JPH0818995B2 - 皮膚用抗菌剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有効成分としてストレプトコッカス属に属す
る微生物、ラクトバチルス属に属する微生物／又はビフ
ィドバクテリウム属に属する微生物の菌体及び／又は水
抽出物を含有する皮膚用抗菌剤、特に抗瘡剤、皮膚疾
患改善剤乃至皮膚保護剤に関する。

主たる瘡（にきび acne）原因菌であるプロピオニ
バクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes又
はCorynebacterium parvum）に対する抗菌性物質として
は、hexachloropheneなどがあるが、人体ならびに腸内
細菌に対する影響等の副作用につき実質的に未解明であ
り、皮膚塗布による皮膚吸収及び経口による体内への侵
入に対し、必ずしも安全であるとはなし難いものであ
る。

上記に鑑み本発明者らは鋭意研究の結果、健常人腸内
細菌由来の乳酸菌であるストレプトコッカス属、ラクト
バチルス属、又はビフィドバクテリウム属に属する微生
物の菌体乃至その水抽出物が、プロピオニバクテリウム
・アクネスに対し強い抗菌活性を有すること、及びこれ
ら乳酸菌菌体乃至水抽出物は腸内細菌や皮膚に対する影
響を含めて、経口投与或いは皮膚塗布実験の結果、実質
的に全然無毒性であることを知見し、本発明に到達した
ものである。

以下、本発明に於いて使用され得る微生物の種類と菌
学的性質、スクリーニング方法、菌体調製法、及び薬理
作用等につき詳細に分説する。

微生物 ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属又はビフィ
ドバクテリウム属に属する微生物であり、就中、ストレ
プトコッカス・フェシウム（Streptococcus faeciu
m）、同デュランス（S.durans）、同エビウム（S.aviu
m）、同フェカーリス（S.faecalis）、ラクトバチルス
・ブレビス（Lactobacillus brevis）、同サリヴァリウ
ス（L.salivarius）、ビフィドバクテルウム・アドレセ
ンテス（Bifidobacterium adolecsentis）、同ブレベ
（B.breve）、同ロンガム（B.longum）等を好適なもの
として例示し得る。ここで本発明に於いて特に有用な菌
株を微工研受託番号と共に表示すれば下記の第１表の通
りである。

菌学的性質 本発明微生物のスクリーニング法、同定など菌学的性
質につき要約して示せば次の通りである。

1.スクリーニング方法 Watanabe,T.,et al.,Studies on streptococci,I.Dis
tribution of fecal streptococci in man.Microbiol.I
mmunol.25.257−269（1981）に記載の方法に準ずる。す
なわち、上記文献に記載の通り、健康人の糞便を下記の
組成（第２表）の希釈液で希釈し、ストレプトコッカス
はKMN agar［vander Weil−Korstanje.J.A.A.,and K.C.
Winkder:J.Med.Microbiol.Ｓ 491（1975）：第３表］、
ラクトバチルスはLBSagar［BBL,第４表］、ビフイドバ
クテリウムはMPN agar［Tanaka,R.et al.,Appl.Enviro
n.Microbiol.40,866−869（1980），第５表］に塗沫、3
7℃、好気的乃至嫌気的条件下で48−72時間培養し、生
成コロニーをカウント、無作為にひろい、コロニー形、
カタラーゼ活性（陰性）、グラム染色陽性球菌及び桿菌
を分離し、生理的、生化学的性状を検査して分類同定し
た。

第２表 希釈液の組成 KH₂PO₄ 4.5g Na₂HPO₄ 6.0g Ｌ−システイン塩酸塩 0.5g ツイーン80 0.5g 寒天 1.0g 精製水 1000 ml 第３表 KMNagar（Red−Kanamycin−milk agar）の組成 Ａ トリプトース 15 ｇ 肉エキス ３ ｇ アジ化ナトリウム 0.2g pH6.8 食塩 ５ ｇ 121℃ 10分間 寒天 18 ｇ 精製水 800ml スキムミルク 16g Ｂ ニュートラルレッド 40mg 100℃ 1時間 精製水 200ml Ｃ カナマイシン 24mg A,B,Cを別滅菌後、合し、平板とする。

第４表 LBSagarの組成（BBL） トリプトース 10g 肉エキス 5g KH₂PO₄ 6g クエン酸三アンモニウム 2g グルコース 20g 無水酢酸ナトリウム 15g ツイーン80 1g MgSO₄・7H₂O 575mg MnSO₄・2H₂O 120mg FeSO₄・7H₂O 34mg 寒天 15g 精製水 100ml pH5.5 121℃ 15分間 加熱滅菌 第５表 MPNagarの組成 ラクトース ２ g （NH₄）₂SO₄ 0.5 g K₂HPO₄ 0.1 g MgSO₄・7H₂O 20 mg FeSO₄・7H₂O １ mg MnSO₄・2H₂O 0.8 mg 食塩 １ mg 0.1％リサズリン 0.1 mg ビオチン 0.01mg パントテン酸カルシウム 0.2 mg リボフラビン 0.1 mg アデニン 0.1 mg グアニン 0.1 mg キサンチン 0.1 mg ウラシル 0.1 mg ツイーン80 0.1 g 10％ピルビン酸 0.1 ml ８％Na₂CO₃ 5 ml ３％Ｌ−システイン塩酸塩 １ ml ナリジクス酸 10 mg 1.6％プロムクレゾールパープル 0.1 ml 寒天 ２ g 精製水 100 ml pH6.8 100℃ 30分間 圧力なし加熱殺菌 2.分離乳酸菌の同定 本発明微生物の一般的菌学的性質は同一分類につき、
公知各文献の示すものと同一の諸性質を有する。

すなわち、ストレプトコッカス属殺菌の選択培地KMNa
gar培地、ラクトバチルス属殺菌の選択培地LBSagar培
地、そしてビフィドバクテリウム属殺菌の選択培地MPNa
gar培地上のコロニー形状、グラム染色性、形態、生理
生化学的性状により下記文献１）〜４）を参照して同定
した。

参考文献 １） 光岡知足：日本殺菌学雑誌、24（６）,261−280
（1969） ２） Poupard,J.A.,Husain,I.and Norris,R.F.,:Bacte
riol.Rev.,37 136−165（1973） ３） Bergey′s Mannual of Determinative Bacteriol
ogy,8th ed.490−676（1974） ４） 光岡知足：臨床と殺菌、２（３）,55（197）−97
（239），（1975） ここで同定の根拠としたその主な菌学的性状を要約し
て示せば、第６乃至第８表の通りである。

3.培養方法 これらの微生物の培養は前出各文献に示す通りの常法
によるものであるが、例えばストレプトコッカス属の微
生物とラクトバチルス属の微生物はロゴサ（Rogosa）液
体培地（注１）、ビフィドバクテリウム属の微生物はGA
M液体培地（注２）にて、ストレプトコッカス属及びラ
クトバチルス属は好気的又は嫌気的に、そしてビフィド
バクテリウム属は嫌気的に培養し、得られた培養液を遠
心分離して、その菌体が採集される。

（注１） ロゴサ液体培地の組成 蒸留水１中に トリプチケース 10.0g 酵母エキス 5.0g トリプトース 3.0g K₂HPO₄ 3.0g KH₂PO₄ 3.0g 酢酸ナトリウム^（＊） 1.0g クエン酸三アンモニウム 2.0g ツイーン80 1.0g グルコース 20.0g Ｌ−システイン塩酸塩 0.2g 塩類溶液^（＊＊） 5.0ml （pH7.0,121℃ 15分間 加熱滅菌） （＊） 酢酸ナトリウムはストレプトコッカスの場合は
不要 （＊＊）塩類溶液 蒸留水100ml中に MgSO₄・7H₂O 11.5 g FeSO₄・7H₂O 0.68g MnSO₄・2H₂O 2.4 g （注２） GAM 液体培地組成 GAMブイヨン「日水製薬株式会社」コード05422 59.0g（１分） ペプトン 10.0g ダイズペプトン 3.0g プロテオースペプトン 10.0g 消化血清末 13.0g 酵母エキス 5.0g 肉エキス 2.2g 肝臓エキス末 1.2g グルコース 3.0g KH₂PO₄ 2.5g 塩化ナトリウム 3.0g 溶性デンプン 5.0g Ｌ−システイン塩酸塩 0.3g チオグリコール酸ナトリウム 0.3g （pH7.3±0.1,115℃ 15分間 加熱滅菌） 得られた菌体は生菌体又は加熱処理等による死菌体と
して、いずれもそのまま薬剤として利用することができ
るが、超音波処理等により破壊菌体として利用に供され
てもよい。したがって、本発明に於ける「死菌体」とは
これら破壊菌体の全部又は一部分をも包含するものであ
る。

皮膚用抗菌剤の調製 本発明皮膚用抗菌剤は前記各微生物の各種滅菌処理菌
体又はその水抽出画分を有効成分とするものであるが、
その典型的調整方法の幾つかにつき例示すれば次の通り
である。

1.熱水抽処理 採集された菌体を80〜130℃（より好ましくは100〜12
0℃）、数分〜数時間滅菌を兼ねた加圧乃至非加圧熱水
抽出処理に付し、遠心分離処理等により、水不溶固形分
を除去して目的活性成分である水溶性画分が得られる。
尚、抽出溶媒としては通常の生理食塩水（0.9％NaCl水
溶液等）のみならず、所定pH値に調製された各種緩衝
液、各種塩類溶液、水／アルコール＞1/2（重量比）の
程度の水：アルコール（メタノールとエタノール）混合
溶媒等、各種水性溶媒、水のみも又同様に使用され得
る。

更に採集菌体を前記滅菌熱水抽出処理に付した全体
を、遠心分離等の固形分除去処理に更に付することなく
そのまま凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥粉末等としたも
のも又、本発明皮膚用抗菌剤として有用なものであるこ
とが付言される。

2.滅菌処理 採集菌体を噴霧乾燥等の加熱滅菌処理し、或いは超音
波破壊処理（例えば、15kc,60分）した各種滅菌処理菌
体も又、本発明皮膚用抗菌剤の有効成分として使用され
得る。更に、これら滅菌処理菌体を水抽出処理に付し、
その水溶性成分とし、目的活性画分を得るようにしても
よい。

抗菌活性 1.抗菌活性 後記実験例に示す通り、本発明皮膚用抗菌剤はプロピ
オニバクテリウム属中の瘡症の原因菌となる菌の増殖
を極めて効果的に抑制乃至阻害する。他方、腸内殺菌の
主要乳酸菌（ストレプトコッカス・フェカーリス、同フ
ェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、同サリヴ
ァリウス、同ブレビス、ビフィドバクテリウム・アドレ
センテス、同ブレベ）には実質的に阻害効果を有しない
という選択特異的抗菌スペクトルを示す。

2.毒性 経口では実質的に全然無毒性であり、そのLD₅₀値は熱
水抽出物乃至滅菌体として約5mg/マウス以上であった。

3.使用態様 本発明皮膚用抗菌剤は沐浴剤乃至浴用化粧剤、洗顔
料、日焼け止めクリーム、整髪・頭皮料、口紅・頬紅等
々の各種化粧品、皮膚塗布用組成物として、或いは皮膚
消毒剤に添加されて皮膚疾患改善乃至皮膚保護性塗布粉
末或いはクリーム状の形態で好適に使用され得るもので
あるが、その使用量は処理菌体乃至水抽出物として通常
0.001〜10重量％（乾燥重量換算）程度である。

以下、実験例により本発明をより詳細に説明する。

実験例１ プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacter
ium acnes:1640001,阪大微研菌株保存施設より分与）の
増殖阻害作用 ロゴサ（Rogosa）液体培地或いはGAM液体培地に、生
菌数濃度およそ10⁶/mlとなるように、本発明各乳酸菌を
接種し、好気的或いは嫌気的条件下で15〜24時間37℃で
培養した。培養後、遠心分離により集菌し、集菌菌体を
約10容の生理食塩水に懸濁し、再び集菌する事を２回繰
り返し、洗浄菌体を集めた。これを１容の蒸留水中に懸
濁し、110〜120℃で10〜15分間オートクレーブで加熱し
た。次いで遠心分離を行い、その上清そのまま或いはそ
の凍結乾燥を試料とした。上記、試料を含有するGAMaga
r培地（注）を嫌気状態にして、嫌気下にプロピオニバ
クテリウム・アクネスを約10³接種し培養した。48時間
後の生成したコロニー数をカウントし、試料を含まない
コントロールと比較して抑制率を測定した。その結果を
第９表に示した。

以上の結果より明らかなように、S.フェシウム、S.デ
ュランス、B.アドレセンテスの３種はP.アクネスの増殖
を強力に抑制し、他の６種も増殖を阻害した。

これら９種のうち、特にS.フェシウムAD1005は、コン
トロール（すなわち菌体抽出液のうちの溶媒である水の
み添加群である）はプレート当り441個のP.アクネスコ
ロニーを生ずるのに対し、プレート当り１個とほぼ100
％、P.アクネスの増殖を抑える程の制菌能をも示した。

実験例２ P.アクネス増殖過程に及ぼすストレプトコッカス属の抑
制作用比較 実験例１と同様に調製した試料を含有するGAM液体培
地を嫌気状態にして、嫌気下にP.アクネスを10⁶/ml接種
し培養した。そして、0,6,12,24,30時間後の生菌数（/m
l）を測定した。その結果は第１図に示した。S.フェシ
ウム、S.デュランス、S.エビウム、S.フェカーリスの順
でP.アクネスの増殖を抑制した。S.フェシウムAD1005に
おいては30時間近くの間、P.アクネスの増殖を抑制し
た。そして12〜15時間は０時の数より減少させ、制菌能
をも示した。

ここで省略したが、B.アドレセンテスAD0053にも、S.
デュランスとほぼ同様な結果を示すことをつけ加えてお
く。

実験例３ S.フェシウムAD1005によるプロピオニバクテリウム・ア
クネスの増殖阻害作用 S.フェシウムAD1005について、実験例１と同様に調製
した菌体水抽出液を乾燥菌体重量において３段階濃度別
にしてGAM液体培地に含有させ、実験例２と同様な方法
で行った。その結果を第２図に示した。

図に示す通り、濃度（蛋白量）に比例してP.アクネス
の増殖を抑制し、培養12時間位まで抑制能が著明であっ
た。

抗菌スペクトル 前記各熱水抽出物を添加した常法によりヒト腸内殺菌
（各種乳酸菌及び大腸菌）への影響を試験した結果を下
記第10表に要約して示す。表から、当該熱水抽出物は主
要な腸内殺菌に対して不活性であると認められる。

急性毒性 ICR系マウス（雄６週令、平均体重33.0±0.5g）を
使用し、前記熱水処理抽出物の製法に従って調製した熱
水抽出物をマウス当り９×10⁹、９×10⁸、９×10⁷個の
３段階の出発菌数（各群10匹）に相当量でその生理食塩
水0.5ml懸濁液を腹腔内投与し、14日間マウスの生死を
観察した。

Behreus−Ｋrber法に従って算出したLD₅₀値（mg/マ
ウス）を第11表に示す。尚、連日経口投与、皮膚塗布で
は、いずれの場合でも全然無毒性であった。

ICR系マウス（雄６週令、平均体重30.5±0.6g）を
使用し、前記加熱滅菌体調製例に従って得られた滅菌体
をマウス当り９×10⁹、９×10⁸、９×10⁷個の３段階の
菌体相当（各群10匹）でその生理食塩水0.5ml懸濁液を
腹腔内投与し、14日間マウスの生死を観察した。

Behrens−Ｋrber法に従って算出したLD₅₀値（菌体
個数／マウス）は、いずれの菌にあっても６×10⁹個／
マウス以上（腹腔内投与）であり、且つ経口投与、皮膚
塗布ではいずれの場合でも実質的に全然無毒性であっ
た。

使用例 1.洗顔クリーム 脂肪酸 36 オレイルアルコール 1.5 ラノリン誘導体（E.O.付加物） 1.0 グリセリン 18.0 水酸化カリウム 6.0 本発明水抽出物 0.1− 1.0 香料 0.5 防腐剤 適量 精製水 36 −36.9 100重量％ 2.沐浴剤 ラウリル硫酸トリエタノールアミン 40 ラウリル硫酸ナトリウム ５ ラウロイルサルコシン酸ナトリウム ３ ラウリルイミタゾリンジカルボン酸ナトリウム 10 ラウリル酸ジエタノールアミド ５ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム 0.3 ヘキサメタリン酸ナトリウム １ プロピレングリコール 10 本発明水抽出物 １−5 香料、色素、防腐剤 適量 精製水 31−35 100重量％ 3.液状塗布剤 乳酸エチル 10ml グリセリン ５〜10ml 本発明水抽出物 １〜5g エタノール 全量で100ml 4.軟膏剤 レゾルシン 6g 酸化亜鉛 6g 次硝酸ビスマス 6g 杜松モクタール 2g ミツロウ 10g 黄色ワセリン 27g 精製ラノリン 26g グリセリン 13g 本発明水抽出物 4g

【図面の簡単な説明】

第１図は、P.アクネス増殖過程に及ぼすストレプトコッ
カス属の抑制作用を比較したもので、横軸は培養時間、
縦軸はP.アクネスの生菌数（log/ml）を示す。 第２図は、S.フェシウムAD1005によるP.アクネスの増殖
阻害作用を調べたもので、横軸は培養時間、縦軸はＰア
クネスの生菌数（log/ml）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/74 ＡＤＡ Ｄ 7431−4Ｃ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属
   又はビフィドバクテリア属に属する微生物の菌体及び／
   又は水抽出物を有効成分として含有することを特徴とす
   る皮膚用抗菌剤。
2. 【請求項２】前記微生物がストレプトコッカス・フェシ
   ウム、同デュランス、同エビウム、同フェカーリス、ラ
   クトバチルス・ブレビス、同サリヴァリウス、ビフィド
   バクテリウム・アドレセンテス、同ブレベ、同ロンガム
   であることを更に特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   に記載の皮膚用抗菌剤。