ES2331724T3 - Composiciones y metodos para mejorar la salud vascular. - Google Patents

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Amy Dombroski
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Abstract

Un producto alimenticio que no es chocolate y que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la fórmula: **(Ver fórmula)** y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de (4 flecha 6) y/o (4 flecha 8); y en que el producto alimenticio comprende al menos 10 µg de procianidinas de cacao/g.

Description

Composiciones y métodos para mejorar la salud vascular.
Campo del invento
Este invento se refiere a composiciones que contienen procianidinas de cacao en combinación con al menos un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol, que son útiles para mejorar la salud vascular, incluyendo el tratamiento y la prevención de la aterosclerosis y la enfermedad cardiovascular.
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Fundamento del invento
La enfermedad de las arterias coronarias, la forma primaria de la enfermedad cardiovascular (CVD; del inglés, cardiovascular disease), es actualmente la causa principal de muerte en los Estados Unidos. La enfermedad cerebrovascular es la tercera. La etiología tanto de la enfermedad de las arterias coronarias como de la enfermedad cerebrovascular se atribuye a la aterosclerosis. A través de sus manifestaciones clínicas, la aterosclerosis es la causa principal de los más de un millón de ataques cardíacos, aproximadamente 400.000 accidentes cerebrovasculares que se producen cada año y numerosos problemas relacionados con la circulación vascular. Muchos pacientes están aquejados de hipertensión.
Una sustancial recopilación de evidencias ha establecido una relación causal entre la hipercolesterolemia y la aterosclerosis prematura; cuanto mayores son los niveles de colesterol plasmático, mayor es el riesgo de un subsiguiente ataque al corazón [véase, por ejemplo, D. Steinberg, JAMA 264: 3047 (1990)]. Se cree que, en la cadena de procesos que conducen a la aterosclerosis, el proceso inicial es la formación de "vetas grasas" en las arterias carótidas, coronarias y cerebrales y en la aorta. Estas lesiones incluyen depósitos grasos de colesterol y éster de colesterilo que se encuentran principalmente en las células de músculo liso y los macrófagos de la capa íntima. La migración y proliferación de células de músculo liso vascular desempeñan un papel crucial en la patogénesis de la aterosclerosis después del depósito inicial de lípido.
Además, el desarrollo de la aterosclerosis y la enfermedad cardiovascular es modulado por, y/o está asociado con, la oxidación de LDL, la actividad ciclooxigenasa (COX), la actividad lipoxigenasa (LOX), la producción de óxido nítrico (NO) y la actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS). Las relaciones entre las diversas rutas y los procesos con ellas implicados se representan en la Figura 1 y se describen con detalle en el Documento WO 97/36497. En resumen, la oxidación de LDL es una etapa crítica en el inicio de las lesiones (ateromas) que se producen cuando los macrófagos captan LDL oxidativamente modificadas y se transforman en las llamadas "células espumosas". Las enzimas COX y LOX están implicadas en la ruta del ácido araquidónico que conduce a la producción de prostaglandinas y tromboxano A2, conocido este último por causar vasoconstricción y agregación de plaquetas, y, por lo tanto, al progreso de la aterosclerosis. Se sabe que el óxido nítrico inhibe la agregación de plaquetas, la adhesión/quimiotaxis de monocitos y la proliferación de músculo liso vascular, todo lo cual es considerado responsable del progreso de la aterosclerosis. Se ha mostrado que los polifenoles de cacao ejercen efectos beneficiosos sobre los procesos anteriormente descritos al inhibir la oxidación de LDL, potenciar la actividad NO/NOS e inhibir la actividad COX/LOX. Estos efectos se muestran, por ejemplo, en la Solicitud Internacional nº PCT/US97/05693, publicada como WO 97/36497, y en los ejemplos presentados en la solicitud. Se pueden utilizar polifenoles de cacao para tratar o prevenir estados de los que se sabe que resultan afectados por la administración de fármacos antiinflamatorios no esteroides, tal como, por ejemplo, la aspirina.
En el Documento WO 98/33494 se describen composiciones que comprenden antioxidantes para uso en el tratamiento y la prevención de microangiopatías y macroangiopatías.
A pesar de los beneficios del polifenol de cacao sobre las diversas rutas y estados asociados con la inducción y el progreso de la aterosclerosis y la enfermedad cardíaca coronaria (CHD; del inglés, coronary heart disease), se ha hallado que estos compuestos no ejercen un sensible efecto reductor del nivel de colesterol. De esta manera, los inventores han preparado una composición mejorada que contiene polifenoles en combinación con al menos un agente reductor de los niveles de colesterol. La composición ejerce efectos potenciados sobre la salud vascular de un mamífero, particularmente de un ser humano, en comparación con las composiciones previamente conocidas que contenían polifenol o agentes reductores del nivel de colesterol.
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Sumario del invento
El invento se refiere a composiciones para mejorar la salud vascular en un mamífero, en particular en un ser humano o un animal de veterinario.
En un aspecto, el invento se refiere a un producto alimenticio que no es chocolate y que comprende una procianidina de cacao y un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol o estanol. El producto alimenticio puede contener opcionalmente L-arginina.
En otra realización, el invento se refiere a un chocolate (por ejemplo, un chocolate negro) reductor del nivel de colesterol.
En otro aspecto, el invento se refiere a una composición farmacéutica para mejorar la salud vascular, incluyendo la prevención o el tratamiento de la aterosclerosis y la enfermedad cardiovascular, en un mamífero, tal como un ser humano o un animal de veterinario, que comprende una procianidina de cacao y un compuesto reductor del nivel de colesterol basado en esterol o estanol, y opcionalmente L-arginina. Los polifenoles de otras fuentes que tienen propiedades similares a las de las procianidinas de cacao pueden ser también utilizados en los productos alimenticios, el chocolate y las composiciones farmacéuticas del invento.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa factores fundamentales que contribuyen al progreso de la enfermedad cardíaca coronaria (CHD) y que muestra cómo los polifenoles de cacao contribuyen a la prevención del progreso de la enfermedad.
Las Figuras 2 A-D muestran el efecto de productos fitoquímicos sobre la síntesis de los prostanoides y las endotelinas por células endoteliales basales, en células endoteliales aórticas bovinas (BAECs; del inglés, bovine aortic endothelial cells) (* = significativamente diferente del testigo para p < 0,05).
Las Figuras 3 A-B muestran los efectos de especies celulares sobre alteraciones, inducidas por procianidina, en la liberación de prostaciclina y endotelina por células endoteliales (ECs; del inglés, endothelial cells).
Las Figuras 4 A-C muestran el efecto del consumo de una bebida de cacao sobre la expresión de GPIIb-IIIA activado en la superficie de las plaquetas, con y sin estimulación con agonistas débiles.
Las Figuras 5 A-C muestran el efecto del consumo de una bebida de cacao sobre la expresión de selectina P activada en la superficie de las plaquetas, con y sin estimulación con agonistas débiles.
La Figura 6 muestra los efectos de los fitosteroles, las procianidinas de cacao y una combinación de los mismos sobre la absorción de epicatequina en el plasma sanguíneo.
La Figura 7 muestra los efectos de los fitosteroles, las procianidinas de cacao y una combinación de los mismos sobre el daño oxidativo a DNA.
La Figura 8 muestra los efectos de los fitosteroles, las procianidinas de cacao y una combinación de los mismos sobre el daño oxidativo a lípidos.
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Descripción detallada
El presente invento proporciona un producto alimenticio que no es chocolate y que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la fórmula:
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y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de (4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8); y en que el producto alimenticio comprende al menos 10 \mug/g de procianidinas de cacao. Este producto alimenticio es útil para mejorar o promover la salud vascular en un mamífero.
El invento proporciona además un chocolate reductor del nivel de colesterol, que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la fórmula:
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y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de (4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8); y en que el chocolate es un chocolate negro que comprende al menos 3600 \mug de procianidinas de cacao por gramo de chocolate, o un chocolate con leche que comprende al menos 1000 \mug de procianidinas de cacao por gramo de chocolate, cantidades que se basan en la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto.
El producto alimenticio que no es chocolate o el chocolate reductor del nivel de colesterol del invento puede comprender además una proteína de soja, una fibra soluble y/o L-arginina. En otra realización, el producto alimenticio o el chocolate reductor del nivel de colesterol comprende además al menos un componente seleccionado entre calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma guar y un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado (por ejemplo, un ácido graso omega-3). Las composiciones que contienen polifenoles de otras fuentes que tienen propiedades similares a las de las procianidinas de cacao pueden ser también utilizadas en el producto alimenticio que no es chocolate o en el chocolate reductor del nivel de colesterol del invento.
El invento también proporciona una composición farmacéutica para uso en la promoción de la salud vascular de un ser humano o un animal de veterinario, que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la fórmula:
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y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de (4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8); y en que la composición es formulada para que suministre una dosis de procianidinas de cacao de al menos 50 mg al día.
Como se usa aquí, la expresión "procianidina de cacao" (CP; del inglés, cocoa procyanidin) se refiere a una procianidina de cacao como la anteriormente definida. Ésta puede estar presente en granos de cacao o ser extraída de granos de cacao o de ingredientes de cacao. Como se definió anteriormente, el término "procianidina" incluye tanto los monómeros como los oligómeros de catequina y epicatequina. La expresión "ingrediente de cacao" se refiere a un material que contiene sólidos de cacao, derivado de fragmentos de cacao tostado y descascarado ("nibs"), tal como chocolate líquido y sólidos de cacao parcial o totalmente desengrasados (por ejemplo, pasta o polvo). La frase "agente reductor del nivel de colesterol" significa un compuesto, una combinación de compuestos, un extracto o un componente vegetal, naturalmente hallado o procesado, que tiene la propiedad de reducir los niveles de colesterol en un mamífero cuando se administra en una cantidad eficaz. Una característica esencial de las composiciones del presente invento es un agente de tipo esterol o estanol que reduce los niveles de colesterol, es decir, incluyendo derivados y formas isómeras. A dicho agente reductor del nivel de colesterol se hace referencia como "agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol". Cuando se usa la frase en referencia a una composición, por ejemplo, "un chocolate reductor del nivel de colesterol", significa que la composición tiene la propiedad de reducir el nivel de colesterol. Como del uso presente puede comprender una persona con experiencia en la técnica, el término "vascular" se refiere al sistema vascular completo, es decir, abarca el corazón, y la expresión "salud vascular" incluye la salud cardiovascular y/o la salud coronaria. La expresión "promover la salud vascular" se refiere a alcanzar los beneficiosos efectos saludables aquí descritos.
Las procianidinas de cacao pueden ser de origen natural, es decir, proceder de un grano de cacao, o ser preparadas sintéticamente. Una persona con experiencia en la técnica puede seleccionar procianidinas de cacao naturales o sintéticas basándose en la disponibilidad o el coste. Las procianidinas de cacao se pueden incluir en la composición como un ingrediente de cacao que contiene procianidinas de cacao, tal como, por ejemplo, un chocolate líquido en chocolate, o se pueden añadir independientemente de los ingredientes de cacao, por ejemplo, como un extracto, una fracción de extracto, fracciones de extracto reunidas o un compuesto sintéticamente preparado. Las procianidinas de cacao son monómeros y/o oligómeros de epicatequina y catequina. Los monómeros de procianidinas incluyen (+)-catequina, (-)-epicatequina y sus respectivos epímeros [por ejemplo, (-)-catequina y (+)-epicatequina] y tienen la estructura:
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Los oligómeros de procianidina tienen de 2 a aproximadamente 18, preferiblemente de 2 a aproximadamente 12, y muy preferiblemente de 2 a aproximadamente 10, unidades monómeras. Por ejemplo, los oligómeros pueden ser dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, heptámeros, octámeros, nonámeros y decámeros. En el oligómero, los monómeros están conectados por medio de uniones interflavánicas de (4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8). Los oligómeros con uniones exclusivamente (4 \rightarrow 8) son lineales, mientras que la presencia de al menos un enlace (4 \rightarrow 6) da lugar a un oligómero ramificado.
La procianidina de cacao puede ser preparada por extracción de granos de cacao, nibs de cacao, o ingredientes de cacao tales como chocolate líquido, sólidos de cacao parcialmente desengrasados y/o sólidos de cacao totalmente desengrasados. Preferiblemente, el extracto se prepara a partir de un polvo de cacao total o parcialmente desengrasado. Se pueden utilizar granos de cualquier especie de Theobroma o Herrania, o de cruces interespecies e intraespecies de las mismas. El extracto se puede preparar a partir de granos fermentados, infrafermentados o no fermentados, teniendo los granos fermentados la menor cantidad de polifenoles de cacao y teniendo los no fermentados la mayor cantidad. La selección de los granos se puede realizar basándose en el factor de fermentación de los granos; por ejemplo, el extracto se puede preparar a partir de los granos que tienen un factor de fermentación de 275 o menos. Se puede realizar la optimización del nivel de procianidinas en el ingrediente de cacao y en el extracto del mismo manipulando el grado de fermentación de la manera descrita en el Documento WO 98/09533.
Las procianidinas de cacao se pueden extraer de ingredientes de cacao que han sido procesados utilizando métodos de procesamiento de cacao tradicionales (descritos, por ejemplo, en "Industrial Chocolate Manufacture and Use", redactado por S. T. Beckett, Blackie Acad. & Professional, New York, 1997; tal como en los Capítulos 1, 5 y 6) o utilizando un método de procesamiento mejorado descrito en la Patente de EE.UU. nº 6.015.913, concedida a Kealey et al., con el que, por contraste con los métodos tradicionales, se conservan las procianidinas (al evitar su destrucción) en los ingredientes de cacao. En el método mejorado para el procesamiento de cacao se omite la operación de tostadura adicional. De esta manera, se pueden utilizar ingredientes de cacao obtenibles al (a) calentar el grano de cacao durante un tiempo y a una temperatura suficientes para que se suelte la cáscara del cacao sin que se tueste el nib de cacao; (b) separar el nib de cacao de la cáscara del cacao; (c) tratar el nib de cacao en una prensa de husillo; y (d) recuperar la manteca de cacao y los sólidos de cacao parcialmente desengrasados que contienen niveles conservados de procianidinas de cacao. El método permite conservar un nivel mucho mayor de oligómeros de procianidina superiores que los métodos tradicionales. Los sólidos de cacao producidos mediante este método pueden contener más de 20.000 \mug de procianidinas totales por gramo de sólidos no grasos; preferiblemente más de 25.000 \mug/g, más preferiblemente más de 28.000 \mug/g, y muy preferiblemente más de 30.000 \mug/g. Para los fines de este invento, las cantidades totales de procianidinas se determinan del modo descrito en el Ejemplo 3.
Las procianidinas de cacao pueden ser extraídas de las fuentes anteriormente indicadas utilizando disolventes en que se disuelven las procianidinas. Los disolventes adecuados incluyen agua y disolventes orgánicos tales como metanol, etanol, acetona, alcohol isopropílico y acetato de etilo. También se pueden utilizar mezclas de disolventes. Cuando se utiliza agua como disolvente, es preferible que esté ligeramente acidificada con, por ejemplo, ácido acético. Los disolventes preferidos son mezclas de agua y un disolvente orgánico, tales como, por ejemplo, metanol, etanol y acetona acuosos. Los disolventes orgánicos acuosos pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 95% de disolvente orgánico. De esta manera, se puede utilizar un disolvente orgánico al 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en agua. El disolvente puede contener también una pequeña cantidad de un ácido tal como, por ejemplo, ácido acético, en una cantidad de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,0%. La composición de los extractos, es decir, la representación (es decir, el perfil oligómero) y la cantidad de oligómeros de procianidina, dependerá de la elección de los disolventes. Por ejemplo, el extracto en agua contiene esencialmente monómeros, el extracto en acetato de etilo contiene monómeros y oligómeros inferiores, principalmente dímeros y trímeros, y el extracto en metanol, etanol, o acetona acuosos contiene monómeros y una diversidad de oligómeros superiores. Uno de los disolventes preferidos para la extracción del monómero así como de oligómeros de procianidina superiores es la acetona al 70%. Sin embargo, cualquier extracto que contenga procianidinas es útil en el invento. Los métodos para la extracción de procianidinas de cacao son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 5.554.645, concedida a Romanczyk et al., y en el Documento WO 97/36497. De esta manera, en una realización, se prepara el extracto de cacao reduciendo granos de cacao hasta un polvo de cacao, desengrasando el polvo, extrayendo las procianidinas de cacao y purificando el extracto. Se puede preparar el polvo de cacao liofilizando los granos y la pulpa de cacao, separando la pulpa y descascarando los granos de cacao liofilizados, y triturando los granos descascarados.
El extracto de procianidinas de cacao puede ser purificado, por ejemplo, mediante la separación de la cafeína y/o la teobromina, y puede ser adicionalmente purificado por cromatografía de permeación en gel y/o cromatografía en estado líquido a alta presión (HPLC; del inglés, high pressure liquid chromatography). Se puede usar la cromatografía de permeación en gel (por ejemplo, en Sephadex LH-20) para enriquecer el extracto en cuanto a oligómeros de procianidina superiores. Por ejemplo, no se puede recoger el producto de elución que contiene monómeros y oligómeros inferiores hasta que el(los) oligómero(s) elegido(s) comience(n) a salir de la columna. Un ejemplo de dicho extracto se conoce en la técnica y se describe en el Ejemplo 5 del Documento WO 97/36497. Utilizando HPLC preparativa, por ejemplo, HPLC en fase normal, se puede fraccionar el extracto en, por ejemplo, fracciones monómeras y oligómeras que contengan al menos el 50% en peso del monómero o del(de los) oligómero(s) específico(s). Cuando las fracciones contienen los monómeros y los oligómeros inferiores (hasta el tetrámero incluido), las fracciones contienen aproximadamente de 90 a 95% en peso de la fracción oligómera particular. Después de la separación, se pueden reunir las fracciones deseadas para obtener una combinación de oligómeros escogidos que contenga, por ejemplo, los oligómeros 3-10 ó 5-10. Una persona con experiencia en la técnica puede manipular las condiciones cromatográficas para alcanzar el deseado perfil de procianidinas a la vista del asesoramiento de esta memoria descriptiva, los conocimientos generales de la técnica y, por ejemplo, las enseñanzas de la Patente de EE.UU. nº 5.554.645, concedida a Romanczyk et al., y del Documento WO 97/36497.
También se pueden proporcionar procianidinas de cacao a la composición del invento mediante ingredientes de cacao que contengan procianidinas o incluyendo chocolate, que puede ser con leche, dulce y semidulce y es preferiblemente chocolate negro, y chocolate con bajo contenido graso. Los ingredientes de cacao se pueden preparar usando procedimientos para procesamiento de cacao tradicionales, pero se preparan preferiblemente usando el método descrito en la Patente de EE.UU. nº 6.015.913, concedida a Kealey et al. Alternativamente, para aumentar el nivel de procianidinas de cacao, se pueden usar chocolate líquido y sólidos de cacao preparados a partir de granos de cacao que tengan un factor de fermentación de 275 o menos. Estos ingredientes tienen un contenido de procianidinas de cacao que es superior al que puede obtenerse al usar métodos de procesamiento de cacao tradicionales (por ejemplo, con tostadura) y granos totalmente fermentados. Se puede preparar el chocolate usando técnicas convencionales a partir de los ingredientes anteriormente descritos o usando un proceso mejorado para conservar las procianidinas de cacao durante la fabricación del chocolate, como se describe en el Documento WO 99/45788. A un chocolate preparado mediante al menos uno de los siguientes procesos no tradicionales se hace aquí referencia como "chocolate que tiene una cantidad conservada de procianidinas de cacao": (i) preparación de ingredientes de cacao a partir de granos de cacao infrafermentados o no fermentados; (ii) conservación de procianidinas de cacao durante el proceso de fabricación de ingredientes de cacao; y (iii) conservación de procianidinas de cacao durante el proceso de fabricación de
chocolate.
También se pueden utilizar procianidinas sintéticas, que se preparan mediante métodos conocidos en la técnica y como se describe, por ejemplo, en el Documento WO 99/19319.
La composición comprende además un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol o estanol. Estos agentes actúan reduciendo la absorción de colesterol en la bilis de un mamífero o reduciendo la síntesis de colesterol. Los ejemplos de agentes basados en esterol y/o estanol adecuados son fitosteroles, fitostanoles y sus derivados e isómeros; ejemplos de agentes reductores del nivel de colesterol adicionales incluyen proteína de soja; fibras solubles, por ejemplo, beta-glucano procedente de, por ejemplo, avena y zaragatona, nueces, y aceite de salvado de arroz, cada uno de los cuales es particularmente adecuado para uso en alimentos, complementos dietéticos y composiciones de aditivos alimentarios. También se pueden usar fármacos reductores del nivel de colesterol conocidos como agentes reductores del nivel de colesterol adicionales; estos son menos preferidos para uso en los alimentos y las composiciones de aditivos alimentarios, pero se pueden usar en un producto farmacéutico. Resultará obvio a una persona con experiencia en la técnica que la elección del agente reductor del nivel de colesterol depende del previsto vehículo de distribución (por ejemplo, alimento o producto farmacéutico) y del modo de administración. De esta manera, para administración intravenosa no se preferirá un agente que reduzca la absorción de colesterol en la bilis. Similarmente, si el vehículo de distribución es un alimento, puede que no sea deseable un agente reductor del nivel de colesterol que tenga un intenso sabor u olor medicinal.
Los fitosteroles son esteroles vegetales que no se disuelven en agua y tienen un peso molecular y una estructura similares a las del colesterol. Los fitosteroles reducen la absorción de colesterol en la bilis (tanto del colesterol endógeno como del dietético) así como los niveles séricos de colesterol (total y LDL) sin que ellos mismos sean absorbidos. Se han identificado más de cuarenta esteroles vegetales, pero el beta-sitosterol, el campesterol y el estigmasterol son los más abundantes. Otros ejemplos de esteroles útiles son brasicasterol, desmosterol, chalinosterol, poriferasterol y clionasterol. Se pueden utilizar esteroles individuales o una mezcla de esteroles, aislados de fuentes naturales o sintéticos, e isómeros y derivados de los mismos. Son particularmente útiles los derivados saturados de esteroles, conocidos como estanoles, en los que todos los enlaces carbono-carbono de los anillos están saturados. Los estanoles adecuados tienen 28 ó 29 átomos de carbono e incluyen beta-sitostanol, clionastanol, 22,23-dihidrobrasicastanol y campestanol. Los fitosteroles pueden estar en forma sólida (por ejemplo, de polvo o gránulos) o líquida (por ejemplo, de
aceite).
Los esteroles y estanoles se encuentran en diversos materiales vegetales, como se describe, por ejemplo, en el Documento WO 1996/038047. La corteza de pino, el aceite de soja, la colofonia líquida, el extracto de brotes de bambú (descrito en el Documento WO 98/57545), las cáscaras y el aceite de cacao, y el aceite de salvado de arroz son fuentes ejemplares de esteroles/estanoles. La colofonia líquida, un subproducto de la industria de la pulpa y el papel, es una buena fuente de estanol, es decir, de beta-estanol.
El esterol vegetal se puede obtener de fuentes naturales tales como aceites vegetales, residuos de aceites vegetales, productos de destilación de aceites vegetales y otras fuentes de aceites vegetales, tal como la colofonia líquida, por medios relativamente sencillos y baratos. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. número 4.420.427, concedida a Hamunen, se describe una preparación de esteroles a partir de residuos de aceites vegetales usando un disolvente tal como el metanol. Los estanoles se encuentran en pequeñas cantidades en la naturaleza, pero pueden ser fácilmente preparados a partir de esteroles por hidrogenación de estos mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica. Cuando se prepara un material de partida esterólico a partir de un material vegetal, contendrá una mezcla de diversos esteroles diferentes; por lo tanto, después de la hidrogenación, el estanol resultante también será una mezcla de distintos estanoles. Las mezclas son adecuadas para uso en el presente invento. Sin embargo, también se pueden hidrogenar preparaciones esterólicas específicas puras para producir estanoles puros que también pueden ser utilizados.
El aceite de cacao extraído de cáscaras de cacao es una buena fuente de fitosterol. Los fitosteroles de cacao son una mezcla de esteroles libres y unidos, constituyendo los esteroles libres hasta aproximadamente el 90% de los fitosteroles presentes. Los fitosteroles incluyen campesterol, \beta-sitosterol, estigmasterol, cicloartenoilo y 24-metilén-cicloartenoilo, así como cantidades menores de otros fitosteroles. Los fitosteroles unidos incluyen ésteres de ácidos grasos o derivados de ferulato de los fitosteroles. El aceite de cacao también contiene tocoles, que incluyen tocoferoles (que tienen propiedades antioxidantes) y tocotrienoles (que pueden tener actividad reductora de los niveles de colesterol). El aceite de cacao se prepara mediante el procedimiento que comprende las operaciones de: (i) triturar las cáscaras de cacao;(ii) extraer los fitosteroles por tratamiento de las cáscaras trituradas de cacao con un disolvente; (iii) eliminar el disolvente; y (iv) recuperar el aceite de cacao. Las cáscaras de cacao, un subproducto de la tostadura de los granos de cacao, pueden proceder de granos de cacao fermentados y secados, granos de cacao micronizados, granos de cacao tostados y, preferiblemente, granos no fermentados y secados, que contienen el mayor contenido total de esteroles. Los granos de cacao preferidos son de Theobroma cacao. Los disolventes preferidos son éter de petróleo, hexano, pentano y éter dietílico. El disolvente puede ser recuperado por destilación en vacío. En una realización se trituran cáscaras liofilizadas hasta un polvo fino con un molino Tekmar (Cincinnati, Ohio, EE.UU.) y se somete la masa triturada a una extracción durante la noche con éter de petróleo redestilado (punto de ebullición de 38-39,6ºC) en un aparato Soxtec (Fisher Scientific, Springfield, New Jersey, EE.UU.). A la mañana siguiente, se elimina cuidadosamente el disolvente mediante una lenta evaporación bajo una corriente de nitrógeno y se almacenan los extractos resultantes a -40ºC. Los fitosteroles pueden ser luego purificados mediante HPLC preparativa o cromatografía en columna.
También se pueden utilizar formas esterificadas tanto de esteroles como de estanoles. La esterificación hace que los esteroles/estanoles sean más solubles en grasas y aceites, lo que, en ciertos casos, facilita su incorporación a productos alimenticios u otros vehículos de distribución. Por ejemplo, los esteroles pueden ser esterificados con ésteres de ácidos grasos. Los ejemplos de dichos esteroles esterificados incluyen acetato de sitosterol, oleato de sitosterol y oleato de estigmasterol. Se pueden preparar ésteres de estanol como es conocido en la técnica y como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 6.031.118, concedida a van Amerongen et al., la Patente de EE.UU. número 5.892.068, concedida a Higgins, la Patente de EE.UU. nº 5.502.045, concedida a Miettenen et al., y el Documento WO 00/04887. En una realización, se preparan ésteres de estanol útiles al esterificar al menos un esterol con un éster de ácido graso C_{2} a C_{22}, como se describe en la Patente de EE.UU. número 5.958.913, concedida a Miettenen et al. Se pueden utilizar otros métodos conocidos en la técnica para aumentar la solubilidad de los esteroles/estanoles tras la administración a un mamífero. Uno de dichos métodos se describe en la Patente de EE.UU. número 5.932.562, concedida a Ostlund, en que se mezcla el esterol/estanol con lecitina para obtener un polvo soluble en agua.
Se pueden añadir esteroles/estanoles a la composición en forma de polvo por mezclamiento con otros ingredientes. En el caso de un producto alimenticio que no es chocolate o de un chocolate reductor del nivel de colesterol, los estanoles/esteroles, así como otros agentes reductores del nivel de colesterol, son convenientemente añadidos en la operación de mezclamiento. Durante la preparación del chocolate reductor del nivel de colesterol, los esteroles/estanoles pueden ser añadidos, por ejemplo, a la mezcla seca que contiene azúcar, la manteca fusible; los nibs antes de la molienda; o el chocolate fundido, lo cual puede ser menos preferido. Para facilitar el mezclamiento, los esteroles/estanoles pueden ser disueltos primero en un agente solubilizante tal como grasa, aceite vegetal, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, tocoferoles y mezclas de los mismos. Los vehículos eficaces para preparar suspensiones y emulsiones de esteroles/estanoles son agua, alcohol, poliol, otros compuestos comestibles, tal como, por ejemplo, chocolate líquido, en que los esteroles/estanoles son al menos parcialmente solubles, y mezclas de los
mismos.
Se puede añadir proteína de soja a la composición en cualquier forma conocida; por ejemplo, puede ser un producto de aislamiento de proteína de soja, un concentrado de proteína de soja, proteína de soja texturizada o harina, copos y granos de soja. También se puede utilizar el grano completo o un fragmento del mismo, como se describe en, por ejemplo, el Ejemplo 5. Diversas formas de proteína de soja son bien conocidas en la técnica y son comercialmente asequibles. Sus propiedades y los métodos para su obtención se describen en, por ejemplo, "Soy Protein and Human Nutrition", redactado por Wilcke et al., Acad. Press, New York, EE.UU., 1979. La proteína de soja puede ser utilizada en combinación con cualquier agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol.
Las fibras vegetales solubles, por ejemplo, el beta-glucano, son capaces de reducir los niveles plasmáticos de colesterol. Las fibras para uso en el presente invento pueden ser obtenidas de cualquier fuente de beta-glucano, preferiblemente de grano de avena y salvado de avena. Las fibras pueden ser preparadas y añadidas a las composiciones de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Son particularmente adecuadas para composiciones oralmente suministradas, tales como alimentos y complementos dietéticos. El beta-glucano y otras fibras vegetales solubles se pueden utilizar en combinación con cualquier agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o
estanol.
Los productos alimenticios que no son chocolate y los chocolates reductores del nivel de colesterol del invento pueden contener también L-arginina, que puede ser proporcionada de diversas formas, tal como, por ejemplo, como un compuesto purificado, como un extracto procedente de una planta que contiene L-arginina o en forma de un ingrediente de semilla/fruto seco, por ejemplo, harina de fruto seco, o como una semilla/fruto seco entero. Se puede usar cualquier fuente de L-arginina, sintética o natural. Las fuentes de L-arginina preferidas son habas de soja y semillas de frutos secos tales como cacahuetes, nueces, almendras y avellanas. Se pueden usar semillas de frutos secos desengrasadas y parcialmente desengrasadas. Éstas pueden ser trituradas y a ellas se hace referencia como harina de frutos
secos.
Las composiciones también pueden contener calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma guar o un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado (por ejemplo, un ácido graso omega-3), que se pueden obtener de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Los ácidos grasos monoinsaturados o poliinsaturados pueden ser utilizados en forma de un aceite de oliva, un aceite de pescado o un fruto seco. Los ejemplos de frutos secos adecuados para este uso son: cacahuetes, almendras y nueces.
Las composiciones del invento son productos alimenticios que no son chocolate, chocolates reductores del nivel de colesterol o composiciones farmacéuticas para uso en la promoción de la salud vascular. Las composiciones pueden contener un vehículo, un diluyente o un excipiente. Dependiendo del uso previsto, se puede elegir el vehículo, diluyente o excipiente para que sea adecuado para uso humano o veterinario, para uso en alimentos, aditivos o complementos, o para uso farmacéutico.
Como aquí se usa, un "alimento" es un material que consiste esencialmente en proteína, hidrato de carbono y/o grasa, que utiliza un organismo para mantener el crecimiento, la reparación y los procesos vitales y para obtener energía. Los alimentos pueden también contener sustancias complementarias tales como minerales, vitaminas y condimentos; véase el Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10ª edición, 1993. El término "alimento" incluye una bebida adaptada para el consumo de seres humanos o animales. Como aquí se utiliza, un "aditivo alimentario" es lo que define la Food & Drug Administration (FDA) en 21 C.F.R. 170.3(e)(1), e incluye aditivos directos e indirectos. Como aquí se usa, un "producto farmacéutico" es un fármaco medicinal; véase el Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10ª edición, 1993. A un producto farmacéutico también se puede hacer referencia como un medicamento.
Los alimentos que comprenden procianidinas de cacao y al menos un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol, y opcionalmente L-arginina, calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma guar o un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado (por ejemplo, omega-3) pueden ser adaptados para uso humano o veterinario e incluir alimentos para animales de compañía. El producto alimenticio que no es chocolate puede ser distinto de un dulce. Los ejemplos incluyen un producto cocido (por ejemplo, un bizcocho de chocolate, un piscolabis cocido, una galleta o un bollo), un condimento, una barrita de muesli, un caramelo masticable, una barrita sustitutiva de la comida, un producto untable, un jarabe, una bebida energética mixta, una bebida con sabor a cacao o chocolate, un pudin, un pastel de arroz, una mezcla de arroz, una salsa saboreadora, y similares. Si se desea, los alimentos pueden tener sabor a chocolate o cacao. Los productos alimenticios que contienen L-arginina además del polifenol de cacao y el agente reductor del nivel de colesterol son preferiblemente chocolates reductores del nivel de colesterol y barritas dulces, tales como barritas de muesli, que contienen frutos secos tales como, por ejemplo, cacahuetes, nueces, almendras y avellanas. Ha de advertirse que la adición de frutos secos con piel al alimento aquí descrito puede aumentar también el contenido total de polifenoles ya que, por ejemplo, la piel del cacahuete contiene aproximadamente 17% de procianidinas y la piel de la almendra contiene aproximadamente 30% de procianidinas. Los productos alimenticios del invento que no son chocolate contienen al menos 10 \mug, más preferiblemente al menos 100 \mug/g de procianidinas de cacao. Si se desea, los productos alimenticios que no son chocolate pueden contener niveles mucho mayores de procianidinas de cacao que los hallados en los productos alimenticios de chocolate descritos más adelante.
El chocolate reductor del nivel de colesterol del invento es preferiblemente chocolate negro. En esta realización, el chocolate comprende al menos 3600 \mug, preferiblemente al menos 4000 \mug, preferiblemente al menos 4500 \mug, más preferiblemente al menos 5000 \mug y muy preferiblemente al menos 5500 \mug, de procianidinas de cacao por gramo de chocolate con respecto a la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto. En otras realizaciones, el chocolate contiene al menos 6000 \mug, preferiblemente al menos 6500 \mug, más preferiblemente al menos 7000 \mug, muy preferiblemente al menos 8000 \mug y aún más preferiblemente 10.000 \mug, de procianidinas de cacao por gramo con respecto a los sólidos de cacao no grasos en el producto.
Un chocolate con leche reductor del nivel de colesterol del invento tiene al menos 1000 \mug, preferiblemente al menos 1250 \mug, más preferiblemente al menos 1500 \mug y muy preferiblemente al menos 2000 \mug, de procianidinas de cacao por gramo con respecto a la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto de chocolate con leche. En la realización preferida, el chocolate con leche contiene al menos 2500 \mug, preferiblemente al menos 3000 \mug, más preferiblemente al menos 4000 \mug y muy preferiblemente al menos 5000 \mug, de procianidinas de cacao por gramo con respecto a la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto de chocolate con leche.
La cantidad de L-arginina en los productos alimenticios puede variar. Típicamente, el cacao contiene entre 1 y 1,1 gramos de L-arginina por 100 gramos de sólidos de cacao parcialmente desengrasados. Puede variar de 0,8 a 1,5 g por 100 gramos de cacao. Los productos alimenticios de chocolate de este invento contienen L-arginina en una cantidad superior a la que se encuentra naturalmente en los ingredientes de cacao. Conociendo las cantidades de ingredientes de cacao y de L-arginina utilizadas en el producto alimenticio, quien tiene una experiencia normal en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad total de L-arginina en el producto final. El producto alimenticio contendrá generalmente al menos 5 \mug/g, preferiblemente al menos 30 \mug/g o al menos 60 \mug/g, y aún más preferiblemente al menos 200 \mug/g de producto alimenticio.
La cantidad del agente reductor del nivel de colesterol en el alimento dependerá del tipo de agente utilizado, y puede ser determinada por una persona con experiencia en la técnica basándose en el asesoramiento de esta memoria descriptiva, particularmente en las dosificaciones diarias proporcionadas más adelante, y en los conocimientos de la técnica. Por ejemplo, una composición alimenticia puede contener de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 g por ración de 45 g de tamaño, preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5 g por ración de 45 g de tamaño, muy preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4,5 g por ración de 45 g de tamaño, de esteroles/estanoles. Con respecto a la proteína de soja y la fibra soluble de avena, la FDA ha proporcionado las cantidades mínimas por ración alimenticia que permiten hacer una reivindicación saludable. De acuerdo con la FDA, una ración alimenticia que contiene beta-glucano debe contener al menos 0,75 g, y la ración alimenticia que contiene proteína de soja debe contener al menos 6,25 g de proteína de soja. Estos valores pueden ser también utilizados como una guía para determinar la cantidad de estos agentes reductores del nivel de colesterol en el
alimento.
En una de las realizaciones preferidas, se proporciona una cantidad eficaz diaria del agente reductor del nivel de colesterol y de la procianidina de cacao en una sola ración. De esta manera, un dulce (por ejemplo, chocolate) que reduce el nivel de colesterol contiene al menos 1,5 g (por ejemplo, 1,5-4,5 g) de esterol/estanol por ración y al menos aproximadamente 100 mg (por ejemplo, aproximadamente 150-200, 200-400 mg) de procianidinas de cacao/
ración.
Las composiciones farmacéuticas del invento como las anteriormente definidas, que son para uso en la promoción de la salud vascular y que incluyen opcionalmente L-arginina, pueden ser administradas de diversas formas, tales como oral, bucal, nasal, rectal, intravenosa, parenteral y tópicamente. Una persona con experiencia en la técnica podrá determinar, dependiendo del modo de administración, un adecuado agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol o estanol. De esta manera, las formas de dosificación adaptadas para cada tipo de administración están dentro del alcance del invento e incluyen formas de dosificación sólidas, líquidas y semisólidas, tales como tabletas, cápsulas, cápsulas de gelatina ("gelcaps"), polvos o gránulos sueltos o en dosis unitarias, emulsiones, suspensiones, pastas, cremas, geles, espumas o gelatinas. Las formas de dosificación para liberación continua están también dentro del alcance del invento y pueden ser preparadas de la manera descrita en las Patentes de EE.UU. números 5.024.843, 5.091.190, 5.082.668, 4.612.008 y 4.327.725. Los vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son generalmente conocidos en la técnica y pueden ser fácilmente determinados por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, la tableta puede comprender una cantidad eficaz de la composición que contiene polifenoles de cacao y, opcionalmente, un vehículo tal como sorbitol, lactosa, celulosa o fosfato
dicálcico.
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El invento proporciona además un envase que comprende un producto alimenticio o un chocolate reductor del nivel de colesterol del invento, como se definieron anteriormente, y una etiqueta y/o instrucciones para el uso del producto alimenticio o el chocolate para promover la salud vascular (también se puede usar la expresión "salud cardiovascular") y/o reducir el riesgo de enfermedad cardíaca. La etiqueta y/o las instrucciones pueden indicar que la composición promueve o potencia la absorción del polifenol. La etiqueta y/o las instrucciones pueden también indicar otras propiedades beneficiosas, tales como reducción del nivel plasmático de colesterol, total y LDL, inhibición de la actividad COX, inhibición de la actividad LOX, potenciación de la producción de óxido nítrico, aumento de la relación de factores aterostáticos a aterogénicos (es decir, eicosanoides y endotelinas producidos) e inhibición de la oxidación de LDL, las cuales, a su vez, individualmente o en combinación, ayudan a reducir la vasoconstricción y la agregación de plaquetas, inhibir la adhesión de monocitos, inhibir una excesiva proliferación de músculo liso vascular, reducir la trombosis, reducir la presión sanguínea y, por lo tanto, reducir los riesgos asociados con enfermedades vasculares y cardiovasculares tales como la aterosclerosis y la enfermedad cardiovas-
cular.
Las composiciones del invento son útiles para tratar y/o prevenir enfermedades y/o estados asociados con, o modulados por, la actividad COX, la actividad LOX, la producción de NO, la actividad NOS, la oxidación de LDL, y unos niveles plasmáticos aumentados de colesterol total y LDL. Como se usa aquí, "tratamiento" significa mejora de un estado médico existente, tal como, por ejemplo, una elevada presión sanguínea o aterosclerosis, al afectar a la patología de la enfermedad o a los síntomas asociados con ella. El término "prevención" significa reducción de los riesgos asociados con el desarrollo de una enfermedad, incluyendo la reducción del inicio de la enfermedad. Se puede utilizar la prevención o la profilaxis en un individuo del que se sabe que presenta un riesgo elevado de desarrollar una enfermedad, o en una población en general para mantener una buena salud, por ejemplo, mantener la salud vascular. El sujeto puede ser un ser humano o un animal de veterinario, tal como un perro, un gato o un
caballo.
Las enfermedades y/o estados asociados con, o modulados por, la actividad COX, la actividad LOX, la producción de NO, la actividad NOS, la oxidación de LDL y/o unos niveles elevados de colesterol incluyen aterosclerosis, hipertensión, enfermedad cardíaca coronaria (CHD), enfermedad cerebrovascular, ataque cardíaco, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica e insuficiencia renal. También se incluyen métodos para tratar o prevenir la hipercolesterolemia (incluyendo la hipercolesterolemia benigna), provocar vasorrelajación, inhibir las actividades COX (incluyendo COX1) y LOX, inhibir la oxidación de LDL, potenciar la actividad NOX y aumentar el nivel de NO, inhibir la agregación de plaquetas, la adhesión de monocitos y la proliferación de músculo liso vascular, reducir la presión sanguínea, reducir las trombosis y modular el estrés oxidativo.
Se puede administrar una composición del invento a un mamífero sano con fines profilácticos, o a un mamífero que necesita un tratamiento o que tiene al menos uno de los factores de riesgo asociados. Cualquier individuo que presente al menos uno de los factores de riesgo asociados con problemas de salud vascular es un sujeto para la administración de las composiciones aquí descritas. Los individuos con una historia familiar de niveles elevados de colesterol, las hembras perimenopáusicas o posmenopáusicas, las hembras posmenopáusicas con lesión miocárdica posisquémica, las hembras con déficit de estrógenos provocado quirúrgica o químicamente, los ancianos, aquellos con hiperglucemia, diabetes, hipertensión y obesidad, y los fumadores de cigarrillos, son todos individuos susceptibles que necesitan el tratamiento aquí descrito. Otras poblaciones de mamíferos que son susceptibles de desarrollar problemas de salud vascular resultarán evidentes a un experto en la técnica.
Una aplicación particularmente útil está en el tratamiento o la prevención de la reestenosis. Cada año, aproximadamente 330.000 pacientes de los Estados Unidos son sometidos a una angioplastia coronaria y/o periférica (Marx, Science 265, 320, 1994), un procedimiento diseñado para abrir los vasos sanguíneos, por ejemplo, las arterias coronarias, obstruidos por placas ateroscleróticas, para restablecer el flujo sanguíneo normal. Sin embargo, casi el 33% de estos pacientes desarrollan reestenosis; es decir, las arterias tratadas se vuelven a obstruir rápidamente otra vez. Estos pacientes no se encuentran mejor, y a veces se encuentran peor, que antes de la angioplastia. La excesiva proliferación de células de músculo liso (SMCs; del inglés, smooth muscle cells) en las paredes de los vasos sanguíneos contribuye a la reestenosis. De esta manera, se pueden administrar las composiciones que contienen polifenol de cacao y un agente reductor del nivel de colesterol (y opcionalmente L-arginina) antes de la angioplastia o poco después de ella, según determine el facultativo médico experto.
Las composiciones anteriormente descritas se pueden administrar a animales de veterinario, por ejemplo, perros, gatos y caballos, para tratar o prevenir la insuficiencia cardíaca, la degeneración valvular y la insuficiencia renal crónica. Por ejemplo, las composiciones del invento se pueden administrar a perros para abordar los estados siguientes: enfermedad valvular crónica (endocardiosis o degeneración mixomatosa de las válvulas atrioventriculares), cardiomiopatía dilatada, enfermedad pericárdica, endocarditis, arritmias primarias y dirofilariasis canina.
La cantidad eficaz puede ser determinada por una persona experta en la técnica usando el asesoramiento aquí proporcionado y los conocimientos generales de la técnica. Por ejemplo, para obtener los efectos reductores del nivel de colesterol usando esteroles/estanoles, se debería administrar más de lo que se encuentra normalmente en la dieta media de una persona no vegetariana. Una persona con una dieta típica de América del Norte consume aproximadamente 200-400 mg/día. Por lo tanto cuando se utiliza un fitosterol, tal como sitosterol, para reducir los niveles de colesterol, se debería administrar aproximadamente al menos 1 g/día, preferiblemente al menos aproximadamente 3 g/día. Preferiblemente, se utiliza de al menos aproximadamente 1 g/día, preferiblemente de al menos aproximadamente 4,5 g/día, a aproximadamente 20 g/día. Sin embargo, la cantidad variará dependiendo de la potencia del fitosterol para reducir el nivel de colesterol, por lo que, por ejemplo, si se usa un sitostanol más potente, la cantidad eficaz puede ser tan pequeña como de aproximadamente uno a aproximadamente tres g/día. Las cantidades pueden ser determinadas utilizando el procedimiento analítico descrito por Roger et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 70 (30), 1993, y Carpenter et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 71 (8), 1994. Se puede administrar proteína de soja, tal como, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 g/día. Se puede hallar un asesoramiento adicional en "Recommended Daily Allowances", 9ª edición, National Res. Council/National Acad. Sci., Washington, distrito de Columbia, EE.UU. Se puede administrar fibra soluble, tal como, por ejemplo, al menos 3 g/día. Se administra procianidina de cacao en una cantidad de aproximadamente 50 mg/día a aproximadamente 1000 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 100-150 mg/día a aproximadamente 900 mg/día, y muy preferiblemente de aproximadamente 300 mg/día a aproximadamente 500 mg/día. Sin embargo, dado que los polifenoles se hallan naturalmente en los alimentos y son atóxicos, se pueden utilizar cantidades mayores que las anteriormente expresadas. Se puede administrar L-arginina en una cantidad de aproximadamente 2 g/día a aproximadamente 50 g/día, preferiblemente de aproximadamente 3 g/día a aproximadamente 10 g/día, y muy preferiblemente de aproximadamente 6 g/día a aproximadamente 8 g/día. También aquí, dado que la L-arginina se encuentra naturalmente en los alimentos, se pueden utilizar cantidades mayores que las anteriormente expresadas. Generalmente, los polifenoles se pueden administrar en las cantidades conocidas en la técnica. Cuando se determina la cantidad eficaz, también se puede tener en cuenta la absorción aumentada en presencia de esteroles/estanoles. Los tratamientos/administraciones preventivas pueden continuarse como un régimen, por ejemplo, diaria, mensual, bimensual, anual o bianualmente, o, en algún otro régimen, según determine el facultativo médico experto, durante el tiempo que sea necesario. Preferiblemente, la composición se administra diariamente, muy preferiblemente dos o tres veces al día, tal como, por ejemplo, por la mañana y por la tarde, para mantener los niveles de los compuestos eficaces en el organismo del mamífero. Para obtener los resultados más beneficiosos, la composición puede administrarse durante un periodo de al menos aproximadamente 30 a aproximadamente 60 días. Estos regímenes se pueden repetir
periódicamente.
El invento se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no restrictivos.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Efecto de procianidinas de cacao sobre la actividad lipoxigenasa
Se prepararon las fracciones (monómero a hexámero) y extractos (crudo en acetona y enriquecido en pentámero) fenólicos del modo descrito en los Ejemplos 1-5 de la Patente de EE.UU. número 5.554.645, concedida a Romanczyk et al., y el Ejemplo 5 de la Solicitud Internacional nº PCT/US97/05693, publicada como WO 97/36497. La lipoxigenasa de tipo I-B de soja, el ácido linoleico (aproximadamente al 99%), el Tween 20 (monolaurato de polioxietilén-sorbitán) y los fenoles testigo [ácido nordihidroguayarético (NDGA), (+)-catequina y (-)-epicatequina] se obtuvieron de Sigma Chemical.
Se solubilizó el ácido linoleico utilizando el agente emulsivo Tween 20 de acuerdo con Grossman y Zakut (Methods Biochem. Anal. 25: 303-329, 1979). Se disolvió la lipoxigenasa en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH de 8,6, hasta 5000 U/ml. Se disolvieron los fenoles de cacao en agua pura y se realizaron diluciones a partir de las disoluciones madre siguientes. Se disolvieron del monómero al hexámero hasta 1 mM, los extractos hasta 1 mg/ml (1 g de extracto crudo en acetona/l, monómero \sim 3,0 mM; 1 g de extracto enriquecido en pentámero/l, \sim 3,4
mM).
Se calculó la inhibición para cada grupo de muestras de seis cubetas de reacción (1 testigo con agua, 5 muestras experimentales con fenol en agua) de acuerdo con la fórmula: % de inhibición = (\Delta abs. del testigo - \Delta abs. de la muestra experimental)/(\Delta abs. del testigo) x 100. Las mezclas de reacción contenían ácido linoleico disuelto (100 \muM) en PBS, pH de 7,4, más/menos fenoles de ensayo en agua. Se inició la reacción añadiendo lipoxigenasa para una concentración final de 100 U/ml. La medición de dienos conjugados en la formación de hidroperóxidos de ácido linoleico se realizó registrando barridos cinéticos durante 5 ó 10 minutos en un espectrofotómetro UV Beckman DU-600 (a 37ºC; absorbancia a 234 nm).
La elevada absorbancia UV de los componentes de cacao no permitía la medición de la concentración inhibitoria semimáxima (IC_{50}; del inglés, inhibitory concentration) en las concentraciones presentes. Por esta razón, se calculó un valor de IC_{50} extrapolando la curva de regresión logarítmica (% de inhibición con respecto al logaritmo de la concentración de fenol) hasta la concentración en que la sustancia de ensayo conseguía una inhibición de la actividad lipoxigenasa del 50%. Los valores de IC_{50} extrapolados proporcionan una aproximación grosera de la actividad inhibidora de lipoxigenasa de los extractos polifenólicos de cacao. El NDGA es un inhibidor establecido de lipoxigenasas de soja y de diversos mamíferos (Kemal et al., Biochemistry 26: 7064-7072, 1987). Es comercialmente usado como un antioxidante en grasas y aceites. El NDGA sirve como testigo positivo ya que el valor de IC_{50} de 2 x 10^{-6} M no fue alcanzado por otros fenoles de ensayo. Se supone que la (+)-catequina y la (-)-epicatequina son estructuralmente similares al monómero polifenólico de cacao.
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Se compararon los fenoles con respecto a una base molar. La inhibición de la lipoxigenasa por (+)-catequina (3 x 10^{-3} M) era dos órdenes de magnitud más intensa que por (-)-epicatequina (3 x 10^{-1} M) y muy similar a la inhibición por el monómero (5 x 10^{-3} M), el dímero (2 x 10^{-3} M) y el trímero (2 x 10^{-3} M) de cacao. La inhibición de la lipoxigenasa por los oligómeros superiores se correlacionaba menos bien con el logaritmo de la concentración molar. A las concentraciones finales de 0,3 a 25 \muM, el tetrámero, el pentámero y el hexámero inhibían el 5-30% de la actividad lipoxigenasa. Sin embargo, la concentración de fenol y la inhibición no se correlacionaban significativamente. El extracto crudo en acetona presentaba una inhibición de lipoxigenasa (IC_{50} = 5 \muM, en comparación con el monómero), dependiente de la concentración, aproximadamente 3 órdenes de magnitud más pequeña que la de las fracciones de monómero a trímero. El extracto enriquecido en pentámero (IC_{50} = 59 M) no inhibía la actividad lipoxigenasa en un nivel significativo.
La actividad de los extractos fenólicos de cacao en cuanto a inhibir la lipoxigenasa de soja se parece a la de la (+)- catequina. Hay poca diferencia entre las actividades del monómero al trímero si se comparan con respecto a una base molar, lo que sugiere una inhibición estérica de la enzima. La inhibición puede ser específica para los componentes de bajo peso molecular (monómero a trímero) ya que los compuestos tetrámero a hexámero muestran una actividad inhibidora de lipoxigenasa considerablemente menor, y el extracto enriquecido en pentámero es menos inhibidor que el extracto crudo, que contiene más de las fracciones oligómeras de monómero a trímero. De esta manera, los polifenoles de cacao inhiben la lipoxigenasa de soja al quelar el ion hierro prostético o al suprimir radicales libres por medio de grupos hidroxilo fenólicos en la reacción de oxidación, que incluye productos intermedios con radicales libres. Los oligómeros más grandes (los tetrámeros a hexámeros) pueden estar estéricamente impedidos y, por lo tanto, puede que no sean capaces de leer el sitio catalítico de la enzima.
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Ejemplo 2
Efectos de extractos de procianidinas de cacao y fracciones oligómeras de procianidinas de cacao sobre la liberación de prostanoides y endotelina (ET) total por células endoteliales basales
Se estudió el efecto de los monómeros y pentámeros purificados de procianidina procedentes del extracto polifenólico de cacao sobre la liberación de los prostanoides prostaciclina, prostaglandina (PGE2) y tromboxano y de la endotelina total por células endoteliales bovinas y humanas en cultivo.
Se adquirió indometacina a Cayman (An Harbor, Michigan, EE.UU.). Las fracciones monómeras y pentámeras de procianidina fueron purificadas a partir de granos de cacao enriquecidos en procianidinas (procesados de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de EE.UU. nº 6.015.913, concedida el 18 de Enero de 2000), mediante los métodos descritos en los Ejemplos 1-5 de la Patente de EE.UU. nº 5.554.645, concedida el 10 de Septiembre de 1996.
Las muestras fueron analizadas por el método de Hammerstone et al. (J. Agric. Food Chem. 47 (2): 490-496, 1999). La confirmación de la pureza a través del peso molecular se obtuvo por espectrometría de masas.
Se cultivaron células endoteliales aórticas bovinas (BAECs) y células endoteliales aórticas humanas (HAECs; del inglés, human aortic endothelial cells) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM; del inglés, Eagle's minimum essential medium) de la manera previamente descrita por Schramm et al. (J. Nutr. Biochem. 8: 647-651, 1997; J. Agric. and Food Chem. 46 (5): 1900-1905, 1998).
Se sembraron ECs (subcultivo < 11) en placas de 24 pocillos con EMEM que contenía 2 milimoles de glutamina/l, suero bovino fetal al 10%, 100 unidades de penicilina/l, 0,1 mg de estreptomicina/l y 0,25 pg de anfotericina/l. Las células confluentes fueron tratadas en 250 ml de EMEM exento de rojo fenol que, cuando era aplicable, contenía los compuestos de tratamiento. El medio incubado con ECs fue analizado después de la aplicación de las fracciones de procianidina (10, 20 y 30 picomoles/l) y la incubación con ECs durante 0 ó 20 minutos. El medio fue almacenado a -70ºC hasta que fue analizado mediante un inmunoensayo del modo descrito más adelante. Se determinó la integridad de las ECs por exclusión de azul de tripano, como describen Bioadjieras et al., Methods in Lab. Invest. 50: 239-246, 1984).
Los procedimientos de los inmunoensayos se llevaron a cabo de la forma descrita por Westcott et al., Prostaglandins 32: 857-873, 1986; Yakota et al., Adv. Prostgl. Thrombox. Leukot. Res. 15: 33-34, 1985; Schramm et al., 1997, 1998, 1999. Se midió la ET total del medio (ET-1 + ET-2 + ET-3) mediante el inmunoensayo número 583151 de Cayman. Se midió la 6-ceto-prostaglandina F1-alfa, un metabolito de la prostaciclina (PGI_{2}), con el inmunoensayo enzimático nº 515211 de Cayman; se midió el TXB_{2}, un metabolito del tromboxano (TXA_{2}), con el inmunoensayo enzimático nº 519031 de Cayman; y se determinó la PGE_{2} con el inmunoensayo nº 514016 de Cayman.
Las condiciones de ensayo establecidas remedan las previamente usadas para mostrar que una fracción de vino con una masa < 3000 Da provocaba efectos diferentes sobre la síntesis de prostanoides por ECs que una fracción de vino que tenía una masa > 3000 (Schramm et al., J. Agric. and Food Chem. 46 (5): 1900-1905, 1998). Se examinaron los efectos sobre la función de las células basales. Ni la viabilidad celular ni la morfología celular resultaron afectadas por los tratamientos con procianidinas de cacao. Cada mililitro de medio testigo incubado con BAECs durante 20 minutos contenía 73,5 \pm 0,044 ng de TXB2 y 294 \pm 6,3 pg de PGE2.
Como se muestra en la Figura 2, la adición de las procianidinas monómeras o pentámeras de cacao al medio incubado con BAECs durante 20 minutos alteraba las concentraciones de prostanoides y ET en el medio cuando se comparaba con la del medio testigo solo. Los medios que contenían procianidinas monómeras (A^{1}) o pentámeras (A^{2}) contenían más 6-ceto-PGF^{1}-alfa que el medio testigo. La PGE^{2} del medio resultaba reducida por la fracción monómera (B^{1}) de un modo dependiente de la dosis, y por la fracción pentámera (B^{2}) en una concentración 30 \muM. No se advirtió efecto significativo alguno de la fracción de procianidinas de cacao sobre el TXB del medio (C^{1-2}). Aunque las fracciones de procianidinas monómeras y pentámeras de cacao ejercían efectos similares sobre la 6-ceto-PGF^{1}-alfa y la PGE^{2} del medio, ejercían efectos opuestos sobre la ET del medio, aumentando la fracción monómera (D^{1}) la concentración de ET en el medio de cultivo en una concentración 30 \muM, y disminuyendo la fracción pentámera (D^{2}) la concentración de ET en el medio de un modo dependiente de la dosis.
Los datos de las Figuras 3 A-B demuestran la forma similar en que las procianidinas monómeras y pentámeras de cacao afectan a las ECs aórticas de vacas (BAECs) y seres humanos (HAECs).
Los datos anteriores demuestran que las procianidinas de cacao inducen efectos de eicosanoides y endotelinas que relajan la relajación de los vasos y disminuyen la formación de agregaciones/trombos de plaquetas, es decir, la inducción de prostaciclina y la inhibición de endotelinas y prostaglandinas.
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Ejemplo 3
Efecto del consumo de una bebida de cacao enriquecida con procianidinas sobre la actividad de las plaquetas
Se estudiaron los efectos del consumo de una bebida de cacao sobre la modulación de la activación de plaquetas y la hemostasis primaria.
Treinta adultos sanos y no fumadores, sin historia de enfermedad cardíaca ni de trastornos hemostáticos, fueron divididos en 3 grupos de tratamiento: (a) 10 sujetos (4 varones y 6 hembras, de 24-49 años de edad) que consumían una bebida de cacao, (b) 10 sujetos (4 varones y 5 hembras, de 26-50 años de edad) que consumían una bebida con cafeína, como testigo, y (c) 10 sujetos (4 varones y 6 hembras, de 24-50 años de edad) que consumían agua, como testigo. Todas las mujeres eran premenopáusicas y ninguna tomaba estrógenos. Los participantes fueron instruidos para que se abstuvieran de medicación con fármacos antiinflamatorios no esteroides durante al menos 4 días, de bebidas alcohólicas durante al menos 2 días, y de alimentos que contuvieran cafeína o teobromina durante al menos 24 horas antes del ensayo y durante el día del ensayo.
Se obtuvo sangre de cada sujeto a una hora entre las 8 y las 10 de la mañana. Las muestras se recogieron en dos tubos vacíos de 5 ml de capacidad que contenían 0,5 ml de una disolución tamponada de citrato sódico al 3,2% (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, EE.UU.). Los sujetos de ensayo bebieron luego 300 ml de una bebida que contenía 18,75 g de polvo de cacao enriquecido con procianidinas (que proporcionaba aproximadamente 960 mg de procianidinas totales, 17 mg de cafeína y 285 mg de teobromina) y 12,5 g de sacarosa mezclados con agua destilada (véase G. E. Adamson et al., J. Ag. Food Chem. 47 (10): 4184-4188, 1999). Los sujetos testigo bebieron o bien una bebida que contenía 17 mg de cafeína y 12,5 g de sacarosa o bien agua natural. Se obtuvieron muestras de sangre adicionales 2 y 6 horas después del consumo de las bebidas. Un sujeto femenino no estuvo presente en la extracción de sangre de las 6 horas después del consumo de cacao.
Se cuantificaron las procianidinas del modo siguiente: se preparó un patrón compuesto utilizando (-)-epicatequina comercialmente asequible y los dímeros a decámeros obtenidos en un estado purificado mediante los métodos descritos por J. F. Hammerstone et al., J. Ag. Food Chem. 47 (10): 490-496, 1999; S. A. Lazarus et al., J. Ag. Food Chem. 47 (9): 3693-3701, 1999; y G. E. Adamson et al., J. Ag. Food Chem. 47 (10): 4184-4188, 1999. Se analizaron las disoluciones madre estándares utilizando estos compuestos, usando el método de HPLC en fase normal descrito en la referencia de Adamson previamente citada, con detección de fluorescencia a las longitudes de onda de excitación y emisión de 276 nm y 316 nm, respectivamente. Se agruparon los picos y se sumaron sus áreas para incluir las contribuciones de todos los isómeros dentro de cualquier clase de oligómeros, y se generaron curvas de calibración utilizando un ajuste cuadrático. Los monómeros y los oligómeros más pequeños presentaban gráficos casi lineales, lo que es coherente con la utilización previa de la regresión lineal para generar curvas de calibración basadas en monómeros y basadas en dímeros.
Luego se usaron estas curvas de calibración para calcular los niveles de procianidinas en muestras preparadas de la manera siguiente: En primer lugar, se desengrasó la muestra de cacao o chocolate (aproximadamente 8 gramos) usando tres extracciones con hexano (de 45 ml cada una). A continuación, se sometió un gramo de material desengrasado a extracción con 5 ml de una mezcla de acetona/agua/ácido acético (70:29,5:0,5; volumen/volumen/volumen). Luego se determinó la cantidad de procianidinas en el material desengrasado comparando los datos de HPLC de las muestras con las curvas de calibración obtenidas del modo anteriormente descrito (en que se utilizaron los oligómeros purificados). Se determinó el porcentaje de grasa en las muestras (utilizando un tamaño de muestra de un gramo para el chocolate o un tamaño de muestra de medio gramo para los líquidos) utilizando un método normalizado de la Association of Official Analytical Chermists (Método Oficial 920.177 de la AOAC). Luego se calculó la cantidad de los niveles totales de procianidinas en la muestra original (con grasa). La calibración se llevó a cabo antes de analizar cada muestra para protegerla de variaciones de columna a columna.
A los 10 minutos de la recogida de las muestras sanguíneas, se incubó la sangre completa con 10 \mul de tampón HEPES (pH de 7,4, testigo no estimulado), ADP 20 ó 100 \muM o epinefrina 20 \muM (BioData, Horsham, Pennsylvania, EE.UU.) en tubos de poliestireno durante 5 minutos a temperatura ambiental, en presencia o ausencia del péptido Arg-Gly-Asp-Ser (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Después de 5 minutos, se suspendieron las muestras en 1 ml de tampón HEPES y se transfirieron 100 \mul de muestra a tubos que contenían concentraciones saturantes (20 \mul) de cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales fluorescentemente marcados: PAC1-isotiocianato de fluoresceína (FITC; del inglés, fluorescein isothiocyanate), anti-CD62P-ficoeritrina (PE; del inglés, phycoerythrin) y anti-CD42a-PerCP. PAC1 reconoce la conformación activada del receptor GPIIb-IIIa ligante de fibrinógeno, y anti-CD62P reconoce la selectina P, presentes en la superficie de las plaquetas activadas. Anti-CD42a reconoce GPIb-IX, que está sobre la superficie de las plaquetas tanto activadas como en reposo. Como testigos isotípicos, se usaron IgG de ratón-FITC e IgG de ratón-PE. Se usó el péptido Arg-Gly-Asp-Ser para bloquear la unión del anticuerpo PAC1 a las plaquetas y, de esta forma, ajustar el marcador testigo negativo en el citómetro de flujo. Los anticuerpos y los testigos isotípicos se adquirieron a Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc, San Jose, California, EE.UU.
Se incubaron las muestras de sangre completa, en presencia y ausencia de los agonistas ADP y epinefrina, con anticuerpos monoclonales o con el testigo isotípico durante 20 minutos a temperatura ambiental en la oscuridad. Las muestras fueron luego fijadas en paraformaldehído al 1% filtrado (pH de 7,2) y almacenadas en la oscuridad a 2-8ºC. Todas las muestras fueron analizadas en 48 horas mediante un citómetro de flujo FACScan utilizando el software LYSYS II. Se verificó el funcionamiento del citómetro de flujo utilizando glóbulos de calibración de 1, 2 y 10 \mum (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc, San Jose, California, EE.UU., y Flow Cytometry Systems, Research, Triangle Park, North Carolina, EE.UU.). Se recogieron veinte mil casos en modo de lista, con todos los parámetros de fluorescencia y de dispersión lumínica en modo logarítmico. Se dejaron pasar las plaquetas basándose en la dispersión lumínica y la expresión de CD42a. Las plaquetas activadas fueron definidas como el porcentaje de casos positivos para CD42a que coexpresan la conformación activada de GPIIb-IIIa o de selectina P. Las micropartículas plaquetarias fueron definidas como el porcentaje de casos positivos para CD42a con un tamaño inferior a 2 \mum.
Una muestra de sangre extraída en cada uno de los tres puntos temporales del estudio fue analizada a las cuatro horas utilizando un analizador de la función plaquetaria (PFA-100^{TM}, Dade Behring International, Miami, Florida, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante; véanse Mammen et al., Sem. Thromb. Hemostas. 24: 195-202, 1998, y Fressinaud et al., Blood 91: 1325-31, 1998. Se midió la función como el tiempo de cierre en segundos, que se define como el tiempo requerido para que la sangre ocluya una abertura en la membrana del cartucho de ensayo.
Se analizaron las diferencias de los datos de cada grupo de tratamiento o grupo testigo utilizando ANOVA de medidas repetidas de Friedman sobre categorías (SigmaStat para Windows, SPSS, Richmond, California, EE.UU.). Se usó el método de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls para identificar diferencias entre la línea de base y los resultados de 2 y 6 horas después del consumo. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
El consumo de cacao suprimía, a las 2 y 6 horas después de la ingestión, la expresión de GPIIb-IIIa activado, no estimulada (P = 0,035, Figura 4A) e inducida por epinefrina ex vivo (P = 0,008, Figura 4B). Los porcentajes medianos de plaquetas que expresan GPIIb-IIIa activado sin estimulación eran 0,9, 0,5 y 0,3% y, en respuesta a la epinefrina, eran 9,6, 6,8 y 3,3% a tiempo cero y a las 2 y 6 horas después del consumo, respectivamente. Por contraste, en el grupo testigo que bebió la bebida con cafeína hubo un aumento en la expresión de GPIIb-IIIa activado, estimulada con epinefrina (P = 0,048, valor mediano = 5,3, 6,5 y 7,5% a tiempo cero y a las 2 y 6 horas después del consumo). No hubo cambio alguno en el grupo testigo que bebió agua.
El cacao disminuyó la expresión de GPIIb-IIIa activado en las plaquetas, provocada por ADP 20 \muM, 2 y 6 horas después del consumo (P < 0,001, Figura 4C, valor mediano = 58,5, 44,2 y 38,8% a tiempo cero y a las 2 y 6 horas después del consumo, respectivamente). La tendencia sugería una expresión disminuida de GPIIb-IIIa activado en las plaquetas después del consumo de cacao cuando la activación era provocada por ADP 100 \muM (P = 0,067, valor mediano = 76,5, 68,7 y 57,6% a tiempo cero y a las 2 y 6 horas después del consumo, respectivamente). Ni en los grupos que consumieron la bebida con cafeína ni en los testigos de agua hubo cambio alguno en la expresión de GPIIb-IIIa activado provocada por ADP.
Después del consumo de cacao, se observó una tendencia no significativa hacia una expresión disminuida de selectina P (P = 0,053, Figura 5A). El consumo de cacao disminuía la expresión de selectina P, provocada por ADP 20 \muM, 2 y 6 horas después del consumo (P = 0,007, Figura 5C), y la expresión de selectina P provocada por ADP 100 \muM era 56,1, 54,7 y 41,7% a tiempo cero y a las 2 y 6 horas después del consumo, respectivamente.
No hubo evidencia alguna de estimulación ni inhibición de plaquetas en los grupos testigo que consumieron agua o la bebida que contenía cafeína.
El número de micropartículas plaquetarias detectadas por citometría de flujo después del consumo de la bebida de cacao resultó disminuido con respecto a la línea de base a las 2 horas y resultó más disminuido a las 6 horas (véase la Tabla 1). Por contraste, el número de micropartículas plaquetarias resultó aumentado a las 2 y 6 horas después del consumo de agua y a las 6 horas después del consumo de la bebida que contenía cafeína. Las micropartículas plaquetarias son hemostáticamente activas, microvesículas ricas en fosfolípidos que se forman durante la activación fisiológica de las plaquetas.
TABLA 1
5 
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Seis horas después del consumo de la bebida de cacao, el tiempo de cierre inducido por colágeno-epinefrina resultó prolongado (véase la Tabla 2). Esto indica una hemostasis primaria relacionada con plaquetas retrasada, por el consumo de cacao. Se observó una tendencia hacia un tiempo de cierre prolongado después de la inducción por colágeno-ADP (p = 0,097); el tiempo de cierre no resultó cambiado en el grupo testigo de la cafeína.
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TABLA 2
6 
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Los resultados mostraban que el consumo de la bebida de chocolate modificaba la función plaquetaria en los seres humanos. En primer lugar, la activación de plaquetas medida por la expresión del marcador de la activación de plaquetas en respuesta a agonistas débiles in vitro resultó disminuida después del consumo de cacao. En segundo lugar, la formación de micropartículas plaquetarias resultó disminuida después del consumo de cacao. Y, en tercer lugar, el consumo de cacao causó un efecto de tipo aspirina sobre la función plaquetaria, según se midió mediante la hemostasis primaria relacionada con plaquetas. El hecho de que el testigo de la bebida con cafeína causara un aumento en la expresión de GPIIb-IIIa activado, provocada por epinefrina, y en la formación de micropartículas implicaría que las procianidinas de cacao presentes en la bebida de cacao son responsables de la inhibición de la activación y la función plaquetarias.
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Ejemplo 4
Efectos del consumo oral de cacao sobre la inhibición de la relajación, dependiente del endotelio vascular, por colesterol
Se ha mostrado que ciertos extractos vegetales que contienen flavonoides provocan una relajación dependiente del endotelio vascular (EDR; del inglés, endothelium dependent relaxation) in vitro en aortas de conejo. Se estudiaron los efectos de una administración oral crónica de cacao sobre la EDR, y su actividad protectora contra la pérdida de EDR que se produce con una alimentación con colesterol. Se alimentaron conejos blancos de Nueva Zelanda durante 7 semanas con 4 dietas: (1) comida, (2) comida + 200 mg de cacao/día, (3) colesterol al 2% durante 3 semanas, seguidas de 4 semanas de comida, y (4) colesterol al 2% durante 3 semanas, seguidas de 4 semanas de comida + 200 mg de cacao/día. Se midió la EDR en anillos aórticos suspendidos en baños para órganos (20 ml). Los anillos fueron previamente contraídos con norepinefrina (NE; 10^{-5} M). Se midió la EDR por acetilcolina (Ach) y extracto de pentámeros de cacao (10^{-7} - 10^{-5} M) como % de relajación con respecto a la NE.
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7 
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Ejemplo 5
Efecto del consumo oral de procianidinas de cacao, fitosteroles y combinaciones de los mismos
Los resultados de este experimento muestran los efectos de la alimentación con una combinación de fitostanoles y fitosteroles no esterificados obtenibles de colofonia líquida ("fitosterol") y polvo de cacao (PoC), que contiene aproximadamente 70 mg de procianidinas totales de cacao/g, sobre (1) los índices de daño y estrés oxidativos y (2) sobre los niveles de colesterol, así como el efecto sinérgico de la administración combinada de fitosteroles y procianidinas de cacao.
Una dieta con cáscara de huevo purificada fue complementada con fitosteroles (2% en peso) y/o PoC (0, 0,5, 1 y 2% en peso) y fue utilizada para alimentar machos de rata durante un periodo de 2 semanas. Las ratas fueron divididas en ocho grupos (tres ratas por grupo) y fueron alimentadas con 20-25 g de las dietas testigo y de ensayo/día de acuerdo con lo siguiente:
Dieta + fitosterol al 2% (440 mg/d) Dieta - fitosterol
Grupo 1 0% de PoC (0,0 mg/d) Grupo 5 0% de PoC (0,0 mg/d)
Grupo 2 0,5% de PoC (110 mg/d) Grupo 6 0,5% de PoC (110 mg/d)
Grupo 3 1% de PoC (220 mg/d) Grupo 7 1% de PoC (220 mg/d)
Grupo 4 2% de PoC (440 mg/d) Grupo 8 2% de PoC (440 mg/d)
Se permitió que las ratas tomaran agua ad libitum y se determinó el consumo pesando la comida sobrante/derramada recogida debajo de las tazas para comida. Se midió la ingesta de comida diariamente y el peso de las ratas en días alternos.
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Se midieron los parámetros de daño/estrés oxidativos, los niveles de colesterol y la absorción de epicatequina en el plasma sanguíneo.
Se midieron las sustancias reactivas frente al ácido tiobarbitúrico (TBARS; del inglés, thiobarbituric acid reactive substances) en el plasma usando una modificación del método descrito por Yagi (Biochem. Med. 15: 212-6, 1976). Se añadieron cien \mul de sangre completa a un ml de disolución salina fisiológica y se centrifugó la mezcla a 1700 x g durante 15 minutos. El sobrenadante fue recogido y fue guardado a -70ºC hasta ser analizado. Se aislaron los lípidos haciéndolos precipitar con un sistema de ácido fosfotúngstico/ácido sulfúrico. Luego se hizo reaccionar la fracción lipídica con ácido tiobarbitúrico y se midieron fluorimétricamente los aductos resultantes utilizando 1,1',3,3'-tetraetoxipropano como patrón. Los resultados se expresaron como nanomoles de malondialdehído (MDA) por mililitro de plasma y en función de la concentración de ácidos grasos poliinsaturados en el plasma.
Se midió la 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8OH2'dG) de la forma siguiente. Se aisló el DNA nuclear usando el kit Wako DNA Extractor WB (Wako Chemical USA, Inc., Richmond, Virginia, EE.UU.). Se homogeneizó tejido (100-250 mg) o células (10^{6} células) en el tampón de lisis del kit y se centrifugó a 10.000 x g durante 20 segundos a 4ºC. El residuo de centrifugación fue tratado con el tampón de lisis, y el residuo resultante fue disuelto en la disolución para reacción enzimática del kit. Se añadió RNasa hasta una concentración final de 20 \mug/ml y se incubó la muestra a 50ºC durante 10 minutos. Se añadió la disolución de proteinasa del kit y se continuó la incubación a 50ºC durante una hora adicional. Se centrifugó la muestra a 10.000 x g durante cinco minutos a temperatura ambiental y se trató el sobrenadante con la disolución de NaI del kit e isopropanol para purificar el DNA. El precipitado fue recogido por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiental y fue lavado con las disoluciones A y B del kit. El residuo final fue dejado secar brevemente al aire y fue resuspendido en 200 \mul de desferilo 0,1 mM/acetato sódico 20 mM, pH de 4,8. La digestión y el análisis del DNA se llevaron a cabo de acuerdo con el método de Shigenaga et al. (Methods Enzymol. 234: 16-33, 1994), con alguna modificación. En resumen, se sometió el DNA a digestión hasta nucleótidos 5'-monofosfatos por incubación con nucleasa P1 en una concentración final de 0,1 mg/ml durante 15 minutos a 65ºC. Se ajustó el pH hasta 8,5 con Tris.HCl 1 M y se utilizó fosfatasa alcalina de intestino de ternera para digerir más la muestra hasta nucleótidos (una hora, 37ºC). Se ajustó el pH de la muestra hasta 5,1 con tampón de acetato sódico 3 M y se añadió EDTA 0,1 mM/desferilo 0,1 mM para evitar la oxidación mediada por metales. Se hizo pasar la muestra a través de un filtro giratorio con un corte de pesos moleculares de 30.000 y se colocó en un vial de inyección para HPLC. Se analizaron las muestras a las 48 horas de la preparación para evitar la formación de artefactos. Para el análisis, se inyectaron las muestras en un sistema Hewlett Packard 1100 para HPLC provisto de un detector electroquímico (ESA, Coulochem II). La separación se llevó a cabo utilizando una columna Supelcosil LC-18-DB (150 x 4,6 mm; tamaño de partícula de 3 \mum) y una fase móvil de tampón de acetato sódico 100 mM, pH de 5,2, con metanol al 5%, en régimen isocrático y con un caudal de 1,0 ml/minuto. Se detectó la OH^{8}dG a 450 mV utilizando detección electroquímica y se detectó la 2'-desoxiguanosina (dG) a 248 nm utilizando detección UV. Los niveles de OH^{8}dG se expresaron con respecto a la cantidad de dG en las
muestras.
La absorción de epicatequina se midió del modo descrito por Rein et al., J. of Nutr. 130 (8S), 2109S-2114S,
2000.
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Resultados
Los resultados establecen unos beneficios inesperados en la administración combinada de fitosteroles y polife-
noles.
Con relación a la Figura 6, la cantidad de la epicatequina absorbida aumentaba de un modo dependiente de la dosis. Sorprendentemente, la administración de fitosteroles aumentaba la absorción de epicatequina de manera que, por ejemplo, con una dieta de PoC al 2% en peso, los niveles plasmáticos de epicatequina resultaron aumentados en aproximadamente un 30% en comparación con la dieta comparable sin fitosteroles. Por lo tanto, los fitosteroles aumentaban la biodisponibilidad de epicatequina.
Con relación a la Figura 7, el PoC inhibía el daño oxidativo al DNA de un modo dependiente de la dosis. Sorprendentemente, con las dosis mayores de PoC (2% en peso), se observó una reducción inesperada en el daño oxidativo al DNA, lo que indica un efecto sinérgico de los fitosteroles y el PoC en cuanto a la prevención del daño oxidativo al DNA.
Con relación a la Figura 8, la alimentación con una dieta que contenía fitosteroles causaba sorprendentemente un mayor estrés oxidativo que con la dieta testigo; es decir, la ingesta de fitosteroles junto con la comida (sin procianidinas de cacao), que se recomendaba en la técnica antes de la fecha de presentación de esta solicitud, exacerbaba el estrés oxidativo. La alimentación con procianidinas de cacao invertía o mitigaba este efecto negativo de los fitoste-
roles.
También se midió el colesterol plasmático total, y los resultados se representan en la Tabla 3.
TABLA 3 Colesterol plasmático total
8
Con relación a la Tabla 3, como se esperaba, los fitosteroles reducían los niveles de colesterol. Sin embargo, sorprendentemente, cuando se administraron fitosteroles con PoC, los niveles de colesterol disminuyeron aún más, de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el nivel medio de colesterol total de las tres ratas alimentadas con una dieta que contenía fitosteroles era 84 mg/dl. El complemento de esta dieta con PoC al 2% en peso daba lugar a una disminución adicional del colesterol total hasta 80 mg/dl, lo que indica un efecto sinérgico de los dos compuestos. Las ratas alimentadas con la dieta testigo tenían un nivel medio de colesterol de 88,3 mg/dl.
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Ejemplo 6
Composiciones alimenticias que contienen agentes reductores del nivel de colesterol en combinación con cacao o chocolate que contiene procianidinas de cacao
Se prepararon chocolate negro, un caramelo masticable y barritas de muesli que contenían agentes reductores del nivel de colesterol.
Se preparó un caramelo masticable a partir de los ingredientes mostrados en la Tabla 4 combinando previamente azúcar y cacao y mezclándolos con caramelo. Se añadieron fitosteroles libres (tal cuales o pulverizados) a la mezcla de azúcar y cacao.
TABLA 4 Caramelos masticables que contienen fitosteroles
9
Se preparó chocolate negro que contenía un esterol libre utilizando un chocolate negro comercialmente asequible (DOVE Dark, asequible de Mars Inc.). Para facilitar el mezclamiento con el chocolate fundido y evitar cualquier efecto negativo sobre la textura del chocolate, las formas granuladas de esterol/estanol vegetales fueron molidas en un aparato Universal Muche M20, fabricado por IKA, durante 30-60 segundos, mezcladas y molidas durante otros 30 segundos hasta que el tamaño de las partículas resultó comparable al del chocolate. Se fundió el chocolate negro y se añadió el esterol con un mezclamiento lento para asegurar la distribución uniforme de las partículas de esterol. La composición resultante se muestra en la Tabla 5.
TABLA 5 Chocolate negro que contiene fitosteroles
10
Se prepararon barritas de muesli que contenían una fibra de avena reductora del nivel de colesterol, a partir de los ingredientes enumerados en las Tablas 6 y 7. Se preparó el jarabe aglutinante fundiendo aceite de semilla de palma a 45ºC y se mantuvo a esa temperatura hasta que estuvo listo para ser usado. Se combinaron jarabe de maíz, glicerol, polvo de cacao, azúcar moreno, sal, lecitina y galato de propilo y se añadió el aceite de semilla de palma. Se mantuvo caliente la mezcla. Para preparar el muesli, se combinaron granos inflados de avena o soja (asequibles de Sovex Food, Collegedale, Tennessee, EE.UU.) con los trozos de chocolate y se vertió el jarabe aglutinante caliente, preparado del modo anteriormente descrito, en la mezcla. Luego se preparó la mezcla de muesli en láminas, se espolvoreó una mezcla de azúcar 10X (62%), polvo de cacao (33%) y canela (5%), y se cortó el producto en porciones. El polvo de cacao usado en la mezcla se 
\hbox{preparó de acuerdo con  el método de la Patente de EE.UU.
nº 6.015.913, concedida a Kealey  et al .}
TABLA 6 Barrita de muesli con chocolate y avena
11
TABLA 7 Barrita de muesli con chocolate y proteína de soja
12

Claims (15)

1. Un producto alimenticio que no es chocolate y que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la
fórmula:
13
y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de
(4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8); y en que el producto alimenticio comprende al menos 10 \mug de procianidinas de cacao/g.
2. Un producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 1, que comprende al menos 100 \mug de procianidinas de cacao/g.
3. Un producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 1, que comprende además una proteína de soja, una fibra soluble y/o L-arginina.
4. Un producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 1, que comprende además al menos un componente seleccionado entre: calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma guar y un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado.
5. Un producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 1, en que las procianidinas de cacao están presentes en forma de (i) un ingrediente de cacao, (ii) un extracto de cacao que contiene procianidinas, o (iii) una fracción del extracto de cacao que contiene al menos un monómero o un oligómero de procianidina.
6. Un producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el alimento es una bebida.
7. Un producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el alimento es un alimento para animales de compañía.
8. Un chocolate reductor del nivel de colesterol, que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la fórmula:
14
y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de
(4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8); y en que el chocolate es un chocolate negro que comprende al menos 3600 \mug de procianidinas de cacao por gramo de chocolate, o un chocolate con leche que comprende al menos 1000 \mug de procianidinas de cacao por gramo de chocolate, cantidades que se basan en la cantidad total de sólidos de cacao no grasos en el producto.
9. Un chocolate de acuerdo con la Reivindicación 8, que comprende además una proteína de soja, una fibra soluble y/o L-arginina.
10. Un chocolate de acuerdo con la Reivindicación 8, que comprende además al menos un componente seleccionado entre: calcio, potasio, magnesio, vitamina E, vitamina C, cualquiera de las vitaminas del complejo B, un carotenoide, goma guar y un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado.
11. Un chocolate de acuerdo con la Reivindicación 8, en que las procianidinas de cacao están presentes en forma de (i) un ingrediente de cacao, (ii) un extracto de cacao que contiene procianidinas, o (iii) una fracción del extracto de cacao que contiene al menos un monómero o un oligómero de procianidina.
12. Un envase que comprende un producto alimenticio como el definido en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7 o un chocolate como el definido en cualquiera de las Reivindicación 8 a 11, y una etiqueta y/o instrucciones para el uso del producto alimenticio o el chocolate para promover la salud vascular y/o reducir el riesgo de enfermedad cardíaca.
13. Una composición farmacéutica para uso en la promoción de la salud vascular de un ser humano o un animal de veterinario, que comprende (i) procianidinas de cacao seleccionadas entre monómeros de procianidinas de cacao y oligómeros derivados de dichos monómeros, y (ii) un agente reductor del nivel de colesterol basado en esterol y/o estanol; en que los monómeros de procianidinas de cacao tienen la fórmula:
15
y los oligómeros comprenden de 2 a 18 unidades monómeras conectadas por medio de enlaces interflavánicos de
(4 \rightarrow 6) y/o (4 \rightarrow 8); y en que la composición es formulada para que suministre una dosis de procianidinas de cacao de al menos 50 mg al día.
14. Una composición para uso de acuerdo con la Reivindicación 13, en que la composición es para promover la salud cardiovascular y/o la salud coronaria.
15. Una composición para uso de acuerdo con la Reivindicación 13, en que la composición es para tratar o prevenir la aterosclerosis o la enfermedad cardiovascular.
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