NO315835B1 - Planteavledet flavonolholdig preparat, fremgangsmåte for fremstilling av drikk som omfatter preparatet, samt anvendelse av preparatet - Google Patents

Abstract

Det beskrives et planteavledet flavonolholdig tørt preparat som er egnet for konsumering av mennesker, hvor minst 25% av det planteavledete materiale i preparatet omfatter polyfenoler,. sammen med anvendelse derav.

Description

Oppfinnelsen vedrører blant annet planteavledet flavonolholdig preparat, fremgangsmåte for fremstilling av drikk som omfatter preparatet, samt anvendelse av preparatet for produksjon av et medikament for konsumering av mennesker.

Det høye forbruk av vin i Frankrike menes å være en viktig diettfaktor i den lave forekomst av koronar-hjertesykdom (CHD)-dødelighet og er foreslått, i det minste delvis, å utgjøre en mulig forklaring på det fenomen som er kjent som det "franske paradoks" (Renaud & De Lorgeril 1992), idet Frankrike er en unntakelse sammenlilgnet med de fleste andre land fordi CHD-dødelighet er lav til tross for høyt inntak av mettet fett.

Det er betydelig litteratur angående de påståtte velgjørende effekter av rødvin

i forhold til å forhindre koronar-hjertesykdom (CHD). Epidemiologiske data antyder at den beskyttelse som gis av vin, er overlegen i forhold til den fra andre alkoholiske drikker, f.eks. øl og brennevin, hvilket indikerer at andre faktorer enn alkoholinnholdet i vin bidrar til effekten (St Leger et al., 1979; Renaud & De Lorgeril 1992). I en fremtidsrettet studie i København, Danmark, ble diverse parametere (inklusive alkoholinntak, røkevaner og kroppsmasseindeks) fatslått hos 13.285 personer etterfulgt av en 12 års oppfølging av dødeligheten. Det ble påvist at lavt til moderat inntak av vin (men ikke øl eller brennevin) var assosiert med lavere dødelighet av kardiovaskulære og cerebrovaskulære sykdommer og andre årsaker (Gronback et al., 1995). Disse resultater bekreftet dem som tidligere var rapportert i USA (Klatsky & Armstrong, 1993).

Det er økende sannsynlighet for at friradikalkjedereaksjonen ved lipidperoksy-dering som involverer oksydasjon av lavdensitets-lipoproteiner (LDL), spiller en viktig bid ragende rolle i utviklingen av arterosklerose og CHD (Steinberg, 1993).

Frankel et al (Lancet 1993 341,454-457) undersøkte evnen hos fortynnet, dealkoholisert rødvin med hensyn til å inhibere oksydasjon av human LDL in vitro, og fant at vinen var svært aktiv som antioksydant. Forfatterne antydet at rutinefortæring av rødvin kan "redusere oksydasjon av lipoproteiner og redusere trombose-fenomener". Imidlertid innrømmet forfatterne at "vi trenger å vite mer om farmakokinetikken hos vinflagonoider og absorpsjonen og metabolismen av vinfenoler.... hvis vi skal evaluere ytterligere den potensielle rolle av antioksydant-forbindelser i rødvin med hensyn til å redusere CHD".

Flavonoider tilhører en gruppe substanser som kalles polyfenoler (PP), kalt slik fordi de inneholder to eller flere fenolgrupper. Polyfenoler opptrer rikelig i rødvin og består av et stort antall forskjellige kjemiske substanser med varierende molekyl-vekter. Hoved-polyfenolkomponentene i druer og vin, og konsentrasjonene av dem, er beskrevet av Shahidi & Nazck (1995) i "matvarefenolforbindelser: kilder, kjemi, effekter og anvendelser" (Technomic Publishing Co., Lancaster Pa, USA) s. 136-146. Blant polyfenolene er de følgende klasser: flavonoider (en betegnelse ofte brukt for å angi polyfenoler generelt, men mer vanlig i Europa for bare å angi flavonene), flavanolene, proanthocyanidinene (også kalt proscanidoler, procyaniner, procyanidiner og tanniner) og antocyaniner.

Flavonene er forbindelser med en basisstruktur vist i figur 2, hvor to benzenringer (A og B) er forbundet med en heterosyklisk seksledet ring C som inneholder en karbonylgruppe. Ring B kan være tilknyttet i posisjon 2 (som illustrert) til å gi et flavon eller til posisjon 3 til å gi et iso-flavon. Hydroksylering kan inntreffe ved posisjoner 3, 5, 7 og 3", 4', 5" til å gi forbindelser kalt flavonoler. Typiske eksempler på flavonoler er: quercetin, (hydroksylert ved posisjonene 3, 5, 7, 3', 4'), kaempferol (hydroksylert ved posisjonene 3, 5, 7,4' og myricetin (hydroksylert ved posisjoner 3, 5, 7, 3', 4', 5'). De kan naturlig eksistere som aglykont eller som O-glykosider (f.eks. D-glykose, galaktose, arabinose, ramnose etc). Andre former for substitusjon, f.eks. metylering, sulfatering og malonylering, er også funnet.

Flavanolene har en basisstruktur som vist i figur 3. De to mest vanlige flavanoler er catechin (hydroksylgrupper posisjoner 5, 7,3', 4') og dens stereo-isomere epi-catechin. Hydroksylgruppene kan være forestret med gallesyre (vist i figur 4). Proantocyanidinene er polymerer av catechin og/eller epi-catechin og kan inneholde opptil 8 enheter eller mer.

Antocyaninene er farvede substanser med en basisk struktur som vist i figur 5. De kalles av og til antocyanidiner. Typiske eksempler er: cyanidin (hydroksylert ved posisjoner 3, 5, 7, 3', 4'), delfinidin (hydroksylert ved posisjoner 3, 5, 7, 3', 4', 5") og pelargonidin (hydroksylert ved posisjoner 3, 5, 7, 3'). Hydroksylgruppene er vanligvis glykosylert og/eller metoksylert (f.eks. malvidin ved 3', 5').

Innen den generelle betegnelse (polyfenoler) er inkludert de hydroksy- eller tri-hydroksy-benzosyrene og fytoaleksinene, hvorav et typisk eksempel er resveratrol (vist i figur 6).

Den mest benyttede metode for bestemmelse av LDL-oksydasjon er å anvende overgangsmetallet kopper (spesifikt Cu<2+->ioner) som katalysator for å fremkalle oksydasjon av endogene lipidhydroperoksyder. Antioksydanter som er til stede i LDL, spesielt a-tokoferol, forsinker oksydasjonsprosessen og produserer en såkalt lagg-fase. Prosessen kan lett følges i et UV-spektrofotometer fordi oksyda-sjonsreaksjonen produserer konjugerte diener som kan overvåkes kontinuerlig ved 234nm (Esterbauer ef al., 1989). For å bevare LDL mot oksydasjon under lagring, tilsettes EDTA for å kompleksdanne kopper og andre sporelementer. Dette overskudd av EDTA interfererer med den kopperkatalyserte oksydasjon. EDTA kan fjernes ved å dialysere LDL-preparatet før tilsetning av kopperionene, eller et overskudd av kopperioner kan tilsettes for å kompensere for dem som er kompleksdannet med EDTA.

Resultatene av in v/frø-eksperimenter som er noe lik dem som er beskrevet av Frankel et al., Lancet 1993, nevnt ovenfor) ble også rapportert av Frankel et al i 1995 (J. Agricult, and Food Chemistry 43, 890-894). Forfatterne av denne publikasjon henleder oppmerksomheten på vanskeligheten med å tolke in v/frø-data. Derfor: "Selv om fenolforbindelsene har lignende kjemiske egenskaper, er deres reduserende kapasitet ikke noen svært presis prediktor for deres antioksyderende aktivitet. I LDL-oksydasjonsanalysen og andre tester på antioksydantaktivitet er systemet typisk heterogent, og fysikalske egenskaper, f.eks. lipofilisitet, løselighet og fordeling mellom de vandige og lipide faser i LDL kan bli viktig med hensyn til å bestemme antioksydant-aktivitet".

Faktisk innser fagmannen på området at ekstrapolering fra in <y>/frø-funn til in wVo-situasjoner ofte er uriktig. Som eksempel på dette henvises det til publikasjonen av McLoone et al, (1995 Proe. Nutr. Soc. 54, Abstract 168A), som viser at selv om forbindelsen lutein har det potensiale å inhibere LDL-oksydasjon in vitro, hadde supplering av dietten til frivillige personer med lutein i to uker (noe som ga seks gangers økning i nivåene for lutein i plasma) ingen effekt på LDL-oksydasjon.

Noen in wVo-forsøk er utført for å undersøke de eventuelle helsefordeler ved rødvin. Fuhrman et al, 1995 Am. J. Clin. Nutr. 61, 549-554) fant at "noen fenoliske substanser som eksisterer i rødvin, men ikke i hvitvin, blir absorbert, binder seg til plasma-LDL og kan være ansvarlige for antioksydantegenskapene hos rødvin" og tilveiebrakte, med sine egne ord, den første demonstrasjon "at rødvinfortæring inhiberer propensiteten hos LDL til å gjennomgå lipidperoksydasjon", og at dette kan bidra til svekking av aterosklerose. Imidlertid fant en studie av Sharpe et al, hvis resultater ble publisert (Q.J. Med. 1995 88,101-108) så å si samtidig med resultatene til Fuhrman et al, at verken nytelse av rødvin eller hvitv in hadde noen effekt "på total-kolesterol, triglycerider, HDL eller mål på antioksydant-status, inklusive tilbøyeligheten hos LDL for oksydasjon".

De Rijke et al. undersøkte også dette emnet og utførte et randomisert dobbelt blindforsøk. De rapporterte sine funn i 1996 (Am. J. Clin. Nutr. 63, 329-334) og fastslo at "resultatene av denne studie viser ikke noen velgjørende effekt av rødvinfortæring på LDL-oksydasjon".

For således å oppsummere, er det flere rapporter om at fortynnet rødvin kan inhibere LDL-oksydasjon i in w'frø-data, men at disse funn ikke nødvendigvis kan utvides til in wVo-situasjonen. Videre er de in wVo-data som vedrører inhibering av LDL-oksydasjon ved rødvininntak høyst konfliktdannende, og det finnes intet klart bevis som antyder at nytelse av rødvin har noen effekt på LDL-oksydasjon.

Et antall preparater er nå tilgjengelige for allmennheten som fremstilles av vin eller drue-biprodukter, og som kan inneholde polyfenoler (skjønt ved ganske lave nivåer i noen av preparatene). Blant disse er "French Paradox"-kapsler (tilgjengelige fra Arkopharma). "French Paradox"-kapsler lages ved å fremstille en ekstrakt av mask (drueskinnavfallet som blir igjen etter vinfermentering). Mesteparten av polyfenolene som er til stede i drueskinnet, er alkoholløselige og vil således kunne bli ekstrahert inn i den fermenterende vin. Derfor har French Paradox-kapsler faktisk ganske lavt polyfenolinnhold. (Andre allment tilgjengelige preparater inkluderer et antocyaninholdig pulver (kan oppnås fra Sefcal) laget av en drueskinnekstrakt, og som anvendes som matfargemiddel, og et proantosyanidinholdig preparat ("Endoleton") fremstilt av druefrø.)

Selv om "French Paradox"-kapsler inneholdt signifikante mengder av polyfenoler, er det ikke klart at oral fortæring av et slikt syntetisk polyfenolpreparat ville utøve den samme terapeutiske effekt som det påstås er assosiert med fortæring av rødvin. For eksempel, som forklart av Goldberg (1995 Clin. Chem. 41,14-16), holder alkoholinnholdet i vin polyfenoler i løsning i vin og i menneskets tarmsystem, slik at de kan være tilgjengelige for absorpsjon. Et syntetisk, alkoholfritt polyfenolpulver kan være fullstendig ineffektivt fordi polyfenolene er utilstrekkelig løselige i tarmsystemet (i fravær av alkohol) til å bli absorbert. I tillegg kan absorpsjon inn i blodomløpet kanskje ikke være tilstrekkelig til at en antioksydanteffekt kan utøves på LDL-intim assosiasjon av polyfenolene med LDL-fraksjonen kan være nødvendig.

Det erkjennes at mange sykdommer forårsakes eller fremkalles av en friradikaloksydasjonsmekanisme, f.eks. kreft, grå stær, diabetes osv. Antioksydantnæringsstoffer, f.eks. vitamin E, vitamin C og andre, menes å forhindre friradikal-oksydasjon i mange organer og vev. Således er det sannsynlig at absorpsjon av polyfenoler som er effektive antioksydanter, vil ha en effekt på friradikal/oksydasjons-sykdommer generelt, og anvendelse av polyfenoler kan være meget videre enn en behandling eller forhindring av koronar-hjertesykdom.

Ikke desto mindre er CHD en av hovedårsakene til dødelighet og sykelighet i den vestlige verden, og derfor av spesiell interesse. Patogenese av tilstanden består i alt vesentlig av en totrinns prosess som omfatter for det første utvikling av artero-sklerotiske plater og deretter dannelse av en trombe (koagulert masse) på platen (en prosess kalt trombose) som kan forårsake arterietilstopning, hvis konsekvenser kan være myokarialt infarkt (Ml) og plutselig død. Andre sykdommer som forårsakes av trombose, er slag og venetrombose. Det innledende trinn i dannelsen av en trombe er aggregering av blodplater som deretter frigjør koagulasjonsfaktorer inn i blodet og forårsaker produksjon av fibrinklumper. Så snart blodklumpene blir dannet, kan de fjernes ved en prosess som er kjent som fibrinolyse, som i alt vesentlig er oppløsning av klumper og nedbrytning av fibrin til nedbrytningsprodukter. Det er således minst to prosesser ved hvilke trombose kan forhindres: inhibering av aggrering av blodplater, eller økning av fibrinolyse.

Anormal vaskulær glattmuskelcelle (BSMC)-proliferasjon kan bidra til dannelse av obstruerende lesjoner i koronar-hjertesykdom, aterosklerose, restenose, slag og glattmuskel-neoplasmer i innvoller og uterus, uterin-fibroid eller fibroma.

Det har vært kjent i mange år at TGF-p er en av de mest potente cellevekst-inhibitorer (Massagué, 1990), og flere forfattere har funnet at TGF-p inhiberer VSMC-proliferasjon (Assolian, 1986; Bjorkerud, 1991; Owens, 1998; Kirschenlohr, 1993). Human-VSMC produserer TGF-p i en latent, inaktiv form som blir aktivert proteolytisk ved serinproteinplasminet, som på sin side oppnås fra plasminogen ved en familie av plasminogen-aktivatorer (PAs), så som vev-plasminogen-aktivator (tPA)

(Lyons, 1990). En økning i total plasma-TGF-p ansees effektivt med hensyn til å

inhibere veksten av VSMC siden den latente form blir omdannet til den aktive form ved plasmin.

Flere forfattere har utviklet metoder for å anslå plasmanivået av TGF-p og for å søke etter farmasøytiske forbindelser som kan stimulere TGF-B-produksjon både i den latente og den aktive form. Med US 5 545 569 (Grainger et al) kreves det beskyttelse for den fremgangsmåte for bestemmelse in vitro av effektiviteten av forbindelser som øker plasmanivået av TGF-B og stimulerer dets produksjon ved anvendelse av de teknikker som der er beskrevet. WO94/26303 (Graniger et al)

åpenbarer en fremgangsmåte for å opprettholde eller øke kar-lumen-diameteren i et sykt eller såret kar hos et pattedyr ved å administrere en effektiv mengde av TGF-B-aktivator eller produksjonsstimulator. Forbindelsen Tamoxifen (trans-2 [4 (difenyl -1-butanyl) fenoksyj-dimetyletylamin hevdes å være effektiv, siden den stimulerer produksjon av TGF-B og øker forholdet mellom aktiv og latent TGF-p. En annen forbindelse som viser aktivitet, er aspirin (Grainger, et al, 1995) som øker både total og aktiv serum-TGF-p hos normale mennesker, men bare total-TGF-p hos pasienter med koronar-hjertesykdom.

En økning i småplateaggregering er også blitt signifikant assosiert med prevalens (Elvood et al, 1991) og insidens (Thaulou etat, 1991) av CHD. Småplateaggregering blir lett studert ved anvendelse av et småplate-aggregometer i hvilket en suspensjon av blodplater som er nylig oppnådd fra blod, blir brakt i kontakt med en agonist som forårsaker aggregering. Mange agonister kan anvendes, men den mest typiske er arakidonsyre, ADP, kollagen og trombe. Ut fra en måling av den maksimale aggregering (%) er det mulig å studere effektene av inhibitorene av småplateaggregering som kan gis oralt eller ved injeksjon til personen. En av de mest effektive substanser med hensyn til å forhindre småplateaggregering er aspirin, som inhiberer syklo-oksygenase-aktivitet og dannelse av tromboksan, en nødvendig faktor i trombedannelse (Moncada & Vane, 1979). Aspirin forhindrer også CHD, slag og plutselig død (Hennekens et al, 1988).

Det fibrinolytiske system utgjør en kaskade av ekstracellulære proteolytiske reaksjoner tett styrt av aktivatorer og inhibitorer. Enzym-vevstype-plasminogen-aktivatoren (t-PA) omdanner plasminogen til plasmin, som på sin side oppløser fibrinklumper. t-PA er et glykoprotein syntetisert i endotelceller, som blir adsorbert på fibrin for å bli aktivert. Plasminogen-aktivator-inhibitor (PAI)-1 er en serinprotease-inhibitor og virker som en spesifikk inhibitor for t-PA. PAI-I eksisterer i tre former; aktivt, latent og som et inaktivt kompleks. Det blir syntetisert i endotelceller, lever og blodplater.

Ved sirkulasjonen blir det meste tPA (95%) kompleksdannet med PAI-1. Svært lite tPA og PAI-1 er i den frie (aktive) form. En redusert fibrinolytisk aktivitet menes å skyldes en økning i PAI-1-nivå eller aktivitet, hvilket resulterer i nedsatt aktivering av plasminogen til plasmin ved tPA. Dette er viktig på grunn av rapporter angående en assosiasjon mellom nedsatt fibrinolytisk aktivitet og risiko for CHD (Mehta et al, 1987) og Ml. Forringet fibrinolyse, hovedsakelig på grunn av forhøyelse av plasma-PAI-1, er et vanlig funn i trombotisk sykdom. I Northwick Park-hjetrestudium, en fremtidsrettet epidemiologisk studie av middelaldrende menn (40-54 ved begynnelsen), rapporterte Meade et al (1987) at en nedsatt fibrinolytisk aktivitet er en hovedsakelig uavhengig risikofaktor for fremtidig CHD. Tverrsnittsstudier av pasienter med angina pectoris eller tidligere myokardinal infarkt har gjennomgående vist nedsatt fibrinolytisk aktivitet hos pasienter sammenlignet med kontrollgruppe (Hamsten ef al., 1985 og 1986; Johnson 1984; Paramo et al., 1985; Aznar ef al., 1986; Francis 1988 og Olofson et al., 1989). PAI-1-konsentrasjoner har vist seg å være høyere hos Ml-pasienter sammenlignet med kontrollgruppe (Hamsten et al., 1987).

På grunn av den rolle som blodplateaggregering og fibrinolyse spiller ved dannelsen av tromber, kunne en fremgangsmåte for nedsettelse av blodplateaggregering og/eller økning av fibrinolyse anvendes som en metode for behandling av trombotiske sykdommer generelt, og CHD spesielt.

I et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et planteavledet flavonolholdig tørt preparat som er egnet for konsumering av mennesker, oppnådd fra druer, vin eller flavonolholdige biprodukter eller avfallsprodukter fra vinfremstilling, og hvor konsumering av preparatet av en person blir effektiv med hensyn til å forårsake i personen ett eller flere av følgende: å inhibere oksydasjon av plasma LDL; å stimulere TGF-p-produksjon; å inhibere blodplateaggregering; og å stimulere fibrinolyse, kjennetegnet ved at minst 25% av det planteavledete materialet i preparatet omfatter polyfenoler, idet preparatet omfatter minst 0,01 % (vekt/vekt) flavonol.

For forklaringens skyld kan planteavledete preparater omfatte ekstrakter av planter eller deler derav (f.eks. rotknoller, frukt), som kan være forarbeidet på en eller annen måte, (f.eks. ved fermentering). Således inkluderer planteavledete preparater vandige eller organisk-løsningsmiddelekstrakter av planter eller deler derav, frukt-safter og fermenterte væsker (f.eks. vin) produsert av planter eller fruktsaft, eller preparater oppnådd fra hva som helst av det foran nevnte. Plantematerialet blir typisk forarbeidet (fysisk og/eller kjemisk) under produksjon av preparatet for å ekstrahere polyfenoler fra planten og således øke og anrike polyfenolinnholdet i preparatet. Fordelaktig kan preparatet være slik at det planteavledete materialet omfatter minst 35% polyfenoler, eller mer foretrukket minst 45% polyfenoler.

Preparatet kan være sammensatt helt eller i alt vesentlig av det planteavledete materiale som flavonolinnholdet i preparatet oppnås fra. Alternativt kan preparatet omfatte annet materiale, f.eks. smaksstoffer, eksipienter, bærere og liknende som konvensjonelt anvendes ved sammensetning av preparater for fortæring av mennesker.

Det "planteavledete materiale" i preparatet stammer fra samme kilde som flavonolinnholdet i preparatet. Preparatet kan også omfatte andre ingredienser (f.eks. stivelse eller aromastoffer) oppnådd fra planter, men disse skal ikke ansees som "planteavledet materiale" hvis de ikke er oppnådd fra samme kilde som flavonolinnholdet i preparatet.

Fortrinnsvis er sammensetningen slik at flavonolinnholdet er minst 0,5 vekt%, fortrinnsvis minst 1 vekt% og mer foretrukket minst 2 vekt% av hele det planteavledete polyfenolinnhold i preparatet.

Det foretrekkes også at flavonolinnholdet i preparatet som helhet er minst 0,01 % (vekt/vekt), mer foretrukket minst 0,1 % og mest foretrukket 1 vekt%.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et planteavledet flavonolholdig tørt preparat som omfatter minst 0,01 % (vekt/vekt) flavonol, mer foretrukket minst 0,1 % og mest foretrukket minst 1 %.

Preparatene som er definert ovenfor, er typisk faste ved atmosfæretrykk

(760 mm hg) gjennom temperaturområdet 10-20° C. Preparatet kan være partikkel-formig (f.eks. pulverisert eller granulert) eller kan være dannet til kapsler, tabletter o.l.

Vi har overraskende funnet at preparater i overensstemmelse med oppfinnelsen er effektive, etter oralfortæring av mennesker, med hensyn til å inhibere oksydasjon av plasma-LDL, mot ved en rekke kriterier. Således er oralfortæring av preparatet effektiv med hensyn til å øke laggfasen i oksydasjon av isolert plasma-LDL bestemt ved fremgangsmåten til Esterbauer et al (1989 Free Radic. Res. Commun. 6, 67.-75). Kort sagt blir ved denne metode LDL isolert fra en persons plasma ved ultrasentrifuge, dialysert for fjerning av EDTA, og kopperioner (5uJv1) tilsatt til LDL (til stede med 50 mg/l). Den vanlige laggtid før diendannelse er ca. 50-60 min. Administrering av preparatet i henhold til oppfinnelsen til personen bør gi en forlengelse av laggtiden på fortrinnsvis minst 2 minutter (eller ca. 4% eller mer). Mest foretrukket er området 5-25 minutter (eller ca. 10-50%). I tillegg er preparatet effektivt (etter oral fortæring) med hensyn til å redusere mengden av lipidperoksyder i plasma hos mennesker (fastslått ved metoden til Gorog ef al, 1994) beskrevet nedenunder.

Preparatene omfatter gjeme polyfenoler (inklusive flavonoler) oppnådd fra druer (hele druer eller deler derav, f.eks. skinn eller saft), vin (spesielt rødvin, som omfatter meget høyere konsentrasjoner av polyfenoler enn hvitvin), eller biprodukter og/eller avfallsprodukter fra vinfremstillingen, f.eks. "pomace" (dvs. rester av knuste druer etter saftekstraksjon) eller mask (faste avfallsstoffer som blir igjen etter innledende gjæring). Imidlertid er slike polyfenoler som flavonoler til stede i et bredt område av naturlig forekommende materialer, hvorav mange inneholder et høyere flavonolinnhold enn rødvin og således kan oppvise mer passende kilder for flavonol. Eksempler på slike materialer inkluderer: frukt generelt, f.eks. epler (f.eks. "Graven-steiner"), spesielt epleskrell; pærer (f.eks. var, "Williams Christs"); paprika (f.eks. var. "Yolo wonder"); rød rips; solbær (spesielt foretrukket da de er relativt rike på flavonoler): sitroner; kirsebær; tranebær; stikkelsesbær; tomater; oliven; og grønnsaker generelt, inklusive: reddiker (f.eks. var. "Saxa treib"); kålrabi (f.eks. var. "Primavera"); neper; poteter: løk; og asparges.

I en spesiell utførelsesform stammer preparatet fra en rødvin og omfatter en representativ profil av i alt vesentlig alle polyfenylforbindelser som er til stede i vinen (typisk, skjønt ikke nødvendigvis, til stede i preparatet i alt vesentlig i de relative mengder som er representative for den i vinen som preparatet stammer fra). Et slikt preparat kan refereres til som en "total polyfenol "pool"".

Polyfenoler kan bekvemt oppnås fra rødvin eller andre polyfenolholdige væsker ved absorpsjon på en kromatografisk harpikskolonne, med eluering av den polyfenolanrikete fraksjon fra kolonnen (typisk etter et vasketrinn) ved anvendelse av et 40-50% etanol-elueringsmiddel, eller andre egnete organiske løsningsmidler (f.eks. metanol, aceton, etylacetat, dimetylenklorid og kloroform - som kan være i vandig løsning). Det organiske løsningsmiddel er fortrinnsvis relativt flyktig (dvs. med et kokepunkt på mellom 30 og 85° C ved 760 mm hg trykk) og drives derfor lett av og etterlater et i alt vesentlig tørt (dvs. mindre enn 10 vekt% H20) fast materiale som omfatter polyfenoler. En slik metode kan med hell anvendes for oppnåelse av en total polyfenol-"pool<n> fra rødvin.

Alternativt kan polyfenoler oppnås fra rødvin eller annen polyfenolholdig væske ved løsningmiddelekstraksjon med et passende organisk løsningsmiddel som er ublandbart med vinen eller den annen væske. Alternativt kan polyfenoler oppnås fra polyfenolholdige faststoffer ved løsningsmiddelekstraksjon (typisk ekstraksjon med et organisk løsningsmiddel som f.eks. etanol eller etylacetat) - faststoffet kan deretter bli separert fra løsningsmiddelet ved filtrering eller sentrifugering. Løsningsmiddelet kan så bli inndampet og vil da etterlate et i alt vesentlig tørt, fast materiale som omfatter polyfenoler.

I foretrukne utførelsesformer presenteres preparatet som en mattilsetning. Dette kan være en substans for tilsetning som en ytterligere ingrediens under produksjon av matvaren, eller kan være en separat substans for konsumering av et invidivid (f.eks. som tablett eller kapsel) i alt vesenlig isolert fra (dvs. ikke blandet med) andre matkomponenter før fortæring (skjønt tabletten eller kapselen naturligvis kan tas sammen med mat). Det beskrives et produkt, spesielt en matvare, som omfatter et preparat i overensstemmelse med oppfinnelsen. Alternativt kan preparatet presenteres som et fast stoff som tillages som en drikk ved blanding med et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel (f.eks. melk, vann eller en annen vandig væske).

Doseringen av preparat som gis til en person, er avhengig av graden av aktivitet hos materialet, men vil ligge mellom 10 mg og 10 g pr. dag. For den totale polyfenol-pool som oppnås fra rødvin, er den foretrukne dose 0,1-4,0 g/dag, og mer foretrukket 1-2 g/dag, ekvivalent med 0,5 til 1 liter rødvin pr. dag. Den foretrukne dose flavonol vil ligge i området 0,1-1000 mg pr. dag, fortrinnsvis i området 0,5-

500 mg pr. dag, mer foretrukket i området 1-250 mg pr. dag.

Fagmannen på området vil være i stand til å benytte preparatet av polyfenoler som oppnås fra vin, druer eller vin-biprodukter og fraksjonerer dette videre for oppnåelse av preparater med mer konsentrert aktivitet. Dette kunne foretas ved kolonnekromatografi, løsningsmiddelekstraksjon, molekylsikter med semipermeable membraner, eller andre metoder som konvensjonelt anvendes i matvareindustrien. Fordelen er at vekten av aktiv substans er mindre, og fargen og smaken på tilsetningen blir modifisert på en velgjørende måte.

Preparater i overensstemmelse med oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av de aktive polyfenolmidler i overensstemmelse med konvensjonell mattilsetnings- eller farmasøytisk praksis. Fortynningsmidlene, eksipientene eller bærerne osv. som kan anvendes, er velkjente på dette fagområde, og den form som velges for ethvert spesielt regime vil avhenge av den gitte kontekst og produsentens valg. Generelt vil dosen avhenge av konsentrasjonen av polyfenoler i preparatet, samt identiteten av de aktuelle polyfenolforbindelser.

Videre kan preparatene omfatte hvilket som helst antall ytterligere komponenter, f.eks. slike som typisk anvendes i matvareindustrien og/eller i den farmasøyt-iske industri. Slike komponenter kan inkludere næringsstoffer (spesielt sporelementer og vitaminer), antioksydanter, terapeutiske substanser (spesielt slike som har en terapeutisk effekt i forhold til forhindring og/eller behandling av CHD, spesielt aspirin), smaksstoffer og søtningsstoffer (spesielt kunstige søtningsstoffer, f.eks. aspartam etc).

Eksempler på ovenstående inkluderer følgende: et karotenoid, f.eks. lutein, lycopen eller a- og/eller p-karoten; antioksydantnæringsstoffer eller anti-inflamma-toriske midler, f.eks. vitamin A, vitamin C, vitamin E (a-tokoferol og andre aktive tokoferoler), folsyre, selen, kopper, sink, mangan, ubikinon (koenzym Q10), salisylsyre, 2,3-dihydroksybenzosyre og 2,5-dihydroksybenzosyre.

Antioksydanter, f.eks. karotenoider og vitamin E, blir delvis ødelagt i mage-/tarmkanalen ved oksydasjon. Ved innlemmelse av disse forbindelser i preparatet i henhold til oppfinnelsen menes det at denne prosess inhiberes og at flere antioksydanter blir absorbert. Anvendelse av et preparat som omfatter a-tokoferol og/eller aspirin er spesielt foretrukket siden det menes at en slik blanding gir en synergistisk effekt i nærvær av polyfenoler.

Typisk passende daglige doser av disse ytterligere komponenter i preparatet (og som derfor kan inkluderes i preparatet slik at normalt inntak av preparatet vil gi den riktige dose) er som følger:

I en utførelsesform har således preparatet form av kapsler, idet hver kapsel inneholder 500 mg polyfenolpreparat, med et foreslått inntak på 1-4 kapsler pr. dag. En annen presentasjon er som en ikke-alkoholisk drikk som gir en effektiv dose av polyfenoler når den er oppløst i vann (med eller uten gass) smaksatt og søtet etter ønske, eller oppløst i en fruktsaft, f.eks. av drue, eple eller appelsin osv.

Seiv om det foretrekkes av en rekke grunner (f.eks. sosiale, religiøse og økonomiske) å tilveiebringe en alkoholfri drikk som omfatter preparatet i henhold til oppfinnelsen, kan slike drikker forsterkes med alkohol (f.eks. fra vodka, gin, whisky) for å gi et ønskelig nivå av 5-15% alkohol avhengig av forbrukerens smak.

Andre presentasjoner er som matingrediens i meieriprodukter, f.eks. melk og yoghurt, konserveringsmidler og diettprodukter ment som måltidssupplement eller-erstatning. De ovennevnte eksempler er bare for illustrasjon.

I et andre aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således en fremgangsmåte for fremstilling av en drikk, kjennetegnet ved at den omfatter å blande et preparat i overensstemmelse med hvilket som helst av kravene 1-12, med en fysiologisk akseptabel væske. Foretrukket vil den fysiologisk akseptable væske omfatte vann, en vandig løsning, en alkoholisk løsning, fruktsaft, melk eller yoghurt.

Vi har funnet at ikke bare inhiberer oralt inntak av preparatet i henhold til oppfinnelsen oksydasjon av plasma-LDL, men preparatet vil også ha effekten av å stimulere produksjon av transformingsvekstfaktor (TGF)-B in vivo. I tillegg har vi funnet at oralt inntak av preparatet i henhold til oppfinnelsen vil inhibere blodplateaggregering og/eller stimulere fibrinolyse og derved senke den trombotiske tendens hos et individ, noe som er til hjelp med hensyn til å forhindre og/eller behandle trombotiske sykdommer, f.eks. CHD og slag. Spesielt finnes inntak av preparatet å øke nivået av tPA-aktivitet i plasma (gjerne målt ved hjelp av slike assays som "Chromolize"-assay [tilgjengelig fra Biopool, Sverige] som er beskrevet nedenfor), hvis effekt er å øke nettoraten av fibrinolyse hos personen.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen i et tredje aspekt en anvendelse av et preparat som angitt i hvilket som helst av kravene 1-12, for produksjon av et medikament for konsumering av et menneske for å bevirke et eller flere av følgende i personen: inhibering av oksydasjon av plasma-LDL i personen, stimulering av TGF-B produksjon; inhibering av piateaggregasjon og stimulering av fibrinolyse.

Preparatet i overensstemmelse med første aspekt av oppfinnelsen til typisk overdra alle de ovennevnte egenskaper til en person som inntar preparatet. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor også en anvendelse av preparatet for fremstilling av et medikament for oral fortæring av en person for formålet å effektuere et eller flere av følgende i personen: inhibering av oksydasjon av plasma-LDL; inhibering av blodplateaggregering; stimulering av fibrinolyse; og stimulering av TGF-B-produksjon; idet fremgangsmåten oppfatter å fremstille et preparat i overensstemmelse med det første aspektet av oppfinnelsen; om nødvendig, å blande preparatet med en fysiologisk akseptabel eksipient eller bærer; og fremstille enhetsdoser av preparatet. Egnede fremgangsmåter for fremstilling av medikamentene er velkjente for fagmannen på dette område.

Medikamenter som har denne effekt, kan ha form av mattilsetninger eller ingredienser, som forklart ovenfor, og bør være nyttige ved forhindring eller behandling av koronar-hjertesykdom. Egnede doser av medikamentene, som forklart tidligere, vil avhenge av konsentrasjonen og identiteten av polyfenolene i preparatet, og av alvorligheten av sykdomstilstanden hos den person som skal behandles. Imidlertid, som en generell rettesnor, bør dosen fortrinnsvis være tilstrekkelig til å gi den samme mengde polyfenolinntak som det som tilveiebringes ved inntak av minst ett glass vin pr. dag (tilnærmet ekvivalent med 0,25 g av den totale polyfenol-pool fra rødvin), men mer foretrukket ca. 0,5-1,0 I rødvin pr. dag (dvs. ca. 1,0-2,0 g totalt vin-polyfenol).

Det er et annet formål med oppfinnelsen, å tilveiebringe et aktivt polyfenolpreparat (passende avledet fra druer, vin eller vin-btprodukter) for behandling av koronar-hjertesykdom og andre sykdommer som er assosiert med glattmuskelcelle-proliferasjon så som aterosklerose, restenose, slag og neoplasi i innvoller og uterus, uterinfibroid eller fibroma.

Vi har overraskende funnet at det er mulig å fremstille et polyfenolpreparat (f.eks. fra rødvin) som, når det gis oralt til et menneske, vil stimulere produksjon av total og aktivTGF-p-1.

Det er demonstrert at når rødvin eller et preparat av polyfenoler oppnådd fra rødvin tilveiebringes som et pulver eller en drikk og administreres oralt til mennesket, er det en økning i plasma av totalt og aktivt TGF-B-1. Hvitvin som inneholder lite av polyfenoler, er inaktiv.

Oppfinnelsen beskrives videre ved illustrerende eksempel og med referanse til de ledsakende tegninger, hvor: Figur 1 viser kurver for LDL-oksydasjon mot tid (minutter); Figur 2 er en skjematisk representasjon av kjernestrukturen av flavoner; Figur 3 er en skjematisk representasjon av kjernestrukturen av flavonoler; Figur 4 er en skjematisk representasjon av kjernestrukturen av gallesyre; Figur 5 er en skjematisk representasjon av kjernestrukturen av antocyaniner; og

Figur 6 er en skjematisk representasjon av strukturen til resveratrol.

Eksempel 1 Fremstilling av polyfenolpulver fra rødvin

Ca. 2000 liter rødvin (fransk 1993 Cabernet Saugvignon) ble filtrert for fjerning av sediment og destillert under vakuum ved 300 millibar trykk ved 75 til 80° C i ett minutt, deretter avkjølt og konsentrert under vakuum ved 55° C og så avkjølt hurtig ned til 25° C. Den konsentrerte vin ble ført gjennom en kolonne (55 cm diameter, tilnærmet 2 meter høy) som inneholdt 65 liter Diaion HP-20 harpiks. Kolonnen ble vasket med 250 liter destillert vann og polyfenolene eluert ca. 250 liter av 50% etanol, over en periode på 150 minutter eller så. Ved slutten av denne tid var eluatet fritt for polyfenoler, målt ved Folin-Ciocalteu-metoden (beskrevet av Singleton & Rossi, 1965). Eluatet ble deretter konsentrert til 35% tørrstoff under vakuum destillasjon og forstøvningstørket under nitrogen slik at det ble produsert ca. 2 kg pulver med et fuktighetsinnhold på 3 til 4%.

Polyfenolpulveret er en utmerket matingrediens med mørkerød farge når det blir oppløst i vann eller vandig alkohol, det er fullstendig velsmakende og gir et "stikk" mot ganen i likhet med rødvin. Den anbefalte dagsdose er 1-2 g/dag.

Typisk sammensetning av polyfenolpulveret sammenlignes nedenunder med polyfenolinnholdet i rødvin. Sammenlignet med rødvin inneholder polyfenolpulveret proporsjonalt mer av proantocyaninene enn de andre polyfenoler, men bevarer vesentlig den relative rikelighet av de forskjellige polyfenoler.

Sammensetning av rødvin og polyfenolpulver

Eksempel 2

Studier med frivillige ved anvendelse av vin-polyfenoler ble utført for å bestemme antioksydantaktiviteten til.rødvin og hvitvin og polyfenolpreparater hos friske frivillige.

Personer og metoder:

26 friske menn, alder 35 til 65, som var ikke-røkere, som konsumerte en standard UK-diett, deltok i en privat og konfidensiell studie. To uker før studien sluttet de frivillige å fortære vin. Alle de frivillige ble bedt om å opprettholde sin vanlige diett og levestil under studien. De frivillige ble inndelt i grupper som konsumerte de følgende vin- eller teprodukter med måltider i to uker i de mengder som er vist i tabell 1. Rødvinen var Cabernet Sauvignon (1993), og hvitvinen var fra området Narbonne, Frankrike. Vinen som ble skaffet til veie under studien, varden eneste vin som ble tillatt under forsøksperioden. I tillegg ble de samme personer gitt polyfenolpulver fremstilt av samme sats av rødvin som ble anvendt i studien. Pulveret ble lagret ved -h20° C (PP1) og en frisk prøve fremstilt i juni 1996 (PP2). Studiene begynte ved begynnelsen av september 1995 og varte ca. ett år.

Gruppetestsu bstans

1) Cabemet Sauvignon rødvin (375 ml), innholdende polyfenoler 1,8 g/l

2) Vin ordinær hvitvin (375ml), inneholdende polyfenoler 0,2 g/l

3) rødvin pp pulver (fremstilt av samme vin som ble gitt til gruppe 1), 1 g i to gelatinkapsler

4) hvitvin som i løsning inneholdt 1 g rødvin-polyfenoler (se nedenfor)

5) vodka og limonade (10 vol.% alkohol) 400 ml pr. dag

6) 50 mg/dag antocyaniner, som drueskinnekstrakt (Sefcal, St. Julien de

Peyrolas, Frankrike) gitt som en drikk

7) rødvin mask (French Paradox™, Arkopharma, Nice, Frankike) gitt som kapsler (3 pr. dag), hvor hver kapsel omfattet 250 mg mask 8) druefrø-proantocyanidiner, som Endotelon™-kapsler (Sanofi-Winthrop,

Frankrike) (3 pr. dag), hvor hver kapsel omfattet 150 mg proantocyanidin

9) grønn teekstrakt (Polyphenon™, Mitsui Norin, Fujieda, Japan), 3 kapsler pr. dag, hvor hver kapsel omfattet 100 mg tecatekiner som følger: 1,6% gallo-catekin, 19,3% epigallo-catekin, 6,4% epicatekiner, 59,1% epigallo-catekingallat og 13.7% epicatekin-gallat

Blodprøver ble tatt i K3 EDTA (1 mmol/l) 12 timer etter aftensmåltidet, før og ved slutten av perioden for vinproduktkonsumering. Prøvene ble sentrifugert ved 1000 x G i 15 minutter ved 4° C for oppnåelse av plasma. LDL ble separert ved densitetsgradient-ultrasentrifugering ved anvendelse av et Beckman-instrument, benketoppmodell Optima TLX med en TLA 100,4 rotor/(Beckman, Palo Alto, CA), som følger: natriumbromid ble tilsatt til plasma til en densitet på 1,3 g/ml og sjiktdannet under en løsning med densitet 1,006 g/ml. Sentrifugering fant sted ved 100.000 OPM i 20 minutter ved 4° C. Det oransje-gule LDL-bånd ble fjernet og sentrifugert med løsninger med densitet 1,154 og 1,063 g/ml i 30 minutter ved 100.000 OPM ved 4° C.

Det synlige LDL-sjikt ble fjernet og dialysert med 10 mM fosfatpufret salt-løsning med 2 u,M EDTA i en time ved anvendelse av en dialysekasett (Pierce Slide-A-Lyzer, Perstorp Biotec Company, USA) ved 4° C i en time, deretter med 10 mM fosfatpufret saltoppløsning natten over.

Totale polyfenoler ble bestemt i plasma og i LDL-fraksjonen ved metoden til Singleton og Rossi (1965). Kort sagt ble totale polyfenoler i plasma og LDL målt ved å ta 125 |il plasma eller 400 \ i\ LDL, og fylle opp til 500 \ i\ med vann. Denne blanding ble tilsatt 2,5 ml Folin-reagens (fortynnet 1:10) og 2,0 ml natriumkarbonat (75 g/l). Etter å ha blandet løsningen godt, ble den inkubert ved romtemperatur i 2,5 timer og deretter sentrifugert ved 2.500 opm i 8 minutter. Den optiske densitet for supematanten ble mål ved 765 nm. Gallesyre ble anvendt som standard for sammenligning.

Protein ble bestemt ved Bradford-metoden (Bradford, 1976) ved anvendelse av et sett som inneholdt Bioquant-reagens (Merck, Darmstadt, Tyskland).

To uavhengige metoder ble anvendt for å bestemme antioksydantaktivitet.

1) Kopperoksydasjon av LDL

Lipoproteinet (50 mg LDL protein/l) ble inkubert i nærvær av koppersulfat (5 mM) ved 37° C i 5 timer. Konjugert diendannelse ble kontinuerlig overvåket ved måling av økningen i absorbanse ved 234 nm og laggtiden før diendannelse bestemt i henhold til metoden til Esterbauer et al. (1989). Figur 1 viser en kurve for konjugert diendannelse (målt ved absorbanse på 234 nm) mot tid (i minutter). Typiske kurver er illustrert for prøver tatt ved begynnelsen av forsøket (0) og etter to uker. Laggfasen er målt ved ekstrapolering av den lineære del av avsetningene nedover x-aksen (vist ved de stiplede linjer). Fortrinnsvis vil fortæring av preparater i overensstemmelse med oppfinnelsen resultere i en økning i laggfasetid på 2 minutter eller mer.

2) Plasmalipidperoksyder

Alle plasmalipider og lipoproteiner ble selektivt fjernet ved anvendelse av PHM-L-liposorb (Calbiochem-Novabiochem UK). Tørt PHM-L-liposorb (20 mg) ble suspendert i 0,25 ml 150 mM natriumklorid som inneholdt 10 mM natriumcitrat i et 2 ml brunt mikrosentrifugerør, innholdet ble omrørt og tillatt å likevektinnstille seg i 5 minutter. Plasma (0,5 ml) eller saltløsning (blindprøve) ble deretter satt til liposorb-suspensjonene, omrørt og rørene anbrakt på en roterende mikser i 15 minutter. Etter sentrifugering (12.000 x G i 1 min.) ble supematanten slått ut og liposorbgelen vasket to ganger med 1,5 ml saltløsning fulgt av omrøring og sentrifugering. Den vaskede liposorbgel ble suspendert i 1,5 ml kolesterol-oksydase-iodidreagens (BDH-Merck) og anbrakt på en roterende mikser og omrørt i 60 minutter. Etter sentrifugering (12.000 x G i 3 min.) romtemperatur ble den optiske densitet for den klare supernatant målt i et spektrofotometer ved 405 nm mot en blinkprøve med saltløsning (Gorog et al, 1994).

Konsumering av preparater i overensstemmelse med oppfinnelsen vil fortrinnsvis resultere i en senkning i plasmalipidperoksydkonsentrasjon på minst 0,1 |imol/g protein.

Resultater

De oppnådde verdier ble sammenlignet før og etter behandling. Tabell 1 oppsummerer resultatene som er gitt i detalj i tabellene 2 til 6. Som vist i tabell 1, viste de produkter som inneholdt rikelig av vinpolyfenoler (rødvin, PP1, PP2, hvitvin + PP1) økning i polyfenoler i plasma og LDL og antioksydantaktivitet i LDL, målt ved testene 1 og 2 ovenfor.

De to polyfenolpulvere (PP1, PP2) ga resultater av samme størrelsesorden som den ekvivalente mengde rødvin.

Det var ingen effekt med hvitvin, antocyaninpulver (Sefcal™, ekstrakt fra drueskinn anvendt som matfarge) rødvin-<n>pomace" French Paradox™-kapsler (Arkopharma) eller Endotelon™ (Sanofi-Winthrop, et proantocyanidinpreparat fra druefrø), og heller ikke med ekstrakten av grønn te Polyphenon™) som inneholdt catekiner og deres estere.

Det aktive polyfenolpreparat inneholdt pool'en av alle polyfenolene i rødvinen og ble omhyggelig forarbeidet for å unngå at de ble oksydert. Videre ble det vist at polyfenolinnholdet i plasma og isolert LDL ble hevet hos de personer som fikk rødvin eller polyfenolpulver oppnådd fra rødvin eller drueskinn.

Til bekreftelse av antioksydantaktiviteten til preparatet ble en annen assay anvendt ved hvilken plasma ble behandlet med en absorbentharpiks som fjernet lipider og lipoproteiner, og innholdet av lipidperoksyder ble bestemt i harpiksen. Innholdet av lipidperoksyder ble senket i de personer som fikk rødvin eller polyfenolpreparatet. Igjen var størrelsesorden av effekten av polyfenolpulveret ekvivalent med mengden av rødvin som det var oppnådd fra.

Disse forsøk viser som konklusjon at polyfenoler blir absorbert etter inntak av rødvin og viser seg i plasma og LDL, og at polyfenoler isolert fra vin kan ha en lignende effekt. Videre har de absorberte polyfenoler kraftig antioksydantaktivitet. Virkningsmodus for polyfenolene kan være forskjellig. Primært kan de sekvestere metallioner, f.eks. kopper og jern, som påskynder produksjon av lipidperoksyder in vivo. Disse chelaterte ioner er inaktive som pro-oksydanter. Polyfenoler omfatter, på grunn av deres høye innhold av hydroksygrupper, kjemiske strukturer som er kjent for å chelatere metallioner og ødelegger således deres katalytiske egenskaper.

En annen virkning kan være som en offersubstans som blir oksydert før LDL, slik det er tilfelle for a-tokoferol. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til noen spesiell virkningsmodus.

For å undersøke viktigheten av fjerning av EDTA fra preparatet før kopper-katalysatoroksydasjon, ble det gjort en sammenligning ved anvendelse av dialyse med og uten EDTA, og en harpikskolonnemetode. Når EDTA tilsettes dialysatet, inntraff ikke forlengelse av den laggtid som ble produsert av rødvin-polyfenolpulver og var heller ikke markert redusert. Dialyse uten EDTA og kolonnemetoden ga lignende resultater. Svikt hos tidligere forfattere (de Rijke et al, 1996) med hensyn til å oppnå en effekt av rødvin hos frivillige, kan forklares med nærvær av EDTA i deres preparater som ble anvendt for kopperkatalysert oksydasjon.

Konklusjoner

Antioksydantaktiviteten av 1 gram vinpolyfenolpulver er ekvivalent med en halv flaske rødvin. En daglig dose på 1-2 g polyfenolpulver ville ha potensiell profylaktisk aktivitet mot koronar-hjertesykdom. Andre produkter, så som drueskinnekstrakt som anvendes i matvareindustrien som fargemiddel, et proantosyanidinpreparat, (French Paradox-kapsler og en grønn teekstrakt som inneholder catekiner og deres estere, var inaktive.

Eksempel 3

Det ble laget en kapsel av følgende ingredienser ved enkel sammenblanding og rutine-innkapsling:

To til fire kapsler tas daglig med eller etter måltider.

Eksempel 4

Det ble laget en kapsel av følgende ingredienser ved enkel sammenblanding og rutine-innkapsling:

Minst tre kapsler pr. dag bør tas ved måltider.

Eksempel 5

Ett gram vinpolyfenolpulver tilsettes tørrpulver-formeldiettpreparat som tilveiebringer 405 kcal pr. dag (42 g protein, 43 g karbohydrat og 8 g fett, RDA av vitaminer og mineraler) solgt i detalj under handelsnavnet Cambridge Diet (Cambridge Health Plan Ltd. Norwich, UK). En dags leveranse (3 måltider/dag) tilveiebringer et inntak polyfenoler som er ekvivalent med 0,5 I rødvin/dag.

Eksempel 6

0,5 g total polyfenol-pool oppnådd fra rødvin tilsettes 250 ml vanlig yoghurt med jordbærsmak og søtningsmiddel. Det rødfargede polyfenolmaterialet forsterker utseendet til yoghurten og gir en sterkt velsmakende matvare med helsefordeler.

Eksempel 7

Følgende resept er for en ikke-alkoholisk drikk tilveiebrakt som pulver som skal blandes med vann. 53 g av pulveret blir oppløst i 1 liter vann. En servering på 250 ml gir 0,75 g aktive polyfenoler.

Eksempel 8

Følgende er en alkoholisk drikk levert som en drikkeferdig miks på flaske.

Polyfenolen oppløses i den flate (avgassete) tonic-miks og gasses deretter med karbondioksyd under trykk slik at man får en luftet drikk. Alikvoter på 540 ml blir dispensert i flasker, Vodka tilsatt og flasken forseglet med en skrukork.

Eksempel 9

Ca. 2000 kg "pomace" oppnådd fra hvite druer ble godt omrørt i en kommersiell mikser med 2500 I destillert vann ved 30° C i fire timer. Blandingen ble deretter fjernet fra mikseren og anbrakt i en tank og tillatt å sette seg i to timer, supematanten ble så tappet av og filtrert slik at man fikk en klar væske. Samme prosess ble så anvendt som i eksempel 1 for absorpsjon av polyfenolene på harpiksen ved anvendelse av samme mengder av Diaion HP-20-harpiks og elueringsløsningsmiddel.

Ved konsentrering av den vandige etanolløsning til 35% tørrstoff fremkom det et rødfarget fast stoff som veide tilnærmet 600 g. Dette var løselig i 10% vandig alkohol og ble deretter forstøvningstørket, slik at man fikk et faststoff som var uløselig i vann, men løselig i vandig alkohol. Den gjenværende løsning ble deretter forstøv-ningstørket under nitrogen slik at man fikk 1,4 kg av et rødfarget materiale som inneholdt ca 50% polyfenoler. Sammensetningen av dette var lik det som ble oppnådd i eksempel 1.

Denne metode har den ulempe at prosessen for å oppnå ekstrakten før absorpsjon på harpiksen er vanskeligere og mer tidkrevende. Selv om utbyttet er mindre, har tilgjengeligheten på drueskinn på billig måte kommersielle fordeler.

Den pulveriserte drikk ble rekonstituert og administrert tii 5 frivillige i to uker etter den protokoll som er beskrevet i eksempel 2. Resultatene i den kopperkatalyserte LDL-oksydasjonsassay var som følger:

Det konkluderes med at en ekstrakt av drueskinn (i dette tilfelle hvite druer), dvs. "pomace", kunne være en effektiv antioksydant ved oralt inntak i 2 uker.

Eksempel 10

Plasma-LDL, (fra skaren av frivillige som er beskrevet i eksempel 2) ble separert ved ultrasentrifugering og dialysert mot fosfatpuffer som beskrevet i eksempel 2. Polyfenolholdige substanser ble analysert med hensyn på polyfenolinnhold ved metoden til Singleton & Rossi (1965). Plasma-LDL (0,05 LDL i 1,0 ml) ble inkubert med 100 jil koppersulfatløsning (endelig konsentrasjon 5 \ iM ved 37° C og laggtiden bestemt ved den kopperkatalyserte dien-assay, som beskrevet i eksempel 2. Evnen hos de polyfenolholdige substanser til å forlenge laggtiden in vitro ble bestemt ved å tilsette 4 \ ig polyfenolsubstans til 1 ml av LDL før tilsetningen av koppersulfatet. De festete substanser var som følger:

Resultatene oppnådd in vivo ved oral konsumering av testsubstansene i

2 uker sammenlignes med in v/fro-resultatene i tabell 7 nedenfor. In v/fro-resultatene er et middel av fire bestemmelser. Laggtiden ble øket med alle substanser tilsatt ved et nivå på 4 ug/ml. Rekkefølgen for størrelsesorden av effekt som ble observert, var: polyfenolpulver = antocyaniner > catekiner fra grønn te > proantocyanidiner fra druefrø > rødvin > hvitvin > rødvinmask.

Hvis substansene ble tatt oralt og LDL separert og testet som beskrevet i eksempel 2, ga bare rødvin og rødvinpolyfenoler forlengelse av laggtiden, mens alle de andre polyfenolholdige substanser var inaktive. Dette viser tydelig at det er umulig å forutse in wVo-effekten av en substans fra in Wfro-resultater. Mangel på aktivitet hos de fleste av substansene in vivo kan skyldes deres mangel på absorpsjon fra tarmen, eller svikt med hensyn til å bli inkorporert i LDL.

Eksempel 11

Tyve av de ovenfor omtalte frivillige fra eksempel 2 ble inndelt i grupper (A og B) på 6-9 personer og ble i to uker gitt: A) En drikk med solbærsmak (330 ml) som inneholdt 1 g totale rødvinpolyfenoler og var blandet med et kommersielt tilgjengelig pulver (sukker, sitronsyre, natriumcitrat, aspartam, syntetisk aroma; Cambridge Manufacturing Co Ltd,

Corby, UK) som var tilsatt vann umiddelbart før fortæring; eller

B) Kapsler inneholdende rødvinpolyfenolpulver som fremstilt ovenfor, i en dose på 2 g rødvinpolyfenoler/dag.

Produktene ble likt oppdelt og tatt etter lunsj og middag.

Ptasmaprøver ble oppnådd og sentrifugert i en ultrasentrifuge for oppnåelse av LDL som beskrevet i eksempel 2.

Tre metoder for behandling av LDL før oksydasjon ble anvendt som angitt nedenunder.

a) Sluttdialyse uten EDTA

LDL ble dialysert med 10 mm fospatpuffer-saltløsning som inneholdt 2 ^iM EDTA i en

time ved anvendelse av en dialysekasett (Pierce Slide-A-Lyzer Perstorp Biotec Company, USA) ved 4° C i en time, deretter med 10 mm fosfatpuffer-saltløsning natten over.

b) Kontinuerlig dialyse med EDTA

LDL ble fjernet og dialysrt ved 4° C som ovenfor, med unntakelse av at dialyse

gjennomgående var med 10 uM EDTA i 10 mm fosfatpufret saltløsning.

c) Kolonnebehandling

LDL ble ført gjennom en EcNo-pac 10 DG avsaltingskolonne (Bio-Rad Labs,

UK). Kolonnen ble vasket to ganger med behandlet 10 mm PBS [chelex-100 harpiks (Bio-Rad- UK), 5 g/l PBS mikset og dekantert). 600 ul LDL ble deretter fylt i kolonnen og eluert med 3 ml PBS-puffer ved en strømingshastighet på 0,6 ml/min. ved anvendelse av en Ismatec IPC peristaltisk pumpe (Ismatec, Weston Super Mare,

UK).

Kopperkatalysert peroksydasjon ble deretter utført og laggtiden målt som i eksempel 2. Resultatene er vist i tabell 7.

Rødvinpolyfenolfortæring enten som drikk (1 g/dag) eller kapsler (2 g/dag) produserte en økning i laggtid (når EDTA var utelatt fra det endelige dialysat) på 30% resp. 21% og også ved kolonnemetoden på henholdsvis 12 og 22%. Tilsetning av EDTA til dialysatet opphevet effekten med 1 g/dag rødvinpolyfenoler og ga bare en liten økning i laggtid på 7% med 2 g/dag.

Doseringen av polyfenolpreparat er avhengig av graden av aktiviteten av materialet, men vil ligge mellom 10 mg og 10 g pr. dag. For den totale polyfenol-pool som oppnås fra vin, er den foretrukne dose 0,1 - 4 g/dag og mer foretrukket 1 -

2 g/dag ekvivalent med 0,5 til 1 liter rødvin pr. dag.

Eksempel 12

Rødvin, hvitvin og et preparat av polyfenoler oppnådd fra rødvin (som beskrevet tidligere i eksempel 1) i form av et pulver eller en drikk gitt oralt til mennesker, er studert med hensyn på effekt på plasma-TGF-B.

Friske frivillige (30 menn med alder 35-65 år) ble bedt om å stanse vinkonsumering i to uker. De ble gitt enten 375 ml rødvin eller hvitvin eller 1 g total pool av rødvinpolyfenoler (fremstilt av den samme Cabernet Sauvignon-vin som ovenfor) enten som kapsler eller som en smaksatt drikk i 330 ml vann. Hver supplering ble konsumert to ganger daglig etter måltider i et tidsrom av to uker.

Blodprøver ble tappet inn i K3 EDTA (1 mmol/l) etter behandling og sentrifugert for oppnåelse av plasma, som ble lagret ved -70° C før analyse. Total-plasma-polyfenoler ble målt ved metoden til Singleton og Rossi (1965). Total-TGF-B-1 ble bestemt ved immunoassay ved anvendelse av to forskjellige polyklonale antistoffer (metoder 1 og 2, beskrevet nedenunder).

Metode 1

Total (latent + aktiv) TGF-B målt av et Quantikine ® menneskelig TGF-B-sett levert av R&D system (Abingdon, Oxford, UK). Denne assay anvender den kvantitative sandwich-immunoassayteknikk. TGF-p-løselig reseptortype II binder TGF-p-1 som er blitt forhåndsbelagt på en mikrotiterplate. Standarder og prøver blir pipettert inn i brønnene, og eventuelt TGF-B-1 som er til stede, blir bundet av den immobiliserte reseptor. Etter bortvasking av eventuelle ubundne substanser tilsettes et enzym-forbundet polyklonalt antistoff som er spesifikt for TGF-p-1 til brønnene for å sandwich-danne TGF-p-1 som er immobilisert under første inkubering. Etter en vasking for å fjerne ubundet antistoff-enzymreagens tilsettes en substratløsning til brønnene som produserer en farge med enzymet. Intensiteten av fargen som utvikles, er proporsjonal med tilstedeværende TGF-p-1.

Før denne assay utføres, blir TGF-p omdannet til den aktive form ved tilsetning av eddiksyre og urinstoff, inkubering i 10 minutter og deretter nøytralisering med natriumhydroksyd/HEPES-løsning. Metoden anslår latent + aktiv TGF-p-1. Aktivering av latent TGF-p ble utført på følgende måte: til 0,1 ml plasma settes 0,1 ml av 2,5 N eddiksyre/10 M urinstoff, dette blandes godt og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur. Til denne løsning tilsettes 0,1 ml av 2,7 N NaOH/1M HEPES for å nøytralisere prøven, og dette blandes godt. Før analysen ble den aktiverte plasma-prøve fortynnet 10 ganger med kalibratorfortynningsmiddel-serum RD6M levert av produsenten av settet.

Assayprosessen var som følger: 200 ul av prøve eller standard ble tilsatt i hver brønn i mikrotiterplaten. Platen ble deretter dekket med en klebestrimmel av plastmateriale og inkubert i 3 timer ved romtemperatur. Hver brønn ble så aspirert og vasket tre ganger med 400 ul av vaskepuffer. 200 ul av TGF-p-1-konjugat ble deretter tilsatt i hver brønn, og platen ble igjen dekket med en ny klebemiddelstrimmel og inkubert ved romtemperatur i 110 minutter. Brønnene ble deretter aspirert og vasket tre ganger med 400 ul vaskepuffer. 200 ul substratløsning ble tilsatt i brønnene, og platen ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. 50 ul av 2 N H2S04-løsning ble deretter tilsatt i hver brønn, og den optiske densitet ble målt ved 450 nm.

Metode 2

I alt vesentlig samme metode ble anvendt som ovenfor, med unntakelse av at TGF-B ikke var aktivert før anslaget ble gjort, og istedenfor det polyklonale antistoff for TGF-p-1 ble et BDA-19-antistoff (R&D systems, Abingdon, Oxford, UK) anvendt. Denne metode anslår en aktiv form av TGF-p-1.

Fortrinnsvis vil konsumering av et preparat i overensstemmelse med oppfinnelsen produsere en økning av TGF-p-1-nivåer i personen med minst 1,5 ng/ml, bedømt ved metode 1, eller minst 0,5 ng/ml, bedømt ved metode 2.

Resultater

Som vist i tabell 8, ble plasma-polyfenoler øket i rødvin, men ikke med hvitvin, og med polyfenolkapslene og drikken. En økning i TGF-p-1 ble observert ved begge metoder i rødvin, og med polyfenolkapslene og drikken, men ikke hvitvin. Dette indikerer at rødvin-polyfenoler øker både den totale mengde latent + aktiv TGF-p-1 og en aktiv form av TGF-p-1. Det konkluderes at vinpolyfenoler øker total TGF-p-1 og har det potensiale å inhibere VSMC-proliferasjon.

Vi har i tillegg overraskende funnet at det er mulig å fremstille et polyfenolpreparat (f.eks. av rødvin) som, når det gis oralt til et menneske, vil inhibere blodplateaggregering og stimulere fibrinolyse.

Spesielt er det blitt demonstrert at når et preparat av polyfenoler oppnådd fra rødvin blir administrert oralt til et menneske, blir det en reduksjon i blodplateaggregering når arakidonsyre, ADP, kollagen eller trombin er brukt som agonister. Videre øker konsumering av polyfenolpreparatet tPA-aktivitet i plasma hos personen.

Doseringen av polyfenolpreparat er avhengig av graden av aktivitet av materialet, men vil ligge mellom 10 mg og 10 g pr. dag. Hvis preparatet omfatter den totale fenol-pool oppnådd fra rødvin, så er den foretrukne dose 0,1 tii 4,0 g pr. dag og mer foretrukket 1 til 2 g, som er ekvivalent med 0,5 -1,0 liter rødvin pr. dag.

Eksempel 13

Et rødvin-polyfenolpreparat ble laget som beskrevet tidligere (eksempel 1 ovenfor).

Dietten til 12 friske menn fra 35 til 65 år ble supplert med 2 g rødvin-polyfenoler (som beskrevet i eksempel 2) eller aspirin (75 mg) daglig i to uker. Fasting-citratblod ble oppsamlet som basislinje, og ved fire timer og to uker etter begynnelsen av forsøket, som følger: Blod ble oppnådd fra den antikubitale vene, med personen i tilbakelent stilling, ved anvendelse av minimal stasis, inn i en sprøyte som inneholdt 0,11 M citrat (1:9 volum/volum mot blod). Blodplaterikt plasma PRP ble laget ved sentrifugering av blod ved 250 G i 10 minutter. Det meste av PRP ble fjernet, og det blodplatefattige plasma (PPP) ble deretter fremstilt ved sentrifugering av restblodet ved 2.500 G i 15 minutter. Konsentrasjonen av blodplater i PRP ble bestemt i en celleteller (Minos STX, ABX Ltd, Montpellier, Frankrike). Prøver med en blodplatetelling utenfor området 150.000 til 350.000 pr. ul ble forkastet. PRP fikk hvile i minst 30 minutter før begynnelsen av aggregeringsstudiene. Tiden mellom blodoppsamling og blodplateaggregering var aldri mer enn tre timer.

Blodplateaggrering ble bestemt på de nypreparerte blodplater ved anvendelse av et PAP-4C aggregometer (BioData, Alpha Laboratories, Southampton, UK). En 100 ul-prøve av PRP ble tilsatt i en silikonisert kuvette og inkubert ved 37° C i 3 minutter. Aggregering ble indusert ved tilsetning av 20 ul av agonisten (en av følgende; arakidonsyre med 455 ug/ml; 1,8 umol/1, ADP, collagen med 43 ug/ml oppnådd fra BioData; trombin med 0,11 U/ml, oppnådd fra Sigma, Poole, Dorset, UK, alle er sluttkonsentrasjoner i aggregeringsblandingen). Blodplatesuspensjonen ble omrørt ved 1.000 opm ved 37° C i 5 minutter. Maksimal aggregering (prosent fra basislinje) ble bestemt innen dette tidsrom. Verdien var et mål på det aggregatoriske potensiale for blodplatene, en reduksjon som indikerer en anti-aggregatorisk respons ved sammenligning av prøver som er tatt før og etter konsumering av testmaterialet. Statistisk signifikans ble fastslått ved parring av t-testen.

Rødvin-polyfenolpulveret inhiberte blodplateaggrering enten akutt eller kronisk som vist i tabell 9. Disse effekter ligner dem, men er mindre enn dem som er observert med aspirin (75 mg pr. dag), med unntakelse av trombin. Spesielt antyder effekten av polyfenolene på arakidonat-indusert aggregering en inhibering av blodplate-syklo-oksygenase-aktivitet. Disse resultater antydet at rødvin-polyfenolene har aspirinlignende effekter, selv om det er en ekstra inhiberende effekt på trombin-indusert aggregering.

Den samme testen ble benyttet til å undersøke nivåene av PAI-1 og tPA aktivitet i individene. Blod ble oppnådd fra den antikubitale vene med individet i hvilende stilling under benyttelse av minimal stase, inn i en sprøyte inneholdende 0.5M citrat, pH 4,3 (Stabilyte™, 1:9 v/v til blod). Plasma ble fremstilt ved sentrifugering ved 2 500g i 15 minutter ved 4°C og frosset ved -70 °C umiddelbart.

Alle tre prøvene (basislinje, 4 timer og 2 uker) fra et individ ble raskt tint ved 37 °C på prøvedagen. tPA aktivitetene ble bestemt ved bruk av en kommersielt tilgjengelig test (Chromolize ™, fra Biopool, Umeå, Sverige) som er et biofunksjonelt immunosorbent assay. Prøve eller standard (100 ul) ble tilsatt til hver brønn. Mikrotiterplaten ble inkubert i en platerister i 20 minutter, etter hvilken innholdet i brønnene ble kastet, og brønnene vasket i 4 timer. Så ble 50 ul av substratløsningen tilsatt til hver brønn, fulgt av 50 ul av plasminogenreagens, og platen inkubert i ytterligere 90 minutter. Endelig ble 50 ul 1,7M iseddiksyreløsning tilsatt til hver brønn og blandet i 15 sekunder. Absorbansen ble målt ved 405 nm og aktiviteten til tPA i prøven ble avlest fra en lineær kalibreringskurve. Signifikansen av forskjellene fra basislinje-, 4 timer- og 2 uker verdier for hver behandling ble vurdert i en to-halet paret t-test. Resultatene er vist i tabell 10.

Enzymet tPA konstituerer et viktig protein i den fibrinolytiske reaksjonsveien og dets aktivitet er tenkt å spille en hovedrolle i det fibrinolytiske systemet. Den fysiologiske rollen til tPA er å aktivere plasminogen til plasmin, som degraderer fibrin til løselige fibrin-degraderingsprodukter. I testen av tPA er den spesifikke inhibitor PAI-1 vanligvis tilstede i store overskudd og må forhindres fra å stoppe tPA aktivitet. Dette tilveiebringes ved bruk av Stabilyte ™ blodoppsamlingsrør som bidrar til mild surgjøring av prøven.

Fordi PAI-1 verdiene er kjent å være gjenstand for diurnal variasjon ble en tilleggstest utført i hvilken de samme individene ble studert ved bruk av vann som placebo istedenfor rødvin polyfenoler. Resultatene er vist i tabell 11.

Rødvin-polyfenoler (2 g/dag) produserte en signifikant nedgang i PAI-1 etter 4 timer, hvilket ble assosiert med en signifikant økning i tPA-aktivitet (tabell 10). Ingen endringer kunne sees etter en faste natten over etter 2 ukers behandling. Imidlertid, som vist i tabell 11, etter 4 timer avtar PAI-1-antigen-konsentrasjon etter administrering av vann, noe som indikerer at effektene på PAI-1-antigen-konsentrasjon som er observert etter polyfenolpulverfortæring, simpelthen skyldes diurnal variasjon. Administrering av vann økte ikke signifikant tPA-aktiviteten, men rødvin-polyfenolpulver ga en 2,7 ganger økning i tPA-aktivitet. Det konkluderes at rødvin-polyfenoler produserer en velgjørende effekt med hensyn til å stimulere fibrinolyse ved økende tPA-aktivitet, men har ingen effekt på PAI-1-antigen-konsentrasjon. tPA fremskynder dannelse av plasmin fra plasminogen, og plasmin omdanner den latende form av TGF-B til dens aktive form som deretter inhiberer veksten av vaskulære glattmuskelceller (VSMC) som bidrar til veksten av aterosklerotiske plakk.

Fortrinnsvis vil konsumering av et preparat i overensstemmelse med oppfinnelsen forårsake minst en 2% reduksjon i maksimal blodplatelaggregering (mot ved den metode som er beskrevet ovenfor) og/eller en økning i tPA-aktivitet på minst 0,75 I U/ml (bestemt ved den metode som er beskrevet ovenfor).

Referanser

Assoian & Sporn (1986) J Cell Biol, 102, 1712-1733

Aznar et al Brit, Heart J. (1986) 59, 535-541

Bjorkerud (1991) Arteriosclerosis Thromb. 11, 892-902

Bradford (1976) Anal Biochem 72, 248-54

de Rijke et al (1996) Am. J. Clin. Nutr. 63. 329-34

Elwood et al (1991) Circulation 83, 38-44

Esterbauer et al (1989) Free Radic. Res. Commun. 6, 67-75

Francis, Am. Heart J. (1988) 115, 776-780

Frankel et al (1993) Lancet 341,454-457

Frankel et al (1993) J. Agriculture and Food Chem, 43, 890-894

Fuhrman et al (1995) Am. J. Clin. Nutr. 61, 549-554

Goldberg (1995) Clin. Chem. 41,14-16

Gorog et al (1994) Atherosclerosis 111,47-53

Grainger ef al (1995) Nature Medicine 1, 74-79

Gronback et a/(1995) Brit Med J. 310,1165-1169

Hamsten ef al New Eng. J. Med. (1985) 313,1557-1563

Hamsten ef al Brit, Heart J. (1986) 55, 58-66

Hamsten ef al Lancet, (1987) II, 3-9

Johnson, Int. J. Cardiol., (1984) 6, 380-382

Kirschenlohr et al (1993) Am. J Physiol. 265 (Cell Physiol. 34) C571-C576

Klatsky & Armstrong (1993) Amer. J. Cardiol. 71, 467-469

Lyons et al (1990) J.Cell Biol. 110,1361-7

Massagué, (1990) Annual Rev. Cell. Biol. 6, 597-641

McLoone et al (1995) Proe. Nutr. Soc. 54, Abstract 168A

Meade, (1987) in Thrombosis and Haemostasis, Verstraete et al (Eds.) Int. Soc. on Thrombosis and Haemostasis Univ. Press Leuven, 37-60

Mehta et al J. Am. Coll. Cardiol, (1987)9, 26

Moncada & Vane, New Eng. J. Med. (1979) 300,1142-27

Olofsson et al Eur. Heart J. (1989) 10, 77-82

Owens et al (1988) J. Cell Biol, 107, 771-780

Paramo et al, Brit. Med. J. (1985) 291, 575-576

Renaud & De Lorgeril (1992) Lancet 339,1523-1526

Shahidi & Nazck (1995) in Food phenolics, sources chemistry effects and applications Technomic Publishing Co. Lancatster, USA s. 136-146 Singleton & Rossi (1965) Amer. J. Enology and Viticuture 16,144-158 Steinberg, (1993) J. Intern. Med. 233, 227-232

St Leger et al (1979) Lancet 1,1017-1020

Thaulou et al (1991) Circulation 84, 613-17

Claims (15)

1. Planteavledet flavonolholdig tørt preparat egnet for konsumering av mennesker, oppnådd fra druer, vin eller flavonolholdige biprodukter eller avfallsprodukter fra vinfremstilling, og hvor konsumering av preparatet av en person blir effektiv med hensyn til å forårsake i personen ett eller flere av følgende: å inhibere oksydasjon av plasma LDL; å stimulere TGF-B-produksjon; å inhibere blodplateaggregering; og å stimulere fibrinolyse, karakterisert ved at minst 25% av det planteavledete materialet i preparatet omfatter polyfenoler, idet preparatet omfatter minst 0,01 % (vekt/vekt) flavonol.

2. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at flavonolinnholdet er minst 0,1 % (vekt/vekt).

3. Preparat som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at flavonolinnholdet er minst 1 % (vekt/vekt).

4. Preparat som angitt i hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at flavonolinnholdet utgjør minst 0,5% av det totale planteavledete polyfenolinnhold i preparatet.

5. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at flavonolinnholdet utgjør minst 1,0% av det totale planteavledete polyfenolinnhold i preparatet.

6. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at flavonolinnholdet utgjør minst 2% av det totale planteavledete polyfenolinnhold i preparatet.

7. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter den totale polyfenol-pool av rødvin.

8. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en eksipient, et fortynningsmiddel eller en bærer.

9. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en eller flere substanser valgt fra gruppen som består av: næringsstoffer, antioksydanter, terapeutiske substanser (spesielt slike som har en terapeutisk effekt i forhold til å forhindre og/eller behandle CHD), smaksstoffer og søtningsmidler.

10. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en eller flere substanser valgt fra gruppen som består av: lutein, lycopen, a- eller B-karoten, vitamin A, vitamin C, vitamin E (a-tokoferol og andre aktive tokoferoler), folsyre, selen, kopper, sink, mangan, ubikinon (koenzym Q10), salisylsyre, 2,3-dihydroksy-benzosyre, 2,5-dihydroksy-benzosyre og aspirin.

11. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det er pakket i enhetsdoseform.

12. Preparat som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det er i form av en tablett, kapsel eller pille.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en drikk, karakterisert ved at den omfatter å blande et preparat i overensstemmelse med hvilket som helst av kravene 1-12, med en fysiologisk akseptabel væske.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den fysiologisk akseptable væske omfatter, vann, en vandig løsning, en alkoholisk løsning, fruktsaft, melk eller yoghurt.

15. Anvendelse av et preparat som angitt i hvilket som helst av kravene 1-12, for produksjon av et medikament for konsumering av et menneske for å bevirke et eller flere av følgende i personen: inhibering av oksydasjon av plasma-LDL i personen, stimulering av TGF-B produksjon; inhibering av plateaggregasjon og stimulering av fibrinolyse.