MXPA02009956A - Composiciones y metodos para mejorar la salud vascular. - Google Patents

Composiciones y metodos para mejorar la salud vascular.

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Abstract

Esta invencion se refiere a las composiciones que contienen polifenoles, por ejemplo, polifenoles de cacao, como las procianidinas, en combinacion con cuando menos un agente reductor del colesterol, y a los metodos para mejorar la salud vascular que incluyen el tratamiento y prevencion de aterosclerosis Y enfermedades cardiovasculares.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA MEJORAR LA SALUD VASCULAR Campo de la invención Esta invención se refiere a las composiciones que contienen polifenoles. por ejemplo, polifenoles de cacao, como las procianidinas, en combinación con cuando menos un agente reductor de colesterol, y a los métodos para mejorar la salud vascular que incluyen el tratamiento y prevención de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares .
Antecedentes de la invención En la actualidad, la enfermedad de la arteria coronaria, la primera forma de enfermedad cardiovascular (CVD), es la principal causa de muerte en Estados Unidos. La enfermedad cerebrovascular es la tercera. El origen de las enfermedades de arteria coronaria y cerebrovascular son atribuidas a la aterosclerosis. Por sus manifestaciones clínicas, la aterosclerosis es la principal causa de más de un millón de ataques al corazón, aproximadamente 400,000 accidentes cerebrovasculares que ocurren cada año y numerosos problemas de circulación vascular. Muchos pacientes sufren de hipertensión.
Un considerable conjunto de evidencias ha establecido una relación causal entre la hipercolesterolemia y la aterosclerosis prematura; a mayores niveles de colesterol en plasma, mayor el riesgo de ataque al corazón ulterior (ver por ejemplo, Steinberg, D., JAMA 264: 3047 (1990)). En la cadena de episodios que conducen hacia la aterosclerosis, se piensa que el suceso inicial es la formación de "estrias de grasa" en las arterias carótida, coronaria y cerebral y en la aorta. Estas lesiones incluyen depósitos grasos de colesterol y éster colesterilico que se encuentran principalmente dentro de las células del músculo liso y macrofágos de la capa intima. La migración y proliferación de células de músculo liso vascular desempeña una función crucial en la patogénesis de la aterosclerosis después del depósito inicial de lipidos.
Además, el desarrollo de la aterosclerosis y enfermedad cardiovascular están reguladas por, y/o están asociadas con, la oxidación de los LDL, la actividad de la ciclooxigenasa (COX) , la actividad de la lipoxigenasa (LOX) , la producción de óxido nitrico (NO) y la actividad de la óxido nitrico sintasa (NOS) . Las relaciones entre los distintos caminos y procesos involucrados con éstos están representados en la Figura 1 y están descritos en detalle en la Solicitud Internacional No. PCT/US97/05693 publicada como WO 97/36497, las porciones pertinentes de la cual se incorporan como referencia. En resumen, la oxidación de los LDL es un punto critico en la iniciación de lesiones (ateromas) que ocurren cuando los macrofágos captan los LDL modificados por oxidación y se transforman en las también conocidas como "células de espuma" las enzimas COX y LOX están involucradas en la ruta del ácido araquidónico que conduce a la producción de prostaglandinas y tromboxano A2, el último siendo conocido por causar vasoconstricción y agregación plaquetaria, y de esta manera progresión de la aterosclerosis. Se sabe que el óxido nitrico inhibe la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos/quimiotaxis y proliferación del músculo liso vascular, todo lo cual es considerado como responsable del progreso de la aterosclerosis. Los polifenoles de cacao se han conocido por tener efectos benéficos sobre los procesos antes descritos para inhibir la oxidación de los LDL, mejorando la actividad NO/NOS e inhibiendo la actividad COX/LOX. Estos efectos se muestran, por ejemplo, en la solicitud Internacional No. PCT/US97/05693 publicada como WO 97/36497 y los ejemplos reportados en la solicitud. Los polifenoles de cacao pueden utilizarse para tratar o prevenir estados que, como se sabe, son afectados por la administración de medicamentos antiinflamatorios no esteroidales, por ejemplo, la aspirina.
A pesar de los beneficios del polifenol de cacao sobre el número de rutas y condiciones asociadas con la inducción y progreso de aterosclerosis y CHD, se encontró que estos compuestos no tienen efecto reductor notable del colesterol. De esta manera, los inventores han preparado una composición mejorada que contiene polifenoles en combinación con cuando menos un agente reductor de colesterol. La composición ha mejorado los efectos sobre la salud vascular de mamiferos, particularmente de un humano, en comparación con las composiciones ya conocidas que contienen polifenol o agentes reductores del colesterol.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a las composiciones y métodos para mejorar la salud vascular en un mamífero, un humano o un animal veterinario, en particular.
En un aspecto, la invención "se refiere a una composición, como puede ser un alimento, un aditivo de alimento, un suplemento de dieta o un fármaco, que contiene un polifenol de cacao y un agente reductor de colesterol. La composición opcionalmente puede contener L-arginina.
En otra modalidad, la invención se refiere a un producto de resposteria reductor de colesterol, más preferiblemente chocolates que reducen colesterol (por ejemplo, chocolate negro) y el producto de repostería que contiene chocolate reductor colesterol.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para mejorar la salud vascular, que incluye la prevención o tratamiento de aterosclerosis y enfermedad cardiovascular en un mamífero, como un humano o un animal veterinario, mediante la administración de una composición que contiene un polifenol de cacao y un compuesto que reduce el colesterol, y opcionalmente L-arginina. Los polifenoles de otras fuentes que tienen propiedades similares a los polifenoles de cacao también pueden ser usados en las composiciones y métodos de la invención en combinación con agentes reductores de colesterol, como los agentes reductores de colesterol a base de esterol y/o estanol.
Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a un método para mejorar la absorción de un polifenol, por ejemplo, un flavanol o un flavonol mediante la administración, a un mamífero, de un polifenol en combinación con un fitosterol y/o un fitostanol. También se proporcionan las composiciones y los productos de manufactura para su uso en el método.
Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es una tabla que representa los principales factores que contribuyen al progreso de cardiopatias coronarias (CHD) y muestra cómo contribuyen los polifenoles de cacao a la prevención del progreso de la enfermedad.
Las Figuras 2A-D muestran el efecto de fitoquimicos sobre la sintesis basal de las células endoteliales de los prostanoides y endotelinas en BAECS (* = significativamente diferente del control en p < 0.05).
Las figuras 3A-B muestran los efectos de especies celulares sobre alteraciones inducidas por procianidina en la liberación de EC de prostaciclina y endotelina.
Las figuras 4A-C muestran el efecto del consumo de bebidas de cacao sobre la expresión superficial de las plaquetas de GPIIb-IIIa activado con y sin estimulación con agonistas débiles.
Las figuras 5-A-C muestran el efecto del consumo de una bebida de cacao sobre la expresión en la superficie plaquetaria de P-selectina activada con y sin estimulación con agonistas débiles.
La figura 6 muestra los efectos de los fitosteroles, procianidinas de cacao y una combinación de éstos sobre la absorción de epicatequina en el plasma sanguineo.
La figura 7 muestra los efectos de los fitosteroles, procianidinas de cacao y una combinación de éstos sobre el daño oxidativo al DNA.
La figura 8 muestra los efectos de los fitosteroles, procianidinas de cacao y una combinación de éstos sobre el daño oxidativo a lipidos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Todas las patentes, solicitudes de patentes y referencias citadas en esta solicitud se incorporan en la presente como referencia. En caso de alguna inconsistencia, la presente descripción prevalece.
La presente invención se refiere a una composición que contiene un polifenol de cacao en combinación con un agente reductor de colesterol, por ejemplo, un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol, una composición como ésta es útil para mejorar o favorecer la salud vascular en un mamífero. La composición opcionalmente puede contener L-arginina, calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C y cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma de guar, un ácido graso mono o poli insaturado (por ejemplo, ácido graso omega-3) . Las composiciones que contienen polifenoles de otras fuentes con propiedades similares a estos polifenoles de cacao también pueden utilizarse en las composiciones y métodos de la invención en combinación con agentes reductores de colesterol, por ejemplo, agentes reductores de colesterol a base de esterol y/o estanol, también entran en el alcance de la invención.
Como se usa en la presente, el término "polifenol de cacao" (CP) se refiere a una sustancia polifenólica que incluye proantocianidina, más especificamente procianidina, presente en semillas de cacao o extracto de semillas de cacao o ingredientes de cacao. El término "procianidina" incluye los monómeros y los oligómeros de catequina y epicatequina. Deberá entenderse que cualquier referencia a polifenol de cacao en la presente también se aplica a procianidina de cacao. El término "ingrediente de cacao" se refiere a un material que contiene sólidos de cacao derivados de semillas de cacao sin cascara, como licor de chocolate y sólidos de cacao parcial o completamente desgrasados (por ejemplo, torta o polvo) . La frase "agente reductor de colesterol" significa cualquier compuesto, combinación de compuestos, un extracto o un componente de planta, que se encuentre en estado natural o procesado, que tenga la propiedad de disminuir los niveles de colesterol en un mamífero cuando se administra en una cantidad eficaz. Cuando tal agente reductor de colesterol es un compuesto o una combinación de compuestos que sea del tipo esterol o-- estanol, es decir, que incluyan derivados y formas isoméricas, el agente reductor de colesterol se conoce como un "agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol". Cuando la frase se usa en relación con una composición, por ejemplo, "un chocolate oscuro reductor de colesterol", significa que la composición tiene la propiedad de reducir el colesterol. Como una persona experta en la técnica puede entender a partir del uso en la presente, el término "vascular" se refiere a todo el sistema vascular, es decir, incluye el corazón, y el término "salud vascular" incluye la salud cardiovascular y/o salud coronaria. "Favorecer la salud vascular" se refiere a alcanzar los efectos saludables, benéficos, descritos en la presente.
Los polifenoles de cacao pueden ser de origen natural, es decir, derivados de una semilla de cacao, o preparados sintéticamente. Una persona con experiencia en la técnica puede seleccionar polifenoles de cacao sintéticos o naturales con base en la disponibilidad o costo. Los polifenoles de cacao pueden ser incluidos en las composiciones como un ingrediente de cacao que contiene polifenoles de cacao, por ejemplo, un licor de chocolate en chocolate, o puede ser adicionado independientemente de los ingredientes de cacao, por ejemplo, como un extracto, una fracción de extracto, fracciones de extracto combinadas o un compuesto preparado sintéticamente. Los polifenoles de cacao incluyen procianidinas de cacao, que pueden ser monómeros y/o oligómeros de epicatequina y catequina. Los monómeros de procianidina incluyen (+) -catequina, (-) -epicatequina y sus respectivos epimeros, (por ejemplo (-) -catequina y (+) -epicatequina) y tienen la estructura: Los oligómeros de procianidina pueden tener desde 2 hasta 18, preferiblemente desde 2 hasta cerca de 12, y más preferiblemente desde 2 hasta cerca de 10 unidades monoméricas. Por ejemplo, los oligómeros pueden ser dimeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, heptámeros, octámeros, nonámeros y decámeros. En los oligómeros, los monómeros están conectados por medio de enlaces interflavano de (4 — 6) y/o (4 — > 8) . Los oligómeros con enlaces exclusivamente (4 — 8) son lineales; mientras que la presencia de cuando menos un enlace (4 — > 6) conduce a un oligómero ramificado.
El polifenol de cacao puede ser preparado por extracción de semillas de cacao, dientes de cacao o ingredientes de cacao, como licor de chocolate, sólidos de chocolate parcialmente desgrasados y/o sólidos de cacao completamente desgrasados. Preferiblemente, el extracto se prepara a partir de un polvo de cacao completa o parcialmente desgrasado. Pueden utilizarse semillas de cualquier especie de Theobroma , Herrania o cruzas de inter- e intraespecies de éstas. El extracto puede ser preparado de semillas fermentadas, subfermentadas o no fermentadas. Las semillas fermentadas tienen menor cantidad de polifenoles de cacao y las no fermentadas mayor. La selección de las semillas puede hacerse ~con base en el factor de fermentación de las semillas, por ejemplo, el extracto se puede hacer a partir de las semillas que tengan un factor de fermentación de 275 o menos. La optimización de los niveles de polifenoles en el ingrediente de cacao y extracto de éste manipulando el grado de fermentación puede hacerse como se describe en la solicitud Internacional No. PCT/US97/15893 publicada como WO 98/09533, las secciones relevantes de las cuales están en esta incorporadas en la presente como referencia.
Los polifenoles de cacao pueden ser extraídos de ingredientes de cacao que hayan sido procesados usando métodos tradicionales de procesamiento de cacao (descrito, por ejemplo, en Industrial Chocolate Manufacture and Use, ed. Beckett, S.T. Blackie Acad & Professional, New York, 1997, como en los capítulos 1, 5 y 6) o usando un método de procesamiento mejorado descrito en la patente US No. 5,015,913 por Kealey y col., que conserva los polifenoles (evitando su destrucción) en los ingredientes de cacao, contrario a los métodos tradicionales. El método de procesamiento mejorado del cacao omite el paso de tostado tradicional. De esta manera, los ingredientes de cacao pueden obtenerse: (a) calentando las semillas de cacao durante un tiempo a una temperatura suficiente para que soltar la cascara de cacao sin tostar la semilla; (b) zarandeando o aventando el diente de cacao de la cascara de cacao; (c) comprimiendo la semilla de cacao en un tornillo y (b) recuperando la manteca de cacao y los sólidos de cacao parcialmente desgrasados que contienen niveles de polifenoles de cacao conservados. El método retiene un nivel mucho mayor de oligómeros de procianidina mayores que los tradicionales. Los sólidos de cacao producidos por este método puede contener más de 20,0000 µg de procianidinas totales por gramo de sólidos no grasos; preferiblemente mayor que 25,000 µg/g. más preferiblemente mayor que 28,000 µg/g, y más preferiblemente mayor que 30,000, µg/g. Para el propósitos de esta invención, las cantidades totales de procianidina se determinan como se describe en el Ejemplo 3.
Los polifenoles de cacao pueden ser extraídos de las fuentes antes indicadas usando los solventes en los que se disuelvan los polifenoles. Los solventes adecuados incluyen agua o solventes orgánicos como metanol, etanol, acetona, alcohol isopropilico y acetato de etilo. También pueden utilizarse mezclas de solventes. Cuando se usa agua como solvente, es preferible que ésta sea ligeramente acidificada, por ejemplo con ácido acético. Los solventes preferidos son mezclas de agua y solvente orgánico, por ejemplo, metanol, etanol o acetona acuosos. Los solventes orgánicos pueden contener, por ejemplo, desde aproximadamente 50% hasta cerca de 95% de solvente orgánico. De esta manera, puede utilizarse 50%, 60%, 70%, 80% y 90% de solvente orgánico en agua. El solvente también puede contener una pequeña cantidad de ácido, como ácido acético, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 0.5% hasta cerca de 1.0%. La composición de los extractos, es decir, la representación (es decir, el perfil de los oligomérico) y la cantidad de oligómeros procianidina, dependerán de la elección de los solventes. Por ejemplo, el extracto con agua contiene principalmente monómeros, el extracto de acetato de etilo contiene monómeros y oligómeros inferiores, principalmente dimeros y trímeros, y los extractos de metanol, etanol o acetona acuosos contienen monómeros y una porción de oligómeros superiores. Uno de los solventes preferidos para extacción de monómeros asi como oligómeros procianidina superiores es acetona al 70%. Sin embargo, cualquier extracto que contenga polifenoles es útil en la invención. Los métodos de extracción de polifenol de cacao se conocen en la técnica y están descritos, por ejemplo, en la patente US No. 5,554,645 por Romanczyk y col., y la solicitud Internacional No. PCT/US97/05693, publicada como WO 097/36497. De esta manera, en una modalidad, el extracto de cacao se prepara por reducción de semillas de cacao hasta polvo de cacao, desgrasando el polvo, la extracción de los polifenoles de cacao y purificación del extracto. El polvo de cacao puede prepararse por secado por congelamiento de las semillas y pulpa de cacao, despulpando y descascarando las semillas de cacao secadas por congelamiento y triturando las semillas descascaradas.
El extracto de polifenoles de cacao puede ser purificado, por ejemplo, separando - la cafeina y/o teobromina, y purificado además por cromatografia de permeación en gel y/o cromatografia liquida de alta resolución (HPLC) . Puede utilizarse cromatografia de permeación en gel. (Por ejemplo, sobre Sephadex LH-20) para enriquecer el extracto de oligómeros de pirocianidina superiores. Por ejemplo, el eluido que contiene monómeros y oligómeros inferiores no puede ser recolectado hasta que el (los) oligómero (s) de elección comience (n) a eluir de la columna. Se conoce un ejemplo de tal extracto en la técnica y esta descrito en el Ejemplo 5 de la solicitud Internacional No. PCT/US97/05693, publicada como WO097/36497, las secciones relevantes de la cual se incorporan en la presente como referencia. Por ejemplo, usando HPLC preparativa, HPLC en fase norma, el extracto puede ser fraccionado, por ejemplo, en las fracciones monoméricas y oligoméricas que contienen cuando menos 50% del monómero u oligómero (s) especifico (s) . Cuando las fracciones contienen el monómero y oligómeros inferiores (hasta e incluido el tetrámero) , las fracciones contienen aproximadamente 90 hasta 95% en peso de la fracción oligomérica particular. Las fracciones deseadas pueden combinarse después de la separación hasta obtener una combinación de los oligómeros de elección, por ejemplo, hasta contener los oligómeros 3-10 ó 5-10. Una persona con experiencia en la I técnica puede manipular las condiciones cromatográficas para conseguir el perfil deseado de pnocianidina tomando en cuenta los lineamientos de esta especificación, el conocimiento general en la técnica y, por ejemplo, las enseñanzas de la patente US No. 5,554,645 de Romanczyk y col., y la solicitud Internacional No. PCT/US97/05693, publicada como W097/36497.
El polifenol de cacao también se puede proporcionar en la composición de la invención por los ingredientes de cacao que contiene polifenoles o incluyendo chocolate, que puede ser chocolate de leche, dulce y semidulce, y preferiblemente es chocolate oscuro, y chocolate bajo en grasas. Los ingredientes del cacao pueden ser preparados con los procesos de elaboración de cacao tradicionales pero preferiblemente se prepara usando el método descrito en la patente US No. 6,015,913 por Kealey y col., de otro modo, para mejorar el nivel de los polifenoles de cacao, puede utilizarse el licor de chocolate y sólidos de cacao preparados de semillas de cacao que tengan un factor de fermentación de 275 o menos. Estos ingredientes tienen un contenido de polifenol de cacao mayor que el que se puede obtener usando los métodos de elaboración de cacao tradicionales (por ejemplo, tostado) y semillas completamente fermentadas. El chocolate puede prepararse usando técnicas tradicionales a partir de los ingredientes antes descritos o usando un proceso mejorado para preservar los polifenoles de cacao durante la elaboración del chocolate, como se describe en la solicitud Internacional No. PCT/US99/05514 publicada como WO 99/45788, las porciones relevantes de la cual se incorporan en la presente como referencia. Un chocolate preparado por cuando menos uno de los siguientes procesos no tradicionales se conoce en la presente como un "chocolate que tienen una cantidad conservada de polifenoles de cacao": (i) preparando los ingredientes de cacao a partir de una semilla de cacao subfermentada o no fermentada; (ii) preservando el polifenol de cacao durante el proceso de elaboración del ingrediente de cacao; y (iii) preservando el polifenol de cacao durante el proceso de elaboración de chocolate.
También pueden utilizarse las procianidinas sintéticas y se preparan por los métodos conocidos en la técnica, como se describe por ejemplo, en la solicitud internacional No. PCT/US98/21392 publicada como WO 99/19319. Las porciones relevantes de la cual se incorporan en la presente como referencias También pueden ser útiles los derivados de polifenoles de cacao. Estos incluyen monómeros " y oligómeros galados, monómeros y oligómeros glucosilados y mezclas de éstos; los metabolitos de los monómeros y oligómeros de procianidina, como las formas sulfatadas, glucoronidadas [sic] y metiladas; y enzimas que desdoblan los productos de procianidinas generadas por metabolismo de la microflora colónica o el metabolismo interno de mamiferos. Los derivados pueden ser de fuentes naturales o preparados sintéticamente.
La composición además comprende un agente reductor de colesterol. Puede utilizarse cualquier agente sin consilderar su modo de acción. Los agentes adecuados pueden actuar reduciendo la absorción de colesterol en la bilis de un mamífero o reduciendo la sintesis de colesterol. Los ejemplos de agentes adecuados son fitosteroles, fitostanoles y sus derivados e isómeros; proteina de soya, fibras solubles, por ejemplo, avena y silium, nueces, aceite de salvado de arroz, cada uno de los cuales es particularmente adecuado para su uso en alimentos, suplementos de dieta y composiciones aditivas para alimentos. Pueden utilizarse los medicamentos reductores de colesterol conocidos, pero son menos preferidos para su uso en alimentos y composiciones aditivas para alimentos, pero pueden utilizarse en un farmacéutico. Será obvio para una persona experta en la técnica que la elección del agente reductor de colesterol depende del vehiculo propuesto para el suministro (por ejemplo, alimento, suplemento, farmacéutico) y el modo de administración. De esta manera, un agente que reduce la absorción de colesterol en la bilis no será preferido para administración intravenosa. Del mismo modo, si el vehiculo de suministro es alimento, tal vez no sea adecuado el agente reductor de colesterol que tenga un sabor u olor medicinal fuerte.
Los fitosteroJes son esteróles de plantas que no se disuelven en agua y tienen la estructura y peso molecular similares al colesterol. El fitosterol reduce la absorción de colesterol en la bilis (de colesterol endógeno y de la dieta) asi como los niveles séricos de colesterol (total y LDL) sin ser absorbidos. Se han identificado unos cuarenta esteróles de plantas, pero el beta-sitosterol, campesterol y estigmasterol son los más abundantes. Otros ejemplos de esteróles útiles son brassicasterol, desmosterol, chalinosterol, poriferasterol y clionasterol. Pueden utilizarse esteróles individuales o una mezcla de esteróles, separados de fuentes naturales o sintéticas, e isomómeros y derivados de éstos. Son particularmente útiles los derivados de esteróles saturados, conocidos como estañóles, en los que todos los enlaces carbono-carbono en el anillo están saturados. Los estañóles adecuados tienen 28 ó 29 átomos de carbono e incluyen beta-sitostanol, clionastanol, 22, 23-dihidrobrassicastanol y campestenol. Los fitosteroles pueden ser sólidos (por ejemplo, polvo, granulos) o líquidos (por ejemplo aceite) .
Los esteróles y estañóles se encuentran en varios materiales de planta como se describe por ejemplo en la solicitud Internacional No. PCT/EP96/02344. Las fuentes ejemplares de los esteróles y estañóles son la corteza de pino, aceite de soya, resina liquida, extracto de retoños de bambú (descrito en la solicitud Internacional No. PCT/US98/12556, publicada como W098/57545) , aceite y vainas de cacao y aceite de salvado de arroz. La resina liquida, un subproducto de la industria de la pulpa y papel, es una buena fuente de estanol, es decir, beta-estanol.
El esterol de plantas puede obtenerse de fuentes naturales como aceites vegetativos [sic], sedimentos de aceites vegetativos [sic] , destilados de aceite vegetativo [sic] , y otras fuentes de aceites de plantas como la resina liquida, por medios relativamente sencillos y económicos. Por ejemplo, una preparación de esteróles a partir de sedimentos de aceites vegetales utilizando solventes como metanol está descrito en la Patente US No. 4,420,427 de Hamunen. Los estañóles se encuentran en pequeñas cantidades en la naturaleza, pero pueden ser fácilmente preparados a partir de esteróles por hidrogenación a partir de cualquiera de los diferentes métodos conocidos por los expertos en la técnica. Cuando una materia prima esterol se prepara a partir de un material de plantas contendrá una mezcla de algunos esteróles diferentes de esta manera, después de la hidrogenación, el estanol resultante también será una mezcla de diferentes estañóles. La mezcla es adecuada para usarse en la presente invención. Sin embargo, las preparaciones de esteróles puros específicos pueden ser hidrogenadas también para producir estañóles puros que también pueden ser utilizados.
El aceite de cacao extraído de vainas de cacao es una buena fuente de fitosterol. Los fitosteroles de cacao son una mezcla de esteróles unidos y libres, en donde los esteróles libres están presentes hasta cerca de 90% de los fitosteroles. Los fitosteroles incluyen campesterol, ß-sitosterol, stigmasterol, cicloartenoil, 24-metileno cicloartenoil, asi como cantidades menores de otros fitosteroles. Los fitosteroles unidos incluyen los esteres de ácidos grasos o derivados ferulados [sic] de los fitosteroles. El aceite de cacao también contiene tocóles, que incluyen tocoferoles (que tienen propiedades antioxidantes) y tocotrienoles que pueden tener actividad reductora del colesterol. El aceite de cacao se prepara por el proceso que comprende los pasos de: (i) molienda de las vainas de cacao; (ii) extracción de las vainas de cacao molidas con un solvente para los fitosteroles; (iii) separación del solvente; y (iv) recuperación del aceite de cacao. Las vainas de cacao, un subproducto de las semillas de cacao tostadas, pueden ser de semillas de cacao fermentadas, secas, semillas de cacao mic onizada, semillas de cacao tostada, y preferiblemente de semillas no fermentadas, secas, que contengan el mayor contenido de esterol total. Las semillas de cacao preferidas son Theobroma cacao. Los solventes preferidos son éter de petróleo, hexano, pentano y etil éter. El solvente puede recuperarse por destilación al vacio. En una modalidad, las vainas secas por congelamiento se muelen hasta un polvo fino con un molino Tekmar (Cincinatti, OH) y la masa molida se somete a una extracción durante la noche con éter de petróleo redestilado (p. eb. 38-39.6°C) en un aparato Soxtec (Fisher Scientific, Springfield, NJ) . A la mañana siguiente se separa cuidadosamente el solvente por evaporación en una corriente de nitrógeno, y los extractos resultantes se almacenan a -40°C. Los fitosteroles entonces pueden ser purificados por HPLC preparativa o cromatografia en columna.
También se pueden usar las formas esterificadas de esteróles y estañóles. La esterificación produce los esteroles/estanoles más solubles en grasas y aceites, lo cual puede, en algunos casos, ayudar a su incorporación en productos alimenticios u otros vehículos para el suministro. Por ejemplo, los esteróles pueden ser esterificados con esteres de ácidos grasos. Los ejemplos de tales esteróles esterificados incluyen acetato de sitosterol, oleato de sitosterol y oleato de stigmasterol. Los esteres de estanol pueden prepararse como se conoce en la técnica y como se describe por ejemplo en la Patente US No. 6,031,118 por van Amerogen y col., Patente US No. 5,892,068 por Higgins, Patente US No. 5,502,045 por Miettenen y col., y la Solicitud Internacional No. PCT/CA99/00655 (publicada como WO 00/04887) . En una modalidad, los esteres de estanol útiles se preparan por esterificación de cuando menos un esterol con un éster de ácido graso de C2 a C2 como se describe en la Patente US No. 5 , 958 , 9J3 por Miettenen y col. Es posible utilizar otros métodos conocidos en la técnica para incrementar la solubilidad de los esteróles y estañóles para la administración a un mamífero. Un método asi está descrito en la Patente US No. 5,932,562 de Ostlund, en donde el esterol o estanol se mezcla con lecitina para obtener un polvo soluble en agua.
Los esteróles y estañóles pueden ser adicionados a la composición en forma de polvo mezclándolos con otros ingredientes. En el caso de una composición alimenticia, el estanol o esterol, asi como otros agentes reductores de colesterol se adicionan convenientemente en el paso de mezclado. Durante la preparación del chocolate reductor de colesterol, por ejemplo, puede adicionarse esteróles y estañóles a la mezcla seca que contiene azúcar, la manteca fundida; los dientes antes de la molienda; o el chocolate fundido, que puede ser menos preferido. Para facilitar el mezclado, los esteróles y estañóles pueden disolverse primero en una agente solubilizante como grasa, aceite vegetal, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, tocoferoles y mezclas de éstos. Los vehículos efectivos para preparar suspensiones y emulsiones de esteróles y estañóles son agua, alcohol, poliol, otros compuestos comestibles, por ejemplo licor de chocolate, en los que los esteróles y estañóles son cuando menos parcialmente solubles, y mezclas de éstos.
La proteina de soya puede ser adicionada a la composición en cualquier forma, por ejemplo puede ser aislado de proteina de soya, proteina de soya concentrada, proteina de soya estructurada o harina, hojuelas y sémola de soya. El grano entero o fragmentos de éstos también pueden utilizarse como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 5. Algunas formas de proteina de soya son bien conocidas en la técnica y están disponibles en el comercio. Sus propiedades y métodos de obtención están descritos, por ejemplo, en Soy Protein and Human Nutrition, Wilcke y col., eds., Acad. Press, NY, 1979. Puede utilizarse la proteina de soya en combinación con cualquier agente reductor de colesterol a base de esterol o estanol, o ambos.
Las fibras solubles de plantas, por ejemplo, beta-glucano, son capaces de reducir el colesterol en plasma. Para su uso en la presente invención, las fibras pueden ser obtenidas de cualquier fuente de beta-glucano, preferiblemente grano de avena y salvado de avena. Las fibras pueden ser preparadas y adicionadas a las composiciones de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Estas son particularmente adecuadas para composiciones para suministro oral como alimentos y suplementos de dieta. Es posible utilizar el beta-glucano y otras fibras solubles de plantas en combinación con cualquier agente reductor de colesterol a base de esterol o estanol, o ambos.
La composición de la invención también puede contener L-arginina, que se puede incorporar en la composición de la invención en diversas formas, por ejemplo, como un compuesto purificado, un extracto de una planta que contenga L-arginina o en forma de un ingrediente de semilla/nuez, por ejemplo, harina de nuez, o como una semilla/nuez entera. Puede utilizarse cualquier fuente de L-arginina, sintética o natural. Las fuentes preferidas de L-arginina son frijol de soya y nueces comestibles como cacahuates, nuez de nogal, almendras y hezelnuts [sic] . Pueden utilizarse nueces comestibles desgrasadas y parcialmente desgrasadas. Estas pueden ser molidas y se conocen como harina de nuez.
La composición también puede contener calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C y cualquier otra vitamina del complejo B, un carotenoide, goma de guar, un ácido graso mono o poliinsaturado (por ejemplo el ácido graso omega-3) los cuales puede ser obtenido de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Los ácidos grasos mono o poliinsaturados pueden utilizarse en forma de un aceite de oliva, aceite de pescado o una nuez. Los ejemplos de las nueces adecuadas para este uso son cacahuates, almendras y nuez de nogal.
También entra dentro del campo de aplicación de la invención una composición que contenga un polifenol con cuando menos una de las siguientes propiedades: inducción de la vasorrelajación, inhibición de la actividad COX, inhibición de la actividad LOX, inhibición de la oxidación de LDL, mejoramiento de la actividad NOS, aumento de los niveles de NO, inhibición de la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducción de la presión sanguínea, reducción de trombosis y regulación del estrés oxidativo, y un agente reductor de colesterol. Puede utilizarse cualquier agente reductor de colesteroJ , por ejemplo, un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. En una composición como ésta, el agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol mejora la biodisponibilidad del polifenol. Los ejemplos de tales polifenoles son flavanoles (por ejemplo, catequina, epicatequina y derivados galados de éstos) , el flavonol (por ejemplo quercetina, kaempserol, miricetina y sus derivados glucosilados) , y las procianidinas, por ejemplo dimeros de procianidina, que pueden ser de cacao) .
La composición de la invención es útil como alimento, aditivo alimenticio, suplemento de dieta, o farmacéutico. Las composiciones pueden contener un vehiculo, un diluyente o un excipiente. Dependiendo del uso propuesto, puede elegirse el vehiculo, diluyente o excipiente que sea adecuado para uso humano o veterinario, para uso como alimento, aditivo, suplemento o farmacéutico.
Como se usa en la presente, "alimento" es un material que consiste principalmente en proteina, carbohidratos y/o grasa, que se usa en el cuerpo de un organismo para el crecimiento sostenido, reparación y procesos vitales y para proporcionar energia. Los alimentos también pueden contener sustancias complementarias como minerales, vitaminas y condimentos. Véase Merriam-Webster' s Collegiate Dictionary, 10a edición, 1993. El término alimento incluye una bebida adaptada para consumo humano o animal. Como se usa en la presente, un "aditivo alimenticio" es como lo definió la FDA en 21 C. F. R. 170.3(e) (l) e incluye aditivos directos e indirectos. Como se utiliza en la presente, un "farmacéutico" es una droga medicinal. Véase Merriam-Webster' s Collegiate Dictionary, 10a edición, 1993. Un farmacéutico también puede mencionarse como medicamento.
Como se utiliza en la presente, un "suplemento de dieta" es un producto (diferente del tabaco) que se propone para suplementar la dieta, que lleva o contiene uno o más de los ingredientes de la dieta: una vitamina, un mineral, una hierba u otro botánico, un aminoácido, una sustancia de dieta para uso por humanos para suplementar la dieta aumentando el consumo diario total, o un concentrado, metabolito, constituyente, extracto o combinación de estos ingredientes.
Cualquier alimento convencional que incluya alguna bebida que haya sido mejorada por un agente reductor de colesterol en combinación con un polifenol, como polifenol de cacao o un derivado de éste, y opcionalmente en combinación con L-arginina, calcio," potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma de guar y/o un ácido graso mono o poliinsaturado (por ejemplo omega-3) estará dentro del alcance de la invención.
En el caso del polifenol de cacao, el mejoramiento se logró (i) por la adición de polifenol de cacao o un derivado de éste a un alimento que no contiene polifenol de cacao, o (ii) cuando el alimento tradicionalmente contiene polifenoles de cacao, como el chocolate, mejorando el nivel de polifenol sobre el que se encuentra en el alimento preparado como es habitual. El mejoramiento puede lograrse adicionado otros polifenoles de cacao, por ejemplo, en forma de un extracto; adicionando polifenol de cacao en combinación con otro ingrediente que contenga polifenol (por ejemplo la piel de la nuez) ; manipulando el procesamiento de los ingredientes de cacao y la selección de la semilla de cacao, como ya se describió, para conservar el polifenol de cacao en el ingrediente de cacao que se utiliza para la elaboración del producto alimenticio; o por la manipulación del proceso de fabricación del chocolate como ya se describió. De esta manera, estos alimentos (incluidas las bebidas) contienen un "elevado nivel de polifenoles" (que incluyen procianidinas de cacao) en comparación con los alimentos comparativos cojmunes (que incluyen bebidas) . Un ejemplo de un chocolate, que tiene un elevado nivel de polifenol se encuentra cuando un fabricante de chocolate adiciona a ' su producto, ya disponible en el comercio, un extracto de cacao que contiene polifenoles de cacao. Los alimentos también pueden ser denominados "alimentos altos en polifenol de cacao", es decir, estos contienen mayores niveles de polifenol que sus contrapartes tradicionales.
Los alimentos que contienen polifenoles de cacao y cuando menos un agente reductor de colesterol (por ejemplo, un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol) , y opcionalmente L-arginina, calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma de guar, o un ácido graso mono o poliinsaturado (por ejemplo omega-3) puede ser adaptado para uso humano o veterinario, e incluye alimentos para mascotas. El alimento puede ser diferente a un producto de repostería, sin embargo, el alimento reductor de colesterol preferido es un producto de repostería, como un chocolate estándar de identidad (SOI) y no-SOI, como chocolate de leche, dulce y semidulce, que incluye el chocolate oscuro, chocolate bajo en grasa y un dulce que_ puede ser un dulce cubierto con chocolate. Otros ejemplos incluyen un producto horneado (por ejemplo, brownie, bocadillo horneado, galleta, biscocho) , condimento, barra de granóla, dulce chicloso, barra para reemplazo de comida, producto para untar, jarabe, mezcla en polvo para bebida, bebida sabor a chocolate o cacao, budin, torta de arroz, mezcla de arroz, condimento picante y similares. Si se desea, los alimentos pueden ser de sabor a chocolate o cacao. Los productos alimenticios que contienen L-arginina, además del polifenol de cacao y el agente reductor de colesterol, son preferiblemente chocolates y barras de dulce, como las barras de granóla, que contienen nuez, por ejemplo cacahuates, nuez de nogal, almendras y hazelnuts [sic] . Cabe señalar que la adición de nueces con piel a los alimentos descritos también puede aumentar el contenido de polifenol total ya que, por ejemplo, las pieles del cacahuate contienen aproximadamente 17% de procianidinas y la piel de la almendra contiene aproximadamente 30% de procianidinas. En una modalidad, las pieles de nueces se adicionan al nougat de un dulce de chocolate que "contenga un agente reductor de colesterol.
En las modalidades preferidas, los productos alimenticios no chocolate que contienen un agente reductor de colesterol contienen desde aproximadamente cuando menos 5 µg/g hasta cerca de 10 mg/g, y por ejemplo, cuando menos 15 µg/g del producto alimenticio, preferiblemente cuando menos 10 µg, más preferiblemente cuando menos 100 µg/g de procianidinas de cacao. Si se desea, los productos alimenticios no chocolate pueden contener niveles mucho mayores de procianidinas de cacao que los que se encuentran en los productos alimenticios de chocolate descritos más adelante.
Un producto particularmente preferido es un producto de repostería de chocolate reductor de colesterol y el mayormente preferido es chocolate oscuro. En ciertas modalidades, el chocolate contiene cuando menos 3,600 µg, preferiblemente cuando menos 4,000 µg, preferiblemente cuando menos 4,500 µg, más preferiblemente cuando menos 5,000 µg, y más preferiblemente cuando menos 5,500 µg de procianidinas de cacao por gramo de chocolate, con base en la cantidad total de sólidos de cacao no graso en el producto. En otras modalidades, el chocolate contiene cuando menos 6,000 µg, preferiblemente cuando menos 6,500 µg, más preferiblemente cuando menos 7,000 µg y más preferiblemente cuando menos 8,000 µg de procianidinas de cacao por gramo, y aún más preferiblemente 10,000 [lacuna] con base en los sólidos de cacao no grasos del producto.
Un postre de chocolate de leche reductor de colesterol puede tener cuando menos 1,000 µg, preferiblemente cuando menos 1,250 µg- mas preferiblemente cuando menos 1,500 µg, y aún más preferiblemente cuando menos 2,000 µg de procianidinas de cacao por gramo, con base en la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto de chocolate con leche. En una modalidad preferida, el chocolate de leche contiene cuando menos 2,500 µg, preferiblemente cuando menos 3,000 µg, más preferiblemente cuando menos 4,000 µg, y aún más preferible cuando menos 5,000 µg de procianidinas de cacao por gramo, con base en la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto de chocolate con leche. I La cantidad de L-arginina en los productos alimenticios puede variar. Por lo regular, el cacao contiene entre 1 hasta 1.1 gramos de L-arginina por 100 gramos de sólidos de cacao parcialmente desgrasados. Puede variar desde 0.8 hasta 1.5 por 100 gramos de cacao. Los productos alimenticios de chocolate de esta invención contienen L-arginina en una cantidad mayor que la que se encuentra en forma natural en los ingredientes de cacao. Conociendo la cantidad de ingredientes de cacao y L-arginina usada en el producto alimenticio, un experto en la técnica puede rápidamente determinar la cantidad total de L-arginina en el producto final. El producto alimenticio generalmente contiene cuando menos 5 µg/g, preferiblemente cuando menos 30 µg/g o cuando menos 60 µg/g, aún más preferible cuando menos 200 µg/g del producto alimenticio.
La cantidad de agente reductor de colesterol en el alimento depende del tipo de agente que se utilice y puede ser determinada por una persona experta en la técnica con base en la especificación, particularmente la dosificación diaria que se proporciona más adelante, y el conocimiento de la técnica. Por ejemplo, una composición alimenticia puede contener desde aproximadamente 0.5 hasta cerca de 10 g por 45 g de una, preferiblemente aproximadamente 1.5 hasta porción determinada cerca de 5 g por 45 g de porción determinada, más preferiblemente alrededor de 2 hasta cerca de 4.5 g por 45 g de porción determinada de esteroles/estanoles. Con respecto a la proteina de soya y fibras solubles de avena, la FDA ha proporcionado cantidades mínimas por porción alimenticia que pueden mantener la salud. De acuerdo con la FDA, una porción de alimento que contenga beta-glucano deberá contener cuando menos 0.75 g, y la porción alimenticia que contenga proteina de soya deberá contener cuando menos 6.25 g de proteina de soya. Estos valores también pueden utilizarse como una guia para determinar la cantidad de estos agentes reductores de colesterol en el alimento.
En una de las modalidades preferidas, una cantidad eficaz diaria del agente reductor de colesterol en el polifenol de cacao se proporciona en una sola porción. De esta manera, un producto de repostería reductor de colesterol (por ejemplo chocolate) contiene cuando menos 1.5 (por ejemplo 1.5 - 4.5 g) por porción de esterolJestanol y cuando menos aproximadamente 100 mg/porción aproximadamente (por ejemplo, 150-200, 200-400 mg) de procianidinas de cacao por porción.
Los farmacéuticos que contienen polifenoles con las propiedades ya mencionadas (por ejemplo, polifenoles de cacao o derivados de éstos) en combinación con un agente reductor de colesterol y opcionalmente L-arginina pueden administrarse en una variedad de formas como por via oral, bucal, nasal, rectal, intravenosa, parenteral y tópica. Una persona con experiencia en la técnica podrá determinar un agente reductor de colesterol adecuado, dependiendo del modo de administración. De esta manera, las formas de dosificación adaptadas para cada tipo de administración están dentro del alcance de la invención e incluyen las formas de dosificación sólida, liquida y semi-sólida, como tabletas, cápsulas, cápsulas de gelatina (gelcaps) , polvos a granel o dosis unitaria o granulos, emulsiones, suspensiones, pastas, cremas, geles, espumas o jaleas. Las formas de dosificación de liberación sostenida también están dentro del alcance de la invención y pueden ser preparadas como se describe en las Patentes US Nos. 5,024,843; 5,091,190; 5,082,668; 4,612,008 y 4,327,725, las porciones relevantes de las cuales están incorporadas en la presente como referencia. Los vehículos, diluyentes o excipientes aceptables farmacéuticamente, adecuados, son los generalmente conocidos en la técnica y pueden ser determinados fácilmente por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, la tableta puede contener una cantidad eficaz de la composición que contiene polifenol de cacao y opcionalmente un vehiculo, como sorbitol, lactosa, celulosa o fosfato dicálcico. El suplemento de dieta que contiene polifenoles de cacao, cuando menos un colesterol de agente reductor y opcionalmente L-arginina, puede ser preparado usando los métodos conocidos en la técnica y puede comprender, por ejemplo, nutrientes tales como fosfato dicálcico, estearato de magnesio, nitrato de calcio, vitaminas y minerales.
Además, dentro del alcance de la invención, está un envase que contiene un alimento, un suplemento de dieta o un farmacéutico, y un marbete indicando (i) la presencia, o un contenido mejorado, de polifenoles y/o derivados de éstos y (ii) la presencia de un agente reductor de colesterol. Opcionalmente, el marbete puede indicar el contenido de L-arginina, las propiedades benéficas del (los) polifenol (es) combinados, el (los) agente (s) reductor (es) de colesterol y opcionalmente L-arginina y las instrucciones de uso. Como menciona en la presente, las propiedades benéficas incluyen reducción de colesterol en plasma, total y LDL, inhibición de la actividad COX (incluyendo actividad COX 1) , inhibición de la actividad LOX, aumento en la producción de óxido nitrico, aumento de la relación de los factores aterostático a aterogénico (es decir, eicosanoide y endotelinas producidas) e inhibición de la oxidación de LDL, que a su vez, en forma individual o en combinación, ayudan a reducir la vasoconstricción y la agregación plaquetaria, inhiben la adhesión de monocitos, inhiben la proliferación excesiva del músculo liso vascular, reducen la trombosis, reducen la presión sanguínea, y de este modo reducen los riesgos asociados con enfermedades vasculares y cardiovasculares como aterosclerosis y enfermedad cardiovascular.
También dentro del alcance de la invención está un envase que contiene (i) una composición que comprende un polifenol con cuando menos una de las siguientes propiedades: inducción de la vasorrelaj ación, inhibición de la actividad COX, inhibición de la actividad LOX, inhibición de la oxidación de LDL, mejoramiento de la actividad NOS, aumento del nivel de NO, inhibición de la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducción de la presión sanguínea, reducción de la trombosis y modulación del estrés oxidativo, y un agente reductor de colesterol, por ejemplo, un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol; y (ii) un marbete y/o las instrucciones para el uso de la composición para favorecer la salud vascular (también puede utilizarse el término salud cardiovascular) y/o reducir el riesgo de cardiopatias . Cuando se emplea un agente reductor de colesterol a base de estanol y/o esterol, en el marbete y/o las instrucciones se puede mencionar que la composición favorece o mejora la absorción del polifenol. El marbete y/o las instrucciones también pueden indicar otras de las propiedades benéficas antes mencionadas. Éstas son la disminución del colesteroJ en plasma, total y LDL, inhibición de la actividad COX, inhibición de la actividad LOX, mejoramiento de la producción de óxido nitrico, aumento de la relación de factores aterostático aterogénico (es decir, eicosanoide y endotelinas producidas) e inhibición de la oxidación de LDL, que a su vez, individualmente o en combinación, ayudan a la reducción de la vasoconstricción y la agregación plaquetaria, inhiben la adhesión de monocitos, inhiben la proliferación excesiva del músculo liso vascular, reducen la trombosis, reducen la presión sanguínea, y de esta manera reducen los riesgos asociados con las enfermedades vasculares y cardiovascular como aterosclerosis y enfermedad cardiovascular.
También dentro del alcance de la invención están los métodos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o estados asociadas con, o regulados por, la actividad COX, actividad LOX, producción de NO, actividad NOS, oxidación de LDL y colesterol total y LDL aumentado en plasma. Como se utiliza en la presente, "tratamiento" significa el mejoramiento de un estado médico existente, por ejemplo, presión sanguínea alta o aterosclerosis, al afectar la patología de la enfermedad o los síntomas asociados con ésta. El término "prevención" significa reducir los riesgos asociados con el desarrollo de una enfermedad, que incluye reducir el principio de la enfermedad. La prevención o profilaxis puede practicarse en un individual del cual se conoce que está en alto riesgo de desarrollar una enfermedad o en una población en general para mantener la buena salud, por ejemplo, el mantenimiento de la salud vascular. Los métodos pueden practicarse en un humano o un animal veterinario, como perro, gato o caballo.
Las enfermedades y/o estados asociadas con, o regulados por, la actividad COX, actividad LOX, producción de NO, actividad NOS, oxidación de LDL y/o colesterol alto incluyen aterosclerosis, hipertensión, cardiopatias coronarias (CHD) , enfermedad cerebro vascular, ataque cardiaco, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica e insuficiencia renal. También se incluyen los métodos para el tratamiento o prevención de hipocolesterolemia (que incluyen hipercolesterolemia leve) , mediante la inducción de vasorrelajación, inhibición de la actividad COX (incluida COX1) y LOX por la inhibición de la oxidación de LDL, el mejoramiento de la actividad NOS y el aumento en el nivel de NO, inhibición de la agregación plaquetaria, la adhesión de monocitos y proliferación del músculo liso vascular, reducción de la presión sanguínea, reducción de trombosis y regulación del estrés oxidativo.
Los métodos consisten en la administración a un mamífero, preferiblemente a un humano o a un animal veterinario, ~ de una cantidad de la composición que contiene un polifenol, por ejemplo, polifenol de cacao y un agente reductor de colesterol, y opcionalmente L-arginina, eficaz para tratar, prevenir o lograr cuando menos uno de los efectos benéficos antes mencionados además de reducir el colesterol. Los métodos pueden comprender determinar la eficacia del tratamiento, por ejemplo, determinando los niveles de colesterol en plasma .
La composición puede ser administrada a un mamífero sano para propósitos profilácticos, o a un mamífero, en necesidad de un tratamiento, que tenga cuando menos uno de los factores de riesgo mencionados. Cualquier individuo que tenga cuando menos uno de los factores de riesgs asociados con problemas de salud vascular es un candidato para la administración de las composiciones descritas en la presente. Los individuos con una historia familiar de niveles de colesterol elevado, mujeres peri-o post-menopáusicas, mujeres post-menopáusicas con daño post-isquémico del miocardio, mujeres "con deficiencia de estrógenos inducida quirúrgic o químicamente, personas de edad avanzada que presenten hipergiucemia, diabetes, hipertensión y obesidad y fumadores, todos son individuos susceptibles en necesidad del tratamiento descrito en la presente. Otras poblaciones de mamiferos susceptibles a desarrollar problemas de salud vascular serán evidentes para un experto en la técnica.
Los métodos son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de restenosis. En Estados Unidos aproximadamente 330,000 pacientes por año sufren de angioplastia coronaria y/o periférica (Marx, 265, Science 320, 1994), un procedimiento diseñado para abrir vasos sanguíneos, por ejemplo, arterias coronarias obstruidas por placas ateroscleróticas con el fin de restaurar el flujo sanguíneo normal. Cerca del 33% de estos pacientes, sin embargo, desarrollan restenosis, es decir, las arterias tratadas rápidamente se vuelven a obstruir. Los pacientes no están en mejores condiciones, y algunas veces su situación es peor que antes de la angioplastia. La proliferación excesiva de células de músculo liso (SMC) en las paredes de los vasos sanguíneos contribuye a la restenosis. De esta manera, las composiciones que contienen polifenol de cacao y un agente reductor de colesterol (y opcionalmente L-arginina) pueden ser administradas antes de la angioplastia, o poco después, como lo juzgue conveniente el especialista.
En animales veterinarios, por ejemplo perros, gatos y caballos, se pueden administrar las composiciones ya descritas para tratar o prevenir insuficiencias cardiacas, degeneración valvular e insuficiencia renal crónica. Por ejemplo, es posible administrar a perros las composiciones de la invención dirigidas a las siguientes condiciones: enfermedad vascular crónica, (endocardiosis o degeneración mixomatosa de las válvulas atrioventriculares) , cariomiopatia dilatada, enfermedad pericarial, endocarditis, arritmias primarias y enfermedad por dilofilaria.
También se proporciona un método para aumentar la absorción de un polifenol en la sangre de un humano o animal veterinario (mascota) . El método-, que en esencia mejora la biodisponibilidad de los polifenoles benéficos para la salud del humano o animal, consiste en la administración al humano o animal veterinario, en combinación: (i) un polifenol que tenga cuando menos una de las siguientes propiedades: inducir la vasorrelajacion, inhibir la actividad COX, inhibir la actividad LOX, inhibir la oxidación LDL, mejorar la actividad NOS, aumentar el nivel de NO, inhibir la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducir la presión sanguínea, reducir la trombosis y regular el estrés oxidativo, y (ii) un agente reductor de colesterol a base de esterol o estanol, o ambos. El polifenol puede ser, por ejemplo, un flavanol o un flavonol, los ejemplos de los cuales fueron ya proporcionados. El método se practica administrando el polifenol y el esterol o estanol, o ambos, como componentes de la misma composición o por separado.
La persona experta en la técnica puede determinar la cantidad eficaz usando la guia que se ofrece en la presente y con el conocimiento general de la técnica. Por ejemplo, para obtener los efectos reductores de colesterol usando los esteroles/estanoles, se administrarla más de lo que normalmente se encuentra en la dieta promedio de un no vegetariano. Una persona con una dieta norteamericana común consume alrededor de 200-400 mg/dia. De esta manera, cuando se utiliza fitosterol, como sitosterol, para reducir los niveles de colesterol, deberá administrarse alrededor de cuando menos 1 g/dia, preferiblemente cuando menos cexca de 3 g/dia. Preferiblemente se utiliza desde cuando menos alrededor de 1 g/dia, preferiblemente cerca de 4.5 g/dia, hasta cerca de 20 g/dia. Sin embargo, la cantidad varia dependiendo de la potencia reductora de colesterol de fitosterol porque, por ejemplo, si se usa un sitostanol más potente, la cantidad eficaz puede ser tan baja como aproximadamente 1 hasta cerca de 3 g/dia. Las cantidades pueden ser determinadas empleando los procedimientos analíticos descritos por Roger y col., J. Amer. Oil. Chem. Soc. 70_ (30) 1993 y Carpenter, y col., J. Amer.
Oil. Chem. Soc. 7JL (8) 1994. La proteina de soya puede ser administrada, por ejemplo, cuando menos aproximadamente 25 g/dia. Otros lineamientos pueden encontrarse en Recommended Daily Allowances, 9a ed. Nacional Res. Council/Nacional Acad. Sci., Washington, D. C. Las fibras solubles pueden ser administradas por ejemplo hasta cuando menos 3 g/dia. Puede adicionarse el polifenol de cacao desde cerca de 50 g/dia hasta acerca de 1000 mg/dia, preferiblemente desde alrededor de 100-150 mg/dia hasta cerca de 900 mg/dia y más preferiblemente desde cerca de 300 mg/dia hasta cerca de 500 mg/dia. Sin embargo, dado que los polifenoles se encuentran naturalmente en alimentos y son no tóxicos, pueden utilizarse "cantidades mayores que las ya establecidas. La L-arginina puede ser -administrada desde aproximadamente 2 g/dia hasta cerca de 50 g/dia, preferiblemente desde alrededor de 3 g/dia hasta cerca de 10 g/dia, y más preferiblemente desde alrededor de 6 g/dia hasta cerca de 8 g/dia. Aqui también, dado que L-arginina se encuentra en forma natural en alimentos, es posible emplear cantidades mayores que las ya establecidas. En general, los polifenoles pueden ser administrados en las cantidades conocidas en la técnica. Cuando se determine la cantidad eficaz también se puede tomar en cuenta la absorción mejorada en presencia de esteroles/estanoles .
El tratamiento/administración preventiva puede ser continua como un régimen, por ejemplo, diario, mensual, bimensual, bianual, anual o en alguno otro régimen, como lo determine el especialista, durante el tiempo necesario. Preferiblemente, la composición se administra diariamente, más preferible dos o tres veces por dia, por ejemplo, mañana y tarde, para mantener la concentración eficaz del compuesto en el cuerpo del mamífero. Para obtener los resultados más benéficos, se puede administrar la composición durante cuando menos alrededor de 30 hasta cerca de 60 dias. Estos regímenes se pueden repetir en forma periódica.
La invención además se describe en los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Efecto de las procianidinas de cacao sobre la actividad de la lipoxigenasa __ Las fracciones fenólicas (monómero hasta hexámero) y los extractos (acetona cruda y pentámero enriquecido) se prepararon como se describe en los Ejemplos 1-5 de la Patente US No. 5,554,645 de Romanczyk y col. y el Ejemplo 5 de la Solicitud Internacional No. PCT/US 97/05693 publicada como WO 97/36497. De Sigma Chemical se obtuvieron la lipoxigenasa Tipo I-B de frijol de soya, ácido linoléico (aproximadamente 99%), Tween 20 (polioxietileno- monolaurato de sorbitan) , y fenoles control (ácido nordihidroguaiarético (NDGA), (+)-catequina y (-) -epicatequina) .
Se solubilizó el ácido linoléico utilizando Tween 20 como emulsificador conforme a Grossman & Zakut (Methods Biochem. Anal. 25: 303-329, 1979). La lipoxigenasa se disolvió en PBS, pH 8.6, a una concentración de 5 000 U/mL. Los fenoles de cacao fueron disueltos en agua pura y diluidos a partir de las soluciones concentradas siguientes. Los 1 hasta 6meros fueron disueltos a 1 mM, los extractos a 1 mg/mL (1 g de extracto de acetona cruda/L de monómero -3.0 mM, 1 g de extracto enriquecido con el 5mero /L ~3.4 mM) .
Se calculó la inhibición para cada serie de muestras de 6 cubetas de reacción (un control con agua, 5 experimentales con fenol en agua) de conformidad con la fórmula: % inhibición = (? abs. control - ? abs. experimental) /? abs. control) x 100. Las mezclas de reacción contenían ácido linoléico disuelto (100 µM) en PBS, pH 7.4 más/menos los fenoles de prueba en agua. La reacción se inició por la adición de polioxigenasa a una concentración final de 100 U/mL. La -medición del dieno conjugado de la formación del hidroperóxido de ácido linoléico se midió anotando los barridos cinéticos durante 5 hasta 10 minutos en un espectrofotómetro UV Beckman DU-600 (a 37°C, absorbancia 234 nm) .
La mayor absorbancia de los componentes de cacao no permitió la medida de la IC50 a las concentraciones reales. Por esta razón se calculó un valor IC50 extrapolando la curva de regresión logarítmica (% de inhibición sobre la concentración logarítmica del fenol) a la concentración a la cual se llegó al 50% de la actividad lipoxigenasa por la sustancia de prueba. Los valores IC50 extrapolados dan una aproximación de la actividad inhibitoria de lipoxigenasa délos extractos polifenólicos de cacao.
El NDGA es un inhibidor de las lipoxigenasas de frijol de soya y de algunos mamiferos (Kemal y col., Biochemistry 26: 7064-7072, 1987) . Se utiliza en el comercio como antioxidante en grasas y aceites. El NDGA sirvió como control positivo ya que otros fenoles de prueba no llegaron al valor IC50 de 2 x 10 M. Se supone que la (+) -catequina y (-) -epicatequina son estructuralmente similares al monómero polifenol de cacao.
Los fenoles fueron comparados según su molaridad. La inhibición de la lipoxigenasa mediante la (+) -catequina (3 x 10" M) fue dos veces mayor que por la (-)-epicatequina (3 x 10 ,-1 M) y muy similar a la inhibición por el monómero (5 x 10 M) , el dimero (2 x 10 M) y trímero (2 x 10 M) de +cacao [sic] . La inhibición de la lipoxigenasa por los oligómeros superiores se correlacionó menos bien con el log de la concentración molar. A concentraciones finales de 0.3 hasta 25 µM, el tetrámero, pentámero y hexámero inhibieron 5-30% la actividad de la lipoxigenasa. Sin embargo, la concentración e inhibición del fenol no se correlacionron significativamente. El extracto de acetona cruda mostró una inhibición de lipoxigenasa dependiente de la concentración (IC5Q = 5 µM, en comparación con los monómeros) aproximadamente 3 veces más débil que el monómero hasta las fracciones de los trímeros. El extracto enriquecido de pentámero (IC50 = 59 M) no inhibió la actividad lipoxigenasa en up nivel importante.
La actividad inhibitoria de la lipoxigenasa de frijol de soya, de los extractos fenólicos de cacao se asemeja a la de (+) -catequina . Hay poca diferencia entre las actividades del monómero hasta trímero si se comparan por su molaridad, lo que sugiere una inhibición estérica de la enzima. La inhibición puede ser especifica para los componentes de peso molecular bajo (monómero hasta trímero) ya que los compuestos tetrámeros hasta hexámeros muestran considerablemente menos actividad inhibitoria de la lipoxigenasa y el extracto enriquecido de pentámero es menos inhibidor que el extracto crudo, el cual contiene más de las fracciones oligoméricas monómero a trímero. De esta manera, los polifenoles de cacao inhiben la lipoxigenasa de frijol de soya por quelación del ion hierro prostético, o por depuración---- de los radicales libres por los grupos hidroxilo fenólicos en la reacción de oxidación, que incluye los intermediarios radicales libres. Los oligómeros superiores (los tetrámeros hasta hexámeros) pueden presentar impedimento estérico y de esta manera pueden no ser capaces de registrar el sitio catalítico de la enzima.
Ejemplo 2: Efectos de los extractos ..de procianidina de cacao y fracciones oligoméricas de procianidina de cacao sobre la liberación de células endoteliales básales prostanoides y endotelina (ET) total Se estudió el efecto de los monómeros y pentámeros de procianidina purificados a partir del extracto de polifenol de cacao sobre la liberación de los prostanoides: prostaciclina, prostaglandina (PGE2) y tromboxano, y endotelina total en un cultivo de células endoteliales humanas y bovinas.
Se adquirió la indometacina de Cayman (Ann Arbor, MI EU) . Las fracciones monoméricas y" pentaméricas de procianidina fueron purificadas de semillas de cacao enriquecidas con procianidina (procesada de conformidad con el método descrito en la Patente US No. 6,015,913, publicada el 18 de enero de 2000) , por los métodos descritos en los Ejemplos 1-5 de la Patente US No. 5,554,645, publicada el 10 de septiembre de 1996.
Las muestras fueron analizadas por el método de Hammerstone y col., (J. Agrie. Food Chem. 47: 2, 490-496, 1999) . La confirmación de la pureza molecular se obtuvo por espectrometría de masas.
Se cultivaron células endoteliales aórticas, bovinas (BAEC) y células endoteliales aórticas, humanas (HAEC) en un medio esencial minimo de Eagle (EMEM) como lo describió previamente Schramm y col., (J. Nutr. Biochem. 8: 647-651; J. Agrie, and Food. Chem., 46(5); 1900-1905, 1998) .
Las CE (pasaje <11) fueron sembradas en placas de 24 pozos con EMEM que contenían 2 mmol de glutamina/L, 10% de suero bovino fetal y 100 unidades de penicilina/L y 0.1 mg de estreptomicina/L, y 0.25 pg de anfotericina/L. Las células confluentes fueron tratadas en 250 mL de EMEM sin rojo fenol que contenia los compuestos de tratamiento, según fue conveniente.
El medio incubado con las CE fue analizado después de la adición de fracciones de prociapidina (10, 20 y 30 pmol/L) y se incubó con las CE durante 0 hasta 20 min. El medio se almacenó a -70 °C hasta que se analizó por inmunoensayo como se describe en lo sucesivo. La integridad de las CE se supervisó por exclusión con Azul de Tripano como se describe en Bioadjieras y col., Methods in Lab. Invest. 50:239-246, 1984.
Los procedimientos del inmunoensayo se realizaron como los describe Westcott y col., Prostaglandins, 32:857-873, 1986; Yakota y col., Adv. Prostgl. Thrombox.
Leukot. Res. 15:33-34, 1985; Schramm y col., 1997; 1998; 1999. La ET total media (ET-1 + ET-2 + ET-3) se midió con inmunoensayo Cayman #583151. El metabolito ß-ceto de la prostaciclina (PGE2) prostaglandina Fl-alfa se midió con inmunoensayo enzimático Cayman #515211. El metabolito TXB2 de tromboxano (TXA2) se midió con inmunoensayo enzimático Cayman 519031 y la PGE2 se determinó con inmunoensayo Cayman #514016.
Las condiciones establecidas del ensayo imitaron las usadas previamente para mostrar que una fracción de vino, con masa < 3000 da, indujo efectos diferentes sobre la sintesis de CE prostanoides en comparación con una fracción de vino que tenia una masa de > 3000 (Schramm y col., J. Agrie, and Food. Chem. 46 ( 5 ) -*_ 1900-1905, 1998). Se examinaron los efectos sobre la función de las células básales. Ni la viabilidad celular ni la morfología celular fueron efectuadas [sic] por los tratamientos de procianidina de cacao. Cada mililitro de medio control incubado con BAEC durante 20 min contenia 73.5 = +/- [sic] 0.44 ng de TXB2 y 294 +/- 6.3 pg de PGE2.
Como se muestra en la Figura 2, la adición de procianidinas de cacao pentaméricas o monoméricas a un medio incubado con BAEC durante 20 min alteró las concentraciones de prostahoides y ET del medio cuando se compararon con el medio control solo. Los medios que contenían procianidinas monoméricas (A ) ó pentaméricas 2 -_ (A ) contenían más 6-ceto-PGF -alfa que el medio control. El PGE2 del medio fue reducido por la fracción monomérica (Bl) en una manera dependiente de la dosis y por la fracción pentamérica (B ) 30 µM. No se observó ningún efecto significativo de ninguna fracción de procianidina de cacao sobre el TXB (Cl-2) del medio. Aunque las fracciones pentamérica y monoméricas de procianidina de i cacao tuvieron efectos similares sobre 6-ceto-PGF -alfa y 2 PGE del medio, estos tuvieron efectos opuestos sobre la ET del medio, con una fracción monomérica (D ) que aumentaba la concentración de ET en el medio de cultivo a 30 µM y la fracción pentamérica (D 2) disminuyendo la concentración de ET en el medio en un modo dependiente de la dosis.
Los datos de las Figuras 3 A-B demuestran la manera similar en que procianidinas de caqao pentaméricas y monoméricas afectaron las CE aórticas de vacas (BAEC) y humanos (HAEC) .
Los datos antes citados demostraron que las procianidinas de cacao inducen los efectos de los eicosanoides y de endotelina que relajan los vasos y disminuyen la agregación plaquetaria/formación de trombos, es decir, la inducción de prostaciclina e inhibición de endotelina y prostaglandina.
Ejemplo 3: Efectos del consumo de una bebida de cacao enriquecida con procianidina sobre la actividad plaquetaria Se estudiaron los efectos del consumo de una bebida de cacao sobre la regulación de la activación plaquetaria y hemostasis primaria.
Treinta adultos sanos, no fumadores, sin historia de cariopatias o desórdenes hemostáticos fueron divididos en tres grupos de tratamiento: (a) 10 individuos (4 varones y 6 mujeres, 24-29 años de edad) consumieron una bebida de cacao (b) 10 individuos (4 varones y 5 mujeres, 26-50 años de edad) consumieron una bebida con cafeina como control y (c) 10 individuos (4 varones y 6 mujeres, 24-50 años de edad) consumieron agua como control. Todas las mujeres eran premenopáusicas y no tomaban estrógenos. Los participantes fueron instruidos para abstenerse de medicamentos anti-inflamatorios, no esteroidales, por cuando menos 4 dias, de bebidas alcohólicas por cuando menos 2 dias y de alimentos que tuvieran cafeina o teobromina por cuando menos 24 horas antes de la prueba y durante el dia de la prueba.
Se extrajo sangre de cada uno de los individuos entre la 8 y 10 am. Las muestras fueron recolectadas en dos tubos en vacio que contenían 0.5 mL de solución amortiguadora de citrato de sodio al 3.2% (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Los individuos de prueba entonces tomaron 300 mL de una bebida que contenia 18.75 g de polvo de cacao enriquecido con procianidina (que proporcionaba aproximadamente 960 mg de procianidinas totales, 17 mg cafeina y 285 mg de teobromipa) y 12.5 g de sacarosa mezclados con agua destilada (véase Adamson, G. E y col. J. Ag. Food. Chem., 1999; 47 (10) 4184-4188). Los individuos control tomaron una bebida que contenia 17 mg de cafeina y 12.5 g de sacarosa o agua sola. Se obtuvieron otras muestras de sangre 2 y 6 horas después del consumo de las bebidas. Una mujer no se presentó a la extracción de sangre de las 6 horas después del consumo del cacao.
Las procianidinas fueron cuantificadas como sigue: se preparó un estándar compuesto con (-) -epicatequina disponible en el comercio, y dimeros hasta decámeros obtenidos en estado puro por los métodos descritos en Hammerstone, J. F. y col., J. Ag. Food. Chem.; 1999; 47 (10) 490-496, Lazarus, S. A. y col., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (9); 3693-3701 y Adamson, G. E. y col., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (10) 4184-4188. Las soluciones concentradas estándar usando estos compuestos fueron analizadas usando el método HPLC en fase normal descrito en la referencia de Adamson previamente citada, con detección fluorescente a las longitudes de onda de excitación y emisión de 276 nm y 316 nm, respectivamente. Los picos fueron agrupados y sus áreas sumadas para incluir contribuciones de todos los isómeros dentro de una clase cualquiera de oligómeros y se produjeron curvas de calibración usando un ajuste cuadrático. Monómeros y oligómeros más pequeños tuvieron gráficas casi lineales consistentes con el uso previo de regresión lineal para generar curvas de calibración con monómeros y dimeros.
Luego se utilizaron estas curvas de calibración para calcular las concentraciones de procianidina en las muestras preparadas como sigue: primero, la muestra de cacao o chocolate (aproximadamente 8 gramos) fue desgrasada mediante tres extracciones con hexano (45 mL cada una) . Después, un gramo de material desgrasado se extrajo con 5 mL de una mezcla de acetona/agua/ácido acético (70:29, 5:0.5 v/v). La cantidad de procianidinas en el material desgrasado entonces se determinó por comparación de los datos de la HPLC de la muestra con las obtenidas en las curvas de calibración como se describió antes (con los oligómeros purificados). El porcentaje de grasa de las muestras (con un tamaño de muestra de un gramo para chocolate o un tamaño de muestra de medio gramo para licores) se determinó mediante un método estandarizado por la Association of Official Analytical Chemists (AOAC Official Method, 920.177). Luego se calculó la cantidad de concentraciones totales de procianidina en la muestra original (con grasa) . La calibración se realizó antes de correr-, cada muestra para proteger contra variaciones de una columna a otra.
Durante los 10 minutos de racolección de las muestras de sangre, la sangre total fue incubada en tubos de poliestireno durante 5 minutos a temperatura ambiente con 10 µL de amortiguador HEPES (pH 7.4, control no estimulado) , ADP 20 ó 100 µM o epinefrina 20 µM (BioData, Horsham, PA) en presencia o ausencia del péptido Arg-Gly-Asp-Ser (Sigma, St. Louis, MO) . Después de 5 minutos se suspendieron las muestras en 1 mL de amortiguador HEPES y 100 µL de muestra fueron transferidos a tubos que contenían concentraciones saturantes (20 µL) cada una de los siguientes anticuerpos monoclonales etiquetados con fluorescencia: PACl-isotiocianato de fluoresceina (FITC), anti-CD62P-ficoeritrina (PE) y anti-CD42a-PerCP. El PACÍ reconoce la conformación activada del receptor que se une a fibrinógeno GPIIb-IIIa y anti-CD62P reconoce P-selectina, presente en la superficie de las plaquetas activadas. Anti-CD42a reconoce GPIb-IX, que está en la superficie de las plaquetas activadas y inactivas. La IgG de ratón, FITC e IgG de ratón, PE fueron usados como controles del isotipo. El péptido Arg-Gly-Asp-Ser se utilizó para bloquear la unión del anticuerpo PACÍ a las plaquetas y de esta manera establecer el marcador del control negativo en el citómetro de flujo. Los anticuerpos y controles del isotipo fueron proporcionados por Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., San José, CA.
Las muestras de sangre totales, en presencia y ausencia de los agonistas ADP y epinefrina, fueron incubadas con anticuerpos monoclonales o controles de isotipo durante 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Las muestras entonces fueron filtradas y fijadas en formaldehido al 1% (pH 7.2) y almacenadas en la oscuridad a 2-8 °C. Todas las muestras fueron analizadas en el transcurso de 48 horas en un citómetro de flujo FACScan usando software LYSYS II. El desempeño del citómetro de flujo se revisó usando perlas de calibración 1, 2 y 10 µm (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., San José, CA and Flow Cytometry Systems, Research Triangle Park, NC) . Se recolectaron veinte mil eventos en modo de lista con todos los parámetros de dispersiones de luz y fluorescencia en modo logarítmico. Las plaquetas fueron obtenidas según el dispersor de luz y la expresión de CD42a. Se definió a las plaquetas activadas como el porcentaje de eventos positivos para CD42a que coexpresaba la conformación activada de GPIIb-IIIa ó P-selectina. Se definió a las microparticulas de plaquetas como el porcentaje de eventos positivos" para CD42a con un tamaño menor que 2 µm.
Una muestra de sangre extraída en cada uno de los tres puntos de tiempo de estudio se analizó en el transcurso de 4 horas usando un analizador de la función plaquetaria (PFA-100™, Dade Behring International, Miami, FL) según las instrucciones del fabricante. Véase Mammen y col. Sem. Thromb. Hemostas. 2A : 195-202, 1998 y Fressinaud y col., Blood _91: 1325-31, 1998. Se midió la función como tiempo de cierre en segundos, que se define como el tiempo necesario para que la sangre obs-truya una abertura en la membrana del cartucho de prueba.
Se analizó las diferencias de los datos de cada grupo de tratamiento o control usando medidas repetidas de Friedman ANOVA en rangos (SigmaStat para Windows, SPSS, Richmond, CA) . Se empleó el método de comparación múltiple Student-Newman-Keuls para identificar diferencias entre los resultados de la linea base y a las 2 y 6 horas después del consumo. Se consideró a los valores P menores que 0.05 con significado estadístico.
El consumo de cacao suprimió la expresión de GPIIb-Illa activada, no estimulada (P = 0.035, Figura 4A) e inducida por epinefrina ex vivo (P = 0.008, Figura 4B) a las 2 y 6 horas después de ingestión. Los porcentajes medios de plaquetas que expresaban GPIIb-IIIa activada sin estimulación fueron 0.9, 0.5 y 0.3% y en respuesta a la epinefrina fueron 9.6, 6.8 y 3.3% en los tiempos cero, 2 y 6 horas, respectivamente, después del consumo. Al contrario, aumentó la expresión de GPIIb-IIIa activada, estimulada con epinefrina, en el grupo control que tomó la bebida con cafeina (P = 0.048, mediana = 5.3, 6.5 y 7.5% en los tiempos cero, 2 y 6 horas después del consumo) . No hubo cambio en el grupo control que bebió agua.
El cacao disminuyó la expresión de GPIIb-IIIa activada, inducida por ADP 20 µM en plaquetas 2 y 6 horas después del consumo (P < 0.001, Figura 4C, mediana = 58.5, 44.2 y 38.8% en los tiempos cero, 2 y 6 horas después del consumo, respectivamente) . La tendencia sugirió disminuir la expresión de la GPIIb-IIIa activada en plaquetas después del consumo de cacao cuando la activación fue inducida por ADP 100 pm (P = 0.067, mediana = 76.5, 68.7 y 57.6% en los tiempos cero, 2 y 6 horas después del consumo, respectivamente) . No hubo cambio en la expresión de GPIIb-IIIa activada, inducida por ADP en los grupos que consumieron la bebida con cafeina y los controles de agua.
Después del consumo de cacao" se observó una tendencia no significativa con relación a la disminución de la expresión de P-selectina (P = 0.053, Figura 5A) . El consumo de cacao disminuyó la expresión de P-selectina inducida por ADP 20 µM a las 2 y 6 horas después del consumo (P = 0.007, Figura 5C) y de P-selectina inducida por ADP 100 µM fueron 56.1, 54.7 y 41.7% en el tiempo cero, 2 y 6 horas después de consumo [sic] , respectivamente . No hubo evidencia de estimulación o inhibición plaquetaria en los grupos control que consumieron la bebida que contenia cafeina o agua.
El número de microparticulas plaquetarias detectado por citometria de flujo después del consumo de la bebida de cacao disminuyó de la linea base a las 2 horas y además disminuyó a las 6 horas (véase la Tabla 1) . En contraste, el número de microparticulas plaquetarias aumentó a las 2 y 6 horas después del consumo de agua y a las 6 horas después del consumo de la bebida que contenia cafeina. Las microparticulas plaquetarias son microvesiculas ricas en fosfolipidos, hemostáticamente activas que se forman durante la activación fisiológica de las plaquetas. f Porcentaje de micropartículas totales CD42 eventos positivos. Los valores denotan mediana (rango), n = 10 por grupo. * Significativamente diferente de "Antes del consumo' (P<0.05) .
Seis horas después del consumo de la bebida de cacao, se prolongó el tiempo de cierre inducido por colágena-epinefriña (véase Tabla 2) . Esto indica hemostasis primaria relacionada con plaquetas, retardada con consumo de cacao. Se observó una "tendencia hacia el tiempo de cierre prolongado después de la inducción con colágena-ADP (p = 0.097); el tiempo de cierre no cambió en el grupo control con cafeina.
Hemostasis primaria relacionada con plaquetas, tiempo de cierre en segundos. Los valores denotan la mediana (rango), n = 10 por grupo. * Muy diferente de "Antes del consumo" (P<0.05) . Medida repetida de Friedman ANOVA en rangos, seguido por el método de comparación múltiple de Student-Newman-Keuls .
Los resultados mostraron que el consumo de la bebida de chocolate modificó Ja función plaquetaria en humanos. Primero, después del consumo de cacao disminuyó la activación de las plaquetas, medida por la expresión de la activación de las plaquetas en respuesta a los agonistas débiles in vi tro. En segundo lugar, después del consumo de cacao disminuyó la formación de microparticulas plaquetarias. Y en tercer lugar, el consumo de cacao causó un efecto parecido a la aspirina sobre la función plaquetaria cuando se midió la hemostasis primaria relacionada con plaquetas. El hecho de que el control con bebida de cafeina causó un aumento en la expresión de la GPIIb-IIIa activada, inducida por epinefrina y la formación de microparticulas implicarla que las procianidinas de caco presentes en la bebida de cacao son responsables de la inhibición de la activación y función plaquetaria.
Ejemplo 4: Efecto del consumo oral de cacao sobre la inhibición de la relajación dependiente del endotelio vascular (EDR) por colesterol Se ha demostrado que algunos extractos de plantas contienen flavonoides que inducen EDR in vi tro en aorta de conejo. Estudiamos los efectos de la administración oral crónica de cacao sobre la EDR y su actividad protectora contra la pérdida de EDR después de alimentación con colesterol. Conejos blancos Nueva Zelanda fueron alimentados con 4 dietas durante 7 semanas: (1) alimento, (2) alimento + 200 mg de cacao/dia, (3) 2% de colesterol durante 3 semanas seguido por 4 semanas de alimento, (4) 2% de colesterol durante 3 semanas seguido por 4 semanas de alimento + 200 mg de cacao/dia. Se midió la EDR en los anillos aórticos suspendidos en baños de órganos (20 mL) . Se pusieron los anillos previamente en contacto con norepinefrina (NE) (10~5 M) . La EDR para acetilcolina (Ach) y extracto de pentámero de cacao (10~7-105 M) se midió como relajación para NE. * otras significativamente diferentes en la columna [sic] Ejemplo 5: Efecto del consumo oral de procianidinas de cacao, fitosteroles y la combinación de éstos Los resultados de este experimento muestran el efecto de la alimentación de una combinación de fitosteroles y fitostanoles no esterificados, disponibles de la resina liquida ("fitosterol") y polvo de cacao (CPd) , con un contenido de aproximadamente 70 mg/g de procianidinas de cacao totales, sobre: (1) los Índices de estrés oxidativo y daño, y (2) sobre los niveles de colesterol, asi como el efecto sinérgico de la administración combinada de fitosteroles y procianidinas de cacao.
Una dieta de cascara de huevo purificada fue suplementada con fifosterol (2% en peso) y/o CPd ( 0 , 5 , 1, 2% en peso ) y se usó para alimentar ratas macho durnate un periodo de 2 semanas . Las ratas fueron divididas en 8 grupos (tres ratas por grupo) y alimentadas 20-25 g/dia de las dietas control y de prueba de acuerdo con lo siguiente : Dieta + 2% fitosterol (440 mq/d) Dieta-fitosterol Grupo 1 0% CPd (0.0 mg/d) Grupo 5 0% CPd (0.0 mg/d) Grupo 2 0.5% CPd (110 mg/d) Grupo 6 0.5% CPd (110 mg/d) Grupo 3 1% CPd (220 mg/d) Grupo 7 1% CPd (220 mg/d) Grupo 4 2% CPd (440 mg/d) Grupo 8 2% CPd (440 mg/d) El agua se proporcionó a voluntad y se determinó el consumo por el peso del alimento sobrante/derramado recolectado por debajo de las copas de alimento. Diario se midió el consumo de alimento y se pesó a las ratas.
Se midieron los parámetros de estrés/daño oxidativo, los niveles de colesterol y la absorción de epicatequina en el plasma sanguineo.
Se midió TBARS en plasma usando una modificación del método descrito por Yagi (Biochem Med 15: 212-6. 1976). Cien µL de sangre total fueron adicionados a 1 mL de solución salina fisiológica y se centrifugaron a 1700 g durante 15 minutos. El sobrenadante fue recolectado y congelado a -70°C hasta el análisis. Se aislaron los lipidos por precipitación con un sistema ácido fosfotúngstico/ácido sulfúrico. La fracción de lipidos entonces reaccionó con ácido tiobarbitúrico y se midió fluorométricamente los aductos resultantes," usando 1, 1' , 3, 3' -tetraetoxipropano como estándar. Los resultados fueron expresados como nanomoles de MDA por mililitro de plasma y como función de la concentración de ácidos grasos poliinsaturados en plasma.
La 8-hidroxi-2' -deoxiguanosina (80H2' dG) fue medida como sigue. DNA nuclear fue aislado usando el kit Wako DNA Extractor WB (Wako Chemical EU, Inc., Richmond, VA). Tejido (100-250 mg) o células (10 células) fueron homogeneizados en el amortiguador para lisis del kit y se centrifugaron a 10,000 g durante 20 segundos a 4°C. Los paquetes fueron tratados con el amortiguador para lisis y el paquete resultante se disolvió en la solución de reacción enzimática del equipo. Se adicionó RNasa hasta una concentración final de 20 µg/mL y la muestra se incubó a 50 °C durante 10 minutos. Se adicionó la solución de proteinasa del equipo y la incubación se continuó durante otra hora. La muestra se centrifugó a 10,000 g por cinco minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se trató con la solución de Nal del equipo e isopropanol para purificar el DNA. El precipitado fue recolectado a 10,000 g por 10 minutos a temperatura ambiente y lavado con las soluciones A y B del equipo. El paquete final fue previamente secado al aire y resuspendido en 200 µL de desferil 0.1 mM/acetato de Na 20 mM, pH 4.8. La digestión y análisis del DNA se llevó a cabo siguiendo el método de Shigenaga y col. (Methods Enzymol 234: 16-33, 1994) con algunas modificaciones. En resumen, se digirió el DNA hasta los nucleótido 5'-monofosfatos por incubación con nucleasa Pl hasta una concentración final de 0.1 mg/mL durante 15 minutos a 65°C. El pH se ajustó con Tris-HCl 1 M, pH 8.5 y se usó fosfatasa alcalina de intestino de ternero para digestión adicional de la muestra hasta nucleótidos (una hora, 37°C) . El pH de la muestra se ajustó con amortiguador de acetato de sodio 3 M, pH 5.1, y se adicionó EDTA 0.1 mM/desferilo 0.1 mM para prevenir la oxidación mediada por metales. La muestra se puso a través de un filtro rotatorio de corte 30 000 MW y se colocó en un vial para inyección a HPLC. Las muestras fueron analizadas dentro de las 48 horas de su preparación para evitar la formación de artefactos. Para análisis, las muestras fueron inyectadas en un HPLC 1100 Hewlett Packard equipado con un detector electroquímico (ESA, Couluchem II) . Se logró la separación con una columna LD-18-DB Supelcosil LC-18-DB (150 x 4.6 mm, tamaño de partícula 3 micrones) y la fase móvil de amortiguador de acetato Na 100 mM, pH 5.2, con metanol, isocrático a una velocidad Q de flujo de 1.0 mL/min. Se detectó OH dG a 450 mV usando detección electroquímica y se detectó 2' -deoxiguanosina (dG) a 248 nm usando detección UV. Los" niveles de OH8 dG fueron expresados con relación a la cantidad de dG en las muestras .
La absorción de epicatequina se midió como en Rein y col., J. of Nutr. 2000, 130 (8S) , 2109S-2114S.
Resultados Los resultados establecen los beneficios inesperados de la administración combinada de fitosteroles y polifenoles.
Con referencia a la Figura 6, la cantidad de epicatequina absorbida aumentó en un modo dependiente de la dosis. Sorprendentemente, la administración de fitosteroles mejoró la absorción de epicatequina de modo que, por ejemplo, en una dieta al 2% en peso de CPd, los noveles plasmáticos de epicatequina mejoraron en aproximadamente 30% en comparación con la dieta equivalente sin fitosteroles. De ahi que, el fitosterol aumentó la biodisponibilidad de epicatequina.
Con referencia a la figura 7, el CPd inhibió el daño oxidativo al DNA en un modo dependiente de la dosis. De manera sorprendente, a mayor dosis de CPd (2% en peso) , se observó una inesperada reducción en- el daño oxidativo hacia el DNA indicando un efecto sinérgico de fitosteroles y CPd en la prevención del daño oxidativo hacia el DNA. Con referencia a la Figura 8, lá alimentación con una dieta que contenga fitosteroles sorprendentemente causó un mayor estrés oxidativo que la dieta control, es decir, el consumo de fitosterol junto con el alimento (sin procianidinas de cacao) , que se recomendó en la técnica anterior a la fecha de colocación de esta aplicación, exacerbó el estrés oxidativo. La alimentación de procianidinas de cacao invirtió o mitigó este efecto negativo de los fitosteroles.
También se midió el colesterol total en plasma y los resultados se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3 - Colesterol total en plasma Con referencia a la Tabla 3, como se esperaba, los fitosteroles redujeron los niveles de colesterol. Sin embargo, sorprendentemente, cuando se administró los fitosteroles con CPd, los niveles de colesterol disminuyeron aún más, en una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, los niveles de colesterol total medio de las tres ratas alimentadas con una dieta que contenia fitosterol fueron 84 mg/dL. La suplementación de esta dieta con CPd 2% en peso dio como resultado una disminución adicional del colesterol total hasta 80 mg/dL, indicando un efecto sinérgico de los dos compuestos. Las ratas alimentadas de la dieta de colesterol tuvieron un nivel de colesterol medio de 88.3 mg/dL.
Ejemplo 6: Composiciones alimenticias que contienen agentes reductores de colesterol en combinación con chocolate o cacao con procianidina de cacao Se preparó chocolate oscuro, dulce chicloso y barra de granóla con un contenido de agentes reductores de colesterol.
El dulce chicloso se preparó de los ingredientes que se muestran en la Tabla 4 premezclando azúcar y cacao y mezclando ésta con caramelo. Los fitosteroles libres (como tales o pulverizados) fueron adicionados a la mezcla de cacao y azúcar.
Tabla 4. Dulce chicloso con un contenido de fi osterol Se preparó chocolate oscuro con un contenido de esterol libre usando un chocolate oscuro disponible en el comercio (DOVE Dark de Mars Inc.) para facilitar el mezclado con el chocolate fundido y para evitar cualquier efecto adverso sobre la textura del chocolate, formas granuladas de esterol/estanol de plantas fueron molidas en un Muche Universal M20, fabricado por IKA durante 30- 60 segundos, se mezclaron y molieron durante otros 30 segundos hasta que el tamaño de partícula se volvió comparable al del chocolate. El chocolate oscuro fue fundido y el esterol adicionado por mezclado lento para asegurar la distribución uniforme de las partículas de esterol. La composición resultante se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Chocolate oscuro con fi osterol Se prepararon barras de granóla que contenían fibras de avena reductoras de colesterol a partir de los ingredientes enlistados en las Tablas 6 y 7. Se preparó el jarabe aglutinante fundiendo aceite de semilla de palma a 45C [sic] y manteniendo a esta temperatura hasta que estuvo listo para su uso. El jarabe de maiz, glicerina, polvo de cacao, azúcar, café, sal, lecitina y galato" de propilo fueron combinados y se adicionó el aceite de semilla de palma. La mezcla se mantuvo caliente. Para preparar la granóla, la avena o soya (disponible de Sovex Food, Collegedale, TN) fueron mezclados con las piezas de chocolate y el jarabe aglutinante caliente preparado como se describió antes fue incorporado en la mezcla. Entonces la mezcla de granóla se preparó en rebanadas, se espolvoreó con una mezcla de azúcar 10X (62%), polvo de cacao (33%), y canela (5%), y se cortó en piezas. El polvo de cacao usado en la mezcla se preparó según el método de la Patente US No. 6,015,913 de Kealey y cpl.
Tabla 6. Barra de granóla con chocolate y avena Tabla 7. Barra de granóla con chocolate y proteina de soya

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un farmacéutico, un suplemento de dieta o un aditivo alimenticio que contiene un monómero y/o oligómero procianidina de cacao y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. El farmacéutico, el suplemento de dieta o el aditivo alimenticio de la reivindicación 1. El farmacéutico, el suplemento de dieta o el aditivo alimenticio de la reivindicación 1 además comprende cuando menos uno de los siguientes: calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma de guar o un ácido graso mono o poliinsaturado. El farmacéutico, suplemento de dieta o el aditivo alimenticio de la reivindicación 1, caracterizado porque el monómero y/o oligómero de procianidina de cacao está en forma de un ingrediente de cacao, un extracto de cacao que contiene procianidina o una fracción del extracto de cacao que contiene cuando menos un monómero u oligómero de procianidina. Un alimento diferente de un producto de repostería que comprende un monómero y/o oligómero de procianidina de cacao y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. El alimento de la reivindicación 5, además comprende una proteina de soya, fibra soluble y/o L-arginina . El alimento de la reivindicación 5, además comprende cuando menos uno de los siguientes: calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma de guar o un ácido graso mono o poliinsaturado. El alimento de la reivindicación 5, en donde el monómero y/o oligómero de procianidina de cacao está en forma de un ingrediente de cacao, un extracto de cacao que contiene procianidina cr una fracción del extracto de cacao que contiene cuando menos un monómero u oligómero de procianidina. El alimento de la reivindicación 5, en donde el alimento es una bebida. El alimento de la reivindicación 5, en donde el alimento es un alimento para mascotas. Un producto de repostería que reduce el colesterol, que comprende un monómero ?/o oligómero de -procianidina de cacao y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. El producto de repostería de la reivindicación 11, además comprende una proteina de soya, una fibra soluble y/o L-arginina. El producto de repostería de la reivindicación 11 además comprende cuando menos uno de los siguientes: calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma de guar, o un ácido graso mono o poliinsaturado . El producto de repostería de la reivindicación 11, en donde el monómero y/o oligómero de procianidina de cacao está en forma de un ingrediente de cacao, extracto de cacao que contiene procianidina, o una fracción del extracto de cacao que contiene cuando menos un monómero u oligómero procianidina. El producto de repostería de la reivindicación 11, en donde el producto de repostería es un chocolate, un dulce cubierto de chocolate, un producto horneado y una barra de granóla. El producto de repostería de la reivindicación 11, en donde el producto de repostería tiene cuando menos una de las siguientes propiedades, induce la vasorrelaj ación, inhibe la actividad LOX, inhibe la oxidación de LDL, mejora la actividad NOS, aumenta el nivel de NO, inhibe la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos-- y proliferación de músculo liso vascular, reduce la presión sanguínea, reduce la trombosis y regula el estrés oxidativo. Un chocolate reductor de colesterol que comprende un monómero y/o oligómero de procianidina de cacao y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol . Un envase que contiene el alimento de cualquiera de las reivindicaciones 5-10 o un producto de repostería de cualquiera de las reivindicaciones 11- 17 y un marbete y/o instrucciones para uso del alimento o el producto de repostería para favorecer la salud vascular y/o reducir el riesgo de enfermedad cardiaca. 9. Un envase que contiene el alimento de cualquiera de las reivindicaciones 5-10 o un producto de repostería de cualquiera de las reivindicaciones 11- 17 y un marbete y/o instrucciones para el uso del alimento o producto de repostería para inducir vasorrelaj ación, inhibir la actividad LOX, inhibir la oxidación de LDL, mejorar la actividad NOS, aumentar el nivel de NO, inhibir la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducir Ja presión sanguínea, reducir la trombosis y contra el efecto del estrés oxidativo. 20. Un envase que contiene el alimento de cualquiera de las reivindicaciones 5-10 o un producto de repostería de cualquiera de las reivindicaciones 11- 17 y un marbete y/o instrucciones para su uso, que indique que el alimento o el producto de repostería favorece y/o mejora la absorción de la procianidina de cacao. 21. Un envase que contiene: una composición que consiste en un polifenol con cuando menos una de las siguientes propiedades: inducir vasorrelaj ación, inhibir la actividad COX, inhibir la actividad LOX, inhibir la oxidación de LDL, mejorar la actividad NOS, aumentar el nivel de NO, inhibir la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducción de la presión sanguínea, reducción de trombosis y regulación del estrés oxidativo, y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol; y (ii) un marbete y/o instrucciones para el uso de la composición para favorecer la salud cardiovascular, reducir el riesgo de cardiopatías, y/o favorecer o mejorar la absorción del polifenol. El envase de la reivindicación 21, en donde el polifenol es flavanol. El envase de la reivindicación 21, en donde el polifenol es un flavonol . El envase que contiene: (i) una composición que consiste en un polifenol con cuando menos una de las siguientes propiedades, inducir vasorrelajación, inhibir la actividad COX, inhibir la actividad LOX, inhibir la oxidación de LDL, mejorar la actividad NOS, aumento del nivel de NO, inhibir la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducir la presión sanguínea, reducir trombosis y regular el estrés pxidativo, y un agente reductor de colesterol; y (ii) un marbete y/o instrucciones para el uso de la composición para favorecer la salud vascular y/o reducir el riesgo de cardiopatias. 25 El envase de la reivindicación 24, en donde el polilfenol es un flavanol. 26. El envase de la reivindicación 25, en donde el flavanol es un flavanol de cacao. 27. El envase de la reivindicación 24, en donde el polifenol es un flavonol. 28. 27. El envase de la reivindicación 24, en donde el polifenol es un oligómero relacionado con flavanol. 29. El envase de la reivindicación 28, en donde el oligómero relacionado con flavanol es un oligómero procianidina de cacao. Una composición que contiene un polifenol que tiene cuando menos una de las siguientes propiedades: inducir vasorrelajación, inhibir la actividad COX, inhibir la actividad LOX, inhibir la oxidación de LDL, mejorar la actividad NOS, aumentar el nivel de NO, inhibir la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducción de la presión sanguínea, reducción de trombosis y regulación de estrés oxidativo, y un agente reductor de colesterol. Un método de favorecer la salud vascular y/o cardiovascular de un humano o un animal veterinario, que consiste administrar al humano o al animal veterinario una composición que comprende un polifenol y un agente reductor del colesterol. El método de la reivindicación 31, en donde el polifenol es un monómero y/o oligómero de procianidina cacao. El método de la reivindicación 31, en donde el agente reductor de colesterol es un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. 34. El método de la reivindicación 32, en donde el agente reductor de colesterol es un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. 35. Un método de aumentar la absorción de un polifenol en la sangre de un humano o un animal veterinario, que consiste en administrar al humano o a un animal veterinario, en combinación: un (i) polifenol que tenga cuando menos una de las siguientes propiedades: inducir vasorrelajación, inhibir la actividad COX, inhibir la actividad LOX, inhibir la oxidación de LDL, mejorar la actividad NOS, aumentar el nivel de NO, inhibir la agregación plaquetaria, adhesión de monocitos y proliferación de músculo liso vascular, reducción de la presión sanguínea, reducción de trombosis, y regulación del estrés oxidativo, y (ii) un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol. 36. El método de la reivindicación 35, en donde el polifenol y el agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol se administran por separado. 37. El método de la reivindicación 35, en donde el polifenol y el agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol se administran en la misma composición. 38. El método de la reivindicación 35, en donde el polifenol es un flavanol. 39. El método de la reivindicación 36, en donde el polifenol es un flavanol. 40. El método de la reivindicación 37, en donde el polifenol es un flavanol. 41. El uso de una procianidina de cacao y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol en la fabricación de un medicamento, alimento, suplemento de dieta o aditivo para alimento para favorecer la salud vascular de un humano o un animal veterinario. 42. El uso de un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol en la elaboración de un medicamento, alimento, suplemento de dieta o aditivo alimenticio para su uso con una procianidina de cacao para favorecer la salud vascular de un humano o animal veterinario. 3. El uso de una procianidina de cacao en la elaboración de un medicamento, alimento, suplemento de dieta o aditivo para alimento, para uso con un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol para favorecer la salud vascular de un humano o un animal veterinario. 44. El uso de un polifenol y/o un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol en la elaboración de un medicamento, alimento, suplemento de dieta o aditivo alimenticio para mejorar la absorción de un polifenol en la sangre de un humano o un animal veterinario. 45. El uso de un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol en la elaboración de un medicamento, alimento, suplemento de dieta o aditivo alimenticio para uso con un polifenol para mejorar la absorción de un polifenol en la sangre de un humano o un animal veterinario. 46. El uso de un polifenol en la elaboración de un medicamento, alimento, suplemento de dieta o un aditivo alimenticio para su uso con un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol para mejorar la absorción de un polifenol en la sangre de un humano o un animal veterinario. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, en donde el polifenol es un flavanol. El uso de conformidad con la reivindicación 47, en donde el flavanol es un flavanol de cacao. Un producto que confien un polifenol y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol para uso separado, simultáneo o secuencial para favorecer la salud vascular. Un polifenol y un agente reductor de colesterol a base de esterol y/o estanol para uso combinado para favorecer la salud vascular.
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