•?&.
*t&f CIENTO DE TUMORES REFRACTARIOS HUMANOS CON ANTAGONISTAS DE RECEPTO ?» FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO
ANTECE#ÜHTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la segunda causa principal de muerte siguiente a los ataques del corazón en los Estados Unidos. Ha existido un progreso
Importante en el desarrollo de nuevas terapias en el tratamiento de esta enfermedad devastadora. La mayoría del progreso se debe a un mejor
10 entendimiento de la proliferación celular tanto en células normales como t^ células cancerosas. Las células normales se proliferan por la activación altamente controlada de los receptores del factor de crecimiento por sus respectivos ligandos. Los ejemplos de tales receptores son las quinasas de tirosina 15 del receptor de factor de crecimiento. Las células cancerosas también se proliferan por la activación de los receptores del factor de crecimiento, pero pierden el control de cuidado de la proliferación normal. La pérdida de control puede originarse por numerosos factores, tal como la sobre expresión de los factores y/o 20 receptores de crecimiento, y la activación autónoma de las vías bioquímicas reguladas por los factores de crecimiento. Algunos ejemplos de los receptores incluidos en la tumorigenesis son los receptores para el factor de crecimiento epidérmico
(EGFR), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGFR), factor de
25 crecimiento similar a la insulina (IGFR), factor de crecimiento nervioso
(NOFR), y factor de crecimiento fibroblástico (FGF). del receptor de factor de crecimiento de tirosina del receptor del factor de crecimiento particularmente importantes asociadas con la tumorigenesis de las células epidérmicas. El primer miembro de la familia de receptor EGF a descubrir fue la glicoproteína que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 165 kD. Esta glicoproteína, que se descubrió por Mendelsohn et al. , en la Patente de E.U. No. 4,943,533, se conoce como el receptor EGF (EGFR) y también como el receptor 1 EGF humano (HER1 ). El EGFR se sobre expresa en varios tipos de células tumorales epidérmicas. El EGF y el factor de crecimiento transformador alfa (TGF- alfa) son dos ligandos conocidos de EGFR. Los ejemplos de tumores que expresan los receptores EGF incluyen gliobastomas, así como también cánceres de pulmón, mama, cabeza y cuello, y vesícula. La amplificación y/o sobre expresión de los receptores EGF en las membranas de las células tumorales se asocia con una prognosis escasa. Los tratamientos de cáncer incluyen tradicionalmente la quimioterapia o terapia de radiación. Algunos ejemplos de los agentes quimioterapeúticos incluyen doxorubicina, cisplatina, y taxol. La radiación puede ser ya sea de un rayo externo o de una fuente colocada dentro de un paciente, es decir, braquiterapia. Otro tipo de tratamiento incluye antagonistas de factores de crecimiento o receptores del factor de crecimiento incluidos en la proliferación de células. Tales antagonistas neutralizan la actividad del
o receptor de crecimiento, e inhiben el crecimiento de tumores que
an el receptor. Por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,943,533 describe un anticuerpo monoclonal muríno denominado 225 que se une al receptor EGF. La patente se asigna á la Universidad de California y se autoriza exclusivamente a ImClone Systems Incorporated. El anticuerpo 225 es capaz de inhibir el crecimiento de las líneas tumorales de expresión de EGFR cultivado así como también el crecimiento de estos tumores in vivo cuando crecen como heterotrasplantes en ratones desnudos. Ver Masui et
10 al., Cáncer Res. 44, 5592-5598 (1986). ^*. Una desventaja de utilizar los anticuerpos monoclonales murino en la terapia humana es la posibilidad de una respuesta de anticuerpo de anti-ratón humano (HAMA) debido a la presencia de secuencias Ig de ratón. Esta desventaja puede minimizarse al reemplazar
15 la región constante total de un anticuerpo murino (u otro mamífero no humano) con aquel de una región constante humana. El reemplazo de las regiones constantes de un anticuerpo murino con secuencias humanas se refiere usualmente como quimerización. El proceso de quimerización puede elaborarse aún más eficaz
20 al reemplazar también las regiones variables de estructura de un anticuerpo murino con las secuencias humanas correspondientes. Las regiones variables de estructura son las regiones variables de un anticuerpo a diferencia de las regiones hipervariables. Las regiones hípervariables también se conocen como las regiones determinantes
25 complementarias (CDRs).
. . . . .,_ __£_«___, fi¡ja?w| ^ t ,_^^ El reemplazo de las regiones constantes y las regiones variables de estructura con sfútiencias humanas se refiere usualmente i, como humanización. El anticuerpo humanizado es menos inmunogénico (es decir, produce menos de una respuesta HA A) a medida que más secuencias de marino se reemplazan por las secuencias humanas. Desafortunadamente, tanto el costo y esfuerzo aumentan a medida que más regiones de anticuerpos murino se reemplazan por secuencias humanas. El reemplazo de las regiones constantes no humanas con regiones constantes humanas no se espera que afecte la actividad de un anticuerpo. Por ejemplo, Prewett et al. , reportó la inhibición del avance de tumor de los heterotrasplantes de tumor de próstata bien establecido en ratones con una forma quimérica del anticuerpo monoclonal anti-EGFR 225 anteriormente discutido. La forma quimérica se denomina c225. Journal of Immunotherapy 19, 419-427 (1997). Otro procedimiento para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos es el uso de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, un artículo por Aboud-Pirak et al. , Journal of the National Cáncer Institute 80, 1605-161 1 (1988), compara el efecto anti-tumoral de un anticuerpo de receptor anti-EGF denominado 108.4 con fragmentos del anticuerpo. El modelo de tumor se basó en células KB como los heterotrasplantes en ratones desnudos. Las células KB se derivan de los carcinomas epidérmicos orales humanos, y expresan los niveles elevados de receptores EGF. Aboud-Pirak et al. encontró que tanto el anticuerpo como el
bivalente F(ab')2 retardaron el crecimiento de tumor in vivo, a pesar de que el fragmento F(ab')2 fue menos eficiente. Sin embargo, el fragmento Fab monovalente del anticuerpo, cuya habilidad para unir el receptor asociado a la célula se conservó, no retardó el crecimiento de tumor. También se han realizado intentos para mejorar los tratamientos de cáncer al combinar alguna de las técnicas anteriormente mencionadas. Por ejemplo, Baselga ef al. , reportó los efectos de tumor de la doxorubicina de agente quimioterapeútico con anticuerpos monoclonales anti-EGFR en el Journal of the National Cáncer Institute 85, 1327-1333 (1993). Otros han intentado mejorar la sensibilidad de las células de cáncer a la radiación al combinar la radiación con adyuvantes. Por ejemplo, Bonnen, Patente de E.U. 4,846,782, reportó la sensibilidad aumentada de los cánceres humanos a la radiación cuando la radiación se combinó con interferona. Snelling et al., reportó una mejora menor en el tratamiento de radiación de pacientes con astrocitomas con foci anaplástico cuando la radiación se combinó con un anticuerpo monoclonal anti-EGFR radiomarcado con yoduro 125 en la prueba clínica fase II. Ver Hybridoma 14, 1 1 1 -1 14 (1995). De igual forma, Balaban et al. , reportó la habilidad de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR para sensibilizar los heterotrasplantes de carcinoma escamoso humano en ratones a la radiación cuando el tratamiento de radiación fue precedido por la administración de un anticuerpo anti-EGFR denominado LA22. Ver
*t¡* A ~¿1ái.+J L¿*. í,?L*1^*il^*tl¿**a^^^ Biochimica et Biophysica Acta 1314. 147-156 (1996). Saleh et al. , también reportó mejor control de tumor in vitro y en ratones cuando la terapia de radiación se aumentó con anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Saleh ef al. , concluyó que: "Más estudios...pueden conducir a una nueva terapia RT/Mab de modalidad combinada." Ver resumen 4197 en tos procedimientos de la American Association for Cáncer Research 37, 612 (1996). A pesar de que los tratamientos anteriormente descritos para combatir el cáncer, ninguno se ha dirigido específicamente a los tumores refractarios de tratamiento en quimioterapia y radiación convencional. Los tumores refractarios conducen a un avance rápido de la enfermedad, usualmente con una prognosis escasa. Actualmente, existe poco que puede hacerse para pacientes con tumor refractario en tratamiento de cáncer convencional. En base a lo precedente, existe una necesidad de un método mejora de tratamiento de tumores refractarios en humanos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esto, y otros objetivos a medida que serán aparentes para aquellos que tienen experiencia ordinaria en la materia, se han logrado al proporcionar un método para inhibir el crecimiento de los tumores refractarios que se estimulan por un ligando del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en pacientes humanos. El método comprende tratar a los pacientes humanos con una cantidad efectiva de un antagonista EGFR/HER1 . En otra modalidad, el método de la presente invención
J___a_______á__..__ __ »______<_„ __- - *^**> *~*>* ______-..^¿ *^ _fe_ ende tratar a los pacientes humanos con una combinación de una cantidad efectiva de un antagonista EGFR/HER1 y un agente quimioterapeútico. • Todavía en otra modalidad, el método de la presente invención
5 comprende tratar a los pacientes humanos con una combinación de una cantidad efectiva de un antagonista EGFR/HER1 y radiación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método mejorado para tratar los tumores refractarios, particularmente los tumores malignos 10 refractarios, en pacientes humanos que tienen cáncer refractario. Tumores Refractarios # Los tumores refractarios incluyen tumores que fallan o son resistentes al tratamiento con agentes quimioterapeúticos solos, la radiación sola o combinaciones de los mismos. Para los propósitos de 15 esta especificación, los tumores refractarios también comprenden tumores que parecen inhibirse por tratamiento con agentes terapéuticos y/o radiación pero se repiten hasta cinco años, algunas veces hasta diez años o más después de que el tratamiento se discontinua. Los tipos de tumores refractarios que pueden tratarse de 20 acuerdo con la invención son cualquiera de los tumores refractarios que se estimulan por un ligando de EGFR. Algunos ejemplos de los ligandos que estimulan EGFR incluyen EGF y TGF alfa. La familia EGFR de los receptores incluye EGFR, el cual también se refiere en la materia como HER1. En esta especificación,
25 EGFR se refiere al miembro específico de la familia EGFR de los
*ptores denominados EGFR/HER1. Los tumores refractarios tratables por la presente invención son tumores endógenos nativos en los humanos pacientes. Estos tumores son más difíciles de tratar que los heterotrasplantes de tumor humano exógeno que se trataron en animales. Ver, por ejemplo, Prewett et al. , Journal of Immunotherapy 19, 419-427 (1997). Algunos ejemplos de los tumores refractarios incluyen carcinomas, gliomas, sarcomas, adenocarcinomas, adenosarcomas y adenomas. Tales tumores ocurren virtualmente en todas las partes del cuerpo humano, incluyendo cada órgano. Los tumores por ejemplo, pueden presentarse en el pecho, corazón, pulmón, intestino delgado, intestino grueso, bazo, riñon, vesícula, cabeza y cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula, sangre, timo, útero, testículos, nuca e hígado. Los tumores pueden expresar EGFR en niveles normales o pueden sobre expresar EGFR en niveles, por ejemplo, que son al menos 10, 100 o 1000 veces niveles normales. Algunos tumores que sobre expresan el EGFR incluyen pecho, pulmón, intestino grueso, riñon, vesícula, cabeza y cuello, especialmente carcinoma de célula escamosa de la cabeza y cuello, ovario, próstata, y cerebro. Antagonistas EGFR/HER1 Los tumores refractarios de la presente invención pueden tratarse con un antagonista EGFR/HER1 . Para los propósitos de esta especificación, un antagonista EGFR/HER1 es cualquier sustancia que inhibe la estimulación de EGFR/HER1 por un ligando EGFR/HER1 . Tal
inhibición de la estimulación inhibe el crecimiento de células que expresan EGFR/HER1 . El crecimiento de los tumores refractarios se inhibe suficientemente en el paciente para prevenir o reducir el avance del cáncer 5 (es decir, crecimiento, invasión, metástasis, y/o repetición). Los antagonistas EGFR de la presente invención pueden ser citostátícos o inhibir el crecimiento del tumor refractario. Preferentemente, el antagonista ERGR es citolítico o destruye el tumor. Ningún mecanismo de inhibición en particular se atribuye como 10 operante en esta invención. Sin embargo, las quinasas de tirosina EGFR se activan generalmente por medio de casos de fosforilación. De acuerdo
• con lo anterior, los ensayos de fosforilación son útiles en predecir los antagonistas útiles en la presente invención. Algunas pruebas útiles para la actividad de quinasa de tirosina EGFR se describen en Panek et al. , 15 Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 238. 1433-1444 (1997) y en Batley et al. , Life Sciences 62, 143-150 (1998). La descripción de estas pruebas se incorpora en la presente para referencia. Los antagonistas EGFR/HER1 incluyen moléculas biológicas o
• moléculas pequeñas. Las moléculas biológicas incluyen todos los lípidos y 20 polímeros de monosacáridos, aminoácidos y nucleótidos que tienen un peso molecular mayor a 450. De esta manera, las moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, oligosacáridos y polisacáridos; oligopéptidos, polipéptidos, péptidos, y proteínas; y oligonucleótidos y polinucleótidos. Los oligonucleótidos y polinucleótidos incluyen, por ejemplo, ADN y RNA. 25 Las moléculas biológicas incluyen además derivados de cualquiera de las moléculas anteriormente descritas. Por ejemplo, los derivados de moléculas biológicas incluyen derivados de lípido y glicosilación de oligopéptidos, polipéptidos, péptidos y proteínas. Los derivados de moléculas biológicas incluyen además derivados de lípido de oligosacáridos y polisacáridos, por ejemplo, lipopolisacáridos. Más típicamente, las moléculas biológicas son anticuerpos, o equivalentes funcionales de anticuerpos. Los equivalentes funcionales de los anticuerpos tienen características vinculantes comparables a aquellas de los anticuerpos, e inhiben el crecimiento de células que expresan EGFR. Tales equivalentes funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos de cadena única, humanizada, y quimerizada así como también fragmentos de los mismos. Los equivalentes funcionales de los anticuerpos también incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente las mismas que la secuencia de aminoácido de las regiones hipervariables o variables de los anticuerpos de la invención. Una secuencia de aminoácido que es sustancialmente la misma que otra secuencia, pero que difiere de la otra secuencia por medio de una o más sustituciones, adiciones, y/o supresiones, se considera que es una secuencia equivalente. Preferentemente, menos del 50%, más preferentemente menos del 25%, y todavía más preferentemente menos del 10%, del número de residuos de aminoácido en una secuencia se sustituyen para, agregarse a, o suprimirse de la proteína. El equivalente funcional de un anticuerpo es preferentemente un anticuerpo humanizado o quimerizado. Un anticuerpo quimerizado
comprende la región variable de un anticuerpo anti-humano y la región constante de un anticuerpo A no. Un anticuerpo humanizado comprende la región variable (CDRs) de un anticuerpo no humano. La región variable a diferencia de la región hipervariable, por ejemplo, la región variable de estructura, y la región constante de un anticuerpo humanizado son aquellos de un anticuerpo humano. Para los propósitos de esta solicitud, las regiones hipervariables y variables adecuadas de los anticuerpos no humanos pueden derivarse de los anticuerpos producidos por cualquier mamífero no
10 humano en donde se elaboran los anticuerpos monoclonales. Los ejemplos adecuados de mamíferos a diferencia de los humanos incluyen,
# por ejemplo, conejos, ratas, ratones, caballos, cabras, o primates. Se prefieren los ratones. Los equivalentes funcionales además incluyen fragmentos de
15 anticuerpos que tienen características vinculantes que son las mismas que, o son comparables a, aquellas de un anticuerpo completo. Los fragmentos adecuados del anticuerpo incluyen cualquier fragmento que comprende una parte suficiente de la región hipervariable (es decir, determinante complementaria) para unirse específicamente, y con
20 suficiente afinidad, a la quinasa de tirosina EGFR para inhibir el crecimiento de células que expresan tales receptores. Tales fragmentos pueden, por ejemplo, contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Preferentemente, todos los fragmentos de anticuerpo contienen seis regiones determinantes
25 complementarias del anticuerpo completo, a pesar de que también se
los fragmentos funcionales que contienen unas po a® tle tales regiones, tal como tres, cuatro o seis CDRs. Los fragmentos preferidos son anticuerpos de cadena única, o fragmentos Fv. Los anticuerpos de cadena única son polipéptidos que comprenden al menos la región variable de la cadena pesada del anticuerpo unido a la región variable de la cadena ligera, con o sin un enlazador de interconexión. De esta manera, el fragmento Fv comprende el anticuerpo entero del sitio combinador. Estas cadenas pueden producirse en bacterias o en células eucarióticas. Los anticuerpos y equivalentes funcionales pueden ser miembros de cualquier clase de inmunoglobulinas, tal como: IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y las subclases de las mismas. Los anticuerpos preferidos son miembros de la subclase lgG1 . Los equivalentes funcionales también pueden ser equivalentes de combinaciones de cualquiera de las clases y subclases anteriores. Los anticuerpos pueden elaborarse del receptor deseado por métodos que se conocen bien en la materia. Los receptores se encuentran ya sea comercialmente disponibles, o pueden aislarse por métodos bien conocidos. Por ejemplo, los métodos para aislar y purificar el EGFR se encuentran en Spada, Patente de E.U. 5,646, 153 comenzando en la columna 41 , línea 55. El método para aislar y purificar el EGFR descrito en la patente Spada se incorpora en la presente para referencia. Los métodos para elaborar los anticuerpos monoclonales incluyen el método inmunológico descrito por Kohier y Milstein en Nature 256. 495-497 (1975) y por Campbell en "Monoclonal Antibody Technology,
* si _ _ ____>__ I hSiÜ , tlé Productíon and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" en Burdon ef al. , Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). El método de ADN recombinante descrito por Huse ef al. , en Science 246. 1275-1281 (1989) también es adecuado. Brevemente, a fin de producir los anticuerpos monoclonales, un mamífero huésped se inocula con un receptor o un fragmento de un receptor, según se describe anteriormente, y así, opcionalmente, se aumenta. A fin de ser útil, el fragmento de receptor debe contener suficientes residuos de aminoácido para definir el epítopo de la molécula a detectarse. Si el fragmento es demasiado corto para ser inmunogénico, puede conjugarse en una molécula vehículo. Algunas moléculas vehículo adecuadas incluyen hemocianina de lapa y albúmina de suero de bovino. La conjugación puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la materia. Un método es combinar un residuo de cisteína del fragmento con un residuo de cisteína en la molécula vehículo. Los bazos se colectan de los mamíferos inoculados unos cuantos días después del aumento final. Las suspensiones de célula de ios bazos se fusionan con una célula tumoral. Las células de hibridoma resultantes que expresan los anticuerpos se aislan, crecen, y mantienen en cultivo. Los anticuerpos monoclonales adecuados así como también las quinasas de tirosina del receptor del factor de crecimiento para elaborarlos también se encuentran disponibles de ias fuentes comerciales, por ejemplo, de Upstate Biotechnology, Santa Cruz Biotechnology de Santa
Cruz, California, Transduction Laboratories de Lexington, Kentucky, R&D Systems Inc de Minneapolíi, f Minnesota, y Dako Corporation de Carpintería, California. # Los métodos para elaborar los anticuerpos humanizados y 5 quiméricos también se conocen en la materia. Por ejemplo, los métodos para elaborar los anticuerpos quiméricos incluyen aquellos descritos en las Patentes de E.U. por Boss (Celltech) y por Cabilly (Genentech). Ver la Patentes de E. U Nos. 4,816,397 y 4,816,567, respectivamente. Los métodos para elaborar los anticuerpos humanizados se describen, por
10 ejemplo, en Wínter, Patente de E. U. No. 5,225,539. ^^ El método preferido para la humanización de los anticuerpos se denomina injerto de CDR. En el injerto de CDR, las regiones del anticuerpo de ratón que se incluyen en la unión al antígeno, la región determinante complementaria o CDRs, se injertan en las regiones variables
15 de humano para crear las regiones variables "de humano reformado". Estas regiones variables completamente humanizadas se unen así a las regiones constantes de humano para crear los anticuerpos completos
"completamente humanizados". A fin de crear los anticuerpos completamente humanizados que
20 se unen bien a un antígeno, es ventajoso designar las regiones variables de humano reformado cuidadosamente. Las regiones variables de humano en donde los CDRs se injertarán, deberán seleccionarse cuidadosamente, y usualmente es necesario elaborar unos cuantos cambios de aminoácidos en posiciones críticas dentro de las regiones de estructura (FRs) de ias
25 regiones variables de humano.
Por ejemplo, las regiones variables de humano reforma o' pueden incluir hasta diez cambios de aminoácidos en las FRs de la región variable de cadena ligera de humano seleccionada, y no menos de veinte cambios de aminoácidos en las FRs de la región variable de cadena pesada de humano seleccionada. Las secuencias de ADN que se codifican por estos genes de región variable de cadena ligera y pesada de humano reformado se unen a las secuencias de ADN que se codifican por los genes de regiones constantes de cadena ligera y pesada de humano, preferentemente ?1 y K, respectivamente. El anticuerpo humanizado reformado se expresa así en células de mamífero y su afinidad por su objetivo comparado con aquél del anticuerpo de murino correspondiente y anticuerpo quimérico. Los métodos para seleccionar los residuos del anticuerpo humanizado a sustituirse y para elaborar las sustituciones se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Co ef al. , Nature 351 , 501 -502 (1992); Queen et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. 86, 10029-1003 (1989) y Rodríguez et al., Int. J. Cáncer, Supplement 7. 45-50 (1992). Un método para humanizar y reformar el anticuerpo monoclonal anti-EGFR se describió por Goldstein et al. , en la solicitud de PCT WO 96/40210. Este método puede adaptarse para humanizar y reformar los anticuerpos contra otras quinasas de tirosina del receptor del factor de crecimiento. Los métodos para elaborar los anticuerpos de cadena única se conocen bien en la materia. Algunos ejemplos adecuados incluyen aquellos descritos por Wels et al. , en la solicitud de patente Europea 502 812 e Int. J. Cáncer 60, 137-144 (1995).
Otros métodos para producir los equivalentes funcionales anteriormente desoritos se describen en la Solicitud de PCT WO 93/21319, Solicitud de Patente Europea 239 400, Solicitud de PCT WO 89/09622, Solicitud de Patente Europea 338 745, Patente de E.U. 5,658,570, Patente de E.U. 5,693,780, y Solicitud de Patente Europea EP 332 424. Los anticuerpos EGFR preferidos son los anticuerpos de cadena única, humanizados, y quimerizados derivados de un anticuerpo de murino denominado 225, el cual se describe en la Patente de E.U.
4,943,533. La patente se asigna a la Universidad de California y se autoriza exclusivamente a ImClone Systems fncorporated. El anticuerpo 225 es capaz de inhibir el crecimiento de las células tumorales de expresión de EGFR/HER1 in vitro así como también in vivo cuando crecen como heterotrasplantes en ratones desnudos. Ver Masui et al. , Cáncer Res. 44, 5592-5598 (1986). Más recientemente, un 225 combinador de régimen de tratamiento más doxorubicina o cisplatina mostraron la sinergia terapéutica contra diversos modelos de heterotrasplante de humano bien establecidos en ratones. Basalga et al. , J. Nati. Cáncer Inst. 85, 1327-1333 (1993). En una modalidad de la presente invención, los pacientes humanos con carcinoma de célula escamosa de cuello y cabeza refractario se trataron con una combinación de un antagonista EGFR/HER1 (anticuerpo monoclonal anti-EGFR quimérico, C225) y cisplatina. Estos pacientes habían fallado antes el tratamiento con la radiación sola, la quimioterapia sola o combinaciones de los mismos. El antagonista EGFR/HER1 inhibió el crecimiento de los tumores refractarios.
__»_«.____________- Los anticuerpos de cadena única, humanizados, y quimerizados derivados de anticuerpo * murino 225 pueden elaborarse del anticuerpo 225, el cual se encuentra disponible del ATTC. Alternativamente, los diversos fragmentos necesitados para preparar los anticuerpos 225 de cadena única, humanizados, y quimerizados pueden sintetizarse de la secuencia proporcionada en Wels et al. , en Int. J Cáncer 60. 137-144 (1995). El anticuerpo 225 quimerizado (c225) puede elaborarse de acuerdo con los métodos anteriormente descritos. El anticuerpo 225 humanizado puede prepararse de acuerdo con el método descrito en el ejemplo IV de la solicitud de PCT WO 96/40210, la cual se incorpora en la presente para referencia. Los anticuerpos 225 de cadena única (Fv225) pueden elaborarse de acuerdo con los métodos descritos por Wels et al. , en Int. J. Cáncer 60, 137-144 (1995) y en la solicitud de patente Europea 502 812. Las secuencias de las regiones hipervariables (CDR) de la cadena ligera y pesada se reproducen más adelante. La secuencia de aminoácido se indica abajo de la secuencia de nucleótido. REGIONES HIPERVARIABLES DE CADENA PESADA (VH. : CDR1 AACTATGGTGTACAC (SEQ ID 1) N Y G V H (SEQ ID 2)
CDR2 GTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCC (SEQ ID 3) V I W S G G N T D Y N T P F T S (SEQ ID 4)
*~*~ l&*t* ,.¿ ______fc________fcA^A««-_-_-^^ .
CDR3 GCCCTCACCTACTATGATTACGAGTTTGCTTAC (SEQ ID 5) A L T Y Y D Y E F A Y (SEQ ID 6)
REGIONES HIPERVARIABLES DE CADENA LIGERA (VL). 5 CDR1 AGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACAC (SEQ ID 7) R A S Q S I G T N I H (SEQ ID 8)
CDR2 GCTTCTGAGTCTATCTCT (SEQ ID 9) A S E S I S (SEQ ID 10)
CDR3 CAACAAAATAATAACTGGCCAACCACG (SEQ ID 11) Q Q N N N W P T T (SEQ ID 12)
5 Además de las moléculas biológicas anteriormente discutidas, los antagonistas útiles en la presente invención también pueden ser moléculas pequeñas. Cualquier molécula que no es una molécula biológica se considera en esta especificación que es una molécula pequeña. Algunos ejemplos de moléculas pequeñas incluyen compuestos orgánicos, compuestos organometálicos, sales de compuestos organometálicos y orgánicos, sacáridos, aminoácidos, y nucleótidos. Las moléculas pequeñas incluyen además moléculas que podrían considerarse de otra forma moléculas biológicas, excepto que su peso molecular no es mayor a 450. De esta manera, las moléculas pequeñas pueden ser lípidos, oligosacáridos, oligopéptidos, y oligonucleótidos, y sus derivados, teniendo
«e " -**£» t %" un peso molecular de 450 o menos. Se enfatiza que todas las moléculas pequeñas pueden tener cualquier peso molecular. Se denominan meramente moléculas pequeñas debido a que tienen típicamente pesos moleculares menores a 450. Las moléculas pequeñas incluyen compuestos que se encuentran en la naturaleza así como también los compuestos sintéticos. Preferentemente, las moléculas pequeñas inhiben el crecimiento de las células tumorales refractarias que expresan la quinasa de tirosina EGFR/HER1 . Las numerosas moléculas pequeñas se han descrito como siendo útiles para inhibir el EGFR. Por ejemplo, Spada et al. , la Patente de E.U. 5,656,655, describe los compuestos de heteroarilo sustituidos por estirilo que inhiben EGFR. El grupo heteroarilo es un anillo monoclíclico con uno o dos heteroátomos, o un anillo bicíclico con 1 a aproximadamente 4 heteroátomos, sustituyéndose o polisustituyéndose opcionalmente el compuesto. Los compuestos descritos en la Patente de E.U. 5,656,655 se incorporan en la presente para referencia. Spada et al. , Patente de E.U. 5,646, 153, describe los compuestos heterocarbocíclicos, carbocíclicos, heteroarilo de arilo mono y/o bicíclico que inhiben EGFR. Los compuestos descritos en la Patente de E.U. 5,646, 153 se incorporan en la presente para referencia. Bridges et al. , Patente de E.U. 5,679,683, describe los compuestos de pirimidina tricíclicos que inhiben el EGFR. Los compuestos son derivados de pirimidina heterocíclicos fusionados descritos en la columna 3, línea 35 a la columna 5, línea 6. La descripción de estos compuestos en la columna 3, línea 35 a columna 5, línea 6 se incorpora en
^_.^_«_ata _rf_&^ la presente para referencia. Barker, Patente de E.U. 5,616,582, describe los derivados de quinazolina que tienen actividad inhibidora de quinasa de tirosina de receptor. Los compuestos descritos en la Patente de E.U. 5,616,582, se
• incorporan en la presente para referencia. Fry et al. , Science 265. 1093-1095 (1994) describe un compuesto que tiene una estructura que inhibe EGFR. La estructura se muestra en la Figura 1 . El compuesto mostrado en la Figura 1 del artículo de Fry ef al. , se incorpora en la presente para referencia. 10 Osherov ef al., describen tirfostinas que inhiben EGFR/HER1 y
HER2. Los compuestos descritos en el artículo de Osherov et al. , en particular, aquellos en las Tablas I, II, lll y IV se incorporan en la presente para referencia. Levitzki et al. , Patente de E.U. 5, 196,446, describe los
15 compuestos de heteroariletenodiilarilo o heteroariletenodiilo que inhiben el EßFR. Los compuestos descritos en la Patente de E.U. 5, 196,446 de la columna 2, línea 42 a columna 3, línea 40 se incorporan en la presente para referencia. Panek ef al. , Journal of Pharmacology and Experimental
20 Therapeutics 283. 1433-1444 (1997) describen un compuesto identificado como PD166285 que inhibe las familias EGFR, PDGFR, y FGFR de los receptores. El PD166285 se identifica como 6-(2,6-diclorofenil)-2-(4-(2- dietílaminoetoxi)fenilamino)-8-metil-8H-pirido(2,3-d)pirimidin-7-ona que tiene la estructura mostrada en la Figura 1 en la página 1436. El
25 compuesto descrito en la Figura 1 en la página 1436 del artículo de Panek
t__ ^__,___Lil_£ ÉtjÉfii?aÉ___^^ m¡ et al. se incorpora en la presente para referencia. Administración de antagonistas EGFR/HER1 La presente invención incluye administrar una cantidad efectiva del antagonista EGFR/HER1 a pacientes humanos. La
# administración de los antagonistas EGFR/HER1 puede lograrse en una variedad de maneras incluyendo sistemáticamente por las vías entérales y parenterales. Por ejemplo, los antagonistas EGFR/HER1 de la presente invención pueden administrarse fácilmente intravenosamente (por ejemplo, inyección intravenosa) la cual es una vía preferida de suministro. La 10 administración intravenosa puede lograrse al contactar los antagonistas EGFR/HER1 con un dispositivo (vehículo) o excipiente farmacéutico
# adecuado según se entiende por aquellos expertos en la materia. El antagonista EGFR/HER1 puede administrarse con adyuvantes, tal como por ejemplo, BCG, estimuladores de sistema inmune y agentes 15 quimioterapeúticos. Los antagonistas EGFR/HER1 que son fármacos biológicos o moléculas pequeñas pueden administrarse según se describe en Spada,
Patente de E.U. 5,646, 153 en la columna 57, línea 47 a columna 59, línea
67. Esta descripción de administrar las moléculas pequeñas se incorpora
20 en la presente para referencia. Los antagonistas EGFR/HER1 de la presente invención inhiben significativamente el crecimiento de las células tumorales refractarias cuando se administran a un paciente humano en una cantidad efectiva.
Según se utiliza en la presente, una cantidad efectiva es aquella cantidad
25 efectiva para lograr el resultado especificado de inhibir el crecimiento del
i±L ? k*- J-¿--*- .____-__. .^^ ¿tofca,^.^,,i ^,^^ tumor refractario. Preferentemente, el antagonista EGFR/HER1 se proporciona en el tumor en una cantidad que inhibe el crecimiento de tumor sin romper el crecimiento del tejido normal. Más preferentemente, el antagonista EGFR/HER1 inhibe el crecimiento de tumor sin serios efectos secundarios. Algunos serios efectos secundarios incluyen supresión de la médula, anemia e infección. Las dosis óptimas de los antagonistas EGFR/HER1 que son anticuerpos y equivalentes funcionales de anticuerpos pueden determinarse por expertos en base al número de parámetros incluyendo, por ejemplo, edad, sexo, peso, severidad de la condición a tratarse, el anticuerpo a administrarse, y la vía de administración. En general, es deseable una concentración de suero de polipéptidos y anticuerpos que permite la saturación del receptor objetivo. Por ejemplo, normalmente es suficiente una concentración en exceso de aproximadamente 0.1 nM. Por ejemplo, una dosis de 100 mg/m2 de C225 proporciona una concentración de suero de aproximadamente 20 nM por aproximadamente ocho días. Como una norma general áspera, las dosis de anticuerpos pueden darse semanalmente en cantidades de 10-300 mg/m2. Las dosis equivalentes de los fragmentos de anticuerpo deberían utilizarse en más intervalos frecuentes a fin de mantener un nivel de suero en exceso de la concentración que permite la saturación de los receptores. Terapia de Combinación En una modalidad preferida, el tumor refractario puede tratarse con una cantidad efectiva de un antagonista EGFR/HER1 con agentes
quimioterapeúticos, de los mismos. *, t Los ejemplos de agentes quimioterapeúticos o de quimioterapia incluyen agentes alquilizantes, por ejemplo, iperita nitrogenada, compuestos de sulfonatos de alquilo, y otros compuestos con una acción alquilizante tal como nítrosoureas, cisplatina y dacarbazina; antimetabolitos, por ejemplo, ácido fólico, antagonistas de pirimidina o purina; inhibidores mitóticos, por ejemplo, alcaloides vinca y derivados de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos y derivados de camptotecina. Los derivados de camptotecina incluyen, por ejemplo camptotecina, camptotecina 7-etilo, 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), camptotecina 9-amino, 10, 1 -metilenodioxi-camptotecina (MDCPT) y topotecan. Tales derivados de camptotecina también incluyen formulaciones estables de lactona de 7-etil-camptotecina descrita en la Patente de E.U. NO. 5,604,233, la descripción completa se incorpora en la presente para referencia. La presente invención incluye derivados de camptotecina altamente lipofílica tal como, por ejemplo, 10, 1 1 -metilenodioxi- camptotecina, 10,11-etilenodioxi-camptotecina, 9-etil-camptotecina, 7-etil- 10-hidroxi-camptotecina, 9-metil-camptotecina, 9-cloro-10, 1 - metilenodioxi-camptotecina, camptotecina 9-cloro, 10-hidroxi- camptotecina, camptotecina 9, 10-dicloro, 10-bromo-camptotecina, 10- bromo-camptotecina, 9-fluoro-camptotecina, 10-metil-camptotecina, 10- fluoro-camptotecina, 9-metoxi-camptotecina, 9-cloro-7-etil-camptotecina y 11-fluoro-camptotecina. Tales derivados de camptotecina altamente
lipofílica se describen en la P $ e de E. U. No. 5,880, 133, la descripción completa se incorpora en la presente para referencia. Los derivados de camptotecii solubles en agua incluyen, por ejemplo, el análogo soluble en agua fi? mptotecina conocido como CPT- 11 , 1 1 -hidroxi-7-alcoxi-camptotecina, 1 -hidroxi-7-metoxi-camptotecína (1 1 ,7-HMCPT) y 1 l -hidroxi-7-etil-camptotecina (1 1 .7-HECPT), 7- dimetilaminometileno-10, 1 1 -metilenodioxi-20(R,S)-camptotecina, 7- dimetilaminometileno-10, 1 1 -metilenodioxi-20(S)-camptotecina, 7- dimetilaminometileno-10, 1 1 -etilenodioxi-20(S)-camptotecina. Tales
10 derivados de camptotecina solubles en agua se describen en la Patentes de E.U. Nos. 5,559,235 y 5,468,754, las descripciones completas se
# incorporan en la presente para referencia. Los agentes quimioterapeúticos preferidos o de quimioterapia incluyen amifostina (etiol), cisplatina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina,
15 mecloretamina (iperita nitrogenada), estreptozocina, ciciofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorubicina (adriamicin), lipo doxorubicina (doxil), gemcitabina (gemzar), daunorubicin, lipo daunorubicin (daunoxoma), procarbazina, mitomicin, citarabina, etoposido, metrotrexato,
^^W 5-fluorouracil, vinblastina, vincristina, bleomicin, paclitaxel (taxol),
20 docetaxel (taxotere), aldesleukin, asparaginasa, busulfan, carboplatin, cladribina, camptotecina, CPT-1 1 , 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarubicin, mesna, interferona alfa, interferona beta, irinotecan, mitoxantrona, topotecan, leuprolido, megestrol, melphalan, mercaptopurina, piicamicin,
25 mitotano, pegaspargasa, pentoestatin, pipobroman, plicamicin, ptozocin, tamoxifen, teniposido, testolactona, tioguanina, titepa, iperita uracil, vinorelbina, cloramfeucil y combinaciones de los mismos. La administración de los agentes quimioterapeúticos puede lograrse en una variedad de maneras incluyendo sistemáticamente por las vías entérales y parenterales. Preferentemente, el agente quimioterapeútico se administra intravenosamente al contactar el agente quimioterapeútico con un dispositivo (vehículo) o excipiente adecuado según se entiende por aquellos expertos en la materia. La dosis de agente quimioterapeútico depende de numerosos factores según se conoce bien en la materia. Tales factores incluyen edad, sexo, peso, severidad de la condición a tratarse, el agente a administrarse, y la vía de administración. Por ejemplo, ia cisplatina puede administrarse convenientemente en una dosis de aproximadamente 100 mg/m2. Sin embargo, debería enfatizarse, que la invención no se limita a cualquier dosis en particular. Todavía en otra modalidad el tumor refractario puede tratarse con una cantidad efectiva de un antagonista EGFR/HER1 en combinación con la radiación. La fuente de radiación puede ser ya sea interna o externa en el paciente a tratar. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia se conoce como terapia de radiación de rayo externo (EBRT). Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquiterapia (BT). La radiación se administra de acuerdo con las técnicas estándares bien conocidas con el equipo estándar elaborado para este propósito, tal como Theratron AECL y Varian Clínica. La dosis de radiación depende de numerosos factores según se conoce bien en la
t_ _______a__. ______»_,_ — ^ün^^^p^., ^^.
no a tratar, los órganos saludables en la v a de la ra ac n que nadvertidamente podrían afectarse adversamente, la tolerancia del paciente para la terapia de radiación, y el área del cuerpo en necesidad del tratamiento. La dosis típicamente será entre 1 y 100 Gy, y más particularmente entre 2 y 80 Gy. Algunas dosis que se han reportado incluyen 35 Gy en la médula espinal, 15 Gy en los riñones, 20 Gy en el hígado, y 65-80 Gy en la próstata. Sin embargo, debería enfatizarse, que la invención no se limita a alguna dosis en particular. La dosis se determinará por el experto en tratamiento de acuerdo con los factores en particular en una situación dada, incluyendo los factores anteriormente mencionados. La distancia entre la fuente de la radiación externa y el punto de entrada en el paciente puede ser cualquier distancia que represente un balance aceptable entre matar las células objetivo y minimizar los efectos secundarios. Típicamente, la fuente de la radiación externa es entre 70 y 100 cm del punto de entrada en el paciente. La braquiterapia se lleva a cabo generalmente al colocar la fuente de radiación en el paciente. Típicamente, la fuente de radiación se coloca aproximadamente 0-3 cm del tejido a tratar. Las técnicas conocidas incluyen braquiterapia de superficie, intercavidad, e intersticial. Las semillas radioactivas pueden implantarse permanente o temporalmente. Algunos átomos radioactivos típicos que se han utilizado en implantes permanentes incluyen yoduro 125 y radón. Algunos átomos radioactivos típicos que se han utilizado en implantes temporales incluyen radio, cesio 137, e iridio 192. Algunos átomos radioactivos adicionales que se han
utilizado e? la braquiterapia incluyen americio 241 y oro 198. La dosis de la braquiterapia puede ser la misma que la anteriormente mencionada para la terapia de radiación de rayo externo. Además de los factores anteriormente mencionados para
• determinar la dosis de la terapia de radiación de rayo externo, la naturaleza del átomo radioactivo utilizado también se tomó en cuenta en la determinación de la dosis de la braquiterapia. En la modalidad preferida, existe sinergia cuando los tumores refractarios en pacientes humanos se tratan con el antagonista
10 EGFR/HER1 y los agentes quimioterapeúticos o radiación o combinaciones de los mismos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento de tumor por el antagonista EGFR/HER1 se mejora cuando se combina con agentes quimioterapeúticos o radiación o combinaciones de los mismos. La sinergia puede mostrarse, por ejemplo, por mayor inhibición del
15 crecimiento de tumor refractario con el tratamiento combinado que podría esperarse del tratamiento ya sea con el antagonista EGFR/HER1 , agente quimioterapeútico o radiación sola Preferentemente, la sinergia se demuestra por remisión del cáncer en donde la remisión no se espera del tratamiento con el antagonista EGFR/HER1 , agente quimioterapeútico o
20 radiación sola. El antagonista EGFR/HER1 se administra antes, durante, o después de comenzar la terapia de radiación o de agente quimioterapeútico, así como también cualquier combinación de los mismos, es decir, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes,
25 durante, y después de comenzar la terapia de radiación y/o de agente
quimioterapeútico. Por ejemplot cuando el antagonista EGFR/HER1 es un anticuerpo, se administra típicamente «entre 1 y 30 días, preferentemente entre 3 y 20 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de comenzar la terapia de radiación y/o de agentes quimioterapeúticos. Ejemplo 1. Prueba Clínica En una prueba clínica, los pacientes humanos con carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello refractario se trataron con una combinación de un antagonista EGFR/HER1 (anticuerpo monoclonal anti- EGFR quimérico, C225) y cisplatina. Los pacientes recibieron
10 semanalmente infusiones de C225 en dosis de mantenimiento/carga de 100/100, 400/250, o 500/250 mg/m2 en combinación con 100 mg/m2 de
• cisplatina cada tres semanas. Las muestras de tumor se obtuvieron en línea de base, 24 horas después de la infusión inicial y 24 horas antes de la tercera infusión para valorar la saturación y función de EGFR de tumor.
15 La saturación de EGFR de tumor se valoró por inmunohistoquímica (IHC) utilizando M225 (contraparte de murino de C225) como anticuerpo principal e IgG de anti-ratón como anticuerpo secundario para detectar el EGFR desocupado. La función de EGFR se valoró por IHC utilizando un anticuerpo específico para EGFR activado (Transduction Labs) y medida
20 de actividad de quinasa de tirosina EGFR en lisatos de tumor después de aclarar los complejos de C225-EGFR. Un aumento de dosis dependiente en la saturación de receptor se notó con más de 70% de la saturación de receptor a través de 500/250 mg/m2 de niveles de dosis. De igual forma, una reducción significativa de actividad de quinasa de tirosina EGFR se ha
25 notado con ninguna actividad detectable en 67% de los pacientes en dosis
de 100/100 mg/m2, saturación funcional de sugestión. Los eventos adversos fueron fiebre, reacciones alérgicas, y toxicidad de la piel manifestados como salpullido folicular o cambios de matriz de la uña, los cuales se resolvieron completamente después de la cesación del tratamiento. En siete pacientes evaluables hubo un mínimo, cinco parciales, y una respuesta completa según se determina por el examen físico y valores de laboratorio. La respuesta completa se observó en un paciente que tuvo antes el tratamiento de cispiatina. La respuesta parcial se observó en cinco pacientes, cuatro tuvieron antes la quimioterapia, uno tuvo antes el tratamiento de radiación. La respuesta mínima se observó en un paciente con el tratamiento de radiación previo. Los resultados se muestran en la tabla, en donde CR significa respuesta completa, PR significa respuesta parcial, y MR significa respuesta mínima. TABLA 1 Prueba Clínica
?á**áJ¡??láiL** Ejemplo 2. Prueba Clínica En una prueba clínica, uno de los pacientes humanos con cáncer de intestino grueso refractario se trató con una combinación de un antagonista EGFR/HER1 (anticuerpo monoclonal anti-EGFR quimérico, C225) y CPT-1 1. El paciente recibió semanalmente infusiones de C225 en una dosis de carga de 400 mg/m2 en combinación con 125 mg/m2 de CPT- 11. La dosis de mantenimiento de 250 mg/m2 C225 en combinación con 69-125 mg/m2 de CPT-1 1 se administraron en una base semanalmente. Clínicamente, el paciente tuvo una respuesta completa. El horario de dosificación se resume en la Tabla 2 de abajo. TABLA 2 Prueba Clínica