NL195078C - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- NL195078C NL195078C NL8800610A NL8800610A NL195078C NL 195078 C NL195078 C NL 195078C NL 8800610 A NL8800610 A NL 8800610A NL 8800610 A NL8800610 A NL 8800610A NL 195078 C NL195078 C NL 195078C
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- ida
- lda
- cells
- tumor
- mice
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
1 195078
Antracycline-antilichaam conjugaten
De uitvinding heeft betrekking op een conjugaat van een antracycline en a) een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor een menselijk neoplasma antigeen of specifiek is voor een oppervlakte-antigeen van 5 een T-lymfocytcel of b) een ten minste één van de antigeen-bindplaatsen van het monoklonaal antilichaam bevattend fragment daarvan waarbij het monoklonaal antilichaam of fragment daarvan aan het koolstof-atoom op de plaats-14 van het antracycline gekoppeld is.
Een dergelijk conjugaat is bekend uit Gallego et al., Int. J. Cancer, 1984, 33, 737-744. Gallego et al. beschrijven verschillende procedures voor het koppelen van daunorubicine via verschillende posities in het 10 antracycline molecuul aan een antilichaam. Een van de posities waaraan koppeling plaatsvindt is het koolstofatoom op plaats-14 in daunorubicine. Getoond wordt dat de koppeling tussen daunorubicine en antilichaam een aminebinding is. Ter bereiding van zulk een conjugaat werd door Gallego et al. een monoklonaal antilichaam in een fysiologische zoutoplossing in een hoeveelheid van 5 mg/ml gemengd met een 25-voudige molaire overmaat aan 14-broomdaunorubicine in methanol (in een hoeveelheid van 10 15 mg/ml) bij een pH = 7,4-7,5 gedurende 4 uren. Het verkregen conjugaat gaf na 72 uren bewaren bij 37°C en een pH = 7 geen daunorubicine af; na langdurig bewaren bij een pH = 5 of minder werd daunorubicine afgegeven.
Het idee om antineoplastische middelen met behulp van monoklonale antilichamen (MA) op tumoren te richten is bekend en de therapeutische betekenis daarvan wordt thans onderzocht. Deze benadering komt 20 neer op het bereiden van conjugaten van antilichamen en een giftig middel, welke selectief tumorcellen kunnen lokaliseren en beschadigen. Veel aandacht wordt daarbij besteed aan het opbouwen van immuno-toxinen van.A-ketens van plantaardige en bacteriële toxinen en antilichamen, zodanig dat de binding daarvan aan het antigeen en de internalisering leidt tot celsterfte. In praktijk zijn vele MAen, die worden verondersteld specifiek te zijn voor tumoren, ook reactief met subpopulaties van normale cellen en daarom 25 zou het wel eens weinig zinvol kunnen zijn om dergelijke sterke toxinen toe te passen wegens hun potentiële schade aan normaal weefsel. Een veiliger alternatief voor plantëtoxinen is het koppelen van antilichamen aan gangbare kankerbestrijdende geneesmiddelen zoals doxorubicine, Vindesine, Chlorambucil, Melphalan en Methotrexaat. In verband met de niet-specifieke toxische effecten van de thans gebruikte antineoplastische middelen tracht men de therapeutische toepasbaarheid daarvan te verhogen door 30 koppeling met MAen voor tumor-antigenen.
Pogingen om de afstoting van transplantaten door van de thymus afkomstige T-cellen te onderdrukken worden tot nu toe vaak gericht op het verlagen van de activiteit van T-cellen door middel van antithymocyt-globuline. De laatste tijd is het met de ontwikkeling van monoklonale antilichamen mogeljjk geworden deelverzamelingen van T-cellen vast te stellen afhankelijk van hun functie in vitro en van de aanwezigheid 35 van specifieke door de antilichamen geïdentificeerde oppervlakte-antigenen. Dit heeft het zoeken naar een mechanisme volgens welk T-cellen de afstoting van transplantaten regelen bevorderd, waarbij veel aandacht wordt besteed aan de belangrijke verdeling in assisterende/inducerende en cytotoxische/onderdrukkende onderverzamelingen die. worden gekenmerkt door de L3T4 en Ly-2 muizenantigenen. Hoewel het ΟΚΓ3 MA, een anti-pan T-celreagens, in vivo bruikbaar bleek, werd onlangs gevonden dat 20 MAen tegen 20 40 verschillende muizenlymfocyt-antigenen in vivo bij muizen zonder effect waren en daarom nutteloos zijn voor in vivo-onderzoek. Daarom is het zinvol naar middelen te zoeken waarmee deze zeer specifiek MAen actiever kunnen worden gemaakt en hun doelcelien volledig kunnen verwijderen. De toepassing van cytotoxische geneesmiddelen gekoppeld aan MAen is daarbij een mogelijkheid.
Tot de klinische toepassingsmogelijkheden van geneesmiddel-antilichaamconjugaten behoort de 45 immunochemotherapie van kanker en de bestrijding van verschillende immuun regelende verstoringen en van de afstoting van vreemde transplantaten. Uit verschillende onderzoeken is de specifieke cytotoxiciteit van toxinen en geneesmiddelen voor tumorcellen bij koppeling aan MAen die zijn opgewekt tegen met tumor samenhangende antigenen gebleken. Er is echter minder aandacht besteed asm het gebruik in vivo van geneesmiddel-MA-conjugaten voor het uitroeien van T-cellen en voor het onderzoeken van immuun-50 regulering van T-cellen bij de transplantaatafstoting, al zijn toxine-antilichaam-conjugaten al veel in vitro gebruikt voor het uitroeien van T-cellen voorafgaande aan beenmergtransplantatie.
Antracyclinen vormen een belangrijke groep antineoplastische middelen die worden gebruikt bij de chemotherapie van kanker, en daarvan zijn doxorubicine en daunorubicine doeltreffend gebleken tegen vaste tumoren. De koppeling van daunorubicine en doxorubicine aan antilichamen leidt echter tot aanzienlijk 55 activiteitsverlies van het geneesmiddel wanneer de koppeling geschiedt via de aminogroep van de suikereenheid (zie: J.J. Marchalonis and G.W. Warr, Antibody as a tool (Wileg, 1982), blz. 455-457).
Hoewel een conjugaat van een antilichaam gekoppeld via koolstofatoom op plaats 14 van daunorubicine in 195078 2 vitro cytotoxische activiteit toont, wordt door Gallego et al. het verder toepassen hiervan ontmoedigd aangezien conjugaten van antilichamen welke middels cisaconietzuuranhydride zijn gekoppeld aan de aminogroep van de suikereenheid in daunorubicine betere resultaten gaven, in het bijzonder met betrekking tot het behoud van de cel-bindende activiteit van het antilichaam, het behoud van de cytotoxische activiteit 5 van het antracycline, het vertonen van selectieve cytotoxiciteit tegen tumorcellen en de mate van reproduceerbaarheid van selectieve toxiciteit. Er wordt geen melding gemaakt van in vivo onderzoek. Voorts wordt van het op plaats 14 gekoppelde conjugaat vermeld dat deze ongewenste niet-specifieke toxiciteit vertoont Aangetoond is dat conjugaten van daunorubicine-MA bij concentraties van meer dan 10 pg/ml een niet-specifieke toxiciteit aan de dag leggen.
10 In GB-A 2158087 worden conjugaten van doxorubicine of analoga daarvan met een copolymeer van divinylether en malelnezuuranhydride in anionische vorm beschreven. De koppeling vindt plaats op het C-14 koolstofatoom van het antracycline via een esterbinding aan het polymeer. Hiermee wordt de aminosuiker-rest in het antracycline ongemoeid gelaten, hetgeen voor de optimale geneeskrachtige werking van het conjugaat van belang is.
15 In EP-A 0 208 615 wordt de koppeling van doxorubicine of daunorubicine met een antilichaam door middel van éen tetrapeptide beschreven, zie voorbeeld 4. De koppeling vindt plaats via de aminosuikerrest in het antracycline. Het koppelingsproduct wordt slechts gehydrolyseerd in aanwezigheid van lysosomen.
De uitvinding verschaft een conjugaat volgens de aanhef, met het kenmerk, dat het antracycline idarubicine is waarbij ten minste 50% van idarubicine via een esterbinding aan het monoklonaal antilichaam 20 of fragment daarvan is gekoppeld welk conjugaat is te verkrijgen door een reactie van (een overmaat) 14-Br-lda met een antilichaam in een oplossing met dimethylformamide (DMF) bij een pH = 8, waarbij ten minste 50 gew.% van het eiwit wordt teruggewonnen, en dat uit het gewonnen conjugaat na gedurende 48 uren op een pH = 9 te zijn gehouden ten minste 50 mol% van het geneesmiddel is afgegeven en na 48 uren houden op een pH = 4,5 geen geneesmiddel is vrijgekomen.
25 Dergelijke conjugaten hebben in vitro en in vivo een selectieve en sterke werking tegen tumoren. De Ida-MA-conjugaten hebben in vitro en in vivo een grotere effectiviteit dan daunorubicine-MA-conjugaten. Bij doses beneden 8,0 mg/kg in vivo zijn er geen aanwijzingen voor een niet-specifieke toxiciteit van de Ida-MA-conjugaten.
Verder werd het vermogen^van Ida-MA-conjugaten om specifiek celpopulaties uit te roeien onderzocht 30 door middel van koppeling van Ida aan MAen waarvan bekend is dat zij met verschillende deelpopulaties van lymfocyten (L3T4+, Ly-2+ en Thy-1+) reageren. Dit bleek een verrassend doeltreffende methode voor het uitdunnen van cellen te zijn. Het MA tegen Ly-2,1 dat in vivo geen meetbaar effect heeft op Ly-2,1+-cellen, kan bijvoorbeeld worden omgezet in een effectief cytotoxisch middel wanneer het wordt gekoppéld met het cytotoxische middel Ida.
35 Voor MAen voor Ly-2 en L3T4-antigenen werd nu aangetoond dat Ida-MA in vitro en in vivo doelcellen kan elimineren. Er kunnen Ida-MA-conjugaten worden verschaft die beter in staat zijn specifiek T-cel-deelverzamelingen die verantwoordelijk zijn voor transplantaatafstoting uit te dunnen dan antilyrrrfocyt-globulinen of anti-pan-T-celreagentia zoals OKT3 MA.
Ida wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.077.988. Bij voorkeur wordt twee tot acht en 40 met meer voorkeur twee tot zes Ida-moleculen covalent aan elk antilichaam of antilichaamfragment gebonden. De Ida-moleculen worden gekoppeld aan de 14-plaats aan het monoklonale antilichaam of fragment daarvan. Bij voorkeur worden zij rechtstreeks gekoppeld, al is het ook mogelijk een inerte, drager of koppelaar in te voegen.
Elk antilichaam of fragment daarvan is meestal specifiek voor een antigeen op het oppervlak van cellen 45 waartegen men Ida wil richten. Het antilichaam of fragment daarvan kan bijvoorbeeld specifiek zijn voor een beoogd weefsel zoals menselijk neoplasma. Voorbeelden van menselijke neoplasmata waartegen het gewenst kan zijn Ida in stelling te brengen, zijn borst-, darm-, long-, prostaat-, eierstok-, thymus- en andere kankers, sarcomen en leukemie. Het antilichaam of fragment daarvan kan ook specifiek zijn voor een dierlijk neoplasma. Er kan een antilichaam of fragment daarvan dat specifiek is voor menselijke transferrine-50 receptor (TFR), dat op delende cellen, erytroïde voorlopercellen en cellen van diverse tumoren aanwezig is, worden gebruikt. Een geschikt monoklonaal antilichaam tegen TFR kan er een zijn dat is opgewekt tegen de transferrine-receptor op LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2) cellen.
Wanneer de immunoglobuline-conjugaten bestemd zijn om te worden gebruikt tegen een bepaalde T-lymfocyt-populatie, is het antilichaam of fragment daarvan specifiek voor een antigeen van het cel-55 oppervlak dat zelf specifiek is voor die T-lymfocyten. Het antilichaam of fragment daarvan kan derhalve specifiek zijn voor een populatie van helpende, onderdrukkende of cytotoxische T-lymfocyten.
Bij voorkeur is het monoklonale antilichaam of fragment daarvan van dezelfde biologische soort als die 3 195078 waaraan het immunoglobuline-conjugaat moet worden toegediend. Een monoklonaal antilichaam of fragment daarvan van de mens of van de muis wordt daarom gewoonlijk gebruikt wanneer het conjugaat aan de mens moet worden toegediend. Ook is het antilichaam of fragment daarvan bij voorkeur van de IgG-klasse. Het fragment van het antilichaam kan het Fab, Fab' of F(ab02 fragment zijn. Ook IgM-5 monomeer dat door proteolytische enzymbehandeling uit IgM-antilichaam kan worden verkregen, kan worden gebruikt
De immunoglobuline-conjugaten worden volgens de uitvinding bereid door het koppelen van Ida, via het koolstofatoom op de plaats-14, aan het monoklonale antilichaam of fragment daarvan. Bij voorkeur wordt een 14-halogeen-lda tot reactie gebracht met het monoklonale antilichaam of fragment daarvan. Het 10 14-halogeenatoom kan fluor, chloor, bijoom of jood zijn, maar is bij voorkeur broom. 14-Broom-lda wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.125.607. De koppeling kan tot stand worden gebracht volgens een werkwijze die omvat: (a) het mengen van het monoklonale antilichaam of fragment daarvan met een molaire overmaat van 14-halogeen-lda in DMF, 15 (b) het laten reageren van het mengsel bij 18-37°C en bij een pH = 8, (c) het verwijderen van neerslag, (d) het verwijderen van niet-omgezette uitgangsstof door middel van gelfiltratie, en (e) het verwijderen van het geadsorbeerd geneesmiddel (Ida) door middel van adsorptie-chromatografie of ionenwisselingschromatografie.
20 Bij voorkeur is de molaire overmaat aan 14-halogeen-lda tot 50-voudig. In stap (b) wordt de reactie bij voorkeur gedurende 1-8 uur uitgevoerd. De reactietemperatuur is als regel kamertemperatuur. Aldus wordt bij meer dan 50% eiwit terugwinning, 3 tot 5 è 3 tot 6 moleculen Ida ingebouwd.
De immunoglobuline-conjugaten volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor de behandeling van een mens of een ander zoogdier dat aan kanker lijdt. Er kan een therapeutisch doeltreffende hoeveelheid 25 van het conjugaat worden toegediend. De kanker kan een vaste tumor, een ascitestumor of een leukemie zijn. Menselijke neoplasmata die kunnen worden behandeld, zijn hierboven genoemd. Er kunnen twee of meer conjugaten worden toegediend, waarbij het monoklonale antilichaam of fragment daarvan in elk conjugaat een verschillende specificiteit heeft.
Een conjugaat kan door middel van injectie worden toegediend. Het kan parenteraal, bijvoorbeeld 30 intraveneus worden toegediend en het kan plaatselijk of rechtstreeks in de tumor worden toegediend. De aan een patiënt toegediende hoeveelheid conjugaat is van diverse factoren afhankelijk zoals de te behandelen tumor en de toestand van de patiënt. Als regel kan echter een dosis van 10 tot 200 mg conjugaat per m2 lichaamsoppervlak worden toegediend. De conjugaten kunnen ook worden toegediend met andere chemotherapeutische middelen of met middelen die de werking van de conjugaten versterken, zoals 35 vaatactieve middelen of tumor-necrosis-factor.
De immunoglobuline-conjugaten kunnen ook worden toegepast om in het bijzonder een deelverzameling van T-lymfocyten uit een celpopulatie aan te pakken. Aan mens of dier kan een doeltreffende therapeutische hoeveelheid van een conjugaat met daarin een monoklonaal antilichaam of fragment daarvan gericht tegen een op de uit te dunnen lymfocyten aanwezig celoppervlakte-antigeen worden toegediend. Ook kan 40 een celpopulatie in vitro met een dergelijk conjugaat worden geïncubeerd:
Een combinatie van conjugaten die is gericht tegen twee of meer celoppervlak-antigenen kan worden gebruikt. De te vernietigen lymfocyten kunnen helpende, onderdrukkende of cytotoxische T-cellen zijn.
Dit aspect van de uitvinding kan worden toegepast om te voorkomen dat getransplanteerd weefsel in een ontvanger wordt afgestoten. De conjugaten kunnen worden gebruikt als immunosuppressieve middelen. Er 45 wordt dan een voor het tegengaan van transplantaatafstoting doeltreffende hoeveelheid conjugaat aan de transplantaatontvanger toegediend. Bij voorkeur zijn het hierbij cytotoxische T-cellen die in aantal worden verminderd. Een mans of dier met kanker kan worden behandeld door toediening van een geschikt conjugaat om onderdrukkende t-cellen uit te dunnen. Autoimmunosatieziekten kunnen worden behandeld door toediening van een conjugaat dat helper-T-cellen opruimt. Hierbij zijn de wijze van toediening en de 50 doses als hierboven vermeld.
De immunoglobuline-conjugaten worden samengesteld als farmaceutische preparaten met een farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunner. Elke geschikte drager of verdunner kan worden gebruikt. Geschikte dragers en verdunners zijn onder meer fysiologische zoutoplossing en Ringers dextrose-oplossing.
55 De volgende voorbeelden illustreren de uitvinding. In de tekeningen hebben figuren 1 t/m 12 betrekking op voorbeeld I en figuren 13 t/m 17 op voorbeeld II. Toelichting op de figuren:
Figuur 1 geeft de structuur van antracyclinederivaten weer.
195078 4
Figuur 2 geeft de koppeling van Idarubicine (Ida) met anti-Ly-2.1 (0,5 mg) weer. Het aantal molen Ida dat is gebonden per mol anti-Ly-2.1 () (linker coördinaat) en de hoeveelheid teruggewonnen eiwit (·) (rechter coördinaat) zijn afgebeeld als functie van het aantal nmolen Ida in het reactiemengsel (abscis).
Figuur 3 geeft de antilichaamtiter weer, gemeten als het percentage rozet-vormende cellen (ordinaat) 5 tegen de antilichaamverdunning (-1) (abscis) van anti-Ly-2.1-conjugaten op ITT(1) 75 NS E3 doelcellen. Er werden verdunningsreeksen gemaakt met een verdunning van 0,5 mg/ml van anti-Ly-2.1 (A), anti-Ly-2.1 met 2 (·) of 8 (o) mol Ida/mol antilichaam.
Figuur 4 geeft het remmende effect van Ida () of lda-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antilichaam, (·) op E3-cellen in een 24 uurs bepaling weer, waarbij het percentage remming in [3H]-thymidine-inbouw (ordinaat) 10 is uitgezet tegen de concentratie lda(M)(abscis).
Figuur 5 geeft het remmende effect van Ida (), lda-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antilichaam (·) of Ida-anti-TFR, 5 mol Ida/mol antilichaam (o) op (Ly-2+) E3-cellen in een remmingsbepaling van 30 minuten weer, waarbij het percentage remming in [3H]-thymidine-inbouw (ordinaat) is uitgezet tegen de concentratie lda(M)(abscis).
15 Figuur 6 geeft het remmende effect van lda-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antilichaam (o) en conjugaat plus antirLy-2.1 (·) op E3 doelcellen in een specificiteitsbepaling van 30 minuten weer, waarbij het percentage remming in [3H]-thymidine-inbouw (ordinaat) is uitgezet tegen de concentratie lda(M)(abscis).
Figuur 7 geeft de groei van de E3 thymoma in met subcutaan met 2 x 10e-cellen geïnjecteerde CBF,-muizen weer. Groepen van 10 muizen werden op de met pijlen aangegeven tijdstippen intraveneus 20 behandeld: PBS (□), Ida (), anti-Ly-2.1 (A), Ida-anti-TFR (o) of lda-anti-Ly-2.1 (·). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is daarbij als ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale balken geven de standaardfout ten opzichte van het gemiddelde weer.
Rguur 8 geeft de afzonderlijke tumorgroeicurven van subcutaan met 2,0 x 10® E3-tumorcellen geïnjecteerde en op dag 4 en dag 5 intraveneus met lda-anti-Ly-2.1-conjugaat behandelde CBF,-muizen weer. De 25 tumorafmeting (cm2) is daarbij in ordinaat uitgezet tegen de tumorinoculatie (abscis).
Figuur 9 geeft de groei van E3-thymoma in subcutaan met 3,0 x 10®-cellen geïnjecteerde CBF1-muizen weer. Groepen van 10 muizen werden op de met een pijl aangeduide tijdstippen intraveneus behandeld: PBS O; anti-Ly-2.1 (A), Ida () of lda-anti-Ly-2.1-conjugaat (·). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is in ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na de tumorinoculatie (abscis). De verticale balkjes geven de 30 standaardfouten ten opzichte van het gemiddelde weer.
Figuur 10 geeft de groei van de E3-thymoma in subcutaan met 3,0 x 10e-cellen geïnjecteerde CBF,-muizen weer. Groepen van 10 muizen kregen op de met een pijl aangeduide tijdstippen een intratumor-behandeling met: PBS (□), anti-Ly-2.1 (A), Ida () of lda-anti-Ly-2.1-conjugaat (·). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is als ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale 35 balkjes geven de standaardfouten ten opzichte van het gemiddelde weer.
Figuur 11 geeft de groei van het vreemde transplantaat COLQ 205 menselijke tumor in naakte, subcutaan met 2 x 106-cellen geïnjecteerde muizen weer. Groepen van 10 muizen werden op de met pijlen aangeduide tijdstippen intraveneus behandeld: PBS (Δ), vrij Ida (♦), lda-250-30.6-conjugaat (·), mengsel van Ida en 250-30.6 (O) en 250-30.6 (A). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is in ordinaat uitgezet tegen 40 het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale balkjes geven de standaardfout ten opzichte van de gemiddelde tumorafmeting weer.
Figuur 12 geeft afzonderlijke tumor-groei-curven van met vreemd materiaal getransplanteerde naakte muizen die intraveneus (pijl) met lda-250-30.6-conjugaat werden behandeld. De onderbroken lijn geeft de gemiddelde tumorafmeting in met PBS behandelde muizen weer. De tumorafmeting (cm2) is in ordinaat 45 uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis).
Figuur 13 toont de koppeling van Idarubicine (Ida) aan anti-L3T4 (0,5 mg). Het aantal molen Ida ingebouwd per mol anti-L3T4 (♦) (linker ordinaat) en de hoeveelheid teruggewonnen eiwit (·) (rechter ordinaat) zijn weergegeven als functie van het aantal nmolen Ida in het reactiemengsel (abscis).
Figuur 14 geeft de antilichaamtiter weer, gemeten als het percentage rozet vormende cellen (ordinaat) 50 tegen de antilichaamverdunning (x 10'1) (abscis) van anti-Thy-1-conjugaten op ITT(1) 75NS E3-doelcellen. Verdunningsreeksen werden uitgevoerd op een oplossing van 1,0 mg/ml van anti-Thy-1 (♦) of conjugaat met 1 (o), 4 (·) of 7 (O) mol Ida/mol anti-Thy-1. j
Figuur 15 toont het effect van behandeling met Ida-MA en MA op het aantal L3T4+ en Ly-2+ cellen in de i milt in met lda-anti-L3T4 (·-·), anti-L3T4 (A-A), lda-anti-Ly-2.1 (·...·), anti-Ly-2.1 (A...A) behandelde of 55 niet-behandelde (...) muizen waarbij het percentage rozet vormende cellen (ordinaat) is uitgezet tegen de tijd in dagen (abscis).
Figuur 16 toont het effect van gecombineerde Ida-MA-conjugaatbehandeling op de overleving van een 5 195078 P388D1 tumor-transplantaat (kruis H-2 en non H-2 verschillen) in CBA-muizen. Groepen van 10-15 muizen werden subcutaan met 8,0 x 106 P388D1 tumorcellen geïnjecteerd en kregen een van de volgende intraveneuze toedieningen (pijl): (i) PBS (♦), (ii) anti-L3T4 en anti-Ly-2.1 (o), (iii) lda-anti-L3T4 (), (iv) lda-anti-Ly-2.1 (·) en (v) lda-anti-L3T4 en lda-anti-Ly-2.1 (A). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is als 5 ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale balkjes geven de standaardfouten ten opzichte van het gemiddelde weer.
Figuur 17 toont het effect van lda-anti-thy-1-conjugaat op de overleving van P388D1-tumortransplantaat in CBA-muizen. Groepen van 10 muizen werden subcutaan met 1,0 x 107 P388D1-tumorcellen geïnjecteerd en kregen een van de volgende intraveneuze toedieningen (pijl): (i) PBS (), (ii) anti-Thy-1 (·) en (iii) 10 lda-anti-Thy-1 (A). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is als ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale balkjes geven de standaardfout ten opzichte van het gemiddelde weer.
Figuur 18 toont de groei van COLO 205 (30,6*, 17,1*) vreemd transplantaat in met 8x10 cellen/muis geïnjecteerde naakte muizen. Groepen van 10 muizen werden intraperitoneaal op de met een pijl aangeduide tijdstippen behandeld met: PBS (Q, 17.1-lda (o), 30.6-la (A) of een mengsel van 30.6-lda en 15 17.1-lda (·). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is als ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale balkjes geven de standaardfout ten opzichte van het gemiddelde weer. De totale dosis Ida was 200 pg.
Figuur 19 toont de groei van vreemd transplantaat van LIM2210 menselijke karteldarmtumor in met het tumorfragment (1-5 mg) geïmplanteerde muizen. Groepen van 10 muizen werden op de met een pijl 20 aangeduide tijdstippen intraveneus behandeld met: PBS (□), 17.1-lda (♦), JGT-13-lda (A), 27.1-lda (·), 30.6-lda (o). De gemiddelde tumorafmeting (cm2) is als ordinaat uitgezet tegen het aantal dagen na tumorinoculatie (abscis). De verticale balkjes geven de standaardfout ten opzichte van het gemiddelde weer. De totale dosis Ida was 80 pg.
25 VOORBEELD I
Materialen en methoden Tumorcellen
In dit voorbeeld werden de volgende cellijnen onderzocht.
30 (Ly-2*) muizenthymoma ITT(1) 75NS E3 variant (E3) (Smyth et al, J. Natl Cancer Inst. (1986) 76, 503-510), het (Ly-2\ TFR') lymfoma EL4 (Horowitz et al, Science (1968) 160, 533-535), de (TFR*) menselijke cellen CEM (Foley et al Cancer (1965) 18, 522-529) en de (250-30.6*) menselijke cellijn COLO 205. De cellen werden in vitro gehandhaafd in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DME) of RPMI 1640 medium (Flow Laboratories, Sydney, Australië), waaraan was toegevoegd 10% met warmte geïnacö-35 veerd serum van pasgeboren kalveren (Flow), 2 mM glutamine (Commonwealthe Serum Laboratories, Sydney, Australië); 100 pg/ml streptomycine (Glaxo, Melbourne, Australië) en 100 I.E7ml penicilline (Commonwealth Serum Laboratories). De E3-tumor werd in vlvo gehandhaafd door achtereenvolgende overgang in (C57BL76 x BALB/c)F!-muizen (CBF^muizen). Cellen van de ascitesvloelstof werden tweemaal in fosfaatbuffer-zoutoplossing (PBS) gewassen en gecentrifugeerd (400 g x 5 min), opnieuw In PBS 40 gesuspendeerd en subcutaan (s.c.) in de buikwand van muizen geïnjecteerd; deze ontwikkelden tot voelbare tumoren voorafgaande aan de behandeling. De muizen werden onderworpen aan een reeks intraveneuze (i.v.) of intratumor (i.t.) behandelingen en de afmeting van de tumoren werd daarna dagelijks met een schuifmaat langs loodrechte assen van de tumoren bepaald. De gegevens werden genoteerd als gemiddelde tumorafmeting (product van de twee doorsneden ± standaardfout).
45 Muizen CBA en (C57BL/6xBALB/c) muizen (CBF^-muizen) en naakte (nu/nu) muizen werden voortgebracht in het Department of Pathology, University of Melbourne. In elk experiment werden groepen 8-10 muizen, alle van hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd, gebruikt Monoklonale antilichamen 50 De gebruikte monoklonale antilichamen (MAen) waren: (i) Anti-Ly-2.1 (lgG1) reactief met muize-Ly-2.1 specificiteit (Hogarth et al Immunology (1982) 46,135-144) en (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgGI) reactief met de menselijke transferrine-receptor (TFR) (Panaccio et al Immunology and Cell Biology 65, 461-472 (1987); alsmede (iii) een antilichaam aangeduid als 250-30.6, reactief tegen een antigeen dat aanwezig is op carcinomacellen van de menselijke karteldarm.
55 De MAen werden geïsoleerd uit ascitesvloeistof door neerslagvorming van 40% ammoniumsulfaat, oplossing in PBS en dialyse met dezelfde buffer. Deze ruwe preparaten werden geabsorbeerd op proteïne-A-Sepharose (Pharmacia Ine., Piscataway, New Jersey), grondig gewassen met PBS (pH 7,3) en geëlueerd 195078 6 met 0,2 M glycine HCI (pH 2,8) of door een Affigel blauwe kolom geleid (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd.,
Sydney). Na neutralisatie werden de MAen gedialyseerd tegen PBS, verdeeld en bewaard bij -70°C. A3C6 werd verkregen door intraperitoneaal immuniseren van CBA-muizen met tussenpozen van een week gedurende drie weken met 2x10® LiCR-LON-HMy-2(HMy-2)-cellen (OKT9+ve), verwijdering van de milt drie 5 dagen na de laatste injectie en fusie met P3-NSI-AG4-1 (NS-l)-cellen.
Bereiding en kwantitatieve bepaling van conjugaten
Intact anti-Ly-2.1, anti-TFR MA, of 250-30.6 (1-2 mg/ml in boraatbuffer pH 8,0) werd gemengd met een molaire overmaat (1-50x) 14-broom-4-demethoxydaunorubicine (Br-lda) opgelost in dirnethylformamide (DMF) in een concentratie van 10 mg/ml.,De reactie werd uitgevoerd gedurende 4 uur bij kamertemperatuur 10 waarna werd gecentrifugeerd (400 g x 5 minuten) ter verwijdering van neerslag. Vrij Br-lda en andere niet-omgezette uitgangsstoffen werden verwijderd door gelfiltratiechromatografie met een Sephadex G-25 kolom (PD-10; Pharmacia) waarna de conjugaten over een kolom van Porapack Q (Millipore) werden geleid i ter verwijdering van geadsorbeerd geneesmiddel (Niederwieser et al, J. Chromatog. (1971) 54, 215-223).
De hoeveelheid in de geneesmiddel-MA-conjugaten opgenomen Ida werd bepaald door middel van ! 15 absorptie-spectrofotometrie bij een golflengte van 483 mm (E498 = 3,4 x 103M'1cm‘1) en door schatting van het eiwitgehalte-(Bradford, Anal. Biochem. (1976) 72, 248-253).
Activiteit van het antilichaam
Door middel van een rozetbepaling met schaap-anti-muis-immunoglobuline (SAMG) werd de antilichaam-activiteit van Ida-MA-conjugaten bepaald in vergelijking met vrij MA dat op dezelfde wijze in de koppelings-20 werkwijze was behandeld (Parish and McKenzie, J. Immunol. Methods 1978,20,173-183).
Werking van het geneesmiddel (a) 24 uurs remmingsbepaling: 100 μΙ cellen (2-5 x 10®/ml) werd op een microtiterplaat met vlakke bodem gebracht en 1 uur bij 37°C geïncubeerd. Vrij Idarubicine (Ida) (opgelost in PBS) en Ida-MA-conjugaten werden aseptisch gefiltreerd en er werden In steriel PBS verdunningen gemaakt. 50 μΙ vrij Ida of conjugaat 25 werd met dubbele putjes voor elk monster aan de cellen toegevoegd; in controleputjes werd 50 μΙ PBS gebracht en de cellen werden gekweekt bij 37°C, 7% C02 gedurende 24 uur.
(b) remmingsbepaling 30 minuten: 200 μΙ cellen (2-5 x 10®/ml) werd in steriele- Eppendorfbuizen verzameld, in steriel geneesmiddel of conjugaat gesuspendeerd en 30 minuten bij 37°C gemengd. De cellen werden vervolgens gecentrifugeerd (4Q0 g x 5 min), opnieuw in kweekmedium gesuspendeerd en in hoeveelheden 30 van 100 μΙ op een microtiterplaat geënt met dubbele putjes voor elk monster. Na 16-24 uur incuberen in beide bepalingen, werd 50 μΙ kweekmedium dat 1 fi\ [3H]-thymidine (specifieke activiteit = 5 Ci/mmol;
Amersham) bevatte toegevoegd en werden de platen 2—4 uur geïncubeerd. De cellen werden geoogst en gedroogd en de afzonderlijke monsters werden gescheiden en op een β-scintillatieteller geteld. De inbouw van [3H]-thymidine werd uitgedrukt als percentage remming van de inbouw bij de controles. De standaard-35 fout werd bij elk punt verkregen door dubbele bepaling en was nergens hoger dan 5%.
Toxiciteit
Groepen van 10-20 CBA-muizen werd een enkele i.v. injectie van de verschillende doses Ida of lda-anti-Ly-2.1 gegeven en de overleving van de muizen werd geregistreerd ten opzichte van dosis toegediende geneesmiddel in mg/kg. De organen van de muizen werden verwijderd en gewogen en daarna 40 met formaline gefixeerd en met haematoxyline en eosine gekleurd.
Resultaten
Bereiding en karakterisering van conjugaten
Br-lda (figuur 1) werd covalent verbonden met verschillende MAen: tegen menselijk TFR, tegen een op 45 menselijke darmkankercellen aanwezig antigeen (antilichaam 250-30.6) en tegen Ly-2-alloantigeen van muizen. De reactieomstandigheden voor de conjugatie werden bepaald door variatie van de molaire overmaat van het aan MA toegevoegde BR-ida waarbij een middenweg werd gekozen tussen een grotere Ida-inbouw en een geringere terugwinning van eiwit. lda-anti-Ly-2.1 (figuur 2), Ida-anti-TFR en lda-250-30.6 (gegevens niet afgebeeld) namen 3 tot 5 moleculen Ida op met een hoeveelheid teruggewonnen eiwit van 50 meer dan 50%. De reactie van Br-lda met MAen kon aanleiding geven tot twee typen koppelingen (figuren 1C en D). Voor het vaststellen welke aanwezig, was werden de conjugaten 48 uur op pH 4,5 of pH 9,0 gehouden, werd het vrijgekomen geneesmiddel geabsorbeerd in Porapak Q en werden de monsters opnieuw kwantitatief bepaald door middel van spectrofotometrie. Vijftig procent van het gebonden geneesmiddel was bij blootstelling aan base (pH 9,0) vrijgekomen terwijl bij pH 4,5 kennelijk geen verlies optrad.
55 Dit doet veronderstellen dat ten minste 50% van het geneesmiddel via een esterbinding is gekoppeld (figuur 1D) aangezien de esterverbinding gevoelig is voor basische omstandigheden en de aminebinding stabiel is.
Activiteit van het antilichaam 7 195078
De antilichaamtiter voor en na conjugatie werd gemeten door middel van de rozetmethode en werd bepaald als de verdunning waarbij 80% van de doelcellen rozetten vertoonden. lda-anti-Ly-2.1-conjugaten die 2 en 8 moleculen Ida bevatten, hadden antilichaamtiters tegen E3-cellen van respectievelijk 1:56.000 en 1:33.000, terwijl de niet geconjugeerde antilichaamtiter 1:80.000 was (figuur 3). Ida-250-30.6-conjugaten die 5 2 en 6 moleculen Ida bevatten hadden antilichaamtiters tegen COLO 205 cellen van respectievelijk 1:16.000 en 1:11.000, terwijl de niet-geconjugeerde antilichaamtiter 1:33.000 was. Er is dus als gevolg van de conjugatieprocedure enig verlies aan antilichaamactiviteit; conjugaten met minder dan 6 moleculen Ida per molecuul antilichaam werden in vitro en in vivo onderzoek gebruikt. Waargenomen werd dat de oplosbaarheid en de antilichaamactiviteit van lda-anti-Ly-2.1 -conjugaten duidelijk beneden deze gradaties van 10 Ida-inbouw afnamen (gegevens niet weergegeven). Het maximale aantal Ida-moleculen dat zinvol kan worden ingebouwd, varieert afhankelijk van het antilichaam.
In vitro activiteit van Idarubicine en Idarubicine-MA-conjugaten
De cytotoxiciteit in vitro van Ida en twee Ida-MA-conjugaten op de muizencellijn ITT(1)75NS E3 (Ly-2+TFR) en de menselijke cellijn CEM (Ly-2'TFFT) werd gemeten in een remmingsbepaling over 24 uur 15 waarbij de ID^-waarden (50% remming in [3H]-thymidine inbouw van de controles) werden bepaald. Resultaten zijn weergegeven in figuur 4 en tabel A. De ID,*, voor Ida lag in het gebied van 1,0-2,5 x 10‘7 voor beide onderzochte cellijnen (figuur 4, tabel A). De ID^ voor lda-anti-Ly-2.1 op E3 was viermaal zo groot (figuur 4) en voor lda-anti*TFR op CEM waren de ID^-waarden 1-2 maal kleiner dan die van vrij Ida (tabel A). Vrij Ida was derhalve cytotoxischer voor zowel E3 als CEM dan lda-anti-Ly-2.1 respectievelijk 20 Ida-anti-TFR. Deze Ida-MA-conjugaten hadden echter een tienmaal zo lage cytotoxiciteit voor niet-reactieve cellijnen (tabel A) waaruit bleek dat een cytotoxische werking specifiek was en het gevolg was van het vasthouden van antilichaamactiviteit (figuur 3).
TABELA
25 Effect van conjugaten van Idarubicine en monoklonale antilichamen op tumorcellen.1
Gemiddelde ID^-waarden bepaald voor -
Tumorcellijn Ida lda-anti-Ly-2.1 Ida-anti-TFR
30 ------:---r:— --- E3 1,2 X10'7 4,3 X10 7 2,3x10·® (5)2 (3) (2) CEM 2,2 x10'7 2,0x10·® 3,0x10‘7 (5) (2) (3) 35 --:-‘‘-:--- 1 ID« b remming in fH]-thymidine inbouw van de controles.
8 b aantal onderzochte preparaten.
De lda-250-30.6-conjugaten waren enigszins minder actief dan vrij Ida. Vrij Ida had een IDgo van 6x1 O^M 40 terwijl het conjugaat een IDS0 van 3,5x10"7M had op de doelcellijn COLO 205.
Om te onderzoeken of de conjugaten selectiviteit aan de dag legden in hun cytotoxische werking voor doelcellen, werden lda-anti-Ly-2.1 en Ida-anti-TFR 30 minuten met E3 (Ly-2+) geïncubeerd waarna niet gebonden conjugaat werd weggewassen en de cytotoxiciteit werd gemeten. Het lda-anti-Ly-2.1-conjugaat had een IDgo van 6,2x10'7M vergeleken met en ID^, van 5,2x10'7M voor vrij Ida (figuur 5). Daarentegen had 45 het niet-reactieve Ida-anti-TFR-conjugaat een ID,*, van 5,0x10^M, dat wil zeggen 10 maal zo groot als die van vrij Ida, waaruit blijkt dat de antilichaam bindende werking van het lda-anti-Ly-2.1-conjugaat een selectieve cytotoxiciteit tot gevolg had. Evenzo werden lda-250-30.6-conjugaat en vrij geneesmiddel 30 minuten met de cellijnen COLO 205 (250-30.6 +ve) en E3 (250-30.6 -ve) geïncubeerd en vervolgens gewassen en aan de cytotoxiciteitsbepaling onderworpen. Beide cellijnen hadden een overeenkomstige 50 dosisrespons op het vrije geneesmiddel, te weten 9,2x10‘7M voor COLO 205 en 9,8x10'7M voor E3. Het lda-250.30.6-conjugaat was viermaal zo toxisch voor COLO 205 dan de voor het antilichaam niet-reactieve E3-cellen. Soortgelijke resultaten werden verkregen met de CEM-cellijn en lda-anti-Ly-2.1 als niet-reactieve controle (gegevens niet afgebeeld). Om meer zekerheid te verkrijgen dat de cytotoxiciteit van Ida-MA-conjugaten voor doelcellen specifiek was en op de bindplaatsen van antilichamen plaatsvond, werd de 55 remming van de cytotoxiciteit van het conjugaat met vrij MA bestudeerd. Bij een concentratie Ida van 4,0x1 O^M (2 pg anti-Ly-2.1) was de cytotoxiciteit van het anti-Ly-2.1-conjugaat op E3-cellen bij toevoeging van 50 pg (250 pg/ml) anti-Ly-2.1 met 70% verminderd (figuur 6), wat erop wijst dat de cytotoxiciteit van het 195078 8 lda-anti-Ly-2.1-conjugaat rechtstreeks verband houdt met het antilichaam bindende vermogen daarvan. Soortgelijke controleresultaten werden verkregen met 250-30.6. Opgemerkt dient te worden dat in alle bepalingen vrij anti-Ly-2.1, anti-TFR en 250-30.6 niet-cytotoxisch waren (gegevens niet afgebeeld).
In vitro behandeling van muizenthymoma ITT(1)75NS E3 5 Om de remming van de groei van vaste tumoren te bepalen werden groepen van CBFrmuizen (10 per groep) die s.c. met 2,0x1 O'6 E3-cellen in de buikholtestreek waren geïnoculeerd, met i.v. injecties met de volgende middelen behandeld: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1; (Hi) Ida; (iv) Ida-anti-TFR of (v) lda-anti-Ly-2.1. De muizen kregen op dag 4 en dag 5 (tumorafmeting is 0,1 cm2) na de tumorenting respectievelijk 20 pg Ida en/of 1200 pg anti-Ly-2.1 toegediend.
10 Binnen 24 uur na de eerste behandeling hadden de met lda-anti-Ly-2.1 behandelde muizen een gemiddelde tumorafmeting van 20% van die van met PBS behandelde muizen (d.w.z. een afname van 80% van de tumormassa (figuur 7)); het was duidelijk dat anti-Ly-2.1 alleen en Ida dat covalent aan het niet-specifieke anti-TFR-MA was gebonden geen E3 tumorgroei teweeg brachten. De tumoren van de muizen die alleen Ida kregen namen af tot 50%; 3 van deze muizen stierven echter en de overige hadden 15 een afname van het lichaamsgewicht van 25%. De afzonderlijke tumorgroeicurven van muizen die lda-anti-Ly-2.1 kregen vertoonden een afname van 9 van de 10 tumoren in de loop van de behandeling (figuur 8); 5 van de 10 tumoren verdwenen volledig en verschenen niet weer (na meer dan 200 dagen) en de tumoren die bij de beëindiging van de behandeling doorgroeiden (5 van de 10) groeiden langzamer dan de tumoren van met PBS en Ida-anti-TFR behandelde muizen. Een volgende proef werd uitgevoerd om de 20 i.v. behandeling van grotere tumoren met lda-anti-Ly-2.1 te bepalen. Groepen van telkens 10 CBFrmuizen werden met 3,0x1 O'® E3-cel!en geïnoculeerd en kregen vervolgens 15 pg respectievelijk 900 pg Ida en anti-Ly-2.1 op dag 6 (tumorafmeting = 0,2 cm2) en dag 7 na de tumorinoculatie (figuur 9). De met lda-anti-Ly-2.1 behandelde muizen hadden op dag 7 een gemiddelde tumorafmeting van 50% van die van met PBS behandelde muizen en 66% van die van met Ida behandelde muizen welke tendens zich tot de beëindiging 25 van het onderzoek voortzette (dag 18). De afzonderlijke tumorgroeicurven van de 10 CBFrmuizen die lda-anti-Ly-2.1 kregen lieten zien dat er viermaal een afname en eenmaal een volledig verdwijning van de tumormassa was (na meer dan 200 dagen, gegevens niet afgebeeld). lda-anti-Ly-2.1 was derhalve effectief tegen grotere tumoren en in beide proeven was de anti-tumorwerking van Ida duidelijk verbeterd wanneer het was gekoppeld aan een anti-Ly-2.1-MA.
30 In vivo behandeling van de menselijke karteldarmtumor COLO 205
De werking van lda-antl-250-30.6-conjugaat werd bepaald in naakte (nu/nu) muizen met vreemd transplantaat van COLO 205.
Injecties van 2x10e-cellen subcutaan in de buikwand leidde binnen 4 dagen tot een voelbare knobbel (ongeveer 0,1 cm2). Groepen van 10 muizen werden vervolgens met i.v.-injecties met een van de volgende 35 middelen behandeld: (i) PBS; (ii) 250-30.6; (Hij Ida plus 250-30.6 (niet-geconjugeerd); (iv) Ida; (v) lda-250-30.6-conjugaat. In een reeks 5 i.v.-injecties op de dagen 4, 5, 6, 10 en 12 na de tumorinoculatie werd In totaal 275 pg Ida toegediend.
In de groepen muizen die behandeld waren met PBS of met niet-geconjugeerd 250-30.6 was geen therapeutisch effect waarneembaar. Met alleen Ida overleefden 2 van de 10 muizen terwijl in de groep die 40 niet-geconjugeerd Ida plus 250.30.6 kregen, alle muizen op dag 7 dood waren nadat zij eerder vergiftigings-symptomen zoals gewichtsverlies hadden vertoond. De muizen die het lda-250-30.6-conjugaat kregen, vertoonden een drastische vermindering in tumorafmeting. Deze resultaten zijn weergegeven in figuur 11. Daarentegen toonden de tumorgroeicurven voor de afzonderlijke muizen (figuur 12) aan, dat 5 van de 10 muizen tumoren hadden die op dag 7 waren afgenomen; deze tumoren groeiden daarna door, waarna 2 45 van de 10 muizen zonder tumoren bleven. Deze muizen toonden geen effecten als gevolg van vergiftiging. Intratumorbehandeling
Intratumorbehandeling blijkt een nuttige techniek te zijn voor de immunotherapie van dierlijke en menselijke tumoren. Daarom werd nagegaan wat de anti-tumoractiviteit van lda-anti-Ly-2.1-conjugaten was bij rechtstreekse toediening in vaste E3-tumor. Groepen van 10 CBFrmuizen die s.c. met 3,0x10® E3-cellen 50 waren geïmplanteerd ontwikkelden 5 dagen na de tumorenting tumoren (0,1-0,2 cm2). De behandeling bestond uit 2 injecties op dag 5 en dag 6 na tumorimplantatie waarbij de muizen een van de volgende behandelingen kregen: (1) PBS; (2) Ida; (3) ant-Ly-2.1; (4) lda-anti-Ly-2.1 (totaal Ida = 30 pg). lda-anti-Ly- 2.1 vertoonde de grootste anti-tumorwerking terwijl vrij Ida en anti-Ly-2.1 alleen geen invloed hadden op de tumorgroei wanneer zij rechtstreeks in de tumor werden gebracht. De met lda-anti-Ly-2.1 behandelde 55 muizen hadden op dag 8 een gemiddelde tumorafmeting van 60% van die van met PBS behandelde muizen en op dag 13 van 30% van die van met PBS behandelde muizen (figuur 10). De afzonderlijke tumorgroeicurven (niet afgebeeld) van met lda-anti-Ly-2.1 behandelde muizen lieten een volledige afname zien 9 195078 terwijl de overige muizen een vertraagde vermindering in tumorgroei lieten zien 3 dagen na de beëindiging van de behandeling.
Toxiciteit
Voor acute-toxiciteitsproeven werd aan groepen van 10 CBA (Ly-2.1+) muizen een enkele injectie met 5 variërende doses van Ida, lda-anti-Ly-2.1 of Ida-anti-TFR toegediend. Alle met Ida ingespoten muizen vertoonden aanvankelijk een gewichtsverlies tot 25% van het oorspronkelijke gewicht; bij de met een van de Ida-MA-conjugaten behandelde muizen werd echter geen gewichtsverlies waargenomen. Tabel B demonstreert de toxiciteit van Ida en Ida-MA-conjugaten door middel van de LD^ en LD10-waarden. Te zien is dat de LD10 van lda-anti-Ly-2.1 10,0 mg/kg Ida bedroeg wat te vergelijken is met slechts 0,75 mg/kg voor vrij 10 Ida. Verder had het Ida-anti-TFR-conjugaat een LD10 van 15,0 mg/kg. De conjugaten werden niet onderzocht tot een LD50-dosis. Deze resultaten illustreren de grotere therapeutische toepasbaarheid van Ida-MA-conjugaten dan die van vrij Ida.
TABEL B
15 Effect van conjugaten van Idarubicine en monoklonale antilichamen op CBA-muizen
Ida (mg/kg) L.D.10 L.D.gg 20 --:---
Ida 0,75 3,0 lda-anti-Ly-2.1 10,0 N.T.
Ida-anti-TFR 15,0 N.T.
25 N.T. b niet getest
Histopathologische resultaten
Acuut effect: De intraveneuze toediening van vrij Ida (1,0 mg/kg) leidde 15 dagen na de behandeling tot atrofie van het witte miltmerg en enige hypertrofie van hartspiervezels (gegevens niet afgebeeld). Daarente-30 gen veroorzaakte een enkele dosis lda-anti-Ly-2.1 (2,4 mg/kg) geen aspecifieke weefseltoxiciteit na 15 en 30 dagen al werd er bij dag 15 wel enige zwelling van hepatocyten waargenomen.
VOORBEELD II
35 Materialen en methoden Muizen (DBA/2 x BALB/c)F, en CBA-muizen werden voortgebracht in het Department of Pathology, University of Melbourne. In elke proef werden groepen van 10-20 muizen, allemaal van hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd gebruikt..
40 Tumorcellen
Onderzocht werden de volgende cellijnen: (Ly-2+) muis-thymoma ITT(1)75NS E3 variant (E3), het (L3T4+) lymfoom EL4 (Horowitz et al, Science (1968) 160, 533-535), het menselijk darmcarcinoom Colo 205 (Semple et al, Cancer Res. (1978) 38,1345-1355) en het (Ly-2*, L3T4') menselijk T-celleukemie CEM (Foley et al, Cancer (1965) 18, 522-529). De cellen werden in vitro in stand gehouden zoals beschreven in 45 voorbeeld I. De P388D1 macrofaag-cellijn werd in vivo gehandhaafd door achtereenvolgende overgang in (DBA/2 x BALB/cjF^muizen. Cellen van de ascites-vloeistof werden tweemaal in fosfaatbuffer-zoutoplossing (PBS, pH 7,3) gewassen en gecentrifugeerd (400 g x 5 min), opnieuw in PBS gesuspendeerd en s.c. geïnjecteerd in de buikwand van muizen waar zij zich ontwikkelden tot voelbare tumortransplantaten. De muizen werden vervolgens aan een reeks i.v. behandelingen onderworpen en de afmeting van de tumoren 50 werd dagelijks met een schuifmaat gemeten langs de loodrechte assen van de tumoren. De gegevens werden geregistreerd als gemiddelde tumorafmeting (product van twee doorsneden ± standaardfout). Monoklonale antilichamen
Monoklonale antilichamen tegen de celoppervlak-antigenen L3T4, Ly-2 en Thy-1 van muizen, die afzonderlijke subpopulaties van lymfocyten karakteriseren, werden als modelsysteem gebruikt.
55 De gebruikte MAen waren: (i) anti-Ly-2.1 (muis lgG2a) dat reageert met de muis-Ly-2.1-specificiteit (Hogarth et al, Immunology, 1982, 46,135-144), (ii) H129.19 (anti-L3T4) (rat lgG2b) dat reageert met muis-L3T4-specificiteit (Pierres et al, J. Immunology (1984) 132, 2775-2782) en (iii) anti-Thy-1 (rat lgG2b) 195078 10 dat reageert met muize-T-cellen (Marshak-Rothstein et al, J. Immunology (1979) 122, 2491-2497). De antilichamen werden geïsoleerd, gezuiverd en bewaard als beschreven in voorbeeld I. De antilichaam-activiteit werd bepaald door middel van een rozetbepaling met schaap-anti-muis-immunoglobuline (SAMG) zoals beschreven in voorbeeld I.
5 Bereiding van conjugaten van Idarubicine en monoklonale antilichamen
Een MA (1-2 mg/ml) werd gemengd met een 5-20-voudige molaire overmaat van 14-broom-4-demethoxydaunorubicine (Br-lda) opgelost in dimethylformamide tot 10 mg/ml gedurende 4 uur bij pH 8,0 (0,05 M boraatbuffer) en bij kamertemperatuur. De reactie, de zuivering en de bepaling vari de hoeveelheid in het conjugaat ingebouwd Ida geschiedde zoals beschreven in voorbeeld I.
10 Activiteit van het geneesmiddel
Volgens de werkwijze van voorbeeld I werden twee bepalingen (van 24 uur en van 30 minuten) uitgevoerd van de geneesmiddelactiviteit waarbij cellen in een concentratie van 1-5 x 10e/ml werden gebruikt.
Serologie 15 In alle proeven werd een rozetvormingsmethode toegepast om de antilichaamtiter en de aantallen L3T4+ en Ly-2+ cellen te bepalen. Deze methode behelst het binden van SAMG en spoort ook ratten-immunoglobuline (Ig) gekoppeld aan rode cellen van het schaap (SRC) op vóór het aantonen van antilichamen op het oppervlak van lyfoïdecellen. Van lg+-mlltcellen werd het oppervlak-lg verwijderd door afsluiting met SMG (25 pl en 2ml cellen bij 107/pl); de cellen werden vervolgens op ijs bewaard in een medium dat 20 0,01% natriumazide bevatte om de terugsynthese van immunoglobuline te voorkomen.
Resultaten
Het onderzoek werd in afzonderlijke fasen uitgevoerd: (a) In vitro karakterisering van drie verschillende Ida-MA-conjugaten, en (b) vervolgens toepassing bij het actief uitdunnen van T-cel-deelverzamelingen voorafgaande of tijdens de 25 afstoting van een vreemd transplantaat van tumorcellen.
Bereiding en karakterisering van conjugaten
Br-lda werd covalent gekoppeld aan MA tegen muis-L3T4, Ly-2 en Thy-1-antigenen. De reactie-omstandigheden voor de conjugatie werden bepaald door middel van variaties van de molaire overmaat van aan het MA toegevoegde Br-lda waarbij een middenweg werd gekozen tussen een hogere Ida-inbouw en 30 een lagere eiwitterugwinning. lda-anti-L3T4 (figuur 13), lda-anti-Ly-2.1 en lda-anti-Thy-1 (gegevens niet afgebeeld) bouwden 3-6 moleculen Ida in met eiwitterugwinning van meer dan 50%.
Antilichaamactiviteit
De antilichaamtiters voor en na conjugatie werden gemeten met behulp van de rozetmethode en werden bepaald als de verdunning waarbij 50% van de E3-doelcellen rozetten vertoonden. lda-anti-Thy-1 -35 conjugaten die 1, 4 en 7 moleculen Ida bevatten hadden antilichaamtiters van respectievelijk 1:425.000, 1:170.000 en 1:130.000, terwijl de niet-gemodificeerde antilichaamtiter 1:550.000 was (figuur 14). Er is dus enig verlies aan antilichaamactiviteit bij conjugatie met Ida; conjugaten met minder dan 4 moleculen Ida per MA werden echter voor in vitro en in vivo gebruikt. Evenzo nam ook de antilichaamactiviteit van zowel lda-anti-Ly-2.1 en lda-anti-L3T4 conjugaten (niet afgebeeld) duidelijk met de bouw van meer dan 6 40 moleculen Ida per molecuul MA af.
Geneesmiddelactiviteit in vitro
De cytotoxiciteit van de Ida-MA-conjugaten werd in een 24-uursbepaling beproefd op verschillende reactieve doelcellen en vergeleken met die van vrij Ida. De activiteit van vrij Ida was 4-10 maal zo groot als die van de Ida-MA-conjugaten waarbij de IDg,, (50% remming in [3H]-thymidine-inbouw van de controles) 45 van vrij Ida optrad bij 6,6-9,0 x 10'8M tegen de onderzochte tumorcellijnen. Het bleek dat het lda-anti-Ly- 2.1-conjugaat het meest cytotoxische conjugaat was (ID^, = 4,3 x 10 7M) wanneer het wordt getest tegen ITT(1)75NS E3-cellijn, die een variant is van de voor het Ly-2-antigeen verrijkte natiéve cellijn. Met hét oog op de bepaling van de selectiviteit van de conjugaatwerking voor doelcellen werden de Ida-MA-conjugaten 3 minuten mét doelcellen geTncubeerd waarna ongebonden conjugaat werd weggewassen en de cytotoxiciteit 50 werd gemeten. In deze 30 minuten bepaling hadden de niet-reactieve Ida-MA-conjügaten een ID^ van 10-50 maal die van vrij Ida waaruit blijkt dat de binding met het antilichaam essentieel is voor de cytotoxiciteit van het Ida-MA-conjugaat. Hierbij dient te worden opgèmerkt dat geen van de hierbij gebruikte MAen in vitro in afwezigheid van het complement een cytotoxische werking op doelcellen had. De resultaten zijn samengevat in tabel C.
11 195078
TABEL C
Effect van conjugaten van Idarubicine en monoklonale antilichamen Gemiddelde ID^ op tumorcellen1 Gemiddelde ID^ bepaald voor 5 -;-;--
Tumorcellijn Bepaling Ida lda-anti-Ly-2.1 lda-anti-L3T4 lda-anti-Thy-1 E3 24 h2 7,8x10·® 4,3x10'7 N.T. 9,0x10'7 30 min3 1,8x1 O*7 4,3x10’7 N.T. 1,2x10·® 10 EL4 24 h 6x6x10® N.T. β,ΟχΙΟ'7 N.T.
30 min 1,6x10'7 N.T. 6,2χ10'7 N.T.
CEM 24 h 9,0x10-® N.T. N.T. N.T.
30 min 2,2x10’7 6,0x10-® N.T. N.T.
Colo 205 24 h 8,0x10·® N.T. N.T. N.T.
15 30 min 1,2x1 O·7 N.T. 4,0x10·® 5,8x10·® 1 I.D.jo = 50% remming van pHJ-thymidine inbouw van de controles 2 cytotoxiciteitsbepaling van 24 uur 3 bepaling van 30 minuten 2Q N.T. = niet getest
Activiteit in vivo van conjugaten van Idarubicine en monoklonale antilichamen
Het immunosuppressieve vermogèn in vivo van de Ida-MA-conjugaten werd vergeleken met dat van MA alleen in een test naar het vermogen van de conjugaten om selectief L3T4+ of Ly-2+-cellen van de milt te 25 verwijderen. CBA-muizen kregen 4 i.v. injecties van anti-Ly-2.1 of anti-L3T4 conjugaat (30 pg lda/1,5 mg MA) op dagen 0,2, 5 en 10 en het aantal Ly-2+ of L3T4+-cellen in de milt werd door middel van een rozetbepaling gevolgd. Bij elke bepaling werden de miltcellen van de twee behandelde muizen elke dag onderzocht en werden de resultaten gemiddeld (figuur 15). Er was een snelle afname in het aantal L3T4+-cellen van ongeveer 30% totale miltcellen in normale muizen op dag 0 tot ongeveer 4% in met 30 lda-anti-L3T4 behandelde muizen op dag 20. Deze L3T4+-cellen bleven meer dan €0 dagen in aantal verminderd voordat er een geleidelijke toename werd waargenomen. De verwijdering na in vivo behandeling met anti-L3T4 alleen leidde ook tot een scherpe afname in het aantal L3T4+-cellen (30% tot 5%).
Het lda-anti-Ly-2.1-conjugaat verminderde het aantal milt-Ly-2+-cellen op dag 10 van 25% tot 5%; het aantal Ly-2+-cellen begon echter op dag 15 te stijgen en werd 40-50 dagen weer normaal. Interessant was 35 dat anti-Ly-2.1-MA zelf niet in staat was Ly-2+-cellen aanmerkelijk uit te dunnen; het verloop in de aantallen Ly-2+- en L3T4+-cellen in de onbehandelde controle muizen was naar wordt verondersteld het gevolg van de natuurlijke variatie tussen muizen. Het was dus duidelijk dat zowel lda-anti-L3T4 als lda-anti-Ly-2.1 het aantal L3T4+- respectievelijk Ly-2+-cellen van de milt van behandelde muizen veel doeltreffender konden verminderen dan het MA alleen. Het effect van het lda-anti-Ly-2.1-conjugaat is belangrijk omdat het 40 anti-Ly-2.1-MA bij afzonderlijk gebruik volledig zonder werking is maar bij koppeling aan Ida kon worden omgezet in een krachtig immunosuppressief middel. De door de geneesmiddel-MA-conjugaten in stand gehouden vermindering leende zich daarom voor het onderzoek van de rol van Ly-2*- en L3T4+-cellen jn . vivo in de transplantaatafstotingsrespons.
Effect van lda-anti-L3T4, lda-anti-Ly-2.1 en lda-anti-Thy-1 op de overleving van een tumortransplantaat 45 De conjugaten lda-anti-L3T4, lda-anti-Ly-2.1 en lda-anti-Thy-1 werden in deze proeven gebruikt om de overlevingstijd van P388D1 tumortransplantaten in CBA-muizen te verlengen; deze vreemde transplantaten zijn kruis-H-2 (klasse I en II) en non-H-2-barrières.
(a) Gecombineerde conjugaatbehandeling
Groepen van 10-15 CBA-muizen werden s.c. geïnjecteerd met 8,0 x 10® P388D1-tumorcellen en kregen 50 i.v. op de dagen -1, 0 (de dag van de tumorenting), 3, 5 en 10 een van de volgende toedieningen: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 en anti-Ly-2.1, (iii) lda-anti-L3T4, (iv) lda-anti-Ly-2.1 en (v) lda-anti-L3T4 en lda-anti-Ly-2.1. De totale ontvangen hoeveelheid Ida en MA was respectievelijk 125 pg en 5,75 mg. De tumortransplantaten van zowel met PBS als met MA behandelde muizen overleefden 14-17 dagen met een maximale gemiddelde tumorafmeting van 0,31 cm2, hetgeen aantoont dat de beide niet-geconjugeerde MAen tezamen niet 55 in staat waren het aantal L3T4+- en Ly-2+cellen doeltreffend te verminderen zodat het tumortransplantaat kon overleven (figuur 16). Verder waren lda-anti-Ly-2.1 en lda-anti-L3T4 afzonderlijk slechts in staat de overleving van het transplantaat te verlengen (dag 20-28) met maximale gemiddelde tumorafmetingen van
Claims (4)
1. Conjugaat van een antracycline en a) een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor een menselijk neoplasma antigeen of specifiek is voor een oppervlakte-antigeen van een.T-lymfocytcel of b) een ten minste één van de antigeen-bindplaatsen van het monoklonaal antilichaam bevattend fragment daarvan waarbij het monoklonaal antilichaam of fragment daarvan aan het koolstofatoöm op de plaats-14 van het 50 antracycline gekoppeld is, met het kenmerk, dat het antracycline idarubicine is waarbij ten minste 50% van idarubicine via een esterbinding aan het monoklonaal antilichaam of fragment daarvan is gekoppeld welk conjugaat is te verkrijgen door een reactie van (een overmaat) 14-Br-lda met een antilichaam in een oplossing met dimethylformamide (DMF) bij en pH = 8, waarbij ten minste 50 gew.% van het eiwit wordt teruggewonnen, en dat uit het gewonnen conjugaat na gedurende 48 uren op een pH = 9 te zijn gehouden 55 ten minste 50 mol% van het geneesmiddel is afgegeven en na 48 uren houden op een pH = 4,5 geen geneesmiddel is vrijgekomen.
2. Conjugaat volgens conclusie 1 waarin 2-6 idarubicine moleculen covalent aan het monoklonaal 13 195078 antilichaam of fragment daarvan zijn gebonden.
3. Werkwijze voor de bereiding van een conjugaat volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men 14-halogeen-idarubicine in een tot 50-voudige molaire overmaat laat reageren met een monoklonaal antilichaam of fragment daarvan in een oplossing met dimethylformamide (DMF) bij een pH = 8, waarbij ten 5 minste 50 gew.% van het eiwit wordt teruggewonnen.
4. Farmaceutisch preparaat met een conjugaat van een antracycline en een, antilichaam als werkzaam bestanddeel in een farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunner, met het kenmerk, dat het werkzaam bestanddeel een conjugaat volgens conclusie 1 of 2 is. Hierbij 10 bladen tekening
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8800610A NL8800610A (nl) | 1988-10-03 |
| NL195078C true NL195078C (nl) | 2003-07-30 |
Family
ID=25643244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8800610A NL8800610A (nl) | 1987-03-11 | 1988-03-11 | Immunoglobine-conjugaten. |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5798097A (nl) |
| JP (1) | JP2736255B2 (nl) |
| KR (1) | KR0130906B1 (nl) |
| CN (1) | CN1045621C (nl) |
| AT (1) | AT395375B (nl) |
| AU (1) | AU622105B2 (nl) |
| BE (1) | BE1001051A4 (nl) |
| CA (1) | CA1329156C (nl) |
| CH (1) | CH678815A5 (nl) |
| CZ (1) | CZ161288A3 (nl) |
| DE (1) | DE3808166C2 (nl) |
| DK (1) | DK173792B1 (nl) |
| ES (1) | ES2006109A6 (nl) |
| FI (1) | FI98706C (nl) |
| FR (1) | FR2612074B1 (nl) |
| GB (1) | GB2203154B (nl) |
| GR (1) | GR1000059B (nl) |
| HU (1) | HU205266B (nl) |
| IE (1) | IE64781B1 (nl) |
| IL (1) | IL85688A0 (nl) |
| IT (1) | IT8819746A0 (nl) |
| MY (1) | MY103231A (nl) |
| NL (1) | NL8800610A (nl) |
| NO (1) | NO178954C (nl) |
| NZ (1) | NZ223834A (nl) |
| PT (1) | PT86960B (nl) |
| RU (1) | RU2106147C1 (nl) |
| SE (1) | SE503402C2 (nl) |
| YU (1) | YU46858B (nl) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6824777B1 (en) * | 1992-10-09 | 2004-11-30 | Licentia Ltd. | Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| CN100340291C (zh) * | 1998-10-09 | 2007-10-03 | 路德维格癌症研究院 | F1t4(VEGFR－3)作为肿瘤显像和抗肿瘤治疗的靶 |
| AU2002216864A1 (en) * | 2000-12-21 | 2002-07-01 | Mcgill University | Conjugates of antibodies and anticancer drugs |
| DE60219419T2 (de) | 2001-01-19 | 2007-08-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4 (vegfr-3) als ein ziel für krebsdarstellung und anti-krebs-behandlung |
| US7592143B2 (en) * | 2003-04-18 | 2009-09-22 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| GB0511266D0 (en) * | 2005-06-02 | 2005-07-13 | Trust | Chemical compounds |
| US20080108138A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-05-08 | Vermette Patrick | Bioactive compositions and their use in cell patterning |
| BR112013013083A2 (pt) | 2010-11-30 | 2016-12-13 | Genentech Inc | métodos para transportar um composto, para aumentar exposição do cns a um composto, para diminuir a depuração de um composto, para aumentar a retenção no cns de um composto, para otimizar a farmacocinética, para tratar um distúrbio neurológico em um mamífero, para desenvolver um anticorpo, anticorpo, fragmento de anticorpo, anticorpo multiespecífico e uso de um anticorpo |
| RS60026B1 (sr) | 2013-02-18 | 2020-04-30 | Vegenics Pty Ltd | Molekuli koji vezuju ligande i njihove upotrebe |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT343812B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven daunosaminylderivaten von anthracyclinonen |
| GB1500421A (en) * | 1975-01-22 | 1978-02-08 | Farmaceutici Italia | Optically active anthracyclinones |
| AT343811B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| AT346838B (de) * | 1975-01-22 | 1978-11-27 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1511680A (en) | 1975-11-18 | 1978-05-24 | Farmaceutici Italia | Daunosaminyl anthracyclinones |
| GB1541436A (en) * | 1976-02-02 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| US4867973A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-19 | Cytogen Corporation | Antibody-therapeutic agent conjugates |
| US5162512A (en) * | 1982-03-09 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibodies |
| US4950738A (en) * | 1984-09-13 | 1990-08-21 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| US4545985A (en) | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| GB8413464D0 (en) * | 1984-05-25 | 1984-07-04 | Erba Farmitalia | Anthracycline-anionic polymer conjugates |
| JPS61155334A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| FR2584293B1 (fr) * | 1985-07-04 | 1989-03-17 | Ire Celltarg Sa | Anticorps utiles comme agents de pilotage et conjugues les incorporant |
-
1988
- 1988-03-10 CA CA000561042A patent/CA1329156C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 IE IE70188A patent/IE64781B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IL IL85688A patent/IL85688A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 BE BE8800268A patent/BE1001051A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 HU HU881160A patent/HU205266B/hu unknown
- 1988-03-10 AU AU12881/88A patent/AU622105B2/en not_active Expired
- 1988-03-10 ES ES8800719A patent/ES2006109A6/es not_active Expired
- 1988-03-10 MY MYPI88000250A patent/MY103231A/en unknown
- 1988-03-10 JP JP63055074A patent/JP2736255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 YU YU48288A patent/YU46858B/sh unknown
- 1988-03-10 KR KR1019880002464A patent/KR0130906B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 NZ NZ223834A patent/NZ223834A/xx unknown
- 1988-03-11 IT IT8819746A patent/IT8819746A0/it unknown
- 1988-03-11 SE SE8800886A patent/SE503402C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CH CH936/88A patent/CH678815A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GB GB8805865A patent/GB2203154B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 NO NO881105A patent/NO178954C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 AT AT0067488A patent/AT395375B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 FI FI881158A patent/FI98706C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 FR FR888803233A patent/FR2612074B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 GR GR880100148A patent/GR1000059B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 DE DE3808166A patent/DE3808166C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 CN CN88101810A patent/CN1045621C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 PT PT86960A patent/PT86960B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 DK DK198801315A patent/DK173792B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CZ CS881612A patent/CZ161288A3/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NL NL8800610A patent/NL8800610A/nl not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-15 RU SU5052164A patent/RU2106147C1/ru active
-
1995
- 1995-04-11 US US08/420,712 patent/US5798097A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4880935A (en) | Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates | |
| KR960015398B1 (ko) | 신규의 링커를 갖는 안트라사이클린 면역결합체 및 그의 제조방법 | |
| Letvin et al. | In vivo administration of lymphocyte-specific monoclonal antibodies in nonhuman primates. In vivo stability of disulfide-linked immunotoxin conjugates. | |
| JPS6330289B2 (nl) | ||
| CA1222694A (en) | Immunochemotherapy for malignant tumors, particularly pancreatic cancer | |
| JPH0639387B2 (ja) | 免疫毒素複合体 | |
| KR20030097883A (ko) | 세포독성 ｃｄ44 항체 면역접합체 | |
| US5514794A (en) | Antibody-drug conjugates | |
| Smyth et al. | Specific targeting of chlorambucil to tumors with the use of monoclonal antibodies | |
| NL195078C (nl) | ||
| Pietersz et al. | Immunochemotherapy of a murine thymoma with the use of idarubicin monoclonal antibody conjugates | |
| US5075108A (en) | Melphalan derivatives | |
| US5144012A (en) | Cytotoxic drug conjugates | |
| Kanellos et al. | Anti‐tumour activity of aminopterin‐monoclonal antibody conjugates; in vitro and in vivo comparison with methotrexate‐monoclonal antibody conjugates | |
| Letvin et al. | In vivo administration of lymphocyte-specific monoclonal antibodies in nonhuman primates. Delivery of ribosome-inactivating proteins to spleen and lymph node T cells. | |
| EP0485749A2 (en) | Chemical modification of antibodies for creating of immunoconjugates | |
| Arnon | Antibodies and dextran as anti-tumour drug carriers | |
| Smyth et al. | The in vitro and in vivo anti-tumour activity of N-AcMEL-(Fab') 2 conjugates | |
| JPS6069034A (ja) | 免疫毒素、免疫毒素を含有する薬剤及び免疫毒素の生体外使用方法 | |
| RU2009500C1 (ru) | Способ получения цитотоксического коньюгата | |
| US20080095802A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients iwth transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in paients undergoing radiation therapy, and C) in vitaminpbinding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| Arnon | Novel Application for Antibodies | |
| Mottram et al. | New anti-CD3 agents for transplantation tolerance | |
| WO1998056823A1 (en) | Induction of immune tolerance by immunotoxin | |
| AU2007201744A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and C) in vitamin binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: PHARMACIA S.P.A.;THE UNIVERSITY OF MELBOURNE |
|
| DNT | Communications of changes of names of applicants whose applications have been laid open to public inspection |
Free format text: PHARMACIA & UPJOHN S.P.A.;THE UNIVERSITY OF MELBOURNE |
|
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: PHARMACIA S.P.A.;THE UNIVERSITY OF MELBOURNE |
|
| DNT | Communications of changes of names of applicants whose applications have been laid open to public inspection |
Free format text: PHARMACIA & UPJOHN S.P.A.;THE UNIVERSITY OF MELBOURNE |
|
| NP1 | Patent granted (not automatically) | ||
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20080311 |