JP2020073557A - FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 - Google Patents
FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020073557A JP2020073557A JP2020000697A JP2020000697A JP2020073557A JP 2020073557 A JP2020073557 A JP 2020073557A JP 2020000697 A JP2020000697 A JP 2020000697A JP 2020000697 A JP2020000697 A JP 2020000697A JP 2020073557 A JP2020073557 A JP 2020073557A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- antigen
- binding
- asp
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
〔1〕抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、およびEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域を含む抗原結合分子の当該抗原を血漿中から消失させるための使用、
〔2〕前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔1〕に記載の使用、
〔3〕前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である〔2〕に記載の使用、
〔4〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性がカルシウムイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の使用、
〔5〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する低カルシウムイオン濃度の条件下での結合活性が、前記抗原に対する高カルシウムイオン濃度の条件下での結合活性よりも低いように結合活性が変化する抗原結合ドメインである、〔4〕に記載の使用、
〔6〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性がpHの条件によって変化する抗原結合ドメインである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の使用、
〔7〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対するpH酸性域の条件下での結合活性がpH中性域の条件下での結合活性よりも低いように結合活性が変化する抗原結合ドメインである、〔6〕に記載の使用、
〔8〕前記抗原結合ドメインが抗体の可変領域である、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の使用、
〔9〕前記Fc領域が配列番号:14、15、16または17のいずれかに含まれるFc領域においてEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域である〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の使用、
〔10〕前記Fc領域のpH酸性域の条件下でのFcRnに対する結合活性が、配列番号:14、15、16または17のいずれかに含まれるFc領域のFcRnに対する結合活性より増強されているFc領域である、〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の使用、
〔11〕前記の増強されているFc領域が、配列番号:14、15、16、または17のいずれかに含まれるFc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位または447位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔10〕に記載の使用、
〔12〕前記の増強されているFc領域が、配列番号:14、15、16、または17に含まれるFc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される;
244位のアミノ酸がLeu、
245位のアミノ酸がArg、
249位のアミノ酸がPro、
250位のアミノ酸がGlnまたはGluのいずれか、もしくは
251位のアミノ酸がArg、Asp、Glu、またはLeuのいずれか、
252位のアミノ酸がPhe、Ser、Thr、またはTyrのいずれか、
254位のアミノ酸がSerまたはThrのいずれか、
255位のアミノ酸がArg、Gly、Ile、またはLeuのいずれか、
256位のアミノ酸がAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、またはThrのいずれか、
257位のアミノ酸がAla、Ile、Met、Asn、Ser、またはValのいずれか、
258位のアミノ酸がAsp、
260位のアミノ酸がSer、
262位のアミノ酸がLeu、
270位のアミノ酸がLys、
272位のアミノ酸がLeu、またはArgのいずれか、
279位のアミノ酸がAla、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
283位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
285位のアミノ酸がAsn、
286位のアミノ酸がPhe、
288位のアミノ酸がAsn、またはProのいずれか、
293位のアミノ酸がVal、
307位のアミノ酸がAla、Glu、Gln、またはMetのいずれか、
308位のアミノ酸がIle、Pro、またはThrのいずれか、
309位のアミノ酸がPro、
311位のアミノ酸がAla、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser 、Val、またはTrpのいずれか、
312位のアミノ酸がAla、Asp、またはProのいずれか、
314位のアミノ酸がAlaまたはLeuのいずれか、
316位のアミノ酸がLys、
317位のアミノ酸がPro、
318位のアミノ酸がAsn、またはThrのいずれか、
332位のアミノ酸がPhe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、またはTrpのいずれか、
339位のアミノ酸がAsn、Thr、またはTrpのいずれか、
341位のアミノ酸がPro、
343位のアミノ酸がGlu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、またはTyrのいずれか、
375位のアミノ酸がArg、
376位のアミノ酸がGly、Ile、Met、Pro、Thr、またはValのいずれか、
377位のアミノ酸がLys、
378位のアミノ酸がAsp、Asn、またはValのいずれか、
380位のアミノ酸がAla、Asn、Ser、またはThrのいずれか、
382位のアミノ酸がPhe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
385位のアミノ酸がAla、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、またはThrのいずれか、
386位のアミノ酸がArg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
387位のアミノ酸がAla、Arg、His、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
389位のアミノ酸がAsn、Pro、またはSerのいずれか、
423位のアミノ酸がAsn、
427位のアミノ酸がAsn、
428位のアミノ酸がLeu、Met、Phe、Ser、またはThrのいずれか、
430位のアミノ酸がAla、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、またはTyrのいずれか、
431位のアミノ酸がHis、またはAsnのいずれか、
433位のアミノ酸がArg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、またはSerのいずれか、
434位のアミノ酸がAla、Gly、His、Phe、Ser、Trp、またはTyrのいずれか、
436位のアミノ酸がArg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、またはThrのいずれか、
438位のアミノ酸がLys、Leu、Thr、またはTrpのいずれか、
440位のアミノ酸がLys、もしくは、
442位のアミノ酸がLys、
の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸である、〔11〕に記載の使用、
〔13〕前記抗原結合分子が抗体である、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の使用、
〔14〕抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、およびEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域を含む抗原結合分子を含む医薬組成物、
〔15〕前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔14〕に記載の医薬組成物、
〔16〕前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である〔15〕に記載の医薬組成物、
〔17〕以下の(a)から(e)の工程;
(a) 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインを得る工程、
(b) 前記工程(a)で選択された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を得る工程、
(c) 前記工程(b)で得られた遺伝子を、EUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域をコードする遺伝子と作動可能に連結する工程、
(d) 前記工程(c)で作動可能に連結された遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程、
(e) 前記工程(d)で得られた培養液から抗原結合分子を単離する工程、
を含む抗原結合分子の製造方法、
〔18〕前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔17〕に記載の製造方法、
〔19〕前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がMet、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である〔18〕に記載の製造方法、
〔20〕以下の(a)から (e)の工程;
(a) 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインを得る工程、
(b) 前記工程(a)で選択された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を得る工程、
(c) 前記工程(b)で得られた遺伝子を、EUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域をコードする遺伝子と作動可能に連結する工程、
(d) 前記工程(c)で作動可能に連結された遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程、
(e) 前記工程(d)で得られた培養液から抗原結合分子を単離する工程、
を含む当該抗原結合分子を含む医薬組成物の製造方法、
〔21〕前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔20〕に記載の製造方法、
〔22〕前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である〔21〕に記載の製造方法、
〔23〕抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、およびEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域を含む抗原結合分子の有効量を投与する工程を含む、当該抗原を血漿中から消失させる方法、
〔24〕前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔23〕に記載の方法、
〔25〕前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である〔24〕に記載の方法、
〔26〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性がカルシウムイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインである、〔23〕から〔25〕のいずれかに記載の方法、
〔27〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する低カルシウムイオン濃度の条件下での結合活性が、前記抗原に対する高カルシウムイオン濃度の条件下での結合活性よりも低いように結合活性が変化する抗原結合ドメインである、〔26〕に記載の方法、
〔28〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性がpHの条件によって変化する抗原結合ドメインである、〔23〕から〔25〕のいずれかに記載の方法、
〔29〕前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対するpH酸性域の条件下での結合活性がpH中性域の条件下での結合活性よりも低いように結合活性が変化する抗原結合ドメインである、〔28〕に記載の方法、
〔30〕前記抗原結合ドメインが抗体の可変領域である、〔23〕から〔29〕のいずれかに記載の方法、
〔31〕前記Fc領域が配列番号:14、15、16または17のいずれかに含まれるFc領域においてEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域である〔23〕から〔30〕のいずれかに記載の方法、
〔32〕前記Fc領域のpH酸性域の条件下でのFcRnに対する結合活性が、配列番号:14、15、16または17のいずれかに含まれるFc領域のFcRnに対する結合活性より増強されているFc領域である、〔23〕から〔30〕のいずれかに記載の方法、
〔33〕前記の増強されているFc領域が、配列番号:14、15、16、または17のいずれかに含まれるFc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位または447位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である〔32〕に記載の方法、
〔34〕前記の増強されているFc領域が、配列番号:14、15、16、または17に含まれるFc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される;
244位のアミノ酸がLeu、
245位のアミノ酸がArg、
249位のアミノ酸がPro、
250位のアミノ酸がGlnまたはGluのいずれか、もしくは
251位のアミノ酸がArg、Asp、Glu、またはLeuのいずれか、
252位のアミノ酸がPhe、Ser、Thr、またはTyrのいずれか、
254位のアミノ酸がSerまたはThrのいずれか、
255位のアミノ酸がArg、Gly、Ile、またはLeuのいずれか、
256位のアミノ酸がAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、またはThrのいずれか、
257位のアミノ酸がAla、Ile、Met、Asn、Ser、またはValのいずれか、
258位のアミノ酸がAsp、
260位のアミノ酸がSer、
262位のアミノ酸がLeu、
270位のアミノ酸がLys、
272位のアミノ酸がLeu、またはArgのいずれか、
279位のアミノ酸がAla、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
283位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
285位のアミノ酸がAsn、
286位のアミノ酸がPhe、
288位のアミノ酸がAsn、またはProのいずれか、
293位のアミノ酸がVal、
307位のアミノ酸がAla、Glu、Gln、またはMetのいずれか、
308位のアミノ酸がIle、Pro、またはThrのいずれか、
309位のアミノ酸がPro、
311位のアミノ酸がAla、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser 、Val、またはTrpのいずれか、
312位のアミノ酸がAla、Asp、またはProのいずれか、
314位のアミノ酸がAlaまたはLeuのいずれか、
316位のアミノ酸がLys、
317位のアミノ酸がPro、
318位のアミノ酸がAsn、またはThrのいずれか、
332位のアミノ酸がPhe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、またはTrpのいずれか、
339位のアミノ酸がAsn、Thr、またはTrpのいずれか、
341位のアミノ酸がPro、
343位のアミノ酸がGlu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、またはTyrのいずれか、
375位のアミノ酸がArg、
376位のアミノ酸がGly、Ile、Met、Pro、Thr、またはValのいずれか、
377位のアミノ酸がLys、
378位のアミノ酸がAsp、Asn、またはValのいずれか、
380位のアミノ酸がAla、Asn、Ser、またはThrのいずれか、
382位のアミノ酸がPhe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
385位のアミノ酸がAla、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、またはThrのいずれか、
386位のアミノ酸がArg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
387位のアミノ酸がAla、Arg、His、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
389位のアミノ酸がAsn、Pro、またはSerのいずれか、
423位のアミノ酸がAsn、
427位のアミノ酸がAsn、
428位のアミノ酸がLeu、Met、Phe、Ser、またはThrのいずれか、
430位のアミノ酸がAla、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、またはTyrのいずれか、
431位のアミノ酸がHis、またはAsnのいずれか、
433位のアミノ酸がArg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、またはSerのいずれか、
434位のアミノ酸がAla、Gly、His、Phe、Ser、Trp、またはTyrのいずれか、
436位のアミノ酸がArg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、またはThrのいずれか、
438位のアミノ酸がLys、Leu、Thr、またはTrpのいずれか、
440位のアミノ酸がLys、もしくは、
442位のアミノ酸がLys、
の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸である、〔33〕に記載の方法、
〔35〕前記抗原結合分子が抗体である、〔23〕から〔34〕のいずれかに記載の方法。
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法(Kunkelら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。これらの公知の方法によってアミノ酸の付加、欠失、および/または置換が適宜加えられる。アミノ酸残基を置換するとは、別のアミノ酸残基に置換することで、例えば次の(a)〜(c)のような点について改変する事を目的とする。
(a) シート構造、若しくは、らせん構造の領域におけるポリペプチドの背骨構造;
(b) 標的部位における電荷若しくは疎水性、または
(c) 側鎖の大きさ。
(1) 疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2) 中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3) 酸性:Asp、Glu;
(4) 塩基性:His、Lys、Arg;
(5) 鎖の配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6) 芳香族性:Trp、Tyr、Phe。
本明細書において、「および/または」の用語の意義は、成句「および/または」の前後の用語の組合せであって、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「326位、328位、および/または428位のアミノ酸が置換されている」とは以下のアミノ酸の改変のバリエーションが含まれる;
(a) 326位、(b) 328位、(c) 428位、(d)326位および328位、(e) 326位および428位、(f) 328位および428位、(g) 326位および328位および428位。
本明細書において「抗原」は抗原結合ドメインが結合するエピトープを含む限りその構造は特定の構造に限定されない。別の意味では、抗原は無機物でもあり得るし有機物でもあり得る。抗原としては下記のような分子;17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1 アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ−V/ベータ-1アンタゴニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-リンパ球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 オステオゲニン(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原(CEA)、癌関連抗原、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67タンパク質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体制御因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(脳IGF-1)、Dhh、ジゴキシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(ミオスタチン)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン(NP-capまたはNIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、単純ヘルペスウイルス(HSV) gB糖タンパク質、HSV gD糖タンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、ヒト成長ホルモン(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、インターフェロン(INF)-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリンアルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンアルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5(アルファV)、インテグリンアルファ5/ベータ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス−Y抗原、ルイス−Y関連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受容体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン(Muc1)、MUC18、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因子(NGF)、NGFR、NGF−ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス(RSV)F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質−72)、TARC、TCA-3、T細胞受容体(例えば、T細胞受容体アルファ/ベータ)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Specific、TGF-ベータRI(ALK-5)、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2リガンド、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド)、TNFSF12(TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEMリガンド、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITRリガンド AITRリガンド、TL6)、TNFSF1A(TNF-a コネクチン(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40リガンド gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fasリガンド Apo-1リガンド、APT1リガンド)、TNFSF7(CD27リガンド CD70)、TNFSF8(CD30リガンド CD153)、TNFSF9(4-1BBリガンド CD137リガンド)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG、Hsp90, IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL, PCSK9, prekallikrein , RON, TMEM16F、SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B、tau, VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、factor B、factor D、factor H、properdin、sclerostin、fibrinogen、fibrin、prothrombin、thrombin、組織因子、factor V、factor Va、factor VII、factor VIIa、factor VIII、factor VIIIa、factor IX、factor IXa、factor X、factor Xa、factor XI、factor XIa、factor XII、factor XIIa、factor XIII、factor XIIIa、TFPI、antithrombin III、EPCR、トロンボモデュリン、TAPI、tPA、plasminogen、plasmin、PAI-1、PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1Pならびにホルモンおよび成長因子のための受容体が例示され得る。
抗原中に存在する抗原決定基を意味するエピトープは、本明細書において開示される抗原結合分子中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。よって、例えば、エピトープは、その構造によって定義され得る。また、当該エピトープを認識する抗原結合分子中の抗原に対する結合活性によっても当該エピトープが定義され得る。抗原がペプチド又はポリペプチドである場合には、エピトープを構成するアミノ酸残基によってエピトープを特定することも可能である。また、エピトープが糖鎖である場合には、特定の糖鎖構造によってエピトープを特定することも可能である。
下記にIL-6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子によるエピトープへの結合の確認方法が例示されるが、IL-6R以外の抗原に対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子によるエピトープへの結合の確認方法も下記の例示に準じて適宜実施され得る。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
本明細書において、「抗原結合ドメイン」は目的とする抗原に結合するかぎりどのような構造のドメインも使用され得る。そのようなドメインの例として、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュール(国際公開WO2004/044011、WO2005/040229)、細胞膜に発現する糖たんぱく質であるfibronectin中のタンパク質に結合するドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin(国際公開WO2002/032925)、ProteinAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束(bundle)を構成するIgG結合ドメインをscaffoldとするAffibody(国際公開WO1995/001937)、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリックスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復(ankyrin repeat:AR)の分子表面に露出する領域であるDARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(国際公開WO2002/020565)、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等(国際公開WO2003/029462)、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体(variable lymphocyte receptor(VLR))のロイシン残基に富んだリピート(leucine-rich-repeat(LRR))モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート構造のくぼんだ領域(国際公開WO2008/016854)が好適に挙げられる。本発明の抗原結合ドメインの好適な例として、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合ドメインが挙げられる。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv(single chain Fv)」、「単鎖抗体(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」または「F(ab')2」等が好適に挙げられる。
本発明によって提供される抗原結合分子の抗原に対する結合に関して「特異的」とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方の分子以外の分子に対しては実質的に結合しない状態をいう。ここで、実質的に結合しないとは、前記の結合活性の項で記載されるように、当該相手方の分子に対する結合活性の80%以下、通常50%以下、好ましくは30%以下、特に好ましくは15%以下の結合活性を当該相手方の分子以外の分子に対して示すことをいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
本発明の非限定な一態様では、(i) イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメイン、(ii) FcγRIIb選択的な結合活性を有するFcγ結合ドメイン、ならびに(iii) pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインを含み、当該抗原に対する中和活性を有する抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物が提供される。一般的に、中和活性とは、ウイルスや毒素など、細胞に対して生物学的活性を有するリガンドの当該生物学的活性を阻害する活性をいう。即ち、中和活性を有する物質とは、当該リガンド又は当該リガンドが結合するレセプターに結合し、当該リガンドとレセプターの結合を阻害する物質をさす。中和活性によりリガンドとの結合を阻止されたレセプターは、当該レセプターを通じた生物学的活性を発揮することができなくなる。抗原結合分子が抗体である場合、このような中和活性を有する抗体は一般に中和抗体と呼ばれる。ある被検物質の中和活性は、リガンドの存在下における生物学的活性をその被検物質の存在又は非存在下の条件の間で比較することにより測定され得る。
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス(アイソタイプ)が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリングで表される356-358位のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい。また、ヒトIgκ(Kappa)定常領域とヒトIgλ (Lambda)定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。
−IL-6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
−免疫抗原を精製する必要が無い
−グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
−AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL-6R発現細胞に接触させる工程、
(2)IL-6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(1)哺乳類細胞、:CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidney cell line)、ミエローマ(Sp2/O、NS0等)、BHK (baby hamster kidney cell line)、Hela、Vero、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA)、Freestyle293、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)など(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
−酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
−糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus )属
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。
イオン濃度の条件
金属イオン濃度の条件
本発明の一つの態様では、イオン濃度とは金属イオン濃度のことをいう。「金属イオン」とは、水素を除くアルカリ金属および銅族等の第I族、アルカリ土類金属および亜鉛族等の第II族、ホウ素を除く第III族、炭素とケイ素を除く第IV族、鉄族および白金族等の第VIII族、V、VIおよびVII族の各A亜族に属する元素と、アンチモン、ビスマス、ポロニウム等の金属元素のイオンをいう。金属原子は原子価電子を放出して陽イオンになる性質を有しており、これをイオン化傾向という。イオン化傾向の大きい金属は、化学的に活性に富むとされる。
ある一態様によれば、本発明の抗原結合ドメイン又は抗原結合分子は、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基が抗原結合ドメインに含まれている互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリから取得され得る。イオン濃度の例としては金属イオン濃度や水素イオン濃度が好適に挙げられる。
前記のスクリーニング方法によってスクリーニングされる本発明の抗原結合ドメインまたは抗原結合分子はどのように調製されてもよく、例えば、金属イオンがカルシウムイオン濃度である場合には、あらかじめ存在している抗原結合ドメインまたは抗原結合分子、あらかじめ存在しているライブラリ(ファージライブラリ等)、動物への免疫から得られたハイブリドーマや免疫動物からのB細胞から作製された抗体またはライブラリ、これらの抗体やライブラリにカルシウムをキレート可能なアミノ酸(例えばアスパラギン酸やグルタミン酸)や非天然アミノ酸変異を導入した抗体またはライブラリ(カルシウムをキレート可能なアミノ酸(例えばアスパラギン酸やグルタミン酸)または非天然アミノ酸の含有率を高くしたライブラリや特定箇所にカルシウムをキレート可能なアミノ酸(例えばアスパラギン酸やグルタミン酸)または非天然アミノ酸変異を導入したライブラリ等)などを用いることが可能である。
また、本発明の一つの態様では、イオン濃度の条件とは水素イオン濃度の条件またはpHの条件をいう。本発明で、プロトンすなわち水素原子の原子核の濃度の条件は、水素指数(pH)の条件とも同義に取り扱われる。水溶液中の水素イオンの活動量をaH+で表すと、pHは-log10aH+と定義される。水溶液中のイオン強度が(例えば10-3より)低ければ、aH+は水素イオン強度にほぼ等しい。例えば25℃、1気圧における水のイオン積はKw=aH+aOH=10-14であるため、純水ではaH+=aOH=10-7である。この場合のpH=7が中性であり、pHが7より小さい水溶液は酸性、pHが7より大きい水溶液はアルカリ性である。
本発明の抗原結合分子において、高水素イオン濃度または低pHすなわちpH酸性域の条件における抗原に対する結合活性が低水素イオン濃度または高pHすなわちpH中性域の条件における抗原に対する結合活性よりも弱い限り、高水素イオン濃度または低pHすなわちpH酸性域の条件下における抗原に対する結合活性と低水素イオン濃度または高pHすなわちpH中性域の条件下における抗原に対する結合活性の比は特に限定されないが、好ましくは抗原に対する高水素イオン濃度または低pHすなわちpH酸性域の条件におけるKD(Dissociation constant:解離定数)と低水素イオン濃度または高pHすなわちpH中性域の条件におけるKDの比であるKD (pH5.8)/KD (pH7.4)の値が2以上であり、さらに好ましくはKD (pH5.8)/KD (pH7.4)の値が10以上であり、さらに好ましくはKD (pH5.8)/KD (pH7.4)の値が40以上である。KD (pH5.8)/KD (pH7.4)の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。
(a) pH酸性域の条件における抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(b) pH中性域の条件における抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(c) pH酸性域の条件における抗原結合活性が、pH中性域の条件における抗原結合活性より低い抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を選択する工程。
(a) pH中性域の条件における抗原結合ドメインまたは抗原結合分子もしくはそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をpH酸性域の条件に置く工程、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する工程。
(a) pH酸性域の条件で抗原結合ドメイン又は抗原結合分子のライブラリを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合しない抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を選択する工程、
(c) 前記工程(b)で選択された抗原結合ドメイン又は抗原結合分子をpH中性域の条件で抗原に結合させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を単離する工程。
(a) 抗原を固定したカラムにpH中性域の条件で抗原結合ドメイン又は抗原結合分子のライブラリを接触させる工程、
(b) 前記工程(a)でカラムに結合した抗原結合ドメイン又は抗原結合分子をpH酸性域の条件でカラムから溶出する工程、
(c) 前記工程(b)で溶出された抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を単離する工程。
(a) 抗原を固定したカラムにpH酸性域の条件で抗原結合ドメイン又は抗原結合分子のライブラリを通過させる工程、
(b) 前記工程(a)でカラムに結合せずに溶出した抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を回収する工程、
(c) 前記工程(b)で回収された抗原結合ドメイン又は抗原結合分子をpH中性域の条件で抗原に結合させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を単離する工程。
(a) pH中性域の条件で抗原結合ドメイン又は抗原結合分子のライブラリを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を取得する工程、
(c) 前記工程(b)で取得した抗原結合ドメイン又は抗原結合分子をpH酸性域の条件に置く工程、
(d) 前記工程(c)で抗原結合活性が、前記工程(b)で選択した基準より弱い抗原結合ドメイン又は抗原結合分子を単離する工程。
前記のスクリーニング方法によってスクリーニングされる本発明の抗原結合ドメイン又は抗原結合分子はどのように調製されてもよく、例えば、あらかじめ存在している抗原結合分子、あらかじめ存在しているライブラリ(ファージライブラリ等)、動物への免疫から得られたハイブリドーマや免疫動物からのB細胞から作製された抗体又はライブラリ、これらの抗体やライブラリに側鎖のpKaが4.0-8.0であるアミノ酸(例えばヒスチジンやグルタミン酸)や非天然アミノ酸変異を導入した抗体又はライブラリ(側鎖のpKaが4.0-8.0であるアミノ酸(例えばヒスチジンやグルタミン酸)又は非天然アミノ酸の含有率を高くしたライブラリや特定箇所に側鎖のpKaが4.0-8.0であるアミノ酸(例えばヒスチジンやグルタミン酸)又は非天然アミノ酸変異を導入したライブラリ等)などを用いることが可能である。
免疫グロブリンスーパーファミリーに属するFcγレセプターと異なり、ヒトFcRnは構造的には主要組織不適合性複合体(MHC)クラスIのポリペプチドに構造的に類似しクラスIのMHC分子と22から29%の配列同一性を有する(Ghetieら,Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598)。FcRnは、可溶性βまたは軽鎖(β2マイクログロブリン)と複合体化された膜貫通αまたは重鎖よりなるヘテロダイマーとして発現される。MHCのように、FcRnのα鎖は3つの細胞外ドメイン(α1、α2、α3)よりなり、短い細胞質ドメインはタンパク質を細胞表面に繋留する。α1およびα2ドメインが抗体のFc領域中のFcRn結合ドメインと相互作用する(Raghavanら(Immunity (1994) 1, 303-315)。
本発明により提供される抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインのFcRn、特にヒトFcRnに対する結合活性は、前記結合活性の項で述べられているように、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、pH以外の条件については当業者が適宜決定することが可能である。抗原結合ドメインまたは当該ドメイン含む抗原結合分子とヒトFcRnとの結合活性は、KD(Dissociation constant:解離定数)、見かけのKD(Apparent dissociation constant:見かけの解離定数)、解離速度であるkd(Dissociation rate:解離速度)、又は見かけのkd(Apparent dissociation:見かけの解離速度)等として評価され得る。これらは当業者公知の方法で測定され得る。例えばBiacore(GE healthcare)、スキャッチャードプロット、フローサイトメーター等が使用され得る。
本発明の抗原結合分子は、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインを含む。FcRn結合ドメインは、抗原結合分子がpH酸性域においてFcRnに対する結合活性を有していれば特に限定されず、また、直接または間接的にFcRnに対して結合活性を有するドメインであってもよい。そのようなドメインとしては、例えば、直接的にFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインとして、例えばIgG型免疫グロブリンのFc領域、アルブミン、アルブミンドメイン3、Christiansonら(mAbs (2012) 4 (2), 208-216)等で記載される抗FcRn抗体、WO2007/098420等で記載される抗FcRnペプチド、抗FcRn足場(Scaffold)分子等、あるいは間接的にFcRnに対する結合活性を有するIgGやアルブミンに結合する分子等が好適に挙げられる。当該ドメインは、あらかじめpH酸性域においてFcRnに対する結合活性を有しているドメインであればそのまま好適に使用され得る。当該ドメインがpH酸性域においてFcRnに対する結合活性がないまたは弱い場合には、抗原結合分子中のFcRn結合ドメインを形成するアミノ酸を改変してFcRnに対する結合活性を付与することが可能である。また、あらかじめpH酸性域においてFcRnに対する結合活性を有しているドメイン中のアミノ酸を改変して、pH酸性域におけるFcRnに対する結合活性を高めてもよい。FcRn結合ドメインのアミノ酸の改変は、アミノ酸改変前と改変後のpH酸性域におけるFcRnに対する結合活性を比較することによって目的の改変を見出すことが可能である。
Fc領域は、抗体重鎖の定常領域に由来するアミノ酸配列を含む。Fc領域は、EUナンバリングで表されるおよそ216位のアミノ酸における、パパイン切断部位のヒンジ領域のN末端から、当該ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含める抗体の重鎖定常領域の部分である。Fc領域は、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のサブクラスに限定されるものでもない。そのようなFc領域の非限定な一態様として、ヒトIgG1(配列番号:14)、IgG2(配列番号:15)、IgG3(配列番号:16)、またはIgG4(配列番号:17)で表されるFc領域が例示される。
前記のように、本発明の非限定な一態様においては、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインとしてヒトIgG型免疫グロブリンのFc領域が使用される。当該ドメインとして、あらかじめpH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有しているFc領域であればそのまま用いられ得るが、そのようなFc領域として、例えばヒトIgG(IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4、およびそれらの改変体)のFc領域が挙げられる。また、Fc領域のpH酸性域の条件下におけるFcRnに対する結合活性がない若しくは弱い場合には、当該Fc領域中のアミノ酸を改変することによって所望のFcRnに対する結合活性を有するFc領域が取得され得る。また、Fc領域中のアミノ酸を改変することによってpH酸性域の条件下でFcRnに対する所望の結合活性を有する、または増強されたFc領域も好適に取得され得る。そのような所望の結合活性をもたらすFc領域のアミノ酸改変は、アミノ酸改変前と改変後のpH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を比較することによって見出され得る。例えば、前記「FcRn、特にヒトFcRnに対するFcRn結合ドメインまたは当該ドメインを含む抗原結合分子の結合活性」の項で記載された方法によって、そのようなアミノ酸改変が見出され得る。
251位のアミノ酸がArgまたはLeuのいずれか、
252位のアミノ酸がPhe、Ser、Thr、またはTyrのいずれか、
254位のアミノ酸がSerまたはThrのいずれか、
255位のアミノ酸がArg、Gly、Ile、またはLeuのいずれか、
256位のアミノ酸がAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrのいずれか、
308位のアミノ酸がIleまたはThrのいずれか、
309位のアミノ酸がPro、
311位のアミノ酸がGlu、Leu、またはSerのいずれか、
312位のアミノ酸がAlaまたはAspのいずれか、
314位のアミノ酸がAlaまたはLeuのいずれか、
385位のアミノ酸がAla、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、またはThrのいずれか、
386位のアミノ酸がArg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
387位のアミノ酸がAla、Arg、His、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
389位のアミノ酸がAsn、Pro、またはSerのいずれか、
428位のアミノ酸がLeu、Met、Phe、Ser、またはThrのいずれか
433位のアミノ酸がArg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、またはSerのいずれか、
434位のアミノ酸がHis、Phe、またはTyrのいずれか、もしくは
436位のアミノ酸がArg、Asn、His、Lys、Met、またはThrのいずれか、
の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸の改変が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、二箇所以上のアミノ酸が改変され得る。
250位のアミノ酸がGlnまたはGluのいずれか、もしくは
428位のアミノ酸がLeuまたはPheのいずれか、
の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸の改変が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、二箇所のアミノ酸が改変され得る。
251位のアミノ酸がAspまたはGluのいずれか、
252位のアミノ酸がTyr、
307位のアミノ酸がGln、
308位のアミノ酸がPro、
378位のアミノ酸がVal、
380位のアミノ酸がAla、
428位のアミノ酸がLeu、
430位のアミノ酸がAla、またはLysのいずれか、
434位のアミノ酸がAla、His、Ser、またはTyrのいずれか、もしくは
436位のアミノ酸がIle、
の群から選択される少なくとも二つ以上のアミノ酸の改変が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、二箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、三箇所以上のアミノ酸が改変され得る。
238位のアミノ酸がLeu、
244位のアミノ酸がLeu、
245位のアミノ酸がArg、
249位のアミノ酸がPro、
252位のアミノ酸がTyr、
256位のアミノ酸がPro、
257位のアミノ酸がAla、Ile、Met、Asn、Ser、またはValのいずれか、
258位のアミノ酸がAsp、
260位のアミノ酸がSer、
262位のアミノ酸がLeu、
270位のアミノ酸がLys、
272位のアミノ酸がLeu、またはArgのいずれか、
279位のアミノ酸がAla、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
283位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
285位のアミノ酸がAsn、
286位のアミノ酸がPhe、
288位のアミノ酸がAsn、またはProのいずれか、
293位のアミノ酸がVal、
307位のアミノ酸がAla、Glu、またはMetのいずれか、
311位のアミノ酸がAla、Ile、Lys、Leu、Met、Val、またはTrpのいずれか、
312位のアミノ酸がPro、
316位のアミノ酸がLys、
317位のアミノ酸がPro、
318位のアミノ酸がAsn、またはThrのいずれか、
332位のアミノ酸がPhe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、またはTrpのいずれか、
339位のアミノ酸がAsn、Thr、またはTrpのいずれか、
341位のアミノ酸がPro、
343位のアミノ酸がGlu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、またはTyrのいずれか、
375位のアミノ酸がArg、
376位のアミノ酸がGly、Ile、Met、Pro、Thr、またはValのいずれか、
377位のアミノ酸がLys、
378位のアミノ酸がAsp、またはAsnのいずれか、
380位のアミノ酸がAsn、Ser、またはThrのいずれか、
382位のアミノ酸がPhe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
423位のアミノ酸がAsn、
427位のアミノ酸がAsn、
430位のアミノ酸がAla、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、またはTyrのいずれか、
431位のアミノ酸がHis、またはAsnのいずれか、
434位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Trp、またはTyrのいずれか、
436位のアミノ酸がIle、Leu、またはThrのいずれか、
438位のアミノ酸がLys、Leu、Thr、またはTrpのいずれか、
440位のアミノ酸がLys、もしくは、
442位のアミノ酸がLys、
の群から選択される少なくとも二つ以上のアミノ酸の改変が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、二箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、三箇所以上のアミノ酸が改変され得る。
Fcγレセプター(FcγR)とは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得るレセプターをいい、実質的にFcγレセプター遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI(CD64);アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131およびR131を含む)、FcγRIIb(FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む)およびFcγRIIcを含むFcγRII(CD32);およびアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158およびF158を含む)およびFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む)を含むFcγRIII(CD16)、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むが、これらに限定されるものではない、いかなる生物由来でもよい。マウスFcγR類には、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)およびFcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。こうしたFcγレセプターの好適な例としてはヒトFcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及び/又はFcγRIIIb(CD16)が挙げられる。FcγRIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:18(NM_000566.3)及び19(NP_000557.1)に、FcγRIIaのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:20(BC020823.1)及び21(AAH20823.1)に、FcγRIIbのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:22(BC146678.1)及び23(AAI46679.1)に、FcγRIIIaのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:24(BC033678.1)及び25(AAH33678.1)に、及びFcγRIIIbのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:26(BC128562.1)及び27(AAI28563.1)に記載されている(カッコ内はRefSeq登録番号を示す)。Fcγ受容体が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合活性を有するか否かは、上記に記載されるFACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法等によって確認され得る(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
本発明の抗原結合分子に含まれるFcγR結合ドメインのFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及び/又はFcγRIIIbのいずれかのヒトFcγレセプターに対する結合活性は、上記に記載されるFACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法等によって確認することができる(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
本発明の抗原結合分子は、抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインに、およびFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFcγレセプター結合ドメイン(以下に、選択的FcγR結合ドメインとも指称される)を含む。FcγR結合ドメインとしては、例えば、IgG型免疫グロブリンのFc領域、IgG型免疫グロブリンのFcγR結合ドメイン、抗FcγR抗体、抗FcγR足場(Scaffold)分子等が好適に挙げられる。当該ドメインは、あらかじめFcγRに対する結合活性を有しているドメインであればそのまま好適に使用され得る。当該ドメインがFcγRに対する結合活性がないまたは弱い場合には、抗原結合分子中のFcγR結合ドメインを形成するアミノ酸を改変してFcγRに対する結合活性を付与することが可能である。また、あらかじめFcγRに対する結合活性を有しているドメイン中のアミノ酸を改変して、FcγRに対する結合活性を高めてもよい。FcγR結合ドメインのアミノ酸の改変は、アミノ酸改変前と改変後のFcγRに対する結合活性を比較することによって目的の改変を見出すことが可能である。そのようなFcγR結合ドメインの非限定な一態様として、ヒトIgG1(配列番号:14)、IgG2(配列番号:15)、IgG3(配列番号:16)、またはIgG4(配列番号:17)で表されるFc領域に含まれるFcγR結合ドメインが例示される。例えば、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインとしてIgG型抗体のFc領域が使用される場合には、FcγR結合ドメインとして当該Fc領域に含まれるFcγR結合ドメインが使用され得る。
本発明のFcγR結合ドメインが選択的な結合活性を有するか否かは、前記のFcγレセプターに対する結合活性の項で記載された方法によって決定された各Fcγレセプターに対する結合活性を比較することによって確認される。本発明によって提供される抗原結合分子に含まれる選択的FcγR結合ドメインとして、活性型Fcγレセプターよりも抑制型Fcγレセプターに対する結合活性が高いFcγR結合ドメインが使用され得る。非限定な一態様では、本発明によって提供される抗原結合分子に含まれる選択的FcγR結合ドメインとして、FcγRIa、FcγRIbならびにFcγRIcを含むFcγRI(CD64)、(アロタイプV158およびF158を含む)アイソフォームFcγRIIIaならびに(アロタイプFcγRIIIb-NA1ならびにFcγRIIIb-NA2を含む)FcγRIIIbを含むFcγRIII(CD16)、および(アロタイプH131およびR131を含む)アイソフォームFcγRIIaおよびFcγRIIcを含むFcγRII(CD32)のいずれかから選択される活性型Fcγレセプターよりも(FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む)FcγRIIbに対する結合活性が高いFcγR結合ドメインが使用され得る。さらに本発明の非限定な一態様では、本発明によって提供される抗原結合分子に含まれる選択的FcγR結合ドメインとして、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、アロタイプV158を含むFcγRIIIa、アロタイプF158を含むFcγRIIIa、アロタイプFcγRIIIb-NA1を含むFcγRIIIb、アロタイプFcγRIIIb-NA2を含むFcγRIIIb、アロタイプH131を含むFcγRIIa、アロタイプR131を含むFcγRIIa、および/またはFcγRIIcよりも、FcγRIIb-1および/またはFcγRIIb-2に対する結合活性が高いFcγR結合ドメインが使用され得る。被験対象のFcγR結合ドメインが、Fcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFcγR結合ドメインかどうかは、たとえば、前記のFcγレセプターに対する結合活性の項で記載された方法によって決定されたFcγR結合ドメインの、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、アロタイプV158を含むFcγRIIIa、アロタイプF158を含むFcγRIIIa、アロタイプFcγRIIIb-NA1を含むFcγRIIIb、アロタイプFcγRIIIb-NA2を含むFcγRIIIb、アロタイプH131を含むFcγRIIa、アロタイプR131を含むFcγRIIa、および/またはFcγRIIcに対するKD値を、FcγRIIb-1および/またはFcγRIIb-2に対するKD値で除した値(比)、すなわち式1で表されるFcγR選択性指数を比較することによって判断することが可能である。
FcγR選択性指数=活性型FcγRに対するKD値/抑制型FcγRに対するKD値
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸が、Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上である改変Fc領域が例示される。
本発明において、抗原結合分子は、抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメイン、およびFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFcγレセプター結合ドメイン(選択的FcγR結合ドメイン)を含む分子を表す最も広義な意味として使用されており、具体的には、それらが抗原に対する結合活性を示す限り、様々な分子型が含まれる。抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメイン、およびFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFcγレセプター結合ドメイン(選択的FcγR結合ドメイン)が結合した分子の例として、例えば抗体が挙げられる。抗体には、単一のモノクローナル抗体(アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等が含まれ得る。また抗体の断片として使用される場合としては、抗原結合ドメインおよび抗原結合断片(例えば、Fab、F(ab')2、scFvおよびFv)が好適に挙げられ得る。既存の安定なα/βバレルタンパク質構造等の立体構造が scaffold(土台)として用いられ、その一部分の構造のみが抗原結合ドメインの構築のためにライブラリ化されたスキャフォールド分子も、本発明の抗原結合分子に含まれ得る 。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:28)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:29)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:30)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:31)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:32)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:33)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:34)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:35)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:30))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:31))n
[nは1以上の整数である]等が好適に挙げられる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
また、上記記載で例示されるリンカーのほか、例えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る。また、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの結合の組合せにより互いに結合する性質もまた好適に利用され得る。例えば、抗体のCH1とCL間の親和性が利用されたり、ヘテロFc領域の会合に際して前述の二重特異性抗体を起源とするFc領域が用いられたりする。さらに、ドメイン間に形成されるジスルフィド結合もまた好適に利用され得る。
(2)F(ab')2を形成する可変領域のうち、一方の可変領域が抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する可変領域であり、もう一方の可変領域がFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有する可変領域であるF(ab')2とpH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFc領域を含む抗体
(3)F(ab')2を形成する可変領域のうち、一方の可変領域が抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する可変領域であり、もう一方の可変領域がpH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有する可変領域であるF(ab')2とFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFc領域を含む抗体
前記の(2)、(3)の構造を含む抗体の調製方法の一態様として、二重特異性抗体の作製方法が適用され得る。二重特異性抗体とは、異なるエピトープに対して特異的に結合する二種類の可変領域を含む抗体である。IgG型の二重特異性抗体はIgG抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma(quadroma)によって分泌させることが可能である(Milsteinら(Nature (1983) 305, 537-540)。
(i) Fc領域を形成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される409のアミノ酸がAsp、370のアミノ酸がGluであり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される399のアミノ酸がLys、357のアミノ酸がLysであることを特徴とする二つのポリペプチド(本態様では、EUナンバリングで表される370のアミノ酸のGluに代えてAspであってもよく、EUナンバリングで表される370のアミノ酸のGluに代えて392のアミノ酸のAspであってもよい)、
(ii) Fc領域を形成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される409のアミノ酸がAsp、439のアミノ酸がGluであり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される399のアミノ酸がLys、356のアミノ酸がLysであることを特徴とする二つのポリペプチド(本態様では、EUナンバリングで表される439のアミノ酸のGluに代えて360のアミノ酸のAsp、EUナンバリングで表される392のアミノ酸のAsp又は439のアミノ酸のAspであってもよい)、
(iii) Fc領域を形成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される370のアミノ酸がGlu、439のアミノ酸がGluであり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される357のアミノ酸がLys、356のアミノ酸がLysであることを特徴とする二つのポリペプチド、または、
Fc領域を形成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される409のアミノ酸がAsp、370のアミノ酸がGlu、439のアミノ酸がGluであり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングで表される399のアミノ酸がLys、357のアミノ酸がLys、356のアミノ酸がLysであることを特徴とする二つのポリペプチド(本態様では、EUナンバリングで表される370のアミノ酸をGluに置換しなくてもよく、更に、370のアミノ酸をGluに置換しない上で、439のアミノ酸のGluに代えてAsp又は439のアミノ酸のGluに代えて392のアミノ酸のAspであってもよい)、
が好適に用いられる。
本発明において、「血漿中抗原消失能」とは、抗原結合分子が生体内に投与された、あるいは、抗原結合分子の生体内への分泌が生じた際に、血漿中に存在する抗原を血漿中から消失させる能力のことをいう。従って、本発明において、「抗原結合分子の血漿中抗原消失能が増加する」とは、抗原結合分子を投与した際に、抗原に対する結合活性がイオン濃度によって変化しない抗原結合ドメインを含む抗原結合分子、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有しないFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子、またはFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有しないFcγレセプター結合ドメインを含む抗原結合分子を投与したときと比較して、血漿中から抗原が消失する速さが速くなっていればよい。抗原結合分子の血漿中抗原消失能が増加したか否かは、例えば、可溶型抗原と抗原結合分子とを生体内に投与し、投与後の可溶型抗原の血漿中濃度を測定することにより判断することが可能である。抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメイン、およびFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFcγレセプター結合ドメイン(選択的FcγR結合ドメイン)を含む抗原結合分子と可溶型抗原を投与した後の血漿中の可溶型抗原の濃度が低下している場合には、抗原結合分子の血漿中抗原消失能が増加したと判断することができる。可溶型抗原は、血漿中において抗原結合分子に結合する抗原であっても、または抗原結合分子が結合しない抗原であってもよく、その濃度はそれぞれ「血漿中抗原結合分子結合抗原濃度」および「血漿中抗原結合分子非結合抗原濃度」として決定することができる(後者は「血漿中遊離抗原濃度」と同義である)。「血漿中総抗原濃度」とは、抗原結合分子結合抗原と抗原結合分子非結合抗原とを合計した濃度、または抗原結合分子非結合抗原濃度である「血漿中遊離抗原濃度」を意味することから、可溶型抗原濃度は「血漿中総抗原濃度」として決定することができる。「血漿中総抗原濃度」または「血漿中遊離抗原濃度」を測定する様々な方法が、本明細書において以下に記載するように当技術分野において周知である。
A値=各時点での抗原のモル濃度
B値=各時点での抗原結合分子のモル濃度
C値=各時点での抗原結合分子のモル濃度あたりの抗原のモル濃度(抗原/抗原結合分子モル比)
C=A/B。
本発明によって提供される、血漿中から当該抗原を消失させるための方法における抗原結合分子の使用の非限定な一態様として、対象から単離された血漿を本発明の抗原結合分子と接触せしめ形成させた免疫複合体を、FcRnおよびFcγレセプターを発現する細胞に接触させることを含む、血漿中から当該抗原を消失させるための、いわゆるex vivoの方法における当該抗原結合分子の使用も例示される。抗原結合分子を生体内に投与する方法に代えて/と組み合わせて、抗原結合分子および抗原結合分子に結合する抗原を含む血漿を生体外にいったん取り出した後に、FcRnおよびFcγレセプターを発現する細胞と接触させ一定期間を経過して細胞外にリサイクル(再分泌または再循環ともいう)された、抗原を結合しない抗原結合分子を含む血漿を生体内に戻すいわゆるex vivoの方法によっても、血漿中の抗原の消失速度を促進させることができる。
本発明は、また以下の工程(a)〜(e)を含む、血漿中に存在する抗原を消失する機能を有する抗原結合分子の製造方法;
(a) 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインを得る工程、
(b) 前記工程(a)で選択された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を得る工程、
(c) 前記工程(b)で得られた遺伝子を、pH酸性域の条件下でFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメイン、およびFcγレセプターに対する選択的な結合活性を有するFcγレセプター結合ドメインをコードする遺伝子と作動可能に連結する工程、
(d) 前記工程(c)で作動可能に連結された遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程、
(e) 前記工程(d)で得られた培養液から抗原結合分子を単離する工程、
を提供する。
本発明は、本発明の抗原結合分子、本発明の改変方法により作製された抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を含む医薬組成物に関する。本発明の抗原結合分子または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子はその投与により通常の抗原結合分子と比較して血漿中の抗原濃度を低下させる作用が高い上に、投与された生体による免疫応答や当該生体中の薬物動態等が改変されていることから医薬組成物として有用である。本発明の医薬組成物には医薬的に許容される担体が含まれ得る。
(1−1)pH依存的ヒトIL-6レセプター結合抗体について
WO2009/125825に記載されているH54-IgG1(配列番号:36)とL28-CK(配列番号:37)からなるH54/L28-IgG1はヒト化抗IL-6レセプター抗体であり、VH3-IgG1(配列番号:38)とVL3-CK(配列番号:39)からなるFv4-IgG1は、H54/L28-IgG1に対して可溶型ヒトIL-6レセプターへpH依存的に結合する特性(pH7.4において結合し、pH5.8において解離する)を付与したヒト化抗IL-6レセプター抗体である。WO2009/125825に記載されているマウスのin vivo試験において、H54/L28-IgG1と抗原である可溶型ヒトIL-6レセプターの混合物を投与した群と比較して、Fv4-IgG1と抗原である可溶型ヒトIL-6レセプターの混合物を投与した群において、可溶型ヒトIL-6レセプターが血漿中からの消失が大幅に加速されることが示された。
マウスFcγRへの結合が増強された抗原結合分子として、VH3-IgG1のEUナンバリングで表される326位のLysがAspに置換され、EUナンバリングで表される328位のLeuがTyrに置換されたVH3-IgG1-F1022(配列番号:40)が作製された。参考実施例1の方法を用いて、VH3-IgG1-F1022を重鎖として含み、VL3-CKを軽鎖として含む、Fv4-IgG1-F1022が作製された。
VH3-IgG1、VH3-IgG1-F1022およびVH3-IgG1-F760を重鎖として含み、L (WT)-CK(配列番号:42)を軽鎖として含むVH3/L (WT)-IgG1、VH3/L (WT)-IgG1-F1022およびVH3/L (WT)-IgG1-F760が参考実施例1の方法で作製された。以下のように、これらの抗体のマウスFcγRに対する結合が速度論的に解析された。
Biacore T100 又はT200(GE Healthcare)を用いて、マウスFcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV(R&D sytems、Sino Biologicalまたは参考実施例2に記載の方法により調製)(以下、マウスFcγRs)と抗体との結合が速度論的に解析された。アミンカップリング法によってSensor chip CM4(GE Healthcare)上にを適切な量が固定化されたprotein L(ACTIGENまたはBioVision)に、目的の抗体をキャプチャーさせた。次に、マウスFcγRsの希釈液とブランクであるランニングバッファーをインジェクトすることによって、センサーチップ上にキャプチャーさせた抗体にマウスFcγRsを相互作用させた。ランニングバッファーとしては20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4が用いられ、マウスFcγRsの希釈に際してもこのバッファーが使用された。センサーチップの再生には10 mmol/L Glycine-HCl, pH1.5が用いられた。測定は全て25℃で実施された。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka(1/Ms)、および解離速度定数 kd(1/s)が算出された。これらの値をもとに各抗体のヒトFcγRに対する KD(M)が算出された。各パラメーターの算出にはBiacore T100 又はT200 Evaluation Software(GE Healthcare)が用いられた。
抗体のFcγRに対する結合活性を増強させる方法としては、抗体のFc領域にアミノ酸改変を導入する方法以外に、抗体に連結された糖鎖を低フコース型糖鎖とする方法が知られている(J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473)。参考実施例1の方法に従い、フコーストランスポーター遺伝子を欠損させたCHO細胞(WO2006/067913)を宿主細胞として用いてFv4-IgG1を発現することにより、低フコース型Fv4-IgG1(以降、Fv4-IgG1-Fucと表記される)が作製された。mFcγR(マウスFcγレセプター)のうちFcγRIVに対する、低フコース型抗体の結合活性は選択的に向上していることが報告されている(Science, 2005, 310 (5753) 1510-1512)。
(2−1)H54/L28-IgG1およびFv4-IgG1の血漿中からの抗原消失効果
抗ヒトIL-6レセプター抗体であるH54/L28-IgG1と、pH依存的にヒトIL-6レセプターに結合する性質を有するFv4-IgG1が、参考実施例1の方法で作製された。作製されたH54/L28-IgG1およびFv4-IgG1を用いたin vivo infusion試験が下記の方法で実施された。
ヒトFcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol. (2010) 602, 93-104)の背部皮下に可溶型ヒトIL-6レセプターが充填されたinfusion pump(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)を埋め込むことで、血漿中可溶型ヒトIL-6レセプター濃度が定常状態に維持される動物モデルが作製された。その動物モデルに対して投与された抗ヒトIL-6レセプター抗体の投与後の体内動態が評価された。可溶型ヒトIL-6レセプターに対する中和抗体の産生を抑制するため、(公知の方法で取得された)monoclonal anti-mouse CD4 antibodyが尾静脈に20 mg/kgで単回投与された。その後、92.8μg/mLの可溶型ヒトIL-6レセプターが充填されたinfusion pumpがマウス背部皮下へ埋め込まれた。Infusion pumpが埋め込まれた3日後に、抗ヒトIL-6レセプター抗体が1 mg/kgで尾静脈に単回投与された。抗ヒトIL-6レセプター抗体投与後15分、7時間、1日、2日、4日、7日が経過した後に当該マウスから採血された。採取された血液を直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離された血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
マウスの血漿中hsIL-6R可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は電気化学発光法にて測定された。2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mLに調製されたhsIL-6R可溶型ヒトIL-6レセプター検量線試料および50倍以上希釈されたマウス血漿測定試料を、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)およびTocilizumabと混合することによって37℃で1晩反応させた。Tocilizumabの終濃度は333μg/mLとなるように調製された。その後、反応液がMA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注された。さらに室温で1時間反応させた反応液を洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)が分注された。その後ただちにSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)で測定が行われた。hsIL-6R可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。
pH依存的ヒトIL-6レセプター結合抗体であるFv4-IgG1に対して、FcγRに対する結合活性を増強あるいは低下させることにより、ヒトIL-6レセプター濃度推移に与える影響が、下記の方法で評価された。実施例1において作製されたFv4-IgG1、Fv4-IgG1-F760、Fv4-IgG1-F1022、Fv4-IgG1-Fucを用いたin vivo infusion試験が下記の方法で実施された。
ヒトFcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol. (2010), 602, 93-104)の背部皮下に可溶型ヒトIL-6レセプターを充填したinfusion pump(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)を埋め込むことで、血漿中可溶型ヒトIL-6レセプター濃度が定常状態に維持される動物モデルが作製された。その動物モデルに対してヒト免疫グロブリン製剤サングロポール(CSLベーリング株式会社)と同時に投与された抗ヒトIL-6レセプター抗体の投与後の可溶型ヒトIL-6レセプターの体内動態が評価された。可溶型ヒトIL-6レセプターに対する中和抗体の産生を抑制するため、(公知の方法で取得された)monoclonal anti-mouse CD4 antibodyが尾静脈に20 mg/kgで単回投与された。その後、92.8μg/mLの可溶型ヒトIL-6レセプターが充填されたinfusion pumpがマウス背部皮下へ埋め込まれた。Infusion pumpが埋め込まれた3日後に、抗ヒトIL-6レセプター抗体が1 mg/kgで、サングロポールが1000 mg/kgで尾静脈に単回投与された。抗ヒトIL-6レセプター抗体投与後15分、7時間、1日、2日、4日、7日、14日、21日が経過した後に当該マウスから採血された。抗ヒトIL-6レセプター抗体投与後15分、7時間、1日、2日、3日、7日、14日、21日が経過した後に当該マウスから採血された。採取された血液を直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離された血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
(2−1−2)に記載された方法と同様に、マウスの血漿中hsIL-6R可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は電気化学発光法にて測定された。
IgG抗体の血漿中滞留性を改善する方法として、pH酸性域の条件下におけるFcRnに対する結合を向上させる方法が報告されている。IgG抗体のFc領域にアミノ酸置換を導入し、pH酸性域の条件下におけるFcRnに対する結合を向上させることで、エンドソーム内から血漿中へのリサイクル効率が上昇し、その結果、当該IgG抗体の血漿中滞留性が改善すると考えられている。
血漿中可溶型ヒトIL-6レセプター濃度が定常状態に維持されたヒトFcRnトランスジェニックマウスを用いて、実施例(2−1−1)の方法と同様に、Fv4-IgG1-F1093のin vivo infusion試験が行われた。当該マウスの血漿中の可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は、実施例(2−1−2)の方法で測定された。その結果を図4に示した。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度はELISA法にて測定された。まず、Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置することによってAnti-Human IgG固相化プレートが作成された。血漿中濃度として0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mLの抗ヒトIL-6レセプター抗体を含む検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。これらの検量線試料および血漿測定試料100μLに20 ng/mLの可溶型ヒトIL-6レセプターが200μL加えられた混合液を、室温で1時間静置させた。その後当該混合液が各ウェルに分注されたAnti-Human IgG固相化プレートをさらに室温で1時間静置させた。その後Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)と室温で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)を室温で1時間反応させた反応液の発色反応が、TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いて行われた。1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)を添加することによって反応が停止された各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が、マイクロプレートリーダーにて測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。
図5に示されたとおり、Fv4-IgG1のpH中性域の条件下におけるFcγRへの結合活性が増強されたFv4-IgG1-F1022が投与された群では、Fv4-IgG1が投与された群に比べて、投与された抗体の血漿中滞留性が低下することが確認された。一方、Fv4-IgG1-F1022のpH酸性域の条件下におけるヒトFcRnへの結合活性が増強されたFv4-IgG1-F1093が投与された群では、Fv4-IgG1-F1022が投与された群に比べて投与された抗体の血漿中滞留性が大幅に改善されたことが確認された。
(4−1)FcγRに対する結合活性を増強した抗体の抗原消失効果
実施例2において、マウスFcγR に対する結合が増強されたFv4-IgG1-F1022が投与された群では、血漿中の抗原濃度が大幅に低下したことが示された。また、実施例3において、Fv4-IgG1-F1022の投与群での血漿中滞留性の低下は、Fv4-IgG1-F1022のpH酸性域の条件下におけるヒトFcRnへの結合活性を増強することにより、大幅に改善することが示された。次に、マウスFcγR に対する結合を増強することによる血漿中可溶型抗原の消失効果と、pH酸性域の条件下におけるヒトFcRnへの結合活性を増強することによる抗体の血漿中滞留性の向上効果が、更に以下のように検証された。
マウスFcγRへの結合が増強された抗原結合分子として、VH3-IgG1のEUナンバリングで表される326位のLysがAspに置換されたVH3-IgG1-F1087(配列番号:44)およびVH3-IgG1のEUナンバリングで表される239位のSerがAspに置換され、332位のIleがGluに置換されたVH3-IgG1-F1182(配列番号:45)が作製された。参考実施例1の方法を用いて、VH3-IgG1-F1087を重鎖として含み、VL3-CKを軽鎖として含むFv4-IgG1-F1087および、VH3-IgG1-F1182を重鎖として含み、VL3-CKを軽鎖として含む、Fv4-IgG1-F1182が作製された。
VH3-IgG1-F1087およびVH3-IgG1-F1182を重鎖として含み、L (WT)-CK(配列番号:42)を軽鎖として含むVH3/L (WT)-IgG1-F1087およびVH3/L (WT)-IgG1-F1182が参考実施例1の方法で作製された。これらの抗体およびVH3/L (WT)-IgG1-F1022、VH3/L (WT)-IgG1のマウスFcγRに対する結合活性が、参考実施例2の方法で評価された。その結果を表7に示した。また、それぞれの改変体のマウスFcγRに対する結合活性が、改変を加える前のIgG1に比較して何倍増強しているかを表8に示した。なお、表中では、VH3/L (WT)-IgG1はIgG1、VH3/L (WT)-IgG1-F1022はF1022、VH3/L (WT)-IgG1-F1087はF1087、VH3/L (WT)-IgG1-F1182はF1182と表記した。
ヒトFcRnトランスジェニックマウスを用いたin vivo infusion試験が実施例2の方法と同様に実施され、当該マウスの血漿中の可溶型IL-6レセプターの濃度が測定された。その結果を図6に示した。
実施例3において、マウスFcγR に対する結合活性が増強しているFv4-IgG1-F1022のpH酸性域の条件下におけるヒトFcRn結合活性を増強したFv4-IgG1-F1093が投与されたヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて、Fv4-IgG1-F1022が投与されたヒトFcRnトランスジェニックマウスと比較して、抗体の血漿中滞留性が大幅に向上することが示された。この効果が、Fv4-IgG1-F1087およびFv4-IgG1-F1182が投与されたヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいても示されるかどうか、更には実施例3で検証された改変とは異なる改変が加えられpH酸性域の条件下におけるヒトFcRnに対する結合活性が増強している改変体が投与されたマウスにおいても同様の効果が示されるかどうかが、以下のように検証された。
ヒトFcRnトランスジェニックマウスにそれぞれFv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181およびFv4-IgG1-F1412を投与するin vivo infusion試験が実施例2の方法と同様に、実施され、当該マウス群の血漿中可溶型IL-6レセプターの濃度が測定された。Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1が投与されたマウス群の血漿中可溶型IL-6レセプター濃度の結果を図9に、Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1が投与されたマウスの血漿中可溶型IL-6レセプター濃度の結果を図10に示した。また、当該マウス群における血漿中抗体濃度が実施例3の方法で測定された。当該マウス群におけるFv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1の血漿中抗体濃度の結果を図7に、Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1の血漿中抗体濃度の結果を図8に示した。
ヒト化抗CD4抗体のpH酸性域の条件下においてヒトFcRnに対する結合活性を増強し、血漿中滞留性を向上させるために、EUナンバリングで表される434位のAsnがHisに置換された抗体分子が、リウマチ因子(Rheumatiod factor、RF)に対して結合することが、近年報告された(Clin. Pharmacol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290)。この抗体はヒトIgG1のFc領域を有し、FcRnに対する結合部位に位置するEUナンバリングで表される434位のAsnがHisに置換されているが、その置換された箇所を認識するリウマチ因子が結合することが示されている。
(5−1)FcγRに対する結合活性を増強したマウス抗体の抗原消失効果
実施例1から4において、ヒト抗体のFc領域を有し、pH依存的にヒトIL-6レセプターに結合する性質を有する抗原結合分子のマウスFcγRに対する結合活性を増強させた抗原結合分子が投与されたヒトFcRnトランスジェニックマウス群において、当該マウスの血漿中可溶型ヒトIL-6レセプターの消失が早められていることが確認された。この効果が、マウスFcRnを有するノーマルマウスにおいて、マウス抗体のFc領域を有し、pH依存的にヒトIL-6レセプターに結合する性質を有する抗原結合分子が投与されたマウスFcRnを有するノーマルマウスにおいても示されるかどうかが、以下に示すように検証された。
pH依存的にヒトIL-6レセプターに結合する性質を有するマウスIgG1抗体の重鎖としてVH3-mIgG1(配列番号:49)、軽鎖としてVL3-mk1(配列番号:50)が参考実施例1の方法を用いて作製された。また、VH3-mIgG1のマウスFcγRに対する結合活性を増強するために、EUナンバリングで表される327位のAlaがAspに置換されたVH3-mIgG1-mF44(配列番号:51)が作製された。同様に、VH3-mIgG1のEUナンバリングで表される239位のSerがAspに置換され、327位のAlaがAspに置換されたVH3-mIgG1-mF46(配列番号:52)が作製された。VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44あるいはVH3-mIgG1-mF46を重鎖として含み、VL3-mk1を軽鎖として含む、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44あるいはFv4-mIgG1-mF46が、参考実施例1の方法を用いて作製された。
VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44あるいはVH3-mIgG1-mF46を重鎖として含み、L (WT)-CK(配列番号:42)を軽鎖として含むVH3/L (WT)-mIgG1、VH3/L (WT)-mIgG1-mF44あるいはVH3/L (WT)-mIgG1-mF46が参考実施例1の方法で作製された。これらの抗体のマウスFcγRに対する結合活性が、参考実施例2の方法で評価された。その結果を表9に示した。また、それぞれの改変体のマウスFcγRに対する結合活性が、改変を加える前のmIgG1に比較して何倍増強しているかを表10に示した。なお、表中では、VH3/L (WT)-mIgG1はmIgG1、VH3/L (WT)-mIgG1-mF44はmF44、VH3/L (WT)-mIgG1-mF46はmF46と表記した。
抗ヒトIL-6レセプター抗体としてFv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44あるいはFv4-mIgG1mF46が投与されたノーマルマウスの血漿中可溶型IL-6レセプターの消失効果が以下のように検証された。
(6−1)FcγRIIbに対する結合活性を選択的に増強した抗体の抗原消失効果
FcγRIII欠損マウス(B6.129P2-FcgrR3tm1Sjv/J mouse, Jackson Laboratories)は、マウスFcγRI、マウスFcγRIIb、マウスFcγRIVを発現しているが、マウスFcγRIIIを発現しないマウスである。一方、Fc受容体γ鎖欠損マウス(Fcer1g mouse, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529)は、マウスFcγRIIbのみを発現し、マウスFcγRI、マウスFcγRIII、マウスFcγRIVを発現しないマウスである。
抗ヒトIL-6レセプター抗体としてFv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44あるいはFv4-mIgG1-mF46が投与されたFcγRIII欠損マウスの血漿中可溶型IL-6レセプターの消失効果が、実施例5の方法と同様に検証された。当該マウスの血漿中の可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は、実施例(2−1−2)の方法で測定された。その結果を図12に示した。
抗ヒトIL-6レセプター抗体としてFv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44またはFv4-mIgG1mF46が投与されたFc受容体γ鎖欠損マウスの血漿中可溶型IL-6レセプターの消失効果が、実施例5の方法と同様に検証された。当該マウスの血漿中の可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は、実施例(2−1−2)の方法で測定された。その結果を図13に示した。
(7−1)FcγRIIIに対する結合活性を選択的に増強した抗体の抗原消失効果
FcγRIIb欠損マウス(Fcgr2b(FcγRII) mouse, Taconic)(Nature (1996) 379 (6563), 346-349)は、マウスFcγRI、マウスFcγRIII、マウスFcγRIVは発現するが、マウスFcγRIIbを発現しないマウスである。実施例5において、天然型マウスIgG1のFcγRへの結合活性を増強させたmF44およびmF46は、マウスFcγRIIbおよびマウスFcγRIIIに対して選択的に結合が増強していることが示された。この選択的に増強された抗体の結合活性を利用し、マウスFcγRIIbを発現しないマウスFcγRIIb欠損マウスにmF44およびmF46を投与することにより、マウスFcγRIIIに対する結合が選択的に増強された抗体を投与する状況を模倣することが可能であると考えられた。
(7−2)FcγRIIb欠損マウスを用いたマウスFcγRIII選択的結合増強による抗原消失効果の検証
FcγRIIb欠損マウスに抗ヒトIL-6レセプター抗体としてFv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44あるいはFv4-mIgG1mF46が投与されたFcγRIIb欠損マウスの血漿中可溶型IL-6レセプターの消失効果が、実施例5の方法と同様に検証された。血漿中の可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は、実施例(2−1−2)の方法で測定された。その結果を図14に示した。
(8−1)FcγRIIbに対する結合を増強する既存の改変が加えられたFc領域を含む抗体の作製
実施例7に記したように、FcγRIIbに対する選択的に結合活性が増強された抗体を生体に投与することで、当該生体の血漿中から抗原を効率的に消失させることが可能である。また、FcγRIIbに対する結合活性が選択的に増強されたFc領域を含む抗体を投与することは、抗体が投与される生体にとって安全性、副作用の観点でも好ましいと考えられた。
ヒトFcγRIIbに対する結合を増強する既存の改変が加えられたFc領域を含む抗体の、ヒトFcγRIa、FcγRIIaのR型およびH型、FcγRIIb、FcγRIIIaに対するアフィニティーが下記のように解析された。抗体H鎖可変領域としてWO2009/125825に開示されているヒトインターロイキン6レセプターに対する抗体の可変領域であるIL6R-H(配列番号:53)を、抗体H鎖定常領域としてヒトIgG1のC末端のGlyおよびLysを除去したG1dを有するIL6R-G1d(配列番号:54)を含むH鎖が作製された。次に、IL6R-G1dのFc領域がSeungら(Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933)に記載されている改変であるEUナンバリング267位で表されるSerのGluへの置換、EUナンバリング328位で表されるLeuのPheへの置換によって改変されたIL6R-G1d-v3(配列番号:55)が作製された。抗体L鎖としてヒトインターロイキン6レセプターに対する抗体のL鎖であるIL6R-L(配列番号:56)を共通に用い、それぞれのH鎖と共に参考実施例1の方法に従い発現させた抗体が精製された。IL6R-G1d、IL6R-G1d-v3を重鎖として含む抗体は、それぞれIgG1、IgG1-v3と以下で呼ばれる。
次に、IgG1のFc領域におけるEUナンバリングで表される267位のSerがGluに、328位のLeuがPheに置換されたFc 領域を含む抗体のFcγRIIaに対するアフィニティーの強弱によって血小板凝集能が変化するかがFcγRIIaのH型、R型のドナー由来の血小板を用いて検証された。IgEに結合するhIgG1抗体(ヒトIgG1定常領域)の重鎖可変領域およびG1d重鎖定常領域を含む重鎖omalizumab_VH-G1d(配列番号:57)、軽鎖としてomalizumab_VL-CK(配列番号:58)を含む抗体が参考実施例1の方法を用いて作製された。また、omalizumab_VH-G1dのEUナンバリングで表される267位のSerがGluに、328位のLeuがPheに置換されたomalizumab_VH-G1d-v3(配列番号:59)が作製された。参考実施例1の方法を用いて、omalizumab_VH-G1d-v3を重鎖として含み、omalizumab_VL-CKを軽鎖として含む、omalizumab-G1d-v3が作製された。この抗体の血小板凝集能が評価された。
ヒト天然型IgG1に対してEUナンバリングで表される238位のProがAspに置換されたFcに対し、さらにFcγRIIbへの結合を上げると天然型抗体の解析から予測される他の改変を組み合わせても、期待される組合せ効果は得られなかった。そこで、EUナンバリングで表される238位のProがAspに置換された改変Fcに対して網羅的改変を導入することによって、さらにFcγRIIbへの結合を増強する改変体を見出すことが試みられた。抗体H鎖として用いられたIL6R-G1d(配列番号:54)のEUナンバリングで表される252位のMetをTyrに置換する改変、EUナンバリングで表される434位のAsnをTyrに置換する改変が導入されたIL6R-F11(配列番号:60)が作製された。さらに、IL6R-F11に対してEUナンバリングで表される238位のProをAspに置換する改変が導入されたIL6R-F652(配列番号:61)が作製された。L6R-F652に対し、EUナンバリングで表される238位の残基の近傍の領域(EUナンバリングで表される234位から237位、239位)が元のアミノ酸とシステインを除く18種類のアミノ酸にそれぞれ置換された抗体H鎖配列を含む発現プラスミドがそれぞれ調製された。抗体L鎖としてはIL6R-L(配列番号:56)が用いられた。これらの改変体が参考実施例1と同様の方法により発現、精製された。これらのFc変異体はPD variantと呼ばれる。参考実施例2と同様の方法により各PD variantのFcγRIIa R型およびFcγRIIbに対する相互作用が網羅的に評価された。
この結果から、天然型IgG1に対して導入した改変の効果にもとづいてP238D改変が含まれる改変体に対して同改変を組み合わせて導入したときの効果を予測するのは困難であることが明らかとなった。また、いいかえれば今回見出された8種類の改変は、P238D改変が含まれる改変体に対して同改変を組み合わせて導入する本検討を行わなければ見出すことが不可能な改変である。
〔式2〕
の式を利用して算出した値である。
先の実施例9に示した通り、P238Dを含むFcに対して、FcγRIIbとの結合活性を向上する、あるいはFcγRIIbへの選択性を向上させると天然型IgG1抗体の解析から予測された改変を導入しても、FcγRIIbに対する結合活性が減弱することが明らかとなり、この原因としてFcとFcγRIIbとの相互作用界面の構造がP238Dを導入することで変化していることが考えられた。そこで、この現象の原因を追及するためP238Dの変異をもつIgG1のFc(以下、Fc(P238D)と呼ぶ)とFcγRIIb細胞外領域との複合体の立体構造をX線結晶構造解析により明らかにし、天然型 IgG1のFc(以下、Fc (WT)と呼ぶ)とFcγRIIb細胞外領域との複合体との立体構造を対比することによって、これらの結合様式が比較された。なお、FcとFcγR細胞外領域との複合体の立体構造に関する複数の報告がすでにあり、Fc (WT) / FcγRIIIb細胞外領域複合体(Nature (2000) 400, 267-273、J. Biol. Chem. (2011) 276, 16469-16477)、Fc (WT) / FcγRIIIa細胞外領域複合体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674)、およびFc (WT) / FcγRIIa細胞外領域複合体(J. Immunol. (2011) 187, 3208-3217)の立体構造が解析されている。これまでにFc (WT) / FcγRIIb細胞外領域複合体の立体構造は解析されていないが、Fc(WT)との複合体の立体構造が既知であるFcγRIIaとFcγRIIbでは細胞外領域においてアミノ酸配列の93%が一致し、非常に高い相同性を有していることから、Fc (WT) / FcγRIIb細胞外領域複合体の立体構造はFc (WT) / FcγRIIa細胞外領域複合体の結晶構造からモデリングにより推定された。
P238D改変を含むFcの調製は以下のように行われた。まず、hIL6R-IgG1-v1(配列番号:62)のEUナンバリングで表される220位のCysをSerに置換し、EUナンバリングで表される236位のGluからそのC末端をPCRによってクローニングした遺伝子配列Fc (P238D)を参考実施例1に記載された方法と同様な方法で発現ベクターの作製、発現、精製が行われた。なお、EUナンバリングで表される220位のCysは通常のIgG1においては、L鎖のCysとdisulfide bondを形成しているが、Fcのみを調製する場合にはL鎖を共発現させないことから、不要なdisulfide bond形成を回避するために当該Cys残基はSerに置換された。
FcγRIIb細胞外領域は、参考実施例2の方法にしたがって調製された。
結晶化に使用するため得られたFcγRIIb細胞外領域サンプル 2 mgに対し、glutathione S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌により発現精製したEndo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) 0.29 mgを加え、0.1M Bis-Tris pH6.5のBuffer条件で、室温にて3日間静置することにより、FcγRIIb細胞外領域のAsnに直接結合したN-acetylglucosamine以外のN型糖鎖が切断された。次に5000MWCOの限外ろ過膜により濃縮された糖鎖切断処理が施されたFcγRIIb細胞外領域サンプルは、20mM HEPS pH7.5, 0.05M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)により精製された。さらに得られた糖鎖切断FcγRIIb細胞外領域画分にFc (P238D)をモル比でFcγRIIb細胞外領域のほうが若干過剰となるよう混合された。10000MWCOの限外ろ過膜により濃縮された前記混合液を20 mM HEPS pH7.5、0.05M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)を用いて精製することによって、Fc (P238D) / FcγRIIb細胞外領域複合体のサンプルが得られた。
10000MWCOの限外ろ過膜 により約10 mg/mlまで濃縮された前記のFc (P238D) / FcγRIIb細胞外領域複合体の試料を用いて、シッティングドロップ蒸気拡散法により当該複合体が結晶化された。結晶化にはHydra II Plus One (MATRIX)を用い、100 mM Bis-Tris pH6.5、17% PEG3350、0.2 M Ammonium acetate、および2.7%(w/v) D-Galactoseのリザーバー溶液に対し、リザーバー溶液:結晶化サンプルを0.2μl:0.2μlで混合して結晶化ドロップを作成した。シールされた当該結晶化ドロップを20℃に静置することによって、薄い板状の結晶が得られた。
得られたFc (P238D) / FcγRIIb細胞外領域複合体の単結晶一つは100 mM Bis-Tris pH6.5、20% PEG3350、Ammonium acetate、2.7% (w/v) D-Galactose、Ethylene glycol 22.5%(v/v) の溶液に浸漬された後、微小なナイロンループ付きのピンを用いて溶液ごとすくいとられ、液体窒素中で凍結された。その後、高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーBL-1Aにて当該結晶からのX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に置くことによって凍結状態を維持し、ビームラインに備え付けられたCCDディテクタQuantum 270(ADSC)によって、結晶を0.8°ずつ回転させながらトータル225枚のX線回折画像が収集された。得られた回折画像からの格子定数の決定、回折斑点の指数付け、ならびに回折データの処理には、プログラムXia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)ならびにScala(CCP4 Software Suite)を用い、最終的に分解能2.46Åまでの当該結晶の回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P21に属し、格子定数a=48.85Å、b=76.01Å、c=115.09Å、α=90°、β=100.70°、γ=90°であった。
Fc (P238D) / FcγRIIb細胞外領域複合体の結晶構造決定は、プログラムPhaser(CCP4 Software Suite)を用いた分子置換法によりおこなわれた。得られた結晶格子の大きさとFc (P238D) / FcγRIIb細胞外領域複合体の分子量から非対称単位中の複合体の数は一個と予想された。Fc (WT) / FcγRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造であるPDB code:3SGJの構造座標から、A鎖239-340番ならびにB鎖239-340番のアミノ酸残基部分を別座標として取り出し、それぞれFc CH2ドメインの探索用モデルと設定した。同じくPDB code:3SGJの構造座標から、A鎖341-444番とB鎖341-443番のアミノ酸残基部分を一つの座標として取り出し、Fc CH3ドメインの探索用モデルと設定した。最後にFcγRIIb細胞外領域の結晶構造であるPDB code:2FCBの構造座標からA鎖6-178番のアミノ酸残基部分を取り出しFcγRIIb細胞外領域の探索用モデルと設定した。Fc CH3ドメイン、FcγRIIb細胞外領域、Fc CH2ドメインの順番に各探索用モデルの結晶格子内での向きと位置を、回転関数および並進関数から決定し、Fc (P238D) / FcγRIIb細胞外領域複合体結晶構造の初期モデルが得られた。得られた初期モデルに対し2つのFc CH2ドメイン、2つのFc CH3ドメインならびにFcγRIIb細胞外領域を動かす剛体精密化をおこなったところ、この時点で25-3.0Åの回折強度データに対し、結晶学的信頼度因子R値は40.4%、Free R値は41.9%となった。さらにプログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcならびにモデルから計算された位相をもとに算出された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを見ながらのモデル修正をプログラムCoot(Paul Emsley)でおこなった。これらの作業を繰り返すことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデルに組み込み、精密化をおこなうことによって、最終的に分解能25-2.6Åの24291個の回折強度データを用い、4846個の非水素原子を含むモデルに対し、結晶学的信頼度因子R値は23.7%、Free R値は27.6%となった。
Fc (WT) / FcγRIIa細胞外領域複合体の結晶構造であるPDB code:3RY6の構造座標をベースに、プログラムDisovery Studio 3.1(Accelrys)のBuild Mutants機能を使い、FcγRIIbのアミノ酸配列と一致するように構造座標中のFcγRIIaに変異が導入された。その際、Optimization LevelをHigh、Cut Radiusを4.5とし、5つのモデルを発生させ、その中から最もエネルギースコアが良いものを採用し、Fc (WT) / FcγRIIb細胞外領域複合体のモデル構造と設定した。
実施例10で得られたFc (P238D)とFcγRIIb細胞外領域との複合体のX線結晶構造解析の結果に基づき、EUナンバリングで表される238位のProがAspに置換された改変FcにおいてFcγRIIbとの相互作用に影響を与えることが予測される部位(EUナンバリングで表される233位、240位、241位、263位、265位、266位、267位、268位、271位、273位、295位、296位、298位、300位、323位、325位、326位、327位、328位、330位、332位、334位の残基)に対して網羅的な改変が導入された改変体を構築することによって、P238D 改変に加えてさらにFcγRIIbとの結合を増強する改変の組合せを得ることが可能であるか検討した。
〔式2〕
の式を利用して算出した値である。
実施例9および11において得られた改変の中で、FcγRIIbへの結合を増強する効果もしくはFcγRIIbへの結合を維持し、他のFcγRへの結合を抑制する効果がみられた改変同士を組み合わせることによる効果が検証された。
〔式2〕
の式を利用して算出した数値である。
実施例8で示されたように、FcγRIIbへの結合を増強する際に、他の活性型FcγRに対する結合を可能な限り抑制したうえで、FcγRIIbへの結合を増強することが好ましい。そこで、FcγRIIbへの結合を増強する、または選択性を向上する効果がある改変同士を組み合わせ、さらにFcγRIIbへの結合が増強されまたは選択性が向上した改変体が作製された。具体的には、FcγRIIbへの結合の増強、選択性の向上において優れた効果を示すP238Dの改変を基礎とし、実施例9、実施例11、実施例12においてP238Dの改変と組み合わせることで効果が見られた改変同士がさらに組み合わされた。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
実施例13において最もFcγRIIbへの結合が増強された改変体IL6R-BP230/IL6R-LのFcγRIIbへの結合は、改変導入前のIL6R-B3/IL6R-Lと比較して約150倍に増強され、FcγRIIaRへの結合も1.9倍程度の増強に抑えられている。従ってIL6R-BP230/IL6R-LはFcγRIIbへの結合、選択性共に優れた改変体であるが、可能な限りFcγRIIaRへの結合を抑制したうえでFcγRIIbへの結合がさらに増強されたより好ましい改変体を作製する可能性が模索された。
Fc (P208)は以下のように調製された。まず、IL6R-BP208の、EUナンバリングで表される439位のGluを天然型ヒトIgG1の配列であるLysにしたIL6R-P208が作製された。次にEUナンバリングで表される220位のCysがSerに置換された改変体をコードするDNAを鋳型として、EUナンバリングで表される216位のGluからそのC末端がPCRによってクローニングされた遺伝子配列Fc (P208)がクローニングされた。参考実施例1に記載の方法にしたがって発現ベクターの作製、発現、精製を行った。なお、通常のIgG1のEUナンバリングで表される220位のCysは、L鎖に存在するCysとジスルフィド結合を形成しているが、Fc領域のみを調製する場合、L鎖を共発現させないため、不要なdisulfide bond形成を回避するために当該220位のCysはSerに置換された。
FcγRIIb細胞外領域は、参考実施例2の方法にしたがって調製された。
glutathione S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌内で発現されたEndo F1(Protein Science (1996) 5, 2617-2622)の精製産物0.15 mgが加えられた、結晶化のために得られた1.5 mgのFcγRIIb細胞外領域サンプルを、0.1M Bis-Tris pH6.5のバッファー中で、室温にて3日間静置することにより、当該FcγRIIb細胞外領域サンプル中のN型糖鎖がAsnに直接結合したN-acetylglucosamineを残して切断された。次に5000MWCOの限外ろ過膜により濃縮された前記の糖鎖切断処理が施されたFcγRIIb細胞外領域サンプルは、20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaClで平衡化されたゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)によって精製された。さらに、Fc (P208) がモル比でFcγRIIb細胞外領域のほうが若干過剰となるよう加えられた、前記の糖鎖切断FcγRIIb細胞外領域の精製画分は、10000MWCOの限外ろ過膜により濃縮され、その後、25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaClで平衡化されたゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)により精製された。前記のように得られた精製画分が、Fc (P208) / FcγRIIb細胞外領域複合体のサンプルとして以後の検討に使用された。
10000MWCOの限外ろ過膜 により約10 mg/mlまで濃縮されたFc (P208) / FcγRIIb細胞外領域複合体のサンプルは、ハンギングドロップ蒸気拡散法によりSeeding法が併用して結晶化された。結晶化にはVDXmプレート(Hampton Research)を用い、0.1M Bis-Tris pH6.5、19%(w/v) PEG3350、0.2 M Potassium Phosphate dibasicのリザーバー溶液に対し、リザーバー溶液:結晶化サンプル=0.85μl:0.85μlで混合して作成された結晶化ドロップに、同様な条件で得られた同複合体の結晶をSeed Bead(Hampton Research)を用いて砕いた種結晶溶液から作成した希釈溶液0.15μlを添加し、リザーバーの入ったウェルに密閉、20℃に静置することにより、板状の結晶が得られた。
前記のように得られたFc (P208) / FcγRIIb細胞外領域複合体の単結晶の一つを0.1M Bis-Tris pH6.5、24% (w/v) PEG3350、0.2 M Potassium Phosphate dibasic、20% (v/v) Ethylene glycolの溶液に浸した後、微小なナイロンループ付きのピンで溶液ごとすくいとり、液体窒素中で凍結させた当該単結晶からのX線回折データは、Spring-8のBL32XUにて測定された。なお、測定中、常に-178℃の窒素気流中に置くことで凍結状態が維持され、ビームライン備え付けのCCDディテクタMX-225HE(RAYONIX)により、当該単結晶を0.6°ずつ回転させながら計300枚の当該単結晶のX線回折画像が収集された。得られた回折画像からの格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理には、プログラムXia2(J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190)、XDS Package(Acta Cryst. (2010) D66, 125-132)およびScala(Acta Cryst. (2006) D62, 72-82)を用い、最終的に分解能2.81Åまでの当該単結晶の回折強度データが得られた。本結晶は、空間群C2221に属し、格子定数a=156.69Å、b=260.17Å、c=56.85Å、α=90°、β=90°、γ=90°であった。
Fc (P208) / FcγRIIb細胞外領域複合体の構造は、プログラムPhaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)を用いた分子置換法により決定された。得られた結晶格子の大きさとFc (P208) / FcγRIIb細胞外領域複合体の分子量から非対称単位中の複合体の数は一個と予想された。Fc (WT) / FcγRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造であるPDB code:3SGJの構造座標から別座標として取り出されたA鎖239-340番ならびにB鎖239-340番のアミノ酸残基部分が、Fc領域のCH2ドメインの探索用モデルとして使用された。同じくPDB code:3SGJの構造座標から一つの座標として取り出されたA鎖341-444番とB鎖341-443番のアミノ酸残基部分がFc領域のCH3ドメインの探索用モデルとして使用された。最後にFcγRIIb細胞外領域の結晶構造であるPDB code:2FCB の構造座標から取り出されたA鎖6-178番のアミノ酸残基部分がFc (P208) の探索用モデルとして使用された。Fc領域のCH3ドメイン、FcγRIIb細胞外領域、Fc領域のCH2ドメインの各探索用モデルの結晶格子内での向きと位置を、回転関数および並進関数から決定しようとしたところ、CH2ドメインの一つの位置がうまく決定されなかった。そこで残りの三つの部分から計算された位相をもとに計算された電子密度マップから、Fc (WT) / FcγRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造を参考にしながら最後のCH2ドメインAの位置が決定され、Fc (P208) / FcγRIIb細胞外領域複合体結晶構造の初期モデルが得られた。得られた初期モデルに対し二つのFc領域のCH2ドメイン、二つのFc領域のCH3ドメインおよびFcγRIIb細胞外領域を動かす剛体精密化をおこなったところ、剛体精密化が行われた時点で25-3.0Åの回折強度データを用いた構造モデルの結晶学的信頼度因子R値は42.6%、Free R値は43.7%となった。さらにプログラムREFMAC5(Acta Cryst. (2011) D67, 355-367)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foと構造モデルから計算された構造因子Fc領域および構造モデルから計算された位相をもとに算出された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをみながら、構造モデルをプログラムCoot(Acta Cryst. (2010) D66, 486-501)を用いて修正する作業を繰り返すことで構造モデルの精密化がおこなわれた。さらに2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子を構造モデルに組み込み、精密化を行うことで、最終的に分解能25-2.81Åの27259個の回折強度データを用いた、4786個の非水素原子を含む構造モデルの、結晶学的信頼度因子R値は24.5%、Free R値は28.2%となった。
[FcγRIIaR細胞外領域の発現精製]
FcγRIIaR細胞外領域は、参考実施例2の方法にしたがって調製された。
S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌内で発現されたEndo F1(Protein Science (1996) 5, 2617-2622)の精製産物0.15 mg、20μlの5 U/ml 濃度のEndo F2(QA-bio)および20μlの5 U/ml 濃度のEndo F3(QA-bio)が加えられた、1.5 mgの精製されたFcγRIIa Rの細胞外領域サンプルを、0.1M Na Acetate pH4.5のバッファー中で、室温にて9日間静置の後、さらに、0.07 mgの前記Endo F1、7.5μl の前記Endo F2および7.5μl の前記Endo F3の追加後3日間静置することにより、当該FcγRIIa R細胞外領域サンプル中のN型糖鎖がAsnに直接結合したN-acetylglucosamineを残して切断された。次に10000MWCOの限外ろ過膜により濃縮された前記の糖鎖切断処理が施されたFcγRIIaR細胞外領域サンプルは、25 mM HEPES pH7、0.1M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)によって精製された。さらに、Fc (P208) をモル比でFcγRIIaR細胞外領域のほうが若干過剰となるよう加えられた、前記の糖鎖切断FcγRIIaR細胞外領域の精製画分は、10000MWCOの限外ろ過膜による濃縮後、25mM HEPES pH7、0.1M NaClで平衡化されたゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)により精製された。前記のように得られた精製画分が、Fc (P208)/FcγRIIaR型細胞外領域複合体のサンプルとして以後の検討に使用された。
10000MWCOの限外ろ過膜 により約10 mg/mlまで濃縮されたFc (P208)/FcγRIIa R型細胞外領域複合体のサンプルは、シッテイングドロップ蒸気拡散法にて結晶化された。0.1 M Bis-Tris pH7.5、26% (w/v) PEG3350、0.2 M Ammonium Sulfaeのリザーバー溶液に対し、リザーバー溶液:結晶化サンプル=0.8μl:1.0μlで混合して作成された結晶化ドロップを、シールで密閉して20℃に静置することにより、板状の結晶が得られた。
前記のように得られたFc (P208)/FcγRIIaR細胞外領域複合体の単結晶の一つを0.1 M Bis-Tris pH7.5、27.5% (w/v) PEG3350、0.2 M Ammonium Sulfate、20% (v/v) Glycerolの溶液に浸した後、微小なナイロンループ付きのピンで溶液ごとすくいとり、液体窒素中で凍結させた当該単結晶中からのX線回折データは、高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーBL-17Aにて測定された。なお、測定中、常に-178℃の窒素気流中に置くことで凍結状態が維持され、ビームライン備え付けのCCDディテクタQuantum 315r(ADSC)により、当該単結晶を0.6°ずつ回転させながら計225枚の当該単結晶のX線回折画像が収集された。得られた回折画像からの格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理は、プログラムXia2(J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190)、XDS Package(Acta Cryst. (2010) D66, 125-132)およびScala(Acta Cryst. (2006) D62, 72-82)を用い、最終的に分解能2.87Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群C2221に属し、格子定数a=154.31Å、b=257.61Å、c=56.19Å、α=90°、β=90°、γ=90°であった。
Fc (P208)/FcγRIIaR型細胞外領域複合体の構造は、プログラムPhaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)を用いた分子置換法により決定された。得られた結晶格子の大きさとFc (P208)/FcγRIIaR細胞外領域複合体の分子量から非対称単位中の複合体の数は一個と予想された。実施例(14−1)で得られたFc (P208)/FcγRIIb細胞外領域複合体の結晶構造を探索用モデルとして用いて、Fc (P208)/FcγRIIaR細胞外領域複合体の結晶格子内での向きと位置が、回転関数および並進関数から決定された。さらに得られた初期構造モデルに対し、二つのFc領域のCH2ドメイン、二つのFc領域のCH3ドメインおよびFcγRIIaR細胞外領域を独立に動かす剛体精密化をおこなったところ、剛体精密化が終了した時点で25-3.0Åの回折強度データを用いた構造モデルの結晶学的信頼度因子R値は38.4%、Free R値は30.0%となった。さらにプログラムREFMAC5(Acta Cryst. (2011) D67, 355-367)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcならびにモデルから計算された位相をもとに算出された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをみながら当該構造モデルをプログラムCoot(Acta Cryst. (2010) D66, 486-501)を用いて修正する作業を繰り返すことで構造モデルの精密化がおこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデルに組み込み、精密化をおこなうことで、最終的に分解能25-2.87Åの24838個の回折強度データを用いた、4758個の非水素原子を含む構造モデルの、結晶学的信頼度因子R値は26.3%、Free R値は38.0%となった。
実施例14においてFcγRIIbへの結合が増強された改変体(P208)のドメインB内で、P271G改変の導入にともなう周囲の構造変化の結果として、EUナンバリングで表される268位のAspが、EUナンバリングで表される292位のArgと静電相互作用していることが示唆された(図34)。この相互作用形成がEUナンバリングで表される266位から271位のループ構造の安定化に働き、結果としてFcγRIIbへの結合増強に寄与した可能性が考えられた。そこで、当該改変体のEUナンバリングで表される268位のAspをGluに置換することによって、前記の静電相互作用が強化され、当該改変体のループ構造をさらに安定化させることで、FcγRIIbへの結合増強が可能か否かが検討された。また図33に示したとおり、FcγRIIbのEUナンバリングで表される160位のTyrは、P208のドメインAのEUナンバリングで表される237位のAspの主鎖と相互作用している。一方、EUナンバリングで表される237位のAspの側鎖は、分子内のEUナンバリングで表される332位のIle、333位のGlu、334位のLysの近傍に位置しているが特に目立った相互作用は形成していない。そこで、これらの部位を親水性アミノ酸残基に置換することでEUナンバリングで表される237位のAspの側鎖との相互作用を強めて、EUナンバリングで表される266位から271位のループ構造を安定化することで、FcγRIIbの160番目のTyrとの相互作用が増強されるか否かが、併せて検証された。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
Fc (P208)とFcγRIIbの構造とFc (P238D)/FcγRIIbの構造の比較において最も違いがみられるのは、Fc領域のCH2ドメインB のEUナンバリングで表される271位の近傍の構造である(図33)。実施例11に示したようにFc (P238D)ではEUナンバリングで表される270位のAspがFcγRIIbの131番目のArgと強固な静電相互作用を形成する際に、EUナンバリングで表される271位のPro部分に立体化学的なストレスがかかっている可能性が示唆された。Fc (P208)/FcγRIIbの構造においてはEUナンバリングで表される271位のProのGlyへの置換により、この構造的なひずみを解消するように主鎖レベルでの位置変化がおきており、その結果、271位の近傍の構造が大きく変化したと考えられる。この変化した271位の近傍の構造をさらに安定化させることができれば、FcγRIIbの131番目のArgとの静電相互作用を形成結合にともなうエントロピー的なエネルギー損失をさらに軽減できる可能性も考えられた。そこで、EUナンバリングで表される271位の周辺のアミノ酸残基に対する改変を網羅的に導入することにより、Fc領域のFcγRIIbに対する結合の増強あるいは選択性の向上を示す改変が探索された。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
EUナンバリングで表される396位のProをLeuに置換する改変はFcγRIIbへの結合を増強することが報告されている(Cancer Res. (2007) 67, 8882-8890)。EUナンバリングで表される396位のアミノ酸はFcγRとの相互作用には直接関与しない部位であるが、抗体の構造を変化させることでFcγRとの相互作用に影響を与えるとも考えられる。そこで、Fc領域のEUナンバリングで表される396位のアミノ酸に改変を網羅的に導入することにより、Fc慮域のFcγRIIbへの結合あるいは選択性が向上するか否かが検証された。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
ヒトIgGに存在するサブクラスによって、FcγRへの結合プロファイルが異なる。IgG1とIgG4の各FcγRへの結合活性の違いを、FcγRIIbへの結合活性の増強、および/または選択性の向上に利用できるか否かが検証された。はじめに、IgG1とIgG4の各FcγRへの結合活性が解析された。抗体H鎖としては、ヒトIgG4 のEUナンバリングで表される228位のSerがProに置換され、C末端のGlyおよびLysが除去されたFc領域であるG4dを含むIL6R-G4d(配列番号:64)が抗体H鎖として作製された。抗体L鎖としてはIL6R-L(配列番号:56)が用いられた。参考実施例1の方法に従い発現した、IL6R-Lの軽鎖とIL6R-G1d/IL6R-LまたはIL6R-G4d/IL6R-Lを含む抗体が精製された。精製された抗体の各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)に対する結合が、参考実施例2の方法によって評価された。得られた改変体の各FcgRへの結合を表24にまとめた。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
これまでの検討において見出されたFcγRIIbへの結合活性あるいは選択性を向上させる改変のさらなる組合せが検討された。具体的には、IL6R-B3(配列番号:63)に対してこれまでの検討の中でFcγRIIbへの結合の増強、および/または選択性の向上をもたらした改変の組合せが導入された。また比較対照として既存のFcγRIIbへの結合を増強する改変(Seungら(Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933))である、S267E、およびL328Fの改変がIL6R-B3に導入されたIL6R-BP253が作製された。抗体L鎖としてはIL6R-L(配列番号:56)が用いられた。参考実施例1の方法に従い発現した、前記の重鎖の改変体とIL6R-Lの軽鎖を含む抗体が精製された。精製された抗体の各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)に対する結合が、参考実施例2の方法によって評価された。
〔式2〕
の式を利用して算出された数値である。
(20−1)ヒトIgA(hIgA)の調製
実施例2から4で、マウスFcγRに対する結合が増強されたpH依存的に抗原であるヒトIL-6レセプターに結合する分子は血漿中の抗原濃度を大幅に低下させることが可能であることが示された。次に、ヒトIL-6レセプター以外の抗原に対してpH依存的に結合し、マウスFcγR に対する結合が増強された抗体が投与された生体の血漿中の可溶型抗原を消失させる効果が同様に観察されるかについて更なる検証を行うために、ヒトIgAを抗原とする抗体を用いた試験が新たに実施された。抗原であるヒトIgA(以下hIgAとも呼ばれる)(可変領域は抗ヒトIL6R抗体)は以下のような組換え技術を用いて調製された。H (WT)-IgA1(配列番号:65)とL (WT)-CK(配列番号:42)を含む組み組換えベクターを含む宿主細胞を培養することによって発現されたhIgAが、当業者公知の方法によってイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製された。
GA2-IgG1(重鎖配列番号:66、軽鎖配列番号:67)はhIgAに結合する抗体である。GA2-IgG1(重鎖配列番号:66、軽鎖配列番号:67)をコードするDNA配列が動物細胞発現用プラスミドに当業者公知の方法で組み込まれた。抗体は以下の方法を用いて発現および精製された。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)をFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁させた細胞懸濁液が、1.33 x 106個/mLの細胞密度で6 well plateの各ウェルへ3 mLずつ播種された。次に、リポフェクション法により調製されたプラスミドが細胞へ導入された。当該細胞はCO2インキュベーター(37℃、8%CO2, 90 rpm)で4日間培養され、単離されたその培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体が精製された。精製された抗体溶液の吸光度(波長:280nm)が、分光光度計を用いて測定された。得られた測定値からPACE法によって算出された吸光係数を用いて抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、実施例(20−2)で単離された抗体のhIgA結合活性(解離定数KD (M))が評価された。ランニングバッファーとして3μMまたは1.2 mM CaCl2を含有する0.05% tween20、20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl(pH7.4またはpH5.8)を用いて当該結合活性が測定された。アミノカップリング法で適切な量の組換え型プロテインA/G(Thermo Scientific)が固定化されたSensor chip CM5(GE Healthcare)に、抗体を結合させた。次に、アナライトとして適切な濃度のhIgA((A1−1)に記載)をインジェクトすることによって、hIgAとセンサーチップ上の抗体を相互作用させた。測定は37℃で行われた。測定後、10 mmol/L Glycine-HCl、 pH1.5をインジェクトすることによって、センサーチップが再生された。Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)を用いて、カーブフィッティングによる解析および平衡値解析により、測定結果から解離定数KD(M)が算出された。その結果を表28に示した。GA2-IgG1はCa2+濃度が1.2 mMの条件下ではhIgAに強く結合するが、Ca2+濃度が3μMの条件下ではhIgAに弱く結合することが示された。また、GA2-IgG1はCa2+濃度が1.2 mMの条件下で、pH7.4においてはヒトIgAに強く結合するが、pH5.8においてはヒトIgAに弱く結合することが示された。すなわち、GA2-IgG1は、ヒトIgAに対して、pH依存的、および、カルシウム依存的に結合することが明らかとなった。
次に、血漿中からの抗原(hIgA)の消失をさらに増大させることを目的に、カルシウム依存的にhIgAに結合するGA2-IgG1に対してマウスFcγRに対する結合を増強するためにGA2-IgG1のEUナンバリングで表される328位のLeuがTyrに置換されたGA2-F1087(重鎖配列番号:68)が作製された。GA2-F1087(重鎖配列番号:68、軽鎖配列番号:67)をコードするDNA配列が当業者に公知の方法で組み込まれた動物発現用プラスミドを用いて、上述の方法で発現したこれらの抗体改変体の濃度が、精製後に測定された。この改変を含む抗体は実施例(4−3)に示されるように、マウスFcγRに対する結合が大幅に増強していた。
(22−1)ノーマルマウスが用いられたin vivo試験
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)に対してhIgA(ヒトIgA:実施例(20−1)にて作製)が単独で投与された、またはhIgAおよび抗hIgA抗体が同時に投与された後の、hIgAおよび抗hIgA抗体の体内動態が評価された。hIgA溶液(80μg/mL)、または、hIgAと抗hIgA抗体の混合溶液が尾静脈に10 mL/kgの用量で単回投与された。抗hIgA抗体としては、上述のGA2-IgG1およびGA2-F1087が使用された。
マウス血漿中の抗hIgA抗体濃度はELISA法にて測定された。まずAnti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)がその各ウェルに分注されたNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)を4℃で1晩静置することによってAnti-Human IgG固相化プレートが作成された。血漿中濃度の標準液として0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.007813μg/mLに調製された抗hIgA抗体の検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が、前記のAnti-Human IgG固相化プレートに分注された後、当該プレートが25℃で1時間インキュベーションされた。その後、Goat Anti-Human IgG (γ chain specific) Biotin (BIOT) Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)が前記プレートの各ウェルに分注された後、当該プレートを25℃で1時間反応させた。さらに、Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)が前記プレートの各ウェルに分注された後、当該プレートを25℃で1時間反応させた。TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いた発色反応が1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)を用いて停止された後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が測定された。マウス血漿中の抗hIgA抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。この方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウスにおけるGA2-IgG1およびGA2-F1087の血漿中抗体濃度推移を図40に示した。その結果、hIgAと強いpH依存的な結合活性を有するクローンGA2-IgG1はFcγRとの結合を増強したとしても、その血漿中抗体濃度が大きく低下しないことが確認された。
マウスの血漿中hIgA濃度はELISA法にて測定された。まずGoat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)がその各ウェルに分注されたNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)を4℃で1晩静置することによってAnti-Human IgA固相化プレートが作成された。血漿中濃度の標準液として0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mLに調製されたhIgAの検量線試料が用いられた。検量線試料および100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料の各100μLに対し、500ng/mLhsL6Rを200μL加えて混合し、室温で1時間静置した。その後、混合溶液100μLが分注された前記のAnti-Human IgA固相化プレートプレートは室温で1時間静置された。次に、Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)が前記プレートの各ウェルに分注された後、当該プレートを室温で1時間反応させた。更にStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)が前記プレートの各ウェルに分注された後、当該プレートを室温で1時間反応させた。TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いた発色反応が1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)を用いて停止された後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が測定された。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおける血漿中hIgA濃度推移を図41に示した。
(23−1)抗ヒトIgE抗体の取得
pH依存的抗ヒトIgE抗体を取得するために、抗原であるヒトIgE(重鎖配列番号:69、軽鎖配列番号:70)(可変領域は抗ヒトGlypican3抗体からなる)をFreeStyle293(Life Technologies)を用いて発現させた。発現したヒトIgEは当業者公知の一般的なカラムクロマトグラフィー法により精製して、調製された。取得された多数の抗体の中から、ヒトIgEにpH依存的に結合する抗体が選抜された。選抜された抗ヒトIgE抗体の重鎖および軽鎖の可変領域が、ヒトIgG1重鎖定常領域、および、ヒト軽鎖定常領域と融合された抗体遺伝子が組み込まれたベクターを用いて発現した組換え抗ヒトIgE抗体が精製された。作製された抗体はクローン278(以下278-IgG1と表記する、重鎖配列番号:71、軽鎖配列番号:72)と命名された。
エンドソーム内で抗原を解離することができる抗体は、抗原に対してpH依存的に結合するだけでなく、Ca依存的に結合する抗原に結合することによっても創製することが可能である。そこで、278-IgG1およびコントロールとなるpH/Ca依存的IgE結合能を有さないヒトIgG1抗体であるXolair(omalizumab, Novartis)の、ヒトIgE(hIgE)に対するpH依存的結合能およびpH/Ca依存的結合能が評価された。すなわち、Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、278-IgG1およびXolairのhIgEに対する結合活性(解離定数KD (M))が評価された。ランニングバッファーとして以下3種を用いて測定が行われた。
・1.2 mmol/l CaCl2 /0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH7.4
・1.2 mmol/l CaCl2 /0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH5.8
・3 μmol/l CaCl2 /0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH5.8
次に、血漿中からの抗原(ヒトIgE)の消失をさらに増大させることを目的に、pH依存的にヒトIgEに結合する278-IgG1に対してマウスFcγRに対する結合を増強するために278-IgG1のEUナンバリングで表される328位のLeuがTyrに置換された278-F1087(重鎖配列番号:74、軽鎖配列番号:72)をコードするDNA配列が当業者に公知の方法で動物発現用プラスミドに組み込まれた。当該プラスミドが導入された動物細胞を用いて、上述の方法で発現したこれらの抗体改変体の濃度が、その精製後に測定された。
(25−1)In vivo評価用のヒトIgE(hIgE(Asp6))の調製
重鎖(配列番号:75)および軽鎖(配列番号:70)からなるin vivo評価用のヒトIgEであるhIgE (Asp6)(可変領域は抗ヒトGlypican3抗体)は、実施例(23−1)と同様の方法で調製された。hIgE(Asp6)は、ヒトIgEのN型糖鎖のヘテロジェニティーが抗原であるヒトIgEの血漿中濃度推移の影響を受けないようにするために、ヒトIgEの6か所のN型糖鎖結合サイトのアスパラギンがアスパラギン酸に改変された分子である。
実施例2から4および22で、pH依存的に抗原であるヒトIL-6レセプターおよびヒトIgAに結合しマウスFcγRに対する結合が増強された分子が投与されたマウスの血漿中の抗原濃度が大幅に低下したことが示された。マウスFcγR に対する結合を増強した場合に、ヒトIL-6レセプター、およびヒトIgA以外の抗原に対してpH依存的に結合しマウスFcγR に対する結合が増強された抗体が投与された生体の血漿中の可溶型抗原の消失効果が同様に観察されるかについて更なる検証を行うために、ヒトIgEを抗原とする抗体を用いた試験が新たに実施された。
マウス血漿中の抗hIgE抗体濃度はELISA法にて測定された。血漿中濃度として0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mLの検量線試料が調製された。hIgE(Asp6)と抗hIgE抗体の免疫複合体を均一にするため、検量線およびマウス血漿測定試料には、1μg/mLとなるようにhIgE(Asp6)を添加し、278-hIgG1投与群および対応する検量線試料は室温で30分静置させた。また、278-F1087投与群および対応する検量線試料は37℃で一晩攪拌された。静置もしくは攪拌後の検量線およびマウス血漿測定試料をAnti-Human Kappa Light Chain Antibody(Bethyl Laboratories)が固相化されたイムノプレート(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International))に分注し、室温で2時間静置攪拌(278-F1087投与群の試料および278-F1087の検量線試料)もしくは4℃で一晩静置(278-hIgG1投与群の試料および278-hIgG1の検量線試料)させた。その後、Rabbit anti-Human IgG (Fc) Secondary antibody, Biotin conjugate(Pierce Biotechnology)およびStreptavidin-Poly HRP80(Stereospecific Detection Technologies)をそれぞれ1時間順次反応させた。TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いた発色反応を1 N-Sulfuric acid(Showa Chemical)で反応停止後、当該発色をマクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定する方法によってマウス血漿中濃度が測定された。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。この方法で測定された静脈内投与後の血漿中抗体濃度推移を図42に示した。その結果、ヒトIgEに対して強いpH依存的な結合活性を有する278-IgG1のFcγRとの結合が増強された改変体が投与されたマウスにおいて、当該マウスの血漿中における抗体濃度は278-IgG1のそれと比較しても大きく低下しないことが確認された。
マウス血漿中hIgE(Asp6)濃度はELISA法にて測定された。血漿中濃度として192、96、48、24、12、6、3 ng/mLの検量線試料が調製された。hIgE(Asp6)と抗hIgE抗体の免疫複合体を均一にするため、検量線およびマウス血漿測定試料には、278-hIgG1を投与した群では10μg/mLとなるようにXolair(Novartis)を添加し、室温で30分静置させた。278-F1087を投与した群では20μg/mLとなるように278-F1022(重鎖配列番号:76、軽鎖配列番号:72、実施例24と同様に調製)もしくは278-F760(重鎖配列番号:77、軽鎖配列番号:72、実施例A5と同様に調製)を添加し、37℃で60時間攪拌した。マウス血漿測定試料をanti-human IgEが固相化されたイムノプレート(MABTECH)もしくは、anti-human IgE(clone 107、MABTECH)が固相化されたイムノプレート(Nunc F96 MicroWell Plate(Nalge nunc International))に分注し、室温で2時間静置もしくは攪拌もしくは4℃で一晩静置させた。その後、human GPC3 core protein(配列番号:78)、NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific)でbiotin化された抗GPC3抗体(社内調製)、Sterptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)をそれぞれ1時間順次反応させた。TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いた発色反応を1 N-Sulfuric acid(Showa Chemical)で反応停止後、当該発色をマイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定する方法、もしくはSuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)を基質として発光反応を行い、マイクロプレートリーダーにて発光強度を測定する方法によってマウス血漿中濃度が測定された。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度もしくは発光強度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。この方法で測定された静脈内投与後の血漿中hIgE(Asp6)濃度推移を図43に示した。
(26−1)FcγRIIbに対して選択的に結合活性を増強したマウス抗体の抗原消失効果
pH依存的にヒトIL-6レセプターに結合する性質を有するマウスIgG1抗体の重鎖としてVH3-mIgG1(配列番号:49)、軽鎖としてVL3-mk1(配列番号:50)が参考実施例1の方法を用いて作製された。また、VH3-mIgG1のマウスFcγRIIbに対する結合活性を増強するために、EUナンバリングで表される230位のThrがGluに置換され、231位のValがAlaに置換され、232位のProがAsnに置換され、238位のSerがGluに置換され、239位のSerがAspに置換されたVH3-mIgG1-MB367(配列番号:79)が作製された。VH3-mIgG1あるいはVH3-mIgG1-MB367を重鎖として含み、VL3-mk1を軽鎖として含む、Fv4-mIgG1あるいはFv4-mIgG1-MB367が、参考実施例1の方法を用いて発現、精製された。
VH3-mIgG1あるいはVH3-mIgG1-MB367を重鎖として含み、L (WT)-CK(配列番号:42)を軽鎖として含むVH3/L (WT)-mIgG1あるいはVH3/L (WT)-mIgG1-MB367が参考実施例1の方法を用いて発現・精製された。これらの抗体のマウスFcγRに対する結合活性が、参考実施例2の方法で評価され、その結果を表31に示した。また、それぞれの改変体のマウスFcγRに対する結合活性が、改変を加える前のmIgG1に比較して何倍増強しているかを表32に示した。
抗ヒトIL-6レセプター抗体としてFv4-mIgG1あるいはFv4-mIgG1-MB367が投与されたノーマルマウスの血漿中可溶型ヒトIL-6レセプターの消失効果が以下のように検証された。
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)に可溶型ヒトIL-6レセプターおよび抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を同時投与した後の可溶型ヒトIL-6レセプターおよび抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体の体内動態が評価された。可溶型ヒトIL-6レセプターと抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体の混合溶液を尾静脈に10 mL/kgで単回投与した。この際、可溶型ヒトIL-6レセプターは50 μg/kg、抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体は1 mg/kgの用量で投与された。抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体としては、上述のFv4-mIgG1およびFv4-mIgG1-MB367が使用された。抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体投与後5分、7時間、1日、2日、3日、7日、14日、21日、28日が経過した後に当該マウスから採血が行なわれた。採取された血液を直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度はELISA法にて測定された。まず、可溶型ヒトIL-6レセプター をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置することによって可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートが作成された。血漿中濃度として2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 μg/mLの抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を含む検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。これらの検量線試料および血漿測定試料100 μLが各ウェルに分注された可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートを室温で2時間撹拌させた。その後Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody(SIGMA)を室温で2時間反応させた反応液の発色反応が、TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いて行われた。1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)を添加することによって反応が停止された各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が、マイクロプレートリーダーにて測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。その結果を図44に示した。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定した。血漿中濃度として12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.781, 0.391, 0.195 ng/mLに調整したhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)およびトシリズマブ溶液(中外製薬)を混合し37℃で1晩反応させた。その後、0.5%BSA(w/v)を含有したPBS-Tween溶液を用いて5℃で1晩BlockingしたStreptavidin Gold Multi-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery)に分注した。さらに室温で2時間反応させ洗浄後、Read Buffer T(×2)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)で測定を行った。hSIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。その結果を図45に示した。
抗体の可変領域のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする全長の遺伝子の合成は、Assemble PCR等を用いて、当業者公知の方法で作製した。アミノ酸置換の導入はPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen社)、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)、または0.45μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア)またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GEヘルスケア)を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science (1995); 4, 2411-2423)。
FcγRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、FcγRIについてはNCBIのアクセッション番号NM_000566(バージョン番号NM_000566.3)の配列、FcγRIIaについてはNCBIのアクセッション番号NM_001136219(バージョン番号NM_001136219.1)の配列、FcγRIIbについてはNCBIのアクセッション番号NM_004001(バージョン番号NM_004001.3)の配列、FcγRIIIaについてはNCBIのアクセッション番号NM_001127593(バージョン番号NM_001127593.1)の配列、FcγRIIIbについてはNCBIのアクセッション番号NM_000570(バージョン番号NM_000570.3)の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。またFcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIbは多型が存在することが知られているが、FcγRIIaの多型部位はWarmerdamら(J. Exp. Med. (1990) 172, 19-25)、FcγRIIIaの多型部位はWuら(J. Clin. Invest. (1997) 100 (5), 1059-1070)、FcγRIIIbの多型部位はOryら(J. Clin. Invest. (1989) 84, 1688-1691)を参考にして作製した。
〔式3〕
Req: a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI: bulk refractive index contribution in the sample
Rmax: analyte binding capacity of the surface
Claims (22)
- 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、およびEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域を含む抗原結合分子の当該抗原を血漿中から消失させるための使用。
- 前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である請求項1に記載の使用。
- 前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGln、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である請求項2に記載の使用。 - 前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性がカルシウムイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する低カルシウムイオン濃度の条件下での結合活性が、前記抗原に対する高カルシウムイオン濃度の条件下での結合活性よりも低いように結合活性が変化する抗原結合ドメインである、請求項4に記載の使用。
- 前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性がpHの条件によって変化する抗原結合ドメインである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対するpH酸性域の条件下での結合活性がpH中性域の条件下での結合活性よりも低いように結合活性が変化する抗原結合ドメインである、請求項6に記載の使用。
- 前記抗原結合ドメインが抗体の可変領域である、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
- 前記Fc領域が配列番号:14、15、16または17のいずれかに含まれるFc領域においてEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域である請求項1から8のいずれか一項に記載の使用。
- 前記Fc領域のpH酸性域の条件下でのFcRnに対する結合活性が、配列番号:14、15、16または17のいずれかに含まれるFc領域のFcRnに対する結合活性より増強されているFc領域である、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用。
- 前記の増強されているFc領域が、配列番号:14、15、16、または17のいずれかに含まれるFc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位または447位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である請求項10に記載の使用。
- 前記の増強されているFc領域が、配列番号:14、15、16、または17に含まれるFc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される;
244位のアミノ酸がLeu、
245位のアミノ酸がArg、
249位のアミノ酸がPro、
250位のアミノ酸がGlnまたはGluのいずれか、もしくは
251位のアミノ酸がArg、Asp、Glu、またはLeuのいずれか、
252位のアミノ酸がPhe、Ser、Thr、またはTyrのいずれか、
254位のアミノ酸がSerまたはThrのいずれか、
255位のアミノ酸がArg、Gly、Ile、またはLeuのいずれか、
256位のアミノ酸がAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、またはThrのいずれか、
257位のアミノ酸がAla、Ile、Met、Asn、Ser、またはValのいずれか、
258位のアミノ酸がAsp、
260位のアミノ酸がSer、
262位のアミノ酸がLeu、
270位のアミノ酸がLys、
272位のアミノ酸がLeu、またはArgのいずれか、
279位のアミノ酸がAla、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
283位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、またはTyrのいずれか、
285位のアミノ酸がAsn、
286位のアミノ酸がPhe、
288位のアミノ酸がAsn、またはProのいずれか、
293位のアミノ酸がVal、
307位のアミノ酸がAla、Glu、Gln、またはMetのいずれか、
308位のアミノ酸がIle、Pro、またはThrのいずれか、
309位のアミノ酸がPro、
311位のアミノ酸がAla、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser 、Val、またはTrpのいずれか、
312位のアミノ酸がAla、Asp、またはProのいずれか、
314位のアミノ酸がAlaまたはLeuのいずれか、
316位のアミノ酸がLys、
317位のアミノ酸がPro、
318位のアミノ酸がAsn、またはThrのいずれか、
332位のアミノ酸がPhe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、またはTrpのいずれか、
339位のアミノ酸がAsn、Thr、またはTrpのいずれか、
341位のアミノ酸がPro、
343位のアミノ酸がGlu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、またはTyrのいずれか、
375位のアミノ酸がArg、
376位のアミノ酸がGly、Ile、Met、Pro、Thr、またはValのいずれか、
377位のアミノ酸がLys、
378位のアミノ酸がAsp、Asn、またはValのいずれか、
380位のアミノ酸がAla、Asn、Ser、またはThrのいずれか、
382位のアミノ酸がPhe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
385位のアミノ酸がAla、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、またはThrのいずれか、
386位のアミノ酸がArg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
387位のアミノ酸がAla、Arg、His、Pro、Ser、またはThrのいずれか、
389位のアミノ酸がAsn、Pro、またはSerのいずれか、
423位のアミノ酸がAsn、
427位のアミノ酸がAsn、
428位のアミノ酸がLeu、Met、Phe、Ser、またはThrのいずれか、
430位のアミノ酸がAla、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、またはTyrのいずれか、
431位のアミノ酸がHis、またはAsnのいずれか、
433位のアミノ酸がArg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、またはSerのいずれか、
434位のアミノ酸がAla、Gly、His、Phe、Ser、Trp、またはTyrのいずれか、
436位のアミノ酸がArg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、またはThrのいずれか、
438位のアミノ酸がLys、Leu、Thr、またはTrpのいずれか、
440位のアミノ酸がLys、もしくは、
442位のアミノ酸がLys、
の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸である、請求項11に記載の使用。 - 前記抗原結合分子が抗体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用。
- 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメイン、およびEUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域を含む抗原結合分子を含む医薬組成物。
- 前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である請求項15に記載の医薬組成物。 - 以下の(a)から(e)の工程;
(a) 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインを得る工程、
(b) 前記工程(a)で選択された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を得る工程、
(c) 前記工程(b)で得られた遺伝子を、EUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域をコードする遺伝子と作動可能に連結する工程、
(d) 前記工程(c)で作動可能に連結された遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程、
(e) 前記工程(d)で得られた培養液から抗原結合分子を単離する工程、
を含む抗原結合分子の製造方法。 - 前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である請求項17に記載の製造方法。
- 前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である請求項18に記載の製造方法。 - 以下の(a)から(e)の工程;
(a) 抗原に対する結合活性がイオン濃度の条件によって変化する抗原結合ドメインを得る工程、
(b) 前記工程(a)で選択された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を得る工程、
(c) 前記工程(b)で得られた遺伝子を、EUナンバリングで表される238位のアミノ酸がAsp、ならびに271位のアミノ酸がGlyであるFc領域をコードする遺伝子と作動可能に連結する工程、
(d) 前記工程(c)で作動可能に連結された遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程、
(e) 前記工程(d)で得られた培養液から抗原結合分子を単離する工程、
を含む当該抗原結合分子を含む医薬組成物の製造方法。 - 前記Fc領域が、さらにEUナンバリングで表される、233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、および419位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換されているFc領域である請求項20に記載の製造方法。
- 前記Fc領域のEUナンバリングで表される;
233位のアミノ酸がAsp、
234位のアミノ酸がTyr、
237位のアミノ酸がAsp、
264位のアミノ酸がIle、
265位のアミノ酸がGlu、
266位のアミノ酸がPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のアミノ酸がAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
269位のアミノ酸がAsp、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、またはGlnのいずれか、
274位のアミノ酸がGln、
296位のアミノ酸がAsp、またはPheのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、またはAspのいずれか、
327位のアミノ酸がGly、
330位のアミノ酸がLys、またはArgのいずれか、
331位のアミノ酸がSer、
332位のアミノ酸がThr、
333位のアミノ酸がThr、Lys、またはArgのいずれか、
355位のアミノ酸がGln、
356位のアミノ酸がGlu、
358位のアミノ酸がMet、
396位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか、
409位のアミノ酸がArg、
419位のアミノ酸がGlu、
のいずれかひとつ以上であるFc領域である請求項21に記載の製造方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022004759A JP7411698B2 (ja) | 2012-02-24 | 2022-01-17 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2023217513A JP2024038068A (ja) | 2012-02-24 | 2023-12-25 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JPPCT/JP2012/054624 | 2012-02-24 | ||
PCT/JP2012/054624 WO2012115241A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-02-24 | FcγRIIb特異的Fc抗体 |
JP2012185866 | 2012-08-24 | ||
JP2012185866 | 2012-08-24 | ||
JPPCT/JP2012/075092 | 2012-09-28 | ||
PCT/JP2012/075092 WO2013047752A1 (ja) | 2011-09-30 | 2012-09-28 | 抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017085757A Division JP6669688B2 (ja) | 2012-02-24 | 2017-04-25 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022004759A Division JP7411698B2 (ja) | 2012-02-24 | 2022-01-17 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020073557A true JP2020073557A (ja) | 2020-05-14 |
JP7012104B2 JP7012104B2 (ja) | 2022-02-10 |
Family
ID=49005844
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014500939A Active JP6138108B2 (ja) | 2012-02-24 | 2013-02-22 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2017085757A Active JP6669688B2 (ja) | 2012-02-24 | 2017-04-25 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2020000697A Active JP7012104B2 (ja) | 2012-02-24 | 2020-01-07 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2022004759A Active JP7411698B2 (ja) | 2012-02-24 | 2022-01-17 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2023217513A Pending JP2024038068A (ja) | 2012-02-24 | 2023-12-25 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014500939A Active JP6138108B2 (ja) | 2012-02-24 | 2013-02-22 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2017085757A Active JP6669688B2 (ja) | 2012-02-24 | 2017-04-25 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022004759A Active JP7411698B2 (ja) | 2012-02-24 | 2022-01-17 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP2023217513A Pending JP2024038068A (ja) | 2012-02-24 | 2023-12-25 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20160046693A1 (ja) |
EP (2) | EP2818183B1 (ja) |
JP (5) | JP6138108B2 (ja) |
KR (3) | KR102219987B1 (ja) |
CN (2) | CN107266564A (ja) |
AU (3) | AU2013223087B2 (ja) |
BR (1) | BR112014020821B1 (ja) |
CA (1) | CA2865158C (ja) |
DK (1) | DK2818183T3 (ja) |
ES (1) | ES2795419T3 (ja) |
HK (1) | HK1201476A1 (ja) |
MX (2) | MX370668B (ja) |
RU (1) | RU2736349C2 (ja) |
SG (2) | SG11201405137QA (ja) |
TW (4) | TW202015731A (ja) |
WO (1) | WO2013125667A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022270611A1 (ja) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体 |
JP7477127B2 (ja) | 2021-06-25 | 2024-05-01 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体の使用 |
Families Citing this family (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11046784B2 (en) | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
MX369784B (es) | 2007-09-26 | 2019-11-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr). |
CN107551270A (zh) | 2008-04-11 | 2018-01-09 | 中外制药株式会社 | 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子 |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
AU2011283694B2 (en) | 2010-07-29 | 2017-04-13 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
RU2658504C9 (ru) | 2010-11-30 | 2018-08-21 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул |
KR20230005405A (ko) | 2011-02-25 | 2023-01-09 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIb 특이적 Fc 항체 |
CN103827300A (zh) | 2011-06-30 | 2014-05-28 | 中外制药株式会社 | 异源二聚化多肽 |
EP2762493B1 (en) | 2011-09-30 | 2021-06-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
TW201817744A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
US10851178B2 (en) | 2011-10-10 | 2020-12-01 | Xencor, Inc. | Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications |
RU2739792C1 (ru) | 2011-11-30 | 2020-12-28 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Содержащий лекарственное средство переносчик в клетку для формирования иммунного комплекса |
DK2857419T3 (da) * | 2012-05-30 | 2021-03-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-bindende molekyle til eliminering af aggregerede antigener |
TWI797443B (zh) | 2012-05-30 | 2023-04-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗原結合分子之篩選或製造方法 |
EP3597747B1 (en) | 2012-08-24 | 2023-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse fcgammarii-specific fc antibody |
KR20210084688A (ko) | 2012-08-24 | 2021-07-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIb 특이적 Fc영역 개변체 |
ES2876009T3 (es) | 2012-12-27 | 2021-11-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Polipéptido heterodimerizado |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
CA2898100C (en) | 2013-01-14 | 2023-10-10 | Xencor, Inc. | Novel heterodimeric proteins |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
CA2897987A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
AU2014232416B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-09-28 | Xencor, Inc. | Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions |
WO2014163101A1 (ja) | 2013-04-02 | 2014-10-09 | 中外製薬株式会社 | Fc領域改変体 |
US11124576B2 (en) | 2013-09-27 | 2021-09-21 | Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
MX2016007312A (es) | 2013-12-04 | 2017-01-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Moleculas de union al antigeno, cuya actividad de union al antigeno varia de acuerdo con la concentracion de los compuestos y bibliotecas de dichas moleculas. |
BR112016022385A2 (pt) | 2014-03-28 | 2018-06-19 | Xencor, Inc | anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3 |
AU2015292326A1 (en) * | 2014-07-24 | 2017-02-23 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
TN2017000223A1 (en) | 2014-11-26 | 2018-10-19 | Xencor Inc | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
EA037065B1 (ru) | 2014-11-26 | 2021-02-01 | Ксенкор, Инк. | Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38 |
TW201809008A (zh) | 2014-12-19 | 2018-03-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗c5抗體及使用方法 |
TWI808330B (zh) | 2014-12-19 | 2023-07-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法 |
EP3237449A2 (en) | 2014-12-22 | 2017-11-01 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
SG10201907215QA (en) | 2015-02-05 | 2019-09-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof |
TWI805046B (zh) | 2015-02-27 | 2023-06-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途 |
WO2016141387A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
CN113372443A (zh) | 2015-09-18 | 2021-09-10 | 中外制药株式会社 | Il-8-结合抗体及其应用 |
CA3007030A1 (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma |
JP7141336B2 (ja) | 2015-12-25 | 2022-09-22 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体および使用方法 |
US20190263918A1 (en) * | 2016-06-08 | 2019-08-29 | Shanghai Jiao Tong University School Of Medicine | Sequence of antibody heavy chain constant region for enhancing agonistic antibody activity |
CA3026151A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-21 | Xencor, Inc. | Bispecific checkpoint inhibitor antibodies |
KR102306744B1 (ko) | 2016-06-17 | 2021-09-28 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체 및 사용 방법 |
JP7021127B2 (ja) | 2016-06-28 | 2022-02-16 | ゼンコア インコーポレイテッド | ソマトスタチン受容体2に結合するヘテロ二量体抗体 |
SG11201900616UA (en) | 2016-08-02 | 2019-02-27 | Visterra Inc | Engineered polypeptides and uses thereof |
SG11201801024XA (en) | 2016-08-05 | 2018-05-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Therapeutic or preventive compositions for il-8-related diseases |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
AU2017342560B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-03-17 | Xencor, Inc. | IL15/IL15Ralpha heterodimeric Fc-fusion proteins |
US11608374B2 (en) | 2017-01-30 | 2023-03-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-sclerostin antibodies and methods of use |
AU2018255938A1 (en) | 2017-04-21 | 2019-10-31 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-ApoC3 antibodies and methods of use thereof |
US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
WO2019006472A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Xencor, Inc. | TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS |
KR101987272B1 (ko) * | 2017-09-15 | 2019-06-10 | 국민대학교 산학협력단 | Fc 감마 수용체 변이체 MG2A28.1 |
CN107621548A (zh) * | 2017-09-15 | 2018-01-23 | 深圳市因诺赛生物科技有限公司 | 人全血中游离型及细胞结合型总IgE测定诊断试剂盒及制备方法 |
KR101987292B1 (ko) * | 2017-10-12 | 2019-06-10 | 국민대학교 산학협력단 | Fc 감마 수용체 변이체 MG2B45.1 |
KR101987268B1 (ko) * | 2017-10-12 | 2019-06-10 | 국민대학교 산학협력단 | Fc 감마 수용체 변이체 MG2A45 |
KR101987279B1 (ko) * | 2017-10-12 | 2019-06-10 | 국민대학교 산학협력단 | Fc 감마 수용체 변이체 MG2A45.1 |
KR101986252B1 (ko) * | 2017-09-15 | 2019-06-05 | 국민대학교 산학협력단 | Fc 감마 수용체 변이체 MG2A28 |
US10538583B2 (en) | 2017-10-31 | 2020-01-21 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-APOC3 antibodies and compositions thereof |
EP3704148A1 (en) | 2017-10-31 | 2020-09-09 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
CN112272563A (zh) | 2017-11-08 | 2021-01-26 | Xencor股份有限公司 | 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体 |
US11319355B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-05-03 | Xencor, Inc. | Engineered IL-2 Fc fusion proteins |
TWI827585B (zh) | 2018-03-15 | 2024-01-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法 |
CN112469477A (zh) | 2018-04-04 | 2021-03-09 | Xencor股份有限公司 | 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体 |
WO2019204665A1 (en) | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Xencor, Inc. | Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof |
JP2021520829A (ja) | 2018-04-18 | 2021-08-26 | ゼンコア インコーポレイテッド | IL−15/IL−15RA Fc融合タンパク質およびTIM−3抗原結合ドメインを含む、TIM−3標的化ヘテロ二量体融合タンパク質 |
AR114550A1 (es) | 2018-08-10 | 2020-09-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Moléculas de unión al antígeno anti-cd137 y sus usos |
JP2022503959A (ja) | 2018-10-03 | 2022-01-12 | ゼンコア インコーポレイテッド | Il-12ヘテロ二量体fc-融合タンパク質 |
WO2020180726A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3 |
JPWO2020189748A1 (ja) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | ||
CA3164818A1 (en) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific anti-ccl2 antibodies |
TW202144395A (zh) | 2020-02-12 | 2021-12-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子 |
WO2021231976A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3 |
US11919958B2 (en) | 2020-08-19 | 2024-03-05 | Xencor, Inc. | Anti-CD28 compositions |
AU2022232375A1 (en) | 2021-03-09 | 2023-09-21 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6 |
JP2024509274A (ja) | 2021-03-10 | 2024-02-29 | ゼンコア インコーポレイテッド | Cd3及びgpc3に結合するヘテロ二量体抗体 |
AU2022295067A1 (en) | 2021-06-18 | 2023-12-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific anti-ccl2 antibodies |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008505174A (ja) * | 2004-07-15 | 2008-02-21 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化Fc変異体 |
WO2009125825A1 (ja) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | 中外製薬株式会社 | 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子 |
Family Cites Families (72)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
EP0585287B1 (en) | 1990-07-10 | 1999-10-13 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
DE69133476T2 (de) | 1990-08-29 | 2006-01-05 | GenPharm International, Inc., Palo Alto | Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper |
WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
CA2119930C (en) | 1991-09-23 | 2002-10-01 | Hendricus R. J. M. Hoogenboom | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
ES2227512T3 (es) | 1991-12-02 | 2005-04-01 | Medical Research Council | Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago. |
WO1993019172A1 (en) | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
NZ255101A (en) | 1992-07-24 | 1997-08-22 | Cell Genesys Inc | A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor |
US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
AU6819494A (en) | 1993-04-26 | 1994-11-21 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
FR2707189B1 (fr) | 1993-07-09 | 1995-10-13 | Gradient Ass | Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé. |
WO1995015388A1 (en) | 1993-12-03 | 1995-06-08 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
CA2194907A1 (en) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Kouji Matsushima | Reshaped human antibody against human interleukin-8 |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
EP1978033A3 (en) | 1995-04-27 | 2008-12-24 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1997034631A1 (en) | 1996-03-18 | 1997-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobin-like domains with increased half lives |
PL220113B1 (pl) | 1999-01-15 | 2015-08-31 | Genentech Inc | Wariant macierzystego polipeptydu zawierającego region Fc, polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcγR), polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), kompozycja, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania wariantu polipeptydu, zastosowanie wariantu polipeptydu i sposób otrzymywania wariantu regionu Fc |
CA2421447C (en) | 2000-09-08 | 2012-05-08 | Universitat Zurich | Collections of repeat proteins comprising repeat modules |
WO2002032925A2 (en) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
ES2727425T3 (es) | 2000-12-12 | 2019-10-16 | Medimmune Llc | Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas |
US20030157561A1 (en) | 2001-11-19 | 2003-08-21 | Kolkman Joost A. | Combinatorial libraries of monomer domains |
JP4281869B2 (ja) | 2001-06-22 | 2009-06-17 | 中外製薬株式会社 | 抗グリピカン3抗体を含む細胞増殖抑制剤 |
WO2003029462A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins |
US7317091B2 (en) * | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
WO2003104453A1 (ja) | 2002-06-05 | 2003-12-18 | 中外製薬株式会社 | 抗体作製方法 |
US20050260213A1 (en) * | 2004-04-16 | 2005-11-24 | Scott Koenig | Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of use thereof |
WO2004022595A1 (ja) | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | MRL/lprマウスを用いた抗体の作製 |
EP1562972B1 (en) | 2002-10-15 | 2010-09-08 | Facet Biotech Corporation | ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS |
US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
US8388955B2 (en) * | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US8101720B2 (en) * | 2004-10-21 | 2012-01-24 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions |
WO2005037867A1 (en) | 2003-10-15 | 2005-04-28 | Pdl Biopharma, Inc. | ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG |
CA2543360A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Joost A. Kolkman | Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers |
WO2005047327A2 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Biogen Idec Ma Inc. | NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO |
US20050260711A1 (en) | 2004-03-30 | 2005-11-24 | Deepshikha Datta | Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids |
WO2005123780A2 (en) | 2004-04-09 | 2005-12-29 | Protein Design Labs, Inc. | Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
PL1674111T3 (pl) | 2004-07-09 | 2011-04-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Przeciwciała anty-glipikan 3 |
WO2006020114A2 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-23 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Variant fc regions |
RU2367667C2 (ru) | 2004-08-19 | 2009-09-20 | Дженентек, Инк. | Полипептидные варианты с измененной эффекторной функцией |
US20060115485A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-06-01 | Medimmune, Inc. | Methods of preventing and treating RSV infections and related conditions |
JP4652414B2 (ja) | 2004-11-12 | 2011-03-16 | ゼンコー・インコーポレイテッド | FcRnとの変化した結合を有するFc変異体 |
US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
WO2006067847A1 (ja) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
EP1871808A2 (en) | 2005-03-31 | 2008-01-02 | Xencor, Inc. | Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES |
DK3050963T3 (da) | 2005-03-31 | 2019-12-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement |
EP1931709B1 (en) | 2005-10-03 | 2016-12-07 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized fc receptor binding properties |
TW200745163A (en) | 2006-02-17 | 2007-12-16 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Peptides that block the binding of IgG to FcRn |
CA2659574C (en) | 2006-08-02 | 2017-04-25 | The Uab Research Foundation | Methods and compositions related to soluble monoclonal variable lymphocyte receptors of defined antigen specificity |
DK2059536T3 (da) | 2006-08-14 | 2014-04-14 | Xencor Inc | Optimerede antistoffer, der er rettet mod cd19 |
EP3239175A1 (en) | 2007-01-05 | 2017-11-01 | University of Zurich | Method of providing disease-specific binding molecules and targets |
WO2008092117A2 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Xencor, Inc. | Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region |
ES2659517T3 (es) * | 2007-05-30 | 2018-03-16 | Xencor, Inc. | Métodos y composiciones para inhibir células que expresan CD32B |
PL2808343T3 (pl) | 2007-12-26 | 2019-11-29 | Xencor Inc | Warianty Fc ze zmienionym wiązaniem do FcRn |
EP2238156B1 (en) * | 2008-01-29 | 2014-10-01 | Ablynx N.V. | Methods to stabilize proteins and polypeptides |
KR20190104432A (ko) * | 2008-04-25 | 2019-09-09 | 다이액스 코포레이션 | Fcrn에 대한 항체 및 이들의 용도 |
CN110317272A (zh) | 2008-10-14 | 2019-10-11 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 免疫球蛋白变体及其用途 |
RU2650594C1 (ru) | 2009-01-29 | 2018-04-17 | Медиммун, Ллк | Человеческие анти-il-6 антитела с пролонгированным периодом выведения in vivo и их применение при лечении онкологических, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний |
TWI646193B (zh) * | 2009-03-19 | 2019-01-01 | 中外製藥股份有限公司 | 抗體恆定區域改變體 |
EP2233500A1 (en) | 2009-03-20 | 2010-09-29 | LFB Biotechnologies | Optimized Fc variants |
TWI667346B (zh) * | 2010-03-30 | 2019-08-01 | 中外製藥股份有限公司 | 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體 |
RU2658504C9 (ru) | 2010-11-30 | 2018-08-21 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул |
KR20230005405A (ko) * | 2011-02-25 | 2023-01-09 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIb 특이적 Fc 항체 |
WO2012132067A1 (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
AU2012233313C1 (en) * | 2011-03-30 | 2017-08-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule |
AU2012317418B2 (en) * | 2011-09-30 | 2017-09-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule for promoting elimination of antigens |
EP2762493B1 (en) * | 2011-09-30 | 2021-06-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
CN104093424A (zh) * | 2011-09-30 | 2014-10-08 | 中外制药株式会社 | 诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子 |
KR20210084688A (ko) * | 2012-08-24 | 2021-07-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIb 특이적 Fc영역 개변체 |
WO2014133515A1 (en) * | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Arranging elements in a layout |
-
2013
- 2013-02-22 US US14/379,825 patent/US20160046693A1/en not_active Abandoned
- 2013-02-22 TW TW108146154A patent/TW202015731A/zh unknown
- 2013-02-22 CN CN201710422847.2A patent/CN107266564A/zh active Pending
- 2013-02-22 ES ES13751098T patent/ES2795419T3/es active Active
- 2013-02-22 TW TW111101638A patent/TW202231872A/zh unknown
- 2013-02-22 TW TW107102927A patent/TWI682939B/zh active
- 2013-02-22 JP JP2014500939A patent/JP6138108B2/ja active Active
- 2013-02-22 KR KR1020147026038A patent/KR102219987B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-22 SG SG11201405137QA patent/SG11201405137QA/en unknown
- 2013-02-22 KR KR1020227032337A patent/KR20220136441A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-02-22 SG SG10201805584YA patent/SG10201805584YA/en unknown
- 2013-02-22 TW TW102106149A patent/TWI617577B/zh active
- 2013-02-22 EP EP13751098.8A patent/EP2818183B1/en active Active
- 2013-02-22 AU AU2013223087A patent/AU2013223087B2/en active Active
- 2013-02-22 DK DK13751098.8T patent/DK2818183T3/da active
- 2013-02-22 CN CN201380021594.8A patent/CN104244980B/zh active Active
- 2013-02-22 RU RU2014138499A patent/RU2736349C2/ru active
- 2013-02-22 MX MX2014010140A patent/MX370668B/es active IP Right Grant
- 2013-02-22 WO PCT/JP2013/054461 patent/WO2013125667A1/ja active Application Filing
- 2013-02-22 CA CA2865158A patent/CA2865158C/en active Active
- 2013-02-22 EP EP20167071.8A patent/EP3738980A1/en active Pending
- 2013-02-22 BR BR112014020821-2A patent/BR112014020821B1/pt active IP Right Grant
- 2013-02-22 KR KR1020217004640A patent/KR102475951B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-08-22 MX MX2018013128A patent/MX2018013128A/es unknown
-
2015
- 2015-03-03 HK HK15102123.9A patent/HK1201476A1/xx unknown
-
2017
- 2017-04-25 JP JP2017085757A patent/JP6669688B2/ja active Active
-
2018
- 2018-04-16 AU AU2018202643A patent/AU2018202643A1/en not_active Abandoned
- 2018-04-30 AU AU2018202968A patent/AU2018202968B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-07 JP JP2020000697A patent/JP7012104B2/ja active Active
-
2022
- 2022-01-17 JP JP2022004759A patent/JP7411698B2/ja active Active
- 2022-06-30 US US17/854,023 patent/US20230140797A1/en active Pending
-
2023
- 2023-12-25 JP JP2023217513A patent/JP2024038068A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008505174A (ja) * | 2004-07-15 | 2008-02-21 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化Fc変異体 |
WO2009125825A1 (ja) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | 中外製薬株式会社 | 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
IGAWA T. ET AL.: "Antibody recycling by engineered pH-dependent antigen binding improves the duration of antigen neutr", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 28, no. 11, JPN6013019318, 2010, pages 1203 - 1207, XP009153598, ISSN: 0004463142, DOI: 10.1038/nbt.1691 * |
REVERBERI, R. ET AL.: "Factors affecting the antigen-antibody reaction", BLOOD TRANSFUS, vol. 5, JPN6018020750, 2007, pages 227 - 240, XP055069254, ISSN: 0004463141, DOI: 10.2450/2007.0047-07 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022270611A1 (ja) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体 |
JP7472405B2 (ja) | 2021-06-25 | 2024-04-22 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体 |
JP7477127B2 (ja) | 2021-06-25 | 2024-05-01 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体の使用 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7411698B2 (ja) | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 | |
JP6998748B2 (ja) | 抗原の消失を促進する抗原結合分子 | |
WO2012132067A1 (ja) | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 | |
RU2772771C1 (ru) | Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200204 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200204 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20201225 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210311 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210427 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210706 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211216 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220117 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7012104 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |