CN1434716A - 皮肤致病菌群的抗粘合试剂 - Google Patents
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Abstract
一种细菌试剂用于制备化妆用、药用或兽医用并旨在稳定和/或调节哺乳动物的皮肤生态系统的组合物中的用途,所述细菌试剂是细菌提取物,或者是细菌,它是针对皮肤系统的病原体根据其与皮肤细胞的粘附性能及其抗粘附性能进行选择的;以及含有这种试剂的组合物。
Description
本发明涉及根据皮肤病原体抗粘合的性能选择的细菌试剂用于制备用于化妆用、药用或兽医用并旨在稳定和/或调节哺乳动物的皮肤生态系统的组合物中的用途,本发明还涉及含有这种试剂的组合物。
背景技术
病原体如金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、或者某些酵母菌的繁殖能够导致皮肤系统的调节障碍,或者甚至导致皮肤或粘膜更严重的病症,例如湿疹、念珠菌病、皮炎等。
已知许多抗这些病原剂的治疗方法。最常用的是使用抗生素或化学抗菌试剂。它们是例如以醛类和衍生物为基础的组合物。
因此,公开的专利申请FR 2740039描述了从醛类和双官能化合物选择的物质,优选戊二醛,用于抑制病原体菌株如金黄色葡萄球菌附着在角质细胞和角膜细胞(cornéocyte)上的用途。
因此,已知六氯酚及其衍生物为抗菌物质并且更具体地说是用于抵抗疮疱丙酸杆菌。
这些治疗通常昂贵且对身体和环境有害。
另外,现在还知道使用某些微生物菌株的抗真菌、杀菌或制菌性能的供选择使用的无毒性治疗。
因此,PCT申请WO 97/366603证实了干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)的抗真菌性能。
其它细菌试剂,例如芽孢杆菌(Bacillus),也可用于皮肤或粘膜上。特别是,在申请WO 98/47374中,凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus lacterosporus)和左旋乳酸芽孢杆菌(Bacilluslaevolacticus)的菌株都用于组合物中旨在预防细菌、病毒或真菌感染皮肤或粘膜。
本发明旨在发现一种能够控制和调节皮肤生态系统的新型细菌试剂。
发明概述
为此,本发明涉及细菌试剂用于制备化妆用、药用或兽医用并打算对人或动物施用以预防或治疗皮肤系统的病原体诱导的病症为目的的组合物中的用途,所述细菌试剂是乳酸细菌的提取物,或者是乳酸细菌,它是根据其与皮肤细胞的粘附性能和调节皮肤病原体结合的性能进行选择的,特别是通过抑制其粘合。
例如,所述细菌试剂可以选自乳杆菌属、微球菌属或双歧杆菌属的菌株,并且优选选自约氏乳杆菌CNCM I-1225、变异微球菌CNCMI-1586、变异微球菌CNCM I-1587或乳双歧杆菌ATCC 27536菌株。
所述细菌菌株可以活、失活或半活性形式使用。
所述细菌试剂可以冻干粉末形式使用,例如可以含有约10×108-10×1011cfu/g。
本发明还涉及用于化妆用、药用或兽医用且含有至少一种能够稳定和/或调节皮肤系统的病原菌丛的细菌试剂的组合物,所述细菌试剂是细菌提取物,或者是细菌,它是针对皮肤系统的病原体与皮肤细胞粘合的性能及其抗粘合性能进行选择的。
该组合物也可以用于眼科学或鼻方面的应用。
例如,该组合物可以具体地是膏、洗剂、皮肤病清洗棒(paindermatologique)、香波或粉末的形式。发明详述
名词“皮肤系统”不仅指所有皮肤细胞(即角质细胞),而且指角膜细胞。
本发明提供了一种细菌试剂,它是根据其与皮肤细胞粘合的性能以及稳定和调节皮肤系统的病原细菌丛的性能,特别是通过抑制病原体如金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或疮疱丙酸杆菌的粘合而选择的。
为此,测试了许多细菌菌株与人角质细胞附着的性能(参见实施例1)。
从由此测试的各种细菌菌株,可以选择乳杆菌属、微球菌属和双歧杆菌属的菌株,并且更具体地说是约氏乳杆菌菌株(NCC 533)、两个变异微球菌菌株(NCC 1482,NCC 1520)和乳双歧杆菌菌株(ATCC27536)。
根据布达佩斯条约,将约氏乳杆菌菌株(NCC 533)和变异微球菌菌株(NCC 1482和NCC 1520)保藏在Collection Nationalede Culturesde Microorganismes(CNCM),Institut Pasteur(巴斯德研究所国家微生物培养收集处),28rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex15,法国,约氏乳杆菌的保藏日期是1992年6月30日,登记号为CNCMI-1225,变异微球菌NCC 1482和NCC 1520的保藏日期是1995年6月7日,登记号为CNCM I-1586和CNCM I-1587。
乳双歧杆菌菌株(ATCC 27536)可以从汉森(Hansen)公司(Chr.Hansen A/S,10-12Boege Alle,P.O.Box407,DK-2970Hoersholm,丹麦)获得。
下面给出了关于这些菌株的形态和常规性能的细节:
约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CNCM I-1225
形态学
-非动性革兰氏阳性微生物,不形成孢子。
-相当短且粗的分离杆状(btonnets)
代谢
-微需氧微生物,均匀发酵代谢产生L(+)和D(-)乳酸。
-其它特征:过氧化氢酶(-)、产生CO2(-)、精氨酸水解(-)。
糖的发酵:
苦杏仁苷(+)、阿拉伯糖(-)、纤维二糖(+)、七叶苷(+)、果糖(+)、半乳糖(-)、葡萄糖(+)、乳糖(+)、麦芽糖(+/-)、甘露醇(-)、甘露糖(+)、蜜二糖(-)、蜜三糖(+)、核糖(-)、水杨苷(+)、蔗糖(+)、海藻糖(+)
变异链球菌(Micrococcus varians)CNCM I-1586(NCC 1482)和CNCM I-1587(NCC 1520)
形态学
-革兰氏阳性微生物,永远不运动。
-球形,为不规则排列的四分体形式。
代谢
-需氧微生物,过氧化氢酶(+)
-其它特征:在BHI培养基上为黄色。所述菌株的最佳生长温度是25-37℃。
糖的发酵:
果糖(+)、葡萄糖(+)
将本发明的细菌用于制备打算预防或治疗与皮肤系统的病原体,例如金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或疮疱丙酸杆菌,或者酵母菌有关病症(désordres)的组合物。
这些皮肤病症具体地可以是特应性皮炎(在缓解期,作为维护治疗)、痤疮、念珠菌病、皮脂溢皮炎、花斑糠疹、脓疱疹、湿疹性二次感染。
皮肤系统的紊乱也可能与抗生素或抗霉菌剂对糖尿病(念珠菌病)、粘膜病状(阴道念珠菌病)、慢性湿疹(内稳态失衡)、过敏性皮肤(早产婴儿,儿童)或油性皮肤(与可能促进细菌生长的激素调节障碍有关)或头皮屑(états pelliculaires)的治疗有关。
本发明的细菌可以其活的或半活性形式,或者以失活形式使用。术语“半活性形式的细菌”是指生理活性低的细菌。例如,其活性可以通过较长的指数生长期或传代时间、对环境的改变具有减慢的或不完全的生理反应的代谢来测定。在某些极端情况下,由于细菌不再能忍受环境的变化,因此细菌数量可能降低。
也可以使用细菌培养上清液。
根据本发明的第一个实施方式,所述细菌试剂可以是细菌提取物、或者细菌,所述细菌是活的形式。然后细菌试剂优选为冻干粉末状,例如通过EP 818529中所述的方法获得的。粉末可以含有10×108-10×1011cfu/g。
根据另一实施方式,细菌试剂可以为半活性形式的细菌提取物,或者细菌。可以几种方式将菌株部分失活,特别是通过:
-冷冻干燥,由在液氮中冷冻/在37℃熔融的循环组成。然后可以获得约1log的降低,
-紫外线作用(在254nm下15-60分钟,距离为20cm):降低2-3logs,
-热作用(70℃持续3小时):例如降低约3-4logs。
然后可以将细菌试剂以含有指数10×106cfu/g的粉末形式使用,并且优选为干燥组合物,例如干香波或其它粉末组合物,它可以含有高达10%的细菌提取物。
最后,细菌试剂也可以是失活形式的细菌提取物,或者细菌。所述细菌优选通过在约90℃下热处理约2小时来失活。细菌试剂为含有10×108-10×1012cfu/g的冻干粉末形式。它也可以高达5%,优选0.05-3%用于液体组合物并以高达10%用于粉状组合物中。
本发明还涉及用于化妆用、药用或兽医用且含有具有上述性能的细菌试剂的组合物。
为了制备这种组合物,将至少一种活、半活性或失活形式的细菌菌株加入药用或化妆用可接受的载体中,其加入量随所需用途的功能而变化。相对组合物的总重量,细菌试剂可以高达约5%存在,并且针对粉末形式的组合物可以高达1O%存在,并且优选0.5-2%。
本发明的组合物可以经局部或眼路径给药。
经过局部路径,以本发明化合物为基础的药用组合物优选用于治疗皮肤和粘膜,并且可以是油膏、膏剂、乳剂、软膏、粉末、浸湿药签、溶液、凝胶、喷雾剂、洗剂或悬液的形式。它们也可以是微球体或纳米球体、或者脂质体的或聚合物的囊、或聚合物碎片和水凝胶的形式,从而控制释放。这些通过局部路径给药的组合物或者可以是无水形式或者可以是含水形式,这取决于临床指征。
通过眼路径,它们主要是洗眼剂。
在一优选实施方式中,本发明涉及一种在化妆用可接受的载体中含有至少一种如上所述细菌试剂的化妆用组合物。相对于组合物的总重量,所述化妆用组合物可以含有比例为至少O.O01%的细菌试剂,并优选O.05-3%。
该化妆用组合物特别是打算用于身体和头发卫生。具体地它可以是膏剂、乳剂、洗剂、凝胶、微球体或纳米球体、或脂质体或聚合物囊、肥皂或香波的形式。
本发明的药用和化妆用组合物也可以含有惰性添加剂或者甚至药效活性或化妆用活性添加剂、或者这些添加剂的组合,具体地说:润湿剂:脱色素剂如氢醌、壬二酸、咖啡酸或曲酸;软化剂;增湿剂如甘油、PEG-400、硫代吗啉酮及其衍生物、或脲;抗皮脂溢剂或抗座疮剂,例如S-羧基甲基半胱氨酸、S-苯甲基半胱胺、其盐和其衍生物,或者过氧化苯甲酰;抗生素如红霉素及其酯、新霉素、克林霉素及其酯;四环素类;抗真菌剂如酮康唑或4,5-聚亚甲基-3-异噻唑啉酮类;促进头发再生的试剂,例如Minoxidil(2,4-二氨基-6-哌啶基嘧啶-3-氧化物)及其衍生物、Diazoxide(7-氯-3-甲基-1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物)和Phényto
n(5,4-二苯基咪唑啉-2,4-二酮);非甾类消炎剂;类胡萝卜素,特别是β-胡萝卜素;抗牛皮癣药如蒽林及其衍生物;和最后,二十碳-5,8,11,14-四炔酸(tétrayno
que)和二十碳-5,8,11-三炔酸(tryno
que)、其酯和酰胺。
本发明的组合物还可以含有防腐剂如对羟基苯甲酸酯类、稳定剂、水分调节剂、pH调节剂、渗透压改进剂、乳化剂、UV-A和UV-B防护剂、和抗氧化剂如α-生育酚、丁基羟基茴香醚或丁基羟基甲苯。
最后,本发明还涉及一种动物兽医和化妆用的含有至少一种上面定义的细菌试剂的组合物。这种组合物例如可以是干香波或液体香波、粉末、泡沫体或洗剂的形式。它可以含有高达10%的所述细菌试剂。
本发明的组合物特别用于治疗或预防健康的、过敏性的和/或病态的皮肤和/或粘膜,它们可能呈现皮肤系统病症,例如特别是:
-传染性并发症如重复感染性特应性皮炎、脓疱病基湿疹、溃疡、创伤、烧伤、重复感染性炎症性座疮,
-皮炎如脓疱病、表面毛囊炎
-皮脂溢皮炎、花斑糠疹,
-皮真菌病(头癣、体癣、脚癣、黑布腊氏湿疹、环状疱疹)
-念珠菌病(阴道的,指间的,与危险职业或糖尿病有关的)
-与抗生素或抗霉菌剂(anti-mycosique)治疗有关的紊乱,
-激素调节障碍引起的紊乱(油性皮肤)或头皮屑(étatspelliculaires)
-过敏性皮肤(早产婴儿、儿童)
所述兽医用的组合物尤其用于治疗或预防由于葡萄球菌感染(由于金黄色葡萄球菌、中间葡萄球菌(S.intermedians))、链球菌感染(由于酿脓链球菌)和霉菌感染(因白色念珠菌的含念珠菌病和因P.canis的pytirosporoses)引起的功能障碍。
通过以下实施方式的实施例的说明,本发明的其它特征将清晰可见,这些实施例是为了说明本发明而提供的,而不限制本发明范围。
实施例
实施例1:细菌试剂的选择
在本发明范围中,将12种不同细菌菌株粘附到皮肤细胞上,特别是粘附到培养物中HaCat人角质细胞上,进行研究。这些菌株属于乳杆菌属、双歧杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、链球菌属和丙酸杆菌属种。
将这些细菌培养物(1ml)于10ml培养基(参见表1)中过夜。为了这些粘合试验,将这些细菌预培养直到获得浓度5.0×108-109cfu/ml。该cfu是通过测定每种菌株的光密度来表征的(1.0×108cfu/ml下的DO:参见表1)。
然后,测定这些细菌菌株的粘合特性。
表1:细菌菌株和培养条件
细菌菌株 | NCC代码 | 培养基 | 培养T℃/小时 | 102cfu下的DO |
约氏乳杆菌La1 | 533 | MRS | 厌氧37℃/48h | 1.00 |
嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)La10 | 90 | MRS | 厌氧37℃/48h | 1.00 |
乳双歧杆菌ATCC27536 | 536 | MRS | 厌氧37℃/18h | 0.65 |
长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)B28 | 585 | MRS | 有氧30℃/18h | 1.32 |
变异微球菌NCC1482 | 1482 | BHi | 有氧30℃/18h | 4.85 |
变异微球菌NCC1520 | 1520 | BHi | 有氧30℃/18h | 3.47 |
变异微球菌MCV17 | 1583 | BHi | 有氧30℃/18h | 4.18 |
肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)STC21 | 931 | BHi | 有氧30℃/18h | 40.20 |
鱼发酵葡萄球菌(Staphylococcuspiscifermentans)STF4 | 751 | BHi | 有氧30℃/18h | 3.26 |
嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Sfi16 | 2019 | HJL | 有氧40℃/18h | 0.37 |
谢氏丙酸杆菌(PropionibacteriumShermanii)PP12 | 1197 | MRS | 有氧30℃/24h | 0.18 |
特氏丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)PP22 | 1116 | MRS | 有氧30℃/24h | 0.25 |
NCC 533、NCC 90、NCC 536和NCC 585在厌氧条件下培养(Gaspack H2+CO2)。
人角质细胞系:
针对3个角质细胞系研究了细菌的粘合性能:
-SV40 T-Ag永生化细胞系:如EP 780469中所述的DK2-NR和FK2-NR细胞,和
-HPV(人乳突淋瘤病毒)E6/E7和SV40 T-Ag永生化细胞系:如WO 99/02347中所述的DK7-NR细胞系。
这些细胞系的培养基:
DK7-NR、FK2-NR:NR-2(Biofluids,Rockville,MD 20850)(EP780469)。
DK2-NR:NR-M(Biofluids,Rockville,MD 20850)。
将这些角质细胞系以5×105个角质细胞/cm2的比例培养,接种于涂布6-孔簇(Becton Dickinson,lincoln Park,NJ)中。涂布液由补充有以下物质的基本培养基组成:10μm/ml人纤连蛋白(BectonDickinson)、31μg/ml牛胶原I(Vitrogen,Collagen Corporation,Fremont,CA)和0.1mg/ml BSA(Biofluids,Rockville,MD 20850)。6-8天之后,这些细胞培养物形成单层(汇合)。接下来,使培养基中的Ca2+浓度升至1.5mM以诱导细胞分化。在没有抗生素的情况下,将这些细胞在高钙浓度培养基中培养4天。针对这些粘合试验,将这些细胞培养物用缓冲液(HBSS,Ca2+:1.0mM)冲洗3次。
放射性标记
通过向培养基中加入100μCi/10ml的2-3H-腺嘌呤(Amersham,TRK.311)将这些细菌接种标记过夜。将等分量的细菌在没有3H-腺嘌呤的培养基中培养。将未标记(冷的)上清液放置在一边,以便调整粘合试验的cfu/ml。
粘合试验
在4000rpm下将细菌悬液离心10分钟。在调整光密度(DO)之前,将这些颗粒于HBSS中洗涤2次。测定每一菌株的DO,以便将细菌的最终浓度调整至1.0×106、1.0×107、1.0×108和1.0×109cfu/ml。这些粘合试验的培养基是1∶1的角质细胞培养基和细菌培养基的未标记上清液的混合物。
为了分析细菌在没有角质细胞的底物上的粘合性能,将细菌悬液在塑料盘和涂布有细胞的塑料盘上培养。
分析
培养物用HBSS(Ca2+,1.0mM)洗涤3次之后,室温下将与角质细胞结合的细菌于1N NaOH溶液中溶解30分钟。用1ml苄索氢氧化铵(hydroxyde de benzethonium)(Sigma,St.Louis,USA)将溶液转移到闪烁小瓶中。在60℃下1小时之后,通过液体闪烁计数(dpm)测定标记细菌的3H活性。
粘合指数(AI)是以3H(dpm/孔)、以细菌悬液的总3H活性(dpm/ml)的%计算的。
结果
粘合指数(AI)
13种不同细菌菌株的粘合指数是通过测定放射性标记微生物的3H-腺嘌呤活性来计算的。结果列于表2中。
表2:FK2-NR角质细胞的细菌菌株的粘合指数
NCC代码 | CFU/ml | dpm(×103) | =SD | 粘合指数(总dpm的%) |
533 | 1.0×109 | 209.6 | 24.2 | 1.2 |
1.0×108 | 175.5 | 42.5 | 10.4 | |
1.0×107 | 39.5 | 1.9 | 23.3 | |
1.0×106 | 4.7 | 0.3 | 27.7 | |
90 | 1.0×109 | 167.7 | 19.4 | 2.8 |
1.0×108 | 47.7 | 2.9 | 7.9 | |
1.0×107 | 8.3 | 0.5 | 13.8 | |
1.0×106 | 0.9 | 0.1 | 15.5 | |
536 | 1.0×109 | 413.9 | 91.7 | 4.8 |
1.0×108 | 221.0 | 31.3 | 25.5 | |
1.0×107 | 22.3 | 3.8 | 25.8 | |
1.0×106 | 2.4 | 0.3 | 28.2 | |
585 | 1.0×109 | 107.7 | 21.0 | 1.2 |
1.0×108 | 19.6 | 1.5 | 2.2 | |
1.0×107 | 9.7 | 1.9 | 10.8 | |
1.0×106 | 1.3 | 0.1 | 14.3 |
1482 | 1.0×109 | 6147.2 | 1292.6 | 72.4 |
1.0×108 | 257.7 | 52.6 | 30.3 | |
1.0×107 | 10.4 | 0.8 | 12.3 | |
1.0×106 | 1.7 | 0.2 | 19.7 | |
1520 | 1.0×109 | 121.2 | 22.3 | 1.5 |
1.0×108 | 40.1 | 5.7 | 5.0 | |
1.0×107 | 16.5 | 5.5 | 20.7 | |
1.0×106 | 2.3 | 0.2 | 29.0 | |
1583 | 1.0×109 | 41.3 | 9.7 | 0.7 |
1.0×108 | 12.9 | 1.3 | 2.2 | |
1.0×107 | 7.5 | 0.5 | 12.7 | |
1.0×106 | 1.1 | 0.1 | 18.7 | |
751 | 1.0×109 | 195.5 | 96.5 | 2.6 |
1.0×108 | 24.7 | 4.9 | 3.2 | |
1.0×107 | 4.8 | 0.9 | 6.4 | |
1.0×106 | 0.6 | 0.09 | 8.9 | |
931 | 1.0×109 | 16.2 | 2.9 | 0.5 |
1.0×108 | 4.6 | 0.6 | 1.3 | |
1.0×107 | 1.6 | 0.1 | 4.6 | |
1.0×106 | 0.2 | 0.01 | 6.7 | |
2019 | 1.0×108 | 67.5 | 1.4 | 1.4 |
1.0×107 | 10.0 | 0.4 | 2.1 | |
1.0×106 | 1.1 | 0.1 | 2.4 | |
1197 | 1.0×109 | 20.2 | 3.1 | 0.2 |
1.0×108 | 3.2 | 0.2 | 0.3 | |
1.0×107 | 0.5 | 0.2 | 0.4 | |
1.0×106 | 0.1 | 0.02 | 0.6 | |
1116 | 1.0×109 | 34.1 | 2.0 | 0.2 |
1.0×108 | 6.3 | 0.2 | 0.4 | |
1.0×107 | 0.7 | 0.1 | 0.5 | |
1.0×106 | 0.1 | 0.01 | 0.7 |
结果显示,以下菌株获得最高粘合指数:乳双歧杆菌ATCC 27536、约氏乳杆菌NCC 533(CNCM I-1225)菌株和变异微球菌NCC 1482(CNCMI-1586)、NCC 1520(CNCM I-1587)和NCC 1583菌株。
实施例2:通过变异微球菌NCC 1482或约氏乳杆菌NCC 533抑制金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌粘合的体外试验
微生物和培养方法
通过在斜面上(sur pente)由培养物传代培养(repiquage)来将病原体金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌于肉汤(bouillon)培养基中培养(表3)。以系列稀释液为基础并在琼脂培养基中计数对每一测定的病菌建立DO/细菌密度对应关系。
表3
细菌菌株 | 登记号 | 培养基 | 培养条件 |
金黄色葡萄球菌 | ATCC 6538 | TCS | 有氧,35℃/24h |
酿脓链球菌 | CIP 5641 T | BHI | 有氧,35℃/24h |
培养基:
TCS(AES,Combourg,代号AEB 141502)
BHI(UNIPATH SA,Dardilly,代号CM 225)
转化的人角质细胞
使用HaCaT系的永生化人角质细胞(Boukamp P.等,J.Cell Biol.,106,761-771,1988)。将这些HaCaT细胞于补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中在37℃和5% CO2下培养。
将6-孔簇(Becton Dickinson)以比例104个细胞/cm2接种。4-5天之后,细胞达到汇合。汇合之后进行4-5天的粘合试验。在这些试验之前将这些单层用PBS洗涤3次。
放射性标记
将这些细菌用2-3H-腺嘌呤(Amersham,TRK 311)于比例为100μCi/10ml的肉汤培养基中标记。将这些悬液洗涤3次,然后再次悬浮于PBS中。在该相同缓冲液中调整细胞密度。
角质细胞在培养物中的粘合试验:
将1ml放射性标记过的细菌悬液于35℃下培养1小时。单层用PBS缓冲液冲洗3次并通过加入1N NaOH于室温下溶解30分钟。将溶解物转移到闪烁小瓶中并在60℃下用1ml的氢氧化季铵(hyamine)(Carlo Erba,代码464951)培养1小时。该3H活性是在液体闪烁计数器中计数的。每一试验重复三次。还用塑料载体进行对照。
该粘合是通过粘合的放射活性与加入的放射活性之比再乘以100定义的。
粘合抑制试验
洗涤和再次悬浮于PBS中之后,将放射性标记过的病原体和冷细菌菌株用该单层同时培养。将试验重复3次以使细菌试剂密度占3log。
结果
对金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、约氏乳杆菌NCC 533和变异微球菌NCC 1482,测定它们在培养物中与HaCaTen角质细胞的粘合。结果列于表4。
表4
微生物 | 粘合(%) | ||
1.0×106cfu/ml | 1.0×107cfu/ml | 1.0×108cfu/ml | |
金黄色葡萄球菌 | - | 5.0 | 2.5 |
酿脓链球菌 | - | 35 | 42.5 |
NCC 533 | 4.5 | 1.7 | 1.2 |
NCC 1482 | 6.5 | 3.0 | 0.6 |
抑制(%) | |||
9.0×106cfu/ml | 9.0×107cfu/ml | 9.0×108cfu/ml | |
金黄色葡萄球菌108cfu/ml+NCC 1482 | 5 | 11 | 66 |
金黄色葡萄球菌108cfu/ml+NCC 533 | 20 | 24 | 34 |
酿脓链球菌108cfu/ml+NCC 1482 | 26 | 28 | 40 |
酿脓链球菌108cfu/ml+NCC 533 | 12 | 19 | 52 |
结果显示,金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、约氏乳杆菌NCC 533和变异微球菌NCC 1482与培养物中的角质细胞粘合。当细菌试剂的密度增加时,病原体递增地替换。
实施例3:通过活或失活的约氏乳杆菌NCC 533抑制金黄色葡萄球菌的体外试验
体外粘合模型是以用单层永生化人角质细胞(HaCaT系)培养放射性标记过且校准过的皮肤病原微生物(金黄色葡萄球菌)悬液为基础的(Boukamp P.等,J Cell Biol.,106,761-771,1988)。
通过测定留在单层上的放射性活性评价在单层上病原体和待测定化合物共培养时针对该粘合的细菌试剂(约氏乳杆菌NCC 533,活的或者失活的形式)的抑制活性。
角质细胞
为此,将HaCaT细胞于补充有10%胎牛血清的DMEM中于37℃和5%的CO2下培养。将它们以1.0×104个细胞/cm2的比例接种于6-孔蔟中。汇合之后进行5天的粘合试验。将这些单层用PBS洗涤3次,之后用微生物培养。
微生物
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)于TCS培养基中在有氧和35℃下培养。
约氏乳杆菌NCC 533于MRS培养基中在厌氧和37℃下培养。针对粘合抑制试验,在PBS缓冲液中由48-小时培养物制备细菌的浓悬液。将该悬液调整至2×108cfu/ml(525nm下的DO=1.5)。在PBS缓冲液中制备系列稀释液,以便获得2.0×107和2.0×106cfu/ml的悬液。将各种悬液在厌氧和37℃下培养的MRS琼脂上计数。
失活形式的NCC 533是通过将乳杆菌经过液氮下冷冻/室温下熔融的几次循环的浓稠悬液冻干获得的。试验的制品相当于4.0×1010cfu/g的生物量。
放射性标记
金黄色葡萄球菌的放射性标记是通过在TCS肉汤培养基中培养24小时的过程中加入100μCi/10ml的3H腺嘌呤获得的。然后在3000rpm下将悬液离心10分钟并在PBS中洗涤3次。用PBS将细胞密度调整至约2.0×108cfu/ml(525nm下的DO=0.5)。通过对100μl悬液闪烁计数来测定比放射性。
粘合抑制试验:
每个孔的HaCaT细胞培养物中同时加入1ml放射性标记过的金黄色葡萄球菌和1ml NCC 533悬液。于37℃下培养1小时之后,将这些单层用PBS缓冲液洗涤3次并加入1ml的1N NaOH于室温下溶解30分钟。将溶菌产物(lysat)转移到闪烁小瓶中并在60℃下用1ml苄索氢氧化铵培养。冷却之后,加入10ml Hyonic荧光材料(fluor)闪烁液,并在液体闪烁计数器上计数该放射性。对照是通过加入1ml放射性标记过的金黄色葡萄球菌悬液和1ml的PBS缓冲液获得的,并且相当于100%粘合。
结果列于表5。
表5:金黄色葡萄球菌与HaCaT细胞的粘合受活性形式和失活形式的NCC 533的抑制
粘合(%) | 标准偏差 | |
对照 | 100 | 9 |
NCC 533 3.0×106cfu/ml | 74 | 19 |
NCC 533 3.0×107cfu/ml | 69 | 8 |
NCC 533 3.0×108cfu/ml | 34 | 1 |
失活的NCC 533 3.0×106cfu/ml | 27 | 2 |
失活的NCC 533 3.0×107cfu/ml | 12 | 1 |
失活的NCC 533 3.0×108cfu/ml | 6 | 0 |
实施例4:失活约氏乳杆菌抑制皮肤病原体粘合的体内试验
材料和方法
动物:
15只7-8周龄的SKH雌性小鼠,重量约30g,由C.River供应。每组使用5只小鼠测定不同的局部涂敷。
微生物
使用从人皮肤损伤处(腿溃疡)分离的金黄色葡萄球菌菌株(命名:菌株1)。该菌株对Methycilin敏感。
接种物的制备
制备用于接种于小鼠中的细菌悬液。为此,将菌株1于固体培养基(AES,AEB 122 859)在35℃下用斜面(en pente)预培养18-24小时。培养之后,将细菌再次悬浮于10ml无菌生理盐水溶液中,然后在3000rpm下离心10分钟回收。然后除去上清液并将颗粒用10ml生理盐水溶液吸收。将该步骤重复2次。通过将洗涤过的细菌再次悬浮于4ml无菌生理盐水溶液中制备接种悬液。将525nm下的DO调整至约0.14。它含有约108cfu/ml。
接种小鼠
将肋腹上的小鼠的皮肤用95乙醇(Mefck)脱脂。用微量吸移管将50μl含有50/50金黄色葡萄球菌接种物1.0×107cfu/ml和待测定产物的混合物的悬液慢慢涂敷到该脱脂区(6.25cm2)。接种位置通过无菌塑料敷料(Dermafilm 33×15,代码38.3015,Vygon laboratory)闭合1小时来加以保护。
对损伤处活的细菌计数
悬液涂敷4小时之后,在异氟醚(Abbott France)的麻醉下将小鼠杀死。将接种部位切除一块(直径12mm)。将除去的皮肤活组织粉碎并使用Polytron(PT 2100,Bioblock Scientific)(5rpm,5min)用2ml无菌盐水溶液均质。
将1ml均质化组织样品加入9ml无菌盐水溶液,并使用10-倍稀释法将0.1ml该混合物于110号葡萄球菌培养基上培养。在35℃下培养48小时之后,计数所生长的菌落并测定CFU(菌落形成单位)。
结果
结果列于表6。
表6:1% NCC 533试验
*比对照(SA/PBS)显著,Student的T试验(n=5)
Log cfu/cm2 | |
金黄色葡萄球菌+PBS | 3.4 |
金黄色葡萄球菌+1%NCC 533于PBS中 | 2.6* |
金黄色葡萄球菌+0.045%戊二醛 | 0.8* |
NCC 533以1%存在能够在接触4小时之后发现细菌数量降低约1log。相对对照样,差异显然是显著的(p=0.098)。
在有戊二醛的情况下,相对对照,细菌数量降低更显著,然而毫无疑问,该活性是由于其抗菌活性并且当金黄色葡萄球菌一加入到混合物中就起作用;因此,4小时之后观察到的活性不是由于抗粘合效果,而是产品的抗菌活性。
结果列于表7。
表7
相对对照样的是显著的*p<0.05,***p<0.001(SA/PBS)
接种大小cfu/ml | 处理 | 相对对照降低的% | 相对对照样的显著性 |
1.0×106cfu/ml | 0.5% NCC 533 | 20.1% | P=0.019(*) |
1% NCC 533 | 22.6% | P=0.016(*) | |
0.045%戊二醛 | 87.9% | P=0.0001(***) | |
1.0×107cfu/ml | 0.5% NCC 533 | 27.4% | P=0.0015(*) |
1% NCC 533 | 19.9% | P=0.0004(***) | |
0.045%戊二醛 | 92.0% | P=0.0004(***) |
相对106cfu/ml和107cfu/ml的接种物,NCC 533以0.5%和1%存在发现金黄色葡萄球菌的数量降低约11og。没有观察到106cfu/ml接种物或107cfu/ml接种物的剂量效果。
在有0.045%戊二醛的情况下,相对对照样降低更大;它为约3log。
这些结果证实了0.5%和1%的失活NCC 533作为金黄色葡萄球菌粘合的抑制剂的活性。
实施例5:身体洗剂
制备具有以下组成的身体洗剂:8.0%矿物油、5.0%棕榈酸异丙酯、2.0%聚甘油基-3-二异硬脂酸酯、4.0%辛基十二烷醇、0.3%卡波姆(carbomère)、0.2%椰油基谷氨酸钠、1.2%的10%氢氧化钠、防腐剂、香精、0.5-3%的含10×108-10×1012cfu/g至少一种选自以下细菌菌株并在约90℃下热处理约2小时使其失活的冻干物:约氏乳杆菌(CNCMI-1225)、变异微球菌(CNCM I-1586或CNCM I-1587)或乳双歧杆菌(ATCC 27536,Hansen)。该混合物用水使其达到100%。
由此获得的身体洗剂由于其相对病原体的抗粘合性能,用于稳定和/或调节皮肤病原菌群。
实施例6:香波
制备具有以下组成的香波:7.0%十二烷基硫酸钠、2.0%椰油酰氨基丙基甜菜碱、2.0%十二烷基磺基琥珀酸钠、氯化钠、防腐剂、香精和0.5-3%含108-1012cfu/g至少一种选自以下细菌菌株并在约90℃下热处理约2小时使其失活的冻干物:约氏乳杆菌(CNCM I-1225)、变异微球菌(CNCM I-1586或CNCM I-1587)或乳双歧杆菌ATCC 27536。该混合物用水使其达到100%。
由此获得的香波具有调节头皮病原菌落的性能。尤其指出的是治疗头皮屑。
实施例7
为了获得具有调节皮肤病原菌落性能的药用组合物,制备具有以下组成的脂相和水相。
实施例5中所述的约氏乳杆菌(CNCM I-1225) 1%脂相: 花生基二十二醇/花生基葡糖苷 3%
异十六烷 7%
甜扁桃油 3%
牛油果油 2%
B.H.T. 0.05%
丙基POB 0.05%水相: 水 适量至100%
甘油 5%
甲基POB 0.1%
将脂相和水相加热至75℃。然后,通过将水相加入到脂相中用Rayneri在1000rpm下混合进行乳化。乳化30分钟之后,将混合物用polytron(4-5速)均质1分钟。
实施例8
以与实施例7相同的方式制备具有以下组成的组合物:
实施例5中所述的约氏乳杆菌(CNCM I-1225) 1%脂相: 硬脂酸甘油酯和PEG100硬脂酸酯 5%
异十六烷 8%
牛油果油 5%
B.H.T. 0.05%
Dc1503 1%水相:水 适量至100%
甘油 3%
卡巴浦尔(Carbopol)981 0.2%
Lubrajel 5%
苯氧乙醇 1%
碳酸钠 适量至pH6
实施例9以与实施例7相同的方式制备具有以下组成的组合物:
实施例5中所述的约氏乳杆菌(CNCM I-1225) 1%脂相:聚甘油基-3二异硬脂酸酯 5%
环甲基硅酮CM5 20%水相:
水 适量至100%
甘油 5%
NaCl 0.5%
MgSO4 0.5%
实施例10:动物香波
制备具有以下组成的动物香波:5%十二烷基硫酸钠、2%椰油酰氨基丙基甜菜碱、2%十二烷基磺基琥珀酸钠、2%氯化钠、1.5% PEG-7椰油酸甘油酯、0.75%丙二醇、泛醇、甘油、磷酸氢二钠、防腐剂、香精和1%的实施例5中所述的约氏乳杆菌(CNCM I-1225)。用水使该混合物达到100%。
由此制备的香波具有调节动物皮肤系统的病原菌群的性能。
Claims (16)
1、一种细菌试剂在制备化妆用、药用或兽医用并旨在对人或动物施用以稳定和/或调节皮肤系统的病原菌群的治疗或预防为目的的组合物中的用途,所述细菌试剂是细菌提取物,或者是细菌,它是针对皮肤系统的病原体根据其与皮肤细胞的粘附性能及其抗粘附性能进行选择的。
2、如权利要求1的用途,其中所述细菌试剂选自乳杆菌属(Lactobacillus)、微球菌属(Micrococcus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
3、如权利要求1和2之一的用途,其中所述细菌试剂选自约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CNCM I-1225、变异微球菌(Micrococcus varians)CNCM I-1586、变异微球菌CNCM I-1587或乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)ATCC 27536菌株。
4、如权利要求1-3之一的用途,其中所述细菌是活、半活性或失活形式。
5、如权利要求4的用途,其中所述细菌是在90℃下热处理2小时失活的。
6、如权利要求1-5之一的用途,特征在于所述细菌试剂以冻干形式含有1.0×108-1.0×1011cfu/g。
7、用于化妆用、药用或兽医用并含有至少一种能够稳定和/或调节皮肤系统的病原菌群的细菌试剂的组合物,所述细菌试剂是细菌提取物,或者是细菌,它是针对皮肤系统的病原体根据其与皮肤细胞的粘附性能及其抗粘附性能进行选择的。
8、如权利要求7的组合物,其中所述细菌试剂选自乳杆菌属、微球菌属或双歧杆菌属。
9、如权利要求7和8之一的组合物,其中所述细菌试剂选自约氏乳杆菌CNCM I-1225、变异微球菌CNCM I-1586、变异微球菌CNCMI-1587或乳双歧杆菌ATCC 27536菌株。
10、如权利要求7-9之一的组合物,其中所述细菌是活、半活性或失活形式。
11、如权利要求10的组合物,其中所述细菌是在90℃下热处理2小时失活的。
12、如权利要求7-11之一的组合物,相对组合物的总重量,含有高达10%wt的所述细菌试剂。
13、如权利要求7-12之一的组合物,相对组合物的总重量,含有约0.05-5%wt的所述细菌试剂。
14、如权利要求7-13之一的组合物,旨在用于治疗或预防皮肤疾病,例如:
-传染性并发症如重复感染性特应性皮炎、脓疱病基湿疹、溃疡、创伤、烧伤、重复感染性炎症性痤疮,
-皮炎如脓疱病、表面毛囊炎,
-皮脂溢皮炎、花斑糠疹,
-皮真菌病,
-念珠菌病,
-与抗生素或抗霉菌剂治疗有关的病症,
-激素调节障碍引起的病症或头皮屑。
15、如权利要求7-14之一的组合物,用于对过敏性皮肤或油性皮肤施用。
16、如权利要求7-13之一的兽医用的组合物,用于治疗或预防动物中与葡萄球菌、链球菌和霉菌感染有关的功能障碍。
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