NO20022989L - Middel for antiadhesjonen av hudpatogen flora - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et bakteriell middel selektert for sine egenskaper for antiadhesjon av hudpatogener, fremstilling av sammensetninger for kosmetisk, farmasøytisk eller veterinær anvendelse og som er ment å stabilisere og/eller regulere hudøkosystemet hos pattedyr, og sammensetninger som inneholder et slikt middel.

Kjent teknikk

Prolifereringen av patogener slik som Staphylococcus aurens, Streptococcus pyogenes eller Propionibacterium acnes, eller av visse gjær, kan føre til dysregulering av hudsystemet, eller enda mer alvorlige forstyrrelser i huden eller av slimhinner, slik som eksem, candida, dermatitt, etc.

Mange måter for behandling mot disse patogene midler er kjent. De mest konvensjonelt anvendte er antibiotika eller kjemiske antibakterielle middel. De er for eksempel sammensetninger basert på aldehyder og derivater.

Således beskriver den publiserte patentsøknaden FR 2740039 anvendelsen av en substans valgt fra aldeyder og bifunksjonelle forbindelser, helst glutaraldehyd, for å hemme binding av patogene stammer slik som Staphylococcus aureus til keratinocytter og corneocytter.

Således er heksaklorofen og dets derivater kjent som antibakterielle substanser og blir spesielt anvendt mot Propionibacterium acnes.

Disse behandlinger er generelt kostbare og skadelige både for helsen og omgivelsene.

Alternative ikke-toksiske behandlinger som består i å bruke de antifungale, baktericidale eller bakteriostatiske egenskapene til visse stammer av mikroorganismer er nå kjent.

Således demonstrerer PCT søknad WO 97/366603 de antifungale egenskapene til en stamme av Lactobacillus casei.

Andre bakterielle midler, slik som Bacillus, kan også anvendes på hud eller slimhinnemembraner. Spesielt, i søknad WO 98/47374, blir stammer av Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus og Bacillus laevolacticus anvendt i sammensetninger som har til hensikt å forebygge bakterielle, virale eller soppinfeksjoner på hud eller slimhinnemembraner.

Oppfinnelsen angår å finne et nytt bakterielt middel som er i stand til å kontrollere og regulere hudøkostystemet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Med denne hensikt, relaterer den foreliggende oppfinnelsen seg til anvendelsen av et bakterielt middel for å fremstille en sammensetning som er for kosmetisk, farmasøytisk eller veterinæranvendelse og som har til hensikt å bli administrert til mennesker eller til dyr med det formål å forebygge eller behandle sykdommer indusert av patogener av hudsystemet, der nevnte bakterielle middel er et ekstrakt av en melkesyrebakterie, eller en melkesyrebakterie, selektert for å fa sine egenskaper til adhesjon til hudceller og til å regulere binding av hudpatogener, spesielt ved å hemme deres adhesjon.

Det bakterielle middel kan selekteres fra stammer av Lactaobacillus, Micrococcus eller Bifidobacterium, og helst fra Lactobacillus johnsonii CNCM1-1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 eller for eksempel Bifidobacterium lactis ATCC 27536 stammer.

Den bakterielle stammen kan anvendes i en levedyktig, deaktivert eller delvis aktiv form.

Det bakterielle middel kan for eksempel anvendes i form av et lyofilisert pulver, som kan omfatte ca. 10 x IO<8>til 10 x IO<11>cfu/g.

Den foreliggende oppfinnelsen angår også en sammensetning som er for kosmetisk, farmasøytisk anvendelse og som inneholder minst et bakterielt middel som er i stand til å stabilisere og/eller regulere den patogene flora i hudsystemet, der nevnte bakterielle middel er et ekstrakt av en bakterie, eller en bakterie, selektert for sine egenskaper til adhesjon til hudceller og dets antiadhesive egenskaper med hensyn til patogener i hudsystemet.

Denne sammensetningen kan også anvendes ved oftalmologi eller nasal bruk.

Denne sammensetningen kan for eksempel spesielt være i form av en krem, lotion, hypoallergen rensende "bar", sjampo eller pulver.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Gruppert sammen under navnet "hudsystem" er alle hudceller (dvs. keratinocytter), men også comeocytter.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et bakterielt middel selektert for sin egenskap for å feste seg til hudceller, og for å stabilisere og regulere den patogene bakterielle flora i hudsystemet, spesielt ved for eksempel å hemme adhesjonen av patogener slik som Stajylococcus aureus, Streptococcus pyogenes eller Propionibacterium acnes.

For dette ble mange bakterielle stammer testet for deres egenskaper til å feste seg til humane keratinocytter (cf. eksempel 1).

Fra diverse bakterielle stammer som derfor ble testet, kan stammer av Lactobacillus, av Micrococcus og av Bifidobaterium og mer spesielt en stamme av Lactaobacillus johnsonii (NCC 533), to stammer av Micrococcus varians (NCC 1482, NCC 1520) og en stamme av Bifidobacterium lactis (ATCC 27536) selekteres.

Stammen av Lactobacillus johnsonii (NCC 533) og stammene av Micrococcus varians (NCC 1482 og NCC 1520) ble deponert ifølge overenskomsten fra Budapestavtalen ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)

[National Collection of Microorgaism Cultures], Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike henholdsvis på 30. juni 1992 under referansen CNCM 1-1225 for Lactobacillus johnsonii og 7. juni 1995 under referansene CNCM I-1586 og CNCM 1-1587 for Micrococcus varians NCC 1482 og NCC 1520.

Stammen av Bifidobacterium lactis (ATCC 27536) kan skaffes fra Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alle, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Danmark).

Detaljer med hensyn til morfologi og de generelle egenskapene til stammene er gitt under:

Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225

Morfologi

- ikke-motil grampositiv mikroorganisme som ikke danner sporer.

- Ganske korte og tykke isolerte staver.

Metabolisme

- Mikoaerofil mikroorganisme med homofermantiv metabolisme som opphav til produksjon av L (+) og D (-) melkesyre. - Andre karakteristika: katalase (-), CO2produksjon (-), arginin hydrolyse (-). Fermentering av sukkere: Amygdalin (+), arabinose (-), cellobiose (+), esculin (+), fruktose (+), galaktose (-), glukose (+), laktose (+), maltose (+/-), mannitol (-), mannose (+), melibiose (-), raffinose (+), ribose (-)salicin (+), sukrose (+), trehalose (+).

Micrococcus varians CNCM 1-1586 (NCC 1482) og CNCM 1-1587 (NCC 1520) Morfologi

- Grampositiv mikroorganisme er permanent immobil.

- Sfærisk form, er i form av irregulære arrangerte tetrader.

Metabolisme

- Aerob mikroorganisme, katalase (+)

- Andre karakteristika: gul farge på BHI medium. Den optimale veksttemperaturen av nevnte stammer er 25-37°C.

Fermentering av sukkere

Fruktose (+), glukose (+).

Bakterien ifølge opprinnelsen blir anvendt for å lage sammensetninger som er ment for profylakse eller behandling av forstyrrelser som er være forbundet med patogener i hudsytemet, slik som for eksempel Staphylococcus aureus, streptococcus pyogenes, Propionibacterum acnes, eller gjær.

Disse hudforstyrrelsene kan spesielt være atopisk dermatitt (i remisjonsfasene som en opprettholdelsesbehandling), acne, candidas, seborroisk dermatitt, pityriasis versicolor, impetigo eller eksematøse sekundære infeksjoner.

Forstyrrelsene i hudsystemet kan også være forbundet med terapier med antibiotika eller antimykotiske middel. Til diabetes (candidaer) til en patologi av slimhinnemembraner (vaginale candidaer), til kronisk eksem (ubalanse i hemostasen), til sensitiv hud (premature spedbarn, barn) eller fet hud (forbundet med hormonell dysregulering som kan fremme veksten av bakterier) eller til flass.

Bakterien ifølge oppfinnelsen kan anvendes i deres levende eller semiaktive form, eller i en deaktivert form. Uttrykket "bakterie i en semiaktiv form" har til hensikt å bety en bakterie som har lav fysiologisk aktivitet. Denne aktiviteten kan måles med lenger eksponentiell vekstfase eller generasjonstid, en metabolisme som er blitt langsommere eller en ufullstendig fysiologisk respons på modifikasjoner for eksempel i omgivelsene. I visse ekstreme tilfeller kan antall bakterier være nedsatt fordi de ikke lenger kan takle forandringene i omgivelsen.

Bakterielle kultursupematanter kan også anvendes.

Ifølge en første utførelsesform ifølge oppfinnelsen, kan det bakterielle middel være et ekstrakt av en bakterie, eller en bakterie der nevnte bakterie er i sin levedyktige aktive form. Det bakterielle middel er helst i form av et lyofilisert pulver skaffet til veie for eksempel ved metoden beskrevet i EP 818529. Pulveret kan inneholde fra 10 x IO<8>til 10 x IO11cfu/g.

Ifølge en annen utførelsesform, kan det bakterielle middel være et ekstrakt av en bakterie, eller en bakterie, i en semiaktiv form. Den partielle deaktiveringen av stammene kan gjøres på forskjellige måter, spesielt ved: - frysetørking, som består av sykluser med frysing i flytende nitrogen/tining ved 37°C. En nedgang på ca. 1 log kan så oppnås, - virkning av UV-stråling (15 til 60 minutter ved 254 nm, distanse 20 cm): nedgang på 2 til 3 log,

- virkning av varme (70°C i 3 timer): nedgang på for eksempel 3 til 4 log.

Det bakterielle middel kan så anvendes i form av et pulver som inneholder minst 10 x IO<6>cfu/g, og helst i tørre sammensetninger, slik som tørre sjampoer eller andre pulversammensetninger som kan inneholde opp til 10% av det bakterielle ekstraktet.

Til slutt kan det bakterielle middel også være et ekstrakt av en bakterie, eller en bakterie, i en deaktivert form. Bakterien blir helst inaktive ved varmebehandling ved ca. 90°C i ca. 2 timer. Det bakterielle middel er i form av et lyofilisert pulver som inneholder fra 10 x 10<8>til 10 x 10<12>cfu/g. Det kan anvendes ved opp til 5%, og fra helst 0,05 til 3% i flytende sammensetninger og opp til 10% i pulversammensetninger.

Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg også til en sammensetning som er for kosmetisk, farmasøytisk eller veterinær anvendelse og som inneholder et bakterielt middel som har egenskapene som er beskrevet ovenfor.

For å lage en slik sammensetning, blir minst en bakteriell stamme i levedyktig, semiaktiv eller deaktivert form inkorporert i en farmasøytisk eller kosmetisk akseptabel støttemateriale i en mengde som varierer som en funksjon av den ønskede anvendelsen. Det bakterielle middel kan være til stede i opp til ca. 5% med hensyn til den totale vekt av sammensetningen og opp til 10% for sammensetninger i form av et pulver, og helst mellom 0,5 til 2%.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan administreres via den lokale eller okulare ruten.

Via topisk administreringsform er de farmasøytiske sammensetningene ifølge forbindelser ifølge oppfinnelsen helst ment for behandling av hud og av slimhinnemembraner, og kan være i form av balsamer, kremer, melk, salver, pulvere, gjennombløtende vattpinner, løsninger, geler, spray, lotions eller suspensjoner. De kan også være i form av mikrosfærer eller nanosfærer, eller lipid eller polymere vesikler, eller av polymerplastere og av hydrogeler som tillater kontrollert frigivelse. Disse sammensetningene for administrering via den lokale ruten kan enten være i vannfri form eller i vandig form avhengig av den kliniske indikasjonen.

Via den okulare administrasjonsmåten er de hovedsakelig øyevaskere.

I en foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen seg til en kosmetisk sammensetning som inneholder i et kosmetisk akseptabelt støttemateriale, minst et bakterielt middel som definert over. Den kosmetiske sammensetningen kan inneholde det bakterielle middel i en andel på minst 0,001 vekt% i forhold til totalvekten av sammensetningen og helst fra 0,05 til 3%.

Denne kosmetiske sammensetningen er spesielt ment for kropp- og hårhygiene. Den kan spesielt være i form av en krem, melk, lotion, gel, mikrosfærer eller nanosfærer, eller lipid eller polymere vesikler, såpe eller sjampo.

I sammensetningene ifølge oppfinnelsen, kan det levedykdige eller inaktiverte bakterielle middel være kombinert med retinider eller kortikosteroider eller kombinert med hemmere av frie radikaler, med ct-hydroksy eller a-ketosyrer eller deres derivater, eller med ionekanalblokkere.

De farmasøytiske og kosmetiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også inneholde inerte tilsetninger og selv farmakodynamiske eller kosmetiske aktive additiver, eller kombinasjoner av disse additiver og spesielt: våtgjørende middel; depigmenteirngsmiddel slik som hydrokinon, azelainsyre, koffeinsyre eller kojinsyre; bløtgjørere; fiiktemidler slik som glyserol, PEG-400, tiamorfolinon og dets derivater, eller urea; antiseborreisk eller antiacne midler, slik som S-karboksymetylcystein, S-benzylcysteamin, deres salter og deres derivater, eller benzoylperoksid; antibiotika slik som erytromycin og det estere, neomycin, clindamycin og dets estere; tetrcykliner; antifungale midler slik som ketoconazol eller 4,5-polymetylen-3-isotiazolinoner; midler for å fremme gjenvekst av hår, slik som Minoxidil (2,4-diamino-6-piperidinopyrimidin 3-oksid) og dets derivater, Diazoksid (7-kloro-3-meyl-l,2,4-benzotiadiazin 1,1-dioksid) og Fenytoin (5,4-difenylimidazolidin-2,4-dion) [sic]; nonsteroidale antiinflammatoriske midler; karotenoider og spesielt P-karoten; antipsoriatiske midler slik som antralin og dets derivater; og til slutt eicosa-5,8,11,14-tetrayninsyre og eicosa-5,8,11-trynoinsyre deres estere og amider.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan også inneholde konserveringsmidler slik som parahydroksybenzoinsyreestere, stabilisatorer, fuktighetsregulatorer, pH regulatorer, osmotisk trykkomformere, emulgeringsmidler, UV-A og UV-B screenende midler og antioksidanter slik som a-tokoferol, butylhydroksyanisol eller butylhydroksytoluen.

Til slutt angår den foreliggende oppfinnelsen også en sammensetning som er for veterinær eller kosmetisk anvendelse for dyr og som inneholder minst et bakterielt middel som definert ovenfor. En slik sammensetning kan være i form av tørre eller flytende sjampoer, pulvere, skum eller for eksempel lotions. Den kan inneholde opp til 10% av det bakterielle middel.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen er ment spesielt for den terapeutiske eller profylaktiske behandling av frisk, sensitiv og/eller syk hud og/eller slimhinnemembraner som kan utvise sykdommer i hudsystemet, slik som spesielt: - infeksiøse komplikasjoner slik som superinfisert atopisk dermatitt, impertigobasert eksem, mavesår, sår, forbrenninger, superinfisert inflammatorisk acne,

- dermatitt slik som impetigo, overflatisk follikulitt,

- seborrisk dermatitt, pityriasis versicolor,

- dermatofytose (Tinea capitis, Tinea corporis, fotsopp, Hebras eksem, herpes

carcinatus),

- candidiasis (vaginal, interdigital, koplet til profesjoner med risiko eller til diabetes),

- forstyrrelser koplet til terapier med antibiotika eller til antimykotiske midler,

- forstyrrelser forårsaket av hormonell dysregulering (fet hud) eller [sic] flass,

- sensitiv hud (premature spedbarn, barn).

Sammensetningene for veterinær anvendelse er spesielt ment for å behandle eller forebygge dysfunksjoner som skyldes stafylokokkinfeksjoner (på grunn av Staphylococcus aureus, S. intermdians), streptokokkinfeksjoner (som skyldes S. pyognes) og mykotiske infeksjoner (candidoses som skyldes C. albicans og pytirosporoses som skyldes P. canis).

Andre karakteristika av den foreliggende oppfinnelsen vil tydeliggjøres gjennom den følgende beskrivelsen av eksemplene på utførelsesformer, som blir tilveiebrakt med de hensikter å illustrere den foreliggende oppfinnelsen og er ikke ment å være begrensende.

Eksempler

Eksempel 1: Seleksjon av det bakterielle middel

I sammenhengen av den foreliggende oppfinnelsen blir adhesjonen av 12 forskjellige bakteriestammer til hudceller, spesielt til HaCat humane keratinocytter i kultur studert. Disse stammene tilhører Lactobacillus, Bifidobacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus og Propionibacterium slektene.

De bakterielle kulturer (1 ml) blir inkubert i 10 ml medium (cf. tabell 1) over natten. For adhesjonsanalysene blir bakteriene predyrket inntil en konsentrasjon på 5,0 x 10 Q til s0 Q cfu/ml er oppnådd. Cfuen blir standardisert ved å måle den optiske tettheten av hver stamme OD ved 10 Q cfu/ml: se tabell 1).

Deretter blir bakteriestammene analysert for deres adhesjonsegenskaper.

Human keratinocyttlinjer:

Adhesjonsegenskapene til bakteriene ble studert på 3 keratinocyttlinjer:

- SV40 T-Ag udødeliggjorte cellelinjer: DK2-NR og FK2-NR celler som beskrevet i EP 780 469 og, - HPV (humant papillomavirus) E6/E7 og SV40 T-Ag udødeliggjorte cellelinjer: DK7-NR cellelinjer som beskrevet i søknad WO 99/02347.

Kulturmedium for cellelinjene:

DK/-NR, FK2-NR: NR-2 (Biofluids, Rockville, MD 20850) (EP 780469).

DK2-NR: NR-M (Biofluids, Rockville, MD 20850).

Keratinocyttlinjene blir dyrket i et forhold på 5 x 10<5>keratinocytter/cm<2>, sådd ut i belagte 6 brønners clustere (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). Beleggingsløsningen består av basalt medium supplementert med 10ug/ml av humant fibronektin (Becton Dickinon), 31 ug/ml av bovint collagen I (Vitrogen, Collagen Corporation, Fremont, CA) og 0,1 mg/ml av BSA (Biofluids, Rockville, MD 20850). Etter 6 til 8 dager, danner cellekulturene et monolag (confluent). Så blir Ca<2+>konsentrasjonen i mediet brakt til 1,5 mM for å indusere celledifferensiering. Celler blir dyrket i 4 dager i et høyt kalsiumkonsentrasjonsmedium uten antibiotika. For adhesjonsanalysene, blir cellekulturene vasket 3 ganger med buffer (HBSS, Ca<2+>: 1,0 mM).

Radioaktiv merking

Bakteriestammene blir merket over natten ved å tilsette 100 uCi/10 ml av 2-<3>H-adenin (Amersham, TRK.311) til dyrkingsmediet. Alikvotfraksjoner av bakteriene blir inkubert i et medium uten<3>H-adenin. Den umerkede (kalde) supernatanten blir satt til side for å justere cfu/ml for adhesjonsanalysene.

Adhesjonsanalyser

Bakteriesuspensjonene blir sentrifugert i 10 minutter ved 4000 rpm. Før justering av den optiske tettheten (OD), blir pelletene vasket to ganger i HBSS. OD blir målt for hver stamme for å justere sluttkonsentrasj onene av bakteriene til IO6, IO<7>,10<8>og IO<9>cfu/ml. Mediet for adhesjonsanalysene er en 1:1 blanding av keratinocyttdyrkingsmedium og av den umerkede supernatanten av bakteriemediet.

For å analysere adhesjonsegenskapene til bakteriene på et substrat uten keratinocytter, blir bakteriesuspensj onene inkubert på plastskåler og plastskåler belagt med celler.

Analyse

Etter vask av kulturene 3 ganger med HBSS (Ca<2+>, 1,0 mM), blir bakteriene som er assosiert med keratinocyttene lysert i en løsning av IN NaOH i 30 minutter ved romtemperatur. Løsningen blir overført til scintillasjonsmpuller med en 1 ml av benzetoniumhydroksid (Sigma, St. Louis, USA). Etter 1 time ved 60°C, blir den<3>H aktiviteten av de merkede bakteriene målt ved flytende scintillasjonstelling (dpm).

Adhesjonsindeksen (AI) beregnet som<3>H aktivitet (dpm/ml) per brønn) som prosent av totalt 3H aktivitet (dpm/ml) av bakterisuspensjonen.

Resultater

Adesjonsindeks (AI)

Adhesjonsindeksen av de 13 forskjellige bakteriestammene er beregnet ved å måle<3>H-adenin aktiviteten i de radioaktivt merkede mikroorganismene. Resultatene er gitt i tabell 2.

Resultatene viser at de høyeste adhesjonsindisiene blir oppnådd for følgende stamme: En Bifidobacterium lactis ATCC 27536, en Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM 1-1225) stamme og Micrococcus varians NCC 1482 (CNCM 1-1586), NCC 1520 (CNCM 1-1587) og NCC 1583 stammene.

Eksempel 2: In vitro analyser for hemming av adhesjonen til Staphylococcus aureus og Streptococcus pyogene ved Micrococcus varians NCC 1482 eller Lactobacillus johnsonii NCC 533.

Mikroorganismer og dyrkingsmetoder

Patogenene Staphylococcus aureus og Streptococcus pyogene blir dyrket i buljong ved subkulturering fra en kultur i den eksponentielle vekstfasen (tabell 3). En OD/bakteriell tetthetkorrespondering ble etablert for hver av de mikroorganismene som ble analysert, på basis av seriefortynninger og telling på agarmedium.

Dyrkingsmedium:

TCS (AES, Combourg, ref. AEB 141502)

BHI (UNEPATH SA, Dardilly, ref. CM 225)

Transformerte humane keratinocytter

Udødeliggjorte humane kertinocytter av HaCaT-linjen ble anvendt (Boukamp P. et al., J. CellBioL, 106, 761-771,1988). HaCaT-cellene ble dyrket i DMEM medium supplmentert med 10% føtalt kalveserum ved 37°C under 5% CO2.

6-brønners clustere (Becton Dickinson) blir sådd ut i et forhold på 10<4->celler/cm<2>. Etter 4 til 5 dager, når cellene konfluens. Adhesjonsanalysene blir utført 4 til 5 dager etter konfluens. Monolayerene blir vasket 3 ganger med PBS før disse analysene.

Radioakiv merking

Bakteriene blir merket med 2-<3>H-adenin (Amersham, TRK 311) i et forhold på 100 uCi/10 ml buljong. Suspensjonene ble vasket 3 ganger og så resuspendert i PBS. Celletettheten blir justert i den samme buffer.

Adhesjonsanalyse på keratinocytter i kultur:

1 ml av radioaktivt merket bakteriesuspensj on blir inkubert i 1 time ved 35°C. Monolayere blir vasket 3 ganger med PBS buffer og lysert ved å tilsette IN NaOH i 30 minutter ved romtemperatur. Lysatet blir overført til en scintillasjonsampulle og inkubert i 1 time ved 60°C med 1 ml hyaminhydroksid (Carlo Erba, ref. 464951).<3>H-aktiviteten blir telt i en flytende scintillasjonsteller. Hver analyse utføres i triplikater. En kontroll med plastsupporten blir også utført.

Adhesjonen er definert ved forholdet mellom radioaktivitet som henger fast og radioaktiviteten som ble introdusert, multiplisert med 100.

Adhesjonsinhiberingsanalyse

Etter vasking og resuspensjon i PBS blir det radioaktivt merkede patogene og den kalde bakteriestammen inkubert samtidig med monolayere. Analysene blir utført i triplikater for bakterielt middeltetthet som dekker 3 logger.

Resultater

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 og Micrococcus varians NCC 1482 ble analysert for deres adhesjon til HsCaTen keratinocytter i kultur. Resultatene er gitt i tabell 4.

Resultatene viser at Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 og Micrococcus varians NCC 1482 fester seg til keratinocytter i kultur. Når tettheten av det bakterielle middel øker, blir patogenet økende erstattet.

Eksempel 3: In vitro analyser for hemmingen av adhesjonen til S. aureus av aktiv eller deaktivert Lactobacillus johnsonii NCC 533.

In vitro adhesjonsmodellen er basert på inkuberingen av en radioaktiv merket og kalibrert suspensjon av en hudpatogen mikroorganisme ( Staphylococcus aureus) med en monolayer av udødeliggjorte humane keratinocytter (HaCaT linje) (Boukamp P. et al., J. CellBiol, 106, 761-771, 1988).

Den hemmende aktiviteten av det bakterielle middel ( Lactobacillus johnsonii NCC 533 i en levedyktig eller deaktivert form) med hensyn til denne adhesjonen er evaluert i sammenheng med en ko-inkubasjon, på monolayere, av patogenet og den forbindelsen som skal analyseres, ved å måle radioaktiviteten som er igjen på monolayeren.

Kreatinocytter

For dette blir HaCaT-cellene dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum ved 37°C under 5% av CO2. De blir sådd ut i 6-brønners clustere i et forhold på 10<4>celler /cm<2>. Adhesjonsanalysen utføres 5 dager etter konfluens. Monolayerene blir vasket 3 ganger med PBS før inkubering med mikroorganismene.

Mikroorganismer

Staphylococcus aureus (ATCC 6538) blir dyrket i TCS medium, i aerobiosis ved 35°C.

Lactobacillus johnsonii NCC 533 blir dyrket i MRS medium i anaerobiosis ved 37°C. For adhesjonshemmingsanalysen blir en konsentrert suspensjon av bakteriene preparert i PBS buffer fra en 48-timers kultur. Suspensjonen blir justert til 2x10 Q cfu/ml (OD ved 525 nm = 1,5). Seriefortynninger blir laget i PBS buffer for å oppnå suspensjoner på 2,0 x IO<7>og 2,0 x IO6 cfu/ml. De forskjellige suspensjonene blir telt og MRS agar inkubert i anaerobiosis ved 37°C.

Den deaktiverte formen av NCC 533 blir skaffet ved å lyofilisere en tett suspensjon av Lactobacilli som er blitt utsatt for flere sykluser med frysing i flytende nitrogen/tining ved romtemperatur. Preparasjonen som analyseres korresponderer til en biomasse på 4,0 x 10<10>cfu/g.

Radiokativ merking

Den radioaktive merkingen av Staphylococcus aureus blir oppnådd ved å inkorporere 100 uCi/10 ml av<3>H -adenin i løpet av 24 timers dyrking i TCS buljong. Suspensjonen blir så sentrifugert i 10 minutter ved 3000 rpm og vasket 3 ganger i PBS. Celletettheten blir justert med PBS buffer til ca. 2,0 x 10<8>cfu/ml (OD ved 525 nm = 0,5). Den spesifikke radioaktiviteten blir bestemt ved scintillasjonstelling på 100 ul av suspensjonen.

Adehesjonsinhiberingsanalyse:

1 ml av den radioaktive merkede suspensjonen av Staphylococcus aureus og 1 ml av suspensjonen av NCC 533 per brønn av HaCaT-cellekultur, blir tilsatt samtidig. Etter 1 times inkubasjon ved 37°C, blir monolayerene vasket 3 ganger med PBS buffer og lysert ved å tilsette 1 ml av IN NaOH i 30 minutter ved romtemperatur. Lysatet blir overført til scintillasjonsampuller og inkubert i 1 time ved 60°C med 1 ml av benzetoniumhydroksid. Etter nedkjøling blir 110 ml av Hyonic fluor scintallasjonsvæske tilsatt og radioaktiviteten blir telt i en væskescintillasjonsteller. Kontrollen oppnås ved å tilsette 1 ml radioaktiv merket suspensjon av Staphylococcus aureus og 1 ml PBS buffer, og korresponderer til 100% adhesjon.

Resultatene er gitt i tabell 5.

Eksempel 4: In vivo analyser for hemmingen av adhesjonen av hudpatogener ved deaktivert Lactobacillus johnsonii.

Materialer og fremgangsmåter

Dyr:

15 7- til 8 uker gamle SKH hunnmus som veide ca. 30 g ble skaffet av C. River. 5 mus ble brukt i hver gruppe for å analysere en forskjellig aktuell applikasjon.

Mikroorganisme

En stamme av Staphylococcus aureus (kalt: stamme 1) som var isolert fra en human hudlesjon (leg ulcer) blir anvendt. Denne stammen er sensitiv til methycilin.

Tilberedning av inokulum

En suspensjon av bakteriene blir laget for inokulering i mus. For dette, blir en prekultur i den eksponentielle vekstfasen av stamme 1 laget på et fast medium (AES, AEB 122 859) ved 35°C i 18 til 24 timer. Etter inkubering blir bakteriene resuspendert i 10 ml av steril saltvannløsning og så restituert etter sentrifugering ved 3000 [lacuna] i 10 minutter. Supernatanten blir så fjernet og pelleten blir tatt opp med 10 ml av saltvannløsning. Denne prosedyren blir repetert to ganger. En inkokulum suspensjon blir laget ved å resuspendere de vaskede bakteriene i 4 ml av steril saltvannløsning. OD ved 525 blir justert til ca. 0,14. Den innholder ca. 10 o cfu/ml.

Inokulering av mus

Huden til musene blir delipidisert på sidene med 95 [sic] etanol (Merck). 50 ul av en suspensjon som inneholder en 50/50 blanding av S. aureus inokulum, IO<7>cfu/ml, og av produktet som skal analyseres ble langsomt tatt på de delipidiserte områdene (6,25 cm<2>) ved å bruke mikropipette. De inokulerte setene blir beskyttet ved lukking i 1 time under en steril plastkledning (Dermafilm 33 x 15, ref. 38.3015, Vygon laboratory).

Telling av de levedyktige bakeriene i lesjonene

4 timer etter anbringelsen av suspensjon, blir musene drept under anestesi med forene (Abbott France). De inokulerte setene blir skåret ut som en blokk (12 mm diameter). Hudbiopsiene som er fjernet blir kvernet og homogenisert med 2 ml steril saltvannløsning ved å bruke en Polytron (PT 2100, Bioblock Scientific) (5 rpm, 5 min.).

En 1 ml prøve av de homogeniserte vev blir tilsatt til 9 ml sterilt saltvannløsning og 0,1 ml av denne blandingen blir dyrket på et stafylokokkmedium No. 110 ved å bruke den 10-gangers dilutronmetoden. Etter 48 timer med inkubering ved 35°C, blir koloniene som er utviklet telt og CFU(kolonidannende enheter) blir bestemt.

Resultater

Resultatene er gitt i tabell 6.

Nærværet av NCC 533 i 1% gjør det mulig å senke antall av bakterier funnet ved ca. 1 logg etter 4 timers kontakt. Forskjellen synes å være signifikant med hensyn til kontrollen (p = 0,098).

I nærværet av glutaraldehyd er nedgangen i antall bakterier enda mer signifikant med hensyn til kontrollen, imidlertid er det ikke umulig at denne aktiviteten skyldes dets antiseptiske aktivitet og virker så snart som S. aureus blir tilsatt til blandingen; derfor ville ikke aktiviteten som ble observert etter 4 timer skyldes en antiadhesiv effekt, men en antibakteriell aktivitet av produktet.

Resultatene er gitt i tabell 7.

Nærværet av MCC 533 ved 0,5% og 1% senker antallet av S. aureus bakteria runnet ved ca. 1 logg for inokula ved IO<6>cfu/ml og IO<7>cfu/ml. Ingen doseeffekt er observert, enten med det IO<6>cfu/ml inokulum eller med inokulum ved IO<7>cfu/ml.

I nærvær av glutaraldehyd ved 0,045%, er nedgangen mye større med hensyn til kontrollen; det er ca. 3 logger.

Disse resultatene bekrefter aktiviteten av det deaktiverte NCC 533 ved 0,5% og 1% som en hemmer av adhesjonen av S. aureus.

Eksempel 5: Kroppslotion

En kroppslotion ble laget som har følgende sammensetning: 8,0% av mineralolje, 5,0% av isopropylpalmitat, 2,0% av polyglyseryl-3-diisostearat, 4,0% av oktyldodecanol, 0,3% av carbomer, 0,2% av natriumcocoylglutamaat, 1,2% av 10% natriumhydroksid, et konserveringsmiddel, lukt, 0,5 til 3% av et lyofilisat som inneholder fra 10 x IO8 til 10 x IO<12>cfu/g av minst en bakteriell stamme valgt fra Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), Micrococcus varians (CNCM 1-1586 eller CNCM 1-1587) eller Bifidobacterium lactis (ATCC 27536, Hansen) og inaktivert ved varmebehandlig ved ca. 90°C i ca. 2 timer. Blandingen ble gjort opp til 100% med vann.

Kroppslotionen som så blir oppnådd, er ment som på grunn av dets antiadhesjonsegenskaper med hensyn til patogener, å stabilisere og/eller regulere hudpatogen flora.

Eksempel 6: Sjampo

En sjampo blir laget som har følgende sammensetning: 7,0% av natriumlaurylsulfat, 2,0% av cocamidopropylbetainet, 2,0% av natriumlaurylsulfosuksinat, natriumklorid, konserveringsmiddel, lukt og fra 0,5til 3% av et lyofilisat som inneholder fra IO<8>til IO12 cfu/g av minst en bakteriell stamme valgt fra Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), Micrococcus varians (CNCM 1-1586 eller CNCM 1-1587) eller Bifidobacterium lactis ATCC 27536, og inaktivert ved varmebehandling ved ca. 90°C i ca. 2 timer. Blandingen ble gjort opp til 100% med vann.

Sjampoen som så ble laget har egenskaper som regulerer skallepatogen flora. Den er spesielt indikert i behandlingen av flass.

Eksempel 7

For å få en farmasøytisk sammensetning med egenskaper som regulerer hudpatogen flora, blir fett og vannfaser laget som har følgende sammensetning:

Fett og vannfasene blir varmet til 75°C. Deretter blir emulgering utført ved å tilsette den vandige fasen til fettfasen med Rayneriblanding ved 1000 rpm. 30 minutter etter emulgering, blir blandingen homogenisert i 1 minutt med en polytron (hastighet 4-5).

Eksempel 8

På samme måte som i eksempel 7, blir en sammensetning laget som har følgende sammensetning:

Eksempel 9

På samme måte som i eksempel 7, blir en sammensetning laget som har følgende sammensetning:

Eksempel 10: Sjampo for kjæledyr

En sjampo for kjæledyr ble laget som har følgende sammensetning: 5% natriumlaurylsulfat, 2% av cocamidoprolylbetain, 2% av natriumlaurylsulfonosuksinat, 2% av natriumklorid, 1,5% av PEG-7-glyserylcocoat, 0,75% av propylenglykol, pantenol, glyserol, dinatriumfosfat, konserveringsmiddel, lukt og 1% av L. johnsonii

(CNCM 1-1225) som beskrevet i eksempel 5. Blandingen ble gjort opp til 100% med vann.

Sjampoen som således prepareres har egenskaper som regulerer den patogene flora i hudsystemet hos kjæledyr.

Claims (16)

1. Anvendelse av et bakterielt middel for å fremstille sammensetninger som er for kosmetisk, farmasøytisk eller veterinær anvendelse og som er ment for å administreres til mennesker eller dyr for terapeutiske eller profylaktiske hensikter for stabilisering og/eller regulering av den patogene flora i hudsystemet, der nevnte bakterielle middel er et ekstrakt av en bakterie, eller en bakterie, selektert for sine egenskaper av adhesjon til hudceller og sine antiadhesive egenskaper med hensyn til patogener i hudsystemet.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor det bakterielle middel er selektert fra arter av Lactobacillus, Micrococcus eller Bifidobacterium.

3. Anvendelse ifølge et av kravene 1 og 2, hvor det bakterielle middel er selektert fra Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM i-1587 eller Bifidobacterium lactis ATCC 27536 stammer.

4. Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 3, hvor bakterien er i en levedyktig, semiaktiv eller deaktivert form.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor bakterien er deaktivert ved varmebehandling ved 90°C i 2 timer.

6. Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 5, hvor det bakterielle middel i lyofilisert form innholder fra IO<8> til IO11 cfu/g.

7. Sammensetning som er for kosmetisk, farmsøytisk eller veterinær anvendelse og som er karakterisert ved at den inneholder minst ett bakterielt middel som er i stand til å stabilisere og/eller regulere den patogene flora i hudsystemet, der nevnte bakterielle middel er et ekstrakt a <y> en bakterie, eller en bakterie, selektert for dens egenskaper for adhesjon til hudceller og dets antiadhesive egenskaper til patogener i hudsystemet.

8. Sammensetning ifølge krav 7, karakterisert ved at det bakterielle middel er valgt fra artene Lactobacillus, Micrococcus eller Bifidobacterium.

9. Sammensetning ifølge et av kravene 7 og 8, karakterisert ved at det bakterielle middel er valgt fra Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Micrococcus varians CNCM; I-15 86, Micrococcus varians CNCM 1-1587 eller Biifdobacterium lactis ATCC 27536 stammer.

10. Sammensetning ifølge et av kravene 7 til 9, karakterisert vedat bakterien er i en levedyktig, semiaktiv eller deaktivert form.

11. Sammensetning ifølge krav 10, karakterisert ved at bakterien er deaktivert ved varmebehandling ved 90°C i 2 timer.

12. Sammensetning ifølge et av kravene 7 til 11, karakterisert ved at den inneholder opp til 10 vekt% av det bakterielle middel med hensyn til den totale vekt av sammensetningen.

13. ■' Sammensetning ifølge et av kravene 7 til 12, karakterisert ved at den inneholder ca. 0,05 til 5% ved vekt av det bakterielle middel med hensyn til den totale vekt av sammensetningen.

14. Sammensetning ifølge et av kravene 7 til 13, karakterisert ved at det er ment for behandlingen eller for profylaksen av hudsykdommer slik som: - infeksiøse komplikasjoner slik som superinfisert atopisk dermatitt, impertigobasert eksem, magesår, sår, forbrenninger, superinfisert inflammatorisk acne, - dermatitt slik som impetigo, overflatisk follikulitt, - seborrisk dermatitt, pityriasis versicolor, - dermatofytose, - candidiasis - de som er koplet til terapier med antibiotika eller til antimykotiske midler, - de som skyldes hormonell dysregulering eller [sic] flass,

15. Sammensetning ifølge et av kravene 7 til 14, karakterisert ved at det er ment å påføres sensitiv hud eller fet hud.

16. Sammensetning for veterinær anvendelse ifølge et av kravene 7 til 13, karakterisert ved at det er ment for behandlingen eller for forebyggingen av dysfunksjoner koplet til stafylokokk, streptokokk og mykotiske infeksjoner hos dyr.