DE69937105T3 - Produkte enthaltend polyphenol(e) und l-arginin zur stimulierung der stickstoffoxidproduktion - Google Patents

Produkte enthaltend polyphenol(e) und l-arginin zur stimulierung der stickstoffoxidproduktion Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Produkte, die Polyphenole und L-Arginin enthalten, welche eine günstige Auswirkung auf die Gesundheit von Säugern zeigen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Polyphenolische Verbindungen stellen bioaktive Substanzen dar, die von pflanzlichen Materialien abgeleitet sind und die in enger Beziehung zu der sensorischen und nutritionellen Qualität von Produkten stehen, die diese enthalten.
  • Proanthocyanidine stellen eine Klasse von polyphenolischen Verbindungen dar, die in mehreren Pflanzenarten zu finden ist. Es handelt sich um Oligomere von Flavan-3-ol-Monomereinheiten, die am häufigsten entweder von 4→6 oder 4→8 verknüpft sind. Die verbreitetsten Klassen sind die Procyanidine, die Ketten von Catechin, Epicatechin und ihren Gallsäureestern sind, und die Prodelphinidine, die aus Gallocatechin, Epigallocatechin und ihren Gallsäureestern als den Monomereinheiten bestehen. Strukturelle Variationen bei den Proanthocyanidin-Oligomeren können mit der Bildung einer zweiten Interflavanoid-Bindung durch C-O-oxidative Kopplung zur Bildung von Oligomeren vom A-Typ ebenfalls vorkommen. Aufgrund der Komplexität dieser Umwandlung sind Proanthocyanidine vom A-Typ im Vergleich zu den Oligomeren vom B-Typ in der Natur weniger häufig anzutreffen.
  • Der Begriff ”Kakaopolyphenole” umfasst polyphenolische Produkte, einschließlich Proanthocyanidine, spezieller gesagt Procyanidine, die aus Kakaobohnen und deren Derivaten extrahiert sind. Spezifischer umfasst der Begriff ”Kakaopolyphenol” Monomere der Formel An (worin n 1 ist) oder Oligomere der Formel An (worin n eine ganze Zahl von 2 bis 18, und höher, ist), worin A die folgende Formel aufweist:
    Figure 00020001
    worin R 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-Saccharid, 3-(β)-O-Saccharid, 3-(α)-O-C(O)-R1 oder 3-(β)-OC(O)-R1 ist;
    die Bindung zwischen benachbarten Monomeren an Positionen 4, 6 oder 8 stattfindet;
    eine Bindung an ein Monomer an Position 4 eine Alpha- oder Beta-Stereochemie aufweist;
    X, Y und Z ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus A, Wasserstoff und einer Saccharid-Komponente, unter der Voraussetzung, dass bezüglich wenigstens eines terminalen Monomers, die Bindung des benachbarten Monomers daran an Position 4 ist, und optional Y = Z = Wasserstoff sind;
    und worin die Saccharid-Komponente eine Mono- oder Disaccharid-Komponente ist und wahlweise mit einer Phenolkomponente substituiert sein kann und R1 eine Aryl- oder Heteroaryl-Komponente sein kann, die wahlweise mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituiert ist, und
    Salze, Derivate oder Oxidationsprodukte davon.
  • Vorzugsweise ist die Saccharid-Komponente abgeleitet von der Gruppe, bestehend aus Glucose, Galactose, Xylose, Rhamnose und Arabinose. Die Saccharid-Komponente und jegliche oder alle von R, X, Y und Z können wahlweise an jeglicher Position mit einer Phenol-Komponente über eine Esterbindung substituiert sein. Die Phenol-Komponente ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Caffein-, Cinnamin-, Coumarin-, Ferulin-, Gall-, Hydroxybenzoe- und Sinapinsäuren.
  • Proanthocyanidine haben aufgrund des schnell wachsenden Gesamtumfangs der Nachweise, der diese Verbindungen mit einem breiten Bereich von potenziellen gesundheitlichen Nutzen in Verbindung bringt, zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Teecatechine sind vor kurzem mit einer potenten Antioxidans-Aktivität und mit einer Verminderung der Tumormultiplizität in Labormäusen in Verbindung gebracht worden (Lunder, 1992; Wang et al., 1992; Chung et al., 1992). Außerdem ist von Proanthocyanidinen in Traubenkernextrakten gezeigt worden, dass sie eine Kapazität als Fänger von freien Radikalen aufweisen und die Anfälligkeit gesunder Zellen für toxische und karzinogene Agenzien herabsetzen (Bagchi et al., 1997; Waterhouse und Walzem, 1997; Joshi et al., 1998). Polyphenole in Traubensaft und Rotwein sind mit einem potenziellen kardiovaskulären Nutzen assoziiert worden, einschließlich der Verminderung der Blutplättchen-Aggregration, einer Modulation der Eicosanoid-Synthese und der Hemmung der Oxidation von Low-Density-Lipoproteinen (Waterhouse und Walzem, 1997; Schramm et al., 1998; Frankel et al., 1995). Vor kurzem ist vorgeschlagen worden, dass jeglicher potenzielle Nutzen für die Gesundheit, der diesen Verbindungen zugeschrieben wird, durch den Grad der Polymerisation beeinflusst sein kann (Saito et al., 1998).
  • Viele Pflanzenpolyphenole weisen eine Antioxidans-Aktivität auf und zeigen eine hemmende Wirkung auf die Mutagenese und Karzinogenese. Zum Beispiel beschreiben US-Patent Nr. 5.554.645 und US-Patent Nr. 5.712.305 Kakaopolyphenol-Extrakte, insbesondere Procyandine, von denen gezeigt worden ist, dass sie einen signifikanten biologischen Nutzen besitzen. Die internationale Veröffentlichung WO 97/36497 (veröffentlicht am 24. Dezember 1997) beschreibt, dass diese Extrakte auch dahingehend wirken, eine periodontale Erkrankung, Arteriosklerose und Hypertension zu vermindern; eine LDL-Oxidation und DNA-Topoisomerase II zu hemmen; die Cyclooxygenase, Lipoxygenase, Stickstoffoxid oder NO-Synthase, Apoptose und Blutplättchen-Aggregation zu modulieren; und eine entzündungshemmende, Antigingivitis- und Antiperiodontis-Aktivität aufweisen. Darüber hinaus beschreibt WO 97/36497 , dass Polyphenol-Oligomere 5–12 eine erhöhte Antikrebs-Aktivität im Vergleich zu den anderen, aus Kakao isolierten polyphenolischen Verbindungen besitzen. Somit kann der Konsum dieser höheren Oligomere in Kakaoprodukten einen signifikanten gesundheitlichen Nutzen bieten.
  • Wie zuvor angemerkt, ist die Verwendung von Kakaoextrakten oder davon abgeleiteten Polyphenolen als NO- oder NO-Synthase-Modulatoren in der internationalen Veröffentlichung WO 97/36497 beschrieben. Von Stickstoffoxid ist gezeigt worden, dass es eine Rolle bei vielen signifikanten biologischen Prozessen spielt, wie etwa der Neurotransmission, Blutgerinnung, Blutdruckkontrolle, Regulation der Serumlipidmengen, kardiovaskulären Erkrankung, zerebralen Zirkulation (vaskuläre Kopfschmerzen), sowie eine Rolle im Abtötungsvermögen des Immunsystems von Tumorzellen und intrazellulären Parasiten. P. Clarkson, et al., ”Oral L-Arginine Improves Endothelium dependent Situation in Hypercholesterolemic Young Adults”, J. Clin. Invest. 97, Nr. 8: 1989–1994 (April 1996), P. L. Feldman, et al., ”The Surprising Life of Nitric Oxide”, Chem. & Eng. News, S. 26–38, (20. Dezember 1993); S. H. Snyder, et al., ”Biological Rules of Nitric Oxide”, Scientific American, S. 68–77 (Mai 1992); P. Chowienczyk et al., ”L-Arginine: No More Than A Simple Amino Acid?”, Lancet, 350: 901–30 (27. September 1997); M. A. Wheeler, et al., ”Efforts of Long Term Oral L-Arginine an The Nitric Oxide Synthase Pathway in The Urine from Patients with Interstitial Cystitis”, J. Urology 158: 2045–2050 (Dez. 1997); A. Tenenbaum, ”L-Arginine: Rediscovery in Progress”, Cardiology 90: 153–159 (1998); I. K. Mohan, et al., ”Effort of L-Arginine Nitric Oxide System an Chemical-Induced Diabetes Mellitus”, Free Radical Biology & Medicine 25, Nr. 7: 757–765 (1998); S. Klahr, ”The Role of L-Arginine in Hypertension and Nephrotoxicity”, Pharmacology and Therapeutics, S. 547–550 (1998); und R. H. Boger, et al., ”Dietary L-arginine and L-Tocopheral Reduce Vascular Oxidation Stress and Preserve Endothelial Function in some Hypocholesteralemic Rabbits via Different Mechanisms”, Arterosclerosis 141: 31–43 (1998).
  • Zum Beispiel sind gesundheitliche Nutzen durch verschiedene Nahrungsmittel vorgeschlagen worden. Erdnüsse sind als eine Quelle von Resveratrol berichtet worden, jener Verbindung, die in Trauben und Rotwein zu finden ist und die mit einer Verminderung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Zusammenhang gebracht worden ist. Eine Ernährung, die Walnüsse einbezieht, ist als in einer Senkung von Serumlipidmengen und Blutdruck resultierend befunden worden. Siehe Sabate, J. et al., ”Effects of Walnuts an Serum Lipid Levels and Blood Pressure in Normal Men”, New England J. Med. 328: 603–607 (4. März 1993). Es ist ebenfalls vorgeschlagen worden, dass der häufige Verzehr von Nüssen einen Schutz vor koronaren Herzerkrankungen bieten kann. Siehe Sabate, J. et al., ”Nuts: A New Protective Food Against Coronary Heart Disease”, Lipidology 5: 11–16 (1994). Ohne durch irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, umfasst ein postulierter Wirkmechanismus, unter anderem, das Vorhandensein von relativ hohen Mengen an Arginin in Nüssen, was zur Produktion von Stickstoffoxid führt und damit eine Entspannung der glatten Gefäßmuskulatur bewirkt. Es wird angenommen, dass L-Arginin ein Substrat für die Produktion von Stickstoffoxid über die Stickstoffoxid-Synthase darstellt.
  • JP 60049751 A2 (CAPLUS an STN, AN 1985: 503673) beschreibt eine Zusammensetzung, umfassend eine Aminosäure, wie etwa Arginin, oder ein Peptid, und einen Geschmacksstoff, ausgewählt aus Kakao und Kaffee. Diese Zusammensetzung ist für mangelernährte Patienten geeignet. RO 76074B (CAPLUS an STN, AN 1983: 493753) beschreibt eine ”energiespendende Arzneimittel”-Formulierung, die verschiedene Mineralien und Mikronährstoffe, einschließlich Arginin, und Schokolade umfasst. Die Formulierung ist zur Erhöhung der Energieniveaus, zum Beispiel während des Sports, vorgesehen.
  • Demgemäß wären Produkte, wie etwa Konfekt und kakaohaltige Produkte (Kakaopulver, Schokoladenliköre oder Extrakte davon) mit einer hohen Kakaopolyphenol-Konzentration, insbesondere einer hohen Konzentration an Kakaopolyphenol-Oligomeren 5–12, wünschenswert. Es wäre ebenfalls in hohem Maße erwünscht, Produkte bereitzustellen, die wirksame Mengen an beiden Polyphenolen, insbesondere dem/n Kakaoprocyanidin(en), und L-Arginin enthalten, um die Produktion von Stickstoffoxid zu stimulieren und den daraus erhaltenbaren gesundheitlichen Nutzen hervorzurufen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft neuartige Nahrungsmittelprodukte, die wenigstens ein oligomeres Procyanidin (Kakao- und/oder Nuss-Procyanidin) und L-Arginin in einer kombinierten Menge umfassen, die darin wirksam ist, einen physiologischen Anstieg der Stickstoffoxid-Produktion in einem Säuger nach Aufnahme des Nahrungsmittelprodukts hervorzurufen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Nahrungsmittelprodukt bereit, umfassend:
    • (i) Ein oligomeres Procyanidin der Formel An, worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 ist und A die folgende Formel aufweist:
      Figure 00060001
      worin R 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-Saccharid, 3-(β)-O-Saccharid, 3-(α)-O-C(O)-R1 oder 3-(β)-OC(O)-R1 ist; die Bindung zwischen benachbarten Monomeren an Positionen 4, 6 oder 8 stattfindet; eine Bindung an ein Monomer an Position 4 eine Alpha- oder Beta-Stereochemie aufweist; X, Y und Z ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus A, Wasserstoff und einer Saccharid-Komponente, unter der Voraussetzung, dass bezüglich wenigstens eines terminalen Monomers, die Bindung des benachbarten Monomers daran an Position 4 ist, und optional Y = Z = Wasserstoff sind; und worin die Saccharid-Komponente eine Mono- oder Disaccharid-Komponente ist und wahlweise mit einer Phenolkomponente substituiert sein kann und R1 eine Aryl- oder Heteroaryl-Komponente sein kann, die wahlweise mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituiert ist, oder ein Salz, Derivat oder Oxidationsprodukt davon; und
    • (ii) L-Arginin; worin die Menge des Procyanidins wenigstens etwa 300 mg pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts beträgt und die Menge des L-Arginins wenigstens etwa 1,2 g pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts beträgt.
  • Das Procyanidin kann synthetisch oder natürlich sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden das Procyanidin und L-Arginin jeweils durch eine Procyanidin-enthaltende Komponente (z. B. Kakao und/oder Kakaopulver und/oder ein Nusshaut-Inhaltsstoff) und eine L-Arginin-enthaltende Komponente (z. B. ein Nussfleisch) bereitgestellt. Alternativ werden das Procyanidin und L-Arginin, von denen jedes natürlich oder synthetisch sein kann, dem Nahrungsmittelprodukt direkt zugegeben.
  • Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung bieten für die Säuger, die die Nahrungsmittelprodukte aufnehmen, einen gesundheitlichen Nutzen. Ein besonders vorteilhafter gesundheitlicher Nutzen ist die Senkung des Blutdrucks. Zu weiteren gesundheitlichen Nutzen können eine Verminderung einer kardiovaskulären Erkrankung, Antikrebs-Aktivität, Antioxidans-Aktivität, Behandlung einer Nierenerkrankung, erhöhte Immunfunktion und verbesserte kognitive Funktion zählen.
  • Die in den Nahrungsmittelprodukten dieser Erfindung enthaltenen Procyanidine sind Kakaoprocyanidin-Oligomere 5–12.
  • Kakaopolyphenole, die oligomere Procyanidine der Formel An, wie oben definiert, enthalten, sind in Kakaobohnen vorhanden. Sie werden durch Lösungsmittelextraktion von pulverförmigen unfermentierten Bohnen erhalten, wie beschrieben in US 5.554.645 . Sie sind auch in Schokoladenbestandteilen vorhanden, die aus Kakaobohnen hergestellt sind.
  • Zu geeigneten oligomeren Procyanidin-enthaltenden Kakaobestandteilen zählen geröstete Kakaobohnenstückchen, Schokoladenlikör, teilweise entfettete Kakaofeststoffe, fettfreie Kakaofeststoffe, aus den Kakaofeststoffen gemahlenes Kakaopulver und Gemische davon. Vorzugsweise werden die Bestandteile aus unterfermentierten Bohnen hergestellt, da diese Bohnen höhere Mengen der Procyanidine enthalten.
  • Eine besonders bevorzugte Art von Nahrungsmittelprodukt dieser Erfindung ist Konfekt, am bevorzugtesten Schokoladen. Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung können auch nicht-schokoladehaltige Nahrungsmittelprodukte sein. Zu bevorzugten nicht-schokoladehaltigen Nahrungsmittelprodukten zählen Produkte auf Nussbasis, wie etwa Erdnussbutter, Erdnusskrokant und ähnliches. Ein anderes bevorzugtes Nahrungsmittelprodukt dieser Erfindung ist ein fettarmes Nahrungsmittelprodukt, das mit entfettetem und teilweise entfettetem Nussfleisch hergestellt ist.
  • Das L-Arginin kann von jeglicher verfügbaren Arginin-Quelle stammen, z. B. Arachis hypogaea (Erdnüsse), Juglans regia (Walnüsse), Prunus amygdalus (Mandeln), Corylus avellana (Haselnüsse), Glycine max (Sojabohnen) und ähnliches. Ebenfalls nützlich sind Carya illinoensis (Pekannüsse), Amacardium occidentale (Cashewnüsse) und Macadamia integrifolia, M. tetraphylla (Makadamianüsse). Es ist bekannt, dass der L-Arginin-Gehalt von Nüssen entsprechend der Reife der Nüsse variieren kann, wobei außerdem bestimmte Züchtungen höhere Mengen enthalten können. Verwandte Spezies jeder Gattung werden hierin ebenfalls nützlich sein. Erdnüsse weisen generell etwa 2–3 g an L-Arginin pro 100 g Nussfleisch auf. Der L-Arginin-Gehalt von Mandeln beträgt etwa 2–3 g pro 100 g, von Walnüssen etwa 2–4 g pro 100 g, von Haselnüssen etwa 1,5–2,5 g pro 100 g und von Pekannüssen und Makadamianüssen etwa 0,5–1,5 g pro 100 g. Die Nuss kann in Form von Nussstücken, Nusshaut, Nusspaste und/oder einem Nussmehl in Mengen vorhanden sein, die die gewünschte Menge an L-Arginin liefern, was in Abhängigkeit von der Nussquelle variieren wird.
  • Der L-Arginin enthaltende Inhaltsstoff kann auch ein Samen, eine Samenpaste und/oder ein Samenmehl sein. Zu geeigneten Samen zählen Helianthus annuus (Sonnenblumensamen), Sesamum indicum (Sesamsamen), Boxhornsamen, Cucurbita spp. (Kürbissamen) und ähnliches. Sonnenblumensamen, Kürbissamen und Sesamsamen enthalten jeweils etwa 1,5–3,0 g, etwa 3,5–6,0 g und etwa 2–3 g an L-Arginin pro 100 g.
  • Eine andere L-Arginin-reiche Quelle ist Gelatine, die etwa 5 g an L-Arginin pro 100 g Gelatine enthält.
  • Das Nahrungsmittelprodukt enthält mindestens 300 mg an oligomeren Procyanidinen pro 100 g Produkt und mindestens 1,2 g, bevorzugter 1,6 g an L-Arginin pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts.
  • Das Nahrungsmittelprodukt kann Procyanidine aus einer anderen Quelle als Kakao enthalten, z. B. die Polyphenole, die in den Häuten von Nüssen, wie etwa den oben beschriebenen, zu finden sind. Erdnusshäute enthalten etwa 17% Procyanidine, und Mandelhäute enthalten bis zu 30% Procyanidine. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nusshäute dem Nahrungsmittelprodukt zugegeben, z. B. dem Nougat eines Schokoladenkonfekts. Polyphenole von Früchten und Gemüsen können ebenfalls zur Verwendung hierin geeignet sein. Es ist bekannt, dass die Häute von Früchten, wie Äpfel und Orangen, als auch Traubensamen, reich an Polyphenolen sind.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Kombination aus den Procyanidinen und L-Arginin einen unerwartet gesteigerten gesundheitlichen Nutzen bietet, aufgrund der positiven Procyanidin-Modulation des NO und/oder der NO-Synthase in der Gegenwart von L-Arginin, einem Substrat für die NO-Synthase. Somit ist die Stickstoffoxid-Produktion durch die Kombination von oligomerem Procyanidin und L-Arginin erhöht, was zu einem erhöhten gesundheitlichen Nutzen durch das Stickstoffoxid führt, z. B. der Verhütung einer kardiovaskulären Erkrankung, einem gesenkten Blutdruck, einer Antikrebs-Aktivität und ähnlichem.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Der Begriff ”oligomeres Procyanidin” umfasst die in Kakaobohnen oder einem Kakaobestandteil, der in der Produktion von Schokoladenkonfekt verwendet wird, vorhandenen Procyanidine, Extrakte von Kakaobohnen oder einen Kakaobestandteil, die Procyanidine enthalten, und synthetisierte Derivate davon, und umfasst synthetisierte Kakaoprocyanidin-Verbindungen oder synthetische Gemische von Kakaoprocyanidin-Verbindungen und Derivate davon. Die Kakaobohnen können vollständig fermentiert oder unterfermentiert sein.
  • Der Begriff ”Kakaoinhaltsstoff” bezieht sich auf ein Kakaofeststoffe enthaltendes Material, das von schalenfreien Kakaobohnenstückchen abgeleitet ist und das Schokoladenlikör, teilweise oder vollständig entfettete Kakaofeststoffe (z. B. Kuchen oder Pulver, alkalisiertes Kakaopulver und alkalisierten Schokoladenlikör und ähnliches) umfasst.
  • Der Begriff ”Schokoladenlikör” bezieht sich auf die dunkelbraune Flüssigkeit ”Likör”, die durch Mahlen von Kakaobohnenstückchen entsteht. Die Flüssigkeit ist auf den Abbau der Zellwände und die Freisetzung der Kakaobutter während der Verarbeitung zurückzuführen, was eine Suspension der gemahlenen Teilchen der Kakaofeststoffe, die in der Kakaobutter suspendiert sind, ergibt.
  • Teilweise entfettete Kakaofeststoffe mit einem hohen Gehalt an Kakaopolyphenol (CP), einschließlich einem hohen Gehalt an oligomerem Procyanidin, können durch direktes Verarbeiten der Kakaobohnen zu Kakaofeststoffen ohne einen Röstschritt der Bohnen oder Bohnenstückchen erhalten werden. Diese Methode konserviert die Kakaopolyphenole, da sie den traditionellen Röstschritt umgeht. Die Methode besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten: a) Erhitzen der Kakaobohnen auf eine Innentemperatur der Bohnen, die soeben ausreichend ist, um den Feuchtigkeitsgehalt auf etwa 3 Gew.-% zu vermindern und die Kakaoschale zu lockern; b) Trennen der Kakaobohnenstückchen von den Kakaoschalen; c) Schraubpressen der Kakaobohnenstückchen; und d) Gewinnen der Kakaobutter und teilweise entfetteten Kakaofeststoffe, die die Kakaopolyphenole einschließlich der Kakaoprocyanidine enthalten. Wahlweise werden die Kakaobohnen vor dem Erhitzungsschritt gereinigt, z. B. in einem Mikroglaskugel-gefüllten Bettapparat zur Dichtetrennung („air fluidized bed density separator”). Das Trennen kann auch in dem Mikroglaskugel-gefüllten Bettapparat zur Dichtetrennung vorgenommen werden. Vorzugsweise werden die Kakaobohnen auf eine Innentemperatur der Bohnen von etwa 100°C bis etwa 110°C, bevorzugter von weniger als etwa 105°C, typischerweise unter Verwendung eines Infrarot-Heizapparates für etwa 3 bis 4 Minuten erhitzt. Sofern erwünscht, können die Kakaofeststoffe alkalisiert und/oder zu einem Kakaopulver gemahlen werden.
  • Die Innentemperatur der Bohnen (IBT) kann durch Befüllen eines Isolierbehälters, wie etwa einer Thermosflasche, mit Bohnen (etwa 80–100 Bohnen) gemessen werden. Der Isolierbehälter wird dann ordnungsgemäß verschlossen, um die Temperatur der darin enthaltenen Probe aufrecht zu erhalten. Ein Thermometer wird in den mit Bohnen befüllten Isolierbehälter eingebracht, und die Temperatur des Thermometers wird bezüglich der Bohnen in der Thermosflasche äquilibriert. Die Temperaturablesung stellt die IBT-Temperatur der Bohnen dar. Die IBT kann auch als die Massentemperatur der Bohnen im Gleichgewicht bezeichnet werden.
  • Kakaobohnen lassen sich, ausgehend von ihrer Farbe, in vier Kategorien unterteilen: vorwiegend braun (vollständig fermentiert), violett/braun, violett und schieferfarben (unfermentiert). Vorzugsweise werden die Kakaofeststoffe aus unterfermentierten Kakaobohnen hergestellt, die einen höheren Kakaopolyphenol-Gehalt als fermentierte Bohnen aufweisen. Zu unterfermentierten Bohnen zählen schieferfarbene Kakaobohnen, violette Kakaobohnen, Gemische aus schieferfarbenen und violetten Kakaobohnen, Gemische aus violetten und braunen Kakaobohnen oder Gemische aus schieferfarbenen, violetten und braunen Kakaobohnen. Bevorzugter sind die Kakaobohnen schieferfarbene und/oder violette Kakaobohnen.
  • Wie oben erörtert ist der Gehalt an Kakaopolyphenol (CP), einschließlich des Gehalts an Kakaoprocyanidin, der gerösteten Kakaobohnenstückchen, des Schokoladenlikörs und der teilweise entfetteten oder fettfreien Kakaofeststoffe höher, wenn sie aus Kakaobohnen oder Mischungen davon hergestellt sind, die unterfermentiert sind, d. h. aus Bohnen mit einem Fermentationsfaktor von 275 oder weniger.
  • Der ”Fermentationsfaktor” wird unter Verwendung eines Bewertungssystems zur Charakterisierung der Fermentation der Kakaobohnen bestimmt. Schieferfarben ist mit 1 bezeichnet, Violett mit 2, Violett/Braun mit 3 und Braun mit 4. Der prozentuale Anteil der Bohnen, die in jede Kategorie fallen, wird mit der gewichteten Zahl multipliziert. Somit wäre der ”Fermentationsfaktor” für eine Probe von 100% braunen Bohnen 100 × 4 oder 400, wohingegen er für eine Probe von 100% violetten Bohnen 100 × 2 oder 200 wäre. Eine Probe von 50% schieferfarbenen Bohnen und 50% violetten Bohnen wiese einen Fermentationsfaktor von 150 [(50 × 1) + (50 × 2)] auf.
  • Ein Schokoladenlikör mit hohem CP und/oder Kakaofeststoffe mit hohem CP können folgendermaßen hergestellt werden: a) Rösten der ausgewählten Kakaobohnen (Fermentationsfaktor von 275 oder weniger) zu einer Innentemperatur der Bohnen von 95°C bis 160°C; b) Trennen („winnowing”) der Kakaobohnenstückchen von den gerösteten Kakaobohnen; c) Mahlen der Kakaobohnenstückchen zu einem Schokoladenlikör; und d) wahlweise Gewinnen der Kakaobutter und der teilweise entfetteten Kakaofeststoffe aus dem Schokoladenlikör. Alternativ können der Schokoladenlikör und/oder die Kakaofeststoffe folgendermaßen hergestellt werden: a) Erhitzen der ausgewählten Kakaobohnen (Fermentationsfaktor von 275 oder weniger) auf eine Innentemperatur der Bohnen von 95–135°C zur Reduzierung des Feuchtigkeitsgehalts auf etwa 3 Gew.-% und zur Lockerung der Kakaoschale von den Kakaobohnenstückchen; b) Trennen der Kakaobohnenstückchen von den Kakaoschalen; c) Rösten der Kakaobohnenstückchen zu einer Innentemperatur der Bohnenstückchen von 95°C bis 160°C; d) Mahlen der gerösteten Bohnenstückchen zu einem Schokoladenlikör; und e) wahlweise Gewinnen der Kakaobutter und der teilweise entfetteten Kakaofeststoffe aus dem Schokoladenlikör. Der Schokoladenlikör und die teilweise entfetteten Kakaofeststoffe, die mindestens 50.000 μg an Kakao-Gesamtprocyanidinen und/oder mindestens 5.000 μg an Kakaoprocyanidin-Pentamer pro Gramm der fettfreien Kakaofeststoffe enthalten, können mittels der obigen Prozesse hergestellt werden.
  • Ein Extrakt, das Kakaopolyphenole einschließlich der Kakaoprocyanidine enthält, kann durch Lösungsmittelextraktion der teilweise entfetteten Kakaofeststoffe oder fettfreien Kakaofeststoffe, die aus den unterfermentierten Kakaobohnen oder Kakaobohnenstückchen hergestellt sind, erhalten werden.
  • Nahrungsmittelprodukte mit hohem CP können unter Verwendung der gerösteten Kakaobohnenstückchen mit hohem CP, der Schokoladenliköre mit hohem CP und/oder der teilweise entfetteten oder fettfreien Kakaofeststoffe mit hohem CP hergestellt werden. Zu den Nahrungsmittelprodukten zählen Tiernahrung, Trockenkakao-Gemische, Puddings, Sirupe, Kekse, Aromasoßen, Reismischungen, Reiskuchen, Mixgetränke, Getränke und ähnliches. Vorzugsweise sind die Nahrungsmittelprodukte ein Konfekt, z. B. eine Zartbitterschokolade oder eine Milchschokolade. Der Extrakt kann auch zur Herstellung von Nahrungsmitteln mit hohen Gehalten an Kakaopolyphenol verwendet werden.
  • Der Begriff ”oligomeres Procyanidin”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliche Verbindung mit der oben dargestellten Formel An, worin n 5–12 ist. Ist n gleich 5, so wird das Oligomer als ein ”Pentamer” bezeichnet.
  • Synthetisierte Derivate der Procyanidine umfassen Verbindungen gemäß der obigen Struktur An, worin R 3-(α)-O-Saccharid, 3-(β)-O-Saccharid, 3-(α)-O-C(O)-R1 oder 3-(β)-O-C(O)-R1, worin die Saccharid-Komponente von einem Mono- oder Disaccharid abgeleitet sein kann, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Galactose, Xylose, Rhamnose und Arabinose; worin die Saccharid-Komponente von irgendeinem oder allen von R, X, Y und Z an jeglicher Position mit einer Phenol-Komponente über eine Esterbindung wahlweise substituiert sein kann; worin die Phenol-Komponente ausgewählt sein kann aus der Gruppe, bestehend aus Caffein-, Cinnamin-, Coumarin-, Ferulin-, Gall-, Hydroxybenzoe- und Sinapinsäuren; und worin R1 eine Aryl- oder Heteroaryl-Komponente ist, die wahlweise mit mindestens einer Hydroxyl-Komponente substituiert ist. Die substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppe von R1 kann vorzugsweise ein Substitutionsmuster entsprechend den substituierten Phenolgruppen von Caffein-, Cinnamin-, Coumarin-, Ferulin-, Gall-, Hydroxybenzoe- oder Sinapinsäuren enthalten.
  • Die oligomeren Procyanidine können hergestellt werden durch
    • (a) Schützen jeder phenolischen Hydroxylgruppe eines ersten und eines zweiten Polyphenol-Monomers mit einer Schutzgruppe, um ein erstes und zweites geschütztes Polyphenol-Monomer herzustellen;
    • (b) Funktionalisieren der 4-Position des ersten geschützten Polyphenol-Monomers, um ein funktionalisiertes geschütztes Polyphenol-Monomer mit der folgenden Formel herzustellen:
      Figure 00140001
      worin: c eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; d eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; y eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; R eine Schutzgruppe ist; und R' H oder OH ist;
    • (c) Koppeln des zweiten geschützten Polyphenol-Monomers mit dem funktionalisierten geschützten Polyphenol-Monomer, um ein geschütztes Polyphenol-Dimer als dem Polyphenol-Oligomer herzustellen;
    • (d) Wiederholen der Funktionalisierungs- und Kopplungsschritte, um das Polyphenol-Oligomer mit n monomeren Einheiten zu bilden, worin n eine ganze Zahl von 5–12 ist; und
    • (e) Entfernen der Schutzgruppen von den phenolischen Hydroxylgruppen.
  • Das bevorzugte geschützte Polyphenol-Monomer ist ein bromiertes geschütztes Epicatechin oder bromiertes geschütztes Catechin, bevorzugter ein 8-Bromoepicatechin oder ein 8-Bromocatechin.
  • Bei dem obigen Prozess kann die 4-Position des geschützten Polyphenol-Monomers unter Verwendung eines Chinon-Oxidationsmittels in der Gegenwart eines Diols, z. B. Ethylenglykol, worin y 2 ist, oxidativ funktionalisiert werden.
  • Der obige Prozess kann außerdem den Schritt des Bildens eines Derivats von dem Polyphenol-Oligomer durch Verestern des Polyphenol-Oligomers an der 3-Position wenigstens einer monomeren Einheit umfassen, um ein verestertes Polyphenol-Oligomer zu erzeugen. Die Estergruppe kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus -OC(O)-Aryl, -OC(O)-substituiertem Aryl, -OC(O)-Styryl und OC(O)-substituiertem Styryl, worin das substituierte Aryl oder substituierte Styryl mindestens einen Substituenten enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Halo, Hydroxyl, Nitro, Cyano, Amino, Thiol, Methylendioxy, Dihalomethylendioxy, einem C1-C6-Alkyl, einem C1-C6-Alkoxy, einem C1-C6-Haloalkyl, einem C1-C6-Haloalkoxy, einem C3-C8-Cycloalkyl und einem C3-C8-Cycloalkoxy. Vorzugsweise wird die 3-Position der wenigstens einen Monomereinheit zu einer Derivatgruppe umgewandelt, die abgeleitet ist von einer Säure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Caffein-, Cinnamin-, Coumarin-, Ferulin-, Gall-, Hydroxybenzoe- und Sinapinsäuren.
  • Der obige Prozess kann weiterhin den Schritt des Bildens eines Derivats von dem Polyphenol-Oligomer durch Glykosylieren des Polyphenol-Oligomers an der 3-Position wenigstens einer monomeren Einheit umfassen, um ein glykosyliertes Polyphenol-Oligomer zu erzeugen. Vorzugsweise wird die 3-Position der wenigstens einen monomeren Einheit zu einer Derivatgruppe umgewandelt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-Glykosid oder einem -O-substituierten Glykosid, worin das substituierte Glykosid durch -C(O)-Aryl, -C(O)-substituiertes Aryl, -C(O)-Styryl oder -C(O)-substituiertes Styryl substituiert ist. Das substituierte Aryl oder substituierte Styryl kann Substituenten enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Halo, Hydroxyl, Nitro, Cyano, Amino, Thiol, Methylendioxy, Dihalomethylendioxy, einem C1-C6-Alkyl, einem C1-C6-Alkoxy, einem C1-C6-Haloalkyl, einem C1-C6-Haloalkoxy, einem C3-C8-Cycloalkyl und einem C3-C8-Cycloalkoxy. Vorzugsweise ist das Glykosid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Galactose, Xylose, Rhamnose und Arabinose.
  • Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung enthalten ein oder mehrere der Procyanidin-Oligomere 5–12, oder Derivate davon, wie oben definiert. Bevorzugt enthalten die Nahrungsmittelprodukte Gemische aus Kakaoprocyanidin-Oligomeren 5–12 oder Derivate davon.
  • Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung beinhalten Produkte, die zur Aufnahme durch Menschen und andere Säuger, z. B. Hunde, Katzen, Pferde und ähnliches, gedacht sind. Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung können zur Ernährung, zum Genuss oder zu medizinischen oder veterinärmedizinischen Zwecken aufgenommen werden.
  • Ein bevorzugtes Nahrungsmittelprodukt ist ein Konfekt, eine Backware, ein Gewürz, ein Müsliriegel, ein Nahrungsersatzriegel, ein Sirup, ein Mixgetränk-Pulver, ein Getränk und ähnliches. Bevorzugter ist das Nahrungsmittelprodukt dieser Erfindung ein Schokoladen-Konfekt, das Nüsse enthält, z. B. Erdnüsse, Walnüsse, Mandeln, Haselnüsse, Nüsse und ähnliches. Das Nussfleisch kann in beliebiger Form vorliegen, z. B. als ganze Nusskerne, gehackte Nüsse, gemahlene Nüsse, Nusspasten oder ähnliches. Zu den bevorzugten nicht-schokoladehaltigen Nahrungsmittelprodukten zählen Erdnussbutter, Erdnusskrokant und ähnliches. Solche nicht-schokoladehaltigen Nahrungsmittelprodukte können Kakaobestandteile enthalten, insbesondere Kakaopolyphenol-enthaltende Kakaobestandteile, würden aber durch einen Fachmann des Gebiets nicht als ein Schokoladeprodukt bezeichnet werden, wie z. B. Erdnussbutter, die einen relativ geringen prozentualen Anteil an Kakaopulver mit hohen Konzentrationen an Kakaopolyphenolen enthält.
  • Schokolade stellt im Wesentlichen ein Gemisch aus in Fett suspendierten Kakaofeststoffen dar. Milchschokolade ist ein Konfekt, das fettfreie Milchfeststoffe, Milchfett, Schokoladenlikör, einen Nahrungskohlehydrat-Süßstoff, Kakaobutter enthält und das eine Vielfalt weiterer Inhaltsstoffe enthalten kann, wie etwa Emulgiermittel, Geschmackstoffe und andere Zusätze. Süßschokolade enthält höhere Mengen an Schokoladenlikör, doch geringere Mengen an Milchfeststoffen als Milchschokolade. Halbsüße Schokolade erfordert mindestens 35 Gew.-% Schokoladenlikör und ist ansonsten von ähnlicher Definition zu Süßschokolade. Zartbitterschokolade enthält generell lediglich Schokoladenlikör, einen Nahrungskohlehydrat-Süßstoff und Kakaobutter, und ist per Definition entweder eine Süßschokolade oder eine halbsüße Schokolade. Buttermilchschokolade und Magermilchschokolade unterscheiden sich von Milchschokolade darin, dass das Milchfett von verschiedenen Formen von süßer Sahne, Buttermilch bzw. Magermilch stammt. Magermilch erfordert eine Beschränkung der Gesamtmenge an Milchfett auf weniger als das Minimum für Milchschokolade. Schokoladen aus gemischten Milchprodukten weichen von Milchschokolade darin ab, dass der Milchfeststoff irgendwelche oder alle der Milchfeststoffe umfasst, die für Milchschokolade, Buttermilchschokolade oder Magermilchschokolade aufgelistet sind. Weiße Schokolade unterscheidet sich von Milchschokolade darin, dass sie keine fettfreien Kakaofeststoffe enthält. Hitzestabile Schokoladen sind hierin ebenfalls nützlich.
  • Schokolade kann die Form von festen Stücken der Schokolade annehmen, wie etwa Riegel oder Formneuheiten. Schokolade kann auch als ein Inhaltsstoff in anderen komplexeren Konfekten enthalten sein, bei denen Schokolade kombiniert wird und im allgemeinen andere Nahrungsmittel-Inhaltsstoffe, wie etwa Karamell, Erdnussbutter, Nougat, Fruchtstücke, Nüsse, Waffeln, Eiscreme oder ähnliches, überzieht. Diese Nahrungsmittel sind als mikrobiologisch lagerstabil bei 65 bis 85°F (18–29°C) unter normalen atmosphärischen Bedingungen gekennzeichnet.
  • Der Begriff ”Kohlehydrat” bezieht sich auf Nahrungskohlehydrat-Süßstoffe mit variierenden Graden der Süßeintensität, die jegliche von den typischerweise verwendeten sein können, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Sucrose (z. B. von Zuckerrohr oder Zuckerrübe), Dextrose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucosesirup-Feststoffen, Maissirup-Feststoffen, Invertzucker, hydrolysierter Lactose, Honig, Ahornsirup, brauner Zucker, Melassen und ähnlichem.
  • Die Schokoladen-Nahrungsmittelprodukte können außerdem weitere Inhaltsstoffe enthalten, wie etwa fettfreie Milchfeststoffe, fettfreie Kakaofeststoffe (Kakaopulver), Zuckerersatzstoffe, natürliche und künstliche Geschmacksstoffe (z. B. Gewürze, Kaffee, Salz, etc., als auch Gemische von diesen), Proteine und ähnliches.
  • Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung enthalten außerdem L-Arginin. Jegliche L-Arginin-Quelle kann verwendet werden, d. h. synthetische oder natürliche. Zu besonders bevorzugten L-Arginin-Quellen zählen Sojabohnen und Nussfleisch, wie etwa Erdnüsse, Walnüsse, Mandeln, Haselnüsse und ähnliches. Entfettetes und teilweise entfettetes Nussfleisch kann ebenfalls verwendet werden, um die Konzentration an L-Arginin zu erhöhen. Teilweise und vollständig entfettetes gemahlenes Nussfleisch wird als Nussmehl bezeichnet.
  • Über die physiologischen Aktivitäten hinaus, die als durch Kakaoprocyanidine oder Zusammensetzungen, die Kakaoprocyanidine enthalten, hervorgerufen bekannt sind, erzeugt die Kombination von L-Arginin mit den Kakaoprocyanidinen eine bessere Wirkung, wie durch die erhöhte Stickstoffoxid-Produktion gezeigt.
  • Eine Ausführungsform einer synergistischen Wirkung auf die NO- und/oder NO-Synthase-Modulation folgt als Beispiel. Viele Nahrungsmittel enthalten nennenswerte Mengen an L-Arginin, doch nicht notwendigerweise an Kakaopolyphenolen. Unter der Vorgabe, dass L-Arginin ein Substrat für NO-Synthase ist, und die NO-abhängige Vasodilatation in hypercholesterolämischen Tieren, die eine L-Arginin-Supplementierung erhalten, signifikant verbessert ist (siehe Cooke et al., Circulation 83: 1057–1062, 1991) und dass Kakaopolyphenole die NO-Mengen modulieren können, wird eine synergistische Verbesserung der Endothel-abhängigen Vasodilatation erwartet.
  • In ungesüßtem Kakaopulver ist von L-Arginin-Mengen von 1,0 bis 1,1 g/100 g berichtet worden. Auf dieser Grundlage werden weitere Quellen an L-Arginin in die Nahrungsmittelprodukte aufgenommen, um einen maximalen Nutzen bezüglich der NO- und NO-Synthase-Modulation bereitzustellen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Kakao- und/oder Nuss-Polyphenole und L-Arginin in Mengen vorhanden, um den oben beschriebenen synergistischen Nutzen wirksam zu liefern, z. B. von etwa 1 mg bis etwa 10 g pro Dosiseinheit, vorzugsweise von etwa 25 mg bis 3 g an Procyanidinen. Die Produkte der Erfindung können verwendet werden, um das Krebszellwachstum in Säugern zum Stillstand zu bringen, um eine Hypertension in Säugern zu reduzieren, um entzündliche Darmerkrankungen zu behandeln, um das bakterielle Wachstum in Säugern zu hemmen, um Atherosklerose oder Restenose zu verhindern oder zu vermindern, um die Blutplättchen-Aggregation zu modulieren, um eine Apoptose zu modulieren, als ein Antioxidans, spezifisch zur Vermeidung einer Oxidation von LDL in Säugern, um Cyclooxygenase und/oder Lipoxygenase zu modulieren, um die Stickstoffoxid-(NO)-Produktion oder Stickstoffoxid-(NO)-Synthase in Säugern zu modulieren oder zu stimulieren, um eine Stickstoffoxid-(NO)-beeinflusste Hypercholesterolämie in einem Säuger zu behandeln, um die Glucose in vivo zu modulieren, um Topoisomerase II zu hemmen, um INOS in Säuger-Monozyten und/oder -Makrophagen zu induzieren, als auch als ein antimikrobielles, antineoplastisches, Anti-Gingivitis- oder Anti-Periodontitis-Mittel.
  • Die Gesundheit eines Säugers kann durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines Nahrungsmittelprodukts der Erfindung an den Säuger an jedem Tag für einen effektiven Zeitraum verbessert werden. In Abhängigkeit von der zu behandelnden Bedingung kann der effektive Zeitraum von nahezu momentan bis zu einem größeren Zeitraum als 60 Tage variieren. In einem Aspekt wird die Gesundheit des Säugers durch Aufnahme eines Nahrungsmittelprodukts der Erfindung an jedem Tag für einen Zeitraum von größer als fünf Tagen bis zu einem Zeitraum von größer als sechzig Tagen verbessert.
  • Die bei dieser Erfindung verwendeten oligomeren Procyanidine modulieren das Stickstoffoxid (NO) und die NO-Synthase. Das Arginin wirkt als ein Substrat für die NO-Synthase. Die kombinierte Menge an Procyanidin und L-Arginin ist zur Hervorrufung einer physiologischen Reaktion in einem Säuger, der das Nahrungsmittelprodukt erhält, wirksam. Die physiologische Reaktion besteht in einer erhöhten Stickstoffoxid-Produktion gegenüber dem, was durch die Verabreichung des Procyanidins oder L-Arginins alleine erhalten werden würde. Es wird angenommen, dass diese verstärkte Stickstoffoxid-Produktion zu den zuvor genannten gesundheitlichen Nutzen in Verbindung mit der Stickstoffoxid-Produktion führt.
  • Die Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung sind zum Beispiel beim Modulieren der Vasodilatation nützlich, und sind außerdem bezüglich der Modulation des Blutdrucks oder hinsichtlich koronarer Bedingungen und bei Migränekopfschmerz-Zuständen nützlich. Die auf die Verabreichung der Zusammensetzungen dieser Erfindung hin hervorgerufenen Reaktionen umfassen die Senkung einer Hypertension und die Erweiterung von Blutgefäßen.
  • Die neuen Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung können ohne weiteres von Fachleuten des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis unter Anwendung der hierin angegebenen Lehren hergestellt werden.
  • Die Kakaobestandteile können aus Kakaobohnen mit einem Fermentationsfaktor von weniger als 300 und/oder aus Kakaobohnen mit einem Fermentationsfaktor von 300 oder mehr hergestellt werden. Aus Kakaobohnen mit einem Fermentationsfaktor von 300 oder mehr hergestellte alkalisierte Schokoladenbestandteile können in Kombination mit Kakaobestandteilen verwendet werden, die aus Kakaobohnen mit einem Fermentationsfaktor von weniger als 300 hergestellt sind.
  • Der Gehalt an Kakaoprocyanidin von auf Schokolade basierenden Nahrungsmittelprodukten kann durch Schützen des/der Kohlehydrat-Bestandteile) und/oder des/der Milch-Bestandteile) während der Formulierung des Nahrungsmittelprodukts konserviert werden. Der/Die Bestandteil(e) wird/werden vor der Zugabe des/der Schokoladenbestandteil(e) geschützt. Zumindest ein schützender Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Fett, einem Emulgator, einem Antioxidans, einem Geschmacksstoff und Gemischen davon wird dem/den Kohlehydrat-Bestandteil(en) und/oder Milchbestandteil(en) zum Erhalt eines ersten Gemischs zugegeben. Das erste Gemisch wird mit dem/den Schokoladenbestandteil(en) zum Erhalt eines zweiten Gemischs kombiniert. Das Nahrungsmittelprodukt wird aus dem zweiten Gemisch hergestellt. Das Nahrungsmittelprodukt kann ein Konfekt oder eine Nahrungsergänzung sein. Das Konfekt kann eine Zartbitter- oder Milchschokolade sein. Wahlweise werden die Kohlehydrate und/oder Milchbestandteile zur Verringerung der Partikelgröße vor dem Mischen mit dem schützenden Inhaltsstoff gemahlen. Der/die Schokoladenbestandteil(e) kann ebenfalls gemahlen werden, bevor er mit dem ersten Gemisch der schützenden Kohlehydrat- und/oder Milchbestandteile kombiniert wird. Bevorzugte Fette zur Verwendung als Vorbehandlungs-Bestandteile sind Kakaobutter und/oder ein Schokoladenlikör, welcher Kakaobutter enthält und der aus Kakaobohnen mit einem Fermentationsfaktor von 300 oder größer hergestellt ist. Zu bevorzugten Emulgatoren zählen Lecithin und/oder fraktioniertes Lecithin. Zu geeigneten Antioxidantien zählen Tannine, Chinone, Polyhydroxy-Verbindungen, Phospholipide, Tocol-Verbindungen und/oder Derivate davon. Zu geeigneten Geschmacksstoffen zählen Vanillin, Gewürze und/oder natürlich ausgepresste Zitrusöle oder Gewürzöle. Das erste Gemisch, der/die Schokoladenbestandteil(e) und/oder das zweite Gemisch können konchiert werden. Die Schokolade wird bei etwa 50 bis etwa 65°C konchiert. Ein zweiter Emulgator kann während oder nach der Konchierung zugegeben werden. Dieser zweite Emulgator kann Lecithin, Succrosepolyeruiat, Ammoniumphosphatid, Polyglycerol, Polyricinoleat, phosphatierte Mono- und Diglykoside/Deactyltartarsäureester von Monoglyceriden und fraktioniertes Lecithin sein. Mit dem/den geschützten Kohlehydrat(en) und/oder Milchbestandteil(en) hergestellte Nahrungsmittelprodukte enthalten mindestens 10 bis 20 Gew.-% mehr Kakaoprocyanidine als ein Nahrungsmittelprodukt, das durch ein Verfahren hergestellt ist, das keine Vorbehandlung des/der Kohlehydrat-Bestandteil(e) und/oder Milchbestandteil(e) umfasst.
  • Die Zugabe von L-Arginin zu dem Nahrungsmittelprodukt kann durch Zugeben einer Menge an Nussfleisch, z. B. Erdnüssen, erfolgen, die ausreichend ist, um die gewünschte Konzentration an L-Arginin bereitzustellen.
  • Wie zuvor angemerkt, ist ein besonders bevorzugtes Nahrungsmittelprodukt ein Schokoladen-Konfekt. Die Schokolade in dem Schokoladen-Konfekt enthält eine relativ hohe Konzentration an Kakaoprocyanidinen. Bei dieser Ausführungsform umfasst die Schokolade zumindest 3.600 μg, vorzugsweise mindestens 4.000 μg, bevorzugt zumindest 4.500 μg, noch bevorzugter mindestens 5.000 μg und am bevorzugtesten mindestens 5.500 μg Kakaoprocyanidinen pro Gramm Schokolade, basierend auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Produkt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Schokolade mindestens 6.000 μg, bevorzugt mindestens 6.500 μg, bevorzugter mindestens 7.000 μg und am bevorzugtesten mindestens 8.000 μg an Kakaoprocyanidinen pro Gramm, und sogar noch bevorzugter 10.000 μg, basierend auf den fettfreien Kakaofeststoffen in dem Produkt.
  • Eine andere Ausführungsform betrifft ein Schokoladen-Nahrungsmittelprodukt, umfassend eine Schokolade mit mindestens 200 μg, vorzugsweise mindestens 225 μg, bevorzugter mindestens 275 μg und am bevorzugtesten mindestens 300 μg Kakaoprocyanidin-Pentamer pro Gramm, basierend auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Schokoladen-Nahrungsmittelprodukt. Vorzugsweise enthält die Schokolade mindestens 325 μg, bevorzugt mindestens 350 μg, bevorzugter mindestens 400 μg und am bevorzugtesten mindestens 450 μg Kakaoprocyanidin-Pentamer pro Gramm, basierend auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Schokoladen-Nahrungsmittelprodukt.
  • Noch eine andere Ausführungsform betrifft ein Milchschokolade-Konfekt, das mindestens 1.000 μg, bevorzugt mindestens 1.250 μg, noch bevorzugter mindestens 1.500 μg und am bevorzugtesten mindestens 2.000 μg Kakaopolyphenole pro Gramm aufweist, bezogen auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Milchschokoladeprodukt. In der bevorzugten Ausführungsform enthält die Milchschokolade mindestens 2.500 μg, bevorzugt mindestens 3.000 μg, bevorzugter mindestens 4.000 μg und am bevorzugtesten mindestens 5.000 μg Kakaoprocyanidine pro Gramm, basierend auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Milchschokoladeprodukt.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Nahrungsmittelprodukt eine Milchschokolade, die mindestens 85 μg, bevorzugt mindestens 90 μg, bevorzugter mindestens 100 μg und am bevorzugtesten mindestens 125 μg Kakaoprocyanidin-Pentamer pro Gramm aufweist, basierend auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Milchschokoladeprodukt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Milchschokolade mindestens 150 μg, bevorzugt mindestens 175 μg, bevorzugter mindestens 200 μg und am bevorzugtesten mindestens 250 μg Kakaoprocyanidin-Pentamer pro Gramm, basierend auf der Gesamtmenge an fettfreien Kakaofeststoffen in dem Milchschokoladeprodukt.
  • Die nicht-schokoladehaltigen Nahrungsmittelprodukte werden mindestens 1 μg, bevorzugt mindestens 5 μg, bevorzugter mindestens 10 μg, noch bevorzugter mindestens 25 μg und am bevorzugtesten mindestens 50 μg Kakaoprocyanidine enthalten. Sofern erwünscht, können die nicht-schokoladehaltigen Nahrungsmittelprodukte viel höhere Mengen an Kakaoprocyanidinen im Vergleich zu jenen enthalten, die in den oben beschriebenen Schokolade-Nahrungsmittelprodukten zu finden sind.
  • Die Menge an L-Arginin in den Nahrungsmittelprodukten kann variieren, doch beträgt wenigstens 1,2 g pro 100 g an Nahrungsmittelprodukt. Typischerweise enthält Kakao zwischen 1 und 1,1 Gramm an L-Arginin pro 100 Gramm an teilweise entfetteten Kakaofeststoffen. Es kann im Bereich von 0,8 bis 1,5 g pro 100 g Kakao liegen. Die Schokolade-Nahrungsmittelprodukte dieser Erfindung enthalten L-Arginin in einer größeren Menge als der, die natürlicherweise in den Kakaobestandteilen vorkommt. Ist die Menge an in dem Nahrungsmittelprodukt verwendeten Kakaobestandteilen und L-Arginin bekannt, so kann ein Fachmann des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis ohne weiteres die Gesamtmenge an L-Arginin im Endprodukt bestimmen.
  • Das Nahrungsmittelprodukt wird vorzugsweise mindestens 20.000, 50.000 oder 100.000 μg an L-Arginin pro Gramm des Nahrungsmittelprodukts enthalten.
  • TESTVERFAHREN
  • Die folgenden Verfahrensweisen können zur Quantifizierung der Menge an Procyanidinen und L-Arginin in den verschiedenen Beispielen angewendet werden.
  • Methode A wurde zur Quantifizierung der Mengen an Kakaoprocyanidin (Gesamtmenge und Pentamer) angewendet, wie in Beispiel 1 bis Beispiel 3 berichtet.
  • Methode B sollte zur Quantifizierung der Mengen an Kakao- und Nuss-Procyanidin (Gesamtmenge und Pentamer) in den Nahrungsmittelprodukten und Nahrungsmittel-Inhaltsstoffen der Beispiele 4 bis 10 angewendet werden. Methode B wurde zur Quantifizierung des Gehalts an Kakaoprocyanidin der gereinigten Kakaoprocyanidin-Oligomere angewendet, wie in Beispiel 14 berichtet und in Beispielen 17–19 angewendet.
  • Methode C sollte zum Extrahieren und Identifizieren der Nuss-Procyanidine angewendet werden.
  • BESTIMMUNG DES PROCYANIDINS
  • Methode A
  • Kakaopolyphenol-Extrakte werden durch Mahlen einer Probe von 6–7 g unter Verwendung einer analytischen Tekmar A-10-Mühle für 5 Minuten, oder in dem Fall des Schokoladenlikörs, von 6–7 g einer Schokoladenlikör-Probe ohne zusätzliches Mahlen hergestellt. Die Probe wird dann in ein 50 ml-Polypropylen-Zentrifugierröhrchen übertragen, etwa 35 ml Hexan werden zugegeben, und die Probe wird für 1 Minute kräftig geschüttelt. Die Probe wird bei 3000 RPM für 10 Minuten unter Verwendung einer IECPR-7000-Zentrifuge von International Equipment Company zentrifugiert. Nach dem Abschöpfen der Hexanschicht wird der Fettextraktionsprozess für zwei weitere Male wiederholt. Etwa 1 g des entfetteten Materials wird in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugierröhrchen abgewogen, und 5 ml einer 70% Aceton: 29,5% Wasser: 0,5% Essgisäure-Lösung werden zugegeben. Die Probe wird für etwa 30 Sekunden unter Verwendung eines Scientific Industries Vortex Genie 2 für etwa 30 Sekunden gevortext und bei 300 RPM für 10 Minuten in der IECPR-7000-Zentrifuge zentrifugiert. Der Likör wird dann in eine 1 ml-Hypophiole durch einen 0,45 μ-Filter von Millex-HV filtriert.
  • Kakaopolyphenol-Extrakte werden mittels eines HPLC-Sytems von Hewlett Packard 1090 Series II, ausgestattet mit einem HP-Modell 1046A Programmierbaren Fluoreszenz-Detektor und einem Diodenarray-Detektor analysiert. Die Trennungen wurden bei 37°C auf einer 5 μ Supelco Supelcosil LC-Si-Säule (250 × 4,6 mm), verbunden mit einer Supelco Supelguard LC-Si 5 μm-Vorsäule (20 × 2,1 mm), vorgenommen.
  • Die Procyanidine wurden durch einen linearen Gradienten unter den folgenden Bedingungen eluiert: (Zeit %A, %B, %C); (0, 82, 14, 4), (30, 67,6, 28,4, 4), (60, 46, 50, 4), (65, 10, 86, 4), gefolgt von einer 5-minütigen Reäquilibration. Die Zusammensetzung der mobilen Phase ist A = Dichlormethan, B = Methanol und C = Essigsäure:Wasser bei einem Volumenverhältnis von 1:1. Eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. wird angewendet. Die Komponenten werden mittels Fluoreszenz detektiert, wobei λex = 276 nm und λem = 316 nm, oder mittels UV bei 280 nm. Epicatechin wird als ein externer Standard verwendet.
    HPLC-Bedingungen:
    250 × 4,6 mm Supelco Supelcosil LC-Si-Säule (5 μm) 20 × 2,1 mm Supelco LC-Si (5 um) Vorsäule
    Detektoren: Photodiodenarray bei 280 nm
    Fluoreszenz λex = 276 nm; λem = 316 nm
    Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min.
    Säulentemperatur: 37°C
    Gradient CH2Cl2 Methanol Essigsäure:Wasser (1:1)
    0 82 14 4
    30 67,6 28,4 4
    60 46 50 4
    65 10 86 4
  • Methode B
  • Bei dieser Methode werden monomere und oligomere Kakao- und Nuss-Procyanidine unter Anwendung der Normalphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Methode mit einer Fluroeszenz-Detektion (FLD) anstelle einer UV-Detektion bei 280 nm quantifiziert.
  • Die normalphasige HPLC-Methode, wie berichtet von Hammerstone et al., ”Identification of Procyanidins in Cocoa (Theobroma cacao) and Chocolate Using High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry”, J. Agric. Food. Chem. 47, 2: 490–496 (14.1.99), wurde für die Trennung und Quantifizierung der Oligomere bis zu dem Dekamer angewendet.
  • Die Procyanidin-Standards bis zu den Dekameren wurden durch Extrahieren aus Kakaobohnen, Anreichern durch Sephadex LH-20-Gelpermeationschromatographie und abschließendes Reinigen mittels präparativer Normalphasen-HPLC erhalten. Die Reinheit jeder Oligomerfraktion wurde unter Anwendung einer an die Massenspektrometrie gekoppelten HPLC ausgewertet.
  • Dann wurde ein Composite-Standard präpariert, und Kalibrationskurven für jede oligomere Klasse wurden unter Anwendung einer quadratischen Anpassung von Flächensumme versus Konzentration generiert.
  • Die Kakaobohnen wurden durch das Almirante Center for Cocoa Studies in Itajuipe, Brasilien, bereitgestellt.
  • Die Referenzverbindungen sind (–)-Epicatechin (Sigma Chemical, St. Louis) und gereinigte Oligomere aus brasilianischen Kakaobohnen.
  • Die Kakaoprocyanidine werden durch Mahlen der frischen Samen in einer Hochgeschwindigkeits-Labormühle mit Flüssigstickstoff extrahiert, bis die Partikelgröße auf etwa 90 μm reduziert ist. Die Lipide werden aus 220 g der gemahlenen Samen durch dreimaliges Extrahieren mit 1000 ml Hexan entfernt. Die Lipid-freien Feststoffe werden zum Erhalt von etwa 100 g eines fettfreien Materials luftgetrocknet. Eine Procyanidine enthaltende Fraktion wird durch Extrahieren mit 1000 ml an 70 Vol.-% Aceton in Wasser erhalten. Die Suspension wird für 10 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert. Die Acetonschicht wird durch einen Trichter mit Glaswolle abgeschöpft. Das wässrige Aceton wird dann mit Hexan (~75 ml) reextrahiert, um restliche Lipide zu entfernen. Die Hexanschicht wird verworfen, und das wässrige Aceton wird unter Teilvakuum bei 40°C zu einem Endvolumen von 200 ml rotationsverdampft. Der wässrige Extrakt wird gefriergetrocknet, was etwa 19 g an Acetonextrakt-Material ergibt.
  • Für die Gelpermeations-Chromatographie werden etwa 2 g des Acetonextrakts in 10 ml an 70% wässrigem Methanol suspendiert und bei 1500 x g zentrifugiert. Der Überstand wird auf einer Sephadex LH-20-Säule (70 × 3 cm), die vorab mit Methanol äquilibriert worden ist, bei einer Fließgeschwindigkeit von 3,5 ml/Min. semi-gereinigt. Zweieinhalb Stunden nach der Probenbeladung werden Fraktionen alle 20 Minuten entnommen und mittels HPLC auf Theobromin und Caffein analysiert (Clapperton et al., ”Polyphenols and Cocoa Flavour”, Proceedings 16th International Conference of Group Polyphenols, Lissabon, Portugal, Grouppe Polyphenols, Norbonne, Frankreich, Tome II: 112–115, 1992). Sind das Theobromin und Caffein einmal aus der Säule eluiert (~3,5 Stunden), so wird das verbliebene Eluat für weitere 4,5 Stunden gesammelt und unter Teilvakuum bei 40°C zur Entfernung des organischen Lösungsmittels rotationsverdampft. Dann wird der Extrakt in Wasser suspendiert und gefriergetrocknet.
  • Die Kakaoprocyanidin-Oligomere werden mittels präparativer Normalphasen-HPLC gereinigt. Etwa 0,7 g semi-gereinigter Acetonextrakt wird in 7 ml Aceton:Wasser:Essigsäure in einem Volumenverhältnis von 70:29,5:0,5 gelöst. Die Trennungen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung einer 5 μ Supelcosil LC-Si 100 Å Säule (50 × 2 cm) vorgenommen. Die Procyanidine wurden mittels eines linearen Gradienten unter den in der nachstehenden Tabelle gezeigten Bedingungen eluiert. Die Trennungen der Oligomere werden mittels UV bei 280 nm überwacht, und die Fraktionen werden bei den Tälern zwischen den Peaks entsprechend den Oligomeren entnommen. Fraktionen mit gleichen Rückhaltezeiten für mehrere präparative Trennungen werden kombiniert, unter Teilvakuum rotationsverdampft und gefriergetrocknet. Gradientenprofil für die präparative Normalphasen-HPLC
    Zeit (Min.) Methylenchlorid:Essigsäure:Wasser (96:2,2, v/v) Methanol:Essigsäure:Wasser (96:2,2, v/v) Fließgeschwindigkeit (ml/Min.)
    0 92,5% 7,5% 10
    10 92,5% 7,5% 40
    30 91,5% 8,5% 40
    145 78,0% 22,0% 40
    150 14,0% 86,0% 40
    155 14,0% 86,0% 50
    180 0 100% 50
  • Für die massenspektrometrische Analyse der teilgereinigten Kakaoprocyanidin-Oligomere werden gereinigte Fraktionen mittels HPLC/Massenspektrometrie (MS) unter Verwendung der Parameter analysiert, die beschrieben sind bei Lazarus et al., ”High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis of Proanthocyanidins in Food Stuffs”, J. Agric. Food Chem. (vorgelegt im Jahre 1998). Die Reinheiten jeder Fraktion werden anhand der Peakfläche unter Anwendung eines UV-Nachweises bei 280 nm in Kombination mit dem Vergleich des Verhältnisses der Ionenabundanzen zwischen jeder Oligomerklasse bestimmt. Vorratslösungen für den Composite-Standard werden unter Verwendung von handelsüblichem (–)-Epicatechin für das Monomer und die gereinigten Oligomere für Dimere bis Dekamere hergestellt. Das oligomere Profil der Vorratslösungen für den Composite-Standard ist in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. Oligomeres Profil des Composite-Standards
    Kakaoprocyanidine Beitrag (Gew.-%)
    Monomer 9,82
    Dimer 13,25
    Trimer 9,85
    Tetramer 10,49
    Pentamer 10,51
    Hexamer 12,68
    Heptamer 7,98
    Oktamer 8,44
    Nonamer 11,56
    Dekamer 5,42
  • Die Vorratslösungen wurden bei den folgenden Konzentrationen hergestellt: 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml und 0,4 mg/ml.
  • Die Schokoladenliköre und Schokoladenproben wurden wie oben extrahiert (etwa 8 g der Probe), nur, dass lediglich 45 ml Hexan verwendet wurden. Etwa 1 g an entfettetem Material wird wie oben mit 5 ml Aceton:Wasser:Essigsäure extrahiert. Die Feststoffe werden durch Zentrifugieren für 10 Min. bei 1500 x g pelletiert. Dann wird der Überstand durch ein Nylonfilter von 0,45 Mikronen in eine HPLC-Phiole zur Injektion filtriert. Alle entfetteten Proben werden gewogen, extrahiert und im Duplikat injiziert. Die Fettzusammensetzung der Kakaoliköre und Schokoladen wird unter Anwendung der ADAC Official Method 920.177 bestimmt. Eine geringfügige Modifikation an der Probengröße ist erforderlich, was die Verwendung von 1 g bei den Schokoladenproben und von 0,5 g bei den Likörproben einbezieht. Die Hochleistungsflüssigchromatographische Analyse der Kakaoprocyanidine wird unter Verwendung eines HP 1100 Series HPLC (Hewlett Packard, Palo Alto, CA), ausgestattet mit einem Autoinjektor, einer quaternären HPLC-Pumpe, einem Säulenerhitzer, einem Fluroeszenz-Detektor und einer HP-ChemStation für die Datensammlung und Manipulation, durchgeführt. Die Fluoreszenz-Detektion wird bei der Anregungswellenlänge 276 nm und Emissionswellenlänge 316 nm aufgezeichnet. Die Normalphasen-Trennungen der Procyanidin-Oligomere werden unter Verwendung einer Phenomenex (Torrance, CA) 5 μ Lichrosphere-Kieselgelsäule (25 × 4,6 mm) bei 37°C mit einem Injektionsvolumen von 5 μl durchgeführt. Die ternäre mobile Phase besteht aus A) Dichlormethan, B) Methanol und C) Essigsäure und Wasser (1:1 v/v). Die Trennungen werden mittels einer Serie von linearen Gradienten von B in A bei konstanten 4% C bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. wie folgt bewirkt: Beginn der Elution mit 14% B in A; 14–28,4% B in A, 0–30 Min.; 28,4 – 39,2% B in A, 30–45 Min., 39,2–86% B in A, 40–50 Min.. Die Säulen werden zwischen den Injektionen mit dem Äquivalent von 25 ml (10 Säulenvolumina) der anfänglichen mobilen Phase reäquilibriert.
  • Für die Quantifizierung von Kakaoprocyanidinen in Schokoladenlikören und Schokoladen werden Kalibrationskurven aus den Vorratslösungen unter Anwendung einer quadratischen Anpassung für die Beziehung von Flächensumme versus Konzentration für die Peaks entsprechend jeder oligomeren Klasse erstellt.
  • Methode C
  • Diese Methode wird zur Bestimmung des Typs der Procyanidine in Nüssen angewendet. In Nüssen vorhandene monomere und oligomere Procyanidine werden nach dem Polymerisationsgrad getrennt und unter Anwendung einer modifizierten Normalphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie-(HPLC)-Methode, gekoppelt mit einer Online-massenspektrometrischen (MS) Analyse unter Verwendung einer Ionisierungselektrospray-(API-ES)-Kammer bei atmosphärischem Druck identifiziert.
  • Die Roherdnüsse sind bezogen von M&M/MARS (Hackettstown, NJ). Die Rohmandeln sind bezogen von der Almond Board of California (Modesto, CA).
  • Die verwendeten Standards sind (–)-Epicatechin und (+)-Catechin (Sigma Chemical, St. Louis, MO).
  • Festphasenextraktionssäulen (SPE) (Supelcosil Envi-18 20 ml-Säulen von Supelco, Inc., Bellafonte, PA) werden mit 3 × 5 ml Methanol gespült und dann mit 3 × 5 ml Wasser vor der Probenbeladung konditioniert. Nach den entsprechenden Probenbeladungs- und Spülprozeduren werden die Säulen unter Vakuum für 1–2 Min. getrocknet. Die SPE-Säule wird dann in 10 ml Aceton, Wasser und Essigsäure in einem Verhältnis nach Volumen von 70:29,5:0,5 für 1 Minute eingeweicht, bevor die Procyanidine aus der Säule eluiert werden. Um die Procyanidine aus den Erdnusshäuten zu extrahieren, werden etwa 3,5 g Erdnusshäute in einer Labormühle gemahlen, bevor sie in 25 ml Aceton, Wasser und Essigsäure in einem Verhältnis nach Volumen von 70:29,5:0,5 extrahiert werden. Die Suspension wird für 10 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert und der Überstand abgeschöpft. 20 ml Wasser werden dem Überstand zugegeben, bevor das organische Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung unter Teilvakuum bei 45°C entfernt wird, was etwa 22 ml an wässrigem Extrakt ergibt. Der wässrige Extrakt (22 ml) wird auf die vorkonditionierte SPE-Säule geladen und mit 40 ml Wasser gespült. Dann werden die Procyanidine wie oben eluiert. Um die Procyanidine aus dem Erdnussfleisch zu extrahieren, wird das Nussfleisch in Flüssigstickstoff eingefroren und dann in einer Labormühle zu einem Pulver gemahlen. Das Nussfleischpulver (–10 g) wird dreimal mit 45 ml Hexan extrahiert, um die Lipide zu entfernen. Ein Gramm des resultierenden entfetteten Nussfleisch wird mit 5 ml Aceton, Wasser und Essigsäure in einem Verhältnis nach Volumen von 70:29,5:0,5 extrahiert.
  • Bei der Mandelsamenschale werden etwa 24 g der Samenschale von den rohen Mandeln unter Verwendung einer Rasierklinge entfernt. Die Samenschale wird dann zweimal mit 135 ml Hexan entfettet und für 10 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert, was etwa 14,6 g des entfetteten Materials erbringt. Die entfettete Samenschale wird mit 90 ml Aceton, Wasser und Essigsäure in einem Verhältnis nach Volumen von 70:29,5:0,5 extrahiert. Dreißig Milliliter Wasser werden dem Überstand zugegeben, und das resultierende angesäuerte wässrige Aceton wird unter einem Teilvakuum bei 45°C zu einem Endvolumen von 50 ml rotationsverdampft. Die wässrige Lösung wird auf die vorkonditionierte SPE-Säule aufgeladen, mit etwa 10 ml Wasser gespült und die Procyanidine wie oben eluiert.
  • Die HPLC/MS-Analysen der Extrakte werden unter Verwendung einer HP 1100 Series HPLC, wie in obiger Methode B beschrieben, vorgenommen und an einen HP Series 1100 Massen-selektiven Detektor (Modell G1946A), ausgestattet mit einer API-ES-Ionisierungskammer, Schnittstellen-angeschlossen. Das Pufferreagens wird über ein Tee in den Eluentstrom des HPLC unmittelbar vor dem Massenspektrometer zugegeben und mit einer HP 1100 Series HPLC-Pumpe, die den Entgaser umgeht, transportiert. Die Bedingungen für die Analyse in dem Negativionen-Modus umfassen ~0,75 M Ammoniumhydroxid als dem Pufferreagens bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,04 ml/Min., einer Kapillarspannung von 3 kV, dem Fragmentor bei 75 V, einem Vernebelungsdruck von 25 psig und einer Trocknungsgastemperatur bei 350°C. Die Daten werden auf einer HP-ChemStation unter Anwendung sowohl des Scan-Modus als auch der Überwachung der gewählten Ionen gesammelt. Die Spektren werden über einen Massenbereich von m/z 100–3000 bei 1,96 s pro Zyklus gescannt.
  • Die massenspektralen Daten der Mandelsamenschalen-Ionen zeigen das Vorhandensein von einfach gebundenen Procyanidin-Oligomeren bis Heptameren an, wohingegen die massenspektralen Daten für die Erdnusshäute sowohl einfach als auch doppelt gebundene Oligomere bis Oktamere anzeigen. Keine Procyanidine werden in dem Erdnussfleisch nachgewiesen.
  • BESTIMMUNG DES GEHALTS AN L-ARGININ
  • Das L-Arginin wird unter Anwendung der Verfahrensweise bestimmt, die berichtet ist in ADAC Official Method 982.30, ADAC Official Methods of Analysis (1995), Vitamins and Other Nutrients, Kapitel 45, S. 59–61. Die Probe wird säurehydrolysiert, und jedes von drei Hydrolysaten wird unter Verwendung der optimalen Parameter für das verwendete Aminosäure-Analysegerät analysiert. Eine standardmäßige L-Argininlösung wird zur Kalibrierung des Analysegeräts mindestens alle 24 Stunden verwendet. Der Stickstoff wird mittels der ADAC Official Method 955.04C, 920.39A, 976.05A oder einer anderen geeigneten Kjidahl-Methode bestimmt. Die unkorrigierten g/16 g N werden folgendermaßen errechnet: g L-Arginin (unkorrigierte 16 g Probe N = (n Mol L-Arginin × anfängliches Probenvolumen (ml) × MG L-Arginin)/(injiziertes Probenvolumen (ml) × Probengewicht (g) × % N für die Probe × 6,25 × 105).
  • Die Säurehydrolyse wird durch Einbringen von etwa 0,1 g (auf eine Genauigkeit von 0,1 mg abzuwiegen) Probe in ein Hydrolyse-Röhrchen, Zugeben von 10 ml an 6 N HI und Mischen durchgeführt. Das Gemisch wird in einem Trockeneis-Alkoholbad eingefroren. Ein Vakuum von < 50 μ wird angelegt und für 1 Minute gehalten, und das Röhrchen wird unter Vakuum versiegelt. Die Probe wird für 24 Stunden bei 110 + 1 hydrolysiert. Das Röhrchen wird abgekühlt und geöffnet. Das Hydrolysat wird durch Whitman Nr. 1-Papier filtriert. Das Röhrchen wird dreimal mit Wasser gespült, und jede Spülung wird filtriert. Das Filtrat wird bei 65°C unter Vakuum getrocknet. Das trockene Hydrolysat wird in einem für das Aminosäure-Analysegerät geeigneten Volumen an Puffer gelöst. Das Hydrolysat kann nicht für mehr als eine Woche vor Durchführung der Analyse gelagert werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen als eine Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung dienen, womit aber keine Beschränkung der Erfindung beabsichtigt ist. Die in diesen Beispielen 17, 18 und 19 verwendeten isolierten Kakaoprocyanidin-Oligomere wurden unter Anwendung der in US 5.554.645 (ausgegeben am 10.9.1996 an L. Romanczyk et al.) beschriebenen Verfahrensweise isoliert und weiter unter Anwendung der Verfahrensweise aus Methode B gereinigt.
  • Beispiel 1
  • Methode zum Erhalt von Kakaopolyphenol aus Kakaofeststoffen von Kakaobohnen
  • Handelsübliche Kakaobohnen mit einem Ausgangs-Feuchtigkeitsgehalt von etwa 7 bis 8 Gewichtsprozent wurden unter Verwendung eines 11'' × 56'' Scalperators (hergestellt von Carter Day International, Minneapolis, MN, USA) vorgereinigt. Etwa 600 Beutel Kakaobohnen (39.000 kg) wurden über einen Zeitraum von 6,5 Stunden vorgereinigt. Die Bohnen wurden in den Fülltrichter eingespeist, wobei die Fließgeschwindigkeit durch eine positive Einspeisewalze reguliert wurde. Die Bohnen wurden auf die Außenseite eines rotierenden Drahtnetz-Schälhaspel gespeist. Die Bohnen wanderten durch die Drahtnetz-Haspel und anschließend durch eine Luftansaugkammer, wo leichter Schmutz, Staub und Fäden aus dem Produktstrom abgesaugt wurden. Die Bohnen, die nicht durch die Schälhaspel wanderten, wurden zum Abfallstrom befördert. Dieser Abfallstrom bestand aus großen Klumpen von Bohnen, Hölzchen, Steinen etc. Die Menge an resultierendem Abfall betrug etwa 150 kg, oder 0,38% des Ausgangsmaterials. Das resultierende vorgereinigte Produkt wog etwa 38.850 kg und wurde zu dem Bohnenreinigungsschritt weitergeleitet.
  • Die vorgereinigten Bohnenprodukte aus dem Skalperator wurden dann unter Verwendung eines Camas International SV4-5 Air Fluidized Bed Density Separator (AFBDS, Mikroglaskugel-gefüllter Bettapparat zur Dichtetrennung, hergestellt von Camas International, Pocotello, ID., USA) weiter gereinigt. Etwa 38.850 kg an Kakaobohnenprodukten wurden in den AFBDS über einen Zeitraum von etwa 6,5 Stunden gespeist. Der Apparat entfernte im Wesentlichen alle groben Unreinheiten, wie etwa Steine, Metall, Glas, etc. von den Bohnen, als auch leichtere unbrauchbare Materialien, wie schimmelige und befallene Kakaobohnen, was ein gereinigtes Bohnenprodukt ergab, das im Wesentlichen lediglich brauchbare Kakaobohnen enthielt. Die resultierend entfernten schweren Unreinheiten wogen etwa 50 kg, und die leichten unbrauchbaren Materialen wogen etwa 151 kg. Insgesamt etwa 38.649 kg an gereinigten Bohnen wurden nach den hierin im obigen beschriebenen Vorreinigungs- und Reinigungsschritten erhalten (99,1% Ausbeute nach der Reinigung).
  • Die gereinigten Kakaobohnen wurden dann durch ein Infrarot-Heizgerät geschickt. Der verwendete Apparat war der elektrische schwingfähige Micro Red 20 Infrarot-Mikronisator (hergestellt von Micronizing Company (U. K.) Limited, U. K.). Der Mikronisator wurde bei einer Rate von etwa 1.701 kg pro Stunde betrieben. Die Tiefe der Bohnen in dem Vibrationsbett des Mikronisators betrug etwa 2 Inches oder etwa 2–3 Bohnen in der Tiefe. Die Oberflächentemperatur des Mikronisators war auf etwa 165°C eingestellt, was eine IBT von etwa 135°C ergab, für einen Zeitraum im Bereich von 1 bis 1,5 Minuten. Diese Behandlung bewirkte, dass die Schalen schnell trockneten und sich von den Kakaobohnenstückchen trennten. Da im Wesentlichen alle der in den Mikronisator eingespeisten Kakaobohnen ganze Bohnen waren, die im Wesentlichen frei von kleinen zerbrochenen Stücken von Bohne oder Schale waren, wurden keine Funken oder Feuerentwicklungen während des Infrarot-Heizschritts beobachtet. Die zerbrochenen Stücke, die durch das Vibrationssieb vor dem Mikronisator abgetrennt worden waren, wurden wieder in den Produktstrom vor dem Trennschritt eingeführt.
  • Die Bohnen aus dem Mikronisator wiesen einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 3,9 Gew.-% auf. Die Bohnen tauchten aus dem Mikronisator bei einer IBT von etwa 135°C auf und wurden sofort auf eine Temperatur von etwa 90°C innerhalb von etwa 3 Minuten zur Minimierung eines zusätzlichen Feuchtigkeitsverlusts abgekühlt. Die Gesamtmenge an nach dem Heizschritt vorhandenen Bohnen betrug etwa 36.137 kg.
  • Die Bohnen wurden dann der Trennung unter Verwendung eines Jupiter Mitra Seita Winnower (hergestellt von Jupiter Mitra Seita, Jakarta, Indonesien) unterzogen. Der Trennschritt zerdrückte die Bohnen, um die Schalen zu lockern, und trennte die leichteren Schalen von den Bohnenstückchen, wobei er zur selben Zeit die Menge an Bohnenstückchen minimierte, die mit dem Schalen-Abfallstrom verloren ging. Die Einspeiserate in den Winnower betrug etwa 1.591 kg pro Stunde. Die resultierenden Produkte enthielten etwa 31.861 kg an brauchbaren Bohnenstückchen und 4.276 kg an Abfallschalen. Die Gesamtausbeute an brauchbaren Bohnenstückchen aus dem Ausgangsmaterial betrug etwa 81,7%.
  • Die resultierenden Kakaobohnenstückchen wurden unter Verwendung eines Dupps 10-6 Pressors (hergestellt von The Dupps Company, Germantown, Ohio, USA) gepresst. Eine ständige gleichbleibende Einspeisung von etwa 1.402 kg pro Stunde an Bohnenstückchen wurde in zwei Schraubenpressen zur Extrahierung der Butter eingespeist. Die Presse erzeugte etwa 16.198 kg an Kakaobutter, die etwa 10% Kakaofeststoffe enthielt, und etwa 15.663 kg an Kakaofeststoffen, die etwa 10% Butter enthielten.
  • Die Kakaobutter wurde unter Verwendung einer Sharples P3000 Dekantier-Zentrifuge (hergestellt von Jenkins Centrifuge Rebuilders, N. Kansas City, MO, USA) weiterverarbeitet. Die Zentrifugation reduzierte den Feststoffgehalt in der Butter auf etwa 1 – 2% Feststoffe und erbrachte etwa 13.606 kg Butter und 2.592 kg Kakaofeststoffe, die etwa 40 bis 45% Butter enthielten. Die Butter, die 1 – 2% Feststoffe enthielt, wurde unter Verwendung eines Platten-und-Rahmenfilters (hergestellt von Jupiter Mitra Seita) weiter verarbeitet, der die verbliebenen Feststoffe von der Butter entfernte und etwa 13.271 kg an klarer Kakaobutter und etwa 335 kg an Kakaofeststoffen, die 40–45% Butter enthielten, erbrachte.
  • Die aus der Zentrifuge und der Filterpresse entfernten Kakaofeststoffe enthielten etwa 40–45% Fett und wurden in eine hydraulische Chargenpresse gepresst, was einen Kakaokuchen mit 10% Fett erzeugte. Dieses Material erbrachte etwa 1.186 kg an klarer Butter und 1.742 kg an Kakaofeststoffen.
  • Die Gesamtausbeute an klarer Butter aus den eingespeisten Bohnen betrug 14.456 kg, oder 37,1%. Die insgesamt erzeugten Kakaofeststoffe aus den eingespeisten Bohnen betrugen 17.405 kg, oder 44,6%.
  • Eine Probe des teilweise entfetteten Kakaopulvers aus Kakaofeststoffen, das gemäß dem oben beschriebenen Vorgang aus unfermentierten Kakaobohnen (Fermentationsfaktor 100) erzeugt wurde, enthielt die folgenden Procyanidin-Konzentrationen: Gesamtprocyanidin 32.743 μg/g, Procyanidin 9.433 μg/g, Procyanidin-Dimer 5.929 μg/g, Procyanidin-Trimer 5.356 μg/g, Procyanidin-Tetramer 4.027 μg/g, Procyanidin-Pentamer 3.168 μg/g, Procyanidin-Hexamer 2.131 μg/g, Procyanidin-Heptamer 1.304 μg/g, Procyanidin-Octamer 739 μg/g, Procyanidin-Nonamer 439 μg/g.
  • Beispiel 2
  • Produktion von Kakaopolyphenole enthaltendem Schokoladenlikör
  • Sulawesi-Kakaobohnen einer Durchschnittsqualität (FAQ) mit einem Ausgangs-Feuchtigkeitsgehalt von 7,4 Gew.-% und einem Fermentationsfaktor von 233 (31% Schieferfarben, 29% Violett, 22% Violett-Braun und 17% Braun) wurden als dem Ausgangsmaterial ausgewählt. Die Kakaobohnen wurden dann durch einen Infrarot-Heizapparat geschickt. Der verwendete Apparat war ein Infrarot-Vibrationsmikronisator (hergestellt von Micronizer Company (U. K.) Limited, U. K.). Die Einspeiserate der Bohnen durch das Infrarot-Heizgerät und die Bettneigung des Infrarot-Heizgeräts wurden zur Kontrolle der Menge an Heizbehandlung, die die Bohnen erhielten, variiert. Die Menge an Zeit, die die Bohnen in dem Infrarot-Heizgerät verbrachten (Verweildauer), wurde durch die Bettneigung und die Einspeiserate bestimmt. Die angewendeten Zeitdauern zur Herstellung der Materialien sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgelistet. Am Ausgang des Mikronisators wurde die Innentemperatur (IBT) der Bohnen gemessen, wobei diese Werte ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt sind.
  • Eine 1 kg-Probe der Infrarot-beheizten Bohnen, die aus dem Infrarot-Heizgerät bei verschiedenen IBTs entnommen wurden, wurden in kleinere Stücke zerdrückt. Dies wurde zur Erleichterung der Trennung der Bohnenstückchen von der Schale vorgenommen. Das zur Entfernung der Schale verwendete Laborgerät war der Limiprimita Cocao Breaker, hergestellt von der John Gordon Co. LTD of England. Die zerdrückten Bohnen wurden als Nächstes durch ein Trennsystem im Labor-Maßstab unter Verwendung eines Catador CC-1, hergestellt von der John Gordon Co. LTD., England, geschickt.
  • Die Kakaobohnenstückchen wurden als nächstes zu einem groben Likör unter Verwendung einer Melange, hergestellt von Pascal) Engineering Co. Limited, England, gemahlen. Dieses Gerät zerstößt und mahlt die Bohnenstückchen zu einem Schokoladenlikör. Die normale Betriebstemperatur für den Likör in der Melange beträgt etwa 50°C. Derselbe Prozess zur Verarbeitung der Bohnenstückchen zu einem groben Likör könnte in einem größeren Produktionsmaßstab unter Verwendung anderer Mühlenarten vorgenommen werden, wie etwa einer Carle & Montanari-Mühle. Die Kakaobohnenstückchen wurden in der Melange für eine Stunde gemahlen. Die Konzentration der Kakaoprocyanidine wurde für die Proben relativ zu den Infrarot-Heiztemperaturen gemessen. Diese Werte sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1
    IBT °C Verweildauer im Mikronisator (Sekunden) Feuchtigkeit im fertigen Likör (%) Procyanidin im entfetteten Likör [μg/g] gesamte Procyanidine im entfetteten Likör [μg/g]
    107 42 3,9 3.098 39.690
    126 82 1,87 1.487 28.815
    148 156 1,15 695 23.937
  • Beispiel 3
  • Schokoladen-Nahrungsmittelprodukt
  • Ein 10 lb Sigma-Paddelmixer (hergestellt von Teledyne Read Co., York, Pennsylvania) wurde zum Vermischen der Inhaltsstoffe innerhalb der unten angegebenen Konzentrationsbereiche verwendet. Die Auswahl der geeigneten Inhaltsstoffe und die Mengenermittlung innerhalb des angegebenen Bereichs zur Herstellung einer Schokolade lassen sich durch einen Fachmann des Gebiets ohne übermäßiges Experimentieren ohne weiteres vornehmen.
    Inhaltsstoff % Konzentration (nach Gewicht)
    Sucrose 40%
    Schokoladenlikör 7%
    CP-Likör (Bsp. 2) 49%
    Fett 3,5%
    Lecithin 0,5%
  • Das Lecithin und das Fett wurden kombiniert und unter Verwendung eines 10 lb Sigma-Messermixers bis zur Homogenität vermischt. Das resultierende Fett/Lecithin-Gemisch wurde der granulierten Sucrose in einem zweiten 10 lb. Sigma-Mixer zugegeben. Sucrose, Fett und Lecithin wurden bei etwa 35°C bis etwa 90°C bis zur Homogenität gemischt. Die verbliebenen Bestandteile, einschließlich des Schokoladenlikörs aus Beispiel 2 mit einer hohen Konzentration an Kakaoprocyanidinen, wurden zugegeben und bis zur Homogenität gemischt. Das resultierende Gemisch wurde bis zu einer Mikrometer-Partikelgröße von etwa 20 Mikronen raffiniert, konchiert und standardisiert. Die Konzentration des Kakaoprocyanidin-Pentamers der resultierenden Schokolade rangierte von etwa 385 bis 472 μg pro Gramm der Schokolade.
  • Erdnüsse in einer Menge von etwa 5–30 Gew.-% des Endprodukts werden zum Erhalt eines Schokolade-enthaltenden Erdnussprodukts zugegeben, das reich an Kakaoprocyanidinen und L-Arginin ist.
  • Beispiel 4
  • Erdnussbutter-Nahrungsmittelprodukt
  • Vorgeröstete Erdnüsse werden unter Zugabe von Salz und Zucker je nach Wunsch gemahlen, um eine Erdnussbutter herzustellen. Während des Mischens wird das Kakaopulver aus Beispiel 1, das einen hohen Kakaoprocyanidin-Gehalt aufweist, dem Gemisch in einer Menge von etwa 2 bis 3 Gewichtsprozent des Gesamtgemischs zugegeben. Das Produkt ist eine Erdnussbutter, die Kakaopolyphenole und L-Arginin enthält.
  • Beispiel 5
  • Pharmazeutische Zusammensetzung
  • Ein Tablettengemisch wird hergestellt, welches die folgenden Inhaltsstoffe enthält (Prozentangaben in Gewichtsprozent):
    Kakaopulver aus Beispiel 1 –24,0%
    L-Arginin –5,0%
    natürlicher Vanilleextrakt –1,5
    Magnesiumstearat (Gleitmittel) –0,5%
    Dipac-Tablettierzucker –32,0%
    Xylitol –37,0
  • Das Kakaopulver, der Vanilleextrakt und L-Arginin werden in einem Nahrungsmittelprozessor für mehrere Minuten miteinander vermischt. Die Zucker und das Magnesiumstearat werden vorsichtig miteinander vermischt, gefolgt von Mischen mit dem Kakaopulver/Vanilleextrakt/L-Arginin-Gemisch. Dieses Material wird durch eine Manesty Tablettenpresse (B3B) bei Maximaldruck und Verdichtung zum Erhalt von runden Tabletten (15 mm × 5 mm), die 1,5 bis 1,8 Gramm wiegen, geschickt.
  • Beispiel 6
  • Zartbitterschokolade
  • Eine Zartbitterschokolade wird in einer im Wesentlichen ähnlichen Weise zu dem in Beispiel 3 beschriebenen Prozess unter Verwendung des folgenden allgemeinen Rezepts hergestellt:
    Bereich der Bestandteile (Gew.-%)
    15–35% Sucrose
    40–75% CP-Likör aus Bsp. 2
    1–10% CP-Kakaopulver aus Bsp. 1
    1–10% Fett
    0,01–0,05% Vanillin
    0,1–1,0% Lecithin
    Erdnüsse in einer Menge von etwa 5 bis 30 Gewichtsprozent des Gesamtprodukts werden der Zartbitterschokolade zugegeben.
  • Beispiel 7
  • Milchschokolade
  • Eine Milchschokolade wird in einer im Wesentlichen ähnlichen Weise zu dem in Beispiel 3 beschriebenen Prozess unter Verwendung des folgenden allgemeinen Rezepts hergestellt:
    Bereich der Bestandteile (Gew.-%)
    35–55% Sucrose
    12–25% Milchbestandteil
    10–20% CP-Likör aus Bsp. 2
    15–25% Fett
    0,1–1,0% Emulgator
    0,1–1,0% Lecithin
    Mandeln in einer Menge von etwa 5 bis 30 Gewichtsprozent des Gesamtprodukts werden der Schokolade zugegeben.
  • Beispiel 8
  • Erdnussbutter-Sojakeks-Riegel, eingehüllt in eine Zartbitterschokolade mit hohem CP
    Inhaltsstoff % Bereich
    Zartbitterschokolade 3,4 mg pro g Schokolade 35 30–40
    Erdnüsse 32 30–40
    Sojamehl, fettarm 11 10–15
    Pflanzenöl 5 2–10
    Zucker 15 10–20
    Wasser 1,5
    Salz < 1
    Karamellsiruplösung < 1
    Natriumbicarbonat < 1
    Propylgallat < 1
  • Die Erdnussbutter wird durch Kombinieren der Erdnüsse, Zucker, Pflanzenöl, Salz und Propylgallat zubereitet. Die Kekse werden durch Kombinieren von Sojamehl, Wasser, Pflanzenöl und Natriumbicarbonat, und Backen hergestellt. Die Erdnussbutter wird dann auf die gebackenen Kekse extrudiert, und der gesamte Riegel wird in die Zartbitterschokolade mit hohem CP eingehüllt.
  • Basierend auf dem Kakaoprocyanidin, Nussprocyanidinen und Arginin-Gehalt der Bestandteile des Rezepts sind die theoretischen Procyanidin- und L-Arginin-Konzentrationen nachstehend gezeigt:
    gesamte Procyanidine 120 mg/100 g
    L-Arginin 1,4 g/100 g
  • Beispiel 9
  • Trockenmixgetränk, enthaltend Kakao mit hohen CP und L-Arginin
  • Ein Trockenmixgetränk, enthaltend das Kakaopulver aus Beispiel 1 mit erhöhten Mengen an Kakaopolyphenolen (CPs) und L-Arginin wird gemäß den folgenden Formulierungen hergestellt:
    Inhaltsstoff %
    Zucker 59
    Magermilchpulver 20
    Malzpulver 1,9
    CP-Kakaopulver 25–50 mg/g Kakaopulver 8,0
    Erdnussmehl 10,0
    Vanillin < 0,01
    Lecithin < 0,995
    Salz < 0,1
    Geschmacksstoffe < 0,1
  • Die trockenen Bestandteile wurden gemäß der obigen Formulierung aufeinander folgend eingefüllt und für eine Stunde in einem Kitchen Aid Professional Mixer (Modell KSM50P) unter Verwendung eines Schneebesens bei Geschwindigkeitsstufe 2 gemischt. Da Lecithin wird vor der Verwendung in dem Rezept in einem Niro-Aeromatic Agglomerator (Modell STREA/1) agglomeriert.
  • Basierend auf dem Kakaoprocyanidin, Nussprocyanidin und Arginin-Gehalt der Bestandteile des Rezepts sind die theoretischen Procyanidin- und L-Arginin-Konzentrationen wie nachstehend gezeigt:
    Procyanidine 200–400 mg/100 g
    L-Arginin 0,9 g/100 g
  • Beispiel 10
  • Nuss und Samen-Riegel mit Kakaoextrakt
    Mandeln 30
    Kürbissamen 12
    Sonnenblumensamen 5
    Sesamsamen 5
    Salz < 1
    Butter 10
    Maissirup 7,6
    Lecithin < 1
    Zucker 26
    Kakaoextrakt 4
  • Die Mandeln werden in gesalzener Butter leicht angeröstet. Dem werden die Kürbissamen, Sonnenblumensamen und Sesamsamen zugegeben. Butter, Maissirup, Lecithin und Salz werden kombiniert und in einem Mikrowellenofen bei halber Leistung für 1 Minute erhitzt. Zucker wird in eine Edelstahl-Pfanne eingebracht und auf einem Induktionskocher bei voller Leistung gekocht. Ist der Zucker vollständig geschmolzen, so wird die Hitze auf halbe Leistung (290°F) herabgesetzt und der Zucker weiter gekocht, bis er vollständig geschmolzen und honigfarben ist. Ist der Zucker vollständig geschmolzen, so wird er dem Maissirup/Butter-Gemisch langsam zugegeben und vermengt. Die Nussmischung wird in einen Standmixer eingebracht. Der Sirup wird vorsichtig in die Nussmischung bei halber Paddel-Geschwindigkeit gegossen. Das Nuss/Sirup-Gemisch wird zu Riegeln geformt und abgekühlt.
  • Basierend auf dem Kakaoprocyanidin, Nussprocyanidin und Arginin-Gehalt der Bestandteile des Rezepts sind die theoretischen Procyanidin- und L-Arginin-Konzentrationen wie nachstehend gezeigt:
    Procyanidine 1586 mg/100 g
    L-Arginin 1,6 g/100 g
  • Beispiel 11
  • Erdnuss-Karamell-Nougat-Riegel, eingehüllt in eine Zartbitterschokolade mit hohem CP
    % Formel
    CP-Zartbitterschokolade 31,5
    Erdnüsse w/Häute 30,0
    Karamell 27,0
    Nougat 11,5
  • Ein Nougatgemisch wird hergestellt, das 45% Erdnüsse enthält und welches auf einen Kühltisch plattenförmig ausgestrichen und in rechteckige Riegel geschnitten wird. Ein Karamellgemisch wird hergestellt, das etwa 38% Erdnüsse enthält, und dieses abgekühlt und in ähnliche Stücke geschnitten. Das Nougat wird mit den Karamellplatten bedeckt und der gesamte Riegel in Schokolade gehüllt, die etwa 10% Erdnüsse enthält.
  • Basierend auf dem Kakaoprocyanidin, Nussprocyanidin und Arginin-Gehalt der Bestandteile des Rezepts sind die theoretischen Procyanidin- und L-Arginin-Konzentrationen wie nachstehend gezeigt:
    Procyanidine 260 mg/100 g
    L-Arginin 1 g/100 g
  • Beispiel 12
  • Kakaoquelle und Herstellungsmethode
  • Mehrere Theobroma cacao-Genotypen, die die drei anerkannten hortikulturellen Rassen des Kakao vertreten (Enriquez, 1967; Engels, 1981) wurden aus den drei wichtigsten Kakao-produzierenden Regionen der Welt erhalten. Eine Liste dieser Genotypen ist in Tabelle 2 gezeigt. Andere Spezies von Theobroma-Kakao und seiner eng verwandten Gattung Herranina werden sich ebenfalls zur Verwendung hierin eignen. TABELLE 2 Beschreibung des Theobroma Kakao-Quellenmaterials
    GENOTYP URSPRUNG HORTIKULURELLE RASSE
    UIT-1 Malaysien Trinitario
    unbekannt Westafrika Foraster
    ICs-100 Brasilien Trinitario (nicaraguanischer Criollo-Vorfahre)
    ICS-39 Brasilien Trinitario (nicaraguanischer Criollo-Vorfahre)
    UF-613 Brasilien Trinitario
    EEG-48 Brasilien Forastero
    UF-12 Brasilien Trinitario
    NA-33 Brasilien Forastero
  • Die geernteten Kakaofrüchte wurden geöffnet, und die unterfermentierten Bohnen mit der Pulpe wurden entfernt und gefriergetrocknet. Die Pulpe wurde manuell entfernt. Die Bohnen wurden manuell geschält und zu einer feinen pulverigen Masse mit einer TEKMAR-Mühle gemahlen. Die resultierende Masse wurde dann über Nacht mittels Soxhlet-Extraktion unter Verwendung von redestilliertem Hexan als dem Lösungsmittel entfettet. Das restliche Lösungsmittel wurde von der entfetteten Masse durch Vakuum bei Raumtemperatur entfernt.
  • Beispiel 12
  • Procyanidin-Extraktionsverfahren
  • A. Methode 1
  • Procyanidine wurden aus den entfetteten, unfermentierten, gefriergetrockneten Kakaobohnen des Beispiels 11 unter Anwendung einer Modifikation der von Jalal und Collin (1977) beschriebenen Methode extrahiert. Procyanidine wurden aus 50 Gramm-Chargen der entfetteten Kakaomasse mit 2.400 ml an 70% Aceton/entionisiertem Wasser, gefolgt von 400 ml an 70% Methanol/entionisiertem Wasser extrahiert. Die Extrakte wurden gepoolt und die Lösungsmittel wurden durch Verdampfung bei 45°C mit einem Rotationsverdampfer, der unter Teilvakuum gehalten wurde, entfernt. Die resultierende wässrige Phase wurde mit entionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt und zweimal mit 400 ml CHCl3 extrahiert. Die Lösungsmittelphase wurde verworfen. Die wässrige Phase wurde dann viermal mit 500 ml Ethylacetat extrahiert.
  • Jegliche resultierenden Emulsionen wurden durch Zentrifugation auf einer Sorvall RC 28S-Zentrifuge, betrieben bei 2000 x Schwerkraft für 30 Min. bei 10°C mit einem unter Teilvakuum gehaltenen Rotationsverdampfer, aufgebrochen. Die resultierende wässrige Phase wurde in Flüssig-N2 eingefroren, gefolgt von Gefriertrocknen auf einem LABCONCO Gefriertrocknungssystem. Die Ausbeuten an Rohprocyanidinen, die von den verschiedenen Kakao-Genotypen erhalten wurden, sind in Tabelle 3 aufgelistet. TABELLE 3 Ausbeuten an Rohprocyanidin
    GENOTYP URSPRUNG AUSBEUTEN (g)
    UIT-1 Malaysien 3,81
    unbekannt Westafrika 2,55
    ICS-100 Brasilien 3,42
    ICS-39 Brasilien 3,45
    UF-613 Brasilien 2,98
    EEG-48 Brasilien 3,15
    UF-12 Brasilien 1,21
    NA-33 Brasilien 2,23
  • B. Methode 2
  • Alternativ wurden die Procyanidine aus den entfetteten, unfermentierten, gefriergetrockneten Kakaobohnen aus Beispiel 1 mit 70% wässrigem Aceton extrahiert. Zehn Gramm des entfetteten Materials wurden mit 100 ml Lösungsmittel für 5–10 Min. aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde für 15 Min.. bei 4°C bei 3.000 x Schwerkraft zentrifugiert, und der Überstand wurde durch Glaswolle passiert. Das Filtrat wurde einer Destillation unter Teilvakuum unterzogen, und die resultierende wässrige Phase wurde in Flüssig-N2 eingefroren, gefolgt von einer Gefriertrocknung auf einem LABCONCO Gefriertrocknungssystem. Die Ausbeuten an Rohprocyanidinen lagen im Bereich von 15–20%.
  • Es wird angenommen, dass die Differenzen in den Rohausbeuten Variationen widerspiegeln, wie sie bei den verschiedenen Genotypen, geographischen Ursprüngen, hortikulturellen Rassen und Herstellungsmethoden vorkommen.
  • Beispiel 13
  • Partielle Reinigung der Kakaoprocyanidine
  • A. Gelpermeationschromatographie
  • Die in Beispiel 12 erhaltenen Procyanidine wurden durch Flüssigchromatographie auf Sephadex LH-20 (28 × 2,5 cm) teilgereinigt. Die Trennungen wurden durch einen Stufengradienten von entionisiertem Wasser in Methanol unterstützt. Die anfängliche Gradientenzusammensetzung begann mit 15% Methanol in entionisiertem Wasser, was schrittweise alle 30 Min. gefolgt war von 25% Methanol in entionisiertem Wasser, 35% Methanol in entionisiertem Wasser, 70% Methanol in entionisiertem Wasser und schließlich 100% Methanol. Der auf die Elution der Xanthinalkaloide (Caffein und Theobromin) folgende Ablauf wurde als eine einzelne Fraktion gesammelt. Die Fraktion erbrachte eine Xanthinalkaloid-freie Subfraktion, die einer weiteren Subfraktionierung zum Erhalt von 5 Subfraktionen unterzogen wurde, die als MM2A bis MM2E bezeichnet wurden. Das Lösungsmittel wurde von jeder Subfraktion durch Verdampfen bei 45°C mit einem unter Teilvakuum gehaltenen Rotationsverdampfer entfernt. Die resultierende wässrige Phase wurde in Flüssig-N2 eingefroren und über Nacht auf einem LABCONCO Gefriertrocknungssystem gefriergetrocknet. Eine repräsentative Gelpermeationschromatographie, die die Fraktionierung zeigt, ist in 2 gezeigt. Etwa 100 mg des Materials wurden in dieser Weise subfraktioniert. Chromatographische Bedingungen: Säule; 28 × 2,5 cm Sephadex LH-20, Mobile Phase: Methanol/Wasser-Stufengradient, 15:85, 25:75, 35:65, 70:30, 100:0, gestuft in halbstündigen Intervallen, Fließgeschwindigkeit; 1,5 ml/Min., Detektor; UV: bei λ1 = 254 nm und λ2 = 365 nm, Bildlauf: 9,5 mm/Min., Säulenbeladung: 120 mg.
  • B. Semi-präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)
  • Methode 1. Umkehrphasentrennung
  • Aus Beispiel 2 und/oder 3A erhaltene Procyanidine wurden mittels semi-präparativer HPLC teilgereinigt. Ein Hewlett Packard 1050 HPLC-System, ausgestattet mit einem variablen Wellenlängen-Detektor, Rheodyne 7010-Injektionsventil mit 1 ml Injektionsschleife, wurde mit einem Pharmacia FRAC-100 Fraktionssammler zusammengesetzt. Die Trennungen wurden auf einer Phenomenex UltracarbTM 10 μ ODS-Säule (250 × 22,5 mm), verbunden mit einer Phenomenex 10 μ ODS UltracarbTM (60 × 10 mm) Vorsäule, vorgenommen. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Wasser; B = Methanol, die unter den folgenden linearen Gradientenbedingungen verwendet wurde: (Zeit, %A); (0, 85), (60, 50), (90, 0) und (110, 0) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min.. Die Verbindungen wurden durch UV bei 254 nm detektiert.
  • Eine repräsentative semi-präparative HPLC-Spur ist in 15N für die Trennung von in Fraktion D + E vorhandenen Procyanidinen gezeigt. Individuelle Peaks oder ausgewählte chromatographische Regionen wurden in festgesetzten Intervallen entnommen oder manuell durch Fraktionsentnahme für die weitere Reinigung und anschließende Auswertung entnommen. Die Injektionsladungen lagen im Bereich von 25–100 mg an Material.
  • Methode 2: Normalphasen-Trennung
  • Aus Beispiel 2 und/oder 3A erhaltene Procyanidinextrakte wurden mittels semi-präparativer HPLC teilgereinigt. Ein Hewlett Packard 1050 HPLC-System, ausgestattet mit einem Millipore-Waters Model 480 LC-Detektor, eingestellt auf 254 nm, wurde mit einem Pharmacia FRAC-100 Fraktionssammler, eingestellt auf Peak-Modus, zusammengesetzt. Die Trennungen wurden auf einer Supelco 5 μm Supelcosil LC-Si-Säule (250 × 10 mm), verbunden mit einer Supelco 5 μm Supelguard LC-Si-Vorsäule (20 × 4,6 mm), vorgenommen. Die Procyanidine wurden mittels eines linearen Gradienten unter den folgenden Bedingungen eluiert: (Zeit, %A, %B); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 46, 50), (65, 10, 86), gefolgt von einer 10-minütigen Reäquilibration. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Dichlormethan; B = Methanol; und C = Essigsäure:Wasser (1:1). Eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. wurde angewendet. Die Komponenten wurden mittels UV bei 254 nm nachgewiesen und auf einem Kipp & Zonan BD41-Recorder aufgezeichnet. Die Injektionsvolumina lagen im Bereich von 100 bis 250 μl von 10 mg der Procyanidinextrakte, gelöst in 0,25 ml an 70% wässrigem Aceton. Eine repräsentative semi-präparative HPLC-Spur ist in 2 gezeigt. Individuelle Peaks oder ausgewählte chromatographische Regionen wurden bei festgesetzten Intervallen oder manuell durch Fraktionsentnahme zur weiteren Reinigung und anschließenden Auswertung gesammelt.
    HPLC-Bedingungen: 250 × 10 mm Supelco Supelcosil LC-Si
    (5 μm) semi-präparative Säule
    20 × 4,6 mm Supelco Supelcosil LC-Si
    (5 μm) Vorsäule
    Detektor: Waters LC
    Spektrophotometer Modell 480 bei 254 nm
    Fließgeschwindigkeiten: 3 ml/Min.
    Säulentemperatur: Raumtemperatur
    Injektion: 250 μl an 70% wässrigem Acetonextrakt
    Gradient: Zeit (Min.) CH2Cl2 Methanol Essigsäure: H2O (1:1)
    0 62 14 4
    30 67,6 28,4 4
    60 46 50 4
    65 10 86 4
    70 10 86 4
  • Beispiel 14
  • HPLC-Reiniqungsmethoden
  • Methode A. GPC-Reinigung
  • Die wie in Beispiel 12 erhaltenen Procyanidine wurden mittels Flüssigchromatographie auf Sephadex LH 20 (72,5 × 2,5 cm) unter Verwendung von 100% Methanol als dem eluierenden Lösungmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 3,5 ml/Min. teilgereinigt. Fraktionen des Eluent wurden nach den ersten 1,5 Stunden entnommen, und die Fraktionen wurden mittels Rotationsverdampfer konzentriert, in Wasser wieder gelöst und gefriergetrocknet. Diese Fraktionen wurden als Pentamer-angereicherte Fraktionen bezeichnet. Etwa 2,00 g des aus Beispiel 2 erhaltenen Extrakts wurden in dieser Weise subfraktioniert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Zusammensetzung der erhaltenen Fraktionen
    Fraktion (Zeit) Monomer (% Fläche) Dimer (% Fläche) Trimer (% Fläche) Tetramer (% Fläche) Pentamer (% Fläche) Hexamer (% Fläche)
    1:15 73 8 16 3 Nd Nd
    1:44 67 19 10 3 1 Sp
    2:13 30 29 24 11 4 1
    2:42 2 16 31 28 15 6
    3:11 1 12 17 25 22 13
    3:40 Sp 18 13 18 20 15
    4:09 Sp 6 8 17 21 19
    Fraktion (Zeit) Heptamer (% Fläche) Oktamer (% Fläche) Nonamer (% Fläche) Dekamer (% Fläche) Undekamer (% Fläche) Weitere (% Fläche)
    1:15 Nd Nd Nd Nd Nd Nd
    1:44 Sp Sp Sp Sp Sp Sp
    2:13 1 Sp Sp Sp Sp Sp
    2:42 2 Sp Sp Sp Sp Sp
    3:11 7 1 Sp Sp Sp Sp
    3:40 10 2 2 Sp Sp Sp
    4:09 14 4 4 2 Sp Sp
    Nd = nicht detektiert
    Sp = Spurenmenge
  • Methode B. Normalphasen-Trennung
  • Die wie in Beispiel 12 erhaltenen Procyanidine wurden getrennt, mittels Normalphasen-Chromatographie auf Supelcosil LC-Si, 100 Å, 5 μm-Säule (250 × 4,6 mm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min., oder alternativ dazu, Lichrosphere Kieselgel 100, 100 Å, 5 μm (235 × 3,2 mm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. gereinigt. Die Trennungen wurden durch einen Stufengradienten unter den folgenden Bedingungen vorgenommen: (Zeit, %A, % B); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86). Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Dichlormethan; B = Methanol; und C = Essigsäure:Wasser (1:1). Die Komponenten wurden durch Fluoreszenz nachgewiesen, worin λex = 276 nm und λem = 360 nm, und durch UV bei 280 nm. Das Injektionsvolumen betrug 5,0 μl (20 mg/ml) der in Beispiel 2 erhaltenen Procyanidine. Diese Ergebnisse sind in 4A und 4B gezeigt.
  • In der Alternative wurden die Trennungen durch einen Stufengradienten unter den folgenden Bedingungen vorgenommen: (Zeit, %A, %B); (0, 76, 20); (25, 46, 50); (30, 10, 86). Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Dichlormethan; B = Methanol; und C = Essigsäure:Wasser (1:1). Die Ergebnisse sind in 4A und 4B gezeigt.
  • Methode C. Umkehrphasen-Trennung
  • Die wie in Beispiel 12 erhaltenen Procyanidine wurden getrennt und mittels Umkehrphasen-Chromatographie auf Hewlett Packard Hypersil ODS 5 μm-Säule (200 × 2,1 mm) und einer Hewlett Packard Hypersil OSD 5 μm-Vorsäule (20 × 2,1 mm) gereinigt. Die Procyanidine wurden mit einem linearen Gradienten von 20% B in A in 20 Minuten eluiert, gefolgt von einem Säulenwaschgang mit 100% B bei einer Fließgeschwindigkeit von 9,3 ml/Min.. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war ein entgastes Gemisch von B = 1,0% Essigsäure in Methanol und A = 2,0% Essigsäure in nanoreinem Wasser. Die Komponenten wurden mittels UV bei 280 nm und einer Fluoreszenz, worin λex = 276 nm und λem = 316 nm war, nachgewiesen; das Injektionsvolumen betrug 2,0 μl (20 mg/ml).
  • Beispiel 15
  • HPLC-Trennung der Pentamer-angereicherten Fraktionen
  • Methode A. Semi-präparative Normalphasen-HPLC
  • Die Pentamer-angereicherten Fraktionen wurden mittels semi-präparativer Normalphasen-HPLC mit einem Hewlett Packard 1050 HPLC-System, ausgestattet mit einem Millipore-Waters-Modell 480 LC-Detektor, eingestellt auf 254 nm, welches mit einem Pharmacia Frac-100 Fraktionssammler, eingestellt auf Peak-Modus, zusammengesetzt war, weiter gereinigt. Die Trennungen wurden auf einer Supelco 5 μm Supelcosel LC-Si, 100 Å-Säule (250 × 10 mm), verbunden mit einer Supelco 5 μm Supelguard LC-Si-Vorsäule (20 × 4,6 mm) vorgenommen. Die Procyanidine wurden mittels eines linearen Gradienten unter den folgenden Bedingungen eluiert: (Zeit, %A, %B); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), gefolgt von einer 10-minütigen Reäquilibrierung. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Dichlormethan; B = Methanol; und C = Essigsäure:Wasser (1:1). Eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. wurde angewendet. Die Komponenten wurden mittels UV bei 254 nm nachgewiesen und auf einem Kipp & Zonan BD41-Recorder aufgezeichnet. Die Injektionsvolumina lagen im Bereich von 100 bis 250 μl von 10 mg der Procyanidinextrakte, gelöst in 0,25 ml an 70% wässrigem Aceton. Individuelle Peaks oder ausgewählte chromatographische Regionen wurden bei festgesetzten Intervallen oder manuell durch Fraktionsentnahme für die weitere Reinigung und anschließende Auswertung gesammelt.
    HPLC-Bedingungen: 250 × 100 mm Supelco Supelcosil LC-Si
    (5 μm) semi-präparative Säule
    20 × 4,6 mm Supelco Supelcosil LC-Si
    (5 μm) Vorsäule
    Detektor: Waters LC
    Spektrophotometer Modell 480 bei 254 nm
    Fließgeschwindigkeiten: 3 ml/Min.
    Säulentemperatur: Raumtemperatur
    Injektion: 250 μl an Pentamer-angereichertem Extrakt
    Gradient CH2Cl2 Methanol Essigsäure:Wasser (1:1)
    0 62 14 4
    30 67,6 28,4 4
    60 46 50 4
    65 10 86 4
    70 10 86 4
  • Methode B. Umkehrphasen-Trennung
  • Die wie in Beispiel 15 erhaltenen Procyanidin-Extrakte wurden durch einen 0,45 μ Nylonfilter filtriert und mittels eines Hewlett Packard 1090 ternäre Phase-HPLC-Systems, ausgestattet mit einem Diodenarray-Detektor und einem HP Modell 1046A programmierbaren Fluoreszenz-Detektor, analysiert. Die Trennungen wurden bei 45°C auf einer Hewlett Packard 5 μ Hypersil ODS-Säule (200 × 2,1 mm) bewirkt. Die Procyanidine wurden mit einem linearen Gradienten von 60% B in A eluiert, gefolgt von einem Säulenwaschgang mit B bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/Min.. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war ein entgastes Gemisch aus B = 0,5% Essigsäure in Methanol und A = 0,5% Essigsäure in nanoreinem Wasser. Die Essigsäuremengen in A und B der mobilen Phase können auf 2% erhöht werden. Die Komponenten wurden mittels Fluoreszenz nachgewiesen, worin λex = 276 nm und λem = 316 nm, und durch UV bei 280 nm. Die Konzentrationen von (+)-Catechin und (–)-Epicatechin wurden relativ zu den Referenz-Standardlösungen bestimmt. Die Procyanidinmengen wurden unter Verwendung des Reaktionsfaktors für (–)-Epicatechin bewertet.
  • Methode C. Normalphasen-Trennung
  • Wie in Beispiel 15 erhaltene Pentamer-angereicherte Procyanidinextrakte wurden durch einen 9,45 μ Nylonfilter filtriert und mittels eines Hewlett Packard 1090 Series II HPLC-Systems, ausgestattet mit einem HP Modell 1046A programmierbaren Fluoreszenz-Detektor und Diodenarray-Detektor, analysiert. Die Trennungen wurden bei 37°C auf einer 5 μ Phenomenex Lichrosphere Kieselgel 100-Säule (250 × 3,2 mm), verbunden mit einer Supelco Supelguard LC-Si 5 μ-Vorsäule (20 × 4,6 mm), vorgenommen. Die Procyanidine wurden mittels eines linearen Gradienten unter den folgenden Bedingungen eluiert: (Zeit, %A, %B); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (7, 10, 86), gefolgt von einer 8-minütigen Reäquilibration. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Dichlormethan; B = Methanol; und C = Essigsäure:Wasser bei einem Volumenverhältnis von 1:1. Eine Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. wurde verwendet. Die Komponenten wurden mittels Fluoreszenz nachgewiesen, worin λex = 276 nm und λem = 316 nm, oder durch UV bei 280 nm. Ein repräsentatives HPLC-Chromatogramm, das die Trennung der verschiedenen Procyanidine zeigt, ist in 4 für einen Genotyp gezeigt. Ähnliche HPLC-Profile wurden von anderen Theobroma, Herrania und/oder deren inter- oder intra-spezifischen Kreuzungen erhalten.
    HPLC-Bedingungen: 250 × 3,2 mm Phenomenex Lichrosphere Kieselgel 100 Säule (5 μ)
    20 × 4,6 mm Supelco Supelguard LC-Si (5 μ) Vorsäule
    Detektoren: Photodioden-Array bei 280 nm
    Fluoreszenz: λex = 276 nm und λem = 316 nm
    Fließgeschwindigkeit: 9,5 ml/Min.
    Säulentemperatur: 37°C
    Gradient CH2Cl2 Methanol Essigsäure:Wasser (1:1)
    0 62 14 4
    30 67,6 28,4 4
    60 46 50 4
    65 10 86 4
    70 10 86 4
  • Methode D. Präparative Normalphasen-Trennung
  • Die wie in Beispiel 5 erhaltenen Pentamer-angereicherten Fraktionen wurden mittels präparativer Normalphasen-Chromatographie durch Modifizieren der Methode von Riguad et al. (J. Chrom. 654: 255–260, (1993)) weiter gereinigt.
  • Die Trennungen wurden bei Raumtemperatur auf einer 5 μ Supelcosil LC-Si 100 A-Säule (50 × 2 cm) mit einer entsprechenden Vorsäule bewirkt. Die Procyanidine wurden mittels eines linearen Gradienten unter den folgenden Bedingungen eluiert:
    (Zeit, %A, %B, Fließgeschwindigkeit); (0, 92,5, 7,5, 10); (10, 92,5, 7,5, 40), (30, 91,5, 18,5, 40); (145, 88, 22, 40); (150, 24, 86, 40); (155, 24, 86, 50); (180, 0, 100, 50). Vor der Verwendung wurden die Komponenten der mobilen Phase anhand des folgenden Protokolls gemischt:
  • Lösungsmittel A-Präparierung (82% CH2Cl2, 14% Methanol, 2% Essigsäure, 2% Wasser):
    • 1. Abmessen von 80 ml Wasser und Dispensieren in eine 4 Liter-Flasche.
    • 2. Abmessen von 80 ml Wasser und Dispensieren in dieselbe 4 l-Flasche.
    • 3. Abmessen von 560 ml Methanol und Dispensieren in dieselbe 4-l-Flasche.
    • 4. Abmessung von 3280 ml Methylenchlorid und Dispensieren in dieselbe 4-l-Flasche.
    • 5. Verdeckeln der Flasche und gut vermischen.
    • 6. Spülen des Gemischs mit hochreinem Helium für 5–10 Minuten zur Entgasung. Zweimaliges Wiederholen der Schritte 1–6 zum Erhalt von 8 Volumina des Lösungsmittels A.
  • Lösungsmittel B-Präparierung (96% CH2Cl2, 2% Essigsäure, 2% Wasser):
    • 1. Abmessen von 80 ml Wasser und Dispensieren in eine 4 Liter-Flasche.
    • 2. Abmessen von 80 ml Essigsäure und Dispensieren in dieselbe 4 l-Flasche.
    • 3. Abmessen von 3840 ml Methanol und Dispensieren in dieselbe 4-l-Flasche.
    • 4. Verdeckeln der Flasche und gut vermischen.
    • 6. Spülen des Gemischs mit hochreinem Helium für 5–10 Minuten zur Entgasung. Wiederholen der Schritte 1–5 zum Erhalt von 4 Volumina des Lösungsmittels B.
  • Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Methylenchlorid mit 2% Essigsäure und 2% Wasser; B = Methanol mit 2% Essigsäure und 2% Wasser. Die Säulenbeladung war 0,7 g in 7 ml. Die Komponenten wurden mittels UV bei 254 nm nachgewiesen. Eine typische präparative Normalphasen-HPLC-Trennung von Kakaoprocyanidinen ist in 5 gezeigt.
  • HPLC-Bedingungen:
    • Säule: 50 × 2 cm, 5 μ Supercosil LC-Si-Ablauf bei Raumtemperatur.
    • Mobile Phase: A = Methylenchlorid mit 2% Essigsäure und 2% Wasser. B = Methanol mit 2% Essigsäure und 2% Wasser.
  • Gradienten/Fließprofil
    ZEIT (MIN) %A %B FLIEßGESCHWINDIGKEIT (ml/Min.)
    0 92,5 7,5 10
    10 92,5 7,5 40
    30 91,5 8,5 40
    145 88,0 22,0 40
    150 24,0 86,0 40
    155 24,0 86,0 50
    180 0 100,0 50
  • Beispiel 16
  • Reinigung der oligomeren Fraktionen
  • Methode A. Reinigung mittels semi-präparativer Umkehrphasen-HPLC
  • Die aus Beispiel 15, Methoden A und B und D, erhaltenen Procyanidine wurden weiter getrennt, um experimentelle Quantitäten der Oligomere zu erhalten. Ein Hewlett Packard 1050 HPLC-System, ausgestattet mit einem variablen Wellenlängen-Detektor, Rheodyne 7010 Injektionsventil mit 1 ml Injektionsschleife, wurde mit einem Pharmacia Frac-100 Fraktionssammler zusammengebaut. Die Trennungen wurden auf einer Phenomenex Ultracarb 10 μ ODS-Säule (250 × 22,5 mm), verbunden mit einer Phenomenex 10 μ ODS Ultracarb (60 × 10 mm) Vorsäule, vorgenommen. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Wasser; B = Methanol, die unter den folgenden linearen Gradienten-Bedingungen verwendet wurde: (Zeit, %A); (0,85), (60, 50), (90, 0) und (110, 0) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min.. Individuelle Peaks oder ausgewählte chromatographische Regionen wurden bei festgesetzten Intervallen oder manuell durch Fraktionsentnahme zur weiteren Auswertung durch MADLY-OF/MS und NKr gesammelt. Die Injektionsladungen lagen im Bereich von 25–100 mg an Material. Ein repräsentatives Elutionsprofil ist in 6A gezeigt.
  • Methode B. Modifizierte semi-präparative HPLC
  • Die aus Beispiel 15, Methoden A und B und D, erhaltenen Procyanidin wurden weiter getrennt, um experimentelle Quantitäten ähnlicher Oligomere oder eine weitere strukturelle Identifikation und Aufklärung zu erhalten (z. B. Beispiel 15, 18, 19 und 20). Es wurde eine Supelcosil LC-Si 5 μ-Säule (250 × 10 mm) mit einer Supelcosil LC-Si 5 μ (20 × 2 mm)-Vorsäule verwendet. Die Trennungen wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 3,0 ml/Min. bei Raumtemperatur bewirkt. Die Zusammensetzung der mobilen Phase war A = Dichlormethan; B = Methanol; und C = Essigsäure:Wasser (1:1); angewendet unter den folgenden linearen Gradienten-Bedingungen: (Zeit, %A, %B); (0, 82, 14), (22, 74, 21), (60, 74, 21); (60, 74, 50, 4); (61, 82, 14), gefolgt von einer 7-minütigen Säulen-Reäquilibration. Die Injektionsvolumina waren 60 μl, enthaltend 12 mg an angereichtertem Pentamer. Die Komponenten wurden mittels UV bei 280 nm detektiert. Ein repräsentatives Elutionsprofil ist in 6B gezeigt.
  • Beispiel 17
  • Beurteilung der Stickstoffoxidsynthase-Aktivität
  • Das verwendete Kulturmedium war Medium 200 (Cascade Biologics Inc.), ergänzt mit Low Serum Growth Supplement (Cascade Biologics Inc.) und 20% fötalem Kälberserum (DAP).
  • Die ausgewerteten Kakaoprocyanidine waren das Epicatechin-Monomer, das Dimer, das Trimer, das Tetramer, das Pentamer und das Heptamer. Der Nitridgehalt der Kakaoprocyanidine wurde ausgewertet. Bei der maximal verwendeten Konzentration (100 μg/ml) wurde kein Nitrit nachgewiesen.
  • Humane umbilikale Venenendothelzellen (HUVEC) wurden im primären Kulturstadium von Cascade Biologics Inc. (Portland) bezogen. Die Zellen wurden in Medium, das mit Low Serum Growth Supplement (LSGS) und 20% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt war, in 75 cm2-Kolben kultiviert. Die Zellen wurden für eine Woche angezüchtet, gefolgt von einer Behandlung mit Trypsin-EDTA (2 ml/Kolben) bei 37°C unter 5% CO2-Atmosphäre. Das Trypsin war auf die Zugabe von 3 ml FCS hin neutralisiert.
  • Die Zellsuspension wurde für 10 Min. bei 1200 rpm zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in dem oben beschriebenen Kulturmedium resuspendiert.
  • Die Stickstoffoxidsynthase-Aktivität wurde durch Messen der Nitritkonzentration in dem Kulturmedium ausgewertet. HUVEC wurde zwischen Passagen 2 bis 13 verwendet. Die Zellen wurden in 24-Well-Kulturplatten bei der Konzentration von 5 × 105 Zellen/ml in Medium 200, enthaltend LSGS (300 μl pro Well) und 20% CS, kultiviert. Nach einer Inkubationsperiode von 24 Stunden bei 48 Stunden bei 37°C unter einer 5% CO2-Atmosphäre wurden die Zellen konfluierend verwendet (2,5 × 106 Zellen). Das Medium wurde entfernt, und frisches Medium wurde zugegeben.
  • Kakaoprocyanidin-Monomer und Oligomere wurden dem Kulturmedium bei 100 μg/ml, 10 μg/ml oder 1 μg/ml (Endkonzentration) zugegeben. Die Kontrollen bestanden aus Zellen, die ohne die Procyanidine kultiviert wurden. Die Referenz-Verbindungen enthielten Acetylcholin, Ionomycin (NO-Synthase-Stimulator über Calciumeintritt), Lipopolysaccharid (NO-Synthase-Induktor) und N-Methyl-L-Arginin-Acetat (Inhibitor der NO-Synthase). Die Referenz-Verbindungen wurden verwendet, um die Nitrit-Produktion aus der endothelialen NO-Synthese nachzuweisen.
  • Die NO-Produktion wurde durch Messen der Nitrit-(NO2)-Konzentration in Kulturüberständen gemäß der Griess-Reaktion ausgewertet. Kurz gesagt wurden 50 μl konditioniertes Medium mit 150 μl Griess-Reagens (1% Sulfanilamid in 30% Essigsäure/0,1% N-(1-Naphthyl)-ethylendiamindihydrochlorid in 60% Essigsäure) bei Raumtemperatur für 2 Min. inkubiert. Die Absorbanz bei 540 nm wurde in einem Labsystems MCC/340 Multiscan bestimmt. Die Nitritkonzentration wurde unter Verwendung von Natriumnitrit als einem Standard bestimmt und unter Verwendung der ΔSOFT 2.12 Software analysiert. Das zellfreie Medium und 100 μg/ml der Procyanidine enthielten keine nachweisbaren Nitritkonzentrationen. Rohdaten1: Wirkung der Kakaoprocyanidine auf die Stickstoffoxid-Produktion durch HUVEC (13 Experimente)
    Behandlung Bsp. 1 Bsp. 2 Bsp. 3 mittlere μ SD
    Kontrolle 2,6 2,9 2,4 2,6 0,3
    Acetylcholin 10–5 M 2,5 2,6 2,8 2,6 0,2
    Ionomycin 1 μM 7,8 6,3 5,4 6,5 1,2
    Ionomycin 1 μM + LNMA 1 μM 1,8 1,9 2 1,9 0,1
    LPS 100 mg/ml 15,6 14,3 13,2 14,4 1,2
    LPS 100 mg/ml + LNMA 1 μM 2,2 2,3 2,6 2,4 0,2
    Monomer
    1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml 2,3 2,7 5,4 2,5 2,8 5,9 2,6 2,6 5,7 2,5 2,7 5,7 0,2 0,1 0,3
    Dimer
    1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml 2,5 3,8 15,1 2,7 4,1 16,4 2,8 3,6 17,2 2,7 3,8 16,2 0,2 0,3 0,1
    Trimer
    1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml 3,1 2,9 11,5 3,3 3,3 11,8 3,1 2,7 11,9 3,2 3,0 11,7 0,1 0,3 0,2
    Tetramer
    1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml 3 3,6 8,9 3,2 3,7 9,3 3,3 4,1 9,2 3,2 3,8 9,1 0,2 0,3 0,2
    Pentamer
    1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml 1,3 2,9 8,8 1,4 3,4 9,5 1,3 3 9,7 1,3 3,1 9,3 0,1 0,3 0,5
    Hexamer
    1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml 2,1 4,8 9,1 2,4 5,6 10,4 2,4 4,3 9,5 2,2 4,9 9,7 0,2 0,7 0,7
    1Ergebnisse sind ausgedrückt als μmol Nitrit/106 Zellen/48 Std.
  • Unstimulierte HUVEC produzierten 2,6 ± 0,3 μM NO über eine Inkubationszeit von 48 Stunden. Acetylcholin bei 10 μm war in der Hervorrufung einer Stickstoffoxid-Produktion durch HUVEC unwirksam. Im Gegensatz dazu riefen Ionomycin (1 μM) und Lipopolysaccharid (100 ng/ml) eine deutliche Produktion von Stickstoffoxid hervor. Diese Produktion von Stickstoffoxid durch HUVEC war blockiert, wenn N-Methyl-L-Arginin dem Inkubationsmedium zugegeben wurde.
  • Das Kakaoprocyanidin-Dimer, -Pentamer und -Heptamer riefen eine dosisabhängige Produktion von NO aus HUVEC hervor. Die maximale Produktion wurde bei der höchsten getesteten Konzentration, d. h. 100 μg/ml, beobachtet. Das Procyanidin-Monomer, -Trimer und -Tetramer riefen ebenfalls eine deutliche Produktion hervor, doch lediglich bei der 100 μg/ml-Konzentration. Die Potenz der verschiedenen Procyanidine, unter Betrachtung der höchsten verwendeten Dosis, ist wie folgt: Dimer > Trimer > Heptamer = Pentamer = Tetramer > Monomer.
  • Beispiel 18
  • Stickstoffoxid-abhängige Hypertension im Meerschweinchen
  • Meerschweinchen (etwa 400 g Körpergewicht, männlich und weiblich) waren auf die Injektion von 40 mg/kg Natriumpentobarbital hin anästhesiert. Die Halsschlagarterie wurde zur Überwachung des arteriellen Blutdrucks durch einen Gould-Druckwandlers (Modell P500) kanüliert. Jedes der sechs Kakaoprocyanidine wurde bei Konzentrationen von 1, 3, 10 und 25 mg/kg intravenös durch die Jugularvene injiziert. Veränderungen im Blutdruck wurden auf einem Polygraphen aufgezeichnet.
  • Bei Vorab-Experimenten (2 Tiere) wurde bestimmt, dass die Dosis von 100 mg/kg nicht verwendet werden konnte, da das Vehikel, das DMSO enthielt, eine direkte Wirkung auf den mittleren arteriellen Blutdruck zeigte. Keine deutliche Wirkung des Vehikels, das DMSO enthielt, wurde bemerkt, wenn die Dosis von 25 mg/kg des Kakaoprocyanidins verwendet wurde (15 ± 5%).
  • Die Wirkungen der Verabreichung von 1, 3, 10 oder 25 mg/kg Kakaoprocyanidinen auf den arteriellen Blutdruck der anästhesierten Meerschweinchen wurden untersucht. Auf die intravenöse Injektion hin riefen das Procyanidin-Monomer und -Dimer eine Senkung des Blutdrucks von etwa 20% hervor, d. h. nicht deutlich verschieden von der Injektion des Lösungsmittels alleine (15 ± 5%, n = 5). Im Gegensatz dazu induzierten das Kakaoprocyanidin-Trimer, -Pentamer und -Hexamer (10 mg/kg) deutliche Abnahmen im arteriellen Blutdruck, d. h. bis zu 62–85% für das Kakaoprocyanidin, Tetramer und Hexamer. Die Rangordnung der Potenz der verschiedenen Kakaoprocyanidine, unter Betrachtung der höchsten verwendeten Dosis, war wie folgt: Hexamer = Tretramer > Pentamer > Trimer. TABELLE 5 Rohdaten: Wirkung von Kakaoextrakten auf den arteriellen Blutdruck von anästhesierten Meerschweinchen (6 Experimente)
    Procyanidin Dosis Hypertension (%)1
    mg/kg Bsp. 1 Bsp. 2 Bsp. 3 Bps. 4 Bsp. 5 Bsp. 6
    Monomer 1 3 10 25 55,32 62,99 58,95 46,93 70,31 72,62 66,53, 55,14 70,27 74,59 70,06 63,08 75,99 73,33 65,79 53,95 71,92 76,04 70,69 65,91 77,97 70,44 66,21 58,66
    Dimer 1 3 10 25 74,47 77,64 90,76 88,14 90,15 86,29 94,3 95,33 92,14 95,29 99,59 106,6 89,74 91,74 90,59 88,02 96,83 100,6 106,7 110,6 94,13 87,08 97,24 94,02
    Trimer 1 3 10 25 75,93 94,99 74,34 12,27 71,61 100 72,38 60,42 74,18 95,05 73,26 12,31 74,05 100,7 78,94 11,6 76,46 92,47 80 12,23 73,23 104,8 70,37 12,56
    Tetramer 1 3 10 25 96,86 101,2 96,53 21,7 89,19 95,14 0,95 3,45 80,31 102,1 7,75 9,61 82,47 99,15 12,75 15,21 77,64 104,9 7,53 9,07 109,9 93,26 102,8 20,83
    Pentamer 1 3 10 25 83,41 79,85 87,72 59,8 82,57 80,33 83,56 21,13 80,81 81,47 82,49 29,94 81,57 73,75 75 21,82 77,55 74,18 79,81 20,27 83,05 83,43 89,35 30,5
    Hexamer 1 3 10 25 90.24 74,15 68,8 25,27 64,23 81,18 85,41 11,2 93,97 83,55 69,49 19,34 95,97 80,73 68,04 26,15 86,35 69,14 70,85 25,09 94,68 71,97 71,47 26,6
    1 Ergebnisse sind ausgedrückt als % des mittleren arteriellen Kontroll-Blutdrucks.
  • Ein Vergleich der in vitro- und in vivo-Ergebnisse ergibt die folgende Rangordnung der Potenz für die Kakaoprocyanidine:
    NO-Produktion (100 μg/ml): Dimer > Trimer > Hexamer = Pentamer = Tetramer > Monomer
    NO-Produktion (10 μg/ml): Pentamer, Tetramer und Dimer (schwache Induktion) Hypotension: Hexamer = Tetramer > Pentamer > Trimer > Dimer = Monomer.
  • Mit Ausnahme des Dimers waren das Heptamer oder Tetramer, die die NO-Produktion bei der niedrigeren Dosis induzieren, die wirksamsten in der Induzierung eines Abfalls des arteriellen Blutdrucks. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Kakaoprocyanidine eine in vitro-NO-Produktion induzieren können, die in Bezug zu der in vivo-NO-Produktion steht.
  • Beispiel 19
  • Aortaringe von weißen New Zealand-Kaninchen wurden in 20 ml-Organbädern gestellt. Eine Endothel-abhängige Relaxation (EDR) auf eine Einzeldosis von (10–5 M) Kakaoprocyanidin und Acetylcholin (Ach) wurde in Parallelringen nachgewiesen, die mit Kakaoprocyanidin und Norepinephrin (NE) (10–5 M) vorkontaktiert waren. Die getesteten Kakaoprocyanidine waren das Monomer, Dimer, Trimer, Tetramer, Pentamer, Hexamer. Von diesen zeigten lediglich das Pentamer, Hexamer und Heptamer eine gefäßrelaxierende Aktivität. Von beiden getesteten Kakaoprocyanidin-Gemischen zeigte lediglich das eine, das Pentamer bis Dekamer enthielt (Combo 2) eine signifikante EDR, wohingegen das andere Gemisch (Combo 1), welches das Monomer bis Tetramer enthielt, keine Wirkung auf den Gefäßtonus zeigte.
  • Sowohl Combo 2 als auch das Pentamer wurden dann zum Nachweis der dosisabhängigen Vasorelaxation verwendet (10–8 bis 10–5 M). Ringe wurden für 30 Min. mit diesen Kakaoprocyanidinen inkubiert (10–5 M) und mit Ach und Kakaoprocyanidinen (10–7 bis 10–4) nochmals getestet. Die Inkubation dieses Gewebes mit diesem/n Kakaoprocyanidin(en) schwächten die EDR ab, die akut sowohl durch die Kakaoprocyanidine als auch Ach hervorgerufen war. Die maximale Relaxation auf die Ach-Präinkubation, 49 ± 5%; Post-Pentamer-Inkubation, 2 ± 1,4%; Post-Combo 2-Inkubation 0,8 ± 0,8%; auf die Pentamer-Präinkubation, 46,5 ± 4,5%; Post-Inkubation, 6,8 ± 3,2%; auf die Combo 2-Präinkubation, 54,3 ± 7%; Post-Inkubation, 1,7 ± 1,1%, n = 5.
  • Die Wirkung der Inkubation mit beiden Kakaoprocyanidinen (d. h. Beseitigung der EDR) wurde durch Inkubation dieser Gewebe mit L-Arginin (10–4 M) für 30 Min. teilweise wiederhergestellt (max. Relaxation, auf Ach: Post-L-Arginin, 21,5 ± 6%; Post-Combo 2, Post-L-Arginin, 13,7 ± 2,6%: auf Pentamer; Post-Pentamer-Inkubation, Post-L-Arginin, 18,3 ± 5,8%: auf Combo 2; Post-Combo 2-Inkubation, Post-L-Arginin, 5,5 ± 2,8%, n = 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Erschöpfung des Substrats für die NO-Synthase für diese Wirkung verantwortlich sein kann.
  • Die obigen Ergebnisse sind in Tabellen 6 bis 9 gezeigt. TABELLE 6 Vorab-Experimente zur Wirkung von Kakaoprocyanidinen auf Aortaringe von Kaninchen
    Ach Monomer Dimer Trimer Tetramer
    % Relaxation 68 0 0 0 40
    Pentamer Hexamer Heptamer Monomer-Tetramer Pentamer-Dekamer
    % Relaxation 93 68 47 0 55
    TABELLE 7 Dosis-Wirkung auf die akute Exposition an Kakaoprocyanidine
    Ach % Relaxation Pentamer % Relaxation
    Dosis (Log mol/1) 10–7 10–6 10–5 10–7 10–6 10–6
    %Relaxation 15,2 ± 2,6 42,2 ± 4,2 49 ± 5,1 1,85 ± 0,2 8,3 ± 2,5 46,5 ± 4,5
    Monomer-Tetramer % Relaxation Pentamer-Dekamer % Relaxation
    Dosis (Log mol/1) 10–7 10–6 10–5 10–7 10–6 10–5
    Relaxation Null 1,4 ± 0,6 25,5 ± 8,2 54,3 ± 7
    TABELLE 8 Wirkung der Inkubation mit Kakaoprocyanidinen und L-Arginin
    Ach % Relaxation
    Dosis (Log mol/1) 10–8 10–7 10–6 10–5
    Pentamer 0 0 2,1 + 1,4 0
    Pentamer und L-Arginin 0,53 ± 0,5 4,5 ± 1,0 14,4 ± 5,8 21,5 ± 5,7
    Pentamer % Relaxation
    Dosis (Log mol/1) 10–8 10–7 10–6 10–5
    Pentamer 0 0 0 6,8 ± 3
    Pentamer und L-Arginin 0 0,8 ± 0,8 5,6 ± 2,5 18,3 ± 5,7
    TABELLE 9
    Ach % Relaxation
    Dosis (Log mol/1) 10–8 10–7 10–6 10–5
    Pentamer-Dekamer 0 0,43 ± 0,4 0,83 ± 0,8 0
    Pentamer-Dekamer und L-Arginin 3,6 ± 0,8 6,4 ± 1,2 11,3 ± 2,4 13,7 ± 2,6
    Pentamer % Relaxation
    Dosis (Log mol/1) 10–8 10–7 10–6 10–5
    Pentamer-Dekamer 0 0 0,58 ± 0,58 1,7 ± 1,1
    Pentamer-Dekamer und L-Arginin 0 1,4 ± 1,4 3,4 ± 1,9 5,5 ± 2,8
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, dass lediglich Kakaoprocyanidine oberhalb des Trimers zur Bewirkung einer Vasorelaxation fähig sind und dass Kakaoprocyanidine diskrete Wirkungen auf den Gefäßtonus aufweisen, deren Bezug zu einer Antioxidans-Aktivität unwahrscheinlich ist.
  • Weitere Variationen und Modifikationen, die den Fachleuten des Gebiets offensichtlich sein werden, befinden sich innerhalb des Umfangs und der Lehren dieser Erfindung. Diese Erfindung soll dadurch nicht eingeschränkt werden, sondern nur, wie durch die folgenden Ansprüchen angegeben.

Claims (21)

  1. Nahrungsmittelprodukt, umfassend (i) ein oligomeres Procyanidin der Formel An, worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 ist und A die folgende Formel aufweist:
    Figure 00660001
    worin R 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-Saccharid, 3-(β)-O-Saccharid, 3-(α)-O-C(O)-R1 oder 3-(β)-OC(O)-R1 ist; die Bindung zwischen benachbarten Monomeren an Positionen 4, 6 oder 8 stattfindet; eine Bindung an ein Monomer an Position 4 eine Alpha- oder Beta-Stereochemie aufweist; X, Y und Z ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus A, Wasserstoff und einer Saccharid-Komponente, unter der Voraussetzung, dass bezüglich wenigstens eines terminalen Monomers, die Bindung des benachbarten Monomers daran an Position 4 ist, und optional Y = Z = Wasserstoff sind; und worin die Saccharid-Komponente eine Mono- oder Disaccharid-Komponente ist und wahlweise mit einer Phenolkomponente substituiert sein kann und R1 eine Aryl- oder Heteroaryl-Komponente sein kann, die wahlweise mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituiert ist, oder ein Salz, Derivat oder Oxidationsprodukt davon; und (ii) L-Arginin; worin die Menge des Procyanidins wenigstens 300 mg pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts beträgt und die Menge des L-Arginins wenigstens 1,2 g pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts beträgt.
  2. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 1, worin die Menge des L-Arginins wenigstens 1,6 g pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts beträgt.
  3. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 1 oder 2, worin das L-Arginin bereitgestellt wird durch wenigstens einen Nahrungsinhaltsstoff, ausgewählt aus Nüssen, Gemüsen, Samen und Gelatine.
  4. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 3, worin der L-Arginin-enthaltende Inhaltsstoff ein Fleisch, eine Schale, eine Paste oder ein Mehl von den Nüssen, den Gemüsen oder den Samen ist.
  5. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 4, wobei die Nüsse ausgewählt sind aus Erdnüssen, Walnüssen, Mandeln, Haselnüssen, Pekannüssen, Cashewnüssen und Makadamianüssen; wobei das Gemüse Sojabohnen ist; und wobei die Samen ausgewählt sind aus Sonnenblumensamen, Sesamsamen, Flachssamen und Kürbissamen.
  6. Nahrungsmittelprodukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das oligomere Procyanidin durch wenigstens einen Kakaoinhaltsstoff bereitgestellt wird.
  7. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 6, wobei der Kakaoinhaltsstoff geröstete Kakaobohnenstückchen oder Fraktionen davon, Schokoladenlikör, teilweise entfettete Kakaofeststoffe, vollständig entfettete Kakaofeststoffe oder Gemische davon ist.
  8. Nahrungsmittelprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das oligomere Procyanidin durch einen Kakaoextrakt bereitgestellt ist.
  9. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 8, wobei der Kakaoextrakt in einer Menge von wenigstens 25 mg pro 100 g des Nahrungsmittelprodukts vorhanden ist.
  10. Nahrungsmittelprodukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Nahrungsmittelprodukt eine Süßigkeit, ein Gewürz, eine Backware, ein Getreideriegel, ein Nahrungsersatzriegel, ein Mixgetränk, ein Getränk oder ein Tierfutter ist.
  11. Nahrungsmittelprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welches ein nicht aus Schokolade bestehendes Nahrungsmittelprodukt ist.
  12. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 11, welches ein auf Erdnuss basierendes Nahrungsmittelprodukt ist.
  13. Nahrungsmittelprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welches ein aus Schokolade bestehendes Nahrungsmittelprodukt ist.
  14. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 13, wobei das aus Schokolade bestehende Nahrungsmittelprodukt ein Schokoladenkonfekt ist.
  15. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 14, wobei das Schokoladenkonfekt eine Zartbitterschokolade umfasst.
  16. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 14, wobei das Schokoladenkonfekt eine Milchschokolade umfasst.
  17. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 10, wobei das Nahrungsmittelprodukt Nüsse mit Schalen, gemahlene Nussschalen oder Mischungen davon enthält.
  18. Nahrungsmittelprodukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches ein veterinäres Nahrungsmittelprodukt ist.
  19. Nahrungsmittelprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das/die Procyanidin(e) und/oder L-Arginin synthetisch ist.
  20. Nahrungsmittelprodukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Derivat des oligomeren Procyanidins der Formel An eine Verbindung ist, worin die 3-Position der wenigstens einen monomeren Einheit zu einer Derivatgruppe umgewandelt ist, die von einer Säure abgeleitet ist, ausgewählt aus Caffein-, Cinnamin-, Coumarin-, Ferulin-, Gall-, Hydroxybenzoe- und Sinapinsäuren.
  21. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 21, worin die Säure Gallsäure ist.
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