JP2002505864A - 窒素酸化物の生成を促進するためにポリフェノールおよびｌ−アルギニンを含有する製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｌ−アルギニンと組み合わせてカカオおよび／またはナッツプロシアニジンを含有する食品および医薬品は、該食品を摂取した哺乳動物において酸化窒素生産の生理学的増加を誘導するのに効果的である。好ましい食品は菓子、特にナッツを含有するダ−クチョコレ−トやミルクチョコレートである。プロシアニジンは天然または合成のものであって良く、過小発酵豆類およびナッツの殻から調製されたチョコレートリッカーおよび／またはココア固形物のごとき食品成分によって提供することができる。Ｌ−アルギニンは天然または合成のものであって良く、ナッツ肉身、ナッツペーストおよび／または粉、種子、種子ペーストおよび／または種子粉、またはゼラチンのごとき食品成分によって提供することができる。有利な健康的効果は、例えば、低下した血圧、心血管病に対する抵抗性および抗癌活性を含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、哺乳類の健康に有益な効果をもたらすポリフェノールおよびＬ−ア
ルギニンを含有する製品に関する。

【０００２】 （背景技術） ポリフェノール化合物は植物材料に由来する生物活性材料であり、それらを含
有する製品の感覚上および栄養上の性質と密接な関連を持つ。

【０００３】 プロアントシアニジンはいくつかの植物種に見出されるポリフェノール化合物
の一種である。プロアントシアニジンは４→６または４→８として最も頻繁に結
合するフラバン−３−オールモノマー単位のオリゴマーである。最も一般的な種
類は、カテキン、エピカテキン、およびこれらの没食子酸エステルの鎖であるプ
ロトシアニジン、およびモノマー単位としてガロカテキン、エピガロカテキン、
およびこれらの没食子酸エステルからなるプロデルフィニジンである。プロアン
トシアニジンオリゴマーの構造の変化はまた、Ｃ−Ｏ酸化結合により第２のイン
ターフラバノイド結合が形成されてＡ型オリゴマーが形成されるのにともなって
起こり得る。この転換は複雑であるため、Ａ型プロアントシアニジンは自然界に
おいてＢ型オリゴマーほど頻繁には生じない。

【０００４】 「カカオポリフェノール」という用語は、カカオ豆から抽出されたプロアント
シアニジン、特にプロシアニジンおよびそれらの誘導体などのポリフェノール製
品を含む。より詳細には、「カカオポリフェノール」という用語は化学式Ａ_ｎ（
式中、ｎは１である）で表されるモノマー、または化学式Ａ_ｎで表されるオリゴ
マー（式中、ｎは２〜１８、およびより大きい整数である。）を含む。ここで、
Ａは以下の化学式を有する。

【０００５】

【化１】 Ｒは３−（α）−ＯＨ、３−（β）、３−（α）−Ｏ−糖類、３−（β）−Ｏ
−糖類、３−（α）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^１、または３−（β）−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ ^１ であり、 隣接するモノマー同士の結合は４位、６位または８位にて発生し、 ４位におけるモノマーとの結合はアルファまたはベータ立体化学特性を有し、 Ｘ、ＹおよびＺは、Ａ、水素、および糖類部分のいずれかであり、ただし、少
なくとも１つの末端モノマーに関して、それと隣接するモノマーとの結合が少な
くとも４位にて行われ、そして必要に応じてＹ＝Ｚ＝水素であることを条件とし
、そして 糖類部分は単糖類または二糖類部分であり、必要に応じてフェノール部分と置
換され、Ｒ’は、必要に応じて少なくとも１つのヒドロキシル基と置換されるア
リールまたは複素環式アリール部分であり、および その塩、誘導体および酸化生成物である。

【０００６】 好ましくは、糖類部分はグルコース、ガラクトース、キシロース、ラムノース
およびアラビノースのいずれかに由来する。糖類部分、およびＲ、Ｘ、Ｙおよび
Ｚのいずれかまたはすべては、必要に応じて任意の位置においてエステル結合を
介してフェノール部分と置換される。このフェノール位置は、カフェー酸、ケイ
皮酸、クマル酸、フェルラ酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、およびシナピン
酸のいずれかである。

【０００７】 プロアントシアニジンについては健康上有益な効果が広い範囲で期待できると
いう事実に関する証拠が急速に増加しつつあるため、プロアントシアニジンはま
すます注目されつつある。カテキンは最近、ハツカネズミにおいて酸化防止作用
が期待できるという結果をともない、また腫瘍の多重化を軽減するという結果を
ともなった（Ｌｕｎｄｅｒ、１９９２年、Ｗａｎｇら、１９９２年、およびＣｈ
ｕｎｇら、１９９２年を参照のこと）。さらに、ブドウ種子抽出物中のプロアン
トシアニジンは、フリーラジカル捕捉能力を有し、健康な細胞が有害な薬剤およ
び発癌性薬剤に冒される可能性を低減することが示されている（Ｂａｇｃｈｉら
、１９９７年、ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅおよびＷａｌｚｅｍ、１９９７年、および
Ｊｏｓｈｉら、１９９８年を参照のこと）。ブドウジュースおよび赤ワイン中の
ポリフェノールは、血小板凝集の低減、エイコサノイド合成の調節、および低密
度リポたんぱく質酸化の阻止など、心臓血管にとって有益な効果が期待できると
いう結果をともなった（ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅおよびＷａｌｚｅｍら、１９９７
年、Ｓｃｈｒａｍｍら、１９９８年、およびＦｒａｎｋｅｌら、１９９５年を参
照のこと）。最近、これらの化合物により得られることが期待される何らかの健
康上有益な効果が重合度によって悪影響を受ける可能性があることが提案されて
いる（Ｓａｉｔｏら、１９９８年を参照のこと）。

【０００８】 多くの植物性ポリフェノールは酸化防止作用を有し、突然変異誘発および発癌
現象を阻止する効果がある。例えば、米国特許第５，５５４，６４５号および米
国特許第５，７１２，３０５号は、カカオポリフェノール抽出物、特にプロシア
ニジンを開示しており、これらは大きな生物学的有用性を持つことが示されてい
る。国際特許公開第ＷＯ９７／３６４９７号（１９９７年１２月２４日公開）は
、これらの抽出物はまた、歯周疾患、動脈硬化症、および高血圧症の低減；ＬＤ
Ｌ酸化、およびＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ型の阻止；シクロオキシゲナーゼ、
リポキシゲナーゼ、窒素酸化物またはＮＯ−シンターゼ、アポトーシスおよび血
小板の凝集の調節；および抗炎症、抗歯肉炎、および抗歯周病作用の保持という
機能もあることを開示している。さらに国際特許公開第９７／３６４９７号は、
ポリフェノールオリゴマー５〜１２は、ココアから分離されたその他のポリフェ
ノール化合物に比べてより高い抗癌作用を保有するということを開示している。
従って、ココア製品中に含まれるこれらのより高いオリゴマーを摂取することに
よって大きな健康上有益な効果が得られる可能性がある。

【０００９】 上述のように、ココア抽出物、またはココア抽出物からＮＯまたはＮＯ−シン
ターゼモジュレータとして導き出されるポリフェノールを利用することは、国際
特許公開第９７／３６４９７号に記載されている。神経伝達、血液凝固、血圧制
御、血清脂質値の調整、循環器疾患、脳循環（血管性頭痛）など多くの重要な生
物学的プロセスにおいて窒素酸化物が何らかの役割を果たすことが示され、また
免疫系が持つ、腫瘍細胞および細胞内寄生体を殺す能力において何らかの役割を
果たすことが示されている。Ｐ．Ｃｌａｒｋｓｏｎらによる「口腔Ｌ−アルギニ
ンは高コレステロール血症の若者における内皮依存状況を改善する（Ｏｒａｌ
Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅ
ｍｉｃ Ｙｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔｓ）」、Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｉｎｎｅｓｔ．９７、
Ｎｏ．８；１９８９〜１９９４年（１９９６年４月）、Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｄｍａｎ
らによる「窒素酸化物の驚異の寿命（Ｔｈｅ Ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ Ｌｉｆｅ
ｏｆ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ）」、Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ，２６
〜３８頁（１９９３年１２月２０日）；Ｓ．Ｈ．Ｓｎｙｄｅｒらによる「窒素酸
化物の生物学的規則（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ Ｎｉｔｒｉｃ
Ｏｘｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、６８〜７７頁（
１９９２年５月）；Ｐ．Ｃｈｏｗｉｅｎｃｚｙｋらによる「Ｌ−アルギニンは、
単なるアミノ酸に過ぎない？（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ： Ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈ
ａｎ Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ？）」、Ｌａｎｃｅｔ、３５０ ：９０１−３０（１９９７年９月２７日）；Ｍ．Ａ．Ｗｈｅｅｌｅｒらによる「
間質性膀胱炎をわずらっている患者から採取した尿における窒素酸化物シンター
ゼ経路に対する長期間経口Ｌ−アルギニンの試み（Ｅｆｆｏｒｔｓ ｏｆ Ｌｏ
ｎｇ Ｔｅｒｍ Ｏｒａｌ Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｏｎ Ｔｈｅ Ｎｉｔｒｉ
ｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｔｈｅ Ｕｒｉｎ
ｅ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙ
ｓｔｉｔｉｓ）」、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １５８：２０４５−２０５０（１９９
７年１２月）、Ａ．Ｔｅｎｅｎｂａｕｍによる「Ｌ−アルギニン、進歩の再発見
（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ： Ｒｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
）」、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ９０：１５３−１５９（１９９８年）；Ｉ．Ｋ．
Ｍｏｈａｎらによる「化学を誘導した真性糖尿病に対するＬ−アルギニン窒素酸
化物系の試み（Ｅｆｆｏｒｔ ｏｆ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏ
ｘｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５、Ｎｏ．７：７５７−７６５（１９９８年）；Ｓ．Ｋ
ｌａｈｒらによる「高血圧および腎毒性におけるＬ−アルギニンの役割（Ｔｈｅ
ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ
ａｎｄ Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、５４７〜５５０頁（１９９８年）、およびＲ．
Ｈ．Ｂｏｇｅｒらによる「食用Ｌ−アルギニンおよびＬ−トコフェロールは、低
コレステロール症の数匹のウサギについて、異なる機構を介して血管酸化応力を
軽減し、内皮機能を維持する（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ
Ｌ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒａｌ Ｒｅｄｕｃｅ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｏｘｉｄａｔ
ｉｏｎ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖｅ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍｅ Ｈｙｐｏｃｈｏｌｏｅｓｔｅｒａｌｅｍｉ
ｃ Ｒａｂｂｉｔｓ ｖｉａ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）」
、Ａｒｔｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １４１：３１−４３（１９９８年）を参照
のこと。

【００１０】 例えば、さまざまな食物から得られる健康上有益な効果が提案されている。ピ
ーナッツは、ぶどうや赤ワインのなかに見出される化合物で循環器系の疾患の軽
減につながるレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）の供給源であること
が報告されている。くるみを含む食物は血清脂質および血圧のレベルを低減する
ことがわかっている。Ｓａｂａｔｅ、Ｊらによる「正常な男性の血清脂質および
血圧に対するくるみの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｗａｌｎｕｔｓ ｏｎ Ｓ
ｅｒｕｍ Ｌｉｐｉｄ Ｌｅｖｅｌｓ Ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ
ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｍｅｎ）」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３ ２８ ：６０３−６０７頁（１９９３年３月４日）を参照のこと。また、ナッツ類
を頻繁に摂取することによって冠状動脈性疾患を防止することができることも提
案されている。Ｓａｂａｔｅ、Ｊ．らによる「ナッツ類は冠状動脈性疾患に対す
る新規の保全食品である（Ｎｕｔｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｆ
ｏｏｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）」
、Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ ５：１１−１６（１９９４年）を参照のこと。いかな
る理論にもとらわれることなく、とりわけ、仮想上の作用機構では、ナッツ中に
存在する比較的高いレベルのアルギニンが存在することにより窒素酸化物が生成
されその結果血管の平滑筋を弛緩させる。Ｌ−アルギニンは、窒素酸化物シンタ
ーゼを介して窒素酸化物を生成するための基質であると考えられている。

【００１１】 従って、高いカカオポリフェノール濃度を有し、特に高い濃度のカカオポリフ
ェノールオリゴマー５〜１２を有するお菓子およびココア含有製品（ココアパウ
ダー、チョコレート液体、またはそれらの抽出物）などの製品は望ましいと思わ
れる。また窒素酸化物の生成を促し、そこから健康上有益な効果を導き出すのに
効果的な量のポリフェノール、特にココアプロシアニジンと、Ｌ−アルギニンと
の両方を含有する製品を提供することも非常に望ましいと思われる。

【００１２】 （発明の概要） 本発明は新規の食品に関し、この食品は、該食品を摂取した後哺乳類の体内に
おいて窒素酸化物の生成を生理的に増加させるのに効果的な量の少なくとも一種
類のポリフェノール（すなわち、ココアおよび／またはナッツプロシアニジン）
およびＬ−アルギニンをあわせて含有する。プロシアニジンは合成したものでも
天然のものでもよい。好適な実施態様においては、カカオポリフェノールおよび
Ｌ−アルギニンはそれぞれ、ポリフェノール含有成分（例えばまたはココアおよ
び／またはココアパウダーおよび／またはナッツ外皮成分）、およびＬ−アルギ
ニン含有成分（例えばナッツ果肉）によって提供される。しかしながら本発明は
また、いずれかが天然または合成である場合があるココアおよび／またはナッツ
ポリフェノールおよび／またはＬ−アルギニンが、直接添加される食品もその範
囲とする。

【００１３】 本発明の食品は、該食品を摂取した哺乳類に健康上有益な効果を提供する。特
に好都合な健康上有益な効果としては血圧の低下があげられる。その他の健康上
有益な効果としては、心臓血管疾患の軽減、抗癌作用、抗酸化作用、腎疾患の治
療、免疫機能の向上、およびの認識機能の改善があげられる。

【００１４】 本発明の食品に含有されるカカオポリフェノールは、好ましくはカカオポリフ
ェノールオリゴマー２〜１８であり、より好ましくは、カカオポリフェノールオ
リゴマー５〜１２である。

【００１５】 プロシアニジンを含有するカカオポリフェノールはカカオ豆中に存在する。カ
カオポリフェノールは、米国特許第５，５５４，６４５号に記載されているよう
に、粉末状の醗酵されていない豆を溶剤抽出することによって得られる。カカオ
ポリフェノールはまた、カカオ豆から調製されるチョコレート成分中にも存在す
る。

【００１６】 適切なココアプロシアニジン含有成分としては、ばい煎した粉砕粗挽きカカオ
豆、チョコレート液体、部分的に脱脂したココア固形物、無脂肪ココア固形物、
ココア固形物を粉砕して得られるココアパウダー、およびこれらの混合物が挙げ
られる。ココアプロシアニジン含有成分は醗酵途中の豆から調製されるのが好ま
しい、なぜなら、このような豆はココアプロシアニジンを含むカカオポリフェノ
ールの含有量がより高いからである。

【００１７】 本発明の特に好ましい食品としてはお菓子が挙げられ、最も好ましいのはチョ
コレートである。チョコレートとしては標準的な内容のチョコレートおよび非標
準的な内容のチョコレートが挙げられる。本発明の食品はまた、非チョコレート
食品であってもよい。好ましい非チョコレート食品としては、ピーナッツバター
、ピーナッツブリットルなど、ナッツを主成分とする製品が挙げられる。本発明
のその他の好ましい食品としては、脱脂されるかまたは部分的に脱脂されたナッ
ツ果肉を使用して調製される低脂肪食品があげられる。

【００１８】 Ｌ−アルギニンは、ナンキンマメ（ピーナッツ）、チョウセングルミ（くるみ
）、アメンドウ（アーモンド）、ハシバミ（ヘーゼルナッツ）、ダイズ（大豆）
など任意の利用可能なアルギニン供給源に由来するものであってよい。ヒッコリ
ー（ペカン）、ムクロジ（カシューナッツ）、およびマカダミアインテグリフォ
リア、マカダミアテトラフィラ（マカダミアナッツ）も利用することができる。
ナッツ中のＬ−アルギニン含有量はナッツの成熟度によって異なり、また、ある
品種においてより高いレベルであることもある。それぞれの属の関連する種も本
願において利用することができる。ピーナッツは一般に、果肉１００グラムにつ
き約２〜３グラムのＬ−アルギニンを含有する。アーモンドのＬ−アルギニン含
有量は、１００グラムにつき約２〜３グラムである。くるみは１００グラムにつ
き約２〜４グラムである。ヘーゼルナッツは１００グラムにつき約１．５〜２．
５グラムである。ペカンおよびマカダミアナッツは１００グラムにつき約０．５
〜１．５グラムである。ナッツは、所望の量のＬ−アルギニンが存在する量であ
ればナッツの粒、ナッツの外皮、ナッツのペースト、および／またはナッツの粉
末であってよく、ナッツ供給源によって異なる。

【００１９】 Ｌ−アルギニン含有成分はまた、種子、種子のペースト、および／または種子
の粉末であってもよい。適切な種子としては、ヒマワリ（ひまわりの種子）、ゴ
マ（胡麻の種子）、コロハ種子、ウリ（かぼちゃの種子）などが挙げられる。ひ
まわりの種子、かぼちゃの種子、および胡麻の種子はそれぞれ１００グラムにつ
き、約１．５〜３．０グラム、約３．５〜６．０グラム、および約２〜３グラム
のＬ−アルギニンを含有する。

【００２０】 Ｌ−アルギニンの含有量の高いその他の供給源としてはゼラチンがあげられ、
ゼラチン１００グラムにつき約５グラムのＬ−アルギニンを含有する。

【００２１】 本発明の食品は、該食品１００グラムにつき少なくとも２００ミリグラム、好
ましくは３００ミリグラムのプロシアニジンを含有し、また１００グラムにつき
少なくとも０．９グラム、好ましくは１．２グラム、より好ましくは１．６グラ
ムのＬ−アルギニンを含有する。

【００２２】 本発明の食品は、ココア以外の供給源から得られるポリフェノールを含有して
よく、例えば上述のナッツ類の外皮に見られるポリフェノールを含有してよい。
ピーナッツの外皮は約１７パーセントのプロシアニジンを含有し、アーモンドの
外皮は３０パーセントに達するプロシアニジンを含有する。好ましい実施態様に
おいては、ナッツの皮は例えばチョコレートキャンディのヌガーなどの食品に使
用される。果物および野菜から得られるポリフェノールも本発明での使用に適し
ている。ぶどうの種子とならんでリンゴやオレンジなどの果物の外皮はポリフェ
ノールの含有量が高いことが知られている。

【００２３】 理論にとらわれることなく、カカオポリフェノールとＬ−アルギニンとを組み
合わせると予想外に向上した健康上有益な効果が得られる。これは、ＮＯ−シン
ターゼの基質であるＬ−アルギンの存在下で、ポリフェノールが積極的にＮＯお
よび／またはＮＯ−シンターゼを調節するからである。従ってココアおよび／ま
たはナッツポリフェノールとＬ−アルギニンとを組み合わせることによって窒素
酸化物の生成が増加し、その結果、心臓血管疾患の防止、血圧の低下、抗癌作用
など、窒素酸化物に由来する健康上有益な効果が改善される。

【００２４】 本発明はまた、少なくとも１つのココアおよび／またはナッツポリフェノール
、Ｌ−アルギニン、および薬理学的に利用可能な担体を含有する、薬理学的組成
物に関する。該ポリフェノールおよびＬ−アルギニンは合わせて、該組成物を摂
取した哺乳類の体内において窒素酸化物の生成を生理学的に増加させるのに効果
的な量存在する。ココアおよび／またはナッツから得られるプロシアニジンは、
単位服用量につき１マイクログラム〜約１０グラム存在する。Ｌ−アルギニンは
、単位服用量につき約１マイクログラム〜約１０グラム存在する。カカオポリフ
ェノール成分は、ココア材料（豆、液体、粉末など）からの抽出物であってよく
、またはそれらの合成された誘導体であってよく、または合成されたポリフェノ
ール化合物、またはポリフェノール化合物の混合物、またはそれらの誘導体であ
ってよい。ナッツ外皮から抽出されるプロシアニジンもまた本発明に適している
。

【００２５】 （発明の詳細な説明） 本発明の食品は、少なくとも一種類のカカオポリフェノールを含有し、必要に
応じて、上述のその他の供給源からのポリフェノールも含有する。カカオポリフ
ェノールは任意の供給源、すなわち、天然または合成された供給源から得られる
ものであってよい。最も好ましくは、カカオポリフェノールはオリゴマーである
。

【００２６】 「カカオポリフェノール」という用語は、カカオ豆またはチョコレート菓子の
製造に使用されるココア成分、カカオ豆の抽出物またはプロシアニジンを含有す
るココア成分、およびそれらの合成された誘導体中に存在するプロシアニジンを
含み、また、合成されたカカオポリフェノール化合物またはカカオポリフェノー
ル化合物の合成された混合物、およびそれらの誘導体を含む。カカオ豆は完全に
醗酵されるかまたは醗酵途中である。

【００２７】 「ココア成分」という用語は、殻を取り除いた粗挽きカカオ豆から導き出され
るココア固形物含有材料を意味し、チョコレート液体、部分的にまたは完全に脱
脂したココア固形物（例えばケーキまたは粉末、アルカリ化したココア粉末、ま
たはアルカリ化したチョコレート液体など）を含む。

【００２８】 「チョコレート液体」という用語は、粗挽きカカオ豆を粉砕することによって
製造される濃褐色の流動性「液体」を意味する。加工中に細胞壁が分解されココ
アバターが放出されることによって、ココア固形物の粉砕された粒子がココアバ
ター中に懸濁することによって流動性が得られる。

【００２９】 カカオポリフェノール（ＣＰ）の含有率が高く、またココアプロシアニジン含
有量の高い部分的に脱脂されたココア固形物は、カカオ豆または粗挽きカカオ豆
をばい煎する工程を行わずにカカオ豆を直接ココア固形物に加工することによっ
て得ることができる。この方法では従来のばい煎工程が省略されているため、カ
カオポリフェノールが保護される。この方法は本質的に以下の工程からなる。ａ
）カカオ豆を、豆内部温度が水分含有量が３重量パーセントまで減少しかつココ
ア殻をたるむのにちょうど十分な温度にまで加熱する、ｂ）粗挽きカカオ豆をコ
コア殻とふるいわける、ｃ）粗挽きカカオ豆を回転圧搾する、ｄ）ココアプロシ
アニジンを含んだカカオポリフェノールを含有するココアバターおよび部分的に
脱脂されたココア固形物を回収する。必要に応じて、カカオ豆は加熱工程前に、
例えば空気流動層式密度分離器などで洗浄される。ふるいわけを空気流動層式密
度分離器にて行ってもよい。好ましくはカカオ豆を、典型的には赤外線加熱装置
にて約３〜４分間、豆の豆内部温度が約１００℃〜約１１０℃、より好ましくは
約１０５℃未満となるように加熱する。所望であれば、ココア固形物をアルカリ
化しおよび／または粉砕してココアパウダーとしてもよい。

【００３０】 豆の内部温度（ＩＢＴ）は、魔法瓶などの断熱容器に豆（約８０〜１００個の
豆）を充填することによって測定できる。次に、中の試料の温度を維持するため
断熱容器をほぼ封止する。豆を充填した断熱容器に温度計を挿入し、魔法瓶の中
の豆に対して温度計の温度を均衡させる。表示される温度は豆の豆内部温度であ
る。豆内部温度はまた、豆の均衡質量温度とも考えられる。

【００３１】 カカオ豆は、色によって４種類に分類できる。茶色一色（完全に醗酵されてい
る）、紫色／茶色、紫色、およびスレート色（醗酵されていない）である。好ま
しくはココア固形物は、醗酵された豆よりカカオポリフェノール含有量の高い、
醗酵途中のカカオ豆から調製される。醗酵途中の豆には、スレート色のカカオ豆
、紫色のカカオ豆、スレート色のカカオ豆と紫色の粗挽きカカオ豆との混合物、
紫色の豆と茶色のカカオ豆との混合物、またはスレート色の豆と、紫色の豆と、
茶色の豆との混合物がある。より好ましくは、カカオ豆はスレート色の豆および
／または紫色のカカオ豆である。

【００３２】 上述のように、焙煎された粗挽きカカオ豆、チョコレート液体、および部分的
に脱脂されるか無脂肪のココア固形物中におけるココアプロシアニジン含有量を
含んだカカオポリフェノール（ＣＰ）含有量は、これらが醗酵途中のカカオ豆ま
たはその混合物、すなわち、醗酵ファクターが２７５以下の豆から調製された場
合、より高いものとなる。

【００３３】 「醗酵ファクター」は、カカオ豆の醗酵を特徴づけるための等級分け方式を使
って定義される。スレート色のものは１とされ、紫色のものは２とされ、紫色／
茶色のものは３とされ、茶色のものは４とされる。それぞれの分類の範疇にはい
る豆の割合は重量測定された数量で掛け算される。従って、１００パーセント茶
色の豆の試料の「醗酵ファクター」は１００×４で４００であり、一方、１００
パーセント紫色の豆の試料については１００×２で２００である。５０パーセン
トがスレート色で５０パーセントが紫色の豆の醗酵ファクターは１５０［（５０
×１）＋（５０×２）］となる。

【００３４】 以下の工程によって、ポリフェノール含有量のより高いチョコレート飲料およ
び／またはポリフェノール含有量のより高いココア固形物を調製することができ
る。ａ）選択したカカオ豆（醗酵ファクター２７５以下）を、豆内部温度が９５
℃〜１６０℃となるまでばい煎する、ｂ）ばい煎したカカオ豆を粗挽きカカオ豆
とふるいわける、ｃ）粗挽きカカオ豆を粉砕してチョコレート液体とする、ｄ）
必要に応じてココアバターおよび部分的に脱脂したココア固形物をチョコレート
液体より回収する。あるいは、チョコレート液体および／またはココア固形物は
以下の工程によって調製できる。ａ）選択したカカオ豆（醗酵ファクター２７５
以下）を、豆内部温度が９５〜１３５℃となるまで加熱し、水分含有量を約３重
量パーセントにまで減少させカカオの殻を粗挽きカカオ豆からほぐす、ｂ）粗挽
きカカオ豆をカカオの殻とふるいわける、ｃ）粗挽きカカオ豆を、豆内部温度が
９５〜１６０℃となるまでばい煎する、ｄ）ばい煎した豆を粉砕してチョコレー
ト液体とする、ｅ）必要に応じて、チョコレート液体からココアバターおよび部
分的に脱脂されたココア固形物を回収する。この工程により、無脂肪ココア固形
物１グラムあたり、少なくとも５００００マイクログラムの総量のココアプロシ
アニジンおよび／または少なくとも５０００マイクログラムのココアプロシアニ
ジン五量体を含有するチョコレート液体および部分的に脱脂されたココア固形物
が得られる。

【００３５】 ココアプロシアニジンを含んだカカオポリフェノールを含有する抽出物は、醗
酵途中のカカオ豆または粗挽きカカオ豆から調製される、部分的に脱脂されたコ
コア固形物または無脂肪ココア固形物を溶剤抽出することによって調製できる。

【００３６】 部分的に脱脂されたココア固形物および／またはカカオポリフェノール抽出物
は、薬理学的組成物に、必要に応じて担体または希釈剤とともに使用される。薬
理学的組成物は抗腫瘍組成物、酸化防止剤、抗菌剤、窒素酸化物（ＮＯ）または
ＮＯ−シンターゼモジュレータ、環状オキシゲナーゼモジュレータ、リポキシゲ
ナーゼモジュレータ、および生体内でのグルコースモジュレータとして使用でき
る。

【００３７】 ポリフェノール含有量の高い食品は、ポリフェノール含有量の高いばい煎粗挽
きカカオ豆、ポリフェノール含有量の高いチョコレート液体、および／またはポ
リフェノール含有量の高い部分的に脱脂されたまたは無脂肪ココア固形物を使用
して調製できる。本発明の食品としては、ペットフード、乾燥ココアミックス、
プリン、シロップ、クッキー、セイヴァリーソース、ライスミックス、もち、飲
料ミックス、飲料などがあげられる。好ましくは、本発明の食品はダークチョコ
レートまたはミルクチョコレートなどのお菓子である。抽出物はまた、カカオポ
リフェノール含有量の高い食品を調製するためにも使用できる。

【００３８】 哺乳類の健康は、ココアおよび／またはナッツプロシアニジンまたは上述のポ
リフェノール含有量の高いココア成分および／またはナッツ成分を含有する組成
物を該哺乳類に投与することによって改善することができる。これらの組成物中
におけるプロシアニジンオリゴマーの総量は、少なくとも１マイクログラムより
多く、該組成物を日常的に６０日間より多く投与する。

【００３９】 ココアプロシアニジンは、化学式Ａ_ｎを有するモノマーＡのオリゴマーとして
構造的に表され、ｎは２〜１８であり、Ａは以下の化学式を有し、

【化２】 Ｒは３−（α）−ＯＨ、３−（β）−ＯＨ、３−（α）−Ｏ−糖類、３−（β
）−Ｏ−糖類であり、隣接するモノマーとの結合は４位、６位または８位で発生
し、ただし、Ｘ、ＹおよびＺはＡ、水素、および糖類のいずれかであることを条
件とし、少なくとも１つの末端モノマーに関して、４位におけるモノマーとの結
合はアルファまたはベータ立体化学特性を有し、それと隣接するモノマーとの結
合は少なくとも４位にて発生する。必要に応じて、Ｙ＝Ｚ＝水素であり、および
その塩である。ここで、糖類部分は単糖類または二糖類から由来する。

【００４０】 本願で使用される「オリゴマー」という用語は、上に示した化学式を有する任
意の化合物を意味し、ここでｎは２〜１８であり、好ましくはｎは５〜１２であ
る。ｎが２である場合、オリゴマーは「ダイマー」とされる。ｎが３である場合
、オリゴマーは「トライマー」とされる。ｎが４である場合、オリゴマーは「テ
トラマー」とされる。ｎが５である場合、オリゴマーは「ペンタマー」とされる
。同様の用語が、１８までとそれ以上のｎを有するオリゴマーに適用され、例え
ばｎが１８の場合はオリゴマーは「オクタデカマー」とされる。

【００４１】 カカオポリフェノールの合成誘導体は上述の構造Ａｎによる化合物を含み、Ｒ
は３−（α）−Ｏ−糖類、３−（β）−Ｏ−糖類、３−（α）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−
Ｒ^１、または３−（β）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^１であって、該糖類部分は、グルコ
ース、ガラクトース、キシロース、ラムノースおよびアラビノースのいずれかで
ある単糖類または二糖類から由来するものであり、該糖類部分のＲ、Ｘ、Ｙおよ
びＺのいずれかまたはすべては、必要に応じてエステル結合を介して任意の位置
でフェノール部分と置換されており、該フェノール部分はカフェー酸、ケイ皮酸
、クマル酸、フェルラ酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、およびシナピン酸の
いずれかであり、Ｒ^１はアリールまたは複素環式アリール部分であり、必要に応
じて少なくとも１つのヒドロキシル部分と置換されている。Ｒ^１の置換されたア
リールまたは複素環式アリール基は好ましくは、カフェー酸、ケイ皮酸、クマル
酸、フェルラ酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、またはシナピン酸の置換され
たフェノール基に対応する置換パターンを含有する。

【００４２】 ポリフェノールオリゴマーは、以下の工程によって調製される。

【００４３】 （ａ）第１および第２ポリフェノールモノマーのそれぞれのフェノールヒドロ
キシル基を保護基によって保護し、第１および第２の保護されたポリフェノール
モノマーを製造する。

【００４４】 （ｂ）第１の保護されたポリフェノールモノマーの４位を官能化し、以下の化
学式を有する、官能化し保護されたポリフェノールモノマーを製造する。

【００４５】

【化３】 式中、ｃは１〜３の整数であり、 ｄは１〜４の整数であり、 ｙは２〜６の整数であり、 Ｒは保護基であり、そして Ｒ’はＨまたはＯＨである。

【００４６】 （ｃ）第２の保護されたポリフェノールモノマーを、官能化し保護されたポリ
フェノールモノマーと結合させ、保護されたポリフェノールダイマーをポリフェ
ノールオリゴマーとして製造する。

【００４７】 （ｄ）必要に応じて、官能化および結合工程を繰り返し、ｎ個のモノマー単位
を有するポリフェノールオリゴマーを形成する。ここで、ｎは３〜１８の整数で
あり、好ましくは５〜１２の整数である。

【００４８】 （ｅ）フェノールヒドロキシル基から保護基を除去する。

【００４９】 好ましい保護されたポリフェノールモノマーは臭素化し保護されたエピカテキ
ンまたは臭素化し保護されたカテキンであり、より好ましくは８−ブロモ−エピ
カテキンまたは８−ブロモ−カテキンである。

【００５０】 上述のプロセスにおいて、保護されたポリフェノールモノマーの４位は、ｙが
２の場合、例えばエチレングリコールなどのジオールの存在下で、キノン酸化剤
を使用して酸化により官能化されている。

【００５１】 上述のプロセスはさらに、少なくとも１つのモノマー単位の３位においてポリ
フェノールオリゴマーをエステル化することによって、ポリフェノールオリゴマ
ーの誘導体を形成し、その結果エステル化されたポリフェノールオリゴマーを製
造する工程を含む場合がある。エステル基は、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、−ＯＣ
（Ｏ）−置換アリール、−ＯＣ（Ｏ）−スチリル、およびＯＣ（Ｏ）−置換スチ
リルのいずれかであり、置換アリールまたは置換スチリルは、ハロ、ヒドロキシ
ル、ニトロ、シアノ、アミノ、チオール、メチレンジオキシ、ジハロメチレンジ
オキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６ハロアルキル、Ｃ_１―Ｃ_６ハロアルコ
キル、Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキルおよびＣ_３−Ｃ_６シクロアルコキシのうち少な
くとも１つの置換基を含有する。好ましくは、少なくとも１つのモノマー単位の
３位は、カフェー酸、ケイ皮酸、クマル酸、フェルラ酸、没食子酸、ヒドロキシ
安息香酸、およびシナピン酸のいずれかの酸に由来する誘導基に変換されている
。

【００５２】 上述のプロセスはさらに、少なくとも１つのモノマー単位の３位においてポリ
フェノールオリゴマーをグリコシル化することによってポリフェノールオリゴマ
ーの誘導体を形成し、その結果グリコシル化ポリフェノールオリゴマーを製造す
る工程を含む場合がある。好ましくは少なくとも１つのモノマー単位の３位は、
−Ｏ−グリコシドまたは−Ｏ−置換グリコシドのいずれかの誘導基に変換され、
該置換グリコシドは−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）−置換アリール、−Ｃ（
Ｏ）−スチリル、または−Ｃ（Ｏ）−置換スチリルによって置換されている。置
換アリールまたは置換スチリルは、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シアノ、アミ
ノ、チオール、メチレンジオキシ、ジハロメチレンジオキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキ
ル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_６ハロアルキル、Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキ
ル、およびＣ_３−Ｃ_６シクロアルコキシのいずれかの置換基を含有する場合があ
る。好ましくは、グリコシドはグルコース、ガラクトース、キシロース、ラムノ
ース、およびアラビノースのいずれかである。

【００５３】 本発明の食品は１種類以上のカカオポリフェノールモノマー、オリゴマー２〜
１８、またはそれらの誘導体を含有する場合がある。好ましくは、本発明の食品
はカカオポリフェノールオリゴマー２〜１８の混合物、またはそれらの誘導体を
含有し、より好ましくは本発明の食品はカカオポリフェノールオリゴマー５〜１
２の混合物、またはその誘導体を含有する。

【００５４】 本発明の食品には、人間またはその他の哺乳類、例えば犬、猫、馬などに投与
するための製品が含まれる。本発明の食品は、栄養供給、嗜好、または医療また
は獣医療目的で摂取できる。

【００５５】 好ましい食品としては、お菓子、焼き製品、薬味、グラノーラバー、食事補助
バー、シロップ、パウダー飲料ミックス、飲料などがあげられる。より好ましく
は、本発明の食品は、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、ヘーゼルナッツ、ナッ
ツなどのナッツ類を含有するチョコレート菓子である。ナッツ果肉はいかなる形
状でもよく、たとえば、丸ごとのナッツ、きざんだナッツ、粉砕したナッツ、ナ
ッツペーストなどである。好ましい非チョコレート食品としては、ピーナッツバ
ター、豆板などがあげられる。このような非チョコレート食品はココア成分を含
有する場合があり、特にカカオポリフェノール含有ココア成分を含む場合がある
が、例えばカカオポリフェノールの含有量が高いココアパウダーを比較的少ない
割合で含有するピーナッツバターなど、当業者によってチョコレート製品ではな
いと考えられる。

【００５６】 米国において食品に使用されるチョコレートは、お菓子に「チョコレート」と
の表示を許可するためにはお菓子の必須成分およびその割合を記載しなければな
らないと定めている米連邦食品医薬品化粧品法にしたがって、米国食品薬品局に
よって制定された内容基準（ＳＯＩ）の規制を受けている。

【００５７】 米国で消費されているもっとも一般的なチョコレートまたはチョコレートキャ
ンディは、スウィートチョコレートまたはミルクチョコレートの形状である。チ
ョコレートは本質的には脂肪中に懸濁されたココア固形物の混合物である。ミル
クチョコレートは、無脂肪牛乳固形物、乳脂、チョコレート液体、栄養炭水化物
甘味料、ココアバターを含有するお菓子であり、乳化剤、香料およびその他の添
加物など、その他のさまざまな成分を含む場合もある。スウィートチョコレート
はチョコレート液体の含有量がより高いが、ミルクチョコレートよりも牛乳固形
物の量が少ない。セミスウィートチョコレートは少なくとも３５重量パーセント
のチョコレート液体を必要とするか、そうでない場合は当然スウィートチョコレ
ートと類似している。ダークチョコレートは一般にチョコレート液体、栄養炭水
化物甘味料、およびココアバターのみを含有し、当然スウィートチョコレートま
たはセミスウィートチョコレートのいずれかである。バターミルクチョコレート
およびスキムミルクチョコレートとミルクチョコレートとは、乳脂肪がスウィー
トクリーム、バターミルク、およびスキムミルクのそれぞれのさまざまな形状か
ら得られる点において異なる。スキムミルクは、乳脂肪の総量がミルクチョコレ
ートの最小限度よりも少なく制限されていることを必要とする。混合された酪農
製品チョコレートは、牛乳固形物がミルクチョコレート、バターミルクチョコレ
ートまたはスキムミルクチョコレートのいずれかのためにあげられた牛乳固形物
のいずれかまたはすべてを含む点においてミルクチョコレートと異なる。ホワイ
トチョコレートは無脂肪ココア固形物を含有する点においてミルクチョコレート
と異なる。耐熱性チョコレートも本発明において利用できる。

【００５８】 標準外チョコレートとは、標準化されたチョコレートの規定範囲に入らないチ
ョコレートである。チョコレートは、たとえばココアバターが植物油または脂肪
で置き換えられている場合のように、特定の成分が部分的にまたは完全に置き換
えられている場合、「標準外」チョコレートと分類される。チョコレートの配合
に、チョコレートの内容に関する米国食品薬品局の基準からはずれて成分の添加
または削除を行った場合、お菓子に「チョコレート」という用語を使用すること
は禁じられる。しかしながら本発明において使用するように、「チョコレート」
または「チョコレート製品」という用語は、いかなる標準内の内容または標準外
の内容のチョコレート製品も意味する。

【００５９】 チョコレートは、バーのようなチョコレートの固形断片または新規の形状とし
てよい。チョコレートはまた、キャラメル、ピーナッツバター、ヌガー、果物の
断片、ナッツ、ウェファース、アイスクリームなど、他のより複合的なお菓子の
成分として組み入れて、お菓子中でチョコレートを混ぜ合わせるか他の食品混在
物をコーティングする。これらの食品は、通常の気圧条件下で華氏６５〜８５℃
（１８〜２９℃）において、微生物学的に貯蔵安定性を有するとして特徴づけら
れる。

【００６０】 「炭水化物」という用語は、栄養的炭水化物甘味料を意味し、甘味の度合いは
さまざまであり、代表的に使用されるものもいずれかであり、ただしこれらに限
定されるわけではないが、サッカロース、（例えば、さとうきびまたはビート）
、デキストロース、フラクトース、ラクトース、マルトース、グルコースシロッ
プ固形物、コーンシロップ固形物、転化糖、加水分解ラクトース、はちみつ、か
えで糖、黒糖、糖蜜などがあげられる。

【００６１】 本発明のチョコレート食品はさらに、無脂肪牛乳固形物、無脂肪ココア固形物
（ココアパウダー）、砂糖代用品、天然または合成香料（例えば香辛料、コーヒ
ー、塩などおよびこれらの混合物）、たんぱく質など他の成分を含有する場合が
ある。

【００６２】 本発明の食品はまた、Ｌ−アルギニンを含む。いかなるＬ−アルギニン供給源
、すなわち天然のものでも合成のものでも利用してよい。特に好ましいＬ−アル
ギニン供給源としては大豆、およびピーナッツ、くるみ、アーモンド、ヘーゼル
ナッツなどのナッツ果肉があげられる。脱脂および部分的に脱脂したナッツ果肉
もＬ−アルギニン濃度を向上させるために使用してよい。部分的または完全に脱
脂し粉砕したナッツ果肉をナッツ粉末とよぶ。

【００６３】 ココアプロシアニジンまたはココアプロシアニジン含有組成物によって引き出
されることが知られいている生理的作用に加えて、Ｌ−アルギニンをココアプロ
シアニジンと組み合わせることによって、窒素酸化物の製造の増加によって示さ
れるようなより有益な効果が得られる。

【００６４】 ＮＯおよび／またはＮＯ−シンターゼ調節の相乗効果の１つの実施態様は例え
ば以下の通りである。多くの食物はかなりの量のＬ−アルギニンを含有している
が、必ずしもカカオポリフェノールであるとは限らない。Ｌ−アルギニンをＮＯ
−シンターゼの基質であり、Ｌ−アルギニンの添加を受けた高コレステロール症
の動物においてＮＯ依存血管拡張がかなり改善されたと仮定し（Ｃｏｏｋｅらに
よる、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：１０５７−１０６２、１９９１年を参照
のこと）と仮定し、そしてカカオポリフェノールがＮＯレベルを調節することが
できると仮定すると、内皮依存血管拡張における相乗的な改善が期待できる。１
．０〜１．１ｇ／１００ｇのレベルのＬ−アルギニンではココアパウダーは甘く
ならないことが報告されている。この根拠から、ＮＯおよびＮＯ−シンターゼ調
節に関する最大の利点を提供するためにはその他のＬ−アルギニン源を食品に組
み入れる。特に好ましい実施態様においては、ココアおよび／またはナッツポリ
フェノールおよびＬ−アルギニンが、上述の相乗効果を得るために効果的な量存
在し、例えば、単位服用量あたり約１〜約１０グラム、好ましくは２５ミリグラ
ム〜３グラムのプロシアニジンが含有される。本発明の製品は、哺乳類の体内に
おいて癌細胞の成長を抑制し、哺乳類の高血圧症を低下させ、炎症腸管疾患を治
療し、哺乳類の体内で微生物が成長するのを阻止し、オセロスクレロシス（ｏｔ
ｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または再狭窄を阻止または軽減し、血小板凝集を
調節し、アポトーシスを調節するために抗酸化剤として使用することができ、特
に、哺乳類の体内でリポタンパク質が酸化することを防止し、シクロオキシゲナ
ーゼおよび／またはリポキシゲナーゼを調節し、哺乳類の体内で窒素酸化物（Ｎ
Ｏ）の製造を調節または促進し、哺乳類の体内で高コレステロール血症によって
そこなわれた窒素酸化物（ＮＯ）を処理し、インビボでグルコ−スを調節し、ト
ポイソメラーゼＩＩ型を阻止し、哺乳類の単核細胞および／またはマクロファー
ジ中にＩＮＯＳおよび抗菌剤、抗腫瘍剤、抗歯肉炎剤または抗歯周炎剤を導入す
るために使用できる。

【００６５】 ココアおよび／またはナッツポリフェノールおよびＬ−アルギニンを含有する
、本発明の食品および薬理学的組成物を使用して哺乳類、特に人間の健康を改善
するための新規の方法を行うことができる。

【００６６】 本発明の好適な実施態様は、ココアおよび／またはポリフェノールおよびＬ−
アルギニンを含有する効果的な量の食品または薬理学的組成物を、効果的な期間
毎日哺乳類に投与することによって、哺乳類の健康を改善する方法である。治療
条件によって、効果的な期間は瞬間的から６０日間より長い期間までにわたって
異なる。１つの側面においては、哺乳類の健康は、カカオポリフェノールおよび
Ｌ−アルギニンを含有する食用組成物を、５日間より長く６０日間より長い期間
までにわたって、毎日摂取することによって改善される。

【００６７】 本発明において使用するポリフェノールは窒素酸化物（ＮＯ）およびＮＯ−シ
ンターゼを調節する。アルギニンはＮＯ−シンターゼの基質として作用する。カ
カオポリフェノールとＬ−アルギニンとを合わせると、食品を摂取した哺乳類の
体内で生理学的作用を引き出すのに効果的である。窒素酸化物の生産において生
理学的作用は、カカオポリフェノールまたはＬ−アルギニンを単独で投与するこ
とによって得られるよりも向上する。このように窒素酸化物の製造が向上するこ
とによって、上述のような窒素酸化物の製造に伴う健康上有益な効果が得られる
。

【００６８】 本発明の食品および薬理学的組成物は、例えば、血管拡張を調整するのに有効
であり、さらに血圧調整または冠循環状態の処理、および片頭痛状態に関して有
効である。本発明の組成物を投与した結果引き出される作用としては、高血圧症
の低下や血管の拡張があげられる。

【００６９】 本発明の新規の食品は、本願に記載した教示を利用して当業者によって容易に
調製することができる。

【００７０】 ココア成分は、醗酵ファクターが３００未満のカカオ豆および／または醗酵フ
ァクターが３００より大きいカカオ豆から調製することができる。醗酵ファクタ
ーが３００未満のカカオ豆から調製されたアルキル化チョコレート成分を、醗酵
ファクターが３００未満のカカオ豆から調製されたココア成分と組み合わせて使
用することができる。

【００７１】 チョコレートを主成分とする食品のココアプロシアニジン含有量は、食品の調
製中、炭水化物成分および／または牛乳成分を保護することによって確保するこ
とができる。これらの成分はチョコレート成分を添加する前に保護する。脂肪、
乳化剤、酸化防止剤、香料およびこれらの混合物のうち少なくとも一種類の保護
成分を、炭水化物成分および／または牛乳成分に添加することによって、第１の
混合物を得る。第１の混合物をチョコレート成分と組み合わせることによって第
２の混合物を得る。本発明の食品は第２の混合物から得られる。食品はお菓子ま
たは補助食品である。お菓子はダークチョコレートまたはミルクチョコレートで
ある。必要に応じて、炭水化物成分および／または牛乳成分は、保護成分と混合
する前に粉砕して粒の大きさを小さくする。チョコレート成分もまた、保護され
た炭水化物および／または牛乳成分の第１の混合物に組み合わせる前に粉砕する
場合がある。前処理成分として使用する好ましい脂肪は、ココアバター、および
ココアバターを含有し醗酵ファクターが３００より大きいカカオ豆から調製され
るチョコレート液体である。好ましい乳化剤としては、レシチンおよびまたは／
分留化レシチンがあげられる。適切な酸化防止剤としては、タンニン、キノン、
ポリヒドロキシ化合物、リン脂質、トコール化合物および／またはそれらの誘導
体があげられる。適切な香料としては、バニリン、香辛料、および／または自然
に発現するシトラス油または香辛料油があげられる。第１の混合物、チョコレー
ト成分、および／または第２の混合物は練って加工される。チョコレートは約５
０℃〜約６５℃で練り加工される。練り加工中または後に第２の乳化剤を添加で
きる。この第２の乳化剤は、レシチン、エルカ酸スクロース、アンモニウムフォ
スファチド、ポリグリセロール、ポリリシノール酸、リン酸化モノグリコシドお
よびジグリコシド／モノグリセリドのデアクチル酒石酸エステル、および分留化
レシチンなどである。保護された炭水化物および／または牛乳成分を使用して調
製された食品は、少なくとも１０〜２０重量パーセント以上のココアプロシアニ
ジンを含有し、この量は、炭水化物成分および／または牛乳成分の前処理を行わ
ないプロセスによって調製された食品と比べて多い。

【００７２】 Ｌ−アルギニンの食品への添加は、ピーナッツなどのナッツの果肉を、所望の
濃度のＬ−アルギニンとするのに十分な量を添加することによって行うことがで
きる。

【００７３】 上述のように、特に好ましい食品はチョコレート菓子である。チョコレート菓
子中のチョコレートは、比較的高い濃度のカカオポリフェノールを含有する。本
実施態様においてチョコレートは、製品中の無脂肪ココア固形物の総量に基づい
て、グラムあたり少なくとも３６００マイクログラム、好ましくは少なくとも４
０００マイクログラム、好ましくは少なくとも４５００マイクログラム、より好
ましくは少なくとも５０００マイクログラム、最も好ましくは少なくとも５５０
０マイクログラムのココアプロシアニジンを含有する。１つの好ましい実施態様
によると、チョコレートは、製品中の無脂肪ココア固形物に基づいて、グラムあ
たり少なくとも６０００マイクログラム、好ましくは少なくとも６５００マイク
ログラム、より好ましくは少なくとも７０００マイクログラム、最も好ましくは
少なくとも８０００マイクログラム、さらにより好ましくは１００００のココア
プロシアニジンを含有する。

【００７４】 他の実施態様はチョコレートを含有するチョコレート食品に関し、該チョコレ
ートは、チョコレ−ト食品中の無脂肪ココア固形物の総量に基づいて、グラムあ
たり少なくとも２００マイクログラム、好ましくは少なくとも２２５マイクログ
ラム、より好ましくは少なくとも２７５マイクログラム、最も好ましくは少なく
とも３００マイクログラムのココアプロシアニジン五量体を有する。好ましくは
チョコレートは、チョコレート食品中の無脂肪ココア固形物の総量に基づいて、
グラムあたり少なくとも３２５マイクログラム、好ましくは少なくとも３５０マ
イクログラム、より好ましくは少なくとも４００マイクログラム、最も好ましく
は少なくとも４５０マイクログラムのココアプロシアニジン五量体を含有する。

【００７５】 さらに他の実施態様はミルクチョコレート菓子に関し、該ミルクチョコレート
菓子は、ミルクチョコレート製品中の無脂肪ココア固形物の総量に基づいて、グ
ラムあたり少なくとも１０００マイクログラム、好ましくは少なくとも１２５０
マイクログラム、より好ましくは少なくとも１５００マイクログラム、最も好ま
しくは少なくとも２０００マイクログラムのカカオポリフェノールを含有する。
好ましい実施態様においては、ミルクチョコレートは、ミルクチョコレート製品
中の無脂肪ココア固形物の総量に基づいて、グラムあたり少なくとも２５００マ
イクログラム、好ましくは少なくとも３０００マイクログラム、より好ましくは
少なくとも４０００マイクログラム、最も好ましくは少なくとも５０００マイク
ログラムのココアプロシアニジンを含有する。

【００７６】 他の実施態様において食品はミルクチョコレートであり、該ミルクチョコレー
トは、ミルクチョコレート製品中の無脂肪ココア固形物の総量に基づいて、グラ
ムあたり少なくとも８５マイクログラム、好ましくは少なくとも９０マイクログ
ラム、より好ましくは少なくとも１００マイクログラム、最も好ましくは１２５
マイクログラムのココアプロシアニジン五量体を含有する。好ましい実施態様に
おいてミルクチョコレートは、ミルクチョコレート製品中の無脂肪ココア固形物
の総量に基づいて、グラムあたり少なくとも１５０マイクログラム、好ましくは
少なくとも１７５マイクログラム、より好ましくは少なくとも２００マイクログ
ラム、最も好ましくは少なくとも２５０マイクログラムのココアプロシアニジン
五量体を含有する。

【００７７】 非チョコレート食品は、少なくとも１マイクログラム、好ましくは少なくとも
５マイクログラム、より好ましくは少なくとも１０マイクログラム、より好まし
くは２５マイクログラム、最も好ましくは５０マイクログラムのココアプロシア
ニジンを含有する。所望であれば、非チョコレート食品は上述のチョコレート食
品よりも高いレベルのココアプロシアニジンを含有することもできる。

【００７８】 食品中のＬ−アルギニンの量はさまざまである。典型的にはココアは、部分的
に脱脂したココア固形物１００グラムあたり１〜１．１グラムのＬ−アルギニン
を含有する。ココア１００グラムあたり０．８〜１．５グラムの範囲であっても
よい。本発明のチョコレート食品は、ココア成分中に自然に含まれているよりも
多い量のＬ−アルギニンを含有する。当業者であれば、本発明の食品に使用され
ているココア成分およびＬ−アルギニンの量を知ることによって、最終製品中の
Ｌ−アルギニンの総量を容易に測定することができる。

【００７９】 本発明の食品は一般に、食品のグラムあたり少なくとも１マイクログラム、好
ましくは少なくとも１０マイクログラム、または少なくとも１００マイクログラ
ム、さらにより好ましくは少なくとも１０００マイクログラム、または５０００
、または１００００マイクログラム、最も好ましくは少なくとも２００００、５
００００、または１０００００マイクログラムのＬ−アルギニンを含有する。

【００８０】 上述のように、本発明はまた、少なくとも一種類のカカオポリフェノール、Ｌ
−アルギニンおよび薬理学的に容認される組成物を含有する薬理学的組成物に関
する。当業者であれば、単位服用量あたり約１マイクログラム〜約１０マイクロ
グラムの量のＬ−アルギニンを容易に含有させることができる。本発明の薬理学
的組成物は、窒素酸化物の生産の増加、および血圧の低下などそのことによって
得られる有益な効果を必要としている哺乳類の治療に有効である。

【００８１】試験手順 さまざまな実施例においてプロシアニジンおよびＬ−アルギニンの量を定量化
するために以下の手順を利用することができる。

【００８２】 方法Ａを、実施例１〜実施例３に報告したココアプロシアニジン量（全部およ
び五量体）の定量化に利用した。

【００８３】 方法Ｂを、実施例４〜１０の食品および食品成分中のココアおよびナッツプロ
シアニジン量（全部および五量体）の定量化に利用した。方法Ｂはまた、実施例
１４に報告した、純化ココアプロシアニジンオリゴマーのココアプロシアニジン
含有量の定量化に使用し、また実施例１７〜１９に使用した。

【００８４】 方法Ｃはナッツプロシアニジンを抽出し内容確認するために使用した。

【００８５】プロシアニジンの測定 方法Ａ テクマールＡ−１０アナリティカルミルを使用して５分間６〜７グラムの試料
を粉砕することにより、またはチョコレート液体の場合は、さらに粉砕すること
なく６〜７グラムのチョコレート液体試料からカカオポリフェノール抽出物を調
製する。次に試料を５０ミリリットルのポリプロピレン遠心管に送り、約３５ミ
リリットルのヘキサンを添加し、１分間試料を激しく振とうする。試料はＩｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製ＩＥＣＰＲ−
７０００遠心分離器を使用して１０分間３０００ＲＰＭにて回転させる。ヘキサ
ン層をデカントした後、脂肪抽出プロセスをさらに２回繰り返す。約１グラムの
脱脂材料が１５ミリリットルのポリプロピレン遠心管中に得られ、７０パーセン
トアセトン、２９．５パーセントの水、０．５パーセントの酢酸溶液を５ミリリ
ットル添加する。Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｖｏｒｔｅｘ
Ｇｅｎｉｅ２を使用して試料を渦巻状に約３０秒間回転させ、ＩＥＣＰＲ−７
０００遠心分離器内で１０分間３００ＲＰＭにて回転させた。次にＭｉｌｌｅｘ
−ＨＶ０．４５μフィルターで１ミリリットルのハイポガラスビンに液体を濾過
する。

【００８６】 ＨＰモデル１０４６Ａプログラマブル蛍光検出器およびダイオードアレー検出
器を備えたヒューレットパッカード１０９０型ＩＩＨＰＬＣシステムによってカ
カオポリフェノール抽出物を分析する。Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ
ＬＣ−Ｓｉ５μｍガードカラム（２０×２．１ｍｍ）に接続した５μ Ｓｕｐ
ｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉカラム（２５０×４．６ｍｍ）に
よって３７℃で分離を行う。直線勾配によって以下の条件下でプロシアニジンを
溶出する。（時間 パーセントＡ、パーセントＢ、パーセントＣ）、（０．８２
、１４、４）（３０、６７．６、２８．４、４）（６０、４６、５０、４）（６
５、１０、８６、４）。その後、５分間再均衡する。移動相組成物はＡ＝ジクロ
ロメタン、Ｂ＝メタノール、およびＣ＝体積比１：１の酢酸：水であった。１ミ
リリットル／分の流量を使用する。λ_ｅｘ＝２７６ｎｍおよびλ_ｅｍ＝３１６ｎ
ｍでの蛍光により、または２８０ｎｍでの紫外線により成分を検出する。外基準
としてエピカテキンを使用する。

【００８７】 ＨＰＬＣ条件： ２５０×４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉカ
ラム（５μｍ）２０×２．１ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ ＬＣ−Ｓｉ（５μｍ）ガー
ドカラム 検出器：２８０ｎｍのフォトダイオードアレー 蛍光 λ_ｅｘ＝２７６ｎｍ、λ_ｅｍ＝３１６ｎｍ 流量１ミリリットル／分 カラム温度：３７℃

【表１】 方法Ｂ この方法では、紫外線検出のかわりに２８０ｎｍでの蛍光検出（ＦＬＤ）を採
用した順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を使用してモノマーおよ
びオリゴマーココアおよびナッツプロシアニジンを定量化する。

【００８８】 順相高速液体クロマトグラフィー法は、Ｈａｍｍｅｒｓｔｏｎｅらによって「
高速液体クロマトグラフィー／質量分析法を使った、ココア（テオブロモカカオ
）およびチョコレート中のプロシアニジンの内容確認（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｉｎ Ｃｏｃｏａ （Ｔｈｅｏｂｒ
ｏｍａ ｃａｃａｏ） ａｎｄ Ｃｈｏｃｏｌａｔｅ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈ
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａ
ｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」に Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈ
ｅｍｓ． ４７， ２：４９０−４９６（１９９９年１月１４日）報告されてい
る方法であり、この方法によってオリゴマーをデカマーまで分離し定量化する。

【００８９】 カカオ豆からの抽出を行い、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲル透過クロマト
グラフィーによる濃縮を行い、予備順相高速液体クロマトグラフィーによって最
終的に純化することによってデカマーを介したプロシアニジン基準を得た。質量
分析器に接続した高速液体クロマトグラフィーを使用して、それぞれのオリゴマ
ー留分を評価する。

【００９０】 次に複合物の基準を調製し、面積合計対濃度の二次適合を利用してそれぞれの
オリゴマー分類について検量線を生成する。

【００９１】 カカオ豆は、Ａｌｍｉｒａｎｔｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｃｏａ Ｓｔ
ｕｄｉｅｓ（Ｉｔａｊｕｉｐｅ、ブラジル）から提供されたものである。

【００９２】 比較用化合物は（−）−エピカテキン（Ｓｉｇｎｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製
、セントルイス）およびブラジル産カカオ豆から得た純化オリゴマーである。

【００９３】 新鮮な種を液体窒素とともに高速実験用ミルで、粒子サイズが約９０μｍとな
るまで粉砕することによってココアプロシアニジンを抽出する。１０００ミリリ
ットルのヘキサンとともに３回抽出することによって、粉砕した種２２０グラム
から脂質を除去する。脂質が除去された固形物は空気乾燥され、約１００グラム
の無脂肪材料を生成する。１０００ミリリットルの７０重量パーセントアセトン
によって水中で抽出することによってプロシアニジン含有留分を得る。懸濁液は
１５００ｘｇにて１０分間遠心分離する。グラスウールがそなわった漏斗を通し
てアセトン層をデカントした。次に水性アセトンをヘキサン（−７５ミリリット
ル）によって再抽出し、残留脂質を除去する。ヘキサン層は廃棄し、４０℃およ
び部分真空状態で水性アセトンを回転蒸発させることによって最終的な体積を２
００ミリリットルとする。水性抽出物を凍結乾燥して約１９グラムのアセトン抽
出材料を生成する。

【００９４】 ゲル透過クロマトグラフィーに関しては、約２グラムのアセトン抽出物を１０
ミリリットルの７０パーセント水性メタノールに抽出し、１５００ｘｇにて遠心
分離する。あらかじめ流量３．５ミリリットル／分の流量でメタノールで均衡し
たＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（７０×３ｃｍ）にて上澄み液を半純化
する。試料搭載後２時間半の間、留分を２０分毎に収集し、高速液体クロマトグ
ラフィーによってテオブロミンおよびカフェインを分析した（Ｃｌａｐｐｅｒｔ
ｏｎらによる、「ポリフェノールおよびココアフレーバー（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏ
ｌｓ ａｎｄ Ｃｏｃｏａ Ｆｌａｖｏｕｒ）」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、１
６^ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｇｒｏｕ
ｐ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ、リスボン、ポルトガル、Ｇｒｏｕｐｐｅ Ｐｏｌ
ｙｐｈｅｎｏｌｓ、Ｎｏｒｂｏｎｎｅ Ｆｒａｎｃｅ、ＴｏｍｅＩＩ：１１２−
１１５、１９９２年を参照のこと）。テオブロミンおよびカフェインをいったん
カラムから溶出し（−３．５時間）、残っている溶出物をさらに４．５時間かけ
て収集し、部分真空状態において４０℃で回転蒸発することによって有機溶剤を
除去する。そして、抽出物を水中で懸濁して凍結乾燥する。

【００９５】 ココアプロシアニジンオリゴマーを予備順相高速液体クロマトグラフィーによ
って純化する。約０．７グラムの半純化アセトン抽出物を、体積比が７０：２９
．５：０．５のアセトン、水、酢酸７ミリリットル中に溶解する。５μＳｕｐｅ
ｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ１００Å（５０×２ｃｍ）を使用して室温にて分離を
行う。以下の表に示す条件下において、直線勾配によってプロシアニジンを溶出
する。オリゴマーの分離を２８０ｎｍでの紫外線によってモニタし、留分をオリ
ゴマーに対応するピーク間の谷間で収集する。いくつかの予備分離から等しい保
持時間を有するものを組み合わせ、部分真空状態で回転蒸発し凍結乾燥する。

【００９６】

【表２】 部分的に純化したココアプロシアニジンオリゴマーの質量分析については、
Ｌａｚａｒｕｓらによる「食材中のプロアントシアニジンの高速液体クロマトグ
ラフィー／質量分析（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｔｕ
ｆｆｓ）」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（１９９８年提出）に記載
のパラメータを使用して、高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＭＳ）によ
って純化した留分を分析する。それぞれの留分の純度は、２８０ｎｍでの紫外線
検出をそれぞれのオリゴマー分類間のイオン存在比とともに利用したピーク領域
によって測定する。モノマーに市販の（−）−エピカテキンを利用し、デカマー
を介してダイマーに純化オリゴマーを利用して複合標準原液を製造する。複合標
準原液のオリゴ−マプロフィ−ルは下表に示す。

【００９７】

【表３】 原液は以下の濃度にて製造する。２０ミリグラム／ミリリットル、１０ミリグ
ラム／ミリリットル、５ミリグラム／ミリリットル、２ミリグラム／ミリリット
ル、１ミリグラム／ミリリットルおよび０．４ミリグラム／ミリリットル。

【００９８】 チョコレート液体およびチョコレート試料を、４５ミリリットルのヘキサン（
約８グラムのサンプル）を使用する以外は上と同様の方法にて抽出する。約１グ
ラムの脱脂材料を５ミリリットルのアセトン：水：酢酸を使用して上と同様の方
法にて抽出する。固形物を１０分間１５００ｘｇにて遠心分離することによって
造粒する。次に、上澄みを０．４５ミクロンのナイロンフィルタで注入用高速液
体クロマトグラフィーガラスビンに濾過する。脱脂したすべての試料の重量を測
定し、抽出し、注入し、これを２回繰り返す。ココア液体およびチョコレートの
脂肪組成物は、ＡＯＡＣ分析法９２０．１７７によって測定する。１グラムのチ
ョコレート試料および０．５グラムの液体試料を使用した試料については試料サ
イズをわずかに変更する。自動注入器、４相ＨＰＬＣポンプ、カラム加熱器、デ
ータ収集および操作用蛍光検出器およびＨＰケムステーションを備えたＨＰ１１
００型ＨＰＬＣ（ヒューレットパッカード、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニ
ア）を使用して、ココアプロシアニジンの高速液体クロマトグラフィー分析を行
う。蛍光検出は２７６ｎｍでの励起波長および３１６ｎｍでの発光波長にて記録
する。５マイクロリットル注入体積および３７℃にて、フェノメネックス（Ｔｏ
ｒｒａｎｃｅ社製、カリフォルニア）５μリクロスフェアシリカカラム（２５×
４．６ｍｍ）を使用してプロシアニジンオリゴマーの順相分離を行う。三元移動
相はＡ）ジクロロメタン、Ｂ）メタノール、およびＣ）酢酸および水（１：１ｖ
／ｖ）からなる。１ミリリットル／分の流量にて、Ｃをファクター４パーセント
としＡへの一連のＢの直線勾配によって以下の通り分離を行う。１４パーセント
のＢから始めてＡに溶出し、０〜３０分間１４〜２８．４パ−セントのＢをＡに
溶出し、３０〜４５分間２８．４〜３９．２パーセントのＢをＡに溶出し、３９
．２〜８６パーセントのＢを４５〜５０分間Ａに溶出する。最初の移動相の２５
ミリリットル（１０カラム体積）の等価物によって抽出の間にカラムを再均衡さ
せる。

【００９９】 チョコレート液体およびチョコレート中におけるココアプロシアニジンの定量
化については、それぞれのオリゴマー分類に対応するピークについての面積合計
対濃度の関係に関する二次適合を使用して原液からカリブレーションカーブを形
成する。

【０１００】方法Ｃ この方法はナッツ中のプロシアニジンの種類を測定するために使用する。ナッ
ツ中に存在するモノマーおよびオリゴマープロシアニジンを重合度によって分離
し、改質した順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を、対気圧イオン
化電気噴霧（ＡＰＩ−ＥＳ）チャンバを利用するオンライン質量分析（ＭＳ）法
とともに利用して内容確認する。

【０１０１】 生のピーナッツはＭ＆Ｍ／ＭＡＲＳ社（Ｈａｃｋｅｔｔｓｔｏｗｎ、ニュージ
ャージー）から提供されたものである。生のアーモンドはＡｌｍｏｎｄ Ｂｏａ
ｒｄ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ社（Ｍｏｄｅｓｔｏ、カリフォルニア）から
提供されたものである。

【０１０２】 使用する基準は（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキン（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、ミズーリ）である。

【０１０３】 試料を搭載する前に固相抽出（ＳＰＥ）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ Ｅｎ
ｖｉ−１８ ２０ミリリットルカラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ社製、ベラフォンテ、ペ
ンシルバニア）を３×５ミリリットルのメタノールで洗浄し、３×５ミリリット
ルの水にて調製する。サンプルを適切に搭載し洗浄する手続きが終了した後、カ
ラムを真空下にて１〜２分間乾燥する。そして、プロシアニジンをカラムから溶
出する前に、それぞれの体積比が７０：２９．５：０．５のアセトン、水および
酢酸１０ミリリットル中に固相抽出カラムを１分間浸漬する。ピーナッツの外皮
からプロシアニジンを抽出するために、約３．５グラムのピーナッツ外皮を、そ
れぞれ体積比７０：２９．５：０．５のアセトン、水および酢酸２５ミリリット
ル中に抽出する前に、実験用ミルで粉砕する。懸濁液を１５００ｘｇにて１０分
間遠心分離し、上澄み液をデカントする。真空状態で４５℃にて回転蒸発によっ
て有機溶媒を除去する前に、２０ミリリットルの水を上澄み液に添加し、約２２
ミリリットルの水性抽出物を生成する。この水性抽出物（２２ミリリットル）は
予備調製された固相抽出カラムに搭載し、４０ミリリットルの水で洗浄する。そ
して、上述の方法と同様にしてプロシアニジンを溶出する。ピーナッツ果肉から
プロシアニジンを抽出するために、果肉を液体窒素中で凍結させ、実験用ミルで
粉砕してパウダーとする。ナッツ果肉パウダー（−１０グラム）を４５ミリリッ
トルのヘキサンで３回抽出して脂質を除去する。それぞれ体積比が７０：２９．
５：０．５のアセトン、水および酢酸５ミリリットルによって得られた脱脂ナッ
ツ果肉１グラムを抽出する。

【０１０４】 アーモンドの種の果皮については、かみそりの刃によって約２４グラムの果皮
を生のアーモンドから除去する。次に果皮を１３５ミリリットルのヘキサンで２
回脱脂し、１５００ｘｇで１０分間遠心分離することによって約１４．６グラム
の脱脂材料を生成する。それぞれ体積比が７０：２９．５：０．５のアセトン、
水および酢酸９０ミリリットルによってこの脱脂された果皮を抽出する。上澄み
液に３０ミリリットルの水を添加し、得られた酸性化水性アセトンを４５℃で部
分真空状態で回転蒸発して最終的な体積が５０ミリリットルとなるようにする。
この水溶液を予備調製した固相抽出カラムに搭載し、約１０ミリリットルの水で
洗浄して上と同様の方法でプロシアニジンを溶出する。

【０１０５】 大気圧イオン化電気噴霧チャンバを備えたＨＰ型１１００質量選択性検出器（
Ｇ１９４６Ａモデル）に接続した、上の方法Ｂで説明のＨＰ１１００型高速液体
クロマトグラフィーを使用して抽出物の高速液体クロマトグラフィー／質量分析
を行う。質量分析器の直前でティーを介して高速液体クロマトグラフィーの溶出
流動に緩衝反応液を添加し、脱気装置を回避するＨＰ１１００型高速液体クロマ
トグラフィーポンプによって搬送する。陰イオンモードでの分析条件は、流量０
．０４ミリリットル／分で緩衝反応液として水酸化アンモニウム−０．７５Ｍ、
３ｋＶの細管電圧、７５Ｖのフラグメンタ、２５ｐｓｉｇの噴霧圧力、および３
５０℃の乾燥ガス温度である。走査方式および選択イオン検出の両方を使用して
、ＨＰケムステーションからデータを収集する。１サイクルにつき１．９６ｓで
ｍ／ｚ１００〜３０００の質量範囲についてスペクトルを走査する。

【０１０６】 アーモンド果皮イオンの質量スペクトルデータから、ヘプタマーを介して単独
で結合したプロシアニジンオリゴマーが存在することがわかり、一方、ピーナッ
ツ外皮の質量スペクトルデータから、オクタマーを介して単独および二重に結合
したオリゴマーが存在することがわかる。ピーナッツの果肉からプロシアニジン
は検出されない。

【０１０７】 Ｌ−アルギニン含有量の測定 該Ｌ−アルギニンはＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ９８２．
３０，ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ
９１９９５，Ｖｉｔａｍｉｎｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎｅｕｔｒｉｅｎｔｓ
，第４５章、５９−６１頁に報告されている手法を用いて測定する。該試料を酸
加水分解し、使用するアミノ酸アナライザーに最適のパラメーターを用いて３つ
の加水分解物の各々を分析する。標準Ｌ−アルギニン溶液を用いて少なくとも２
４時間ごとにアナライザーを較正する。窒素はＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄ ９５５．０４Ｃ．９２０．３９Ａ、９７６．０５Ａ、または他の適
当なケルダール法によって測定する。未修正ｇ／１６ｇ Ｎは： ｇ Ｌ−アルギニン（未修正１６ｇ試料Ｎ＝（ｎモルＬ−アルギニン×初期試料
容量（ｍＬ）×ＭＷ Ｌ−アルギニン）／（噴出試料容量（ｍＬ）×試料重量（
ｇ）×試料についての％Ｎ×６．２５×１０^５） に従って計算する。

【０１０８】 酸加水分解は約０．１ｇ（０．１ｍｇ精度まで秤量）試料を加水分解チューブ
に入れ、１０ｍＬの６Ｍ ＨＩを添加し、混合することによって行う。混合物を
ドライアイスーアルコール浴中で凍結させる。＜５０ｕの真空に引き、１分間保
持し、チューブを真空下でシールした。１１０＋１において試料を２４時間加水
分解する。チューブを冷却し開く。加水分解をホイットマンＮｏ１ペーパーを通
じて濾過する。チューブを水で３回すすぎ、各すすぎを濾過する。濾液を真空下
で６５゜で乾燥する。乾燥した加水分解物をアミノ酸アナライザーに適した容量
の緩衝液に溶解させる。加水分解物は分析で用いる前に１週間を越えては保存で
きない。

【０１０９】 実施例 以下の実施例は本発明のある好ましい具体例の例示を意図し、本発明の限定
は意味しない。実施例１７、１８および１９で使用される単離カカオ・オリゴマ
ーは、（Ｌ．Ｒｏｍｚｎｃｚｙｋらに対して１９９６年１０月９日に発行された
）米国特許第５，５５４，６４５号に記載された方法を用いて単離し、方法Ｂの
手法を用いてさらに精製した。

【０１１０】 実施例１ カカオ豆からのカカオポリフェノールココア固形物を得る方法 約７ないし８重量％の初期水分含有量を有する商業的に入手可能なカカオ豆
を、（Ｃａｒｔｅｒ Ｄａｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ミネアポリス、Ｍ
Ｎ，米国によって製造された）１１”×５６”Ｓｃａｌｐｅｒａｔｏｒを用いて
予備清浄した。ほぼ６００バッグのカカオ豆（３９，０００ｋｇ）を６．５時間
にわたって予備清浄した。豆を流入ホッパーに供給し、ここに、流速は正の供給
ロールによって調節した。豆を回転ワイアーメッシュ皮剥ぎリールの外部に供給
した。豆をワイアーメッシュリールに通し、引き続いて空気吸引チャンバーに通
し、そこで軽い汚れたダストおよびストリングを生成物流から吸引した。皮剥ぎ
リールを通過しなかった豆を噴出流まで運んだ。この噴出流は豆の大きなクラン
プ、スティック、ストーン等よりなるものであった。得られた噴出物の量はほぼ
１５０ｋｇであり、または出発材料の０．３８％であった。得られた予備清浄生
成物は約３８，８５０ｋｇの重量であり、豆清浄工程まで通過させた。

【０１１１】 次いで、Ｓｃａｌｐｅｒａｔｏｒからの予備清浄豆生成物を、Ｃａｍａｓ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＶ４−５ Ａｉｒ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ Ｂｅｄ
Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＡＦＢＤＳ， Ｃａｍａｓ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｐｏｃｏｔｅｌｌｏ， ＩＤ， 米国によって製造）を
用いてさらに清浄した。約３８，８５０ｋｇのカカオ豆生成物を約６．５時間に
わたってＡＦＢＤＳに供給した。該装置はストーン、金属、ガラス等のごとき実
質的に全ての重い不純物を豆から除去し、ならびにカビが生えたおよび虫に食わ
れたカカオ豆のごとき軽い使用できない材料を除去し、その結果、実質的に使用
できるカカオ豆のみを含有する清浄豆生成物が得られた。除去された得られた重
い不純物は約５０ｋｇの重量であり、軽い使用できない材料は約１５１ｋｇの重
量であった。合計約３８，６４９ｋｇの清浄豆が前記した予備清浄および清浄工
程双方の後に得られた（清浄後９９．１％収率）。

【０１１２】 次いで、清浄カカオ豆を赤外線加熱装置に通した。使用した装置は（Ｍｉｃｒ
ｏｎａｉｚｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｕ．Ｋ．）Ｌｉｍｉｔｅｄ，英国によっ
て製造された）Ｍｉｃｒｏ Ｒｅｄ ２０ 電気赤外線振動マイクロナイザーで
あった。マイクロナイザーは１時間当たり約１，７０１ｋｇの速度で運転した。
マイクロナイザーの振動床中の豆の深さは約２インチまたは約２−３個の豆の深
さであった。マイクロナイザーの表面温度は約１６５℃に設定し、その結果、１
ないし１．５分の範囲の時間に、約１３５℃のＩＢＴが得られた。この処理によ
り、殻は迅速に乾燥され、粗挽きカカオ豆から分離された。マイクロナイザーに
供給された実質的に全てのカカオ豆は全豆であって、豆または殻の小さな破片は
実質的になかったので赤外線加熱工程の間に破裂または発火は観察されなかった
。マイクロナイザーに先立って振動スクリーンによって分離された破片は、ふる
い分け工程に先立って生成物流に再度導入された。

【０１１３】 マイクロナイザーからの豆は約３．９重量％の水分含有量を有した。約１３５
℃のＩＢＴにおいてマイクロナイザーから出現した豆を直ちに約３分以内に約９
０℃の温度まで冷却してさらなる水分喪失を最小化した。加熱工程後に利用でき
る全豆は約３６，１３７ｋｇであった。

【０１１４】 次いで、該豆は（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｍｉｔｒａ Ｓｅｉｔａ，ジャカルタ，
インドネシア国によって製造された）Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｍｉｔｒａ Ｓｅｉｔａ
篩機を用いてふるい分けに付した。ふるい分け工程は豆を破砕して殻を緩め、
同時に殻噴出流と共に失われた中身の量を最小化しつつ、中身からより軽い殻を
分離した。篩機への供給速度は１時間につき約１，５９１ｋｇであった。得られ
た生成物は約３１，８６１ｋｇの使用できる粗挽きカカオ豆および４，２７６ｋ
ｇの噴出殻を含んだ。出発材料からの使用できる粗挽きカカオ豆の全収率は約８
１．７％であった。

【０１１５】 （Ｔｈｅ Ｄｕｐｐｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， オハイ
オ州、米国によって製造された）Ｄｕｐｐｓ １０−６ Ｐｒｅｓｓｏｒを用い
て得られた粗挽きカカオ豆を圧縮した。１時間当たり約１，４０２ｋｇの粗挽き
カカオ豆の定常的一定供給物を２つのスクリュープレスに供給してバターを抽出
した。該圧縮により、約１０％ココア固形物を含有する約１６，１９８ｋｇのコ
コアバター、および約１０％のバターを含有する約１５，６６３ｋｇのココア固
形物が生じた。

【０１１６】 （Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｒｅｂｕｉｌｄｅｒｓ， ノース
カンザスシティ， ＭＯ、米国によって製造された）Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｐ３０
００デカンティング遠心機を用いてココアバターをさらに加工した。遠心により
、バター中の固形物含有量は約１−２％固形物まで減少し、約１３，６０６ｋｇ
のバターおよび約４０ないし４５％のバターを含有する２，５９２ｋｇのココア
固形物が得られた。（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｍｉｔｒａ Ｓｅｉｔａによって製造さ
れた）プレートおよびフレームフィルターを用いて、１−２％固形物を含有する
バターをさらに加工し、これによりバターから残りの固形物が除去され、約１３
，２７１ｋｇの透明ココアバターおよび４０−４５％のバターを含有する約３３
５ｋｇのココア固形物が得られた。

【０１１７】 遠心機およびフィルタープレスから取り出されたココア固形物は約４０−４５
％の脂肪を含有し、これをバッチ式水圧プレス中で圧縮して１０％の脂肪ココア
ケーキが得られた。この材料は約１，１８６ｋｇの透明バターおよび１，７４２
ｋｇのココア固形物を生じた。

【０１１８】 新しい豆からの全透明バター収率は１４，４５６ｋｇまたは３７．１％であっ
た。新しい豆から生じた全ココア固形物は１７，４０５ｋｇまたは４４．６％で
あった。

【０１１９】 未発酵カカオ豆（未発酵因子レベル１００）から前記プロセスに従って生じた
部分的に脱脂されたココア固形物ココア粉末の試料は以下のプロシアミジン濃度
を含有した：全プロシアニジン３２，７４３μｇ／ｇ、プロシアニジン９，４３
３μｇ／ｇ、プロシアニジンダイマー５，９２９μｇ／ｇ、プロシアニジントリ
マー５，３５６μｇ／ｇ、プロシアニジンテトラマー４，０２７μｇ／ｇ、プロ
シアニジンペンタマー３，１６８μｇ／ｇ、プロシアニジンヘキサマー２，１３
１μｇ／ｇ、プロシアニジンヘプタマー１，３０４μｇ／ｇ、プロシアニジンオ
クタマー７３９μｇ／ｇ、プロシアニジンノナマー４３９μｇ／ｇ。

【０１２０】 実施例２ カカオポリフェノールを含有するチョコレートリッカーの生産 初期水分含有量７．４重量％および２３３の発酵因子レベルを有する公正平
均品質（ＦＡＱ）Ｓｕｌａｗｅｓｉカカオ豆（３１％ネズミ色、２９％紫色、２
２％紫茶色および１７％茶色）を出発材料として選択した。次いで、カカオ豆を
赤外線加熱装置に通した。使用した装置が（Ｍｉｃｒｏｎａｉｚｅｒ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ （Ｕ．Ｋ．）Ｌｉｍｉｔｅｄ． 英国によって製造された）赤外線振動
マイクロナイザーであった。赤外線ヒーターを通す豆の供給速度および赤外線ヒ
ーターベッド角を変化させて、豆が受けた熱処理の量を制御した。豆が赤外線ヒ
ーター中で消費した時間の量（滞留時間）はベッド角および供給速度によって決
定した。材料を調製するために使用した時間を後記表１にリストする。マイクロ
ナイザーの流出口において豆の内部豆温度（ＩＢＴ）を測定し、これらの値も表
１に示す。

【０１２１】 異なるＩＢＴにおいて赤外線ヒーターから収集した赤外線加熱した１ｋｇ試料
を小破片に破砕した。これは殻から中身を分離するのを促進するために行った。
殻を除去するのに使用した器具の実験室ピースはイングランドのＪｏｈｎ Ｇｏ
ｌｄｏｎ Ｃｏ． Ｌｔｄ．によって作成されたＬｉｍｉｐｒｉｍｉｔａカカオ
ブレーカーであった。Ｊｏｈｎ Ｇｏｌｄｏｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．イングランドに
よって製造されたＣａｔａｄｏｒ ＣＣ−１を用い、破砕された豆を実験室スケ
ールのふるい分けシステムを通した。

【０１２２】 次に、Ｐａｓｃａｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．Ｌｔｄ．イングラン
ドによって作成されたＭｅｌａｎｇｅを用いてカカオ中身を粗いリッカーに粉砕
した。このデバイスは該中身を破砕し粉砕してチョコレートリッカーとする。該
Ｍｅｌａｎｇｅ中でのリッカーに対する通常の操作温度はほぼ５０℃である。粗
挽きカカオ豆を粗いリッカーとするこの同一プロセスは、Ｃａｒｌｅ＆Ｍｏｎｔ
ａｎａｒｉ Ｍｉｌｌのごとき他のタイプのミルを用いて大きな生産規模で行う
ことができる。カカオ中身をＭｅｌａｎｇｅ中で１時間粉砕した。カカオプロシ
アニジンの濃度は赤外線加熱温度に対する試料につき測定した。これらの値を以
下の表１に掲げる。

【０１２３】

【表４】 実施例３ チョコレート食品 （Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｒｅａｄ Ｃｏ．， Ｙｏｒｋ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎ
ｉａによって製造された）１０ ｌｂ． Ｓｉｇｍａ ブレードミキサーを用い
て後記する範囲の濃度内で成分を一緒に混合した。チョコレートを製造するため
の適当な成分の選択および与えられた範囲内の量は過度の実験なくして当業者が
容易に実行できる。

【０１２４】 成分 ％濃度（重量） スクロース ４０％ チョコレートリッカー ７％ ＣＰリッカー（実施例２） ４９％ 脂肪 ３．５％ レシチン ０．５％ レシチンおよび脂肪を合わせ、１０ ｌｂ． Ｓｉｇｍａ ブレードミキサー
を用いて均一になるまで混合した。得られた脂肪／レシチン混合物を第２の１０
ｌｂ．Ｓｉｇｍａ ミキサー中の造粒スクロースに添加した。スクロース、脂
肪およびレシチンを約３５℃ないし約９０℃で均一になるまで混合した。高濃度
のココアプロシアニジンを有する実施例２のチョコレートリッカーを含めた残り
の成分を添加し、均一になるまで混合した。得られた混合物を約２０ミクロンの
マイクロメーター粒子サイズまで精錬し、コンチングし（ｃｏｎｃｈｅｄ）、標
準化した。得られたチョコレートのココアプロシアニジンペンタマー濃度はチョ
コレート１ｇにつき約３８５ないし４７２μｇの範囲であった。

【０１２５】 最終製品のほぼ５−３０重量％の量のピーナッツを添加して、ココアプロシア
ニジンおよびＬ−アルギニンが高いチョコレート含有ピーナッツ製品を形成させ
た。

【０１２６】 実施例４ ピーナッツバター製品 予め炙ったピーナッツを所望の塩および糖を添加して粉砕し、ピーナッツ
バターを形成させた。混合しつつ、高いココアプロシアニジン含有量を有する実
施例１のココア粉末を全混合物のほぼ２ないし３重量％の量で混合物に添加する
。該製品はカカオポリフェノールおよびＬ−アルギニンを含有するピーナッツバ
ターである。

【０１２７】 実施例５ 医薬組成物 以下の成分を含む錠剤混合物を調製する（重量パーセントとして表したパー
セント）： 実施例のココア粉末 −２４．０％ Ｌ−アルギニン −５．０％ 天然バニラエキス −１．５％ ステアリン酸マグネシウム（滑沢剤） −０．５％ Ｄｉｐａｃ錠剤化糖 −３２．０％ キシリトール −３７．０％ ココア粉末、バニラエキスおよびＬ−アルギニンを食品プロセッサー中で数分
間一緒にブレンドする。糖およびステアリン酸マグネシウムを一緒に温和に混合
し、続いてカカオ粉末／バニラエキス／Ｌ−アルギニン混合物とブレンドする。
この材料を最大圧力および圧縮にてＭａｎｅｓｔｙ Ｔａｂｌｅｔ Ｐｒｅｓｓ
（Ｂ３Ｂ）を通して、１．５ないし１．８グラムの重量の丸い錠剤（１５ｍｍ×
５ｍｍ）を得る。

【０１２８】 実施例６ ダークチョコレート 以下の一般的な処方を用い、実施例３に記載したプロセスと実質的に同様にし
てダークチョコレートを調製する： 成分の範囲（重量％） １５−３５％のスクロース ４０−７５％の実施例２のＣＰリッカー １−１０％の実施例１のＣＰココア粉末 １−１０％の脂肪 ０．０１−０．０５％のバニリン ０．１−１．０％のレシチン 全製品のほぼ５ないし３０重量％の量のピーナッツをダークチョコレートに添
加する。

【０１２９】 実施例７ ミルクチョコレート 以下の一般的な処方を用い、実施例３に記載したプロセスと実質的に同様にし
てミルクチョコレートを調製する： 成分の範囲（重量％） ３５ー５５％のスクロース １２−２５％ミルク成分 １０−２０％の実施例２のＣＰリッカー １５−２５％の脂肪 ０．１−１．０％の乳化剤 全製品のほぼ５ないし３０重量％の量のアーモンドをダークチョコレートに添
加する。

【０１３０】 実施例８ 高ＣＰダークチョコレートで包まれた ピーナッツバター−ソイクッキーバー 成分 ％ 範囲 チョコレート１ｇにつきダークチョコレート３．４ｍｇ ３５ ３０−４０ ピーナッツ ３２ ３０−４０ ソイフラワー、低脂肪 １１ １０−１５ 植物油 ５ ２−１０ 糖 １５ １０−２０ 水 １．５ 塩 ＜１ カラメルシロップ溶液 ＜１ 炭酸水素ナトリウム ＜１ 没食子酸プロピル ＜１ ピーナッツ、糖、植物油、塩および没食子酸プロピルを合わせることによって
ピーナッツバターを調製する。ソイフラワー、水、植物油および炭酸水素ナトリ
ウムを合わせ、焼くことによってクッキーを調製する。次いで、ピーナッツバタ
ーを焼いたクッキー上に押し出し、次いで、全バーを高ＣＰダークチョコレート
中に包む。

【０１３１】 処方成分のココアプロシアニジン、ナッツプロシアニジンおよびアルギニン含
有量に基づき、理論プロシアンジンおよびアルギニン濃度を以下に示す： 全プロシアニジン １２０ｍｇ／１００ｇ アルギニン １．４ｇ／１００ｇ 実施例９ 高ＣＰカカオおよびＬ−アルギニンを含有するドライドリンクミックス 増大したレベルのカカオポリフェノール（ＣＰ）およびＬ−アルギニンを有す
る実施例１からのココア粉末を含有するドライドリンクミックスを以下の処方に
従って作成する： 成分 ％ 糖 ５９ スキムミルク粉末 ２０ 麦芽粉末 １．９ ＣＰココア粉末２５−５０ｍｇ／ｇカカオ粉末 ８．０ ピーナッツフラワー １０．０ バニリン ＜０．０１ レシチン ＜０．９９５ 塩 ＜０．１ フレーバー剤 ＜０．１ 前記処方に従って乾燥成分をまとめ、＃２スピードのワイヤーフイップを用い
てＫｉｔｃｈｅｎ Ａｉｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｍｉｘｅｒ（モデルＫ
ＳＭ５０Ｐ）中で１時間混合する。Ｎｉｒｏ−Ａｅｒｏｍａｔｉｃアブロレメレ
ーター（モデルＳＴＲＡＥ／１）中での処方の使用に先立ってレシチンを凝集さ
せる。

【０１３２】 処方成分のココアプロシアニジン、ナッツプロシアニジンおよびアルギニン含
有量に基づき、理論プロシアニジンおよびＬ−アルギニン濃度を以下に示す： プロシアニジン ２００−４００ｍｇ／１００ｇ Ｌ−アルギニン ０．９／１００ｇ 実施例１０ ココアエキスを含むナッツおよびシードバー アーモンド ３０ カボチャの種子 １２ ヒマワリ種子 ５ ゴマ種子 ５ 塩 ＜１ バター １０ トウモロコシシロップ ７．６ レシチン ＜１ 糖 ２６ ココアエキス ４ 加塩バター中でアーモンドを軽く焼く。カボチャ種子、ヒマワリ種子および
ゴマ種子を添加する。バター、トウモロコシシロップ、レシチンおよび塩を合わ
せ、１／２パワーにて１分間マイクロ波加熱する。糖をステンレス鋼ソースパン
に入れ、フルパワーにて誘導調理器で調理する。糖がほとんど完全に融解すれば
、加熱を中程度のパワー（２９０゜Ｆ）まで低下させ、糖が十分に融解し色がハ
チミツ色となるまで糖を調理する。糖が十分に融解すれば、それをトウモロコシ
シロップ／バター混合物にゆっくりと添加し、混合する。ナッツミックスをスタ
ンドミックスに入れる。低速のパドルを用いてシロップを注意深くナッツミック
スに注ぐ。ナッツ／シロップミックスをバーに形成し、冷却する。

【０１３３】 処方成分のココアプロシアニジン、ナッツプロシアニジンおよびアルギニン含
有量に基づき、理論プロシアニジンおよびアルギニン濃度を以下に示す： プロシアニジン １５８６ｍｇ／１００ｇ アルギニン １．６ｇ／１００ｇ 実施例１１ 高ＣＰダークチョコレートに包んだ ピーナッツ、カラメル、ヌガー、バー ％ 処方 ＣＰダークチョコレート ３１．５ ピーナッツｗ／スキン ３０．０ カラメル ２７．１ ヌガー １１．５ ４５％ピーナッツを含有するヌガー混合物を調製し、冷却テーブル上に厚くの
せ、三角形バーに切断する。約３８％ピーナッツを含有するカラメル混合物を調
製し、冷却し、同様のピースに切断する。ヌガーの頂部にカラメルスラブをのせ
、全バーを約１０％ピーナッツを含有するチョコレート中に包む。

【０１３４】 処方成分のココアプロシアニジン、ナッツプロシアニジンおよびアルギニン含
有量に基づき、理論プロシアニジン、Ｌ−アルギニン濃度を以下にしめす： プロシアニジン２６０ｍｇ／１００ｇ アルギニン１ｇ／１００ｇ 実施例１２ ココア源および調整方法 ココアの３つの認められた園芸種を表すいくつかのＴｈｅｏｂｒｏｍａカカ
オ遺伝子型（Ｅｎｒｉｑｕｅｚ、１９６７；Ｅｎｇｅｌｓ、１９８１）は世界の
３つの主要なカカオ生産領域から得た。それらの遺伝子型のリストを表２に示す
。Ｔｈｅｏｂｒｏｍａカカオの他の種およびその密接に関連する属Ｈｅｒｒａｎ
ｉｎａもまたここでの使用に適するであろう。

【０１３５】

【表５】 収穫したカカオの鞘を開き、果肉を含む発酵下豆を取り出し、凍結乾燥した。
果肉は手で取り出した。豆を手で鞘を取り除き、ＴＥＫＭＡＲミルで微粉末の塊
に粉砕した。次いで、溶媒として再蒸留ヘキサンを用いるソックルレー抽出によ
って得られた塊を一晩脱脂する。雰囲気温度の真空によって残存する溶媒を脱脂
塊から除去した。

【０１３６】 実施例１２ プロシアニジン抽出手法 Ａ．方法１ ＪａｌａｌおよびＣｏｌｌｉｎ（１９７７）によって記載されている方法の
修飾を用い、実施例１１の脱脂した未発酵凍結乾燥カカオ豆からプロシアニジン
を抽出した。プロシアニジンは、２４００ｍｌ７０％アセトン／脱イオン水、続
いて４００ｍｌの７０％メタノール／脱イオン水を用いて脱脂ココア塊の５０ｇ
バッチから抽出した。抽出物をプールし、不完全な真空下に維持されたロータリ
ーエバポレーターを用いて４５℃の蒸発によって溶媒を除去した。得られた水性
相を脱イオン水で１Ｌに希釈し、４００ｍｌのＣＨＣｌ_３で２回抽出した。溶媒
相を捨てた。次いで、水性相を５００ｍｌの酢酸エチルで４回抽出した。不完全
な真空下に維持されたロータリーエバポレーターを用いて１０℃で３０分間２０
００×重力にて作動させたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ２８５遠心機上の遠心によって
いずれのエマルジョンも破壊した。得られた水性相を液体窒素中で凍結し、続い
てＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム上で凍結乾燥した。異なるカカオ遺伝子型
から得られた粗製プロシアニジンの収率を表３に示す。

【０１３７】

【表６】 Ｂ．方法２ 別法として、プロシアニジンは７０％水性アセトンを用いて実施例１の脱脂
された未発酵凍結乾燥カカオ豆から抽出する。１０ｇの脱脂材料を５−１０分間
で１００ｍｌの溶媒でスラリー化した。３０００×重力にて４℃でスラリーを１
５分間遠心し、上清をガラスウールに通した。不完全な真空下で濾液を蒸留に付
し、得られた水性相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥シ
ステムで凍結乾燥した。粗製プロシアニジンの収率は１５％ないし２０％の範囲
であった。

【０１３８】 粗製収率の差異は異なる遺伝子型、地理的起源、園芸学的種、および調整方法
で遭遇した変動を反映したものであると考えられる。

【０１３９】 実施例１３ カカオプロシアニジンの部分的生成 Ａ．ゲル透過クロマトグラフィー 実施例１２から得られたプロシアニジンはセファデックスＬＨ−２０（２８×
２．５ｃｍ）上の液体クロマトグラフィーによって部分的に生成した。分離は、
脱イオン水からメタノールへの段階的勾配によって助けた。最初の勾配組成は脱
イオン水中の１５％メタノールで出発し、これが脱イオン水中２５％メタノール
、脱イオン水中３５％メタノール、脱イオン水中７０％メタノール、および最後
に１００％メタノールにて３０分ごとに段階的に続けた。キサンチンアルカロイ
ド（カフェインおよびテオブロミン）の溶出に続く流出物を単一画分として収集
した。該画分はキサンチンアルカロイドを含まないサブ画分を生じ、これをさら
にサブ分画に付してＭＭ２ＡないしＭＭ２Ｅと命名した５つのサブ画分を得た。
不完全な真空下に保持したロータリーエバポレーターを用いる４５℃の蒸発によ
って溶媒を各サブ画分から溶媒を除去した。得られた水性相を液体窒素中で凍結
させ、ＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システムで一晩凍結乾燥した。分画を示す代表
的なゲル透過クロマトグラムを図２に示す。ほぼ１００ｍｇの材料をこのように
してサブ分画した。

【０１４０】 クロマトグラフィー条件：カラム；２８×２．５ｃｍセファデックスＬＨ−２
０，移動相：メタノール／水段階勾配、１５：８５、２５：７５、３５：６５、
７０：３０、１００：０ １／２時間感覚で段階付け、流速；１．５ｍｌ／分
、ディテクター；λ_１＝２５４ｎｍおよびλ_２＝３６５ｎｍにおいてＵＶ、チャ
ートスピード：９．５ｍｍ／分、カラム負荷；１２０ｍｇ Ｂ． 半分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） 方法１． 逆相分離 実施例２および／または３Ａから得られたプロシアニジンを半分取用ＨＰＬＣ
によって部分的に精製した。可変波長ディテクターを装備したＨｅｗｌｅｔｔ
ｐａｃｋａｒｄ １０５０ ＨＰＬＣシステム、１ｍｌ注射ループを持つＲｈｅ
ｃｄｙｎｅ ７０１０注射バルブをＰｈａｒｍａｃｉａ ＦＲＡＣ−１００画分
コレクターとで組み立てた。分離はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ １０μ ＯＤＳ Ｕ
ｌｔａｃａｒｂ^ＴＭ（６０×１０ｍｍ）ガードカラムと結合させたＰｈｅｎｏｍ
ｅｎｅｘ １０μ ＯＤＳカラム Ｕｌｔｒａｃａｒｂ^ＴＭ （２５０×２２．
５ ｍｍ）で行った。移動相組成は、以下の直線勾配条件；５ｍＬ／分の流速の
（時間、％Ａ）；（０，８５）、（６０，５０）、（９０，０）、および（１１
０，０）下でＡ＝水；Ｂ＝メタノールであった。化合物はＵＶ２５４ｍｍで検出
された。

【０１４１】 代表的に半分取用ＨＰＬＣトレースは画分Ｄ＋Ｅに存在するプロシアニジンの 分離につき図１５Ｎに示す。個々のピークまたは選択クロマトグラフィー領域を
、適時の間隔でまたはさらなる精製および引き続いての評価のための画分収集に
より手動によって収集した。注射負荷は２５−１００ｍｇの材料の範囲であった
。

【０１４２】 方法２． 通常相分離 実施例２および／または３Ａから得られたプロシアニジン抽出物を半分取用 ＨＰＬＣによって部分的に精製した。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０５
０ ＨＰＬＣシステム、２５４ｎｍに設定されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅ
ｒｓ Ｍｏｄｅｌ ４８０ ＬＣディテクターをピークモードに設定したＰｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｒａｃ−１００フラクションコレクターとで組み立てた。分離
はＳｕｐｅｌｃｏ ５μｍ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉガードカラム（
２０×４．６ ｍｍ）に結合したＳｕｐｅｌｃｏ ５μｍ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉ
ｌ ＬＣ−Ｓｉカラム（２５０×１０ ｍｍ）で行った。プロシアニジンは以下
の条件：（時間、％Ａ、％Ｂ）；（０，８２，１４）、（３０，６７．６，２８
．４）、（６０，４６，５０）、（６５，４６，５０）、（６５，１０，８６）
、（７０，１０，８６） 下の直線勾配によって溶出させ、続いて１０分間再平
衡化させた。移動相の組成はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノール；およびＣ＝
酢酸：（１：１）であった。３ｍｌ／分の流速を用いた。成分は２５４ｎｍにお
けるＵＶによって検出され、Ｋｉｐｐ＆Ｚｏｎａｎ ＢＤ４１レコーダーで記録
した。注射用量は、０．２５ｍｌの７０％水性アセトンに溶解させた１０ｍｇの
ポリシアニジン抽出物の１００ないし２５０μｌの範囲であった。代表的な半分
取用ＨＰＬＣトレースを図２に示す。個々のピークまたは選択クロマトグラフィ
ー領域は適時の間隔またはさらなる精製および引き続いての評価のための分画収
集によって手動で収集した。

【０１４３】 ＨＰＬＣ条件： ２５０×１０ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ （５ｍ）半分取用カラム ２０×４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ （５μｍ）ガードカラム ディテクター： ウォーターズ ＬＣ 分光高度計モデル４８０（２５４ｎｍにて） 流速：３ｍｌ／分 カラム温度：雰囲気 注射：７０％水性アセトン抽出物の２５０μｌ

【表７】 実施例１４ ＨＰＬＣ精製方法 方法Ａ． ＧＰＣ精製 ３．５ｍｌ／分の流速にて、溶出溶媒として１００％メタノールを用い、 実施例１２におけるごとくに得られたプロシアニジンをセファデックスＬＨ２０
（７２．５×２．５ｃｍ）上の液体クロマトグラフィーによって部分的に精製し
た。最初の１．５時間後に溶出物の画分を収集し、ロータリーエバポレーターに
よって画分を濃縮し、水に再度溶解させ、凍結乾燥した。これらの画分をペンタ
マー立地の画分という。実施例２から得られたほぼ２．００ｇの抽出物をこのよ
うにしてサブ分画した。結果を表４に示す。

【０１４４】

【表８】 方法Ｂ． 通常相分離 実施例１２におけるごとくに得られたプロシアニジンを分離し、１．０ｍ ｌ／分の流速にて、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ、１００Ａ、５μｍ（２
５０×４．６ｍｍ）、あるいは０．５ｍｌ／分の流速にて、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈ
ｅｒｅ゜シリカ１００、１００Ａ、５μｍ（２３５×３．２ｍｍ）上の通常相ク
ロマトグラフィーによって精製した。分離は、以下の条件：（時間，％Ａ，％Ｂ
）；（０，８２，１４）、（３０，６７．６，２８．４）、（６０，４６，５０
）、（６５，１０，８６）、（７０，１０，８６）下の段階勾配によって助けた
。移動相の組成はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノール；およびＣ＝酢酸：水（
１：１）であった。成分は、λ_ｅｘ＝２７６ｎｍおよびλ_ｅｍ＝３６０ｎｍであ
る蛍光、および２８０ｎｍにおけるＵＶによって検出した。注射用量は実施例２
から得られたプロシアニジンの５．０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）であった。これら
の結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。

【０１４５】 別法として、分離は、以下の条件：（時間，％Ａ、％Ｂ）；（０，７６，２ ０）；（２５，４６，５０）；（３０，１０，８６）下の段階勾配によって助け
た。移動相の組成はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノールであって、Ｃ＝酢酸：
水（１：１）であった。結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。

【０１４６】 方法Ｃ． 逆相分離 実施例１２におけるごとくに得られたプロシアニジンを分離し、Ｈｅｗｌｅ ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ ５μｍ（２００×２．１ｍ
ｍ）、およびＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ
５μｍガードカラム（２０×２．１ｍｍ）上の逆相クロマトグラフィーによって
精製した。プロシアニジンを２０分以内の２０％ＢからＡへの直線勾配によって
溶出させ、続いて９．３ｍｌ／分の流速の１００％Ｂでカラム洗浄した。移動相
の組成はＢ＝メタノール中の１．０％酢酸およびナノ純粋水中の２．０％酢酸の
脱ガス混合物であった。成分は、２８０ｎｍにおけるＵＶ、およびλ_ｅｘ＝２７
６ｎｍであってλ_ｅｍ＝３１６ｎｍである蛍光によって検出し；注射用量は２．
０μｌであった（２０ｍｇ／Ｌ）。

【０１４７】 実施例１５ ペンタマーリッチの画分のＨＰＬＣ分離 方法Ａ．半分取用通常相ＨＰＬＣ ピークモードに設定したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｒａｃ−１００フラクシ ョンコレクターとで組み立てた２５４ｎｍに設定したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−ｗａ
ｔｅｒｓモデル４８０ＬＣディテクターを装備したＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａ
ｒｄ １０５０ＨＰＬＣシステムによる半分取用通常相ＨＰＬＣによってペンタ
マーリッチの画分をさらに精製した。分離はＳｕｐｅｌｃｏ５ Ｓｕｐｅｌｇｕ
ａｒｄ ＬＣ−Ｓｉガードカラム（２０×４．６ｍｍ）と連結したＳｕｐｅｌｃ
ｏ ５ｍ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ、１００Ａカラム（２５０×１０
ｍｍ）で行った。プロシアニジンは以下の条件：（時間，％Ａ，％Ｂ）；（０，
８２，１４）、（３０，６７．６，２８．４）、（６０，４６，５０）、（６５
，１０，８６）、（７０，１０，８６）下の直線勾配によって溶出させ、続いて
１０分間再平衡化させた。移動相の組成はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノール
であって、Ｃ＝酢酸：水（１：１）であった。３ｍｌ／分の流速を用いた。成分
は、２５４ｎｍにおけるＵＶによって検出し、Ｋｉｐｐ＆Ｚｏｎａｎ ＢＤ４１
レコーダーで記録した。注射用量は、０．２５ｍｌの７０％水性アセトンに溶出
させた１０ｍｇのプロシアニジン抽出物の１００ないし２５０μｌの範囲であっ
た。個々のピークまたは選択クロマトグラフィー領域は適時の間隔またはさらな
る精製および引き続いての評価のための分画収集によって手動で収集した。

【０１４８】 ＨＰＬＣ条件： ２５０×１００ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉ ｌ ＬＣ−Ｓｉ （５μｍ）半分取用カラム ２０×４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ （５μｍ）ガードカラム ディテクター： ウォーターズ ＬＣ 分光高度計モデル４８０（２５４ｎｍにて） 流速：３ｍｌ／分 カラム温度：雰囲気 ペンタマーリッチの抽出物２５０μｌ

【表９】 方法Ｂ． 逆相分離 実施例１５におけるごとく得られたプロシアニジン抽出物を０．４５μで ナイロンフィルターを通して濾過し、ダイオードアレイディテクターおよびＨＰ
モデル１０４６Ａプログラマブル蛍光ディテクターを装備したＨｅｗｌｅｔｔ
Ｐａｃｋａｒｄ １０９０三元相ＨＰＬＣシステムによって分析した。分離はＨ
ｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２０
０×２．１ｍｍ）上で４５℃にて行った。６０％ＢからＡへの直線勾配でプロシ
アニジンを溶出させ、続いて０．３ｍｌ／分の流速にてＢでカラムを洗浄した。
移動相の組成はメタノール中のＢ＝０．５酢酸およびＡ＝ナノ純粋水中の０．５
％酢酸の脱ガス混合物であった。ＡおよびＢ移動相における酢酸レベルは２％ま
で増大できる。成分は、λ_ｅｘ＝２７６ｎｍであってλ_ｅｍ＝３１６ｎｍである
蛍光、および２８０ｎｍにおけるＵＶによって検出した。（＋）−カテキンおよ
び（−）−エピカテキンの濃度を参照標準溶液に対して測定した。プロシアニジ
ンレベルは（−）エピカテキンについての応答因子を用いることによって評価し
た。

【０１４９】 方法Ｃ．通常相分離 実施例１５におけるごとくに得られたペンタマーリッチの抽出物を９．４ ５μナイロンフィルターを通して濾過し、ＨＰモデル１０４６Ａでプログラマブ
ル蛍光ディテクターおよびダイオードアレイディテクターを装備したＨｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０９０シリーズＩＩ ＨＰＬＣシステムによって分析
した。分離は、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ ５μガー
ドカラム（２０×４．６ｍｍ）と連結した５μ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｐｈｅｒｅ゜シリカ１００カラム（２５０×３．２ｍｍ）上で３７℃に
て行った。プロシアニジンは以下の条件：（時間，％Ａ，％Ｂ）；（０，８２，
１４）、（３０，６７．６，２８．４）、（６０，４６，５０）、（６５，１０
，８６）、（７０，１０，８６）下の直線勾配によって溶出させ、続いて８分間
再平衡化させた。移動相の組成はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノールであって
、Ｃ＝１：１の容量比の酢酸：水であった。０．５ｍｌ／分の流速を用いた。成
分は、λ_ｅｘ＝２７６ｎｍであってλ_ｅｍ＝３１６ｎｍである蛍光、および２８
０ｎｍにおけるＵＶによって検出した。種々のプロシアニジンの分離を示す代表
的なＨＰＬＣクロマトグラムを１つの遺伝子型につき図４に示す。同様のＨＰＬ
Ｃプロフィールが他のＴｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｈｅｒｒａｎｉａおよび／またはそ
の特異的交雑間または内から得られた。

【０１５０】 ＨＰＬＣ条件： ２５０×３．２ｍｍ ｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ゜シ リカ１００ カラム（５μ） ２０×４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ （５μ） ガードカラム ディテクター： フォトダイオードアレイ（２８０ｎｍに て） 蛍光λ_ｅｘ＝２７６ｎｍであってλ_ｅｍ＝３１６ｎｍ 流速：９−５／分 カラム温度：３７℃ 酢酸：

【表１０】 方法Ｄ．分取用通常相分離 実施例５におけるごとくに得られたペンタマーリッチの画分をＲｉｇｕａｄら （Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ６５４：２５５−２６０（１９９３））の方法を変更す
ることによって分取用通常相クロマトグラフィーによってさらに精製した。分離
は、適当なガードカラム付きの５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ１００
Ａカラム（５０×２ｃｍ）で雰囲気温度にて行った。プロシアニジンは以下の条
件：（時間，％Ａ，％Ｂ，流速）；（０，９２．５，７．５，１０）；（１０，
９２．５，７．５，４０）；（３０，９１．５，１８．５，４０）；（１４５，
８８，２２，４０）；（１５０，２４，８６，４０）；（１５５、２４，８６，
５０）；（１８０，０，１００，５０）下の直線勾配によって溶出させた。使用
に先立って、以下のプロトコルによって移動相成分を混合した： 溶媒Ａ調製（８２％ＣＨ_２Ｃｌ_２ １４％メタノール、２％酢酸、２％水） ： １．水８０ｍｌを測定し、４Ｌボトルに分注する。

【０１５１】 ２．水８０ｍｌを測定し、同一４Ｌボトルに分注する。

【０１５２】 ３．メタノール５６０ｍｌを測定し、同一４Ｌボトルに分注する。

【０１５３】 ４．塩化メチレン３２８０ｍｌを測定し、同一４Ｌボトルに分注する。

【０１５４】 ５．該ボトルに蓋をし、よく混合する。

【０１５５】 ６．高純度のヘリウムで混合物を５−１０分間パージして脱気する。

【０１５６】 工程１ないし６を２回反復して８容量の溶媒Ａを得る。

【０１５７】 溶媒Ｂ調製（９６％メタノール、２％酢酸、２％水）： １．水８０ｍｌを測定し、４Ｌボトルに分注する。

【０１５８】 ２．酢酸８０ｍｌを測定し、同一４Ｌボトルに分注する。

【０１５９】 ３．メタノール３８４０ｍｌを測定し、同一４Ｌボトルに分注する。

【０１６０】 ４．該ボトルに蓋をし、よく混合する。

【０１６１】 ５．高純度のヘリウムで混合物を５−１０分間パージして脱気する。

【０１６２】 工程１ないし５を反復して４容量の溶媒Ｂを得る。移動相の組成はＡ＝２％ 酢酸および２％水を含む塩化メチレンであり；Ｂ＝２％酢酸および２％水を含む
メタノールである。カラム負荷は７ｍｌ中０．７ｍｇであった。成分は２５４ｎ
ｍにおけるＵＶによって検出した。カカオプロシアニジンの典型的な分取用通常
相ＨＰＬＣ分離を図５に示す。

【０１６３】 ＨＰＬＣ条件： カラム：雰囲気温度における５０×２ｃｍ ５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉラン 移動相：Ａ＝２％酢酸および２％水を含む塩化メチレン Ｂ＝２％酢酸および２％水を含むメタノール

【表１１】 実施例１６ オリゴマー画分の精製 方法Ａ． 半分取用逆相ＨＰＬＣによる精製 実施例１５、方法ＡおよびＢおよびＤから得られたプロシアニジンをさら に分離して実験量のオリゴマ−を得た。可変波長ディテクターを装備したＨｅｗ
ｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０５０ＨＰＬＣシステム、１ｍｌの注射ループを
持つＲｈｅｏｄｙｎｅ７０１０注射バルブをＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｒａｃ−１
００フラクションコレクターとで組み立てた。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ
１０μ ＯＤＳ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ（６０×１０ｍｍ）ガードカラムと連結し
たＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ １０μ ＯＤＳカラム（２５０
×２２．５ｍｍ）で行った。移動相の組成は、５ｍｌ／分の流速での以下の直線
勾配条件：（時間、％Ａ）；（０，８５）、（６０，５０）、（９０，０）およ
び（１１０，０）下で用いたＡ＝水；Ｂ＝メタノールであった。個々のピークま
たは選択クロマトグラフィー領域は適時の間隔にてまたはＭＡＤＬＹ−５Ｆ／Ｍ
ＳおよびＮＫｒによるさらなる評価のための画分収集により手動で収集した。注
射負荷は材料の２５ないし１００ｍｇの範囲であった。代表的な溶出プロフィー
ルを図６Ａに示す。

【０１６４】 方法Ｂ． 修飾された半分取用ＨＰＬＣ 実施例１５、方法ＡとＢとＤから得られたプロシアニジンをさらに分離し て、実験量の同様のオリゴマーまたはさらなる構造の同定および解明を得た（例
えば、実施例１５、１８、１９および２０）。Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓ
ｉ ５μ（２０×２ｍｍ）ガードカラム付きのＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓ
ｉ ５μ（２５０×１０ｍｍ）。分離は雰囲気温度によって３．０ｍｌ／分にて
行った。移動相の組成、以下の勾配条件：（時間，％Ａ，％Ｂ）；（０，８２，
１４）、（２２，７４，２１）、（６０，７４，２１）；（６０，７４，５０．
４）；（６１，８２，１４）下で使用するＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノール
；およびＣ＝酢酸：水（１：１）であり、続いて７分間カラムの再平衡化を行っ
た。注射用量は１２ｍｇのリッチとなったペンタマーを含有する６０μｌであっ
た。成分は２８０ｎｍにおけるＵＶによって検出した。代表的な溶出プロフィー
ルを図６Ｂに示す。

【０１６５】 実施例１７ 酸化窒素シンターゼ活性の評価 使用した培地は低血清成長補足物（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）および２０％胎児ウシ血清（ＤＡＰ）を補足した培地２００（Ｃａｓ
ｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）であった。

【０１６６】 評価したココアプロシアニジンはエピカテキンモノマー、ダイマー、テトラ マー、ペンタマーおよびヘプタマーであった。ココアプロシアニジンの亜硝酸塩
含有量を評価した。使用した最大濃度（１００μｇ／ｍｌ）において、亜硝酸塩
は検出されなかった。

【０１６７】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＣａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．（ポートランド）から一次培養段階において購入した。細胞を、７５
ｃｍ^２フラスコ中の低血清成長補足物（ＬＳＧＳ）および２０％胎児ウシ血清（
ＦＣＳ）を補足した培地中で培養した。細胞を５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃におけ
るトリプシン−ＥＤＴＡ（２ｍｌ／フラスコ）での処理に続いて１週間接種した
。トリプシンを３ｍｌのＦＣＳの添加に際して中和した。

【０１６８】 細胞懸濁液を１２００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、細胞ペレットを前記 した培養培地に再懸濁した。

【０１６９】 培養培地中の亜硝酸塩濃度を測定することによって酸化窒素シンターゼ活性 を評価した。継代２ないし１３の間のＨＵＶＥＣを使用した。ＬＣＧＳ（ウェル
当たり３００μｌ）および２０％ＣＳを含有する培地２００中にて５×１０^５細
胞にて細胞を２４−ウェル培地プレートで培養した。５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃
での２４時間ないし４８時間のインキュベーション期間の後、密集した細胞（２
．５×１０^４細胞）を用いた。培地を取り出し、新鮮なものを添加した。

【０１７０】 ココアプロシアニジンモノマーおよびオリゴマーを１００μｇ／ｍｌ、１０ μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ（最終濃度）にて培養培地に添加した。対照はプ
ロシアニジンなくして培養した細胞よりなるものであった。参照化合物はアセチ
ルコリン、イオノマイシン（カルシウムエントリーを介するＮＯシンターゼ刺激
物）、リポ多糖（ＮＯシンターゼインデューサー）、酢酸Ｎ−メチルＬ−アルギ
ニン（ＮＯシンターゼの阻害剤）を含んだ。内皮細胞ＮＯ合成からの亜硝酸塩生
産を証明するために参照化合物を用いた。

【０１７１】 ＧＲＹＳＳ反応に従って培養上清中の亜硝酸塩（ＮＯ_２）濃度の測定によっ てＮＯ生産を評価した。略言すると、室温にて、２分間、５０μｌの条件培地を
１５０μｌのＧＲＹＳＳ試薬（３０％酢酸中の１％スルファニルアミド／６０％
酢酸中の０．１％Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアニン二塩酸塩）と共にイ
ンキュベートした。５４０ｎｍにおける吸光度をＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ ＭＣＣ
／３４０マルチスキャンで測定した。亜硝酸塩濃度を標準としての亜硝酸ナトリ
ウムを用いることによって測定しΔＳＯＦＴ ２．１２ ＳＯＦＴＷＡＲＥを用
いて分析した。無細胞培地および１００μｇ／ｍｌのプロシアニジンは検出可能
な亜硝酸塩を含有しなかった。

【０１７２】

【表１２】 未刺激ＨＵＶＥＣは４８時間のインキュベーション期間にわたって２．６±０
．３μＭ ＮＯを生じた。１０μＭにおけるアセチルコリンはＨＵＶＥＣによる
酸化窒素生産を誘導するのに効果的でなかった。対照的に、イオノマイシン（１
μＭ）およびリポ多糖（１００ｎｇ／ｍｌ）は酸化窒素の顕著な生産を誘導した
。ＨＵＶＥＣによる酸化窒素のこの生産は、ＮメチルＬ−アルギニンをインキュ
ベーション培地に添加するとブロックされた。

【０１７３】 ココアプロシアニジンのダイマー、ペンタマーおよびヘキサマーはＨＵＶＥＣ からのＮＯの用量依存的生産を誘導した。最大生産はテストした最高濃度、すな
わち、１００μｇ／ｍｌで観察された。また、プロシアニジンのモノマー、トリ
マーおよびテトラマーは１００μｇ／ｍｌ濃度においてのみ顕著な生産を誘導し
た。使用した最高濃度を考慮すると、種々のプロシアニジンの能力は以下のとお
りｄｅある：ダイマー＞トリマー＞ヘプタマー＝ペンタマー＝テトラマー＞モノ
マーである。

【０１７４】 実施例１８ モルモットにおける酸化窒素依存的高血圧 モルモット（ほぼ４００ｇの体重、雄および雌）を４０ｍｇ／ｋｇペント バルビタールナトリウムの注射により麻酔した。Ｇｏｕｌｄ圧力変換器（モデル
Ｐ５００）を介して動脈血圧をモニターするために頸動脈にカニューレを入れた
。１、３、１０および２５ｍｇ／ｋｇｎｏ濃度において６つのココアプロシアニ
ジンの各々を頸静脈を通じて静脈内注射した。血圧の変化をポリグラフに記録し
た。

【０１７５】 予備的実験（２匹の動物）において、１００ｍｇ／ｋｇの用量を用いることが できないと判断された。ＤＭＳＯを含有するビヒクルは平均動脈血圧に対して直
接的効果を有したからである。ココアプロシアニジンの２５ｍｇ／ｋｇの用量を
用いた場合（１５±５％）、ＤＭＳＯを含有するビヒクルの顕著な効果は観察さ
れなかった。

【０１７６】 麻酔したモルモットの動脈血圧に対する１，３，１０または２５ｍｇ／ｋｇ ココアプロシアニジンの投与の効果を調べた。静脈内注射に際し、プロシアニジ
ンモノマーおよびダイマーは約２０％の血圧の減少を誘導した、すなわち、溶媒
単独の注射とは顕著には異ならない（１５±５％、ｎ＝５）。対照的に、ココア
プロシアニジンのトリマー、ペンタマーおよびヘキサマー（１０ｍｇ／ｋｇ）は
動脈血圧の顕著な減少、すなわち、ココアプロシアニジン、テトラマーおよびヘ
キサマーについての６２−８５％まで誘導した。使用した最高用量を考慮すると
種々のカカオプロシアニジンの能力のランクは以下のとおりであった：ヘキサマ
ー＝テトラマ−＞ペンタマー＞トリマー。

【０１７７】

【表１３】 イン・ビトロおよびイン・ビボの結果の比較はココアプロシアニジンについ ての能力の以下のランクを示す： ＮＯ生産（１００μｇ／ｍｌ）：ダイマー＞トリマー＞ヘキサマー＝ペンタ マー＝テトラマー＞モノマー ＮＯ生産（１０μｇ／ｍｌ）：ペンタマー、テトラマーおよびダイマー（貧 弱な誘導） 低血圧：ヘキサマー＝テトラマー＞ペンタマー＞トリマー＞ダイマー＝モノマ ー ダイマーを除き、低用量でＮＯ生産を誘導するヘプタマーおよびテトラマー は動脈血圧の降下を誘導するのに最も効果的であった。これらの結果は、カカオ
プロシアニジンがイン・ビボに関したイン・ビトロＮＯ生産を誘導できることを
示唆する。

【０１７８】 実施例１９ ニュージーランドホワイトウサギからの大動脈環を２０ｍｌ器官浴中にセット した。単一用量（１０^−５Ｍ）のココアプロシアニジンおよびアセチルコリン（
Ａｃｈ）に対する内皮細胞依存性緩和（ＥＤＲ）は、ココアプロシアニジンノル
エピネフィン（ＮＥ）（１０^−５Ｍ）で予備収縮させた平行環で示された。テス
トしたココアプロシアニジンはモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペ
ンタマー、ヘキサマーであった。これらのうち、ペンタマー、ヘキサマーおよび
ヘプタマーのみが血管緩和活性を示した。テストした２つのココアプロシアニジ
ン混合物のうち、ペンタマーないしデカマーを含有するもの（ｃｏｍｂｏ２）の
みが有意なＥＤＲを示し、他方モノマーないしテトラマーを含有する他の混合物
（ｃｏｍｂｏ１）は血管トーンに対して効果を有しなかった。

【０１７９】 次いで、ｃｏｍｂｏ２およびペンタマーを共に使用して用量依存性血管緩和 （１０^−８ないし１０^−５Ｍ）を示した。これらのココアプロシアニジン（１０ ^−５ Ｍ）と共に環を３０秒間インキュベートし、Ａｃｈおよびココアプロシアニ
ジン（１０^−７ないし１０^−４）で再度テストした。これらのココアプロシアニ
ジンと一緒での組織のインキュベーションは、ココアプロシアニジンおよびＡｃ
ｈ双方によって急性的に誘導されたＥＤＲを減少させた。Ａｃｈプレインキュベ
ーションに対する最大緩和、４９±５％；ポストペンタマーインキュベーション
、２±１．４％；ポストｃｏｍｂｏ２インキュベーション０．８±０．８％：ペ
ンタマープレインキュベーションまで、４６．５±４．５％；ポストインキュベ
ーション６．８±３．２％ｃｏｍｂｏ２でプレインキュベーションまで、５４．
３±７％；ポストインキュベーション、１．７±１．１％、ｎ＝５）。

【０１８０】 両ココアプロシアニジンとのインキュベーションの効果すなわち、ＥＤＲの排 除は、Ｌ−アルギニン（１０^−４Ｍ）と共に３０秒間インキュベートすることに
よって部分的に回復した（最大緩和、Ｈｃｈまで：ポストＬ−アルギニン、２１
．５±６％；ポストｃｏｍｂｏ２，ポストＬ−アルギニン、１３．７±２．６％
：ペンタマーまで：ポストペンタマーインキュベーション、ポストＬ−アルギニ
ン、１８．３±５．８％：ｃｏｍｂｏ２まで：ポストｃｏｍｂｏ２インキュベー
ション、ポストＬ−アルギニン５．５±２．８％、ｎ＝５）。結果は、ＮＯシン
ターゼについての基質の枯渇はこの効果を説明し得る。

【０１８１】 前記結果を表６ないし９に示す。

【０１８２】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】 前記知見は、トリマー上のココアプロシアニジンのみが血管緩和を引き起こ すことができ、ココアプロシアニジンは抗酸化剤活性に関連しないような血管ト
ーンに対する区別される効果を有することを示す。

【０１８３】 当業者に自明な他の変形および修飾は本発明の範囲および表示内のものであ る。以下の請求の範囲に記載されたのを除き本発明は制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 1/305 Ａ２３Ｌ 1/305 1/36 1/36 2/52 2/38 Ｃ 2/38 2/00 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ロマンツィーク，レオ ジェイ ジュニア アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07840 ハケッツタウン ファーン ドラ イヴ ４ Ｆターム(参考） 2B150 AA01 AA06 AB03 AB04 DA09 DA47 DD31 4B014 GB01 GL03 GL09 4B017 LC03 LK06 LK14 4B018 MD08 MD19 ME04 ME08 4B036 LC06 LH14 LH28

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 食品を消化した後哺乳動物において酸化窒素生産の生理学的
   増加を誘導するのに効果的な組合せ量の少なくとも１つのプロシアニジンおよび
   Ｌ−アルギニンを含む食品。
2. 【請求項２】 （Ｉ）ココアプロシアニジン、ナッツプロシアニジンまたは
   その混合物を含み、ここで、プロシアニジンの量は食品１００ｇ当たり少なくと
   も約３００ｍｇであって、Ｌ−アルギニンの量は食品１００ｇ当たり少なくとも
   約１．２ｇである食品。
3. 【請求項３】 前記Ｌ−アルギニンが食品１００ｇ当たり少なくとも約１．
   ６ｇであることを特徴とする請求項２記載の食品。
4. 【請求項４】 前記プロシアニジンが前記ココアプロシアニジンであること
   を特徴とする請求項２記載の食品。
5. 【請求項５】 前記プロシアニジンが前記ココアプロシアニジンおよび前記
   ナッツプロシアニジンであることを特徴とする請求項２記載の食品。
6. 【請求項６】 前記プロシアニジンが前記ナッツプロシアニジンであること
   を特徴とする請求項２記載の食品。
7. 【請求項７】 前記Ｌ−アルギニンがナッツ、豆類、種子およびゼラチンよ
   りなる群から選択される少なくとも１つの食品成分によって提供されることを特
   徴とする請求項１、２、４、５または６記載の食品。
8. 【請求項８】 前記Ｌ−アルギニン含有成分が肉身、殻、ペースト、または
   ナッツからの粉、豆類または種子であることを特徴とする請求項７記載の食品。
9. 【請求項９】 前記ナッツが、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、ハシバミ
   、ペカン、カシューおよびマカデミアナッツよりなる群より選択され、前記豆類
   が大豆であり、前記種子がヒマワリ種子、ゴマ種子、アマ種子、カボチャ種子よ
   りなる群より選択されることを特徴とする請求項８記載の食品。
10. 【請求項１０】 前記ココアプロシアニジンが少なくとも１つのココア成分
    によって供されることを特徴とする請求項４または５記載の食品。
11. 【請求項１１】 前記カカオ成分が焼いたカカオ中身またはその画分、チョ
    コレートリッカー、部分的に脱脂されたココア固形物、十分に脱脂されたココア
    固形物、またはその混合物であることを特徴とする請求項１０記載の食品。
12. 【請求項１２】 前記食品が菓子、香辛料、焼き製品、穀物ベースのバー、
    ミール置換バー、飲料ミックス、飲料またはペットフードであることを特徴とす
    る請求項１、２、４、５または６記載の食品。
13. 【請求項１３】 前記ココアプロシアニジンがココアエキスによって提供さ
    れることを特徴とする請求項１、２、４または５記載の食品。
14. 【請求項１４】 前記ココアエキスが食品１００ｇ当たり少なくとも２５ｍ
    ｇの量で存在することを特徴とする請求項１３記載の食品。
15. 【請求項１５】 前記食品が非チョコレート食品であることを特徴とする請
    求項１２記載の食品。
16. 【請求項１６】 前記非チョコレート食品がピーナッツベースの食品である
    ことを特徴とする請求項１５記載の食品。
17. 【請求項１７】 前記食品がチョコレート食品であることを特徴とする請求
    項１３記載の食品。
18. 【請求項１８】 前記チョコレート食品がチョコレート菓子であることを特
    徴とする請求項１７記載の食品。
19. 【請求項１９】 前記チョコレート菓子がダークチョコレートを含むことを
    特徴とする請求項１７記載の食品。
20. 【請求項２０】 前記チョコレート菓子がミルクチョコレートを含むことを
    特徴とする請求項１７記載の食品。
21. 【請求項２１】 前記食品が殻、粉砕ナッツ殻またはその混合物を含有する
    ことを特徴とする請求項１２記載の食品。
22. 【請求項２２】 ココアおよびナッツプロシアニジン、Ｌ−アルギニンおよ
    び医薬上許容される担体を含み、該プロシアニジンおよびＬ−アルギニンが当該
    組成物を摂取した後に哺乳動物で心血管利益を供するのに効果的な組合せ量で添
    加される医薬組成物。
23. 【請求項２３】 ココアおよびナッツプロシアニジン、Ｌ−アルギニンお
    よび医薬上許容される担体を含み、該プロシアニジンおよびＬ−アルギニンが当
    該組成物を摂取した後に哺乳動物で酸化窒素変調剤として作用するのに効果的な
    組合せ量で添加される医薬組成物。
24. 【請求項２４】 前記プロシアニジンが単位用量当たり１０ｍｇないし約５
    ｇの間の量で存在し、ここで、Ｌ−アルギニンが単位用量当たり約１００ｍｇな
    いし約３０ｇの量で存在することを特徴とする請求項２２または２３記載の組成
    物。
25. 【請求項２５】 前記プロシアニジンが２５ｍｇないし３ｇであり、Ｌ−ア
    ルギニンが０．５ｇないし１０ｇであることを特徴とする請求項２４記載の組成
    物。
26. 【請求項２６】 前記ココアプロシアニジンがペンタマーないしノナマーで
    あることを特徴とする請求項２２または２３記載の組成物。
27. 【請求項２７】 前記プロシアニジンおよび／またはＬ−アルギニンが合成
    されたものであることを特徴とする請求項１記載の食品または請求項２３記載の
    医薬組成物。
28. 【請求項２８】 酸化窒素生産を増加させるのに効果的な組合せ量の少なく
    とも１つのプロシアニジンおよびＬ−アルギニンを含む食品を哺乳動物に供給す
    ることを特徴とする哺乳動物において酸化窒素生産を増加させる方法。
29. 【請求項２９】 前記プロシアニジンがカカオプロシアニジン、ナッツプロ
    シアニジンまたはその混合物であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記プロシアニジンの量が食品１００ｇ当たり少なくとも
    約３００ｍｇであって、Ｌ−アルギニンの量が食品１００ｇ当たり少なくとも約
    １．２ｇであることを特徴とする請求項２８記載の方法。