MX2014010140A

MX2014010140A - Molecula de union al antigeno para promover la perdida de antigeno a traves de fc?riib.

Info

Publication number: MX2014010140A
Application number: MX2014010140A
Authority: MX
Inventors: Tomoyuki Igawa; Futa Mimoto; Shojiro Kadono; Atsuhiko Maeda; Kenta Haraya; Yuki Iwayanagi; Hitoshi Katada
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2014-09-12
Also published as: WO2013125667A1; JP2022043347A; ES2795419T3; TW202231872A; CN107266564A; SG10201805584YA; KR102475951B1; AU2018202968A1; KR102219987B1; TW201900681A; KR20220136441A; TW201343673A; MX370668B; AU2013223087B2; AU2018202643A1; EP2818183A1; TWI682939B; JP7411698B2; BR112014020821B1; JP2024038068A

Abstract

La presente invención proporciona las moléculas de unión al antígenos que contienen (i) un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de iones, (ii) un dominio de unión a Fcy que tiene actividad de unión selectiva a FcyRllb, y (iii) un dominio de unión a FcRn que tiene una actividad de unión a FcRn bajo una condición de intervalo de pH ácido, y los métodos para disminuir la concentración plasmática del antígeno en comparación con antes de administrar la molécula, que incluye la etapa de administrar la molécula.

Description

MOLÉCULA DE UNIÓN AL ANTÍGENO PARA PROMOVER LA PÉRDIDA DE ANTÍGENO A TRAVÉS DE FCYRIIB Campo de la Invención La presente invención proporciona los usos de moléculas de unión al antígeno para eliminar antígenos del plasma; métodos para eliminar antígenos del plasma, que comprenden administrar las moléculas de unión al antígeno; composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas de unión al antígeno que son capaces de eliminar los antígenos del plasma; y métodos para producir las moléculas de unión al antígeno para eliminar los antígenos del plasma.

Antecedentes de la Invención Los anticuerpos están llamando la atención como productos farmacéuticos pues son altamente estables en plasma y tienen pocos efectos secundarios. En la presente, un número de anticuerpos de productos farmacéuticos tipo IgG está disponible en el mercado y muchos anticuerpos terapéuticos están actualmente en desarrollo (Documentos No Relacionados con Patente 1 y 2). Mientras tanto, varias tecnologías aplicables a anticuerpos terapéuticos de segunda generación se han reportado, que incluye aquellos que mejoran la función efectora, ia capacidad de unión al antígeno, la farmacocinética y la estabilidad, y aquellos que reducen el riesgo de inmunogenicidad (Documento No Relacionado con Patente 3). En general, la dosis requerida de un anticuerpo farmacéutico es muy alta. Esto a su vez ha llevado a problemas, como alto costo de producción, así como la dificultad en producir formulaciones subcutáneas. En teoría, la dosis de un anticuerpo farmacéutico puede reducirse mejorando la farmacocinética de anticuerpo o mejorando la afinidad entre los anticuerpos y los antígenos.

La literatura ha reportado métodos para mejorar la farmacocinética de anticuerpo al usar la sustitución artificial de aminoácidos en regiones constantes (Documentos No Relacionados con Patentes 4 y 5). Similarmente, la maduración de afinidad se ha reportado como una tecnología para mejorar la capacidad de unión al antígeno y/o la actividad neutralizante de antígeno (Documento No Relacionado con Patente 6). Esta tecnología deja la mejora de la actividad de unión al antígeno mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en la región de CDR de una región variable o similares La mejora de la capacidad de unión al antígeno deja la mejora de la actividad biológica in vitro o la reducción de la dosificación, y deja además la mejora de la eficacia ¡n vivo (Documento No Relacionado con Patente 7).

La capacidad neutralizante de antígeno de una simple molécula de anticuerpo que tiene actividad neutralizante depende de su afinidad. Por lo tanto, la afinidad de anticuerpos se ha mejorado al usar varios métodos para neutralizar los antígenos con una pequeña cantidad de anticuerpos (Documento No Relacionado con Patente 6). Además, si la afinidad del anticuerpo puede hacerse infinita por la unido covalente al antfgeno, una simple molécula de anticuerpo podría neutralizar una molécula de antígeno (un anticuerpo divalente puede neutralizar dos moléculas de antígeno). Sin embargo, la reacción de neutralización estequiométrica de una molécula de anticuerpo contra una molécula de antígeno (un anticuerpo divalente contra dos antígenos) es el límite de los métodos, y es así imposible neutralizar totalmente un antígeno con una cantidad de anticuerpo más pequeña que la cantidad de antígeno. En decir, el efecto neutralizante de antígeno al mejorar la afinidad tiene un límite (Documento No Relacionado con Patente 8). Para prolongar el efecto de neutralización de un anticuerpo neutralizante por un cierto período, el anticuerpo se debe administrar en una dosis mayor que la cantidad de antígeno producida en el cuerpo durante el mismo período. Con sólo la mejora de la farmacocinética del anticuerpo o la tecnología de maduración de afinidad descrita antes, por lo tanto, existe una limitación en la reducción de la dosis de anticuerpo requerida. Por consiguiente, para sostener un efecto neutralizante de antígeno por un período objetivo con una cantidad de anticuerpo más pequeña que la cantidad de antígeno, un solo anticuerpo debe neutralizar los múltiples antígenos. Una molécula de unión al antígeno que une a un antígeno de una manera dependiente de pH y/o de la concentración de iones de metal se ha reportado recientemente como un nuevo método para alcanzar el objetivo anterior (Documentos de Patente 1 y 2). Cuando disocia una molécula de unión al antígeno dependiente de la concentración de ion del antígeno es reciclada al plasma por FcRn, puede unirse a otro antígeno de nuevo. Así, una simple molécula de unión al antígeno dependiente a la concentración de ion puede unirse a un número de antígenos repetidamente.

Por una parte, la retención de plasma de un antígeno es muy corta comparada con los anticuerpos reciclados a través de la unió a FcRn. Sin embargo, aunque la retención de plasma del mimo antígeno es corta, cuando un anticuerpo común con tal retención de plasma larga une al antígeno, la retención de plasma del complejo de antígeno-anticuerpo es similar prolongada al anticuerpo. Así, normalmente, cuando se administra un anticuerpo, el antígeno unido por el anticuerpo existe en la forma de un complejo de antígeno-anticuerpo, que prolonga la retención de plasma del antígeno (el antígeno no se elimina fácilmente del plasma), y causa un aumento de la concentración de antígeno en plasma. Por una parte, una molécula de unión al antígeno dependiente de la concentración de ion puede suprimir el aumento en la concentración del antígeno en plasma disociando del antígeno en el endosoma. Sin embargo, esta supresión de aumento en la concentración del antígeno en plasma es afectada por el equilibrio con la cantidad de los antígenos producidos in vivo. Por lo tanto, la posibilidad que la administración de tales moléculas de unión al antígeno dependientes de la concentración de ion pueda elevar la concentración del antígeno en plasma con respecto a antes de que la administración se consideró (Documento de Patente 3).

Recientemente, se produjeron las moléculas de unión al antígeno que unen a FcRn bajo condiciones neutras. La administración de una molécula de unión al antígeno que une a un antígeno de una manera dependiente de la concentración de ion y une a FcRn bajo condiciones neutras reveló que la molécula puede disminuir la concentración del antígeno en plasma con respecto a antes de la administración (Documento de Patente 3). Mientras que los anticuerpos comunes aumentan la concentración del antígeno en plasma cuando se administran, las moléculas de unión al antígeno que tienen actividad de unión a FcRn bajo condición al pH neutro y las moléculas de unión al antígeno que unen a un antígeno de una manera dependiente de la concentración de ion y que tienen actividad de unión a FcRn bajo una condición de pH neutro puede disminuir la concentración del antígeno en plasma cuando se administran. Puesto que tales moléculas de unión al antígeno pueden eliminar activamente los antígenos del plasma a través de la endocltosis que ocurre como un resultado de unirse a FcRn, estas moléculas son altamente útiles como productos farmacéuticos.

Por una parte, además de FcRn, varios receptores Fcv (FcyRI, FcYRIIa, FcyRIIb, y FcyRIIIa) existen como receptores para la IgG (Documento No Relacionado con Patente 9). Puesto que la actividad de unión de anticuerpos para activar receptores Fcy desempeñar un papel importante en la citotoxicidad de un anticuerpo, anticuerpos que dirigen antígenos de membrana, cuyas citotoxicidades han sido mejoradas mejorando su actividad de unión para activar los receptores Fcy se han desarrollado hasta la fecha (Documentos No Relacionados con Patentes 10 y 11). Similarmente, puesto que la actividad de unión al receptor Fcy inhibidor (FcyRIIb) desempeña un papel importante en la actividad de inmunosupresión (Documentos No Relacionados con Patentes 12, 13, y 14), la actividad agonística (Documentos No Relacionados con Patentes 15 y 16), y similares, anticuerpos que dirigen los antígenos de membrana, que han mejorado la actividad de unión a los receptores Fcy inhibidores, (Documentos No Relacionados con Patentes 17 y 18).

Los efectos de los anticuerpos que unen a los antígenos solubles en la unión a FcyR se han examinado principalmente desde el punto de vista de los efectos secundarios. Por ejemplo, se conoce que el riesgo para el tromboembolismo aumentado en un grupo de pacientes que se les administró bevacizumab, un anticuerpo contra VEGF (Documento No Relacionado con Patente 19). Similarmente, el tromboembolismo se ha observado en pruebas de desarrollo clínico de anticuerpos contra el ligando CD40, y el estudio clínico se continuó (Documento No Relacionado con Patente 20). El FcyRIIa, un receptor Fcy activador, se expresa en las células de plaquetas, mientras que un FcyRIIb del receptor Fcy inhibidor no lo está (Documento No Relacionado con Patente 21), y estudios posteriores usan modelos animales y similares han sugerido que ambos anticuerpos administrados agregan plaquetas a través de la unión a FcYRIIa en las plaquetas, y forman coágulos de sangre consecuentemente (Documentos No Relacionados con Patentes 22 y 23). En pacientes con lupus eritematoso sistémico que es una enfermedad autoinmune, las plaquetas se activan a través de un mecanismo dependiente de FcyRIIa, y la activación de la plaqueta se ha reportado para correlacionar con la severidad de los síntomas (Documento No Relacionado con Patente 24). Además, hay reportes que cuando un anticuerpo con unión a FcvRllb mejorada se usa como un farmacéutico, una disminución en riesgo de producción de anticuerpo puede esperarse (Documento No Relacionado con Patente 25), y un anticuerpo que une a un antígeno de membrana, cuyo unión a FcyRIIa se ha mejorado, mejora la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés) a través de los macrófagos y las células dendríticas (Documento No Relacionado con Patente 26). Sin embargo, la actividad de unión hacia la activación y/o receptores Fcy inhibidores de anticuerpos que dirigen antígenos solubles no había sido conocida para tener un efecto en la cinética en plasma de los anticuerpos o de los antígenos unidos por los anticuerpos en los organismos administrados con los anticuerpos.

Documentos del Estado de la Técnica [Documentos de Patente] [Documento de Patente 1] WO 2009/125825 [Documento de Patente 2] WO 2000/042072 [Documento de Patente 3] WO 2006/019447 Documentos No Relacionados con Patentes [Documento No Relacionado con Patente 1] Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 [Documento No Relacionado con Patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396 [Documento No Relacionado con Patente 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29 [Documento No Relacionado con Patente 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human lgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356 [Documento No Relacionado con Patente 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640 [Documento No Relacionado con Patente 6] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial librarles., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. (2005) 102 (24), 8466-8471 [Documento No Relacionado con Patente 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White Wl, Young JF, Kiener PA., Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665 [Documento No Relacionado con Patente 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S., Catalytic antibodies and their applications. , Curr Opin Biotechnol. (2005) 16 (6), 631-636 [Documento No Relacionado con Patente 9] Jefferis R, Lund J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models., Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65 [Documento No Relacionado con Patente 10] Clynes, R., Yoshizumi, T., Moroi, Y., Houghton, A.N., and Ravetch, J.V., Fe Receptors are required for passive and active immunity to melanoma., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 652-656 [Documento No Relacionado con Patente 11] Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV., Inhibitory Fe receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets., Nat. Med. (2000) 6, 443-446 [Documento No Relacionado con Patente 12] Wernersson S, Karlsson MC, Dahlstrom J, Mattsson R, Verbeek JS, Heyman B., IgG-mediated enhancement of antibody responses is low in Fc receptor gamma chain-deficient mice and increased in Fc gamma Rll-deficient mice., J. Immunol. (1999) 163 (2), 618-622 [Documento No Relacionado con Patente 13] Yuasa T, Kubo S, Yoshino T, Ujike A, Matsumura K, Ono M, Ravetch JV, Takai T., Deletion of fcgamma receptor IIB renders H-2(b) mice susceptible to collagen-induced arthritis., J. Exp. Med. (1999) 189 (1), 187-194 [Documento No Relacionado con Patente 14] Nakamura A, Yuasa T, Ujike A, Ono M, Nukiwa T, Ravetch JV, Takai T., Fcgamma receptor IIB-deficient mice develop Goodpasture's syndrome upon immunization with type IV collagen: a novel murine model for autoimmune glomerular basement membrane disease., J. Exp. Med. (2000) 191 (5), 899-906 [Documento No Relacionado con Patente 15] Li F, Ravetch JV., Inhibitory Fcy receptor engagement drives adjuvant and antitumor activities of agonistic CD40 antibodies., Science (2011) 333 (6045), 1030-1034 [Documento No Relacionado con Patente 16] Wilson NS, Yang B, Yang A, Loeser S, Marsters S, Lawrence D, Li Y, Pitti R, Totpal K, Yee S, Ross S, Vernes JM, Lu Y, Adams C, Offringa R, Kelley B, Hymowitz S, Daniel D, eng G, Ashkenazi A., An Fcy receptor-dependent mechanism drives antibody-mediated target- receptor signaling ¡n cáncer cells., Cáncer Cell (2011) 19 (1), 101-113 [Documento No Relacionado con Patente 17] Moore GL, Chen H, Karki S, Lazar GA., Englneered Fe variant antibodies with enhanced ability to recruit complement and medíate effector functions., Mol. Immunol.(2008) 45, 3926-3933 [Documento No Relacionado con Patente 18] Li F, Ravetch JV., Apoptotic and antitumor activity of death receptor antibodies require inhibitory Fcy receptor engagement., Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. (2012) 109 (27), 10966-10971 [Documento No Relacionado con Patente 19] Scappaticci FA, Skillings JR, Holden SN, Gerber HP, Miller K, Kabbinavar F, Bergsland E, Ngai J, Holmgren E, Wang J, Hurwitz H., Arterial thromboembolic events in patients with metastatíc carcinoma treated with chemotherapy and bevacizumab. , J. Nati. Cáncer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239 [Documento No Relacionado con Patente 20] Boumpas DT, Furíe R, anzi S, lllei GG, Wallace DJ, Balow JE, Vaishnaw A, A short course of BG9588 (anti-CD40 ligand antibody) improves serologíc activity and decreases hematuria ¡n patients with proliferative lupus glomerulonephritis. , Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727.

[Documento No Relacionado con Patente 21] Mackay M, Stanevsky A, Wang T, Aranow C, Li M, Koenig S, Ravetch JV, Diamond B., Selective dysregulation of the FcgammallB receptor on memory B cells ¡n SLE. , J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164 [Documento No Relacionado con Patente 22] Meyer T, Robles-Carrillo L, Robson T, Langer F, Desai H, Davila M, Amaya M, Francis JL, Amirkhosravi A., Bevacizumab immune complexes actívate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181 [Documento No Relacionado con Patente 23] Robles-Carrillo L, Meyer T, Hatfield M , Desai H, Davila , Langer F, Amaya M, Garber E, Francis JL, Hsu YM, Amirkhosravi A., Anti-CD40L immune complexes potently actívate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583 [Documento No Relacionado con Patente 24] Duffau P, Seneschal J, Nicco C, Richez C, Lázaro E, Douchet I, Bordes C, Viallard JF, Goulvestre C, Pellegrin JL, Weil B, Moreau JF, Batteux F, Blanco P., Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus., Sci. Transí. Med. (2010) 2 (47), 47-63 [Documento No Relacionado con Patente 25] Desai DD, Harbers SO, Flores M, Colonna L, Downie MP, Bergtold A, Jung S, Clynes R., Fe gamma receptor IIB on dendritic cells enforces peripheral tolerance by inhibiting effector T cell responses., J. Immunol. (2007) 178 (10), 6217-6226 [Documento No Relacionado con Patente 26] Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR., Optimization of antibody binding to FcgammaRlla enhances macrophage phagocytosis of tumor cells., Mol. Cáncer Ther. (2008) 7 (8) 2517-2527.

Breve Descripción de la Invención [Problemas a Solucionarse por la Invención] Se logró la presente invención en vista de las circunstancias anteriores. Como se menciona anteriormente, la actividad de unión hacia receptores FCY activadores y/o inhibidores de anticuerpos que dirigen antígenos solubles no había sido conocida por tener un efecto en la cinética en plasma de los anticuerpos o de los antígenos unidos por los anticuerpos en los organismos administrados con los anticuerpos. Más específicamente, un objetivo de la presente invención es suprimir el aumento en la concentración en plasma de un antígeno unido por una molécula de unión al antígeno administrando la molécula de unión al antígeno que tiene una actividad de unión hacia un antígeno patogénico presente en una forma soluble en plasma, y también tiene una actividad de unión deseada hacia los receptores Fcy activadores y/o inhibidores. Otro objetivo de la presente invención es optimizar la actividad de unión hacia los receptores Fcy activadores y/o inhibidores de moléculas de unión al antígeno contra los antígenos que causan enfermedades presentes en una forma soluble en plasma, y de tal modo optimizan la supresión del aumento en la concentración en plasma de antlgenos unidos por las moléculas de unión al antígeno.

[Medios para Solucionar los Problemas] Específicamente, la presente invención proporciona las moléculas de unión al antígeno que comprenden (i) un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, (ii) un dominio de unión a Fcy que tiene actividad de unión selectiva a FcyRIIb, y (¡ii) un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y los métodos para disminuir la concentración en plasma del antígeno en comparación con antes de administrar la molécula de unión al antígeno, que comprende la etapa de administrar la molécula. Además, la presente invención proporciona agentes para disminuir la concentración en plasma del antígeno, que comprenden una molécula de unión al antígeno que comprende (i) un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, (ii) un dominio de unión a Fcy que tiene actividad de unión selectiva a FcyRIIb, y (iii) un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. La presente invención también proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión al antígeno que comprende (i) un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, (ii) un dominio de unión a FCY que tiene actividad de unión selectiva a FCYRIID, y (iii) un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. La presente invención también proporciona los usos de la molécula de unión al antígeno para disminuir la concentración en plasma del antígeno, donde la molécula comprende (i) un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, (ii) un dominio de unión a FCY que tiene actividad de unión selectiva a FcYRIIb, y (iii) un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Además de lo anterior, la presente invención proporciona métodos para producir y/o métodos de evaluación para las moléculas de unión al antígeno. Aunque no se propone particularmente para limitar la invención, específicamente, se proporciona lo siguiente como una modalidad no limitante: [1] el uso de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno del plasma, donde la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU; [2] el uso de [1], donde la región Fe tiene una sustitución del aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 como se indica por la numeración de EU; [3] el uso de [2], donde los aminoácidos de la región Fe incluyen cualquiera o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición del aminoácido 233; Tyr en la posición del aminoácido 234; Asp en la posición del aminoácido 237; lie en la posición del aminoácido 264; Glu en la posición del aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición del aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición del aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición del aminoácido 268; Asp en la posición del aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, Me, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición del aminoácido 272; Gln en la posición del aminoácido 274; Asp o Phe en la posición del aminoácido 296; Ala o Asp en la posición del aminoácido 326; Gly en la posición del aminoácido 327; Lys o Arg en la posición del aminoácido 330; Ser en la posición del aminoácido 331; Thr en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, and Arg en la posición del aminoácido 333; Gln en la posición del aminoácido 355; Glu en la posición del aminoácido 356; Met en la posición del aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición del aminoácido 396; Arg en la posición del aminoácido 409; y Glu en la posición del aminoácido 419; [4] el uso de cualquiera de [1] a [3], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio; [5] el uso de [4], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía de tal manera que la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de ion calcio es menor que una actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de ion calcio; [6] el uso de cualquiera de [1] a [3], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones del pH; [7] el uso de [6], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía de tal manera que la actividad de unión al antígeno bajo una condición del intervalo de pH ácido es menor que una actividad de unión al antígeno bajo una condición del intervalo de pH neutro; [8] el uso de cualquiera de [1] a [7], donde el dominio de unión al antígeno es una región variable de anticuerpo; [9] el uso de cualquiera de [1] a [8], donde la región Fe es una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU en la región Fe incluida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; [10] el uso de cualquiera de [1] a [8], donde la actividad de unión a FcRn de la región Fe bajo una condición del intervalo de pH ácido se mejora comparada a la actividad de unión a FcRn de la región Fe incluida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; [11] el uso de [10], donde la región Fe con la unión mejorada es una región Fe que tiene una sustitución de aminoácido de por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, y 447, como se indica por la numeración de EU, en la secuencia de aminoácido de la región Fe incluida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; [12] el uso de [11], donde la región Fe con la unión mejorada comprende por lo menos uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: Leu en la posición del aminoácido 244; Arg en la posición del aminoácido 245; Pro en la posición del aminoácido 249; GIn o Glu en la posición del aminoácido 250; cualquiera de Arg, Asp, Glu, y Leu en la posición del aminoácido 251 ; cualquiera de Phe, Ser, Thr, y Tyr en la posición del aminoácido 252; Ser o Thr en la posición del aminoácido 254; cualquiera de Arg, Gly, Me, y Leu en la posición del aminoácido 255; cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, GIn, Glu, Pro, and Thr en la posición del aminoácido 256; cualquiera de Ala, Me, Met, Asn, Ser, and Val en la posición del aminoácido 257; Asp en la posición del aminoácido 258; Ser en la posición del aminoácido 260; Leu en la posición del aminoácido 262; Lys en la posición del aminoácido 270; Leu o Arg en la posición del aminoácido 272; cualquiera de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 279; cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 283; Asn en la posición del aminoácido 285; Phe en la posición del aminoácido 286; Asn o Pro en la posición del aminoácido 288; Val en la posición del aminoácido 293; cualquiera de Ala, Glu, Gln, and Met en la posición del aminoácido 307; cualquiera de lie, Pro, and Thr en la posición del aminoácido 308; Pro en la posición del aminoácido 309; cualquiera de Ala, Glu, He, Lys, Leu, Met, Ser, Val, and Trp en la posición del aminoácido 311; cualquiera de Ala, Asp, and Pro en la posición del aminoácido 312; Ala o Leu en la posición del aminoácido 314; Lys en la posición del aminoácido 316; Pro en la posición del aminoácido 317; Asn o Thr en la posición del aminoácido 318; cualquiera de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, and Trp en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Asn, Thr, and Trp en la posición del aminoácido 339; Pro en la posición del aminoácido 341; cualquiera de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, or Tyr en la posición del aminoácido 343; Arg en la posición del aminoácido 375; cualquiera de Gly, Me, Met, Pro, Thr, and Val en la posición del aminoácido 376; Lys en la posición del aminoácido 377; cualquiera de Asp, Asn, and Val en la posición del aminoácido 378; cualquiera de Ala, Asn, Ser, and Thr en la posición del aminoácido 380; cualquiera de Phe, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 382; cualquiera de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser, and Thr en la posición del aminoácido 385; cualquiera de Arg, Asp, lie, Lys, Met, Pro, Ser, and Thr en la posición del aminoácido 386; cualquiera de Ala, Arg, His, Pro, Ser, and Thr en la posición del aminoácido 387; cualquiera de Asn, Pro, and Ser en la posición del aminoácido 389; Asn en la posición del aminoácido 423; Asn en la posición del aminoácido 427; cualquiera de Leu, Met, Phe, Ser, and Thr en la posición del aminoácido 428; cualquiera de Ala, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, y Tyr en la posición del aminoácido 430; His o Asn en la posición del aminoácido 431; cualquiera de Arg, Gln, His, lie, Lys, Pro, and Ser en la posición del aminoácido 433; cualquiera de Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 434; cualquiera de Arg, Asn, His, Me, Leu, Lys, Met, and Thr en la posición del aminoácido 436; cualquiera de Lys, Leu, Thr, and Trp en la posición del aminoácido 438; Lys en la posición del aminoácido 440; y Lys en la posición del aminoácido 442; como se indica por la numeración de EU, en la secuencia de aminoácido de la región Fe incluida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; [13] el uso de cualquiera de [1] a [12], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo; [14] una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU; [15] la composición farmacéutica de [14], donde la región Fe tiene una sustitución del aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 como se indica por la numeración de EU; [16] la composición farmacéutica de [15], donde los aminoácidos de la región Fe incluyen cualquiera o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición del aminoácido 233; Tyr en la posición del aminoácido 234; Asp en la posición del aminoácido 237; Me en la posición del aminoácido 264; Glu en la posición del aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición del aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición del aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición del aminoácido 268; Asp en la posición del aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, Me, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición del aminoácido 272; Gln en la posición del aminoácido 274; Asp o Phe en la posición del aminoácido 296; Ala o Asp en la posición del aminoácido 326; Gly en la posición del aminoácido 327; Lys o Arg en la posición del aminoácido 330; Ser en la posición del aminoácido 331; Thr en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, and Arg en la posición del aminoácido 333; Gln en la posición del aminoácido 355; Glu en la posición del aminoácido 356; Met en la posición del aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, lie, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición del aminoácido 396; Arg en la posición del aminoácido 409; y Glu en la posición del aminoácido 419; [17] un método para producir una molécula de unión al antígeno, que comprende las etapas (a) a (e) a continuación: (a) obtener un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion; (b) obtener un gen que codifica el dominio de unión al antígeno seleccionado en la etapa (a); (c) operablemente ligar el gen obtenido en la etapa (b) con un gen que codifica una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU; (d) cultivar las células hospedadoras que contienen el gen operablemente ligado en la etapa (c); y (e) aislar una molécula de unión al antígeno a partir de la solución de cultivo obtenida en la etapa (d); [18] el método de producción de [17], donde la región Fe tiene una sustitución del aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 como se indica por la numeración de EU; [19] el método de producción de [18], donde los aminoácidos de la región Fe incluyen cualquiera o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición del aminoácido 233; Tyr en la posición del aminoácido 234; Asp en la posición del aminoácido 237; Me en la posición del aminoácido 264; Glu en la posición del aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición del aminoácido cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición del aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición del aminoácido 268; Asp en la posición del aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, lie, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición del aminoácido 272; Gln en la posición del aminoácido 274; Asp o Phe en la posición del aminoácido 296; Ala o Asp en la posición del aminoácido 326; Gly en la posición del aminoácido 327; Lys o Arg en la posición del aminoácido 330; Ser en la posición del aminoácido 331; Thr en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición del aminoácido 333; Gln en la posición del aminoácido 355; Met en la posición del aminoácido 356; Met en la posición del aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición del aminoácido 396; Arg en la posición del aminoácido 409; y Glu en la posición del aminoácido 419; [20] un método para producir una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión al antígeno, la cual comprende las etapas de: (a) obtener un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion; (b) obtener un gen que codifica el dominio de unión al antígeno seleccionado en la etapa (a); (c) operablemente ligar el gen obtenido en la etapa (b) con un gen que codifica una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de EU) es Asp y el aminoácido en la posición 271 (numeración de EU) es Gly; (d) cultivar las células hospedadoras que contienen el gen operablemente ligado en la etapa (c); y (e) aislar una molécula de unión al antígeno a partir de la solución de cultivo obtenida en la etapa (d); [21] el método de producción de [20], donde la región Fe tiene una sustitución del aminoácido de por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 (numeración de EU); [22] el método de producción de [21], donde los aminoácidos de la región Fe incluyen cualquiera o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición del aminoácido 233; Tyr en la posición del aminoácido 234; Asp en la posición del aminoácido 237; lie en la posición del aminoácido 264; Glu en la posición del aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición del aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición del aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición del aminoácido 268; Asp en la posición del aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, lie, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición del aminoácido 272; Gln en la posición del aminoácido 274; Asp o Phe en la posición del aminoácido 296; Ala o Asp en la posición del aminoácido 326; Gly en la posición del aminoácido 327; Lys o Arg en la posición del aminoácido 330; Ser en la posición del aminoácido 331; Thr en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición del aminoácido 333; Gln en la posición del aminoácido 355; Glu en la posición del aminoácido 356; Met en la posición del aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición del aminoácido 396; Arg en la posición del aminoácido 409; y Glu en la posición del aminoácido 419; [23] un método para eliminar un antígeno del plasma, que comprende administrar una cantidad eficaz de una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU; [24] el método de [23], donde la región Fe tiene una sustitución del aminoácido de por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 como se indica por la numeración de EU; [25] el método de [24], donde los aminoácidos de la región Fe incluyen cualquiera o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición del aminoácido 233; Tyr en la posición del aminoácido 234; Asp en la posición del aminoácido 237; Me en la posición del aminoácido 264; Glu en la posición del aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición del aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición del aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición del aminoácido 268; Asp en la posición del aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, lie, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición del aminoácido 272; Gln en la posición del aminoácido 274; Asp o Phe en la posición del aminoácido 296; Ala o Asp en la posición del aminoácido 326; Gly en la posición del aminoácido 327; Lys o Arg en la posición del aminoácido 330; Ser en la posición del aminoácido 331; Thr en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición del aminoácido 333; Gln en la posición del aminoácido 355; Glu en la posición del aminoácido 356; Met en la posición del aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición del aminoácido 396; Arg en la posición del aminoácido 409; y Glu en la posición del aminoácido 419; [26] el método de cualquiera de [23] a [25], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio; [27] el método de [26], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión ai antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía de tal manera que la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de ion calcio es menor que una actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de ion calcio; [28] el método de cualquiera de [23] a [25], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones del pH; [29] el método de [28], donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía de tal manera que la actividad de unión al antígeno bajo una condición del intervalo de pH ácido es menor que una actividad de unión al antígeno bajo una condición del intervalo de pH neutro; [30] el método de cualquiera de [23] a [29], donde el dominio de unión al antígeno es una región variable de anticuerpo; [31] el método de cualquiera de [23] a [30], donde la región Fe anteriormente mencionada es la región Fe contenida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17 en las cuales el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU; [32] el método de cualquiera de [23] a [30], donde la actividad de unión a FcRn de la región Fe bajo una condición del intervalo de pH ácido se mejora comparada a la actividad de unión a FcRn de la región Fe contenida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; [33] el método de [32], donde la región Fe con el unión mejorada es una región Fe que tiene una sustitución del aminoácido de por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, y 447, como se indica por la numeración de EU, en la secuencia de aminoácido de la región Fe contenida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; [34] el método de [33], donde la región Fe con el unión mejorada comprende por lo menos uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: Leu en la posición del aminoácido 244; Arg en la posición del aminoácido 245; Pro en la posición del aminoácido 249; GIn o Glu en la posición del aminoácido 250; cualquiera de Arg, Asp, Glu, y Leu en la posición del aminoácido 251 ; cualquiera de Phe, Ser, Thr, y Tyr en la posición del aminoácido 252; Ser o Thr en la posición del aminoácido 254; cualquiera de Arg, Gly, lie, y Leu en la posición del aminoácido 255; cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, GIn, Glu, Pro, y Thr en la posición del aminoácido 256; cualquiera de Ala, Me, Met, Asn, Ser, y Val en la posición del aminoácido 257; Asp en la posición del aminoácido 258; Ser en la posición del aminoácido 260; Leu en la posición del aminoácido 262; Lys en la posición del aminoácido 270; Leu o Arg en la posición del aminoácido 272; cualquiera de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, GIn, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 279; cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Asn, Pro, GIn, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 283; Asn en la posición del aminoácido 285; Phe en la posición del aminoácido 286; Asn o Pro en la posición del aminoácido 288; Val en la posición del aminoácido 293; cualquiera de Ala, Glu, Gln, y Met en la posición del aminoácido 307; cualquiera de Me, Pro, y Thr en la posición del aminoácido 308; Pro en la posición del aminoácido 309; cualquiera de Ala, Glu, Me, Lys, Leu, Met, Ser, Val, y Trp en la posición del aminoácido 311; cualquiera de Ala, Asp, and Pro en la posición del aminoácido 312; Ala o Leu en la posición del aminoácido 314; Lys en la posición del aminoácido 316; Pro en la posición del aminoácido 317; Asn o Thr en la posición del aminoácido 318; cualquiera de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, y Trp en la posición del aminoácido 332; cualquiera de Asn, Thr, y Trp en la posición del aminoácido 339; Pro en la posición del aminoácido 341; cualquiera de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, y Tyr en la posición del aminoácido 343; Arg en la posición del aminoácido 375; cualquiera de Gly, Me, Met, Pro, Thr, y Val en la posición del aminoácido 376; Lys en la posición del aminoácido 377; cualquiera de Asp, Asn, o Val y en la posición del aminoácido 378; cualquiera de Ala, Asn, Ser, y Thr en la posición del aminoácido 380; cualquiera de Phe, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 382; cualquiera de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser, y Thr en la posición del aminoácido 385; cualquiera de Arg, Asp, lie, Lys, Met, Pro, Ser, y Thr en la posición del aminoácido 386; cualquiera de Ala, Arg, His, Pro, Ser, y Thr en la posición del aminoácido 387; cualquiera de Asn, Pro, y Ser en la posición del aminoácido 389; Asn en la posición del aminoácido 423; Asn en la posición del aminoácido 427; cualquiera de Leu, Met, Phe, Ser, y Thr en la posición del aminoácido 428; cualquiera de Ala, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, y Tyr en la posición del aminoácido 430; His o Asn en la posición del aminoácido 431; cualquiera de Arg, Gln, His, Me, Lys, Pro, y Ser en la posición del aminoácido 433; cualquiera de Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp, y Tyr en la posición del aminoácido 434; cualquiera de Arg, Asn, His, lie, Leu, Lys, Met, y Thr en la posición del aminoácido 436; cualquiera de Lys, Leu, Thr, y Trp en la posición del aminoácido 438; Lys en la posición del aminoácido 440; y Lys en la posición del aminoácido 442 como se indica por la numeración de EU, en la secuencia de aminoácido de la región Fe contenida en cualquiera de las SEC ID NOs: 14, 15, 16, o 17; y [35] el método de cualquiera de [23] a [34], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.

En la presente invención, las siguientes frases se usan sinónimamente: "uso de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno del plasma, donde la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU"; "un método para tratar una enfermedad causada por un antígeno, que comprende administrar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU"; "una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de la condición de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU"; "uso de una molécula de unión al antígeno en producir una composición farmacéutica, donde la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de la condición de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU"; y "un proceso para producir una composición farmacéutica, que comprende usar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de la condición de concentración de ion, y una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly como se indica por la numeración de EU".

Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 muestra un mecanismo de acción no limitante para la eliminación del antígeno soluble del plasma administrando un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera dependiente de la concentración de ion y cuya unión del receptor Fcy se mejora en un pH neutro en comparación con los anticuerpos neutralizantes existentes.

La Fig. 2 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1 que se une al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH o H54/L28-lgG 1.

La Fig. 3 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1 que se une al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH, Fv4-lgG 1 -F760 que es una variante Fv4-lgG1 que carece de unión a FcyR de ratón, Fv4-lgG1 -F1022 que es una variante Fv4-lgG1 con unión a FcyR de ratón mejorada, o Fv4-lgG1-Fuc que es un anticuerpo Fv4-lgG1 con bajo contenido de fucosa.

La Fig. 4 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de los ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1 o las moléculas de unión al antígeno que comprenden como la cadena pesada, Fv4-lgG 1 -F 1022 o Fv4-lgG1 -F1093 que es una variante Fv4-lgG1-F1022 con unión a FcRn mejorado en un intervalo de pH ácido.

La Fig. 5 muestra un curso de tiempo de concentración de las moléculas de unión al antígeno administradas en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1 o moléculas de unión al antígeno que comprenden como la cadena pesada, Fv4-lgG 1 -F1022 o Fv4-lgG1-F1093 que es una variante Fv4-lgG1-F1022 con unión a FcRn mejorado en un intervalo de pH ácido.

La Fig. 6 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1, Fv4-lgG 1 -F 1087 que es una variante Fv4-lgG1 con unión a FCYR de ratón mejorado (en particular, unión a FcyRIIb de ratón mejorado y unión a FcyR 111 de ratón mejorado), y Fv4-lgG 1 -F 1182 que es una variante Fv4-lgG1 con unión a FcyR de ratón mejorado (en particular, unión a FcyRI de ratón mejorado y unión a FcyRIV de ratón mejorado).

La Fig. 7 muestra un curso de tiempo de concentración de las moléculas de unión al antígeno administradas en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-F1087, y Fv4-lgG1 -F1180 y Fv4-lgG1 -F1412 que son las variantes Fv4-lgG 1 -F 1087 con unión a FcRn mejorado en un intervalo de pH ácido.

La Fig. 8 muestra un curso de tiempo de concentración de las moléculas de unión al antígeno administradas en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-F1182, y Fv4-lgG1 -F1181 que es una variante Fv4-lgG1-F1182 con unión a FcRn mejorado en un intervalo de pH ácido.

La Fig. 9 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1, Fv4-lgG1 -F1087, y Fv4-lgG1-F1180 y Fv4-lgG 1 -F 1412 que son las variantes Fv4-lgG1-F1087 con unión a FcRn mejorado en un intervalo de pH ácido.

La Fig. 10 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-F1182, y Fv4-lgG1-F1181 que es una variante Fv4-lgG 1 -F1182 con unión a FcRn mejorado en un intervalo de pH ácido.

La Fig. 11 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones normales administrados con Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1 -mF44 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FCYRIID de ratón mejorado y unión a FcyRIII de ratón mejorado, y Fv4-mlgG 1 -mF46 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FCYRIID de ratón mejorado adicional y unión a FCYRIII de ratón mejorado.

La Fig. 12 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones deficientes de FCYRIII administrados con Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1-mF44 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcyRIIb de ratón mejorado y unión a FCYRIII de ratón, y Fv4-mlgG 1 -mF46 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FCYRIID de ratón mejorado adicional y unión a FCYRIII de ratón mejorado.

La Fig. 13 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe administrados con Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1-mF44 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcyRIIb de ratón mejorado y unión a FcyRIII de ratón, y Fv4-mlgG 1 -mF46 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcyRIIb de ratón mejorado adicional y unión a FcyRIII de ratón mejorado.

La Fig. 14 muestra un curso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones deficientes de FcyRIIb administrados con Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1-mF44 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcyRIIb de ratón mejorado y unión a FcyRIII de ratón, y Fv4-mlgG1 -mF46 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcyRIIb de ratón mejorado adicional y unión a FcyRIII de ratón.

La Fig. 15 muestra un resultado de evaluar la capacidad de agregación plaquetaria del inmunocomplejo de omalizumab-G 1 d-v3/lgE mediante el ensayo de agregación plaquetaria al usar plaquetas derivadas de donantes con el alotipo FcyRIIa (R/H).

La Fig. 16 muestra un resultado de evaluar la capacidad de agregación plaquetaria del inmunocomplejo de omalizumab-G 1 d-v3/lgE mediante el ensayo de agregación plaquetaria al usar plaquetas derivadas de donantes con el alotipo FcyRIIa (H/H).

La Fig. 17 muestra un resultado de evaluar la expresión de CD62p en la superficie de membrana de las plaquetas lavadas. El área rellenada en color negro en la gráfica indica un resultado de la estimulación por ADP después de la reacción con PBS. El área que no está rellena en la gráfica indica un resultado de la estimulación por ADP después de la reacción con el inmunocomplejo.

La Fig. 18 muestra un resultado de evaluar la expresión de la integrina activa en la superficie de membrana de las plaquetas lavadas. El área rellenada en color negro en la gráfica indica un resultado de la estimulación por ADP después de la reacción con PBS. El área que no está rellena en la gráfica indica un resultado de la estimulación por ADP después de la reacción con el inmunocomplejo.

La Fig. 19 muestra una gráfica en la cual el eje horizontal muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIb de cada variante PD, y el eje vertical muestra el valor relativo de la actividad de unión a R tipo FcYRIIa de cada variante PD. Se dividió el valor para la cantidad de unión de cada variante PD a cada FcyR por el valor para la cantidad de unión de IL6R-F652/IL6R-L, que es un anticuerpo de control antes de la introducción de la alteración (IL6R-F652, definido por la SEC ID NO: 61, es una cadena pesada de anticuerpo que comprende una Fe alterada con la sustitución de Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Asp), a cada FcyR; y entonces se multiplicó el valor obtenido por 100, y se usó como el valor de actividad de unión relativa para cada variante PD a cada FcyR. La gráfica F652 en la figura muestra el valor para IL6R-F652/IL6R-L.

La Fig. 20 muestra una gráfica en la cual el eje vertical muestra el valor relativo de la actividad de unión a FCYRIID de las variantes producidas introduciendo cada alteración en GpH7-B3 (SEC ID NO: 63)/GpL16-kO que no tiene la alteración P238D, y el eje horizontal muestra el valor relativo de la actividad de unión a FCYRIID de las variantes producidas introduciendo cada alteración en IL6R-F652 (SEC ID NO: 61)/IL6R-L que tiene la alteración P238D. Se dividió el valor para la cantidad de unión a FCYRIID de cada variante por el valor para la cantidad de unión a FCYRIID del anticuerpo previamente alterado; y entonces se multiplicó el valor obtenido por 100, y se usó como el valor de actividad de unión relativa. Aquí, la región A contiene las alteraciones que exhiben el efecto de mejorar la unión a FcYRIIb en ambos casos donde se introduce una alteración en GpH7-B3/GpL16-k0 que no tiene P238D y donde una alteración se introduce en IL6R-F652/IL6R-L que tiene P238D. La región B contiene las alteraciones que exhiben el efecto de mejorar la unión a FcYRIIb cuando se introduce en GpH7-B3/GpL16-k0 que no tiene P238D, pero no exhiben el efecto de mejorar la unión a FcYRIIb cuando se introduce en I L6R-F652/I L6R-L que tiene P238D.

La Fig. 21 muestra una estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcYRIIb.

La Fig. 22 muestra una imagen de sobreposición de la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcYRIIb y la estructura modelo del complejo de región extracelular de FC(WT)/FCYRIID, con respecto a la región extracelular FCYRIID y al dominio A CH2 de Fe mediante ajustar los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca.

Fig. 23 muestra la comparación de la estructura detallada alrededor de P238D después de sobreponer la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcvRllb y la estructura modelo del complejo de región extracelular de FC(WT)/FCYRI Ib con respecto al único dominio A CH de Fe o al único dominio B CH2 de Fe mediante el ajuste de los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca.

La Fig. 24 muestra que un enlace de hidrógeno puede encontrarse entre la cadena principal de Gly en la posición 237 (indicada por la numeración de UE) en el dominio A CH de Fe, y Tyr en la posición 160 en FcYRIIb en la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcYRIIb.

La Fig. 25 muestra que una interacción electrostática se puede encontrar entre Asp en la posición 270 (indicada por la numeración de UE) en el dominio B CH2 de Fe, y Arg en la posición 131 en FcYRIIb en la estructura cristalina del complejo de región extracelular de FC(P238D)/FCYRI Ib.

La Fig. 26 muestra una gráfica en la cual el eje horizontal muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcyRIIb de cada variante 2B, y el eje vertical muestra el valor relativo de la actividad de unión a R tipo FcYRIIa de cada variante 2B. Se dividió el valor para la cantidad de unión de cada variante 2B a cada FcyR por el valor para la cantidad de unión de un anticuerpo de control antes de la alteración (Fe alterado con sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración de UE) con Asp) a cada FcyR; y entonces se multiplicó el valor obtenido por 100, y se usó como el valor de la actividad de unión relativa de cada variante 2B hacia cada FcyR.

La Fig. 27 muestra Glu en la posición 233 (indicada por la numeración de UE) en la cadena A de Fe y los residuos circundantes en la región extracelular de FcyRIIb en la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcYRIIb.

La Fig. 28 muestra Ala en la posición 330 (indicada por la numeración de UE) en la cadena A de Fe y los residuos circundantes en la región extracelular de FcyRIIb en la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcyRllb.

La Fig. 29 muestra las estructuras Pro en la posición 271 (numeración de UE) de la cadena B de Fe después de sobreponer las estructuras cristalinas del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcYRIIb y el complejo de región extracelular de Fc(WT)/FcyRllla mediante el ajuste de los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca con respecto a la cadena B de Fe.

La Fig. 30 muestra una imagen del complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcvRllb determinado mediante análisis de estructura cristalina de rayos X. Para cada uno de los dominios CH2 y CH3 en la porción de Fe, estos en el lado izquierdo se refieren como el dominio A y estos en el lado derecho se refieres como dominio B.

La Fig. 31 muestra la comparación después de sobreponer las estructuras del complejo de región extracelular de FC(P208)/FCYRI Ib y el complejo de región extracelular de Fc(WT)/FcYRIIa y (código PDB: 3RY6) determinada mediante análisis de estructura cristalina de rayos X con respecto al dominio A CH2 de la porción de Fe mediante el ajuste de los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca. En la gráfica, la estructura indicada con la línea gruesa muestra el complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb, mientras que la estructura indicada con la línea delgada indica la estructura del complejo de región extracelular de Fc(WT)/FcYRIIa. Solamente el dominio A CH2 de la porción de Fe se indica para el complejo de región extracelular de Fc(WT)/FcYRIIa.

La Fig. 32 muestra en la estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb, una estructura detallada alrededor de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en el dominio A CH2 de la porción de Fe, que forma un enlace de hidrógeno con Tyr en la posición 160 en FcYRIIb en el residuo de cadena principal.

La Fig. 33 muestra en la estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb, la estructura de los residuos de aminoácidos alrededor de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en el dominio A CH2 de la porción de Fe, que forma un enlace de hidrógeno con Tyr en la posición 160 en FcYRIIb en el residuo de cadena principal.

Fig. 34 muestra la comparación alrededor del bucle en las posiciones 266 a 271 (numeración de UE) después de sobreponer las estructuras cristalinas de rayos X del complejo de región extracelular de Fc(P238D)/FcYRIIb mostrado en el Ejemplo 10 y el complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb con respecto al dominio B CH2 de la porción de Fe mediante el ajuste de los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca. Cuando se comparó a Fc(P238D), Fc(P208) tiene la alteración H268D en la posición 268 (numeración de UE) y la alteración P271G en la posición 271 (numeración de UE) en el bucle.

La Fig. 35 es un diagrama que muestra la estructura alrededor de Ser239 en el dominio B CH2 de la porción de Fe en la estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb, junto con la densidad de electrones determinada mediante el análisis de estructura cristalina de rayos X con el coeficiente 2Fo-Fc.

Fig. 36 muestra la comparación después de sobreponer las estructuras tridimensionales del complejo de región extracelular de FC(P208)/FCYRI laR y el complejo de región extracelular de FC(P208)/FCYRIID determinada mediante el análisis de estructura cristalina de rayos X mediante el ajuste de los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca.

La Fig. 37 muestra la comparación alrededor de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en el dominio A CH2 de la porción de Fe entre las estructuras cristalinas de rayos X del complejo de región extracelular de FC(P208)/FCYRI laR y el complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb, junto con la densidad de electrones determinada mediante el análisis de estructura cristalina de rayos X con el coeficiente 2Fo-Fc.

La Fig. 38 muestra la comparación alrededor de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en el dominio B CH2 de la porción de Fe entre las estructuras cristalinas de rayos X del complejo de región extracelular de FC(P208)/FCYRI laR y el complejo de región extracelular de Fc(P208)/FcYRIIb, junto con la densidad de electrones determinada mediante el análisis de estructura cristalina de rayos X con el coeficiente 2Fo-Fc.

La Fig. 39 muestra la comparación entre las secuencias de región constante de G1d y G4d. En el diagrama, los aminoácidos enmarcados con las posiciones indican el marco grueso con diferentes residuos de aminoácidos entre G1d y G4d.

La Fig. 40 muestra el cambio en la concentración de anticuerpo en plasma de GA2-lgG1 y de GA2-F1087 en ratones normales.

La Fig.41 muestra el cambio en la concentración de hlgA en plasma en ratones normales administrados con GA2-lgG1 y GA2-F1087.

La Fig. 42 muestra el cambio en la concentración de anticuerpo en plasma de 278-lgG1 y de 278-F1087 en ratones normales.

La Fig.43 muestra el cambio en la concentración de hlgE en plasma (Asp6) en ratones C57BL/6J administrados con 278-lgG1 y 278-F1087.

La Fig. 44 muestra un transcurso de tiempo de la concentración del anticuerpo de ratón anti-receptor IL-6 humano en el plasma de ratones normales administrados con Fv4-mlgG1 y Fv4-mlgG1 -MB367 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcYRIIb de ratón de mejorada.

La Fig. 45 muestra un transcurso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano soluble en el plasma de los ratones normales administrados con Fv4-mlgG1 y Fv4-mlgG1-MB367 que es una variante Fv4-mlgG1 con unión a FcyRIIb de ratón mejorada.

[Modo Para Realizar la Invención] Las definiciones y la descripción detallada a continuación se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención ilustrada en la presente.

Aminoácidos En la presente, aminoácidos se describen en uno o tres códigos de letras o ambos, por ejemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, I le/1 , o Val/V.

Alteración de Aminoácidos Para las alteraciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácido de una molécula de unión al antígeno, los métodos conocidos como métodos de mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y la PCR de extensión traslapante puede emplearse apropiadamente. Las adiciones, las supresiones, y/o las sustituciones de un aminoácido se agregan apropiadamente mediante estos métodos conocidos. La sustitución de los residuos de aminoácidos se entiende sustituir un residuo de aminoácido con otro residuo de aminoácido con el fin de alterar los aspectos como los siguientes (a) a (c): (a) estructura principal de un polipéptido en una región de estructura helicoidal o una región de estructura de hoja; (b) carga o hidrofobicidad en un sitio objetivo; o (c) longitud de una cadena lateral.

Los residuos de aminoácidos se clasifican en los siguientes grupos basados en las propiedades de las cadenas laterales incluidas en sus estructuras: (1) hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, e Me; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, y Gln: (3) ácido: Asp y Glu; (4) básico: His, Lys, y Arg; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: Gly y Pro; y (6) aromático: Trp, Tyr, y Phe.

La sustitución entre los residuos de aminoácidos dentro de cada uno de estos grupos se refiere como sustitución conservadora. Por una parte, la sustitución entre los residuos de aminoácidos de diferentes grupos de aminoácidos se refiere como sustitución no conservadora. Las sustituciones en la presente invención pueden ser sustituciones conservadoras o sustituciones no conservadoras, o una combinación de sustituciones conservadoras y no conservadoras. Además, una pluralidad de métodos conocidos puede emplearse como métodos de alteración de aminoácido para la sustitución a aminoácidos no nativos (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; y Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por ejemplo, un sistema de traducción libre de células (Clover Direct (Protein Express)) que contiene un ARNt que tiene el aminoácido no nativo unido a un ARNt supresor ámbar complementario del codón de UAG (codón ámbar), que es uno de los codones de detención, se usa adecuadamente.

Además, una expresión que usa los códigos de aminoácidos de una letra del aminoácido antes de la alteración y el aminoácido después de la alteración antes y después de un número que indica una posición específica, respectivamente, puede usarse apropiadamente como una expresión para una alteración de aminoácido. Por ejemplo, la alteración P238D, que se usa sustituyendo un aminoácido de la región Fe incluida en una región constante de anticuerpo, expresa la sustitución de Pro en la posición 238 (de acuerdo con la numeración de UE) con Asp. Es decir, el número muestra la posición del aminoácido de acuerdo con la numeración de UE, el código de aminoácido de una letra escrito antes de que el número muestre el aminoácido antes de la sustitución, y el código de aminoácido de una letra escrito después del número muestra el aminoácido después de la sustitución.

Y/o Como se usa en la presente, el término "y/o" se entiende una combinación de los términos antes y después de la frase indicada "y/o", e incluye cada combinación donde "y" y "o" se combinan adecuadamente. Específicamente, por ejemplo, "los aminoácidos en las posiciones 326, 328, y/o 428 se sustituyen" incluyen una variación de alteraciones de los siguientes aminoácidos: aminoácidos en (a) la posición 326, (b) la posición 328, (c) la posición 428, (d) las posiciones 326 y 328, (e) las posiciones 326 y 428, (f) las posiciones 328 y 428, y (g) las posiciones 326, 328, y 428.

Antíqenos En la presente, "antígenos" no se limitan particularmente a su estructura, siempre que comprendan los epítopos a los cuales se unen los dominios de unión al antígeno. En otras palabras, los antígenos pueden ser sustancias inorgánicas u orgánicas. Los antígenos incluyen, por ejemplo, las moléculas a continuación: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1 a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM 12, ADAM 5, ADAM 7/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adresina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1 -antitripsina, antagonista alfa-v/beta-1 , ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-ld, ASPÁRTICO, péptido natriurético auricular, integrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, factor estimulante de linfocitos B (BlyS, por sus siglas en inglés), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, Osteogenina BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, factor neurotrófico derivado del hueso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, factor de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembriónico (CEA, por sus siglas en inglés), antígeno asociados a cáncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1 , CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, C V UL, CNTF, CNTN-1, $COX, C-Enrían, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1 , CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR 1 , CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno asociado a tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, factor regulador de complemento (factor acelerador de degradación), des (1-3)-IGF-l (cerebro IGF-1), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, E MPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinasa, eNOS, EOT, eotaxina 1, EpCAM , efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, selectina E, ET-1, factor lia, factor VII, factor VI 11 c, factor IX, proteína activadora del fibroblasto (FAP, por sus siglas en inglés), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrin, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormona estimuladora de folículo, fractalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1 , GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagón, Glut4, glicoproteína llb/llla (GPIIb/llla), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormona liberadora de la hormona de crecimiento, hapteno (cápsula de NP o cápsula de NIP), HB-EGF, HCC, glicoproteína envolvente de HCMV gB, glicoproteína envolvente de HCMV gH, HCMV UL, factor de crecimiento hematopoyético (HGF, por sus siglas en inglés), Hep B gp120, heparanasa, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), glicoproteína gD de HSV, HGFA, antígeno asociado a melanoma de alto peso de molecular (HMW-MAA), VIH gp120, bucle HIV IIIB gp 120 V3, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardiaca humana, citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), hormona de crecimiento humano, HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor IgA, proteína de unión a IgE, IGF, IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferón (INF)-alfa, INF-beta, INF-gamma, inhibina, ¡NOS, cadena de insulina A, cadena de insulina B, factor 1 de crecimiento similar a insulina, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfa V), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina betal, integrina beta2, interferón gamma, IP-10, l-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, kc, KDR, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, ETB, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Y de Lewis, antígeno Y de Lewis asociado, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superficie pulmonar, hormona luteinizante, receptor linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASAS, receptor de GDF, MG T, MHC (HLA-DR), FIM, MIG, MIPS, ???-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP- 4, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, po, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, sustancia inhibidora ulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, adherina N-C, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4, o -6, neurturina, factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormona paratiroides, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-cadherina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, alcalina fosfatasa placentaria (PLAP, por sus siglas en inglés), PIGF, PLP, PP14, proinsulina, prorelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno prostático específico de membrana (PLAP, por sus siglas en inglés), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadena A de relaxina, cadena B de relaxina, renina, virus respiratorio sincitial (RSV, por sus siglas en inglés) F, RSV Fgp, Ret, Factor reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albúmina de suero, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína asociada a tumor-72), TARC, TCA-3, receptor de célula T (por ejemplo, receptor de célula T alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TE 8, TERT, fosfatasa alcalina similar a PLAP testicular, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico, TGF-betaRI (ALK-5) , TGF-betaRII, TGF-betaRllb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, timo Ck-1, hormona estimuladora de la tiroides, Tie, TIMP, TIQ, factor de tejido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, ASESINO, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF1 OD (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11 A (RANGO ODF R, TRANCE R), TNFRSF11 B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (PELLIZCO R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGERO R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1 A (TNF Rl CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF Rll CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3) , TNFRSF3 (LTbR TNF RUI, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, I LA) , TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligando TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligando TRANCE/RANK ODF, ligando OPG), TNFSF12 (ligando TWEAK Apo-3, ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligando LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligando GITR ligando AITR, TL6), TNFSF1A (Conectina TNF-a, DI F, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligando gp34 de OX40, TXGP1), TNFSF5 (ligando CD154 de CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligando Apo-1 del ligando de Fas, ligando APT1), TNFSF7 (ligando CD70 de CD27), TNFSF8 (ligando CD30 de CD153), TNFSF9 (ligando CD137 del 4-1BB ligando), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antfgeno CA125 asociado a tumor, carbohidratos asociados a Lewis-Y que expresan antígeno asociado a tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinasa, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherina, VE-cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno viral, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrina, factor de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR 1 , XEDAR, XIAP, XPD, H GB1, IgA, ?ß, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, I L- 17/I L- 17R , I L-20/I L-20R, LDL oxidada, PCSK9, precalicreína, RON, T EM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, quininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdina, esclerostina, fibrinógeno, fibrina, protrombina, trombina, factor de tejido, factor V, factor Va, factor VII, factor Vlla, factor VIII, factor Villa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor Xla, factor XII, factor Xlla, factor XIII, factor XI I la , TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminógeno, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecano-1, Slndecano-2, Sindecano-3, Sindecano-4, LPA, y S1P; y receptores para hormona y factores de crecimiento.

Aunque los receptores se citan como ejemplos de los antígenos mencionados antes, cuando estos receptores existen en formas solubles en fluidos biológicos como plasma, pueden formar complejos con las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Por lo tanto, siempre que los receptores mencionados antes existan en sus formas solubles en fluidos biológicos como plasma, pueden usarse como antígenos que puedan formar complejos de la presente invención uniendo a una molécula de unión al antígeno de la presente invención. Un ejemplo de una modalidad no limitante de tal receptor soluble es IL-6R soluble, que es una proteína que consiste de los aminoácidos en las posiciones 1 a 357 en la secuencia del polipéptido de IL-6R de la SEC ID NO: 1 como se describe en Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968).

Los antígenos solubles se citan como ejemplos de los antígenos mencionados antes, y las soluciones en las cuales los antígenos existen no están limitadas. Los antígenos solubles pueden existir en fluidos biológicos, o más específicamente en todos los fluidos que llenan el espacio entre los tejidos y las células o los vasos en organismos. En una modalidad no limitante, los antígenos a la cual las moléculas de unión al antígeno de la presente invención se unen pueden estar presentes en fluidos extracelulares. En vertebrados, el fluido extracelular es un término general para el plasma, fluido intersticial, linfa, tejido conectivo compacto, fluido cerebroespinal, fluido espinal, fluido de perforación, fluido sinovial, o tales componentes en el hueso y el cartílago, fluido alveolar (fluido de lavado broncoalveolar), fluido peritoneal, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido de quiste, humor acuoso (hidatoide), o tales fluidos transcelulares (varios fluidos en las cavidades glandulares y fluidos en la cavidad del tracto digestivo y otros fluidos de la cavidad corporal producidos como resultado del transporte activo/actividades secretoras de las células).

Epítopo El "epítopo" se entiende un determinante antigénico en un antígeno, y se refiere a un sitio del antígeno al cual el dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno descrita en la presente se une. Así, por ejemplo, el epítopo puede definirse de acuerdo con su estructura. Alternativamente, el epítopo puede definirse de acuerdo con la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno que reconoce el epítopo. Cuando el antígeno es un péptido o un polipéptido, el epítopo puede especificarse por los residuos de aminoácidos que forman el epítopo. Alternativamente, cuando el epítopo es una cadena de azúcar, el epítopo puede especificarse por su estructura de cadena de azúcar específica.

Un epítopo lineal es un epítopo que contiene un epítopo cuya secuencia de aminoácido primaria se reconoce. Tal epítopo lineal contiene comúnmente por lo menos tres y más comúnmente por lo menos cinco, por ejemplo, aproximadamente 8 a 10 o 6 a 20 aminoácidos en su secuencia específica.

En contraste con el epítopo lineal, el "epítopo conformacional" es un epítopo en el cual la secuencia de aminoácido primaria que contiene el epítopo no es el único determinante del epítopo reconocido (por ejemplo, la secuencia de aminoácido primaria de un epítopo conformacional no es reconocida necesariamente por un anticuerpo de definición de epítopo). Los epítopos conformacionales pueden contener un mayor número de aminoácidos comparados a los epítopos lineales. Un anticuerpo que reconoce el epítopo conformacional reconoce la estructura tridimensional de un péptido o de una proteína. Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega y forma una estructura tridimensional, los aminoácidos y/o las cadenas principales de polipéptido que forman un epítopo conformacional se alinean, y se hace el epítopo reconocible por el anticuerpo. Los métodos para determinar las conformaciones de epítopo incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional, etiquetado de giro específico al sitio, y resonancia paramagnética de electrón, pero no se limitan a los mismos. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).

Actividad de Unión Los ejemplos de un método para evaluar la unión al epítopo por una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 se describen a continuación. De acuerdo con los ejemplos a continuación, los métodos para evaluar la unión al epítopo por una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno para un antígeno con excepción de IL-6, pueden también conducirse apropiadamente.

Por ejemplo, si una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 reconoce un epítopo lineal en la molécula IL-6 puede confirmarse por ejemplo como se menciona a continuación. Un péptido lineal que comprende una secuencia de aminoácido que forma el dominio extracelular de IL-6 se sintetiza para el propósito anterior. El péptido puede sintetizarse químicamente, u obtenerse por técnicas de ingeniería genética al usar una región que codifica la secuencia de aminoácido que corresponde al dominio extracelular en un ADNc de IL-6 representado por la SECID NO: 2. Entonces, una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 se evalúa para su actividad de unión hacia un péptido lineal que comprende la secuencia de aminoácido que forma el dominio extracelular. Por ejemplo, un péptido lineal inmovilizado puede usarse como un antígeno mediante ELISA para evaluar la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno hacia el péptido. Alternativamente, la actividad de unión hacia un péptido lineal puede evaluarse basada en el nivel que el péptido lineal inhibe la unión de la molécula de unión al antígeno a las células que expresan IL-6. Estas pruebas pueden demostrar la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno hacia el péptido lineal.

Si una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 reconoce un epítopo conformacional puede evaluarse como sigue. Las células que expresan IL-6 se preparan para el propósito anterior. Una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 puede determinarse para reconocer un epítopo conformacional cuando une potentemente a las células que expresan IL-6 sobre contacto, pero no une sustancialmente a un péptido lineal inmovilizado que comprende una secuencia de aminoácido que forma el dominio extracelular de IL-6. En la presente, "no se une sustancialmente" se entiende que la actividad de unión es del 80% o menor, generalmente del 50% o menor, preferiblemente del 30% o menor, y particularmente de manera preferible del 15% o menor comparada a la actividad de unión hacia las células que expresan IL-6 humana.

Los métodos para ensayar la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 hacia las células que expresan IL-6 Incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en Anticuerpos: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Específicamente, la valoración puede realizarse basada en el principio de ELISA o la separación de célula activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) al usar células que expresan IL-6 como antígeno.

En el formato de ELISA, la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 hacia las células que expresan IL-6 puede evaluarse cuantitativamente comparando los niveles de señal generados por la reacción enzimática. Específicamente, se agrega un complejo de polipéptido de prueba a una placa de ELISA sobre la cual se inmovilizan las células que expresan IL-6. Entonces, la molécula de unión al antígeno de prueba unida a las células se detecta ai usar un anticuerpo etiquetado con enzima que reconoce la molécula de unión al antígeno de prueba. Alternativamente, cuando se usa FACS, se prepara una serie de diluciones de una molécula de unión al antígeno de prueba, y el título de unión al anticuerpo para las células que expresan IL-6 puede determinarse para comparar la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno de prueba hacia las células que expresan IL-6.

La unión de una molécula de unión al antígeno de prueba hacia un antígeno expresado en la superficie de las células suspendidas en amortiguador o similares puede detectarse al usar un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo conocidos incluyen, por ejemplo, los siguientes dispositivos: FACSCanto™ II FACSAria™ FACSArray™ FACSVantage™ SE FACSCalibur™ (todos son nombres comerciales de BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos son nombres comerciales de Beckman Coulter).

Los métodos preferibles para ensayar la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 hacia un antígeno incluyen, por ejemplo, el siguiente método. Primero, las células que expresan IL-6 se hacen reaccionan con una molécula de unión al antígeno de prueba, y después estas se tiñen con un anticuerpo secundario etiquetado con FITC que reconocen la molécula de unión al antígeno. La molécula de unión al antígeno de prueba se diluye apropiadamente con un amortiguador adecuado para preparar la molécula a una concentración deseada. Por ejemplo, la molécula puede usarse a una concentración dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. Entonces, la intensidad de fluorescencia y el conteo celular son determinados al usar FACSCalibur (BD). La intensidad de fluorescencia obtenida mediante análisis al usar el Software CELL QUEST (BD), Es decir, el Valor de la Media Geométrica, refleja la cantidad del anticuerpo unido a las células. Es decir, la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba, que es representada por la cantidad de la unión de la molécula de unión al antígeno de prueba, puede determinarse midiendo el valor de la Media Geométrica.

Si una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 comparte un epítopo común con otra molécula de unión al antígeno puede evaluarse basada en la competición entre las dos molécula para el mismo epítopo. La competición entre las moléculas de unión al antígeno puede detectarse mediante análisis de bloqueo cruzado o similares. Por ejemplo, el ensayo de ELISA competitivo es un ensayo de bloqueo cruzado preferido.

Específicamente, en el ensayo de bloqueo cruzado, la proteína IL-6 inmovilizada a los pozos de una placa de microtítuio se preincuba en presencia o ausencia de una molécula de unión al antígeno competidor candidato, y entonces se agrega una molécula de unión al antígeno de prueba a la misma. La cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida a la proteína IL-6 en los pozos se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión de una molécula de unión al antígeno competidor candidato que compite para la unión al mismo epítopo. Es decir, cuanto mayor es la afinidad de la molécula de unión al antigeno competidor para el mismo epítopo, la inferior es la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno de prueba hacia los pozos cubiertos con proteína IL-6.

La cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida a los pozos a través de la proteína IL-6 puede determinarse fácilmente etiquetando la molécula de unión al antígeno por adelantado. Por ejemplo, se midió una molécula de unión al antígeno etiquetada con biotina al usar un conjugado de avidina/peroxidasa y el sustrato apropiado. En particular, el ensayo de bloqueo cruzado que usa las etiquetas de enzima como peroxidasa se llama ensayo de ELISA competitivo. La molécula de unión al antígeno puede también etiquetarse con otras sustancias de etiquetado que permitan la detección o la medición. Específicamente, se conocen radioetiquetas, etiquetas fluorescentes, y similares.

Cuando la molécula de unión al antígeno competidor candidato puede bloquear la unión por una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno del receptor IL-6 por lo menos del 20%, preferiblemente por lo menos del 20 al 50%, y más preferiblemente por lo menos del 50% comparado con la actividad de unión en un experimento de control conducido en ausencia de la molécula de unión al antígeno competidor, la molécula de unión al antígeno de prueba se determina para unir sustancialmente al mismo epítopo unido por la molécula de unión al antígeno competidor, o competir para la unión al mismo epítopo.

Cuando la estructura de un epítopo unido por una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6 ya se ha identificado, si las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control comparten un epítopo común pueden evaluarse comparando las actividades de unión de las dos moléculas de unión al antígeno hacia un péptido preparado introduciendo las mutaciones del aminoácido en el péptido que forma el epítopo.

Para medir las actividades de unión anteriores, por ejemplo, las actividades de unión de prueba y las moléculas de unión al antígeno de control hacia un péptido lineal en el cual se introduce una mutación se comparan en el formato de ELISA anterior. Además de los métodos de ELISA, la actividad de unión hacia el péptido del mutante unido a una columna puede determinarse mediante la prueba de flujo y las moléculas de unión al antígeno de control en la columna, y después cuantificado la molécula de unión al antígeno eluida en la solución de elución. Los métodos para adsorber un péptido mutante a una columna, por ejemplo, en la forma de un péptido de fusión de GST, se conocen.

Alternativamente, cuando el epítopo identificado es un epítopo conformacional, si las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control comparten un epítopo común pueden evaluarse por el siguiente método. Primero, se preparan las células que expresan IL-6 y las células que expresan IL-6 con una mutación introducida en el epítopo. Las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control se agregan a una suspensión celular preparada suspendiendo estas células en un amortiguador apropiado como PBS. Entonces, las suspensiones celulares se lavan apropiadamente con un amortiguador, y un anticuerpo etiquetado con FITC que reconoce las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control se agrega a las mismas. La intensidad de fluorescencia y el número de células teñidas con el anticuerpo etiquetado son determinados al usar FACSCalibur (BD). Las moléculas de unión al antigeno de prueba y de control se diluyen apropiadamente al usar un amortiguador adecuado, y se usan a concentraciones deseadas. Por ejemplo, pueden usarse a una concentración dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. La intensidad de fluorescencia determinada por el análisis al usar el Software CELL QUEST (BD), Es decir, el valor de Media Geométrica, refleja la cantidad de anticuerpo etiquetado unido a las células. Es decir, las actividades de unión de las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control, que son representadas por la cantidad de anticuerpo etiquetado unido, pueden determinarse midiendo el valor de Media Geométrica.

En el método anterior, si una molécula de unión al antígeno está "no unida sustancialmente a las células que expresan IL-6 mutante" puede evaluarse, por ejemplo, mediante el siguiente método. Primero, las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control unidas a las células que expresan IL-6 mutante se tiñen con un anticuerpo etiquetado. Entonces, se determina la intensidad de fluorescencia de las células. Cuando se usa FACSCalibur para la detección de fluorescencia mediante citometría de flujo, la intensidad de fluorescencia determinada puede analizarse al usar el Software CELL QUEST. A partir de los valores de la Media Geométrica en presencia y ausencia del complejo de polipéptido, el valor de comparación (AGeo-Mean) puede calcularse de acuerdo con la siguiente fórmula para determinar la relación de aumento en intensidad de fluorescencia como un resultado de la unión por la molécula de unión al antigeno.

AGeo-Mean = Media Geométrica (en presencia del complejo de polipéptido)/Media Geométrica (en ausencia del complejo de polipéptido) El valor de comparación de la Media Geométrica (valor de AGeo-Mean para la molécula IL-6 mutante) determinado por el análisis anterior, que refleja la cantidad de una molécula de unión al antígeno de prueba unida a las células que expresan la IL-6 mutante, se compara al valor de la comparación de AGeo-Mean que refleja la cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida a las células que expresan IL-6. En este caso, las concentraciones de la molécula de unión al antígeno de prueba usada para determinar los valores de comparación de AGeo-Mean para las células que expresan IL-6 y las células que expresan IL-6 mutante son ajustadas particularmente de manera preferible que son iguales o sustancialmente iguales. Una molécula de unión al antígeno que se ha confirmado para reconocer un epítopo en IL-6 se usa como una molécula de unión al antígeno de control.

Si el valor de comparación de AGeo-Mean de una molécula de unión al antígeno de prueba para las células que expresan IL-6 mutante es más pequeño que el valor de comparación de AGeo-Mean de la molécula de unión al antígeno de prueba para las células que expresan el receptor IL-6 por lo menos el 80%, preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 30%, y particularmente de manera preferible el 15%, entonces la molécula de unión al antígeno de prueba "no se une sustancialmente a las células que expresan IL-6 mutante". La fórmula para determinar el valor de Geo-Mean (Media Geométrica) se describe en la Guía de Usuario del software CELL QUEST (BD biosciences). Cuando la comparación muestra que los valores de comparación son sustancialmente equivalentes, el epítopo para las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control puede determinarse que es igual.

Dominio de unión al antígeno Un "dominio de unión al antígeno" puede ser de cualquier estructura, siempre y cuando se una a un antígeno de interés. Tales dominios incluyen preferiblemente, por ejemplo: regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo; un módulo de aproximadamente 35 aminoácidos llamado dominio A que se contiene en la proteína de membrana celular in vivo Avimer (WO 2004/044011, WO 2005/040229); Adnectina que contiene el dominio 10Fn3 que se une a la fracción de la proteina de fibronectina, una glicoproteína expresada en la membrana celular (WO 2002/032925); Afficuerpo que se compone de una estructura de tres hélices de 58 aminoácidos basada en el andamio del dominio de unión a IgG de la proteína A (WO 1995/001937); Las Proteínas de Repetición de Anquirina Diseñadas (DARPins, por sus siglas en inglés) que son una región expuesta en la superficie molecular de las repeticiones de anquirina (AR, por sus siglas en inglés) que tienen una estructura en la cual una subunidad que consiste de una vuelta que comprende 33 residuos de aminoácidos, dos hélices antiparalelas, y un bucle se apilan repetidamente (WO 2002/020565); Las anticalinas y similares, que son dominios que consisten en cuatro bucles que soportan un lado de una estructura de barril integrada por ocho hebras antiparalelas colocadas circularmente que se conserven altamente entre las moléculas de lipocalina como lipocalina asociada a gelatinasa neutrófila (NGAL, por sus siglas en inglés) (WO 2003/029462); y la región cóncava formada por la estructura de hoja paralela dentro de la estructura en forma de herradura constituida por repeticiones apiladas del módulo de repetición rico en leucina (LRR, por sus siglas en inglés) del receptor de linfocito variable (VLR, por sus siglas en inglés) el cual no tiene la estructura de inmunoglobulina y se usa en el sistema de inmunidad adquirida en vertebrado sin mandíbulas como lamprea y mixinos (WO 2008/016854). Los dominios de unión al antfgeno preferidos de la presente invención incluyen, por ejemplo, éstos que tienen regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpo. Los ejemplos preferidos de dominios de unión al antígeno incluyen "simple cadena Fv (scFv, por sus siglas en inglés)", "simple anticuerpo de cadena", "Fv", "simple cadena Fv2 (scFv2, por sus siglas en inglés)", "Fab", y "F(ab')2".

Los dominios de unión ai antígeno de moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden unirse a un epítopo idéntico. Tal epítopo puede estar presente, por ejemplo, en una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1. Alternativamente, cada uno de los dominios de unión al antígeno de moléculas de unión al antígeno de la presente invención puede unirse a un diferente epítopo. En la presente, el diferente epítopo puede estar presente en, por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1.

Específico Con respecto a la unión de las moléculas de unión al antígeno proporcionadas por la presente invención para un antígeno, el término "específico" significa que una de las moléculas que se une específicamente no une sustancialmente a las moléculas con excepción de su simple o pluralidad de moléculas asociadas de unión. En la presente, "no se une sustancialmente" se refiere a mostrar el 80% o menos, generalmente el 50% o menos, preferiblemente el 30% o menos y particularmente de manera preferible el 15% o menos de actividad de unión a las moléculas con excepción de las moléculas asociadas de unión comparadas con la actividad de unión hacia las moléculas asociadas, como se describe en la sección anteriormente mencionada en actividad de unión. Además, "específico" también se usa cuando un dominio de unión al antígeno es específico a un epítopo particular entre múltiples epítopos en un antígeno. Cuando un epítopo unido por un dominio de unión al antígeno se contiene en múltiples diferentes antígenos, las moléculas de unión al antígeno que contienen el dominio de unión al antígeno pueden unirse a varios antígenos que tienen el epítopo.

Actividad de neutralizante En una modalidad no limitante de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo una molécula de unión al antígeno que tiene actividad de neutralizante de antígeno, donde la molécula de unión al antígeno que comprende (i) un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, (ii) un dominio de unión a Fcy que tiene actividad de unión selectiva a FcyRIIb, y (iii) un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Generalmente, la actividad neutralizante se refiere a la actividad de inhibir la actividad biológica de un ligando, como virus y toxinas, que tiene actividad biológica en las células. Así, las sustancias que tienen actividad neutralizante se refieren a las sustancias que unen al ligando o al receptor a los cuales se une el ligando, e inhiben la unión entre el ligando y el receptor. Los receptores bloqueados de la unión con el ligando por la actividad neutralizante no podrán exhibir actividad biológica a través de este receptor. Cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, tal anticuerpo que tiene actividad neutralizante generalmente se llama un anticuerpo neutralizante. La actividad neutralizante de una sustancia de prueba puede medirse comparando la actividad biológica en presencia de un ligando entre cuando la sustancia de prueba está presente y ausente.

Por ejemplo, los principales ligandos posibles para el receptor IL-6 incluyen preferiblemente IL-6 como se muestra en la SEC ID NO: 3. El receptor IL-6, que es una proteína de membrana tipo I con su extremo amino que forma el dominio extracelular, forma un hetero-tetrámero con un receptor gp130 el cual se ha inducido a dimerizar por la IL-6 (Heinrich et al.

(Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). La formación del heterotetrámero activa Jak que se asocia con el receptor gp130. Jak experimenta la autofosforilación y fosforila el receptor. El sitio de fosforilación del receptor y del Jak sirve como un sitio de enlace para las moléculas que llevan SH2 que pertenecen a la familia Stat como Stat3; MAP Cinasa; PI3/Akt; y otras proteínas que llevan SH2 y adaptadores. Después, Stat unido al receptor gp130 es fosforilado por Jak. El Stat fosforilado se dimeriza y se mueven en el núcleo, y regula la transcripción de los genes objetivo. El Jak o el Stat puede también implicarse en las cascadas de señal a través de los receptores de otras clases. Las cascadas de señal de la IL-6 desregularizada se observan en la inflamación y las condiciones patológicas de enfermedades autoinmunes, y cánceres como cáncer de próstata y mieloma múltiple. El Stat3 que puede actuar como un oncogén es activado constitutivamente en muchos cánceres. En cáncer de próstata y mieloma múltiple, existe una interferencia entre la cascada de señalización a través del receptor IL-6 y la cascada de señalización a través de los miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento epiteliales (EGFR, por sus siglas en inglés) (Ishikawa et al. (J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2), 55-66)).

Tales cascadas de señalización intracelular son diferentes para cada tipo de célula; por lo tanto, las moléculas objetivo apropiadas pueden determinarse para cada célula objetivo de interés, y no se limitan a los factores anteriormente mencionados. La actividad neutralizante puede evaluarse midiendo la activación de la señalización in vivo. Además, la activación de la señalización in vivo puede detectarse usando como un índice la acción de inducir la transcripción de un gen objetivo que existe corriente adelante de la cascada de señalización in vivo. El cambio en la actividad de transcripción del gen objetivo puede detectarse por el principio de ensayo reportero. Específicamente, un gen reportero como la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) o la luciferasa se coloca corriente adelante de una región promotora o un factor de transcripción del gen objetivo, se mide su actividad reportera, y de tal modo el cambio en la actividad de transcripción puede medirse como la actividad reportera. Los kits comercialmente disponibles para medir la activación de la señalización in vivo pueden usarse apropiadamente (por ejemplo, Mercury Pathway Profiling Luciferase System (Clontech)).

Además, para los métodos para medir la actividad de neutralizar receptores/ligandos de la familia del receptor EGF y similares, que actúan normalmente en las cascadas de señalización que trabajan hacia promover la proliferación celular, la actividad neutralizante de moléculas de unión al antígeno puede evaluarse midiendo la actividad de proliferación de las células objetivo. Por ejemplo, cuando las células son promovidas para proliferar mediante los factores de crecimiento de la familia EGF como HB-EGF, el efecto inhibidor sobre la proliferación de tales células basadas en la actividad neutralizante de un anticuerpo anti-HB-EGF puede evaluarse o medirse adecuadamente por los siguientes métodos: Para evaluar o medir la actividad inhibidora de la proliferación celular in vitro, se usa un método para medir la incorporación de timidina etiquetada con [3H] agregada al medio por células viables como un índice de la capacidad de replicación del ADN. Como métodos más convenientes, se usan un método de exclusión de tinte, en el cual se mide la capacidad de una célula de excluir un tinte como azul tripán de la célula bajo el microscopio, y método de MTT. El último método hace uso de la capacidad de células viables de convertir MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), que es una sal de tetrazolio, a un producto de azul formazán. Más específicamente, se agrega un anticuerpo de prueba así como un ligando a la solución de cultivo de una célula de prueba, y después de cierto periodo de tiempo, se agrega la solución de MTT a la solución de cultivo, y ésta se deja reposar durante algún tiempo para la incorporación de MTT en la célula. Como resultado, el MTT, que es un compuesto de color amarillo, se convierte a un compuesto de color azul mediante la acción de la succinato deshidrogenasa en las mitocondrias de la célula. Después de disolver este producto de color azul para la coloración, se mide su absorbencia y se usa como un índice para el número de células viables. Además de MTT, los reactivos como MTS, XTT, WST-1, y WST-8 también están comercialmente disponibles (Nacalai Tesque, y similares) y pueden usarse adecuadamente. Para medir la actividad, un anticuerpo de unión que es del mismo isotipo como el anticuerpo anti-HB-EGF pero no tiene la actividad inhibidora de proliferación celular puede usarse como un anticuerpo de control de la misma manera como el anticuerpo anti-HB-EGF, y la actividad puede determinarse cuando el anticuerpo anti-HB-EGF muestra actividad inhibidora de proliferación celular más fuerte que el anticuerpo de control.

Las células que pueden usarse preferiblemente para evaluar la actividad incluyen, por ejemplo, células promovidas para proliferar mediante HB-EGF como la línea celular de cáncer ovárico RMG-1, y células Ba/F3 de ratón que han sido transformadas por un vector para expresar un gen que codifica hEGFR/mG-CSFR, que es una proteína de fusión en la cual el dominio extracelular de EGFR humano se fusiona en el marco con el dominio intracelular del receptor GCSF de ratón. De esta manera, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente las células para ser usadas para evaluar la actividad y usarlas para medir la actividad de proliferación celular como se menciona antes.

Anticuerpo En la presente, "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina natural o una i nmunoglobulina producida mediante síntesis parcial o completa. Los anticuerpos pueden aislarse a partir de fuentes naturales como plasma y suero que ocurren artificialmente, o sobrenadantes de cultivo de hibridomas productores de anticuerpo. Alternativamente, los anticuerpos pueden sintetizarse parcialmente o totalmente al usar técnicas como recombinación genética. Los anticuerpos preferidos incluyen, por ejemplo, anticuerpos de un isotipo de inmunoglobulina o una subclase que pertenece a los mismos. Las inmunoglobulinas humanas conocidas incluyen anticuerpos de las siguientes nueve clases (isotipos): lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, I g A 1 , lgA2, IgD, IgE, e IgM. De estos isotipos, los anticuerpos de la presente invención incluyen lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4. Un número de secuencias de alotipo de las regiones constantes de lgG1 humana, lgG2 humana, lgG3 humana, e lgG4 humana debido a los polimorfismos de gen se describen en "Sequences of proteins of immunological interest", Número de Publicación de NIH 91-3242. Cualquiera de tales secuencias pueden usarse en la presente invención. En particular, para la secuencia lgG1 humana, la secuencia de aminoácido de las posiciones 356 a 358 como se indica por la numeración de UE puede ser DEL o EEM. Varias secuencias de alotipo debido a polimorfismos genéticos se han descrito en "Sequences of proteins of immunological interest", Número de Publicación de NIH 91-3242 para la región constante Igjc humana (Kappa) y la región constante humana (Lambda), y cualquiera de las secuencias pueden usarse en la presente invención.

Los métodos para producir un anticuerpo con actividad de unión deseada se conocen a los expertos en la técnica. Más adelante está un ejemplo que describe un método para producir un anticuerpo que se une a IL-6R (anticuerpo anti-IL-6R). Los anticuerpos que se unen a un antígeno con excepción de IL-6 pueden también producirse de acuerdo con el ejemplo descrito a conti nuación .

Los anticuerpos anti-IL-6R pueden obtenerse como anticuerpos policlonales o monoclonales al usar métodos conocidos. Los anticuerpos anti-IL-6R producidos preferiblemente son anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos. Tales anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos incluyen anticuerpos producidos por los hibridomas o las células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que lleva un gen de anticuerpo mediante técnicas de ingeniería genética. Los "anticuerpos humanizados" o los "anticuerpos quiméricos" se incluyen en los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonales pueden producirse al usar técnicas conocidas, por ejemplo, como se describe a continuación. Específicamente, los mamíferos son inmunizados mediante métodos de inmunización convencional al usar una proteína IL-6R como un antígeno sensibilizante. Las células inmunes resultantes son fusionadas con las células parentales conocidas mediante métodos de fusión celular convencionales. Entonces, los hibridomas que producen un anticuerpo anti-IL-6R pueden seleccionarse mediante evaluación para células productoras de anticuerpo monoclonal al usar métodos de evaluación convencional.

Específicamente, los anticuerpos monoclonales se preparan como se menciona a continuación. Primero, el gen IL-6R cuya secuencia de nucleótido se describe en la SEC ID NO: 2 pueden expresarse para producir una proteína IL-6R mostrada en la SEC ID NO: 1, la cual será usada como un antígeno sensibilizante para la preparación del anticuerpo. Es decir, una secuencia de gen que codifica IL-6R se inserta en un vector de expresión conocido, y las células hospedadoras apropiadas se transforman con este vector. La proteína IL-6R humana deseada es purificada a partir de células hospedadoras o sus sobrenadantes de cultivo mediante métodos conocidos. Para obtener la IL-6R soluble a partir de los sobrenadantes de cultivo, por ejemplo, una proteína que consiste de los aminoácidos en las posiciones 1 a 357 en la secuencia de polipéptido IL-6R de la SEC ID NO: 1, como se describe en Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), se expresa como IL-6R soluble, en vez de la proteína IL-6R de la SEC ID NO: 1. La proteína IL-6R nativa purificada puede también usarse como un antígeno sensibilizante.

La proteína IL-6R purificada puede usarse como un antígeno sensibilizante para la inmunización de mamíferos. Un péptido IL-6 parcial puede también usarse como un antígeno sensibilizante.

En este caso, un péptido parcial puede prepararse mediante síntesis química basada en la secuencia de aminoácido de IL-6R humana, o insertando un gen IL-6R parcial en un vector de expresión para la expresión. Alternativamente, un péptido parcial puede producirse degradando una proteína IL-6R con una proteasa. La longitud y la región del péptido IL-6R parcial no se unen a las modalidades particulares. Una región preferida puede seleccionarse arbitrariamente de la secuencia de aminoácido en las posiciones de aminoácido 20 a 357 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1. El número de aminoácidos que forman un péptido que se usará como un antígeno sensibilizante es preferiblemente por lo menos cinco o más, seises o más, o siete o más. Más específicamente, un péptido de 8 a 50 residuos, más preferiblemente 10 a 30 residuos puede usarse como un antígeno sensibilizante.

Para el antígeno sensibilizante, es alternativamente posible usar una proteína de fusión preparada fusionando un polipéptido o un péptido parcial deseado de la proteína IL-6R con un diferente polipéptido. Por ejemplo, los fragmentos Fe de anticuerpo y las etiquetas de péptido se usan preferiblemente para producir proteínas de fusión que se usarán como antígenos sensibilizantes. Los vectores para la expresión de tales proteínas de fusión pueden construirse fusionándose en los genes de estructural que codifican dos o más fragmentos de polipéptido deseados e insertando el gen de fusión en un vector de expresión como se describe anteriormente. Los métodos para producir las proteínas de fusión se describen en Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Los métodos para preparar la IL-6R que es usados como un antígeno sensibilizante, y los métodos de inmunización que usan IL-6R se describen específicamente en los documentos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, y similares.

No hay limitación particular en los mamíferos que se inmunizarán con el antígeno sensibilizante. Sin embargo, es preferible seleccionar los mamíferos considerando su compatibilidad con las células originales que se usarán para la fusión celular. En general, los roedores como ratones, ratas, y hámsteres, conejos, y monos se usan preferiblemente.

Los animales anteriores son inmunizados con un antígeno sensibilizante mediante métodos conocidos. Los métodos de inmunización realizados generalmente incluyen, por ejemplo, inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante en mamíferos. Específicamente, un antígeno sensibilizante se diluye apropiadamente con PBS (Solución Salina Amortiguada con Fosfato), solución salina fisiológica, o similares. Si se desea, un adyuvante convencional como el adyuvante completo de Freund se mezcla con el antígeno, y se emulsiona la mezcla. Entonces, el antígeno sensibilizante se administra a un mamífero varias veces a intervalos de 4 a 21 días. Los portadores apropiados pueden usarse en la inmunización con el antígeno sensibilizante. En particular, cuando un péptido parcial de bajo peso molecular se usa como el antigeno sensibilizante, es a veces deseable combinar el péptido de del antígeno sensibilizante a una proteína de portador como albúmina o hemocianina de lapa ojo de cerradura para la inmunización.

Alternativamente, los hibridomas que producen un anticuerpo deseado pueden prepararse al usar la inmunización del ADN como se menciona a continuación. La inmunización del ADN es un método de inmunización que confiere inmunoestimulación expresando un antígeno sensibilizante en un animal inmunizado como un resultado de administrar un ADN de vector construido para permitir la expresión de un gen codificante de proteína del antígeno en el animal. Con respecto a los métodos de inmunización convencionales en los cuales un antígeno de proteína se administra a los animales que se inmunizarán, se espera que la inmunización con ADN que es superior en que: - la inmunoestimulación puede proporcionarse mientras que conserva la estructura de una proteína de membrana como el receptor IL-6R; y - no hay necesidad de purificar el antígeno para la inmunización.

Para preparar un anticuerpo monoclonal de la presente invención al usar la inmunización del ADN, primero, se administra un ADN que expresa una proteína IL-6R a un animal que se inmunizará. El ADN que codifica IL-6R puede sintetizarse mediante métodos conocidos como PCR. Se inserta el ADN obtenido en un vector de expresión apropiado, y después este se administra a un animal que se inmunizará. Los vectores de expresión preferiblemente usados incluyen, por ejemplo, vectores de expresión comercialmente disponibles como pcDNA3.1. Los vectores pueden administrarse a un organismo al usar métodos convencionales. Por ejemplo, la inmunización del ADN es realizada al usar una pistola de genes para introducir las partículas de oro recubiertas con vector de expresión en las células en el cuerpo de un animal que se inmunizará. Los anticuerpos que reconocieron la IL-6R pueden también producirse mediante los métodos descritos en el documento WO 2003/104453.

Después de inmunizar un mamífero como se describe antes, un aumento en el título de un anticuerpo de unión a IL-6R se confirmó en el suero. Entonces, las células inmunes se recolectaron del mamífero, y después se sometieron a fusión celular. En particular, los esplenocitos se usan preferiblemente como células inmunes.

Se usa una célula de mieloma mamífera como una célula que se fusionará con las células inmunes anteriormente mencionadas. Las células de mieloma comprenden preferiblemente un marcador de selección adecuado para evaluación. Un marcador de selección confiere las características a las células para su supervivencia (o muerte) bajo una condición de cultivo específica. La deficiencia de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (a continuación abreviada como deficiencia de HGPRT) y la deficiencia de la timidina cinasa (a continuación abreviada como deficiencia de TK) se conocen como marcadores de selección. Las células con deficiencia de HGPRT o de TK tienen sensibilidad de la hipoxantina-aminopterina-timidina (a continuación abreviada como sensibilidad de HAT). Las células sensibles a HAT no pueden sintetizar el ADN en un medio de selección de HAT, y se eliminan así. Sin embargo, cuando las células se fusionan con células normales, pueden continuar la síntesis del ADN al usar la trayectoria de recuperación de las células normales, y por lo tanto pueden crecer incluso en el medio de selección de HAT.

Pueden seleccionarse las células deficientes de HGPRT y deficientes de TK en un medio que contiene 6-tioguanina, 8-azaguanina (a continuación abreviado como 8AG), o 5'-bromodesoxiuridina, respectivamente. Se eliminan las células normales debido a que incorporan estos análogos de pirimidina en su ADN. Mientras tanto, las células que son deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de selección, puesto que no pueden incorporar estos análogos de pirimidina. Además, un marcador de selección designado como resistencia a G418 proporcionada por el gen resistente a neomicina confiere resistencia a antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Se conocen varios tipos de células de mieloma que son adecuados para la fusión celular.

Por ejemplo, las células de mieloma que incluye las siguientes células pueden usarse preferiblemente: P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

Las fusiones celulares entre los inmunocitos y las células de mieloma esencialmente se realizan al usar métodos conocidos, por ejemplo, un método por Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

Más específicamente, puede realizarse la fusión celular, por ejemplo, en un medio de cultivo convencional en presencia de un agente promotor de fusión celular. Los agentes promotores de fusión incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) y el virus de Sendai (HVJ, por sus siglas en inglés). Si se requiere, una sustancia auxiliar como sulfóxido de dimetilo también se agrega para mejorar la eficacia de la fusión.

La relación de células inmunes a células de mieloma puede determinarse a discreción, preferiblemente, por ejemplo, una célula de mieloma por cada uno a diez inmunocitos. Los medios de cultivo que se usarán para las fusiones celulares incluyen, por ejemplo, medios que son adecuados para el crecimiento de las líneas de células de mieloma, como medio de RPMI1640 y medio de MEM, y otro medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo celular. Además, los suplementos de suero como suero de becerro fetal (FCS, por sus siglas en inglés) pueden agregarse preferiblemente al medio de cultivo.

Para la fusión celular, las cantidades predeterminadas de las células inmunes anteriores y células de mieloma se mezclan bien en el medio de cultivo anterior. Entonces, una solución de PEG (por ejemplo, el peso molecular promedio es aproximadamente 1,000 a 6,000) previamente entibiada a 37°C se agrega a la misma a una concentración de generalmente 30% a 60% (p/v). Esta se mezcla suavemente para producir las células de fusión deseadas (hibridomas). Entonces, un medio de cultivo apropiado mencionado anteriormente se agrega gradualmente a las células, y éste se centrifuga repetidamente para eliminar el sobrenadante. Así, los agentes de fusión celular y similares que son desfavorables para el crecimiento de hibridoma pueden eliminarse.

Los hibridomas así obtenidos pueden seleccionarse mediante cultivo al usar un medio selectivo convencional, por ejemplo, medio de HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina). Las células con excepción de los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden ser eliminadas continuando el cultivo en el medio de HAT anterior por un suficiente periodo de tiempo (comúnmente, el período es varios días a varias semanas). Entonces, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son evaluados y clonados individualmente por métodos de dilución limitante convencionales.

Los hibridomas así obtenidos pueden seleccionarse al usar un medio de selección basado en el marcador de selección poseído por el mieloma usado para la fusión celular. Por ejemplo, células deficientes de HGPRT o de TK pueden seleccionarse por cultivo al usar el medio de HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina). Específicamente, cuando las células de mieloma sensibles a HAT se usan para la fusión celular, las células fusionadas exitosamente con células normales pueden proliferar selectivamente en el medio de HAT. Células con excepción de los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden eliminarse continuando el cultivo en el medio de HAT anterior por un suficiente periodo de tiempo. Específicamente, los hibridomas deseados pueden seleccionarse mediante el cultivo por generalmente varios días a varias semanas. Entonces, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son evaluados y clonados individualmente mediante métodos de dilución limitante convencionales.

Los anticuerpos deseados pueden seleccionarse preferiblemente y clonarse individualmente mediante métodos de evaluación basados en la reacción de antígeno/anticuerpo conocida. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de unión a IL-6R puede unirse a IL-6R expresado en la superficie celular. Tal anticuerpo monoclonal puede evaluarse mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). La FACS es un sistema que evalúa la unión de un anticuerpo a la superficie celular analizando las células puestas en contacto con un anticuerpo fluorescente al usar el rayo láser, y midiendo la fluorescencia emitida desde las células individuales.

Para la evaluación de hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante FACS, las células que expresan IL-6R primero se preparan. Las células usadas preferiblemente para evaluación son células mamíferas en las cuales IL-6R es expresada forzadamente. Como control, la actividad de un anticuerpo para unir a IL-6R de superficie celular puede detectarse selectivamente al usar células mamíferas no transformadas como células hospedadoras. Específicamente, los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-IL6R pueden aislarse seleccionando hibridomas que producen un anticuerpo que se une a las células forzadas para expresar IL-6R, pero no a las células hospedadoras.

Alternativamente, la actividad de un anticuerpo para unir las células que expresan IL-6R inmovilizado puede evaluarse basada en el principio de ELISA. Por ejemplo, las células que expresan IL-6R se inmovilizan a los pozos de una placa de ELISA. Los sobrenadantes de cultivo de hibridomas se ponen en contacto con las células inmovilizadas en los pozos, y se detectan los anticuerpos que se unen a las células inmovilizadas. Cuando los anticuerpos monoclonales se derivan de ratón, anticuerpos unidos a las células pueden detectarse al usar un anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón. Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado que tiene la capacidad de unión al antígeno son seleccionados por la evaluación anterior, y pueden clonarse mediante un método de dilución limitante o similares.

Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal así preparados pueden pasarse en un medio de cultivo convencional, y almacenarse en nitrógeno líquido durante un largo periodo.

Los hibridomas anteriores son cultivados mediante un método convencional, y los anticuerpos monoclonales deseados pueden prepararse a partir de sobrenadantes de cultivo. Alternativamente, los hibridomas se administran a y se hacen crecen en mamíferos compatibles, y los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de ascitis. El método anterior es adecuado para preparar anticuerpos con alta pureza.

Los anticuerpos codificados por los genes del anticuerpo que se clonan a partir de las células productoras de anticuerpo como los hibridomas anteriores pueden también usarse preferiblemente. Un gen de anticuerpo clonado se inserta en un vector apropiado, y éste se introduce en un huésped para expresar el anticuerpo codificado por el gen. Los métodos para aislar genes del anticuerpo, insertando los genes en los vectores, y transformando las células hospedadoras han sido ya establecidos, por ejemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Los métodos para producir los anticuerpos recombinantes también se conocen como describe a continuación.

Por ejemplo, un ADNc que codifica la región variable (región V) de un anticuerpo anti-IL-6R se prepara a partir de las células de hibridoma que expresan el anticuerpo anti-IL-6R. Con este fin, el ARN total primero se extrae de los hibridomas. Los métodos usados para extraer los ARNm de las células incluyen, por ejemplo: el método de ultracentrifugación de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), y - el método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156- 159).

Los ARNm extraídos pueden purificarse al usar el Kit de Purificación de ARNm (GE Healthcare Bioscience) o similares. Alternativamente, los kits para extraer el ARNm total directamente de las células, como el Kit de Purificación de ARNm QuickPrep (GE Healthcare Bioscience), están también comercialmente disponibles. Los ARNm pueden prepararse de los hibridomas al usar tales kits. Los ADNc que codifican la región V de anticuerpo pueden sintetizarse a partir de los ARNm preparados al usar una transcriptasa inversa. Los ADNc pueden sintetizarse al usar el Kit de Síntesis de ADNc de Primer Cadena de Transcriptasa o inversa de AMV (Seikagaku Co.) o similares. Además, el kit de amplificación del ADNc S ART RACE (Clontech) y el método 5'-RACE basado en PCR (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) pueden usarse apropiadamente para sintetizar y para amplificar los ADNc. En tal proceso de síntesis del ADNc, los sitios de enzima de restricción apropiados descritos a continuación pueden introducirse en ambos extremos de un ADNc.

El fragmento de ADNc de interés se purifica a partir del producto de PCR resultante, y después este se une a un ADN de vector. Un vector recombinante se construye así, y se introduce en E. coli o similares. Después de la selección de colonia, el vector recombinante deseado puede prepararse a partir de la formación de colonias E. coli. Entonces, si el vector recombinante tiene la secuencia de nucleótido de ADNc de interés se prueba por un método conocido como el método de terminación de cadena de nucleótido de dideoxi.

El método de 5'-RACE que usa cebadores para amplificar el gen de región variable se usa convenientemente para aislar el gen que codifica la región variable. Primero, la biblioteca del ADNc de 5'-RACE es construida mediante síntesis del ADNc al usar los RNA extraídos de las células de hibridoma como un cebador. Un kit comercialmente disponible como el kit de amplificación del ADNc SMART RACE se usa apropiadamente para sintetizar la biblioteca del ADNc de 5'-RACE.

El gen del anticuerpo es amplificado mediante PCR al usar la biblioteca del ADNc de 5'-RACE preparada como un cebador. Los cebadores para amplificar el gen del anticuerpo de ratón pueden diseñarse basándose en secuencias del gen de anticuerpo conocidas. Las secuencias de nucleótido de los cebadores varían dependiendo de la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, es preferible que la subclase esté determinada por adelantado al usar un kit comercialmente disponible como el kit de isotipificación del anticuerpo monoclonal de ratón Iso Strip (Roche Diagnostics).

Específicamente, por ejemplo, los cebadores que dejan la amplificación de los genes que codifican las cadenas pesadas ?1, y2a, y2b, y y3 y las cadenas ligeras y ? se usan para aislar genes descodificantes de IgG de ratón. En general, un cebador que hibridiza a un sitio de región constante cerca de la región variable se usa como un cebador lateral 3' para amplificar un gen de región variable de IgG. Mientras tanto, un cebador unido a un kits de construcción de biblioteca de ADNc de 5'-RACE se usa como un cebador lateral 5'.

Los productos de PCR así amplificados se usan para reformar las inmunoglobulinas integradas de una combinación de cadenas pesadas y ligeras. Un anticuerpo deseado puede seleccionarse al usar la actividad de unión a IL-6R de una inmunoglobulina reformada como un indicador. Por ejemplo, cuando el objetivo es aislar un anticuerpo contra IL-6R, es más preferido que la unión del anticuerpo a IL-6R es específico. Un anticuerpo de unión a IL-6R puede evaluarse, por ejemplo, por las siguientes etapas: (1) poner en contacto una célula que expresan IL-6R con un anticuerpo que comprende la región V codificada por un ADNc aislado de un hibridoma; (2) detectar la unión del anticuerpo a la célula que expresan IL-6R; y (3) seleccionar un anticuerpo que se une a la célula que expresan IL-6R.

Los métodos para detectar la unión de un anticuerpo a las células que expresan IL-6R se conocen. Específicamente, la unión de un anticuerpo a las células que expresan IL-6R puede detectarse mediante las técnicas descritas antes como FACS. Las muestras inmovilizadas de las células que expresan el receptor IL-6R se usan apropiadamente para evaluar la actividad de unión de un anticuerpo.

Métodos de evaluación del anticuerpo preferidos que usan la actividad de unión como un indicador también incluye los métodos de selección al usar vectores de bacteriófago. Los métodos de evaluación que usan vectores de bacteriófago son ventajosos cuando los genes del anticuerpo se aislan a partir de bibliotecas de subclase de cadena pesada y de cadena ligera a partir de una población celular que expresa el anticuerpo policlonal. Los genes que codifican las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera pueden enlazarse por una secuencia enlazadora apropiada para formar una Fv de cadena simple (scFv, por sus siglas en inglés). Los bacteriófagos que presentan la scFv en su superficie pueden producirse insertando un gen que codifica la scFv en un vector de bacteriófago. Los bacteriófagos se ponen en contacto con un antígeno de interés. Entonces, un ADN que codifica la scFv que tiene la actividad de unión de interés puede aislarse recolectando los bacteriófagos unidos al antígeno. Este proceso puede repetirse como sea necesario para enriquecer la scFv que tiene la actividad de unión de interés.

Después del aislamiento del ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R de interés, el ADNc se digiere con las enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción introducidos en ambos extremos del ADNc. Las enzimas de restricción preferidas reconocen y dividen una secuencia de nucleótido que ocurre en la secuencia de nucleótido del gen del anticuerpo a una baja frecuencia. Además, un sitio de restricción para una enzima que produce un extremo pegajoso se introduce preferiblemente en un vector para insertar un fragmento digerido de una simple copia en la orientación correcta. El ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R se digiere como se describe antes, y éste se inserta en un vector de expresión apropiado para construir un vector de expresión del anticuerpo. En este caso, si un gen que codifica la región constante del anticuerpo (región C) y un gen que codifica la región V anterior se fusionan en el gen estructural, se obtiene un anticuerpo quimérico. En la presente, "anticuerpo quimérico" se entiende que el origen de la región constante es diferente del de la región variable. Así, además de los anticuerpos heteroquiméricos de ratón-humano, anticuerpos aloquiméricos humano-humano, se incluyen en los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Un vector de expresión del anticuerpo quimérico puede construirse insertando el gen de región V anterior en un vector de expresión que tenga ya la región constante. Específicamente, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción que elimina el gen de región V anterior puede colocarse apropiadamente en el lado 5' de un vector de expresión que lleva un ADN que codifica una región constante del anticuerpo deseada. Un vector de expresión del anticuerpo quimérico es construido fusionando en el estructural los dos genes digeridos con la misma combinación de enzimas de restricción.

Para producir un anticuerpo monoclonal anti-IL6R, los genes del anticuerpo se insertan en un vector de expresión de manera que los genes se expresan bajo el control de una región reguladora de expresión. La región reguladora de expresión para la expresión del anticuerpo incluye, por ejemplo, mejoradores y promotores. Además, una secuencia de señal apropiada puede unirse al extremo amino de manera que secreta el anticuerpo expresado al exterior de las células. En los Ejemplos descritos más adelante, un péptido que tiene la secuencia de aminoácido MGWSCII LFLVATATGVHS (SEC ID NO: 4) se usa como una secuencia de señal. Mientras tanto, otras secuencias de señal apropiadas pueden unirse. El polipéptido expresado se divide en el extremo carboxilo de la secuencia anterior, y el polipéptido resultante se secreta al exterior de las células como un polipéptido maduro. Entonces, las células hospedadoras apropiadas se transforman con el vector de expresión, y se obtienen las células recombinantes que expresan el ADN que codifica el anticuerpo anti-IL-6R.

Los DNA que codifican la cadena pesada del anticuerpo (cadena H) y la cadena ligera (cadena L) se inserta por separado en diferentes vectores de expresión para expresar el gen del anticuerpo. Una molécula del anticuerpo que tiene las cadenas H y L puede expresarse mediante co-transfectar la misma célula hospedadora con los vectores en los cuales los genes de cadena H y cadena L se insertan respectivamente. Alternativamente, las células hospedadoras pueden transformarse con un simple vector de expresión en el cual se insertan los ADN que codifica las cadenas H y L (ver el documento WO 1994/11523).

Hay varias combinaciones de célula hospedadora/vector expresión conocidas para la preparación del anticuerpo introduciendo genes del anticuerpo aislado en los huéspedes apropiados. Todos estos sistemas de expresión son aplicables para el aislamiento de los dominios de unión al antígeno de la presente invención. Las células eucarióticas apropiadas usadas como células hospedadoras incluyen células animales, células de plantas, y células fungicidas. Específicamente, las células animales incluyen, por ejemplo, las siguientes células. (1) células mamíferas: CHO (línea celular de ovario de hámster chino), COS (línea celular de riñón de mono), mieloma (Sp2/0, NSO, y similares), BHK (línea celular de riñón de hámster bebé), HeLa, Vero, HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano con ADN de adenovirus cortado (Ad)5), Freestyle293, PER.C6 (línea celular de retiniana embrionaria humana transformada con el Adenovirus tipo 5 (Ad5)E1 A y los genes E1B), y similares (Current Protocols in Protein Science (Mayo, 2001, Unidad 5.9, Tabla 5.9.1)); (2) células de anfibio: oocitos de Xenopus, o; y (3) células de insectos: sf9, sf21, Tn5, o similares.

Además, como una célula de planta, se conoce un sistema de expresión de gen del anticuerpo al usar células derivadas de Nicotiana genus como Nicotiana tabacum. Las células cultivadas de callos pueden usarse apropiadamente para transformar las células de plantas.

Además, las siguientes células pueden usarse como células fungicidas: levaduras: la Saccharomyces genus como Saccharomyces cerevisiae, y la Pichia genus como Pichia pastoris; y hongos filamentosos: el Aspergillus genus como Aspergillus niger.

Además, los sistemas de expresión de gen del anticuerpo que usan células procarióticas también se conocen. Por ejemplo, cuando usan células bacterianas, células E. coli, células Bacillus subtilis, y similares pueden usarse adecuadamente en la presente invención. Los vectores de expresión que llevan los genes del anticuerpo de interés son introducidos en estas células mediante transfección. Las células transfectadas se cultivan in vitro, y el anticuerpo deseado puede prepararse a partir del cultivo de células transformadas.

Además de las células hospedadoras descritas antes, los animales transgénicos pueden también usarse para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, el anticuerpo puede obtenerse a partir de un animal en el cual se introduce el gen que codifica el anticuerpo de interés. Por ejemplo, el gen del anticuerpo puede construirse como gen de fusión mediante la inserción en estructural en un gen que codifica una proteína producida específicamente en leche. La ß-caseína de cabra o similares puede usarse, por ejemplo, como la proteína secretada en leche. Los fragmentos de ADN que contienen el gen fusionado insertado con el gen del anticuerpo se inyectan en un embrión de cabra, y entonces este embrión se introduce en una cabra hembra. Los anticuerpos deseados pueden obtenerse como proteína fusionada con la proteína de leche de la leche producida por la cabra transgénica que nace de la cabra del receptor de embrión (o la progenie de la misma). Además, para aumentar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, las hormonas puede administrarse a la cabra transgénica como sea necesario (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

Cuando un complejo de polipéptido descrito en la presente se administra al humano, un dominio de unión al antígeno derivado de un anticuerpo genético recombinante que se ha modificado artificialmente para reducir la antigenicidad heteróloga contra el humano y similares, puede usarse apropiadamente como el dominio de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno. Tales anticuerpos genéticamente recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados son producidos apropiadamente por métodos conocidos.

Una región variable de anticuerpo usada para producir el dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno descrita en la presente es formada generalmente por tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) que son separadas por cuatro regiones de estructural (FRs, por sus siglas en inglés). La CDR es una región que determina sustancialmente la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de las CDR son altamente diversas. Por una parte, las secuencias de aminoácidos formadoras de FR tienen a menudo alta identidad incluso entre anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, generalmente, la especificidad de unión de cierto anticuerpo puede introducir a otro anticuerpo injertando la CDR.

Un anticuerpo humanizado también se llama un anticuerpo humano reformado. Específicamente, se conocen los anticuerpos humanizados preparados injertando la CDR de un anticuerpo animal no humano como un anticuerpo de ratón a un anticuerpo humano y similares. Las técnicas de ingeniería genética comunes para obtener anticuerpos humanizados también se conocen. Específicamente, por ejemplo, la PCR de extensión traslapante se conoce como un método para injertar una CDR de anticuerpo de ratón a una RF humana. En la PCR de extensión traslapante, una secuencia de nucleótido que codifica una CDR de anticuerpo de ratón que se injertará se agrega a los cebadores para sintetizar una FR de anticuerpo humano. Los cebadores se preparan para cada una de las cuatro FR. Se considera generalmente que cuando se injertar una CDR de ratón a una FR humana, seleccionando una FR humana que tiene alta identidad a una FR de ratón es ventajosa para mantener la función de CDR. Es decir, es generalmente preferible usar una FR humana que comprende una secuencia de aminoácido que tiene alta identidad a la secuencia de aminoácido de la FR adyacente a la CDR de ratón que se injertará.

Las secuencias de nucleótido que se enlazarán se diseñan de modo que se conecten entre sí en estructural. Las FR humanas se sintetiza individualmente al usar los cebadores respectivos. Como un resultado, se obtienen los productos en los cuales el ADN que codifica la CDR de ratón se une a los ADN que codifican la FR individual. Las secuencias de nucleótido que codifican la CDR de ratón de cada producto se diseñan de modo que se traslapan entre sí. Entonces, la reacción de síntesis de hebra complementaria se conduce para recocer las regiones CDR traslapantes de los productos sintetizados al usar un gen de anticuerpo humano como el cebador. Las FR humanas se ligan a través de las secuencias de CDR de ratón mediante esta reacción.

El gen de región V de longitud completa, en el cual tres CDR y cuatro FR se ligan últimamente, se amplifica al usar los cebadores que hibridizan a su extremo 5' o 3', que se agregan con secuencias reconocedoras de enzima de restricción adecuadas. Un vector de expresión para el anticuerpo humanizado puede producirse insertando el ADN obtenido como se describe anteriormente y un ADN que codifica una región C de anticuerpo humano en un vector de expresión de modo que se ligue en el estructural. Después de que el vector recombinante es transfectado en un huésped para establecer las células recombinantes, se cultivan las células recombinantes, y el ADN que codifica el anticuerpo humanizado se expresa para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo celular (ver, Número de Publicación de Patente Europea EP 239400 y el Número de Publicación de Patente Internacional WO 1996/002576).

Mediante medición cualitativa o cuantitativa y evaluando la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado producido como se describe anteriormente, uno puede seleccionar adecuadamente las FR de anticuerpo humano que deja que las CDR formen un sitio de unión al antígeno favorable cuando se une a través de las CDR. Los residuos de aminoácidos en las FR pueden sustituirse como sea necesario, de manera que las CDR de un anticuerpo humano reformado forma un sitio de unión al antígeno apropiado. Por ejemplo, pueden introducirse las mutaciones de la secuencia de aminoácido en las FR aplicando el método de PCR usado para injertar una CDR de ratón en una FR humana. Más específicamente, las mutaciones de secuencia de nucleótido parcial pueden introducirse en los cebadores que hibridizan a la FR. Las mutaciones de secuencia de nucleótido se introducen en las FR sintetizadas usando tales cebadores. Las secuencias de FR mutante que tienen las características deseadas pueden seleccionarse midiendo y evaluando la actividad del anticuerpo mutante sustituido con aminoácido para unir al antígeno por el método anteriormente mencionado (Cáncer Res. (1993) 53: 851-856).

Alternativamente, los anticuerpos humanos deseados pueden obtenerse inmunizando animales transgénicos que tienen el repertorio entero de genes de anticuerpo humano (ver los documentos WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) mediante inmunización del ADN.

Además, las técnicas para preparar los anticuerpos humanos mediante la selección al usar bibliotecas de anticuerpo humano también se conocen. Por ejemplo, la región V de un anticuerpo humano es expresada como un anticuerpo de cadena simple (scFv, por sus siglas en inglés) en la superficie de bacteriófago por el método exhibición de bacteriófago. Los bacteriófagos que expresan un scFv que se une al antígeno pueden seleccionarse. La secuencia de ADN que codifica la región V de anticuerpo humano que se une al antígeno puede ser determinada analizando los genes de los bacteriófagos seleccionados. Es determinada la secuencia de ADN del scFv que se une al antígeno. Es preparado un vector de expresión fusionando la secuencia de región V en el estructural con la secuencia de región C de un anticuerpo humano deseado, e insertando este en un vector de expresión apropiado. Se introduce el vector de expresión en las células apropiadas para la expresión según se describió anteriormente. El anticuerpo humano puede producirse expresando el gen codificante de anticuerpo humano en las células. Estos métodos se conocen ya (ver los documentos WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

Además de las técnicas descritas antes, las técnicas de clonación de la célula B (identificación de cada secuencia que codifica el anticuerpo, la clonación y de su aislamiento; el uso en construir el vector de expresión para preparar cada anticuerpo (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4 en particular); y similares) como se describe en Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) o en el documento WO 2008/081008 pueden usarse apropiadamente para aislar genes de anticuerpo.

Sistema de numeración de UE y sistema de numeración de Kabat De acuerdo con los métodos usados en la presente invención, las posiciones del aminoácido asignadas a las CDR y las FR de anticuerpo se especifican de acuerdo con la numeración de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)). En la presente, cuando una molécula de unión al antígeno es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, los aminoácidos de región variable se indican de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, mientras que los aminoácidos de región constante se indican de acuerdo con el sistema de numeración de UE basado en las posiciones del aminoácido de Kabat.

Condiciones de la concentración de ión Condiciones de la concentración de ion de metal En una modalidad no limitante de la presente invención, la concentración de ion se refiere a una concentración de ion de metal. Los "iones de metal" se refieren a los iones de los elementos del grupo I excepto hidrógeno como metales alcalinos y los elementos del grupo de cobre, los elementos del grupo II como metales alcalinotérreos y los elementos del grupo zinc, elementos del grupo III excepto boro, elementos del grupo IV excepto carbón y silicio, los elementos del grupo VIII como el grupo hierro y los elementos del grupo platino, los elementos que pertenecen al subgrupo A de los grupos V, VI, y VII, y los elementos como antimonio, bismuto, y polonio. Los átomos de metal tienen la propiedad de liberar electrones de valencia para convertirse en cationes. Esto se refiere como tendencia de ionización. Los metales con tendencia de ionización potente se consideran que son químicamente activos.

En la presente invención, los iones de metal preferidos incluyen, por ejemplo, ion de calcio. El ion de calcio está implicado en la modulación de muchos fenómenos biológicos, que incluye la contracción de músculos como músculos esqueléticos, lisos, y cardiacos; activación de movimiento, fagocitosis, y similares de Leucocitos; activación del cambio de forma, secreción, y similares de plaquetas; activación de linfocitos; activación de mastocitos que incluye secreción de histamina; respuestas de células mediadas por el receptor de catecolamina a o el receptor de acetilcolina; exocitosis; liberación de sustancias transmisoras de terminales neuronales; y flujo axoplásmico en neuronas. Los receptores de ion calcio intracelulares conocidos incluyen la troponina C, la calmodulina, la parvalbúmina, y la cadena ligera de miosina, que tienen varios sitios de unión al ion calcio y se creen que son derivados de un origen común en términos de evolución molecular. Hay también muchos motivos de unión al calcio conocidos. Tales motivos bien conocidos incluyen, por ejemplo, dominios de cadherina, mano EF de calmodulina, dominio C2 de la protelna cinasa C, dominio de Gla del factor IX de protefna de coagulación de la sangre, lectinas tipo C del receptor de aciaroglicoproteína y el receptor de unión a mañosa, dominios A de los receptores de LDL, anexina, dominio tipo 3 de trombospondina, y dominios similares a EGF.

En la presente invención, cuando el ion de metal es ion de calcio, las condiciones de la concentración de ion calcio incluyen bajas concentraciones de ión calcio y altas concentraciones de ion calcio. "La actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno contenido en la molécula de unión al antígeno de la presente invención varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio" se entiende que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno en la molécula de unión al antígeno varía debido a la diferencia en las condiciones entre bajas y altas concentraciones de ion calcio. Por ejemplo, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno puede ser mayor bajo una alta condición de concentración de ion calcio que bajo una baja concentración de ion calcio. Alternativamente, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, mayor bajo una baja condición de concentración de ion calcio que bajo una alta condición de concentración de ion calcio.

En la presente, la alta concentración de ion calcio no está limitada particularmente a un valor específico; sin embargo, la concentración puede seleccionarse preferiblemente entre 100 µ? y 10 m . En otra modalidad, la concentración puede seleccionarse entre 200 µ? y 5 mM. En una modalidad alternativa, la concentración puede seleccionarse entre 400 µ? y 3 mM. En aún otra modalidad, la concentración puede seleccionarse entre 200 µ? y 2 mM. Además, la concentración puede seleccionarse entre 400 µ? y 1 mM. En particular, una concentración seleccionada entre 500 µ? y 2.5 mM, que está cercana a la concentración plasmática (sangre) de ion de calcio ¡n vivo, es preferida.

En la presente, la baja concentración de ion calcio no está limitada particularmente a un valor específico; sin embargo, la concentración puede seleccionarse preferiblemente entre 0.1 µ? y 30 µ?. En otra modalidad, la concentración puede seleccionarse entre 0.2 µ? y 20 µ?. En aún otra modalidad, la concentración puede seleccionarse entre 0.5 µ? y 10 µ?. En una modalidad alternativa, la concentración puede seleccionarse entre 1 µ? y 5 µ?. Además, la concentración puede seleccionarse entre 2 µ? y 4 µ?. En particular, es preferida una concentración seleccionada entre 1 µ? y 5 µ M , que está cercana a la concentración de calcio ionizado en los endosomas tempranos in vivo.

En la presente, "la actividad de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de ion calcio que bajo una alta condición de concentración de ion calcio" se entiende que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio de la presente invención es más débil a una concentración de ion calcio seleccionada entre 0.1 µ? y 30 µ? que a una concentración de ion calcio seleccionada entre 100 µ? y 10 mM. Preferiblemente, se entiende que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio de la presente invención es más débil a una concentración de ion calcio seleccionada entre 0.5 µ? y 10 µ? que a una concentración de ion calcio seleccionada entre 200 µ? y 5 mM. En particular se entiende preferiblemente que la actividad de unión al antígeno a la concentración de ion calcio en el endosoma temprano in vivo es más débil que a la concentración de ion calcio en plasma in vivo; y específicamente, se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es más débil a una concentración de ion calcio seleccionada entre 1 µ y 5 µ? que a una concentración de ion calcio seleccionada entre 500 µ? y 2.5 mM.

Si la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el domino es cambiada dependiendo de las concentraciones de ion metal puede determinarse, por ejemplo, por el uso de los métodos de medición conocidos como los descritos en la sección "Actividad de Unión" anterior. Por ejemplo, para confirmar que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio se vuelve mayor bajo una alta condición de concentración de ion calcio que bajo una baja condición de concentración de ion calcio, se compara la actividad de unión al antígeno del dominio o la molécula bajo bajas y altas condiciones de concentración de ion calcio.

En la presente invención, la expresión "la actividad de unión al antígeno es inferior bajo una baja condición de concentración de ion calcio que bajo una alta condición de concentración de ion calcio" puede también expresarse como "la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio es mayor bajo una alta condición de concentración de ion calcio que bajo una baja concentración de ion calcio". En la presente invención, "la actividad de unión al antígeno es inferior bajo una baja condición de concentración de ion calcio que bajo una alta condición de concentración de ion calcio" se escribe a veces como "la actividad de unión al antígeno es más débil bajo una baja condición de concentración de ion calcio que bajo una alta condición de concentración de ion calcio". También, "la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de ion calcio se reduce que es inferior que bajo una alta condición de concentración de ion calcio" puede ser escrita como "la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de ion calcio se hace más débil que bajo una baja condición de concentración de ion calcio".

Cuando se determina la actividad de unión al antígeno, las condiciones con excepción de la concentración de ion calcio pueden seleccionarse apropiadamente por los expertos en la técnica, y no están particularmente limitadas. Por ejemplo, la actividad puede determinarse a 37°C en amortiguador de HEPES. Por ejemplo, puede usarse Biacore (GE Healthcare) o similares para la determinación. Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio puede evaluarse haciendo fluir el antígeno como un analito sobre una matriz sobre la cual se inmoviliza el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio. Cuando el antígeno es un antígeno de membrana, la actividad de unión de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio de membrana puede evaluarse haciendo fluir el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio como un analito sobre una matriz sobre la cual se inmoviliza el antígeno.

Siempre que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención sea más débil a una baja condición de concentración de ion calcio que bajo una alta condición de concentración de ion calcio, la relación de la actividad de unión al antígeno entre las bajas y altas condiciones de concentración de ion calcio no está particularmente limitada. Sin embargo, la relación de la KD (constante de disociación) de la molécula de unión al antígeno para un antígeno a una condición de concentración de ion calcio con respecto a la KD a una condición de concentración de ion calcio, Es decir el valor de la KD (3 µ? de Ca)/KD (2 m de Ca), es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 10 o más, y aún más preferiblemente 40 o más. El límite superior del valor de la KD (3 µ? de Ca)/KD (2 mM de Ca) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 400, 1000, o 10000 siempre que la molécula pueda producirse por técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la KD (constante de disociación) puede usarse para representar la actividad de unión al antígeno. Mientras tanto, cuando el antígeno es un antígeno de membrana, la KD aparente (constante de disociación aparente) puede usarse para representar la actividad. La KD (constante de disociación) y la KD aparente (constante de disociación aparente) pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al usar Biacore (GE Healthcare), diagrama de Scatchard, o citómetro de flujo.

Alternativamente, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) puede también usarse preferiblemente como un índice para representar la relación de la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio de la presente invención entre las bajas y altas condiciones de concentración de calcio. Cuando la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) se usa en vez de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) como un índice para representar la relación de actividad de unión, la relación de la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) entre las bajas y altas condiciones de concentración de calcio, Es decir el valor de la kd (condición de concentración de calcio)/kd (alta concentración de calcio), es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 5 o más, aún más preferiblemente 10 o más, y todavía más preferiblemente 30 o más. El límite superior del valor de la Kd (condición de concentración de calcio)/kd (alta concentración de calcio) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 50, 100, o 200 siempre que la molécula pueda producirse por las técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la kd (constante de velocidad de disociación) puede usarse para representar la actividad de unión al antígeno. Mientras tanto, cuando el antígeno es un antígeno de membrana, la kd aparente (constante de velocidad de disociación aparente) puede usarse para representar la actividad de unión al antígeno. La kd (constante de velocidad de disociación) y la kd aparente (constante de velocidad de disociación aparente) pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al usar Biacore (GE Healthcare) o citómetro de flujo. En la presente invención, cuando la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio es determinada a diferentes concentraciones de ion calcio, es preferible usar las mismas condiciones a excepción de las concentraciones de calcio.

Los métodos descritos en el documento WO 2012/073992 (por ejemplo, párrafo 0200-0213) y similares pueden presentarse como ejemplos de un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno o un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo bajas condiciones de concentración de ion calcio es más baja que bajo altas condiciones de concentración de ion calcio, que es una modalidad proporcionada por la presente invención.

Bibliotecas En una modalidad, un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno de la presente invención puede obtenerse a partir de una biblioteca que se compone principalmente de una pluralidad de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de unión al antígeno tienen por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de las moléculas de unión al antígeno dependiendo de las concentraciones de iones. Las concentraciones de iones incluyen preferiblemente, por ejemplo, la concentración de ion de metal y la concentración de ion de hidrógeno.

En la presente, una "biblioteca" se refiere a una pluralidad de moléculas de unión al antígeno o una pluralidad de polipéptidos de fusión que contiene las moléculas de unión al antígeno, o los ácidos nucleicos o los polinucleótidos que codifican sus secuencias. Las secuencias de una pluralidad de moléculas de unión al antígeno o de una pluralidad de polipéptidos de fusión que contienen las moléculas de unión al antígeno en una biblioteca no son idénticas, sino son diferentes entre sí.

En la presente, la frase "secuencias son diferentes entre sí" en la expresión "una pluralidad de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí" se entiende que las secuencias de moléculas de unión al antígeno en una biblioteca son diferentes entre sí. Específicamente, en una biblioteca, el número de secuencias diferentes entre sí refleja el número de clones independientes con diferentes secuencias, y puede también referirse como "tamaño de biblioteca". El tamaño de biblioteca de una biblioteca de expresión en bacteriófagos convencional oscila de 106 a 1012. El tamaño de biblioteca puede aumentarse hasta 1014 por el uso de técnicas conocidas como exhibición de ribosoma. Sin embargo, el actual número de partículas de bacteriófagos usado en la selección por cribado de una biblioteca de bacteriófagos es en general 10-10000 veces mayor que el tamaño de la biblioteca. Este exceso de multiplicidad también se refiere como "el número de equivalentes de biblioteca", y se entiende que hay 10 a 10,000 clones individuales que tienen la misma secuencia de aminoácido. Así, en la presente invención, la frase "secuencias son diferentes entre sí" se entiende que las secuencias de moléculas de unión al antígeno independientes en una biblioteca, excepto los equivalentes de biblioteca, son diferentes entre sí. Más específicamente, lo anterior se entiende que hay 106 a 1014 moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí, preferiblemente 107 a 1012 moléculas, más preferiblemente 108 a 1011 moléculas, y particularmente de manera preferible 108 a 1012 moléculas cuyas secuencias son diferentes entre sí.

En la presente, la frase "una pluralidad de" en la expresión "una biblioteca compuesta principalmente de una pluralidad de moléculas de unión al antígeno" se refiere generalmente a, en el caso de, por ejemplo, moléculas de unión al antígeno, polipéptidos de fusión, moléculas de polinucleótidos, vectores, o virus de la presente invención, un grupo de dos o más tipos de la sustancia. Por ejemplo, cuando dos o más sustancias son diferentes entre sí en una característica particular, esto se entiende que hay dos o más tipos de la sustancia. Tales ejemplos pueden incluir, por ejemplo, aminoácidos mutantes observados en las posiciones de aminoácidos específicas en una secuencia de aminoácido. Por ejemplo, cuando hay dos o más moléculas de unión al antígeno de la presente invención cuyas secuencias son sustancialmente las mismas o preferiblemente las mismas a excepción de los residuos flexibles o a excepción de los aminoácidos mutantes particulares en las posiciones hipervariables expuestas en la superficie, hay una pluralidad de moléculas de unión al antígeno de la presente invención. En otro ejemplo, cuando hay dos o más moléculas de polinucleótidos cuyas secuencias son sustancialmente las mismas o preferiblemente las mismas a excepción de los nucleótidos que codifican los residuos flexibles o los nucleótidos que codifican los aminoácidos mutantes de las posiciones hipervariables expuestas en la superficie, hay una pluralidad de moléculas de polinucleótidos de la presente invención.

Además, en la presente, la frase "compuesto principalmente de" en la expresión "una biblioteca compuesta principalmente de una pluralidad de moléculas de unión al antígeno" refleja el número de moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las concentraciones de iones, entre clones independientes con diferentes secuencias en una biblioteca. Específicamente, es preferible que haya por lo menos 104 moléculas de unión al antígeno que tienen tal actividad de unión en una biblioteca. Más preferiblemente, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca que contiene por lo menos 105 moléculas de unión al antígeno que tienen tal actividad de unión. Aún más preferiblemente, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca que contiene por lo menos 106 moléculas de unión al antígeno que tienen tal actividad de unión. Particularmente de manera preferible, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca que contiene por lo menos 107 moléculas de unión al antígeno que tienen tal actividad de unión. Aún más preferiblemente, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca que contiene por lo menos 10 moléculas de unión al antígeno que tienen tal actividad de unión. Alternativamente, esto puede también expresarse preferiblemente como la relación del número de moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las concentraciones de iones en comparación con número de clones independientes que tienen diferentes secuencias en una biblioteca. Específicamente, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca en la cual las moléculas de unión al antígeno que tienen tal cuenta de actividad de unión de 0.1% a 80%, preferiblemente 0.5% al 60%, más preferiblemente 1% a 40%, aún más preferiblemente 2% a 20%, y particularmente de manera preferible 4% a 10% de clones independientes con diferentes secuencias en la biblioteca. En el caso de los polipéptidos de fusión, las moléculas de polinucleótidos, o los vectores, las expresiones similares pueden ser posibles al usar el número de moléculas o la relación al número total de moléculas. En el caso de virus, expresiones similares pueden también ser posibles al usar el número de viriones o la relación al número total de viriones.

Aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de dominios de unión al antígeno que dependen de las concentraciones de ion calcio Los dominios de unión al antígeno o las moléculas de unión al antígeno de la presente invención que se evaluarán por los métodos de evaluación descritos antes pueden prepararse de cualquier manera. Por ejemplo, cuando el ion de metal es el ion de calcio, es posible usar dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno preexistentes, bibliotecas preexistentes (biblioteca de bacteriófago, etc.), anticuerpos o bibliotecas preparadas a partir de hibridomas obtenidos inmunizando animales o de células B de animales inmunizados, anticuerpos o bibliotecas obtenidas introduciendo aminoácidos capaces de quelatar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico) o mutaciones del aminoácido no naturales en los anticuerpos o las bibliotecas descritas antes (aminoácidos quelatables con calcio (como ácido aspártico y ácido glutámico), bibliotecas con contenido aumentado de aminoácidos no naturales, bibliotecas preparadas introduciendo aminoácidos quelatables con calcio (como ácido aspártico y ácido glutámico) o mutaciones del aminoácido no naturales en las posiciones particulares, o similares.

Los ejemplos de los aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de moléculas de unión al antígeno que dependen de las concentraciones de iones como se describe anteriormente pueden ser cualquiera de los tipos de aminoácidos, siempre y cuando los aminoácidos formen un motivo de unión al calcio. Los motivos de unión al calcio son bien conocido por los expertos en la técnica y se han descrito en detalles (por ejemplo, Springer et al. (Gell (2000) 102, 275- 277); Kawasaki and Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief et al. (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux et al. (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch and Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer et al. (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg et al. (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). Específicamente, cualquier motivo de unión al calcio conocido, que incluye lectinas tipo C como ASGPR, CD23, MBR, y DC-SIGN, puede incluirse en las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Los ejemplos preferidos de tales motivos de unión al calcio preferidos también incluyen, además de los descritos antes, por ejemplo, el motivo de unión al calcio en el dominio de unión al antígeno de la SEC ID NO: 5.

Además, como aminoácidos que alteren la actividad de unión al antígeno de dominios de unión al antígeno incluidos en las moléculas de unión al antígeno de la presente invención que dependen de las concentraciones de ion calcio, por ejemplo, aminoácidos que tienen actividad de quelación metálica puede también usarse preferiblemente. Los ejemplos de tales aminoácidos de quelación metálica incluyen, por ejemplo, serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glutamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)), y ácido glutámico (Glu (E)).

Las posiciones en los dominios de unión al antígeno en las cuales se contienen los aminoácidos descritos antes no están limitadas particularmente a las posiciones particulares, y pueden ser cualquiera de las posiciones dentro de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera que forman un dominio de unión al antígeno, siempre que alteren la actividad de unión al antígeno de las moléculas de unión al antígeno dependiendo de las concentraciones de ion calcio. En una modalidad no limitante, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca integrada principalmente de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de unión al antígeno de cadena pesada contienen aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de las moléculas de unión al antígeno dependiendo de las concentraciones de ion calcio. En otra modalidad no limitante, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca integrada principalmente de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CDR3 de cadena pesada contienen los aminoácidos mencionados anteriormente. En aún otra modalidad no limitante, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca integrada principalmente de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CDR3 de cadena pesada contienen los aminoácidos mencionados anteriormente en las posiciones 95, 96, 100a, y/o 101 como se indica de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Mientras tanto, en una modalidad no limitante de la presente invención, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de unión al antígeno de cadena ligera contienen aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de moléculas de unión al antígeno dependiendo de las concentraciones de ion calcio. En otra modalidad no limitante, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR1 de cadena ligera contienen los aminoácidos anteriormente mencionados. En aún otra modalidad, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CD 1 de cadena ligera contienen los aminoácidos anteriormente mencionados en las posiciones 30, 31, y/o 32 como se indica de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

En otra modalidad no limitante, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CDR2 de cadena ligera contienen los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados. En aún otra modalidad no limitante, la presente invención proporciona las bibliotecas compuestas principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CDR2 de cadena ligera contienen los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados en la posición 50 como se indica de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

En aún otra modalidad de la presente invención, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CDR3 de cadena ligera contienen los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados. En una modalidad alternativa, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de CDR3 de cadena ligera contienen los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados en la posición 92 como se indica de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Además, en una diferente modalidad de la presente invención, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y en las cuales dos o tres CDR seleccionadas de las CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera descritas antes contienen los residuos de aminoácidos ya mencionados. Por otra parte, los dominios de unión al antígeno de la presente invención pueden obtenerse a partir de una biblioteca compuesta principalmente de las moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyas cadenas ligeras contienen los residuos de aminoácidos ya mencionados en cualquiera o más de las posiciones 30, 31, 32, 50, y/o 92 como se indica de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

En una modalidad particularmente preferida, las secuencias estructurales de la región variable de cadena ligera y/o de cadena pesada de una molécula de unión al antígeno contienen preferiblemente las secuencias estructurales de la línea germinal humana. Así, en una modalidad de la presente invención, cuando las secuencias estructurales son secuencias completamente humanas, se espera que cuando tal molécula de unión al antígeno de la presente invención se administra a humanos (por ejemplo, para tratar enfermedades), induce poco o nada de la respuesta inmunogenética. En el sentido anterior, la frase "que contiene una secuencia de la línea germinal" en la presente invención se entiende que una parte de las secuencias estructurales de la presente invención es idéntica a una parte de cualquiera de las secuencias estructurales de la línea germinal humana. Por ejemplo, cuando la secuencia FR2 de cadena pesada de una molécula de unión al antígeno de la presente invención es una combinación de la secuencias FR2 de cadena pesada de diferente secuencias estructurales de la linea germinal humana, tal molécula es también una molécula de unión al antígeno de la presente invención "que contiene una secuencia de la línea germinal".

Los ejemplos preferidos de las estructuras incluyen, por ejemplo, secuencias de región estructural completamente humanas conocidas actualmente, que se incluyen en el Sitio Web de V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) u otros. Esas secuencias de región estructural pueden usarse apropiadamente como una secuencia de la línea germinal contenida en una molécula de unión al antígeno de la presente invención. Las secuencias de la línea germinal pueden categorizarse de acuerdo con su similitud (Tomlinson et al. (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams and Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Las secuencias de la línea germinal apropiadas pueden seleccionarse de VK, que se agrupa en siete subgrupos; \/?, que se agrupa en diez subgrupos; y VH, que se agrupa en siete subgrupos.

Las secuencias de VH completamente humanas incluyen preferiblemente, pero no se limitan a, por ejemplo, secuencias de: subgrupo VH 1 (por ejemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, y VH1-69); subgrupo VH2 (por ejemplo, VH2-5, VH2-26, and VH2-70); subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11 , VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, y VH3-74); subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59. y VH4-61); subgrupo VH5 (VH5-51); subgrupo VH6 (VH6-1 ); y subgrupo VH7 (VH7-4 y VH7-81). Éstos también se describen en los documentos conocidos (Matsuda et al. (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) y similares, y los expertos en la técnica pueden diseñar así apropiadamente moléculas de unión al antígeno de la presente invención basadas en la información de estas secuencias. Es también preferible usar otras estructuras completamente humanas o subregiones estructurales.

Las secuencias de VK completamente humanas incluyen preferiblemente, pero no se limitan a, por ejemplo: A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, 02, 04, 08, 012, 014, y 018 agrupados en el subgrupo Vk1 ; A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, 01, y 011, agrupado en el subgrupo Vk2; A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20, y L25, agrupado en el subgrupo Vk3; B3, agrupado en el subgrupo Vk4; B2 (en la presente también referido como Vk5-2), agrupado en el subgrupo Vk5; y A10, A14, y A26, agrupados en el subgrupo VK6 (Kawasaki et al. (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable and Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173-181)).

Las secuencias de \/? completamente humanas incluyen preferiblemente, pero no se limitan a, por ejemplo: V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20, y V1-22, agrupados en el subgrupo VL1; V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, y V2-19, agrupados en el subgrupo VL1; V3-2, V3-3, y V3-4, agrupados en el subgrupo VL3; V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, y V4-6, agrupados en el subgrupo VL4; y V5-1, V5-2, V5-4, y V5-6, agrupados en el subgrupo VL5 (Kawasaki er a/. (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).

Normalmente, estas secuencias estructurales son diferentes entre sí en uno o más residuos de aminoácidos. Estas secuencias estructural pueden usarse en combinación con "por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de iones" en la presente invención. Otros ejemplos de las estructurales completamente humanas usados en combinación con "por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de iones" de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI , LAY, y POM (por ejemplo, Kabat et al. (1991) supra; Wu et al. (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

Sin estar unida por una teoría particular, una razón de la expectativa que el uso de las secuencias de la línea germinal imposibilita las inmunorespuestas adversas en la mayoría de los individuos se cree que es como sigue. Como un resultado del proceso de la maduración de afinidad durante las inmunorespuestas normales, la mutación somática ocurre frecuentemente en las regiones variables de inmunoglobulina. Tales mutaciones ocurren sobre todo alrededor de las CDR cuyas secuencias son hipervariables, pero también afectan residuos de regiones estructurales. Tales mutaciones estructurales no existen en los genes de la línea germinal, y también son menos probables ser inmunogenéticas en los pacientes. Por una parte, la población humana normal está expuesta a la mayor parte de las secuencias estructural expresadas a partir de los genes de la línea germinal. Como resultado de inmunotolerancia, estas estructuras de la línea germinal se espera que tengan baja o ninguna inmunogenicidad en los pacientes. Para maximizar la posibilidad de inmunotolerancia, los genes que codifican la región variable pueden seleccionarse de un grupo de genes de la línea germinal funcional que ocurre comúnmente.

Métodos conocidos como mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel ef al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y PCR de extensión traslapante puede emplearse apropiadamente para producir moléculas de unión al antígeno de la presente invención en la cual la región variable descrita antes ordena, secuencias de región variable de cadena pesada o ligera, secuencias de CDR, o secuencias estructurales contienen los aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de las moléculas de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio.

Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión al antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí pueden construirse combinando las regiones variables de cadena pesada preparadas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria con una región variable de cadena ligera seleccionada como una secuencia estructural que contiene originalmente por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio. Como ejemplo no limitante, cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, tales bibliotecas preferidas incluyen, por ejemplo, las construidas combinando la secuencia de región variable de cadena ligera de la SEC ID NO: 5 (Vk5-2) y la región variable de cadena pesada producida como biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria.

Alternativamente, una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada como una región estructural que contiene originalmente por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno como se menciona antes puede diseñarse para contener varios residuos de aminoácidos con excepción de los residuos de aminoácidos anteriores. En la presente, tales residuos se refieren como residuos flexibles. El número y la posición de los residuos flexibles no están particularmente limitados, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno del dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las concentraciones de iones. Específicamente, las secuencias de CDR y/o las secuencias de FR de la cadena pesada y/o de cadena ligera pueden contener uno o más residuos flexibles. Por ejemplo, cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, los ejemplos no limitantes de los residuos flexibles que se introducirán en la secuencia de región variable de cadena ligera de la SEC ID NO: 5 (Vk5-2) incluyen los residuos de aminoácidos numerados en las Tablas 1 o 2.

[Tabla 1] (LA POSICION INDICA LA NUMERACION DE Kabat) [Tabla 2] (LA POSICIÓN INDICA LA NUMERACIÓN DE Kabat) En la presente, los residuos flexibles se refieren a variaciones del residuo de aminoácido presentes en las posiciones hipervariables en las cuales varios diferentes aminoácidos están presentes en las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada cuando se comparan las secuencias de aminoácidos de anticuerpos conocidos y/o nativos o de dominios de unión al antígeno. Las posiciones hipervariables están localizadas generalmente en las regiones de las CDR. En una modalidad, los datos proporcionados por Kabat, Sequences of proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda d.) (1987 and 1991) son útiles para determinar las posiciones hipervariables en anticuerpos conocidos y/o nativos. Además, bases de datos en Internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) proporcionan las secuencias recolectadas de muchas cadenas ligeras y cadenas pesadas humanas y sus localizaciones. La información sobre las secuencias y las localizaciones es útil para determinar las posiciones hipervariables en la presente invención. De acuerdo con la presente invención, cuando cierta posición del aminoácido tiene preferiblemente de manera aproximada 2 a aproximadamente 20 variaciones del residuo de aminoácido posibles, preferiblemente de manera aproximada 3 a aproximadamente 19, preferiblemente de manera aproximada 4 a aproximadamente 18, preferiblemente 5 a 17, preferiblemente 6 a 16, preferiblemente 7 a 15, preferiblemente 8 a 14, preferiblemente 9 a 13, y preferiblemente 10 a 12 variaciones del residuo de aminoácido posibles, la posición es hipervariable. En algunas modalidades, cierta posición del aminoácido puede tener preferiblemente por lo menos aproximadamente 2, preferiblemente por lo menos aproximadamente 4, preferiblemente por lo menos aproximadamente 6, preferiblemente por lo menos aproximadamente 8, preferiblemente de manera aproximada 10, y preferiblemente de manera aproximada 12 variaciones del residuo de aminoácido.

Alternativamente, una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión al antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí puede construirse combinando las regiones variables de cadena pesada producidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria con regiones variables de cadena ligera en las cuales por lo menos se introduce un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de moléculas de unión al antígeno dependiendo de las concentraciones de iones como se menciona anteriormente. Cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, los ejemplos no limitantes de tales bibliotecas incluyen preferiblemente, por ejemplo, bibliotecas en las cuales las regiones variables de cadena pesada producidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria se combina con las secuencias de región variable de cadena ligera en las cuales unos residuos particulares en una secuencia de línea germinal por ejemplo la SEC ID NO: 6 (Vk1), la SEC ID NO: 7 (Vk2), la SEC ID NO: 8 (Vk3), o la SEC ID NO: 9 (Vk4) se ha sustituido con por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las concentraciones de ion calcio. Los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos incluyen residuos de aminoácidos en la CDR1 de cadena ligera. Además, los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos incluyen residuos de aminoácidos en la CDR2 de cadena ligera. Además, los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos también incluyen residuos de aminoácidos en la CDR3 de cadena ligera.

Los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos contenidos en la CDR1 de cadena ligera incluyen aquellos en las posiciones 30, 31, y/o 32 en la CDR1 de región variable de cadena ligera como se indica por la numeración de Kabat. Además, los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos contenidos en la CDR2 de cadena ligera incluyen un residuo de aminoácido en la posición 50 en la CDR2 de región variable de cadena ligera como se indica por la numeración de Kabat. Por otra parte, los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos contenidos en la CDR3 de cadena ligera incluyen un residuo de aminoácido en la posición 92 en la CDR3 de región variable de cadena ligera como se indica por la numeración de Kabat. Estos residuos de aminoácidos pueden contenerse solos o en combinación, siempre y cuando formen un motivo de unión al calcio y/o, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno varíe dependiendo de las concentraciones de ion calcio. Mientras tanto, como la cadena ligera de troponina C, de calmodulina, de parvalbúmina, y de miosina, que tiene varios sitios de unión al ion calcio y se creen que es derivada de un origen común en términos de evolución molecular, se conoce, la CDR1, CDR2, y/o CDR3 de cadena ligera, puede diseñarse para tener sus motivos de unión.

Por ejemplo, es posible usar dominios de cadherina, mano de EF de la calmodulina, el dominio C2 de la proteína cinasa C, dominio Gla del Factor IX de proteína de coagulación de la sangre, lectinas tipo C del receptor de aciaroglicoproteína y el receptor de unión a mañosa, los dominios A de los receptores LDL, anexina, dominio tipo 3 de trombospondina, y dominios similares a EGF en una manera apropiada para los propósitos anteriores.

Cuando las regiones variables de cadena pesada producidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria y las regiones variables de cadena ligera en las cuales por lo menos se ha introducido un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion se combinan como se describe anteriormente, las secuencias de las regiones variables de cadena ligera pueden diseñarse para contener residuos flexibles de la misma manera como se describe anteriormente. El número y la posición de tales residuos flexibles no están limitados particularmente a las modalidades particulares, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las condiciones de concentración de ion. Específicamente, las secuencias de CDR y/o las secuencias de FR de cadena pesada y/o de cadena ligera pueden contener uno o más residuos flexibles. Cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, los ejemplos no limitantes de los residuos flexibles que se introducirán en la secuencia de región variable de cadena ligera incluyen los residuos de aminoácidos enumerados en las Tablas 1 y 2.

Las regiones variables de cadena pesada preferidas que se combinarán incluyen, por ejemplo, bibliotecas de región variable seleccionadas de manera aleatoria. Se combinan los métodos conocidos como sea apropiado para producir una bibliotecas de región variable seleccionadas de manera aleatoria. En una modalidad no limitante de la presente invención, una biblioteca inmune construida basada en los genes de anticuerpos derivada a partir de linfocitos de animales inmunizados con un antígeno específico, pacientes con infecciones, personas con un elevado título de anticuerpo en sangre como un resultado de la vacunación, pacientes con cáncer, o pacientes con enfermedad autoinmune, pueden usarse preferiblemente como una biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria.

En otra modalidad no limitante de la presente invención, una biblioteca sintética producida sustituyendo las secuencias de CDR de genes V en el ADN genómico o genes V reformados funcionales con un conjunto de oligonucleótidos sintéticos que contienen las secuencias que codifican los conjuntos de codones de una longitud apropiada puede también usarse preferiblemente como la biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria. En este caso, puesto que la diversidad de secuencia se observa en la secuencia de CDR3 de cadena pesada, es también posible sustituir la secuencia de CDR3 solamente. Un criterio de dar lugar a la diversidad en los aminoácidos en la región variable de una molécula de unión al antígeno es que la diversidad se da a los residuos de aminoácidos en las posiciones expuestas a la superficie en la molécula de unión al antígeno. La posición expuesta en la superficie se refiere a una posición que se considera puede estar expuesta en la superficie y/o está en contacto con un antígeno, basada en la estructura, conjunto de estructuras, y/o estructura modelada de una molécula de unión al antígeno. En general, tales posiciones son las CDR. Preferiblemente, las posiciones expuestas a la superficie son determinadas al usar coordenadas a partir de un modelo tridimensional de una molécula de unión al antígeno al usar un programa de computadora como el programa de Insightll (Accelrys). Las posiciones expuestas en la superficie pueden determinarse al usar los algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). La determinación de las posiciones expuestas a la superficie puede realizarse al usar el software adecuado para el modelado de proteína e información estructural tridimensional obtenida a partir de un anticuerpo. El software que puede usarse para estos propósitos preferiblemente incluye el software SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Generalmente o preferiblemente, cuando un algoritmo requiere a un usuario introducir el parámetro de tamaño, el "tamaño" de una sonda que se usa en el cálculo se establece a aproximadamente 1.4 Angstrom o más pequeño en radio. Además, los métodos para determinar regiones y áreas expuestas a la superficie al usar el software para las computadoras personales se describen por Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

En otra modalidad no limitante de la presente invención, una biblioteca sin tratamiento, que se construye a partir de los genes de anticuerpos derivados de los linfocitos de personas sanas y cuyo repertorio consiste de las secuencias sin tratamiento, que son secuencias de anticuerpos sin desviación, puede también usarse particularmente de manera preferible como una biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). En la presente, una secuencia de aminoácido que comprende una secuencia sin tratamiento se refiere a una secuencia de aminoácido obtenida a partir de tal biblioteca sin tratamiento.

En una modalidad de la presente invención, un dominio de unión al antígeno de la presente invención puede obtenerse de una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión al antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí, preparadas combinando las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria con una región variable de cadena pesada seleccionada como una secuencia estructural que contiene originalmente "por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion". Cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, los ejemplos no limitantes de tales bibliotecas incluyen preferiblemente las construidas combinando las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria con la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 10 (6RL#9-lgG1) o la SEC ID NO: 11 (6KC4-1#85-lgG1). Alternativamente, tal biblioteca puede construirse seleccionando las regiones variables de cadena ligera apropiadas de las que tienen las secuencias de línea germinal, en vez de las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria. Tales bibliotecas preferidas incluyen, por ejemplo, aquellas en las cuales la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 10 (6RL#9-lgG1) o la SEC ID NO: 11 (6KC4-1#85-lgG1) se combina con las regiones variables de cadena ligera que tienen las secuencias de línea germinal.

Alternativamente, la secuencia de una región variable de cadena pesada seleccionada como secuencia estructural que contenga originalmente "por lo menos un residuo de aminoácido que altere la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion" como se menciona anteriormente puede diseñarse para contener los residuos flexibles. El número y la posición de los residuos flexibles no están particularmente limitados, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las condiciones de concentración de ion. Específicamente, las secuencias de CDR y/o de FR de cadena pesada y/o de cadena ligera pueden contener uno o más residuos flexibles. Cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, los ejemplos no limitantes de los residuos flexibles que se introducirán en la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 10 (6RL#9-lgG1) incluyen todos los residuos de aminoácidos de las CDR1 y CDR2 de cadena pesada y los residuos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada excepto aquellos en las posiciones 95, 96, y/o 100a. Alternativamente, los ejemplos no limitantes de los residuos flexibles que se introducirán en la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 11 (6KC4-1#85-lgG1 ) incluyen todos los residuos de aminoácidos de las CDR1 y CDR2 de cadena pesada y los residuos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada excepto aquellos en las posiciones 95 y/o 101 del aminoácido.

Alternativamente, una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión al antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí puede ser construida combinando las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria o regiones variables de cadena ligera que tienen secuencias de línea germinal con las regiones variables de cadena pesada en las cuales "por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion" se ha introducido como se menciona anteriormente. Cuando la concentración de ion es la concentración de ion calcio, los ejemplos no limitantes de tales bibliotecas incluyen preferiblemente aquellas en las cuales las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria o las regiones variables de cadena ligera que tienen secuencias de línea germinal se combinan con la secuencia de una región variable de cadena pesada en la cual unos residuos particulares se han sustituido con por lo menos un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio. Los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos incluyen los residuos de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada. Ejemplos adicionales no limitantes de tales residuos de aminoácidos incluyen residuos de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada. Además, los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos también incluyen los residuos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada. Los ejemplos no limitantes de tales residuos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada incluyen los aminoácidos de las posiciones 95, 96, 100a, y/o 101 en la CDR3 de región variable de cadena pesada como se indica por la numeración de Kabat. Además, estos residuos de aminoácidos pueden contenerse solos o en combinación, siempre y cuando formen un motivo de unión al calcio y/o la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno varíe dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio.

Cuando las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria o las regiones variables de cadena ligera que tienen la secuencia de línea germinal se combinan con una región variable de cadena pesada en la cual por lo menos se ha introducido un residuo de aminoácido que altera la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion como se menciona anteriormente, la secuencia de la región variable de cadena pesada puede también diseñarse para contener residuos flexibles de la misma manera como se describe anteriormente. El número y la posición de los residuos flexibles no están particularmente limitados, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las condiciones de concentración de ion. Específicamente, las secuencias de CDR y/o de FR de cadena pesada pueden contener uno o más residuos flexibles. Además, las bibliotecas de secuencia de región variable seleccionadas de manera aleatoria pueden usarse preferiblemente como secuencias de aminoácidos de CDR1, de CDR2, y/o de CDR3 de la región variable de cadena pesada con excepción de los residuos de aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion. Cuando la secuencias de línea germinal se usa como las regiones variables de cadena ligera, los ejemplos no limitantes de tales secuencias incluyen los de la SEC ID NO. 6 (Vk1), SEC ID NO: 7 (Vk2), SEC ID NO: 8 (Vk3), y SEC ID NO: 9 (Vk4).

Cualquiera de los aminoácidos descritos antes que alteran la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de ion calcio pueden usarse preferiblemente, siempre y cuando formen un motivo de unión al calcio. Específicamente, tales aminoácidos incluyen aminoácidos donadores de electrón. Los ejemplos preferidos de tales aminoácidos donadores de electrón incluyen, serina, treonina, asparagina, ácido glutámico, ácido aspártico, y ácido glutámico.

Condición de las concentraciones de iones de hidrógeno En una modalidad de la presente invención, la condición de las concentraciones de iones se refiere a la condición de las concentraciones de iones de hidrógeno o de la condición del pH. En la presente invención, la concentración de protón, Es decir, el núcleo del átomo de hidrógeno, se trata como sinónimo con el índice de hidrógeno (pH). Cuando la actividad del ion de hidrógeno en una solución acuosa se representa como aH + , el pH se define como -log10aH + . Cuando la fuerza iónica de la solución acuosa es menor (por ejemplo, menor de 10"3), aH+ es casi igual a la fuerza del ion de hidrógeno. Por ejemplo, el producto iónico del agua a 25°C y 1 atmósfera es Kw=aH + aOH = 10"14, y por lo tanto en agua pura, aH + = aOH = 10"7. En este caso, pH = 7 es neutro; una solución acuosa cuyo pH es menor de 7 es ácida o cuyo pH es mayor de 7 es alcalina.

En la presente invención, cuando la condición del pH se usa como la condición de concentración de ión, las condiciones del pH incluyen condiciones de alta concentración de ion de hidrógeno o bajos pH, Es decir, una condición del intervalo de pH ácido, y condiciones de baja concentración de ion de hidrógeno o altos pH, Es decir, una condición del intervalo de pH neutro. "La actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno contenida en la molécula de unión al antígeno de la presente invención varía dependiendo de la condición del pH" se entiende que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno contenida en una molécula de unión al antígeno varía debido a la diferencia en condiciones de una alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH (un intervalo de pH ácido) y una baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH (un intervalo de pH neutro). Esto incluye, por ejemplo, el caso donde la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es mayor bajo una condición del intervalo de pH neutro que bajo una condición del intervalo del pH ácido y el caso donde la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es mayor bajo una condición del intervalo de pH ácido que bajo una condición del intervalo de pH neutro.

En la presente, el intervalo de pH neutro no está limitado a un valor específico y se selecciona preferiblemente de entre pH 6.7 y de pH 10.0. En otra modalidad, el pH puede seleccionarse de entre pH 6.7 y pH 9.5. En aún otra modalidad, el pH puede seleccionarse de entre pH 7.0 y pH 9.0. En aún otra modalidad, el pH puede seleccionarse de entre pH 7.0 y pH 8.0. En particular, el pH preferido incluye pH 7.4, que está cercano al pH del plasma (sangre) ¡n vivo.

En la presente, un intervalo de pH ácido no está limitado a un valor específico y se selecciona preferiblemente de entre pH 4.0 y pH 6.5. En otra modalidad, el pH puede seleccionarse de entre pH 4.5 y pH 6.5. En aún otra modalidad, el pH puede seleccionarse de entre pH 5.0 y pH 6.5. En aún otra modalidad, el pH puede seleccionarse de entre pH 5.5 y pH 6.5. En particular, el pH preferido incluye el pH 5.8, que está cercano a la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo.

En la presente invención, "la actividad de unión al antígeno bajo una condición de una alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH (un intervalo de pH ácido) es menor que la de bajo una condición de una baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH (un intervalo de pH neutro)" se entiende que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio de la presente invención a un pH seleccionado de entre pH 4.0 y pH 6.5 es más débil que a un pH seleccionado de entre pH 6.7 y pH 10.0; se entiende preferiblemente que la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno comprende el dominio a un pH seleccionado de entre pH4.5 y pH 6.5 es más débil que a un pH seleccionado de entre pH 6.7 y pH 9.5; más preferiblemente, se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a un pH seleccionado de entre pH 5.0 y pH 6.5 es más débil que a un pH seleccionado de entre pH 7.0 y pH 9.0; aún más preferiblemente se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a un pH seleccionado de entre pH 5.5 y pH 6.5 es más débil que a un pH seleccionado de entre pH 7.0 y pH 8.0; se entiende particularmente de manera preferible que la actividad de unión al antígeno al pH en el endosoma temprano in vivo es más débil que la actividad de unión al antígeno al pH del plasma in vivo; y se entiende específicamente que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a pH 5.8 es más débil que la actividad de unión al antígeno a pH 7.4.

Si la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio ha cambiado por la condición del pH puede determinarse, por ejemplo, por el uso de los métodos de medición conocidos como los descritos en la sección "Actividad de Unión" anterior. Por ejemplo, la actividad de unión se midió bajo diferentes condiciones del pH al usar los métodos de medición descritos antes. Por ejemplo, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio se compara bajo las condiciones del intervalo de pH ácido y del intervalo de pH neutro para confirmar que la actividad de unión del dominio o la molécula cambia que es mayor bajo la condición del intervalo de pH neutro que bajo la condición del intervalo de pH ácido.

Además, en la presente invención, la expresión "la actividad de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido, es menor que bajo una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en bajo una condición del intervalo de pH neutro" puede también expresarse como "la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio bajo una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH neutro, es mayor que bajo una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido". En la presente invención, "la actividad de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido, es menor que a bajo una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH neutro" puede describirse como "la actividad de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido, es más débil que la capacidad de unión al antígeno bajo una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH neutro". Alternativamente, "la actividad de unión al antígeno bajo condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido, se reduce que es menor que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH neutro" puede describirse como "la actividad de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido, se reduce que es más débil que la capacidad de unión al antígeno bajo una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH neutro".

Las condiciones con excepción de la concentración de ion de hidrógeno o pH para medir la actividad de unión al antígeno pueden seleccionarse adecuadamente por los expertos en la técnica y no están particularmente limitadas. Las mediciones pueden realizarse, por ejemplo, a 37°C al usar el amortiguador de HEPES. Las mediciones pueden realizarse, por ejemplo, al usar Biacore (GE Healthcare). Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio puede determinarse evaluando la actividad de unión al antígeno soluble vertiendo el antígeno como un analito en una matriz inmovilizada con el dominio de unión al antígeno o la molécula de unión al antígeno que comprende el dominio. Cuando el antígeno es un antígeno de membrana, la actividad de unión al antígeno de membrana puede evaluarse vertiendo el dominio de unión al antígeno o la molécula de unión al antígeno que comprende el dominio como un analito en una matriz inmovilizada con el antígeno.

Siempre y cuando el actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido sea débil que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en la condición del intervalo de pH neutro, la relación de la actividad de unión al antígeno entre la de bajo una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH ácido, y bajo una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, bajo una condición del intervalo de pH neutro no está particularmente limitado, y el valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4), que es la relación de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) para un antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido a la KD a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, es preferiblemente 2 o más; más preferiblemente el valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) es 10 o más; y aún más preferiblemente valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) es 40 o más. El límite superior del valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 400, 1000, o 10000, siempre que la molécula pueda producirse por las técnicas de los expertos en la técnica.

Alternativamente, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) puede usarse adecuadamente como un índice para indicar la relación de la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio de la presente invención que entre una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido y una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro. Cuando se usa la kd (constante de velocidad de disociación) como un índice para indicar la relación de actividad de unión en vez de la KD (constante de disociación), el valor de la kd (en una condición del intervalo de pH ácido)/kd (en una condición del intervalo de pH neutro), que es la relación de la kd (constante de velocidad de disociación) para el antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido a la kd (constante de velocidad de disociación) a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 5 o más, aún más preferiblemente 10 o más, y aún más preferiblemente 30 o más. El límite superior del valor de la kd (en una condición del intervalo de pH ácido)/kd (en una condición del intervalo de pH neutro) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 50, 100, o 200, siempre que la molécula pueda producirse por las técnicas de los expertos en la técnica.

Cuando el antígeno es un antígeno soluble, puede usarse la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) como el valor para la actividad de unión al antígeno y cuando el antígeno es un antígeno de membrana, puede usarse la constante de velocidad de disociación aparente (kd, por sus siglas en inglés). La constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) y la constante de velocidad de disociación aparente (kd, por sus siglas en inglés) pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, y pueden usarse Biacore (GE Healthcare), citómetro de flujo, y similares. En la presente invención, cuando la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio se midió a diferentes concentraciones de iones de hidrógeno, Es decir, los pH, las condiciones con excepción de la concentración de ion de hidrógeno, Es decir, pH, son preferiblemente las mismas.

Por ejemplo, un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido es inferior que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, que es una modalidad proporcionada por la presente invención, puede obtenerse a través de la evaluación de los dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno, que comprende las siguientes etapas (a) a (c): (a) obtener la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno en una condición del intervalo de pH ácido; (b) obtener la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno en una condición del intervalo de pH neutro; y (c) seleccionar un dominio de. unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido es inferior que en la condición del intervalo de pH neutro.

Alternativamente, un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, es menor que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, que es una modalidad proporcionada por la presente invención, puede obtenerse a través de la evaluación de dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno, o una biblioteca de los mismos, comprende las siguientes etapas (a) a (c): (a) poner en contacto un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno, o una biblioteca del mismo, en una condición del intervalo de pH neutro con un antígeno; (b) colocar en una condición del intervalo de pH ácido el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno unido al antígeno en la etapa (a); y (c) aislar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno disociado en la etapa (b).

Un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido es inferior que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, que es otra modalidad proporcionada por la presente invención, puede obtenerse a través de la evaluación de los dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno, o una biblioteca de los mismos, comprende las siguientes etapas (a) a (d): (a) poner en contacto en una condición del intervalo de pH ácido un antígeno con una biblioteca de dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno; (b) seleccionar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) permitir que el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno seleccionado en la etapa (b) se una con el antígeno en una condición del intervalo de pH neutro; y (d) aislar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno unido al antígeno en la etapa (c).

Un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, es menor que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, que es incluso otra modalidad proporcionada por la presente invención, puede obtenerse por un método de evaluación que comprende las siguientes etapas (a) a (c): (a) poner en contacto en una condición del intervalo de pH neutro con una biblioteca de dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno con una columna inmovilizada con un antígeno; (b) eluir en una condición del intervalo de pH ácido de la columna el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno unido a la columna en la etapa (a); y (c) aislar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno eluido en la etapa (b).

Un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, es inferior que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del Intervalo de pH neutro, que sigue siendo otra modalidad proporcionada por la presente invención, puede obtenerse por un método de evaluación que comprende las siguientes etapas (a) a (d): (a) permitir que, en una condición del intervalo de pH ácido, una biblioteca de dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno pase una columna inmovilizada con un antígeno; (b) recolectar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno eluido sin unir a la columna en la etapa (a); (c) permitir que el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antfgeno recolectado en la etapa (b) se una con el antígeno en una condición del intervalo de pH neutro; y (d) aislar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno unido al antígeno en la etapa (c).

Un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, es menor que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, que es aún otra modalidad proporcionada por la presente invención, puede obtenerse por un método de evaluación que comprende las siguientes etapas (a) a (d): (a) poner en contacto un antígeno con una biblioteca de dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno en una condición del intervalo de pH neutro; (b) obtener el dominio de unión al antígeno o el anticuerpo unida al antígeno en la etapa (a); (c) colocar en una condición del intervalo de pH ácido el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno obtenido en la etapa (b); y (d) aislar el dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en la etapa (c) es más débil que el criterio para la selección en la etapa (b).

Las etapas descritas antes pueden repetirse dos veces o más veces. Así, la presente invención proporciona dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en una condición del intervalo de pH ácido es inferior que a una condición del intervalo de pH neutro, que son obtenidos por un método de evaluación que comprende además las etapas de repetir las etapas (a) a (c) o (a) a (d) en los métodos de evaluación descritos antes. El número de veces que las etapas (a) a (c) o (a) a (d) se repite no está particularmente limitado; sin embargo, el número es 10 o menor en general.

En los métodos de evaluación de la presente invención, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en un intervalo de pH ácido, no está particularmente limitada, siempre y cuando sea la actividad de unión al antígeno a un pH de entre 4.0 y 6.5, e incluye la actividad de unión al antígeno a un pH de entre 4.5 y 6.6 como el pH preferido. La actividad de unión al antígeno también incluye que a un pH de entre 5.0 y 6.5, y que a un pH de entre 5.5 y 6.5 como otro pH preferido. La actividad de unión al antígeno también incluye que en el pH en el endosoma temprano in vivo como el pH más preferido, y específicamente, que en pH 5.8. Mientras tanto, la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en un intervalo de pH neutro, no está particularmente limitada, siempre y cuando sea la actividad de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y 10, e incluye la actividad de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y 9.5 como el pH preferido. La actividad de unión al antígeno también incluye que a un pH de entre 7.0 y 9.5 y que a un pH de entre 7.0 y 8.0 como otro pH preferido. La actividad de unión al antígeno también incluye que en el pH del plasma in vivo como el pH más preferido, y específicamente, que a pH 7.4.

La actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno puede medirse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica pueden determinar adecuadamente las condiciones con excepción de la concentración de calcio ionizado. La actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno puede determinarse basada en la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés), la constante de disociación aparente (kd, por sus siglas en inglés), la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés), la constante de velocidad de disociación aparente (kd, por sus siglas en inglés), y similares. Éstas pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando Biacore (GE Healthcare), diagrama de Scatchard, o FACS.

En la presente, la etapa de seleccionar un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, es mayor que a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, es sinónimo con la etapa de seleccionar un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, es inferior que a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro.

Siempre y cuando la actividad de unión al antígeno a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, sea mayor que a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, la diferencia entre la actividad de unión al antígeno a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, una condición del intervalo de pH neutro, y que a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, una condición del intervalo de pH ácido, no está particularmente limitada; sin embargo, la actividad de unión al antígeno a una condición de baja concentración de ion de hidrógeno o alto pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, es preferiblemente dos veces o más, preferiblemente 10 veces o más, y aún más preferiblemente 40 veces o más que a una condición de alta concentración de ion de hidrógeno o bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido.

Aminoácidos que alteran la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno que dependen de las condiciones de concentración de ion de hidrógeno El dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno de la presente invención que se evaluará por los métodos de evaluación descritos antes puede prepararse de cualquier manera. Por ejemplo, las moléculas de unión al antígeno convencionales, bibliotecas convencionales (biblioteca de bacteriófago, etc.), anticuerpos o bibliotecas preparadas a partir de células B de animales inmunizados o a partir de hibridomas obtenidos inmunizando los animales, los anticuerpos o las bibliotecas (bibliotecas con contenido aumentado de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, bibliotecas introducidas con aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o mutaciones de aminoácidos no naturales en las posiciones especificas, etc.) obtenidos introduciendo aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o mutaciones de aminoácidos no naturales en los anticuerpos o las bibliotecas descritas antes pueden usarse.

Los métodos para obtener un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una baja concentración de ion de hidrógeno o mayor pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH neutro, es mayor que a una alta concentración de ion de hidrógeno o un bajo pH, Es decir, en una condición del intervalo de pH ácido, a partir de los dominios de unión al antfgenos o moléculas de unión al antígeno preparados aplicación de los hibridomas obtenidos inmunizando animales o a partir de células B de animales inmunizados incluyen preferiblemente, por ejemplo, la molécula de unión al antígeno o la molécula de unión al antígeno en la cual por lo menos uno de los aminoácidos del dominio de unión al antígeno o la molécula de unión al antígeno se sustituye con un aminoácido con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o una mutación de aminoácido no natural, o el dominio de unión al antígeno o la molécula de unión al antígeno insertada con un aminoácido con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácido no natural, como los descritos en el documento WO 2009/125825.

Los sitios para introducir mutaciones de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o de aminoácidos no naturales están particularmente limitados, y pueden ser cualquier posición siempre y cuando la actividad de unión al antígeno en un intervalo de pH ácido llegue a ser más débil que en un intervalo de pH neutro (valor de KD (en un intervalo de pH ácido)/KD (en una intervalo de pH neutro) o kd (en un intervalo de pH ácido)/kd (en una intervalo de pH neutro) se aumenta) en comparación con antes de la sustitución o la inserción. Por ejemplo, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, la región variable de anticuerpo y las CDR son adecuados. Los expertos en la técnica pueden determinar apropiadamente el número de aminoácidos que se sustituirán con o el número de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales que se insertarán. Es posible sustituir con un simple aminoácido que tiene un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o un simple aminoácido no natural; es posible insertar un simple aminoácido que tiene un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o un simple aminoácido no natural; es posible sustituir con dos o más aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o dos o más aminoácidos no naturales; y es posible insertar dos o más aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o dos o más aminoácidos no naturales. Alternativamente, otros aminoácidos pueden suprimirse, agregarse, insertarse, y/o sustituirse concomitantemente, aparte de la sustitución en los aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o ios aminoácidos no naturales, o la inserción de los aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales. La sustitución en o la Inserción de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o de aminoácidos no naturales puede realizado aleatoriamente por métodos como exploración de histidina, en la cual la alanina de la exploración de alanina conocida por los expertos en la técnica se sustituye con histidina. Las moléculas de unión al antígeno exhibiendo un mayor valor de KD (en un intervalo de pH ácido)/KD (en un intervalo de pH neutro) o kd (en un intervalo de pH ácido)/kd (en un intervalo de pH neutro) en comparación con antes de que la mutación pueda seleccionarse de los dominios o de los anticuerpos de unión al antígenos introducidos con inserciones aleatorias o mutaciones de sustitución de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales.

Los ejemplos preferidos de moléculas de unión al antígeno que contienen la mutación en los aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o los aminoácidos no naturales como se describe anteriormente y cuya actividad de unión al antígeno en un intervalo de pH ácido son menores que en un intervalo de pH neutro incluye, moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro después de la mutación en los aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales es comparable con la de antes de la mutación en los aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales. En la presente, "una molécula de unión al antígeno después de la mutación con aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales tienen una actividad de unión al antígeno comparable con la de antes de la mutación con aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales" significan que, cuando se toma la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno antes de la mutación con aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales como 100%, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno después de la mutación con aminoácidos que tienen un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales es por lo menos 10% o más, preferiblemente 50% o más, preferiblemente 80% o más, y aún preferiblemente 90% o más. La actividad de unión al antígeno después de la mutación de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales a pH 7.4 puede ser mayor que la de antes de la mutación de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o de aminoácidos no naturales a pH 7.4. Si la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es disminuida debido a la inserción de o a la sustitución en aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, la actividad de unión al antígeno puede hacerse para ser comparable con la de antes de la inserción de o de la sustitución en aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, introduciendo una sustitución, una supresión, una adición, y/o una inserción de uno o más aminoácidos de la molécula de unión al antígeno. La presente invención también incluye moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión se ha ajustado para ser comparable mediante sustitución, supresión, adición, y/o inserción de uno o más aminoácidos después de la sustitución o la inserción de aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0- 8.0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales.

En una modalidad de la presente invención, una biblioteca que contiene múltiples dominios de unión al antígeno o moléculas de unión al antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí pueden también construirse combinando las regiones variables de cadena pesada, producidas como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria, con regiones variables de cadena ligera introducidas con "por lo menos un residuo de aminoácido que cambie la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno dependiendo de la condición de concentración de ion de hidrógeno".

Tales residuos de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, residuos de aminoácidos contenidos en la CDR1 de cadena ligera. Los residuos de aminoácidos también incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, residuos de aminoácidos contenidos en la CDR2 de cadena ligera. Los residuos de aminoácidos también incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, residuos de aminoácidos contenidos en la CDR3 de cadena ligera.

Los residuos de aminoácidos descritos antes contenidos en la CDR1 de cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, residuos de aminoácidos de las posiciones 24, 27, 28, 31, 32, y/o 34 de acuerdo la numeración de Kabat en la CDR1 de la región variable de cadena ligera. Mientras tanto, los residuos de aminoácidos contenidos en la CDR2 de cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, residuos de aminoácidos de las posiciones 50, 51, 52, 53, 54, 55, y/o 56 de acuerdo la numeración de Kabat en la CDR2 de región variable de cadena ligera. Además, los residuos de aminoácidos en la CDR3 de cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, residuos de aminoácidos de las posiciones 89, 90, 91, 92, 93, 94, y/o 95A de acuerdo la numeración de Kabat en la CDR3 de región variable de cadena ligera. Por otra parte, los residuos de aminoácidos pueden contenerse solos o pueden contenerse en combinación de dos o más aminoácidos, siempre y cuando permitan el cambio en la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de la condición de concentración de ion de hidrógeno.

Incluso cuando la región variable de cadena pesada producida como una biblioteca de secuencia de región variable seleccionada de manera aleatoria se combina con la región variable de cadena ligera descrita antes introducida con "por lo menos un residuo de aminoácido que cambie la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno dependiendo de la condición de concentración de ion de hidrógeno", es posible diseñar de manera que los residuos flexibles se contengan en la secuencia de la región variable de cadena ligera de la misma manera como se describe anteriormente. El número y la posición de los residuos flexibles no están limitados particularmente a una modalidad específica, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno de la presente invención cambia dependiendo de la condición de concentración de ion de hidrógeno. Específicamente, las secuencias de CDR y/o de FR de cadena pesada y/o de cadena ligera pueden contener uno o más residuos flexibles. Por ejemplo, los residuos flexibles que se introducirán en las secuencias de las regiones variables de cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, los residuos de aminoácidos enumerados en las Tablas 3 y 4. Mientras tanto, las secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera con excepción de los residuos flexibles y de los residuos de aminoácidos que cambian la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno dependiendo de la condición de concentración de ion de hidrógeno adecuadamente incluyen, pero no se limitan a, secuencias de línea germinal como Vk1 (SEC ID NO: 6), Vk2 (SEC ID NO: 7), Vk3 (SEC ID NO: 8), y Vk4 (SEC ID NO: 9).

[Tabla 3] posición indica la numeración de Kabat) [Tabla 4] posición indica la numeración de Kabat) Cualquier residuo de aminoácido puede usarse adecuadamente como los residuos de aminoácidos descritos antes que cambian la actividad de unión al antígeno de un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno dependiendo de la condición de concentración de ion de hidrógeno. Específicamente, tales residuos de aminoácidos incluyen aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4.0-8.0. Tales aminoácidos liberadores de electrones incluyen preferiblemente, por ejemplo, los aminoácidos que ocurren naturalmente como histidina y ácido glutámico, así como aminoácidos no naturales como análogos de histidina (US20090035836), m-N02-Tyr (pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7.21), y 3,5-l2-Tyr (pKa 7.38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Los residuos de aminoácidos particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 6.0-7.0. Tales residuos de aminoácidos liberadores de electrones incluyen preferiblemente, por ejemplo, histidina.

La región variable de cadena pesada preferida que se usa en combinación incluye, por ejemplo, bibliotecas de secuencia de región variable seleccionadas de manera aleatoria. Se combinan los métodos conocidos apropiadamente como un método para producir una biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria. En una modalidad no limitante de la presente invención, una biblioteca inmune construida basada en los genes de anticuerpos derivados de los animales inmunizados con antígenos específicos, pacientes con infección o personas con un título elevado de anticuerpo en sangre como un resultado de la vacunación, pacientes con cáncer, o linfocitos de enfermedades autoinmunes pueden usarse adecuadamente como bibliotecas de región variable seleccionadas de manera aleatoria.

En otra modalidad no limitante de la presente invención, de la misma manera como se describe anteriormente, una biblioteca sintética en la cual las secuencias de CDR de genes V a partir del ADN genómico o genes V reconstruidos funcionales se sustituyen con un conjunto de oligonucleótidos sintéticos que contienen las secuencias que codifican los conjuntos de codones de una longitud apropiada puede también usarse adecuadamente como la biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria. En este caso, la secuencia de CDR3 solamente puede sustituirse debido a que se observa la variedad en la secuencia de gen de la CDR3 de cadena pesada. La base para dar lugar a variaciones de aminoácidos en la región variable de una molécula de unión al antígeno es generar variaciones de residuos de aminoácidos de posiciones expuestas en la superficie de la molécula de unión al antígeno. La posición expuesta en la superficie se refiere a una posición donde un aminoácido se expone en la superficie y/o se pone en contacto con un antígeno basado en la conformación, conjunto estructural, y/o la estructura modelada de una molécula de unión al antígeno, y en general, tales posiciones son las CDR. Las posiciones expuestas en la superficie son preferiblemente determinadas al usar las coordenadas derivadas a partir de un modelo tridimensional de la molécula de unión al antígeno al usar programas de computadora como el programa Insightll (Accelrys). Las posiciones expuestas en la superficie pueden determinarse al usar los algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Las posiciones expuestas en la superficie pueden determinarse en base a la información sobre la estructura tridimensional de anticuerpos al usar el software adecuado para el modelado de proteínas. El software que se usa adecuadamente con este fin incluye el software del módulo de biopolímero de SYBYL (Tripos Associates). Cuando el algoritmo requiere el parámetro de tamaño de entrada del usuario, el "tamaño" de la sonda para el uso en la computación está generalmente o preferiblemente indicado a aproximadamente 1.4 angstrom o menos en radio. Además, un método para determinar la región expuesta en la superficie y el área al usar software de la PC se describe por Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; y J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

En aún otra modalidad no limitante de la presente invención, una biblioteca sin tratamiento construida de genes de anticuerpos derivados de linfocitos de personas sanas y que consiste de las secuencias sin tratamiento, que son el repertorio imparcial de las secuencias de anticuerpos, puede también usarse particularmente de manera adecuada como una biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); y Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).

FcRn A diferencia del receptor Fcy que pertenece a la superfamilia de la inmunoglobulina, el FcRn humano es estructuralmente similar a los polipéptidos de la clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC, por sus siglas en inglés), que exhibe 22% a 29% de identidad de la secuencia a moléculas de clase I del MHC (Ghetie el al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn se expresa como un heterodímero que consiste de ß soluble o la cadena ligera (microglobulina ß2) formada en complejo con la transmembrana a o la cadena pesada. Como MHC, la cadena a de FcRn comprende tres dominios extracelulares (a1, a2, y a3) y su corto dominio citoplásmico ancla la proteína sobre la superficie celular. Los dominios a1 y a2 interactúan con el dominio de unión a FcRn de la región Fe de anticuerpo (Raghavan er a/., Immunity (1994) 1: 303-315).

FcRn es expresado en la placenta maternal y el saco de York de mamíferos, y está implicado en la transferencia de IgG madre-a-feto. Además, en el intestino delgado neonatal de roedores, donde se expresa FcRn, FcRn está implicado en la transferencia de IgG maternal a través del epitelio de borde en cepillo del colostro injerido o la leche. El FcRn se expresa en una variedad de otros tejidos y sistemas de células endoteliales de varias especies. El FcRn también se expresa en endotelio humano adulto, vasos sanguíneos musculares, y capilares sinusoidales hepáticos. El FcRn se cree para desempeñar un papel en mantener la concentración de IgG en plasma mediante reciclaje por mediación de IgG a suero sobre unión a IgG. Comúnmente, la unión al FcRn a moléculas de IgG es estrictamente dependiente del pH. Se observa la unión óptima en una condición del intervalo de pH ácido por debajo de 7.0.

El FcRn humano cuyo precursor es un polipéptido que tiene la secuencia de señal de la SEC ID NO: 12 (el polipéptido con la secuencia de señal se muestra en la SEC ID NO: 13) forma un complejo con la p2-microglobulina humana in vivo. El FcRn humano soluble formado en complejo con la 2-microglobulina es producido al usar técnicas de expresión recombinantes convencionales. El dominio de unión a FcRn de la presente invención pueden evaluarse por su actividad de unión a tal FcRn humano soluble formado en complejo con la p2-microglobulina. En la presente, salvo se especifique lo contrario, el FcRn humano se refiere a una forma capaz de unir a un dominio de unión a FcRn de la presente invención. Los ejemplos incluyen un complejo entre el FcRn humano y la 2-microglobulina humana. La actividad de unión de un dominio de unión a FcRn o molécula de unión al antíaeno que comprende el dominio a FcRn, FcRn humano en particular La actividad de unión de un dominio de unión de FcRn contenido en una molécula de unión al antígeno proporcionado por la presente invención a FcRn, FcRn humano en particular, puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, como se describe en la sección "Actividad de unión" antes. Los expertos en la técnica pueden determinar apropiadamente las condiciones con excepción del pH. La actividad de unión del dominio de unión al antígeno o la molécula de unión al antígeno que comprende el dominio a FcRn humano puede evaluarse basada en la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés), constante de disociación aparente (KD, por sus siglas en inglés), velocidad de disociación (kd), velocidad de disociación aparente (kd aparente), y similares. Éstas pueden medirse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse Biacore (GE Healthcare), diagrama de Scatchard, o citómetro de flujo.

Cuando se mide la actividad de unión a FcRn de un dominio de unión a FcRn o molécula de unión el antígeno que comprende el dominio de la presente invención, las condiciones con excepción del pH no están particularmente limitadas, y pueden seleccionarse apropiadamente por los expertos en la técnica. Las mediciones pueden realizarse, por ejemplo, en una concentración de 37°C al usar el amortiguador de MES, como se describe en el documento WO 2009/125825. Alternativamente, la actividad de unión a FcRn de un dominio de unión a FcRn o molécula de unión el antígeno que comprende el dominio de la presente invención puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, y puede medirse al usar, por ejemplo, Biacore (GE Healthcare) o similares. La actividad de unión de un dominio de unión a FcRn o molécula de unión el antígeno que comprende el dominio de la presente invención a FcRn puede evaluarse mediante vertido, como un analito, FcRn humano, o un dominio de unión a FcRn o una molécula de unión al antígeno que comprende el dominio en una matriz inmovilizada con un dominio de unión a FcRn o molécula de unión al antígeno que comprende el dominio, o FcRn humano.

En la presente invención, el intervalo de pH ácido presentado como la condición para tener actividad de unión entre FcRn y una molécula de unión al antígeno de la presente invención o dominio de unión a FcRn en la molécula se refiere generalmente de pH 4.0 a pH 6.5. Se refiere preferiblemente de pH 5.5 a pH 6.5, y particularmente se refiere preferiblemente de pH 5.8 a pH 6.0 que está cercano al pH en un endosoma temprano ¡n vivo. El intervalo de pH neutro presentado como la condición para tener actividad de unión entre FcRn y una molécula de unión al antígeno de la presente invención o un dominio de unión a FcRn incluido en tal molécula se refiere generalmente de pH 6.7 a pH 10.0. El intervalo pH neutro es preferiblemente un intervalo indicado por cualquier valor de pH de pH 7.0 a pH 8.0, y se selecciona preferiblemente de pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, y 8.0, y es particularmente de manera preferible pH 7.4 que está cercano al pH en plasma (en sangre) in vivo. Cuando la evaluación de la afinidad de unión entre FcRn humano y un dominio de unión a FcRn humano o una molécula de unión al antígeno que contiene este dominio a pH 7.4 es difícil debido a la baja afinidad de unión, el pH 7.0 puede usarse en vez de pH 7.4. Mientras que la temperatura que se usará en las condiciones de ensayo, la afinidad de unión entre un FcRn humano y un dominio de unión a FcRn o molécula de unión el antígeno que comprende el dominio puede evaluarse a cualquier temperatura de 10°C a 50°C. Preferiblemente, una temperatura de 15°C a 40°C se usa para determinar la afinidad de unión entre un FcRn humano y un dominio de unión a FcRn o una molécula de unión el antígeno que comprende el dominio. Más preferiblemente, cualquier temperatura de 20°C a 35°C como cualquiera de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, y 35°C también se usa igualmente para determinar la afinidad de unión entre un dominio de unión a FcRn humano o una molécula de unión el antígeno que comprende el dominio y el FcRn humano. Una temperatura de 25°C es un ejemplo no limitante de una modalidad de la presente invención.

Dominio de unión a FcRn Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención tienen un dominio de unión a FcRn que tiene una actividad de unirse a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. El dominio de unión a FcRn no está particularmente limitado siempre que las moléculas de unión al antígeno tengan una actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH ácido, y pueda ser un dominio que tiene actividad de unión directa o indirecta a FcRn. Los ejemplos preferidos de tal dominio de unión a FcRn incluyen la región Fe de inmunoglobulina de IgG, albúmina, el dominio de albúmina 3, anticuerpo anti-FcRn descrito en Christianson et al. (mAbs (2012) 4 (2), 208-216), péptido anti-FcRn descrito en el documento WO 2007/098420, molécula de andamio anti-FcRn, y similares que tienen una actividad de unirse directamente a FcRn, o moléculas que unen a IgG o albúmina, y similares que tienen una actividad de unirse indirectamente a FcRn. Si el dominio tiene ya actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH ácido, puede usarse preferiblemente tal como está. Si el dominio no tiene ni tendrá actividad de unión a FcRn débil en un intervalo de pH ácido, los aminoácidos que constituyen un dominio de unión a FcRn en la molécula de unión al antígeno pueden alterarse para conferir actividad de unión a FcRn. Alternativamente, los aminoácidos pueden alterarse en un dominio ya que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH ácido para aumentar la actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH ácido. Para la alteración del aminoácido del dominio de unión a FcRn, la alteración de interés puede ser identificada comparando las actividades de unión a FcRn en un intervalo de pH ácido antes y después de la alteración de aminoácido.

Región Fe Una región Fe contiene la secuencia de aminoácido derivada de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo. Una región Fe es una porción de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo, a partir del extremo N terminal de la región de bisagra, que corresponde al sitio de división de papaína en un aminoácido alrededor de la posición 216 de acuerdo con el sistema de numeración de EU, y contiene la bisagra, los dominios CH2, y CH3. Mientras que la región Fe puede obtenerse a partir de la lgG1 humana, no se limita a una subclase particular de IgG. Los ejemplos de una modalidad no limitante de la región Fe incluyen las regiones Fe de la IgG 1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 (SEC ID NO: 17).

Dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido Como se describe anteriormente, en una modalidad no limitante de la presente invención, una región Fe de una ¡nmunoglobulina de IgG humana se usa como el dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Una región Fe original que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido puede usarse como tal como está para este dominio, y los ejemplos de tales regiones Fe incluyen las regiones Fe de las IgG humanas (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4, y variantes de las mismas). Cuando una región Fe tiene débil o ninguna actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, las regiones Fe que tiene actividad de unión a FcRn deseada pueden obtenerse alterando los aminoácidos de la región Fe. Alternativamente, las regiones Fe que tienen actividad de unión a FcRn deseada o mejorada bajo una condición del intervalo de pH ácido pueden obtenerse adecuadamente alterando los aminoácidos en la región Fe. Las alteraciones de aminoácidos de una región Fe que dé lugar a tal actividad de unión deseada pueden determinarse comparando la actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido antes y después de la alteración del aminoácido. Por ejemplo, tales alteraciones de aminoácidos pueden determinarse por los métodos descritos en la sección anteriormente mencionada "Actividad de unión de un dominio de unión a FcRn o de una molécula de unión al antígeno que comprende el dominio a FcRn, FcRn humano en particular".

Las alteraciones de la región Fe que mejoran actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido se presentan abajo como ejemplos de una modalidad no limitante de tales alteraciones. Las regiones Fe preferidas (que comienzan las regiones Fe) de una inmunoglobulina tipo IgG para la alteración incluyen, por ejemplo, aquellas de las IgG humanas (lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4, y variantes de las mismas). El origen de iniciar las regiones Fe no está limitado, y pueden obtenerse a partir de humano o de cualquiera de organismos no humanos. Tales organismos incluyen preferiblemente ratones, ratas, conejillos de Indias, hámsteres, jerbos, gatos, conejos, perros, cabras, ovejas, bovinos, caballos, camellos y organismos seleccionados de primates no humanos. En otra modalidad, la iniciación de las regiones Fe puede también obtenerse de monos, titis, macacos de la India, chimpancés, o humanos. La iniciación de regiones Fe puede obtenerse preferiblemente a partir de la lgG1 humana; sin embargo, no se limitan a ninguna de las subclases de IgG particulares. Esto significa que una región Fe representada por la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 (SEC ID NO: 17) puede usarse apropiadamente como una región Fe de inicio, y en la presente también significan que una región Fe de una clase o subclase de IgG arbitraria derivada de cualquiera de los organismos descritos antes puede usarse preferiblemente como una región Fe de inicio. Los ejemplos de las variantes IgG que ocurren naturalmente o formas modificadas se describen en los documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635; y WO 2006/105338)); sin embargo, no se limitan a los ejemplos.

Los ejemplos de alteraciones incluyen aquéllos con una o más mutaciones, por ejemplo, mutaciones mediante sustitución de diferentes residuos de aminoácidos para aminoácidos de regiones Fe de inicio, mediante inserción de uno o más residuos de aminoácidos en regiones Fe de inicio, o mediante supresión de uno o más aminoácidos a partir de la región Fe de inicio. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de regiones Fe alteradas comprenden por lo menos una parte de la secuencia de aminoácido de una región Fe no nativa. Tales variantes tienen necesariamente identidad o semejanza de secuencia de menos del 100% a su región Fe de inicio. En una modalidad preferida, las variantes tienen identidad o semejanza de secuencia de aminoácido de aproximadamente 75% menos de 100%, más preferiblemente de aproximadamente 80% menos de 100%, más preferiblemente de aproximadamente 85% menos a de 100%, aún más preferiblemente de aproximadamente 90% menos de 100%, y más preferiblemente de aproximadamente 95% menos de 100% a la secuencia de aminoácido de su región Fe de inicio. En una modalidad no limitante de la presente invención, por lo menos un aminoácido es diferente entre una región Fe modificada de la presente invención y su región Fe de inicio. La diferencia del aminoácido entre una región Fe modificada de la presente invención y su región Fe de inicio puede también preferiblemente especificarse basada en diferencias del aminoácido en las posiciones de aminoácidos particulares descritas antes de acuerdo con la numeración de EL).

Mientras que la región Fe tenga una actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido o pueda aumentar la actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, los aminoácidos en cualquier posición pueden modificarse en otros aminoácidos. Cuando la molécula de unión al antígeno de la presente invención contiene la región Fe de la IgG 1 humana como el dominio de unión a FcRn, es preferible que la región Fe resultante contenga una modificación que da lugar en el efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de la IgG 1 humana de inicio. Los aminoácidos que dejan tal modificación incluyen, por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433, y/o 434 de acuerdo con la numeración de EU, y sus aminoácidos de combinación en las posiciones 253, 310, 435, y/o 426 como se describe en el documento WO 1997/034631. Los ejemplos favorables incluyen aminoácidos en las posiciones 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, y/o 447 como se indica por la numeración de UE como se describe en el documento WO2000/042072. Similarmente, los ejemplos favorables de aminoácidos que dejan tales modificaciones incluyen, aminoácidos en las posiciones 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434, y/o 436 de acuerdo con la numeración de UE como se describe en el documento WO2002/060919. Además, los aminoácidos que dejan tales modificaciones incluyen, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones 250, 314, y 428 de acuerdo con la numeración de UE como se describe en el documento WO2004/092219. Además, los aminoácidos que dejan tal modificación incluyen, por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones 250, 314, y 428 de acuerdo con la numeración de EU como se describe en el documento WO2004/092219. Además, los ejemplos favorables de aminoácidos que dejan tal modificación incluyen los aminoácidos en las posiciones 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440, y/o 442 como se describe en el documento WO 2006/020114. Además, los ejemplos favorables de aminoácidos que dejan tal modificación incluyen los aminoácidos en las posiciones 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434, y/o 436 de acuerdo con la numeración de EU como se describe en el documento WO 2010/045193. La modificación de estos aminoácidos mejora la unió a FcRn de la región Fe de una inmunoglobulina tipo IgG bajo una condición del intervalo de pH ácido.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugarda en el efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana incluye por lo menos una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: Arg o Leu para el aminoácido en la posición 251; Phe, Ser, Thr, o Tyr para el aminoácido en la posición 252; Ser o Thr para el aminoácido en la posición 254; Arg, Gly, Me, o Leu para el aminoácido en la posición 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, o Thr para el aminoácido en la posición 256; lie o Thr para el aminoácido en la posición 308; Pro para el aminoácido en la posición 309; Glu, Leu, o Ser para el aminoácido en la posición 311; Ala o Asp para el aminoácido en la posición 312; Ala o Leu para el aminoácido en la posición 314; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser, o Thr para el aminoácido en la posición 385; Arg, Asp, lie, Lys, Met, Pro, Ser, o Thr para el aminoácido en la posición 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser, o Thr para el aminoácido en la posición 387; Asn, Pro, o Ser para el aminoácido en la posición 389; Leu, Met, Phe, Ser, o Thr para el aminoácido en la posición 428; Arg, Gln, His, lie, Lys, Pro, o Ser para el aminoácido en la posición 433; His, Phe, o Tyr para el aminoácido en la posición 434; y Arg, Asn, His, Lys, Met, o Thr para el aminoácido en la posición 436, como se indica por la numeración de EU. Mientras tanto, el número de aminoácidos que se modificarán no está particularmente limitado; y el aminoácido puede modificarse en solamente un sitio o los aminoácidos pueden modificarse en dos o más sitios.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión al FcRn, una modalidad no limitante de las modificaciones que da lugarn en el efecto de mejorar la unión a FcRn en una condición del intervalo de pH ácido comparada con la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluyen Me para el aminoácido en la posición 308, Pro para el aminoácido en la posición 309, y/o Glu para el aminoácido en la posición 311 de acuerdo con la numeración de UE. Otra modalidad no limitante de estas modificaciones puede incluir Thr para el aminoácido en la posición 308, Pro para el aminoácido en la posición 309, Leu para el aminoácido en la posición 311, Ala para el aminoácido en la posición 312, y/o Ala para el aminoácido en la posición 314. Además, otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir lie o Thr para el aminoácido en la posición 308, Pro para el aminoácido en la posición 309, Glu, leu, o Ser para el aminoácido en la posición 311, Ala para el aminoácido en la posición 312, y/o Ala o leu para el aminoácido en la posición 314. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Thr para el aminoácido en la posición 308, Pro para el aminoácido en la posición 309, Ser para el aminoácido en la posición 311, Asp para el aminoácido en la posición 312, y/o Leu para el aminoácido en la posición 314.

Cuando la región Fe de la I g G 1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye Leu para el aminoácido en la posición 251, Tyr para el aminoácido en la posición 252, Ser o Thr para el aminoácido en la posición 254, Arg para el aminoácido en la posición 255, y/o Glu para el aminoácido en la posición 256 de acuerdo con la numeración de EU.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye Leu, Met, Phe, Ser, o Thr para el aminoácido en la posición 428, Arg, Gln, His, Me, Lys, Pro, o Ser para el aminoácido en la posición 433, His, Phe, o Tyr para el aminoácido en la posición 434, y/o Arg, Asn, His, Lys, Met, o Thr para el aminoácido en la posición 436 de acuerdo con la numeración de EU. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir His o Met para el aminoácido en la posición 428, y/o His o Met para el aminoácido en la posición 434.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye Arg para el aminoácido en la posición 385, Thr para el aminoácido en la posición 386, Arg para el aminoácido en la posición 387, y/o Pro para el aminoácido en la posición 389 de acuerdo con la numeración de EU. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Asp para el aminoácido en la posición 385, Pro para el aminoácido en la posición 386, y/o Ser para el aminoácido en la posición 389.

Además, cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana incluye por lo menos una o más modificaciones del aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de: Gln o Glu para el aminoácido en la posición 250; y Leu o Phe para el aminoácido en la posición 428 de acuerdo con la numeración de UE. El número de aminoácidos que se alterarán no está particularmente limitado, y el aminoácido puede modificarse en solamente un sitio o los aminoácidos en pueden modificarse en dos sitios.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye GIn para el aminoácido en la posición 250, y/o Leu o Phe para el aminoácido en la posición 428 de acuerdo con la numeración de EU. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Glu para el aminoácido en la posición 250, y/o Leu o Phe para el aminoácido en la posición 428.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana incluye por lo menos dos o más modificaciones del aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: Asp o Glu para el aminoácido en la posición 251; Tyr para el aminoácido en la posición 252; GIn para el aminoácido en la posición 307; Pro para el aminoácido en la posición 308; Val para el aminoácido en la posición 378; Ala para el aminoácido en la posición 380; Leu para el aminoácido en la posición 428; Ala o Lys para el aminoácido en la posición 430; Ala, His, Ser, y Tyr para el aminoácido en la posición 434; e lie para el aminoácido en la posición 436, como se indica por la numeración de UE. El número de aminoácidos que se modificará no está particularmente limitado, y el aminoácido puede modificarse en solamente dos sitios o los aminoácidos pueden modificarse en tres o más sitios.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye GIn para el aminoácido en la posición 307, y Ala o Ser para el aminoácido en la posición 434 de acuerdo con la numeración de EU. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Pro para el aminoácido en la posición 308, y Ala para el aminoácido en la posición 434. Además, otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Tyr para el aminoácido en la posición 252, y Ala para el aminoácido en la posición 434. Una diferente modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Val para el aminoácido en la posición 378, y Ala para el aminoácido en la posición 434. Otra diferente modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Leu para el aminoácido en la posición 428, y Ala para el aminoácido en la posición 434. Otra diferente modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Ala para el aminoácido en la posición 434, e lie para el aminoácido en la posición 436. Además, otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Pro para el aminoácido en la posición 308, y Tyr para el aminoácido en la posición 434. Además, otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir GIn para el aminoácido en la posición 307, e Me para el aminoácido en la posición 436.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye GIn para el aminoácido en la posición 307, Ala para el aminoácido en la posición 380, y Ser para el aminoácido en la posición 434 de acuerdo con la numeración de EU. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir GIn para el aminoácido en la posición 307, Ala para el aminoácido en la posición 380, y Ala para el aminoácido en la posición 434. Además, otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Tyr para el aminoácido en la posición 252, Pro para el aminoácido en la posición 308, y Tyr para el aminoácido en la posición 434. Una diferente modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Asp para el aminoácido en la posición 251, Gln para el aminoácido en la posición 307, y His para el aminoácido en la posición 434.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana incluyen la modificación de por lo menos dos o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: Leu para el aminoácido en la posición 238; Leu para el aminoácido en la posición 244; Arg para el aminoácido en la posición 245; Pro para el aminoácido en la posición 249; Tyr para el aminoácido en la posición 252; Pro para el aminoácido en la posición 256; Ala, lie, Met, Asn, Ser, o Val para el aminoácido en la posición 257; Asp para el aminoácido en la posición 258; Ser para el aminoácido en la posición 260; Leu para el aminoácido en la posición 262; Lys para el aminoácido en la posición 270; Leu o Arg para el aminoácido en la posición 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, o Tyr para el aminoácido en la posición 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, o Tyr para el aminoácido en la posición 283; Asn para el aminoácido en la posición 285; Phe para el aminoácido en la posición 286; Asn o Pro para el aminoácido en la posición 288; Val para el aminoácido en la posición 293; Ala, Glu, or Met para el aminoácido en la posición 307; Ala, Me, Lys, Leu, Met, Val, or Trp para el aminoácido en la posición 311; Pro para el aminoácido en la posición 312; Lys para el aminoácido en la posición 316; Pro para el aminoácido en la posición 317; Asn o Thr para el aminoácido en la posición 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, or Trp para el aminoácido en la posición 332; Asn, Thr, o Trp para el aminoácido en la posición 339; Pro para el aminoácido en la posición 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, o Tyr para el aminoácido en la posición 343; Arg para el aminoácido en la posición 375; Gly, lie, Met, Pro, Thr, o Val para el aminoácido en la posición 376; Lys para el aminoácido en la posición 377; Asp o Asn para el aminoácido en la posición 378; Asn, Ser, o Thr para el aminoácido en la posición 380; Phe, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, o Tyr para el aminoácido en la posición 382; Asn para el aminoácido en la posición 423; Asn para el aminoácido en la posición 427; Ala, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, o Tyr para el aminoácido en la posición 430; His o Asn para el aminoácido en la posición 431; Phe, Gly, His, Trp, o Tyr para el aminoácido en la posición 434; lie, Leu, o Thr para el aminoácido en la posición 436; Lys, Leu, Thr, o Trp para el aminoácido en la posición 438; Lys para el aminoácido en la posición 440; y Lys para el aminoácido en la posición 442 de acuerdo con la numeración de UE. El número de aminoácidos que se modificarán no está particularmente limitado y el aminoácido en solamente dos sitios puede ser modificado y los aminoácidos en tres o más sitios pueden ser modificados.

Cuando la región Fe de la lgG1 humana se comprende como el dominio de unión a FcRn, una modalidad no limitante de la modificación que da lugar al efecto de mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con respecto a la actividad de unión de la región Fe de inicio de la lgG1 humana puede ser las modificaciones que incluye lie para el aminoácido en la posición 257, e Me para el aminoácido en la posición 311 de acuerdo con la numeración de EL). Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir lie para el aminoácido en la posición 257, y His para el aminoácido en la posición 434. Otra modalidad no limitante de esta modificación puede incluir Val para el aminoácido en la posición 376, y His para el aminoácido en la posición 434.

Receptor Fcv El receptor FCY (FCYR, por sus siglas en inglés) se refiere a un receptor capaz de unirse a la región Fe de los anticuerpos lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4, monoclonales e incluye todos los miembros que pertenecen a la familia de proteínas codificadas sustancialmente por un gen del receptor Fcy. En humanos, la familia incluye el FcyRI (CD64) que incluye las isoformas FcyRIa, FcyRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32) que incluye las isoformas FcyRIIa (que incluye el alotipo H131 y R131), FcyRIIb (que incluye FcyRllb-1 y FcyRllb-2), y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16) que incluye la isoforma FcyRIIIa (que incluye el alotipo V158 y F158) y FcyRIIIb (que incluye el alotipo FcyRlllb-NA1 y FcyRlllb-NA2); así como todas las isoformas FcyRs, FcyR humanas no identificadas, y los alotipos de las mismas. Sin embargo, el receptor Fcy no se limita a estos ejemplos. Sin limitarse a los mismos, el FcyR incluye los derivados de humanos, ratones, ratas, conejos, y monos. El FcyR puede derivarse de cualquier organismo. El FcyR de ratón incluye, sin limitarse a, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), y FcyRIII-2 (FcyRIV, CD16-2), así como todas las ¡soformas FcyRs, FCYR de ratón no identificadas, y los alotipos de las mismas. Tales receptores Fcy preferidos incluyen, por ejemplo, el FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), FcyRIIb (CD32), FcYRIIIa (CD16), y/o FCYRIIID (CD16) humano. La secuencia de polinucleótido y la secuencia de aminoácido de FcyRI se muestran en las SEC ID NOs: 18 (NM_000566.3) y 19 (NP_000557.1 ), respectivamente; la secuencia de polinucleótido y la secuencia de aminoácido de FcyRIIa se muestran en las SEC ID NOs: 20 (BC020823.1) y 21 (AAH20823.1 ), respectivamente; la secuencia de polinucleótido y la secuencia de aminoácido de FcyRIIb se muestran en las SEC ID NOs: 22 (BC146678.1) y 23 (AAI46679.1 ), respectivamente; la secuencia de polinucleótido y la secuencia de aminoácido de FcyRIIIa se muestran en las SEC ID NOs: 24 (BC033678.1) y 25 (AAH33678.1 ), respectivamente; y la secuencia de polinucleótido y la secuencia de aminoácido de FCYRIIID se muestran en las SEC ID NOs: 26 (BC128562.1) y 27 (AAI28563.1 ), respectivamente (el número de acceso de RefSeq se muestra en cada paréntesis). Si un receptor FCY tiene actividad de unión a la región Fe de un anticuerpo lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4 monoclonal puede evaluarse mediante evaluación ALPHA (Ensayo Homogéneo de Proximidad Luminiscente Amplificado), el método BIACORE basado en resonancia de plasmón superficial (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), además de los formatos de FACS y de ELISA descritos antes.

En el FCYRI (CD64) que incluye FcyRIa, FcyRIb, y FcyRIc, y FcyRIlI (CD16) que incluye las isoformas FcyRIIIa (que incluye los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (que incluye los alotipos FcyRlllb-NA1 y FcyRlllb-NA2), la cadena a que une la porción de Fe de la IgG es asociada con la cadena ? común que tiene la ITAM responsable de la transducción de la señal de activación intracelular. Mientras tanto, el dominio citoplásmico de FcyRIl (CD32) que incluye las isoformas FcyRIIa (que incluye los alotipos H131 y R131) y FcyRIIc contiene la ITAM. Estos receptores se expresan en muchas células inmunes como macrófagos, mastocitos, y células presentadoras de antígeno. La señal de activación transducida sobre la unión de estos receptores a la porción de Fe de la IgG resulta en la mejora de la actividad fagocítica y de la producción de la citocina inflamatoria de macrófagos, la degranulación de mastocitos, y la función mejorada de células presentadoras de antígeno. Los receptores de Fcy que tienen la capacidad de transducir la señal de activación como se describe anteriormente también se refieren como que activan los receptores de Fcy.

Mientras tanto, el dominio intracitoplásmico del FcyRIIb (que incluye FcyRllb-1 y FcyRllb-2) contiene el ITIM responsable de la transducción de señales inhibidoras. La reticulación entre el FcyRIIb y el receptor de célula B (BCR, por sus siglas en inglés) en células B que suprimen la señal de activación de BCR, que da lugar a la supresión de la producción del anticuerpo a través de BCR. La reticulación de Fcy RUI y de FcyRIIb en macrófagos suprime la actividad fagocítica y la producción de citocina inflamatoria. Los receptores de Fcy que tienen la capacidad de transducir la señal inhibidora como se describe anteriormente también se refieren como receptores de Fcy inhibidores.

Actividad de unión al receptor Fcv La actividad de unión de un dominio de unión a FcyR, que se incluye en una molécula de unión al antígeno de la presente invención, a cualquiera de los receptores Fcy humanos, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, y/o FcyRIIIb, puede confirmarse por el formato de FACS o de ELISA como se describe anteriormente, así como la evaluación ALPHA (Ensayo Homogéneo de Proximidad Luminiscente Amplificado), un método de BIACORE al usar el fenómeno de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés), o similares (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).

Se realizó la evaluación ALPHA mediante la tecnología ALPHA basada en el principio descrito a continuación al usar dos tipos de gránulos: gránulos donantes y aceptores. Se detectó una señal luminiscente solamente cuando las moléculas unidas a los gránulos donantes interactúan biológicamente con moléculas unidas a los gránulos aceptores y cuando los dos gránulos están localizados en estrecha proximidad. Excitado por de rayo láser, el fotosensibilizador en un gránulo donante que convierte el oxígeno alrededor del gránulo en oxígeno singlete excitado.

Cuando el oxígeno singlete se difunde alrededor de los gránulos donantes y alcanza los gránulos aceptores localizados en estrecha proximidad, se induce una reacción quimioluminiscente dentro de los gránulos aceptores. Esta reacción da lugar en última instancia a la emisión de luz. Si las moléculas unidas a los gránulos donantes no interactúan con las moléculas unidas a los gránulos aceptores, no ocurre el oxígeno singlete producido por los gránulos donantes no alcanza los gránulos aceptores y la reacción quimioluminiscente.

Por ejemplo, una molécula de unión al antígeno etiquetada con biotina que comprende la región Fe se inmoviliza a los gránulos donantes y el receptor Fcy marcado con glutatión S-transferasa (GST, por sus siglas en inglés) se inmoviliza a los gránulos aceptores. En ausencia de una molécula de unión al antígeno competitiva que comprende una región Fe alterada, el receptor Fcy interactúa con un complejo de polipéptido que comprende una región Fe tipo silvestre, induciendo una señal de 520 a 620 nm como un resultado. Una molécula de unión al antígeno no marcada que tiene la región Fe alterada compite con la molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe tipo silvestre para la interacción con el receptor Fcy. La afinidad de unión relativa puede determinarse cuantificando la reducción de la fluorescencia como un resultado de la competición. Se conocen los métodos para biotinilar las moléculas de unión al antígeno como anticuerpos al usar la Sulfo-NHS-biotina o similares. Los métodos apropiados para agregar la etiqueta de GST a un receptor Fcy incluyen los métodos que implican fusionar los polipéptidos que codifican el Fcy y el GST en marco, expresando el gen fusionado al usar células introducidas con un vector al cual el gen se enlaza operablemente, y después purificándolo al usar una columna de glutatión. La señal inducida puede analizarse preferiblemente, por ejemplo, ajustando a un modelo de competición de un sitio basado en análisis de regresión no lineal al usar el software como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).

Una de las sustancias para observar su interacción se inmoviliza como un ligando sobre la capa delgada de oro de una matriz de sensor. Cuando la luz se derrama en la superficie posterior de la matriz de sensor de modo que la reflexión total ocurre en la interfaz entre la capa delgada de oro y el cristal, la intensidad de la luz reflejada se reduce parcialmente en cierto sitio (señal de SPR). La otra sustancia para observar su interacción se inyecta como un analito sobre la superficie de la matriz de sensor. La masa de la molécula de ligando inmovilizada aumenta cuando el analito une al ligando. Esto altera el índice de refracción del solvente en la superficie de la matriz de sensor. El cambio en el índice de refracción causa una variación posicional de la señal de SPR (inversamente, la disociación varía la señal de nuevo a la posición original). En el sistema de Biacore, la cantidad de variación descrita antes (es decir, el cambio de masa en la superficie de la matriz de sensor) se traza en el eje vertical, y así el cambio de la masa se muestra como los datos medidos (sensograma). Los parámetros cinéticos (constante de velocidad de asociación (ka, por sus siglas en inglés) y constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés)) se determinan a partir de la curva del sensograma, y la afinidad (KD, por sus siglas en inglés) es determina a partir de la relación entre estos dos constantes. El ensayo de inhibición se usa preferiblemente en los métodos de BIACORE. Los ejemplos de tal ensayo de inhibición se describen en Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010. Las actividades de unión del dominio de unión a FcyR incluidas en la molécula de unión al antígeno de la presente invención hacia cualquiera de los receptores Fcy humano, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcYRIIIa, y/o el FcYRIIIb, pueden determinarse de la cantidad de unión y el valor de la KD para cada uno de los receptores Fcy humanos calculado al usar el sistema de Biacore de acuerdo con los ejemplos descritos antes. Aquí, la cantidad de unió de varios FcyR a los polipéptidos también está representada por los valores obtenidos determinando la diferencia en los valores de RU de los sensogramas que cambiaron antes y después de la interacción de varios FcyR como el analito con cada polipéptido, y dividiéndolos por diferencias en los valores de RU de los sensogramas que cambiaron antes y después de capturar los polipéptidos a las matrices de sensor.

Una condición del intervalo de pH ácido o la condición del intervalo de pH neutro puede usarse adecuadamente para las condiciones del pH para medir la actividad de unión al receptor FCY del dominio de unión al FcyR incluidas en la molécula de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión al antígeno que contiene el dominio. Un intervalo de pH neutro como una condición para medir la actividad de unión al receptor Fcy del dominio de unión al receptor FCYR de la presente invención o una molécula de unión al antígeno que contiene el dominio se refiere generalmente de pH 6.7 a pH 10.0. Preferiblemente, es un intervalo indicado con valores de pH arbitrarios entre pH 7.0 y pH 8.0; y preferiblemente, se selecciona a partir de pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, y pH 8.0; y particularmente de manera preferible, es pH 7.4, que está cercano al pH de plasma (sangre) ¡n vivo. En la presente, un intervalo de pH ácido como una condición para el dominio de unión al FcyR de la presente invención o una molécula de unión al antígeno que contiene el dominio para tener actividad de unión al receptor Fcy se refiere generalmente de pH 4.0 a pH 6.5. Preferiblemente, se refiere de pH 5.5 a pH 6.5, y particularmente de manera preferible, se refiere de pH 5.8 a pH 6.0, que está cercano al pH en el endosoma temprano in vivo. Con respecto a la temperatura usada como una condición de medición, la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcyR o una molécula de unión al antígeno que contiene el dominio y un receptor FCY humano puede evaluarse a cualquier temperatura entre 10°C y 50°C. Preferiblemente, una temperatura entre 15°C y 40°C se usa para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcyR o una molécula de unión al antígeno que contiene el dominio y un receptor Fcy. Más preferiblemente, cualquier temperatura entre 20°C y 35°C, como cualquiera de 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, o 35°C, puede usarse de una manera similar para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcyR o una molécula de unión al antígeno que contiene el dominio y un receptor Fcy. Una temperatura de 25°C es un ejemplo no limitante en una modalidad de la presente invención.

Dominio de unión al FcyR Una molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y un dominio de unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy (más adelante también referido como un dominio de unión al FcyR selectivo). Los ejemplos preferidos del dominio de unión al FcyR incluyen las regiones Fe de las inmunoglobulinas tipo IgG, los dominios unión al FcyR de las inmunoglobulinas tipo IgG, los anticuerpos anti- FcyR, y las moléculas de andamio anti-FcYR. Un dominio originalmente que tiene actividad de unión al FcyR puede usarse adecuadamente tal como está para el dominio. Cuando el dominio tiene débil o ninguna actividad de unión al FcyR, la actividad de unión al FcyR puede conferirse alterando los aminoácidos que forman el dominio de unión al FcyR en la molécula de unión al antígeno. Alternativamente, la actividad de unión al R Fcy puede aumentarse alterando los aminoácidos en el dominio que tiene originalmente la actividad de unión al FcyR. Las alteraciones de aminoácidos del dominio de unión al FcyR que dan lugar a tai actividad de unión deseada pueden ser descubiertas comparando la actividad de unión al FcyR antes y después de la alteración del aminoácido. Una modalidad no limitante de tales dominios de unión al FcyR es, por ejemplo, el dominio de unión al FcyR incluido en la región Fe de la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 (SEC ID NO: 17). Por ejemplo, cuando la región Fe de un anticuerpo de IgG se usa como el dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, el dominio de unión al FcyR incluido en la región Fe puede usarse como el dominio de unión al FcyR.

Dominio de unión a FcyR que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy Sea o no un dominio de unión a FcyR de la presente invención tiene actividad de unión selectiva puede confirmarse comparando las actividades de unión a los receptores Fcy respectivo, determinados por el método descrito en la sección mencionada antes en actividad de unión a receptores FCY. Un dominio de unión a FCYR con una mayor actividad de unión a los receptores Fcy inhibidores que para activar receptores Fcy puede usarse como el dominio de unión a FcyR selectivo incluido en la molécula de unión al antígeno proporcionada por la presente invención. En una modalidad no limitante, un dominio de unión a FCYR con una mayor actividad de unión al FcYRIIb (que incluye FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) que a un receptor FCY activador seleccionado del grupo que consiste de FCYRI(CD64) que incluye FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FCYRIII(CD16) que incluye las isoformas FcYRIIIa (que incluye los alotipos V158 and F158) y Fcy R 111 b (que incluye los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2), y FCYRII(CD32) que incluye las isoformas FcYRIIa y FCYRIIC (que incluye los alotipos H131 y R131) puede usarse como un dominio de unión a FcyR selectivo incluido en una molécula de unión al antígeno proporcionado por la presente invención. Además, en una modalidad no limitante de la presente invención, un dominio de unión a FCYR con una mayor actividad de unión a FcYRIIb-1 y/o a FcYRIIb-2 que a FcyRIa, FcYRIb, y FcyRIc, FcYRIIIa que incluye el alotipo V158, FcYRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyR 111 b que incluye que incluye el alotipo FcyRlllb-NA1 , FcyRIIIb que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA2, FCYRI la que incluye el alotipo H131, FcYRIIa que incluye el alotipo R131, y/o FcyRIIc puede usarse como dominio de unión a FcyR selectivo incluido en una molécula de unión al antígeno proporcionada por la presente invención. Si un dominio de unión a FcyR a probarse tiene actividad de unión selectiva a receptores FCY puede determinarse comparando el valor (relación) obtenido dividiendo los valores de la KD del dominio de unión a FcyR para FcyRIa, FcYRIb, FCYRIC, FcYRIIIa que incluye el alotipo V158, FcYRIIIa que incluye el alotipo F158, que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA1 , FcyR 111 b que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA2, FcyRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRI la que incluye el alotipo R131, y/o FCYRIIC por los valores de la KD para FcYRIIb-1 y/o FcYRIIb-2, donde se determinan los valores de la KD por el método descrito en la sección mencionada antes en actividad de unión a receptores Fcy, o más específicamente, comparando los índices de selectividad de FCY mostrados en la Ecuación 1.

[Ecuación 1] índice de selectividad de FCYR = valor de la KD para activar FcYR/valor de la KD para el FCYR inhibidor En la Ecuación 1 mencionada antes, el "FCYR activador" se refiere a FcYRIa, FcyR I b, FcyRIc, FcYRIIIa que incluye el alotipo V158, FcYRIIIa que incluye el alotipo F158, FcYRIIIb que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA1 , FcYRIIIb que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRIIa que incluye el alotipo R131, y/o FCYRIIC, y el FCYR inhibidor se refiere a FcYRIIb- y/o FcYRIIb-2. Aunque el FCYR activador y el FcyR inhibidor usados para las mediciones del valor de la KD pueden seleccionarse de cualquier combinación, en una modalidad no limitante, puede usarse un valor (relación) obtenido dividiendo el valor de la KD para FcYRIIa que incluye el alotipo H131 por el valor de la KD para FcyRllb-1 y/o FcYRIIb-2.

Por ejemplo, los índices de la selectividad de FcyR tienen los valores de, 1.2 o mayor, 1.3 o mayor, 1.4 o mayor, 1.5 o mayor, 1.6 o mayor, 1.7 o mayor, 1.8 o mayor, 1.9 o mayor, 2 o mayor, 3 o mayor, 5 o mayor, 6 o mayor, 7 o mayor, 8 o mayor, 9 o mayor, 10 o mayor, 15 o mayor, 20 o mayor, 25 o mayor, 30 o mayor, 35 o mayor, 40 o mayor, 45 o mayor, 50 o mayor, 55 o mayor, 60 o mayor, 65 o mayor, 70 o mayor, 75 o mayor, 80 o mayor, 85 o mayor, 90 o mayor, 95 o mayor, 100 o mayor, 110 o mayor, 120 o mayor, 130 o mayor, 140 o mayor, 150 o mayor, 160 o mayor, 170 o mayor, 180 o mayor, 190 o mayor, 200 o mayor, 210 o mayor, 220 o mayor, 230 o mayor, 240 o mayor, 250 o mayor, 260 o mayor, 270 o mayor, 280 o mayor, 290 o mayor, 300 o mayor, 310 o mayor, 320 o mayor, 330 o mayor, 340 o mayor, 350 o mayor, 360 o mayor, 370 o mayor, 380 o mayor, 390 o mayor, 400 o mayor, 410 o mayor, 420 o mayor, 430 o mayor, 440 o mayor, 450 o mayor, 460 o mayor, 470 o mayor, 480 o mayor, 490 o mayor, 500 o mayor, 520 o mayor, 540 o mayor, 560 o mayor, 580 o mayor, 600 o mayor, 620 o mayor, 640 o mayor, 660 o mayor, 680 o mayor, 700 o mayor, 720 o mayor, 740 o mayor, 760 o mayores, 780 o mayor, 800 o mayor, 820 o mayor, 840 o mayor, 860 o mayor, 880 o mayor, 900 o mayor, 920 o mayor, 940 o mayor, 960 o mayor, 980 o mayor, 1000 o mayor, 1500 o mayor, 2000 o mayor, 2500 o mayor, 3000 o mayor, 3500 o mayor, 4000 o mayor, 4500 o mayor, 5000 o mayor, 5500 o mayor, 6000 o mayor, 6500 o mayor, 7000 o mayor, 7500 o mayor, 8000 o mayor, 8500 o mayor, 9000 o mayor, 9500 o mayor, 10000 o mayor, o 100000 o mayor.

Una modalidad no limitante del dominio de unión al FcyR selectivo en una molécula de unión al antígeno de la presente invención incluye, por ejemplo, las regiones Fe producidas modificando el dominio de unión al FcyR incluido en una región Fe presentada como la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 (SEC ID NO: 17). Un ejemplo de un método para producir las regiones Fe modificadas incluye el método descrito en la sección mencionada anteriormente en alteraciones de aminoácidos. Los ejemplos de tales regiones Fe alteradas incluyen una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp o una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 328 (numeración de UE) es Glu en una IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4). Una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp o una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 328 (numeración de UE) es Glu en una IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4), y las moléculas de unión al antígeno que contienen tal región Fe muestran la mayor actividad de unión a FcyRllb-1 y/o al FcYRIIb-2 que a FcyRIa, FcYRIb, FCYRIC, FcyRIIIa que incluye el alotipo V158, FcvRllla que incluye el alotipo V158, FcyRIIIa que incluye el alotipo F158, FcvRlllb que incluye el alotipo FcyRlllb-NA1 , FcYRIIIb que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa que incluye el alotipo H131, FcYRIIa que incluye el alotipo R131, y/o FCYRIIC.

Las regiones Fe que contienen un dominio de unión a FcyR selectivo que se incluyen en las moléculas de unión al antígeno de las presente invención y las moléculas de unión al antígeno que contienen tal región Fe pueden también ser regiones Fe y las moléculas de unión al antígeno que contienen tal región Fe que mantiene o muestra actividad de unión reducida para activar FcyR (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa que incluye el alotipo V158, FcYRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyR 111 b que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA1 , FcYRIIIb que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa que incluye el alotipo H131, FcYRIIa que incluye el alotipo R131, y/o FCYRIIC) cuando se compara con una región Fe presentada como la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 humana (SEC ID NO: 17) (más adelante designada una región Fe tipo silvestre) y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe tipo silvestre.

Comparado a un región Fe tipo silvestre y una molécula de unión al antígeno que contiene un región Fe tipo silvestre, el grado de reducción anteriormente mencionado en actividad de unión para activar el FcyR de una región Fe que contiene un dominio de unión a FcyR selectivo incluido en una molécula de unión al antígeno de la presente invención, y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe es, por ejemplo, 99% o menos, 98% o menos, 97% o menos, 96% o menos, 95% o menos, 94% o menos, 93% o menos, 92% o menos, 91% o menos, 90% o menos, 88% o menos, 86% o menos, 84% o menos, 82% o menos, 80% o menos, 78% o menos, 76% o menos, 74% o menos, 72% o menos, 70% o menos, 68% o menos, 66% o menos, 64% o menos, 62% o menos, 60% o menos, 58% o menos, 56% o menos, 54% o menos, 52% o menos, 50% o menos, 45% o menos, 40% o menos, 35% o menos, 30% o menos, 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 4% o menos, 3% o menos, 2% o menos, 1% o menos, 0.5% o menos, 0.4% o menos, 0.3% o menos, 0.2% o menos, 0.1% o menos, 0.05% o menos, 0.01% o menos, o 0.005% o menos.

Las regiones Fe que contienen un dominio de unión al FcyR selectivo y las moléculas de unión al antígeno que contienen tal región Fe, que se incluyen en las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, pueden también ser regiones Fe y moléculas de unión al antígeno que contienen tal región Fe que muestra actividad de unión mejorada al FcyR inhibidor (FcyRllb-1 y/o FcyRllb-2) cuando se comparada a una región Fe presentada como la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 humana (SEC ID NO: 17) (más adelante referida como una región Fe tipo silvestre) y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe tipo silvestre.

Comparado a un región Fe tipo silvestre y una molécula de unión al antígeno que contiene una región Fe tipo silvestre, el grado de la mejora anteriormente mencionado en actividad de unión al FcyR inhibidor de una región Fe que contiene un dominio de unión a FcyR selectivo incluido en una molécula de unión al antígeno de la presente invención y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe es, por ejemplo, 101% o mayor, 102% o mayor, 103% o mayor 104% o mayor, 105% o mayor, 106% o mayor, 107% o mayor 108% o mayor, 109% o mayor, 110% o mayor, 112% o mayor 114% o mayor, 116% o mayor, 118% o mayor, 120% o mayor 122% o mayor, 124% o mayor, 126% o mayor, 128% o mayor 130% o mayor, 132% o mayor, 134% o mayor, 36% o mayor 138% o mayor, 140% o mayor, 142% o mayor, 144% o mayor 146% o mayor, 148% o mayor, 50% o mayor, 155% o mayor 160% o mayor, 65% o mayor, 170% o mayor, 175% o mayor 80% o mayor, 185% o mayor, 190% 0 mayor, 195% o mayor, 2 veces o mayor, 3 veces o mayor, 4 o mayor, 5 veces o mayor, 6 veces o mayor, 7 veces o mayor, 8 veces o mayor , 9 veces o mayor, 10 veces o mayor, 20 veces o mayor, 30 veces o mayor, 40 veces o mayor, 50 veces o mayor, 60 veces o mayor, 70 veces o mayor, 80 veces o mayor, 90 veces o mayor, 100 veces o mayor, 200 veces o mayor, 300 veces o mayor, 400 veces o mayor, 500 veces o mayor, 600 veces o mayor, 700 veces o mayor, 800 veces o mayor, 900 veces o mayor, 1000 veces o mayor, 10000 veces o mayor, o 100000 veces o mayor.

Además, la reglón Fe que contiene un dominio de unión a FcyR selectivo incluido en una molécula de unión al antígeno de la presente invención y la molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe puede ser una región Fe y una molécula de unión al antígeno que contienen tal región Fe que mantiene o muestra la actividad de unión reducida para activar el FcyR (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, Fcy R 111 a que incluye el alotipo V158, FcYRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRlllb-NA1 , FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRIIa que incluye el alotipo R131, y/o FcyRIIc) cuando se compara con una región Fe presentada como la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 humana (SEC ID NO: 17) (más adelante referida como una región Fe tipo silvestre) y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe tipo silvestre; y muestra la actividad de unión mejorada al FcyR inhibidor (FcyRllb- y/o FcyRllb-2) cuando se compara con una región Fe presentada como la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 humana (SEC ID NO: 17) (más adelante referida una región Fe tipo silvestre) y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe tipo silvestre.

Además, la región Fe que contiene un dominio de unión a FcyR selectivo incluido en una molécula de unión al antígeno de la presente invención y la molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe puede ser una región Fe y una molécula de unión al antígeno que contienen tal región Fe con mayor grado de mejorar la actividad de unión a un receptor Fcy inhibidor (FcyRllb-1 y/o FcyRllb-2) que a un receptor Fcy activador (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa que incluye el alotipo V158, FcYRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRIIIb-NAl , FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRIIa que incluye el alotipo R131), cuando se compara con una región Fe presentada como la lgG1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 humana (SEC ID NO: 17) (más adelante referida una región Fe tipo silvestre) y una molécula de unión al antígeno que contiene tal región Fe tipo silvestre.

En la presente invención, por lo menos otra alteración a la región Fe puede agregarse a la región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp y la región Fe en la cual el aminoácido en la posición 328 (numeración de UE) es Glu, por las modalidades y similares descritas en la sección anteriormente mencionada en alteraciones de aminoácidos. Además de estas alteraciones, las alteraciones adicionales pueden también agregarse. Las alteraciones adicionales pueden seleccionarse de cualquiera de sustituciones, supresiones, y modificaciones de un aminoácido, y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, las alteraciones que mejoran la actividad de unión a FcyRIIb mientras que mantienen o reducen la actividad de unión a FcYRIIa (tipo H) y FcyRIIa (tipo R) pueden agregarse. La adición de tales alteraciones mejora la selectividad de unión a FcyRIIb sobre FcyRIIa.

Entre éstos, son favorables las alteraciones que mejoran la selectividad de unión al FcyRIIb sobre FcyRIIa (tipo R), y son más favorables las alteraciones que mejoran la selectividad de unión a FcyRIIb sobre FcyRIIa (tipo H). Los ejemplos de las sustituciones de aminoácidos preferidos para tales alteraciones incluyen: una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Asn en la posición 325 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con He; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Val; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Gln; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Gly en la posición 236 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Ala en la posición 327 (numeración de UE) con Asn; una alteración sustituyendo Asn en la posición 325 (numeración de UE) con Ser; una alteración sustituyendo Leu en la posición 235 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Val en la posición 266 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Leu en la posición 235 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Leu en la posición 235 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Ser en la posición 239 (numeración de UE) con Gly; una alteración sustituyendo Ala en la posición 327 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Ala en la posición 327 (numeración de UE) con Gly; una alteración sustituyendo Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Ser en la posición 239 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Thr; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Ser; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Pro en la posición 331 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Pro en la posición 331 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Pro en la posición 331 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Ala en la posición 327 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Pro en la posición 271 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Me; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con GIn; una alteración sustituyendo Leu en la posición 328 (numeración de UE) con Val; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Arg; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Gly; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Asn; una alteración sustituyendo Ser en la posición 324 (numeración de UE) con Val; una alteración sustituyendo Val en la posición 266 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Pro en la posición 271 (numeración de UE) con Gly; una alteración sustituyendo He en la posición 332 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Ser en la posición 324 (numeración de UE) con lie; una alteración sustituyendo Glu en la posición 333 (numeración de UE) con Pro; una alteración sustituyendo Tyr en la posición 300 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Ser en la posición 337 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Tyr en la posición 300 (numeración de UE) con GIn; una alteración sustituyendo Thr en la posición 335 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Ser en la posición 239 (numeración de UE) con Asn; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Me; una alteración sustituyendo Ser en la posición 239 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Val; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Pro; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con His; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Gln; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Gln; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Val en la posición 266 (numeración de UE) con Me; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Tyr en la posición 300 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Val; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Thr; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Ser; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con His; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Gln; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Pro; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con He; una alteración sustituyendo Gln en la posición 295 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 334 (numeración de UE) con Asn; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Ser en la posición 239 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Leu en la posición 234 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Leu en la posición 234 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Lys; una alteración sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Arg; una alteración sustituyendo Glu en la posición 233 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Ser; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Thr; una alteración sustituyendo Val en la posición 323 (numeración de UE) con Me; una alteración sustituyendo Val en la posición 323 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Val en la posición 323 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Tyr en la posición 296 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Asn; y una alteración sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Met.

Las sustituciones de aminoácidos favorables entre estas alteraciones son, por ejemplo, una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Phe; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Val; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Gln; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Asn; una alteración sustituyendo Pro en la posición 271 (numeración de UE) con Gly; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Gln; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con et; una alteración sustituyendo Ser en la posición 239 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Ser en la posición 267 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Leu en la posición 234 (numeración de UE) con Trp; una alteración sustituyendo Leu en la posición 234 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Gly en la posición 237 (numeración de UE) con Tyr; una alteración sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Lys; una alteración sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Arg; una alteración sustituyendo Glg en la posición 233 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo His en la posición 268 (numeración de UE) con Glu; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Ser; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Thr; una alteración sustituyendo Val en la posición 323 (numeración de UE) con Me; una alteración sustituyendo Val en la posición 323 (numeración de UE) con Leu; una alteración sustituyendo Val en la posición 323 (numeración de UE) con Met; una alteración sustituyendo Tyr en la posición 296 (numeración de UE) con Asp; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Ala; una alteración sustituyendo Lys en la posición 326 (numeración de UE) con Asn; y una alteración sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Met.

La alteración mencionada antes puede estar en una posición, o las alteraciones en dos o más posiciones pueden combinarse. Los ejemplos favorables de tales alteraciones se describen en las Tablas 13 a 14, las Tablas 16 a 23, y las Tablas 25 a 27.

La región Fe producida alterando el dominio de unión a FcyR incluido en la región Fe presentada como la IgG 1 humana (SEC ID NO: 14), lgG2 (SEC ID NO: 15), lgG3 (SEC ID NO: 16), o lgG4 humana (SEC ID NO: 17) puede darse como un ejemplo de otra modalidad no limitante del dominio de unión a FCYR selectivo incluido en las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Un método para producir las regiones Fe modificadas es, por ejemplo, el método descrito en la sección mencionada antes en alteraciones de aminoácidos. Los ejemplos de tales regiones Fe alteradas incluyen una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp y el aminoácido en la posición en 271 (numeración de UE) es Gly en una IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4). Una región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp y el aminoácido en la posición 271 (numeración de UE) es Gly en una IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4), y las moléculas de unión al antígeno que contienen tal región Fe muestran mayor actividad de unión a FcyRllb-1 y/o FcyRllb-2 que a FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcYRIIIa que incluye el alotipo V158, FcyRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRlllb-NA , FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRlllb-NA2, FcyRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRIIa que incluye el alotipo R131, y/o FcyRIlc.

En la presente invención, por lo menos otra alteración a la región Fe puede agregarse a la región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp y el aminoácido en la posición 271 (numeración de UE) es Gly, por las modalidades y similares descritas en la sección anteriormente mencionada en alteraciones de aminoácidos. Además de estas alteraciones, las alteraciones adicionales pueden también agregarse. Las alteraciones adicionales pueden seleccionarse de cualquiera de las sustituciones, supresiones, y modificaciones de un aminoácido, y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, las alteraciones que mantienen o reducen la actividad de unión a receptores Fcy activadores (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa que incluye el alotipo V158, FcyRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyR 111 b que incluye el alotipo FcyRlllb-NA1 , FcyRIIIb que incluye el alotipo FcYRIIIb-NA2, FcyRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRIIa que incluye el alotipo R131) pueden agregarse. Las alteraciones que mejoran actividad de unión a receptores Fcy inhibidores (FcyRllb-1 y/o FcyRllb-2) mientras que mantienen o reducen la actividad de unión a FcyRIIa (tipo H) y FcyRIIa (tipo R) pueden agregadas. Además, las alteraciones donde el grado de mejora la actividad de unión a los receptores Fcy inhibidores (FcyRllb-1 y/o FcyRllb-2) es mayor que el grado de mejora de la actividad de unión a receptores Fcy activadores (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa que incluye el alotipo V158, FcyRIIIa que incluye el alotipo F158, FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRlllb-NA1 , FcyRIIIb que incluye el alotipo FcyRlllb-NA2, FcyRIIa que incluye el alotipo H131, FcyRIIa que incluye el alotipo R131) pueden también agregarse. La adición de tales alteraciones mejora la selectividad de unión a FcyRIIb sobre FcYRIIa.

Un ejemplo de una modalidad no limitante de la región Fe alterada que comprende un dominio de unión a FCYR selectivo incluye una región Fe alterada en la cual cualquiera o más de las posiciones 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, y 396 (numeración de UE) se sustituyen en la región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) es Asp y el aminoácido en la posición 271 (numeración de UE) es Gly en una IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4).

Además, un ejemplo de una modalidad no limitante de la región Fe alterada que comprende un dominio de unión a FcyR selectivo es una región Fe alterada que comprende cualquiera o más de Asp en la posición del aminoácido 233, Tyr en la posición del aminoácido 234, Asp en la posición del aminoácido 237, Me en la posición del aminoácido 264, Glu en la posición del aminoácido 265, cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición del aminoácido 266, cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición del aminoácido 267, cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición del aminoácido 268, Asp en la posición del aminoácido 269, cualquiera de Asp, Phe, Me, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición del aminoácido 272, Gln at position 274, Asp o Phe en la posición del aminoácido 296, Ala o Asp en la posición del aminoácido 326, Gly en la posición del aminoácido 327, Lys o Arg en la posición del aminoácido 330, Ser en la posición del aminoácido 331, Thr en la posición del aminoácido 332, cualquiera de Thr, Lys, and Arg en la posición del aminoácido 333, Gln en la posición del aminoácido 355, Glu en la posición del aminoácido 356, Met en la posición del aminoácido 358, cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición del aminoácido 396, Arg en la posición del aminoácido 409, Glu en la posición del aminoácido 419, mostrados por la numeración de UE, en la región Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 (numeración de UE) es Gly en una IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4).

Los ejemplos de una modalidad no limitante de la región Fe que comprende además por lo menos otra alteración a la región Fe y comprenden además las alteraciones adicionales mencionadas antes incluyen las regiones Fe mostradas en las Tablas 5-1 a 5-7.

[Tabla 5-1] (La Tabla 5-2 es una tabla de continuación de la Tabla 5-1.) [Tabla 5-2] (La Tabla 5-3 es una tabla de continuación de la Tabla 5-2.) [Tabla 5-3] (La Tabla 5-4 es una tabla de continuación de la Tabla 5-3.) [Tabla 5-4] (La Tabla 5-5 es una tabla de continuación de la Tabla 5-4.) [Tabla 5-5] (La Tabla 5-6 es una tabla de continuación de la Tabla 5-5.) [Tabla 5-6] Tabla 5-7 es una tabla de continuación de la Tabla 5-6.) [Tabla 5-7] Molécula de unión al antígeno En la presente invención, "una molécula de unión al antígeno" se usa en el sentido más amplio para referir a una molécula que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, de un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y de un dominio de unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy (un dominio de unión al FcyR selectivo). Específicamente, las moléculas de unión al antígeno incluyen varios tipos de moléculas siempre y cuando exhiban actividad de unión al antígeno. Los anticuerpos son ejemplos de las moléculas en las cuales se ligan juntos un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y un dominio de unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy (un dominio de unión al FcyR selectivo). Los anticuerpos pueden incluir simples anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos agonísticos y anticuerpos antagónicos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y similares. Alternativamente, cuando se usan como fragmentos de anticuerpo, incluyen preferiblemente dominios de unión al antígeno y fragmentos de unión al antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab')2, scFv, y Fv). Las moléculas de andamio donde las estructuras tridimensionales, como estructura de proteína de barril a/ß estable ya conocida, se usan como un andamio (base) y solamente algunas porciones de las estructuras se hacen en bibliotecas para construir dominios de unión al antígeno también se incluyen en moléculas de unión al antígeno de la presente invención.

Una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede contener por lo menos algunas porciones de una región Fe que media la unión a FcRn y une al receptor Fcy y/o al receptor de complemento. En una modalidad no limitante, la molécula de unión al antígeno incluye, por ejemplo, anticuerpos y proteínas de fusión de Fe. Una proteína de fusión se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácido que se ligua a un polipéptido que tiene una segunda secuencia de aminoácido que no se enlazaría naturalmente en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácido de por lo menos una porción de una región Fe (por ejemplo, una porción de una región Fe responsable de la unión a FcRn o una porción de una región Fe responsable de la unión al receptor Fcy, o una porción de una región Fe responsable de la unión para complemento) y un polipéptido distinto a inmunoglobulina que contiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácido del dominio de unión al ligando de un receptor o un dominio de unión al receptor de un ligando. Las secuencias de aminoácidos pueden estar presentes en las proteínas separadas que se transportan juntas a una proteína de fusión, o generalmente pueden estar presentes en una sola proteína; sin embargo, se incluyen en una nueva reorganización en un polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden producirse, por ejemplo, mediante síntesis química, o por técnicas de recombinación genética para expresar un polinucleótido que codifica regiones de péptido en una reorganización deseada.

Los dominios respectivos de la presente invención como el dominio de unión al antígeno, el dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y el dominio de unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy (dominio de unión al FcvR selectivo), pueden ligarse junto§ a través de enlazadores o directamente a través de enlaces de polipéptido. Los enlazadores comprende enlazadores de péptido arbitrario que pueden introducirse mediante ingeniería genética, enlazadores sintéticos, y enlazadores descritos en, por ejemplo, Proteína Engineering (1996) 9(3), 299-305. Sin embargo, los enlazadores de péptido son preferidos en la presente invención. La longitud de los enlazadores de péptido no está particularmente limitada, y puede seleccionarse adecuadamente por los expertos en la técnica de acuerdo con el propósito. La longitud es preferiblemente cinco aminoácidos o más (sin limitación particular, el límite superior es generalmente 30 aminoácidos o menos, preferiblemente 20 aminoácidos o menos), y particularmente de manera preferible 15 aminoácidos.

Por ejemplo, tales enlazadores de péptido incluyen preferiblemente: Ser GlySer GlyGlySer Ser«GlyGly GlyGlyGlySer (SEC ID NO: 28) Ser»GlyGlyGly (SEC ID NO: 29) GlyGlyGlyGlySer (SEC ID NO: 30) Ser-GlyGlyGlyGly (SEC ID NO: 31) GlyGlyGlyGlyGlySer (SEC ID NO: 32) Ser«GlyGlyGlyGlyGly (SEC ID NO: 33) GlyGlyGlyGlyGlyGlySer (SEC ID NO: 34) Ser«GlyGlyGlyGlyGlyGly (SEC ID NO: 35) (GlyGlyGlyGlySer (SEC ID NO: 30))n (SefGlyGlyGlyGly (SEC ID NO: 31))n donde n es un número entero de 1 o mayor. La longitud o las secuencias de enlazadores de péptido pueden seleccionarse por consiguiente por los expertos en la técnica dependiendo del propósito.

Los enlazadores sintéticos (agentes reticulantes químicos) se usan rutinariamente para reticular péptidos, y por ejemplo: N-hidroxisuccinimida (NHS, por sus siglas en inglés), suberato de disuccinimidilo (DSS por sus siglas en inglés), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3, por sus siglas en inglés), ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP, por sus siglas en inglés), ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP, por sus siglas en inglés), etilenglicol de bis(succinato de succinimidilo) (EGS, por sus siglas en inglés), etilenglicol de bis(succinato de sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS, por sus siglas en inglés), tartrato de disuccinimidilo (DST, por sus siglas en inglés), bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES, por sus siglas en inglés), y bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES, por sus siglas en inglés). Estos agentes reticulantes están comercialmente disponibles. ÍH Cuando se usan los múltiples enlazadores para enlazar los dominios respectivos, pueden todos ser del mismo tipo, o pueden ser de diferentes tipos.

Además de los enlazadores ejemplificados antes, los enlazadores con etiquetas de péptido con etiqueta como etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc, y etiqueta FLAG pueden también usarse adecuadamente. Además, la unión a hidrógeno, la unión a disulfuro, la unión covalente, interacción iónica, y las propiedades de unirse entre sí como un resultado de combinación de las mismas pueden usarse adecuadamente. Por ejemplo, la afinidad entre CH1 y CL del anticuerpo puede usarse, y las regiones Fe que originan desde los anticuerpos biespecíficos descritos antes pueden también usarse para la asociación de la región Fe hetero. Por otra parte, los enlaces de disulfuro formados entre los dominios pueden también usarse adecuadamente.

Cuando se usan múltiples enlazadores para enlazar los dominios respectivos, pueden todos ser del mismo tipo, o pueden ser de diferentes tipos.

Además de los enlazadores ejemplificados antes, los enlazadores con etiquetas de péptido como la etiqueta His, etiqueta Ha, etiqueta myc, y etiqueta FLAG pueden también usarse adecuadamente. Además, la unión a hidrógeno, la unión a disulfuro, la unión covalente, la interacción iónica, y las propiedades de unirse entre sí como un resultado de la combinación de las mismas pueden usarse adecuadamente. Por ejemplo, la afinidad entre CH1 y CL del anticuerpo puede usarse, y las regiones Fe que originan desde los anticuerpos biespecíficos descritos antes pueden también usarse para la asociación de región Fe hetero. Por otra parte, los enlaces de disulfuro formados entre los dominios pueden también usarse adecuadamente.

Para enlazar dominios respectivos a través del enlace de péptido, los polinucleótidos que codifican los dominios se enlazan juntos en estructura. Los métodos conocidos para enlazar polinucleótidos en estructura incluyen técnicas como enlace de fragmentos de restricción, PCR de fusión, y PCR traslapada. Tales métodos pueden usarse apropiadamente solos o en combinación para construir moléculas de unión al antígeno de la presente invención. En la presente invención, los términos "enlazado" y "fusionado", o "ligación" y "fusión" se usan alternativamente. Estos términos se entienden que dos o más elementos o componentes como polipéptidos se enlazan juntos para formar una sola estructura por cualquier medio incluyendo los medios de enlace químico descritos antes y técnicas de recombinación. Cuando dos o más dominios, elementos, o componentes son polipéptidos, enlazados en el marco significa que se enlazan dos o más unidades del marco de lectura para formar un marco de lectura más largo continuo mientras que mantiene los marcos de lectura correctos de los polipéptidos. Cuando dos moléculas de Fab se usan como un dominio de unión al antígeno, un anticuerpo, que es una molécula de unión al antígeno de la presente invención donde el dominio de unión al antígeno se une en estructura a través del enlace de péptido sin enlazarse a un dominio de unión al antígeno que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido y el dominio de unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy (dominio de unión al FcyR selectivo), puede usarse como una molécula de unión al antígeno preferido de la presente aplicación. Los ejemplos de múltiples modalidades no limitantes de la molécula de unión al antígeno de la presente invención incluyendo la estructura de anticuerpo se muestran a continuación: (1) un anticuerpo que comprende F(ab')2 que comprende dos regiones variables y que tiene actividad de unión al antígeno que varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion y una región Fe que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido y actividad de unión selectiva a un receptor Fcy; (2) un anticuerpo que comprende F(ab')2 donde una de las regiones variables que forman F(ab')2 tiene actividad de unión al antígeno que varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion y la otra región variable tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy, y una región Fe que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido; y (3) un anticuerpo que comprende F(ab')2 donde una de las regiones variables que forman F(ab')2 tiene actividad de unión al antígeno que varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion y la otra región variable tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y una región Fe que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy.

Cuando un anticuerpo comprende la estructura anteriormente mencionada de (3), una región variable que tiene actividad de unión a FcRn que varía dependiendo de las condiciones del pH puede usarse preferiblemente como la región variable que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Sin unirse por una teoría particular, si se usa una región variable cuya actividad de unión a FcRn varía dependiendo de las condiciones del pH y si la región variable no tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH neutro, el anticuerpo se libera del FcRn en la superficie celular cuando el anticuerpo unido a FcRn en el endosoma ácido se transporta a la superficie celular y puede reciclarse fácilmente en el plasma.

Anticuerpos biespecíficos y métodos para producirlos Los métodos para producir los anticuerpos biespecífico pueden aplicarse como una modalidad del método para preparar los anticuerpos que comprenden las estructuras de (2) y (3) mencionadas anteriormente. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que comprenden dos tipos de regiones variables que unen específicamente a diferentes epttopos. Los anticuerpos biespecíficos tipo IgG puede secretarse a partir de un hibridoma híbrido (cuadroma) producido fusionando dos tipos de hibridomas que produzcan los anticuerpos de IgG (Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540).

Cuando un anticuerpo biespecífico es producido usando técnicas de recombinación como las descritas en la sección mencionada antes en los anticuerpos, uno puede adoptar un método que introduzca los genes que codifican las cadenas pesadas que contienen los dos tipos de regiones variables de interés en células para co-expresarlas. Sin embargo, incluso cuando solamente se considera la combinación de cadena pesada, tal método de co-expresión producirá una mezcla de (i) una combinación de un par de cadenas pesadas en las cuales una de las cadenas pesadas contiene una región variable que une al primer epítopo y la otra cadena pesada contiene una región variable que une a un segundo epítopo, (ii) una combinación de un par de cadenas pesadas que incluye solamente las cadenas pesadas que contienen una región variable que une al primer epítopo, y (iii) una combinación de un par de cadenas pesadas que incluyen solamente las cadenas pesadas que contienen una región variable que une al segundo epítopo, que está presente en una relación molecular de 2:1:1. Es difícil purificar las moléculas de unión al antígeno que contienen la combinación deseada de cadenas pesadas a partir de la mezcla de tres tipos de combinaciones de cadena pesada.

Cuando se producen anticuerpos biespecífico al usar técnicas de recombinación como se describe antes, los anticuerpos biespecíficos que comprenden la combinación hetero de las cadenas pesadas pueden ser secretados preferencialmente alterando el dominio CH3 que constituye una cadena pesada al usar sustituciones de aminoácidos apropiadas. Específicamente, es un método de mejorar la formación de la cadena pesada heterogénea y de inhibir la formación de la cadena pesada homogénea sustituyendo la cadena lateral del aminoácido en un dominio CH3 de cadena pesada con una cadena lateral aparente (ojal (se entiende "proyección")) mientras que sustituye la cadena lateral del aminoácido en el otro dominio CH3 de cadena pesada con una pequeña cadena lateral (orificio (se entiende "vacío")) para que se coloque el "ojal" en el "orificio" (WO 1996/027011, Ridgway et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant er a/. (Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).

Además, las técnicas conocidas para producir anticuerpos biespecífico incluyen aquellas en las cuales los medios para regular la asociación de polipéptido o la asociación para formar multímeros heteroméricos constituidos por los polipéptidos se apliquen a la asociación de cadenas pesadas. Específicamente, para producir anticuerpos biespecífico, uno puede usar los métodos para regular la asociación de cadena pesada alterando los residuos de aminoácidos que forman la interfaz entre las cadenas pesadas para formar dos cadenas pesadas con diferentes secuencias, siempre que inhiban la asociación de las cadenas pesadas que tienen una secuencia idéntica (WO 2006/106905). Tales métodos se pueden usarse para producir anticuerpos biespecífico.

En una modalidad no limitante de la presente invención, dos polipéptidos que constituyen una región Fe derivados de un anticuerpo biespecífico descrito antes pueden usarse adecuadamente como la región Fe contenida en una molécula de unión al antígeno. Más específicamente, dos polipéptidos que constituyen una región Fe pueden usarse adecuadamente, en las cuales, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 349 como se indica por la numeración de EU es Cys y el aminoácido en la posición 366 es Trp, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 como se indica por la numeración de EU es Cys, el aminoácido en la posición 366 es Ser, el aminoácido en la posición 368 es Ala, y el aminoácido en la posición 407 es Val.

En otra modalidad no limitante de la presente invención, dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 de acuerdo con la numeración de EU es Asp, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 de acuerdo con la numeración de EU es Lys, pueden usarse adecuadamente como la región Fe. En la modalidad anterior, el aminoácido en la posición 409 puede ser Glu en vez de Asp, y el aminoácido en la posición 399 puede ser Arg en vez de Lys. Por otra parte, además del aminoácido Lys en la posición 399, Asp puede agregarse adecuadamente como el aminoácido en la posición 360 o Asp puede agregarse adecuadamente como el aminoácido en la posición 392.

En todavía otra modalidad no limitante de la presente invención, dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 370 de acuerdo con la numeración de EU es Glu, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 357 de acuerdo con la numeración de EU es Lys, puede usarse adecuadamente como la región Fe.

En aún otra modalidad no limitante de la presente invención, dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 439 de acuerdo con la numeración de EU es Glu, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 de acuerdo con la numeración de EU es Lys, pueden usarse adecuadamente como la región Fe.

En todavía aún otra modalidad no limitante de la presente invención, cualquiera de las modalidades indicadas a continuación, en las cuales las anteriores se han combinado, puede usarse adecuadamente como la región Fe: (i) dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 de acuerdo con la numeración de EU es Asp y el aminoácido en la posición 370 es Glu, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 de acuerdo con la numeración de EU es Lys y el aminoácido en la posición 357 es Lys (en esta modalidad, el aminoácido en la posición 370 de acuerdo con la numeración de EU puede ser Asp en vez de Glu, y el aminoácido Asp en la posición 392 de acuerdo con la numeración de EU puede usarse en vez del aminoácido Glu en la posición 370 de acuerdo con la numeración de EU); (ii) dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 de acuerdo con la numeración de EU es Asp y el aminoácido en la posición 439 es Glu, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 de acuerdo con la numeración de EU es Lys y el aminoácido en la posición 356 es Lys (en esta modalidad, el aminoácido Asp en la posición 360 de acuerdo con la numeración de EU, el aminoácido Asp en la posición 392 de acuerdo con la numeración de EU, o el aminoácido Asp en la posición 439 de acuerdo con la numeración de EU puede usarse en vez del aminoácido Glu en la posición 439 de acuerdo con la numeración de EU); (iii) dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 370 de acuerdo con la numeración de EU es Glu y el aminoácido en la posición 439 es Glu, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 357 de acuerdo con la numeración de EU es Lys y el aminoácido en la posición 356 es Lys; y dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 de acuerdo con la numeración de EU es Asp, el aminoácido en la posición 370 es Glu, y el aminoácido en la posición 439 es Glu, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 de acuerdo con la numeración de EU es Lys, el aminoácido en la posición 357 es Lys, y el aminoácido en la posición 356 es Lys (en esta modalidad, el aminoácido en la posición 370 de acuerdo con la numeración de EU no puede sustituirse a Glu, y además, cuando el aminoácido en la posición 370 no se sustituye a Glu, el aminoácido en la posición 439 puede ser Asp en vez de Glu, o el aminoácido Asp en la posición 392 puede usarse en vez del aminoácido Glu en la posición 439).

Además, en otra modalidad no limitante de la presente invención, dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 de acuerdo con la numeración de EU es Lys, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 435 de acuerdo con la numeración de EU es Arg y el aminoácido en la posición 439 es Glu, pueden también usarse adecuadamente.

En todavía otra modalidad no limitante de la presente invención, dos polipéptidos que constituyen una región Fe, en la cual, de la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 de acuerdo con la numeración de EU es Lys y el aminoácido en la posición 357 es Lys, y de la secuencia de aminoácido del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 370 de acuerdo con la numeración de EU es Glu, el aminoácido en la posición 435 es Arg, y el aminoácido en la posición 439 es Glu, pueden también usarse adecuadamente.

Por otra parte, además de la técnica mencionada antes de asociar cadenas pesadas heterólogas, la tecnología de CrossMab que se conoce como una tecnología para asociar cadenas ligeras heterólogas, en las cuales una cadena ligera que forma una región variable que une a un primer epítopo y a una cadena ligera que forma una región variable que une a un segundo epítopo se asocian respectivamente con una cadena pesada que forma una región variable que une al primer epítopo y una cadena pesada que forma una región variable que une al segundo epítopo (Scaefer et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. (2011) 108, 11187-11192)), pueden también usarse para producir las moléculas de unión al antígeno proporcionadas por la presente invención.

Mejora de la farmacocinética En la presente invención, la "capacidad de eliminar los antígenos en plasma" se refiere a la capacidad de eliminar del plasma los antígenos que están presentes en el plasma cuando las moléculas de unión al antígeno se administran in vivo o cuando las moléculas de unión al antígeno se secretan in vivo. Por lo tanto, en la presente invención, la "capacidad de una molécula de unión al antígeno de eliminar los antígenos en plasma es aumentada" se entiende que cuando se administra una molécula de unión al antígeno, el índice de eliminación de antígeno del plasma se acelera comparado a cuando la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno no varía dependiendo de las concentraciones de ion, se administra una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn sin actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, o una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio unión al receptor Fcy sin actividad de unión selectiva a un receptor Fcv. A pesar de que la capacidad de una molécula de unión al antígeno de eliminar los antígenos en el plasma aumentados puede determinarse, por ejemplo, administrando los antígenos solubles y la molécula de unión al antígeno ¡n vivo, y después midiendo la concentración en plasma del antígeno soluble después de la administración. Cuando la concentración de los antígenos solubles en plasma es disminuida después de la administración de los antígenos solubles y las moléculas de unión al antígeno que comprenden un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion, el dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y un dominio unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy (un dominio de unión al FcyR selectivo), la capacidad de las moléculas de unión al antígeno de eliminar los antígenos en el plasma se juzga para ser aumentada. El antígeno soluble puede ser un antígeno que se une a una molécula de unión al antígeno o un antígeno que no se une a una molécula de unión al antígeno en el plasma, y su concentración puede determinarse como una "concentración en plasma del antígeno unido a la molécula de unión al antígeno" o como una "concentración en plasma del antígeno no unido a la molécula de unión al antígeno", respectivamente (este último es sinónimo con "concentración libre de antígeno en plasma"). La "concentración de antígeno total en plasma" significa que la suma de concentraciones del antígeno unido a la molécula de unión al antígeno y el antígeno no unido por una molécula de unión al antígeno, o la "concentración de antígeno libre en plasma" que es la concentración del antígeno no unido por una molécula de unión al antígeno. Así, la concentración de antígeno soluble puede determinarse como la "concentración de antígeno total en plasma". Varios métodos para medir la "concentración de antígeno total en plasma" o la "concentración de antígeno libre en plasma" son bien conocidos en la técnica como se describe más adelante.

En la presente, "potenciar la farmacocinética", "mejora de la farmacocinética", y "farmacocinética superior" pueden reexpresarse como "potenciar la retención en plasma (sangre)", "mejora de la retención en plasma (sangre)", "retención en plasma superior (sangre)", y "retención en plasma prolongada (sangre)". Estos términos son sinónimos.

En la presente, la "mejora de la farmacocinética" se entiende no sólo la prolongación del periodo hasta la eliminación del plasma (por ejemplo, hasta que la molécula de unión al antígeno se degrade intracelularmente o los similares y no pueda regresar al plasma) después de la administración de la molécula de unión al antígeno a humanos, o animales no humanos como ratones, ratas, monos, conejos, y perros, pero también la prolongación de la retención en plasma de la molécula de unión al antígeno en una forma que permita la unión al antígeno (por ejemplo, en una forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno) durante el periodo de la administración a la eliminación debido a la degradación. La IgG humana que tiene la región Fe nativa puede unirse a FcRn a partir de animales no humanos. Por ejemplo, el ratón puede ser preferiblemente usado para ser administrado para confirmar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la invención puesto que la IgG humana que tiene la región Fe nativa puede unirse al FcRn de ratón más intensa que al FcRn humano (Int Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). Como otro ejemplo, el ratón en el cual sus genes de FcRn nativo son deficientes y un transgén para el gen FcRn humano se alberga para ser expresado ( ethods Mol Biol. 2010; 602: 93-104) pueden también usarse preferiblemente como un sujeto a ser administrado para confirmar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la invención descrita más adelante. Específicamente, la "mejora de la farmacocinética" también incluye la prolongación del periodo hasta la eliminación debido a la degradación de la molécula de unión al antígeno no unida a los antígenos (la forma libre de antígeno a partir de la molécula de unión al antígeno). La molécula de unión al antígeno en plasma no puede unirse a un nuevo antígeno si la molécula de unión al antígeno se ha unido ya a un antígeno. Así, cuanto más largo es el periodo que la molécula de unión al antígeno no está unida a un antígeno, más largo es el periodo en el que puede unirse a un nuevo antígeno (mayor es la ocasión de unirse a otro antígeno). Esto deja la reducción del periodo de tiempo que un antígeno está libre de la molécula de unión al antígeno in vivo y la prolongación del periodo que un antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno. La concentración plasmática de la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno puede aumentarse y el periodo que el antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno puede prolongarse acelerando la eliminación del antígeno del plasma mediante la administración de la molécula de unión al antígeno. Específicamente, en la presente "mejora de la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno" incluye la mejora de un parámetro farmacocinético de la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno (cualquier de la prolongación de la vida promedio en plasma, la prolongación del tiempo de retención promedio en plasma, y la mejora de la separación del plasma), la prolongación del periodo que el antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno, y la aceleración de la eliminación del antígeno mediado por la molécula de unión al antígeno del plasma. La mejora de la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno puede evaluarse determinando cualquiera de los parámetros, vida promedio en plasma, tiempo de retención del plasma promedio, y separación del plasma para la molécula de unión al antígeno o la forma libre de antígeno de la misma ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Por ejemplo, la concentración plasmática de la molécula de unión al antígeno o la forma libre de antígeno de la misma es determinada después de la administración de la molécula de unión al antígeno a ratones, ratas, monos, conejos, perros, humanos. Entonces, se determina cada parámetro. Cuando se prolonga la vida promedio del plasma o el tiempo de retención del plasma promedio, la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno puede juzgarse para ser mejorada. Los parámetros pueden determinarse mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los parámetros pueden evaluarse apropiadamente, por ejemplo, mediante análisis no compartimental al usar el software de análisis de farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acuerdo con el manual de instrucción anexo. La concentración plasmática de la molécula de unión al antígeno libre de antígeno puede determinarse mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al usar el método de ensayo descrito en Clin Pharmacol. abril de 2008; 48(4): 406-417).

En la presente, la "mejora de la farmacocinética" también incluye la prolongación del periodo que un antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno. Si el periodo que un antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno se prolonga puede evaluarse determinando la concentración plasmática del antígeno libre. La prolongación puede juzgarse basada en la concentración del plasma determinada del antígeno libre o del periodo de tiempo requerido para un aumento en la relación de la concentración de antígeno libre a la concentración de antígeno total.

La concentración plasmática del antígeno libre no unida a la molécula de unión al antígeno o la relación de la concentración de antígeno libre a la concentración total puede determinarse mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante método usado en Pharm Res. enero de 2006; 23 (1): 95-103. Alternativamente, cuando un antígeno exhibe una función particular in vivo, si el antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno que neutraliza la función del antígeno (molécula antagónica) puede determinarse probando si la función del antígeno es neutralizada. Si la función del antígeno es neutralizada puede evaluarse ensayando un marcador in vivo que refleje la función del antígeno. Si el antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno que activa la función del antígeno (molécula agonística) puede evaluarse ensayando un marcador in vivo que refleja la función del antígeno.

La determinación de la concentración plasmática del antígeno libre y la relación de la cantidad de antígeno libre en plasma a la cantidad de antígeno total en plasma, el ensayo del marcador in vivo, y tales mediciones no están particularmente limitadas; sin embargo, se realizan los ensayos preferiblemente después de que un cierto periodo de tiempo haya pasado después de la administración de la molécula de unión al antígeno. En la presente invención, el periodo después de la administración de la molécula de unión al antígeno no está particularmente limitado; los expertos en la técnica pueden determinar el periodo apropiado dependiendo de las propiedades y similares de la molécula de unión al antígeno administrada. Tales periodos incluyen, por ejemplo, un día después de la administración de la molécula de unión al antígeno, tres días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, siete días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, 14 días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, y 28 días después de la administración de la molécula de unión al antígeno. En la presente, el concepto "concentración del antígeno en plasma" comprende "concentración de antígeno total en plasma" que es la suma de la molécula de unión al antígeno unida al antígeno y concentración del antígeno no unido o "concentración de antígeno libre en plasma" que es la concentración del antígeno no unido a la molécula de unión al antígeno.

La concentración de antígeno total en plasma puede disminuirse mediante administración, como la molécula de unión al antígeno, de la molécula de unión al antígeno de la presente invención por 2-veces, 5-veces, 10-veces, 20-veces, 50-veces, 100-veces, 200-veces, 500-veces, 1,000-veces, o aún mayor comparada a la administración de una molécula de unión al antígeno que contiene un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es independiente de la concentración de ion o una molécula de unión al antígeno que contiene una región Fe con una actividad de unión a FCYR deteriorada, o comparada a cuando la molécula del dominio de unión al antígeno de la presente invención no se administra.

La relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno puede calcularse como se muestra a continuación; valorar A: Concentración molar del antígeno en cada punto de tiempo valor B: Concentración molar de la molécula unión al antígeno en cada punto de tiempo valor C: Concentración molar del antígeno por concentración molar de la molécula de unión al antígeno (relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno) en cada punto de tiempo C=A/B.

Un valor C más pequeño indica una mayor eficacia de la eliminación del antígeno por molécula de unión al antígeno mientras que un mayor valor C indica menor eficacia de la eliminación del antígeno por molécula de unión al antígeno.

La relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno puede calcularse como se describe anteriormente.

Una reducción 2-veces, 5-veces, 10-veces, 20-veces, 50-veces, 100-veces, 200-veces, 500-veces, 1,000-veces, o aún mayor de la relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno puede lograrse mediante la administración de una molécula de unión al antígeno de la presente invención con respecto a cuando una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno no varía dependiendo de las concentraciones de ion, una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn sin actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, o una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio unión al receptor Fcy sin actividad de unión selectiva a un receptor Fcy se administra como la molécula de unión al antígeno.

En la presente invención, una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno no varía dependiendo de las concentraciones de ion, una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn sin actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, o una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio unión al receptor Fcy sin actividad de unión selectiva a un receptor Fcy se usa como una molécula de unión al antígeno de referencia que se comparará con las moléculas de unión al antígeno de la presente invención.

Cuando se evalúa el efecto de un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, la reducción de la concentración de antígeno total en plasma o la relación antígeno/anticuerpo molar puede evaluarse por ya sea el modelo de co-inyección de antígeno y anticuerpo o el modelo de infusión de antígeno de estado estacionario usar la línea 32 o la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano (Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104), cuando la molécula de unión al antígeno no reacciona de forma cruzada con el antígeno de contrapartes de ratón. Cuando una molécula de unión al antígeno reacciona de forma cruzada con las contrapartes de ratón, pueden evaluarse simplemente inyectando la molécula de unión al antígeno a la línea 32 o la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano (Jackson Laboratories). En modelo de co-inyección, la mezcla de molécula de unión al antígeno y el antígeno se administra al ratón. En el modelo de infusión del antígeno en estado estacionario, la bomba de infusión que contiene la solución del antígeno se implanta al ratón para alcanzar la concentración del antígeno en plasma constante, y entonces se inyecta la molécula de unión al antígeno al ratón. Se administra la molécula de unión al antígeno de prueba a la misma dosificación. La concentración de antígeno total en plasma, la concentración de antígeno libre en plasma y la concentración de la molécula de unión al antígeno en plasma se mide a punto de tiempo apropiado al usar el método conocido por los expertos en la técnica.

Para evaluar los efectos de un dominio de unión al receptor Fcv que tiene actividad de unión selectiva a los receptores Fcy, cuando una molécula de unión al antígeno no reacciona de forma cruzada con un antígeno de contraparte de ratón, la concentración de antígeno total en plasma o la disminución en la relación molar de antígeno/anticuerpo puede evaluarse por ya sea el modelo de inyección simultánea de antígeno-anticuerpo o el modelo de inyección de estado estacionario del antígeno al usar los ratones C57BL/6J usados convencionalmente (Charles River Japón). Cuando una molécula de unión al antígeno reacciona de forma cruzada con la contraparte de ratón, la molécula de unión al antígeno puede inyectarse simplemente a los ratones C57BL/6J usados convencionalmente (Charles River Japón) para realizar la evaluación.

En el modelo de co-inyección, una mezcla de la molécula de unión al antígeno y el antígeno se administra a los ratones. En el modelo de infusión de antígeno de estado estacionario, una bomba de infusión llenada con una solución de antígeno se incrustó en ratones para lograr una concentración de antígeno en plasma constante, y entonces la molécula de unión al antígeno se inyecta en los ratones. Las moléculas de unión al antígeno de prueba se administran en la misma dosis. La concentración de antígeno total en plasma, la concentración de antígeno libre en plasma, y la concentración de molécula de unión al antígeno en plasma se miden en los puntos de tiempo apropiados al usar los métodos conocidos por los expertos en la técnica.

La concentración de antígeno total o libre en plasma y la relación molar de antígeno/molécula de unión al antígeno puede medirse a 2, 4, 7, 14, 28, 56, o 84 días después de la administración para evaluar el efecto a largo plazo de la presente invención. En otras palabras, una concentración del antígeno en plasma a largo plazo es determinada mediante la medición de la concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno a 2, 4, 7, 14, 28, 56, o 84 días después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la presente invención. Si la reducción de la concentración del antígeno en plasma o la relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno es alcanzada por la molécula de unión al antígeno descrita en la presente invención puede determinarse por la evaluación de la reducción en cualquiera o más de los puntos de tiempo descritos antes.

La concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación molar del antígeno/molécula de unión al antígeno puede medirse a 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, o 24 horas después de la administración para evaluar el efecto a corto plazo de la presente invención. En otras palabras, es determinada una concentración del antígeno en plasma a corto plazo mediante la medición de la concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de antígeno molar/molécula de unión al antígeno a 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, o 24 horas, después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la presente invención.

La ruta de administración de una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede seleccionarse de inyección intradérmica, intravenosa, intravitreal , subcutánea, intraperitoneal, parenteral e intramuscular.

En la presente invención, se prefiere la mejora de la farmacocinética en humano. Cuando la retención en plasma en humano es difícil de determinar, puede predecirse basada en la retención en plasma en ratones (por ejemplo, ratones normales, ratones transgénicos de expresión al antfgeno humano, ratones transgénicos de expresión al FcRn humano) o monos (por ejemplo, macacos) "La mejora de la farmacocinética y de la retención de plasma prolongada de una molécula de unión al antígeno" en la presente invención significa la mejora de cualquier parámetro farmacocinético (cualquier de la prolongación de la vida promedio en plasma, la prolongación del tiempo de retención promedio en plasma, la reducción de la separación en plasma, y la biodisponibilidad) después de la administración ¡n vivo de la molécula de unión al antígeno, o un aumento en la concentración de la molécula de unión al antígeno en el plasma en un tiempo apropiado después de la administración. Puede determinarse midiendo cualquier parámetro como la vida promedio en plasma, tiempo de retención promedio en plasma, separación de plasma, y biodisponibilidad de la molécula de unión al antígeno ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice), (Nanzando)). Por ejemplo, cuando una molécula de unión al antígeno se administra a los ratones (ratones normales y ratones transgénicos FcRn humanos), ratas, monos, conejos, perros, humanos, y así sucesivamente, y la concentración de la molécula de unión al antígeno en el plasma es determina y cada uno de los parámetros se calcula, la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno puede juzgarse para ser mejorada cuando la vida promedio del plasma o el tiempo de retención promedio en el plasma se prolonga. Estos parámetros pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los parámetros pueden determinarse apropiadamente mediante análisis compartimental al usar el software de análisis de farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acuerdo con el manual de instrucción anexo.

Cuatro tipos de FcyRs, FcyRI , FcyRIIb, FCYRIII, y FcyRIV, se han identificado en ratones. En humanos así, como se han identificado los FcyRs, FcyRI , FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIa, y FcyRIIIb correspondientes. El FcyRIIb que se considera ser el único tipo inhibidor entre estos FcyRs se conserva en humanos y ratones. El otro FcyRs, a excepción de FcyRIIIb, transmite señales activadoras a través del motivo activador basado en el immunoreceptor tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés), mientras que el FcyRIIb transmite señales inhibidoras a través del motivo activador basado en el immunoreceptor tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) presente dentro de las células (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).

El FcyRIlbl y el FcyRllb2 se han reportado como variantes de empalme de FcyRIIb. En humanos y ratones, el FcyRIlbl tiene un dominio intracelular más largo que el FcyRMb2. El FcyRIlbl se ha confirmado para expresarse en células B, y el FcyRllb2 se ha confirmado para expresarse en los macrófagos, mastocitos, células dendríticas, basófilos, neutrófilos, y eosinófilos (J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1-18).

Hasta ahora, en humanos, la disfunción y la expresión disminuida de FcyRIIb se han reportado para correlacionarse con el inicio de enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, se ha reportado que en algunos pacientes de SLE, la unión de activadores transcripcionales es atenuada debido al polimorfismo en una región promotora de expresión de FcyRIIb, que da lugar a la expresión de FcyRIIb disminuida (Hum. Genet. (2005) 117, 220-227; J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199; and J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). Además, entre pacientes de SLE, dos tipos de alotipos se han reportado, donde el aminoácido en la posición 233 es Me o Thr en FcyRIIb. Esta posición existe en la región de transmembrana de FcyRIIb, y se reporta que FcyRIIb es menos probable que exista en la balsa de lípidos cuando el aminoácido en la posición 233 es Thr comparado a cuando este aminoácido es Me, y como un resultado, la función de transducción de señal de FcyRIIb disminuye (Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058; Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). En ratones también, los ratones nuligénicos producidos interrumpiendo el gen de FcyRIIb en ratones C57BL/6 se han reportado a presentes síntomas similares a SLE como la producción y glomerulonefritis (Immunity 13 (2000) 277-285; J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). Además, hasta ahora, el reducido nivel de expresión de FcyRIIb y similares se han reportado en los ratones considerados ser modelos con el inicio natural de SLE (Immunogenetics (2000) 51, 429-435; Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691; Curr. Biol. (2000) 10, 227-230; J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). A partir de estos reportes, el FcYRIIb se considera para regular inmunidad humoral en ratones como en humanos.

Cuando un anticuerpo que lleva un Fe de la presente invención elimina los antígenos a través del FcyRIIb, la función de endocitosis del FcyRIIb se considera que está haciendo la contribución más importante entre las funciones del FcyRIIb. Como se describe antes, el FcyRIlbl y el FcYRIIb2 existen como variantes de empalme del FcYRIIb, pero se reporta que este último está implicado principalmente en la endocitosis de un inmunocomplejo de un anticuerpo y un antfgeno (J. Immunol. (1994), 152 574-585; Science (1992) 256, 1808-1812; Cell (1989) 58, 317-327). Hasta ahora, el FcyRllb2 de ratón se ha reportado para incorporarse en una fosa recubierta con clatrina y sometida a endicitosis (Cell (1989) 58, 317-327). Además, se ha reportado que un motivo de dileucina es necesario para la endocitosis mediada con FcYRIIb2, y el motivo de dileucina se conserva en humanos y ratones (EMBO J. (1994) 13 (13), 2963-2969). A partir de éstos, FcyRllb2 puede tener una capacidad endocitótica en humanos como en ratones.

Por una parte, a diferencia de FcYRIIb2, se ha reportado que el FCYRIIDI no causa endocitosis. El FCYRIIDI tiene una secuencia insertada en su dominio intracelular que no se encuentra en el FCYRIID2. Se considera que esta secuencia inhibe la absorción del FcYRIlbl en una fosa recubierta con clatrina, y como un resultado la endocitosis es inhibida (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888; J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291-3302). En humanos también, el FcYRIlbl tiene una secuencia de inserción en un sitio similar al del FcYRIIb2 como en ratones; por lo tanto, la diferencia en la capacidad endocitótica entre FcyRIlbl y FcyRllb2 se presume para ser causada por un mecanismo similar. Además, en humanos y ratones, aproximadamente 40% de inmunocomplejos en la superficie celular se reporta para ser tomado en la célula a 20 minutos (Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337; Science (1992) 256, 1808-1812). Por lo tanto, en humanos también, el FcyRllb2 se presume a inmunocomplejos de absorción en células a índices similares a aquellos en ratones.

Puesto que el FcYRIIb es el único que tiene ITIM dentro de la célula en humanos y ratones entre la familia FcyR y la distribución de células de expresión es la misma, se presume que su función en control inmune es similar. Además, considerando el hecho de que los inmunocomplejos son tomados en las células a índices similares en humanos y ratones, los efectos de eliminación del antígeno de los anticuerpos mediados por el FCYRIID en humanos puede ser predecible usar ratones. Las moléculas de unión al antígeno mF44 y mF46 tienen propiedades de unir a antígenos solubles de una manera dependiente al pH, y han mejorado la afinidad al FcyRIIb de ratón y al FCYRIII comparado a mlgG1 que es una molécula de unión al antígeno que tiene la propiedad de unir a un antígeno soluble de una manera dependiente al pH. De hecho, se muestra en el Ejemplo 5 que la separación del antígeno aumentó cuando de administró mF44 o mF46 a los ratones normales comparados a cuando se administró mlgG1.

Además, en el Ejemplo 6 descrito posteriormente, se realizó un experimento similar usar ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe. Se ha reportado que el FCYRS con excepción del FcYRIIb está expresado solamente en co-presencia de una cadena gamma en ratones. Así, solamente el FcYRIIb se expresa en ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe. La administración de mF44 o de mF46, que son moléculas de unión al antígeno que tienen la propiedad de unirse a los antígenos solubles de una manera dependiente al pH, a ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe deja la evaluación de los efectos de aceleración de eliminación del antígeno cuando la unión a FcYRIIb se mejora selectivamente. A partir de los resultados del Ejemplo 6, cuando mF44 o mF46 (que son moléculas de unión al antígeno que tienen la propiedad de unirse a los antígenos solubles de una manera dependiente al pH) se administró a ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe, la separación del antígeno se muestra para el aumento comparado a cuando mlgG1 (que es una molécula de unión al antígeno que tiene la propiedad de unirse a los antígenos solubles de una manera dependiente al pH) se administró a los ratones. Además, los resultados del Ejemplo 6 muestran que cuando se administra a ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe, mF44 o mF46 causa los grados similares de eliminación del antígeno como cuando se administra a ratones normales.

En el Ejemplo 6, se realizó un experimento similar al usar ratones deficientes de Fe ? R 111. Puesto que mlgG1, mF44, y mF46 solamente se unen FCYRIID y FCYRIII entre el mFcyRs, la administración los anticuerpos a ratones deficientes de FcyRI 11 deja la evaluación de los efectos de aceleración de eliminación del antígeno cuando la unión a FCYRIID se mejora selectivamente. Los resultados del Ejemplo 6 indican que cuando se administró mF44 o mF46 a los ratones deficientes de FCYRIII, la separación del antígeno se aumentó comparada a cuando se administró mlgG1 a la separación del antígeno de ratones. Además, los resultados del Ejemplo 6 mostraron que cuando se administró a los ratones deficientes de FCYRIII, mF44 y mF46 causa los grados similares de eliminación del antígeno como cuando se administra a los ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe y cuando se administra a ratones normales.

Estos resultados revelaron que la eliminación del antígeno puede acelerarse la mejorar de unión selectiva al FcyRIIb solamente sin mejorar la unión al FCYRS activo.

Además de los documentos reportados discutidos hasta ahora, basado en los resultados de evaluación anteriormente mencionados al usar ratones, se considera que la absorción de inmunocomplejos en células a través del FcYRIIb ocurre in vivo en humanos como en ratones, y como un resultado, los anticuerpos que tienen Fe con unión mejorada selectivamente al FcyRIIb humano pueden acelerar la eliminación de sus antlgenos. Además, como se discutió antes, puesto que la absorción de inmunocomplejos en células a través del FcyRIIb se considera ocurrir a índices similares en ratones y humanos, los efectos de acelerar la eliminación del antígeno comparable a los de los anticuerpos que tienen Fe con afinidad mejorada al FcyRIIb de ratón puede alcanzarse in vivo en humanos al usar Fe en el cual la afinidad al FcyRIIb humano se mejoran a un grado similar.

Como se describe en el documento WO2009/125825, Fv4-lgG1 es un anticuerpo que resulta de conferir a un anticuerpo H54/L28-lgG1 del receptor anti-IL-6 humanizado la actividad de unir al antígeno de una manera dependiente al pH, Es decir, alterando la región variable para conferir la propiedad de unir a un antígeno a pH 7.4 y disociar a partir del antígeno a pH 5.8. El documento WO2009/125825 mostró que la eliminación del receptor IL-6 humano soluble está acelerada grandemente en ratones co-administrados con Fv4 lgG1 y el receptor IL-6 humano soluble como el antígeno en comparación con los ratones co-administrados con H54/L28-lgG1 y el antígeno. En la presente, la H54-lgG1 de cadena pesada y la L28-CK de cadena ligera incluida en H54/L28-lgG1 se muestran en la SEC ID NO: 36 y la SEC ID NO: 37, respectivamente; y la VH3-lgG1 de cadena pesada y la VL3-CK de cadena ligera incluida en Fv4-lgG1 se muestran en la SEC ID NO: 38 y la SEC ID NO: 39, respectivamente.

El receptor IL-6 humano soluble unido a un anticuerpo H54/L28-lgG 1 , que se une al receptor IL-6 humano soluble, se recicla al plasma junto con el anticuerpo a través de FcRn. Mientras tanto, el anticuerpo Fv4-lgG1 que se une al receptor IL-6 humano soluble de una manera dependiente al pH disocia del receptor IL-6 humano soluble que ha estado unido al anticuerpo bajo la condición ácida en el endosoma. Puesto que el receptor IL-6 humano soluble disociado se degrada en el lisosoma, la eliminación del receptor IL-6 humano soluble puede acelerarse en mayor medida, y el anticuerpo Fv4-lgG1 que se une al receptor IL-6 humano soluble de una manera dependiente al pH se recicla al plasma después de unir a FcRn en el endosoma. Puesto que el anticuerpo reciclado puede unirse a un receptor IL-6 humano soluble de nuevo, se repiten la unión al antígeno (receptor IL-6 humano soluble) y reciclado al plasma a través de FcRn. Como un resultado, una simple molécula de anticuerpo puede unirse repetidamente a múltiples tiempos del receptor IL-6 humano soluble (Fig. 1).

Por una parte, como se describe en la presente invención, se encontró que la concentración plasmática del antígeno soluble puede reducirse en mayor medida por la administración de una molécula de unión al antígeno con la actividad de unión a FcyR mejorada del dominio de unión al receptor Fcy incluido en la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno en el cual la actividad de unión al antígeno cambia dependiendo de la condición de concentración de ion como el pH, un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, y un dominio de unión al receptor Fcy.

Mientras que no se restringe a una teoría particular, la disminución inesperada de la concentración del antígeno soluble en el plasma observada mediante la administración de una molécula de unión al antígeno con la unión mejorada a FcyRs, que comprende un dominio de unión al antígeno en el cual la actividad de unión al antígeno cambia dependiendo de la condición de concentración de ion como el pH y un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido puede explicarse como sigue.

Como se describe anteriormente, una molécula de unión al antígeno como Fv4-lgG1 que comprende un dominio de unión al antígeno en el cual la actividad de unión al antígeno cambia dependiendo de la condición de concentración de ion puede ser III capaz de gnirse repetidamente a los múltiples tiempos del antígeno, pero el efecto de disociar el antígeno soluble en el endosoma para acelerar la eliminación del antígeno del plasma puede ser dependiente en el índice de absorción del complejo del antígeno y de la molécula de unión al antígeno en el endosoma. Las moléculas de unión al antígeno con actividades de unión mejoradas a varios FcyRs, que comprenden un dominio de unión al antígeno en el cual la actividad de unión al antígeno cambia dependiendo de la condición de concentración de ion, son tomadas activamente en las células al unir varios FcvRs expresados en la membrana celular, y se pueden circular en el plasma de nuevo mediante el reciclaje a través de la unión entre FcRn y el dominio de unión a FcRn en la molécula que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Más específicamente, puesto que las moléculas de unión al antígeno anteriormente mencionadas que formaron complejos con los antígenos solubles en plasma se colocan activamente en las células a través del FcvRs expresado en la membrana celular, el efecto de acelerar la eliminación de antígenos solubles en plasma puede ser más pronunciado que el de las moléculas de unión al antígeno cuyas actividades de unión a varios FcyRs no se mejoran.

Las actividades de unión a FcyR de anticuerpos que se unen a los antígenos de membrana tienen un papel importante en la actividad citotóxica de los anticuerpos. Por lo tanto, cuando la actividad citotóxica es necesaria para un anticuerpo a ser usado como un producto farmacéutico, se usa un isotipo lgG1 humana que tiene mayor actividad de unión a FCYR, y la técnica de mejorar las actividades de unión a FcyR del anticuerpo para mejorar la actividad citotóxica del anticuerpo se usa extensamente. Por una parte, el papel de las actividades unión a FcyR de los anticuerpos que se unen a antígenos solubles y se usan como productos farmacéuticos no habían sido conocidos, y las diferencias en efectos fisiológicos sobre los organismos administrados con lgG1 humana con altas actividades de unión a FcyR e lgG2 humana e lgG4 humana con bajas actividades de unión a FcyR, debido a sus diferencias en actividades de unión a FcyR, no habían sido examinadas completamente hasta ahora. Como se describe más adelante en los Ejemplos, se confirmó actualmente que en el plasma de individuos administrados con anticuerpos cuyas actividades de unión a FcyR se han perdido, no se afectaron los cambios en la concentración del antígeno soluble. Por una parte, en la presente invención, se encontró la concentración de antígenos solubles en el plasma para ser reducida en mayor medida en individuos administrados con moléculas de unión al antígeno con actividades de unión a FcyR mejoradas y comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión a antígenos solubles cambia dependiendo de la condición de concentración de ion. Más específicamente, combinando un dominio de unión a FcRn que tiene una actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido y un dominio de unión al antígeno cuya unión a los antígenos solubles cambia dependiendo de la condición de concentración de ion, que son los dominios incluidos en las moléculas de unión al antígeno que dirigen antígenos solubles, una ventaja de mejorar la unión al FcyR se encontró por primera vez.

Método ex vivo para eliminar los antígenos del plasma Un ejemplo de una modalidad no limitante del uso de una molécula de unión al antígeno para el método para eliminar los antígenos del plasma, que es proporcionado por la presente invención, incluye el uso de la molécula de unión al antígeno para un método ex vivo así llamado para eliminar los antígenos del plasma, que comprende poner en contacto la molécula de unión al antígeno de la presente invención con plasma aislado a partir de sujetos para permitir la formación de inmunocomplejos, y permitir que los inmunocomplejos entren en contacto con las células que expresan los receptores FcRn y Fcy. La velocidad de eliminación del antígeno del plasma puede también promoverse sustituyendo/combinando un método para administrar las moléculas de unión al antígeno ¡n vivo con un método ex vivo así llamado, en el cual el plasma que contiene moléculas y antígenos de unión al antígeno que se unen a las moléculas de unión al antígeno se toman temporalmente del cuerpo y después se ponen en contacto con células que expresan receptores FcRn y Fcy durante un cierto período de tiempo, y el plasma que contiene moléculas de unión al antígeno recicladas extracelularmente (o resecretadas o recirculadas) que no están unidas al antígeno después se regresan al cuerpo.

Además, un ejemplo de una modalidad no limitante del uso de una molécula de unión al antígeno en el método proporcionado por la presente invención para eliminar los antígenos del plasma incluye el uso de la molécula de unión al antígeno en un método ex vivo así llamado para eliminar los antígenos del plasma, que comprende poner en contacto un inmunocomplejo presente en el plasma aislado de los sujetos que se han administrado con las moléculas de unión al antígeno de la presente invención con células que expresan receptores FcRn y Fcy.

Ya sean o no eliminados los antígenos del plasma puede confirmarse, por ejemplo, mediante la evaluación de sí o no el índice de eliminación de antígenos en plasma se acelera en comparación a cuando una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno no variar dependiendo de las concentraciones de ion, una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn sin actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, o una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al receptor Fcy con actividad de unión selectiva a receptores Fcy se usa como un control en vez de una molécula de unión al antígeno de la presente invención.

Método para producir moléculas de unión al antígeno La presente invención proporciona un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene la función de eliminar los antígenos en plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (e) a continuación: (a) obtener un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de ion; (b) obtener un gen que codifica el dominio de unión al antígeno seleccionado en la etapa (a); (c) operablemente enlazar el gen obtenido en la etapa (b) con un gen que codifica un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido y un dominio unión al receptor FCY que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy; (d) cultivar las células hospedadoras que contenían el gen ligado operablemente en la etapa (c); y (e) aislar una molécula de unión al antígeno de la solución de cultivo obtenida en la etapa (d).

En una modalidad no limitante de la presente Invención, después de aislar un polinucleótido que codifica un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión cambia dependiendo de la condición seleccionada como se describe anteriormente, el polinucleótido se inserta en un vector de expresión apropiado. Por ejemplo, cuando el dominio de unión al antígeno es una región variable de anticuerpo, una vez que un ADNc que codifica la región variable se obtiene, el ADNc se digiere con las enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción insertados en los dos extremos del ADNc. Preferiblemente, las enzimas de restricción reconocen y digieren una secuencia de nucleótido que aparece a una baja frecuencia en la secuencia de nucleótido que compone el gen de la molécula de unión al antígeno. Además, las enzimas de restricción que proporcionan los extremos cohesivos se insertan preferiblemente para insertar una simple copia de un fragmento digerido en el vector en la orientación correcta. El ADNc que codifica una región variable de una molécula de unión al antígeno digerida como se describe anteriormente se inserta en un vector de expresión apropiado para obtener un vector de expresión para la molécula de unión al antígeno de la presente invención.

El polinucleótido que codifica un dominio de unión al antígeno obtenido como se describe anteriormente se liga operablemente al gen que codifica un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido y un dominio unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy, que se describen en las secciones "dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido" y "dominio de unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy", respectivamente. Cuando se ligan, los genes pueden enlazarse directo directamente en marco, o los polinucleótidos que codifican cada dominio pueden enlazarse en marco a través de enlazadores. Además de cada uno de los dominios mencionados antes, pueden ligarse operablemente con un gen que codifica el dominio de unión al FcyR descrito en la sección anteriormente mencionada "dominio de unión al FcyR".

Cuando un anticuerpo se usa como la molécula de unión al antígeno de la presente invención, un polinucleótido que codifica una región Fe de anticuerpo puede usarse apropiadamente como el "dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido y el dominio unión al receptor FCY que tiene actividad de unión selectiva a un receptor FCY" antes mencionado. Las regiones Fe cuya "actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido" y "actividad de unión selectiva a un receptor Fcy" se modifican apropiadamente a través de la modificación de los polinucleótidos pueden también usarse. Los ejemplos de modalidades no limitantes de tales modificaciones se muestran en las secciones anteriormente mencionadas "dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido" y "dominio unión al receptor Fcy que tiene actividad de unión selectiva a un receptor Fcy", respectivamente.

Para producir una molécula de unión al antígeno de interés, un polinucleótido que codifica la molécula de unión al antígeno se inserta de una forma ligada operablemente a una secuencia reguladora en un vector de expresión. Las secuencias reguladoras incluyen, por ejemplo, mejoradores y promotores. Además, una secuencia de señal apropiada puede unirse al extremo amino de manera que secreta la molécula de unión al antígeno expresada al exterior de las células. Como la secuencia de señal, por ejemplo, se usa un péptido que tiene la secuencia de aminoácido MGWSCI ILFLVATATGVHS (SEC ID NO: 4); sin embargo, es también posible enlazar otras secuencias de señal apropiadas. El polipéptido expresado se divide en el extremo carboxilo de la secuencia descrita antes, y el polipéptido dividido se secreta como un polipéptido maduro al exterior de células. Entonces, las células hospedadoras apropiadas se transforman con este vector de expresión de manera que puedan obtenerse las células recombinantes que expresan el polinucleótido que codifica la molécula de unión al antígeno de interés. Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden producirse a partir de las células recombinantes siguiendo los métodos descritos antes en la sección en los anticuerpos.

Para un ácido nucleico, "ligado operablemente" se entiende que el ácido nucleico tiene una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un ADN que codifica una presecuencia o una secuencia líder secretora se liga operablemente a un ADN que codifica cierto polipéptido si va a ser expresado como una proteína precursora implicada en la secreción del polipéptido. Un promotor o mejorador se liga operablemente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Un sitio de enlace del ribosoma se liga operablemente a una secuencia codificante si está en una posición que facilite la traducción. Generalmente, "ligado operablemente" se entiende que las secuencias de ADN ligadas son contiguas, y en el caso de una secuencia líder secretora, se entiende que las secuencias de ADN ligadas son contiguas y en un marco de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace es logrado por la ligación en sitios de restricción adecuados. Si no existen tales sitios, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótido sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional. Además, los ácidos nucleicos ligados pueden producirse por la técnica de PCR de extensión traslapante anteriormente mencionada.

En una modalidad no limitante de la presente invención, después de aislar un polinucleótido que codifica la molécula de unión al antígeno descrita antes cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de una condición seleccionada, una variante del polinucleótido se inserta en un vector de expresión apropiado. Tales variantes incluyen preferiblemente las preparadas a través de humanización basada en la secuencia de polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de la presente invención obtenida evaluando como una biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria, una biblioteca sintética, a una biblioteca inmune construida originalmente de animales no humanos. Los mismos métodos como se describe anteriormente para producir anticuerpos humanizados descritos antes pueden usarse como método para producir variantes de molécula de unión al antígeno humanizadas.

En otra modalidad, tales variantes incluyen preferiblemente las obtenidas introduciendo una alteración que aumente la afinidad del antígeno (maduración de afinidad) de una molécula de unión al antígeno de la presente invención en una secuencia de polinucleótido aislado para la molécula obtenida mediante evaluación al usar una biblioteca sintética o una biblioteca sin tratamiento como una biblioteca de región variable seleccionada de manera aleatoria. Tales variantes pueden obtenerse mediante varios procedimientos conocidos para la maduración de afinidad, incluyendo mutagénesis de CDR (Yang et al. (J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)), transposición de cadena (Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al. (J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368)), transposición de ADN (Patten et al. (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), exhibición bacteriófaga (Thompson et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)), y PCR sexual (Clameri et al. (Nature (1998) 391, 288-291)).

En una modalidad de variantes de la presente invención, los polinucleótidos que codifican las moléculas de unión al antígeno que tienen una cadena pesada donde un polinucleótido que codifica una región Fe modificada para tener una mutación del aminoácido como se describe anteriormente se ligan en marco a un polinucleótido que codifica el dominio de unión al antígeno descrito antes cuya actividad de unión varía dependiendo de una condición seleccionada.

La presente invención proporciona métodos para producir las moléculas de unión al antígeno, que comprenden recolectar las moléculas de unión al antígeno de medios de cultivo de células introducidas con vectores en los cuales un polinucleótido que codifica una región Fe se liga operablemente en marco a un polinucleótido que codifica gn dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión varía dependiendo de la condición de concentración de ion. Además, la presente invención también proporciona métodos para producir moléculas de unión al antígeno, que comprenden recolectar las moléculas de unión al antígeno de medios de cultivo de células introducidas con vectores construidos ligando operablemente un polinucleótido que codifica un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión varía dependiendo de la condición de concentración de ion a un polinucleótido que codifica una región Fe que se ligua operablemente por adelantado a un vector.

En los "Métodos para producir moléculas de unión al antígeno" de la presente invención, los métodos conocidos pueden emplearse como métodos para evaluar la eliminación del antígeno del plasma por las moléculas de unión al antígeno. Una molécula de unión al antígeno de la presente invención se administra a cada grupo de animales no humanos como ratones en una edad apropiada en mes. Como se describe más adelante en la sección "Composición farmacéutica", la molécula de unión al antígeno puede administrarse sistémicamente o localmente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intracraneal, o similares, como las composiciones en la forma de dosificación para inyecciones, administración transnasal, administración transpulmonar, o administración transdérmica.

Los métodos espectroscópicos como resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) o análisis de espectrometría de masa (MS, por sus siglas en inglés) incluyendo SELDI(-TOF), MALDI(-TOF), análisis basado en gel 1D, análisis basado en gel 2D, cromatografía líquida (por ejemplo, cromatografía líquida a alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) o cromatografía líquida a baja presión (LPLC, por sus siglas en inglés)), cromatografía en capa fina, y técnicas basadas en LC-MS pueden usarse para medir las concentraciones. Los ejemplos de las técnicas de LCMS apropiadas incluyen ICAT (marca registrada) (Applied Biosystems) e iTRAQ (marca registrada) (Applied Biosystems). Un método para detectar fragmentos de antígeno que han sido producidos mediante digestión adicional de un antígeno dirigido por una enzima apropiada puede también emplearse cuando sea apropiado. Además, la concentración del antígeno puede medirse mediante un método de detección directa o indirecta. Más específicamente, el antígeno puede detectarse directamente o indirectamente a través de la interacción con un ligando o ligandos como enzimas, unión, receptores o proteínas de transporte, anticuerpos, péptidos, aptámeros o oligonucleótidos, o cualquiera de los receptores o compuesto químicos sintéticos que puedan unirse específicamente al antígeno. El ligando puede modificarse con una etiqueta detectable como una etiqueta luminiscente, etiqueta fluorescente, o etiqueta radiactiva, y/o una etiqueta de afinidad. Un método inmunológico puede darse como tal ejemplo.

Un método de medición preferido puede ser, por ejemplo, un método inmunológico que usa un anticuerpo que une a un epítopo presente en el antígeno. Los ejemplos de tal método inmunológico incluyen inmunoensayo de enzima (ELISA, EIA), fluoroinmunoensayo (FIA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunoensayo de luminiscencia, técnica de anticuerpo de enzima, técnica de anticuerpo fluorescente, método de inmunocromatografía, inmunoturbidimetría, turbidimetría de látex, y método de medición de aglutinación de látex. Además, las medidas en estos métodos inmunológicos pueden realizarse manualmente o usando un dispositivo como un analizador. El método inmunológico en la presente invención puede realizarse de acuerdo con un método conocido como el método de intercalación. Por ejemplo, un primer anticuerpo inmovilizado sobre un portador se deja reaccionar simultáneamente o secuencialmente con una muestra biológica y un segundo anticuerpo modificado por una sustancia de etiquetado. La reacción anteriormente mencionada lleva a la formación de un complejo que comprende el primer anticuerpo inmovilizado sobre un portador, el antígeno, y un segundo anticuerpo modificado por una sustancia de etiquetado, y la cuantificación de la sustancia de etiquetado ligada al segundo anticuerpo incluido en este complejo deja la medición de la cantidad (concentración) del antígeno incluido en la muestra biológica.

Por ejemplo, en el caso de inmunoensayo de enzima, una microplaca sobre la cual se inmoviliza un primer anticuerpo, muestras biológicas diluidas en serie, un anticuerpo secundario modificado por una enzima como HRP, amortiguador de lavado, y una solución que contiene un sustrato al cual una enzima como reactivos de HRP se usa preferiblemente. En una modalidad no limitante de la medición, un sustrato se deja reaccionar bajo una condición óptima con la enzima que modifica el anticuerpo secundario, y la cantidad del producto de reacción enzimática puede determinarse por un método óptico. En el caso de fluoroinmunoensayo, una guía de onda óptica sobre la cual se inmoviliza un primer anticuerpo, las muestras biológicas diluidas en serie, un anticuerpo secundario modificado por una sustancia fluorescente, y el amortiguador de lavado se usan preferiblemente. En una modalidad no limitante de la medición, la intensidad de la fluorescencia emitida por la sustancia fluorescente a través de irradiación de luz de excitación sobre la sustancia fluorescente que modifica el anticuerpo secundario puede medirse.

Además, en el caso del radioinmunoensayo, se mide la cantidad de radiación emitida por la sustancia radiactiva. En el caso de inmunoensayo por luminiscencia, se mide la cantidad de luminiscencia emitida por el sistema de reacción luminiscente.

Además, en el caso de inmunoturbidimetría, turbidimetría de látex, método de medición de aglutinación de látex, y similares, la luz transmitida o la luz dispersada es medida por el método de punto final o el método por índice. Cuando se hace las mediciones de ¡nmunocromatografía por la observación visual, el color de la sustancia etiquetada que aparece en la línea de prueba es determinado por observación visual. En vez de tal medición por observación visual, un instrumento como un analizador puede usarse cuando sea apropiado.

Composición farmacéutica La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, moléculas de unión al antígeno producidas mediante métodos de alteración de la presente invención, o moléculas de unión al antígeno producidas mediante métodos de producción de la presente invención. Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o moléculas de unión al antígeno producidas mediante métodos de producción de la presente invención son útiles como composiciones farmacéuticas puesto que, cuando se administran, tienen el fuerte efecto para reducir la concentración del antígeno en plasma con respecto a las moléculas de unión al antígeno comunes, y exhiben la inmunorespuesta in vivo, la farmacocinética mejoradas, y otras en animales administrados con las moléculas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender portadores farmacéuticamente aceptados.

En la presente invención, las composiciones farmacéuticas se refieren generalmente a agentes para tratar o prevenir, o probar y diagnosticar enfermedades.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse parenteralmente, en la forma de inyecciones de soluciones o de suspensiones estériles que incluye agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, tales composiciones pueden formularse mediante la mezcla en la forma de unidad de dosis requerida en la práctica de fabricación de medicamento aprobado generalmente, combinando apropiadamente con portadores o medios farmacológicamente aceptables, específicamente con agua estéril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, emulsionantes, suspensión, tensioactivo, estabilizador, agente aromatizante, excipiente, vehículo, conservante, aglutinante, o similares. En tales formulaciones, la cantidad de ingrediente activo se ajusta para obtener una cantidad apropiada en un intervalo predeterminado.

Las composiciones estériles para inyección pueden formularse al usar vehículos como agua destilada para inyección, de acuerdo con la práctica de formulación estándar. Las soluciones acuosas para inyección incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen dextrosa u otros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro sódico). Es también posible usar en combinación solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcoholes (etanol y similares), polialcoholes (propilenglicol, polietilenglicol, y similares), tensioactivos no iónicos (polisorbato 80(TM), HCO-50, y similares).

Los aceites incluyen aceite de sésamo y aceites de soja. El benzoato bencílico y/o alcohol bencílico pueden usarse en combinación como solubilizantes. Es también posible combinar amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de fosfato y amortiguador de acetato de sodio), agentes calmantes (por ejemplo, clorhidrato de procaína), estabilizadores (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol), y/o antioxidantes. Las ampollas apropiadas se llenan de las inyecciones preparadas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran preferiblemente de manera parenteral. Por ejemplo, las composiciones en la forma de dosificación para inyecciones, administración transnasal, administración transpulmonar, o administración transdérmica se administran. Por ejemplo, pueden administrarse sistémica o localmente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similares.

Los métodos de administración pueden seleccionarse apropiadamente en consideración de la edad y síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene una molécula de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, de 0.0001 a 1,000 mg/kg para cada administración. Alternativamente, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0.001 a 100,000 mg por paciente. Sin embargo, la presente invención no está limitada por los valores numéricos descritos antes. Las dosis y los métodos de administración varían dependiendo del peso, la edad, los síntomas, del paciente y similares. Los expertos en la técnica pueden ajustar la dosis apropiada y los métodos de administración en consideración de los factores descritos antes.

Además, la presente invención proporciona kits para el uso en los métodos de la presente invención, que comprenden por lo menos una molécula de unión al antígeno de la presente invención. Además de lo anterior, los portadores farmacéuticamente aceptables, medios, manuales de instrucción que describen el método de uso, y similares pueden empaquetarse en los kits.

Además, la presente invención se refiere a agentes farmacéuticos para la eliminación, del plasma, los complejos que contienen dos o más unidades de unión antigénicas y dos o más moléculas de unión al antígeno presentes en el plasma, que contienen como un ingrediente activo las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o las moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención.

La presente invención se refiere a métodos para tratar una enfermedad, que incluye administrar a los sujetos (pacientes, sujetos humanos, etc.) las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o las moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención. Un ejemplo no limitante de la enfermedad incluye cáncer y enfermedades inflamatorias.

La presente invención también se refiere al uso de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o las moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención en la fabricación de un agente farmacéutico para la eliminación de los complejos de plasma que contienen dos o más unidades de unión antigénicas y dos o más moléculas de unión al antígeno presentes en el plasma.

La presente invención además se refiere al uso de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o las moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención para la eliminación, del plasma, complejos que contienen dos o más unidades de unión antigénicas y dos o más moléculas de unión al antígeno presentes en el plasma.

Además, la presente invención se refiere a las moléculas de unión al antígeno de la presente invención y moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención para el uso en los métodos de la presente invención.

Los aminoácidos contenidos en las secuencias de aminoácidos de la presente invención pueden ser modificados después de la traducción (por ejemplo, la modificación de una glutamina N terminal en un ácido piroglutámico mediante piroglutamilación es bien conocida por los expertos en la técnica). Naturalmente, tales aminoácidos modificados después de la traducción se incluyen en las secuencias de aminoácidos en la presente invención.

Todos los documentos de la técnica anterior citados en la especificación se incorporan en la presente por referencia.

En la presente a continuación, la presente invención será descrita específicamente con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse como que se limita a los mismos.

[Ejemplos] [Ejemplo 1] Preparación de las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcyR de ratón bajo una condición del intervalo de pH neutro es mayor que la actividad de unión de la región Fe de IgG humana nativa. (1 -1 ) Anticuerpos de unión al receptor IL-6 humano dependjente al pH H54/L28-lgG1 que comprende H54-lgG1 (SEC ID NO: 36) y L28-CK (SEC ID NO: 37) descrito en el documento WO2009/125825 es un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizada. Mientras tanto, Fv4-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 38) y VL3-CK (SEC ID NO: 39) es un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizada que da lugar de conferir, a H54/L28-lgG1 , la propiedad de unir al receptor IL-6 humano soluble de una manera dependiente al pH (que une a pH 7.4 y disocia a pH 5.8). La prueba de ratón ¡n vivo descrita en el documento WO2009/125825 demostró que, en el grupo administrado con una mezcla de Fv4-lgG1 y un receptor IL-6 humano soluble como el antígeno, la eliminación del receptor IL-6 humano soluble del plasma se aceleró significativamente como se comparó con el grupo administrado con una mezcla de H54/L28-lgG1 y un receptor IL-6 humano soluble como el antígeno.

El receptor IL-6 humano soluble unido a H54/L28-lgG 1 , que es un anticuerpo que se une a un receptor IL-6 humano soluble, es, junto con el anticuerpo, reciclado al plasma por FcRn. Mientras tanto, Fv4-lgG1, que es un anticuerpo que se une a un receptor IL-6 humano soluble de una manera dependiente al pH, disocia el receptor IL-6 humano soluble bajo la condición ácida en el endosoma. Se degrada el receptor soluble IL-6 humana disociada en los lisosomas, así esto permite la considerable aceleración de la eliminación del receptor IL-6 humano soluble. Además, después de unirse a FcRn en el endosoma, Fv4-lgG1, que es un anticuerpo que se une a un receptor IL-6 humano soluble de una manera dependiente al pH, se recicla al plasma. Puesto que el anticuerpo reciclado puede unirse al receptor IL-6 humano soluble de nuevo, el anticuerpo se une repetidamente al antígeno (receptor IL-6 humano soluble) y se recicla por FcRn al plasma. Se cree que, como un resultado, una simple molécula de anticuerpo puede unirse repetidamente varias veces al receptor IL-6 humano soluble (Fig. 1). (1-2) Preparación de un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano con unión a FcvR de ratón meiorado v anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano sin la unión a FcvR de ratón VH3-lgG1-F1022 (SEC ID NO: 40), una molécula de unión al antígeno con unión a FcyR de ratón mejorado, se preparó mediante la sustitución de Asp por Lys en la posición 326 (numeración de UE) y Tyr por Leu en la posición 328 (numeración de UE) en VH3-lgG1. Fv4-lgG1 -F1022 que contenía VH3-lgG1 -F1022 como la cadena pesada y VL3-CK como la cadena ligera se produjo al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

Mientras tanto, VH3-lgG1 -F760 (SEC ID NO: 41), una molécula de unión al antígeno sin unión a FCYR de ratón, se preparó mediante la sustitución de Arg por Leu en la posición 235 y Lys por Ser en la posición 239 (numeración de UE) en VH3-lgG1. Fv4-lgG 1 -F760 que contenía VH3-lgG 1 -F760 como la cadena pesada y VL3-CK como la cadena ligera se produjo al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. (1-3) Evaluación de la actividad de unión a FcyR de ratón VH3/L (WT) - lgG1, VH3/L (WT) - lgG1-F1022, y VH3/L (WT) - lgG1-F760, que contienen VH3-lgG1, VH3-lgG1 -F1022, y VH3-lgG1-F760 como la cadena pesada, y L (WT) - CK (SEC ID NO: 42) como la cadena ligera, fueron producidos usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Estos anticuerpos se analizaron cinéticamente para su unión a FcyR de ratón como se describe más adelante. (1-4) Análisis cinético de la unión a FcyR de ratón La unión de anticuerpos a FcyRI, FcyRIIb, FCYR III, y FcyRIV de ratón (más adelante, referida como FcyRs de ratón) (sistemas de R & D, SinoBiological, o preparados mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2) se analizó cinéticamente al usar Biacore T100 y T200 (GE Healthcare). Se inmovilizó una cantidad apropiada de la proteína L (ACTIGEN o BioVision) sobre una matriz sensor CM4 (GE Healthcare) mediante un método de combinación de amino, y los anticuerpos de interés se capturaron en la misma. Entonces, se inyectaron las soluciones diluidas de las FcyR de ratón y un amortiguador de corrida como una solución en objetivo, y las FCYR de ratón se dejaron interactuar con los anticuerpos capturados sobre la matriz sensor. El amortiguador de corrida usado fue 20 de mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, 0.05% (p/v) de Tween20, pH 7.4. Se usó este amortiguador también para diluir las FcyR de ratón. Se regeneró la matriz sensor al usar 10 mmol/l de glicina-HCI, pH 1.5. Se realizaron todas las medidas a 25°C. La constante de velocidad de unión ka (1/Ms) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), que son parámetros cinéticos, se calcularon a partir de los sensogramas obtenidos por la mediciones. Se calculó la KD (M) de cada anticuerpo para el FcyR humano basada en los valores. Se calculó cada parámetro al usar el Software de Evaluación T100 o T200 de Biacore (GE Healthcare).

Se obtuvo el resultado mostrado en la Tabla 6 mediante la medición. Se demostró VH3/L (WT)-lgG1-F1022 para tener actividad de unión aumentada a mFcYRI, mFcYRIIb, y mFcYRIII como se comparó con VH3/L (WT)-lgG1. Con respecto a VH3/L (WT)-lgG 1 -F760, la unión a varios FcyR de ratón fue indetectable, demostrando que VH3/L (WT)-lgG1 -F760 carece de la actividad de unión a los varios FCY de ratón. En la tabla, VH3/L (PESO)-lgG1, VH3/L (PESO)-lgG1-F1022, y VH3/L (PESO)-lgGI -F760 se muestran como lgG1, F1022, y F760, respectivamente.

[Tabla 6] (1-5) Preparación de anticuerpos con bajo contenido de fucosa Los métodos conocidos para aumentar la actividad de unión a FcyR de anticuerpos incluyen métodos para hacer que las cadenas de azúcar ligadas a un anticuerpo sean cadenas de azúcar con bajo contenido de fucosa (J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473) además de los métodos para introducir una alteración de aminoácido en la región Fe de un anticuerpo. Un Fv4-lgG1 con bajo contenido de fucosa (más adelante, abreviado como Fv4-lgG1-Fuc) se produjo expresando Fv4-lgG1 al usar células CHO deficientes del gen transportador de fucosa (WO2006067913) como células hospedadoras de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se ha reportado que, de los mFcyRs (receptores Fcy de ratón), los anticuerpos con bajo contenido de fucosa han aumentado selectivamente la actividad de unión a FcyRIV (Science, 2005, 310 (5753) 1510-1512).

[Ejemplo 2] Efecto de eliminar antígenos del plasma mediante moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcyR es mayor que la actividad de unión de la región Fe de IgG humana nativa (2-1) Efecto de H54/L28-lgG 1 y de Fv4-lqG1 para eliminar los antígenos del plasma H54/L28-lgG 1 , que es un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano, y Fv4-lgG1 que tienen la propiedad de unirse al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH se produjeron mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se realizaron las pruebas de infusión in vivo al usar H54/L28-lgG 1 y Fv4-lgG1 producidos por el método descrito más adelante. (2-1-1) Las pruebas de infusión in vivo usaron ratones transgénicos FcRn humano Se creó un modelo animal en el cual la concentración del receptor IL-6 humano soluble se mantiene constante en plasma implantando una bomba de infusión (BOMBA MINI-OSMÓTICA MODEL 2004, alzet) que contiene el receptor IL-6 humano soluble bajo la piel en la parte posterior de los ratones transgénicos FcRn humano (línea 32 B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg +/+ ratón, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602: 93-104). La dinámica in vivo después de la administración de un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano se evaluó en el modelo animal. Para suprimir la producción de anticuerpos neutralizantes contra el receptor IL-6 humano soluble, un anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón (preparado por un método conocido) se administró una vez a 20 mg/kg en la vena caudal. Entonces, una bomba de infusión que contenía 92.8 pg/ml de receptor IL-6 humano soluble se implantó subcutáneamente en la parte posterior de los ratones. Tres días después de la implantación de la bomba de infusión, se administró un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano una vez a 1 mg/kg en la vena caudal. Se recolectó la sangre de los ratones 15 minutos, siete horas, un día, dos días, cuatro días, y siete días después de la administración del anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano. Inmediatamente, se centrifugó la sangre recolectada a 15,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para preparar el plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador ajustado a -20°C o menos hasta uso. (2-1-2) Determinación de la concentración del receptor IL-6 humano (hs!L-6R) en plasma mediante un método electro quimioluminescencia Se determinaron las concentraciones del receptor IL-6 humanos en plasma de ratón mediante un método de electroquimioluminescencia. Se mezclaron las muestras de la curva estándar de hslL-6R preparadas a 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, y 31.25 pg/ml y las muestras de ensayo de plasma de ratón se diluyeron 50 veces o más con el Anticuerpo Anti-IL-6R humano monoclonal (R&D), Anticuerpo Anti-IL-6R humana Biotinilado (R&D), Tocilizumab, el cual se rutenó con éster de NHS SULFO-TAG (Meso Scale Discovery). Se incubaron las mezclas a 37°C durante la noche. Se preparó Tocilizumab a una concentración final de 333 pg/ml. Entonces, las mezclas de reacción se dividieron en alícuotas en una Placa de Estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Se lavó la solución reaccionada a temperatura ambiente durante una hora, y después se dividió en alícuotas el Amortiguador de Lectura T (x4) (Meso Scale Discovery). Inmediatamente después, la medición se realizó al usar el Lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Se determinó la concentración del receptor IL-6 humano basada en la respuesta de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices).

Un transcurso dé tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano monltoreada se muestra en la Fig. 2. Como se comparó con H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1 que se une al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH podrían reducir la concentración del receptor IL-6 humano, pero no podría reducirla debajo de la línea base sin la administración del anticuerpo. Es decir, el anticuerpo administrado que se une a un antígeno de una manera dependiente al pH no podría reducir la concentración del antígeno en plasma debajo del nivel antes de la administración del anticuerpo. (2-2) El efecto de eliminar un antígeno del plasma por un anticuerpo con actividad de unión a FcvR aumentada o reducida Si el transcurso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano es influenciado aumentando o reduciendo la actividad de unión a FcyR de Fv4-lgG1, que es un anticuerpo de unión al receptor IL-6 humano dependiente al pH, se evaluó por el método descrito más adelante. Al usar Fv4-lgG1, Fv4-lgG1 -F760, Fv4-lgG1-F1022, y Fv4-lgG1-Fuc se preparó como se describe en el Ejemplo 1, las pruebas de infusión in vivo se realizaron mediante el método descrito más adelante. (2-2-1) Las pruebas de infusión in vivo usaron ratones transqénicos FcRn humano Un modelo animal en el cual la concentración del receptor IL-6 humano soluble se mantiene constante en plasma se creó implantando una bomba de infusión (MINI-BOMBA OSMÓTICA MODELO 2004; alzet) que contiene el receptor IL-6 humano soluble bajo la piel en la parte posterior de los ratones transgénicos FcRn humano (línea 32 B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg +/+ ratón, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602: 93-104). En el modelo animal, un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano se administró simultáneamente con Sanglopor (CSL Behring) que es una preparación de inmunoglobulina humana, para evaluar la dinámica in vivo del receptor IL-6 humano soluble después de la administración del anticuerpo. Para suprimir la producción de anticuerpos neutralizantes contra el receptor IL-6 humano soluble, se administró un anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón (preparado por un método conocido) una vez a 20 mg/kg en la vena caudal. Entonces, una bomba de infusión que contenía 92.8 g/ml de receptor IL-6 humano soluble se implantó subcutáneamente en la parte posterior de los ratones. Tres días después de la implantación de la bomba de infusión, un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano y Sanglopor se administraron una vez a 1 mg/kg y 1000 mg/kg, respectivamente, en la vena caudal. Se recolectó la sangre de los ratones 15 minutos, siete horas, un día, dos días, cuatro días, siete días, 14 días, y 21 días después de la administración del anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano. Se recolectó la sangre de los ratones 15 minutos, siete horas, un día, dos días, tres días, siete días, 14 días y 21 días después de la administración del anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano. Inmediatamente, se centrifugó la sangre recolectada a 15,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para preparar el plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador ajustado a -20°C o menos hasta uso. (2-2-2) Determinación de la concentración del receptor IL-6 humano soluble (hslL-6R) en plasma mediante un método de electroquimioluminescencia Se determinaron las concentraciones de hslL-6R en plasma de ratón por el mismo método de electroquimioluminescencia como se describe en (2-1-2).

El resultado se muestra en la Fig. 3. El transcurso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones administrados con Fv4-lgG1-F760, a partir de la cual se suprimió la unión a FcyR de ratón de Fv4-lgG1, se demostró que era comparable a la de los ratones administrados con Fv4-lgG1. La actividad citotóxica a un antígeno de membrana depende de la unión a FcyR, y así la actividad citotóxica se pierde cuando se elimina la unión a FcyR. Por una parte, incluso cuando se administró un anticuerpo, a partir del cual se suprime la unión a FcyR de ratón, contra el receptor IL-6 humano que es un antígeno soluble, no hubo efecto sobre el transcurso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de los ratones administrados. Así, sería pensado que la unión a FcyR de un anticuerpo contra el antígeno soluble no tiene ninguna contribución al transcurso de tiempo de la concentración del antígeno en el plasma de ratones administrados con el anticuerpo.

Sorpresivamente, sin embargo, la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1022 con unión a FCYR de ratón mejorado se redujo considerablemente en comparación con la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones administrados con Fv4-lgG1. En cuanto al grado de reducción, se confirmó la concentración para ser disminuida debajo de la concentración del receptor IL-6 humano de la línea base sin la administración del anticuerpo. En particular, la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1022 se redujo abajo de aproximadamente 1/100 tres días después de la administración en comparación con el caso de la administración de Fv4-lgG1. Este hallazgo demuestra que, administrando a los ratones un anticuerpo que se une al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH y cuya unión a FcyR se ha mejorado, la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de los ratones puede reducirse significativamente, y en cuanto al grado de reducción, la concentración del antígeno en plasma puede reducirse debajo del nivel ante la administración del anticuerpo.

Además, también se demostró que, comparada con los ratones administrados con Fv4-lgG1, la concentración del receptor IL-6 humano en plasma se redujo en los ratones administrados con Fv4-lgG1-Fuc que tiene cadenas de azúcar con bajo contenido de fucosa y con actividad de unión a FcyR de ratón aumentada. En particular, la concentración del receptor IL-6 humano en el plasma de ratones administrados con Fv4-lgG1-Fuc se redujo debajo de aproximadamente siete y 1/2 días después de la administración en comparación con el caso de la administración de Fv4-lgG1. El hallazgo anterior demuestra que, administrando a los ratones un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno dependiente al pH que se une al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH y cuya unión a FcyR se ha mejorado, la concentración del antígeno soluble en el plasma de los ratones puede reducirse. En este caso, los métodos para mejorar la unión a FcyR no se limitan particularmente a la introducción de modificaciones de aminoácidos. Se demostró que tal mejora puede alcanzarse, por ejemplo, al usar una región Fe de IgG humana a la cual una cadena de azúcar con bajo contenido de fucosa se liga en la posición 297 (numeración de UE); sin embargo, el efecto de Fv4-lgG1-Fuc para reducir la concentración del antígeno es más pequeño que Fv4-F1022. Basado en este resultado, sería pensado que, de varios FcyRs (FcyRI, II, III, y IV para el ratón), ITIFCYIV, al cual la unión de Fv4-lgG1-Fuc se mejora, no tiene una contribución grande a la reducción de la concentración del antígeno como un FCYR.

Así, se reveló que, administrando a un individuo un anticuerpo que se une a un antígeno soluble de una manera dependiente al pH y cuya unión a FcyR se ha mejorado, la concentración del antígeno soluble en el plasma del individuo puede reducirse marcadamente.

Sin unirse por una teoría particular, la reducción inesperada de la concentración del antígeno soluble en el plasma, que se observó cuando se administra una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya unión a FcyR se ha mejorado y cuya actividad de unión al antígeno se altera dependiendo de la condición de concentración de ion como pH y un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, puede explicarse como sigue.

Los anticuerpos IgG que no se incorporan específicamente en las células regresan a la superficie celular mediante la unión a FcRn bajo la condición ácida en el endosoma, y después de disociarse del FcRn bajo la condición neutra en plasma. En tal caso, cuando un anticuerpo que neutraliza la función de un antígeno soluble mediante la unión al antígeno se administra a los ratones en los cuales la concentración del antígeno soluble se mantiene constante en plasma, el antígeno soluble en plasma forma un complejo con el anticuerpo administrado. El antígeno soluble incorporado en las células mientras permanece como el complejo probablemente se recicla, en un estado unido al anticuerpo, al plasma junto con el anticuerpo, debido a que la región Fe del anticuerpo se une a FcRn bajo la condición ácida en el endosoma.

Mientras tanto, cuando el anticuerpo contra el antígeno soluble es un anticuerpo que se une al antígeno de una manera dependiente al pH (es decir, un anticuerpo que disocia el antígeno soluble bajo la condición ácida en el endosoma), el antígeno soluble que no se incorpora específicamente en las células mientras permanece como un complejo con el anticuerpo, se disocia del anticuerpo en el endosoma y se degrada en el lisosoma; así, el antígeno soluble no se recicla al plasma. Es decir, se cree que el Fv4-lgG1 incorporado como un complejo con el antígeno soluble en las células puede disociar el antígeno soluble en el endosoma y acelera así la eliminación del antígeno soluble.

Como se describe anteriormente, las moléculas de unión al antígeno como Fv4-lgG1, que contienen un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno se altera dependiendo de la concentración de ion, son probablemente capaces de unirse a los antígenos repetidamente varias veces. El efecto para acelerar la eliminación de antígenos solubles del plasma disociándolos en el endosoma se cree para depender del índice de incorporación del antígeno/complejo de la molécula de unión al antígeno en el endosoma. Un dominio de unión al antígeno o molécula de unión al antígeno que contiene un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión a varios FCYRS se ha aumentado y cuya actividad de unión al antígeno se altera dependiendo de la condición de concentración de ion, se incorpora activamente en las células mediante la unión a varios FcyRs expresados en la membrana celular, y pueden ser transportados de nuevo al plasma mediante reciclado a través de la unión entre FcRn y el dominio de unión a FcRn comprendido en la molécula, que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Es decir, se cree que, puesto que la molécula de unión al antígeno mencionada antes que forma un complejo con un antígeno soluble en plasma se incorpora activamente en las células a través del FcyR expresado en la membrana celular, su efecto para acelerar la eliminación del antígeno soluble del plasma está mostrado más marcadamente que las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a varios FcyRs no se ha aumentado.

La actividad de unión a FcyR de un anticuerpo que se une a un antígeno de membrana desempeña un papel principal en la actividad citotóxica del anticuerpo. Así, cuando es necesario para un anticuerpo usado como un agente farmacéutico para tener actividad citotóxica, se usa un isotipo I g G 1 humana con actividad de unión a FcyR intensa. Además, se usan las técnicas para mejorar la actividad citotóxica de tales anticuerpos aumentando la actividad de unión a FcyR de los anticuerpos comúnmente en la técnica.

Mientras tanto, el papel de la actividad de unión a FcyR de los anticuerpos que se unen a los antígenos solubles y que se usan como agentes farmacéuticos no se han conocido en la técnica. No ha habido suficiente evaluación sobre qué diferencia en el efecto sobre el organismo vivo administrado con los anticuerpos es causada por la diferencia en la actividad de unión a FcyR entre la I g G 1 humana con alta actividad de unión a FcyR y la lgG2 humana y la lgG4 humana con baja actividad de unión a FcyR. Actualmente, se demostró en el presente Ejemplo que no había influencia en el transcurso de tiempo de la concentración del antígeno soluble en el plasma de los individuos administrados con un anticuerpo que carece de actividad de unión a FcyR. Mientras tanto, en la presente invención, se reveló que la concentración del antígeno soluble se redujo significativamente en el plasma de los individuos administrados con una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcyR se ha aumentado y que contiene un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno soluble se altera dependiendo de la condición de concentración de ion. Específicamente, puede decirse que los presentes inventores revelaron por primera vez la ventaja de la mejora de la unión a FcyR combinando un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido con un dominio de unión al antígeno cuya unión al antígeno soluble se altera dependiendo de la condición de concentración de ion, comprendida en una molécula de unión al antígeno dirigida a un antígeno soluble.

[Ejemplo 3] Efecto de eliminar antígenos del plasma por las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a FCYR es mayor que la de la región Fe de IgG humana nativa y cuya actividad de unión a FcRn humano se ha aumentado bajo una condición del intervalo de pH ácido (3-1) Preparación de moléculas de unión al antígeno cuva actividad de unión a FcvR es mayor que la actividad de unión de la región Fe de IgG humana nativa v cuva actividad de unión a FcRn humano se ha aumentado bajo una condición del intervalo de pH ácido Un método reportado para mejorar la retención del anticuerpo IgG en plasma es mejorar la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido. Se cree que, cuando la unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido es mejorada introduciendo una sustitución del aminoácido en la región Fe de un anticuerpo de IgG, esto aumenta la eficacia de reciclado del endosoma al plasma, dando por resultado una mejora de la retención en plasma del anticuerpo de IgG.

Hay muchos reportes sobre las alteraciones de aminoácidos para mejorar la retención en plasma mejorando la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido. Tales alteraciones incluyen, por ejemplo: el método para sustituir Leu por Met en la posición 428 y Ser por Asn en la posición 434 (numeración de UE) en un anticuerpo de IgG (Nat. Biotechnol, (2010) 28, 157-159); el método para sustituir Ala por Asn en la posición 434 (Drug. Metab. Dispos. (2010) 38 (4), 600-605); el método para sustituir Tyr por et en la posición 252, Thr por Ser en la posición 254, y Glu por Thr en la posición 256 (J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23524); el método para sustituir Gln por Thr en la posición 250 y Leu por Met en la posición 428 (J. Immunol. (2006) 176 (1) 346-356); el método para sustituir His por Asn en la posición 434 (Clin. Pharm. & Ther. (2011) 89 (2) 283-290); y los documentos WO2010/106180; WO2010/045193; WO2009/086320; WO2009/058492; WO2008/022152; WO2006/050166, WO2006/053301, WO2006/031370; WO2005/123780; WO2005/047327; WO2005/037867; WO2004/035752; y WO2002/060919.

VH3-lgG1-F1093 (SEC ID NO: 43) con una sustitución de Leu por Met en la posición 428 y Ser por Asn en la posición 434 (numeración de UE) en VH3-lgG1-F1022 se prepararon para mejorar la farmacodinámica de Fv4-lgG 1 -F1022 que demostró producir, cuando se administró, el efecto de reducir significativamente la concentración del antígeno soluble en plasma, como se describe en el Ejemplo 2. Fv4-lgG 1 -F1093 comprende VH3-lgG1-F1093 como la cadena pesada y VL3-CK como la cadena ligera se construyó al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. (3-2) Efecto de eliminar los antíqenos del plasma mediante las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcvR es mayor que la de la región Fe de IgG humana nativa y cuya actividad de unión a FcRn humano se ha aumentado bajo una condición del intervalo de pH ácido Se realizó una prueba de infusión in vivo para Fv4-lgG1- F1093 mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo (2-1-1) al usar ratones transgénicos FcRn humano en los cuales la concentración del receptor IL-6 humano soluble se mantiene constante en plasma. Las concentraciones del receptor IL-6 humano soluble en el plasma de ratones se determinaron por el método descrito en el Ejemplo (2-1-2). El resultado se muestra en la Fig. 4. (3-2-1) Determinación de la concentración del anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano en plasma mediante el método de ELISA Se determinaron las concentraciones del anticuerpo del antireceptor IL-6 humano en plasma de ratón mediante el método de ELISA. Primero, un fragmento F(ab')2 anti-lgG humana (específico a la cadena y) del anticuerpo (SIGMA) se dividió en alícuotas en una placa Nunc-lmmuno, MaxiSoup (Nalge nunc International). La placa se dejó en reposo a 4°C durante la noche para preparar una placa inmovilizada con el anticuerpo anti-lgG humana. Se prepararon las muestras de la curva estándar que contienen un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano (concentración en plasma: 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, y 0.0125 Mg/ml) y las muestras de ensayo de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Se combinaron 100 µ? de cada una de las muestras de la curva estándar y de ensayo con 200 µ? de 20 ng/ml de receptor de IL-6 humana soluble. Las mezclas resultantes se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante una hora, y se dividieron en alícuotas en cada pozo de la placa inmovilizada con el anti-lgG humana. La placa se dejó en reposo a temperatura ambiente durante otra hora. Entonces, el Anticuerpo Anti-IL-6R Humana Biotinilado (R&D) se hizo reaccionar en la misma a temperatura ambiente durante una hora. Después, se hizo reaccionar Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) en la misma a temperatura ambiente durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica de la solución de reacción al usar como un sustrato el Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories). Después de terminar la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), la absorbencia a 450 nm de la solución de reacción de cada pozo se midió con un lector de microplaca. Las concentraciones de anticuerpos en plasma de ratón se determinaron basadas en la absorbencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices).

El resultado se muestra en la Fig. 5. (3-3) Meiora de la farmacodinámica aumentando la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido Como se muestra en la Fig. 5, en el grupo administrado con Fv4-lgG 1 -F1022 que resulta de la mejora de la actividad de unión a FcvR de Fv4-lgG1 bajo una condición del intervalo de pH neutro, la retención en plasma del anticuerpo administrado se demostró para ser reducida como se comparó con el grupo administrado con Fv4-lgG1. Mientras tanto, en el grupo administrado con Fv4-lgG1-F1093 que resulta de la mejora de la actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1 -F1022 bajo una condición del intervalo de pH ácido, la retención en plasma del anticuerpo administrado se demostró para ser mejorada significativamente en comparación con el grupo administrado con Fv4-lgG1-F1022.

Además, como se muestra en la Fig. 4, el transcurso de tiempo de la concentración del receptor IL-6 humano soluble en el plasma del grupo administrado con Fv4-lgG1-F1022 fue equivalente al del grupo administrado con Fv4-lgG1-F1093, hasta tres días después de la administración del anticuerpo. En el día tres después de la administración, como se comparó con el grupo administrado con Fv4-lgG1, la concentración del receptor IL-6 humano soluble en plasma se redujo tanto como aproximadamente 100 veces en ambos grupos administrado con Fv4-lgG1 -F1022 y Fv4-lgG1 -F1093. Sin embargo, en el día siete después de la administración del anticuerpo, la concentración del receptor IL-6 humano soluble en plasma se observó para ser elevada en el grupo administrado con Fv4-lgG1 -F1022 como se comparó al del día tres después de la administración. Por una parte, en el grupo administrado con Fv4-lgG1-F1093, un aumento en la concentración plasmática del receptor IL-6 humano soluble no se observó, mostrando que el efecto para reducir la concentración del receptor IL-6 humano soluble fue sostenido en este grupo de la administración.

Específicamente, Fv4-lgG1-F1093, cuando se administró, redujo la concentración del receptor IL-6 humano soluble en el plasma del individuo administrado abajo de aproximadamente 1/100 como se comparó con Fv4-lgG1, y además, se sostuvo esta condición durante un largo periodo. Así, Fv4-lgG1 -F1093 se demostró para ser una molécula de unión al antígeno altamente excelente. Sin estar unida por una teoría particular, el fenómeno observado en la presente puede explicarse como sigue. Fv4-lgG1-F1022 en el cual la actividad de unión a FcyR de Fv4-lgG1 se ha aumentado bajo una condición del intervalo de pH neutro probablemente se incorpora en una gran cantidad principalmente en células que expresan el FCYR en la membrana celular. Se transfiere el anticuerpo incorporado en el endosoma, y mediante unión a FcRn en el endosoma, el anticuerpo es reciclado al plasma. Cuando la actividad de unión a FcRn del anticuerpo no es lo suficientemente alta bajo la condición a pH ácido en el endosoma, el anticuerpo incorporado en el endosoma es probablemente incapaz de suficiente reciclado. Específicamente, una razón posible de la retención reducida del plasma de Fv4- lgG1-F1022 con relación a Fv4-lgG1 sería que la actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido es insuficiente para el suficiente reciclado del anticuerpo incorporado en el endosoma al plasma por la unión a FcRn, y el anticuerpo que no se recicló se degradó en el lisosoma.

Por una parte, como con Fv4-lgG1 -F1022, Fv4-lgG1 -F1093 que resulta de la mejora de la actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1 -F1022 bajo una condición del intervalo de pH ácido probablemente se incorpora en una gran cantidad principalmente en células que expresan el FcyR en la membrana celular. Un anticuerpo incorporado y transferido en el endosoma es reciclado al plasma mediante la unión a FcRn en el endosoma. Puesto que su actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido se mejoró, Fv4-lgG1 -F1093 se cree para tener suficiente actividad de unión a FcRn en el endosoma. Así, después de la incorporación en las células, la mayor parte de Fv4-lgG1-F1093 se recicla al plasma. Así, sería pensado que la retención en plasma de Fv4-lgG1 -F1093 fue mejorada en individuos administrados como se comparó con Fv4-lgG1 -F1022.

Por una parte, se ha conocido que la retención en plasma de anticuerpos ordinarios es mejorada cuando su actividad de unión a FcRn se mejora bajo una condición del intervalo de pH ácido. Sin embargo, se cree que, cuando la retención del anticuerpo en plasma se mejora, la retención en plasma de antígenos unidos a anticuerpos también se mejora, y esto da lugar a un aumento de la concentración del antígeno en plasma. Actualmente, como se describe en el documento WO2010/088444, el anticuerpo 18E introducido con la alteración YTE en el Anticuerpo 18, que es un anticuerpo de I g G 1 humana contra IL-6, para aumentar la actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido, mostrada la retención del anticuerpo mejorada en el plasma de macacos, y al mismo tiempo, la concentración del antígeno IL-6 también se elevó en el plasma.

Sorpresivamente, sin embargo, cuando se administra Fv4-lgG1-F1093 introducido con una alteración similar a YTE para aumentar la actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido en Fv4-F1022 que se une al antígeno de una manera dependiente al pH y tiene actividad de unión a FcyR aumentada, la retención en plasma del anticuerpo se mejoró significativamente en los individuos administrados sin aumentar la concentración del receptor IL-6 humano soluble que es el antígeno. Más bien, en el día siete después de la administración del anticuerpo, la concentración del receptor IL-6 humano soluble seguía siendo baja en los individuos administrados con Fv4-lgG1-F1093 como se comprueba con estos administrados con Fv4-F1022.

Sin unirse por una teoría particular, el fenómeno observado en la presente puede explicarse como sigue. Cuando se administra a un organismo vivo, un anticuerpo sin unión al antígeno dependiente al pH manera no se incorpora específicamente en las células. Los antígenos que permaneces para unirse al anticuerpo se reciclan al plasma en el mismo grado que el anticuerpo. Mientras tanto, para un anticuerpo con actividad de unión a FcRn aumentada bajo una condición del intervalo de pH ácido, el grado de reciclado al plasma en un organismo vivo administrado con el anticuerpo es mayor que el de un anticuerpo sin actividad de unión a FcRn aumentada, y éste da lugar a un grado aumentado del reciclado de los antígenos unidos al antígeno al plasma en el organismo vivo. Así, debido a la retención de plasma mejorada del anticuerpo administrado en el organismo vivo, la concentración plasmática del antígeno al cual el anticuerpo se une probablemente también se aumenta del organismo vivo.

Mientras tanto, cuando se administra a un organismo vivo, un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera dependiente al pH y que tiene actividad de unión a FcyR aumentada se incorpora principalmente en células que expresan el FcyR en la membrana celular, y éste reduce la retención en plasma. Además, después de que se incorpora en las células mientras que es une al anticuerpo, el antígeno se disocia del anticuerpo en el endosoma y después se degrada en el lisosoma, dando por resultado una disminución de la concentración del antígeno en plasma del organismo vivo. Cuando la actividad de unión a FcRn se aumenta bajo una condición del intervalo de pH ácido, la retención del anticuerpo en plasma, incluso si empeora debido a la actividad de unión a FcyR aumentada, es mejorada mediante un aumento en el índice de reciclado de FcRn. En este caso, puesto que el antígeno unido al anticuerpo que se une al antígeno de una manera dependiente al pH se disocia del anticuerpo en el endosoma y se degrada directamente en el lisosoma, no se cree que la concentración del antígeno se aumente en el plasma. Además, la retención en plasma mejorada del anticuerpo administrado al organismo vivo se cree para permitir que el efecto de eliminación del antígeno del anticuerpo sea sostenido, y la concentración del antígeno que se mantendrá baja por un periodo más largo.

Los hallazgos anteriores demuestran que la retención en plasma de un anticuerpo administrado es mejorada en un organismo vivo administrado con el anticuerpo en el cual la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido se mejora en una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcyR es mayor que la de la región Fe de IgG humana nativa. Además, se reveló que, en este caso, la retención del anticuerpo en plasma es mejorada sin deteriorar el efecto de eliminación del antígeno.

[Ejemplo 4] Evaluación adicional del efecto de eliminar los antígenos de las moléculas de unión al antígeno en plasma cuya actividad de unión a FcyR es mayor que la de la región Fe de IgG humana nativa y cuya actividad de unión a FcRn humano se ha aumentado bajo una condición del intervalo de pH ácido (4-1) El efecto de eliminación de un anticuerpo cuya actividad de unión a FcvR se mejora Como se describe en el Ejemplo 2, la concentración del antígeno en plasma se redujo significativamente en el grupo administrado con Fv4-lgG1 -F1022 con unión a FcyR de ratón mejorado. Mientras tanto, como se muestra en el Ejemplo 3, la retención en plasma reducida observada en el grupo administrado con Fv4-lgG1 -F1022 fue mejorada marcadamente aumentando la actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1 -F1022 bajo una condición del intervalo de pH ácido. Después, el efecto de eliminar los antígenos solubles del plasma mediante la unión a FcyR de ratón aumentado y el efecto de mejorar la retención en plasma de un anticuerpo al mejorar la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido, se evaluaron además como describe más adelante. (4-2) Preparación de un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano con unión a FcvR de ratón mejorado VH3-lgG1-F1087 (SEC ID NO: 44) que resultan de sustituir Asp por Lys en la posición 326 (numeración de UE) en VH3-lgG1, y VH3-lgG1-F1182 (SEC ID NO: 45) que resultaban de sustituir Asp por Ser en la posición 239 y Glu por Me en la posición 332 (numeración de UE) en VH3-lgG1, se prepararon como moléculas de unión al antígeno con unión a FcyR de ratón mejorado. Fv4-lgG1-F1087 que contiene VH3-lgG1-F1087 como la cadena pesada y VL3-CK como la cadena ligera, y Fv4-lgG1-F1182 que contiene VH3-lgG1-F1182 como la cadena pesada y VL3-CK como la cadena ligera, se produjeron al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. (4-3) Evaluación de la actividad de unión a FcvR de ratón VH3/L (WT)-lgG1-F1087 y VH3/L (WT)-lgG1-F1182 que contienen VH3-lgG1-F1087 y VH3-lgG1-F1182 como la cadena pesada, respectivamente, y L (WT)-CK (SEC ID NO: 42) como la cadena ligera, se prepararon mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Estos anticuerpos y VH3/L (WT)-lgG1-F1022 y VH3/L (WT)-lgG1 se evaluaron para su actividad de unión a FcyR de ratón mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. El resultado se muestra en la Tabla 8. En la tabla, VH3/L (WT)-lgG1, VH3/L (WT)-lgG1-F1022, VH3/L (WT)-lgG1-F1087, y VH3/L (WT)-lgG1-F1182 se muestran como lgG1, F1022, F1087, y F1182, respectivamente.

[Tabla 7] Como se muestra en la Tabla 8, se demostró que F1087 y F1022 tiene actividad de unión aumentada a FCYRI de ratón, FcvRllb de ratón, y FCYRIII de ratón comparada con lgG1, mientras que su actividad de unión a FCYRIV de ratón no se aumentó. En cuanto a la actividad de unión de F1087 a FCYRI de ratón, FcYRIIb de ratón, FCYRIII de ratón, and FCYRIV de ratón, el grado de su aumento se reveló para ser más pequeño que el de F1022. Mientras tanto, se mostró que la actividad de unión de F1182 a FcyRI de ratón y FCYRIV de ratón se aumentó considerablemente, mientras que el grado de aumento en su actividad de unión a FcYRIIb y a FCYRIII fue más pequeño que el de F1022 y de F1087. Como se menciona antes, estos tres tipos de variantes muestran unión mejorada a ciertos FCYRS de ratón; sin embargo, se mostró que el FcyR al cual la actividad de unión se aumenta selectivamente y el grado del aumento varía dependiendo de la variante. (4-4) El efecto de eliminar antíaenos del plasma de Fv4-lqG1-F1087 y Fv4-lqG1-F1182 Mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 2, se realizaron las pruebas de infusión in vivo al usar ratones transgénicos FcRn humano para determinar las concentraciones del receptor IL-6 soluble en el plasma de los ratones. El resultado se muestra en la Fig. 6.

En ambos grupos administrados con Fv4-lgG1-F1087 y Fv4-lgG1-F1182 in vivo, que tiene actividad de unión a FCYR de ratón aumentado comparada con Fv4-lgG1, la concentración en plasma in vivo de receptor IL-6 humano soluble se reduciría en comparación con el grupo administrado con Fv4-lgG1. El efecto para reducir la concentración en plasma del receptor IL-6 humano soluble fue alto especialmente en el grupo administrado con Fv4-lgG1-F1087 que tiene unión mejorada al FCYRII de ratón y al FcyRIII de ratón. Mientras tanto, el efecto de la administración de F1182 para reducir la concentración plasmática del receptor IL-6 humano soluble fue pequeño en el grupo administrado con F1182 in vivo que tiene actividad de unión aumentada considerablemente al FcyRI de ratón y al FcyRIV de ratón (así como unión mejorado varias veces al FcyRII de ratón y al FcyRIII de ratón). Se pensó a partir de estos resultados que los FcyRs de ratón que contribuyen más significativamente por un efecto que disminuye eficientemente la concentración del antígeno en el plasma de ratones administrados con un anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH, son el FcyRII de ratón y/o el FcyRIII de ratón. Específicamente, se cree que la concentración del antígeno en plasma puede reducirse más eficientemente in vivo administrando en un organismo vivo un anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con unión mejorada al FcyRII de ratón y/o al FcyRIII de ratón. (4-5) Preparación de moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcvR es mayor gue la actividad de unión de la región Fe de IqG humana nativa v gue tiene actividad de unión a FcRn humano aumentada baio una condición del intervalo de pH ácido Como se describe en el Ejemplo 3, cuando se compara con ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1-F1022, la retención en plasma de un anticuerpo se mejora marcadamente en los ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1-F1093 que resultan de aumentar la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido de Fv4-lgG 1 -F1022 en el cual se ha aumentado la actividad de unión a FcyR de ratón. Si este efecto también se observa en los ratones transgénicos FcRn humano administrados con Fv4-lgG1-F1087 y Fv4-lgG 1 -F1182, y si el mismo efecto se observa en los ratones administrados con variantes cuya actividad de unión a FcRn humano ha sido aumentada bajo una condición del intervalo de pH ácido mediante la adición de una alteración distinta de la alteración evaluada en el Ejemplo 3 se evaluaron como sigue.

VH3-lgG1-F1180 (SEC ID NO: 46) y VH3-lgG1-F1181 (SEC ID NO: 47) se prepararon sustituyendo Leu por Met en la posición 428 y Ser por Asn en la posición 434 (numeración de UE) en las cadenas pesadas VH3-lgG1 -F 087 y VH3-lgG1-F1182, para aumentar su actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1-F1087 y de Fv4-lgG1-F1182 bajo una condición del intervalo de pH ácido. Además, VH3-lgG1-F1412 (SEC ID NO: 48) se preparó sustituyendo Ala por Asn en la posición 434 (numeración de UE) en la cadena pesada VH3-lgG -F1087, para aumentar la actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1-F1087 bajo una condición del intervalo de pH ácido. Fv4-lgG1-F1180, Fv4-lgG1-F1181 , y Fv4-lgG1-F1412, que contienen las cadenas pesadas y VL3-CK anteriores como la cadena ligera, se prepararon al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. (4-6) Mejora de la farmacodinámica de anticuerpos al aumentar la actividad de unión a FcRn humano baio una condición del intervalo de pH ácido Se realizaron las pruebas de infusión in vivo administrando Fv4-lgG1-F1180, Fv4-lgG 1 -F 1181 , y Fv4-lgG1-F1412 a ratones transgénicos FcRn humano de acuerdo con el mismo método como se describe en el Ejemplo 2 para evaluar las concentraciones del receptor IL-6 soluble en el plasma de los ratones. Los resultados en las concentraciones del receptor IL-6 soluble en el plasma de los grupos de ratón administrados con Fv4-lgG1-F1087, Fv4-lgG1 -F1180, Fv4-lgG1-F1412, y Fv4-lgG1 se muestran en la Fig. 9. Los resultados en las concentraciones del receptor IL-6 soluble en el plasma de los grupos de ratón administrados con Fv4-lgG1 -F1 82, Fv4-lgG1-F 181 , y Fv4-lgG1 se muestran en la Fig. 10. Mientras tanto, las concentraciones del anticuerpo en plasma en los grupos de ratón se midieron por el método descrito en el Ejemplo 3. Los resultados en las concentraciones del anticuerpo en plasma de Fv4-lgG1-F1087, de Fv4-lgG 1 -F1180, Fv4-lgG 1 -F 1412 , y Fv4-lgG1 en los grupos de ratón se muestran en la Fig. 7; y los resultados en las concentraciones del anticuerpo en plasma de Fv4-lgG1-F1182, Fv4-lgG1-F1181 , y Fv4-lgG1 se muestran en la Fig. 8.

Se confirmó que, como se compara con el grupo de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1182, la retención en plasma de anticuerpos se mejoró en el grupo de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1181 que resulta de aumentar la actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1-F1182 en un intervalo de pH ácido. Mientras tanto, la concentración del receptor IL-6 soluble en el plasma de los grupos de ratón administrados con Fv4-lgG1-F1181 fue comparable a la del grupo de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1182. Cuando se compara con los grupos de ratón administrados con Fv4-lgG1, la concentración del receptor IL-6 soluble en el plasma se disminuyó en ambos grupos.

Por una parte, como se compara con el grupo de ratones administrados con Fv4-lgG1 -F1087, la retención en plasma de anticuerpos se mejoró en ambos grupos de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1 80 y Fv4-lgG1-F1412 que resulta de aumentar la actividad de unión a FcRn humano de Fv4-lgG1-F1087 en un intervalo de pH ácido, y sorpresivamente, la retención en plasma se mejoró hasta un nivel comparable al de los grupos de ratón administrados con Fv4-lgG1. Por otra parte, la sostenibilidad del efecto de reducir la concentración del receptor IL-6 soluble en plasma se mejoró mediante la mejora de la retención del anticuerpo en plasma en los grupos de ratones administrados. Específicamente, en los grupos de ratones administrados, las concentraciones del receptor IL-6 soluble en plasma 14 días y 21 días después de que la administración de Fv4-lgG1-F1180 y Fv4-lgG1-F1412 se redujeron significativamente comparadas con las concentraciones 14 días y 21 días después de la administración de Fv4-lgG1-F1087.

En vista de lo anterior, como para los grupos de ratones administrados con los cuatro ejemplos de anticuerpos, Fv4-lgG1-F1093, Fv4-lgG1-F1181, Fv4-lgG1 -F1180, y Fv4-lgG1-F1412, se demostró que la retención en plasma puede mejorarse en un organismo vivo administrado con un anticuerpo en el cual la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido se ha mejorado en una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcyR es mayor que la actividad de unión de la región Fe de IgG humana nativa. También se demostró que, en el organismo vivo administrado con la molécula de unión al antígeno, la retención en plasma es mejorada sin deteriorar el efecto de eliminar los antígenos del organismo vivo, y más bien, el efecto de eliminación del antígeno puede sostenerse.

Se demuestra que la alteración para aumentar la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición en el Intervalo de pH ácido se podría lograr por medio del método que sustituye Ala por Asn en la posición 434 (numeración EU), además del método que sustituye Leu por Met en la posición 428 (numeración EU) y Ser por Asn en la posición 434 (numeración EU). Por lo tanto, puden usarse las alteraciones usadas para mejorar la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición de intervalo de pH ácido no están particularmente limitadas, y el método que sustituye Leu por Met en la posición 428 (numeración EU) y Ser por Asn en la posición 434 (numeración EU) en un anticuerpo de IgG Nat. Biotechnol. (2010) 28, 157-159), el método que sustituye Ala por Asn en la posición 434 (numeración EU) en un anticuerpo de IgG (Drug Metab. Dispos. (2010) 38 (4), 600-605), el método que sustituye Tyr por Met en la posición 252 (numeración EU), Thr por Ser en la posición 254 (numeración EU), y Glu por Thr en la posición 256 (numeración EU) en un anticuerpo de IgG (J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23524), el método que sustituye Gln por Thr en la posición 250 (numeración EU) y Leu por Met en la posición 428 (numeración EU) en un anticuerpo de IgG (J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356), el método que sustituye His por Asn en la posición 434 (numeración EU) en un anticuerpo de IgG (Clin. Pharmcol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290), así como las alteraciones descritas en los documentos WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, WO 2002/060919 y similares. (4-7) Preparación de moléculas de unión al antíaeno con actividad de unión a FcRn humano aumentada bajo una condición del intervalo de pH ácido y unión suprimida a un factor reumatoide En los últimos años, una molécula de anticuerpo que resulta de sustituir His por Asn en la posición 434 (numeración de UE) en un anticuerpo ant¡-CD4 humanizado para mejorar la retención en plasma aumentando su actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del intervalo de pH ácido, se ha reportado para unirse al factor reumatoide (RF, por sus siglas en inglés) (Clin. Pharmacol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290). Este anticuerpo tiene una región Fe de lgG1 humana y una sustitución de His por Asn en la posición 434 (numeración de UE) en el sitio de unión a FcRn. El factor reumatoide se ha demostrado para reconocer y unir a la porción sustituida.

Como se muestra en (4-6), varias alteraciones se han reportado como alteraciones para mejorar la actividad de unión a FcRn humano bajo una condición de intervalo de pH ácido, y la introducción de estas alteraciones al sitio de unión a FcRn en una región de Fe puede mejorar su afinidad a un factor reumatoide que reconozca este sitio.

Sin embargo, las moléculas de unión al antígeno que tienen actividad de unión a FcRn humano aumentada bajo una condición del intervalo de pH ácido pero no tienen la unión al factor reumatoide pueden producirse mediante la introducción en el sitio de la alteración de región Fe que reduce la actividad de unión al factor reumatoide solamente sin reducir la actividad de unión a FcRn bajo una condición del intervalo de pH ácido.

Tales alteraciones usadas para reducir la actividad de unión al factor reumatoide incluyen las alteraciones en las posiciones 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439, y 441-444 (numeración de UE), preferiblemente estas en las posiciones 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438, y 440 (numeración de UE), y particularmente de manera preferible, una alteración que sustituye Glu o Ser por Val en la posición 422, una alteración que sustituye Arg por Ser en la posición 424, una alteración que sustituye Asp por His en la posición 433, una alteración que sustituye Thr por Tyr en la posición 436, una alteración que sustituye Arg o Lys por Gln en la posición 438, y una alteración que sustituye Glu o Asp por Ser en la posición 440 (numeración de UE). Estas alteraciones pueden usarse solamente o en la combinación.

Alternativamente, es posible introducir las secuencias del glicosilación tipo N para reducir la actividad de unión al factor reumatoide. Específicamente, las secuencias de glicosilación tipo N conocidas incluye Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx representa un aminoácido arbitrario con excepción de Pro). Esta secuencia puede introducirse en la región Fe para agregar una cadena de azúcar tipo N, y la unión al RF puede inhibirse por el impedimento estérico de la cadena de azúcar tipo N. Las alteraciones usadas para agregar una cadena de azúcar tipo N incluyen preferiblemente una alteración que sustituye Asn por Lys en la posición 248, una alteración que sustituye Asn por Ser en la posición 424, una alteración que sustituye Asn por Tyr en la posición 436 y Thr por Gln en la posición 438, y una alteración que sustituye Asn por Qln en la posición 438, de acuerdo con la numeración de UE, particularmente de manera preferible una alteración que sustituye Asn por Ser en la posición 424 (numeración de UE).

[Ejemplo 5] Efectos de la eliminación de los antígenos del plasma para las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión a FcyR es mayor que la de una región Fe de ratón nativa (5-1) Efecto de eliminación del antígeno de los anticuerpos de ratón con actividad de unión a FcyR mejorada Como se describe en los Ejemplos 1 a 4, se demostró que la eliminación del receptor IL-6 humano soluble del plasma de ratón es acelerada en los grupos de ratones transgénicos FcRn humano administrados con moléculas de unión al antígeno que resultan de aumentar la actividad de unión a FcyR de ratón de las moléculas de unión al antígeno que tienen una región Fe de anticuerpo humano y la propiedad de unir al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH. Si este efecto también se alcanza en ratones normales que tienen FcRn de ratón que se administraron con moléculas de unión al antígeno que tienen una región Fe de anticuerpo de ratón y la propiedad de unirse al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH, se evaluó en ratones normales que tienen el FcRn de ratón como sigue. (5-2) Preparación de anticuerpos de ratón con actividad de unión a FcyR aumentada Para un anticuerpo lgG1 de ratón que tiene la propiedad de unirse al receptor IL-6 humano de una manera dependiente al pH, la cadena pesada VH3-mlgG1 (SEC ID NO: 49) y la cadena ligera VL3-mk1 (SEC ID NO: 50) se construyeron al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Mientras tanto, para aumentar la actividad de unión a FcyR de ratón de VH3-mlgG1, VH3-mlgG1 -mF44 (SEC ID NO: 51) se produjo mediante la sustitución de Asp por Ala en la posición 327 (Numeración de UE). Asimismo, VH3-mlgG1 -mF46 (SEC ID NO: 52) se produjo mediante la sustitución de Asp por Ser en la posición 239 y Asp por Ala en la posición 327, de acuerdo con la numeración de EU, en VH3-mlgG1. Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG 1 -mF44, y Fv4-mlgG1-mF46, que contienen VH3-mlgG1, VH3-mlgG1-mF44, y VH3-mlgG1-mF46, respectivamente, como la cadena pesada, y VL3-mk1 como la cadena ligera, se prepararon al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencial 2. (5-3 Evaluación de la actividad de unión a FcyR de ratón VH3/L (WT)-mlgG1, VH3/L (WT)-mlgG1 -mF44, y VH3/L (WT)-mlgG1-mF46, que contienen VH3-mlgG 1 , VH3-mlgG1 -mF44, y VH3-mlgG1 -mF46, respectivamente, como la cadena pesada, y L (WT)-CK (SEC ID NO: 42) como la cadena ligera, se prepararon mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Estos anticuerpos se evaluaron para su actividad de unión a FcyR de ratón mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. El resultado se muestra en la Tabla 9. Además, la relación del aumento en la actividad de unión a FCYR de ratón de cada variante con relación a la mlgG1 antes de la alteración se muestra en la Tabla 10. En la tabla, VH3/L (WT)-mlgG1 , VH3/L (WT)-mlgG1 -mF44, y VH3/L (WT)-mlgG1-mF46 se muestran como mlgG1, mF44, y mF46, respectivamente.

[Tabla 9] El resultado de evaluación del Ejemplo 4 muestra que VH3/L (WT)-mlgG1 que tiene la región Fe del anticuerpo lgG1 de ratón nativa se une solamente al FcyRIIb de ratón y al FcyRIII de ratón pero no al FcyRI de ratón y al FcyRIV de ratón, sugiere que los FcyRs de ratón principal para la reducción de la concentración del antígeno son el FcyRIl de ratón y/o el FcyRIII de ratón. VH3/L (WT)-mlgG-mF44 y VH3/L (WT)-mlgG1 -mF46 introducidos con una alteración que se cree para aumentar la actividad de unión a FcyR de VH3/L (WT)-mlgG1 se demostró para tener actividad de unión aumentada a ambos de FcyRIIb de ratón y de FcyRIII de ratón. (5-4) Evaluación del efecto para reducir la concentración del receptor IL-6 soluble en el plasma de ratones normales El efecto para eliminar el receptor soluble IL-6 del plasma de ratones normales administrados con el anticuerpo del receptor anti-humano Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1-mF44, o Fv4-mlgG 1 mF46 IL-6 se evaluó como sigue.

Se creó un modelo animal donde la concentración del receptor IL-6 humano soluble se mantiene en un de estado estacionario en plasma implantando una bomba de infusión (MINI-BOMBA OSMÓTICA MODELO 2004; alzet) que contiene el receptor IL-6 humano soluble bajo la piel en la parte posterior de los ratones normales (ratón C57BL/6J, Charles River Japón). Se evaluó la dinámica in vivo del receptor IL-6 humano soluble después de la administración del anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano en el modelo animal. Para suprimir la producción de anticuerpos contra el receptor IL-6 humano soluble, se administró un anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón una vez a 20 mg/kg en la vena caudal. Entonces, una bomba de infusión que contenía 92.8 pg/ml de receptor IL-6 humano soluble se implantó subcutáneo en la parte posterior de los ratones. Tres días después de la implantación de la bomba de infusión, se administró el anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano una vez a 1 mg/kg en la vena caudal. Se recolectó la sangre de los ratones 15 minutos, siete horas, un día, dos días, cuatro días, siete días, 14 días (o 15 días), y 21 días (o 22 días) después de la administración del anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano. Inmediatamente después, se centrifugó la sangre recolectada a 15,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para preparar el plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador ajustado a -20°C o menos hasta el uso.

Las concentraciones del receptor IL-6 humano soluble en plasma se determinaron por el método descrito en (2-1-2). El resultado se muestra en la Fig. 11.

Sorpresivamente, se demostró que, en los ratones administrados con mF44 y mF46 introducidos con una alteración para aumentar la actividad de unión de mlgG1 (lgG1 de ratón nativo) al FcyRIIb de ratón y al FcyRIII de ratón, la concentración del receptor IL-6 en plasma se redujo marcadamente comparada con los ratones administrados con mlgG1. En particular, incluso en el día 21 después de la administración de mF44, la concentración del receptor IL-6 en plasma en el grupo administrado con mF44 se redujo por aproximadamente 6 veces en comparación con la concentración del receptor IL-6 en plasma en el grupo sin administración de anticuerpo, y aproximadamente 10 veces como se compara con el grupo administrado con mlgG1. Por una parte, en el día siete después de la administración de mF46, la concentración del receptor IL-6 en plasma en el grupo administrado con mF46 se redujo marcadamente por aproximadamente 30 veces en comparación con la concentración del receptor IL-6 en plasma en el grupo sin administración de anticuerpo, y aproximadamente 50 veces como se compara con el grupo administrado con mlgG1.

Los hallazgos anteriores demuestran que la eliminación del receptor soluble IL-6 del plasma también se aceleró en ratones administrados con anticuerpos en los cuales la actividad de unión a FcyR de ratón de una molécula de unión al antígeno que tiene las regiones Fe de anticuerpo I g G 1 de ratón se aumentó, como con los anticuerpos de los cuales la actividad de unión a FcyR de ratón de una molécula de unión al antfgeno que tiene la región Fe de anticuerpo I g G 1 humana se aumentó. Sin estar unido por una teoría particular, el fenómeno observado como se describe anteriormente puede explicarse como sigue.

Cuando se administran a los ratones, los anticuerpos que se unen a un antígeno soluble de una manera dependiente al pH y tienen actividad de unión a FcyR aumentada se incorporan activamente de manera principal en las células que expresan el FcyR en la membrana celular. Los anticuerpos incorporados disocian el antígeno soluble bajo una condición de pH ácido en el endosoma, y entonces reciclado al plasma a través de FcRn. Así, un factor que alcanza el efecto de eliminar el antígeno soluble en plasma de tal anticuerpo es el nivel de actividad de unión a FcyR del anticuerpo. Específicamente, como la actividad de unión a FcyR es mayor, la incorporación en células de expresión de FcyR ocurre más activamente, y esto hace la eliminación de los antígenos solubles del plasma más rápido. Además, siempre y cuando se haya aumentado la actividad de unión a FcyR, el efecto puede evaluarse de la misma manera sin importar si la región Fe contenida en un anticuerpo originado a partir de la lgG1 humana o de ratón. Específicamente, la evaluación puede alcanzarse por una región Fe de cualquier especie animal, como cualquiera lgG1 humana, lgG2 humana, lgG3 humana, lgG4 humana, lgG1 de ratón, lgG2a de ratón, lgG2b de ratón, lgG3de ratón, IgG de rata, IgG de mono, y IgG de conejo, siempre y cuando la actividad de unión al FcyR de la especie animal que se administrará se haya aumentado.

[Ejemplo 6] El efecto de eliminación del antígeno por los anticuerpos con la actividad de unión aumentada de una manera selectiva de FcyRIIb (6-1) El efecto de eliminación del antígeno de los anticuerpos en los cuales la actividad de unión a FcvRllb se ha aumentado selectivamente Los ratones deficientes de FcyRI 11 (ratón B6.129P2-FcgrR3tm1 Sjv/J, Jackson Laboratories), expresaron FcyRI de ratón, FcyRIIb de ratón, y FcyRIV de ratón, pero no FcyRI 11 de ratón. Mientras tanto, los ratones deficientes de cadena y del receptor (ratón Fcerlg, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529) expresó el FcyRIIb de ratón solamente, pero no FcyRI de ratón, FcyRIII de ratón, y FcyRIV de ratón.

Como se describe en el Ejemplo 5, se demostró que mF44 y mF46 con actividad de unión a FCYR aumentada de la IgG 1 de ratón nativa muestra unión selectivamente mejorada al FcyRIIb de ratón y al FcyRIII de ratón. Se concibió que, al usar la actividad de unión selectivamente aumentada de los anticuerpos, la condición bajo la cual un anticuerpo con unión a FcyRIIb de ratón selectivamente mejorada es administrada puede imitarse administrando mF44 y mF46 a ratones deficientes de FcyRIII de ratón o ratones deficientes de cadena y del receptor Fe que no expresan el FcyRIII de ratón. (6-2) Evaluación del efecto de eliminación del antíqeno por la mejora selectiva de unión al FcvRllb de ratón al usar ratones deficientes de FcyRIII El efecto para eliminar el receptor IL-6 soluble del plasma en los ratones deficientes de FcyRIII administrados con el anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1-mF44, o Fv4-mlgG 1 -mF46 se evaluó mediante el mismo método descrito en el Ejemplo 5. Las concentraciones del receptor IL-6 humano soluble en el plasma de los ratones se determinaron mediante el método descrito en el Ejemplo (2-1-2). El resultado se muestra en la Fig. 12.

Sorpresivamente, se demostró que, las concentraciones del receptor IL-6 en plasma en ratones deficientes de FcyRIII administrados con mF44 y mF46, que imitan la condición bajo la cual la actividad de unión a FcyRIIb de ratón de mlgG1 (lgG1 de ratón nativa) se aumenta selectivamente, se redujeron marcadamente comparadas con la concentración del receptor IL-6 en plasma en ratones administrados con mlgG1. En particular, la concentración del receptor IL-6 en plasma del grupo administrado con mF44 se redujo por aproximadamente tres veces en comparación con la del grupo administrado con mlgG1 y se suprimió la acumulación de la concentración del anticuerpo debido a la administración del anticuerpo. Mientras tanto, en el día tres después de la administración, la concentración del receptor IL-6 en plasma del grupo administrado con mF46 se redujo marcadamente por aproximadamente seis veces en comparación con la concentración del receptor IL-6 en plasma del grupo sin administración del anticuerpo, y aproximadamente 25 veces en comparación con la concentración del receptor IL-6 en plasma del grupo administrado con mlgG1. Este resultado muestra que, como la actividad de unión a FCYRIID de ratón de un anticuerpo del anti-receptor IL-6 humano que se une al antígeno de una manera dependiente al pH es mayor, la concentración del receptor IL-6 puede reducirse más en el plasma de ratones administrados con el anticuerpo. (6-3) Evaluación del efecto de eliminación del antígeno por la mejora selectiva de unión a FcvRllb de ratón al usar ratones deficientes de cadena y del receptor Fe El efecto para eliminar el receptor soluble IL-6 del plasma de ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe administrados con el anticuerpo del receptor anti-IL-6humano Fv4-mlgG1, Fv4- mlgG1-mF44, o Fv4-mlgG1 mF46, se evaluó mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 5. Las concentraciones del receptor IL-6 humano soluble en el plasma de ratones se determinaron mediante el método descrito en el Ejemplo (2-1-2). El resultado se muestra en la Fig. 13.

Como con el caso donde se administraron mF44 y mF46 a ratones deficientes de FcvRIII, la concentración del receptor IL-6 en plasma en ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe administrados con mF44 y mF46, que imitan la condición que resulta del aumento selectivo en la actividad de unión a FcvRllb de ratón de mlgG1 (lgG1 de ratón nativa), se demostró para ser reducida marcadamente en comparación con la concentración del receptor IL-6 en plasma en ratones deficientes de cadena ? del receptor Fe administrados con mlgG1. En particular, la se redujo concentración del receptor IL-6 en plasma en el grupo administrado con mF44 de aproximadamente tres que en el grupo administrado con mlgG1, y se suprimió la acumulación de la concentración del antígeno debido a la administración del anticuerpo. Mientras tanto, en el día tres después de la administración, la concentración del receptor IL-6 en plasma en el grupo administrado con mF46 se redujo marcadamente por aproximadamente cinco veces en comparación con la del grupo sin administración de anticuerpo, y aproximadamente 15 veces en comparación con la del grupo administrado con mlgG1.

Los resultados descritos en los Ejemplos (6-2) y (6-3) muestran que la concentración del antígeno soluble en el plasma es reducida marcadamente en el grupo administrado con un anticuerpo que se une a un antígeno soluble de una manera dependiente al pH y tiene actividad de unión a FcYRIIb de ratón selectivamente aumentada.

[Ejemplo 7] El efecto de eliminación del antígeno de anticuerpos con mejora selectiva de la unión a FCYRIII (7-1) El efecto de eliminación del antígeno de los anticuerpos con la unión a FcvRIII selectivamente mejorada Los ratones deficientes de FcyRIIb (ratón Fcgr2b (FCYRII), Tacónico) (Nature (1996) 379 (6563), 346-349) expresaron el FCYRI de ratón, FCYRIII de ratón, y FCYRIV de ratón, pero no el FcYRIIb de ratón. Como se describe en el Ejemplo 5, se demostró que mF44 y mF46 que resultan de aumentar la actividad de unión a FCYR de la lgG1 de ratón nativa muestra unión mejorada selectivamente a FcYRIIb de ratón y a FCYRIII de ratón. Se concibió que, basado en el uso de la actividad de unión selectivamente aumentada de los anticuerpos, la condición de la administración de un anticuerpo con unión selectivamente mejorada a FCYRIII de ratón puede imitarse administrando mF44 o mF46 a ratones deficientes de FcYRIIb de ratón que no expresa FcYRIIb de ratón.

Como se describe en el Ejemplo 6, se redujo la concentración del antígeno soluble en el plasma de ratones deficientes de FcyR 111 , que imitan la condición de la administración de un anticuerpo con actividad de unión a FcvRllb de ratón aumentada selectivamente. Mientras tanto, si la concentración del antígeno soluble es reducida en el plasma de ratones deficientes de FcYRIIb, que imitan la condición de la administración de un anticuerpo con actividad de unión a FcvRIII de ratón aumentada selectivamente, se evaluó mediante la prueba descrita más adelante. (7-2) Evaluación del efecto de eliminación del antígeno mediante la mejora selectiva de la unión a FcvRIII de ratón mejorada al usar ratones deficientes de FcyRIIb El efecto para eliminar el receptor soluble IL-6 del plasma de ratones deficientes de FcYRIIb administrados con el anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano Fv4-mlgG1, Fv4-mlgG1 -mF44, o Fv4-mlgG1 mF46, se evaluó mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 5. Las concentraciones del receptor IL-6 humano soluble en plasma se determinaron mediante el método descrito en el Ejemplo (2-1-2). El resultado se muestra en la Fig. 14.

Sorpresivamente, en los grupos administrados con mF44 y mF46, que imitan el aumento selectivo de la actividad de unión a FCYRIII de ratón de mlgG1 (lgG1 de ratón nativa), se redujo la concentración del receptor IL-6 en plasma, pero la reducción notable no se confirmó comparada con la mostrada en el Ejemplo 6.

Sin estar unida por una teoría particular, basada en los resultados descritos en los Ejemplos 5, 6, y 7, es posible la siguiente discusión. La eliminación del receptor IL-6 soluble del plasma se encontró para ser acelerada marcadamente en ratones normales que expresan el FcyRIIb de ratón y el FcyRI 11 de ratón que se administraron con mF44 y mF46 con actividad de unión selectivamente aumentada de mlgG1 (lgG1 de ratón nativa) a FcyRIIb de ratón y a FcyR 111 de ratón. Además, se reveló que, cuando mF44 y mF46 se administraron a los ratones que expresan el FcyRIIb de ratón pero no el FcyRIII de ratón (es decir, ratones deficientes de FcyRIII y ratones deficientes de cadena y del receptor Fe), la eliminación del receptor IL-6 soluble del plasma también fue acelerada marcadamente en los ratones. Mientras tanto, cuando se administraron mF44 y mF46 a ratones que expresaron FcyRIII de ratón pero no FcyRIIb de ratón (es decir, ratones deficientes de FcyRIl), la eliminación del receptor IL-6 soluble del plasma no fue acelerado notablemente en ratones hasta el punto que fueron administrados en los ratones.

A partir de los hallazgos anteriores, se cree que, los anticuerpos mF44 y mF46 en los cuales se aumenta la actividad de unión de mlgG1 (lgG1 de ratón nativa) a FcyRIIb de ratón y a FcyRIII de ratón, se incorporan en células de expresión de FcyR principalmente por el FcyRIIb de ratón, y así se elimina el antígeno soluble en el plasma que se une a los anticuerpos. Mientras tanto, la incorporación mediada por FcyRIII de complejos de anticuerpos/antígenos en las células de expresión de FcyR se cree para no contribuir significativamente con la eliminación del antígeno soluble del plasma.

Además, como se muestra en el Ejemplo 4, la concentración plasmática del receptor IL-6 soluble se redujo marcadamente en ratones administrados con Fv4-lgG1-F1087 que tienen actividad de unión aumentaba a FcyRIIb de ratón y a FcyRIII de ratón, en particular. Mientras tanto, el efecto para eliminar el receptor IL-6 soluble del plasma de ratones administrados con Fv4-lgG1-F1182 con actividad de unión aumentada a FcyRI de ratón y a FcyRIV de ratón, en particular, fue más pequeño que el de Fv4-lgG1-F1087.

Además, como se muestra en el Ejemplo 2, en ratones administrados con Fv4-lgG1-Fuc cuya actividad de unión a FcyRIV de ratón ha sido aumentada considerablemente por tener cadenas de azúcar con bajo contenido de fucosa (Science (2005) 310 (5753), 1510-1512), la concentración plasmática del receptor IL-6 soluble se redujo en comparación con la de los ratones administrados con Fv4-lgG1; sin embargo, el efecto de reducción fue tan pequeño como aproximadamente dos veces. Así, la incorporación mediada por FcyRIV de ratón de anticuerpos en células de expresión de FcyR se cree para no contribuir significativamente con la eliminación de antígenos solubles del plasma.

En vista de lo anterior, se demuestra que, de varios FcyRs de ratón, FcyRIIb de ratón desempeña un papel principal en la incorporación del anticuerpo en células de expresión de FcyR en ratones. Así, sería pensado que las mutaciones que se introducirán en el dominio de unión a FCYR de ratón incluyen particularmente de manera preferible, pero no se limita a, mutaciones que mejoran la unión al FcyRIIb de ratón.

Los hallazgos anteriores demuestran que, en ratones la actividad de unión a FcvRllb de los anticuerpos que se administrarán es más preferiblemente aumentada para acelerar la eliminación de antígenos solubles del plasma de un organismo vivo administrándole moléculas de unión al antígeno que se unen a los antígenos solubles de una manera dependiente al pH y tiene actividad de unión a FcyR aumentada. Específicamente, cuando se administraran a un organismo vivo, las moléculas de unión al antígeno que se unen a los antígenos solubles de una manera dependiente al pH y tiene actividad de unión a FcyRIIb aumentada pueden acelerar la eliminación de los antígenos solubles del plasma y reduce efectivamente la concentración plasmática de antígenos solubles, y así, las moléculas de unión al antígeno se revelaron para mostrar una acción muy eficaz.

[Ejemplo 8] Evaluación de la capacidad de agregación plaquetaria de anticuerpos que contienen una región Fe introducida con una alteración existente que mejora la unión a FcyRIIb (8-? Preparación de anticuerpos que contienen una región Fe introducida con una alteración existente que mejora la unión a FcyRIIb Como se describe en el Ejemplo 7, los antlgenos pueden eliminarse eficientemente del plasma del organismo vivo administrando anticuerpos con actividad de unión a FcvRllb selectivamente aumentada al organismo vivo. Además, la administración de los anticuerpos que contienen una región Fe con actividad de unión a FcvRllb selectivamente aumentada es probablemente preferida del punto de vista de seguridad y efectos secundarios en el organismo vivo administrado con tales anticuerpos.

Sin embargo, la unión a FcvRllb de ratón y la unión a FCYRIII de ratón se mejoran en mF44 y mF46, y así la mejora de unión no es selectiva para el FcyRIIb de ratón. Puesto que la homología entre el FcyRIIb de ratón y el FcyRI 11 de ratón es alta, sería difícil encontrar una alteración que mejore la unión selectiva a FcyRIIb de ratón mientras se distinguen las dos. Por otra parte, no existe reporte previo sobre las regiones Fe con unión a FcyRIIb de ratón selectivamente mejorada. También, la homología entre el FcyRIIb humano y el FcyRIIa humano (los dos alotipos, 131Arg y 131 H is) también se conoce para ser alta. Por otra parte, no existe reporte sobre las regiones Fe que contienen una alteración que mejore la unión selectivo a FcyRIIb humano mientras que distingue los dos (Seung et al., (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933); Greenwood et al., (Eur. J. Immunol. (1993) 23 (5), 1098-1104)). Además, se ha reportado que los anticuerpos con la unión a FcyRIIa aumentan la actividad agregante de plaquetas y pueden aumentar el riesgo de desarrolar la trombosis cuando se administran a los organismos (Meyer et al., (J. Thromb. Haemost. (2009), 7 (1), 171-181); y Robles-Carrillo ef al., (J. Immunol. (2010), 185 (3), 1577-1583)). Así, si los anticuerpos con unión de FcYRIIa aumentada tienen una actividad agregante de plaquetas mejorada se determinó como sigue. (8-2) Evaluación de la actividad de unión a FcvR humano de anticuerpos que contienen una región Fe introducida con una alteración existente que mejora la unión a FcyRIIb Los anticuerpos que contenían una región Fe introducida con una alteración existente que mejora la unión a FcyRIIb humano se analizó para su afinidad para el FcyRIa humano, FcyRIIa tipo R y tipo H, FcyRIIb, y FcyRIIIa mediante el siguiente procedimiento. Se construyó una cadena H para tener, como la región variable de cadena H de anticuerpo, la región variable de anticuerpo IL6R-H (SEC ID NO: 53) contra el receptor de la interleucina 6 humana que se describe en el documento WO2009/125825, y como la región constante de cadena H de anticuerpo, IL6R-G1d (SEC ID NO: 54) que tiene la G1d que resulta de eliminar Gly de C terminal y Lys de la lgG1 humana. Entonces, se construyó IL6R-G1d-v3 (SEC ID NO: 55) alterando la región Fe de IL6R-G1d mediante la sustitución de Glu por Ser en la posición 267 (numeración de UE) y Phe por Leu en la posición 328 (numeración de UE), como se describe en Seung et al., (Mol.

Immunol. (2008) 45, 3926-3933). La IL6R-L (SEC ID NO: 56) la cual es la cadena L del anticuerpo del receptor anti-interleucina 6 humana se usó como una cadena L de anticuerpo común, y expresado en combinación con las cadenas H respectivas de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1, y se purificaron los anticuerpos resultantes. Más adelante, los anticuerpos que contienen IL6R-G1d e IL6R-G1d-v3 como la cadena pesada se refieren como lgG1 e lgG1-v3, respectivamente.

Entonces, la interacción entre FCYR y los anticuerpos anteriores cinéticamente analizados usan Biacore T100 (GE Healthcare). Se realizó el ensayo para la interacción a 25°C al usar HBS-EP+ (GE Healthcare) como un amortiguador de corrida. La matriz usada fue una matriz de Sensor CM5 serie S (GE Healthcare) inmovilizada con proteína A mediante un método de combinación de amino. Cada FcyR diluido con el amortiguador de corrida se dejó interactuar con los anticuerpos de interés capturados sobre la matriz para medir la unión de los anticuerpos a cada FcyR. Después de la medición, 10 mM de glicina-HCI (pH 1.5) se hicieron reaccionar a la matriz para lavar los anticuerpos capturados para usar repetidamente la matriz regenerada. Se analizó un sensograma obtenido como un resultado de la medición se al usar 1:1 de modelo de unión a Langmuir con el Software de Evaluación de Biacore, y se calcularon la constante de velocidad de unión ka (L/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), y se calculó la constante de disociación KD (mol/l) a partir estos valores. Los valores de la KD de IgG 1 y de lgG1-v3 a cada FcyR (los valores de la KD de cada anticuerpo para cada FcyR) se muestran en la tabla 11, mientras los valores de la KD relativa de lgG1-v3, que son obtenidos dividiendo KD de lgG1 para cada FcyR por KD de lgG1-v3 para cada FcyR, se muestran en la Tabla 12.

[Tabla 11] [Tabla 12] Estos resultados confirmaron que en comparación con el anticuerpo que contiene la región de Fe de I g G 1 , el anticuerpo que contiene una región de Fe alterada en la cual Ser en la posición 267 se ha sustituido con Glu y Leu en la posición 328 se ha sustituido con Phe, según lo indicado por la enumeración de EU, en la región de Fe de lgG1 (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926- 3933), tiene la afinidad 408 veces aumentada a FcgRIIb, y mientras la afinidad al tipo FcgRIIa H se disminuyó 0.51 veces, la afinidad al tipo de FcgRIIa R se aumentó 522 veces. (8-3) Evaluación de la capacidad de agregar plaquetas A continuación, si la afinidad de FcYRIIa aumentada/reducida del anticuerpo que contiene la región Fe con la sustitución de Glu por Ser en la posición 267 y Phe por Leu en la posición 328 (numeración de UE) en la región Fe de la IgG 1 cambia la capacidad de agregación plaquetaria, se evaluó al usar plaquetas derivadas de donantes con FcYRIIa tipo H o tipo R. El anticuerpo que comprende como el omalizumab_VL-CK de cadena ligera (SEC ID NO: 58) y omalizumab_VH-G 1 d (SEC ID NO: 57) que contiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo hlgG1 (región constante de IgGlhumana) que se une a I g E y la región constante de cadena pesada de G1d, se construyeron al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, se construyó el omalizumab_VH-G 1 d-v3 (SEC ID NO: 59) mediante la sustitución de Glu por Ser en la posición 267 y Phe por Leu en la posición 328 (Numeración de UE) en omalizumab_VH-G1 d. El omalizumab-G1 d-v3, que contiene omalizumab_VH-G1 d-v3 como la cadena pesada y el omalizumab_VL-CK como la cadena ligera, se preparó al usar el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó este anticuerpo para la capacidad de agregación plaquetaria.

Se ensayó la agregación plaquetaria al usar el agregómetro plaquetario HEMA TRACER 712 (LMS Co.). Primero, se recolectaron aproximadamente 50 mi de sangre entera en una cantidad fija en tubos de recolección de sangre evacuada de 4.5 mi que contenían 0.5 mi de 3.8% de citrato de sodio, y esto se centrifugó a 200 g durante 15 minutos. El sobrenadante resultante se recolectó y se usó como plasma rico en plaquetas (PRP, por sus siglas en inglés). Después se lavó el PRP con amortiguador A (137 mM de NaCI, 2.7 mM de KCI, 12 mM de NaHC03, 0.42 mM de NaH2P04, 2 mM de MgCI2, 5 mM de HEPES, 5.55 mM de dextrosa, 1.5 U/ml de apirasa, 0.35% de BSA), el amortiguador se sustituyó con amortiguador B (137 mM de NaCI, 2.7 mM de KCI, 12 mM de NaHC03, 0.42 mM de NaH2P04, 2 mM de MgCI2, 5 mM de HEPES, 5.55 mM de dextrosa, 2 mM de CaCI2, 0.35% de BSA). Esto produjo plaquetas lavadas a una densidad de aproximadamente 300,000/µ?. Se dividieron en alícuotas 156 µ? de las plaquetas lavadas en cubetas de ensayo que contenían una barra de agitación en el agregómetro de plaquetas. Las plaquetas se agitaron a 1000 rpm con la barra de agitación en las cubetas mantenidas a 37.0°C en el agregómetro de plaquetas. 44 µ? del complejo inmune de omalizumab-G 1 d-v3 e IgE en una relación molar de 1:1, preparados a concentraciones finales de 600 g ml y 686 pg/ml, respectivamente, se agregaron a las cubetas. Las plaquetas se hicieron reaccionar con el complejo inmune mediante cinco minutos. Entonces, a una concentración que no permite la agregación plaquetaria secundaria, se agregó difosfato de adenosina (ADP, SIGMA) a la mezcla de reacción para probar si la agregación es mejorada.

El resultado de la agregación plaquetaria para cada donante con una forma polimórfica de FcyRIIa (H/H o R/H) obtenido del ensato anterior se muestra en las Figs. 15 y 16, respectivamente. A partir del resultado en la Fig. 15 se muestra que, la agregación plaquetaria mejoró cuando se agregó el complejo inmune a las plaquetas de un donante con la forma polimórfica de FcYRIIa (R/H). Mientras tanto, como se muestra en la Fig. 16, la agregación plaquetaria no se mejoró cuando el complejo inmune se agregó a las plaquetas de un donante con la forma polimórfica de FcYRIIa (H/H).

Después, la activación de plaquetas se evaluó al usar marcadores de activación. La activación de plaquetas puede medirse basada en la expresión aumentada de un marcador de activación como CD62p (p-selectina) o integrina activa en la superficie de la membrana de la plaqueta. 2.3 µ? del complejo inmune se agregaron a 7.7 µ? de las plaquetas lavadas preparadas mediante el método descrito antes. Después de cinco minutos de reacción a temperatura ambiente, la activación se indujo agregando el ADP a una concentración final de 30 µ?, y si el complejo inmune mejora se evaluó la activación dependiente de ADP. Una muestra agregada con el amortiguador de fosfato (pH 7.4) (Gibco), en vez del complejo inmune, se usó como un control negativo. Se realizó el teñido agregando, a cada muestra después de la reacción, anticuerpo anti-CD62 etiquetado con PE (BECTON DICKINSON), anticuerpo anti-CD61 etiquetado con PerCP, y anticuerpo PAC-1 etiquetado con FITC (BD bioscience). La intensidad de fluorescencia para cada tinción se midió al usar un citómetro de flujo (FACS Cantoll, BD bioscience).

El resultado en la expresión de CD62p, obtenida mediante el método de ensayo anterior, se muestra en la Fig. 17. El resultado en la expresión de integrina activada se muestra en la Fig. 18. Las plaquetas lavadas usadas se obtuvieron a partir de una persona sana con la forma polimórfica de FcyRIIa R/H. Tanto CD62p como las integrinas activas se expresaron en la superficie de la membrana de plaquetas, que es inducida por estimulación de ADP, se mejoró en presencia del complejo inmune.

Los resultados anteriores demuestran que el anticuerpo que tiene la región Fe introducida con una alteración existente que mejora la unión a FcYRIIb humano, que es la sustitución de Glu por Ser en la posición 267 y Phe por Leu en la posición 328 (numeración de UE) en la región Fe de lgG1, promueve la agregación de las plaquetas cuyo alotipo es aquel en el cual el aminoácido en la posición 131 es R, en comparación con las plaquetas cuyo alotipo FcyRIIa es aquel en el cual el aminoácido en la posición 131 es H. Es decir, se sugerió que el riesgo de desarrollar trombosis debido a la agregación plaquetaria puede aumentarse cuando un anticuerpo que contiene una región Fe introducida con una alteración existente que mejora la unión a FcyRIIb humano existente se administra a los humanos que tienen FcyRIIa tipo R. Se mostró que las moléculas de unión al antígeno que contienen una región Fe de la presente invención que mejora la unión a FcyRIIb no sólo mejoran más selectivamente la retención del antígeno en plasma, sino también soluciona posiblemente los problemas anteriores. Así, la utilidad de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención es obvia. [Ejemplo 9] Análisis comprensivo de la unión a FcYRIIb de las variantes introducidas con una alteración en la porción de bisagra además de la alteración P238D En un Fe producido sustituyendo Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Asp en una I g G 1 humana que ocurre naturalmente, un efecto combinatorio anticipado no podría obtenerse incluso combinándolo con otra alteración prevista para aumentar además la unión a FcYRIIb a partir del análisis de anticuerpos que ocurren naturalmente. Por lo tanto, para encontrar las variantes que mejoran además la unión a FcYRIIb, las alteraciones se introdujeron comprensivamente en el Fe alterado producido sustituyendo Pro en la posición 238 (numeración de UE) con ASP. Se produjo IL6R-F11 (SEC ID NO: 60) introduciendo una alteración de la sustitución et en la posición 252 (numeración de UE) con Tyr y una alteración de la sustitución Asn en la posición 434 (numeración de UE) con Tyr en IL6R-G1d (SEC ID NO: 54) la cual se usó como la cadena H del anticuerpo. Además, se preparó IL6R-F652 (SEC ID NO: 61) introduciendo una alteración de la sustitución Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Asp en IL6R-F11. Se prepararon plásmidos de expresión que contenían una secuencia de cadena H del anticuerpo para cada una de las secuencias de cadena H del anticuerpo producidas sustituyendo la región cerca del residuo en la posición 238 (numeración de UE) (posiciones 234 a 237, y 239 (numeración de UE)) en L6R-F652 cada uno con 18 aminoácidos excluyendo los aminoácidos y la cisteína originales. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como una cadena L del anticuerpo. Se expresaron estas variantes y se purificaron mediante el método del Ejemplo de Referencia 1. Estas variantes de Fe se llaman variantes PD. Se evaluaron las interacciones de cada variante PD con FcyRIIa y FcyRIIb tipo R comprensivamente por el método del Ejemplo de Referencia 2.

Una figura que muestra los resultados de analizar la interacción con los FcyRs respectivos se produjo de acuerdo con el siguiente método. El valor obtenido dividiendo el valor por la cantidad de unión de cada variante PD a cada FcyR por el valor por la cantidad de unión a FcyR del anticuerpo previamente alterado que se usa como el control (IL6R-F652/IL6R-L, que tiene una alteración de sustituir Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Asp y después multiplicar el resultado por 100, se muestra como el valor de actividad de unión relativa de cada variante PD a cada FcyR. El eje horizontal muestra los valores relativos de la actividad de unión a FcyRIIb de cada variante PD, y el eje vertical muestra los valores relativos de los valores de actividad de unión a FcyRIIa tipo R de cada variante PD (Fig. 19).

Como un resultado, se encontró que la unión a FcyRIIb de once tipos de alteraciones se mejoró comparada con el anticuerpo antes de introducir las alteraciones, y tienen los efectos de mantener o de mejorar la unión a FcyRIIa tipo R. Las actividades de estas once variantes para unir FcyRIIb y FcyRIIaR se resumen en la Tabla 13. En la tabla, los números de ID de la secuencia se refieren a los de las cadenas H de las variantes, y la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-F11 (SEC ID NO: 60).

[Tabla 13] La Fig. 20 muestra los valores relativos para la actividad de unión a FcyRIIb obtenida adicionalmente introduciendo las once alteraciones mencionada antes en una variante que lleva la alteración de P238D, y los valores relativos para la actividad de unión a FcyRIIb de una variante obtenida introduciendo las alteraciones en un Fe que no contiene el P238D. Estas once alteraciones mejoraron la cantidad de unión a FcyRIIb comparada con la introducción anterior cuando se introdujeron además en la variante P238D. De lo contrario, el efecto de disminuir la unión a FcyRIIb se observó para ocho de esas alteraciones excepto G237F, G237W, y S239D, cuando se introdujeron en la variante que no contiene P238D (datos no mostrados).

Estos resultados mostraron que, basado en los efectos de introducir alteraciones en una I g G 1 que ocurre naturalmente, es difícil predecir los efectos de combinar y de introducir las mismas alteraciones en la variante que contiene la alteración P238D. En otras palabras, no habría sido posible descubrir que estas ocho alteraciones identificadas en esta ocasión sin esta investigación que introduce las mismas alteraciones se combinan y se introducen en la variante que contiene la alteración P238D.

Los resultados de medir los valores de la KD de las variantes indicadas en la Tabla 13 para FcyRIa, FcyRIIaR, FcyRIIaH, FcyRIIb, y FcYRIIIaV mediante el método del Ejemplo de Referencia 2 se resumen en la Tabla 14. En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-F11 (SEC ID NO: 141). El molde usado para producir IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*). Además, KD(llaR)/KD(llb) y KD(llaH)/KD(llb) en la tabla respectivamente muestran el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de cada variante para FcyRIIaR por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIb, y el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de cada variante para FcyRIIaH por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIb. La KD (llb) del polipéptido/KD(llb) original de la variante se refiere a un valor obtenido dividiendo el valor de la KD del polipéptido original para FcyRIIb por el valor de la KD de cada variante para I FcYRIlb.

Además, la Tabla 14 muestra los valores de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcYRIIaH de cada variante/valores de la KD para la más furte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original. Aquí, el polipéptido original se refiere a una variante que tiene IL6R-F11 (SEC ID NO: 60) como la cadena H. Se determinó que debido a la débil unión de FcyR a IgG, fue imposible analizarla exactamente mediante análisis cinético, y así las células rellenas de color gris en la Tabla 15 muestran los valores calculados al usar la Ecuación 2 del Ejemplo de Referencia 2.

[Ecuación 2] KD= CRmax/(Roq-RI)-C La Tabla 14 muestra que todas las variantes mejoraron su afinidad para FcYRIlb comparada con IL6R-F11, y el intervalo de mejora fue 1.9 veces a 5.0 veces. La relación del valor de la KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de la KD de cada variante para FcYRIlb, y la relación del valor de la KD de cada variante para FcYRIlaH/valor de la KD de cada variante para FcYRIlb representan una actividad de unión a FcYRIlb con relación a la actividad de unión a FcYRIIaH y la actividad de unión a FcYRIIaR, respectivamente. Es decir, estos valores muestran el grado de selectividad de unión de cada variante para FCYRIID, y un valor más grande indica una selectividad de unión mayor por FCYRIID. Para el polipéptido original IL6R-F11/IL6R-L, la relación del valor de la KD para FcYRIIaR/valor de la KD para FCYRIID y la relación del valor de la KD para FcYRIlaH/valor de la KD para FCYRIID son ambo 0.7, y por consiguiente todas las variantes en la Tabla 14 mostraron la mejora de la selectividad de unión para FcYRIIb en comparación con el polipéptido original. Cuando el valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante/valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original es 1 o más, esto se entiende que la más furte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante tiene unión equivalente o reducida comparada con la unión por la más intensa de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original. Puesto que este valor fue 0.7 a 5.0 para las variantes obtenidas en esta ocasión, uno puede decir que la unión por la más intensa de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de las variantes obtenidas en esta ocasión fue casi la misma o disminuida en comparación con el polipéptido original. Estos resultados mostraron que en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas en esta ocasión han mantenido o disminuido las actividades de unión a FcYRIIa tipo R y tipo H y la actividad de unión mejorada a FcYRIIb, y así han mejorado la selectividad para FcYRIIb. Además, comparado con IL6R-F11, todas las variantes tenían menor afinidad a FcyRIa y a FcYRIIIaV.

[Tabla 14] ( ?? O [Ejemplo 10] El análisis de estructura cristalina de rayos X de un complejo formado entre un Fe que contiene P238D y una región extracelular de FcyRIIb Como se indica antes en el Ejemplo 9, a pesar de que una alteración se predice a partir del análisis de los anticuerpos de lgG1 que ocurre naturalmente para mejorar la actividad de unión a FcyRIIb o la selectividad para FcyRIIb se introdujo en un Fe que contiene P238D, la actividad de unión a FcyRIIb se encontró para disminuir, y la razón de esto puede ser que la estructura en el interfaz de interactuar entre Fe y FcyRIIb es cambiada debido a la introducción de P238D. Por lo tanto, para perseguir la razón de este fenómeno, la estructura tridimensional del complejo formado entre un Fe de lgG1 que contiene la mutación P238D (más adelante, referida como Fe (P238D)) y la región extracelular de FcyRIIb fue dilucidada mediante el análisis de estructura cristalina de rayos X, y esto se comparó con la estructura tridimensional del complejo formado entre el Fe de una lgG1 que ocurre naturalmente (más adelante, referida como Fe (WT)) y se compararon la región extracelular de FcyRIIb, y los modos de unión. Se han hecho múltiples reportes en la estructura tridimensional de un complejo formado entre un Fe y una región extracelular FcyR; y las estructuras tridimensionales del complejo de región extracelular Fe (WT)/FcyRlllb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276, 16469-16477), el complejo de región extracelular Fe (WT)/FcyRllla (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674), y el complejo de región extracelular Fe (WT)/FcYRIIa (J. Immunol. (2011) 187, 3208-3217 se han analizado. Mientras que la estructura tridimensional del complejo de región extracelular Fe (WT)/FCYRIID no se ha analizado, FcYRIIa, cuya estructura tridimensional en un complejo con Fe (WT) ya se conoce, y FCYRIID coinciden al 93% en la secuencia de aminoácido de su región extraceluar y tienen muy alta homología. Así, la estructura tridimensional del complejo de región extracelular Fe (WT)/FCYRI Ib se predijo mediante el modelando al usar la estructura cristalina del complejo de región extracelular Fe (WT)/FcYRIIa.

Se determinó la estructura tridimensional del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FCYRI Ib mediante el análisis de estructura cristalina de rayos X a resolución de 2.6 A. La estructura obtenida como un resultado de este análisis se muestra en la Fig. 21. La región extracelular FcYRIIb está unida entre dos dominios CH2 de Fe, y ésta fue similar a las estructuras tridimensionales de los complejos formados entre Fe (WT) y la región extracelular respectiva de FcYRIIIa, FcYRIIIb, o FcYRIIa analiza hasta ahora. Después, para comparación detallada, la estructura cristalina del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcYRIIb y la estructura modelo del complejo de región extracelular Fe (WT)/FcYRIIb se superpusieron mediante el ajuste de mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca con respecto a la región extracelular FcYRIIb y el dominio A CH2 de Fe (Fig. 22). En ese caso, el grado de traslapo entre los dominios B CH2 de Fe no fue satisfactorio, y las diferencias conformacionales se encontraron en esta porción. Además, al usar la estructura cristalina del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcyRllb y la estructura modelo del complejo de región extracelular Fe (WT)/FcyRllb, los pares de átomos que tienen una distancia de 3.7 A o menos entre la región extracelular FcyRIIb extraída y el dominio B CH2 de Fe se compararon para la comparación de la interacción interatómica entre el dominio B CH2 de FcyRIIb y de Fe (WT) con la interacción interatómica entre FcyRIIb y el dominio B CH2 de Fe. Como se muestra en la Tabla 16, las interacciones interatómicas entre el dominio B CH2 de Fe y FcyRIIb en Fe (P238D) y Fe (WT) no se igualó.

[Tabla 15] Además, se compararon las estructuras detalladas alrededor de P238D sobreponiendo la estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcYRIIb en la estructura modelo del complejo de región extracelular Fe (WT)/FcyRllb al usar el método de mínimos cuadrados basado en la distancia atómica Ca entre los dominios A y B CH2 de Fe solamente. Como la posición del residuo de aminoácido en la posición 238 (numeración de EU), es decir, una posición de mutagénesis de Fe (P238D), se alteró a partir de Fe (WT), la estructura de bucle alrededor del residuo de aminoácido en la posición 238 después de la región de bisagra se encuentra para ser diferente entre Fe (P238D) y Fe (WT) (Fig. 23). Pro en la posición 238 (numeración de UE) está localizado originalmenre en el interior de Fe (WT), formando un núcleo hidrofóbico con residuos alrededor de la posición 238. Sin embargo, si Pro en la posición 238 (numeración de UE) se altera a Asp altamente hidrofflico y cargado, la presencia del residuo Asp alterado en un núcleo hidrofóbico es enérgicamente desventajoso en términos de solvatación. Por lo tanto, en Fe (P238D), para cancelar esta situación enérgicamente desventajosa, el residuo de aminoácido en la posición 238 (numeración de UE) cambia su orientación para estar opuesta a la región del solvente, y ésta puede haber causado este cambio en la estructura de bucle cerca del residuo de aminoácido en la posición 238. Además, puesto que este bucle no está lejos de la región de bisagra reticulada por los enlaces S-S, su cambio estructural no estará limitado a un cambio local, y afectará la colocación relativa entre el dominio A y el dominio B de FcCH2. Como un resultado, se asumió que habían cambiado las interacciones interatómicas entre el dominio B CH2 de FcYRIIb y de Fe. Por lo tanto, los efectos previstos no podrían observarse cuando las alteraciones que mejoran la selectividad y la actividad de unión hacia FcyRIIb en una IgG que ocurre naturalmente se combinaron con un Fe que contenta la alteración P238D.

Además, como un resultado de los cambios estructurales debido a la introducción de P238D en el dominio A CH de Fe, un enlace de hidrógeno se ha encontrado entre la cadena principal de Gly en la posición 237 (numeración de UE), que está adyacente a P238D que está mutado, y Tyr en la posición 160 en FcyRIIb (Fig. 24). El residuo en FcYRIIa que corresponde a este Tyr 160 es Phe; y cuando la unión es FcyRIIa, este enlace de hidrógeno no se forma. Considerando que el aminoácido en la posición 160 es una de las pocas diferencias entre FcyRIIa y FcyRIIb en la interfaz de interacción con Fe, la presencia de este enlace de hidrógeno que es específica a FcyRIIb se presume por haber llevado la mejora de actividad de unión a FcyRIIb y disminución de la actividad de unión a FcyRIIa en Fe (P238D), y la mejora de su selectividad. Además, en el dominio B CH2 de Fe, una interacción electrostática se observa entre Asp en la posición 270 (numeración de UE) y Arg en ia posición 131 en FcyRIIb (Fig. 25). En el FcyRIIa tipo H, que es uno de los alotipos de FcyRIIa, el residuo que corresponde a Arg en la posición 131 de FcyRIIb es His, y por lo tanto no puede formar esta interacción electrostática. Esto puede explicar porqué la actividad de unión a Fe (P238D) se disminuye en el FcyRIIa tipo H comparado con el FcyRIIa tipo R. Las observaciones basadas en tales resultados del análisis de estructura cristalina de rayos X mostró que el cambio de la estructura de bucle cerca de P238D debido a la introducción de P238D y el cambio acompañante en la colocación del dominio relativo causa la formación de nuevas interacciones que no se encuentra en la unión de la IgG que ocurre naturalmente y FcyR, y esto podría llevar a un perfil de unión selectivo de las variantes de P238D para FcyRIIb.

[Expresión y purificación de Fe (P238D)] Se preparó un Fe que contiene la alteración P238D como sigue. Primero, Cys en la posición 220 (numeración de UE) de hll_6R-lgG1-v1 (SEC ID NO: 62) se sustituyó con Ser. Entonces, se clonó la secuencia genética de Fe (P238D) a partir de Glu en la posición 236 (numeración de UE) a su C terminal mediante PCR. Al usar esta secuencia genética clonada, la producción de los vectores de expresión, y la expresión y la purificación de Fe (P238D) se realizaron de acuerdo con el método del Ejemplo de Referencia 1. Cys en la posición 220 (numeración de UE) forma un enlace de disulfuro con Cys de la cadena L en la lgG1 general. La cadena L no co-expresada cuando se prepara Fe solamente, y por lo tanto, el residuo Cys se sustituyó con Ser por evitar la formación de enlaces de disulfuro innecesarios.

[Expresión y purificación de la región extracelular de FcyRIIb] La región extracelular de FcyRIIb se prepraró de acuerdo con el método del Ejemplo de Referencia 2.

[Purificación del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcYRIIb] Se agregaron a 2 mg de la muestra de región extracelular de FcyRllb obtenida para el uso en la cristalización, 0.29 mg de Endo F1 (Protein Science (1996) 5: 2617-2622) expresado y purificado a partir de Escherichia coli como una proteína de fusión de glutatión S-transferasa. Esto le permitió permanecer a temperatura ambiente durante tres días en amortiguador Bis-Tris 0.1 M a pH 6.5, y las cadenas de azúcar ligadas a N se dividieron, a excepción de la /V-acetilglucosamina unida directamente a Asn de la región extracelular FcYRIlb. Después, la muestra de región extracelular FcYRIlb se sometió a tratamiento de división de cadena de azúcar, que se concentró mediante ultrafiltración con 5000 MWCO, se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300) al usar una columna equilibrado en 20 mM de HEPS a pH 7.5 que contiene NaCI 0.05 M. Además, de la fracción de región extracelular de FcyRIIb dividido por carbohidrato obtenida, se agregó Fe (P238D) de modo que la relación molar de la región extracelular de FcyRIIb estuviera presente en leve exceso. La mezcla concentrada mediante ultrafiltración con 10,000 MWCO se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300) al usar una columna equilibrada en 20 mM de HEPS a pH 7.5 que contiene NaCI 0.05 M. Así, se obtuvo una muestra del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcyRI Ib.

[Cristalización del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcyRllb] Al usar la muestra del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcyRllb que se concentró a aproximadamente 10 mg/ml mediante ultrafiltración con 10,000 MWCO, se realizó la cristalización del complejo mediante el método de difusión de vapor en gota colgante. Se usó Hydra II Plus One (MATRIX) para la cristalización; y para una solución madre que contiene Bis-Tris pH 6.5, el 17% PEG3350, 100 mM de Bis-Tris pH 6.5, 17% de PEG3350, acetato de amonio 0.2 M, y 2.7% (p/v) de D-Galactosa, una gota de cristalización se produjo mezclándose en una relación de la solución de reserva: muestra de cristalización = 0.2 µ?: 0.2 µ?. La gota de cristalización después de sellarse se dejó reposar a 20°C, y así se obtuvieron cristales similares a placas delgadas.

[Medición de los datos de difracción de rayos X a partir de un cristal del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FCYRIID] Uno de los simples cristales obtenidos del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcyRllb se empapó en una solución de 100 mM de Bis-Tris pH 6.5, 20% de PEG3350, acetato de amonio, 2.7% (p/v) de D-Galactosa, 22.5% (v/v) de etilenglicol. Se eliminó el simple cristal de la solución al usar una punta de micro-bucle de nylon unido, y se congeló en nitrógeno liquido. Entonces, se midieron los datos de la difracción de rayos X del cristal en las en las instalaciones de radiación de sincrotrón de la Photon Factory en la High Energy Accelerator Research Organization. Durante la medición, el cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178°C para mantenerlo en un estado se congelado, y un total de 225 imágenes de difracción de rayos X se recolectaron al usar el detector Quantum 270 CCD (ADSC, por sus siglas en inglés) unido a una línea de haz mientras gira el cristal a intervalos de 0.8°. Se realizaron la determinación de los parámetros celulares, la ¡ndexación de punto de difracción, y el procesamiento de la datos de difracción a partir de las imágenes de difracción obtenidas al usar el programa Xia2 (CCP4 Software Suite), el Paquete (Walfgang Kabsch), y la Escala (CCP4 Software Suite); y finalmente, se obtuvieron los datos de intensidad de difracción del cristal hasta la resolución de 2.46 A. El cristal pertenece al grupo de espacio P21, y tiene los siguientes parámetros celulares; a = 48.85 A, b = 76.01 A, c = 115.09 A, a = 90°, ß = 100.70°, ? = 90°.

[Análisis de la estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcYRIIb] Se determinó la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcYRIIb mediante el método de sustitución molecular al usar el programa Phaser (CCP4 Software Suite). A partir del tamaño de la celosía cristalina obtenido y el peso molecular del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcYRIIb, el número de complejos en la unidad asimétrica se predijo para ser una. A partir de las coordenadas estructurales del código PDB: 3SGJ que es la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIIa, las porciones del residuo de aminoácido de las posiciones de cadena A 239-340 y de las posiciones de cadena B 239-340 se tomaron como las coordenadas separadas, y se ajustaron respectivamente como los modelos para buscar los dominios CH2 de Fe. Las porciones del residuo de aminoácido de las posiciones de cadena A 341-444 y las posiciones de cadena B 341-443 se tomaron como un simple conjunto de coordenadas de las mismas coordenadas estructurales del código PDB: 3SGJ; y esto se ajustó como un modelo para buscar los dominios CH3 de Fe. Finalmente, a partir de las coordenadas estructurales del código PDB: 2FCB que es una estructura cristalina de la región extracelular de FcYRIIb, las porciones del residuo de aminoácido de las posiciones de cadena A 6-178 se tomaron y se ajustaron como un modelo para buscar la región extracelular de FcyRIlb. La orientación y la posición de cada modelo de búsqueda en la celosía de cristal se determinaron en el orden del dominio CH3 de Fe, la región extracelular de FcyRIlb, y el dominio CH2 de Fe, basada en la función de giro y la función de traducción para obtener el modelo inicial para la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcyRllb. Cuando el refinamiento del cuerpo rígido que mueve los dos dominios CH2 de Fe, los dos dominios CH3 de Fe, y se realizó la región extracelular de FcyRIIb en el modelo inicial obtenido, el factor de confiabilidad cristalográfica, el valor R se convirtió al 40.4%, y el valor R libre se convirtió al 41.9% a los datos de intensidad de difracción a partir de 25 A a 3.0 A a este punto. Además, el refinamiento estructural al usar el programa Refmac5 (CCP4 Software Suite), y la revisión del modelo para observar los mapas de densidad de electrones cuyo coeficiente tiene 2Fo-Fc o Fo-Fc, que se calcularon basados en el factor estructural experimentalmente determinado Fo, el factor estructural calculado Fe y la fase calculada al usar el modelo, se realizaron mediante el programa Coot (Paul Emsley). Se realizó el refinamiento del modelo repitiendo estas etapas. Finalmente, como un resultado de la incorporación de las moléculas de agua en el modelo basado en los mapas de densidad de electrones que usan 2Fo-Fc o Fo-Fc como el coeficiente, y el siguiente refinamiento, el factor de confiabilidad cristalográfica, los valores R y el valor R libre del modelo que contiene 4846 átomos distintos a hidrógeno se convirtió a 23.7% y 27.6% a 24291 datos de intensidad de difracción a partir de la resolución de 25 A a 2.6 A, respectivamente.

[Producción de una estructura modelo del complejo de región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIb] Sobre la base en las coordenadas estructurales del código PDB: 3RY6 que es una estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIa, el programa Build Mutants function of the Discovery Studio 3.1 (Accelrys) se usó para introducir mutaciones para igualar la secuencia de aminoácido de FcYRIIb en FcvRlla en estas coordenadas estructurales. En este caso, el Nivel de Optimización se ajustó a Alto, el Radio Cortado se ajustó a 4.5, se generaron cinco modelos, y el que está con el núcleo de mejor energía entre ellos se ajustó como la estructura modelo para el complejo de región extracelular de Fe (WT)/FCYRI Ib.

[Ejemplo 11] Análisis de unión a FcyR de las variantes Fe cuyos sitios de alteración se determinaron basados en las estructuras cristalinas Sobre la base de los resultados del análisis de estructura cristalina de rayos X en el complejo formado entre Fe (P238D) y la región extracelular de FcyRIIb obtenida en el Ejemplo 10, se construyeron las variantes mediante comprensivamente introducir alteraciones en sitios en el Fe alterado que tiene la sustitución de Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Asp que se predijo para afectar la interacción con FcyRIIb (residuos en las posiciones 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332, y 334 (numeración de UE)), y si se examinaron las combinaciones de alteraciones que además mejoran la unión a FcyRIIb además de la alteración de P238D puede obtenerse.

Se produjo IL6R-B3 (SEC ID NO: 66) mediante la introducción en IL6R-G1d (SEC ID NO: 54), la alteración producida sustituyendo Lys en la posición 439 (numeración de UE) con Glu. Después, se produjo IL6R-BF648 mediante la introducción en IL6R-B3, la alteración producida sustituyendo Pro en la posición 238 (numeración de UE) con ASP. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como la cadena L de anticuerpo común. Se purificaron estas variantes de anticuerpo expresadas de acuerdo con el método del Ejemplo de Referencia 1. La unión de estas variantes de anticuerpos a cada uno de los FcyRs (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcvRlla tipo R, FcyRIIb, y FcyRIIIa tipo V) se evaluaron comprensivamente por el método del Ejemplo de Referencia 2.

Se produjo una figura de acuerdo con el siguiente método para mostrar los resultados de analizar las interacciones con los FcyRs respectivos. El valor para la cantidad de unión de cada variante a cada FcyR se dividió por el valor por la cantidad de unión del anticuerpo de control previamente alterado (IL6R-BF648/I L6R-L, alteración sustituyendo Pro en la posición 238 (numeración de UE) con ASP) a cada FcyR, y lo obtenido después se multiplicó por 100 y mostrado como el valor de actividad de unión relativa de cada variante a cada FcyR. El eje horizontal muestra el valor de actividad de unión relativa de cada variante a FcyRIIb, y el eje vertical muestra el valor de actividad de unión relativa de cada variante a FcyRIIa tipo R (Fig.26).

Como se muestra en la Fig. 26, los resultados muestran que de todas las alteraciones, 24 tipos de alteraciones se encontraron para mantener o para mejorar la unión a FcyRIIb en comparación con el anticuerpo previamente alterado. La unión de estas variantes a cada uno de los FcyRs se muestra en la Tabla 16. En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). El molde usado para producir IL6R-B3, I L6R-G 1 d/l L6R-L, se indica con un asterisco (*).

[Tabla 16] Los resultados de medir los valores de la KD de las variantes mostradas en la Tabla 17 para FcyRIa, FcyRIIaR, FcYRIIaH, FcvRllb, y F c y R 111 a tipo V por el método del Ejemplo de Referencia 2 se resumen en la Tabla 13. En la tabla, alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). El molde usado para producir IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*). Además, KD(llaR)/KD(llb) y KD(llaH)/KD(llb) en la tabla representan respectivamente el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de cada variante por FCYRI Ib por el valor de la KD de cada variante por FcyRI l b, y el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de cada variante por FcyRIIaM por el valor de la KD de cada variante por FcyRIlb. La KD(llb) del polipéptido o r ig i nal/K D ( 11 b) del polipéptido alterado se refiere al valor obtenido dividiendo el valor de la KD del polipéptido original por FcyRIlb por el valor de la KD de cada variante por FcyRIlb. Además, el valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH de cada variante/valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH del polipéptido original se muestra en la Tabla 17. Aquí, el polipéptido original se refiere a la variante que tiene IL6R-B3 (SEC ID NO: 63) como la cadena H. Se determinó que debido a la débil unión de FcyR a IgG, fue imposible de analizar exactamente mediante análisis cinético, y así las células rellenas de color gris en la Tabla 17 muestran los valores calculados al usar la Ecuación 2 del Ejemplo de Referencia 2.

[Ecuación 2] Kl CRmax/(Req-RT)-C [Tabla 17] o La Tabla 17 muestra que en comparación con IL6R-B3, todas las variantes mostraron mejora de la afinidad para el FcyRIib, y el intervalo de mejora fue 2.1 veces a 9.7 veces. La relación del valor de la KD de cada variante para FcyRIIaR/valor de la KD de cada variante para FcyRIib, y la relación del valor de la KD de cada variante para el FcyRIlaH/valor de la KD de cada variante para FcyRIib representan una actividad de unión a FcyRIib con relación a la actividad de unión a FcyRIIaR y la actividad de unión a FcyRIIaH, respectivamente. Es decir, estos valores muestran el grado de selectividad de unión de cada variante para FcyRIib, y un mayor valor indica una mayor selectividad de unión para FcyRIib. Puesto que la relación del valor de la KD para el FcyRIIaR/valor de la KD para FcyRIib, y la relación del valor de la KD para FcyRIlaH/valor de la KD para FcyRIib en el polipéptido original IL6R-B3/IL6R-L fue 0.3 y 0.2, respectivamente, todas las variantes en la Tabla 17 mostraron mejora de la selectividad de unión para FcyRIib en comparación con el polipéptido original. Cuando el valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH de una variante/valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH del polipéptido original es 1 o más, éste se entiende que la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH de una variante tiene unión equivalente o disminuida comparada con la unión para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH del polipéptido original. Puesto que este valor fue 4.6 a 34.0 para las variantes obtenidas en esta ocasión, uno puede decir que en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas en esta ocasión habían reducido la unión por la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRllaH. Estos resultados mostraron que en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas en esta ocasión tienen actividades de unión a FcyRIIa tipo R y tipo H mantenidas o disminuidas, la actividad de unión a FcyRIIb mejorada, y la selectividad mejorada para FcYRIlb. Además, comparado con IL6R-B3, todas las variantes tenían afinidad disminuida a FcyRIa y FcYRIIIaV.

Con respecto a las variantes prometedoras entre las variantes de combinación obtenidas, los factores que llevan a sus efectos se investigaron al usar la estructura cristalina. La Fig. 27 muestra la estructura cristalina del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcYRIIb. En esta figura, la cadena H colocada en el lado izquierdo es la cadena A de Fe, y la cadena H colocada en el lado derecho es la cadena B de Fe. Aquí, uno puede ver que el sitio en la posición 233 (numeración de UE) en la cadena A de Fe está localizado cerca de Lys en la posición 113 de FcyRIlb. Sin embargo, en esta estructura cristalina, la cadena lateral E233 está en una condición de movilidad considerablemente alta, y su densidad de electrones no está bien observada. Por lo tanto, la alteración producida por sustitución de Glu en la posición 233 (numeración de UE) con Asp lleva a disminución en el grado de libertad de la cadena lateral puesto que la cadena lateral se convierte en un carbón más corto. Como un resultado, la pérdida de entropía cuando se forma una interacción con Lys en la posición 113 de FcYRIIb puede disminuirse, y por lo tanto ésta se especula para contribuir a la mejora de la unión de energía libre.

Similarmente, la Fig. 28 muestra el ambiente cerca del sitio en la posición 330 (numeración de UE) en la estructura del complejo de región extracelular Fe (P238D)/FcYRIIb. Esta figura muestra que el ambiente alrededor del sitio en la posición 330 (numeración de UE) de la cadena A de Fe de Fe (P238D) es un ambiente hidrofílico integrado por Ser en la posición 85, Glu en la posición 86, Lys en la posición 163, y similares de FcyRllb. Por lo tanto, la alteración producida sustituyendo Ala en la posición 330 (numeración de UE) con Lys o Arg se especula para contribuir a consolidar la interacción con Ser en la posición 85 o Glu en la posición 86 en FcyRIlb.

La Fig. 29 representa las estructuras de Pro en la posición 271 (numeración de UE) de cadena B de Fe después de sobreponer las estructuras cristalinas del complejo de región extracelular de Fe (P238D)/FcYRIIb y el complejo de región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIIa mediante el ajuste de los mínimos cuadrados basados en las distancias pares del átomo Ca con respecto a la cadena B de Fe. Estas dos estructuras están bien igualadas, pero tienen diferentes estructuras tridimensionales de Pro en la posición 271 (numeración de UE). Cuando la débil densidad de electrones alrededor de esta área en la estructura cristalina del complejo de región extracelutar de Fe (P238D)/FCYRI Ib también se toma en consideración, se sugiere que existe la posibilidad que Pro en la posición 271 (numeración de UE) en Fe (P238D)/FcYRIIb causa una gran tensión en la estructura, así disturbando la estructura de bucle para lograr una estructura óptima. Por lo tanto, la alteración producida mediante la sustitución de Pro en la posición 271 (numeración de UE) con Gly da flexibilidad a esta estructura de bucle, y se especula para contribuir a la mejora de la unión reduciendo la barrera energética cuando permite que una estructura óptima se forme durante la interacción con FcYRIlb.

[Ejemplo 12] Examen del efecto combinatorio de las alteraciones que mejoran la unión a FcYRIl cuando se combinan con P238D De las alteraciones obtenidas en los ejemplos 9 y 11, las que mejoraron la unión a FcYRIlb o mantuvieron la unión a FcYRIlb y los efectos mostrados de suprimir la unión a otros FCYRS se combinaron entre sí, y su efecto se examinó.

Particularmente las buenas alteraciones seleccionadas de las Tablas 13 y 17 se introdujeron en la IL6R-BF648 de cadena H de anticuerpo de una manera similar al método del Ejemplo 11. IL6R-L se utilizó como la cadena L de anticuerpo, se purificaron los anticuerpos expresados de acuerdo con el método del Ejemplo de Referencia 1. La unión a cada uno de los FcyRs (FcYRIa, FcyRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcvRllb, y FcvRllla tipo V) se evaluó comprensivamente mediante el método del Ejemplo de Referencia 2.

De acuerdo con el siguiente método, las actividades de unión relativas se calcularon para los resultados de analizar las interacciones con los FcyRs respectivos. El valor por la cantidad de unión de cada variante a cada FCYR se dividió por el valor para la cantidad de unión del anticuerpo de control previamente alterado (IL6R-BF648/IL6R-L con sustitución de Pro en la posición 238 (numeración de UE) con Asp a cada FCYR, y multiplicado por 100; y entonces el valor se mostró como el valor de actividad de unión relativa de cada variante a cada FcyR (Tabla 18). En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). El molde usado para producir IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L se indica con un asterisco (*).

[Tabla 18-1] [Tabla 18-2] Los resultados de medir los valores de la KD de las variantes mostradas en la Tabla 18 para los tipos FcyRIa, FcyRIIaR, FcyRI laH , FcyRIIb, y FcYRIIIa, y FcyRIIIaV mediante el método del Ejemplo de Referencia 2 se resumen en las Tablas 19-1 y 19-2. En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). El molde usado para producir IL6R-B3, I L6R-G1 d/l L6R-L, se indica con un asterisco (*). Además, KD(llaR)/KD(llb) y KD(llaH)/KD(llb) en la tabla representan respectivamente el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de la variante para FcyRIIaR por el valor de la KD de la variante para FcYRIIb, y el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de la variante para FcyRIIaH por el valor de la KD de cada variante para FcYRIIb. La KD(llb) del polipéptido original/KD(llb) del polipéptido alterado se refiere al valor obtenido dividiendo el valor de la KD del polipéptido original para FcyRIIb por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIb. Además, el valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH de cada variante/valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH del polipéptido original se muestran en las Tablas 19-1 y 19-2. Aquí, el polipéptido original se refiere a la variante que tiene IL6R-B3 (SEC ID NO: 63) como la cadena H. Se determinó que debido a la débil unión de FcyR a IgG, fue imposible de analizar exactamente mediante el análisis cinético, y así los valores de células rellenas de color gris en las Tablas 20-1 y 20-2 muestran los valores calculados al usar la ecuación 2 del Ejemplo de Referencia 25.

[Ecuación 2] KD= C.Rmax/(Rl¾rRI)-C Las Tablas 19-1 y 19-2 muestran que en comparación con IL6R-B3, todas las variantes mostraron mejora de afinidad para FcyRIIb, y el intervalo de mejora fue 3.0 veces a 99.0 veces. La relación del valor de la KD de cada variante para FcyRI laR/valor de la KD de cada variante para FcyRIIb, y la relación del valor de la KD de cada variante para FcyRIlaH/valor de la KD de cada variante para FcyRIIb representan una actividad de unión a FcyRIIb con relación a la actividad de unión a FcyRMaH y la actividad de unión a FcyRIIaR, respectivamente. Es decir, estos valores muestran el grado de selectividad de unión de cada variante para FcyRIIb, y un mayor valor indica una selectividad de unión mayor para FcyRIIb. Puesto que la relación del valor de la KD para FcyRIIaR/valor de la KD para FcyRIIb, y la relación del valor de la KD para FcyRIlaH/valor de la KD para FcyRIIb del polipéptido original IL6R-B3/IL6R-L fueron 0.3 y 0.2, respectivamente, todas las variantes en las Tablas 19-1 y 19-2 mostraron mejora de la selectividad de unión para FcyRIIb en comparación con el polipéptido original. Cuando el valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH de un variante/valor de la KD para la más intensa de las actividades de unión a FcyRIIaR y FcyRIIaH del polipéptido original es 1 o más, esto se entiende que la más intensa de las actividades de unión a FCYRI laR y FcYRIIaH de una variante tiene unión equivalente o disminuida comparada con la unión por la más intensa de las actividades de unión a FCYRI laR y FcyRIIaH del polipéptido original. Puesto que este valor fue 0.7 a 29.9 para las variantes obtenidas en esta ocasión, uno puede decir que la unión mediante la más intensa de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de las variantes obtenidas en esta ocasión fue casi equivalente o disminuida comparada con el del polipéptido original. Estos resultados mostraron que en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas en esta ocasión han mantenido o disminuido las actividades de unión a FcYRIIa tipo R y tipo H, la actividad de unión a FcYRIIb mejorada, y la selectividad mejorada para FcYRIIb. Además, comparado con IL6R-B3, todas las variantes tenían menor afinidad para FcyRIa y FcYRIIIaV.

[Tabla 19-1] ?94 [Ejemplo 13] Preparación de variantes con unión a FcyRIIb mejorado Como se muestra en el Ejemplo 8, cuando se mejora la unión a FcyRIIb, es preferible que la unión a FcyRIIb se mejore mientras que máximamente suprime la unión a los otros FcyRs activadores. Así, los presentes inventores adicionalmente producen las variantes con unión a FcyRIIb mejorado o la selectividad mejorada a FcYRlIb combinando las alteraciones que mejoran la unión a FcyRIIb o mejorando la selectividad a FcYRlIb. Específicamente, las alteraciones descritas en los Ejemplos 9, 11, y 12 que se encuentran por ser eficaces cuando se combinan con la alteración P238D, se combinaron entre sí, en base de la alteración P238D que mostró el excelente efecto para mejorar la unión a FcYRlIb y para mejorar la selectividad a FcYRlIb.

Se produjeron las variantes combinando las regiones Fe de IL6R-G1d (SEC ID NO: 54) e IL6R-B3 (SEC ID NO: 63) con las alteraciones E233D, L234Y, G237D, S267Q, H268D, P271G, Y296D, K326D, K326A, A330R, y A330K descritas en los Ejemplos 9, 11, y 12 que se encuentran por ser eficaces cuando se combinab con la alteración P238D. Al usar IL6R-L (SEC ID NO: 135) como la cadena L de anticuerpo, se expresaron los anticuerpos que comprenden las variantes descritas antes en la cadena pesada y se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Las variantes resultantes se evaluaron respectivamente para la unión a cada FCYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb, o FcYRIIIaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

La KD de cada variante a cada FCYR se muestra en la Tabla 20. "Alteración" se refiere a una alteración introducida en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). IL6R-B3/IL6R-L que se usa como el molde para producir cada variante está indicada por el asterisco (*). "KD(llaR)/KD(llb)" en la tabla muestra el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante para FcYRIIaR por la KD de cada variante para FcYRIIb. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcYRIIb. "KD(llb) del polipéptido or ig in a l/KD( 11 b) del polipéptido alterado" muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIb por el valor de la KD de cada variante para FcYRIIb. Mientras tanto, la KD(llaR) del polipéptido original/KD(llaR) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIaR por el valor de la KD de cada variante para FcYRIIaR. En la Tabla 20, el número en las células rellenas de color gris indica que la unión a FcyR a IgG se concluyó para ser demasiado débil para analizar correctamente mediante análisis cinético y así se calculó usando: [Ecuación 2] KD= c.R_/(REQ-RT)-c descrita en el Ejemplo de Referencia 2.

[Tabla 20] Cuando se toma la unión a cada FCYR por IL6R-B3/IL6R-L que resulta de introducir la alteración de K439E en IL6R-G1d/IL6R-L que contiene la secuencia de la lgG1 humana nativa como 1, la unión de IL6R-G1 d/IL6R-L a FcyRIa como 1.3 veces; la unión de IL6R-G1d/IL6R-L a FcYRIIaR fue 1.1 veces; la unión de IL6R-G1d/IL6R-L a FcYRIIaH fue 1.1 veces, la unión de IL6R-G1d/IL6R-L a la unión a FcyRIIb fue 1.2 veces, y la unión de IL6R-G1 d/IL6R-L a FcYRIIIaV fue 0.9 veces. Así, para cualquier tipo FcyR dado, la unión de I L6R-B3/I L6R-L a FCYR fue comparable a la unión de IL6R-G1d/IL6R-L a FCYR. ASÍ, la comparación de la unión de cada variante a cada FCYR con la de IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de la alteración es asumida para ser equivalente a la comparación de la unión de cada variante a cada FCYR con la unión a cada FcyR por IL6R-G1d/IL6R-L que contiene la secuencia de la lgG1 humana nativa. Por esta razón, en los Ejemplos subsiguientes a continuación, la actividad de unión de cada variante a cada FcyR será comparada a la de cada FcyR por IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de la alteración. La Tabla 20 muestra que todas las variantes tienen actividad de unión a FcyRIIb aumentada como se compara con IL6R-B3 antes de la introducción de la alteración. La actividad de unión de I L6R-BF648/I L6R-L, que fue más baja, se aumentó por 2.6 veces, mientras que la actividad de unión de IL6R-BP230/IL6R-L, que es más alta, se aumentó por 147.6 veces. Como se compara con el valor de la KD(llaR)/KD(llb) que representa la selectividad, el valor para I L6R-BP234/IL6R-L, que fue el más bajo, fue 10.0, mientras que el valor para IL6R-BP231/IL6R-L, que fue el más alto, fue 32.2. Comparado a 0.3 para IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de la alteración, estos valores implican que todas las variantes tienen selectividad mejorada. Todas las variantes mostraron actividad de unión más baja a FcYRIa, FcYRIIaH, y FcYRIIIaV que la de IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de la alteración.

[Ejemplo 14] Análisis de estructura cristalina de rayos X de los complejos de región extracelular de FcyRIIb o región extracelular de FcyRIIaR y la región Fe con unión a FcyRIIb mejorada Como se muestra en el Ejemplo 13, la unión a FcyRIIb de la variante I L6R-BP230/I L6R-L, cuya unión a FcyRIIb fue más mejorada, se mejoró de aproximadamente 150 veces como se comparó con IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de la alteración, mientras que la mejora de su unión de FcyRIIaR fue suprimida a un grado de aproximadamente 1.9 veces. Así, IL6R-BP230/IL6R-L es una excelente variante en unión a FcyRIIb y selectividad. Sin embargo, los presentes inventores intentaron una posibilidad para crear variantes más preferibles con unión a FcyRIIb mejorada adicional de mientras que suprimían la unión a FcyRIIaR como sea posible.

Como se muestra en la Fig. 25 descrita en el Ejemplo 10, en la región Fe con la alteración de P238D, Asp en la posición 270 (numeración de UE) en sus formas del dominio B de CH2 una firme interacción electrostática con Arg en la posición 131 en FcvRllb. Este residuo de aminoácido en la posición 131 es His en FcYRIIIa y FcYRIIaH, mientras que es Arg en FcyRIIaR similar en FcyRIIb. Así, no existe diferencia entre FcyRIIaR y FcyRIIb en términos de interacción del residuo de aminoácido en la posición 131 con Asp en la posición 270 (numeración de UE) en el dominio B de CH2. Esto se asume para ser principal factor para la pobre selectividad entre la unión a FcyRIIaR y la unión a FcyRIIb de la región Fe.

Por una parte, las regiones extracelulares de FcyRIIa y de FcyRIIb son 93% idénticas en la secuencia de aminoácido, y así comparten muy alta homología. Basado en el análisis de la estructura cristalina del complejo de la región Fe de la I g G 1 nativa (más adelante abreviado como Fe (WT)) y la región extracelular de FcyRIIaR (J. Imunol. (2011) 187, 3208-3217), una diferencia encontrada alrededor del interfaz entre los dos que interactúan entre sí solamente tres aminoácidos (Gln127, Leu132, Phe160) entre FcyRIIaR y FcyRIIb. Así, los presentes inventores predijeron que fue extremadamente difícil mejorar la selectividad de la región Fe entre la unión a FcyRIIaR y la unión a FcyRIIb.

En este contexto, los presentes inventores concibieron que, para mejorar además la actividad de unión a FcyRIIb de la región Fe, y mejorar la selectividad de las regiones Fe entre la unión a FcyRIIb y la unión a FcyRIIaR, fue importante aclarar las diferencias sutiles entre la interacción de FcyRIIb de región Fe y la interacción de FcYRIIaR de región mediante el análisis no sólo la estructura tridimensional del complejo de la región Fe con la unión a FcyRIIb mejorado y la región extracelular de FcyRIIb pero también de la estructura tridimensional del complejo de la región Fe con la unión a FcyRIIb mejorado y la región extracelular de FcyRIIaR. Primero, los presentes inventores analizaron la estructura cristalina de rayos X del complejo de la región extracelular de FcyRIIb o de FcyRIIaR y Fe (P208) que resulta de eliminar la alteración K439E de la región Fe de IL6R-BP208/IL6R-L creada como se describe en el Ejemplo 12, que fue la variante usada como la base en producir IL6R-BP230/IL6R-L. (14-1) Análisis de estructura cristalina de Rayos X del complejo de Fe (P208) y la región extracelular de FcvRllb [Expresión y purificación de Fe (P208)] Se preparó Fe (P208) como describe más adelante. Primero, se produjo IL6R-P208 mediante la sustitución de Lys por Glu en la posición 439 (numeración de UE) en IL6R-BP208, como es en el caso de la secuencia de la lgG1 humana nativa. Entonces, la secuencia de gen de Fe (P208), que se clonó mediante PCR a partir de Glu en la posición 216 (numeración de UE) al extremo C al usar como un molde una ADN que codifica una variante con una sustitución de Ser por Cys en la posición 220 (numeración de UE), se clonó. Se lograron la construcción, expresión, y purificación del vector de expresión de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Mientras tanto, Cys en la posición 220 (numeración de UE) en la lgG1 ordinaria forma un enlace de disulfuro a un Cys en la cadena L. Cuando se prepara la región Fe solamente, la cadena L no se coexpresa. Así, Cys en la posición 220 se sustituyó por Ser por evitar la formación del enlace de disulfuro ¡necesaria.

[Expresión y purificación de la región extracelular de FCYRIID] Se prepraró la región extracelular de FcyRIIb de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

[Purificación del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FCYRMD] 0.15 mg del producto purificado de Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) expresados en E. coli como una proteína de fusión con la Glutatión S-transferasa se agregaron 1.5 mg de una muestra de cristalización de la región extracelular de FCYRIID. Esta muestra agregada en amortiguador Bis-Tris 0.1 M (pH 6.5) se dejó en reposo a temperatura ambiente durante tres días para dividir las cadenas de azúcar tipo N, excepto la N-acetilglucosamina directamente ligada al Asn en la muestra de la región extracelular de FcYRIlb. Entonces, se concentró la muestra de la región extracelular de FcYRIlb sometida al tratamiento de división de la cadena de azúcar con un filtro de ultrafiltración 5000MWCO, y se purificó mediante cromatografía con una columna de filtración en gel (Superdex200 10/300) equilibrada con 20 mM de HEPES (pH 7.5)/NaCI 0.1 M. Además, a la región extracelular FcYRIlb purificada con sus cadenas de azúcar divididas, Fe (P208) se agregó de tal manera que la relación molar de la región extracelular FcvRllb estaría presente en un leve exceso. La mezcla concentrada por ultrafiltración con 10,000 MWCO se purificó mediante cromatografía con una columna de filtración en gel (Superdex200 10/300) equilibrada con 25 mM de HEPES (pH 7.5), NaCI 0.1 M. La fracción purificada preparada como se describe anteriormente se usó como una muestra del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIb en la evaluación subsecuente.

[Cristalización del complejo de la región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIb] Se cristalizó una muestra del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIb concentrada a aproximadamente 10 mg/ml con un filtro de ultrafiltración 10000 MWCO al usar el método de difusión de vapor en gota colgante en combinación con el método de siembra. Se usó la placa VDXm (Hampton Research) para cristalización. Al usar una solución de reserva de Bis-Tris 0.1 M (pH 6.5)/19% (p/v) de PEG3350/potasio de fosfato dibásico 0.2 M, se prepararon las gotas de cristalización en una relación de mezcla de la solución de reserva: muestra de cristalización = 0.85 µ?: 0.85 µ?. Se trituraron los cristales del complejo obtenido bajo la condición similar con Seed Bead (Hampton Research) para preparar una solución de cristal de semilla. Se agregaron las gotas de cristalización con 0.15 µ? de una solución diluida preprarada a partir de la solución de semilla y se dejó reposar a 20°C en pozos de depósito sellados. Esto produjo cristales similares a placas.

[Mediciones de datos de difracción de rayos X a partir de un cristal del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcyRllb] Se empapó un simple cristal del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcvRllb preparado como se describe anteriormente en una solución de Bis-Tris 0.1 M (pH 6.5), 24% (p/v) de PEG3350/fosfato de potasio dibásico 0.2 M/20% (v/v) de etilenglicol. Entonces, el simple cristal se extrajo de la solución al usar una punta con micro-bucle de nylon unido, y se congeló en nitrógeno líquido. Los datos de la difracción de rayos X del simple cristal se recolectaron en Spring-8 BL32XU. Durante la medición, el cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178°C para mantenerlo en un estado congelado. Un total de 300 imágenes de difracción de rayos X a partir del simple cristal se recolectaron al usar el detector CCD MX-225HE (RAYONIX) unido a una línea de haz con giro de la simple cristal 0.6° a la vez. Basado en las imágenes de difracción obtenidas, determinación constante de celosía, indexación de punto de difracción, y procesamiento de datos de difracción se realizaron al usar los programas Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), la Escala de XDS (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) y la Escala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Finalmente, se obtuvieron los datos de intensidad de difracción del simple cristal hasta la resolución de 2.81 A. El cristal pertenece al grupo de espacio C222i con constante de celosía a = 156.69 A, b = 260.17 A, c = 56.85 A, a = 90°, ß = 90°, y ? = 90°.

[Análisis de estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcyRI Ib] Se determinó la estructura del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIb mediante un método de sustitución molecular al usar el programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). El número de complejos en una unidad asimétrica se estimó para ser uno del tamaño de la celosía cristalina obtenida y el peso molecular del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIb. Las porciones de residuo de aminoácidos de la cadena en las posiciones 239-340 y de la cadena B en las posiciones 239-340, que se extrajeron como una coordenada separada de la coordenada estructural de código PDB: 3SGJ para la estructura cristalina del complejo de región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIIa, se usaron respectivamente como modelos para buscar el dominio CH2 de la región Fe. Asimismo, las porciones de residuo de aminoácidos de la cadena A en las posiciones 341-444 y de la cadena B en las posiciones 341-443, que se extrajeron como una coordenada a partir de la coordenada estructural de código PDB: 3SGJ, se usaron como un modelo para buscar el dominio CH3 de la región Fe. Finalmente, el segmento que atraviesa los residuos de aminoácidos en las posiciones 6-178 de la cadena A, que se recupéró a partir de la coordenada estructural de código PDB: 2FCB para la estructura cristalina de la región extracelular de FCYRIID, se usó como un modelo para buscar Fe (P208). Los presentes inventores intentaron determinar las orientaciones y las posiciones de los modelos de búsqueda respectivos del dominio CH3 de la región Fe, la región extracelular de FcYRIIb, y el dominio CH2 de la región Fe en las celosías cristalinas basadas en la función de giro y la función de traducción, pero fracasaron para determinar la posición de uno de los dominios CH2. Entonces, con referencia a la estructura cristalina del complejo de la región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIIa, la posición del último dominio A CH2 se determinó con base en un mapa de densidad de electrones que se calculó basado en la fase determinada para las tres partes restantes. Así, los presentes inventores obtuvieron un modelo inicial para la estructura cristalina del complejo de la región extracelular de Fe (P208)/FCYRI Ib. El valor del factor R de confiabilidad cristalográfica del modelo estructural para los datos de intensidad difractada de 25 a 3.0 Á fue 42.6% y el valor R libre fue 43.7% después del refinamiento del cuerpo rígido del modelo estructural inicial obtenido que mueve dos dominios CH2 y dos dominios CH3 de la región Fe, y la región extracelular de FcYRIIb. Entonces, el refinamiento del modelo estructural se logró repitiendo el refinamiento estructural al usar el programa REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) seguido por la revisión del modelo estructural realizado al usar el programa Goot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) con referencia a los mapas de densidad de electrones donde se calcularon los coeficientes 2Fo-Fc y Fo-Fc al usar el factor estructural experimentalmente determinado Fo, la región Fe del factor estructural calculada de acuerdo con el modelo estructural, y las fases calculadas de acuerdo con el modelo estructural. Finalmente, como resultado de la incorporación de las moléculas de agua al modelo basado en los mapas de densidad de electrones que usan 2Fo-Fc o Fo-Fc como el coeficiente, y el siguiente refinamiento, los valores del factor R de contabilidad cristalográfica y el valor R Free del modelo estructural que contienen 4786 átomos distintos a hidrógeno, llegaron a ser los datos de intensidad de difracción de 25 A a 2.81 de resolución, respectivamente.

Se determinó la estructura tridimensional del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcyRllb a una resolución de 2.81 A mediante análisis de estructura. La estructura obtenida mediante el análisis se muestra en la Fig. 30. La región extracelular de FcyRIIb se reveló para estar unida entre los dos dominios CH2 de la región Fe, que se asemeja a las estructuras tridimensionales de los complejos previamente analizados de Fe (WT), que es el Fe de la IgG nativa, y cada una de las regiones extracelulares de FcYRIIIa (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674), FcYRIIIb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276, 16469-16477), y FcyRIIa (J. Immunol. (2011) 187 (6), 3208-3217).

Una observación cercana del complejo de la región extracelular de Fe (P208)/FCYRIID reveló un cambio en la estructura de bucle en las posiciones 233 a 239 (numeración de UE) después de la región de bisagra en el dominio A CH2 de la región Fe debido a una influencia de las alteraciones G237D y P238D introducidas como se compara con el complejo de la región extracelular de Fe (WT)/FcYRIIaR (Fig. 36). Esto lleva a que la cadena principal de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en Fe (P208) formó un estrecho enlace de hidrógeno a la cadena lateral de Tyr en la posición 160 en el FcyRIIb (Fig. 37). En el FcYRIIaH y el FcYRIIaR, el residuo de aminoácido en la posición 160 es Phe, que es incapaz de formar tal enlace de hidrógeno. Esto sugiere que el enlace de hidrógeno antes descrito tenga importante contribución a la mejora de la unión a FcYRIIb y la adquisición de la selectividad contra la unión a FcYRIIa de Fe (P208), es decir, la mejora de la actividad de unión a FcYRIIb y reducción de la actividad de unión a FcYRIIa de Fe (P208).

Por una parte, la cadena lateral de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en Fe (P208) no forma la interacción particularmente significativa en la unión a FCYRI Ib ni la interacción con otros residuos dentro de la región Fe. lie en la posición 332, Glu en la posición 333, y Lys en la posición 334 (numeración de UE) en la región Fe se localizan cerca a Asp en la posición 237 (numeración de EU) (Fig. 33). Cuando los residuos de aminoácidos de estas posiciones son sustituidos por los residuos hidrofílicos para formar una interacción con la cadena lateral de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en Fe (P208) y la estructura de bucle pueden estabilizarse por la interacción, ésta puede llevar a la reducción de la pérdida de energía entrópica debido a la unión a hidrógeno entre la región Fe y Tyr en la posición 160 en FcyRIIb y de tal modo a un aumento en la energía libre de unión, es decir, un aumento en la actividad de unión.

Cuando la estructura cristalina de rayos X del complejo de Fe (P238D) con la alteración de P238D y la región extracelular de FcyRIIb descrita en el Ejemplo 10 se compara con la estructura cristalina de rayos X del complejo de la región extracelular de Fe (P208) y FcyRIIb, las alteracciones se observan en cinco porciones en Fe (P208) como se compara con Fe (P238D) y la mayoría de los cambios que se ven sólo en el nivel de cadena lateral. Mientras tanto, una desviación posicional en el nivel de I cadena principal debido a la alteración de Pro--Gly en la posición 271 (numeración de UE) también se observa en el dominio B CH2 de la región Fe, y, además, hay un cambio estructural en el bucle en las posiciones 266 a 270 (numeración de EU) (Fig. 34). Como se describe en el Ejemplo 11, se sugiere que, cuando Asp en la posición 270 (numeración de UE) en Fe (P238D) forma una firme interacción electrostática con Arg en la posición 131 en FcyRIIb, la interacción puede inducir la tensión estereoquímica en Pro en la posición 271 (numeración de UE). El experimento descrito en la presente sugiere que el cambio estructural observado con la alteración a Gly por el aminoácido en la posición 271 (numeración de UE) está asumido para ser un resultado de la eliminación de la distorsión estructural acumulada en Pro antes de la alteración y de los resultados de eliminación en un aumento en la energía libre para la unión a FcyRIIb, es decir, un aumento en la actividad de unión.

Además, se demostró que, debido al cambio de la estructura de bucle en las posiciones 266 a 271 (numeración de UE), Arg en la posición 292 (numeración de UE) experimentó un cambio estructural con dos estados. En este caso, se sugiere que la interacción electrostática ( Fig . 34) formada entre Arg en la posición 292 (numeración de UE) y Asp en la posición 268 (numeración de UE) que es un residuo alterado en Fe (P208) puede contribuir a la estabilización de la estructura de bucle. Puesto que la interacción electrostática formada entre Asp en la posición 270 (numeración de UE) en el bucle y Arg en la posición 131 en FcyRIIb contribuyen en gran parte a la actividad de unión de Fe (P208) a FcyRIIb, la estabilización de la estructura de bucle en la conformación de unión fue probablemente para reducir la pérdida de energía entrópica durante la unión. Así, se espera que la alteración dé lugar a un aumento en la energía libre de unión, es decir, un aumento en la actividad de unión.

Por otra parte, se analizó la posibilidad de la alteración para aumentar la actividad basada en el resultado del análisis estructural. Ser en la posición 239 (numeración de UE) fue encontrado como un candidato para el sitio para introducir la alteración. Como se muestra en la Fig. 35, Ser en la posición 239 (numeración de UE) en el dominio B CH2 está presente en la posición hacia la cual Lys en la posición 117 en FcyRIIb se extiende lo más naturalmente en la estructura. Sin embargo, puesto que la densidad de electrones no se observó para Lys en la posición 117 en FcyRIIb mediante el análisis descrito antes, el Lys no tiene ninguna estructura definida. En esta situación, Lys117 es probablemente que tenga solamente un efecto limitado en la interacción con Fe (P208). Cuando Ser en la posición 239 (numeración de UE) en el dominio B CH2 es sustituido con Asp o Glu negativamente cargado, se espera que tal alteración cause una interacción electrostática con Lys positivamente cargado en la posición 117 en FcyRIIb, de tal modo dando por resultado la actividad de unión a FcyRIIb mejorado.

Por una parte, una observación de la estructura de Ser en la posición 239 (numeración de UE) en el dominio A CH2 reveló que, formando un enlace de hidrógeno a la cadena principal de Gly en la posición 236 (numeración de UE), la cadena lateral de este Ser estabilizó la estructura de bucle en las posiciones 233 a 239, que incluye Asp en la posición 237 (numeración de UE) que forma un enlace de hidrógeno a la cadena lateral de Tyr en la posición 160 en FcyRIIb, después de la región de bisagra (Fig. 32). La estabilización de la estructura de bucle en la conformación de unión puede reducir la pérdida de energía entrópica durante la unión, y resulta en un aumento en la energía libre de unión, es decir, una mejora de la actividad de unión. Mientras tanto, cuando Ser en la posición 239 (numeración de UE) en el dominio A CH2 es sustituido con Asp o Glu, la estructura de bucle puede llegar a ser inestable debido a la pérdida del enlace de hidrógeno a la cadena principal de Gly en la posición 236 (numeración de UE). Además, la alteración puede dar lugar a la repulsión electrostática al Asp en la posición 265 (numeración de UE) en estrecha proximidad, llevando a la desestabilización adicional de la estructura de bucle. La energía para la desestabilización corresponde a la pérdida de energía libre para la unión a FcYRIIb, que puede dar lugar a la reducción en la actividad de unión. (14-2) Análisis de estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular de Fe (P208) v FcvRllaR [Expresión y purificación de la región extracelular de FcyRIIaR] La región extracelular de FcyRIIaR se preparó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

[Purificación del complejo de región extracelular tipo Fe (P208)/FcYRIIaR] Se agregaron 1.5 mg de la muestra purificada de la región extracelular de FcyRIIaR con 0.15 mg del producto purificado de Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) expresado en E. coli como una proteína de fusión con S-transferasa, 20 µ? de 5 U/ml de Endo F2 (QA-bio), y 20 µ? de 5 U/ml de Endo F3 (QA-bio).

Después de 9 días de incubación a temperatura ambiente en amortiguador de acetato de Na 0.1 M (pH 4.5), se agregó la muestra además con 0.07 mg de Endo F1 descrito antes, 7.5 µ? de Endo F2 descrito antes, y 7.5 µ? de Endo F3 descrito antes, y se incubó durante tres días para dividir la cadenas de azúcar tipo N, excepto la /V-acetilglucosamina ligada directamente al Asn en la muestra de la región extracelular de FcYRIIaR. Entonces, la muestra de la región extracelular de FcyRIIaR concentrado con un filtro de ultrafiltración 10000 MWCO y se sometió al tratamiento de división de cadena de azúcar descrito antes se purificó mediante cromatografía con una columna de filtración en gel (Superdex200 10/300) equilibrada con 25 mM de HEPES (pH 7), NaCI 0.1M. Después, a la región extracelular FcYRIIaR purificada con las cadenas de azúcar divididas, se agregó Fe (P208) de tal manera que la relación molar de la región extracelular FcvRllaR estaría presente en un leve exceso. La mezcla concentrada por ultrafiltración con 10,000 MWCO se purificó mediante cromatografía con una columna de filtración en gel (Superdex200 10/300) equilibrada con 25 mM de HEPES (pH 7), NaCI 0.1 M. La fracción purificada preprarada como se describe anteriormente se usó como una muestra de complejo de región extracelular tipo Fe (P208)/FcyRllaR en la evaluación subsecuente.

[Cristalización del complejo de región extracelular tipo Fe (P208)/FcYRIIaR] Se cristalizó una muestra del complejo de región extracelular tipo Fe (P208)/FcyRI laR concentrada a aproximadamente 10 mg/ml con un filtro de ultrafiltración 10000 MWCO al usar el método de difusión de vapor en gota colgante. Al usar una solución de reserva de Bis-Tris 0.1 M (pH 7.5)/26% (p/v) de PEG3350/sulfato de amonio 0.2 M, se prepararon gotas de cristalización en una relación de mezcla de la solución de reserva: muestra de cristalización = 0.8 µ?: 1.0 µ?. Las gotas se sellaron firmemente y se dejaron reposar a 20°C. Esto produjo cristales similares a placas.

[Medición de datos de difracción de rayos X a partir del cristal del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcyRllaR] Se empapó un simple cristal del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcyRI laR preparado como se describe anteriormente en una solución de Bis-Tris 0.1 M (pH 6.5)/24% (p/v) de PEG3350/fosfato de potasio dibásico 0.2 M/20% (v/v) de etilenglicol. Entonces, se extrajo el cristal de la solución al usar una punta con micro-bucle de nylon unido, y se congeló en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X del simple cristal se recolectaron en la instalación de radiación de sincrotrón Photon Factory BL-17A en la High Energy Accelerator Research Organization. El cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178°C para mantenerlo en un estado congelado durante la medición. Un total de 225 imágenes de difracción de rayos X a partir del simple cristal se recolectaron al usar el detector CCD Quantum 315r (ADSC) equipado en la línea de haz con el giro del simple cristal a 0.6° a la vez. Basado en las imágenes de difracción obtenidas, se realizaron la determinación constante de celosía, la indexación de punto de difracción, y procesamiento de de datos de difracción al usar los programas Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), Escala de XDS (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132), y Escala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Finalmente, se obtuvieron los datos de intensidad de difracción hasta la resolución de 2.87 A. El cristal pertenece al grupo de espacio C222^ con constante de celosía a = 154.31 A, b = 257.61 A, C = 56.19 A, a = 90°, ß = 90°, y ? = 90°. [Análisis de estructura cristalina de rayos X del complejo de región extracelular tipo Fe (P208)/FcyRI laR] Se determinó la estructura del complejo de región extracelular tipo Fe (P208)/FcYRIIaR mediante un método de sustitución molecular al usar el programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). El número de complejos en una unidad asimétrica se estimó para ser uno del tamaño de la celosía cristalina obtenida y el peso molecular del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIaR. Al usarse, como un modelo de búsqueda, la estructura cristalográfica del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcyRI Ib obtenido como se describe en el Ejemplo (14-1), la orientación y la posición del complejo de región extracelular de Fe (P208)/FcYRIIaR en las celosías cristalinas se determinaron basadas en la función de giro y la función de traducción. El valor R del factor de confiabilidad cristalográfica del modelo estructural para los datos de intensidad difractada a 25 a 3.0 A fue 38.4% y el valor R libre fue 30.0% después del refinamiento del cuerpo rígido del modelo estructural inicial obtenido que mueve los dos dominios CH2 y dos dominios CH3 de la región Fe, y la región extracelular de FcyRIIaR. Entonces, se logró el refinamiento del modelo estructural repitiendo el refinamiento estructural al usar el programa REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) seguido por la revisión del modelo estructural realizado al usar el programa Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) con referencia a los mapas de densidad de electrones donde se calcularon los coeficientes Fo-Fc y 2Fo-Fc al usar el factor estructural experimentalmente determinado Fo, el factor estructural Fe calculado de acuerdo con el modelo, y las fases calculadas de acuerdo con el modelo. Finalmente, como resultado de la incorporación de las moléculas de agua al modelo basado en los mapas de densidad de electrones que usaron Fo-Fc o 2Fo-Fc como el coeficiente, y el siguiente refinamiento, los valores del factor R de confiabilidad cristalográfica y el valor R Free del modelo estructural que contiene 4758 átomos distintos a hidrógeno llegaron a ser los datos de intensidad de difracción de 26.3% y de 24838 a partir de la resolución de 25 A a 2.87 A, respectivamente.

Se determinó la estructura tridimensional del complejo de la región extracelular de Fe (P208)/FCYRI laR a una resolución de 2.87 A mediante análisis de estructura. Una comparación de la estructura cristalina entre el complejo de la región extracelular tipo Fe (P208)/FcYRIIaR y el complejo de la región extracelular de Fe (P208)/FcyRllb descrita en el Ejemplo (14-1) detectada casi sin diferencia en el nivel de la estructura total (Fig . 36), que refleja muy alta identidad de aminoácido entre los dos receptores Fcy.

Sin embargo, una observación exacta de las estructuras en el nivel de densidad de electrones detectó algunas diferencias que pueden llevar a la mejora de la selectividad entre la unión a FcyRIIb y la unión a FcyRIIaR de la región Fe. El residuo de aminoácido en la posición 160 en FcyRIIaR no es Tyr sino Phe. Como se muestra en la Fig. 37, el enlace de hidrógeno entre la cadena principal del residuo de aminoácido en la posición 237 (numeración de UE) en el dominio A CH2 de la región Fe y Tyr en la posición 160 en FcyRIIb, aunque formado en la unión entre FcyRIIb y la región Fe con la alteración P238D, se espera no se forme durante la unión entre FcyRIIb y la región Fe con la alteración P238D. La ausencia de la formación del enlace de hidrógeno puede ser factor principal para mejorar la selectividad entre la unión a FcyRIIb y la unión a FcyRIIaR de la región Fe introducida con la alteración P238D. La comparación adicional en el nivel de densidad de electrones mostró que, en el complejo de región Fc/FcyRIIb, la densidad de electrones fue claramente observable para las cadenas laterales de Leu en las posiciones 235 (numeración de UE) y 234 (numeración de UE), mientras que la densidad de electrones de las cadenas laterales fue confusa en el complejo de región Fc/FcYRIIaR. Esto sugiere que el bucle cerca de la posición 237 (numeración de UE) se vuelve flexible debido a la interacción reducida con FcgRIIaR alrededor de esta posición. Mientras tanto, una comparación estructural Del dominio B CH2 de la región Fe (Fig . 38) en la misma región reveló que, en el complejo de la región Fe y FcYRIIb, la densidad de electrones fue observable hasta Asp en la posición 237 (numeración de UE), mientras que, en la estructura del complejo de la región Fe y FcyRIIaR, la densidad de electrones fue observable hasta tres residuos antes de Asp en la posición 237 (numeración de UE), es decir, hasta alrededor de Leu en la posición 234 (numeración de UE), sugiriendo que la unión a FcyRIIaR forma una interacción sobre una región más grande como se compara con la unión a FcgRIlb. El hallazgo descrito antes sugiere la posibilidad que, en el dominio A CH2 de la región Fe, la región desde la posición 234 a 238 (numeración de UE) tiene una contribución grande a la unión entre la región Fe y FcyRIIb, mientras que en el dominio B CH2 de la región Fe la región desde la posición 234 a 238 (numeración de UE) tiene una contribución grande a la unión entre la región Fe y FcyRIIaR.

[Ejemplo 15] Las variantes Fe para las cuales los sitios de alteración se determinaron basadas en la estructura cristalina Como se describe en el Ejemplo 14, se sugirió Asp en la posición 268 (numeración de UE) para interactuar electrostáticamente con Arg en la posición 292 (numeración de EU) (Fig. 34) como un resultado del cambio estructural local debido a la introducción de la alteración P271G en el dominio B de la variante con unión a FcYRIIb mejorado (P208). Existe una posibilidad que la estructura de bucle en las posiciones 266 a 271 (numeración de UE) se estabilice mediante la formación de la interacción, dando por resultado la mejora de la unión a FcYRIIb. Así, los presentes inventores evaluaron si la unión a FcyRIIb de la variante podría mejorarse mediante estabilización adicional de su estructura de bucle debido a la mejora de la interacción electrostática mediante la sustitución de Glu por Asp en la posición 268 (numeración de UE) en la variante. Por una parte, como se muestra en la Fig. 33, Tyr en la posición 160 (numeración de UE) en FcyRIIb interactua con la cadena principal de Asp en la posición 237 (numeración de UE) en el dominio A de P208. Mientras tanto, la cadena lateral de Asp en la posición 237 (numeración de UE) se localiza cerca de Me en la posición 332, Glu en la posición 333, y Lys en la posición 334 (numeración de UE) en la molécula sin la formación de ninguna interacción particularmente significativa. Así, los presentes inventores también evaluaron si la interacción con Tyr en la posición 160 en FcyRIIb puede mejorarse a través de la estabilización de la estructura de bucle en las posiciones 266 a 271 (numeración de UE) debido a la interacción aumentada con la cadena lateral del Asp en la posición 237 (numeración de UE) sustituyendo los residuos de aminoácidos hidrofílicos en las posiciones descritas antes.

Las variantes de IL6R-BP230/IL6R-L preparadas tal como se describe en el ejemplo 13 se produjeron mediante la introducción con cada una de las alteraciones H268E, I332T, I332S, I332E, I332K, E333K, E333R, E333S, E333T, K334S, K334T, y K334E. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 135) como la cadena L de anticuerpo. Se expresaron los anticuerpos que contenían la cadena ligera de IL6R-L y las variantes de cadena pesada descritas antes y se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos purificados se evaluaron para su unión a cada FcyR (FcyRIa, FcYRIIaH, FcyRIIaR, FcgRIIb, o FcgRIIIaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

La KD de cada variante a cada FcyR se muestra en la Tabla 22. En la tabla, "alteración" se refiere a una alteración introducida en IL6R-BP3 (SEC ID NO: 63). IL6R-B3/IL6R-L que se usa como el molde para producir IL6R-BP230 se indica por el asterisco (*). KD (llb) del polipéptido o ri g i n al/KD ( 11 b ) del polipéptido alterado en la tabla muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de I L6R-B3/I L6R-L para FcyRIIb por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIb. Mientras tanto, la KD (MaR) del polipéptido original/KD(llaR) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para el FcyRIIaR por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIaR. La KD(llaR)/KD(llb) muestra el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante para FcyRIIaR por la KD de la variante para FcyRIlb. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcyRIlb. En la Tabla 21, el número en las células rellenas de color gris indica que la unión de FcyR a IgG se concluyó para ser demasiado débil para analizarse correctamente medíante análisis cinético y así se calculó usando: [Ecuación 2] KD- CRraax/(Req-RT)-C descrita en el Ejemplo de Referencia 2.

[Tabla 21] aumentaron la actividad de unión a FcyRIlb selectividad de FcyRIlb de IL6R-BP264/IL6R-L, I L6R-BP465/I L6R-L, IL6R-BP466/IL6R-L, y IL6R-BP470, resulta de introducir las alteraciones H268E, E333K, E333R, y E333T, respectivamente, en IL6R-BP230/IL6R-L en comparación con las de IL6R-BP230/IL6R-L. Se redujo la selectividad de FcyRIlb de IL6R-BP391/IL6R-L introducida con la alteración I332T mientras su actividad de unión a FcYRIIb se aumentó comparada con I L6R-BP230/I L6R-L.

[Ejemplo 16] Introducción integral de alteraciones en los residuos de aminoácidos alrededor de la posición 271 (numeración de UE) En la comparación estructural entre Fe (P208) y FcyRIlb y Fe (P238D)/FcyRI Ib, la diferencia más significativa se encuentra en la estructura alrededor de la posición 271 (numeración de UE) en el dominio B CH2 de la región Fe (Fig. 33). Como se describe en el Ejemplo 11, se sugiere que, cuando, en Fe (P238D), Asp en la posición 270 (numeración de UE) forma una firme interacción electrostática con Arg en la posición 131 en FcyRIlb, la interacción puede inducir a la tensión estereoquímica en Pro en la posición 271 (numeración de UE). En la estructura de Fe (P208)/FcYRIIb, debido a la sustitución de Gly por Pro en la posición 271 (numeración de UE), una desviación posicional ocurrió en el nivel de cadena principal para eliminar la distorsión estructural, dando por resultado un cambio estructural grande alrededor de la posición 271. Existe una posibilidad que la estabilización adicional de la estructura cambiada alrededor de la posición 271 reduce además la pérdida de energía entrópica causada por la unión sobre la formación de una interacción electrostática con Arg en la posición 131 en FcyRIlb. Así, las alteraciones que mejoran la unión a FcyRIlb o aumentan la selectividad de FcyRIlb de la región Fe se buscaron mediante la introducción integral de alteraciones en los residuos de aminoácidos alrededor de la posición 271 (numeración de UE).

Se construyó IL6R-BP267 como un molde en introducción integral de alteraciones introduciendo las alteraciones E233D, G237D, P238D, H268E, y P271G en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). IL6R-L (SEC ID NO: 56) se usó como la cadena L de anticuerpo. Los anticuerpos que contenían la cadena ligera de IL6R-L y las variantes de cadena pesada descritas antes se expresaron y se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos purificados se evaluaron para su unión a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcgRIIb, o FcgRIIIaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Los aminoácidos en las posiciones 264, 265, 266, 267, 269, y 272 (numeración de UE) en IL6R-BP267 se sustituyeron con cada uno de los 18 tipos de aminoácidos, excepto Cys y el aminoácido antes de la sustitución. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como la cadena L de anticuerpo. Los anticuerpos que contenían la cadena ligera de IL6R-L y las variantes de cadena pesada descritas antes se expresaron y se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos purificados se evaluaron para su unión a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb, o FcyRIIIaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Las variantes cuya unión a FcyRIIb se ha mejorado o la selectividad de FcyRIIb se ha aumentado como se compara con la unión a FcyRIIb o la selectividad de Fcyllb de IL6R- BP267/IL6R-L antes de la introducción de las alteraciones se muestra en la Tabla 22.

[Tabla 22] El valor de la KD de cada variante a cada FCYR se muestra en la Tabla 22. En la tabla, "alteración" se refiere a una alteración introducida en IL6R-B3, que se usó como un molde. IL6R-B3/IL6R-L que se usa como el molde para producir IL6R-BP267 está indicada por el asterisco (*). En la tabla, la KD (llb) de polipéptido original/KD (llb) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIb por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIb. Mientras tanto, la KD (MaR) de polipéptido original/KD ( 11 a R) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcvRllaR por la KD de cada variante para FcYRIIaR. La KD (MaR)/KD (llb) muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de cada variante para FcYRIIaR por el valor de la KD de la variante para FcYRIIb. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcYRIIb. En la Tabla 22, el número en células rellenas de color gris indica que la unión de FcyR a IgG se concluyó por ser demasiado débil para analizarse correctamente mediante análisis cinético y así se calculó usando: [Ecuación 2] KD= CRmax/(Req-RI)-C descrita en el Ejemplo de Referencia 2.

Todas las actividades de unión de las variantes mostradas en la Tabla 22 a FcyRIa, FcvRllaH, y FcYRIIIaV fueron comparables o reducidas en comparación con la de IL6R-B3/IL6R-L. Mientras tanto, la actividad de unión a FcyRIIb de las variantes que resultan de agregar las alteraciones S267A, V264I, E269D, S267E, V266F, S267G, y V266M, respectivamente, a IL6R-BP267/IL6R-L se aumentaron en comparación con la de IL6R-BP267/IL6R-L antes de la adición de la alteración. Mientras tanto, los valores de la KD (llaR)/KD (llb) de las variantes que resultan de agregar las alteraciones de S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I, y E272F, respectivamente, a IL6R-BP267/IL6R-L se aumentaron en comparación con los de IL6R-BP267/IL6R-L antes de la adición de la alteración. Esto muestra que las alteraciones S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I, y E272F producen el efecto para mejorar la selectividad de FcYRIIb.

[Ejemplo 17] Mejora de la unión a FcyRIIb mediante la introducción de alteraciones en la región CH3 Una alteración de sustitución de Leu por Pro en la posición 396 (numeración de UE) se ha reportado para mejorar la unión a FcyRIIb (Cáncer Res. (2007) 67, 8882-8890). El aminoácido en la posición 396 (numeración de UE) está presente en una posición que no está implicada directamente en la interacción con FcyR. Sin embargo, el aminoácido puede asumirse por tener un efecto en la interacción con FcyR cambiando la estructura de anticuerpo. Así, los presentes inventores evaluaron si la unión a FcYRIIb de la región Fe es mejorado o su selectividad de FcYRIIb es aumentada mediante la introducción integral de las alteraciones de aminoácidos en la posición 396 (numeración de UE) en la región Fe.

Se construyó IL6R-BP423 como un molde en la introducción integral de alteraciones introduciendo las alteraciones E233D, G237D, P238D, S267A, H268E, P271G, y A330R en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). Se construyeron las variantes, en las cuales el aminoácido en la posición 396 (numeración de UE) en IL6R-BP423 se sustituyó con cada uno de los 18 tipos de aminoácidos, excepto cisteína y el aminoácido antes de la sustitución. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como la cadena L de anticuerpo. Los anticuerpos que contenían la cadena ligera de IL6R-L y las variantes de cadena pesada descritas antes se expresaron y se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos purificados se evaluaron por su unión a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb, o FcyRIIIaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. La unión de las variantes resultantes a cada FcyR se muestra en la Tabla 23.

[Tabla 23] En la tabla, "alteración introducida en IL6R-BP423" se refiere a una alteración introducida en IL6R-BP423, que se usó como un molde. IL6R-B3/IL6R-L que se usa como el molde para producir IL6R-BP423 se indica por el asterisco (*). En la tabla, la KD (llb) del polipéptido original/KD (llb) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcgRIIb por el valor de la KD de cada variante para FcYRIlb. Mientras tanto, la KD (llaR) del polipéptido original/KD ( 11 a R) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de I L6R-B3/I L6R-L para FcYRIIaR por el valor de la KD de cada variante para FcYRIIaR. KD (MaR)/KD (llb) muestra el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante para FCYRI laR por la KD de la variante para FcyRIlb. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcyRIlb. En la Tabla 23, el número en las células rellenas de color gris indica que la unión de FcyR a IgG se concluyó para ser demasiado débil para analizarse correctamente mediante análisis cinético y así calculado en uso: [Ecuación 2] KD= CRraax/(Req-RT)-C descrita en el Ejemplo de Referencia 2.

El resultado mostrado en la Tabla 23 muestra que: la actividad de unión a FcyRIlb de IL6R-BP456/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396M en IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP455/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396L en IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP464/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396Y en IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP450/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396F en IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP448/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396D en I L6R-BP423/I L6R-L, IL6R-BP458/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396Q en IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP453/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396I en I L6R-BP423/I L6R-L, IL6R-BP449/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396E en IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP454/IL6R-L que resulta de introducir la alteración P396K en IL6R-BP423/IL6R-L, y IL6R-BP459/IL6R-L que resultaba de introducir la alteración P396R en IL6R-BP423/IL6R-L se aumentó toda en comparación con la de IL6R-BP423/IL6R-L antes de la introducción de las alteraciones. Mientras tanto, el valor de la KD (HaR)/KD (llb) de IL6R-BP456/IL6R-L que que resulta de introducir la alteración P396M en IL6R-BP423/IL6R-L fue mayor en comparación con la de IL6R-BP423/IL6R-L antes de la introducción de la alteración, demostrando la selectividad de FcYRIIb mejorada. Como se ve en la Tabla 23, la actividad de unión de las variantes preparadas para FcyRIa, FcYRIIaH, y FcYRIIIaV fue menor que la de IL6R-B3/IL6R-L, que fue el polipéptido original.

[Ejemplo 18] Preparación de variantes con unión a FcyRIIb mejorado al usar secuencias de subclases El perfil de unión a FcyR varía dependiendo de la subclase de IgG humana. Los presentes inventores evaluaron si la diferencia en la actividad de unión a cada FcyR entre IgG 1 e lgG4 se podría usar para aumentar la actividad de unión a FcyRIIb y/o para mejorar la selectividad. Primero, IgG 1 e lgG4 se analizaron para su actividad de unión a cada FcyR. Se construyó IL6R-G4d (SEC DE ID: 64) que contenían G4d como la cadena H de anticuerpo. G4d es una región Fe que carece de la Gly y Lys de C terminal y contiene una sustitución de Pro por Ser en la posición 228 (numeración de UE) en la lgG4 humana. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como la cadena L de anticuerpo. Se expresaron los anticuerpos que contenían la cadena ligera de IL6R-L e I L6R-G 1 d/l L6R-L o I L6R-G4d/I L6R-L y se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluaron los anticuerpos purificados para su unión a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb, o FcyRIIIaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. La unión de las variantes resultantes a cada FcgR se resume en la Tabla 24.

[Tabla 24] Se demostró que la unión a FcyRIIb de IL6R-G4d/IL6R-L fue 1.5 veces más intensa que la de IL6R-G1d/IL6R-L mientras que la unión de FcYRIIaR de IL6R-G4d/IL6R-L fue 2.2 veces más débil que la de IL6R-G1d/IL6R-L. Mientras tanto, la actividad de unión de IL6R-G4d/IL6R-L a FcyRIa, FcYRlIaH, y FcYRIIIaV fue más baja que la de IL6R-G1d/IL6R-L El resultado descrito antes reveló que IL6R-G4d tenía las características preferibles comparadas con IL6R-G1d en términos de la actividad y la selectividad de unión a FcgRIlb.

La Fig. 39 es una alineación para comparar las secuencias CH1 de G1d y de G4d hasta el extremo C (posiciones 118 a 445 (numeración de UE)). En la Fig. 39, los residuos de aminoácidos que son diferentes entre G1d y G4d se rellenan en negro. Los presentes inventores evaluaron si la unión a FcyRIIb podría aumentarse además y/o la selectividad de FcyRIIb podría mejorarse además mediante la selección, de los diferentes aminoácidos descritos antes, algunas porciones que se predicen para ser implicadas en la interacción con FcyR, e injertando por lo menos un residuo de aminoácido o más de la secuencia de G4d, que confiere una propiedad preferible desde el punto de vista de la actividad y de la selectividad de unión a FcyRIIb, a una variante con la unión a FcyRIIb mejorado.

Específicamente, los presentes inventores producen: IL6R-BP473 que resulta de introducir la alteración A327G en I L6R-BP230; IL6R-BP472 que resulta de introducir la alteración A330S en I L6R-BP230; IL6R-BP471 que resulta de introducir la alteración P331 S en I L6R-BP230; IL6R-BP474 que resulta de introducir las alteraciones A330S y P331 S en I L6R-BP230; IL6R-BP475 que resulta de introducir las alteraciones A327G y A330S en I L6R-BP230; IL6R-BP476 que resulta de introducir las alteraciones A327G, A330S, y P331 S en I L6R-BP230; y IL6R-BP477 que resulta de introducir las alteraciones A327G y P331 S en I L6R-BP230. Además, para el constructo I L6R-BP478, los aminoácidos a partir de Ala en la posición 1 1 8 a Thr en la posición 225 (numeración de UE) en IL6R-BP230 se sustituyeron con los aminoácidos de la secuencia G4d a partir de Ala en la posición 1 1 8 a Pro en la posición 222 (numeración de U E). Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como la cadena L de anticuerpo. Los anticuerpos que contenían la cadena ligera de I L6R-L y se purificaron las variantes de cadena pesada descritas antes de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 . Se evaluaron los anticuerpos purificados para su actividad de unión a cada FcyR (FcyRIa, FcYRI IaH , FcYRI IaR, FcyRI Ib, o FcYRI I IaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

El valor de la KD de cada variante a cada FcyR se muestra en la Tabla 25. La "KD (l lb) del polipéptido original/KD (llb) del polipéptido alterado" en la tabla muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRI Ib por el valor de la KD de cada variante para FcYRI I b. En la tabla, "alteración introducida en I L6R-BP230" se refiere a una alteración introducida en I L6R-BP230. I L6R-B3/I L6R-L usado como el molde para producir IL6R-BP230 se indica por *1 . M ientras tanto, I L6R-BP478, en el cual la secuencia G4d el Ala en la posición 1 18 hasta Pro en la posición 222 (numeración de UE) se ha sustituido para el segmento de Ala en la posición 1 18 hasta Thr en la posición 225 (numeración de U E) en IL6R-BP230, se indica por *2. La KD (MaR) del polipéptido original/KD (l laR) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de I L6R-B3/IL6R-L para FcyRI IaR por el valor de la KD de la variante para FcyRI IaR. La KD (MaR)/KD (l lb) muestra el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante para FcyRI IaR por la KD de la variante para FcYRI I b. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcyRI lb. En la Tabla 25, el número en las células rellenas de color gris indica que la unión de FcyR a IgG fue concluido para ser demasiado débil para analizarse correctamente mediante análisis cinético y así se calculó usando: [Ecuación 2] KD- ORmax/ (Req-RI) -C descrita en el Ejemplo de Referencia 2.

[Tabla 25] t o ^ 4- De las variantes mostradas en la Tabla 25, IL6R-BP473/IL6R-L introducido con la alteración A327G mostró la unión a FcyRIIb incrementada por 1.2 veces comparada a la de IL6R-BP230/IL6R-L. IL6R-BP478/IL6R-L que se produjeron al sustituir los aminoácidos de Ala en la posición 118 a Thr en la posición 225 (numeración de UE) de IL6R-BP230 con los aminoácidos de Ala en la posición 118 a Pro en la posición 222 (numeración de UE) de la secuencia G4d, tiene una unión 1.1 veces mejorada a FcyRIIb que aquella de IL6R-BP230/IL6R-L, y la unión de IL6R-BP478/IL6R-L a FcYRIIaR se disminuye 0.9 veces que aquella de of IL6R-BP2307IL6R-L Las actividades de unión de todas la variantes a FcyRIa, FcyRIIaH, y FcyRIIIaV fueron menores que aquellas del polipéptido parental IL6R-B3/IL6R-L.

En el examen realizado hasta ahora, la introducción de la alteración A327G, que sustituye el aminoácido en la secuencia de lgG4 humana para el aminoácido en la posición 327 (numeración de EU) en la variante IL6R-BP230/IL6R-L, mostró mejorar la actividad de unión a FcyRIlb. Un examen adicional se realizó para los aminoácidos que no coinciden entre las secuencias de lgG4 y lgG1 y aquellos distintos a los aminoácidos en la posición 327 (numeración de EU). Específicamente, las variantes se produjeron al introducir las siguientes alteraciones en IL6R-BP230 que se usó como la cadena H de anticuerpo; K274Q se introdujo para producir IL6R-BP541; Y296F se introdujo para producir IL6R-BP542; H268Q se introdujo para producir IL6R-BP543; R355Q se introdujo para producir IL6R-BP544; D356E se introdujo para producir IL6R-BP545; L358M se introdujo para producir IL6R-BP546; K409R se introdujo para producir IL6R-BP547; y Q419E se introdujo para producir IL6R-BP548, tal como se indicó por medio de la numeración de EU, respectivamente. Mientras tanto, se usó IL6R-L como la cadena L de anticuerpo común. Los anticuerpos que contienen la variante de cadena ligera anterior y la IL6R-L de cadena pesada se purificaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluaron los anticuerpos purificados para su unión a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb, o FcyRIIIaV) mediante el método del Ejemplo de Referencia 2.

La KD de cada variante a cada FcyR se muestra en la Tabla 26. En la tabla, "KD (llb) del polipéptido original/KD (llb) del polipéptido alterado" representa el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L a FcyRIIb por el valor de la KD de cada variante a FcyRIIb. En la tabla, "alteración de IL6R-BP230" se refiere a una alteración introducida en IL6R-BP230. IL6R-B3/IL6R-L usado como el molde para producir IL6R-BP230 se indica con *1. "KD (llaR) del polipéptido original/KD (MaR) del polipéptido alterado" representa el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de I L6R-B3/I L6R-L a FcyRIIaR por el valor de la KD de la misma variante a FcyRIIaR. La KD (llaR)/KD (llb) representa el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante a FcYRIIaR por la KD de la misma variante a FCYRIID. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FCYRIID. En la Tabla 26, el número en la célula rellenada de color gris indica que la unión de FCYR a IgG fue débil, y se determinó que el análisis no se podría realizar correctamente mediante el análisis cinético, y se calculó usando: [Ecuación 2] KD= CRmax/(Req-Rl)-C descrita en el Ejemplo de Referencia 1.

Como se muestra en la Tabla 26, IL6R-BP541/IL6R-L que resulta de introducir K274Q (cada uno representado por la numeración de EU) en IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP544/IL6R-L que resulta de introducir R355Q en IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L que resulta de introducir D356E en IL6R-BP230/IL6R-L, e IL6R-BP546/IL6R-L que resulta de introducir L358M en IL6R-BP230/IL6R-L, demostraron unión a FcYRIIb mejorada comparada con IL6R-BP230/IL6R-L antes de la introducción de la alteración. De los mismos, IL6R-BP544/IL6R-L que resulta de introducir R355Q (cada uno representado por la numeración de EU) en IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L que resulta de introducir D356E en IL6R-BP230/IL6R-L, e IL6R-BP546/IL6R-L que resulta de introducir L358M en IL6R-BP230/IL6R-L, se mostraron para tener un valor de KD (llaR)/KD (llb) aumentada y una selectividad mejorada al FcYRIIb, comparada con IL6R-BP230/IL6R-L antes de la introducción de la alteración.

[Tabla 26] [Ejemplo 19] Evaluación de combinaciones de las alteraciones que mejoran la unión a FcYRIIb o mejoran la selectividad de FcYRIIb Se evaluaron las combinaciones adicionales de las alteraciones que habían sido encontradas por la evaluación descrita anteriormente para mejorar la unión a FcYRIIb o la selectividad de FcYRIIb. Específicamente, las alteraciones que habían sido evaluadas para ser eficaces en mejorar la la unión a FcYRIIb y/o mejoran la selectividad de FcyRIIb se introdujeron en combinación en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). Además, alteraciones existentes S267E y L328F que mejoran la unión a FcyRI Ib (Seung et al., (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933)) se introdujeron en IL6R-B3 para producir IL6R-BP253 como un control de comparación. Se usó IL6R-L (SEC ID NO: 56) como la cadena L de anticuerpo. Los anticuerpos que contenían la cadena ligera de IL6R-L y las variantes de cadena pesada descritas antes se expresaron y se purificaron de acuerdo con el método como se describe en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluaron los anticuerpos purificados para su unión a cada FcyR (FcYRIa, FcYRIIaH, Fc RllaR, FcyRI Ib, o FcvRlllaV) mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

La KD de cada variante a cada FcyR se muestra en la Tabla 27. En la tabla, "alteración" se refiere a una alteración introducida en IL6R-B3 (SEC ID NO: 63). Se usa IL6R-B3/IL6R-L que como el molde para producir cada variante se indica por el asterisco (*). La KD (llb) del polipéptido original/KD (llb) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIb por el valor de la KD de cada variante para FcyRIIb. Mientras tanto, la KD (llaR) del polipéptido original/KD (llaR) del polipéptido alterado muestra el valor obtenido dividiendo el valor de la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcvRllaR por la KD de la variante para FcvRllaR. La KD (MaR)/KD (llb) muestra el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante para FcyRIIaR por la KD de la variante para FcYRIlb. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcyRIIb como se compara con FcyRIIaR. Mientras tanto, la KD (llaH)/KD (llb) muestra el valor obtenido dividiendo la KD de cada variante para FcyRIIaH por la KD de la variante para FcYRIlb. Cuanto mayor es el valor, mayor es la selectividad a FcyRIIb como se compara con el FcyRIIaH. En la Tabla 27, el número en las células rellenas de color gris indica que la unión de FcyR a IgG se concluyó para ser demasiado débil para analizarlo correctamente mediante análisis cinético y se calculó usando: [Ecuación 2] KD= C*Rrailx/(Req-RI)-C descrita en el Ejemplo de Referencia 25.

[Tabla 27] De las variantes mostradas en la Tabla 27, se agregó IL6R-BP253/IL6R-L con las alteraciones existentes que mejoran la unión a FcvRllb de las actividades de unión a FcyRIIb y FcyRIIaR exhibidas y aumentadas a 277 veces y 529 veces las de IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de las alteraciones, respectivamente. Además, la actividad de unión a FcyRIa de IL6R-BP253/IL6R-L fue también mayor que la de I L6R-B3/I L6R-L. Mientras tanto, la unión a FcyRIIaH y la unión a FcyRIIIaV de IL6R-BP253/IL6R-L se redujeron comparadas con las de IL6R-B3/IL6R-L. Entre otras variantes, IL6R-BP436/IL6R-L e IL6R-BP438/IL6R-L mostraron una unión a FcyRIa mejorada ligeramente en comparación con la de IL6R-B3/IL6R-L antes de la introducción de las alteraciones. Todas las otras variantes mostraron una unión a FcyRIa reducida. Además, todas las variantes exhibieron unión a FcyRIIaH y unión a FcyRIIIaV reducidas comparadas con las de I L6R-B3/I L6R-L.

Comparada con IL6R-BP489/IL6R-L, I L6R-BP487/I L6R-L, IL6R-BP499/IL6R-L, IL6R-BP498/IL6R-L, IL6R-BP503/IL6R-L, IL6R-BP488/IL6R-L, IL6R-BP490/IL6R-L, IL6R-BP445/IL6R-L, IL6R-BP552/IL6R-L, IL6R-BP507/IL6R-L, I L6R-BP536/I L6R-L, IL6R-BP534/IL6R-L, I L6R-491 /I L6R-L, I L6R-BP553/I L6R-L, IL6R-BP532/IL6R-L, IL6R-BP506/IL6R-L, IL6R-BP511/IL6R-L, IL6R-BP502/IL6R-L, I L6R-BP531 /I L6R-L, I L6R-BP51 O/l L6R-L, IL6R-BP535/IL6R-L, I L6R-BP497/I L6R-L, I L6R-BP533/I L6R-L, IL6R-BP555/IL6R-L, IL6R-BP554/IL6R-L, IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R- BP423/IL6R- L, IL6R -BP440/IL6R -L, IL6R- BP538/IL6R- L, IL6R- BP429/IL6R- L, IL6R -BP438/IL6R -L, IL6R- BP565/IL6R- L, IL6R- BP540/IL6R- L, IL6R -BP426/IL6R -L, IL6R- BP437/IL6R- L, IL6R- BP439/IL6R- L, IL6R -BP551/IL6R -L, IL6R- BP494/IL6R- L, IL6R- BP537/IL6R- L, IL6R -BP550/IL6R -L, IL6R- BP556/IL6R- L, IL6R- BP539/IL6R- L, IL6R- BP558/IL6R- L, IL6R-BP425/IL6R-L, e IL6R- BP495/IU6R-L, su unión a FcyRllb fue más alta que al de IL6R-BP253/IL6R-L agregado con la alteración existente que mejora la unión a FcYRIlb. De lo anterior, la mejora de la unión a FcyRIIb se oscila de 321 veces (más bajas) a 3100 veces (más altas), comparada a la unión de IL6R-B3/IL6R-L (que se define para ser 1), de IL6R-BP495/IL6R-L a IL6R-BP489/IL6R-L, respectivamente. Así, puede decirse que estas variantes son superiores en ambos del nivel y la selectividad de la mejora de la actividad de unión a FcvRllb comparada a la de la técnica anterior.

La comparación de las variantes producidas en este examen con la variante existente IL6R-BP253/IL6R-L que mejora la uniónde a FcgRIIb mostró que el valor de KD (HaR)/KD (llb) es 16.1 para IL6R-BP479/IL6R-L que mostró el valor menor y es 64.4 para IL6R-BP567/IL6R-L que mostró el valor mayor, y los valores para todas las variantes fue mayor que 0.2 para IL6R-BP253/IL6R-L. Además, el valor de KD (MaH)/KD (llb) es 107.7 para IL6R-BP480/IL6R-L que mostró el valor menor y es 8362 para IL6R-BP426/IL6R-L que mostró el valor mayor, y los valores para todas las variantes fueron mayores que 107.1 para IL6R- BP253/IL6R-L. De estos resultados, todas las variantes mostradas en la tabla 27 han mostrado ser variantes con selectividad mejorada a FcgRIib con respecto a la variante conocida en la cual se introduce la alteración que mejora la unión a FcgRIib. Particularmente, IL6R-BP559/IL6R-L, IL6R- BP493/IL6R-L, IL6R-BP557/IL6R-L, IL6R-BP492/IL6R-L, e IL6R-BP500/IL6R-L tienen la actividad de unión mantenida en no más de 1.5 veces que la de IL6R-B3/IL6R-L, y al mismo tiempo la actividad de unión a FcgRIib mejorada en 100 veces; por lo tanto, se espera que estas variantes muestren los efectos producidos por la unión a FcgRIib mejorada mientras evitan los efectos secundarios causados por la unión mejorada a FcgRIIaR. Por consiguiente, puede considerarse que estas variantes tienen mejores propiedades en términos de ambas actividades de unión y la selectividad a FcgRIib que los anticuerpos producidos por las técnicas existentes.

Sin limitación por una teoría particular, pueden ser más eficaces las variantes IL6R-BP568/IL6R-L e I L6R-BP492/I L6R-L que han conservado la secuencia Tregitope que tiene la mayor capacidad de inducción de Treg (De Groot et al. (Blood (2008) 112, 3303-3311) y así se considera que tiene una mayor actividad de inducción de Treg que las variantes que tienen Y296D, IL6R-BP567/IL6R-L e I L6R-BP493/I L6R-L. En relación con la actividad de unión y la selectividad de estas variantes para FcgRIib, la comparación con el tipo nativo muestra que la unión a FcgRIIaR es 1.6 veces y la unión a FcgRIIb es 211 veces la del tipo nativo para IL6R-BP568/IL6R-L, y la unión a FcgRIIaR es 1.2 veces y la unión a FcgRIIb es 131 veces la del tipo nativo para IL6R-BP492/IL6R-L, y se descubrió que estas variantes tuvieron mayor actividad de unión y selectividad a FcgRIIb.

[Ejemplo 20] Preparación de anticuerpos que se unen a IgA humana de una manera dependiente al calcio (20- ) Preparación de la IgA humana (hlqA) Los Ejemplos 2 a 4 muestran que las moléculas que tienen unión a FcvR de ratón mejorada y que se unen de una manera dependiente al pH al receptor IL-6 humano como un antígeno, puede significativamente reducir la concentración del antígeno en plasma. Entonces, se realizó una prueba adicional al usar anticuerpos a IgA humana como un antígeno, para evaluar la presencia de un efecto similar de eliminar antígenos solubles del plasma en un organismo vivo administrado con anticuerpos que tienen unión a FcyR de ratón mejorada y que se unen de una manera dependiente al pH a antígenos con excepción del receptor IL-6 humano. El antígeno, se preparó IgA humana (más adelante también referida hlgA) (su región variable es de un anticuerpo anti-IL6R humana) al usar la siguiente técnica de recombinación. Se expresó la hlgA cultivando células huspedadoras que contiene vectores recombinantes que llevaban H (WT)-lgA1 (SEC ID NO: 65) y L (WT)-CK (SEC ID NO: 42), y purificados mediante un método conocido por los expertos en la técnica al usar cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel. (20-2) Expresión y purificación de un anticuerpo que se une hlaA GA2-lgG1 (cadena pesada, SEC ID NO: 66; cadena ligera, SEC ID NO: 67) es un anticuerpo que se une a hlgA. Una secuencia de ADN que codifica GA2-lgG1 (cadena pesada, SEC ID NO: 66; cadena ligera, SEC ID NO: 67) se insertó en un plásmido de expresión de célula animal mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se expresó el anticuerpo y se purificó mediante el método descrito más adelante. Se suspendieron células de la línea FreeStyle 293-F derivadas de células de riftón fetal humano (Invitrogen) en Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen). La suspensión celular se aplicó sobre la placa a una densidad celular de 1.33 x 106 células/ml en 3 mi a a cada pozo de una placa de 6 pozos. Entonces, se introdujo el plásmido preparado en las células mediante el método de lipofección. Se cultivaron las células en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm) durante 4 días. A partir del sobrenadante de cultivo aislado, se purificó el anticuerpo mediante un método conocido por los expertos en la técnica que al usar rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Se midió la absorbencia (longitud de onda: 280 nm) de la solución del anticuerpo purificado al usar un espectrofotómetro. Se determinó la concentración de anticuerpo al usar el coeficiente de extinción calculado del valor medido mediante el método de PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). (20-3) Evaluación del anticuerpo aislado para su capacidad de unión a hlgA dependiente de calcio Se evaluó el anticuerpo aislado como se describe en el Ejemplo (20-2) para su actividad de unión a hlgA (constante de disociación, la KD (M)) al usar Biacore T200 (GE Healthcare). Se midió la actividad de unión al usarse como un amortiguador de corrida, 0.05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI (pH 7.4 o pH 5.8) que contenía 3 µ? o 1.2 mM de CaCI2. Se inmovilizó una cantidad apropiada de proteína recombinante A/G (Thermo Scientific) sobre una matriz sensor CM5 (GE Healthcare) mediante un método de combinación de amino, y el anticuerpo se dejó unir a la misma. Entonces, se inyectó una concentración apropiada de hlgA (descrita en (A1-1)) como un analito y dejó interactuar con el anticuerpo en la matriz sensor. La medición se realizó a 37°C. Después de la medición, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5) para regenerar la matriz sensor. A partir del resultado de la medición, se calculó la constante de disociación KD (M) mediante el análisis de ajuste de curva y el análisis de equilibrio al usar el Software de Evaluación de Biacore T200 (GE Healthcare). El resultado se muestra en la Tabla 28. GA2-lgG1 unido intensamente a hlgA a una concentración de Ca2+ de 1.2 mM, y unido débilmente a hlgA a una concentración de Ca2+ de 3 µ?. Mientras tanto, a una concentración de Ca2+ de 1.2 mM, GA2-lgG1 unido intensamente a IgA humana a pH 7.4, y unido débilmente a IgA humana a pH 5.8. En resumen, GA2-lgG1 se demostró para unirse a IgA humana de una manera dependiente al pH y calcio.

[Tabla 28] [Ejemplo 21] Preparación de las variantes de anticuerpos que se unen a hlgA de una manera dependiente al calcio Después, para la eliminación del antígeno acelerada adicional (hlgA) del plasma, GA2-F1087 (cadena pesada, SEC ID NO: 68) se produjo mediante la sustitución de Tyr por Lys en la posición 328 (numeración de UE) en GA2-lgG1 para mejorar la unión a FcyR de ratón de GA2-lgG1 que se une a hlgA de una manera dependiente al calcio. Se insertó una secuencia de ADN que codifica GA2-F1087 (cadena pesada, SEC ID NO: 68; cadena ligera, SEC ID NO: 67) en un plásmido de expresión animal mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se expresaron las variantes de anticuerpos mediante el método descrito antes al usar el plásmido. Las concentraciones de las variantes se midieron después de la purificación. Los anticuerpos que comprenden la alteración anterior exhibieron unión a FCYR de ratón significativamente incrementada, como se muestra en el Ejemplo (4-3).

[Ejemplo 22] Evaluación del efecto sobre la retención del antfgeno en plasma en ratones normales administrados con anticuerpos de unión ¾f hlgA dependientes de Ca (22-1 ) Pruebas in vivo al usar ratones normales Se administró hlgA (IgA humana, preparada como se describe en el Ejemplo (20-1)) sola o en combinación con un anticuerpo anti-hlgA a ratones normales (ratón C57BL/6J, Charles River Japón). Después de la administración, se evaluaron la dinámica in vivo de hlgA y los anticuerpos anti-hlgA. Una solución de hlgA (80 pg/ml) o una solución mezclada de hlgA y se administró un anticuerpo anti-hlgA una vez en una dosis de 10 ml/kg en la vena caudal. Los anticuerpos anti-hlgA usados fueron GA2-lgG1 y GA2-F1087 descritos antes.

En todas las soluciones mezcladas, la concentración de hlgA fue 80 pg/ml, y la concentración de anticuerpo anti-hlgA fue 2.69 mg/ml. En este experimento, los anticuerpos anti-hlgA están presentes significativamente en exceso sobre hlgA, y así la mayor parte de hlgA se pensó para unirse a los anticuerpos. En el grupo administrado con GA-hlgG1, de los ratones, se recolectó la sangre cinco minutos, siete horas, un día, dos días, tres días, y siete días después de la administración. Mientras tanto, en el grupo administrado con GA-F1087, de los ratones, se recolectó la sangre cinco minutos, 30 minutos, una hora, dos horas, un día, tres días, y siete días después de la administración. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 12,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para aislar el plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador a -20°C o menos hasta uso. (22-2) Determinación de la concentración de anticuerpo anti-hlgA en plasma en ratones normales mediante el método de ELISA Se midieron las concentraciones anticuerpo anti-hlgA en plasma de ratón mediante el método de ELISA. Primero, para preparar una placa inmovilizada con IgG anti-humana, la IgG antihumana (cadena ? específica) fragmento F(ab')2 del anticuerpo (SIGMA) se dividió en alícuotas a cada pozo de una placa Nunc-Immuno, MaxiSorp (Nalge nunc International), y la placa se dejó reposar a 4°C durante la noche. Las muestras de la curva de calibración del anticuerpo anti-hlgA preparadas como soluciones estándar para la concentración plasmática (0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01563, y 0.007813 pg/ml) y las muestras de ensayo de plasma de ratón diluidas 100 veces o más, se dividieron en alícuotas en la placa inmovilizada con IgG antihumana mencionada antes. Después de una hora de incubación de la placa a 25°C, IgG Anti-Humana de Cabra (cadena ? específica) Biotina (BIOT) Conjugado (Southern Biotechnology Associates Inc.) se dividieron en alícuotas a cada pozo de la placa. Entonces, se incubó la placa a 25°C durante una hora. Después, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) se dividió en alícuotas a cada pozo de la placa. Entonces, se incubó la placa a 25°C durante una hora. La se realizó reacción cromogénica al usar como un sustrato el Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories). Después de terminar la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), la absorbencia de la solución de reacción en cada pozo se midió a 450 nm con un lector de microplaca. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo anti-hlgA en plasma de ratón basadas en la absorbencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Un transcurso de tiempo de las concentraciones de anticuerpos de GA2-lgG1 y de GA2-F1087 en el plasma de ratones normales después de la administración intravenosa, que se midió mediante el método describió antes, se muestra en la Fig. 40. Los resultados demuestran que, con respecto al clon GA2-lgG1 que tiene intensa actividad de unión a hlgA dependiente al pH, la concentración plasmática del anticuerpo no se reduce significativamente incluso si la unión a FcvR se mejora. (22-3) Determinación de la concentración de hlgA en plasma mediante el método de ELISA Se midieron las concentraciones de hlgA en plasma de ratón mediante el método de ELISA. Primero, para preparar una placa inmovilizada con IgA anti-humana, el anticuerpo IgA anti-humana de cabra (BETHYL) se dividió en alícuotas a cada pozo de una placa Nunc-lmmuno, MaxiSoup (Nalge nunc International), y la placa se dejó en reposo a 4°C durante la noche. Se prepararon las muestras de la curva de calibración de hlgA como soluciones estándar para la concentración plasmática (0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, y 0.00625 pg/ml), y se usaron. 100 µ? de cada una de las muestras de la curva de calibración y de las muestras de ensayo de plasma de ratón diluidas 100 veces o más, se combinaron con 200 µ? de 500 ng/ml de hsL6R. Éste se mezcló e incubó a temperatura ambiente durante una hora. Entonces, 100 µ? de las mezclas se dividió en alícuotas en la placa inmovilizada con IgA anti-humana. La placa se dejó en reposo a temperatura ambiente durante una hora. Después, anticuerpo IL-6R antihumano biotinilado (R&D) se dividió en alícuotas en cada pozo de la placa. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, Streptavidin-PolyH RP80 (Stereospecific Detection Technologies) se dividió en alícuotas en cada pozo de la placa. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica al usar como un sustrato el Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories). Después de terminar la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), la absorbencia de la solución de reacción en cada pozo se midió a 450 nm con un lector de microplaca. Se determinaron las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Un transcurso de tiempo de la concentración de hlgA en el plasma de ratones normales después de la administración intravenosa, que se midió mediante el método anteriormente mencionado, se muestra en la Fig.41.

El resultado mostró que, en ratones administrados con hlgA en combinación con GA2-lgG1 que tiene una actividad de unión a hlgA dependiente de Ca de 100 veces o más mayor, la eliminación de hlgA fue acelerada comparada a la administración de hlgA solo. Mientras tanto, en el plasma de ratones administrados con GA2-F1087 con unión mejorada a hlgA y FcyR, se redujo la concentración de hlgA debajo del intervalo medible (0.006 pg/ml o más) un día después de la administración, y así la eliminación de hlgA se aceleró significativamente comparada a la del plasma de ratones administrados con GA-lgG1. Los hallazgos descritos en los Ejemplos 2 a 7 anteriores demuestran el efecto de eliminación aumentada del antígeno de anticuerpos con unión a FcyR mejorada en los ratones administrados con el anticuerpo IL6R y anti-IL6R. Asimismo, un efecto similar también se demostró para lograrse en ratones administrados con el antígeno de hlgA y el anticuerpo anti-hlgA. A partir de los resultados obtenidos hasta ahora en los Ejemplos, la eliminación del antígeno en este caso pude también mediarse por medio de FcyRIlb.

[Ejemplo 23] Preparación de un anticuerpo anti-lgE dependiente al pH (23-1) Preparación de un anticuerpo anti-lgE humana Para preparar un anticuerpo anti-lgE humana dependiente al pH, la IgE humana (cadena pesada, SEC ID NO: 69; cadena ligera, SEC ID NO: 70) (su región variable es de un anticuerpo anti-glipicano 3) se . expresó como un antígeno al usar FreeStyle293 (Life Technologies). Se preparó la IgE humana expresada y se purificó mediante un método cromatográfico general conocido por los expertos en la técnica. Se seleccionó un anticuerpo que se une a la IgE humana de una manera dependiente al pH de muchos anticuerpos aislados. Las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo anti-lgE humana seleccionado se fusionó con una región constante de cadena pesada de lgG1 humana y una región constante de cadena ligera humana, y el gen de anticuerpo resultante se insertó en un vector. Al usar el vector, se expresó un anticuerpo anti-lgE humana recombinante y se purificó. El anticuerpo preparado se nombró el clon 278 (más adelante designado 278-lgG1; cadena pesada, SEC ID NO: 71, cadena ligera, SEC ID NO: 72). (23-2) Evaluación del anticuerpo anti-lgE humana para la actividad de unión a IgE humana y la actividad de unión dependiente al pH Los anticuerpos capaces de disociar antígenos en el endosoma pueden producirse de una manera tal que se unen a los antigenos no sólo de una manera dependiente al pH sino también de una manera dependiente de Ca. Así, se evaluaron 278-lgG1 y el anticuerpo lgG1 humana de control Xolair (omalizumab, Novartis) sin capacidad de unión a IgE dependiente al pH/Ca para la capacidad de unión dependiente al pH y la capacidad de unión a IgE humana dependiente al pH/Ca (hlgE). Específicamente, se evaluaron 278-lgG1 y Xolair para su actividad de unión a hlgE (constante de disociación, KD (M)) al usar Biacore T200 (GE Healthcare). Se realizaron las mediciones al usar los siguientes tres tipos de amortiguadores de corrida: • 1.2 mmol/l de CaCI2, 0.05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, pH 7.4 ¦ 1.2 mmol/l de CaCI2, 0.05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, pH 5.8 • 3 prnol/l de CaCI2, 0.05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, pH 5.8 Una cantidad apropiada de un péptido (más adelante referido "péptido GPC3 biotinilado") que resulta de agregar la biotina al Lys de terminal C de una secuencia químicamente sintetizada derivada de la proteína glipicano 3 humana (SEC ID NO: 73) se cargó en una matriz sensor SA (GE Healthcare), e inmovilizados en la matriz sensor SA basada en la afinidad de biotina/estreptavidina. Se inyectó una concentración apropiada de IgE humana y se capturó por el péptido GPC3 biotinilado para inmovilizar la IgE humana en la matriz. Se inyectó una concentración apropiada de 278-lgG1 como un analito, y se dejó para interactuar con la IgE humana en la matriz sensor. Entonces, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5) para regenerar la matriz sensor. Se realizó todo el análisis para la interacción a 37°C. Al usar el Software de Evaluación de Biacore T200 (GE Healthcare), se analizaron los resultados de ensayo mediante el ajuste de la curva para evaluar la constante de velocidad de unión ka (1/Ms) y la constante de velocidad de disociación KD (1/s). Se calculó la constante de disociación KD (M) a partir de las constantes anteriores. Entonces, se evaluó la unión dependiente al pH calculando la relación de la KD de cada anticuerpo entre las condiciones de pH 5.8/1.2 mM de Ca y pH 7.4/1.2 mM de Ca. Se evaluó la unión dependiente al pH/Ca calculando la relación de la KD de cada anticuerpo entre las condiciones de pH 5.8/3 µ? de Ca y pH 7.4/1.2 mM de Ca. Los resultados se muestran en la Tabla 29.

[Tabla 29] [Ejemplo 24] Preparación de una variante de anticuerpo que se une a la IgE humana de una manera dependiente al pH Después, para además acelerar la eliminación del antígeno (IgE humana) del plasma, se insertó una secuencia de ADN que codifica 278-F1087 (cadena pesada, SEC ID NO: 74; cadena ligera, SEC ID NO: 72) con una sustitución de Tyr por Leu en la posición 326 (numeración de UE) en 278-lgG1 en un plásmido de expresión animal mediante un método conocido por los expertos en la técnica, para mejorar la unión a FCYR de ratón de 278-lgG1 que se une a IgE humana de una manera dependiente al pH. Se expresaron las variantes de anticuerpos mediante el método anteriormente mencionado al usar células animales introducidas con el plásmido. Las concentraciones de las variantes de anticuerpos se determinaron después de la purificación.

[Ejemplo 25] Evaluación in vivo de 278-lgG1 (25-1 ) Preparación de la IgE humana (hlgE (Asp6)) para evaluación in vivo La hlgE (Asp6) (su región variable es de un anticuerpo anti-glipicano 3 humano), que es una IgE humana para evaluación in vivo, que consiste en la cadena pesada (SEC ID NO: 75) y la cadena ligera (SEC ID NO: 70), se prepararon mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo (23-1). La hlgE (Asp6) es una molécula en la cual la asparragina se ha sustituido con ácido aspártico en los seis sitios de / -glicosilación en IgE humana, de modo que los cambios dependientes de tiempo en la concentración de IgE humana como un antígeno en el plasma no afectan la heterogeneidad de las cadenas de azúcar ligadas a N de la IgE humana. (25-2) Evaluación del efecto de acelerar la eliminación de la ?a? humana del plasma de ratones normales administrados con el clon 278 Como se describe en los Ejemplos 2 a 4, y 22, la concentración de antígeno se demostró para ser reducida significativamente en el plasma de ratones administrados con las moléculas que se unen de una manera dependiente al pH al receptor IL-6 humano o IgA humana como un antígeno, y cuyo unión a FcyR de ratón se ha mejorado. Se realizó una prueba adicional al usar anticuerpos contra IgE humana como un antígeno para evaluar si un efecto similar de eliminar antígenos solubles del plasma de un organismo vivo administrado con anticuerpos con unión a FcyR de ratón mejorada que se une de una manera dependiente al pH a antígenos con excepción del receptor IL-6 humano y IgA humana, cuando la unión a FcyR de ratón se mejora.

Se evaluaron la hlgE (Asp6) y los anticuerpos anti-lgE humana para su dinámica in vivo después de la administración de la hlgE (Asp6) sola, o la hlgE (Asp6) en combinación con los anticuerpos anti-hlgE (278-lgG1 y 278-F1087) a ratones C57BL/6J (Charles River Japón). Se administró la hlgE (Asp6) (20 pg/ml) o una mezcla de hlgE (Asp6) y un anticuerpo anti-lgE humana una vez a 10 ml/kg en la vena caudal (como se describe en Tabla 30, se prepararon todos los anticuerpos a la misma concentración). En este caso, cada anticuerpo se presentó significativamente en exceso sobre hlgE (Asp6), y casi toda la hlgE (Asp6) se pensó así para unirse al anticuerpo. En el grupo administrado con el clon 278 (278-lgG1), a partir de los ratones, se recolectó la sangre cinco minutos, dos horas, siete horas, un día, dos días, cuatro días, cinco días, siete días, 14 días, y 21 días después de la administración. En el grupo administrado con 278-F1087, a partir de los ratones, se recolectó la sangre cinco minutos, 30 minutos, una hora, dos horas, un día, tres días, siete días, 14 días, y 21 días después de la administración. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 15,000 rpm y 4°C durante 5 minutos para aislar el plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador a -20°C o menos hasta uso.

[Tabla 30] (25-3) Determinación la concentración del anticuerpo anti-lgE humana en plasma en ratones normales Se midieron las concentraciones de anticuerpo anti-hlgE en plasma de ratón mediante el método de ELISA. Se prepraron muestras de curva estándar a 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, y 0.00625 g/ml para las concentraciones en plasma. Para asegurar la homogeneidad del complejo inmune entre la hlgE (Asp6) y el anticuerpo anti-hlgE, se agregó la hlgE (Asp6) a 1 pg/ml a las muestras de curva estándar y a las muestras de ensayo de plasma de ratón. Las muestras del grupo de administración 278-hlgG1 y las muestras de curva estándar correspondientes se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, las muestras del grupo de administración 278-F1087 y las muestras de curva estándar correspondientes se agitaron a 37°C durante la noche. Después de la incubación o la agitación, las muestras de curva estándar y las muestras de ensayo de plasma de ratón se dividieron en alícuotas a una inmunoplaca (Placa Nunc-lmmuno, MaxiSorp (Nalge nunc International)) inmovilizada con Anticuerpo de Cadena Ligera Kappa Anti-Humano (Bethyl Laboratories), y esto se dejó en reposo/se agitó a temperatura ambiente durante dos horas (las muestras del grupo de administración 278-F1087 y las muestras de curva estándar de 278-F1087), o se dejó reposar a 4°C durante la noche (las muestras del grupo de administración 278-hlgG1 y las muestras de curva estándar de 278-hlgG1). Entonces, el anticuerpo secundario de IgG anti-humano de conejo (Fe), conjugado de biotina (Pierce Biotechnology) y Streptavidin-Poly HRP80 (Stereospecific Detection Technologies) cada uno se hizo reaccionar en sucesión durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica al usar como sustrato el Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories). Después de terminar la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se determinaron las concentraciones en plasma de ratón basadas en el desarrollo de color mediante un método para medir la absorbencia a 450 nm con un lector de microplaca. Se determinaron las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Un transcurso de tiempo de las concentraciones de anticuerpos en plasma después de la administración intravenosa, que se determinó mediante el método anterior, se muestra en la Fig. 47. El resultado demuestra que, en ratones administrados con las variantes que resultan de mejorar la unión a FCYR de 278-lgG1 con potente actividad de unión a IgE humana dependiente al pH, la concentración de anticuerpo en el plasma de ratones no se redujo significativamente en comparación con la de 278-lgG1. (25-4) Determinación de la concentración de la hlgE en plasma (Asp6) en ratones normales Se midieron las concentraciones de la hlgE (Asp6) en plasma de ratón mediante el método de ELISA. Se prepraron las muestras de la curva de calibración a 192, 96, 48, 24, 12, 6, y 3 ng/ml para las concentraciones de plasma. Para asegurar la homogeneidad del complejo inmune entre la hlgE (Asp6) y el anticuerpo anti-hlgE, en el grupo administrado con 278-hlgG1, se agregó Xolair (Novartis) a 10 pg/ml a la curva estándar y las muestras de ensayo de plasma de ratón, y las mezclas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. En el grupo administrado con 278-F1087, se agregaron 278-F1022 (cadena pesada, SEC ID NO: 76; cadena ligera, SEC ID NO: 72; preparada de manera similar como en el Ejemplo 24) o 278-F760 (cadena pesada, SEC ID NO: 77; cadena ligera, SEC ID NO: 72; preparada de manera similar como en el Ejemplo 24) a 20 pg/ml, y las mezclas se agitaron a 37°C durante 60 horas. Las muestras de ensayo de plasma de ratón se dividieron en alícuotas en una inmunoplaca (MABTECH) inmovilizada con anti-lgE humana, o una inmunoplaca (placa Nunc F96 MicroWell (Nalge nunc International)) inmovilizada con anti-lgE humana (clon 107, MABTECH), y ésta se dejó reposar o se agitó a temperatura ambiente durante dos horas, o se dejó reposar a 4°C durante la noche. Entonces, la proteína nuclear GPC3 humana (SEC ID NO: 78), el anticuerpo anti-GPC3 (preparación internamente) biotinilado con NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific), y Sterptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) cada uno se hizo reaccionar en sucesión durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica al usar como un sustrato el Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories). Después de terminar la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se determinaron las concentraciones en plasma de ratón basadas en el desarrollo de color mediante un método para medir la absorbencia a 450 nm con un lector de microplaca. Alternativamente, se realizó la reacción cromogénica al usar como un sustrato el Sustrato Quimioluminiscente de SuperSignal(r) Pico ELISA (Thermo Fisher Scientific), y se evaluaron las concentraciones en plasma de ratón mediante un método para medir la intensidad de a luminiscencia con un lector de microplaca. Se determinaron las concentraciones en plasma de ratón basadas en la intensidad de absorbencia o de luminiscencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Un transcurso de tiempo de las concentraciones de hlgE (Asp6) en plasma después de la administración intravenosa, que se determinaron mediante el método anterior, se muestra en la Fig. 43.

En cuanto a la eliminación de la IgE humana solo, el resultado demuestra que, en ratones administrados con IgE humana en combinación con 278-lgG1 que tiene actividad de unión intensa dependiente al pH, la eliminación de la IgE humana se aceleró en comparación con la administración de IgE humana solo. Además, en ratones administrados con IgE humana en combinación con 278-F1087 que resulta de mejorar la unión a FCYR de 278-lgG1, la eliminación de IgE humana se demostró para ser acelerada significativamente comparada con la de los ratones administrados con IgE humana solo, o IgE humana en combinación con 278-lgG1. Es decir, se mostró que la eliminación del antígeno fue acelerada no sólo en ratones administrados con el anticuerpo anti-IL6R anteriormente mencionado y el anticuerpo anti-lgA con unión a FcyR mejorada, pero también en ratones administró con el anticuerpo anti-lgE con unión a FcyR mejorada. A partir de los resultados obtenidos hasta ahora en los Ejemplos, la eliminación del antígeno en este caso también puede mediarse por medio de FcyRIIb.

[Ejemplo 26] Efectos de la eliminación de los antígenos del plasma para las moléculas de unión al antígeno con mayor actividad de unión a FcyRIIb que aquella de una región de Fe de IgG nativa de ratón (26-1) Efecto de la eliminación del antígeno de los anticuerpos de ratón con actividad de unión a FcyRIIb selectivamente mejorada En los Ejemplos 5 a 7, se examinó un grupo de ratones normales administrados con una molécula de unión al antígeno producida al mejorar la actividad de unión a FcyR de ratón de una molécula de unión al antígeno que tiene una región de Fe del anticuerpo de ratón y que tiene las propiedades de unión al receptor IL-6 humano dependiente del pH, y un grupo de ratones deficientes de la cadena y del receptor Fe y un grupo de ratones deficientes de FCYR 111 que simulan la condición donde se administra un anticuerpo con actividad de unión a FcyRIIb de ratón selectivamente mejorada. A partir de estos resultados, las moléculas de unión al antígeno que exhiben la unión dependiente de pH a los antígenos solubles y que tienen actividad de unión a FcyRIIb selectivamente mejorada mostraron poder eliminar eficientemente los antígenos solubles en plasma cuando se administraron in vivo. Si este efecto se observa en los ratones normales administrados con una molécula de unión al antígeno que comprende una región de Fe de ratón con actividad de unión a FcyRIIb selectivamente mejorada y que tienen las propiedades de unión al receptor IL-6 humano dependiente del pH, se examinó tal como se indica a continuación. (26-2) Producción de los anticuerpos de ratón con actividad de unión a FcvRllb selectivamente mejorada VH3-mlgG1 (SEC ID NO: 49) y VL3-mk1 (SEC ID NO: 50) se produjeron como la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo lgG1 de ratón que tiene las propiedades de unión al receptor IL-6 humano dependiente de pH usando el método del Ejemplo de referencia 1. Además, para mejorar la actividad de unión al FcyRIIb de ratón de VH3-mlgG1, las sustituciones de Glu por Thr en la posición 230, Ala por Val en la posición 231, Asn por Pro en la posición 232, Glu por Ser en la posición 238, y Asp por Ser en la posición 239 según lo indicado por la numeración de EU, se realizaron para producir VH3-mlgG1-MB367 (SEC ID NO: 79). Fv4-mlgG1 o Fv4-mlgG1- B367 que comprenden VL3-mk1 como la cadena ligera y VH3-mlgG1 o VH3-mlgG1-MB367, respectivamente, como la cadena se expresaron y purificaron usando el método del Ejemplo de referencia 1. (26-3) Confirmación de la actividad de unión a FcvR de ratón VH3/L(WT)-mlgG1 o VH3/L(WT)-mlgG 1 -MB367 que comprende L(WT)-CK (SEC ID NO: 42) como la cadena ligera y VH3-mlgG1 o VH3-mlgG 1 -MB367, respectivamente, como la cadena pesada, se expresaron y purificaron usando el método del Ejemplo de referencia 1. Las actividades de unión al FcyR de ratón de estos anticuerpos se determinaron por medio del Ejemplo de referencia 2, y los resultados se muestran en la tabla 31. Además, cuánto mayor sea la actividad de unión a FcyR de ratón de cada variante, se mejora con respecto a mlgG1 antes de la alteración mostrada en la tabla 32.

[Tabla 31] De acuerdo con los resultados mostrados en la tabla 32, VH3/L(WT)-mlgG1-MB367 producido al introducir las cinco alteraciones mencionadas anteriormente en VH3/L(WT)-mlgG1 tiene la actividad de unión a FcyRIIb de ratón que se mejoró aproximadamente 160 veces y la actividad de unión a FcyRIII de ratón que se mejoró 6.2 veces con respecto a antes de la alteración. Es decir, VH3/L(WT)-mlgG1- B367 mostró la actividad de unión a FcyRIIb de ratón selectiva y mejorada. (26-4) Confirmación de los efectos de reducir la concentración del receptor soluble IL-6 humano en plasma usando los ratones normales Los efectos de la eliminación del receptor soluble IL-6 humano en el plasma de los ratones normales administrados con Fv4-mlgG1 o Fv4-mlgG1 -MB367 como el anticuerpo anti-receptor IL-6 humano, se examinaron tal como se describirá a continuación. (26-4-1) Prueba in vivo usando ratones normales Los ratones normales (ratón C57BL/6J; Charles River, Japón) se co-administraron con el receptor soluble IL-6 humano y el anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón, y después se determinó su dinámica in vivo. Una solución mezclada del receptor soluble IL-6 humano y de un anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón se administró una vez a una dosis de 10 ml/kg en la vena de la cola. En este caso, el receptor soluble IL-6 humano y el anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón se administraron a una dosis de 50 Mg/kg y de 1 mg/kg, respectivamente. Fv4-mlgG1 o Fv4-mlgG1-MB367 mencionados anteriormente se usaron como el anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón. La sangre se recolectó de los ratones 5 minutos, 7 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón. Las muestras de sangre recolectadas se centrifugaron inmediatamente a 4°C y 15,000 rpm durante 15 minutos para obtener el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador a -20°C o menos hasta la medición. (26-4-2) Determinación por ELISA de la concentración plasmática del anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón La concentración plasmática del anticuerpo anti-receptor IL- 6 humano en ratón se determinó por ELISA. Primero, el receptor soluble IL-6 humano se dividió en alícuotas en una placa Nunc-Inmuna, MaxiSoup (Nalge nunc International) y se dejó reposar durante la noche a 4°C para preparar una placa con el receptor soluble IL-6 humano inmovilizado. Las muestras de la curva de calibración que contienen un anticuerpo anti-receptor IL-6 humano en ratón se prepararon a las concentraciones plasmáticas de 2.50, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, y 0.039 pg/ml, y se prepararon las muestras del análisis del plasma de ratón diluidas 100 veces o más. 100 µ? de estas muestras de la curva de calibración y de las muestras del análisis de plasma se dividieron en alícuotas en cada pozo de la placa con receptor soluble IL-6 humano inmovilizado, y esto se agitó a temperatura ambiente durante dos horas. Posteriormente, la reacción del desarrollo de color de una solución de reacción se dejó reaccionar a la temperatura ambiente durante dos horas con el anticuerpo anti-IgG-peroxidasa de ratón (SIGMA) y se realizó usando el sustrato HRP Microwell de un componente TMB (BioFX Laboratories) como sustrato. Después de detener la reacción al agregar ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), la absorbencia de la solución de reacción en cada pozo a 450 nm se midió por medio de un lector de microplaca. La concentración del anticuerpo en el plasma de ratón se calculó con base en la absorbancia de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Fig.44. (26-4-3) Determinación de la concentración plasmática del receptor soluble IL-6 humano por medio de un método electroquimioluminiscente Una concentración de hslL-6R en plasma de ratón se determinó por medio de un método electroquimioluminiscente. Las muestras de la curva de calibración de hslL-6R se prepararon a las concentraciones plasmáticas de 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.781, 0.391, y 0.195 ng/ml. Las muestras del análisis de plasma de ratón se prepararon en una dilución de 50 veces o mayor. El anticuerpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) que se etiquetó con rutenio usando el éster NHS etiquetado con SULFO (Meso Scale Discovery), el anticuerpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D), y la solución de tocilizumab (Chugai Pharmaceutical Co. Ltd.) se mezclaron y se dejaron reaccionar durante la noche a 37°C. Entonces, una placa Streptavidin Gold Multi-ARRAY (Meso Scale Discovery) se bloqueó con una solución de PBS-Tween que contiene 0.5% de BSA (p/v) a 5°C durante la noche, y la solución mezclada se dividió en alícuotas en la placa. Después además de hacer reaccionar la placa durante dos horas a temperatura ambiente, la placa se lavó. Entonces, el amortiguador de lectura ? (?2) (Meso Scale Discovery) se dividió en alícuotas en la placa y las mediciones se realizaron inmediatamente al usar SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). las concentraciones de hSIL-6R se calcularon con base en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Fig. 45.

Tal como se muestra en la Fig. 44, en el grupo administrado con Fv4-mlgG1 -MB367 que tiene la actividad de unión a FcyRIIb de ratón selectivamente mejorada, mientras el cambio del transcurso del tiempo en la concentración plasmática del anticuerpo fue equivalente a aquellas en el grupo administrado con Fv4-mlgG1, no se observó la disminución de la retención en plasma del anticuerpo debido a la mejora de la actividad de unión a FcyRIIb de ratón. Mientras tanto, tal como se muestra en la Fig. 45, en el grupo administrado con Fv4-mlgG1 -MB367 que tiene la actividad de unión a FcyRIIb ratón selectivamente mejorada, la concentración plasmática del receptor soluble IL-6 se disminuyó notablemente con respecto a aquella del grupo administrado con Fv4-mlgG1.

Se mostró anteriormente que cuando se administra ¡n vivo, una molécula de unión al antígeno que une un antígeno soluble de una manera dependiente de pH y que tiene la actividad de unión a FcyRIIb selectivamente mejorada, también puede eliminar eficientemente los antígenos solubles en plasma en los ratones normales. Sin la restricción a una teoría particular, los fenómenos observados se pueden explicar como sigue.

Cuando un anticuerpo que une a un antígeno soluble de una manera dependiente de pH y que tiene la actividad de unión a FcyRIIb mejorada se administra a un ratón, el anticuerpo se capta de manera activa principalmente por las células que expresan FcYRIIb en su membrana celular. El anticuerpo internalizado se disocia del antígeno soluble bajo la condición de pH ácido en el endosoma, y después se recicla al plasma a través de FcRn. Por lo tanto, uno de los elementos que conlleva a un efecto de eliminar los antígenos solubles en el plasma debido a tal anticuerpo puede incluir la intensidad de la actividad de unión a FcyRIIb del anticuerpo. Es decir, una actividad de unión FcyRIIb más intensa lleva a una internalización más activa en las células de expresión de FcyRIIb, y los antígenos solubles en el plasma pueden eliminarse rápidamente. Además, tales efectos pueden verificarse de una manera similar sin importar si la región de Fe incluida en el anticuerpo se deriva de un lgG1 humano o de un lgG1 de ratón, mientras se mejore la actividad de unión a FcyRIIb. Más específicamente, la verificación puede realizarse usando la región de Fe de cualquier especie animal, como de lgG1 humano, de lgG2 humano, de lgG3 humano, de lgG4 humano, de lgG1 de ratón, de lgG2a de ratón, de lgG2b de ratón, de lgG3 de ratón, de IgG de rata, de IgG de mono, o de IgG de conejo mientras la actividad de unión se mejore para FcyRIIb de la especie animal a la cual se administra.

[Ejemplo referencia 1] Construcción de los vectores de expresión de anticuerpo; y expresión y purificación de los anticuerpos La síntesis de los genes integrales que codificaban las secuencias de nucleótido de la cadena H y de la cadena L de las regiones variables del anticuerpo se realiza por medio de los métodos de producción conocidos para los expertos en la técnica que usan la PCR del ensamble y similares. La introducción de las sustituciones de aminoácido se realizó por medio de los métodos conocidos para los expertos en la técnica que usan la PCR o similar. El fragmento de plásmido obtenido se insertó en un vector animal de expresión celular, y se produjo el vector de expresión de cadena H y el vector de expresión de cadena L. La secuencia de nucleótido del vector de expresión obtenido se determinó por medio de los métodos conocidos para los expertos en la técnica. Los plásmidos producidos se introdujeron de manera transitoria en la línea de células HEK293H derivada de las células renales cancerosas embrionarias humanas (Invitrogen) o en las células FreeStyle293 (Invitrogen) para la expresión del anticuerpo. El sobrenadante de cultivo obtenido se recolectó, y después pasó a través de un filtro MILLEX(R)-GV de 0.22 µ?t? (Millipore), o a través del filtro MILLEX(R)-GV de 0.45 µ?t? (Millipore) para obtener el sobrenadante de cultivo. Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante obtenido del cultivo por medio de los métodos conocidos para los expertos en la técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) o Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para la concentración de los anticuerpos purificados, su absorbancia a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro. A partir del valor obtenido, el coeficiente de extinción calculado por medio de los métodos como PACE se usó para calcular la concentración de anticuerpo (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).

[Ejemplo de referencia 2] Método para preparar FCYR y método para analizar la interacción entre un anticuerpo y un FcyR alterados Los dominios extracelulares de los FcyR se prepararon por medio del siguiente método. Primero, un gen del dominio extracelular de FcyR se sintetizó por medio de un método bien conocido para los expertos en la técnica. En ese momento, la secuencia de cada FcyR se produjo con base en la información registrada en NCBI. Específicamente, FcyRI se produjo con base en la secuencia del Número de Acceso de NCBI NM_000566 (versión No. NM_000566.3), FcyRIIa se produjo con base en la secuencia del Número de Acceso de NCBI NM_001136219 (versión No. NM_001136219.1 ), FcyRIIb se produjo con base en la secuencia del Número de Acceso de NCBI NM_004001 (versión No. NM_004001.3), FcyRI lia se produjo con base en la secuencia del Número de Acceso de NCBI NM_001 27593 (versión No. NM_001127593.1 ), y FcyRIIIb se produjo con base en la secuencia del Número de Acceso de NCBI NM 000570 (versión No. NM_000570.3), y una etiqueta His se unió al extremo C. Además, la existencia del polimorfismo se conoce para FcYRIIa, FcYRIIIa, y FCYRIIID, y los sitios polimórficos se produjeron al consultar Warmerdam et al. (J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25) para FcyRlla; Wu et al. (J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070) para FcyRIIIa; y Ory et al. (J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691) para FCYRIIID.

Los fragmentos de gen obtenidos se insertaron en un vector animal de expresión celular, y se produjeron los vectores de expresión. Los vectores de expresión producidos se introdujeron de manera transitoria en las células FreeStyle293 derivadas de la línea celular cancerosa renal embrionaria humana (Invitrogen) para expresar las proteínas de interés. Con respecto a FcYRIIb usado para el análisis cristalográfico, la proteína de interés se expresó en presencia de Kifunesina a una concentración final de 10 pg/ml, de modo que la cadena de azúcar agregada a FcYRIIb sea el tipo con alto contenido de mañosa. Las células se cultivaron, y después de la recolección del sobrenadante obtenido del cultivo, éste se pasó a través del filtro de 0.22 µ?? para obtener el sobrenadante de cultivo. En principio, los sobrenadantes de cultivo obtenidos se purificaron en las siguientes cuatro etapas. Las etapas realizadas fueron, cromatografía en columna de intercambio catiónico (SP Sepharose FF) en la etapa 1, la cromatografía en columna por afinidad (HisTrap HP) para la etiqueta His en la etapa 2, la cromatografía en columna de filtración en gel (Superdex200) en la etapa 3, y cromatografía aséptica en la etapa 4. Sin embargo, para FCYRI, la cromatografía en columna de intercambio aniónico usando Q Sepharose FF se realizó como en la etapa 1. Las proteínas purificadas se sometieron a las mediciones de absorbancia a 280 nm usando un espectrofotómetro; y de los valores obtenidos, las concentraciones de las proteínas purificadas se calcularon usando el coeficiente de absorción calculado usando los métodos como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).

El análisis de interacción entre cada anticuerpo alterado y el receptor Fcy preparado según lo mencionado anteriormente se realizó usando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100, y Biacore 4000. HBS-EP+ (GE Healthcare) se usó como el amortiguador de corrida, y la temperatura de medición se ajustó a 25°C. Los chips producidos al inmovilizar el péptido de antígeno, la proteína A (Thermo Scientific), la proteína A/G (Thermo Scientific), y la protefna L (ACTIGEN o BioVision) por medio del método de acoplamiento de amina a un chip CM5 de detención Serie S (GE Healthcare) o a un chip CM4 de detección Serie S (GE Healthcare), o alternativamente, se usaron los chips producidos al permitir que los péptidos de antígeno preliminarmente biotinilados interactúen con y se inmovilicen sobre un chip SA de detección Serie S (certificado) (GE Healthcare).

Después de capturar los anticuerpos de interés sobre estos chips de detección, un receptor Fcy diluido con el amortiguador de corrido se dejó interactuar, la cantidad unida a un anticuerpo se midió, y los anticuerpos se compararon. Sin embargo, puesto que la cantidad del receptor Fcy unido depende de la cantidad de los anticuerpos capturados, la cantidad del receptor Fcy unido se dividió por la cantidad de cada anticuerpo capturado para obtener los valores corregidos, y estos valores se compararon. Además, los anticuerpos capturados sobre los chips se lavaron por medio de la reacción con 10 mM de glicina-HCI, pH 1.5, y los chips se regeneraron y se usaron en varias ocasiones.

Los análisis cinéticos para calcular los valores de KD de cada anticuerpo alterado para FcyR se realizaron de acuerdo con el siguiente método. Primero, los anticuerpos de interés se capturaron sobre los chips de detección anteriormente mencionados, y un receptor Fcy diluido con el amortiguador de corrido se dejó interactuar. El software de evaluación Biacore se usó para ajustar globalmente los resultados medidos al sensorgrama obtenido usando el modelo de unión de Langmuir a 1:1, y se calculó la constante de índice de asociación ka (l/mol/s) y la constante de índice de disociación kd (l/s); y a partir de esos valores se calcularon las constantes de disociación KD (mol/l).

Cuando la interacción entre cada uno de los anticuerpos alterados y FcyR fue débil, y el análisis correcto se determinó como imposible por el análisis cinético anteriormente mencionado, las KD para tales interacciones se calcularon usando la siguiente ecuación del modelo de unión a 1:1 descrita en Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE.

El comportamiento de las moléculas de interacción de acuerdo con el modelo de unión a 1:1 en Biacore puede describirse por la Ecuación 3 mostrada a continuación.

[Ecuación 3] Req: un diagrama de los niveles de unión constante contra la concentración de analitos C: concentración Rl: contribución del índice de refracción a granel en la muestra Rmax: capacidad de unión enlace al analito de la superficie Cuando se reconfigura esta ecuación, KD puede expresarse como la ecuación 2 mostrada a continuación.

[Ecuación 2] KD= CRmax/(Req-RI)-C KD puede calcularse al sustituir los valores de Rmax, Rl, y C en esta ecuación. Los valores de Rl y C pueden determinarse a partir del sensorgrama de los resultados de medición y de las condiciones de medición. Rmax se calculó de acuerdo con el siguiente método. Como un objetivo de la comparación, para los anticuerpos que tienen interacciones suficientemente intensas según lo evaluado simultáneamente en el mismo ciclo de medición, el valor de Rmax se obtuvo a través del ajuste global usando el modelo de unión de Langmuir a 1:1, y entonces se dividió por la cantidad del anticuerpo de comparación capturado en el chip de detección, y se multiplicó por la cantidad capturada de un anticuerpo alterado que se evaluará.

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno de plasma, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de la concentración de iones, y una región de Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly según lo indicado por la numeración de EU.

2. El uso de la reivindicación 1, donde la región de Fe tiene una sustitución de aminoácido en por lo menos uno o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 según lo indicado por la numeración de EU.

3. El uso de la reivindicación 2, donde los aminoácidos de la región de Fe incluyen cualquiera de uno o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición de aminoácido 233; Tyr en la posición de aminoácido 234; Asp en la posición de aminoácido 237; He en la posición de aminoácido 264; Glu en la posición de aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición de aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición de aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición de aminoácido 268; Asp en la posición de aminoácido 269; Asp, Phe, lie, et, Asn, Pro, o Gln en la posición de aminoácido 272; Gln en la posición de aminoácido 274; Asp o Phe en la posición de aminoácido 296; Ala o Asp en la posición de aminoácido 326; Gly en la posición de aminoácido 327; Lys o Arg en la posición de aminoácido 330; Ser en la posición de aminoácido 331; Thr en la posición de aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición de aminoácido 333; Gln en la posición de aminoácido 355; Glu en la posición de aminoácido 356; Met en la posición de aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición de aminoácido 396; Arg en la posición de aminoácido 409; y Glu en la posición de aminoácido 419.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de iones de calcio.

5. El uso de la reivindicación 4, donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía de tal manera que la actividad de unión al antígeno en una condición de baja concentración de iones de calcio es menor que una actividad de unión al antígeno en una condición de alta concentración de iones de calcio.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de condiciones de pH.

7. El uso de la reivindicación 6, donde el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía de tal manera que la actividad de unión al antígeno en una condición de intervalo de pH ácido es más baja que una actividad de unión al antígeno en una condición de intervalo de pH neutro.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el dominio de unión al antígeno es una región variable del anticuerpo.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la región de Fe es una región de Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly según lo indicado por la numeración de EU en la región de Fe incluida en las SEC ID NO: 14, 15, 16, o 17.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la actividad de unión a FcRn de la región de Fe bajo la condición de intervalo de pH ácido se mejora en comparación con la actividad de unión a FcRn de la región de Fe incluida en las SEC ID NO: 14, 15, 16, o 17.

11. El uso de la reivindicación 10, donde la región de Fe con la unión mejorada es una región de Fe que tiene una o sustitución de aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, y 447, según lo indicado por la numeración de EU, en la secuencia de aminoácido de la región de Fe incluida en cualqueira de las SEC ID NO: 14, 15, 16, o 17.

12. El uso de la reivindicación 11, donde la región de Fe con la unión mejorada comprende por lo menos uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: Leu en la posición de aminoácido 244; Arg en la posición de aminoácido 245; Pro en la posición de aminoácido 249; GIn o Glu en la posición de aminoácido 250; cualquiera de Arg, Asp, Glu, y Leu en la posición de aminoácido 251 ; cualquiera de Phe, Ser, Thr, y Tyr en la posición de aminoácido 252; Ser o Thr en la posición de aminoácido 254; cualquiera de Arg, Gly, Me, y Leu en la posición de aminoácido 255; cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, GIn, Glu, Pro, y Thr en la posición de aminoácido 256; cualquiera de Ala, lie, Met, Asn, Ser, y Val en la posición de aminoácido 257; Asp en la posición de aminoácido 258; Ser en la posición de aminoácido 260; Leu en la posición de aminoácido 262; Lys en la posición de aminoácido 270; Leu o Arg en la posición de aminoácido 272; cualquiera de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, GIn, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr en la posición de aminoácido 279; cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Asn, Pro, GIn, Arg, Ser, Thr, Trp, y Tyr en la posición de aminoácido 283; Asn en la posición de aminoácido 285; Phe en la posición de aminoácido 286; Asn o Pro en la posición de aminoácido 288; Val en la posición de aminoácido 293; cualquiera de Ala, Glu, Gln, y Met en la posición de aminoácido 307; cualquiera de lie, Pro, y Thr en la posición de aminoácido 308; Pro en la posición de aminoácido 309; cualquiera de Ala, Glu, Me, Lys, Leu, Met, Ser, Val, y Trp en la posición de aminoácido 311; cualquiera de Ala, Asp, y Pro en la posición de aminoácido 312; Ala o Leu en la posición de aminoácido 314; Lys en la posición de aminoácido 316; Pro en la posición de aminoácido 317; Asn o Thr en la posición de aminoácido 318; cualquiera de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, y Trp en la posición de aminoácido 332; cualquiera de Asn, Thr, y Trp en la posición de aminoácido 339; Pro en la posición de aminoácido 341; cualquiera de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, o Tyr en la posición de aminoácido 343; Arg en la posición de aminoácido 375; cualquiera de Gly, Me, Met, Pro, Thr, y Val en la posición de aminoácido 376; Lys en la posición de aminoácido 377; cualquiera de Asp, Asn, y Val en la posición de aminoácido 378; cualquiera de Ala, Asn, Ser, y Thr en la posición de aminoácido 380; cualquiera de Phe, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr en la posición de aminoácido 382; cualquiera de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser, y Thr en la posición de aminoácido 385; cualquiera de Arg, Asp, Me, Lys, Met, Pro, Ser, y Thr en la posición de aminoácido 386; cualquiera de Ala, Arg, His, Pro, Ser, y Thr en la posición de aminoácido 387; cualquiera de Asn, Pro, y Ser en la posición de aminoácido 389; Asn en la posición de aminoácido 423; Asn en la posición de aminoácido 427; cualquiera de Leu, Met, Phe, Ser, y Thr en la posición de aminoácido 428; cualquiera de Ala, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, y Tyr en la posición de aminoácido 430; His o Asn en la posición de aminoácido 431; cualquiera de Arg, Gln, His, e, Lys, Pro, y Ser en la posición de aminoácido 433; cualquiera de Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp, y Tyr en la posición de aminoácido 434; cualquiera de Arg, Asn, His, lie, Leu, Lys, Met, y Thr en la posición de aminoácido 436; cualquiera de Lys, Leu, Thr, y Trp en la posición de aminoácido 438; Lys en la posición de aminoácido 440; y Lys en la posición de aminoácido 442 según lo indicado por la numeración de EU, en la secuencia de aminoácido de la región de Fe incluida en cualquiera de SEC ID NO: 14, 15, 16, o 17.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.

14. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de la concentración de iones, y una región de Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly según lo indicado por la numeración de EU.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, donde la región de Fe tiene una sustitución del aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 según lo indicado por la numeración de EU.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, donde los aminoácidos de la región de Fe incluyen cualquiera de uno o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición de aminoácido 233; Tyr en la posición de aminoácido 234; Asp en la posición de aminoácido 237; Me en la posición de aminoácido 264; Glu en la posición de aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición de aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición de aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición de aminoácido 268; Asp en la posición de aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, lie, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición de aminoácido 272; Gln en la posición de aminoácido 274; Asp o Phe en la posición de aminoácido 296; Ala o Asp en la posición de aminoácido 326; Lys o Arg en la posición de aminoácido 330; Gly en la posición de aminoácido 327; Ser en la posición de aminoácido 331; Thr en la posición de aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición de aminoácido 333; Gln en la posición de aminoácido 355; Glu en la posición de aminoácido 356; Met en la posición de aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, lie, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición de aminoácido 396; Arg en la posición de aminoácido 409; y Glu en la posición de aminoácido 419.

17. Un método para producir una molécula de unión al antígeno, que comprende las siguientes etapas (a) a (e): (a) obtener un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de la condición de concentración de iones; (b) obtener un gen que codifica el dominio de unión al antígeno seleccionado en la etapa (a); (c) ligar de manera operable el gen obtenido en la etapa (b) a un gen que codifica una región de Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly según lo indicado por la numeración de EU; (d) cultivar las células hospedadoras que contienen el gen ligado de manera operable en la etapa (c); y (e) aislar una molécula de unión al antígeno de la solución de cultivo obtenida en la etapa (d).

18. El método de producción de la reivindicación 17, donde la región de Fe tiene una sustitución de aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 según lo indicado por la numeración de EU.

19. El método de la reivindicación 18, donde los aminoácidos de la región de Fe incluyen cualquiera de uno o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición de aminoácido 233; Tyr en la posición de aminoácido 234; Asp en la posición de aminoácido 237; lie en la posición de aminoácido 264; Glu en la posición de aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición de aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición de aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición de aminoácido 268; Asp en la posición de aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, Me, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición de aminoácido 272; Gln en la posición de aminoácido 274; Asp o Phe en la posición de aminoácido 296; Ala o Asp en la posición de aminoácido 326; Gly en la posición de aminoácido 327; Lys o Arg en la posición de aminoácido 330; Ser en la posición de aminoácido 331; Thr en la posición de aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición de aminoácido 333; Gln en la posición de aminoácido 355; Glu en la posición de aminoácido 356; Met en la posición de aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, lie, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición de aminoácido 396; Arg en la posición de aminoácido 409; y Glu en la posición de aminoácido 419.

20. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión al antígeno, que comprende las siguientes etapas (a) a (e): (a) obtener un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno varía dependiendo de las condiciones de concentración de iones; (b) obtener un gen que codifica el dominio de unión al antígeno seleccionado en la etapa (a); (c) ligar de manera operable e gene obtenido en la etapa (b) a un gen que codifica una región de Fe en la cual el aminoácido en la posición 238 es Asp y el aminoácido en la posición 271 es Gly según lo indicado por la numeración de EU; (d) cultivar las células hospedadoras que contienen el gen ligado de manera operable en la etapa (c); y (e) aislar la molécula de unión al antígeno de la solución de cultivo obtenida en la etapa (d).

21. El método de producción de la reivindicación 20, donde la región de Fe tiene una sustitución de aminoácido en por lo menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409, y 419 según lo indicado por la numeración de EU.

22. El método de producción de la reivindicación 21, donde los aminoácidos de la región de Fe incluyen cualquiera de uno o más de los siguientes aminoácidos indicados por la numeración de EU: Asp en la posición de aminoácido 233; Tyr en la posición de aminoácido 234; Asp en la posición de aminoácido 237; Me en la posición de aminoácido 264; Glu en la posición de aminoácido 265; cualquiera de Phe, Met, y Leu en la posición de aminoácido 266; cualquiera de Ala, Glu, Gly, y Gln en la posición de aminoácido 267; cualquiera de Asp, Glu, y Gln en la posición de aminoácido 268; Asp en la posición de aminoácido 269; cualquiera de Asp, Phe, Me, Met, Asn, Pro, y Gln en la posición de aminoácido 272; Gln en la posición de aminoácido 274; Asp o Phe en la posición de aminoácido 296; Ala o Asp en la posición de aminoácido 326; Gly en la posición de aminoácido 327; Lys o Arg en la posición de aminoácido 330; Ser en la posición de aminoácido 331; Thr en la posición de aminoácido 332; cualquiera de Thr, Lys, y Arg en la posición de aminoácido 333; Gln en la posición de aminoácido 355; Glu en la posición de aminoácido 356; Met en la posición de aminoácido 358; cualquiera de Asp, Glu, Phe, Me, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, y Tyr en la posición de aminoácido 396; Arg en la posición de aminoácido 409; and Glu en la posición de aminoácido 419.