (MCa-4) tumormodell:

Hunnmus av type C3Hf/Kam ble inokulert med brystkreft (MCa-4) i høyre lårmuskler (5 x 10<5>celler/mus). Når tumorene hadde vokst til 8 mm (ca. 2 uker), ble en enkelt dose av paclitaxel eller DTPA-paclitaxel gitt i mengder på 10, 20 og 40 mg ekvivalent paclitaxel/kg kroppsvekt. I kontrollstudier ble saltvann og absolutt alkohol/ Cremophor 50/50 fortynnet med saltvann (1:4) benyttet. Tumorvekst ble bestemt hver dag ved å måle tre ortogonale tumordiametere. Når tumorstørrelsen nådde 12 mm i diameter, ble forsinkelsen i tumorvekst kalkulert. Musene ble avlivet når tumorene var ca. 15 mm.

Tumorvekstkurven er vist i FIG. 3. Sammenlignet med kontroll viste både paclitaxel og DTPA-paclitaxel anti-tumoreffekter ved en dose på 40 mg/kg. Data ble også analysert for å bestemme gjennomsnitt antall dager før tumor nådde 12 mm i diameter. Statistisk analyse viste at DTPA-paclitaxel forsinket tumorvekst signifikant sammenlignet med saltvannsbehandlede kontroller ved en dose på 40 mg/kg (p<0,01). Gjennomsnittstiden som tumor brukte for å nå 12 mm i diameter var 12,1 dager for DTPA-paclitaxel, sammenlignet med 9,4 dager for paclitaxel (FIG. 4).

Radioaktiv merking av DTPA-paclitaxel med<111>ln

40 u.L 0,6M natriumacetat (pH 5,3) buffer, 40 uL 0.06M natriumcitratbuffer (pH 5,5), 20 (0.L DTPA-paclitaxel-løsning i etanol (2% vekt/volum) og 20 uL<111>lnCI3-løsning (1,0 mCi) i natriumacetatbuffer (pH 5,5) ble tilsatt etter hverandre i et 2 ml_ V-reagensrør. Etter en inkubasjonsperiode på 30 minutter ved romtemperatur ble det merkede<111>ln-DTPA-paclitaxel renset ved å sende blandingen gjennom en Cia Sep-Pac patron, der først saltvann og deretter etanol ble benyttet som de mobile faser. Fritt<111>ln-DTPA (<3%) ble fjernet ved hjelp av saltvann, mens<111>ln-DTPA-paclitaxel ble samlet i etanolvasken. Etanolen ble fordampet under nitrogengass, og det merkede produkt ble rekonstituert i saltvann. Radiokjemisk utbytte: 84%.

Analyse av11<1>IN-DTPA-paclitaxel:

HPLC ble benyttet for å analysere reaksjonsblandingen og renheten av<111>ln-DTPA-paclitaxel. Systemet besto av en LDC binær pumpe, en 100 x 8,0 mm (i.d) Waters søyle fylt med ODS 5 u.m kiselgel. Søylen ble eluert med en strømnings-hastighet på 1 mL/min. med en gradientblanding av vann og metanol (gradient fra 0% til 85% metanol i løpet av 15 minutter). Gradientsystemet ble fulgt med en Nal krystalldetektor og en Spectra-Physics UV/Vis detektor. Som vist ved HPLC-analyse fjernet rensingen ved hjelp av Sep-Pac patronen mesteparten av 111ln-DTPA, som hadde en retensjonstid på 2,7 min.<111>ln-DTPA kom trolig fra spor av DTPA-forurensning i DTPA-paclitaxelpreparatet. Et radiokromatogram av<111>ln-DTPA-paclitaxel korrelerte med dets UV-kromatogram, noe som indikerte at toppen ved 12,3 min. faktisk var målforbindelsen. Under de samme kromatografiske betingelser hadde paclitaxel en retensjonstid på 17,1 min. Den radiokjemiske renhet av sluttpreparatet var 90%, som bestemt med HPLC-analyse.

Helkropps-scintigrafi:

Hunnmus av C3Hf/Kam type ble inokulert med brystkreft (MCa-4) i høyre lårmuskler (5 x 10<5>celler). Når tumorene hadde vokst til 12 mm i diameter ble musene delt i to grupper. I gruppe I ble musene anestesert med intraperitoneal injeksjon av natriumfenemal, etterfulgt av<111>ln-DTPA-paclitaxel (100-200 mCi) via halevenen. Et y-kamera utstyrt med en middels energi collimator ble plassert over musene (tre per gruppe). En serie på 5 minutter oppsamlinger ble utført 5, 30, 60, 120 og 240 minutter, samt 24 timer etter injeksjon. I gruppe II ble de samme prosedyrer fulgt med unntak av at musene ble injisert med<111>ln-DTPA som en kontroll. FIG. 5 viser gamma-scintigrafer av dyr injisert med<111>ln-DTPA og 111 ln-DTPA-paclitaxel.<111>ln-DTPA blekarakterisertav rask fjernelse fra plasma, rask og høy utskillelse i urinen med minimal retensjon i nyren og neglisjerbar retensjon i tumoren, leveren, tarmen og andre organer eller kroppsdeler. I motsetning fremviste<111>IN-DTPA-paclitaxel en farmakologisk profil som ligner den til paclitaxel (Eiseman er a/., 1994). Radioaktivitet i hjernen var neglisjerbar. Lever og nyre hadde de høyeste vev:plasma-ratioer. Hepatobilliær utskillelse av radioaktivt merket DTPA-paclitaxel eller dets metabolitter, var en av de viktigste veiene for å fjerne legemidlet fra blodet. I motsetning til paclitaxel var også en betydelig mengde av<111>ln-DTPA-paclitaxel utskilt gjennom nyren, som bare spilte en ubetydelig rolle i fjernelsen av paclitaxel. Tumoren viste et signifikant opptak av<111>ln-DTPA-paclitaxel. Disse resultatene viser at<111>ln-DTPA-paclitaxel har evnen til å påvise visse tumorer, og kan kvantifisere opptak av<111>ln-DTPA-paclitaxel i tumorene, noe som igjen kan hjelpe i utvelging av pasienter for behandling med paclitaxel.

Eksempel 2

Polygl utam i nsyre-pacl itaxel

Det foreliggende eksempel demonstrerer konjugering av paclitaxel til en vannløselig polymer, poly(l-glutaminsyre) (PG). Potensialet av vannløselige polymerer som legemiddelbærere er vel etablert (Kopecek, 1990; Maeda and Matsumura, 1989). I tillegg til dets evne til å løse opp legemidler som ellers er uløselige, fungerer legemiddel-polymerkonjugatet også som et langsomt-frisettende depot med henblikk på kontrollert frisetting av legemiddel.

Syntese av PG-paclitaxel

PG ble valgt som bærer for paclitaxel siden det lett kan nedbrytes av lysosomale enzymer, det er stabilt i plasma og inneholder tilstrekkelig med funksjonelle grupper som kan brukes til å binde legemiddel. Flere antitumorlege-midler, deriblant adriamycin (Van Heeswijk et al., 1985; Hoes et al., 1985), cyklo-fosfamid (Hirano er al., 1979) og Ara-C (Kato ef al., 1984) har blitt konjugert til PG.

PG-natriumsalt (MW 34 K, Sigma, 0,35 g) ble løst opp i vann. pH til den vandige løsning ble justert til 2 ved hjelp av 0,2M HCI. Presipitatet ble samlet, dialysert mot destillert vann og frysetørket for å gi 0,29 g PG.

Til en løsning av PG (75 mg, gjentagende enhet FW 170, 0,44 mmol) i

tørr DMF (1,5 ml_) ble tilsatt 20 mg paclitaxel (0,023 mmol, molar ratio PG/ paclitaxel = 19), 15 mg dicykloheksylkarbodiimid (DCC) (0,073 mmol) og en spor-mengde av dimetylaminopyridin (DMAP). Reaksjonen ble tillatt å gå ved romtemperatur i 4 timer. Tynnskiktskromatografi (TLC, kiselgel) viste komplett omdannelse av paclitaxel (Rf = 0,55) til polymerkonjugat (Rf = 0, mobil fase, CHCIg/MeOH = 10:1). Reaksjonsblandingen ble helt over i kloroform. Det resulterende bunnfall ble samlet og tørket i vakuum for å gi 65 mg polymer-legemiddelkonjugat. Ved å endre vekt-ratioene av paclitaxel i forhold til PG i startmaterialene kan polymere konjugater med ulike paclitaxel-konsentrasjoner bli syntetisert.

Natriumsaltet til PG-paclitaxelkonjugatet ble fremskaffet ved å løse opp produktet i 0,5M NaHC03. Den vandige løsningen av PG-paclitaxel ble dialysert mot destillet rvann (MWCO 1000) for å fjerne lavmolekylære vektsforurensninger og overskudd NaHC03-salt. Frysetørking av dialysatet ga 88,6 mg hvitt pulver. Paclitaxel-innholdet i dette polymerkonjugat ble bestemt ved hjelp av UV (beskrevet under) til å være 21% (vekt/vekt). Utbytte (overføring til polymer-bundet paclitaxel, UV): 93%. PG-paclitaxel med høyere innhold av paclitaxel (opp til 35%) kan bli syntetisert ved hjelp av denne metode ved enkelt å øke ratio paclitaxel til PG som benyttes.

<1>H-NMR (GE modell GN 500 spektrometer, 500 MHz i D20): 8 = 7,75 til

7,36 ppm (aromatiske komponenter av paclitaxel), 8 = 6,38 ppm (C10-H), 5,97 ppm (C13-H), 5,63 og 4,78 ppm (C2'-H), 5,55-5,36 ppm (C3'-H og C2-H, m), 5,10 ppm (C5-H), 4,39 ppm (C7-H), 4,10 (C20-H), 1,97 ppm (OCOCH3); og 1,18-1,20 ppm

(C-CH3) blir identifisert som alifatiske komponenter av paclitaxel. Andre resonanser i paclitaxel ble dekket over av resonanser f ra PG. PG-resonanser ved 4,27 ppm (H-a), 2,21 ppm (H-y), og 2,04 ppm (H-f5) er i overensstemmelse med spektrum av rent PG. Koblingen av polymerkonjugert paclitaxel er separert for dårlig til å kunne måles med tilstrekkelig nøyaktighet. Løseligheten i vann var >20 mg paclitaxel/mL.

Karakterisering av PG-paclitaxel

Ultrafiolette spektra (UV) ble fremskaffet på et Beckman DU-640 spektro-fotometer (Fullerton, CA). Innhold av paclitaxel konjugert PG ble estimert ved UV, basert på en standardkurve som var laget med kjente konsentrasjoner av paclitaxel i metanol (A, = 228 nm), der man antok at polymerkonjugatet i vann og det frie legemiddel i metanol hadde de samme molare ekstinksjonskoeffisienter og at begge fulgte Lambert-Beer's lov. Som vist ved dets UV-spektrum har PG-paclitaxel karakteristisk paclitaxel-absorpsjon med X skift fra 228 til 230 nm. Konsentrasjon av paclitaxel i PG-paclitaxel ble estimert basert på standardkurver produsert med kjente konsentrasjoner av paclitaxel i metanol ved absorpsjon ved 228 nm, der man antar at polymerkonjugatet i vann ved 230 nm og det frie legemiddel i metanol ved 228 nm, har de samme molare ekstinksjoner og begge følger Lambert-Beer's lov.

Gelfiltreringskromatografistudier av PG-paclitaxel

Den relative molekylvekt av PG-paclitaxel blekarakterisert vedgelfiltreringskromatografi (GPC). GPC-systemet besto av to LDC modell III pumper koblet med en LDC gradient-danner, en PL gel GPC-søyle, og en Waters 990 fotodiode detektor. Elueringsmidlet (DMF) ble pumpet ved en hastighet på 1,0 ml_/min. med UV deteksjon satt ved 270 nm. Konjugering av paclitaxel til PG resulterte i en økning av molekylvekten til PG-paclitaxel, som vist ved skift av retensjonstid fra 6,4 min. av PG til 5,0 min. ved PG-paclitaxelkonjugat, som analysert ved GPC. Den kalkulerte molekylvekt av PG-paclitaxel som inneholdt 15-25% paclitaxel (vekt/vekt) er i området på 45-55 kDa. Det urene produkt inneholdt en forurensning med liten molekylvekt (retensjonstid 8,0 til 10,0 min., og 11,3 min.) som kan effektivt fjernes ved å konvertere PG-paclitaxel til dets natriumsalt, etterfulgt av dialyse.

Hydrolytisk degradering av PG-paclitaxelkonjugat

PG-paclitaxel ble oppløst i fosfatbuffrede løsninger (PBS, 0,01 M) ved pH 6,0, pH 7,4 og pH 9,6, ved en ekvivalent paclitaxelkonsentrasjon på 0,4 mM. Løsningene ble inkubert ved 37°C med forsiktig omristing. Ved utvalgte tidsintervaller ble deler (100 uL) fjernet, blandet med en lik mengde metanol og analysert ved hjelp av høytrykks væskekromatografi (HPLC). HPLC-systemet besto av en reversert fase kiselgelsøyle (Nova-Pak, Waters, CA), en mobil fase av metanol-vann (2:1, volum/ volum) levert med en strømningshastighet på 1,0 mL/min., og en fotodiode detektor. Konsentrasjonen av PG bundet paclitaxel, fritt paclitaxel og andre degraderings-produkter i hver prøve, ble kalkulert ved å sammenligne topp-områdene med en separat fremskaffet standardkurve, preparert fra paclitaxel, idet det antas at de molare ekstinksjonskoeffisienter i hver topp ved 228 nm er de samme som den til paclitaxel. Halveringstiden til konjugatet, estimert til å være 132, 40 og 4 dager ved henholdsvis pH 6,0, 7,4 og 9,6, ble bestemt ved hjelp av lineær minstekvadrat regresjonsanalyse. HPLC-analyse viste at inkubering av PG-paclitaxel i PBS-løsninger ga paclitaxel og flere andre komponenter, deriblant en som er mere hydrofob enn paclitaxel (metabolitt-1). Mengde metabolitt-1, som sannsynligvis representerte 7-epipaclitaxel, som ble gjenvunnet i PBS ved pH 7,4, overgikk faktisk mengde paclitaxel etter 100 timer inkubering (FIG. 6).

In vitro studier

Prøver tatt fra PBS-løsning ved pH 7,4 ble analysert ved hjelp av en tubulin-polymeriseringsanalyse. Tubulin-polymeriseringsreaksjonen ble utført ved 32°C i PEM-buffer (pH 6,9), med tubulin (fra bovin hjerne, Cytoskelleton, Inc., Boulder, CO) i en konsentrasjon på 1 mg/mL (10 u,M) i nærvær av prøver (1,0 u.M ekvivalent paclitaxel) og 1,0 mM GTP. Tubulin-polymerisering ble fulgt ved å måle absorbans av løsningen ved 340 nm som funksjon av tid. Etter 15 minutter ble kalsiumklorid (125 mM) tilsatt for å måle kalsiumklorid-indusert depolymerisering av mikrotubuler. Mens PG-paclitaxel ferskt oppløst i PBS, ikke hadde aktivitet i å produsere mikrotubuler, hadde prøver av PG-paclitaxel som var inkubert i 3 dager, evne til å gi tubulin-polymerisering. De mikrotubuler som var dannet var stabile mot kalsiumklorid-indusert depolymerisering.

Effekten av PG-paclitaxel på cellevekst ble også undersøkt ved hjelp av tetrazoliumsalt- (MTT) analyse (Mosmann, 1983). MCF-7-celler eller 13762F-celler ble sådd ut i mengde på 2 x 10<4>celler/ml_ i en 96 brønns mikrotiterplate som ble behandlet 24 timer senere med ulike konsentrasjoner av PG-paclitaxel, paclitaxel eller PG, og inkubert i ytterligere 72 timer. MTT-løsning (20 uL, 5 mg/mL) ble deretter tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Supernatanten ble fjernet, og det MTT formazan som var dannet av metabolske levedyktige celler, ble målt ved hjelp av en mikroplate fluorescensleser ved en bølgelengde på 590 nm. I løpet av en 3 dagers periode hemmet PG-paclitaxel tumorcelleproliferasjon like mye som fritt paclitaxel gjorde. De resulterende IC5o-verdier for den humane brystkreftcellelinje MCF-7 var for paclitaxel 0,59 u.M og 0,82 u.M for PG-paclitaxel (målt i paclitaxel ekvivalente enheter). I en 3762F-cellelinje var sensitivitet for PG-paclitaxel (IC5o= 1,86 |iM) sammenlignbar med den overfor paclitaxel (IC50 = 6,79 jiM). IC50av PG alene var større enn 100 u.M i begge cellelinjer.

In vivo anti-tumoraktivitet

Alt arbeid med forsøksdyr ble utført ved dyrestallen ved M.D. Anderson Cancer Center i overensstemmelse med institusjonens retningslinjer. C3H/Kam-mus ble avlet og oppstallet i en patogenfri dyrestall i avdelingen for eksperimentell strålingsonkologi. Enkelt-tumorer ble produsert i høyre lårmuskel hos C3H/Kam-hunnmus (25-30 g) ved å sprøyte inn 5 x 10<5>mus-eggstokk-kreftceller (OCa-l), brystkreft (MCa-4), leverkreft (HCa-l) eller fibrøst sarkom (FSa-ll). I en parallell studie fikk Fischer 344 hunnrotter (125-150 g) injisert 1,0 x 10<5>levedyktige 13762F tumorceller i 0,1 ml_ PBS. Behandlingene ble påbegynt når tumorene hos mus hadde vokst til 500 mm<3>(10 mm i diameter), eller når tumorene hos rotter hadde vokst til 2400 mm<3>(gjennomsnittsdiameter på 17 mm). En enkel dose av PG-paclitaxel i saltvann eller paclitaxel i Cremophor EL bæremiddel ble gitt i doser som varierte fra 40 til 160 mg ekvivalent paclitaxel/kg kroppsvekt. I kontrolleksperimenter ble saltvann, Cremophor bæremiddel [50/50 Cremophor/etanol fortynnet med saltvann (1:4)], PG- (MW 38K) løsning i saltvann, og en paclitaxel/PG-blanding benyttet. Tumorvekst ble bestemt hver dag (FIG. 7A, 7B, 7C, 7D og 7E) ved å måle tre ortogonale tumordiametere. Tumorvolum ble kalkulert ifølge formel A x B x C)/2. Absolutt vekstforsinkelse (AGD) hos mus blir definert som tiden målt i dager som tumorer behandlet med ulike legemidler bruker for å vokse fra 500 til 2000 mm<3>hos mus minus tiden målt i dager for tumorer behandlet med saltvannskontroll trenger for å vokse fra 500 til 2000 mm<3>. Tabell 1 sammenfatter den akutte toksisitet av PG-paclitaxel hos rotter sammenlignet med paclitaxel/Cremophor. Tabell 2 sammenfatter data vedrørende effekten av PG-paclitaxel mot MCa-4, FSa-ll og HCa-l tumorer hos mus. Disse data blir også sammenfattet i FIG. 7A-FIG. 7E.

a. PG-paclitaxel-løsning ble forberedt ved å løse opp konjugatet i saltvann

(8 mg ekvivalent paclitaxel/mL). Det injiserte volum ved 60 mg/kg var

0,975 ml_ per rotte.

b. Paclitaxel Cremophor-løsning ble forberedt ved å løse opp paclitaxel i en 1:1

blanding av etanol og Cremophor (30 m/mL). Denne stamløsning ble videre fortynnet med saltvann (1:4) før injeksjon. Sluttkonsentrasjonen av paclitaxel i

løsningen var 6 mg/mL. Det injiserte volum ved 60 mg/kg var 1,3 mL per rotte. c. PG-løsning ble forberedt ved å løse opp polymeren i saltvann (22 mg/mL).

Den injiserte dose var 0,3 g/kg (1,8 mL per rotte) som var ekvivalent til en

paclitaxel-dose på 60 mg/kg.

d. Cremophor bæremiddel ble preparert ved å fortynne en blanding av etanol og Cremophor (1:1) med saltvann (1:4).

a. Mus som hadde 500 mm<3>tumorer i det høyre ben ble behandlet med ulike doser PG-paclitaxel (40-120 mg ekvivalent paclitaxel/kg) i saltvann eller paclitaxel i Cremophor bæremiddel i.v. ved hjelp av en enkel injeksjon. Kontrolldyr ble behandlet med saltvann (0,6 mL), Cremophor bæremiddel (0,5 mL), PG-løsning i

saltvann, eller PG g/kg) pluss paclitaxel (80 mg/kg).

b. Tumorvekst ble bestemt ved daglige målinger av tre ortogonale diametere, og volumet ble kalkulert som (a x b x c)/2. Tall vist i parenteser er antall mus som ble benyttet i hver gruppe. Tiden for vekst fra 500 mm<3>til 2000 mm<3>representerer

dager og presenteres som gjennomsnitt ±standardawik.

c. Absolutt vekstforsinkelse (AGD) definert som tiden i dager som tumorene behandlet med ulike medikamenter brukte for å vokse fra 500 til 2000 mm<3>minus tiden i dager som tumorene behandlet med saltvannskontroll brukte for å vokse

fra 500 til 2000 mm<3>.

d. Tiden i dager brukt for å vokse fra 500 til 2000 mm<3>ble sammenlignet mellom behandlingsgrupper og saltvannsgrupper ved å bruke Studenfs f-Test. P-verdier er tosidede og ble tatt som signifikante når de var mindre eller like med 0,05.

Eksempel 3

Polyetylenglykol-paclitaxel

Syntese av polyetylenglykol-paclitaxel (PEG-paclitaxel)

Syntesen ble oppnådd i to trinn. Først ble 2'-suksinyl-paclitaxel laget ifølge en beskrevet prosedyre (Deutsch et al., 1989). Paclitaxel (200 mg, 0,23 mmol) og rav-syreanhydrid (288 mg, 2,22 mmol) ble tillatt å reagere i vannfri pyridin (6 mL) ved romtemperatur i 3 timer. Pyridinet ble deretter fordampet, og resten ble behandlet med vann, omrørt i 20 minutter og filtrert. Presipitatet ble løst opp i aceton, vann ble langsomt tilsatt og de fine krystaller ble samlet for å gi 180 mg 2'-suksinyl-paclitaxel. PEG-paclitaxel ble så syntetisert ved en koblingsreaksjon mediert av N-etoksy-karbonyl-2-etoksy-1,2-dihydrokinolin (EEDQ). Til en løsning av 2'-suksinyl-paclitaxel (160 mg, 0,18 mmol) og metoksy-polyoksyetylenamin (PEG-NH2, MW 5000, 900 mg, 0,18 mmol) i metylenklorid ble tilsatt EEDQ (180 mg, 0,72 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Det grove produkt ble kromato-grafert på kiselgel med etylacetat etterfulgt av kloroform-metanol (10:1). Dette ga 350 mg produkt.

<1>H NMR (CDCI3) 8 2,76 (m, ravsyre, COCH2CH2C02), 8 3,63 (PEG, OCH2CH20), 8 4,42 (C7-H) og 8 5,51 (C2'-H). Maksimal UV-absorpsjon var ved 288 nm, som også er karakteristisk for paclitaxel. Binding til PEG forbedret sterkt vannløseligheten til paclitaxel (>20 mg ekvivalent paclitaxel/ml_ vann).

Hydrolytisk stabilitet til PEG-paclitaxel

PEG-paclitaxel ble løst opp i fosfatbuffer (0,01 M) ved ulike pH-verdier i en konsentrasjon på 0,4 mM, og løsningene ble tillatt å inkuberes ved 37°C med forsiktig omristing. Ved utvalgte tidspunkter ble prøver (200 uL) fjernet og frysetørket. De resulterende tørre pulvere ble løst opp igjen i metylenklorid med henblikk på gelfiltreringskromatografi (GPC-analyse). GPC-systemet besto av en Perkin-Elmer PL gel mixed bed søyle, en Perkin-Elmer isokratisk LC pumpe, en PE Nelson 900 serie interfase, en Spectra-Physics UV/Vis detektor og en datastasjon. Elueringsmidlet (metylenklorid) ble pumpet med hastighet på 1,0 mL/min. med UV-detektoren satt ved 228 nm. Retensjonstidene til PEG-paclitaxel og paclitaxel var henholdsvis 6,1 og 8,2 min. Topp-områder ble kvantifisert og prosenten av PEG-paclitaxel som var igjen og prosenten av paclitaxel som var frigitt, ble kalkulert. Halveringstiden til PEG-paclitaxel bestemt ved hjelp av lineær minste kvadrat ved pH 7,4, var 54 minutter. Halveringstiden ved pH 9,0 var 7,6 minutter. Frigjørings-profiler av paclitaxel fra PEG-paclitaxel ved pH 7,4 blir vist i Figur 8.

Cytotoksisitetsstudier av PEG-paclitaxel ved bruk av B16 mus-melanomceller in vitro

Ved å følge prosedyren som er beskrevet i cytotoksisitetsstudiene med DTPA-paclitaxel, ble melanomcellene sådd ut i 24 brønnsplater ved en konsentrasjon på 2,5 x 10<4>celler/mL og dyrket i en 50:50 Dulbeccos modifiserte minimalt essensielt medium (DME) og F12 medium som inneholdt 10% bovint kalveserum ved 37°C i 24 timer i en 97% fuktig atmosfære med 5,5% C02. Mediet ble deretter byttet ut med ferskt medium som inneholdt paclitaxel eller dets derivater i konsentrasjoner fra 5

x 10'<9>M til 75 x 10"<9>M. Etter 40 timer ble cellene frigjort ved trypsinisering og tellet i en Coulter teller. Sluttkonsentrasjonene av DMSO (benyttet for å løse opp paclitaxel) og 0.05M natriumbikarbonat-løsning (benyttet for å løse opp PEG-paclitaxel) i cellemediet var mindre enn 0,01%. Denne mengde løsningsmiddel hadde ingen effekt på cellevekst i kontrollstudier. Videre hadde PEG i konsentrasjonsområdet benyttet for å

produsere en ekvivalent paclitaxelkonsentrasjon fra 5 x 10'<9>M til 75 x 10"<9>M ingen effekt på celleproliferasjon.

Anti-tumoreffekt av PEG-paclitaxel mot MCa-4 tumor i mus

For å evaluere anti-tumoreffektiviteten til PEG-paclitaxel mot faste brysttumorer ble MCa-4 celler (5 x 10<5>celler) sprøytet inn i høyre lårmuskel på C3Hf/Kam hunnmus. Som beskrevet i Eksempel 1 med DTPA-paclitaxel ble når tumor hadde vokst til 8 mm (ca. 2 uker) en enkelt dose av paclitaxel eller PEG-paclitaxel gitt i 10, 20 og 40 mg ekvivalente paclitaxel-mengder/kg kroppsvekt. Paclitaxel ble først løst opp i absolutt etanol med en lik mengde av Cremophor. Denne stamløsning ble videre fortynnet (1:4 ved volum) med en steril fysiologisk løsning innen 15 minutter fra injeksjon. PEG-paclitaxel ble løst opp i saltvann (6 mg ekvivalent paclitaxel/ml_) og filtrert gjennom et sterilfilter (Millipore, 4,5 u.m). Saltvann, paclitaxel bæremiddel, absolutt alkohol:Cremophor (1:1) fortynnet med saltvann (1:4) og PEG-løsning i saltvann (600 mg/kg kroppsvekt) ble benyttet i kontrolleksperimenter. Tumorvekst ble bestemt hver dag ved å måle tre ortogonale tumordiametere. Når tumorstørrelsen nådde 12 mm i diameter ble tumorvekstforsinkelsen kalkulert.

Tumorvekstkurven blir vist i Figur 9. Ved en dose på 40 mg/kg ga både PEG-paclitaxel og paclitaxel effektiv hemming av tumorvekst. Paclitaxel var mere effektiv enn PEG-paclitaxel, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant. Paclitaxel-behandlede tumorer behøvde 9,4 dager for å nå 12 mm i diameter, mens PEG-paclitaxel-behandlede tumorer trengte 8,5 dager. Statistisk var disse verdier signifikante (p>0,05) sammenlignet med deres tilsvarende kontroller, som var 6,7 dager og 6,5 dager for henholdsvis paclitaxel-bæremiddel og for saltvannsløsningen av PEG (Figur 4).

Referanser

De følgende referanser, i den utstrekning de gir eksempler på prosedyrer eller andre detaljer som er i tillegg til de som er beskrevet her, blir spesifikt inkorporert her som referanse.

Bartoni and Boitard, " In vitro and in vivo antitumoral activity of free, and encapsulated taxol," J. Microencapsulation, 7:191-197,1990.

Cortes, J.E. and Pazdur, R., "Docetaxel", Journal of Clinical Oncology, 13:2643-2655,1995.

Deutsch et al, "Synthesis of congeners and prodrugs. 3. water-soluble prodrugs of taxol with potent antitumor activity," J. Med Chem., 32:788-792-, 1989.

Eiseman et al, "Plasma pharmacokinetics and tissue distribution of paclitaxel in CD2F1 mice," Cancer Chemother. Pharmacol, 34:465-471,1994.

Fidler, et al, "The biology of cancer invasion and metastasis," Adv. Cancer Res., 28:149-250,1987.

Goldspiel, "Taxol pharmaceutical issues: preparation, administration, stability, and compatibility with other medications," Ann. Pharmacotherapy, 28:S23-26,1994.

Greenwald et ai, "Highly water soluble Taxol derivatives, 7-polyethylene glycol esters as potential products," J. Org. Chem., 60:331-336,1995.

Greenwald et al., "Highly water soluble taxol derivative: 2-pølyethylene glycol esters

as potential products," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 4:2465-2470, 1994.

Hirano et al, "Polymeric derivatives of activated cyclophosphamide as drug delivery systems in antitumor therapy," Makromol Chem., 180:1125-1130,1979.

Hoes et al, "Optimization of macromolecular prodrugs of the antitumor antibiotic adriamycin," J. ControlledRelease, 2:205-213,1985.

Hofleera/.,DE38942.

Horwitz et al, "Taxol, mechanisms of action and resistance," J. Nati. Cancer Inst. MonographsNo. 15, pp. 55-61,1993.

Kato et al, "Antitumor activity of 1-b-arabtoofuranosylcytosine conjugated with polyglutamic acid and its derivative", Cancer Res., 44:25,1984.

Kopecek, "The potential of water-soluble polymeric carriers in targefed and site-specific drug delivery", J. ControlledRelease, 11:279-290,1990.

Kopecek and Kopeckova, "Targetable water-soluble polymeric anticancer drugs: achievements and unsolved problems," Proceed. Intern Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 20:190-191,1993.

Maeda and Matsumura, "Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs", Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:193-210,1989.

Magri and Kingston, "Modified taxols. 2. Oxidation products of taxol," J. Org. Chem., 51:797-802,1986.

Mathew et al., "Synthesis and evaluation of some water-soluble prodrugs and derivatives of taxol with antitumor activity," J. Med. Chem., 35:145-151,1992.

Mosmann, T., "Rapid colormetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assay," J. Immunol. Methods, 65:55-63,1983.

Oliver, S.J. et al, Suppression of collagen-induced arthritis using an angiogenesis inhibitor, AGM-1470, and a microtubule stabilizer, Taxol," Cellular Immunology, 157:291-299,1994.

Phillips-Hughes and Kandarpa, "Restenosis: pathophysiology and preventive strategies," JVIR, 7:321-333, 1996.

Reynolds, T., "Polymers help guide cancer drugs to tumor, targets- and keep them there," J. Nati Cancer Institute, 87:1582-1584,1995.

Scudiero et al. "Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines," Cancer Research, 48:4827-4833,1988.

Serruys et al, "A comparison of balloon-expandable-stent implantation with ballodn angioplasty in patients with coronary artery disease," N. Engl. J. Med, 331:489-495, 1994.

Sharma and Straubinger, "Novel taxol formulations: Preparation and Characterization of taxol-containing liposomes," Pharm. Res., 11:889-896,1994.

US Patent 5,583,153

van Heeswijk et al, "The synthesis and characterization of polypeptide-adriamycin conjugate and its complexes with adriamycin. Part 1", J. Controlled Release, 1:301-315,1985.

Weiss et al, "Hypersensitivity reactions from Taxol," J. Clin. Oncol, 8:1263-1268, 1990.

WO 96/25176

Zhao, Z. and Kingston, D.G.L, "Modified taxols. 6. Preparation of water-soluble taxol phosphates," J. Nat. Prod, 54:1607-1611, 1991.

Claims (10)

1. Blanding,karakterisert vedat den omfatter et antitumor-legemiddel konjugert til en vannløselig polymer hvor det nevnte antitumor-legemiddel er paclitaxel, docetaxel, etopsid, teniposid, camptothecin eller epothilon, og hvor nevnte vann-løselige polymer er poly(l-glutaminsyre), poly(d-glutaminsyre) poly(dl-glutaminsyre), poly(d-asparaginsyre), poly(l-asparaginsyre), poly(dl-asparaginsyre), poly(2-hydroksyetyl-l-glutamin), karboksymetyl-dekstran, hyaluronsyre, humant serumalbumin, alginsyre eller en kombinasjon av dette.

2. Blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat antitumor-legemidlet er valgt fra paclitaxel, docetaxel og camptothecin.

3. Blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte polyaminopolymer videre er definert som en kopolymer med polykaprolakton, polyglykolsyre, polymelkesyre, poly(2-hydroksyetyl-l-glutamin), karboksymetyldekstran, hyaluronsyre, humant serumalbumin, polyalginsyre eller en kombinasjon av dette.

4. Blanding ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte polymer har en molekylvekt på fra 5000 til 100000, fortrinnsvis fra 20000 til 80000.

5. Blanding ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte vannløselige polymer er konjugert til 2'- og/eller 7-hydroksyl i paclitaxel eller docetaxel.

6. Blanding ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte blanding omfatter fra 2 til 35% (vekt/vekt)paclitaxel.

7. Blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat den vannløselige polymer er poly(l-glutaminsyre), poly(d-glutaminsyre), poly(dl-glutaminsyre), poly(d-asparaginsyre), poly(l-asparaginsyre eller poly(dl-asparaginsyre).

8. Anvendelse av en blanding ifølge ethvert av kravene 1 -7 for fremstilling av et medikament i behandling av kreft, en systemisk autoimmun-sykdom, eller for arteriell restenose eller arteriell okklusjon etterfølgende vaskulært trauma.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor nevnte kreft er brystkreft, eggstokk-kreft, ondartet melanom, lungekreft, mavesekk-kreft, prostatakreft, tykktarmskreft, hode-og halskreft, leukemi, fibrøst sarkom eller mykvevssarkoma tumor.

10. En implanterbar medisinsk utstyrsenhet spesielt en stent,karakterisertv e d at nevnte enhet er dekket med en blanding som omfatter paclitaxel konjugert til vannløselig polymer som definert i krav 1 i en mengde som er effektiv i å hemme glattmuskelcelleproliferasjon.