KR20000048486A - 플라보놀 함유 식품 보충물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조성물중의 25% 이상의 식물 유도 물질이 폴리페놀을 포함하고 있는, 사람이 소모하기에 적합한 식물 유도 플라보놀 함유 건조 조성물, 및 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

플라보놀 함유 식품 보충물 {FLAVONOL CONTAINING FOOD SUPPLEMENTS}

프랑스에서의 높은 포도주 소모량은 관상동맥성심장병(CHD) 사망률의 저발병률의 중요한 식이 요소인 것으로 생각되며, "프렌치 파라독스(French Paradox)"(레나우드 앤드 데 로르게릴(Renaud & De Lorgeril) 1992)로서 공지된 현상에 대하여 가능한 설명을 적어도 부분적으로 제공하는 것으로 제시되어 왔으며, 프랑스는, 포화 지방의 높은 섭취에도 불구하고 CHD 사망률이 낮기 때문에, 대부분의 다른 국가들과 비교하여 예외이다.

관상동맥성심장병(CHD)의 예방과 관련하여 명백히 유리한 적포도주 효과에 관해 상당량의 문헌이 있다. 유행병학적 데이터는 포도주에 의해 제공된 보호가 맥주 및 주정과 같은 그 밖의 알코올성 음료 보다 우수하다는 것을 제안하고 있으며, 포도주내 알코올 함량 이외의 요소가 이러한 효과에 기여함을 나타낸다[참고문헌: St Leger et al., 1979; Renaud & De Lorgeril 1992]. 덴마크 코펜하겐의 예기 연구에서, 다양한 파라미터(알코올 섭취, 흡연 습관 및 체중 지수를 포함하는)가 사망률에 관한 12년간 지속된 추적조사에 의해 13,285명의 사람에게서 평가되었다. 포도주의 저섭취량에서 중간 정도의 섭취량에 이르기까지의 섭취량이 심장혈관 및 뇌혈관 질환 및 그 밖의 원인으로부터의 보다 낮은 사망률과 관련되어 있다는 것이 입증되었다[Gronbaek et al., 1995]. 이들 결과는 USA에서 이전에 보고된 결과를 확인하는 것이었다[Klatsky & Armstrong, 1993].

저밀도 리포단백질(LDL)의 산화반응을 수반하는 지질 과산화반응의 자유 라디칼 연쇄 반응이 아태롬성동맥경화증 및 CHD의 성장에 지대한 역할을 한다는 증거가 증가하는 추세다[Steinberg, 1993].

프랭클(Frankel) 등[Lancet 1993 341, 454-457]은 체외에서 사람의 LDL의 산화반응을 억제하기 위한 묽은 탈알코올화된 적포도주의 능력을 조사하여, 포도주가 산화방지제로서 매우 유효하다는 것을 밝혔다. 상기 문헌의 저자는 적포도주의 일상적인 소모가 "리포단백질의 산화반응을 감소시키고 혈전증 현상을 감소시킬 수 있다"고 제안하였다. 그러나, 상기 문헌의 저자는 "우리가 CHD를 감소시키는데 있어 적포도주내에 있는 산화방지 화합물의 잠재적인 역할을 보다 구체적으로 파악하기만 한다면..., 우리는 포도주 플라보노이드의 약물 동력학 및 포도주 페놀의 흡수 및 대사에 관해 더 알아야 한다"는 것을 인정했다.

플라보노이드는 폴리페놀(PP)로 불리어지는 물질군에 속하는데, 이렇게 불리는 이유는 둘 이상의 페놀기를 함유하기 때문이다. 폴리페놀은 적포도주에 풍부하게 존재하며, 다양한 분자량을 갖는 다수의 상이한 화학물질로 구성된다. 포도 및 포도주의 주된 폴리페놀 성분, 및 이들의 농도는 문헌[Shahi야 & Nazck (1995) in "Food phenolics: sources, chemistry, effects and applications" (미국 펜실베니아 랜캐스터에 소재하는 테크노믹 퍼블리슁 컴파니(Technomic Publishing Co.)) p136-146]에 기술되어 있다. 폴리페놀 중에서도 특히 플라보노이드(일반적으로 폴리페놀을 지칭하는데 종종 사용되는 용어지만 유럽에서는 보다 공통적으로 플라본으로만 지칭됨), 플라보놀(프로시아니돌, 프로시아닌, 프로시아니딘 및 탄닌으로도 불리움), 프로안토시아니딘 및 안토시아닌이 중요하다,

플라본은 두 개의 벤젠 고리(A 및 B)가 카르보닐기를 함유하는 헤테로고리 6원 고리 C와 연결되어 있는 도 2에 도시된 기본 구조를 갖는 화합물이다. 고리 B는 위치 2 (도시된 바와 같이)에 결합되어 플라본을 제공할 수 있거나, 고리 3에 결합되어 이소 플라본을 제공할 수 있다. 히드록실화반응은 위치 3, 5, 7 및 3', 4', 5',에서 일어나서 플라보놀이라 불리는 화합물을 제공할 수 있다. 플라보놀의 전형적인 예로는 쿼세틴(위치 3, 5, 7, 3', 4'에서 히드록실화된), 캠프페롤(위치 3, 5, 7, 4'에서 히드록실화된), 및 미리세틴(위치 3, 5, 7, 3', 4', 5'에서 히드록실화된)이 있다. 이들은 아글리콘 또는 O-글리코시드(예를 들어, D-글루코오스, 갈락토오스, 아라비노오스, 램노오스 등)로 천연적으로 존재할 수 있다. 메틸화반응, 술페이션 및 말로닐화반응과 같은 그 밖의 형태의 치환도 발견된다.

플라보놀은 도 3에 도시된 기본 구조를 갖는다. 두 개의 가장 공통적인 플라보놀은 카테킨(히드록실기 위치 5, 7, 3', 4') 및 이의 입체이성질체 에피-카테킨이다. 히드록실기는 갈산과 에스테르화될 수 있다(도 4 참조). 프로안토시아니딘은 카테킨 및/또는 에피카테킨의 중합체이며, 8개 이하 또는 그 이상 함유할 수 있다.

안토시아닌은 도 5에 도시된 기본 구조를 갖는 착색된 물질이다. 이들의 종종 안토시아니딘으로 불린다. 전형적인 예로는 시아니딘(위치 3, 5, 7, 3', 4'에서 히드록실화된), 델피니딘(위치 3, 5, 7, 3', 4', 5'에서 히드록실화된) 및 펠아르고니딘(위치 3, 5, 7, 3'에서 히드록실화된)이 있다. 히드록실기는 보통 글리코실화되고/거나 메톡실화된다(예를 들어, 3', 5'에서 말비딘).

본원에서 사용되는 용어 "폴리페놀"은 디히드록시- 또는 트리히드록시 벤조산 및 피토아렉신에 포함되며, 이들의 전형적인 예는 레스베라트롤(resveratrol)(도 6에 도시됨)이다.

LDL 산화반응을 결정하기 위한 가장 널리 사용되는 방법은 촉매로서 전이금속 구리(특히 Cu2+ 이온)을 사용하여 내인성 지질 히드로퍼옥시드의 산화반응을 촉진시키는 것이다. LDL중에 존재하는 산화방지제, 특히 알파 토코페롤은 산화반응 공정을 지연시키며 소위 래그 페이즈(lag phase)를 생성시킨다. 산화반응이 234nm에서 연속적으로 모니터링될 수 있는 컨쥬게이션된 디엔을 생성시키기 때문에, 상기 방법은 UV 분광광도계에서 용이하게 수행될 수 있다. 저장 동안 LDL의 산화를 방지하기 위해서, EDTA가 착물 구리 및 그 밖의 미량 원소에 첨가된다. 이러한 과량의 EDTA는 구리 촉매 산화반응을 방해한다. EDTA는 구리 이온의 첨가 전에 LDL 제조물을 투석시킴으로써 제거될 수 있거나 과량의 구리 이온이 첨가되어 EDTA와 착화된 이온들을 보충할 수 있다.

프랭클 등[Lancet 1993, 상기 인용]에 의해 기술된 결과와 다소 유사한 시험관내 실험의 결과는 1995년에 프랭클에 의해 보고되었다[J. Agricult. and Food Chemistry 43, 890-894]. 이 문헌의 저자는 시험관내 데이터는 해석하는데 어렵다는데 유의한다. 이와 같이, "페놀계 화합물이 유사한 화학 특성을 지니고 있을 지라도 이들의 환원 능력은 이들의 산화방지제 활성의 매우 정확한 예측은 아니다. LDL 산화반응 검정 및 산화방지제 활성을 위한 그 밖의 시험에서, 시스템은 전형적으로 불균질하며, 친지성, 용해도 및 LDL의 수성상과 지질상 사이의 분배와 같은 물리적 특성은 산화방지제 활성을 결정하는데 중요하게 될 수 있다".

실제로, 당업자는 시험관내에서의 발견으로부터 체내 상태까지의 외삽이 종종 부적합하다는 것을 인정한다. 일례로서, 맥룬(McLoone) 등의 문헌(1995 Proc. Nutr. Soc. 54, Abstract 168A)을 들수 있으며, 상기 문헌은 화합물 루테인이 시험관내에서 LDL 산화반응을 억제하는 잠재성을 지니고 있지만, 2주 동안 루테인으로 사람 지원자의 식이 보충(혈장내에서 루테인의 수준을 6배 증가시킴)은 LDL 산화반응에 전혀 효력이 없었음을 보여준다.

적포도주의 가능한 건강상의 이점을 연구하기 위해 일부 체내 연구가 수행되었다. 푸흐르맨(Fuhrman) 등(1995 Am. J. Clin. Nutr. 61, 549-554)은 "적포도주내에 존재하지만 백포도주에는 존재하지 않는 일부 폐놀계 물질이 혈장 LDL에 흡수되어 결합하고, 적포도주의 산화방지제 특성을 유발시킬 수 있으며", "적포도주 소모가 LDL의 성향을 억제하여 지질이 과산화반응되어진다"는 첫 번째 증거에 따라, 적포도주가 아태롬성동맥경화증의 감쇠에 기여할 수 있다는 것을 발견하였다. 그러나, 샤프(Sharpe) 등에 의한 연구, 푸흐르맨 등의 연구와 거의 동시적으로 만들어진 결과[참고문헌: Q.J. Med. 1995 88, 101-108]는 적포도주 또는 백포도주의 소모가 "전체 콜레스테롤, 트리글리세리드, HDL 또는 산화방지제 상태의 측정(산화반응에 대한 LDL의 민감도를 포함)에 대하여 어떠한 영향도 미치지 않음"을 드러냈다.

드 리지케(De Rijke) 등은 또한 물질을 조사하고 무작위 이중맹검법을 수행하였다. 이들은 1996년[Am. J. Clin. Nutr. 63, 329-334]에 이들의 발견을 보고하면서 "이러한 연구 결과는 LDL 산화반응에 대한 적포도주의 유리한 효과를 나타내지는 않는다"고 진술했다.

이와 같이, 요약하면, 묽은 적포도주가 시험관내 검정에서 LDL 산화반응을 억제할 수 있다는 수개의 보고서가 있지만, 이러한 발견이 체내 상황으로 반드시 확대될 수는 없다. 또한, 적포도주 소모에 의한 LDL 산화의 억제와 관련된 체내 데이터는 기껏해야 상충되며 적포도주가 LDL 산화반응에 어떠한 영향을 미친다고 제안하는 어떠한 명백한 증거도 없다.

적포도주 또는 포도 부산물로부터 제조되고 (조성물중의 일부가 매우 저수준임에도 불구하고) 폴리페놀을 함유할 수 있는 다수의 조성물이 현재 공공연하게 시판되고 있다. 이들 중에서도 특히 프렌치 파라독스 캡슐(아르코파르마시아(Arkopharma)가 시판)이 중요하다. 프렌치 파라독스 캡슐은 찌꺼기(포도주 발효 후 남는 포도 껍질)로부터 추출물을 제조함으로써 만들어진다. 포도 껍질에 존재하는 대부분의 폴리페놀은 알코올 가용성이어서 발효 포도주로 추출되는 경향이 있다. 따라서, 프렌치 파라독스 캡슐은 실제적으로 오히려 낮은 폴리페놀 함량을 갖는다. (그 밖의 공공연하게 시판중인 조성물은 포도 껍질 추출물로부터 제조되고 식품 착색제로서 사용되는 안토시아닌 함유 분말(세프칼(Sefcal))로부터 구입), 및 포도 종자로부터 제조되는 프로안토시아닌 함유 조성물("엔도텔론(Endotelon)")을 포함한다.)

프렌치 파라독스 캡슐이 상당량의 폴리페놀을 함유해도, 이러한 합성 폴리페놀 조성물의 경구적 소모가 이른바 적포도주 소모와 관련된 동일한 치료 효과를 미칠 것이라는 것은 분명하지 않다. 예를 들어, 골드베르그[참고문헌: 1995 Clin. Chem. 41, 14-16]에 의해 설명된 바와 같이, 포도주의 알코올 함량은 포도주 및 사람의 장에서 폴리페놀을 용액 형태로 유지시켜 이들이 흡수에 이용될 수 있게 할 수 있다. 폴리페놀이 흡수시키려는 (알코올 부재하에서) 장에서 충분히 가용성이 아니기 때문에, 알코올 유리된 합성 폴리페놀 분말은 완전하게 효과가 없을 수도 있다. 또한, 혈류로의 흡수는 LDL에 관한 미쳐지는 산화방지 효과에 충분하지 않을 수도 있다 - LDL 분획과 폴리페놀의 친밀한 관계가 요구될 수도 있다.

자유 라디칼 산화반응 메카니즘에 의해 많은 질병, 예를 들어 암, 백내장, 당뇨병 등이 야기되거나 유발됨이 인지된다. 비타민 E, 비타민 C 및 그 밖의 다른 것들과 같은 산화방지 영양분은 많은 기관 및 조직에서 자유 라디칼 산화반응을 억제하는 것으로 생각된다. 이와 같이, 효과적인 산화방지제인 폴리페놀의 흡수는 자유 라디칼/산화반응 질병에 영향을 미칠 것 같으며, 폴리페놀의 용도는 관상동맥성심장병의 치료 또는 예방보다도 훨씬 광범위할 것이다.

그럼에도 불구하고, CHD는 서방 세계의 사망률 및 질병률의 주된 원인중의 하나이며, 그러므로 특히 관심을 모은다. 질환의 발병은 아태롬성동맥경화 플라크의 발전, 이어서 동맥 폐색증을 야기시킬 수 있는 플라크상에 혈전(응혈)의 형성(혈전증이라 불리는 과정)을 수반하는 두 단계 과정으로 이루어지는데, 상기 과정의 결과는 심근경색(MI) 또는 급사일 수 있다. 혈전증에 의해 야기되는 그 밖의 질환은 발작 및 정맥 혈전증이다. 혈전 형성에 있어 초기 단계는 혈소판의 응집이며, 그런 다음, 응고 인자를 피브린 응혈을 생성시키는 혈액으로 방출시킨다. 일단 혈괴가 형성되면, 이들은 분해 생성물로 피브린의 분해 및 응혈의 분해에 필수적인 피브리놀리시스로 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 이와 같이, 혈소판의 응집을 억제하거나 피브리놀리시스를 증가시킴으로써 혈전증이 예방될 수 있는 두가지 이상의 방법이 있다.

비정상적인 맥관평활근세포(VSMC) 증식은 관상동맥성심장병, 아태롬성동맥경화증, 협착증, 발작, 및 장 및 자궁의 평활근 종양, 자궁 피브로이드 또는 섬유종의 폐색성 병변의 형성에 기여할 수 있다.

TGF-β가 가장 효능성이 있는 세포 성장 억제제(Massague, 1990) 중의 하나라는 것은 다년간 공지되어 왔으며, 수명의 과학자들은 TGF-β가 VSMC 증식을 억제하는 것을 발견하였다[참고문헌: Assolian, 1986; Bjorkerud, 1991; Owens, 1988; Kirschenlohr, 1993]. 사람의 VSMC는 세린 단백질 플라스민에 의해 단백질가수분해적으로 비활성화되고 교대로 조직 플라스미노겐 활성화물(tPA)과 같은 일종의 플라스미노겐 활성화물(PAs)에 의해 플라스미노겐으로부터 수득되는 잠복성의 비활성형으로 TGF-β를 생성시킨다(Lyons, 1990). 잠복형이 플라스미드에 의해 활성형으로 전환되기 때문에, 전체 플라스미드 TGF-β의 증가는 VSMC의 성장을 억제하는데 효과적인 것으로 간주된다.

수명의 과학자들은 TGF-β의 혈장 수준을 평가하고, 잠복형 및 활성형 둘 모두의 형태로 TGF-β 생성을 촉진시킬 수 있는 약제학적인 화합물을 조사하기 위한 방법을 개발하였다. 미국특허 제 5,545,569호(그레인저(Grainger) 등)에는 TGF-β의 혈장 수준을 증가시키고 본원에 기술된 기술을 사용하여 이의 생성을 촉진시키는 화합물의 유효성을 시험관내에서 결정하기 위한 방법이 청구되어 있다. WO 94/26303호(그레인저 등)에는 유효량의 TGF-β 활성화물 또는 생성 촉진물을 투여함으로써 병에 걸리거나 상처를 입은 포유동물의 맥관의 맥관 루멘 직경을 유지시키거나 증가시키기 위한 방법이 기술되어 있다. 화합물 타모시펜(Tamoxifen)(트랜스-2 [4(디페닐-1-부탄일)페녹시]-디메틸 에틸아민이 TGF-β의 생성을 촉진시키고 활성 TGF-β 대 잠복성 TGF-β의 비를 증가시키기 때문에 효과적인 것으로 청구되어 있다. 활성도를 보여주는 또 다른 화합물은 정상적인 사람의 경우에는 전체 및 활성 혈청 TGF-β 둘 모두를 증가시키지만 관상동맥성심장병을 앓는 환자의 경우에는 전체 TGF-β만을 증가시키는 아스피린이다(그레인저 등, 1995).

혈소판 응집률의 증가는 CHD의 발생률(타울로우(Thaulou) 등, 1991) 및 유행률(엘우드(Elwood) 등, 1991)과 상당히 관련되었다. 혈소판 응집률은 혈액으로부터 새로이 수득된 혈소판의 현탁액이 응집을 일으키는 작용물질과 접촉하여 위치되는 혈소판 아그레고미터(aggregometer)를 사용하여 용이하게 연구된다. 많은 작용물질이 사용될 수 있지만 아라키돈산, ADP, 콜라겐 및 트롬빈이 가장 전형적이다. 최대 응집률(%)의 측정으로부터, 피검자에게 경구로 또는 주사에 의해 제공될 수 있는 혈소판 응집의 억제제의 효과를 연구하는 것이 가능하다. 혈소판 응집을 억제하는데 가장 효과적인 물질 중의 하나는 시클로-옥시게나아제 활성 및 혈전 형성의 필수 인자인 트롬복세인의 형성을 억제하는 아스피린이다(Moncada & Vane, 1979). 아스피린은 또한 CHD, 발작 및 급사를 예방한다(Hennekens et al, 1988).

피브린분해 시스템은 활성화물 및 억제물에 의해 조절된 계단식의 세포외 단백질분해 반응을 구성한다. 효소 조직 유형 플라스미노겐 활성화물(t-PA)은 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키고, 교대로 피브린 응혈을 용해시킨다. t-PA는 내피 세포에서 합성된 글리코단백질로서, 피브린에 흡수되어 활성화된다. 플라스미노겐 활성화물 억제제 PAI-1은 세린 프로테아제 억제제이며 t-PA의 특이적 억제제로 작용한다. PAI-1은 세가지 형태: 활성형, 잠복형 및 비활성 복합체로 존재한다. PAI-1은 내피 세포, 간 및 혈소판에서 합성된다.

대부분의 tPA(95%)는 순환시에 PAI-1과 복합체를 이룬다. 매우 적은 양의 tPA 및 PAI-1은 자유(활성)형이다. 감소된 피브린분해 활성은 PAI-1 수준 또는 활성의 증가로 인한 것으로 간주되며, 이 결과 tPA에 의한 플라스민으로의 플라스미노겐의 활성화가 감소된다. 이러한 사실은 CHD(Mehta et al, 1987) 및 MI의 위험성과 감소된 피브린분해 활성 사이의 관련성의 보고서 때문에 중요하다. 손상된 피브리놀리시스(주로 혈장 PAI-1의 상승으로 인해 기인됨)는 혈전증 질환에서 공통적으로 발견된다. 노오쓰윅크 파크 심장 연구에서, 중년의 남성(40-54 등록 연령)의 예기된 유행병학적 연구에서, 미드(Meade) 등(1987)은 감소된 피브린분해 활성이 장래의 CHD에 대한 주된 독립적인 위험 인자라고 보고하였다. 앙기나 펙토리스(pectoris) 또는 이전의 심근경색을 앓는 환자의 횡단면 연구는 대조군과 비교하여 환자의 피브린분해 활성이 감소되었음을 일관되게 보여주었다[참조: Hamsten et al., 1985 및 1986; Johnson 1984; Paramo et al., 1985; Aznar et al., 1986; Francis 1988; 및 Olofson et al., 1989]. PAI-1 농도는 대조군과 비교하여 MI 환자에게서 더 높게 나타났다[참조: Hamsten et al., 1987].

혈소판 응집의 역할 및 트롬빈 형성시 피브리놀리시스 때문에, 혈소판 응집을 감속시키고/거나 피브리놀리시스를 증가시키는 방법은 일반적으로 혈전증 질환, 특히 CHD를 치료하는 방법으로서 사용될 수 있었다.

본 발명은 특히 특정의 조성물, 이들의 사용방법, 및 조성물을 함유하는 사람 소모용 식품 보충물 및 음료에 관한 것이다.

도 1은 시간(분)에 대한 LDL 산화반응을 나타내는 그래프이다.

도 2는 플라본의 코어 구조를 개략적으로 도시하는 도면이다.

도 3은 플라보놀의 코어 구조를 개략적으로 도시하는 도면이다.

도 4는 갈산의 구조를 개략적으로 도시하는 도면이다.

도 5는 안토시아닌의 코어 구조를 개략적으로 도시하는 도면이다.

도 6은 레스베라톨의 구조를 개략적으로 도시하는 도면이다.

발명의 요약

제 1 양태에서, 본 발명은 사람이 소모하는데 적합한 식물 유도 플라보놀 함유 건조 조성물을 제공하는데, 여기에서 조성에 있어 식물 유도 물질의 25%는 폴리페놀을 포함한다.

설명을 위하여, 식물 유도 조성물이 식물의 추출물 또는 이들의 일부(예, 괴경, 열매)를 포함할 수 있으며, 몇가지 방식으로(예를 들어, 발효에 의해) 가공될 수도 있다. 이와 같이, 식물 유도 조성물은 식물의 수성 또는 유기 용매 추출물 또는 이들의 일부, 열매즙, 및 식물 또는 열매즙으로부터 생성된 발효주(예, 포도주), 또는 앞서의 어떠한 것으로부터 수득된 조성물 포함한다. 식물 물질은 (물리적으로 및/또는 화학적으로) 전형적으로 가공되어 조성물의 폴리페놀 함량을 증가시키고 부화시킨다.

식물 유도 물질이 바람직하게는 35% 이상 또는 보다 바람직하게는 45% 이상의 폴리페놀을 포함하도록 조성이 이루어질 수 있다.

조성물은 조성물의 플라보놀 내용물이 수득되는 식물 유도 물질로 전체적으로 또는 실질적으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 사람의 소모를 위한 조성물을 제형화시키는데 통상적으로 사용되는 착향제, 부형제, 담체 등과 같은 그 밖의 물질을 포함할 수 있다.

조성물에서 "식물 유도 물질"은 조성물의 플라보놀 내용물과 같은 공급원으로부터 유도되는 조성물의 일부를 언급한다. 조성물은 식물로부터 수득된 그 밖의 성분(예, 전분 또는 향미료)을 또한 포함할 수 있지만, 이들이 조성물의 플라보놀 내용물과 같은 공급원으로부터 수득되지 않는다면, "식물 유도 물질"로서 간주되지 않는다.

조성물은 플라보놀 함량이 조성물의 전체 식물 유도 폴리페놀 함량의 0.5%(w/w) 이상, 바람직하게는 1% 이상 및 보다 바람직하게는 2% 이상이 되게 하는 것이 바람직하다.

조성물의 플라보놀 함량은 전체적으로 0.01%(w/w) 이상, 보다 바람직하게는 0.1% 이상, 및 보다 바람직하게는 1% 이상이 또한 바람직하다.

제 2 양태에서, 본 발명은 0.01%(w/w) 플라보놀, 보다 바람직하게는 0.1%, 및 가장 바람직하게는 1% 이상을 포함하는 식물 유도 플라보놀 함유 건조 조성물을 제공한다.

상기 정의된 조성물은 10-20℃의 온도 범위에 걸쳐 대기압(760mmHg)에서 전형적으로 고체이다. 조성물은 미립물(예를 들어, 분말화되거나 과립화된)일 수 있거나 캡슐, 정제 등의 내부에 형성될 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 조성물이 다수의 표준에 의해 측정된 바와 같이 혈장 LDL의 산화를 억제하는데 있어 피검자에 의해 효과적인, 경구적 소모라는 것을 발견하였다. 이와 같이, 조성물의 경구적 소모는 에스터바우어(Esterbauer) 등의 방법[참고문헌: 1989 Free Radic. Res. Commun. 6, 67-75]에 의해 결정된 바와 같이 단리된 혈장 LDL의 산화에 있어 래그 페이즈를 증가시키는데 효과적이다. 간략하면, 이 방법에서, 초원심분리기에 의해 피검자의 혈장으로부터 단리된 LDL은 EDTA를 제거하기 위해 투석되며, 구리 이온(5μM)이 LDL(50mg/L로 존재)에 첨가된다. 디엔 형성 이전의 통상적인 래그 시간은 약 50-60분이다. 피검자에게 본 발명의 조성물의 투여는 바람직하게는 2분 이상(또는 약 4% 이상)의 래그 시간를 연장하여야 한다. 5-25분(또는 약 10-15%)의 범위가 가장 바람직하다. 또한, 조성물은 (하기된 [Gorog et al, 1994]의 방법에 의해 평가되는 바와 같이) 피검자의 혈장내에 있는 지질 퍼옥시드의 양을 감소시키는데 효과적(다음의 경구적 소모)이다.

조성물은 편의상 포도(전체 포도, 또는 껍질 또는 즙과 같은 이들의 일부), 포도주(특히, 백포도주보다 훨씬 더 높은 농도의 폴리페놀을 포함하는 적포도주)로부터, 또는 포도주 제조 공정중의 부산물 및/또는 폐생성물, 예를 들어 찌꺼기(즉, 즙 추출 후 분쇄된 포도 잔류물) 또는 짜낸 찌꺼기(초기의 발효 후 남는 폐 고형성분)에 의해 수득된 폴리페놀(플라보놀 포함)을 포함한다. 그러나, 플라보놀과 같은 폴리페놀은 광범위한 천연 발생 물질중에 존재하는데, 천연 발생 물질중의 대부분은 적포도주보다 높은 플라보놀을 함유하여 보다 적합한 플라보놀 공급원을 제공할 수 있다. 이러한 물질의 예로는 일반적으로 사과와 같은 과일(예, "그라벤슈타이너"), 특히 사과 껍질(예, "윌리암스 크리스트"); 종 형상의 후추(예, "욜로 원더(Yolo wonder)"); 적색 건포도; 흑색 건포도(특히, 플라보놀 함량이 비교적 높은 것이 바람직함); 레몬; 체리; 덩굴월귤; 구즈베리; 토마토; 올리브; 및 일반적으로 무(예, "삭사 트레이브(Saxa treib)"), 구경양배추(예, "프리마베라(Primavera)"), 양고추냉이, 감자, 양파 및 아스파라거스를 포함하는 채소가 있다.

특정의 구체예에서, 조성물은 적포도주로부터 유도되고, 포도주에 존재하는 (전형적으로는, 반드시 그렇지는 않지만, 조성물이 유도되는 포도주내의 상대적인 양으로 실질적으로 조성물내에 존재하는) 실질적으로 모든 폴리페놀 화합물의 대표적인 프로파일을 포함한다. 이러한 조성물은 "전체 폴리페놀 푸울"로 언급된다.

폴리페놀은 40-50% 에탄올 용리액, 또는 적합한 유기 용매(예, 메탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 염화디메틸렌, 및 클로로포름-수용액의 형태로 존재할 수 있음)의 사용에 의해 (전형적으로는 세척 단계 다음에) 칼럼으로부터 폴리페놀 부화 분획을 용리시키면서, 크로마토그래피 수지 칼럼상에서의 흡수에 의해 적포도주 또는 그 밖의 폴리페놀 함유 지질로부터 용이하게 수득될 수 있다. 유기 용매는 비교적 휘발성(즉, 760mmHg 압력하에서 30 내지 85℃의 비점을 갖는)인 것이 바람직하며, 그렇게 되면 용이하게 유도되어 폴리페놀을 포함하는 실질적으로 건조한(즉, 10% w/w H2O 미만) 고형 조성물이 수득된다. 이러한 방법은 적포도주로부터 전체 폴리페놀 푸울을 수득하는데 성공적으로 사용될 수 있다.

대안적으로, 폴리페놀은 포도주 또는 그 밖의 지질과 비혼화적인 적합한 유기 용매를 사용하는 용매 추출에 의해 적포도주 또는 그 밖의 폴리페놀 함유 지질로부터 수득된다. 대안적으로, 폴리페놀은 용매 추출에 의해 폴리페놀 함유 고체로부터 수득될 수 있으며 - 그런 다음, 고형물은 여과 또는 원심분리에 의해 용매로부터 분리될 수 있다. 그런 다음, 용매는 증발되어 폴리페놀을 포함하는 실질적으로 건조한 고형 조성물이 수득된다.

바람직한 구체예에서, 조성물은 식품 보충물로 제공된다. 이것은 식료품의 제조 동안 추가의 성분으로 첨가하는 물질일 수 있거나, (물론, 정제 또는 캡슐이 음식과 함께 취해질 수 있지만) 소모 이전에 그 밖의 식품 성분(즉, 그 밖의 식품 성분과는 혼합되지 않는)으로부터 실질적으로 단리시에 개인에 의해 소모되는 (예, 정제 또는 캡슐로서) 별도의 물질일 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 이의 범위내에 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 생성물, 특히, 식료품을 포함한다. 대안적으로, 조성물은 생리학적으로 허용되는 희석물(예, 우유, 물 또는 그 밖의 수성 액체)와 혼합시킴으로써 마실수 있는 고형물로서 제공될 수 있다.

피검자에게 제공된 조성물의 용량은 물질의 활성도에 의존하지만 하루에 10mg 내지 10g일 것이다. 적포도주로부터 수득된 전체 폴리페놀 푸울에 대해, 용량은 바람직하게는 0.1-4.0g/1일, 보다 바람직하게는 1-2g/1일이며, 이는 하루에 0.5 내지 1 리터의 적포도주에 해당된다. 플라보놀의 바람직한 용량은 하루 당 0.1-1000mg, 바람직하게는 하루 당 0.5-500mg, 보다 바람직하게는 하루 당 1-250mg일 것이다.

당업자라면 포도주, 포도 또는 포도주 부산물로부터 수득된 폴리페놀의 제조를 취하고, 보다 큰 활성을 갖는 조성물을 수득하기 위해 더 분별할 수 있을 것이다. 이것은 칼럼 크로마토그래피, 용매 추출법, 반투과성 막을 갖는 분자체, 또는 식품 산업에서 통상적으로 사용되는 그 밖의 방법(들)에 의해 수행될 수 있다. 장점은 활성 물질의 중량이 작으며, 보충물의 색과 맛이 유리하게 개질되는 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 통상적인 식품 보충 또는 약제학적인 실시에 따라서 활성 폴리페놀 제제를 사용하여 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 희석제, 부형제 또는 담체 등은 제형 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 특정 섭생을 위해 선택된 형태는 제시된 정황 및 제형화시키는 사람의 선택에 의존할 것이다. 일반적으로, 용량은 조성물중의 폴리페놀의 농도, 및 사안이 되는 폴리페놀 화합물의 동일성에 의존할 것이다.

더욱이, 이러한 조성물은 임의적인 수의 추가 성분(예, 식품 산업 및.또는 약제 산업에서 전형적으로 사용되는 성분)을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 영양분(특히 미량 원소 및 비타민), 산화방지제, 치료 물질(특히 CHD의 예방 및/또는 치료와 관련하여 치료 효과를 갖는 물질, 특히 아스피린), 착향제, 감미료(특히, 인공 감미료, 예, 아스파테임 등)를 포함한다.

상기의 예는 다음을 포함한다: 카르티노이드, 예를 들어 루테인, 리코펜, 또는 α 및/또는 β-카로텐; 산화방지 영양분 또는 소염성 제제, 예를 들어 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E(α-토코페롤 및 그 밖의 활성 토코페롤), 폴산, 셀레늄, 구리, 아연, 망간, 유비퀴논(조효소 Q10), 살리실산, 2,3-디히드록시 벤조산, 및 2,5-디히드록시 벤조산.

카로테노이드 및 비타민 E와 같은 산화방지제는 산화반응에 의해 위장관에서 부분적으로 파괴된다. 본 발명의 조성물에서 이들 화합물의 포함에 의해, 이러한 방법이 방해를 받고 보다 많은 산화방지제가 흡수되는 것으로 믿어진다. α-토코페롤 및/또는 아스피린을 포함하는 조성물의 사용은 특히 바람직한데, 그 이유는 이러한 혼합물이 폴리페놀의 존재하에 상승 효과를 제공하는 것으로 믿어지기 때문이다.

조성물의 이들 추가 성분(및, 그러므로 조성물의 정상적인 소모가 적합한 용량을 제공할 수 있도록 조성물내에 포함될 수 있는)의 전형적인 적합한 매일 용량은 다음과 같다:

루테인 2 내지 50mg, 예를 들어 편의상 7.5mg

베타 카로텐 2 내지 20mg, 예를 들어 편의상 5mg

비타민 A 400 내지 600RE, 예를 들어 편의상 500RE

비타민 C 75 내지 250mg, 예를 들어 편의상 100mg

폴산 0.1 내지 1.0mg, 예를 들어 편의상 0.2mg

셀레 80 내지 120μg, 예를 들어 편의상 90μg

구리 2 내지 4mg, 예를 들어 편의상 3mg

아연 10 내지 20mg, 예를 들어 편의상 15mg

조효소 Q10 10 내지 200mg, 예를 들어 편의상 30mg

아스피린 10 내지 150mg, 예를 들어 편의상 150mg

이와 같이, 하나의 구체예에서, 조성물은 캡슐 형태(각각의 캡슐은 500mg의 폴리페놀 조성물을 함유)로 취해지며, 제안된 섭취량은 하루 당 1 내지 4개의 캡슐이다. 또 다르게는, 향이 좋고 맛이 좋은 물중에 (정지상태로 또는 폭기상태로) 용해되거나, 과즙, 예를 들어 포도, 사과 또는 오렌지 등에 용해될 때 유효 용량의 폴리페놀을 제공하는 비알코올성 음료가 대표적이다.

다수의 이유 때문에 본 발명의 조성물을 포함하는 알코올 유리된 음료를 제공하는 것이 바람직할 수 있지만, 이러한 음료는 알코올로 인해 독해져(예를 들어, 보드카, 진, 위스키) 소비자의 기호에 따라 원하는 수준의 5-15% 알코올을 제공할 수 있다.

다르게는, 우유 및 요구르트와 같은 낙농제품, 방부제, 및 식사 보충 또는 대체로서 의도된 식제품의 식품 성분이 대표적이다. 상기 예는 설명을 위한 것일 뿐 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다.

제 3 양태에서, 본 발명은 피검자의 혈장 LDL의 산화를 억제하는 방법; 본 발명의 제 1 양태 또는 제 2 양태에 따른 조성물을 제조하는 방법; 조성물을 피검자에게 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 본 발명의 조성물의 경구적 소모가 혈장 LDL의 산화를 억제할 뿐만 아니라 조성물이 체내 형질전환 성장 인자 (TGF)-β의 생성을 촉진시키는 효과를 또한 가질 것이라는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 조성물의 경구적 소모가 혈소판 응집을 억제하고/거나 피브리놀리시스를 촉진시켜 개인의 혈전증 경향을 감소시켜 CHD, 발작과 같은 혈전증 질환을 예방하고/거나 치료하는데 도움을 제공한다는 것을 발견하였다. 특히, 조성물의 소모는 (하기된 "크로몰라이즈(Chromolize)" 검정[스웨덴 바이오푸울(Biopool)]과 같은 검정 수단에 의해 용이하게 측정되는 바) 혈장에서 tPA 활성 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌는데, 이의 효과는 피검자의 피브리놀리시스의 전체 비율을 증가시키는 것이다.

따라서, 제 4 양태에서, 본 발명은 피검자의 TGF-β 생성을 촉진시키는 방법; 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 조성물을 제조하는 방법; 및 조성물을 피검자에게 투여하는 방법을 제공한다.

제 5 양태에서, 본 발명은 혈소판 응집을 억제하고/거나 피검자의 피브리놀리시스를 촉진시키는 방법; 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 조성물을 제조하는 방법; 및 조성물을 피검자에게 투여하는 방법을 제공한다.

제 6 양태에서, 본 발명은 피검자의 혈장 LDL의 산화를 억제하기 위해, 피검자에 의해 경구적 소모용 약제를 제조하기 위한 조성물을 상기 정의된 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따라서 사용하는 방법을 제공한다.

제 7 양태에서, 본 발명은 피검자의 TGF-β의 생성을 촉진시키기 위해 피검자에 의해 경구적 소모를 위한 약제를 제조하기 위한 조성물을 상기 정의된 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따라서 사용하는 방법을 제공한다.

제 8 양태에서, 본 발명은 피검자의 혈소판 응집을 억제하고/거나 피브리놀리시스를 촉진시키기 위해 피검자에 의한 경구적 소모를 위한 약제를 제조하기 위한 조성물을 상기 정의된 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따라서 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 조성물은 전형적으로 상기 언급된 모든 특성을 조성물을 소모하는 피검자에게 제공할 것이다. 따라서, 본 발명은 피검자에게 혈장 LDL의 산화의 억제, 혈소판 응집의 억제, 피브리놀리시스의 촉진 및 TGF-β 생성의 촉진 중의 하나 이상을 수행시킬 목적으로 피검자에 의한 경구 소모용 약제를 제조하는 방법; 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 조성물을 제조하고, 필요하다면, 조성물을 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체와 혼합시키고; 단위 용량의 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 약제를 제조하는 적합한 방법은 당해기술분야에 널리 공지되어 있다.

이러한 효과를 갖는 약제는 상기된 바와 같이 식품 보충물 또는 성분 형태로 취할 수 있으며, 관상동맥성심장병의 예방 또는 치료에 유용해야 한다. 상기된 바와 같이 약제의 적합한 용량은 조성물중의 폴리페놀의 농도 및 동일성, 및 치료하고자하는 환자의 질병 상태의 심각도에 의존할 것이다. 그러나, 일반적인 가이드로서, 용량은 하루 당 한 컵 이상의 포도주(적포도주로부터 전체 폴리페놀 푸울의 0.25gm에 해당), 보다 바람직하게는 하루 당 약 0.5L-1.0L의 적포도주의 소모(즉, 약 1.0-2.0gms 전체 포도주 폴리페놀)에 의해 제공되는 양과 같은 폴리페놀을 소모하는데 충분한 것이 바람직하다.

본 발명은 실시예 및 첨부 도면을 참조로 보다 상세하게 설명된다.

실시예 1

적포도주부터 폴리페놀 분말의 제조

적포도주(프랑스 1993 캐버네이 소우비뇽) 약 2,000리터를 여과시켜 침전물을 제거하고 1분 동안 75 내지 80℃ 및 300mmbar의 압력의 진공하에서 증류시킨 후, 55℃ 및 진공하에서 냉각시키고 농축시킨 후, 냉각에 의해 25℃로 급냉시켰다. 농축된 포도주를 용량이 65리터인 Diaion HP-20 수지를 갖춘 칼럼(직경 55cm, 높이 약 2m)을 통해 통과시켰다. 칼럼을 250리터의 증류수로 세척하고 폴리페놀을 약 250리터의 50% 알코올로 150분의 기간에 걸쳐 용리시켰다. 이러한 시간이 끝나갈 무렵에, (1965년에 싱글레톤(Singleton) 및 로시(Rossi)에 의해 기술된) 폴린-시오칼테우(Folin-Ciocalteu) 방법에 의해 측정한 바, 용리액에는 폴리페놀이 없었다. 그런 다음, 용리액을 진공 증류하에서 35% 물질로 농축시키고 스프레이를 질소 분위기하에서 건조시켜 습기 함량이 3 내지 4%인 분말 약 2kg을 생성시켰다.

폴리페놀 분말은 물 또는 수성 알코올중에 용해될 때 암적색을 가지며, 맛이 매우 좋으며, 적포도주의 미각에 유사한 미각에 "바이트(bite)"를 제공하는 우수한 식품 성분이다.

폴리페놀 분말의 전형적인 조성은 적포도주의 폴리페놀 함량보다 낮다. 적포도주와 비교하여, 폴리페놀 분말은 다른 폴리페놀보다 많은 프로안토시아닌을 비례적으로 함유하지만, 비교적 풍부한 다양한 폴리페놀을 보존시킨다.

적포도주 및 폴리페놀 분말의 조성

	적포두주 갈산	적포도주 폴리페놀 분말
	mg/L	%	mg/g	%
히드록시신남산	165	15	18	3
카테킨	200	17	38	6
플라보놀	20	2	14	2
안토시아닌	200	17	70	11
포로안토시아니딘	550	49	480	77
합계	1135		620

실시예 2

포도주 폴리페놀을 사용하는 지원자 연구를 수행하여 건강한 지원자의 적포도주 및 백포도주, 및 폴리페놀 제조물의 산화방지 활성을 결정하였다.

대상 및 방법:

비흡연가이면서 표준 UK 규정식을 소모하는 26명의 건강한 남자(35 내지 65세)이 연구에 참여하였다. 연구 개시 2주 전에, 지원자는 포도주 소모를 끊었다. 모든 지원자에게 연구 동안 평상시의 식사 및 생활 양식을 유지시키도록 했다. 지원자를 표 1에 기재된 양으로 2주 동안 다음의 포도주 또는 가루를 갖는 차 제품을 소모하는 그룹으로 나눴다. 적포도주는 캐버네이 소우비뇽(1993)이었으며, 백포도주는 프랑스 나르본네(Narbonne) 지역산이었다. 연구 동안 제공된 포도주는 실험 기간 동안 허용된 포도주 뿐이었다. 또한, 동일한 피검자에게 연구에서 사용된 적포도주의 동일 배치로부터 제조된 폴리페놀 분말을 제공하였다. 분말을 -20℃에서 저장하고(PP1), 1996년 6월에 제조된 새로운 샘플(PP2)을 저장하였다. 연구는 1995년 9월 초에 시작하여 약 1년 동안 지속시켰다.

그룹 시험 물질

1) 폴리페놀 1.8gm/L를 함유하는 캐버네이 소우비뇽 적포도주(375ml)

2) 폴리페놀 0.2gm/L를 함유하는 보통 백포도주(375ml)

3) 적포도주 pp 분말(그룹 1에 제공된 것과 동일한 포도주로부터 제조됨), 두 개의 젤라틴 캡슐중에 1gm

4) 용액중에 1gm 적포도주 폴리페놀을 함유하는 백포도주 (하기 참조)

5) 보드카 및 레모네이드(10% v/v 알코올), 400mls/1일

6) 음료로서 제공된 포도 껍질 추출물(프랑스 세인트 쥴리엔 드 페이롤라스 세프칼)로서 안토시아닌 50mgs/1일

7) 각각 250mg의 찌꺼기를 포함하는 캡슐로서 제공된 적포도주 찌꺼기(프랑스 아르코파르마 프렌치 파라독스(등록상표))

8) 각각 150mg의 프로안토시아닌을 포함하는 엔도텔론(Endotelon : 등록상표) 캡슐로서 포도 종자 프로안토시아니딘(프랑스 사노피-윈트로프)(3캡슐/1일)

9) 각 캡슐이 다음과 같은 100mg의 카테킨을 포함하는 녹차 추출물(폴리페논(Polyphenon : 등록상표), 일본 후지에다 미추이 노린)(3캡슐/1일): 1.6% 갈로 카테킨, 19.3 에피갈로 카테킨, 6.4% 에피 카테킨, 59.1% 에피갈로 카테킨 갈레이트 및 13.7% 에피카테킨 갈레이트.

저녁 식사 후 12 시간, 포도주 소모 기간 전 및 거의 끝나갈 무렵에 혈액 샘플을 K3 EDTA (1mmol/L)내로 유도해냈다. 샘플을 4℃에서 15분 동안 2000×g에서 원심분리하여 혈장을 수득하였다. TLA 100.4 로터를 갖춘 베크만 벤치 톱 모델 옵티마 TLX를 사용하여 밀도 구배 초원심분리에 의해 다음과 같이 LDL을 분리하였다: 브롬화나트륨을 혈장에 첨가하여 밀도가 1.3g/ml가 되게하고 1.006g/ml 밀도 용액하에서 층을 이루게 하였다. 4℃에서 20분 동안 100,000RPM으로 회전시켰다. 오렌지색/황색 LDL 밴드를 제거하고 4℃에서 30분 동안 100,000RPM으로 1.154 및 1.063g/ml 밀도의 용액을 회전시켰다.

가시적인 LDL 층을 제거하고, 투석 카세트(피어스 슬라이드-A-라이저(Pierce Slide-A-Lyzer, USA 퍼스토프 바이오테크 컴파니(Perstorp Biotec Company))를 사용하여 1시간 동안 EDTA가 2μM 들어있는 10mM 인산염 완충화된 염수로, 이어서 10mM 인산염 완충화된 염수로 밤새 투석시켰다.

싱글레톤 및 로시(1965)의 방법에 의해 혈장 및 LDL 분획중의 전체 폴리페놀을 결정하였다. 간략하면, 혈장 및 LDL중의 전체 폴리페놀은 혈장 125㎕ 또는 LDL 400㎕를 취하고 물로 500㎕가 되게 함으로써 측정하였다. 이 혼합물을 폴린 시약(희석비 1:10) 2.5mls 및 탄산나트륨(75gm/L) 2.0mls에 첨가하였다. 균질하게 혼합시킨 후, 용액을 2.5시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 이어서 8분 동안 2,500rpm으로 원심분리하였다. 상청액의 광학 밀도를 765nm에서 측정하였다. 갈산을 비교용 표준으로서 사용하였다.

단백질은 바이오퀀트 시약(독일 담스타트에 소재하는 머크(Merck))을 함유하는 킷을 사용하여 브래드포드 방법(Bradford, 1976)에 의해 측정하였다.

두가지 다른 방법을 사용하여 산화방지 활성을 측정하였다.

1) LDL의 구리 산화반응

리포단백질(50mg LDL 단백질/L)을 5시간 동안 37℃에서 황산구리(5mM)의 존재하에 인큐베이션시켰다. 컨쥬케이션된 디엔 형성을 234nm에서의 흡광도 증가량을 측정함으로써 연속적으로 모니터링하고, 디엔 형성 이전의 래그 시간을 에스터바우어 등(1989)의 방법에 따라 측정하였다. 도 1은 시간(분)에 대한 (234nm에서 흡광도를 측정한) 컨쥬게이션된 디엔 형성률의 그래프를 도시한다. 시험 개시(0) 및 2주 후에 취한 샘플에 대한 전형적인 곡선이 도해되어 있다. 래그 페이즈는 점들의 선형 부분을 x축 아래 방향으로(파선으로 도시됨) 외삽시킴으로써 측정된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물의 소모는 2분 이상의 래그 페이즈 시간을 증가시킬 것이다.

2) 혈장 지질 퍼옥시드

모든 혈장 지질 및 리포단백질을 PHM-L-리포소브(칼바이오켐-노바바이오켐 UK)를 사용하여 선택적으로 제거하였다. 건조 PHM-L-리포소르브(20mg)를 2ml 용량의 갈색 미세원심분리기관에서 10mM 시트르산나트륨을 함유하는 150mM 염화나트륨 0.25ml중에 현탁시키고, 내용물을 교반시키고 5분 동안 평형을 유지시켰다. 그런 다음, 혈장(0.5ml) 또는 염수(블랭크)를 리포소르브 현탁액에 첨가하고, 교반시키고, 관을 15분 동안 회전 혼합기상에 위치시켰다. 원심분리(12,000×g, 1분) 후, 상청액을 제거하고 리포소르브 겔을 1.5ml 염수로 2회 세척하고, 이어서 교반 및 원심분리하였다. 세척한 리포소르브 겔을 1.5ml 콜레스테롤 옥시다아제-요오드 시약(BDH-Merck) 중에서 현탁시키고, 회전 혼합기상에 위치시키고, 60분 동안 교반시켰다. 실온에서 원심분리(12,000×g, 3분) 후, 염수를 함유한 블랭크 용액에 대하여 405nm에서 분광광도계를 사용하여 투명한 상청액의 광학 밀도를 측정하였다[Gorog et al, 1994].

바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물의 소모는 0.1μmol/g 단백질의 혈장 지질 퍼옥시드 농도를 감소시킬 것이다.

결과

처리 이전과 이후에 얻은 값을 비교하였다. 표 1은 표 2 내지 6에 상세하게 제시된 결과를 요약하고 있다. 표 1에 기재된 바와 같이, 풍부한 포도주 폴리페놀을 함유하는 이들 생성물(적포도주, PP1, PP2, 백포도주 + PP1)은 상기 시험 1 및 2에 의해 측정한 바, 혈장 및 LDL에서 폴리페놀의 증가, 및 LDL에서 산화방지 활성의 증가를 보여주었다.

2종의 폴리페놀 분말(PP1, PP2)은 등량의 적포도주와 같은 크기의 결과를 제공하였다.

백포도주, 안토시아닌 분말(Sefcal(등록상표), 식품 착색제로서 사용된 포도 껍질로부터의 추출물), 적포도주 찌꺼기, 프렌치 파라독스(등록상표) 캡슐(아르코파르마) 또는 Endotelon(등록상표)(사노피-윈트롭(Sanofi-Winthrop), 포도 종자로부터의 프로안토시아니딘 제조물), 또는 카테킨 및 이들의 에스테르를 함유하는 녹차 추출물(Polyphenol(등록상표))에 있어 어떠한 효과도 없었다.

활성 폴리페놀 제조물은 적포도주내에 모든 폴리페놀 푸울을 함유하였고, 이들의 산화를 피하기 위해 조심스럽게 가공되었다. 더욱이, 혈장 및 단리된 LDL의 폴리페놀 함량이 적포도주, 또는 적포도주 또는 포도 껍질로부터 수득된 폴리페놀 분말을 수용하는 이들 피검자에게서 상승되었다.

제조물의 산화방지 활성의 확인으로서, 혈장이 지질 및 리포단백질이 제거된 흡수성 수지로 처리되고 지질 퍼옥시드의 함량이 수지에서 결정되는 제 2 검정을 사용하였다. 지질 퍼옥시드의 함량은 적포도주 또는 폴리페놀 제조물이 제공된 피검자에게서 감소되었다. 재차, 폴리페놀 분말의 효과의 크기는 수득된 적포도주의 양과 동등하였다.

이들 실험은 결론적으로 폴리페놀이 적포도주 침지 후에 흡수되고 혈장 및 LDL에서 나타나며, 포도주로부터 단리된 폴리페놀이 유사한 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 더욱이, 흡수된 폴리페놀은 강력한 산화방지 활성을 갖는다. 폴리페놀의 작용 형태는 수가지 형태일 수 있다. 주로, 이들은 체내에서 지질 퍼옥시드의 생성을 촉진시키는 구리 및 철과 같은 금속 이온을 격리시킬 수 있다. 이들 킬레이트화된 이온은 산화촉진제로서는 비활성적이다. 폴리페놀은 고함량의 히드록시기 때문에 금속 이온을 킬레이트화시키는 것으로 공지된 화학 구조를 포함하며, 이렇게 하여 이들의 촉매 특성을 파괴시킨다.

또 다른 작용은, 알파-토코페롤의 경우에서와 같이, LDL 보다 먼저 산화되는 손실성 물질로서 작용하는 것일 수 있다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 작용 형태에 제한되지 않는다.

구리 촉매 산화보다 먼저 제조물로부터 EDTA의 제거의 중요성을 조사하기 위해, EDTA의 존재하 및 부재하에서 투석 및 수지 칼럼 방법을 사용하여 비교하였다. EDTA가 투석물에 첨가될 때, 적포도주 폴리페놀 분말에 의해 생성된 래그 시간의 연장이 일어나지 않았거나 현저하게 감소되었다. EDTA 부재하에서의 투석 및 칼럼 방법은 유사한 결과를 제공하였다. 지원자에게서 적포도주의 효과를 얻는데 이전의 저자들이 실패한 것은 구리 촉매 산화반응에 사용된 이들의 제조물내 EDTA의 존재에 의해 설명될 수 있다.

결론

포도주 폴리페놀 분말 1g의 산화방지 활성은 적포도주 병의 절반과 같다. 폴리페놀 분말이 매일 1-2g의 용량으로 투여된다면, 관상동맥성심장병에 대하여 잠재적인 예방적 활성을 가질 것이다. 식품 산업에서 착색제로서 사용된 포도 껍질 추출물, 프로안토시아니딘 제조물, 프렌치 파라독스 캡슐 및 카테킨 및 이들의 에스테르를 함유하는 녹차 추출물과 같은 그 밖의 생성물은 비활성적이었다.

실시예 3

단순한 혼합 및 정기적인 캡슐화에 의해 하기 성분으로부터 캡슐을 제조하였다.

포도주 폴리페놀 분말 500mg

스테아르산 25

마그네슘 스테아레이트 50

미결정상 셀룰로오스 25

600mg

2 내지 4개의 캡슐이 식사와 함께 또는 식사 후에 매일 섭취된다.

실시예 4

단순한 혼합 및 정기적인 캡슐화에 의해 하기 성분으로부터 캡슐을 제조하였다.

포도주 폴리페놀 분말 400mg

α 토코페롤 150

폴산 0.2mg (1:50으로 희석) 10

레시틴 20

밀랍 20

600mg

하루에 3개 이상의 캡슐이 식사와 함께 섭취되어야 한다.

실시예 5

포도주 폴리페놀 분말 1g을 캠브리지 다이어트(UK 노르위치에 소재하는 캠브리지 헬쓰 플랜 리미티드(Cambridge Health Plan Ltd))라는 상표명으로 시판되는 하루 당 405Kcal를 제공하는 건조 분말 제형 식이 조성물 (42g 단백질, 43g 탄수화물 및 8% 지방, 비타민 및 미네랄의 RDA)에 첨가하였다. 하루 공급량(3끼의 식사/1일)은 0.5L 적포도주/1일에 해당하는 폴리페놀의 섭취를 제공한다.

실시예 6

적포도주로부터 수득된 전체 폴리페놀 푸울의 0.5g을 딸기 착향제 및 감미료를 함유하는 250ml 플레인 요구르트에 첨가하였다. 적색 폴리페놀 물질은 요구르트의 외관을 강화시키고 건강에 이로우면서도 매우 맛있는 식료품을 제공한다.

실시예 7

하기 제형은 물과 혼합시키려는 분말로서 제공된 비알코올성 음료의 제형이다.

덱스트로오스 모노하이드레이트 300g

시트르산 32g

트리 나트륨 시트레이트 5g

그레이프프루트 착향제 6g

레몬 착향제 1.4g

오렌지 착향제 1.4g

아스파테임 1g

전체 포도주 폴리페놀 푸울(실시예 1과 같이) 21g

분말 53g이 물 1리터 중에 용해된다. 250ml의 서빙은 활성 폴리페놀 0.75g을 제공한다.

실시예 8

다음은 하나의 병으로 된 바로 마실수 있는 음료 혼합물로서 제공되는 알코올성 음료이다.

탈탄산 탄산음료 450ml

보드카 50ml

전체 포도주 폴리페놀 (실시예 1과 같이) 1g

폴리페놀을 지방(탈탄산) 탄산 혼합물중에 용해시킨 후, 압력하에서 이산화탄소를 공급하여 탄산 음료를 제공하였다. 450ml의 분취액을 병에 분배하고, 보드카를 첨가하고 병을 나사식 뚜껑으로 밀봉시켰다.

실시예 9

백포도주로부터 수득된 약 2000Kg의 찌꺼기를 4시간 동안 30℃에서 2500L 증류수가 들어있는 시판중인 혼합기에서 균질하게 교반시켰다. 그런 다음, 혼합물을 혼합기로부터 제거하고 탱크에 위치시키고 2시간 동안 침전시키고, 이어서 상청액을 뽑아내어 여과시켜 투명한 액체를 생성시켰다. 그런 다음, 유사한 양의 Diaion HP-20 수지 및 용리 용매를 사용하여 수지상에 폴리페놀의 흡수를 위해 실시예 1에서와 같은 방법을 사용하였다.

에탄올 수용액을 35% 건조 물질로 농축시켰을 때, 약 600g의 중량이 나가는 적색 고형물이 나타났다. 이 고형물은 10% 수성 알코올 용액에서는 가용성이기 때문에, 이어서 분무 건조시켜 수중에서는 불용성이지만 수성 알코올에서는 가용성인 고형물을 생성시켰다. 그런 다음, 잔류 용액을 질소 분위기하에서 분무 건조시켜 약 50% 폴리페놀을 함유하는 1.4Kg의 적색 물질을 생성시켰다. 이러한 물질의 조성은 실시예 1에서 수득된 물질의 조성과 유사하였다.

이러한 방법은 수지상에서의 흡수 이전에 추출물을 수득하는 과정이 보다 복잡하고 시간 소모적이라는 단점을 갖는다. 수율은 작지만, 포도 껍질의 이용성은 싸다는 이유로 상업적으로 유리하다.

분말화된 음료를 재구성하여 실시예 2에 기술된 프로토콜에 따라서 2주 동안 5명의 지원자에게 투여하였다. 구리 촉매 LDL 산화 검정에서의 결과는 다음과 같았다:

이전 78.8±7.2분

2주 후 93.0±9.4분

변화 14.2±4.8분

(p 값 0.003)

결론적으로, 포도 껍질(이 경우 백포도주)로부터의 추출물, 즉 찌꺼기가 2주 동안 경구로 섭취되었을 때 효과적인 산화방지제일 수 있다.

실시예 10

혈장 LDL(실시예 2에 기술된 일단의 지원자로부터)을 초원심분리에 의해 분리시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 인산염 완충액에 대하여 투석시켰다. 폴리페놀 함유 물질을 싱글레톤 및 로시(1965)의 방법에 의해 이들의 폴리페놀 함량을 위해 투석시켰다. 혈장 LDL(1.0ml중의 0.05㎍ LDL)을 37℃에서 100㎕ 황산구리 용액(최종 농도 5μM)으로 인큐베이션시키고 실시예 2에 기술된 바와 같이 구리 촉매 디엔 검정에 의해 래그 시간을 결정하였다. 시험관내에서 래그 시간을 연장시키는 페놀 함유 물질의 능력은 황산구리를 첨가하기 전에 폴리페놀 물질 4㎍을 LDL 1ml에 첨가함으로써 결정하였다. 시험된 물질은 다음과 같았다:

1) 캐버네이 소우비뇽 적포도주

2) 보통 백포도주

3) 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 적포도주 폴리페놀

4) 실시예 2에 기술된 바와 같은 Sefcal(등록상표) 안토시아닌

5) 실시예 2에 기술된 바와 같은 Endotelon(등록상표) 프로안토시아니딘

6) 실시예 2에 기술된 바와 같은 프렌치 파라독스 캡슐(적포도주 찌꺼기)

7) 실시예 2에 기술된 바와 같은 Polyphenon(등록상표)(녹차 카테킨)

2주 동안 시험 물질의 경구적 소모에 의해 체내에서 얻어진 결과를 하기 표 7의 시험관내 결과와 비교하였다. 시험관내 결과는 4개의 측정치에 대한 평균치이다. 래그 시간은 4㎍/ml의 수준으로 첨가된 모든 물질에 의해 증가되었다. 관찰된 효과의 크기 순서는 다음과 같았다: 폴리페놀 분말 = 안토시아닌 > 녹차 카테킨 > 포도 종자 프로안토시아니딘 > 적포도주 > 백포도주 > 적포도주 찌꺼기.

물질이 경구로 섭취되고 LDL이 실시예 2에 기술된 바와 같이 분리되고 시험되었을 때, 적포도주와 적포도주 폴리페놀만이 래그 시간을 연장시켰으며, 모든 다른 폴리페놀 함유 물질은 비활성적이었다. 이러한 사실은 시험관내 결과로부터 물질의 체내 효과를 예측하는 것이 불가능하다는 것을 보여준다. 대부분의 체내 물질의 활성의 결여는 장으로부터의 흡수력 부족 때문이거나 LDL으로의 혼입에 실패함 때문일 수 있다.

구리-디엔 검정법으로 시험관내에서와 체내에서의 폴리페놀 함유 물질의 비교

물질	시험관내	체내
	래그 시간의 증가	래그 시간의 증가
	폴리페놀 함량	분	%	효과**	폴리페놀 섭취량/1일	분	%	효과
적포도주	1.8g/L	26	100	++	675	17.8	100	++
백포도주	0.2g/L	22	85	+	75	-0.22	-1	-
폴리페놀 분말*	450mg/g	65	230	+++	450	14.2	80	++
적포도주 안토시아닌	500mg/g	66	255	+++	500	-1.5	-8	_
포도 종자 프로안토시아닌	425mg/g	50	190	+++	750	-6.7	-38	_
적포도주 찌꺼기	210mg/g	18	70	+	156	-1.7	-10	_
녹차 카테킨	960mg/g	75	290	+++	300	-6.8	-38	_
* 캡슐내에서 ; ** 관찰된 효과: + 작음, ++ 중간 정도, +++ 큼, - 없음

실시예 11

실시예 2로부터 상기 언급된 지원자 중의 20명을 다음과 같은 6-9명의 피검자 군(A 및 B)으로 나누고, 2주 동안 시험하였다:

A) 1g 전체 적포도주 폴리페놀을 함유하고 소모 바로 전에 물이 첨가되는 시판중인 분말(설탕, 시트르산, 나트륨 시트레이트 아스파테임, 합성 조미료; 영국 코르비에 소재하는 캠브리지 매뉴팩쳐링 컴파니 리미티드(Cambridge Manufacturing Co Ltd))과 혼합된 까막까치밥나무향 음료(330ml); 또는

B) 2g 적포도주 폴리페놀/1일의 용량으로 상기에서 제조된 바와 같은 적포도주 폴리페놀 분말을 함유하는 캡슐.

생성물을 동등하게 나누고 점심식사 및 저녁식사 후에 섭취하게 하였다.

혈장 샘플을 수득하고 초원심분리기에서 회전시켜서 실시예 2에 기술된 바와 같은 LDL을 수득하였다.

산화 전에 LDL을 처리하는데 하기와 같이 세가지 방법을 사용하였다.

a) EDTA 부재하의 최종 투석

투석 카세트(피어스 슬라이드-A-라이저(Pierce Slide-A-Lyzer, USA 퍼스토프 바이오테크 컴파니(Perstorp Biotec Company), USA)를 사용하여 1시간 동안 2μM EDTA를 함유하는 10mM 인산염 완충액 염수로 LDL을 투석시켰다.

b) EDTA 존재하의 연속 투석

LDL을 제거하고, 10μM EDTA를 함유하는 10mM 인산염 완충화된 염수로 투석시키는 것을 제외하고는 상기와 같이 4℃에서 투석시켰다.

c) 칼럼 처리

LDL을 EcNo-pac 10DG 탈염 칼럼(바이오-래드 랩스(Bio-Rad Labs), UK)을 통해 통과시켰다. 칼럼을 처리된 10mM PBS[혼합되고 부어진 chelex-100 수지 (바이오-래드, UK), 5g/L PBS]로 2회 세척하였다. 그런 다음, LDL 600μL를 칼럼상에 로딩시키고, Ismatec IPC Peristaltic 펌프(영국 웨스톤 수퍼 메어의 이스마테크(Ismatec))를 사용하여 0.6ml/분의 유속으로 3ml PBS 완충액과 함께 용리시켰다.

그런 다음, 구리 촉매 과산화반응을 수행하고, 래그 시간을 실시예 2에서와 같이 측정하였다. 결과는 표 7에 기재하였다.

음료(1g/1일) 또는 캡슐(2g/1일)로서 적포도주 폴리페놀 소모는 (EDTA가 최종 투석물로부터 제거되었을 때) 래그 시간을 각각 30% 및 20%씩 증가시켰으며, 칼럼 방법에 의해서도 각각 12% 및 20%씩 증가시켰다. 투석물에 EDTA의 첨가는 1g/1일 적포도주 폴리페놀로 효과를 폐지시켰으며, 2g/1일로 래그 시간을 7% 증가시켰을 뿐이다.

LDL을 탈염시키기 위한 상이한 방법을 사용하는 구리 촉매 과산화반응의 래그 시간(분)

보충물	No	투석	투석	비투석
		EDTA 부재하	EDTA 존재하	칼럼
포도주 폴리페놀
음료(1g/1일)	6
기준선		60.0±5.3	64.3±3.8	54.2±4.6
2주 후		77.7±8.4	64.5±3.9	60.6±4.7
평균 차		17.7±3.1	0.3±0.1	6.4±0.1
P 값		0.02	0.9	0.005
캡슐 (2g/1일)	6
기준선		62.7±2.5	67.7±3.6	54.0±2.2
2주 후		75.8±2.8	72.2±3.1	65.8±2.2
평균 차		13.2±0.3	4.5±0.5	11.8±0.1
P 값		0.004	0.02	0.003

발명의 또 다른 목적은 관상동맥성심장병 및 평활근세포 증식과 관련된 그 밖의 질환(예를 들어, 아태롬성동맥경화증, 협착증, 발작 및 장과 자궁의 종양, 자궁 유섬유종 또는 섬유종) 치료용 활성 폴리페놀 제조물을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 피검자에게 경구로 투여될 때 전체 및 활성 TGF-β-1의 생성을 촉진할 폴리페놀 조성물(예를 들어, 적포도주로부터)을 제조하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.

분말 또는 음료 형태로 제공된 적포도주 또는 적포도주로부터 수득된 폴리페놀 제조물이 사람에게 경구로 투여될 때 혈장 전체 및 활성 TGF-β-1이 증가된다는 것이 입증되었다. 폴리페놀을 거의 함유하지 않는 백포도주는 비활성적이다.

폴리페놀 제조물의 용량은 물질의 활성도에 따라 다르지만 하루 당 10mg 내지 10g일 것이다. 포도주로부터 수득된 전체 폴리페놀 푸울에 대해, 바람직한 용량은 0.1-4g/1일이며, 보다 바람직하게는 1-2g/1일(하루 당 0.5 내지 1리터의 적포도주에 해당)이다.

실시예 12

피검자에게 경구 투여에 의해 제공된 분말 또는 음료 형태의 적포도주, 백포도주 및 (실시예 1에 이미 기술된 바와 같이) 적포도주로부터 수득된 폴리페놀 제조물을 혈장 TGF-β에 관해 이들 효과를 알아보기 위해 연구하였다.

건강한 지원자(35 내지 65세의 남자 30명)에게 2주 동안 포도주 소모를 끊도록 하였다. 이들에게 적포도주 또는 백포도주 375ml 또는 (상기에서와 같이 캐버네이 소우비뇽 포도주로부터 제조된) 적포도주 폴리페놀의 1g 전체 푸울을 330ml의 물에 캡슐 또는 음료로서 제공하였다. 각각의 보충물을 2주 동안 식사 후 매일 2회 소모하도록 하였다.

혈액 샘플을 처리 후 K3 EDTA(1mmol/L)에 취하고 원심분리하여 혈장을 수득하고, 이것을 분석하기 전까지 -70℃에서 저장하였다. 전체 혈장 폴리페놀을 싱글레톤 및 로시(1965)의 방법에 의해 측정하였다. 두가지 상이한 폴리클로날 항체를 사용하여 전체 TGF-β-1을 면역검정에 의해 결정하였다(하기된 방법 1 및 2 참조).

방법 1

전체(잠복성 + 활성) TGF-β를 R & D 시스템(UK 옥스퍼드 아빙돈)에 의해 제공된 Quantikine(등록) 사람 TGF-β 면역검정킷에 의해 측정하였다. 이 검정은 정량적 샌드위치 면역검정 기술을 사용한다. TGF-β 가용성 수용체 유형 II는 미세역가판상에 사전 코팅된 TGF-β-1을 결합시킨다. 표준 및 샘플을 웰내로 피페팅시키고 존재하는 모든 TGF-β-1을 고정화 수용체에 의해 결합시킨다. 비결합된 물질을 세척한 후, TGF-β-1에 대해 특이적인 효소 결합된 폴리클로날 항체를 웰에 첨가하여 제 1 인큐베이션 동안 고정화된 TGF-β-1을 샌드위치시킨다. 세척하여 비결합된 항체 효소 시약을 제거한 후, 기질 용액을 효소로 인해 색을 내는 웰에 첨가한다. 색의 강도는 존재하는 TGF-β-1에 비례한다.

검정을 수행하기 전에, 아세트산 및 요소를 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션시킨 후 수산화나트륨/HEPES 용액으로 중성화시킴으로써 잠복성 TGF-β를 활성형으로 전환시킨다. 이 방법은 (잠복성 + 활성) TGF-베-1을 평가한다. 잠복성 TGF-β의 활성화를 다음과 같이 수행하였다: 혈장 0.1ml에 2.5N 아세트산/10M 요소 0.1ml를 첨가하고 웰을 혼합시키고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 용액에 2.7N NaOH/1M HEPES 0.1ml를 첨가하여 샘플을 중성화시키고 웰을 혼합시켰다. 검정하기 전에, 활성화된 혈장 샘플을 킷 제조업자에 의해 제공된 칼리브레이터 묽은 혈청 RD6M으로 10배 희석시켰다.

검정법은 다음과 같다: 200㎕의 샘플 또는 표준을 미세역가판의 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음, 플라스틱 물질의 접착 스트립으로 판을 덮고 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 각 웰을 아스피레이션시키고 세척 완충액 400㎕로 3회 세척하였다. 그런 다음, TGF-β-1 컨쥬게이트 200㎕를 각각의 웰에 첨가하고 판을 새로운 접착 스트립으로 다시 덮고 110분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 웰을 아스피레이션시키고 세척 완충액 400㎕로 3회 세척하였다. 기질 용액 200㎕를 웰에 첨가하고 판을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 2N H2SO4 용액 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고 450nm에서 광학 밀도를 측정하였다.

방법 2

평가 전에 TGF-β를 활성화시키지 않는다는 것을 제외하고 상기와는 본질적으로는 동일한 방법을 사용하고, TGF-β-1에 대한 폴리클로날 항체 대신에 BDA-19 항체(영국 옥스퍼드 아빙돈에 소재하는 알 앤 디 시스템즈(R & D systems))를 대신 사용하였다. 이 방법은 TGF-β-1의 활성형을 평가한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물의 소모는 피검자의 TGF-β1 수준을 방법 1에 의해 판단된 바 1.5ng/ml 이상까지 또는 방법 2에 의해 판단된 바 0.5ng/ml까지 증가시킬 것이다.

결과

표 8에 기재된 바와 같이, 혈장 폴리페놀은 적포도주, 폴리페놀 캡슐 및 음료에서는 증가되었지만 백포도주에서는 증가되지 않았다. TGF-β-1의 증가는 적포도주, 폴리페놀 캡슐 및 음료에서 두 방법 모두에 의해 관찰되었지만, 백포도주에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 적포도주 폴리페놀이 전체량(잠복성 + 활성) TGF-β-1 및 TGF-β-1의 활성형 둘 모두를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 결론적으로, 포도주 폴리페놀이 전체 TGF-β-1을 증가시키며 VSMC 증식을 잠재적으로 억제한다.

2가지 상이한 검정법에 의한 혈장 폴리페놀 및 전체 TGF-β에 대한 포도주 및 적포도주 폴리페놀의 효과

보충물	No	폴리페놀mg/g 단백질	전체 TGF-β
			방법 1	방법 1
			ng/ml
적포도주	8
기준선		16.2±1.87	6.6±1.3	5.0±0.4
2주 후		22.6±0.91	15.5±3.1	6.5±0.5
평균 차		6.33±0.96	8.9±1.8	1.5±0.1
P 값		0.002	0.01	0.01
백포도주	8
기준선		18.9±1.67	9.7±2.5	5.6±0.6
2주 후		20.2±0.91	11.9±3.4	5.3±0.6
평균 차		1.33±0.76	2.2±0.9	0.3±0.1
P 값		0.5	0.5	0.8
폴리페놀 캡슐	8
기준선		21.0±0.96	9.0±2.3	6.0±0.7
2주 후		26.9±1.76	19.8±3.9	8.5±0.9
평균 차		5.86±0.80	10.8±1.6	2.5±0.2
P 값		0.02	0.01	0.01
폴리페놀 음료	6
기준선		21.6±0.35	9.2±1.1	5.0±1.5
2주 후		23.6±0.40	15.6±2.4	9.9±1.1
평균 차		2.05±0.05	6.4±1.3	4.9±0.4
P 값		0.03	0.03	0.03
평균±sem

발명자들은 놀랍게도 피검자에게 경구로 제공될 때 혈소판 응집을 억제하고 피브리놀리시스를 촉진할 폴리페놀 조성물(예를 들어, 적포도주로부터)을 제조하는 것이 가능하는 것을 추가로 발견하였다.

특히, 적포도주로부터 수득된 폴리페놀 제조물이 사람에게 경구로 투여될 때 아라키돈산, ADP, 콜라겐 또는 트롬빈이 작용물질로서 사용될 때 혈소판 응집률이 감소한다는 것이 입증되었다. 더욱이, 폴리페놀 제조물의 소모는 피검자의 혈장내 tPA 활성을 증가시킨다.

폴리페놀 제조물의 용량은 물질의 활성도에 따라 다르지만 하루 당 10mg 내지 10g일 것이다. 조성물이 적포도주로부터 수득된 전체 페놀성 푸울을 포함하는 경우에, 바람직한 용량은 하루 당 0.1 내지 4.0g이고, 보다 바람직하게는 하루 당 1 내지 2g(하루 당 0.5 내지 1.0리터의 적포도주에 해당)이다.

실시예 13

앞서 언급된 바(상기 실시예 1)와 같이 적포도주 폴리페놀 조성물을 제조하였다.

35 내지 65세의 건강한 남자에게 2주 동안 매일 2g의 적포도주 폴리페놀(실시예 2에 기술된 바와 같이) 또는 아스피린(75mg)을 음식물에 보충하여 제공하였다. 빠르게 시트레이트화된 혈액을 다음과 같이 기준선, 개시후 4시간 및 2주 후에 수집하였다: 최소의 혈행정지를 사용하여 누운 자세에 있는 피검자의 주전 정맥으로부터 0.1M 시트레이트를 함유하는 주사기내로(시트레이트 대 혈액 1:9 v/v) 혈액을 채취하였다. 10분 동안 250g으로 혈액을 원심분리시켜 혈소판 부화 혈장(PRP)을 제조하였다. 대부분의 PRP를 제거한 후, 15분 동안 2,5000g에서 잔류 혈액을 원심분리시켜 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 제조하였다. PRP중의 혈소판 농도를 세포 카운터(프랑스 몽펠리에르에 소재하는 에이비엑스 리미티드(ABX Ltd), 미노스 에스티엑스(Minos STX))에서 결정하였다. 1㎕ 당 150,000 내지 350,000 범위 밖의 혈소판을 갖는 샘플은 제거하였다. PRP을 응집 연구 개시 전에 30분 이상 동안 방치시켰다. 혈액 수집과 혈소판 응집 사이의 시간은 결코 3시간을 넘지 않았다. PAP-4C 응집기(영국 사우쓰암프톤 알파 래버러토리이즈 바이오데이타 (BioData))를 사용하여 새로이 제조된 혈소판에서 혈소판 응집률을 측정하였다. PRP 샘플 200㎕를 실리콘화된 큐벳에 첨가하고 3분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 20㎕의 작용물질(작용물질은 다음 중의 하나: 아라키돈산 455㎍/ml; ADP 1.8μmol/L; 바이오데이타에서 시판하는 콜라겐 43㎍/ml; 영국 도어세트 푸울의 시그마에서 시판하는 트롬빈 0.11U/ml; 모두 응집 혼합물에서 최종 농도이다)을 첨가함으로써 응집을 유도하였다. 혈소판 현탁액을 5분 동안 37℃에서 1,000rpm으로 교반시켰다. 이 시간 동안 최대 응집률(기준선으로부터의 %)을 결정하였다. 이 값은 혈소판의 응집 가능성을 결정하는 값으로서, 감소는 시험 물질의 소모 전 및 후에 회수된 샘플을 비교하는 경우에 반대 응집 반응을 나타낸다. 통계학적인 의미는 쌍을 이룬 t-시험에 의해 평가되었다.

적포도주 폴리페놀 분말은 표 9에 기재된 바와 같이 단기적으로 또는 장기적으로 혈소판 응집을 억제하였다. 이들 효과는 트롬빈을 제외하고는 아스피린(하루 당 75mg)에서 관찰된 효과와 유사하지만 이보다는 적었다. 특히, 아라키도네이트 유도된 응집에 관한 폴리페놀의 효과는 혈소판 시클로-옥시기나아제 활성의 억제를 암시한다. 이들 결과는 트롬빈 유도된 응집에 관한 추가의 억제 효과가 있음에도 불구하고 적포도주 폴리페놀이 아스피린 유사 효과를 갖는다는 것을 암시하였다.

적포도주 폴리페놀 또는 아스피린이 제공된 지원자의 최대 혈소판 응집률(%). 평균(SEM)

	최대 혈소판 응집률 (%)
	적포도주 폴리페놀a(12)†	아스피린b(7)†
작용물질	기준선	4시간	2주	기준선	4시간	2주
아라키돈산(455㎍/ml)	82.3(1.1)	78.7(0.8)*	79.0(0.8)**	69.2(10.1)	28.6(11.2)*	12.6(1.9)**
ADP(1.8μmol/L)	42.4(3.4)	37.6(3.3)	38.7(2.9)	39.2(4.2)	31.5(3.7)	31.3(2.6)*
콜라겐(43㎍/mL)	54.2(8.8)	59.2(8.0)	47.3(9.2)**	67.5(5.1)	24.6(5.0)***	21.8(4.7)***
트롬빈(0.11U/mL)	22.0(1.7)	17.4(1.8)**	16.2(2.2)*	15.5(2.8)	13.9(4.5)	12.2(2.0)
*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (기준선과는 차이가남); 피검자a2g/1일b75mg/1일)

동일한 시험을 사용하여 피검자의 PAI-1 및 tPA 활성 수준을 조사하였다. 최소의 혈행정지를 사용하여 누운 자세에 있는 피검자의 주전 정맥으로부터 pH4.3의 0.5M 시트레이트를 함유하는 주사기내로 (Stabilyte(등록상표), 시트레이트 대 혈액 1:9 v/v) 혈액을 채취하였다. 4℃에서 15분 동안 2,500g로 혈액을 원심분리하여 혈장을 제조하고, 곧바로 -70℃에서 냉동시켰다. 피검자로부터의 세 개 샘플 모두(기준선, 4시간 및 2주) 검정일에 37℃에서 급속하게 해빙시켰다. 생물 작용성 면역흡착 검정인 시판중인 킷(Chromolize(등록상표), 스웨덴 움에아에 소재하는 바이오푸울(Biopool)에서 시판)을 사용하여 tPA 활성을 결정하였다. 샘플 또는 표준(100㎕)을 각각의 웰에 첨가하였다. 미세역가판을 20분 동안 판형 셰이커에서 인큐베이션 시킨 후, 웰의 내용물을 버리고 웰을 4회 세척하였다. 그 다음, 기질 용액 50㎕, 이어서 플라스미노겐 시약 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 판을 추가의 90분 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 1.7M 빙초산 용액 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고 15초 동안 혼합시켰다. 405nm에서 흡광도를 측정하고, 샘플내 tPA의 활성을 선형 검정 곡선으로부터 읽었다. 각각의 처리에 대한 기준선, 4시간 및 2주 값 사이의 차의 의미 두 꼬리 모양의 쌍을 이룬 t-시험에 의해 평가되었다. 결과는 표 10에 기재하였다.

효소 tPA는 피브린분해 경로에서 중요한 단백질을 구성하며, 이의 활성은 피브린분해 시스템에서 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. tPA의 생리학적인 역할은 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는 것이며, 이것은 피브린을 가용성 피브린 분해 생성물로 분해한다. tPA의 검정에서, 특이적 억제제 PAI-1는 보통 매우 과량으로 존재하기 때문에 tPA 활성을 제지하지 못하도록 되어야 한다. 이것은 샘플의 중간정도의 산성화를 제공하는 Stabilyte(등록상표) 혈액 수집관의 사용에 의해 제공된다.

PAI-1 값이 주간 변화에 따라 달라지는 것으로 공지되어 있기 때문에, 동일한 피검자가 적포도주 폴리페놀 대신에 플라시보로서 물을 사용하여 연구되는 추가의 시험을 수행하였다. 결과는 표 11에 기재하였다.

적포도주 폴리페놀(2g/1일) 보충 후 PAI-1 및 tPA

	N	기준선	4시간	2주
PAI-1 항원(ng/ml)	6	18.8±3.6	8.6±1.0*	17.0±3.4
tPA 활성 (IU/ml)	10	0.62±0.16	1.61±0.30**	0.76±0.20
* P < 0.05 **P < 0.01 (기준선과 차이가 남)

4시간 후 물과 2g 적포도주 폴리페놀의 비교

PAI-1 항원(ng/ml)(n=11)
용량	물	적포도주 폴리페놀 (2g)
시간	0 시간	4시간	0시간	4시간
평균	21.9	10.6	20.3	9.5
SD	12.7	4.2	9.0	3.1
SEM	3.8	1.3	2.7	0.9
P 값		0.0061		0.0007
tPA 활성도(IU/ml)(n=9)
용량	물	적포도주 폴리페놀 (2g)
시간	0시간	4시간	0시간	4시간
평균	0.821	1.221	0.566	1.511
SD	0.693	0.605	0.492	0.934
SEM	0.231	0.202	0.164	0.311
P 값		0.1968		0.0136

적포도주 폴리페놀(2g/1일)은 tPA 활성을 상당히 증가시키는 것과 관련되어 있는 PAI-1을 4시간 후에 상당히 감소시켰다(표 10 참조). 2주 처리 후 밤샘 절식 후 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 그러나, 표 11에 기재된 바와 같이, 4시간 후에, PAI-1 항원 농도는 물의 투여 후에 증가되며, 이는 폴리페놀 분말의 소모 후에 관찰된 PAI-1 항원 농도에 관한 효과가 단순히 주간 변화에 의한 것임을 나타낸다. 그러나, 물의 투여는 tPA 활성을 상당히 증가시키지는 못했지만, 적포도주 폴리페놀 분말은 tPA 활성을 2.6배 증가시켰다. 결론적으로, 적포도주 폴리페놀이 tPA 활성을 증가시킴으로써 피브리놀리시스를 촉진시키는데 상당히 효과적이지만, PAI-1 항원 농도에 대해서는 효과가 없다는 것을 알 수 있다. tPA는 플라스미노겐으로부터 플라스민의 형성을 촉진시키며, 플라스민은 TGF-β의 잠복형을 활성형으로 전환시킨 후 아태롬성동맥경화성 플라크의 성장에 기여하는 맥관 평활근 세포(VSMC)의 성장을 억제한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물의 소모는 (상기된 방법에 의해 결정된 바와 같이) 최대 혈소판 응집률을 2% 이상 감소시키고/거나 (상기된 방법에 의해 결정된 바와 같이) tPA 활성을 0.751U/ml 증가시킬 것이다.

참고문헌

Claims (25)

1. 사람이 소모하기에 적합한 식물 유도 플라보놀 함유 건조 조성물로서, 조성물중의 식물 유도 물질의 25% 이상이 폴리페놀을 포함하는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 0.01%(w/w) 이상의 플라보놀을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
3. 0.01%(w/w) 이상의 플라보놀을 포함하는, 사람이 소모하기에 적합한 식물 유도 플라보놀 함유 건조 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 플라보놀 함량이 0.1%(w/w) 이상임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 플라보놀 함량이 1%(w/w) 이상임을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 플라보놀 함량이 조성물중의 전체 식물 유도 폴리페놀 함량의 0.5% 이상을 구성함을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 플라보놀 함량이 조성물중의 전체 식물 유도 폴리페놀 함량의 1.0% 이상을 구성함을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 플라보놀 함량이 조성물의 전체 식물 유도 폴리페놀 함량의 2% 이상을 구성함을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 적포도주의 전체 폴리페놀 푸울을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 부형제, 희석제 또는 담체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 영양분, 산화방지제, 치료 성분(특히 CHD의 예방, 치료 또는 둘 모두와 관련하여 치료 효과를 갖는 성분), 착향제, 감미제로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 루테인, 리코펜, α-카로텐 β-카로텐, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E(α-토코페롤 및 그 밖의 활성 토코페롤), 폴산, 셀레늄, 구리, 아연, 망간, 유비퀴논(조효소 Q10), 살리실산, 2,3-디히드록시 벤조산, 2,5-디히드록시 벤조산, 및 아스피린으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 단위 용량형으로 충전됨을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 정제, 캡슐 또는 환약 형태임을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물 및 생리학적으로 허용되는 액체를 포함하는 음료.
16. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 생리학적으로 허용되는 액체와 혼합시키는 것을 포함하여, 음료를 제조하는 방법.
17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 생리학적으로 허용되는 액체가 물, 수용액, 알코올성 용액, 과즙, 우유 또는 요구르트를 포함함을 특징으로 하는 음료 또는 방법.
18. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제 15항에 따른 음료을 제조하고; 조성물 또는 음료를 피검자에게 투여하는 것을 포함하여, 피검자의 혈장 LDL의 산화를 억제하는 방법.
19. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제 15항에 따른 음료을 제조하고; 조성물 또는 음료를 피검자에게 투여하는 것을 포함하여, 피검자의 TGF-β 생성을 자극하는 방법.
20. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제 15항에 따른 음료을 제조하고; 조성물 또는 음료를 피검자에게 투여하는 것을 포함하여, 피검자의 혈소판 응집을 억제하거나, 피브리놀리시스를 자극하거나, 이둘 모두를 수행하는 방법.
21. 피검자의 혈장 LDL의 산화를 억제하기 위해 피검자에 의해 소모되는 약제의 제조를 위해 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 방법.
22. 피검자의 TGF-β 생성을 자극하기 위해 피검자에 의해 소모되는 약제의 제조를 위해 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 방법.
23. 피검자의 혈소판 응집을 억제하거나, 피브리놀리시스를 자극하거나 둘 모두를 수행하기 위해 피검자에 의해 소모되는 약제의 제조를 위해 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 방법.
24. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하고; 조성물의 단위 용량을 제조하는 것을 포함하여, 환자의 혈장 LDL의 산화의 억제; 펼소판 응집의 억제; 피브리놀리시스의 자극; 및 TGF-β 생성의 자극 중의 하나 이상을 수행하기 위해 피검자에 의한 경구 소모용 약제를 제조하는 방법.
25. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 생성물, 특히 식료품.