MXPA02006222A - Agente para la anti-adhesion de flora patogena de la piel. - Google Patents

Abstract

Se describe el uso de un agente bacteriano para preparar composiciones que son para el uso cosmetico, farmaceutico o veterinario, y que estan disefiadas para estabilizar y/o regular el ecosistema cutaneo de los mamiferos, dicho agente bacteriano es un extracto de una bacteria o una bacteria, seleccionada por sus propiedades de adhesion con respecto a las celulas de la piel y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patogenos del sistema cutaneo; y las composiciones que contienen tal agente.

Description

AGENTE PARA LA ANTI-ADHESIÓN DE FLORA PATÓGENA DE LA PIEL La presente invención se refiere al uso de un agente bacteriano seleccionado por sus propiedades de anti-adhesión de los patógenos de la piel, para la preparación de las composiciones que son para el uso cosmético, farmacéutico o veterinario, y las cuales están diseñadas para estabilizar y/o regular el ecosistema cutáneo de los mamíferos, y a las composiciones que contienen tal agente.

ESTADO DE LA TÉCNICA La proliferación de patógenos tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o Propi onibacteri um acnés , o de ciertas levaduras, puede conducir a la mala regulación del sistema cutáneo, o incluso a desórdenes más serios de la piel o de las membranas mucosas, tales como eczema, candidiasis, dermatitis, etc. Son conocidos muchos medios de tratamiento contra estos agentes patógenos. Los más convencionales utilizados son los antibióticos o agentes ¡¿^^¿¿¡^^ . +*fjf jtiLtri.*{(l¡^..»**Jl- -???Í, antibacterianos químicos. Éstas son, por ejemplo, composiciones basadas en aldehidos y derivados. De este modo, la solicitud de patente publicada FR 2740039 describe el uso de una sustancia elegida de los aldehidos y los compuestos bifuncionales, preferentemente glutaraldehído, para la inhibición de la adhesión de las cepas de patógenos tales como Staphylococcus aureus a los queratinocitos y corneocitos . De este modo, el hexaclorofeno y sus derivados son conocidos como sustancias antibacterianas y son más particularmente utilizados contra Propionibacteri um acnés . Estos tratamientos son en general caros y dañinos para la salud y el ambiente. Los tratamientos no tóxicos, alternativos, son ahora conocidos, los cuales consisten en utilizar las propiedades antifúngicas, bactericidas o bacteriostáticas de ciertas cepas de microorganismos. De este modo, la solicitud del PCT WO 97/366603 demuestra las propiedades antifúngicas de una cepa de Lactobacillus casei . Otros agentes bacterianos, tales como Bacill us , pueden también ser utilizados sobre la piel o las membranas mucosas. Específicamente, en la {g.Ae±.ú .iAr.ti&réiiA*, solicitud WO 98/47374, cepas de Bacill us coagulans, Bacillus subtili s, Bacillus la terosporus y Bacillus laevolacti cus son utilizadas en composiciones diseñadas para prevenir las infecciones bacterianas, virales o fúngicas de la piel o de las membranas mucosas. La invención propone encontrar un novedoso agente bacteriano capaz de controlar y regular el ecosistema cutáneo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Para este propósito, la presente invención se refiere al uso de un agente bacteriano para la preparación de una composición que es para el uso cosmético, farmacéutico o veterinario, y que está diseñada para ser administrada a los humanos, a los animales para fines de prevenir o tratar desórdenes inducidos por patógenos del sistema cutáneo, siendo dicho agente bacteriano un extracto de una bacteria de ácido láctico, o una bacteria de ácido láctico, seleccionada por sus propiedades de adhesión en las células de la piel y de regulación de la adhesión de los patógenos de la piel, en particular al inhibir su adhesión.

El agente bacteriano puede ser seleccionado de las cepas de Lactobaci llus, Mi crococcus o Bifidobacteri um, y preferentemente de Lactobacillus j ohnsoni i CNCM 1-1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Mi crococcus varians CNCM 1-1587 o Bifidobacteri um lacti s ATCC 27536, por ejemplo. La cepa bacteriana puede ser utilizada en una forma viable, desactivada o semi-activa. El agente bacteriano puede ser utilizado en la forma de un polvo liofilizado, por ejemplo, el cual puede comprender aproximadamente 10 x 108 a 10 x 1011 ufc/g. La presente invención también se refiere a una composición que es para el uso cosmético, farmacéutico o veterinario y que contiene al menos un agente bacteriano capaz de estabilizar y/o de regular la flora patógena en el sistema cutáneo, dicho agente bacteriano es un extracto de una bacteria, o una bacteria, seleccionada por sus propiedades de adhesión a las células de la piel y sus propiedades anti-adhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo. Esta composición puede también ser utilizada en oftalmología o para la aplicación nasal. tofc?ÍA l »MM^;ii.-A»-&&^^ Esta composición puede en particular estar en la forma de una crema, loción, barra de limpieza hipoalergénica, champú o polvo, por ejemplo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Agrupadas conjuntamente bajo el nombre de "sistema cutáneo" están todas las células de la piel (por ejemplo, queratinocitos), pero también los corneocitos. La presente invención proporciona un agente bacteriano seleccionado por su propiedad de adherencia a las células de la piel, y de estabilización y de regulación de la flora bacteriana patógena del sistema cutáneo, en particular al inhibir la adhesión de patógenos tales como Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes o Propionibacteri um acnés , por ejemplo . Para esto, fueron probados muchas cepas bacterianas por sus propiedades de adhesión a los queratinocitos humanos (ver ejemplo 1) . A partir de diversas cepas bacterianas, la cepas de Lactobacillus, de Micrococcus y de Bifidobacterium, y más particularmente una cepa de Lactobacill us j ohnsonii (NCC 533), dos cepas de Mi crococcus varians (NCC 1482, NCC 1520) y una cepa de Bifidobacteri um lacti s (ATCC 27536) pueden ser seleccionadas . Las cepas de Lactobacill us johnsonii (NCC 533) y las cepas de Micrococcus varians (NCC 1482 y NCC 1520) fueron depositadas, de acuerdo al Tratado de Budapest, en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) [National Collection of Microorganism Cultures] , Instituto Pasteur, 28 rué du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, respectivamente el 30 de Junio de 1992 bajo la referencia CNCM 1-1225 para Lactobaci ll us j ohnsoni i , y el 07 de Junio de 1995 bajo las referencias y CNCM (I-1586 y CNCM 1-1587 para Mi crococcus varians NCC 1482 y NCC 1520. La cepa de Bifidobacterium lactis (ATCC 27536) puede ser obtenida de Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alie, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca) . Los detalles concernientes a la morfología y las propiedades generales de las cepas se dan enseguida : Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225 Morfología F *«- .. « Microorganismo Gram-negativo no móvil que no forma esporas . Bastones aislados claramente cortos y regordetes. Metabolismo Microorganismo microaerofílico con metabolismo homofermentativo que da origen a la producción de ácido L(+) y D (-) -láctico . Otras características: Catalasa (-), producción de C02 (-) , hidrólisis de arginina (-) . Fermentación de azúcares: Amigdalina ( + ) , arabinosa (-), celobiosa ( + ) , esculina (+) , fructosa (+) , galactosa (-), glucosa (+), lactosa ( + ) , maltosa ( +/-), manitol (-), mañosa ( + ) , melibiosa (-), rafinosa (+), ribosa (-), salicina (+), sucrosa (+) , trehalosa (+) .

Micrococcus varians CNCM 1-1586 (NCC 1482) y CNCM I-1587 (NCC 15020) Morfología - Microorganismo Gram-positivo, es permanentemente inmóvil . Forma esférica, está en la forma de tetradas irregularmente acomodadas. Metabolismo - Microorganismo aeróbico, catalasa (+) l Jft^<¡^ s&gt^rftj,,a--ba^.

Otras características: color amarillo sobre el medio BHI . La temperatura de desarrollo óptima de dichas cepas es de 25-37°C. Fermentación de azúcares 5 Fructosa (+) , glucosa (+) .

Las bacterias de acuerdo a la invención son utilizadas para la preparación de composiciones diseñadas para la profilaxis o el tratamiento de 10 desórdenes ligados a los patógenos del sistema cutáneo, tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o Propionibacterium acnés , o levaduras, por ejemplo . Estos desórdenes de la piel pueden ser en 15 particular dermatitis atópica (en las fases de remisión, como un tratamiento de mantenimiento), acné, candidiasis, dermatitis seborreica, pitiriasis versicolor, impétigo o infecciones secundarias eczematosas . 20 Los desórdenes del sistema cutáneo pueden también estar ligados a las terapias con antibióticos o agentes antimicóticos a la diabetes (candidiasis) , a una patología de las membranas mucosas (candidiasis vaginal) , eczema crónico (desbalance de la 25 homeostasis), a la piel sensible (bebes prematuros, niños) o piel grasosa (ligada a la mala regulación hormonal que puede promover el desarrollo de bacterias) o a la caspa. Las bacterias de acuerdo a la invención pueden ser utilizadas en su forma viva o semiactiva, o en una forma desactivada. La expresión "bacteria en una forma semi -activada" se pretende que de a entender una bacteria con baja actividad fisiológica. Esta actividad puede ser medida por una fase de crecimiento exponencial más larga o un tiempo de generación más prolongado. Un metabolismo que se ha retardado o una respuesta fisiológica incompleta a las modificaciones del ambiente, por ejemplo. En ciertos casos extremos, el número de bacterias puede ser disminuido ya que éstas ya no pueden resistir el cambio en el ambiente. Se pueden utilizar también sobrenadantes de cultivo bacteriano. De acuerdo a una primera modalidad de la invención, el agente bacteriano puede ser un extracto de una bacteria o una bacteria, estando dicha bacteria en su forma activa viable. El agente bacteriano está entonces preferentemente en la forma de un polvo liofilizado obtenido, por ejemplo, mediante el método descrito en la patente Europea EP 818529. El polvo puede contener 10 x 108 a 10 x 1011 ufc/g. ^ .^¿,?.f,íyi ,y~,.*l^Sái«yy..... -^-->.

De acuerdo a otra modalidad más, el agente bacteriano puede ser un extracto de una bacteria, o una bacteria, en una forma semi-activa. La desactivación parcial de las cepas puede ser llevada a cabo en varias formas, en particular mediante: liofilización, consistente de los ciclos de congelamiento en nitrógeno líquido/descongelamiento a 37°C. Puede ser luego obtenida una disminución de aproximadamente 1 log, - la acción de los rayos UV (15 a 50 minutos a 254 nm, distancia 20 cm) ; disminución de 2 a 3 logs, la acción del calor (70°C por 3 horas) ; disminución de aproximadamente 3 a 4 logs, por ejemplo.

El agente bacteriano puede ser luego utilizado en la forma de un polvo que contiene al menos 10 x 106 ufc/g, y preferentemente en composiciones anhidras, tales como champúes anhidros u otras composiciones en polvo, que pueden contener hasta 10% del extracto bacteriano. Finalmente, el agente bacteriano puede también ser un extracto de una bacteria, o una bacteria, en una forma desactivada. La bacteria es preferentemente inactivada por tratamiento con calor, aproximadamente a 90°C por aproximadamente 2 horas. El agente bacteriano está en la forma de un polvo liofilizado que contiene de 10 x 108 a 10 x 1012 ufc/g. Éste puede ser utilizado hasta 5%, y preferentemente de 0.05 al 3%, en composiciones líquidas y hasta del 10% en composiciones pulverulentas. La presente invención también se refiere a una composición que es para el uso cosmético, farmacéutico o veterinario y que contiene un agente bacteriano que tienen las propiedades como se describen anteriormente. Con el fin de preparar tal composición, al menos una cepa bacteriana en forma viable, en forma semi-activa o desactivada es incorporada en un soporte farmacéutica o cosméticamente aceptable en una cantidad que varía como una función del uso deseado. El agente bacteriano puede estar presente hasta en aproximadamente 5% con respecto al peso total de la composición y hasta en 10% para las composiciones en la forma de un polvo, y preferentemente a entre 0.5 a 2%. Las composiciones de acuerdo a la invención pueden ser administradas vía la ruta tópica u ocular. Vía la ruta tópica, las composiciones farmacéuticas basadas en los compuestos de acuerdo a la invención están preferentemente diseñados para el tratamiento de la piel y las membranas mucosas, y pueden estar en la forma de bálsamos, de cremas, de leches, de ungüentos, de polvos, de estropajos humedecidos, de soluciones, de geles, de rocíos, de lociones o de suspensiones. Éstas pueden estar también en la forma de microesferas o nanoesferas, o de vesículas lipídicas o poliméricas, o de parches poliméricos o de hidrogeles, que permiten la liberación controlada. Estas composiciones para la administración vía la ruta tópica pueden estar ya sea en la forma anhidra o en la forma acuosa, dependiendo de la indicación clínica. Vía la ruta ocular, éstas son principalmente lavados oculares. En una modalidad preferida, la invención se refiere a una composición cosmética que contiene, en un soporte cosméticamente aceptable, al menos un agente bacteriano como se define anteriormente. La composición cosmética puede contener el agente bacteriano en una proporción de al menos 0.001% en peso con respecto al peso total de la composición, y preferentemente de 0.05 a 3%. Esta composición cosmética está en particular diseñada para la higiene corporal y del pelo. Esta puede estar en particular en la forma de una crema, una leche, una loción, un gel, microesferas o nanoesferas, o de vesículas lipídicas o poliméricas, un jabón o un champú . En las composiciones de acuerdo a la invención, el agente bacteriano viable o inactivado puede ser combinado con retinoides o corticosteroides, o combinados con agentes anti-radicales libres, con a- hidroxi o a-ceto-ácidos o sus derivados, o con bloqueadores de los canales de iones. Las composiciones farmacéuticas y cosméticas de acuerdo a la invención pueden también contener aditivos inertes o incluso aditivos farmacodinámicamente o cosméticamente activos, o combinaciones de estos aditivos, y en particular: agentes humectantes, agentes de despigmentación tales como hidroquinona, ácido azelaico, ácido cafeico, o ácido kójico,- emolientes; agentes humectantes tales como glicerol; PEG-400, tiamorfolinona y sus derivados, o urea; agentes anti-seborreicos o anti-acné, tales como S-carboximetilcisteina, S-bencilcisteamina, sus sales y sus derivados, o peróxido de benzoilo; antibióticos tales como eritromicina y sus esteres, neomicina, clindamicina y sus esteres; tetraciclinas ; agentes antifúngicos tales como ketoconazol o 4,5- polimetilen-3-isotiazolinonas ; agentes para promover el nuevo desarrollo del cabello, tales como Minoxidil 3- óxi'do de (2 , 4 -diamino-6-piperidinopirimidina) y sus derivados, Diazóxido (1,1-dióxido de 7-cloro-3 -metil-1 , 2 , 4-benzotiadiazina) , y Fenitoina (5,4-difenilimidazolidin-2 , 4 -diona) [sic]; agentes anti-inflamatorios no esteroides, carotenoides y, en particular, ß-caroteno; agentes anti-psoriáticos tales como antralina y sus derivados; y finalmente, ácido eicosa-5 , 8 , 11 , 14 - tetrainoico y ácido eicosa-5 , 8 , 11 -trinoico, sus esteres y amidas. La composición de acuerdo a la invención puede también contener agentes conservadores tales como los esteres del ácido para-hidroxibenzoico, estabilizadores, reguladores de la humedad, reguladores de pH, modificadores de la presión osmótica, agentes emulsificantes, agentes de filtro de UV-A y UV-B, y antioxidantes tales como a-tocofenol, butilhidroxianisol o butilhidroxitolueno . Finalmente, la presente invención también se refiere a una composición que es para el uso veterinario o cosmético para animales, y que contiene al menos un agente bacteriano como se define anteriormente. Tal composición puede ser en la forma de champúes anhidros o líquido, polvos, espumas o lociones, por ejemplo. Ésta puede contener hasta el 10% del agente bacteriano. , .Í.tA¿J.j...i--.1.-«»J i, .J.^J-.fa«*..-fc.--^---fa»»-i ..--^-ju,,¿ aajt?a¡¡4£ La composición de acuerdo a la invención está diseñada en particular para el tratamiento terapéutico o profiláctico de membranas de la piel y/o mucosas saludables, sensibles y/o enfermas, las cuales pueden mostrar desórdenes del sistema cutáneo, tales como en particular : complicaciones infecciosas, tales como dermatitis atópica superinfectada, eczema basado en impétigo, úlceras, heridas, quemaduras, acné inflamatorio superinfectado, dermatitis tales como impétigo, foliculitis superficial , dermatitis seborreicas, pitiriasis versicolor, dermatofitosis (Tinea capitis, Tinea corporis, pie de atleta, eczema de hebra, herpes carcinatus) , candidiasis (vaginal, interdigital, ligada a profesiones en riesgo o a diabetes) , desórdenes ligados a las terapias con antibióticos o a los agentes antimicóticos , - desórdenes provocados por mala regulación hormonal (piel grasosa) o a la caspa [sic] , piel sensible (bebes prematuros, niños) .

Las composiciones para el uso veterinario están particularmente diseñadas para tratar o prevenir disfunciones debidas a las infecciones por estafilococos (debido a Staphylococcus aureus, S . in termedians) , infecciones estreptocócicas (debidas a S . pyogenes) e infecciones micóticas (candidiasis debidas a C. albi cans y pitirosporosis debidas a P. Canis) . Otras características de la presente invención aparecerán en el curso de las siguientes descripciones de los ejemplos de las modalidades, que se proporcionan para fines de ilustración de la presente invención, y que no se pretende que sean limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Selección del agente bacteriano En el contexto de la presente invención, la adhesión de 12 diferentes cepas bacterianas a las células de la piel, en particular a los queratinocitos humanos HaCat en cultivo, es estudiada. Estas cepas pertenecen a los géneros Lactobaci ll us, Bifidobacterium, Micrococcus, Staphylococcus , Streptococcus y Propionibacterium . Los cultivos bacterianos (1 ml) son incubados en 10 ml de medio (ver Tabla 1) toda la noche. Para los ensayos de adhesión, las bacterias son precultivadas hasta que se obtiene una concentración de 5.0 x 108 a 109 ufc/ml. La ufe son estandarizadas por la medición de la densidad óptica de cada cepa (OD a 108 ufc/ml: ver tabla 1). Luego, las cepas bacterianas son evaluadas para sus propiedades de adhesión.

Tabla 1 : Cepas bacterianas y condiciones de cultivo NCC 533, NCC 90, NCC 536 y NCC 585 fueron cultivadas bajo condiciones anaeróbicas (Gaspac H2 + C02) - LÍNEAS DE QUERATINOCITOS HUMANOS: Las propiedades de adhesión de las bacterias fueron estudiadas sobre 3 líneas de queratinocitos: líneas celulares inmortalizadas SV40 T-Ag: células DK2-NR y FK2-NR como se describen en EP 780 469 y, HPV (virus de papiloma humano) líneas de células inmortalizadas E6/E7 y SV40 T-Ag: líneas celulares de DK7-NR como se describen en la solicitud WO 99/02347.

Medios de cultivo para las líneas celulares: DK7-NR, FK2-NR: NR-2 (Biofluids, Rockville, MD 20850) (EP 780469) . DK2-NR: NR-M (Biofluids, Rockville, MD 20850) . Las líneas de queratinocitos son cultivadas en una proporción de 5 x 105 de queratinocitos/cm2, sembradas en cúmulos de 6 pozos recubiertos (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) . La solución de recubrimiento consiste de medio básico suplementado con 10 µg/ml de fibronectina humana (Becton Dickinson) , 31 µg/ml de colágeno bovino I (vitrogen, Collagen Corporation, Fremont, CA) y 0.1 mg/ml de BSA (Biofluids, Rockville MD 20850) . Después de 6 a 8 días, los cultivos celulares forman una monocapa (confluente) . Enseguida, la concentración de Ca2+ del medio se lleva hasta 1.5 mM para inducir la diferenciación celular. Las células son cultivadas por 4 días en un medio con alta concentración de calcio, sin antibióticos. Para los ensayos de adhesión, los ^^.^MÉ-i-í.„a-j-8»¿ cultivos celulares son lavados 3 veces con amortiguador (HBSS, Ca2+: 1.0 mM) . RADIOMARCACIÓN Las cepas bacterianas son marcadas toda la noche mediante la adición de 100 µCi/10 ml de 2-3H-adenina (Amersham, TRK.311) al medio de cultivo. Fracciones de alícuota de la bacteria son incubadas en un medio con 3H-adenina. El sobrenadante no marcado (frío) es apartado con el fin de ajustar las ufc/ml para los ensayos de adhesión.

ENSAYOS DE ADHESIÓN Las suspensiones obtenidas son centrifugadas por 10 minutos a 4000 rpm. Antes de ajustar la densidad óptica (DO) , los concentrados son lavados dos veces en HBSS. La DO es medida para cada cepa para ajustar las concentraciones finales de las bacterias a 106, 107, 108 y 109 ufc/ml. El medio para los ensayos de adhesión es una mezcla de 1:1 de medio de cultivo de queratinocitos y del sobrenadante no marcado del medio bacteriano . Con el fin de analizar las propiedades de adhesión de la bacteria sobre un sustrato sin queratinocitos, las suspensiones bacterianas son incubadas sobre cajas de plástico y cajas de plástico recubiertas con células.

ANÁLISIS Después del lavado de los cultivos 3 veces con HBSS (Ca2+, 1.0 mM) , la bacteria asociada con los queratinocitos son lisadas en una solución de hidróxido de sodio ÍN por 30 minutos a temperatura ambiente. La solución es transferida a frascos de cintilación con 1 ml de hidróxido de bencetonio (Sigma, St . Louis, EUA) . Después de 1 h a 60°C, la actividad de 3H de las bacterias marcadas es medida mediante el conteo de cintilación líquida (dpm) . El índice de adhesión (AI) es calculado como la actividad de 3H (dpm/pozo) , como el de la actividad de 3H total (dpm/ml) de la suspensión bacteriana .

RESULTADOS ÍNDICE DE ADHESIÓN (AI) li^í¡ÍÍ^É¿^ií^ El índice de adhesión de las 13 diferentes cepas bacterianas es calculado mediante la medición de la actividad 3H-adenina de los microorganismos radiomarcados. Los resultados se dan en la tabla 2.

Tabla 2 : índice de adhesión de las cepas bacterianas de los queratinocitos FK2-NR Los resultados muestran que los más altos índices de adhesión son obtenidos para las siguientes cepas: una cepa de Bifidobacterium lactis ATCC 27536, Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM 1-1225) y el ., - Mi crococcus varians NCC 1482 (CNCM 1-1685) , NCC 1520 (CNCM 1-1587) y NCC 1583.

Ejemplo 2 : Ensayos in vi tro de la inhibición de la adhesión de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes por Mi crococcus varians NCC 1482 o Lactobacillus johnsonii NCC 533.

MICROORGANISMOS Y MÉTODOS DE CULTIVO Los patógenos Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes son cultivados en caldo mediante subcultivo a partir de un cultivo en la fase de crecimiento exponencial (Tabla 3). Una correspondencia de OD/densidad bacteriana fue establecida para cada uno de los microorganismos evaluados, con base en las diluciones en cereal y el conteo sobre medio de agar.

Tabla 3 Medio de cultivo: TCS (AES, Combourg, ref. AEB 141502) BHI (UNIPATH SA, Dardilly, ref. CM 225) QÜERATINOCITOS HUMANOS TRANSFORMADOS Los queratinocitos humanos inmortalizados de la línea HaCaT son utilizados (Boukamp P. y colaboradores, J. Cell Biol . . 106, 761-771, 1988). Las células HaCaT son cultivados en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera, a 37°C bajo 5% de C02. Cúmulos de 6 pozos (Becton Dickinson) son sembrados en una proporción de 104 células/cm2. Después de 4 a 5 días, las células alcanzan la confluencia. Los ensayos de adhesión son llevados a cabo 4 a 5 días después de la confluencia. Las monocapas son lavadas 3 veces con PBS antes de estos ensayos .

RADIOMARCACION Las bacterias son marcadas con 2-3H-adenina (Amersham, TRK 311) , en una proporción de 100 µCi/10 ml de caldo. Las suspensiones se lavan 3 veces y luego se •-«*»—"- ..-»---««-* resuspenden en PBS. La densidad celular es ajustada en este mismo amortiguador.

ENSAYO DE ADHESIÓN SOBRE QUERATINOCITOS EN CULTIVO 1 ml de suspensión bacteriana radiomarcada se incuba por 1 h a 35°C. La monocapa se lava 3 veces con amortiguador de PBS y se lisan mediante la adición de hidróxido de sodio ÍN por 30 minutos a temperatura ambiente. El lisado se transfiere a un frasco de cintilación y se incuba por 1 h a 60°C con 1 ml de hidróxido de hiamina (Cario Erba, ref. 464951) . La actividad de 3H es contada en un contador de cintilación líquida. Cada ensayo es llevado a cabo por triplicado. Se lleva también a cabo un control con el soporte de plástico. La adhesión es definida por la proporción entre la radioactividad que se ha adherido y la radioactividad que fue introducida, multiplicada por 100.

ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA ADHESIÓN Después del lavado y la resuspensión en PBS, el patógeno radiomarcado y la cepa bacteriana fría se i J^Jatí^áUk'M?fi?á incuban simultáneamente con la monocapa. Los ensayos son llevados a cabo por triplicado para densidades de agente bacteriano que cubren 3 logs .

RESULTADOS Staphylococcus , aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus jahnsonii NCC 533 y Micrococcus varians NCC 1482 fueron evaluados para su adhesión a los queratinocitos HaCaTen en cultivo. Los resultados se dan en la Tabla 4.

Tabla 4 Los resultados muestran que Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus johnsonii NCC 533 y Mi crococcus varians NCC 1482 se adhieren a los queratinocitos en cultivo. Cuando la densidad del agente bacteriano se incrementa, el patógeno es desplazado cada vez más.

Ejemplo 3 : Ensayos in vi tro de la inhibición de la adhesión de S . aureus por Lactobacil l us j ohnsoni i NCC 533 activo o desactivado El modelo de adhesión in vi tro está basado en la incubación de una suspensión radiomarcada y calibrada de un microorganismo patógeno para la piel ( Staphylococcus aureus) con una monocapa de queratinocitos humanos inmortalizados (línea HaCaT) (Boukamp P. Y colaboradores, J. Cell Bi ol . , 106, 761- 771, 1988) . La actividad inhibitoria del agente bacteriano ( Lactobacill us johnsoni i NCC 533 en una forma viable o desactivada) con respecto a esta adhesión, es evaluada en el contexto de una co-incubación, sobre la monocapa, del patógeno y del compuesto que va a ser evaluado, mediante la medición de la radioactividad retenida sobre la monocapa.

QUERATINOCITOS Para esto, las células HaCaT son cultivadas en DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera, a 37°C bajo 5% de C02. Éstas se siembran en cúmulos de grupos de 6 pozos en una proporción de 104 células/cm2. El ensayo de adhesión se lleva a cabo 5 días después de la confluencia. Las monocapas son lavadas 3 veces con PBS antes de la incubación con los microorganismos.

MICROORGANISMOS Staphylococcus aureus (ATCC 6538) se cultiva en medio TCS, en aerobiosis a 35°C. Lactobacill us johnsoni i NCC 533 se cultiva en medio MRS, en anaerobiosis a 37°C. Para el ensayo de inhibición de la adhesión, una suspensión concentrada de la bacteria se prepara en amortiguador de PBS, a partir de un cultivo de 48 horas. La suspensión se ajusta a 2 x 108 ufc/ml (OD a 525 nm = 1.5). Se preparan diluciones en serie en el amortiguador PBS con el fin de obtener suspensiones a 2.0 x 107 y 2.0 x 106 ufc/ml. Las diversas suspensiones son contadas sobre agar MRS incubadas en anaerobiosis a 37°C. La forma desactivada de NCC 533 es obtenida mediante la liofilización de una suspensión densa de Lactobacilos que ha sido sometida a varios ciclos de congelamiento en nitrógeno líquido/descongelamiento a temperatura ambiente. La preparación evaluada corresponde a una biomasa de 4.0 x 1010 ufc/g.

RAD OMARCACION La radiomarcación de Staphylococcus aureus es obtenida mediante la incorporación de 100 µCi/10 ml de adenina 3H durante 24 h de cultivo en caldo TCS. La suspensión es luego centrifugada por 10 minutos a 3000 rf\-rX ---t^«*-«gfa- rprn y lavada 3 veces en PBS. La densidad celular es ajustada con amortiguador de PBS a aproximadamente a 2.0 x 108 ufc/ml (OD a 525 nm = 0.5). La radioactividad específica es determinada mediante conteo de cintilación sobre 100 µl de la suspensión.

ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA ADHESIÓN: 1 ml de suspensión radiomarcada de Staphylococcus aureus y 1 ml de suspensión de NCC 533, por pozo de cultivo de células HaCaT, se agregan simultáneamente. Después de 1 h de incubación a 37°C, las monocapas se lavan 3 veces con amortiguador de PBS y se lisan mediante la adición de 1 ml de hidróxido de sodio ÍN por 30 minutos a temperatura ambiente. El lisado se transfiere a frascos de cintilación y se incuban por 1 h a 60 °C con 1 ml de hidróxido de bencetonio. Después del enfriamiento, se agregan 10 ml de líquido de cintilación de flúor Hyonic, y la radioactividad se cuenta en un contador de cintilación líquida. El control es obtenido mediante la adición de 1 ml de suspensión radiomarcada de Staphylococcus aureus y 1 ml de amortiguador de PBS, y corresponde a 100% de adhesión. Los resultados se dan en la Tabla 5.

Tabla 5: Inhibición de la adhesión de Staphylococcus aureus a las células HaCaT por NCC 533 en su forma viable y en su forma desactivada.

Ejemplo 4 : Ensayos in vivo de la inhibición de la adhesión de patógenos de piel por Lactobacillus johnsonii desactivado MATERIALES Y MÉTODOS ANIMALES : 15 ratones hembra SKH de 7 a 8 semanas de edad que pesaban aproximadamente 30 g, fueron suministrados por C. River. 5 ratones fueron utilizados para cada grupo evaluando una aplicación tópica diferente.

MICROORGANISMO Una cepa de Staphylococcus aureus (llamada: cepa 1) que se aisló de una lesión de piel humana (úlcera de pierna), es utilizada. Esta capa es sensible a la meticilina.

PREPARACIÓN DEL INOCULO Se prepara una suspensión de bacteria para la inoculación de los ratones. Para esto, se prepara en precultivo en la fase de crecimiento exponencial de la cepa 1 sobre un medio sólido (AES, AEB 122 859) a 35°C por 18 a 24 horas. Después de la incubación, la bacteria resuspendida en 10 ml de solución salina estéril y luego recubierta después de la centrifugación a 3000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante es luego removido y el botón o concentrado se recoge con 10 ml de solución salina. Este procedimiento se repite dos veces. Se prepara una suspensión de inoculo mediante la resuspensión de las bacterias lavadas en 4 ml de solución salina estéril. La DO a 525 nm es ajustada a aproximadamente 0.14. Ésta contiene aproximadamente 108 ufc/ml.

INOCULACIÓN DE LOS RATONES La piel de los ratones es deslipidizada sobre los flancos con etanol al 95% (Merck) . 50 µl de una suspensión que contiene una mezcla de 50/50 de inoculo de S . aureus , 107 ufc/ml, y el producto que va a ser evaluado, fueron lentamente aplicados al área deslipidizada (6.25 cm2) , utilizando una micropipeta. Los sitios inoculados son protegidos por oclusión por 1 hora bajo un aposito de plástico estéril (Dermafilm 33 x 15, ref. 38.3015, Vygon laboratory).

CONTEO DE LAS BACTERIAS VIABLES DE LAS LESIONES 4 horas después de la aplicación de la suspensión, los ratones son sacrificados bajo anestesia con foreno (Abbott France) . Los sitios inoculados son extirpados como un bloque (12 mm de diámetro) . Las biopsias de piel removidas son trituradas y homogenei zadas con 2 ml de solución salina estéril, utilizando un Polytron (PT 2100, Bioblock Scientific) 5 rpm, 5 min. ) . Una muestra de 1 ml del tejido homogeneizado se agrega a 9 ml de una solución salina estéril, y 0.1 ml de esta mezcla se cultiva en un medio estafilococos No. 110 utilizando el método de dilución a 1 décimo. Después de 48 horas de incubación a 35°C, las colonias desarrolladas se cuentan y se determinan las UFC (unidades formadoras de colonia) .

RESULTADOS Los resultados se dan en la Tabla 6.

Tabla 6: Ensayo de NCC 533 al 1% Log ufc/cm2 s. aureus + PBS 3.4 s. aureus + 1% NCC 533 en PBS 2.6* s. aureus + 0.045% glutaraldehído 0.8* * significativo con respecto al control (SA/PBS) , prueba T de Student (n = 5) La presencia de NCC 533 al 1% hace posible disminuir el número de bacterias encontradas por aproximadamente 1 log después de 4 horas de contacto. La diferencia parece ser significativa con respecto al control (p = 0.098) . En presencia del glutaraldehído, la disminución en el número de bacterias es aún más significativa con respecto al control, no obstante, no está fuera de cuestión que esta actividad sea debida a su actividad antiséptica, y actúa tan pronto como S . aureus es agregado a la mezcla; de este modo, la actividad observada después de 4 horas podría no ser debida a un efecto anti-adhesivo, sino una actividad antibacteriana del producto. Los resultados se dan en la Tabla 7.

Tabla 7 * p<0.05, ***p<0.001 significante con respecto al control (SA/PBS) La presencia de NCC 533 al 0.5% y 1% disminuye el número de bacterias S . aureus encontradas por aproximadamente 1 log para los inóculos 106 ufc/ml y 107 ufc/ml . No se observa efecto de dosis, ya sea con el inoculo de 106 ufc/ml o con el inoculo de 107 ufc/ml. En presencia de glutaraldehído al 0.045%, la disminución es mucho mayor con respecto al control; ésta es de aproximadamente 3 logs. Estos resultados confirman la actividad de la NCC 533 desactivada, al 0.5% y al 1% con un inhibidor de la adhesión de S . aureus .

Ejemplo 5 Loción corporal Se prepara una loción corporal que tiene la siguiente composición: 8.0% de aceite mineral, 5% de palmitato de isopropilo, 2.0% de diisoestearato de poliglicerilo-3 , 4% de octildodecanol , 0.3% de carbómero, 0.2% de cocoilglutamato de sodio, 1.2% de hidróxido de sodio al 10%, un agente conservador, fragancia, 0.5 a 3% de un liofilizado que contiene de 10 x 108 a 10 x 1012 ufc/g de al menos una cepa bacteriana elegida de Lactobacill us j ohnsoni i (CNCM I-1225), Mi crococcus varians (CNCM 1-1586 O CNCM i-1587) o bifidobacteri um lacti s (ATCC 27536, Hansen) y se inactiva mediante tratamiento con calor a aproximadamente a 90°C por aproximadamente 2 horas. La mezcla se afora hasta el 100% con agua. La loción corporal obtenida de este modo está diseñada, debido a sus propiedades anti-adhesión con respecto a los patógenos, para estabilizar y/o regular la flora patógena de la piel.

Ejemplo 6: Champú Se prepara un champú que tiene la siguiente composición: 7.0% de laurilsulfato de sodio, 2.0% de »«j«__-.|* i,.,..¿.ttfcA. -J..*. cocamidopropilbetaina, 2.0% de laurilsulfonosuccinato de sodio, cloruro de sodio, agente conservador, fragancia y 0.5 a 3% de liofilizado que contiene 108 a 1012 ufc/g de al menos una cepa bacteriana elegida de Lactobacill us johnsonii (CNCM-1225), Mi crococcus varians (CNCM 1-1586 o CNCM 1-1587) o Bifidobacterium lacti s ATCC 27536, y se inactiva mediante tratamiento con calor a aproximadamente 90 °C por aproximadamente 2 horas. La mezcla se afora hasta 100% con agua. El champú preparado de este modo tiene las propiedades que regulan la flora patógena del cuero cabelludo. Éste es en particular indicado en el tratamiento de la caspa.

Ejemplo 7 Con el fin de obtener una composición farmacéutica con propiedades que regulen la flora patógena de la piel, las fases acuosa y grasosa son preparadas, teniendo la siguiente composición: L. johnsonii (CNCM 1-1225) Como se describe en el Ejemplo 5 1% ?.fy??UUJmti t?uea Fase grasosa: Alcohol araquidil-behenílico / araquidilglucósido 3% Isohexadecano 7% Aceite de almendras dulces 3% Manteca de karite 2% B.H.T. 0.05% Propil POB 0.05% Fase acuosa: Agua Cbp 100% Glicerol 5% Metil POB 0.1% Las fases grasosas y acuosas se calientan a 75°C. Luego, se lleva a cabo la emulsificación al agregar la fase acuosa a la fase grasosa con mezclado de Rayneri a 1000 rpm. 30 minutos después de la emulsificación, la mezcla se homogeniza por 1 minuto con un politrón (velocidad 4-5) .

Ejemplo 8 De la misma manera que en el Ejemplo 7, se prepara una composición que tiene la siguiente composición: L. johnsonii (CNCM 1-1225) ?^ ? ±¿d»^-L Juf* .».¿..

Como se describe en el Ejemplo 5 1% Fase grasosa : Estearato de glicerilo y estearato 5% de PEG 100 Isohexadecano 8% Manteca de karite 5% B.H.T. 0.05% DC 1503 1% Fase acuosa: Agua cbp 100% Glicerol 3% Carbopol 981 0.2% Lubrajel 5% Fenoxietanol 1% Hidróxido de sodio cbp pH 6 Ejemplo 9 De la misma manera que en el ejemplo 7, se prepara una composición que tiene la siguiente composición: L. johnsonii (CNCM 1-1225) Como se describe en el Ejemplo 5 1% Fase grasosa: Diisoestearato de poliglicerilo-3 5% Ciclometicona CM5 20% Fase acuosa: Agua cbp 100% iHÜit luí nMÜtÉfíi liiltf ?? ?? 1 1 inn ffriiíi Glicerol 5% NaCl 0 . 5% MgS04 0 . 5% Ej emplo 10 : Champú para mascotas Se prepara un champú para mascotas que tiene la siguiente composición: 5% de laurilsulfato de sodio; 2% de cocamidopropilbetaina, 2% de laurilsulfonosuccinato de sodio, 2% de cloruro de sodio, 1.5% de glicerilcocoato de PEG-7, 0.75% de propilenglicol, pantenol, glicerol, fosfato disódico, agente conservador, fragancia y 1% de L. johnsonii (CNCM 1-1225) como se describe en el Ejemplo 5. La mezcla se afora hasta 100% con agua. El champú preparado de este modo tiene propiedades que regulan la flora patógena del sistema cutáneo de las mascotas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente bacteriano para preparar composiciones para el uso cosmético, farmacéutico o veterinario, y que están diseñadas para ser administradas a humanos o a animales para fines terapéuticos o profilácticos de estabilización y/o regulación de la flora patógena del sistema cutáneo, el agente bacteriano es un extracto de una bacteria, o una bacteria, seleccionada por sus propiedades de adhesión a las células de la piel y sus propiedades antiadhesivas con respecto a los patógenos del sistema cutáneo .

2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en el cual el agente bacteriano se selecciona de las especies de Lactobacill us , Mi crococcus o Bif i doba c t eri u .

3. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el cual el agente bacteriano se selecciona de las cepas Lactobaci ll us johnsoni i CNCM 1-1225, Mi crococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 o Bifidobacterium lactis ATCC 27536.

4. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , en el cual la bacteria es una forma viable, semi-activa o desactivada.

5. Uso de conformidad con la reivindicación 4, en el cual la bacteria es desactivada mediante tratamiento con calor a 90°C por 2 horas.

6. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el agente bacteriano en forma liofilizada contiene de 108 a 1011 ufc/g.

7. Composición que es para el uso cosmético, farmacéutico o veterinario, y la cual contiene al menos un agente bacteriano capaz de estabilizar y/o de regular la flora patógena del sistema cutáneo, el agente bacteriano es un extracto de una bacteria, o una bacteria, seleccionada por sus propiedades de adhesión a las células de la piel y sus propiedades antiadhesivas a los patógenos del sistema cutáneo.

8. Composición de conformidad con la reivindicación 7, en la cual el agente bacteriano es elegido de las especies de Lactobacillus, Micrococcus o Bif i doba cterium.

9. Composición de conformidad con las reivindicaciones 7 y 8, en la cual el agente bacteriano se selecciona de las cepas de Lactobacillus johnsonii CNCM I- 1225, Micrococcus varians CNCM 1-1586, Micrococcus varians CNCM 1-1587 o Bifidobacterium lactis ATCC 27536.

10. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la cual la bacteria es una forma viable, semi-activa o desactivada.

11. Composición de conformidad con la reivindicación 10, en la cual la bacteria es desactivada mediante tratamiento con calor a 90 °C por 2 horas.

12. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en la cual contiene hasta 10% en peso del agente bacteriano con respecto al total de la composición.

13. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 , que contiene aproximadamente -y ..yy..y.. ^.-.t?.?l- ii.\,í-Mi¿?mMi£?íiii 0.05 a 5% en peso del agente bacteriano con respecto al peso total de la composición.

14. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, diseñada para el tratamiento o para la profilaxis de desórdenes de la piel tales como: complicaciones infecciosas tales como dermatitis atópica superinfectada, eczema basado en impétigo, úlceras, heridas, quemaduras, acné inflamatorio superinfectado; dermatitis tales como impétigo, foliculitis superficial; dermatitis seborreica, pitiriasis versicolor; dermatofitosis, candidiasis, aquellas ligadas a terapias con antibióticos o a agentes antimicóticos; aquellas provocadas por mala regulación hormonal o a la caspa.

15. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, diseñada para ser aplicada a la piel sensible o la piel grasosa.

16. Composición para uso veterinario de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, diseñada para el tratamiento o para la prevención de disfunciones ligadas a infecciones por estafilococos, estreptococos e infecciones micóticas en animales.