ES2345761T3

ES2345761T3 - Agente anti-adhesion de la flora patogena de la piel.

Info

Publication number: ES2345761T3
Application number: ES00990751T
Authority: ES
Inventors: Markus Baur; Ralf Zink; Isabelle Auzanneau; Karine Buffard
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2010-10-01
Anticipated expiration: 2020-12-13
Also published as: BR0016709A; PT1244463E; US20160082052A1; US8685389B2; CN101385745B; CY1111029T1; MXPA02006222A; AU3011801A; EP1244463B1; US9226943B2; RU2002119396A; EP1110555A1; JP2003518070A; CN1434716A; PL355411A1; KR20020068382A; KR100797819B1; CN101385745A; US20140079677A1; NO20022989L

Abstract

Utilización de un agente bacteriano, elegido de entre las cepas de Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Micrococcus varians CNCM I-1586, Micrococcus varians CNCM I-1587 ó Bifidobacterium lactis ATCC 27536, para la preparación de una composición tópica, de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, destinada a ser administrada al hombre, o a animales, con la finalidad terapéutico o profiláctica de estabilización y/o de regulación de la flora patógena del sistema cutáneo, siendo, el citado agente bacteriano, un extracto de bacteria o una bacteria seleccionada por sus facultades de adhesión con respecto a las células de la piel, y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo.

Description

Agente anti-adhesión de la flora patógena de la piel.

La presente invención, tiene por objeto la utilización de una agente bacteriano, seleccionado por sus facultades anti-adhesión de patógenos cutáneos y elegido de entre las cepas de Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Micrococcus varians CNCMI-1586, Micrococcus varians CNCM I-1587, ó Bifidobacterium lactis ATCC 27536, para la preparación de composiciones tópicas de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, destinadas a estabilizar y/o regular el ecosistema cutáneo de los mamíferos y las composiciones que contienen un agente de este tipo.

Estado actual de la técnica

La proliferación de patógenos tales como los Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o Propionibac-terium acnes, o de cierta levaduras, pueden conllevar una desregulación del sistema cutáneo, o incluso trastornos más graves, al nivel de la piel o de las mucosas, tales como eccema, candidiasis, dermatitis, etc.

Se conocen diversos medios de tratamiento contra estos agentes patógenos. Los antibióticos o anti-bacterianos químicos son, de una forma clásica, los más utilizados. Éstos son, por ejemplo, composiciones a base de aldehídos y derivados.

Así, de este modo, la solicitud de patente publicada FR 2740039, describe la utilización de una substancia elegida de entre los aldehídos y los compuestos bi-funcionales, de una forma preferible, el glutaraldehído, para inhibir la fijación sobre los queratinocitos y corneocitos de cepas de patógenos tales como el Staphylococcus aureus.

Asimismo, el hexaclorofeno y sus derivados, son conocidos, como substancias antibacterianas y éstos se utilizan, de una forma particular, contra el Propionibacterium acnes.

Estos tratamientos, son generalmente caros y nocivos, tanto para la salud, como para el medio ambiente.

Se conocen, ahora, tratamientos alternativos, no tóxicos, los cuales consisten en utilizar las propiedades anti-fúngicas, bactericidas o bacteriostáticas de ciertas cepas de microorganismos.

Así, de este modo, la solicitud de patente internacional PCT WO 97/366603, evidencia las propiedades anti-fúngicas de una cepa de Lactobacillus casei.

Otros agentes bacterianos, tales como los Bacillus, pueden también utilizarse sobre la piel y las mucosas. Efectivamente, en la solicitud de patente internacional PCT WO 98/47374, se utilizan cepas de Bacillus coagulans, Bacillus subtiles, Bacillus lateroporus y Bacillus laevolacticus, en composiciones destinadas a prevenir las infecciones bacterianas, víricas o fúngicas de la piel o de las mucosas.

Las solicitudes de patente europea EP 0 577 903 y EP 0 577 904, describen la utilización de Lactobacillus acidophilus CNCM I-1225, como un agente antigastritis y/o antiúlcera, que presenta un poder de desplazamiento de bacterias patógenas sobre las células intestinales y/o gástricas.

La invención, se propone encontrar un nuevo agente bacteriano, capaz de controlar y regular el ecosistema cutáneo.

Resumen de la invención

A dicho efecto, la presente invención, se refiere a la utilización de un agente bacteriano, para la preparación de una composición tópica, de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, destinada a ser administrada al hombre, o animales, con la finalidad de prevenir o tratar los trastornos inducidos por los patógenos del sistema cutáneo, siendo, el citado agente bacteriano, un extracto de bacteria láctica o una bacteria láctica, seleccionada por sus facultades de adhesión con respecto a las células cutáneas y de regulación de la unión de patógenos cutáneos, especialmente, mediante la inhibición de su adhesión.

El agente bacteriano, se elige de entre las cepas de Lactobacillus, Micrococcus o Bifidobacterium, es decir, de entre las cepas de Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Micrococcus varians CNCM I-1586, Micrococcus varians CNCM I-1587, ó Bifidobacterium lactis ATCC 27536.

La cepa de bacteria, puede utilizarse en una forma viable, desactivada o semi-activa.

El agente bacteriano, puede utilizarse en forma de una materia en polvo liofilizada, por ejemplo, la cual podrá comprender aproximadamente de 10E+08 a 10E-11 ufc/g.

La presente invención, se refiere igualmente a una composición tópica, de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, que contiene por lo meno una agente bacteriano capaz de estabilizar y/o de regular la flora patógena del sistema cutáneo, siendo, el citado agente bacteriano, un extracto de bacteria o una bacteria seleccionada por sus facultades de adhesión con respecto a las células de la piel y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo.

Esta composición, puede ser, principalmente, en forma de crema, loción, pastilla dermatológica, champú o materia en polvo, por ejemplo.

Descripción detallada de la invención

Se reagrupa, bajo la denominación de "sistema cutáneo", el conjunto de células de la piel (es decir, los queratinocitos), pero también los corneocitos.

La presente invención, propone un agente bacteriano seleccionado por su facultad de adherencia a las células cutáneas, de estabilización y de regulación de la flora bacteriana patógena del sistema cutáneo, principalmente, por inhibición de la adhesión de patógenos tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o Propionibac-terium acnes, por ejemplo.

Para ello, se ha procedido a someter a tests de ensayo, numerosas cepas de bacterias, debido a sus propiedades de unión o adhesión sobre los queratinocitos humanos (véase el ejemplo 1).

De entre diversas cepas de bacterias de esta forma ensayadas, se han seleccionado cepas de Lactobacillus, de Micrococcus y de Bifidobacterium y, de una forma más particular, una cepa de Lactobacillus johnsonii (NCC 533), dos cepas de Micrococcus varians (NCC 1482, NCC 1520), y una cepa de Bifidobacterium lactis (ATCC 27536).

La cepa de Lactobacillus johnsonii (NCC 533) y las cepas de Micrococcus varians (NCC 1482, NCC 1520), han sido el objeto de un depósito, según el Tratado de Budapest, en la Collection national de cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris 15, Francia, respectivamente, el 30 de junio de 1992, bajo la referencia CNCM I-1225 para la Lactobacillus johnsonii, y el 7 de junio de 1995, bajo las referencias CNCM I-1586 y CNCM I-1587, para las Micrococcus varians NCC 1482 y NCC 1520.

La cepa de Bifidobacterium lactis (ATCC27536), puede obtenerse en Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alle, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca).

Los detalles concernientes a la morfología y las propiedades generales de las cepas, se proporcionan abajo, a continuación:

Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225

Morfología:

- Microorganismo Gram-positivos, no motil, que no forma esporas.

- Bastoncitos aislados, bastantes cortos y achaparrados.

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Metabolismo:

- Microorganismo microaerófilo, con metabolismo homofermentante, que da lugar a la producción de ácido láctico L(+) y D(-).

- Otras características: Catalasa (-), producción de CO_{2} (-), hidrólisis de la arginina (-).

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Fermentación de azúcares:

Amigdalina(+), arabinosa(-), celobiosa(+), esculina(+), fructuosa(+), galactosa(-), glucosa(+), lactosa(+),
maltosa(+/-), manitol(-), manosa(+), melibiosa(-), rafinosa(+), ribosa(-), salicina(+), sucrosa(+), trealosa(+).

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Micrococcus varians CNCM I-1586(NCC 1482) y CNCM I-1587 (NCC 1520)

Morfología:

- Microorganismo Gram positivo y que son inmóviles de forma permanente

- Forma esférica, se presenta en forma de tetradas, distribuidas irregularmente.

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Metabolismo

- Microorganismo aerobio, Catalasa(*)

- Otras características: color amarillo sobre medio BHI. La temperatura óptima de crecimiento de las citadas cepas, es 25-27ºC.

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Fermentación de los azúcares

Fructosa(+), glucosa (+).

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Las bacterias en concordancia con la presente invención, se utilizan para la preparación de composiciones destinadas al tratamiento profiláctico o terapéutico de los trastornos asociados a los patógenos del sistema cutáneo, tales como los Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o Propionibacterium acnes, o levaduras, por ejemplo.

Estos trastornos del sistema cutáneo, pueden ser, principalmente, la dermitis atópica (en las fases de remisión, como tratamiento de mantenimiento), el acné, la candidiasis, la dermitis seborreica, la pitiriasis versicolor, el impétigo o las sobreinfecciones eccematosas.

Los trastornos del sistema cutáneo, pueden también encontrarse asociados a terapéuticas con antibióticos, anti-micóticos, a la diabetes (candidiasis), a una patología de las mucosas (candidiasis vaginal), al eccema crónico (desequilibrio de la homeostasis), a las pieles sensibles (prematuros, niños), a las pieles grasas (asociadas a desregulaciones hormonales que pueden favorecer el crecimiento de bacterias) a estados peliculares.

Las bacterias en concordancia con la presente invención, pueden utilizarse en su forma viva, semi-activa o en forma desactivada. Se entiende por bacteria en una forma semi-activa, una bacteria en donde, la actividad fisiológica, se encuentra reducida. Esta actividad, puede medirse mediante una fase exponencial de crecimiento o un tiempo de generación superior, un metabolismo enlentecido o una respuesta fisiológica incompleta a las modificaciones del medio ambiente, por ejemplo. En ciertos casos extremos, el número de bacterias, puede encontrarse disminuido, debido al hecho de que, éstas, no pueden ya resistir más al cambio del medio ambiente.

Los sobrenadantes de cultivo de las bacterias, pueden igualmente utilizarse.

Según una primera forma de realización de la invención, el agente bacteriano, puede ser un extracto de bacteria o una bacteria, encontrándose, la citada bacteria, en su forma viable activa. El agente bacteriano, se presenta entonces, de una forma preferente, en forma de una materia en polvo liofilizada, obtenida, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en la patente europea EP 818 529. La materia en polvo, puede contener de 10E+08 a 19E+11 ufc/g.

Según otra forma de realización, el agente bacteriano, puede ser un extracto de bacteria, o una bacteria en forma semi-activa. La desactivación parcial de las cepas, puede realizarse de varias formas, principalmente, mediante:

- liofilización, consistente en ciclos de congelación en nitrógeno líquido/descongelación a 37ºC. Se puede entonces obtener una reducción de aproximadamente 1 log,

- acción de los UV (de 15 a 60 minutos, a 254 nm, distancia de 20 cm): reducción de 2 a 3 logs,

- acción del calor (70ºC, durante un tiempo de 3 horas: reducción de aproximadamente 3 a 4 logs,

por ejemplo.

El agente bacteriano, puede entonces utilizarse en forma de materia en polvo, que contenga por lo menos 10E+6 ufc/g y, de una forma preferible, en composiciones secas, tales como los champús secos, u otras composiciones en polvo, que pueden contener hasta un 10% del extracto bacteriano.

Finalmente, el extracto bacteriano, puede ser igualmente un extracto de bacteria o una bacteria en forma desactivada. La bacteria, de una forma preferible, se desactiva mediante un tratamiento térmico a una temperatura de aproximadamente 90ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas. El agente bacteriano, se presenta entonces en forma de una materia en polvo liofilizada, que contiene de 10E+08 a 10E+12 ufc/g. Éste puede utilizarse en un porcentaje de hasta un 5% y, de una forma preferible, en un porcentaje que vaya de un 0,05 a un 3%, en las composiciones líquidas, y en un porcentaje de hasta un 10%, en las composiciones en polvo.

La presente invención, se refiere, igualmente, a una composición tópica de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, que contiene un agente bacteriano que tiene las propiedades descritas anteriormente, arriba.

Para preparar una composición de este tipo, se incorpora una capa de bacteria en forma viable, semi-activa ó desactivada, a un soporte farmacéuticamente o cosméticamente aceptable, en una cantidad que varía en función de la aplicación pretendida. El agente bacteriano, puede encontrarse presente en un porcentaje de hasta aproximadamente un 5%, con relación al peso total de la composición, y en un porcentaje de hasta 10%, para composiciones en forma de polvo y, de una forma preferente, en un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 0,5 a un 2%.

Las composiciones en concordancia con la invención, se administran por vía tópica.

Por vía tópica, las composiciones farmacéuticas a base de compuestos en concordancia con la invención, se destinan, de una forma preferente, al tratamiento de la piel y de las mucosas, y pueden presentarse en forma de ungüentos, de cremas, de leches, de pomadas, de materias en polvo, de tampones embebidos, de soluciones, de geles, de proyecciones por pulverización (sprays), de lociones o de suspensiones. Éstas pueden igualmente presentarse en forma de microesferas o nanoesferas o vesículas lípidas o poliméricas, o parches poliméricos e hidrogeles que permitan una liberación controlada. Estas composiciones por vía tópica, pueden presentarse bien ya sea en forma anhidra, o bien ya sea en forma acuosa, según la indicación clínica.

La presente invención, pretende, de una forma más particular, una composición cosmética que contenga, en un soporte cosméticamente aceptable, por lo menos por lo menos un agente bacteriano tal y como éste se ha definido anteriormente, arriba. La composición cosmética, puede contener el agente bacteriano, a razón de por lo menos un porcentaje del 0,001%, en peso, con relación al peso total de la composición y, de una forma preferible, a razón de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 0,05 a un 3%.

Esta composición cosmética, se destina principalmente a la higiene corporal y capilar. Ésta puede presentarse, principalmente, en forma de una crema, de una leche, de una loción, de un gel, de microesferas o nanoesferas, o vesículas lípidas o poliméricas, de un jabón o de un champú.

En las composiciones en concordancia con la invención, el agente bacteriano viable o inactivado, puede combinarse con retinoides o corticosteroides, o asociarse con anti-radicales libres, con \alpha-hidroxi- ó \alpha-ceto ácidos o sus derivados, o incluso, con bloqueantes de canales iónicos.

Las composiciones farmacéuticas y cosméticas en concordancia con la invención, pueden contener, además, aditivos inertes o incluso farmacodinámicamente o cosméticamente activos, o combinaciones de estos aditivos y, principalmente: agentes humectantes; agentes despigmentantes, tales como la hidroquinona, el ácido azeláico, el ácido cafeico o el ácido kójico; emolientes; agentes hidratantes tales como el glicerol, el PEG 400, la tiamorfolina y sus derivados, agentes antiseborreicos o antiacnéicos, tales como la S-carboximetilcisteína, la S-bencil-cisteamina, sus sales y sus derivados, o el peróxido de benzoílo; antibióticos tales como la eribromicina y sus ésteres, la neomicina, la clindamicina y sus ésteres, las tetraciclinas, agentes antifúngicos tales como el quetoconazol o las polimetilen-4,5-isotiazolinonas-3; agentes que favorecen la respuesta de los cabellos, como el Minoxidil (2,4-diamino-6-piperidino-pirimidina-3-óxido) y sus derivados, la Dioxazida (7-cloro-3-metil-1,2,4-benzotiazidina 1,1-dióxido) y la Fenitoína (5,4-difenil-imidazolidina-2,4-diona); agentes antiinflamatorios no esteroides; carotenoides y, especialmente, el \beta-caroteno; agentes antipsoriásicos, tales como la antralina y sus derivados y, finalmente, los ácidos eicosa-5,8,11,14-tetraenoico, el eicosa-5,8,11-trienoico, sus ésteres y las amidas.

Las composiciones en concordancia con la presente invención, pueden igualmente contener agentes conservantes, tales como los ésteres del ácido parahidroxibenzóico, agentes estabilizantes de la humedad, agentes reguladores del pH, agentes reguladores de la presión osmótica, agentes emulsionantes, filtros UV-A y UV-B, antioxidantes, tales como el \alpha-tocoferol, el butilhidroxianisol o el butilhidroxi-tolueno.

La presente invención, pretende, finalmente, una composición de uso veterinario o cosmético para animales, que contiene por lo menos un agente bacteriano tal y como se define anteriormente, arriba. Una composición de este tipo, puede presentarse en forma de champús secos, o líquidos, materias en polvo, espumas o lociones, por ejemplo. Ésta puede contener un porcentaje de hasta un 10% del agente bacteriano.

La composición en concordancia con la presente invención, se destina, de una forma particular, al tratamiento terapéutico o profiláctico de las pieles y/o de las mucosas sanas, sensibles y/o enfermas, que puedan presentar trastornos del sistema cutáneo, tales como, de una forma especial:

- las complicaciones infecciosas tales como la dermatitis atópica sobreinfectada, eccema impetiginizado, úlceras, llagas, quemaduras, acné inflamatorio sobreinfectado

- las polidermitis, tales como el impétigo, las foliculitis superficiales,

- las dermatitis seborreicas, la pitiriasis versicolor

- la dermotafitosis (Tinea capitis, Tinea corporis, Pié de atleta, Eccema marginado de Hebra, Herpes circinado)

- las candidiasis (vaginales, interdigitales, vinculadas a profesiones de riesgo o a la diabetes)

- los trastornos vinculados a terapéuticas con antibióticos o antimicóticos,

- los trastornos ocasionados por desregulaciones hormonales (pieles grasas) o estados peliculares.

- las pieles sensibles (prematuros, niños).

Las composiciones de uso veterinario, se destinan, de una forma particular, a tratar o prevenir las disfunciones debidas a infecciones por estafilococos (Staphylococcus aureus, S. intermedians), estreptococos (S. pirogenes) y micóticas (candidiasis por C. albicans y pitirosporosis por P. canis).

Otras características de la presente invención, aparecerán durante el transcurso de las descripciones que se facilitan a continuación de las formas de realización, las cuales se proporcionan con fines de ilustración de la presente invención, y que no se destinan a ser limitativas.

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Ejemplos Ejemplo 1 Selección del agente bacteriano

En el ámbito de la presente invención, se estudia la adhesión de 12 cepas diferentes de bacterias a las células de la piel, especialmente, a queratinocitos humanos HaCat en cultivo. Estas cepas, pertenecen al género de los Lactobacillus, Bifidobacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Propionibacterium.

Los cultivos de bacterias (1 ml), se incuban en 10 ml de medio (véase la tabla 1), durante el transcurso de una noche. Para los ensayos de adhesión, las bacterias, se precultivan hasta una concentración de 5,0E+08 a 1,0E ufc/ml. Las ufc, se estandarizan para medir la densidad óptica de cada cepa (DO a 1,0E-0,8 ufc/ml: véase la Tabla 1).

A continuación, las cepas de bacterias, se someten a tests de ensayo, en cuanto a lo referente a sus propiedades de adhesión.

TABLA 1 Cepas de bacterias y condiciones de cultivo

1

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Líneas de queratinocitos humanos

Las propiedades de adhesión de las bacterias, se estudiaron sobre 3 líneas de queratinocitos:

- Líneas de células inmortalizadas SV40 T-Ag: células DK2-NR y FK2-NR, tales como las que se describen en la patente europea EP 780 469, y

- Líneas de células inmortalizadas HPV (virus del papiloma humano) E6/E7 y SV40 T-Ag: líneas de células DK7-NR. tales como las que se describen en la solicitud de patente internacional WO 99/02 347.

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Medio de cultivo para las líneas de células:

DK7-NR, FK2-NR: NR-2 (Biofluids, Rockville, MD 20850)(EP 780 469).

DK2-NR. MR-M (Biofluids, Rockville, MD 20850).

Las líneas de queratinocitos, se ponen en cultivo, a razón de 5 x 10^{5} queratinocitos/cm^{2}, se siembra en racimos de pozos, recubiertos (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). La solución de recubrimiento, se encuentra constituida por medio basal, suplementado con 10 \mug/ml de fibronectina humana (Becton Dickinson), 31 \mug/ml de colágeno bovino 1 (Vitrogen, Collagen Corporation, Fremont, CA), y 0,1 mg/ml de BSA (Biofluids, Rockville, MD 20850). Después de un transcurso de tiempo de 6 a 8 días, los cultivos de células, forman una monocapa (confluente). A continuación, la concentración del medio en Ca^{2+}, se lleva a 1,5 mM, para inducir la diferenciación celular. Las células, se ponen en cultivo, durante un transcurso de tiempo de 4 días, en un medio a alta concentración en calcio, sin antibiótico. Para los tests de ensayo de adherencia, los cultivos de células, se lavan 3 veces con tampón (HBSS, Ca^{2*}; 1,0 mM).

Radiomarcaje

Las cepas de bacterias, se marcan, durante una noche, mediante la adición de e100 \muCi/10 ml de 2-^{3}H-adenina (Amersham, TRK,311), en el medio de cultivo. Se procede a incubar fracciones alícuotas de las bacterias, en un medio sin ^{3}H-adenina. El sobrenadante no marcado (frío), se aparta, con objeto de ajustar la ufc/ml, para los ensayos de adhesión.

Ensayos de adhesión

Las suspensiones de bacterias, se centrifugan durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una velocidad angular de 400 revoluciones por minuto. Antes del ajuste de la densidad óptica (DO), las tortas, se lavan 2 veces en HBSS. La DO, se mida para cada cepas, de tal forma que se ajusten las concentraciones finales en bacterias a 1,0E+06, 1,0E+07, 1,0E+08 y 1,0E+09 ufc/ml. El medio para los ensayos de adhesión, es una mezcla 1:1 de medio de cultivo de queratinocitos y del sobrenadante no marcado del medio de bacteriano.

Para analizar las propiedades de adhesión de las bacterias sobre un substrato sin queratinocitos, las suspensiones de bacterias, se incuban sobre placas de plástico y placas de plástico recubiertas sin células.

Análisis

Después del lavado de los cultivos, 3 veces, con HBSS (Ca2+, 1,0 mM), las bacterias asociadas a los queratinocitos, se lisan en una solución de NaOH 1N, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. La solución, se transfiere a recipientes de centelleo, con 1 ml de hidróxido de bencetonio (Sigma, St. Louis, USA). Después de un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 60ºC, la actividad ^{3}H de las bacterias marcadas, se mide, mediante recuento de centelleo líquido (dpm).

El índice de adhesión (AI), se calcula en actividad ^{3}H (dpm/pozo), en % del total de actividad ^{3}H (dpm/ml) de la suspensión de bacterias.

Resultados Índice de adhesión (AI)

El índice de adhesión de las 13 cepas, se calcula procediendo a medir la actividad ^{3}H-adenina de los microorganismos radiomarcados. Los resultados obtenidos, se recopilan en la Tabla 2.

TABLA 2 Índice de adhesión de las cepas de bacterias, sobre queratinocitos FK2-NR

3

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Los resultados, muestran el hecho de que, los índices de adhesión más fuertes, se obtienen para las siguientes cepas: una cepa de Bifidobacterium lactis ATCC 27536, una cepa de Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM I-1225) y las cepas de Micrococcus varians NCC 1482 (CNCM-I-1586), NCC 1520 (CNCM I-1587), y NCC 1583.

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Ejemplo 2 Tests de ensayo in vitro de la inhibición de la adhesión de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes por Micrococcus varians NCC 1482 ó Lactobacillus johnsonii NCC 533 Microorganismos y métodos de cultivo

Los patógenos Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, se cultivan en caldo de cultivo, mediante trasplante a partir de un cultivo sobre pendiente (Tabla 3). Se ha establecido una correspondencia DO/densidad bacteriana, para cada uno de los gérmenes sometidos a test de ensayo, sobre la base de diluciones en serie y de recuentos sobre medio gelosificado.

TABLA 3

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Medio de cultivo:

TSC (AES, Comburg, ref. AEB 141502)

BHI (UNIPATH SA, Dardilly, ref. CM 225).

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Queratinocitos humanos transformados

Se utilizan queratinocitos humanos inmortalizados de la línea HaCaT (Bokamp P. y colegas, J. Cell Biol., 106, 761-771, 1988). Las células HaCaT, se cultivan en medio DMEM, suplementado con un 10% de suero bovino fetal, a una temperatura de 37ºC, bajo un porcentaje del 5% de CO_{2}.

Se procede a sembrar racimos de 6 pozos (Becton Dickinson), a razón de 10^{4} células/cm^{2}. Después de un transcurso de tiempo de 4 a 5 días, las células, alcanzan la confluencia. Los ensayos de adhesión, se realizan de 4 a 5 días después de la confluencia. Las monocapas, se lavan 3 veces con PBS, antes de los ensayos.

Radiomarcaje

Las bacterias, se marcan con 2-^{3}H-adenina (Amersham, TRK 311), a razón de 100 \muCi/10 ml de caldo de cultivo. Las suspensiones, se lavan 3 veces y, a continuación, se resuspenden en PBS. La densidad celular, se ajusta en el mismo tampón.

Ensayo de adhesión sobre queratinocitos en cultivo

Se procede a incubar 1 ml de suspensión bacteriana radiomarcada, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 35ºC. La monocapa, se lava 3 veces mediante un tampón PBS, y se lisa, mediante la adición de NaOH 1N, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, a la temperatura ambiente. El lisado, se transfiere a un frasco de centelleo, y se incuba durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 60 minutos, con hidróxido de hiamina (Carlo Erba, ref. 464951). La actividad ^{3}H, se recuenta, mediante un contador de centelleo líquido. Cada ensayo, se realiza en triple. Se procede, asimismo, a realizar un control en soporte plástico.

La adhesión, se define con relación a la radiactividad adherida y la radioactividad introducida, multiplicado por 100.

Ensayo de inhibición de adhesión

Después del lavado y resuspensión en PBS, el patógeno radiomarcado y la cepa de bacteria fría, se incuban simultáneamente con la monocapa. Los ensayos, se efectúan en triple, para las densidades en agente bacteriano que cubren 3 log.

Resultados

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 y Micrococcus varians NCC 1482, se sometieron a tests de ensayo, en cuanto a lo referente a su adhesión a los queratinocitos HaCaTen en cultivo. Los resultados obtenidos, se proporcionan en la Tabla 4.

TABLA 4

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Los resultados obtenidos, muestran que, los Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 y Micrococcus varians NCC 1482, se adhieren a los queratinocitos en cultivo. Cuando la densidad del agente bacteriano aumenta, el patógeno, se desplaza cada vez más.

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Ejemplo 3 Tests de ensayo in vitro de la inhibición de S. aureus por Lactobacillus johnsonii NCC 533 activo o desactivado

El modelo de adhesión in vitro, se basa en la incubación de una suspensión radiomarcada y calibrada de un microorganismo patógeno cutáneo (Staphyolococcus aureus) con una monocapa de queratinocitos humanos inmortalizados (línea HACaT)(Boukamp P. y colegas., J. Cell Biol., 106, 761-771, 1988).

La actividad inhibidora del agente bacteriano (Lactobacillus johnsonii NCC 533, en forma viable o desactivada), con respecto a esta adhesión, se evalúa en el ámbito de una co-incubación sobre la monocapa del patógeno y del compuesto a someter a tests de ensayo, mediante dosificación de la radio-actividad retenida sobre la monocapa.

Queratinocitos

Para este cometido, las células HaCaT, se cultivan en medio DMEM, suplementando mediante un 10% de suero bovino fetal, a una temperatura de 27ºC, bajo un 5% de CO_{2}. éstas se siembran en racimos de 6 pozos, a razón de 1,0E+04 células/cm^{2}. El ensayo de adhesión, se realiza 5 días después de la confluencia. Las monocapas, se lavan 3 veces con PBS, antes de la incubación con los microorganismos.

Microorganismos

El estaphylococcus aureus (ATCC 6538), se cultiva en medio TSC, en aerobiosis, a una temperatura de 35ºC.

El Lactobacillus johnsonii NCC 533, se cultiva en medio MRS, en anaerobiosis, a una temperatura de 37ºC. Para el ensayo de inhibición de adhesión, se procede a preparar un suspensión concentrada de la bacteria, en tampón PBS, a partir de cultivo de un transcurso de tiempo de 48 horas. La suspensión, se ajusta a un valor de 2 x 10^{8} ufc/ml (DO a 525 nm = 1,5). Las diluciones en series, se realizan en tampón PBS, con objeto de obtener suspensiones a 2,0E+07 y 2,0E+-06 ufc/ml. Las diferentes suspensiones, se recuentan sobre gelosa MRS, en anaerobiosis, a una temperatura de 37ºC.

La forma desactivada de NCC 533, se obtiene mediante liofilización de una suspensión densa en lactobocillus, sometida a varios de congelación en nitrógeno líquido/descongelación a la temperatura ambiente. La preparación sometida a test de ensayo, corresponde a una biomasa de 4,00E + 10 ufc/g.

Radiomarcaje

El radiomarcaje de Staphylococcus aureus, se obtiene mediante la incorporación de 100 \muCi/10 ml de ^{3}H adenina, durante un transcurso de tiempo de 24 horas de cultivo en caldo de cultivo TCS. La suspensión, se centrifuga entonces, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una velocidad angular de 3000 revoluciones por minuto, y se lava 3 veces con PBS. La densidad celular, se ajusta con tampón de PBS, a aproximadamente 2,0E+08 ufc/l (DO a 525 nm = 0,5). La radioactividad específica, se determina mediante recuento en centelleo, sobre 100 \mul de la suspensión.

Ensayo de inhibición de adhesión

Se procede a añadir, de una forma simultánea, 1 ml de suspensión radiomarcada de Staphylococcus aureus y 1 ml de suspensión de NCC 533 por pozo de cultivo de células HaCaT. Después de 1 hora de incubación a una temperatura de 37ºC, las monocapas, se lavan 3 veces, con tampón PBS, y se lisan mediante la adición de 1 ml de NaOH 1N, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. El lisado, se transfiere a un recipiente de centelleo, y se incuba, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 60ºC, con 1 ml de hidróxido de bencetonio. Después de enfriamiento, se procede a añadir 10 ml de líquido de centelleo Hyonic fluor y, la radiactividad, se recuenta mediante contador de centelleo líquido. El control, se obtiene mediante la adición de suspensión radiomarcada de Staphylococcus y 1 ml de tampón PBS, y corresponde a un 100% de adhesión.

Los resultados obtenidos, se proporcionan en la Tabla 5.

TABLA 5 Inhibición de la adhesión de Staphylococcus aureus a las células HaCaT mediante NCC 533, en forma viable y en forma desactivada

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Ejemplo 4 Tests de ensayo in vivo de inhibición de la adhesión de patógenos cutáneos por Lactobacillus johnsonii desactivado Material y métodos Animales

Se proporcionaron 15 ratones hembra SKH, de 7 a 8 semanas de edad, y con un peso de aproximadamente 30 g, por parte de la firma C. River. Se utilizaron 5 ratones para cada grupo, que se ensayaron a una aplicación tópica diferente.

Microorganismo

Se utiliza una cepa de Staphylococcus aureus (denominada: cepa 1), la cual se aisló a partir de una lesión de piel humana (úlcera de la pierna). Esta cepa, es sensible a la meticilina.

Preparación del inóculo

Se prepara una suspensión de la bacteria, para su incubación en los ratones. Para ello, se procede a efectuar un precultivo en pendiente de la cepa 1, sobre un medio sólido (AESS, AEB 122 859) a una temperatura de 35ºC, durante un transcurso de tiempo de 18 a 24 horas. Después de la incubación, la bacteria, se resuspende en 10 ml de solución salina, estéril y, a continuación, se recupera después de centrifugación a una velocidad angular de 3000 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos. A continuación, se elimina el sobrenadante y, la torta, se recoge mediante 10 ml de solución salina. Este procedimiento, se repite 2 veces. Se prepara una suspensión de inóculo, resuspendiendo las bacterias lavadas en 4 ml de solución salina estéril. La DA a 525 nm, se ajusta a un valor de aproximadamente 0,14. Ésta contiene aproximadamente 10^{8} ufc/ml.

Inoculación de los ratones

Se procede a depilar la piel de los ratones, al nivel de los costados, con etanol 95 (Merck). Se procedió a aplicar ampliamente 50 \mul de una suspensión que contenía una mezcla 50/50 de inóculo de S. aureus 1,0E+07 ufc/m del producto a someter a test de ensayo, con la ayuda de una micropipeta, sobre la zona depilada (6,25 cm^{2}). Los sitios inoculados, se protegen, mediante oclusión, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, mediante un apósito de plástico, estéril (Dermafilm 33 x 15, ref. 38.3015, Vygon laboratory).

Recuento de las bacterias viables de las lesiones

Después de un transcurso de tiempo de 4 horas, después de la aplicación de la suspensión, los ratones, se sacrifican mediante anestesia con foreno (Abbot France). Lo sitios inoculados, se extraen mediante escisión en bloque (diámetro: 12 mm). Las biopsias de las pieles extraídas, se trituran y se homogeneizan, con 2 ml de solución salina estéril, con un Polytron (PT 2100, Bioblock Scientific)(a una velocidad angular de 5 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos).

Se procede a añadir una muestra de 1 ml del tejido homogeneizado, a 9 ml de una solución salina estéril, y 0,1 ml de esta mezcla, se cultiva sobre un medio de estafilococo nº 110, utilizando el procedimiento dilutron, 10 veces. Después de un transcurso de tiempo de 48 horas de incubación, a una temperatura de 35ºC, las colonias desarrolladas, se cuentan y se determinan las UFC (unidades de formación de colonias).

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Resultados

Los resultados obtenidos, se recopilan en la Tabla 6.

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TABLA 6 Ensayo del NCC 533 a un 1%

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La presencia de NCC 533 a un 1%, permite reducir el número de bacterias encontradas, en un valor de aproximadamente 1 log., después de un transcurso de tiempo de contacto de 4 horas. La diferencia, aparenta ser significativa, con relación al testigo (p=0,098).

En presencia de glutaraldehído, las disminución del número de bacterias, es todavía más importante, con relación al testigo, mientras que, no queda excluido el hecho de que, esta actividad, sea debida a su actividad antiséptica, y que actúe desde la puesta en presencia del S. aureus, en la mezcla; así, de este modo, la actividad observada, después de un transcurso de tiempo de 4 oras, no se debería a un efecto antiadhesivo, sino a una actividad antibacteriana del producto.

Los resultados obtenidos, se recopilan en la Tabla 7.

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TABLA 7

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La presencia de NCC 533 a un 0,5% y a un 1%, reduce el número e S. aureus encontrados de aproximadamente 1 log, para los inóculos a 10^{6} ufc/ml y 10^{7} ufc/ml. No se observa ningún efecto dosis, bien ya sea con el inóculo 1,0E+06 ufc/ml, o bien ya sea con el inóculo de 1,0E+07 ufc/ml.

En presencia de glutaraldehído, a un 0,045%, la disminución, es mucho más importante, con relación al testigo, siendo ésta de aproximadamente 3 log.

Estos resultados, confirman la actividad del NCC 533 desactivado a un 0,5% y a un 1%, como inhibidor de la adhesión del S. aureus.

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Ejemplo 5 Loción para el cuerpo

Se procede a preparar una loción para el cuerpo, que tiene la siguiente composición: 8,0% de aceite mineral; 5,0% de palmitato de isopropilo, 2,0% de 3-diisoestearato de poliglicilo, 4,0% de octildodecanol, 0,3% de carbómero, 0,2% de cocoilglutamato sódico, 1,2% de hidróxido de sodio con un 10% de conservante, perfume, de un 0,5 a un 3% de un liofilizado que contiene de 10E+0,8 a 10E-12 ufc/g, de por lo menos una cepa de bacteria elegida de entre los Lactobacillus johnsonii (CNCM I-1225), Micrococcus varians (CNCM I-1586 ó CNCM I-1587), o Bifidobacterium lactis (ATCC 27536, Hansen) e inactivada mediante tratamiento térmico a una temperatura de aproximadamente 90ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas. Se completa, hasta un 100%, con agua.

La loción para el cuerpo de esta forma obtenida, gracias a sus propiedades de anti-adhesión, con respecto a los patógenos, se destina a estabilizar y/o regular la flora patógena de la piel.

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Ejemplo 6 Champú

Se procede a preparar un champú, que tiene la siguiente composición: 7,05 de laurilsulfato de sodio, 2,0% laurilsulfonosuccinato de sodio, cloruro sódico, conservante, perfume, y de un 0,5 a un 3% de un liofilizado que contiene una cepa de bacteria elegida de entre los Lactobacillus johnsonii (CNCM I-1225), Micrococcus varians (CNCM I-1586 ó CNCM I-1587), o Bifidobacterium lactis ATCC 27536, e inactivada mediante tratamiento térmico a una temperatura de aproximadamente 90ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas. Se completa, hasta un 100%, con agua.

El champú de esta forma preparado, tiene propiedades reguladoras de la flora patógena del cuero cabelludo. Éste está principalmente indicado en el tratamiento de los estados peliculares.

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Ejemplo 7

Para la obtención de una composición farmacéutica que tenga una propiedades reguladoras de la flora patógena cutánea, se procede a preparar las fases grasas y acuosas que tienen la siguiente composición:

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Se procede a calentar las fases grasas y acuosa, a una temperatura de 75ºC. A continuación, se procede a emulsionar mediante la adición de la fase acuosa en la fase grasa, bajo una agitación Rymeri de una velocidad angular de 1000 revoluciones por minuto. Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos a partir de la emulsión, se procede a homogeneizar, durante un transcurso de tiempo de 1 minuto, con el polytron (a una velocidad de 4-5).

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Ejemplo 8

Se procede a preparar una composición de la misma forma que la del ejemplo 7, pero que tiene la siguiente composición:

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Ejemplo 9

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Ejemplo 10 Champú para animales

Se procede a preparar un champú para animales, que tiene la siguiente composición: 5% de laurilsulfato de sodio, 2% de cocamidopropilbetaína, 2% de laurilsufonosuccinato de sodio, 2% de cloruro de sodio, 1,5% de glicerilcocoato de PEG-7, 0,75% de propilenglicol, pantenol, glicerina, fosfato disódico, conservante, perfume y un 1% de L. johnsonii (CNCM I-1225) tal como se ha descrito en el ejemplo 5. Se completa, a un 100%, con agua.

El champú de esta forma preparado, tiene propiedades reguladoras de la flora patógena del sistema cutáneo de los animales.

Claims

1. Utilización de un agente bacteriano, elegido de entre las cepas de Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Micrococcus varians CNCM I-1586, Micrococcus varians CNCM I-1587 ó Bifidobacterium lactis ATCC 27536, para la preparación de una composición tópica, de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, destinada a ser administrada al hombre, o a animales, con la finalidad terapéutico o profiláctica de estabilización y/o de regulación de la flora patógena del sistema cutáneo, siendo, el citado agente bacteriano, un extracto de bacteria o una bacteria seleccionada por sus facultades de adhesión con respecto a las células de la piel, y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la cual, la bacteria, se encuentra en forma viable, semi-activa o desactivada.

3. Utilización, según la reivindicación 2, en la cual, la bacteria, se encuentra desactivada, mediante tratamiento térmico, a una temperatura de 90ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas.

4. Utilización, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por el hecho de que, el agente bacteriano, en forma liofilizada, contiene de 1,0E+0,8 a 1,0E+11 ufc/g.

5. Composición tópica de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, que contiene, por lo menos, un agente bacteriano capaz de estabilizar y/o de regular la flora patógena del sistema cutáneo, elegido de entre las cepas de Micrococcus varians CNCM I-1586, Micrococcus varians CNCM I-1587 ó Bifidobacterium lactis ATCC 27536, siendo, el citado agente bacteriano, un extracto de bacteria o una bacteria seleccionada por sus facultades de adhesión con respecto a las células de la piel, y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo.

6. Composición tópica de uso cosmético, farmacéutico o veterinario, que contiene, como agente bacteriano, una cepa de Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, siendo, el citado agente bacteriano, un extracto de bacteria o una bacteria seleccionada por sus facultades de adhesión con respecto a las células de la piel, y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo, para la utilización en la estabilización y/o la regulación de la flora patógena del sistema cutáneo.

7. Composición, según la reivindicación 5-6, en la cual, la bacteria, se encuentra en forma viable, semi-activa o desactivada.

8. Composición, según la reivindicación 7, en la cual, la bacteria, se desactiva mediante tratamiento térmico, a una temperatura de 90ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas.

9. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, que contiene un porcentaje de hasta un 10%, en peso, del agente bacteriano, con respecto al peso total de la composición.

10. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que contiene un porcentaje de aproximadamente un 0,05% a un 5%, en peso, del agente bacteriano, con respecto al peso total de la composición.

11. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, destinada al tratamiento o a la profilaxis de trastornos cutáneos, tales como:

- las polidermitis, tales como el impétigo, las foliculitis superficiales,

- las dermatitis seborreicas, la pitiriasis versicolor

- la dermotafitosis

- las candidiasis

- aquéllos vinculados a terapéuticas con antibióticos o antimicóticos,

- aquéllos ocasionados por desregulaciones hormonales o estados peliculares.

12. Compasiones, según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, destinadas a ser aplicadas sobre las pieles sensibles o las pieles grasas.

13. Composición de uso veterinario, según una de las reivindicaciones 5 a 12, destinada al tratamiento o a la prevención de las disfunciones asociadas a las infecciones por estafilococos, por estreptococos y micóticas, en los animales.