DE69723713T2

DE69723713T2 - Flavanol enthaltende nahrungsergänzungszusammensetzungen

Info

Publication number: DE69723713T2
Application number: DE69723713T
Authority: DE
Inventors: Norman Alan HOWARD; Vijay Shailja NIGDIKAR; Jayshri Rajput-Williams; Ross Norman WILLIAMS
Original assignee: HOWARD FOUNDATION CAMBRIDGE; Howard Foundation
Current assignee: HOWARD FOUNDATION CAMBRIDGE; Howard Foundation
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2017-09-20
Also published as: BR9713212A; CN1230875A; EA002760B1; EA199900312A1; HK1020843A1; GB9720030D0; WO1998012189A1; CN1230956A; ATE245364T1; IL128977A0; KR20000048486A; ES2205207T3; CZ97399A3; NZ334282A; CA2266318C; TR199900626T2; NO315835B1; EP0930831A1; CA2266318A1; IL129034A

Description

Hintergrund der Erfindung
Der hohe Weinkonsum in Frankreich gilt als wichtiger Ernährungsfaktor bei der geringen Häufigkeit der Sterblichkeit an der koronaren Herzkrankheit (KHK), und es ist vermutet worden, dass er wenigstens teilweise eine mögliche Erklärung für das Phänomen bietet, das als „französisches Paradox" bekannt ist (Renaud & De Lorgeril 1992), wobei Frankreich eine Ausnahme im Vergleich zu den meisten anderen Ländern ist, da die KHK-Sterblichkeit trotz hohen Konsums von gesättigten Fetten niedrig ist.
Es gibt eine beträchtliche Menge an Literatur zu den angenommenen positiven Auswirkungen von Rotwein in Bezug auf die Prävention der koronaren Herzkrankheit (KHK). Epidemiologische Daten legen nahe, dass der Schutz durch Rotwein dem durch andere alkoholische Getränke wie Bier und Spirituosen überlegen ist, was darauf hindeutet, dass andere Faktoren als der Alkoholgehalt des Weins zu dieser Wirkung beitragen (St Leger et al., 1979; Renaud & De Lorgeril 1992). In einer prospektiven Studie in Kopenhagen, Dänemark, wurden verschiedene Parameter (einschließlich Alkoholkonsum, Rauchen und Körpermassenindex) bei 13.285 Menschen bewertet, gefolgt von einer Nachfolgestudie der Sterblichkeit 12 Jahre später. Es zeigte sich, dass ein niedriger bis mittlerer Weinkonsum (nicht jedoch der Konsum von Bier oder Spirituosen) mit einer niedrigeren Sterblichkeit aufgrund kardiovaskulärer und zerebrovaskulärer Krankheiten sowie anderer Ursachen in Verbindung stand (Gronbaek et al., 1995). Diese Ergebnisse bestätigten die zuvor in den USA berichteten (Klatsky & Armstrong, 1993).
Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass die Kettenreaktion der freien Radikalen bei der Lipidperoxidation, die die Oxidation von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) umfasst, wesentlich zu der Entstehung von Atherosklerose und KHK beiträgt (Steinberg, 1993).
Frankel et al. (Lancet 1993 341, 454–457) untersuchten die Fähigkeit von verdünntem, entalkoholisiertem Rotwein, die Oxidation von menschlichen LDL in vitro zu hemmen, und fanden heraus, dass der Wein als Antioxidans sehr aktiv war. Die Autoren vermuteten, dass der regelmäßige Konsum von Rotwein „die Oxidation von Lipoproteinen und thrombotische Phänomene verringern" kann. Die Autoren räumten jedoch ein, dass „wir mehr über die Pharmakokinetik von Wein-Flavonoiden und die Resorption und den Metabolismus von Wein-Phenolen wissen müssen... wenn wir die potenzielle Rolle der antioxidativen Verbindungen in Rotwein bei der Reduzierung von KHK bewerten sollen."
Flavonoide gehören zu einer Gruppe von Substanzen, die Polyphenole (PP) genannt werden, die so heißen, weil sie zwei oder mehr Phenolgruppen enthalten. Polyphenole treten reichlich in Rotwein auf und bestehen aus einer großen Zahl verschiedener chemischer Substanzen von unterschiedlichem Molekulargewicht. Die Haupt-Polyphenolbestandteile von Trauben und Wein und ihre Konzentrationen wurden von Shahidi & Nazck (1995) in „Food phenolics: sources, chemistry, effects and applications" (Nahrungsmittelphenole: Quellen, Chemie, Wirkungen und Anwendungen) (Techomic Publishing Co., Lancaster Pa, USA), S. 136–146, beschrieben. Bei den Polyphenolen gibt es folgende Klassen: Flavonoide (ein Begriff, der oft zur Bezeichnung von Polyphenolen im Allgemeinen benutzt wird, in Europa aber häufiger zur Bezeichnung nur der Flavone), Flavanole, Proanthocyanidine (auch Procyanidole, Procyanine, Procyanidine und Tannine genannt) sowie Anthocyanine.
Die Flavone sind Verbindungen mit einer in 2 dargestellten Grundstruktur, bei der zwei Benzenringe (A und B) mit einem heterozyklischen sechsgliedrigen Ring C, der eine Carbonylgruppe enthält, verbunden sind. Ring B kann in Position 2 (wie dargestellt) verbunden sein, um ein Flavon zu erzeugen, oder in Position 3, um ein Isoflavon zu erzeugen. Hydroxylierung kann an Positionen 3, 5, 7 und 3', 4', 5' auftreten, um Flavonole genannte Verbindungen zu erzeugen. Typische Beispiele für Flavonole sind: Quercetin (hydroxyliert an Positionen 3, 5, 7, 3', 4'), Kaempferol (hydroxyliert in Positionen 3, 5, 7, 4') und Myricetin (hydroxyliert an Positionen 3, 5, 7, 3', 4', 5'). Sie können natürlich als Aglycone oder als O-Glycoside (z.B. D-Glukose, Galactose, Arabinose, Rhamnose etc.) vorhanden sein. Andere Formen der Substitution wie Methylierung, Sulfatierung und Malonylierung treten ebenfalls auf.
Die Flavonole haben eine Grundstruktur, die in 3 dargestellt ist. Die zwei häufigsten Flavonole sind Katechin (Hydroxylgruppen-Positionen 5, 7, 3' und 4') und sein Stereoisomer Epikatechin. Die Hydroxylgruppen können mit Gallussäure verestert werden (in 4 gezeigt). Die Proanthoycyanidine sind Polmere aus Katechin und/oder Epikatechin und können bis zu 8 Einheiten oder mehr enthalten.
Die Anthocyanine sind farbige Substanzen mit einer in 5 dargestellten Grundstruktur. Sie werden manchmal als Anthocyanidine bezeichnet. Typische Beispiele sind: Cyanidin (hydroxyliert an Positionen 3, 5, 7, 3', 4'), Delphinidin (hydroxyliert an Positionen 3, 5, 7, 3', 4', 5') und Pelargonidin (hydroxyliert an Positionen 3, 5, 7, 3'). Diy Hydroxylgruppen sind üblicherweise glykosyliert und/oder methoxyliert (z.B. Malvidin bei 3', 5').
Der allgemeine Begriff „Polyphenole" umfasst die Dihydroxy- oder Trihydroxy-Benzoesäuren und die Phytoalexine, für die ein typisches Beispiel Resveratrol ist (in 6 gezeigt).
Das am häufigsten verwendete Verfahren für die Bestimmung der LDL-Oxidation besteht darin, das Übergangsmetall Kupfer (insbesondere Cu²+-Ionen) als Katalysator zu benutzen, um die Oxidation von endogenen Lipid-Hydroperoxiden zu fördern. In LDL vorhandene Antioxidanzien, insbesondere alpha-Tocopherol, verzögern den Oxidationsvorgang und erzeugen eine so genannte Verzögerungsphase. Der Vorgang kann leicht in einem UV-Spektrophotometer verfolgt werden, weil die Oxidationsreaktion konjugierte Diene erzeugt, die kontinuierlich bei 234 nm boebachtet werden können (Esterbauer et al., 1989). Um LDL während der Lagerung vor Oxidation zu schützen, wird EDTE zugefügt, um mit Kupfer und anderen Spurenelementen einen Komplex zu bilden. Diese überschüssige EDTE stört die kupferkatalysierte Oxidation. Die EDTE kann entfernt werden, indem das LDL-Präparat dialysiert wird, bevor die Kupferionen zugefügt werden, oder überschüssige Kupferionen können zugefügt werden, um diejenigen auszugleichen, die mit der EDTE einen Komplex gebildet haben.
Die Ergebnisse der In-Vitro-Experimente, die den von Frankel et al. (Lancet 1993, a.a.O.) beschriebenen etwas ähnlich waren, wurden auch von Frankel et al 1995 be richtet (J. Agricult. and Food Chemistry 43, 890–894). Die Verfasser dieser Veröffentlichung weisen auf die Schwierigkeit hin, in vitro-Daten zu interpretieren. So heißt es: „Obwohl die Phenolverbindungen ähnliche chemische Eigenschaften haben, ist ihre Reduktionsfähigkeit kein sehr präzises Mittel zur Vorhersage ihrer Antioxidans-Aktivität. Bei dem LDL-Oxidationstest und anderen Tests auf Antioxidans-Aktivität ist das System typischerweise heterogen, und physikalische Eigenschaften wie Lipophilizität, Löslichkeit und Trennung zwischen der wässrigen und der lipiden Phase der LDL können bei der Bestimmung der Antioxidans-Aktivität wichtig werden."
Tatsächlich ist dem Fachmann bewusst, dass die Extrapolation von in vitro-Ergebnissen auf in vivo-Situationen oft ungeeignet ist. Als Beispiel wird auf die Veröffentlichung von McLoone et al. (1995 Proc. Nutr. Soc. 54, Zusammenfassung 168A) verwiesen, die zeigt, dass, obgleich das Verbindungs-Lutein das Potenzial hat, eine LDL-Oxidation in vitro zu hemmen, eine zweiwöchige Nahrungsergänzung bei menschlichen Freiwilligen durch Lutein (was eine sechsfache Erhöhung des Luteinspiegels in Plasma hervorrief) keine Auswirkung auf die LDL-Oxidation hatte.
Einige in vivo-Versuche wurden durchgeführt, um die möglichen gesundheitlichen Vorteile von Rotwein zu untersuchen. Fuhrman et al. (1995 Am. J. Clin. Nutr. 61, 549–554) kamen zu dem Ergebnis, dass „einige phenolische Substanzen, die in Rotwein, aber nicht in Weißwein vorhanden sind, resorbiert werden, sich an Plasma-LDL binden und für die Antioxidans-Eigenschaften von Rotwein verantwortlich sein können", und boten nach ihren eigenen Worten die erste Demonstration, „dass Rotweinkonsum die Neigung von LDL zur Lipidperoxidierung hemmt", und dass dies zu einer Abschwächung von Atherosklerose beitragen kann. Eine Studie von Sharpe et al. dagegen, deren Ergebnisse veröffentlicht wurden (Q. J. Med. 1995 88, 101–108) kommt beinahe zeitgleich mit derjenigen von Fuhrman et al. zu dem Schluss, dass weder Rotwein- noch Weißweinkonsum irgendeine Auswirkung „auf den Gesamtwert von Cholesterin, Triglyceriden, HDL oder Werte, die eine antioxidative Wirkung anzeigen, einschließlich der Oxidationsneigung von LDL" hatten.
De Rijke et al. untersuchten die Frage ebenfalls und führten einen zufälligen Doppelblind-Versuch durch. Sie berichteten über ihre Ergebnisse 1996 (Am. J. Clin. Nutr. 63, 329–334) und stellten fest: „Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen keine vorteilhafte Auswirkung von Rotweinkonsum auf die LDL-Oxidation."
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass laut mehreren Berichten verdünnter Rotwein die LDL-Oxidation bei in vitro-Tests hemmen kann, dass aber diese Ergebnisse sich nicht notwendig auf die in vivo-Situation übertragen lassen. Darüber hinaus sind die in vivo-Daten bezüglich der Hemmung der LDL-Oxidation durch Rotweinkonsum zu mindest widersprüchlich, und es gibt keinen klaren Beweis, dass Roweinkonsum irgendeine Auswirkung auf die LDL-Oxidation hat.
Eine Vielzahl von Zusammensetzungen sind nun öffentlich erhältlich, die aus Wein- oder Traubennebenprodukten zubereitet werden und die Polyphenole enthalten können (wenngleich bei einigen der Zusammensetzungen in ziemlich geringen Mengen). Darunter sind French-Paradox-Kapseln (erhältlich durch Arkopharma). French-Paradox-Kapseln werden hergestellt, indem ein Extrakt aus Mark zubereitet wird (dem Traubenschalenabfall, der nach der Fermentierung des Weins übrig bleibt). Die meisten der in den Traubenschalen vorhandenen Polyphenole sind alkohollöslich und neigen deshalb dazu, in den fermentierenden Wein extrahiert zu werden. Daher haben French-Paradox-Kapseln tatsächlich einen recht niedrigen Polyphenolgehalt. (Andere öffentlich erhältliche Zusammensetzungen umfassen ein anthocyaninhaltiges Pulver (erhältlich durch Sefcal), das aus Traubenschalenextrakt hergestellt wird und als Lebensmittelfarbstoff eingesetzt wird, sowie eine proanthocyanidinhaltige Zusammensetzung („Endotelon"), die aus Traubenkernen zubereitet wird.)
Selbst wenn French-Paradox-Kapseln wesentliche Mengen von Polyphenolen enthielten, ist nicht klar, ob die orale Einnahme einer solchen synthetischen Polyphenolzusammensetzung die gleiche therapeutische Wirkung hätte, die dem Rotweinkonsum zugeschrieben wird. Wie z.B. Goldberg (1995 Clin. Chem. 41, 14–16) erläutert, hält der Alkoholgehalt des Weins Polyphenole im Wein und im menschlichen Darm gelöst, so dass sie zur Resorption zur Verfügung stehen. Ein synthetisches, alkoholfreies Polyphenolpulver kann vollständig wirkungslos sein, da die Polyphenole im Darm nicht genügend löslich sind (bei Fehlen von Alkohol), um resorbiert zu werden. Außerdem kann die Aufnahme in den Blutkreislauf nicht ausreichend sein, um eine antioxidative Wirkung auf LDL auszuüben – eine enge Verbindung der Polyphenole mit der LDL-Fraktion kann erforderlich sein.
Es ist bekannt, dass viele Krankheiten durch einen Oxidationsmechansimus freier Radikaler verursacht oder begünstigt werden, z.B. Krebs, Arten des grauen Stars, Diabetes etc.. Von antioxidativen Nährstoffen wie Vitamin E, Vitamin C und anderen wird angenommen, dass sie eine Oxidation freier Radikaler in vielen Organen und Geweben verhindern. Daher hat die Resorption von Polyphenolen, die wirksame Antioxidanzien sind, wahrscheinlich eine Wirkung auf Krankheiten im Zusammenhang mit freien Radikalen/Oxidation im Allgemeinen, und der Nutzen von Polyphenolen kann viel größer sein als nur für eine Behandlung oder Verhinderung der koronaren Herzkrankheit.
Nichtsdestoweniger ist die KHK einer der größten Verursacher von Sterblichkeit und Krankheit in der westlichen Welt und ist daher von besonderem Interesse. Die Entstehung der Krankheit besteht im Wesentlichen aus einem zweistufigen Prozess, der zuerst die Entwicklung atherosklerotischer Plaques und danach die Bildung eines Thrombus (Pfropf) auf der Plaque umfasst (ein Vorgang, der als Thrombose bezeichnet wird), was einen arteriellen Verschluss verursachen kann, dessen Folgen ein Myokardinfarkt (MI) und plötzlicher Tod sein können. Andere Krankheiten, die durch Thrombose hervorgerufen werden, sind Schlaganfall und Venenthrombose. Das Anfangsstadium der Bildung eines Thrombus ist die Aggregation von Thrombozyten, die dann Koagulationsfaktoren in das Blut freisetzen, was zur Bildung von Fibrinpfropfen führt. Sobald die Blutpropfen entstanden sind, können sie durch ein als Fibrinolyse bekanntes Verfahren entfernt werden, was im Wesentlichen die Auflösung von Pfropfen und den Abbau von Fibrin zu Abbauprodukten beinhaltet. So gibt es wenigstens zwei Verfahren zur Verhinderung von Thrombose: Hemmen der Aggregation von Thrombozyten oder Verstärken der Fibrinolyse.
Eine abnorme Vermehrung der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) kann zur Bildung obstruktiver Läsionen bei koronarer Herzkrankheit, Atherosklerose, Restenose, Schlaganfall und Glattmuskel-Neoplasmen des Darms und des Uterus, uterinen Fibroiden oder -fibromen beitragen.
Es ist seit vielen Jahren bekannt, dass TGF-β einer der stärksten Zellwachstumsinhibitoren ist (Massague, 1990), und mehrere Autoren haben festgestellt, dass TGF-β die VSMC-Vermehrung hemmt (Assolian, 1986; Bjorkerud, 1991; Owens, 1988; Kirschenlohr, 1993). Menschliche VSMC erzeugen TGF-β in latenter, inaktiver Form, die proteolytisch von dem Serinprotein Plasmin aktiviert wird, das wiederum aus Plasminogen durch eine Familie von Plasminogen-Aktivatoren (PAs) erhalten wird, z.B. Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) (Lyons, 1990). Ein Anstieg des gesamten Plasma-TGF-β gilt als wirksam zur Hemmung des Wachstums von VSMC, da die latente Form durch Plasmin in die aktive Form umgewandelt wird.
Mehrere Autoren haben Verfahren entwickelt, um den Plasmaspiegel von TGF-β zu schätzen und nach pharmazeutischen Verbindungen zu suchen, die die TGF-β-Produktion sowohl in der latenten als auch in der aktiven Form stimulieren können. In der US-5,545,569 (Grainger et al.) wird ein Verfahren beansprucht, um in vitro die Wirksamkeit von Verbindungen zu bestimmen, die den Plasmaspiegel von TGF-β erhöhen und seine Produktion stimulieren, wobei die darin beschriebenen Techniken verwendet werden. Die WO094/26303 (Grainger et al.) offenbart ein Verfahren zur Aufrechterhaltung oder Erhöhung des Gefäßlumendurchmessers in einem kranken oder verletzten Gefäß eines Säugetiers durch Verabreichung einer wirksamen Menge an TGF-β-Aktivator oder Produktionsstimulator. Die Verbindung Tamoxifen (trans-2[4(diphenyl-1-butanyl)phenoxy]-dimethylethylamin wird als wirksam beansprucht, da sie die Produktion von TGF-β stimuliert und das Verhältnis von aktivem zu latentem TGF-β erhöht. Eine andere Verbindung, die Aktivität zeigt, ist Aspirin (Grainger et al., 1995), das sowohl die totale als auch die aktive Menge an Serum-TGF-β bei normalen Menschen, aber nur die totale Menge an TGF-β bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit erhöht.
Ein Anstieg der Thrombozyten-Aggregation ist auch deutlich mit der Prävalenz (Elwood et al, 1991) und Inzidenz (Thaulou et al., 1991) von KHK in Zusammenhang gebracht worden. Die Thrombozyten-Aggregation wird zweckmäßigerweise unter Verwendung eines Thrombozytenaggregometers untersucht, in dem eine Suspension aus Thrombozyten, die frisch aus Blut gewonnen wurden, in Kontakt mit einem Agonisten gebracht werden, der Aggregation verursacht. Viele Agonisten können verwendet werden, aber die typischsten sind Arachidonsäure, ADP, Collagen und Thrombin.
Durch eine Messung der maximalen Aggregation (in %) ist es möglich, die Wirkungen der Thrombozyten-Aggregationsinhibitoren zu untersuchen, die der Person oral oder durch Injektion verabreicht werden können. Eine der wirksamsten Substanzen bei der Verhinderung von Thrombozyten-Aggregation ist Aspirin, das eine Zyklo-Oxygenase-Aktivität und die Bildung von Thromboxan, einem notwendigen Faktor bei der Thrombusbildung, hemmt (Moncada & Vane, 1979). Aspirin verhindert auch KHK, Schlaganfall und plötzlichen Tod (Hennekens et al., 1988).
Das fibrinolytische System bildet einen Strom von extrazellulären proteolytischen Reaktionen, die durch Aktivatoren und Inhibitoren genau geregelt werden. Der enzymgewebeartige Plasminogen-Aktivator (t-PA) wandelt Plasminogen in Plasmin um, das wiederum Fibrinpfropfen auflöst. t-PA ist ein Glykoprotein, das in den Endothelzellen synthetisiert wird und das an Fibrin adsorbiert wird, um aktiviert zu werden. Der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI)-1 ist ein Serinproteaseinhibitor und wirkt als spezifischer Inhibitor von t-PA. PAI-1 existiert in drei Formen: aktiv, latent und als inaktiver Komplex. Er wird in Endothelzellen, in der Leber und in Thrombozyten synthetisiert.
Im Blutkreislauf bildet der meiste t-PA (95%) einen Komplex mit PAI-1. Sehr wenig t-PA und PAI-1 sind in der freien (aktiven) Form vorhanden. Eine verringere fibrinolytische Aktivität wird auf einen Anstieg des PAI-1-Spiegels oder der PAI-1-Aktivität zurückgeführt, die zu einer verringerten Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin durch t-PA führt. Das ist wichtig wegen Berichten über einen Zusammenhang zwischen verringerter fibrinolytischer Aktivität und dem Risiko von KHK (Mehta et al., 1987) und MI. Eine gehinderte Fibrinolyse, hauptsächlich aufgrund eines Anstiegs von Plasma-PAI-1, ist eine häufige Diagnose bei thrombotischen Erkrankungen. In der Northwick-Park-Herzstudie, einer prospektiven epidemiologischen Studie an Männern mittleren Alters (40–54 Jahre bei der Aufnahme), berichteten Meade et al. (1987), dass eine verringerte fibrinolytische Aktivität ein wesentlicher unabhängiger Risikofaktor für zukünftige KHK darstellt. Fachgebietsübergreifende Studien an Patienten mit Angina pectoris oder vorausgegangenem Myokardinfarkt haben durchgehend eine verringerte fibrinolytische Aktivität bei Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe gezeigt (Hamsten et al., 1985 und 1986; Johnson 1984; Paramo et al., 1985, Aznar et al., 1986; Francis 1988; und Olofson et al., 1989). Es hat sich gezeigt, dass PAI-1- Konzentrationen bei MI-Patienten höher als bei Kontrollgruppen sind (Hamsten et al., 1987).
Wegen der Rolle der Thrombozyten-Aggregation und der Fibrinolyse bei der Bildung von Thromben könnte ein Verfahren zum Verringern von Thrombozyten-Aggregation und/oder zur Verstärkung der Fibrinolyse als ein Verfahren zur Behandlung von thrombotischen Erkrankungen im Allgemeinen und KHK im Besonderen angewandt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt eine aus aus Pflanzen gewonnene trockene Zusammensetzung, die für den Verzehr durch Menschen geeignet ist und aus Weintrauben, Wein oder Flavonol enthaltenden Nebenprodukten oder Abfallprodukten der Weinherstellung gewonnen wird, zur Verfügung, wobei wenigstens 25% des aus Pflanzen gewonnenen Materials in der Zusammensetzung Polyphenole enthält, wobei die Zusammensetzung wenigstens 0,1 Nassgewichts-% Flavonol enthält und wobei der Verzehr der Zusammensetzung durch eine menschliche Person eine oder mehrere der folgenden Wirkungen auf diese Person hat: Hemmung der Plasma-LDL-Oxidation; Stimulation der TGF-β-Produktion; Hemmung der Thrombozyten-Aggregation und Stimulation der Fibrinolyse.
Zur Erläuterung: Aus Pflanzen gewonnene Zusammensetzungen können Extrakte aus Pflanzen oder deren Teilen (z.B. Trauben) enthalten, die auf irgendeine Art verarbeitet wurden (z.B. durch Fermentierung). So umfassen aus Pflanzen gewonnene Zusammensetzungen wässrige oder organische Lösungsmittelextrakte aus Trauben oder deren Teilen, Traubensäfte und fermentierte alkoholische Getränke (z.B. Wein), die aus Trauben oder Traubensaft gewonnen werden, oder Zusammensetzungen, die aus beliebigen der oben genannten Bestandteile bestehen. Das Pflanzenmaterial wird während der Herstellung der Zusammensetzung typischerweise verarbeitet (physisch und/oder chemisch), um Polyphenole aus der Pflanze zu extrahieren und so den Polyphenolgehalt der Zusammensetzung zu erhöhen und anzureichern.
Vorteilhafterweise kann die Zusammensetzung so sein, dass das aus Pflanzen gewonnene Material wenigstens 35% Polyphenole oder noch bevorzugter wenigstens 45% Polyphenole enthält.
Die Zusammensetzung kann ganz oder im Wesentlichen aus dem aus Pflanzen gewonnenen Material bestehen, aus dem der Flavonolgehalt der Zusammensetzung gewonnen wird. Alternativ kann die Zusammensetzung anderes Material aufweisen, z.B. Geschmacksstoffe, Bindemittel, Träger und Ähnliches, das herkömmlicherweise bei der Formulierung von Zusammensetzungen für den menschlichen Konsum verwendet wird.
Das „aus Pflanzen gewonnene Material" in der Zusammensetzung bezieht sich auf den Teil der Zusammensetzung, der aus derselben Quelle stammt wie der Flavonolgehalt der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung kann auch andere aus Pflanzen gewonnene Inhaltsstoffe aufweisen (z.B. Stärke oder Geschmacksstoffe), die aber nicht als „aus Pflanzen gewonnenes Material" anzusehen sind, wenn sie nicht aus derselben Quelle wie der Flavonolgehalt der Zusammensetzung gewonnen werden.
Vorzugsweise beträgt der Flavonolgehalt der Zusammensetzung wenigstens 0,5% (Nassgewicht), bevorzugt wenigstens 1% und noch bevorzugter wenigstens 2% des gesamten aus Pflanzen gewonnenen Polyphenolgehalts der Zusammensetzung.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der Flavonolgehalt der Zusammensetzung als Ganzes wenigstens 0,1% (Nassgewicht), und am meisten bevorzugt wenigstens 1% beträgt.
Die oben definierten Zusammensetzungen sind bei atmosphärischem Druck (760 mm Hg) im Temperaturbereich von 10–20°C typischerweise fest. Die Zusammensetzung kann auch partikelförmig sein (z.B. pulver- oder granulatförmig) oder zu Kapseln, Tabletten und Ähnlichem geformt werden.
Überraschenderweise haben die Erfinder herausgefunden, dass erfindungsgemäße Zusammensetzungen nach oraler Einnahme durch menschliche Personen wirksam die Oxidation von Plasma-LDL hemmen, gemessen an einer Reihe von Kriterien. So ist die orale Einnahme der Zusammensetzung wirksam bei der Verlängerung der Verzö gerungsphase bei der Oxidation von isolierten Plasma-LDL, wie durch das Verfahren von Esterbauer et al. (1989 Free Radic. Res. Commun. 6, 67–75) bestimmt. Kurz gefasst werden bei diesem Verfahren LDL, die durch Ultrazentrifugieren aus dem Plasma eines Subjekts isoliert wurden, dialysiert, um EDTE zu entfernen, und Kupferionen (5 μM) werden den LDL zugefügt (die mit 50 mg/l vorhanden sind). Die übliche Verzögerungszeit vor der Dienbildung liegt etwa bei 50–60 min. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung an das Subjekt sollte eine Verlängerung der Verzögerungszeit von vorzugsweise wenigstens 2 Minuten bewirken (oder etwa 4% oder mehr). Am meisten bevorzugt ist eine Verlängerung im Bereich von 5–25 Minuten (oder etwa 10–50%). Zusätzlich ist die Zusammensetzung wirksam (nach oraler Einnahme) bei der Verringerung der Menge an Lipidproxiden im Plasma menschlicher Personen (wie durch das Verfahren von Gorog et al., 1994, bewertet und unten beschrieben).
Die Zusammensetzungen weisen Polyphenole auf (einschließlich Flavonole), die aus Trauben (ganzen Trauben oder deren Teilen, z.B. Schalen oder Saft), Wein (insbesondere Rotwein, der viel höhere Konzentrationen von Polyphenolen aufweist als Weißwein) oder flavonolhaltigen Nebenprodukten und/oder Abfallprodukten des Weinherstellungsvorgangs, z.B. Trester (d.h. dem Rest der gepressten Trauben nach der Saftextraktion) oder Mark (nach der Anfangsfermentierung verbleibende Abfallfeststoffe), gewonnen werden. Polyphenole wie Flavonole sind jedoch in einer großen Zahl von natürlich vorkommenden Materialien vorhanden, von denen viele einen höheren Flavonolgehalt als Rotwein haben. Beispiele solcher Materialien sind: Früchte im Allgemeinen, etwa Äpfel (z.B. var. „Gravensteiner"), insbesondere Apfelschalen, Birnen (z.B. var. „Williams Christs"), Paprika (z.B. var. „Yolo wonder"), rote Johannisbeeren, schwarze Johannisbeeren (besonders bevorzugt, da sie einen relativ hohen Flavonolgehalt haben), Zitronen, Kirschen, Preiselbeeren, Stachelbeeren, Tomaten, Oliven, und Gemüse im Allgemeinen, darunter: Radiese (z.B. var. „Saxa treib"), Kohlrabi (z.B. var. „Primavera"), Meerrettich, Kartoffeln, Zwiebeln und Spargel.
Bei einer speziellen Ausführungsform wird die Zusammensetzung aus einem Rotwein gewonnen und weist ein repräsentatives Profil von im Wesentlichen allen Polyphenolverbindungen auf, die in dem Wein vorhanden sind (typischerweise, aber nicht notwendigerweise, sind sie in der Zusammensetzung im Wesentlichen in den relativen Mengen vorhanden, die repräsentativ für die Mengen in dem Wein sind, aus dem die Zusammensetzung gewonnen wird). Eine solche Zusammensetzung kann als „Gesamt-Polyphenolpool" bezeichnet werden.
Polyphenole können zweckmäßigerweise aus Rotwein oder anderen polyphenolhaltigen Flüssigkeiten durch Absorption auf eine chromatographische Harzsäule erhalten werden, unter Elution der polyphenolangereicherten Fraktion aus der Säule (typischerweise nach einem Waschschritt) durch Verwendung eines Eluenten mit 40–50% Ethanol oder eines anderen geeigneten organischen Lösungsmittels (z.B. Methanol, Aceton, Ethlyacetat, Dimethylenchlorid und Chloroform – das in einer wässrigen Lösung sein kann). Das organische Lösungsmittel ist vorzugsweise relativ flüchtig (d.h. es hat einen Siedepunkt zwischen 30 und 85°C bei einem Druck von 760 mm Hg) und wird so leicht ausgetrieben, so dass eine im Wesentlichen trockene (d.h. weniger als 10% Nassgewicht H₂O), feste Zusammensetzung zurückbleibt, die Polyphenole enthält. Ein solches Verfahren kann erfolgreich verwendet werden, um einen Gesamt-Polyphenolpool aus Rotwein zu gewinnen.
Alternativ können Polyphenole aus Rotwein oder einer anderen polyphenolhaltigen Flüssigkeit durch Lösungsmittelextraktion gewonnen werden, wobei ein geeignetes organisches Lösungsmittel verwendet wird, das nicht mit dem Wein oder der anderen Flüssigkeit mischbar ist. Alternativ können Polyphenole aus polyphenolhaltigen Feststoffen durch Lösungsmittelextraktion gewonnen werden (typischerweise Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol oder Ethlyacetat) – dann können die Feststoffe durch Filtern oder Zentrifugieren von dem Lösungsmittel getrennt werden. Das Lösungsmittel kann dann verdampft werden, so dass eine im Wesentlichen trockene, feste Zusammensetzung zurückbleibt, die Polyphenole enthält.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Zusammensetzung als Nahrunsergänzung dargereicht. Dies kann eine Substanz, die als zusätzlicher Bestandteil dem Lebensmittel während dessen Herstellung zugesetzt wird, oder eine separate Substanz sein, die von einer Person (z.B. als Tablette oder Kapsel) im Wesentlichen isoliert von anderen Nahrungskomponenten (d.h. nicht mit diesen gemischt) vor dem Verzehr eingenommen wird (obgleich die Tablette oder Kapsel zusammen mit Lebensmitteln eingenommen werden kann). Der Schutzbereich der Erfindung umfasst damit ein Pro dukt, insbesondere ein Nahrunsgmittel, das eine erfindungsgemäße Zusammensetzung aufweist. Alternativ kann die Zusammensetzung als Feststoff dargereicht werden, der zu einem Getränk verarbeitet wird, indem er mit einem physiologisch aufnehmbaren Verdünnungsmittel gemischt wird (z.B. Milch, Wasser oder einer anderen wässrigen Flüssigkeit).
Die Dosierung der Zusammensetzung, die einem Subjekt verabreicht wird, hängt vom Grad der Aktivität des Materials ab, liegt jedoch zwischen 10 mg und 10 g pro Tag. Für den aus Rotwein gewonnenen Gesamt-Polyphenolpool liegt die bevorzugte Dosis bei 0,1–4,0 g/Tag, noch bevorzugter 1–2 g/Tag, gleichwertig mit 0,5 bis 1 Liter Rotwein pro Tag. Die bevorzugte Flavonoldosis liegt im Bereich von 0,1–1.000 mg pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 0,5–500 mg pro Tag, noch bevorzugter im Bereich von 1–250 mg pro Tag.
Der Fachmann kann das Präparat aus Polyphenolen, die aus Wein, Trauben oder Weinnebenprodukten gewonnen wurden, weiter zerlegen, um Zusammensetzungen mit konzentrierterer Aktivität zu erhalten. Dies kann durch Säulenchromatographie, Lösungsmittelextraktion, Molekularsiebe mit halbdurchlässigen Membranen oder (einem) anderen Verfahren geschehen, das (die) herkömmlicherweise in der Lebensmittelindustrie verwendet werden. Der Vorteil besteht dann, dass das Gewicht aktiver Substanz geringer ist, und dass die Farbe und der Geschmack der Ergänzung günstig modifiziert wird.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können zubereitet werden, indem die aktiven Polyphenol-Agenten gemäß herkömmlicher Nahrungsergänzungs- oder pharmazeutischer Praxis verwendet werden. Die Verdünnungsmittel, Bindemittel oder Träger usw., die verwendet werden können, sind im Stand der Formulierungs-Technik bekannt, und die Form, die für eine bestimmte Kur gewählt wird, hängt von dem gegebenen Kontext und der Wahl desjenigen, der die Formulierung durchführt, ab. Im Allgemeinen hängt die Dosis von der Konzentration der Polyphenole in der Zusammensetzung und der Identität der betreffenden Polyphenolverbindungen ab.
Darüber hinaus können die Zusammensetzungen eine beliebige Zahl von weiteren Komponenten enthalten, wie sie typischerweise in der Lebensmittelindustrie und/oder in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden. Diese Komponenten können Nährstoffe (insbesondere Spurenelemente und Vitamine), Antioxidanzien, therapeutische Substanzen (insbesondere solche, die eine therapeutische Wirkung im Zusammenhang mit der Prävention und/oder Behandlung von KHK haben, speziell Aspirin), Geschmacksstoffe und Süßungsmittel (insbesondere künstliche Süßungsmittel wie Aspartam etc.) umfassen.
Beispiele hierfür umfassen: Ein Karotinoid wie Lutein, Lycopin oder α- oder β-Karotin, antioxidative Nährstoffe oder entzündungshemmende Agenten wie Vitamin A, Vitamin C, Vitamin E (α-Tocopherol und andere aktive Tocopherole), Folsäure, Selen, Kupfer, Zink, Mangan, Ubichinon (Coenzym Q10), Salicylsäure, 2,3-Dihydroxybenzoesäure und 2,5-Dihydroxybenzoesäure.
Antioxidanzien wie Karotinoide und Vitamin E werden im Magen-Darm-Trakt durch Oxidation teilweise zerstört. Es wird angenommen, dass durch die Aufnahme dieser Verbindungen in die erfindungsgemäße Zusammensetzung dieser Vorgang gehemmt wird und mehr Antioxidanzien resorbiert werden. Die Verwendung einer Zusammensetzung, die α-Tocopherol und/oder Aspirin enthält, ist besonders bevorzugt, da angenommen wird, dass eine solche Mischung bei Vorhandensein von Polyphenolen einen Synergie-Effekt bewirkt.

Typische geeignete Tagesdosen dieser zusätzlichen Komponenten der Zusammensetzung (die deshalb in die Zusammensetzung aufgenommen werden können, so dass eine normale Einnahme der Zusammensetzung die angemessene Dosis ergibt) sind folgende:

Lutein	2 bis 50 mg, z.B. zweckmäßigerweise 7,5 mg
Beta-Karotin	2 bis 20 mg, z.B. zweckmäßigerweise 5 mg
Vitamin A	400 bis 600 RE, z.B. zweckmäßigerweise 500 RE
Vitamin C	75 bis 250 mg, z.B. zweckmäßigerweise 100 mg
Folsäure	0,1 bis 1,0 mg, z.B. zweckmäßigerweise 0,2 mg
Selen	80 bis 120 μg, z.B. zweckmäßigerweise 90 μg
Kupfer	2 bis 4 mg, z.B. zweckmäßigerweise 3 mg
Zink	10 bis 20 mg, z.B. zweckmäßigerweise 15 mg
Coenzym Q10	10 bis 200 mg, z.B. zweckmäßigerweise 30 mg
Aspirin	10 bis 150 mg, z.B. zweckmäßigerweise 150 mg.

So hat bei einer Ausführungsform die Zusammensetzung die Form von Kapseln, wobei jede Kapsel 500 mg der Polyphenolzusammensetzung enthält, bei einer empfohlenen Einnahmemenge von ein bis vier Kapseln pro Tag. Eine andere Darreichtungsform ist ein alkoholfreies Getränk, das eine wirksame Dosis Polyphenole liefert, wenn es in Wasser (still oder sprudelnd) gelöst, mit Geschmacksstoffen versehen und nach Belieben gesüßt, oder in einem Fruchtsaft gelöst wird, z.B. Traubensaft, Apfelsaft oder Orangensaft etc.
Während es aus einer Reihe von Gründen (beispielsweise sozialer, religiöser und wirtschaftlicher Art) vorzuziehen sein kann, ein alkoholfreies Getränk vorzusehen, das die erfindungsgemäße Zusammensetzung aufweist, können solche Getränke auch mit Alkohol angereichert werden (z.B. aus Wodka, Gin, Whisky), um einen wünschenswerten Gehalt von 5–15% Alkohol zu haben, je nach Geschmack des Konsumenten.
Andere Darreichtungsformen sind: als Nahrungsinhaltsstoff in Milchprodukten wie Milch und Joghurt, Konserven und Diätprodukten, die als Ergänzung oder Ersatz für Mahlzeiten vorgesehen sind. Die obigen Beispiele sind nur illustrativ und sollen keine Einschränkung irgendeiner Art darstellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Feststellung gemacht, dass eine orale Einnahme der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nicht nur die Oxidation von Plasma-LDL hemmt, sondern dass die Zusammensetzung auch die Wirkung hat, die Produktion des umformenden Wachstumsfaktors (TGF)-β in vivo zu stimulieren. Außerdem haben die Erfinder festgestellt, dass die orale Einnahme der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Thrombozyten-Aggregation hemmt und/oder die Fibrinolyse stimuliert, wodurch die Thromboseneigung einer Person verringert wird, was hilfreich bei der Prävention und/oder Behandlung von thrombotischen Erkrankungen wie KHK und Schlaganfall ist. Insbesondere hat sich herausgestellt, dass die Einnahme der Zusammensetzung das Niveau der t-PA-Aktivität in Plasma erhöht (was zweckmäßigerweise durch Tests wie den unten beschriebenen „Chromolize"-RTM- Test [erhältlich durch Biopool, Schweden] gemessen wird), was dazu führt, dass die Nettorate der Fibrinolyse bei der Person ansteigt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß dem oben definierten ersten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Einnahme durch eine menschliche Person vor, um die Oxidation von Plasma-LDL bei der Person zu hemmen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß dem oben definierten ersten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Einnahme durch eine menschliche Person vor, um die Produktion von TGF-β bei der Person zu stimulieren.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß dem oben definierten ersten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Einnahme durch eine menschliche Person vor, um die Thrombozyten-Aggregation zu hemmen und/oder die Fibrinolyse bei der Person zu stimulieren (insbesondere durch Erhöhung des Niveaus der t-PA-Aktivität im Plasma der menschlichen Person).
Die Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung überträgt typischerweise alle oben genannten Eigenschaften auf eine Person, die die Zusammensetzung einnimmt. Die Erfindung stellt deshalb auch ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Einnahme durch eine menschliche Person zur Verfügung, mit dem Zweck, bei der Person eine oder mehrere der folgenden Wirkungen zu erzielen: Hemmung der LDL-Plasma-Oxidation, Hemmung der Thrombozyten-Aggregation, Stimulierung der Fibrinolyse und Stimulierung der TGF-β-Produktion; wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Zubereiten einer Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung; falls nötig, Mischen der Zusammensetzung mit einem physiologisch aufnehmbaren Bindemittel oder Träger; und Zubereiten von Einzeldosen der Zusammensetzung. Geeignete Verfahren zur Herstellung der Medikamente sind dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet bekannt.
Medikamente mit dieser Wirkung können die Form von Nahrungsergänzungsmitteln oder -inhaltsstoffen haben, wie oben erläutert, und sollen bei der Prävention oder Behandlung der koronaren Herzkrankheit nützen. Geeignete Dosen der Medikamente hängen, wie bereits erläutert, von der Konzentration und Identität der Polyphenole in der Zusammensetzung und von der Schwere des Krankheitszustands bei der zu behandelnden Person ab. Als allgemeine Richtlinie sollte die Dosierung jedoch vorzugsweise ausreichend sein, um die gleiche Menge an Polyphenolen zu liefern wie der Konsum wenigstens eines Glases Wein pro Tag (ungefähr gleichwertig mit 0,25 g des Gesamt-Polyphenolpools aus Rotwein), bevorzugter jedoch etwa 0,5–1,0 l Rotwein pro Tag (d.h. etwa 1,0–2,0 g der gesamten Wein-Polyphenole).
Die Erfindung wird weiterhin illustrativ-beispielartig und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 einen Graph der LDL-Oxidation bezogen auf die Zeit (in Minuten) zeigt;
2 eine schematische Darstellung der Kernstruktur von Flavonen ist;
3 eine schematische Darstellung der Kernstruktur von Flavonolen ist;
4 eine schematische Darstellung der Struktur von Gallussäure ist;
5 eine schematische Darstellung der Kernstruktur von Anthocyaninen ist; und
6 eine schematische Darstellung der Struktur von Resveratrol ist.
Beispiel 1 Zubereitung von Polyphenolpulver aus Rotwein
Etwa 2.000 Liter Rotwein (französischer 1993er Cabernet Sauvignon) wurde gefiltert, um Sediment zu entfernen, und unter Vakuum bei einem Druck von 300 Millibar bei 75 bis 80°C eine Minute lang destilliert, dann abgekühlt und unter Vakuum bei 55°C konzentriert und anschließend schnell durch Kühlen auf 25°C heruntergekühlt. Der konzentrierte Wein wurde durch eine Säule (Durchmesser 55 cm, Höhe ungefähr 2 Meter) geleitet, die 65 Liter Diaion HP-20-Harz enthielt. Die Säule wurde mit 250 Liter destillierten Wassers gewaschen, und die Polyphenole eluierten etwa 250 Liter 50%igen Ethanols über einen Zeitraum von ca. 150 Minuten. Am Ende dieser Zeit war das Eluat frei von Polyphenolen, wie durch das Folin-Ciocalteu-Verfahren bestimmt (beschrieben von Singleton & Rossi, 1965). Das Eluat wurde dann durch Destillation unter Vakuum auf 35% Trockenmasse konzentriert und unter Nitrogen zerstäubungs getrocknet, so dass es etwa 2 kg Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3 bis 4 ergab.
Das Polyphenolpulver ist ein ausgezeichneter Nahrungsmittelbestandteil und hat eine dunkelrote Farbe, wenn es in Wasser oder wässrigem Alkohol gelöst wird, ist durchaus geschmackvoll und hat geschmacklichen „Biss" ähnlich dem von Rotwein. Die empfohlene Tagesdosis liegt bei 1–2 g/Tag.
Die typische Zusammensetzung des Polyphenolpulvers wird im Folgenden mit dem Polyphenolgehalt von Rotwein verglichen. Im Vergleich zu Rotwein enthält das Polyphenolpulver proportional mehr von den Proanthocyaninen als von den anderen Polyphenolen, bewahrt aber im Wesentlichen den relativen Reichtum an den verschiedenen Polyphenolen.
Zusammensetzung von Rotwein und Polyphenolpulver
Beispiel 2
Studien an Freiwilligen, bei denen Wein-Polyphenole verwendet wurden, wurden durchgeführt, um die antioxidative Aktivität von Rot- und Weißwein und von Polyphenolzubereitungen an gesunden Freiwilligen zu bestimmen.
Probanden und Verfahren:
26 gesunde Männer im Alter von 35 bis 65 Jahren, die nicht rauchten und sich für Großbritannien typisch ernährten, nahmen an einer privaten und vertraulichen Studie teil. Zwei Wochen vor der Studie setzten die Freiwilligen ihren Weinkonsum aus. Alle Freiwilligen wurden gebeten, ihre übliche Ernährung und und ihre üblichen Lebensgewohnheiten während der Studie beizubehalten. Die Freiwilligen wurden in Gruppen eingeteilt, die zwei Wochen lang die folgenden Wein- oder Teeprodukte in den in Tabelle 1 angegebenen Mengen zu den Mahlzeiten einnahmen. Der Rotwein war Cabernet Sauvignon (1993), und der Weißwein kam aus der Region Narbonne in Frankreich.
Der während der Studie vorgesehene Wein war der einzige Wein, der während der Zeit des Experiments erlaubt war. Zusätzlich bekamen dieselben Probanden Polyphenolpulver, das aus derselben Charge von Rotwein zubereitet wurde, der in der Studie verwendet wurde. Das Pulver wurde bei –20°C (PP1) gelagert, und eine frische Probe wurde im Juni 1996 zubereitet (PP2). Die Studien begannen Anfang September 1995 und dauerten ca. ein Jahr.

Gruppe	Testsubstanz
1)	Cabernet Sauvignon-Rotwein (375 ml), enthielt 1,8 g Polyphenole pro 1
2)	Vin ordinaire-Weißwein (375 ml), enthielt 0,2 g Polyphenole pro 1
3)	Rotwein-PP-Pulver (zubereitet aus dem gleichen Wein, der Gruppe 1 gegeben wurde), 1 g in zwei Gelatinekapseln
4)	Weißwein, der 1 g Rotweinpolyphenole in Lösung enthielt (s.u.)
5)	Wodka und Limonade (10 Volumen-% Alkohol), 400 ml pro Tag
6)	50 mg Anthocyanine pro Tag, als Traubenschalenextrakt (Sefcal, St Julien de Peyrolas, Frankreich), als Getränk gegeben
7)	Rotweinmark (French Paradox' Arkopharma, Nizza, Frankreich), als Kapseln gegeben (3 pro Tag), wobei jede Kapsel 250 g Mark enthielt
8)	Traubenkern-Proanthocyanidine, als Endotelon^TM-Kapseln (Sanofi-Winthrop, Frankreich) (3 pro Tag), wobei jede Kapsel 150 mg Proanthocyanidin enthielt
9)	Grünteeextrakt (Polyphenon^TM, Mitsui Norin, Fujieda, Japan), 3 Kapseln pro Tag, wobei jede Kapsel 100 mg Tee-Katechine wie folgt enthielt: 1,6% Gallokatechin, 19,3% Epigallokatechin, 6,4% Epikatechine, 59,1% Epigallokatechingallat und 13,7% Epikatechin-Gallat.

Blutproben wurden 12 Stunden nach der Abendmahlzeit in K₃-EDTE (1 mmol/l) gezogen, vor dem Ende und am Ende des Zeitraums der Einnahme des Weinprodukts. Die Proben wurden bei 2000 × g 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. LDL wurde durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unter Verwendung eines Beckman-Tischmodells Optima TLX mit einem TLA 100.4-Rotor (Beckman, Palo Alto, CA) wie folgt separiert: Natriumbromid wurde zu dem Plasma gegeben, bis zu einer Dichte von 1,3 g/ml und unter einer Dichtelösung von 1,006 g/ml geschichtet. Das Rotieren fand mit 100.000 U/min 20 Minuten lang bei 4°C statt. Das orange-gelbe LDL-Band wurde entfernt und mit Dichtelösungen von 1,154 und 1,063 g/ml 30 Minuten lang bei 100.000 U/min und 4°C rotiert.
Die sichtbare LDL-Schicht wurde entfernt und mit 10 mM phosphatgepufferter Saline mit 2 μM EDTE bei 4°C eine Stunde lang dialysiert, wobei eine Dialyse-Kassette verwendet wurde (Pierce Slide-A-Lyzer, Perstorp Biotec Company, USA), dann mit 10 mM phosphatgepufferter Saline über Nacht.
Der Gesamtgehalt an Polyphenolen wurde in Plasma und in der LDL-Fraktion durch das Verfahren von Singleton und Rossi (1965) bestimmt. Kurz gefasst wurde der Gesamtgehalt an Polyphenolen in Plasma und LDL gemessen, indem 125 μl Plasma oder 400 μl LDL genommen und mit Wasser auf 500 μl ergänzt wurden. Dieses Gemisch wurde zu 2,5 ml Folins Reagens (1 : 10 verdünnt) und 2,0 ml Natriumkarbonat (75 g/l) hinzugefügt. Nach gutem Durchmischen wurde die Lösung bei Raumtemperatur 2,5 Stunden lang inkubiert und dann mit 2.500 U/min 8 Minuten lang zentrifugiert. Die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit wurde mit 765 nm gemessen. Gallussäure wurde als Vergleichsnorm verwendet.
Protein wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt (Bradford, 1976), wobei ein Kit verwendet wurde, der das Bioquant-Reagens enthielt (Merck, Darmstadt, Deutschland).
Zwei unabhängige Verfahren wurden verwendet, um die antioxidative Aktivität zu testen.
1) Kupferoxidation der LDL
Das Lipoprotein (50 mg LDL-Protein/l) wurde mit Kupfersulfat (5 mM) bei 37°C 5 Stunden lang inkubiert. Die Bildung von konjugiertem Dien wurde fortlaufend beobachtet, indem der Anstieg der Absorbanz bei 234 nm gemessen und die Verzögerungszeit vor der Dienbildung gemäß dem Verfahren von Esterbauer et al. (1989) bestimmt wurde. 1 zeigt einen Graph der Bildung von konjugiertem Dien (gemessen durch die Absorbanz bei 234 nm) bezogen auf die Zeit (in Minuten). Es sind typische Kurven für Proben dargestellt, die zu Beginn des Versuchs (0) und nach 2 Wochen genommen wurden. Die Verzögerungsphase wird durch Extrapolation des linearen Teils der Kurven hinunter zur x-Achse gemessen (wie durch die gestrichelten Linien dargestellt). Vorzugsweise führt die Einnahme von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu einem Anstieg der Verzögerungsphasenzeit von 2 Minuten oder mehr.
2) Plasmalipidperoxide
Alle Plasmalipide und Lipoproteine wurden selektiv unter Verwendung von PHM-L-liposorb (Calbiochem-Novabiochem, Großbritannien) entfernt. Trockenes PHM-L-liposorb (20 mg) wurde in 0,25 ml von 150 mM Natriumchlorid, das 10 mM Natriumcitrat enthielt, in einem braunen 2 ml-Mikro-Zentrifugenglas suspendiert, der Inhalt wurde gerührt und konnte 5 Minuten lang Gleichgewicht herstellen. Plasma (0,5 ml) oder Saline (Blank) wurde dann den Liposorb-Suspensionen zugegeben, gerührt und die Gläser 15 Minuten lang auf einem drehenden Mixer platziert. Nach dem Zentrifugieren (12.000 × g, 1 min.) wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Liposorb-Gel zweimal mit 1,5 ml Saline gewaschen, worauf Rühren und Zentrifugieren folgten. Das gewaschene Liposorb-Gel wurde in 1,5 ml Cholesterin-Oxidase-Iodid-Reagens (BDH-Merck) suspendiert und auf einem drehenden Mixer platziert und 60 min. gerührt. Nach dem Zentrifugieren (12.000 × g, 3 min.) bei Raumtemperatur wurde die optische Dichte der klaren überstehenden Flüssigkeit in einem Spektrophotometer bei 405 nm gegen ein Blank mit Saline gemessen (Gorog et al., 1994).
Vorzugsweise führt die Einnahme von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu einer Verringerung der Plasmalipidperoxidkonzentration um wenigstens 0,1 μmol/g Protein.
Ergebnisse
Die erhaltenen Werte wurden vor und nach der Behandlung verglichen. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse zusammen, die im Einzelnen in Tabellen 2 bis 6 aufgeführt sind. Wie in Tabelle 1 gezeigt zeigten die Produkte, die reichlich Wein-Polyphenole enthielten (Rotwein, PP1, PP2, Weißwein + PP1) einen Anstieg der Polyphenole in Plasma und LDL und eine antioxidative Aktivität in LDL, wie oben in den Tests 1 und 2 gemessen.
Die beiden Polyphenolpulver (PP1, PP2) ergaben Ergebnisse derselben Größe wie die gleichwertige Menge Rotwein.
Es gab keine Wirkung bei Weißwein, dem Anthocyaninpulver (Sefcal^TM, einem Extrakt aus Traubenschalen, der als Lebensmittelfarbstoff verwendet wird), Rotweintrester, French Paradox^TM-Kapseln (Arkopharma) oder Endotelon^TM (Sanofi-Winthrop, eine Proanthocyanidin-Zubereitung aus Traubenkernen), auch nicht bei dem Grünteeextrakt (Polyphenon^TM), der Katechine und deren Ester enthielt.
Die aktive Polyphenolzubereitung enthielt den Pool aller Polyphenole in dem Rotwein und wurde sorgfältig verarbeitet, um deren Oxidation zu vermeiden. Außerdem wurde gezeigt, dass sich der Polyphenolgehalt des Plasmas und der isolierten LDL bei den Probanden erhöhte, die Rotwein oder Polyphenolpulver aus Rotwein oder Traubenschalen erhielten.
Zur Bestätigung der antioxidativen Aktivität der Zubereitung wurde ein zweiter Test verwendet, bei dem Plasma mit einem absorbierenden Harz behandelt wurde, das Lipide und Lipoproteine und den Gehalt an Lipidperoxiden entfernte, die durch das Harz bestimmt wurden. Der Gehalt an Lipidperoxiden verringerte sich bei den Probanden, denen Rotwein oder die Polyphenolzubereitung gegeben wurde. Wieder war die Stärke der Wirkung des Polyphenolpulvers gleichwertig mit der Menge Rotwein, aus der sie gewonnen wurde.
Diese Experimente zeigen schlüssig, dass Polyphenole nach der Ingestion von Rotwein resorbiert werden und in Plasma und LDL erscheinen, und dass aus Wein isolierte Polyphenole eine ähnliche Wirkung haben können. Außerdem haben die resorbierten Polyphenole eine starke antioxidative Wirkung. Die Wirkungsweise der Polyphenole kann verschieden sein. Primär können sie Metallionen wie Kupfer und Eisen maskieren, die die Produktion von Lipidperoxiden in vivo fördern. Diese chelatierten Ionen sind als Prooxygene inaktiv. Polyphenole weisen wegen ihres hohen Gehalts an Hydroxygruppen chemische Strukturen auf, von denen bekannt ist, dass sie Metallionen chelatieren und damit ihre katalytischen Eigenschaften vernichten.
Eine weitere Wirkung kann darin bestehen, als Opfersubstanz zu wirken, die vor LDL oxidiert, wie es bei alpha-Tocopherol der Fall ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf eine bestimmte Wirkungsweise beschränkt.
Um die Bedeutung des Entfernens von EDTE aus der Zubereitung vor der kupferkatalysierten Oxidation zu erforschen, wurde ein Vergleich angestellt, wobei Dialyse mit und ohne EDTE und ein Harzsäulenverfahren verwendet wurden. Wenn EDTE dem Dialysat zugegeben wird, trat die Verlängerung der Verzögerungszeit, die von dem Rotweinpolyphenolpulver verursacht wurde, nicht auf oder war deutlich verkürzt. Eine Dialyse ohne EDTE und das Säulenverfahren führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die Tatsache, dass Autoren (de Rijke et al, 1996) bisher keine Wirkung von Rotwein bei Freiwilligen erzielen konnten, kann durch das Vorhandensein von EDTE in ihren Zubereitungen, die sie für kupferkatalysierte Oxidation verwendeten, erklärt werden.
Tabelle 1. Zusammenfassung der Ergebnisse der Freiwilligen-Studien zu Weinpolyphenolen
Tabelle 2. Wirkung von Wein und Weinprodukten auf Plasmapolyphenole mg/g Protein ± (S.D.)
Tabelle 3 Wirkung von Wein und Weinprodukten auf LDL-Polyphenole (mg/g Protein ± S.D.
Tabelle 4 Wirkung von Wein und Weinprodukten auf Plasma-Lipidperoxide (μmol/g Protein (± S.D.)
Tabelle 5 Wirkung von Wein und Weinprodukten auf die LDL-Oxidation durch Kupfer: Mittlere Verzögerungszeit in Minuten (± S.D.)
Schlussfolgerungen
Die antioxidative Aktivität von 1 Gramm Wein-Polyphenolpulver ist gleichwertig einer halben Flasche Rotwein. Eine Tagesdosis von 1–2 g Polyphenolpulver hätte eine potenzielle prophylaktische Wirkung gegen koronare Herzkrankheit. Andere Produkte wie Traubenschalenextrakt, der in der Lebensmittelindustrie als Farbstoff benutzt wird, eine Proanthocyanidin-Zubereitung, French-Paradox-Kapseln und Grünteeextrakt, der Katechine und deren Ester enthält, waren inaktiv.
Beispiel 3
Eine Kapsel wurde aus den folgenden Inhaltsstoffen durch einfaches Zusammenmischen und übliches Einschließen in die Kapsel hergestellt.

	mg
Weinpolyphenolpulver	500
Stearinsäure	25
Magnesiumstearat	50
Mikrokristalline Zellulose	25
	600 mg

Zwei bis vier Kapseln werden täglich zu oder nach den Mahlzeiten eingenommen.
Beispiel 4
Eine Kapsel wurde aus den folgenden Inhaltsstoffen durch einfaches Zusammenmischen und übliches Einschließen in die Kapsel hergestellt.

	mg
Weinpolyphenolpulver	400
α-Tocopherol	150
Folsäure 0,2 mg (1 : 50 in Verdünnungsmittel)	10
Lecithin	20
Bienenwachs	20
	600 mg

Wenigstens drei Kapseln sollten pro Tag zu den Mahlzeiten eingenommen werden.
Beispiel 5
Ein Gramm Weinpolyphenolpulver wird zu einer Trockenpulver-Diätformelzusammensetzung zugefügt, die 405 kcal pro Tag liefert (42 g Protein, 43 g Kohlehydrate und 8 g Fett, RDA-Werte an Vitaminen und Mineralien), die unter dem Handelsnamen Cambridge-Diät vertrieben wird (Cambridge Health Plan Ltd, Norwich, Großbritannien). Eine Tagesration (3 Mahlzeiten/Tag) liefert eine Aufnahme von Polyphenolen, die 0,5 l Rotwein/Tag entspricht.
Beispiel 6
0,5 g des aus Rotwein gewonnenen Gesamt-Polyphenolpools wird zu 250 ml einfachem Joghurt zugegeben, der Erdbeergeschmack und Süßstoff enthält. Das rote Polyphenolmaterial verbessert das Aussehen des Joghurts und liefert ein sehr schmackhaftes Lebensmittel mit Vorteilen für die Gesundheit.
Beispiel 7
Die folgende Formel ist die Formel eines nichtalkoholischen Getränks, das als Pulver vorgesehen ist, das mit Wasser zu mischen ist.

Dextrose-Monohydrat	300 g
Zitronensäure	32 g
Trinatriumcitrat	5 g
Grapefruit-Geschmacksstoff	6 g
Zitronengeschmacksstoff	1,4 g
Orangengeschmacksstoff	1,4 g
Aspartam	1 g
Gesamt-Weinpolyphenolpool (wie Beispiel 1)	21 g.

53 g des Pulvers wird in 1 Liter Wasser gelöst. Eine Portion von 250 ml liefert 0,75 g aktive Polyphenole.
Beispiel 8
Das Folgende ist ein alkoholisches Getränk, das als in Flaschen abgefüllte trinkfertige Mixtur vorgesehen ist.

Entgastes Tonic Water	450 ml
Wodka	50 ml
Gesamt-Weinpolyphenole (wie Beispiel 1)	1 g

Das Polyphenol wird in der stillen (entgasten) Tonic-Mixtur gelöst und dann mit Kohlendioxid unter Druck begast, damit ein sprudelndes Getränk entsteht. Portionen von 450 ml werden in Flaschen abgefüllt, der Wodka wird hinzugefügt und die Flasche mit einem Schraubverschluss verschlossen.
Beispiel 9
Etwa 2.000 kg Trester aus weißen Trauben wurde in einem handelsüblichen Mixer mit 2.500 1 destilliertem Wasser bei 30°C vier Stunden lang gut gerührt. Die Mischung wurde dann aus dem Mixer entfernt und in einen Behälter gegeben, wo sie sich zwei Stunden lang setzen konnte; danach wurde die überstehende Flüssigkeit abgenommen und gefiltert, so dass sie eine klare Flüssigkeit ergab. Der gleiche Vorgang wie in Beispiel 1 wurde dann angewandt, damit die Polyphenole auf dem Harz absorbiert wurden, wobei ähnliche Mengen an Diaion HP-20-Harz und Eluationslösung verwendet wurden.
Bei einer Konzentration der wässrigen Ethanollösung auf 35% Trockenmasse entstand ein Feststoff von roter Farbe, der ungefähr 600 g wog. Dieser war in 10%igem wässrigem Alkohol löslich und wurde dann zerstäubungsgetrocknet, um einen Feststoff zu ergeben, der in Wasser nicht löslich war, in wässrigem Alkohol aber löslich war. Die übrige Lösung wurde dann unter Stickstoff zerstäubungsgetrocknet, so dass sie 1,4 kg eines Materials von roter Farbe ergab, das etwa 50% Polyphenole enthielt. Die Zusammensetzung hiervon war ähnlich wie die in Beispiel 1 erhaltene.
Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die Prozedur zum Erhalt des Extrakts vor der Absorption auf dem Harz schwieriger und zeitaufwändiger ist. Obleich die Ausbeute geringer ist, hat die preiswerte Erhältlichkeit der Traubenschalen wirtschaftliche Vorteile.
Das pulverisierte Getränk wurde zubereitet und 5 Freiwilligen zwei Wochen lang verabreicht, entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Plan. Die Ergebnisse der Analyse der kupferkatalysierten LDL-Oxidation waren wie folgt:

Vorher 78,8 ± 7,2 min.

Nach 2 Wochen 93,0 ± 9,4 min.

Veränderung (p-Wert 0,003) 14,2 ± 4,8 min.
Es wird der Schluss gezogen, dass ein Extrakt aus Traubenschalen (in diesem Fall von weißen Trauben), d.h. Trester, ein wirksames Antioxidans sein könnte, wenn er oral 2 Wochen lang eingenommen wird.
Beispiel 10
Plasma-LDL (von der in Beispiel 2 beschriebenen Gruppe von Freiwilligen) wurde durch Ultrazentrifugieren separiert und gegen einen Phosphatpuffer dialysiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Polyphenol enthaltende Substanzen wurden durch das Verfahren von Singleton & Rossi (1965) auf ihren Polyphenolgehalt analysiert. Plasma-LDL (0,05 μg LDL in 1,0 ml) wurde mit 100 μl Kupfersulfatlösung bei 37°C inkubiert (Endkonzentration 5 μM), und die Verzögerungszeit wurde durch den kupferkatalysierten Dientest bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Fähigkeit der polyphenolhaltigen Substanzen, die Verzögerungszeit in vitro zu verlängern, wurde bestimmt, indem 4 μg Polyphenolsubstanz zu 1 ml LDL gegeben wurde, bevor das Kupfersulfat zugegeben wurde. Die getesteten Substanzen waren folgende:

1) Cabernet Sauvignon-Rotwein
2) Vin ordinaire-Weißwein
3) Rotweinpolyphenole, zubereitet wie in Beispiel 1 beschrieben
4) Sefcal^TM-Anthocyanin wie in Beispiel 2 beschrieben
5) Endotelon^TM-Proanthocyanidine wie in Beispiel 2 beschrieben
6) French Paradox-Kapseln (Rotweinmark) wie in Beispiel 2 beschrieben
7) Polyphenon^TM (Grünteekatechine) wie in Beispiel 2 beschrieben

Die Ergebnisse, die in vivo durch zweiwöchige orale Einnahme der Testsubstanzen erzielt wurden, werden mit den in vitro-Ergebnissen in Tabelle 7 unten verglichen. Die in vitro-Ergebnisse sind ein Mittel aus vier Messungen. Die Verzögerungszeit verlängerte sich bei allen Substanzen, die in einer Menge von 4 μg/ml zugegeben wurden. Die Größenordnung der beobachteten Wirkung war: Polyphenolpulver = Anthocyanine > Grünteekatechine > Traubenkern-Proanthocyanidine > Rotwein > Weißwein > Rotweinmark.
Wenn die Substanzen oral eingenommen wurden und LDL separiert und getestet wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, ergaben nur Rotwein und Rotweinpolyphenofle eine Verlängerung der Verzögerungszeit; alle anderen polyphenolhaltigen Substanzen waren inaktiv. Dies zeigt klar, dass es unmöglich ist, die in vivo-Wirkung einer Substanz aus in vitro-Ergebnissen vorherzusagen. Der Mangel an Aktivität der meisten Substanzen in vivo kann auf ihre mangelhafte Resorption durch den Darm oder ihre fehlende Aufnahme in die LDL zurückzuführen sein.
Tabelle 6 Vergleich polyphenolhaltiger Substanzen in vitro und in vivo bei dem Kupfer-Dien-Test
Beispiel 11
Zwanzig der oben genannten Freiwilligen aus Beispiel 2 wurden in Gruppen (A und B) von 6–9 Testpersonen eingeteilt und erhielten zwei Wochen lang:

A) ein Getränk (330 ml) mit dem Geschmack von schwarzer Johannisbeere, das 1 g der gesamten Rotweinpolyphenole enthielt und mit einem handelsüblichen Pulver gemischt wurde (Zucker, Zitronensäure, Natriurnzitrat-Aspartam, synthetischer Geschmacksstoff; Cambridge Manufacturing Co Ltd, Corby, Großbritannien), dem unmittelbar vor der Einnahme Wasser zugegeben wurde; oder
B) Kapseln, die Rotwein-Polyphenolpulver enthielten, zubereitet wie oben, in einer Dosis von 2g Rotweinpolyphenolen/Tag.

Die Produkte wurden gleich geteilt und nach dem Mittag- und Abendessen eingenommen.
Plasmaproben wurden entnommen und in einer Ultrazentrifuge rotiert, um LDL zu erhalten, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Drei Verfahren zur Behandlung der LDL vor der Oxidation wurden angewandt, wie unten beschrieben.
a) Enddialyse ohne EDTE
LDL wurde mit 10 mM Phospatpuffer-Saline, die 2 μM EDTE enthielt, unter Verwendung einer Dialysekassette (Pierce Slide-A-Lyzer Perstorp Biotec Company, USA) bei 4°C eine Stunde lang dialysiert, dann mit 10 mM Phosphatpuffer-Saline über Nacht.
b) Fortlaufende Dialyse mit EDTE
LDL wurde entfernt und bei 4°C wie oben dialysiert, mit der Abweichung, dass die Dialyse durchgehend mit 10 μM EDTE in 10 mM Phosphatpuffer-Saline erfolgte.
c) Säulenbehandlung
LDL wurden durch eine EcNo-pac 10DG-Entsalzungssäule (Bio-Rad Labs, Großbritannien) geleitet. Die Säule wurde zweimal mit 10 mM behandelter PBS gewaschen [Chelex-100-Harz (Bio-Rad, Großbritannien), 5 g/l PBS gemischt und dekantiert]. 600 μl LDL wurden dann auf die Säule geladen und mit 3 ml PBS-Puffer eluiert, bei einem Durchsatz von 0,6 ml/min unter Verwendung einer Ismatec IPC peristaltischen Pumpe (Ismatec, Weston Super Mare, Großbritannien).
Eine kupferkatalysierte Peroxidierung wurde anschließend durchgeführt und die Verzögerungszeit wie bei Beispiel 2 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgelistet.
Die Einnahme von Rotweinpolyphenolen entweder als Getränk (1 g/Tag) oder Kapseln (2 g/Tag) führten zu einem Anstieg der Verzögerungszeit (wenn EDTE bei dem End-Dialysat weggelassen wurde) von 30% bzw. 21%, und ebenso bei dem Säulenverfahren von 12% bzw. 22%. Die Zugabe von EDTE zu dem Dialysat vernichteten die Wirkung bei 1 g Rotweinpolyphenolen pro Tag und führten nur zu einem geringen Anstieg der Verzögerungszeit von 7% bei 2 g/Tag.
Tabelle 7 Verzögerungszeiten (min) bei kupferkatalysierter Peroxidation unter Verwendung verschiedener Verfahren zum Entsalzen von LDL
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Zubereitung aus aktiven Polyphenolen (zweckmäßigerweise aus Trauben, Wein oder Weinnebenprodukten) zur Behandlung der koronaren Herzkrankheit und anderer Krankheiten, die mit der Vermehrung glatter Muskelzellen in Zusammenhang stehen, wie Atherosklerose, Restenose, Schlaganfall und Neoplasien des Darms und des Uterus, uterinen Fibroiden oder -fibromen zur Verfügung zu stellen.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass es möglich ist, eine Polyphenolzusammensetzung zuzubereiten (z.B. aus Rotwein), die, wenn sie einer menschlichen Person oral verabreicht wird, die Produktion des totalen und aktiven TGF-β-1 stimuliert.
Es ist gezeigt worden, dass, wenn Rotwein oder eine Zubereitung aus Polyphenolen, die aus Rotwein gewonnen werden, als Pulver oder Getränk vorgesehen ist und dem Menschen oral verabreicht wird, ein Anstieg des totalen und aktiven TGF-β-1 in Plasma auftritt. Weißwein, der wenig Polyphenole enthält, ist inaktiv.
Die Dosierung der Polyphenolzubereitung hängt von dem Grad der Aktivität des Materials ab, liegt jedoch zwischen 10 mg und 10 g pro Tag. Für den aus Wein gewonnenen Gesamt-Polyphenolpool liegt die bevorzugte Dosis bei 0,1–4 g/Tag, noch bevorzugter bei 1–2 g/Tag, was gleichwertig ist mit 0,5 bis 1 l Rotwein pro Tag.
Beispiel 12
Rotwein, Weißwein und eine Polyphenolzubereitung aus Rotwein (wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben) in Form eines Pulvers oder Getränks, der menschlichen Personen oral verabreicht wird, wurden auf ihre Wirkungen auf Plasma-TGF-β untersucht.
Gesunde Freiwillige (30 Männer im Alter von 35 bis 65 Jahren) wurden gebeten, zwei Wochen mit dem Weinkonsum auszusetzen. Sie erhielten entweder 375 ml Rotwein oder Weißwein oder 1 g des Gesamtpools der Rotweinpolyphenole (zubereitet aus dem gleichen Cabernet Sauvignon-Wein wie oben) entweder als Kapseln oder als Getränk mit Geschmacksstoffen in 330 ml Wasser. Jede Nahrungsergänzung wurde über einen Zeitraum von zwei Wochen zweimal täglich nach den Mahlzeiten eingenommen.
Blutproben wurden nach der Behandlung in K₃ EDTE (1 mmol/l) gezogen und zentrifugiert, um das Plasma zu erhalten, das vor der Untersuchung bei –70°C gelagert wurde. Die Gesamtheit der Plasmapolyphenole wurde mit dem Verfahren von Singleton und Rossi (1965) gemessen. Das gesamte TGF-β-1 wurde durch Immunoassay bestimmt, wobei zwei verschiedene polyklonale Antikörper verwendet wurden (Verfahren 1 & 2, unten beschrieben):
Verfahren 1
Das gesamte (latente und aktive) TGF-β wurde mit einem Quantikine®-Immunoassaykit für menschliches TGF-β, das von R&D Systems (Abingdon, Oxford, Großbritannien) geliefert wird, bestimmt. Bei dieser Untersuchung wird die quantitative Sandwich-Immunoassay-Technik verwendet. Ein TGF-β-löslicher Typ-II-Rezeptor bindet TGF-β-1, das auf einer Mikrotitrierplatte anschwemmfiltriert wurde. Referenzmaterial und Proben werden in die Behälter gegeben, und vorhandenes TGF-β-1 wird durch den immobilisierten Rezeptor gebunden. Nach dem Auswaschen ungebundener Substanzen wird ein enzymgekoppelter polyklonaler Antikörper, der spezifisch für TGF-β-1 ist, in die Behälter zugegeben, um das TGF-β-1 sandwichartig zu umschließen, das während der ersten Inkubation immobilisiert wurde. Nach einer Waschung zum Entfernen von ungebundenem Antikörper-Enzym-Reagens wird eine Substratlösung in die Behälter zugegeben, die mit dem Enzym eine Farbe erzeugt. Die Intensität der entwickelten Farbe ist proportional zu dem vorhandenen TGF-β-1.
Vor der Durchführung der Untersuchung wird latentes TGF-β in die aktive Form umgewandelt, indem Essigsäure und Harnstoff zugefügt werden, 10 Minuten inkubiert und dann mit Natriumhydroxid/HEPES-Lösung neutralisiert wird. Mit diesem Verfahren wird (latentes und aktives) TGF-β-1 geschätzt. Die Aktivierung des latenten TGF-β wurde wie folgt durchgeführt: Zu 0,1 ml Plasma wurde 0,1 ml von 2,5 N Essigsäure/10 M Harnstoff zugegeben, gut gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zu dieser Lösung wurde 0,1 ml von 2,7 N NaOH/1 M HEPES zugegeben, um die Probe zu neutralisieren, und gut gemischt. Vor der Untersuchung wurde die aktive Plasmaprobe mit Kalibrierungs-Verdünnungsserum RD6M, das vom Hersteller des Kits geliefert wird, 10-fach verdünnt.
Die Untersuchungsprozedur war folgende: 200 μl der Probe oder des Referenzmaterials wurde in jeden Behälter der Mikrotitrierplatte gegeben. Die Platte wurde dann mit einem Haftstreifen aus Kunststoff bedeckt und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Jeder Behälter wurde dann abgesaugt und dreimal mit 400 μl Waschpuffer gewaschen. 200 μl TGF-β-1-Konjugat wurde dann in jeden Behälter gegeben und die Platte wieder mit einem neuen Haftstreifen bedeckt und bei Raumtemperatur 110 Minuten inkubiert. Die Behälter wurden dann abgesaugt und dreimal mit 400 μl Waschpuffer gewaschen. 200 μl Substratlösung wurde in die Behälter gegeben und die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 50 μl von 2 N H₂SO₄-Lösung wurde dann in jeden Behälter zugegeben und die optische Dichte bei 450 nm gemessen.
Verfahren 2
Im Wesentlichen wurde das gleiche Verfahren angewandt wie oben, mit dem Unterschied, dass TGF-β nicht vor der Schätzung aktiviert wurde und anstelle des polyklonalen Antikörpers für TGF-β-1 ein BDA-19-Antikörper (R & D Systems, Abingdon, Oxford, Großbritannien) verwendet wurde. Mit diesem Verfahren wird eine aktive Form von TGF-β-1 geschätzt.
Vorzugweise erzeugt die Einnahme einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung einen Anstieg der TGF-β-1-Spiegel bei der Person um wenigstens 1,5 ng/ml, gemessen durch Verfahren 1, oder wenigstens 0,5 ng/ml, gemessen durch Verfahren 2.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 8 dargestellt, stiegen die Plasmapolyphenole bei Rotwein an, jedoch nicht bei Weißwein, sowie bei bei den Polyphenol-Kapseln und dem Polyphenol-Getränk. Ein Anstieg des TGF-β-1 wurde bei beiden Verfahren bei Rotwein sowie bei den Polyphenol-Kapseln und dem Polyphenol-Getränk, jedoch nicht bei Weißwein beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Rotweinpolyphenole sowohl die Gesamtmenge an (latentem und aktivem) TGF-β-1 als auch einer aktiven Form von TGF-β-1 erhöht. Es wird der Schluss gezogen, dass Weinpolyphenole das gesamte TGF-β-1 erhöhen und das Potenzial zur Hemmung der Vermehrung von VSMC haben.
Tabelle 8 Wirkung von Wein und Rotweinpolyphenolen auf Plasmapolyphenole und das gesamte TGF-β durch zwei verschiedene Untersuchungsverfahren
Die Erfinder sind außerdem überraschend zu der Erkenntnis gelangt, dass es möglich ist, eine Polyphenolzusammensetzung (z.B. aus Rotwein) zuzubereiten, die, wenn sie einer menschlichen Person oral verabreicht wird, die Thrombozyten-Aggregation hemmt und die Fibrinolyse stimuliert.
Insbesondere ist gezeigt worden, dass, wenn eine Zubereitung von aus Rotwein gewonnenen Polyphenolen dem Menschen oral verabreicht wird, eine Verringerung der Thrombozyten-Aggregation auftritt, wenn Arachidonsäure, ADP, Collagen oder Thrombin als Agonisten verwendet werden. Außerdem verstärkt die Einnahme der Polyphenolzubereitung die t-PA-Aktivität im Plasma der Person.
Die Dosierung der Polyphenolzubereitung hängt von dem Grad der Aktivität des Materials ab, liegt jedoch zwischen 10 mg und 10 g pro Tag. Wenn die Zusammensetzung den aus Rotwein gewonnenen Gesamt-Polyphenolpool enthält, liegt die bevorzugte Dosis bei 0,1 bis 4,0 g/Tag, noch bevorzugter 1 bis 2 g, was gleichwertig ist mit 0,5 bis 1 l Rotwein pro Tag.
Beispiel 13
Eine Rotweinpolyphenol-Zusammensetzung wurde zubereitet wie zuvor beschrieben (Beispiel 1 oben).
Die Ernährung von zwölf gesunden Männern im Alter von 35 bis 65 Jahren wurde zwei Wochen lang mit 2 g Rotweinpolyphenolen (wie in Beispiel 2 beschrieben) oder Aspirin (75 mg) pro Tag ergänzt. Nüchtern zitriertes Blut wurde als Basislinie sowie vier Stunden und zwei Wochen nach Beginn des Versuchs wie folgt entnommen: Blut wurde bei minimaler Stasis aus der vorkubitalen Vene entnommen, wobei der Proband in ruhender Stellung war, und in eine Spritze geleitet, die 0,11 M Zitrat enthielt (1 : 9 v/v zu Blut). Thrombozytenreiches Plasma (TRP) wurde präpariert, indem Blut bei 250 g 10 Minuten lang zentritfugiert wurde. Das meiste TRP wurde entfernt, und das thrombozytenarme Plasma (TAP) wurde dann präpariert, indem das restliche Blut bei 2,500 g 15 Minuten lang zentrifugiert wurden. Die Konzentration der Thrombozyten in dem TRP wurde in einem Zellzähler (Minos STX, ABX Ltd, Montpellier, Frank reich) bestimmt. Proben mit einer Thrombozytenzahl außerhalb des Bereichs von 150.000 bis 350.000 pro μl wurden als Ausschuss behandelt. Das TRP konnte wenigstens 30 Minuten lang ruhen, bevor die Aggregationsuntersuchungen begannen. Die Zeit zwischen der Blutentnahme und der Thrombozyten-Aggregation betrug nie mehr als drei Stunden.
Thrombozyten-Aggregation wurde an den frisch präparierten Thrombozyten unter Verwendung eines PAP-4C-Aggregationsmessers bestimmt (BioData, Alpha Laboratories, Southampton, Großbritannien). Eine 200 μl-Probe von TRP wurde in eine silikonisierte Küvette gegeben und bei 37°C 3 Minuten lang inkubiert. Die Aggregation wurde induziert, indem 20 μl des Agonisten zugefügt wurde (einer der folgenden: Arachidonsäure mit 455 μg/ml; ADP mit 1,8 μmol/l; Collagen mit 43 μg/ml, bezogen durch BioData; Thrombin mit 0,11 U/ml, bezogen durch Sigma, Poole, Dorset, Großbritannien; jeweils Endkonzentrationen in dem Aggregationsgemisch). Die Thrombozytensuspension wurde mit 1.000 U/min bei 37°C 5 Minuten lang gerührt. Die maximale Aggregation (in Prozent von der Basislinie) wurde innerhalb dieser Zeit bestimmt. Der Wert war ein Maß des Aggregationspotenzials der Thrombozyten, wobei eine Verringerung eine Anti-Aggregations-Reaktion anzeigte, wenn Proben verglichen wurden, die vor und nach der Einnahme des Testmaterials gezogen worden waren. Die statistische Signifikanz wurde durch den Paar-t-Test bewertet.
Das Rotweinpolyphenol-Pulver hemmte die Thrombozyten-Aggregation entweder akut oder chronisch, wie in Tabelle 9 gezeigt. Diese Wirkungen sind ähnlich, aber schwächer als die bei Aspirin beobachteten (75 mg pro Tag), außer bei Thrombin. Insbesondere legt die Wirkung der Polyphenole auf die arachidonatinduzierte Aggregation eine Hemmung der Cyclo-Oxygenase-Aktivität der Thrombozyten nahe. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Rotweinpolyphenole aspirinartige Wirkungen haben, obgleich es eine zusätzliche hemmende Wirkung auf die thrombininduzierte Aggregation gibt.
Tabelle 9 Maximale Thrombozyten-Aggregation bei Freiwilligen, denen Rotweinpolyphenole oder Aspirin (%) verabreicht wurden. Mittel (SEM)
Der gleiche Versuch wurde verwendet, um die Niveaus der PAI-1 und t-PA-Aktivität bei den Probanden zu untersuchen. Blut wurde mit minimaler Stasis aus der vorkubitalen Vene entnommen, wobei der Proband in ruhender Stellung war, und in eine Spritze geleitet, die 0,5 M Zitrat mit pH 4,3 enthielt (Stabilyte^TM, 1 : 9 v/v zu Blut). Plasma wurde präpariert, indem Blut bei 2,500 g bei 4°C 15 Minuten lang zentrifugiert und sofort bei –70°C eingefroren wurde.
Alle drei Proben (Basislinie, 4 Stunden und 2 Wochen) von einem Probanden wurden am Untersuchungstag rasch bei 37°C aufgetaut. t-PA-Aktivitäten wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Chromolize^TM, von Biopool, Umea, Schweden), der ein biofunktionaler Immunosorbens-Test ist, bestimmt. Die Probe oder das Referenzmaterial (100 μl) wurden in jeden Behälter gegeben. Die Mikrotitrierplatte wurde in einem Plattenrüttler 20 Minuten lang inkubiert, woraufhin die Inhalte der Behälter entfernt wurden und die Behälter 4 Mal gewaschen wurden. Als Nächstes wurden 50 μl Substratlösung in jeden Behälter gegeben, gefolgt von 50 μl Plasminogen-Reagens, und die Platte wurde weitere 90 Minuten lang inkubiert. Schließlich wurden 50 μl von 1,7 M Eisessiglösung in jeden Behälter zugefügt und 15 Sekunden lang gemischt. Absorbances wurden bei 405 nm gemessen, und die Aktivität der t-PA in der Probe wurde von einer linearen Eichkurve gemessen. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Werten der Basislinie, 4 Stunden und 2 Wochen wurde für jede Behandlung durch einen zweiseitigen Paar-t-Test bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt.
Das Enzym t-PA bildet ein wichtiges Protein auf dem Weg der Fibrinolyse, und es wird angenommen, dass seine Aktivität eine bedeutende Rolle im fibrinolytischen System spielt. Die physiologische Rolle von t-PA ist das Aktivieren von Plasminogen zu Plasmin, das Fibrin zu löslichen Fibrin-Abbauprodukten abbaut. Beim t-PA-Test ist der spezifische Inhibitor PAI-1 meistens in starkem Übermaß vorhanden und muss daran gehindert werden, die t-PA-Aktivität zu unterdrücken. Dafür sorgt die Verwendung von Stabilyte^TM-Blutentnahmeröhren, die eine milde Säuerung der Probe vorsehen.
Da PAI-1-Werte bekanntlich diurnalen Abweichungen unterliegen, wurde ein zusätzlicher Versuch durchgeführt, bei dem dieselben Probanden untersucht wurden, wobei Wasser als Placebo anstelle von Rotweinpolyphenolen verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgelistet.
Tabelle 10 PAI-1 und t-PA nach Supplementierung mit Rotweinpolyphenolen (2 g/Tag) Mittel ± SEM
Tabelle 11 Vergleich von 2 g Rotweinpolyphenolen mit Wasser nach 4 Stunden PAI-1-Antigen (ng/ml) (n = 11)
t-PA-Aktivität (IU/ml) (n = 9)
Rotweinpolyphenole (2 g/Tag) verursachten eine signifikante Verringerung von PAI-1 nach 4 Stunden, die mit einem signifikanten Anstieg der t-PA-Aktivität einherging (Tabelle 10). Keine Veränderungen zeigten sich nach einem Fasten über Nacht nach zweiwöchiger Behandlung. Wie jedoch Tabelle 11 zeigt, verringert sich nach 4 Stunden die PAI-1-Antigenkonzentration nach Verabreichung von Wasser, was darauf hindeutet, dass die Wirkungen der PAI-1-Antigenkonzentration, die nach der Einnahme von Polyphenolpulver beobachtet wurden, einfach auf diurnale Abweichung zurückzuführen waren. Die Verabreichung von Wasser erhöhte die t-PA-Aktivität jedoch nicht wesentlich, während Rotweinpolyphenol-Pulver eine 2,7-fache Erhöhung der t-PA-Aktivität bewirkte. Es wird der Schluss gezogen, dass Rotweinpolyphenole eine positive Wirkung bei der Stimulation der Fibrinolyse bewirken, indem die t-PA-Aktivität erhöht wird, jedoch keine Auswirkung auf die PAI-1-Antigen-Konzentration haben. t- PA fördert die Bildung von Plasmin aus Plasminogen, und Plasmin wandelt die latente Form von TGF-β in die aktive Form um, die dann das Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) hemmt, die zum Wachstum von atherosklerothischen Plaques beitragen.
Vorzugsweise verursacht die Einnahme einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine Verringerung der maximalen Thrombozyten-Aggregation um wenigstens 2% (bestimmt durch das oben beschriebene Verfahren) und/oder einen Anstieg der t-PA-Aktivität von wenigstens 0,75 IU/ml (bestimmt durch das oben beschriebene Verfahren).
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Claims

Aus Pflanzen gewonnene, Flavonol enthaltende trockene Zusammensetzung, die für den Verzehr durch Menschen geeignet ist und aus Weintrauben, Wein oder Flavonol enthaltenden Nebenprodukten oder Abfallprodukten der Weinherstellung gewonnen wird, wobei wenigstens 25% des aus Pflanzen gewonnenen Materials in der Zusammensetzung Polyphenole enthält, wobei die Zusammensetzung wenigstens 0,1 Nassgewichts-% Flavonol enthält und wobei der Verzehr der Zusammensetzung durch eine menschliche Person eine oder mehrere der folgenden Wirkungen auf diese Person hat: Hemmung der LDL-Plasma-Oxidation; Stimulation der TGF-β-Produktion; Hemmung der Thrombozyten-Aggregation; und Stimulation der Fibrinolyse.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der der Flavonolgehalt wenigstens 1% (Nassgewicht) beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, bei der der Flavonolgehalt wenigstens 0,5% des gesamten aus Pflanzen gewonnenen Polyphenolgehalts der Zusammensetzung enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, bei der der Flavonolgehalt wenigstens 1,0% des gesamten aus Pflanzen gewonnenen Polyphenolgehalts der Zusammensetzung beträgt.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der der Flavonolgehalt wenigstens 2% des gesamten aus Pflanzen gewonnenen Polyphenolgehalts der Zusammensetzung beträgt.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, die die Gesamtheit der Polyphenole aus Rotwein enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, die ein Bindemittel, einen Verdünner oder einen Träger enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, die eine oder mehrere Substanzen enthält, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus folgenden Substanzen besteht: Nährstoffe, Antioxidanzien, therapeutische Substanzen (speziell diejenigen, die eine therapeutische Wirkung in Bezug auf die Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen der Herzkranzgefäße haben), Geschmacksstoffe und Süßungsmittel.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, die eine oder mehrere Substanzen enthält, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus folgenden Substanzen besteht: Lutein, Lycopin, α- oder β-Karotin, Vitamin A, Vitamin C, Vitamin E (α-Tocopherol und andere aktive Tocopherole), Folsäure, Selen, Kupfer, Zink, Mangan, Ubichinon (Coenzym Q), Salicylsäure, 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure und Aspirin.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, als Einzeldosis verpackt.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche in Form einer Tablette, Kapsel oder Pille.
Verfahren zur Herstellung eines Getränks, das das Mischen einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 mit einer physiologisch aufnehmbaren Flüssigkeit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die physiologisch aufnehmbare Flüssigkeit Wasser, eine wässrige Lösung, eine alkoholische Lösung, Fruchtsaft, Milch oder Joghurt enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Einnahme durch eine menschliche Person für eine Hemmung der Oxidation von LDL-Plasma bei der Person.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Einnahme durch eine menschliche Person zur Stimulierung der TGF-β-Produktion bei der Person.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Einnahme durch eine menschliche Person zur Hemmung der Thrombozyten-Aggregation und/oder zur Stimulierung der Fibrinolyse bei der Person.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Einnahme durch eine menschliche Person mit dem Zweck, bei der Person eine oder mehrere der folgenden Wirkungen zu erzielen: Hemmung der LDL-Plasma-Oxidation, Hemmung der Thrombozyten-Aggregation, Stimulierung der Fibrinolyse und Stimulierung der TGF-β-Produktion, wobei das Verfahren die Zubereitung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und die Herstellung von Einzeldosen der Zusammensetzung umfasst.