PT1244463E

PT1244463E - Agente anti-adesivo da flora patogénica da pele

Info

Publication number: PT1244463E
Application number: PT00990751T
Authority: PT
Inventors: Ralf Zink; Markus Baur; Isabelle Auzanneau; Karine Buffard
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2010-09-07
Also published as: JP4828759B2; US20160082052A1; CN1434716B; EP1244463A1; JP2003518070A; US20140079677A1; DE60044566D1; US9226943B2; CN1434716A; DK1244463T3; BR0016709A; RU2002119396A; NO20022989L; KR20020068382A; KR100797819B1; CN101385745B; ATE471152T1; US8685389B2; CN101385745A; CA2395419A1

Description

DESCRIÇÃO "AGENTE ΑΝΤΙ—ADESIVO DA FLORA PATOGÉNICA DA PELE" A presente invenção tem, como objectivo, a utilização de um agente bacteriano seleccionado pelas suas propriedades de anti-aderência de agentes patogénicos cutâneos e seleccionado das estirpes de Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 ou Bifidobacterium lactis ATCC 27536 para a preparação de composições tópicas com utilização cosmética, farmacêutica ou veterinária, destinadas a estabilizar e/ou regular o ecossistema cutâneo dos mamíferos e as composições contendo esse agente.

Estado da técnica A proliferação de agentes patogénicos, tais como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ou Propionibacterium acnes, ou de determinadas leveduras, pode provocar uma desregulação do sistema cutâneo ou até patologias mais graves ao nível da pele ou das mucosas, tais como eczema, candidíases, dermatites, etc. São conhecidos numerosos meios de tratamento contra estes agentes patogénicos. Os antibióticos ou antibacterianos químicos são os mais utilizados convencionalmente. São, por exemplo, composições à base de aldeídos e derivados. 1

Assim, o pedido de patente publicado FR 2740039 descreve a utilização de uma substância seleccionada de aldeídos e compostos bifuncionais, de um modo preferido, o glutaraldeído, para inibir a fixação sobre os queratinocitos e corneocitos de estirpes de agentes patogénicos, tal como Staphylococcus aureus.

Também o hexaclorofeno e os seus derivados são conhecidos como substâncias antibacterianas e são especialmente utilizados contra Propionibacterium acnes.

Estes tratamentos são, em geral, dispendiosos e nocivos para a saúde e para o ambiente.

Conhece-se agora tratamentos alternativos, não tóxicos, que consistem em utilizar as propriedades antifúngicas, bactericidas ou bacteriostáticas de determinas estirpes de microrganismos.

Assim, o pedido PCT WO 97/366603 demonstra as propriedades antifúngicas de uma estirpe de Lactobacillus casei.

Outros agentes bacterianos, tais como os Bacillus também podem ser utilizados sobre a pele ou as mucosas. Com efeito, no pedido WO 98/47374, estirpes de Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus e Bacillus laevolacticus são utilizadas em composições destinadas a prevenir as infecções bacterianas, virais ou fúngicas da pele ou das mucosas.

Os documentos EP 0577903 e EP 0577904 descrevem a utilização de Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225 como um agente antigastrite e/ou anti-úlceras que apresenta um poder de 2 deslocamento de bactérias patogénicas em células intestinais e/ou gástricas. A invenção propõe-se encontrar um novo agente bacteriano, capaz de controlar e regular o ecossistema.

Sumário da invenção

Por este motivo, a presente invenção refere-se à utilização de um agente bacteriano para a preparação de uma composição tópica para utilização cosmética, farmacêutica ou veterinária, destinada a ser administrada a humanos ou a animais, com o fim de prevenir ou tratar patologias induzidas pelos agentes patogénicos do sistema cutâneo, sendo o referido agente bacteriano um extracto de bactéria láctica ou uma bactéria láctica seleccionada pelas suas faculdades de aderência às células cutâneas e de regulação da fixação de agentes patogénicos cutâneos, nomeadamente, por inibição da sua aderência. 0 agente bacteriano é seleccionado de estirpes de Lactobacillus, Micrococcus ou Bifidobacterium, a saber, das estirpes Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 ou Bifidobacterium lactis ATCC 27536. ser utilizada numa forma A estirpe de bactéria pode viável, desactivada ou semi-activa. 3 0 agente bacteriano pode ser utilizado na forma de um pó liofilizado, por exemplo, que pode compreender cerca de 10E+08 a 10E+11 cfu/g. A presente invenção refere-se, igualmente, a uma composição tópica para utilização cosmética, farmacêutica ou veterinária, contendo, pelo menos, um agente bacteriano capaz de estabilizar e/ou de regular a flora patogénica do sistema cutâneo, sendo o referido agente bacteriano um extracto de bactéria ou uma bactéria seleccionada pelas suas faculdades de aderência a células da pele e às suas propriedades anti-adesivas em relação aos agentes patogénicos do sistema cutâneo.

Esta composição pode estar, nomeadamente, na forma de creme, loção, barra dermatológica, champô ou pó, por exemplo.

Descrição detalhada da invenção

Na designação "sistema cutâneo" estão agrupadas as células de pele (i. e. queratinocitos) mas também os corneocitos. A presente invenção propõe um agente bacteriano seleccionado pela sua faculdade de aderência às células cutâneas, de estabilização e de regulação da flora bacteriana patogénica do sistema cutâneo, nomeadamente, por inibição da aderência de agentes patogénicos, tais como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ou Propionibacterium acnes, por exemplo. 4

Para isso, numerosas estirpes de bactérias foram testadas quanto às suas propriedades de fixação em queratinocitos humanos (cf. exemplo 1).

Entre as diversas estirpes de bactérias assim testadas, foram seleccionadas estirpes de Lactobacillus, de Micrococcus e de Bifidobacterium e, mais particularmente, uma estirpe de Lactobacillus johnsonii (NCC 533), duas estirpes de Micrococcus varians (NCC 1482, NCC 1520) e uma estirpe de Bifidobacterium lactis (ATCC 27536). A estirpe de Lactobacillus johnsonii (NCC 533) e as estirpes de Micrococcus varians NCC 1482 e NCC 1520 foram depositadas, de acordo com o Tratado de Budapeste, na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Cedex 15, França, respect ivamente em 30 de Junho de 1992 com a referência CNCM 1-1225 para Lactobacillus johnsonii e 7 de Junho de 1995 com as referências CNCM 1-1586 e CNCM 1-1587 para os Micrococcus varians NCC 1482 e NCC 1520. A estirpe de Bifidobacterium lactis (ATCC27536) pode ser obtida de Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alie, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca).

Os pormenores relativos à morfologia e às propriedades gerais das estirpes estão apresentados a seguir: 5

Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225

Morfologia - Microrganismo Gram positivo, não móvel, que não forma esporos. - Bastonetes isolados bastante curtos e atarracados.

Metabolismo

Microrganismo microaerófilo, com metabolismo homofermentativo, dando lugar à produção de ácido láctico L (+) e D (-) .

Outras caracteristicas: Catalase (-) , produção de CO2 (-), hidrólise de arginina (-).

Fermentação de açúcares:

Amigdalina ( + ) , arabinose (-) , celobiose ( + ), esculina ( + ), frutose ( + ) , galactose (-) , glucose ( + ) , lactose ( + ), maltose ( + /-), manitol (-) , manose ( + ) , melibiose (-) , rafinose ( + ) , ribose (-) , salicina ( + ) , sacarose ( + ) , trealose ( + ) · 6

Micrococcus varians CNCM 1-1586 (NCC 1482) e CNCM 1-1587 (NCC 1520)

Morfologia - Microrganismo Gram positivo, está permanentemente imóvel

Forma esférica, apresenta-se em forma de tétrades dispostas irregularmente.

Metabolismo - Microrganismo aeróbio, catalase (+)

Outras características: cor amarela em meio BHI. A temperatura óptima de crescimento das referidas estirpes é de 25-37 °C.

Fermentação de açúcares frutose (+), glucose (+).

As bactérias de acordo com a invenção são utilizadas para a preparação de composições destinadas ao tratamento profiláctico ou terapêutico de patologias associadas aos agentes patogénicos do sistema cutâneo, tais como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ou Propionibacterium acnes, ou a leveduras, por exemplo. 7

Estes distúrbios da pele podem ser, nomeadamente, a dermatite atópica (nas fases de remissão como tratamento de manutenção), acne, candidiases, dermatite seborreica, pitiríase versicolor, impetigo ou infecções secundárias eczematosas.

Os distúrbios do sistema cutâneo também podem estar associados a terapêuticas com antibióticos, antimicóticos, diabetes (candidíase), a uma patologia das mucosas (candidiase vaginal), a eczema crónico (desequilíbrio da homeostasia), a pele sensível (bebés prematuros, crianças), a pele oleosa (associada a desregulação hormonal que pode favorecer o crescimento de bactérias) ou a estados peliculares.

As bactérias de acordo com a invenção podem ser utilizadas na sua forma viva, semi-activa ou numa forma desactivada. Entende-se por bactéria em forma semi-activa, uma bactéria cuja actividade fisiológica está reduzida. Esta actividade pode ser medida por uma fase exponencial de crescimento ou um tempo de geração superior, um metabolismo lento ou uma resposta fisiológica incompleta a modificações do ambiente, por exemplo. Em certos casos extremos, o número de bactérias pode estar diminuído uma vez que não podem resistir mais à alteração do ambiente.

Os sobrenadantes de cultura das bactérias também podem ser utilizados.

De acordo com uma primeira forma de realização da invenção, o agente bacteriano pode ser um extracto de bactéria ou uma bactéria, estando a referida bactéria na sua forma viável activa. 0 agente bacteriano apresenta-se, então, de um modo preferido, na forma de um pó liofilizado, obtido, por exemplo, pelo processo descrito no documento EP 818529. O pó pode conter de 10E+08 a 10E+11 cfu/g.

De acordo com outra forma de realização, o agente bacteriano pode ser um extracto de bactéria ou uma bactéria numa forma semi-activa. A desactivação parcial das estirpes pode ser realizada de vários modos, nomeadamente por: liofilização, consistindo em ciclos de congelação em azoto líquido/descongelação a 37 °C. Pode, então, obter-se uma redução de cerca de 1 log, - acção dos UV (15 a 60 minutos a 254 nm, distância de 20 cm): redução de 2 a 3 logs, - acção do calor (70 °C durante 3 horas): redução de cerca de 3 a 4 logs, por exemplo. O agente bacteriano pode então ser utilizado na forma de pó contendo pelo menos 10E + 6 cfu/g e, de um modo preferido, em composições secas, tais como champôs secos ou outras composições em pó que podem conter até 10% do extracto bacteriano.

Finalmente, o agente bacteriano também pode ser um extracto de bactéria ou uma bactéria em forma desactivada. A bactéria é, de um modo preferido, inactivada por tratamento térmico a cerca de 90 °C, durante cerca de 2 horas. O agente bacteriano apresenta-se na forma de um produto liofilizado contendo de 10E+08 a 10E+12 cfu/g. Pode ser utilizado até 5% e, de um modo preferido, de 0,05 a 3% em composições liquidas e até 10% em composições em pó. 9 A presente invenção refere-se, igualmente, a uma composição tópica para utilização cosmética, farmacêutica ou veterinária contendo um agente bacteriano que tem as propriedades aqui descritas acima.

Para preparar essa composição, pelo menos uma estirpe de bactéria em forma viável, semi-activa ou desactivada, é incorporada num suporte farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitável numa quantidade variável, em função da aplicação desejada. 0 agente bacteriano pode estar presente até cerca de 5% em relação ao peso total da composição e até 10% para composições em forma de pó e, de um modo preferido entre 0,5 e 2%.

As composições de acordo com a invenção são administradas por via tópica.

Por via tópica, as composições farmacêuticas à base de compostos de acordo com a invenção são, de um modo preferido, destinadas ao tratamento da pele e das mucosas e podem ser apresentadas na forma de unguentos, cremes, leites, pomadas, pós, tampões impregnados, soluções, géis, produtos para pulverização, loções ou suspensões. Também podem ser apresentadas na forma de microsferas ou nanosferas ou vesículas lipídicas ou poliméricas ou de pensos poliméricos ou de hidrogéis que permitem uma libertação controlada. Estas composições por via tópica podem ser apresentadas quer em forma anidra, quer em forma aquosa, dependendo da indicação clínica. A presente invenção refere-se, particularmente, a uma composição cosmética contendo, num suporte cosmeticamente aceitável, pelo menos um agente bacteriano, tal como aqui 10 definido acima. A composição cosmética pode conter o agente bacteriano numa proporção de, pelo menos, 0,001% em peso em relação ao peso total da composição e, de um modo preferido, de 0,05 à 3%.

Esta composição cosmética é, em particular, destinada à higiene corporal e capilar. Pode ser apresentada, em particular, na forma de um creme, de um leite, de uma loção, de microsferas ou nanosferas ou vesículas lipídicas ou poliméricas, de um sabonete ou de um champô.

Nas composições de acordo com a invenção, o agente bacteriano viável ou inactivado pode ser combinado com retinóides ou com corticosteróides, ou associado a anti-radicais livres, com α-hidroxi ou CC-ceto ácidos ou os seus derivados ou, ainda, com bloqueadores de canais iónicos.

As composições farmacêuticas e cosméticas de acordo com a invenção podem, além disso, conter aditivos inertes ou até farmacodinamicamente ou cosmeticamente activos ou associações destes aditivos e em particular: agentes molhantes; agentes despigmentantes, tais como hidroquinona, ácido azeláico, ácido cafeico ou ácido kójico; emolientes; agentes hidratantes como glicerol, PEG-400, tiamorfolinona e os seus derivados ou ureia; agentes antisseborreicos ou anti-acne, tais como S-carboximetilcisteína, S-benzil-cisteamina, os seus sais e os seus derivados, ou peróxido de benzoílo; antibióticos como eritromicina e os seus ésteres, neomicina, clindamicina e os seus ésteres, tetraciclinas; agentes antifúngicos, tais como cetoconazole ou 4,5-polimetileno-3-isotiazolinonas; agentes que favorecem o recrescimento dos cabelos, como o Minoxidil (3-óxido de 2,4-diamino-6-piperidino-pirimidina) e os seus derivados, o 11 7-cloro-3-metil-l,2,4-

Diazoxide (1,1-dióxido de benzotiadiazina) e a Fenitoína (5,4-difenil-imidazolidino-2,4-diona); agentes anti-inflamatórios não esteróides; carotenóides e, em particular, o β-caroteno; agentes antipsoriáticos, tal como antralina e os seus derivados e finalmente os ácidos eicosa-5,8,11,14-tetrainóico e eicosa-5,8,11-trinóico, os seus ésteres e amidas. A composição de acordo com a invenção também pode conter agentes conservantes, tais como os ésteres do ácido para-hidroxibenzóico, agentes estabilizantes, agentes reguladores da humidade, agentes reguladores do pH, agentes modificadores da pressão osmótica, agentes emulsionantes, filtros UV-A e UV-B, anti-oxidantes, tais como a-tocoferol, butil hidroxianisole ou butil hidroxitolueno. A presente invenção refere-se, por fim, a uma composição para utilização veterinária ou cosmética para animais, contendo, pelo menos, um agente bacteriano tal como aqui definido acima. Essa composição pode ser apresentada na forma de champôs secos ou líquidos, pós, espumas ou loções, por exemplo. Pode conter até 10% do agente bacteriano. A composição de acordo com a invenção é destinada, em particular, ao tratamento terapêutico ou profiláctico de peles e/ou mucosas saudáveis, sensíveis e/ou doentes que podem apresentar distúrbios do sistema cutâneo, tais como, em particular: 12 complicações infecciosas, tais como dermatite atópica sobre-infectada, eczema impetiginoso, úlceras, feridas, queimaduras, acne inflamatório sobre-infectado - polidermatites, tais como impetigo, foliculites superficiais, - dermatites seborreicas, pitiríase versicolor - dermatofitoses (Tinea capitis, Tinea corporis, pé de atleta, Eczéma marginé de Hébra, Herpès circiné) - candidíases (vaginais, interdigitais, associadas a profissões de risco ou à diabetes) - distúrbios associados a terapêuticas com antibióticos ou a agentes antimicóticos distúrbios causados por desregulações hormonais (peles oleosas) ou a estados peliculares - peles sensíveis (bebés prematuros, crianças).

As composições para utilização veterinária são particularmente destinadas a tratar ou prevenir as disfunções devidas a infecções estafilocócicas (devidas a Staphylococcus aureus, S. intermedians), estreptocócicas (devidas a S. pyogenes) e micóticas (candidoses devidas a C. albicans e pitirosporoses devidas a P. canis).

Outras características da presente invenção surgirão no decurso das descrições seguintes de exemplos de formas de 13 realizaçao que sao apresentados para fins de ilustração da presente invenção e que não se destinam a ser limitativos.

Exemplos

Exemplo 1: Selecção do agente bacteriano

No contexto da presente invenção, é estudada a aderência de 12 estirpes diferentes de bactérias às células da pele, em particular, a queratinocitos humanos HaCat em cultura. Estas estirpes pertencem aos géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus e Propionibacterium.

As culturas de bactérias (1 mL) são incubadas em 10 mL de meio (cf. Tabela 1) de um dia para o outro. Para os ensaios de aderência, as bactérias são pré-cultivadas até uma concentração de 5,0E+08 a l,0E+09 cfu/mL. As cfu são normalizadas por determinação da densidade óptica de cada estirpe (OD a l,0E+08 cfu/mL: ver Tabela 1).

Em seguida as estirpes de bactérias são testadas quanto às suas propriedades de aderência.

Tabela 1: Estirpes de bactérias e condições de cultura

Estirpes de bactérias Código NCC Maio Incubação T°C/hora CD a 1E+02 cfu Lactobacillus johnsonii Lai 533 MRS Anaerob. 37 °C/48 h 1,00 Lactobacillus acidophilus LalO 90 MRS Anaerob. 37 °C/48 h 1,00 Bifidobacterium lactis ATCC27536 536 MRS Anaerob. 37 °C/18 h 0,65 14 (continuacao)

Estirpes de bactérias Código NCC Maio Incubação T°C/hora OD a 1E+02 cfu Bifidobacterium longum B28 585 MRS Aerob. 30 °C/18 h 1,32 Micrococcus varians NCC 1482 1482 BHi Aerob. 30 °C/18 h 4,85 Micrococcus varians NCC 1520 1520 BHi Aerob. 30 °C/18 h 3,47 Micrococcus varians MCV 17 1583 BHi Aerob. 30 °C/18 h 4,18 Staphylococcus carnosus STC 21 931 BHi Aerob. 30 °C/18 h 40,20 Staphylococcus piscifermentans STF 4 751 BHi Aerob. 30 °C/18 h 3,26 Streptococcus thermophilus Sfi 16 2019 HJL Aerob. 40 °C/18 h 0,37 Propionibacterium shermanii PP12 1197 MRS Aerob. 30 °C/24 h 0,18 Propionibacterium thoenii PP22 1116 MRS Aerob. 30 °C/24 h 0,25 NCC 533, NCC 90, NCC536 e NCC585 sao cultivadas em condições anaeróbias (Gaspack H2+C02).

Linhas de queratinocitos humanos:

As propriedades de aderência das bactérias foram estudadas em três linhas de queratinocitos: - Linhas de células imortalizadas SV40 T-Ag: células DK2-NR e FK2-NR, tal como descritas no documento EP 780469, e - Linhas de células imortalizadas HPV (vírus do papiloma humano) E6/E7 e SV40 T—Ag: linhas de células DK7—NR, tal como descritas no pedido WO 99/02347. 15

Meio de cultura para as linhas de células: DK7-NR, FK2-NR: NR-2 (Biofluids, Rockville, MD 20850) (EP 780469) . DK2-NR: NR-M (Biofluids, Rockville, MD 20850).

As linhas de queratinocitos são cultivadas na proporção de 5 2 5x10 queratinocitos/cm , semeadas em grupos 6 poços revestidos (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) . A solução de revestimento é constituída por meio básico suplementado com 10 pg/mL de fibronectina humana (Becton Dickinson), 31 pg/mL de colagénio bovino I (Vitrogen, Collagen Corporation, Fremont, CA) e 0,1 mg/mL de BSA (Biofluids, Rockville, MD 20850) . Após 6 a 8 dias, as culturas de células formam uma monocamada (confluente). Em seguida, a concentração do meio em 2 + Ca é levada a 1,5 mM para induzir a diferenciação celular. As células são cultivadas durante 4 dias num meio de alta concentração de cálcio, sem antibióticos. Para os ensaios de aderência, as culturas de células são lavadas 3 vezes com tampão (HBSS, Ca2+: 1,0 mM) .

Radiomarcação

As estirpes de bactérias são marcadas de um dia para o 3 outro por adiçao de 100 pCi/10 mL de 2- H-adenina (Amersham, TRK.311) ao meio de cultura. Fracções alíquotas das bactérias 3 sao incubadas num meio sem H-adenina. O sobrenadante nao marcado (frio) é posto de lado para ajustar as cfu/mL para os ensaios de aderência. 16

Ensaios de aderência

As suspensões de bactérias são centrifugadas, durante 10 minutos, a 4000 rpm. Antes do ajustamento da densidade óptica (DO), os sedimentos são lavados 2 vezes com HBSS. A DO é medida para cada estirpe de modo a ajustar as concentrações finais de bactérias para l,0E+06, l,0E+07, l,0E+08 e l,0E+09 cfu/mL. O meio para os ensaios de aderência é uma mistura 1:1 de meio de cultura dos queratinocitos e do sobrenadante não marcado do meio bacteriano.

Para analisar as propriedades de aderência das bactérias a um substrato sem queratinocitos, as suspensões de bactérias são incubadas em placas de plástico e em placas de plástico revestidas sem células.

Análise

Após lavagem das culturas 3 vezes com HBSS (Ca2 + , 1,0 mM) as bactérias associadas aos queratinocitos são lisadas numa solução de NaOH 1 N, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. A solução é transferida para frascos de cintilação com 1 mL de hidróxido de benzetónio (Sigma, St. Louis, EUA) . Após lha 3 60 °C, a actividade de H das bactérias marcadas é medida por contagem de cintilação liquida (dpm). 17 0 índice de aderência (AI) é calculado como a actividade 3 3 de H (dpm/poço) em % do total da actividade de H (dpm/mL) da suspensão de bactérias.

Resultados índice de aderência (AI) 0 índice de aderência das 13 estirpes de bactérias 3 diferentes e calculado medindo a actividade de H-adenina dos microrganismos radiomarcados. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: índice de aderência de estirpes de bactérias a queratinocitos FK2-NR. Código NCC CFU/mL dpm (xlO3) =DP indice de aderência (% de dpm total) 533 1,0E+09 209,6 24, 2 1,2 1,0E+08 175,5 42,5 10,4 1,0E+07 39,5 1,9 23,3 1,0E+06 4, 7 0,3 27,7 90 1,0E+09 167, 7 19,4 2,8 1,0E+08 47, 7 2,9 7,9 1,0E+07 8,3 0,5 13, 8 1,0E+06 0,9 0,1 15, 5 536 1,0E+09 413,9 91, 7 4,8 1,0E+08 221,0 31,3 25, 5 1,0E+07 22,3 3,8 25, 8 1,0E+06 2,4 0,3 28,2 18 (continuacao) Código NCC CFU/mL dpm (xlO"3) =DP índice de aderência (% de dpm total) 585 1,0E+09 107, 7 21,0 1,2 1,0E+08 19,6 1,5 2,2 1,0E+07 9, 7 1,9 10,8 1,0E+06 1,3 0,1 14,3 1483 1,0E+09 6147,2 1292,6 72, 4 1,0E+08 257, 7 52,6 30,3 1,0E+07 10, 4 0,8 12,3 1,0E+06 1, 7 0,2 19, 7 1520 1,0E+09 121,2 22,3 1,5 1,0E+08 40,1 5, 7 5, 0 1,0E+07 16,5 5,5 20, 7 1,0E+06 2,3 0,2 29,0 1583 1,0E+09 41,3 9, 7 0, 7 1,0E+08 12,9 1,3 2,2 1,0E+07 7,5 0,5 12, 7 1,0E+06 1,1 0,1 18, 7 751 1,0E+09 195,5 96,5 2,6 1,0E+08 24, 7 4, 9 3,2 1,0E+07 4,8 0,9 6, 4 1,0E+06 0,6 0,09 8,9 931 1,0E+09 16,2 2,9 0,5 1,0E+08 4,6 0,6 1,3 1,0E+07 1,6 0,1 4,6 1,0E+06 0,2 0,01 6, 7 2019 1,0E+08 67,5 1,4 1,4 1,0E+07 10,0 0,4 2,1 1,0E+06 1,1 0,1 2,4 1197 1,0E+09 20,2 3,1 0,2 1,0E+08 3,2 0,2 0,3 19 (continuação) Código NCC CFU/mL dpm (xlO"3) =DP índice de aderência (% de dpm total) 1,0E+07 0,5 0,2 0,4 1,0E+06 0,1 0,02 0,6 1116 1,0E+09 34, 1 2, 0 0,2 1,0E+08 6,3 0,2 0,4 1,0E+07 0,7 0,1 0,5 1,0E+06 0,1 0, 01 0,7

Os resultados mostram que os índices de aderência mais fortes são obtidos para as seguintes estirpes: uma estirpe de Bifidobacterium lactis ATCC 27536, uma estirpe de Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM 1-1225) e as estirpes de Micrococcus varians NCC 1482 (CNCM 1-1586), NCC 1520 (CNCM 1-1587) e NCC 1583.

Exemplo 2: Ensaios in vitro de inibição da aderência de Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes por Micrococcus varians NCC 1482 ou Lactobacillus johnsonii NCC 533.

Microrganismos e métodos de cultura

Os agentes patogénicos Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes são cultivados em caldo de cultura por repicagem a partir de uma cultura na fase de crescimento exponencial (Tabela 3). Foi estabelecida uma correspondência DO/densidade bacteriana para cada um dos microrganismos testados, com base em diluições em série e contagem em meio de agar. 20

Tabela 3

Estirpe bacteriana Ref. Meio Condições de cultura Staphylococcus aureus ATCC 6538 TCS Aerobiose, 35 °C/24 h Streptococcus pyogenes CIP 5641 T BHI Aerobiose, 35 °C/24 h

Meios de cultura: TCS (AES, Combourg, ref. AEB 141502) BHI (UNIPATH SA, Dardilly, ref. CM 225)

Queratinocitos humanos transformados

Utiliza-se queratinocitos humanos imortalizados da linha HaCaT (Boukamp P. et al., J. Cell Biol., 106, 761-771, 1988). As células HaCaT são cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, a 37 °C, sob 5% de CO2 ·

Grupos de 6 poços (Becton Dickinson) são cultivados na 4 2 proporção de 10 células/cm . Após 4 a 5 dias as células atingem a confluência. Os ensaios de aderência são realizados 4 a 5 dias após a confluência. As monocamadas são lavadas 3 vezes com PBS antes dos ensaios.

Radiomarcação 3

As bactérias são marcadas com 2- H-adenina (Amersham, TRK 311), na proporção de 100 pCi/10 mL de caldo de cultura. As

suspensões são lavadas 3 vezes e, depois, ressuspensas em PBS. A densidade celular é ajustada neste mesmo tampão. 21

Ensaio de aderência a queratinocitos em cultura: 1 mL de suspensão bacteriana radiomarcada é incubada durante 1 h, a 35 °C. A monocamada é lavada 3 vezes com tampão PBS e lisada por adição de NaOH 1 N durante 30 minutos à temperatura ambiente. O lisado é transferido para um frasco de cintilações e incubado, 1 h, a 60 °C, com 1 mL de hidróxido de 3 hiamina (Cario Erba, ref. 464951). A actividade de H é contada no contador de cintilações liquidas. Cada ensaio é realizado em triplicado. É também feito um controlo com o suporte de plástico. A aderência é definida pela razão entre a radioactividade aderente e a radioactividade introduzida, multiplicada por 100.

Ensaio de inibição da aderência

Após lavagem e ressuspensão em PBS, o agente patogénico radiomarcado e a estirpe da bactéria fria são incubados simultaneamente com a monocamada. Os ensaios são efectuados em triplicado para densidades de agente bacteriano cobrindo 3 log. 22

Resultados

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 e Micrococcus varians NCC 1482 foram testados quanto à sua aderência a queratinocitos HaCaT em cultura. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Microrganismo Aderência < %) 1,0E+06 cfu/mL 1,0E+07 cfu/mL 1,0E+08 cfu/mL Staphylococcus aureus - 5, 0 2,5 Streptococcus pyogenes - 35 42,5 NCC 533 4,5 1, 7 1,2 NCC 1482 6,5 3, 0 0,6 Inibição (%) 9, 0E+06 9,0E+07 9,0E+08 cfu/mL cfu/mL cfu/mL S. aureus 1E+8 cfu/mL + NCC 1482 5 11 66 S. aureus 1E+8 cfu/mL + NCC 533 20 24 34 S. pyogenes 1E+8 cfu/mL + NCC 1482 26 28 40 S. pyogenes 1E+8 cfu/mL + NCC 533 12 19 52

Os resultados demonstram que Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 e Micrococcus varians NCC 1482 aderem aos queratinocitos em cultura. Quando a densidade do agente bacteriano aumenta, o agente patogénico é cada vez mais deslocado. 23

Exemplo 3: Ensaios in vitro de inibição da aderência de S. aureus por Lactobacillus johnsonii NCC 533 activo ou desactivado. 0 modelo de aderência in vitro baseia-se na incubação de uma suspensão radiomarcada e calibrada de um microrganismo patogénico cutâneo (Staphylococcus aureus) com uma monocamada de queratinocitos humanos imortalisados (linha HaCaT)(Boukamp P. et al.r J. Cell Biol., 106, 761-771, 1988). A actividade inibidora do agente bacteriano (Lactobacillus johnsonii NCC 533 em forma viável ou desactivada) relativamente a esta aderência é avaliada no quadro de uma co-incubação, sobre a monocamada, do agente patogénico e do composto a ser testado por doseamento da radioactividade retida na monocamada.

Queratinocitos

Para isso, as células HaCaT são cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de sero fetal de vitelo, a 37 °C, sob 5% de CO2. As células são cultivadas em grupos de 6 poços numa 2 proporção de l,0E+04 células/cm . 0 ensaio de aderência é realizado 5 dias após a confluência. As monocamadas são lavadas 3 vezes com PBS antes da incubação com os microrganismos.

Microrganismos

Staphylococcus aureus (ATCC 6538) é cultivado em meio TCS em aerobiose a 35 °C.

Lactobacillus johnsonii NCC 533 é cultivado em meio MRS em anaerobiose a 37 °C. Para o ensaio de inibição da aderência, é preparada uma suspensão concentrada da bactéria em tampão PBS a partir de uma cultura de 48 horas. A suspensão é ajustada para g 2x10 cfu/mL (DO a 525 nm = 1,5) . São preparadas diluições em série em tampão PBS para se obter suspensões a 2,0E+07 e 2,0E+06 cfu/mL. As várias suspensões são contadas em MRS agar incubadas em anaerobiose a 37 °C. A forma desactivada de NCC 533 é obtida por liofilização de uma suspensão densa de Lactobacilli submetida a vários ciclos de congelação em azoto liquido/descongelação à temperatura ambiente. A preparação testada corresponde a uma biomassa de 4,0E+10 cfu/g.

Radiomarcação A radiomarcação de Staphylococcus aureus é obtida por 3 incorporação de 100 pCi/10 mL de H adenina durante 24 h de cultura em meio TCS. A suspensão é depois centrifugada, durante 10 minutos, a 3000 rpm/min e lavada 3 vezes em PBS. A densidade celular é ajustada com tampão PBS para cerca de 2,0E+08 cfu/mL (DO a 525 nm = 0,5) . A radioactividade especifica é determinada por contagem de cintilações em 100 pL da suspensão. 25

Ensaio de inibição da aderência:

Adiciona-se, simultaneamente, 1 mL de suspensão radiomarcada de Staphylococcus aureus e 1 mL de suspensão de NCC 533 a poços de cultura de células HaCaT. Após 1 h de incubação a 37 °C, as monocamadas são lavadas 3 vezes com tampão PBS e lisadas por adição de 1 mL de NaOH 1 N, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. O lisado é transferido para um balão de cintilações e incubado, durante 1 h, a 60 °C, com 1 mL de hidróxido de benzetónio. Após arrefecimento, adiciona-se 10 mL de líquido de cintilações Hyonic fluor e a radioactividade é contada no contador de cintilações líquidas. O controlo é obtido por adição de 1 mL de suspensão radiomarcada de Staphylococcus aureus e 1 mL de tampão PBS e corresponde a 100% de aderência.

Os resultados estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 5: Inibição da aderência de Stapllylococcus aureus às células HaCaT por NCC 533 na sua forma viável e na sua forma desactivada.

Aderência (%) Desvio padrão Controlo 100 9 NCC 533 3,0E+06 cfu/mL 74 19 NCC 533 3,0E + 07 cfu/mL 69 8 NCC 533 3,0E + 08 cfu/mL 34 1 NCC 533 desactivado 3,0E+06 cfu/mL 27 2 NCC 533 desactivado 3,0E+07 cfu/mL 12 1 NCC 533 desactivado 3,0E+08 cfu/mL 6 0 26

Exemplo 4: Ensaios in vivo de inibição da aderência de agentes patogénicos cutâneos por Lactobacillus johnsonii desactivado.

Material e métodos

Animais: 15 murganhos fêmeas SKH com idade de 7 a 8 semanas e pesando cerca de 30 g foram fornecidos por C. River. Utilizou-se 5 murganhos por cada grupo de teste de uma aplicação tópica diferente.

Microrganismo

Utiliza-se uma estirpe de Staphylococcus aureus (designada estirpe 1) que foi isolada a partir de uma lesão de pele humana (úlcera da perna). Esta estirpe é sensível à Meticilina.

Preparação do inoculo

Prepara-se uma suspensão da bactéria para a sua inoculação aos murganhos. Para isso, é feita uma pré-cultura na fase de crescimento exponencial num meio sólido (AES, AEB 122 859), a 35 °C, durante 18 a 24 h. Após a incubação, a bactéria é ressuspensa em 10 mL de soro fisiológico estéril e, depois, recuperada após centrifugação a 3000 durante 10 min. 0 sobrenadante é, em seguida, eliminado e o sedimento é retomado em 10 mL de soro fisiológico. Este processo é repetido duas 27 vezes. É preparada uma suspensão de inoculo ressuspendendo as bactérias lavadas em 4 mL de soro fisiológico estéril. A DO a g 525 nm é ajustada para cerca de 0,14. Contém cerca de 10 cfu/mL.

Inoculação dos murganhos A pele dos murganhos é desengordurada ao nível dos flancos com etanol 95 (Merck) . 50 pL de uma suspensão contendo uma mistura 50/50 do inoculo de S. aureus l,0E+07 cfu/mL e do produto a testar foram lentamente aplicados com a ajuda de uma 2 micropipeta na zona desengordurada (6,25 cm ) . Os sítios inoculados são protegidos por oclusão durante 1 h, sob um penso de plástico estéril (Dermafilm 33x15, ref. 38.3015, Vygon Laboratory).

Contagem das bactérias viáveis das lesões 4 horas após a aplicação da suspensão, os murganhos são mortos sob anestesia com foreno (Abbott France). Os sítios inoculados são excisados em bloco (diâmetro de 12 mm). As biópsias de pele retiradas são trituradas e homogeneizadas com 2 mL de soro fisiológico estéril com um Polytron (PT 2100, Bioblock Scientific) (5 rpm/min, 5 min) .

Uma amostra de 1 mL do tecido homogeneizado é adicionada a 9 mL de soro fisiológico estéril e 0,1 mL desta mistura é cultivado num meio estafilocócico n° 110 utilizando o método dilutron 10 vezes. Após 48 horas de incubação a 35 °C, as 28 colónias desenvolvidas sao contadas e as CFU (unidades formadoras de colónias) são determinadas.

Resultados

Os resultados estão apresentados na Tabela 6.

Tabela 6: ensaio de NCC 533 a 1%

Log cfu/cm S. aureus + PBS 3,4 S. aureus + NCC 533 a 1% em PBS 2,6* S. aureus + Glutaraldeido a 0,045% 0, 8* *significativo em relação ao controlo (SA/PBS), teste T de Student (n=5) A presença de NCC 533 a 1% permite reduzir o número de bactérias encontradas em, aproximadamente, 1 log após 4 horas de contacto. A diferença parece ser significativa em relação ao controlo (p=0,098).

Em presença de glutaraldeido, a diminuição do número de bactérias é ainda mais significativo em relação ao controlo, contudo não está fora de questão que esta actividade seja devida a sua actividade antisséptica e actue logo que S. aureus é adicionado à mistura; assim a actividade observada após 4 h não seria devida a um efeito anti-adesivo mas a uma actividade antibacteriana do produto. 29

Os resultados estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7

Tamanho do Tratamento % de redução Significância inoculo cfu/mL vs. controlo vs. controlo NCC 533 a 0,5% 20, 1% P=0,019(*) 1,0E+06 cfu/mL NCC 533 a 1% 22,6% P=0,016(*) Glutaraldeído a 0,045% 87, 9% P=0,0001(***) NCC 533 a 0,5% 27, 4% P=0,0015(*) 1,0E+07 cfu/mL NCC 533 a 1% 19,9% P=0,0004(***) Glutaraldeído a 0,045% 92,0% P=0,0004(***) * p<0,05, *** p<0,001 significativo em relação ao controlo (SA/PBS), A presença de NCC 533 a 0,5% e 1% reduz o número de S. aureus encontrados cerca de 1 log para os inóculos a 6 7 10 cfu/mL e 10 cfu/mL. Nao se observa efeito da dose, quer com o inoculo a l,0E+06 cfu/mL quer com o inoculo a l,0E+07 cfu/mL.

Em presença de glutaraldeído a 0,045%, a diminuição é muito maior em relação ao controlo, sendo de cerca de 3 log.

Estes resultados confirmam a actividade do NCC 533 desactivado a 0,5% e a 1% como inibidor da aderência de S. aureus. 30

Exemplo 5: loção para o corpo

Prepara-se uma loção para o corpo tendo a seguinte composição: 8,0% de óleo mineral, 5,0% de palmitato de isopropilo, 2,0% de 3-diisoestearato de poliglicerilo, 4,0% de octildodecanol, 0,3% de carbómero, 0,2% de cocoílglutamato de sódio, 1,2% de hidróxido de sódio a 10%, um conservante, perfume, 0,5 a 3% de um liofilizado contendo 10E+8 a 10E+12 cfu/g de, pelo menos, uma estirpe de bactéria seleccionada de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225),

Micrococcus varians (CNCM 1-1586 ou CNCM 1-1587) ou

Bifidobacterium lactis (ATCC 27536, Hansen) e inactivada por tratamento térmico a cerca de 90 °C durante cerca de 2 horas. Completa-se a 100% acom água. A loção para o corpo assim obtida, graças às suas propriedades de anti-aderência relativamente a agentes patogénicos, está destinada a estabilizar e/ou regular a flora patogénica da pele.

Exemplo 6: Champô

Prepara-se um champô tendo a seguinte composição: 7,0% de lauril sulfato de sódio, 2,0% de cocamidopropilbetaína, 2,0% de laurilsulfonossuccinato de sódio, cloreto de sódio, conservante, perfume e de 0,5 a 3% de um liofilizado contendo de l,0E+08 a 1,0E+12 cfu/g de, pelo menos, uma estirpe de bactéria seleccionada de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), Micrococcus varians (CNCM 1-1586 ou CNCM 1-1587) ou Bifidobacterium lactis ATCC 27536, e inactivada por tratamento 31 térmico a cerca de 90 °C, durante cerca de 2 horas. Completa-se a 100% com água. 0 champô assim preparado tem propriedades reguladoras da flora patogénica do coro cabeludo. Está indicado em particular para o tratamento de estados peliculares.

Exemplo 7

Para obter uma composição farmacêutica tendo propriedades reguladoras da flora patogénica cutânea, prepara-se as fases gorda e aquosa tendo a composição seguinte: L. johnsonii (CNCM 1-1225) tal como descrito no exemplo 5 1% Fase gorda: Álcool araquidil beenílico/ araquidil glucosido 3% Iso-hexadecano 7% Óleo de amêndoas doces 3% Manteiga de Karité 2% BHT 0,05% POB propilo 0,05% Fase aquosa: Água qs 100% Glicerina 5% POB metilo 0,1%

Aquece-se a fase gorda e a fase aquosa a 75 °C. Em seguida emulsiona-se por adição da fase aquosa à fase gorda com agitação Rayneri a 1000 rpm/min. 30 minutos após a emulsionação, homogeniza-se durante 1 minuto com um polytron (velocidade 4-5). 32

Exemplo 8

Prepara-se uma composição do mesmo modo que no exemplo mas tendo a composição seguinte: L. johnsonii (CNCM 1-1225) 1% tal como descrito no exemplo 5

Fase gorda: Estearato de glicerilo e 5% estearato de PEG100 Iso-hexadecano 8% Manteiga de Karité 5% BHT 0, 05% Dc 1503 1% Fase aquosa: Água qs 100% Glicerina 3% Carbopol 981 0,2% Lubrajel 5% Fenoxietanol 1 2-± o Hidróxido de sódio qs pH 6

Exemplo 9 Prepara- se uma composição do mesmo modo que no exemplo mas tendo a composição seguinte: L. johnsonii (CNCM 1-1225) 1% tal como descrito no exemplo 5 Fase gorda: 3-Diisoestearato de 5% poliglicerilo Ciclometicona CM5 20%

Fase aquosa; Água qs 100%

Glicerina 5%

NaCl 0,5%

MgSC>4 °'5%

Exemplo 10: Champô para animais

Prepara-se um champô para animais tendo a composição seguinte: 5% de lauril sulfato de sódio, 2% de cocamidopropilbetaina, 2% de laurilsulfonossuccinato de sódio, 2% de cloreto de sódio, 1,5% de PEG-7 cocoato de glicerilo, 0,75% de propileno glicol, pantenol, glicerina, fosfato dissódico, conservante, perfume e 1% de L. johnsonii (CNCM 1-1225) tal como descrito no exemplo 5. Completa-se a 100% com água. O champô assim preparado tem propriedades reguladoras da flora patogénica do sistema cutâneo dos animais.

Lisboa, 31 de Agosto de 2010 34

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente bacteriano seleccionado das estirpes de Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 ou Bifidobacterium lactis ATCC 27536 para a preparação de composições tópicas com utilização cosmética, farmacêutica ou veterinária, destinadas a serem administradas a humanos ou animais com um fim terapêutico ou profiláctico de estabilização e/ou regulação da flora patogénica do sistema cutâneo, sendo o referido agente bacteriano um extracto de bactéria ou uma bactéria seleccionada pelas suas propriedades de aderência em relação às células da pele e pelas suas propriedades anti-adesivas face aos agentes patogénicos do sistema cutâneo.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a bactéria está em forma viável, semi-activa ou desactivada.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a bactéria está desactivada por tratamento térmico a 90 °C durante 2 horas.
4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada por o agente bacteriano em forma liofilizada conter de l,0E+08 a 1,0E+11 cfu/g.
5. Composição tópica para utilização cosmética, farmacêutica ou veterinária contendo, pelo menos, um agente bacteriano capaz de estabilizar e/ou regular a flora patogénica do 1 sistema cutâneo, seleccionada das estirpes de Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 ou Bifidobacterium lactis ATCC 27536, sendo o referido agente bacteriano um extracto de bactéria ou uma bactéria seleccionada pelas suas faculdades de aderência em relação a células da pele e pelas suas propriedades anti-adesivas em relação aos agentes patogénicos do sistema cutâneo.
6. Composição tópica farmacêutica ou veterinária compreendendo, como agente bacteriano, uma estirpe de Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225, sendo o referido agente bacteriano um extracto de bactéria ou uma bactéria seleccionada pelas suas faculdades de aderência em relação a células da pele e pelas suas propriedades anti-adesivas em relação aos agentes patogénicos do sistema cutâneo, para utilização na estabilização e/ou regulação da flora patogénica do sistema cutâneo.
7. Composição de acordo com a reivindicação 5-6, em que a bactéria está em forma viável, semi-activa ou desactivada.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a bactéria está desactivada por tratamento térmico a 90 °C durante 2 horas.
9. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 8, contendo até 10% em peso do agente bacteriano em relação ao peso total da composição.
10. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 9, contendo cerca de 0,05 a 5% em peso do agente bacteriano em relação ao peso total da composição. 2
11. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 10, destinada ao tratamento ou à profilaxia de distúrbios cutâneos tais como: - complicações infecciosas, tais como dermatite atópica sobre-infectada, eczema impetiginoso, úlceras, feridas, queimaduras, acne inflamatório sobre-infectado - polidermatites, tais como impetigo, foliculites superficiais, - dermatites seborreicas, pitiriase versicolor - dermatofitoses - candidiases - as associadas a terapêuticas com antibióticos ou a agentes antimicóticos - as causadas por desregulações hormonais ou estados peliculares.
12. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 11 destinada a ser aplicada em peles sensíveis ou em peles oleosas.
13. Composição para utilização veterinária de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 12, destinada ao tratamento ou à prevenção das disfunções associadas a infecções estafilocócicas, estreptocócicas e micóticas nos animais. Lisboa, 31 de Agosto de 2010 3