BR112014020821B1 - Composição farmacêutica e método de produção de uma molécula de ligação a antígeno - Google Patents

Abstract

USO DE MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO PARA ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO ATRAVÉS DE FC(GAMA) RIIB, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEUS MÉTODOS DE PRODUÇÃO. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno contendo (i) um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, (ii) um domínio de ligação a Fc(Gama) tendo atividade de ligação seletiva ao Fc(Gama)RIIb e (iii) um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e métodos de diminuição da concentração plasmática de antígeno quando comparado com antes da administração da molécula, os quais incluem a etapa de administração da molécula.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção fornece usos de moléculas de ligação a antígeno para eliminação de antígenos do plasma; métodos para eliminação de antígenos do plasma os quais compreendem administração de moléculas de ligação a antígeno; composições farmacêuticas compreendendo moléculas de ligação a antígeno que são capazes de eliminação de antígenos do plasma; e métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno para eliminação de antígenos do plasma.

Técnica Antecedente

[002] Anticorpos estão atraindo a atenção como agentes farmacêuticos uma vez que eles são altamente estáveis em plasma e têm poucos efeitos colaterais. No momento, uma série de anticorpos terapêuticos estão disponíveis no mercado e muitos anticorpos terapêuticos estão atualmente sob desenvolvimento (Documentos de Não Patente 1 e 2). Entretanto, várias tecnologias aplicáveis a anticorpos terapêuticos de segunda geração foram relatadas, incluindo aquelas que aumentam a função efetuadora, habilidade de ligação a antígeno, farmacocinética e estabilidade, e aquelas que reduzem o risco de imunogenicidade (Documento de Não Patente 3). Em geral, a dose requerida de um anticorpo terapêutico é muito alta. Isto, por sua vez, leva a problemas tal como alto custo de produção, bem como a dificuldade na produção de formulações subcutâneas. Na teoria, a dose de um anticorpo terapêutico pode ser reduzida aprimorando a farmacocinética do anticorpo ou aprimorando a afinidade entre anticorpos e antígenos.

[003] A literatura reportou métodos para aprimoramento da farmacocinética de anticorpo usando substituição artificial de aminoácidos em regiões constantes (Documentos de Não Patente 4 e 5). Similarmente, maturação por afinidade foi reportada como uma tecnologia para aumento da atividade de ligação a antígeno e/ou atividade de neutralização de antígeno de um anticorpo (Documento de Não Patente 6). Esta tecnologia permite aumento de atividade de ligação a antígeno por meio de introdução de mutações de aminoácido na região CDR de uma região variável ou similar. O aumento de habilidade de ligação a antígeno permite aprimoramento de atividade biológica in vitro ou redução de dosagem e permite ainda aprimoramento de eficácia in vivo (Documento de Não Patente 7).

[004] A capacidade de neutralização de antígeno de uma única molécula de anticorpo tendo atividade de neutralização depende de sua afinidade. Portanto, a afinidade de anticorpos tem sido aumentada usando vários métodos de forma a neutralizar antígenos com uma pequena quantidade de anticorpos (Documento de Não Patente 6). Além disso, se a afinidade do anticorpo pelo antígeno puder ser tornada infinita pela ligação covalente ao antígeno, uma única molécula de anticorpo poderia neutralizar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas moléculas de antígeno). No entanto, a reação de neutralização estequiométrica de uma molécula de anticorpo contra uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente contra dois antígenos) é o limite de tais métodos e, assim, é impossível neutralizar completamente antígeno com uma quantidade de anticorpo menor do que a quantidade de antígeno., Isto é, o efeito de neutralização de antígeno pelo aumento de afinidade tem um limite (Documento de Não Patente 8). Para sustentar o efeito de neutralização de um anticorpo de neutralização durante um determinado período, o anticorpo deve ser administrado em uma dose maior do que a quantidade de antígenos produzida no corpo durante o mesmo período. Apenas com aprimoramento de farmacocinética do anticorpo ou a tecnologia de maturação por afinidade descritos acima há, assim, uma limitação na redução da dose requerida de anticorpo. Consequentemente, a fim de sustentar o efeito de neutralização de antígeno durante um período alvo com uma quantidade de anticorpo menor do que a quantidade de antígeno, um único anticorpo deve neutralizar múltiplos antígenos. Uma molécula de ligação a antígeno que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH e/ou da concentração de íons de metal foi recentemente reportada como um novo método para atingir o objetivo acima (Documentos de Patente 1 e 2). As moléculas de ligação a antígeno dependentes da concentração de íons as quais se ligam fortemente a um antígeno sob condições de pH neutro e/ou alta concentração de íons de cálcio no plasma e dissociam do antígeno sob condições de pH ácido e/ou baixa concentração de íons de cálcio no endossomo, podem dissociar do antígeno no endossomo. Quando uma molécula de ligação a antígeno dependente da concentração de íons se dissocia do antígeno, ela é reciclada para o plasma através do FcRn, podendo se ligar a outro antígeno novamente. Desta maneira, uma única molécula de ligação a antígeno dependente da concentração de íons pode se ligar a uma série de antígenos repetidamente.

[005] Por outro lado, a retenção plasmática de um antígeno é muito curta comparado com anticorpos reciclados via ligação ao FcRn. Contudo, mesmo embora a retenção plasmática do antígeno em si seja curta, quando um anticorpo típico com tal retenção plasmática longa se liga ao antígeno, a retenção plasmática do complexo antígeno-anticorpo é prolongada, similar ao anticorpo. Assim, normalmente, quando um anticorpo é administrado, o antígeno ligado pelo anticorpo existe na forma de um complexo de antígeno-anticorpo, o qual prolonga retenção plasmática do antígeno (antígeno não é facilmente eliminado do plasma) e provoca um aumento da concentração plasmática de antígeno. Por outro lado, uma molécula de ligação a antígeno dependente da concentração de íons suprimir o aumento da concentração plasmática de antígenos pela dissociação do antígeno no endossomo. Contudo, esta supressão de aumento na concentração plasmática de antígenos é afetada pelo equilibro com a quantidade dos antígenos produzidos in vivo. Portanto, a possibilidade de que administração de tais moléculas de ligação a antígeno dependentes da concentração de íons pode elevar a concentração plasmática de antígenos quando comparado com antes de administração foi considerada (Documento de Patente 3).

[006] Recentemente, moléculas de ligação a antígeno que se ligam ao FcRn sob condições neutras foram produzidas. Administração de uma molécula de ligação a antígeno que se liga a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de íons e se liga ao FcRn sob condições neutras revelou que a molécula pode diminuir a concentração plasmática de antígeno quando comparado com antes de administração (Documento de Patente 3). Embora anticorpos típicos aumentem a concentração plasmática de antígeno quando administrados, moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de pH neutro e moléculas de ligação a antígeno que se ligam a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de íons e tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de pH neutro podem diminuir a concentração plasmática de antígeno quando elas são administradas. Uma vez que tais moléculas de ligação a antígeno podem eliminar ativamente antígenos do plasma por meio de endocitose que ocorre como um resultado de ligação ao FcRn, estas moléculas são altamente úteis como produtos farmacêuticos.

[007] Por outro lado, além de FcRn, vários receptores de Fcy (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb e FcyrIIIa) existem como receptores para IgG (Documento de Não Patente 9). Uma vez que a atividade de ligação de anticorpos a receptores de ativação de Fcy exerce um papel importante na citotoxicidade de um anticorpo, anticorpos dirigidos contra antígenos na membrana, cujas citotoxicidades foram aumentadas ao aumentar sua atividade de ligação a receptores de ativação de Fcy foram desenvolvidos até o momento (Documentos de Não Patente 10 e 11). Similarmente, uma vez que a atividade de ligação ao receptor inibidor de Fcy (FcyRIIb) exerce um papel importante na atividade de imunossupressão (Documentos de Não Patente 12, 13 e 14), atividade agonística (Documentos de Não Patente 15 e 16) e similares, anticorpos dirigidos contra antígenos na membrana, os quais têm atividade de ligação aprimorada a receptores inibidores de Fcy, estão sendo estudados (Documentos de Não Patente 17 e 18).

[008] Efeitos de anticorpos que se ligam a antígenos solúveis quando de ligação ao FcyR foram examinados, principalmente do ponto de vista dos efeitos secundários. Por exemplo, sabe-se que o risco de tromboembolismo aumentou em um grupo de pacientes aos quais foi administrado bevacizumab, um anticorpo contra VEGF (Documento de Não Patente 19). Similarmente, tromboembolismo foi observado em testes de desenvolvimento clínico de anticorpos contra o ligante de CD40 e o estudo clínico foi interrompido (Documento de Não Patente 20). FcyRIIa, um receptor de ativação de Fcy, é expresso sobre células de plaquetas, enquanto que um receptor inibidor de Fcy, FcyRIIb, não (Documento de Não Patente 21), e estudos posteriores usando modelos animais e similares têm sugerido que ambos os anticorpos administrados agregam plaquetas via ligação ao FcyRIIa sobre as plaquetas e forma coágulos sanguíneos como um resultado (Documentos de Não Patente 22 e 23). Em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, o qual é uma doença autoimune, plaquetas são ativadas através de um mecanismo dependente de FcyRIIa e foi reportado que a ativação de plaquetas se correlaciona com a gravidade dos sintomas (Documento de Não Patente 24). Além disso, há relatos de que, quando um anticorpo com maior ligação ao FcyRIIb é usado como um produto farmacêutico, uma diminuição no risco de produção de anticorpos pode ser esperada (Documento de Não Patente 25) e um anticorpo que se liga a um antígeno na membrana, cuja ligação ao FcyRIIa foi aumentada, aumenta a fagocitose celular dependente do anticorpo (Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis - ADCP) através de macrófagos e células dendríticas (Documento de Não Patente 26). Contudo, não se sabia que a atividade de ligação a receptores de ativação e/ou inibidores de Fcy de anticorpos dirigidos contra antígenos solúveis tinha um efeito sobre a cinética plasmática de anticorpos ou antígenos ligados pelos anticorpos nos organismos aos quais o anticorpo foi administrado.

[009] Documentos da Técnica Antecedente

[0010] [Documentos de Patente]

[0011] Documento de Patente 1 WO 2009/125825

[0012] Documento de Patente 2 WO 2012/073992

[0013] Documento de Patente 3 WO 2011/122011

[0014] [Documentos de Não Patente]

[0015] Clark, J. Documentos da Técnica Antecedente [Documentos de Patente] Documento de Patente 1 WO 2009/125825 Documento de Patente 2 WO 2012/073992 Documento de Patente 3 WO 2011/122011 [Documentos de Não Patente] [Documento de Não Patente 1] Janice, M. Reichert, Rosensweig, Laura, B. Faden & Matthew, C. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078.

[0016] [Documento de Não Patente 2] Pavlou, A.K,, Belsey, M.J., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur, J, Pharm, Biopharm. (2005); 59(3), 389-396.

[0017] [Documento de Não Patente 3] Kim, S.J., Park, Y., Hong, H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol. Cells. (2005) 20(1), 17-29.

[0018] [Documento de Não Patente 4] Hinton, P.R., Xiong, J.M., Johlfs, M.G., Tang, M.T., Keller, S., Tsurushita, N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176(1), 346-356.

[0019] [Documento de Não Patente 5] Ghetie, V., Popov, S., Borvak, J., Radu, C., Matesoi, D., Medesan, C., Ober, R.J., Ward, E.S., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15(7) 637-640.

[0020] [Documento de Não Patente 6] Rajpal, A., Beyaz, N., Haber, L., Cappuccilli, G., Yee, H., Bhatt, R.R., Takeuchi, T., Lerner, R.A., Crea, R. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102 (24), 8466-8471.

[0021] [Documento de Não Patente 7] Wu, H., Pfarr, D.S., Johnson, S., Brewah, Y.A., Woods, R.M., Patel, N.K., White, W.I., Young, J.F., Kiener, P.A. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J. Mol. Biol. (2007) 368: 652-665.

[0022] [Documento de Não Patente 8] Hanson, C.V., Nishiyama, Y., Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Biotechnol. (2005) 16(6), 631-636.

[0023] [Documento de Não Patente 9] Jefferis, R., Lund, J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models. Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65.

[0024] [Documento de Não Patente 10] Clynes, R., Yoshizumi, T., Moroi, Y., Houghton, A.N. e Ravetech, J.V. Fc Receptors are required for passive and active immunity to melanoma. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95, 625-656.

[0025] [Documento de Não Patente 11] Clynes, R.A., Towers, T.L., Presta, L.G., Ravetech, J.V., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets. Nat. Med. (2000) 6, 443-446.

[0026] [Documento de Não Patente 12] Wernersson S, Karlsson MC, Dahlstrom J, Mattsson R, Verbeek JS, Heyman B., IgG- mediated enhancement of antibody responses is low in Fc receptor gamma chain-deficient mice and increased in Fc gamma RII-deficient mice., J. Immunol. (1999) 163 (2), 618-622.

[0027] [Documento de Não Patente 13] Yuasa T, Kubo S, Yoshino T, Ujike A, Matsumura K, Ono M, Ravetch JV, Takai T., Deletion of fcgamma receptor IIB renders H-2(b) mice susceptible to collagen- induced arthritis., J. Exp. Med. (1999) 189 (1), 187-194.

[0028] [Documento de Não Patente 14] Nakamura A, Yuasa T, Ujike A, Ono M, Nukiwa T, Ravetch JV, Takai T., Fcgamma receptor IIB-deficient mice develop Goodpasture's syndrome upon immunization with type IV collagen: a novel murine model for autoimmune glomerular basement membrane disease., J. Exp. Med. (2000) 191 (5), 899-906.

[0029] [Documento de Não Patente 15] Li F, Ravetch JV., Inhibitory Fcy receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies., Science (2011) 333 (6045), 1030-1034.

[0030] [Documento de Não Patente 16] Wilson NS, Yang B, Yang A, Loeser S, Marsters S, Lawrence D, Li Y, Pitti R, Totpal K, Yee S, Ross S, Vernes JM, Lu Y, Adams C, Offringa R, Kelley B, Hymowitz S, Daniel D, Meng G, Ashkenazi A., An Fcy receptor-dependent mechanism drives antibody-mediated target-receptor signaling in cancer cells., Cancer Cell (2011) 19 (1), 101-113.

[0031] [Documento de Não Patente 17] Moore GL, Chen H, Karki S, Lazar GA., Engineered Fc variant antibodies with enhanced ability to recruit complement and mediate effector functions., Mol. Immunol.(2008) 45, 3926-3933.

[0032] [Documento de Não Patente 18] Li F, Ravetch JV., Apoptotic and antitumor activity of death receptor antibodies require inhibitory Fcy receptor engagement., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (2012) 109 (27), 10966-10971.

[0033] [Documento de Não Patente 19] Scappaticci FA, Skillings JR, Holden SN, Gerber HP, Miller K, Kabbinavar F, Bergsland E, Ngai J, Holmgren E, Wang J, Hurwitz H., Arterial thromboembolic events in patients with metastatic carcinoma treated with chemotherapy and bevacizumab., J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239.

[0034] [Documento de Não Patente 20] Boumpas DT, Furie R, Manzi S, Illei GG, Wallace DJ, Balow JE, Vaishnaw A, A short course of BG9588 (anti-CD40 ligand antibody) improves serologic activity and decreases hematuria in patients with proliferative lupus glomerulonephritis., Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727.

[0035] [Documento de Não Patente 21] Mackay M, Stanevsky A, Wang T, Aranow C, Li M, Koenig S, Ravetch JV, Diamond B., Selective dysregulation of the FcgammaIIB receptor on memory B cells in SLE., J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164.

[0036] [Documento de Não Patente 22] Meyer T, Robles- Carrillo L, Robson T, Langer F, Desai H, Davila M, Amaya M, Francis JL, Amirkhosravi A., Bevacizumab immune complexes activate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181.

[0037] [Documento de Não Patente 23] Robles-Carrillo L, Meyer T, Hatfield M, Desai H, Davila M, Langer F, Amaya M, Garber E, Francis JL, Hsu YM, Amirkhosravi A., Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583.

[0038] [Documento de Não Patente 24] Duffau P, Seneschal J, Nicco C, Richez C, Lazaro E, Douchet I, Bordes C, Viallard JF, Goulvestre C, Pellegrin JL, Weil B, Moreau JF, Batteux F, Blanco P., Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus., Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63.

[0039] [Documento de Não Patente 25] Desai DD, Harbers SO, Flores M, Colonna L, Downie MP, Bergtold A, Jung S, Clynes R., Fc gamma receptor IIB on dendritic cells enforces peripheral tolerance by inhibiting effector T cell responses., J. Immunol. (2007) 178 (10), 6217-6226.

[0040] [Documento de Não Patente 26] Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells., Mol. Cancer Ther. (2008) 7 (8) 2517-2527.

[0041] Sumário da Invenção

[0042] Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

[0043] A presente invenção foi obtida em vista das circunstâncias acima. Conforme mencionado acima, não se sabia que a atividade de ligação a receptores de ativação e/ou inibidores de Fcy de anticorpos dirigidos contra antígenos solúveis tinha um efeito sobre a cinética plasmática de anticorpos ou antígenos ligados pelos anticorpos nos organismos aos quais os anticorpos foram administrados. Mais especificamente, um objetivo da presente invenção é suprimir um aumento na concentração plasmática de um antígeno ligado por uma molécula de ligação a antígeno , por meio de administração da molécula de ligação a antígeno que tem uma atividade de ligação a um antígeno patogênico presente em uma forma solúvel no plasma e comprimido tem uma atividade de ligação desejada a receptores de ativação e/ou inibidores de Fcy. Outro objetivo da presente invenção é otimizar a atividade de ligação a receptores de ativação e/ou inibidores de Fcy de moléculas de ligação a antígeno contra o antígeno causador de doença presente em uma forma solúvel no plasma e, deste modo, otimizar a supressão do aumento na concentração plasmática de antígenos ligados pelas moléculas de ligação a antígeno.

[0044] Meios para Resolver os Problemas

[0045] Especificamente, a presente invenção proporciona moléculas de ligação a antígeno compreendendo (i) um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, (ii) um domínio de ligação ao FcyR tendo atividade de ligação seletiva ao FcyRIIb e (iii) um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições na faixa de pH ácido e métodos para diminuição da concentração plasmática do antígeno quando comparado com antes de administração da molécula de ligação a antígeno o qual compreende a etapa de administração da molécula. Além disso, a presente invenção proporciona agentes para diminuição da concentração plasmática de antígeno os quais compreendem uma molécula de ligação a antígeno compreendendo (i) um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, (ii) um domínio de ligação ao FcyR tendo atividade de ligação seletiva ao FcyRIIb e (iii) um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições na faixa de pH ácido. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem uma molécula de ligação a antígeno compreendendo (i) um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, (ii) um domínio de ligação ao FcyR tendo atividade de ligação seletiva ao FcyRIIb e (iii) um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições na faixa de pH ácido. A presente invenção também proporciona o uso da molécula de ligação a antígeno para diminuição da concentração plasmática de antígeno em que a molécula compreende (i) um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de ions, (ii) um domínio de ligação ao FcyR tendo atividade de ligação seletiva ao FcyRIIb e (iii) um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições na faixa de pH ácido. Além do exposto, a presente invenção fornece métodos de produção e/ou métodos de rastreio de moléculas de ligação a antígeno. Embora não particularmente destinado a limitar a invenção, especificamente, o seguinte é fornecido como uma modalidade não limitativa:

[0046] [1] O uso de uma molécula de ligação a antígeno para eliminação de antígeno do plasma, em que a molécula de ligação a antígeno compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc na qual o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU;

[0047] [2] O uso de acordo com [1], em que a região Fc tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409 e 419, conforme indicado pela numeração EU;

[0048] [3] O uso de acordo com [2], em que o aminoácidos da região Fc incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU:

[0049] Asp na posição de aminoácido 233;

[0050] Tyr na posição de aminoácido 234;

[0051] Asp na posição de aminoácido 237;

[0052] Ile na posição de aminoácido 264;

[0053] Glu na posição de aminoácido 265;

[0054] qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266;

[0055] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267;

[0056] qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268;

[0057] Asp na posição de aminoácido 269;

[0058] qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272;

[0059] Gln na posição de aminoácido 274;

[0060] Asp ou Phe na posição de aminoácido 296;

[0061] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326;

[0062] Gly na posição de aminoácido 327;

[0063] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330; Ser na posição de aminoácido 331;

[0064] Thr na posição de aminoácido 332;

[0065] qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333;

[0066] Gln na posição de aminoácido 355;

[0067] Glu na posição de aminoácido 356;

[0068] Met na posição de aminoácido 358;

[0069] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396;

[0070] Arg na posição de aminoácido 409; e

[0071] Glu na posição de aminoácido 419

[0072] [4] O uso de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação varia dependendo das condições de concentração de íons de cálcio;

[0073] [5] O uso de acordo com [4], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia, de modo que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio é menor do que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio;

[0074] [6] O uso de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de pH;

[0075] [7] O uso de acordo com [6], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia, de modo que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH neutro;

[0076] [8] O uso de acordo com qualquer um de [1] a [7], em que o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anticorpo;

[0077] [9] O uso de acordo com qualquer um de [1] a [8], em que a região Fc é uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU na região Fc incluída em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 ou 17;

[0078] [10] O uso de acordo com qualquer um de [1] a [8], em que a atividade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH ácido é aprimorada quando comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc incluída em qualquer um de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17;

[0079] [11] O uso de acordo com [10], em que a região Fc com ligação aumentada é uma região Fc tendo uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447, conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc incluída em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17;

[0080] [12] O uso de acordo com [11], em que a região Fc com ligação aprimorada compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em:

[0081] Leu na posição de aminoácido 244;

[0082] Arg na posição de aminoácido 245;

[0083] Pro na posição de aminoácido 249;

[0084] Gln ou Glu na posição de aminoácido 250;

[0085] qualquer um de Arg, Asp, Glu e Leu na posição de aminoácido 251;

[0086] qualquer um de Phe, Ser, Thr e Tyr na posição de aminoácido 252;

[0087] Ser ou Thr na posição de aminoácido 254;

[0088] qualquer um de Arg, Gly, Ile e Leu na posição de aminoácido 255;

[0089] qualquer um de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro e Thr na posição de aminoácido 256;

[0090] qualquer um de Ala, Ile, Met, Asn, Ser e Val na posição de aminoácido 257;

[0091] Asp na posição de aminoácido 258; Ser na posição de aminoácido 260;

[0092] Leu na posição de aminoácido 262; Lys na posição de aminoácido 270;

[0093] Leu ou Arg na posição de aminoácido 272;

[0094] qualquer um de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 279;

[0095] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 283;

[0096] Asn na posição de aminoácido 285;

[0097] Phe na posição de aminoácido 286; Asn ou Pro na posição de aminoácido 288;

[0098] Val na posição de aminoácido 293;

[0099] qualquer um de Ala, Glu, Gln e Met na posição de aminoácido 307;

[00100] qualquer um de Ile, Pro e Thr na posição de aminoácido 308;

[00101] Pro na posição de aminoácido 309;

[00102] qualquer um de Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val e Trp na posição de aminoácido 311;

[00103] qualquer um de Ala, Asp e Pro na posição de aminoácido 312;

[00104] Ala ou Leu na posição de aminoácido 314; Lys na posição de aminoácido 316;

[00105] Pro na posição de aminoácido 317;

[00106] Asn ou Thr na posição de aminoácido 318;

[00107] qualquer um de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser e Trp na posição de aminoácido 332;

[00108] qualquer um de Asn, Thr e Trp na posição de aminoácido 339;

[00109] Pro na posição de aminoácido 341;

[00110] qualquer um de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr e Tyr na posição de aminoácido 343;

[00111] Arg na posição de aminoácido 375;

[00112] qualquer um de Gly, Ile, Met, Pro, Thr e Val na posição de aminoácido 376;

[00113] Lys na posição de aminoácido 377;

[00114] qualquer um de Asp, Asn e Val na posição de aminoácido 378;

[00115] qualquer um de Ala, Asn, Ser e Thr na posição de aminoácido 380;

[00116] qualquer um de Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr e na posição de aminoácido 382;

[00117] qualquer um de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser e Thr na posição de aminoácido 385;

[00118] qualquer um de Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser e Thr na posição de aminoácido 386;

[00119] qualquer um de Ala, Arg, His, Pro, Ser e Thr na posição de aminoácido 387;

[00120] qualquer um de Asn, Pro, Ser e na posição de aminoácido 389;

[00121] Asn na posição de aminoácido 423;

[00122] Asn na posição de aminoácido 427;

[00123] qualquer um de Leu, Met, Phe, Ser e Thr na posição de aminoácido 428;

[00124] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 430;

[00125] His ou Asn na posição de aminoácido 431;

[00126] qualquer um de Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro e Ser na posição de aminoácido 433;

[00127] qualquer um de Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp e Tyr na posição de aminoácido 434;

[00128] qualquer um de Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met e Thr na posição de aminoácido 436;

[00129] qualquer um de Lys, Leu, Thr e Trp na posição de aminoácido 438;

[00130] Lys na posição de aminoácido 440; e

[00131] Lys na posição de aminoácido 442,

[00132] conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc incluída em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17;

[00133] [13] O uso de acordo com qualquer um de [1] a [12], em que a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo;

[00134] [14] Uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação a antígeno a qual compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU;

[00135] [15] A composição farmacêutica de acordo com [14], em que a região Fc tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269 , 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409 e 419 conforme indicado pela numeração EU;

[00136] [16] A composição farmacêutica de acordo com [15], em que os aminoácidos da região Fc incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU:

[00137] Asp na posição de aminoácido 233;

[00138] Tyr na posição de aminoácido 234;

[00139] Asp na posição de aminoácido 237;

[00140] Ile na posição de aminoácido 264;

[00141] Glu na posição de aminoácido 265;

[00142] qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266;

[00143] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267;

[00144] qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268;

[00145] Asp na posição de aminoácido 269;

[00146] qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272;

[00147] Gln na posição de aminoácido 274;

[00148] Asp ou Phe na posição de aminoácido 296;

[00149] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326;

[00150] Gly na posição de aminoácido 327;

[00151] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330;

[00152] Ser na posição de aminoácido 331;

[00153] Thr na posição de aminoácido 332;

[00154] qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333;

[00155] Gln na posição de aminoácido 355;

[00156] Glu na posição de aminoácido 356;

[00157] Met na posição de aminoácido 358;

[00158] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396;

[00159] Arg na posição de aminoácido 409; e

[00160] Glu na posição de aminoácido 419;

[00161] [17] Um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno compreendendo as etapas (a) a (e) abaixo:

[00162] obtenção de um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons;

[00163] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação a antígeno selecionado na etapa (a);

[00164] ligação operativa do gene obtido na etapa (b) com um gene que codifica uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU;

[00165] cultura de células hospedeiras que contêm o gene operativamente ligado na etapa (c); e

[00166] isolamento de uma molécula de ligação a antígeno a partir da solução de cultura obtida na etapa (d);

[00167] [18] O método de produção de acordo com [17], em que a região Fc tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269 , 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409 e 419, conforme indicado pela numeração EU;

[00168] [19] O método de produção de acordo com [18], em que os aminoácidos da região Fc incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU:

[00169] Asp na posição de aminoácido 233;

[00170] Tyr na posição de aminoácido 234;

[00171] Asp na posição de aminoácido 237;

[00172] Ile na posição de aminoácido 264;

[00173] Glu na posição de aminoácido 265;

[00174] qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266;

[00175] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267;

[00176] qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268;

[00177] Asp na posição de aminoácido 269;

[00178] qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272;

[00179] Gln na posição de aminoácido 274;

[00180] Asp ou Phe na posição de aminoácido 296;

[00181] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326;

[00182] Gly na posição de aminoácido 327;

[00183] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330;

[00184] Ser na posição de aminoácido 331;

[00185] Thr na posição de aminoácido 332;

[00186] qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333;

[00187] Gln na posição de aminoácido 355;

[00188] Met na posição de aminoácido 356;

[00189] Met na posição de aminoácido 358;

[00190] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396;

[00191] Arg na posição de aminoácido 409; e

[00192] Glu na posição de aminoácido 419;

[00193] [20] Um método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação a antígeno compreendendo as etapas de:

[00194] obtenção de um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons;

[00195] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação a antígeno selecionado na etapa (a);

[00196] ligação operativa do gene obtido na etapa (b) com um gene que codifica uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e o aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly;

[00197] cultura de células hospedeiras que contêm o gene operativamente ligado na etapa (c); e

[00198] (e) isolamento de uma molécula de ligação a antígeno a partir da solução de cultura obtida na etapa (d);

[00199] [21] O processo de produção de acordo com [20], em que a região Fc tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste nas posições 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269 , 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409 e 419, (numeração EU);

[00200] [22] O método de produção de acordo com [21], em que os aminoácidos da região Fc incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU:

[00201] Asp na posição de aminoácido 233;

[00202] Tyr na posição de aminoácido 234;

[00203] Asp na posição de aminoácido 237;

[00204] Ile na posição de aminoácido 264;

[00205] Glu na posição de aminoácido 265;

[00206] qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266;

[00207] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267;

[00208] qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268;

[00209] Asp na posição de aminoácido 269;

[00210] qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272;

[00211] Gln na posição de aminoácido 274;

[00212] Asp ou Phe na posição de aminoácido 296;

[00213] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326;

[00214] Gly na posição de aminoácido 327;

[00215] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330;

[00216] Ser na posição de aminoácido 331;

[00217] Thr na posição de aminoácido 332;

[00218] qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333;

[00219] Gln na posição de aminoácido 355;

[00220] Glu na posição de aminoácido 356;

[00221] Met na posição de aminoácido 358;

[00222] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396;

[00223] Arg na posição de aminoácido 409; e

[00224] Glu na posição de aminoácido 419;

[00225] [23] Um método de eliminação de um antígeno do plasma o qual compreende administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU;

[00226] [24] O método de acordo com [23], em que a região Fc tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272 , 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409 e 419; conforme indicado pela numeração EU;

[00227] [25] O método de acordo com [24], em que os aminoácidos da região Fc incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicado pela numeração EU:

[00228] Asp na posição de aminoácido 233;

[00229] Tyr na posição de aminoácido 234;

[00230] Asp na posição de aminoácido 237;

[00231] Ile na posição de aminoácido 264;

[00232] Glu na posição de aminoácido 265;

[00233] qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266;

[00234] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267;

[00235] qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268;

[00236] Asp na posição de aminoácido 269;

[00237] qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272;

[00238] Gln na posição de aminoácido 274;

[00239] Asp ou Phe na posição de aminoácido 296;

[00240] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326;

[00241] Gly na posição de aminoácido 327;

[00242] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330;

[00243] Ser na posição de aminoácido 331;

[00244] Thr na posição de aminoácido 332;

[00245] qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333;

[00246] Gln na posição de aminoácido 355;

[00247] Glu na posição de aminoácido 356;

[00248] Met na posição de aminoácido 358;

[00249] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396;

[00250] Arg na posição de aminoácido 409; e

[00251] Glu na posição de aminoácido 419;

[00252] [26] O método de acordo com qualquer um de [23] a [25], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons de cálcio;

[00253] [27] O método de acordo com [26], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de modo que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio é menor do que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio;

[00254] [28] O método de acordo com qualquer um de [23] a [25], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de pH;

[00255] [29] O método de acordo com [28], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de modo que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH neutro;

[00256] [30] O método de acordo com qualquer um de [23] a [29], em que o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anticorpo;

[00257] [31] O método de acordo com qualquer um de [23] a [30], em que a região Fc mencionada acima é a região Fc contida em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 ou 17, em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU;

[00258] [32] O método de acordo com qualquer um de [23] a [30], em que a atividade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH ácido é aprimorada quando comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc contida em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 ou 17;

[00259] [33] O método de acordo com [32], em que a região Fc com ligação aumentada é uma região Fc tendo uma substituição de aminoácido em pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste nas posições 244, 245, 249, 250, 251, 252 , 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314 , 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447, conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc contida em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17;

[00260] [34] O método de acordo com de [33], em que a região Fc com ligação aprimorada compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em:

[00261] Leu na posição de aminoácido 244;

[00262] Arg na posição de aminoácido 245;

[00263] Pro na posição de aminoácido 249;

[00264] Gln ou Glu na posição de aminoácido 250;

[00265] qualquer um de Arg, Asp, Glu e Leu na posição de aminoácido 251;

[00266] qualquer um de Phe, Ser, Thr, Tyr e na posição de aminoácido 252;

[00267] Ser ou Thr na posição de aminoácido 254;

[00268] qualquer um de Arg, Gly, Ile e Leu na posição de aminoácido 255;

[00269] qualquer um de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro e Thr na posição de aminoácido 256;

[00270] qualquer um de Ala, Ile, Met, Asn, Ser e Val na posição de aminoácido 257;

[00271] Asp na posição de aminoácido 258;

[00272] Ser na posição de aminoácido 260;

[00273] Leu na posição de aminoácido 262;

[00274] Lys na posição de aminoácido 270;

[00275] Leu ou Arg na posição de aminoácido 272;

[00276] qualquer um de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, Tyr e na posição de aminoácido 279;

[00277] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, Tyr e na posição de aminoácido 283;

[00278] Asn na posição de aminoácido 285;

[00279] Phe na posição de aminoácido 286;

[00280] Asn ou Pro na posição de aminoácido 288;

[00281] Val na posição de aminoácido 293;

[00282] qualquer um de Ala, Glu, Gln e Met na posição de aminoácido 307;

[00283] qualquer um de Ile, Pro e Thr na posição de aminoácido 308;

[00284] Pro na posição de aminoácido 309;

[00285] qualquer um de Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val, Trp e na posição de aminoácido 311;

[00286] qualquer um de Ala, Asp, Pro e na posição de aminoácido 312;

[00287] Ala ou Leu na posição de aminoácido 314;

[00288] Lys na posição de aminoácido 316;

[00289] Pro na posição de aminoácido 317;

[00290] Asn ou Thr na posição de aminoácido 318;

[00291] qualquer um de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser e Trp na posição de aminoácido 332;

[00292] qualquer um de Asn, Thr e Trp na posição de aminoácido 339;

[00293] Pro na posição de aminoácido 341;

[00294] qualquer um de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, Tyr e na posição de aminoácido 343;

[00295] Arg na posição de aminoácido 375;

[00296] qualquer um de Gly, Ile, Met, Pro, Thr, Val e na posição de aminoácido 376;

[00297] Lys na posição de aminoácido 377;

[00298] qualquer um de Asp, Asn e Val e posição de aminoácido 378;

[00299] qualquer um de Ala, Asn, Ser e Thr na posição de aminoácido 380;

[00300] qualquer um de Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr e na posição de aminoácido 382;

[00301] qualquer um de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser e Thr na posição de aminoácido 385;

[00302] qualquer um de Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser e Thr na posição de aminoácido 386;

[00303] qualquer um de Ala, Arg, His, Pro, Ser e Thr na posição de aminoácido 387;

[00304] qualquer um de Asn, Pro, Ser e na posição de aminoácido 389;

[00305] Asn na posição de aminoácido 423;

[00306] Asn na posição de aminoácido 427;

[00307] qualquer um de Leu, Met, Phe, Ser e Thr na posição de aminoácido 428;

[00308] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr e na posição de aminoácido 430;

[00309] His ou Asn na posição de aminoácido 431;

[00310] qualquer um de Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, Ser e na posição de aminoácido 433;

[00311] qualquer um de Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp, Tyr e na posição de aminoácido 434;

[00312] qualquer um de Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met e Thr na posição de aminoácido 436;

[00313] qualquer um de Lys, Leu, Thr e Trp na posição de aminoácido 438;

[00314] Lys na posição de aminoácido 440; e

[00315] Lys na posição de aminoácido 442,

[00316] conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc contida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17; e

[00317] [35] O método de acordo com qualquer um de [23] a [34], em que a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

[00318] Na presente invenção, as expressões a seguir são usadas como sinônimos: "uso de uma molécula de ligação a antígeno para eliminação do antígeno do plasma, em que a molécula de ligação a antígeno compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU"; "um método para tratamento de uma doença causada por um antígeno, o qual compreende administração de uma molécula de ligação a antígeno compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU"; "uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação a antígeno compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU"; "uso de uma molécula de ligação a antígeno na produção de uma composição farmacêutica, em que a molécula de ligação a antígeno compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU"; e "um processo para produção de uma composição farmacêutica o qual compreende uso de uma molécula de ligação a antígeno compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU.

[00319] Breve Descrição dos Desenhos

[00320] A Figura 1 mostra um mecanismo de ação não limitativo para eliminação de antígeno solúvel do plasma através da administração de um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de íons e cuja ligação ao receptor Fcy é aumentada em um pH neutro comparado com os anticorpos de neutralização existentes.

[00321] A Figura 2 mostra um curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humana no plasma de camundongos transgênicos para FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, o qual se liga ao receptor de IL-6 humana de uma maneira dependente do pH, ou H54/L28-IgG1.

[00322] A Figura 3 mostra um curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humana no plasma de camundongos transgênicos para FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, o qual se liga ao receptor de IL-6 humana de uma maneira dependente do pH, Fv4-IgG1-F760, o qual é uma variante de Fv4-IgG que carece de ligação ao FcyR de camundongo, Fv4-IgG1-F1022, o qual é uma variante de Fv4-IgG1 com ligação aumentada ao FcyR de camundongo, ou Fv4-IgG1-Fuc, o qual é um anticorpo Fv4-IgG1 com baixo teor de fucose.

[00323] A Figura 4 mostra um curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humana no plasma de camundongos transgênicos para FcRn humano administrados com Fv4-IgG1 ou moléculas de ligação a antígeno compreendendo, como a cadeia pesada, Fv4-IgG1-F1022 ou Fv4-IgG1-F1093, o qual é uma variante de Fv4-IgG1-F1022 com ligação aprimorada ao FcRn em uma faixa de pH ácido.

[00324] A Figura 5 mostra um curso de tempo da concentração das moléculas de ligação a antígeno administradas no plasma de camundongos transgênicos para FcRn humano administrados com Fv4- IgG1 ou moléculas de ligação a antígeno compreendendo, como a cadeia pesada, Fv-IgG1-F1022 ou Fv4-IgG1-F1093, o qual é uma variante de Fv4-IgG1-F1022 com ligação aprimorada ao FcRn em uma faixa de pH ácido.

[00325] A Figura 6 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 que é uma variante de Fv4-IgG1 com ligação a FcyR de camundongo aumentada (em particular, ligação a FcyRIIb de camundongo e ligação ao FcyRIII de camundongo aumentada) e Fv4-IgG1-F1182 que é um variante de Fv4-IgG1 com ligação a FcyR de camundongo aumentada (em particular, ligação a FcyRI de camundongo aumentada e ligação a FcyRIV de camundongo).

[00326] A Figura 7 mostra um curso de tempo de concentração das moléculas de ligação a antígeno administradas no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4- IgG1, Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412 que são variantes de Fv4-F1087 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.

[00327] A Figura 8 mostra um curso de tempo de concentração das moléculas de ligação a antígeno administradas no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4- IgG1, Fv4-IgG1-F1182 e Fv4-IgG1-F1181 que é uma variante de Fv4- IgG1-F1182 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.

[00328] A Figura 9 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1- F1180 e Fv4-IgG1-F1412 que são variantes de Fv4-IgG1-F1087 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.

[00329] A Figura 10 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 e Fv4- IgG1-F1181 que é uma variante de Fv4-IgG1-F1182 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.

[00330] A Figura 11 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos normais administrados com Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo.

[00331] A Figura 12 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos deficientes em FcyRIII administrados com Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv-4mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo.

[00332] A Figura 13 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc administrados com Fv4-mIgG1, F4-mIgG1- mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo e Fv4- mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo.

[00333] A Figura 14 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos deficientes em FcyRIIb administrados com Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo.

[00334] A Figura 15 mostra um resultado de avaliação da habilidade de agregação de plaqueta do complexo imune de omalizumabe-G1d- v3/IgE pelo ensaio de agregação de plaqueta usando plaquetas derivadas de doadores com alótipo FcyRIIa (R/H).

[00335] A Figura 16 mostra um resultado de avaliação da habilidade de agregação de plaqueta do complexo imune de omalizumabe-G1d- v3/IgE através do ensaio de agregação de plaqueta usando plaquetas derivadas de doadores com alótipo FcyRIIa (H/H).

[00336] A Figura 17 mostra um resultado de avaliação da expressão de CD62p sobre a superfície de membrana de plaquetas lavadas. A área preenchida de preto no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com PBS. A área que não é preenchida no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com complexo imune.

[00337] A Figura 18 mostra um resultado de avaliação da expressão de integrina ativa sobre a superfície da membrana de plaquetas lavadas. A área preenchida de preto no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com PBS. A área que não está preenchida no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com o complexo imune.

[00338] A Figura 19 mostra um gráfico onde o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcyRIIb de cada variante de PD e o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a tipo R de FcyRIIa de cada variante de PD. O valor para a quantidade de ligação de cada variante de PD a cada FcyR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação a IL6R-F652/IL6R-L, que é um anticorpo controle antes da introdução da alteração (IL6R-F652, definido pela SEQ ID NO: 61, é uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma Fc alterada com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp) em cada FcyR; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativo para cada variante de PD a cada FcyR. O gráfico F652 na figura mostra o valor para IL6R-F652/IL6R-L.

[00339] A Figura 20 mostra um gráfico onde o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcyRIIb de variantes produzidas pela introdução de cada alteração em GpH7-B3 (SEQ ID NO: 63)/GpL16-k0 que não tem a alteração de P238D e o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcyRIIb de variantes produzidas através da introdução de cada alteração em IL6R-F652 (SEQ ID NO: 61)/IL6R-L que tem a alteração de P238D. O valor para a quantidade de ligação a FcyRIIb de cada variante foi dividido pelo valor da quantidade de ligação a FcyRIIb do anticorpo pré-alterado; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa. Aqui, a região A contém alterações que exibem o efeito de aumento de ligação a FcyRIIb aumentada em ambos os casos onde uma alteração é introduzida em GpH7-B3/GpL16-k0 que não tem P238D e onde uma alteração é introduzida em IL6R-F652/IL6R-L que tem P238D. A região B contém alterações que exibem o efeito de aumento da ligação a FcyRIIb quando introduzida em GpH7-B3/GpL16- k0 que não tem P238D, mas não exibe o efeito de aumento de ligação a FcyRIIb quando introduzida em IL6R-F652/IL6R-L que tem P238D.

[00340] A Figura 21 mostra uma estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb.

[00341] A Figura 22 mostra uma imagem de superposição da estrutura de cristal do complexo de FcP238D)/região extracelular de FcyRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcyRIIb, com relação à região extracelular de FcyRIIb e o domínio A de CH2 de Fc através do ajuste de quadrados mínimos com base na distância de par de átomo de Cα.

[00342] A Figura 23 mostra comparação da estrutura detalhada em torno de P238D após superposição da estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb e da estrutura modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcyRIIb com relação a apenas o domínio A de CH2 de Fc ou apenas o domínio B de CH2 de Fc através do ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα.

[00343] A Figura 24 mostra que uma ligação hidrogênio pode ser encontrada entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (indicado pela numeração EU) no domínio A de CH2 de Fc e posição Tyr 160 em FcyRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb.

[00344] A Figura 25 mostra que uma interação eletrostática pode ser encontrada entre Asp na posição 270 (indicado pela numeração EU) no domínio B de CH2 de Fc e Arg na posição 131 em FcyRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb.

[00345] A Figura 26 mostra um gráfico onde o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcyRIIb de cada variante 2B e o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a tipo R de FcyRIIa de cada variante 2B. O valor para a quantidade de ligação de cada variante 2B a cada FcyR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação de um anticorpo controle antes da alteração (Fc alterado com substituição de Pro na posição 238 (indicado por numeração EU) com Asp) a cada FcyR; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante 2B com relação a cada FcyR.

[00346] A Figura 27 mostra Glu na posição 233 (indicada pela numeração EU) na Cadeia A de Fc e os resíduos circundantes na região extracelular de FcyRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb.

[00347] A Figura 28 mostra Ala na posição 330 (indicado pela numeração EU) na Cadeia A de Fc e os resíduos circundantes na região extracelular de FcyRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb.

[00348] A Figura 29 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (numeração EU) da Cadeia B de Fc após superposição das estruturas de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcyRIIb e o complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcyR através do ajuste dos quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Ca com relação à cadeia B de Fc.

[00349] A Figura 30 mostra uma imagem do complexo de Fc(P208)/região extracelular de FcyRIIb determinado através de análise de estrutura de cristal de raios X. Para cada um dos domínios CH2 e CH3 na porção Fc, aqueles no lado esquerdo são referidos como domínio A e aqueles no lado direito são referidos como domínio B.

[00350] A Figura 31 mostra comparação após superposição das estruturas do complexo de Fc(P208)/região extracelular de FcyR e do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcyRIIa (código PDB: 3RY6) determinadas através de análise de estrutura de cristal de raios X com relação ao domínio A de CH2 da porção Fc através do ajuste dos quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Ca. No diagrama, a estrutura desenhada com linha grossa mostra o complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb, enquanto a estrutura desenhada com linha fina indica a estrutura de complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIa. Apenas o domínio A de CH2 da porção Fc é desenhado para o complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIa.

[00351] A Figura 32 mostra na estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb uma estrutura detalhada em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio CH2 A da porção Fc, que forma uma ligação hidrogênio com Tyr na posição 160 em FcyRIIb na porção de cadeia principal.

[00352] A Figura 33 mostra na estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb a estrutura de resíduos de aminoácido em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da porção Fc, que forma uma ligação hidrogênio com Tyr na posição 160 em FcyRIIb na porção de cadeia principal.

[00353] A Figura 34 mostra comparação em torno da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU) após superposição das estruturas de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb mostrado no Exemplo 10 e o complexo da Fc (P208)/região extracelular FcyRIIb com relação ao domínio B de CH2 da porção através do ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα. Quando comparado com Fc (P238D), Fc (P208) tem a alternação de H269D na posição 268 (numeração EU) e a alteração P271G na posição 271 (numeração EU) na alça.

[00354] A Figura 35 é um diagrama mostrando a estrutura em torno de Ser239 no domínio B de CH2 da porção Fc na estrutura de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb junto, junto com a densidade de elétrons com coeficiente 2Fo-Fc determinada por análise de estrutura de cristal de raios X.

[00355] A Figura 36 mostra comparação após superposição das estruturas tridimensionais do complexo de Fc (P208)/região extracelular FcyRIIaR e complexo de Fc (P208)/região extracelular FcyRIIb determinado através de análise de estrutura de cristal de raios X através de ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα.

[00356] A Figura 37 mostra comparação em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da porção Fc entre as estruturas de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular FcyRIIaR e o complexo de Fc (P208) região extracelular FcyRIIb, junto com a densidade de elétron com coeficiente 2Fo-Fc determinada através de análise de estrutura de cristal de raios X.

[00357] A Figura 38 mostra comparação em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da porção Fc entre as estruturas de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular FcyRIIaR e o complexo de Fc (P208)/região extracelular FcyRIIb, junto com a densidade de elétron com coeficiente 2Fo-Fc determinada através de análise de estrutura de cristal de raios X.

[00358] A Figura 39 mostra comparação entre as sequências de região constante de G1d e G4d. No diagrama, os aminoácidos circundados com estrutura grossa indicam posições com resíduos de aminoácido ácidos diferentes entre G1d e G4d.

[00359] A Figura 40 mostra a mudança em concentração de anticorpo no plasma de GA2-IgG1 e GA2-F1087 em camundongos normais.

[00360] A Figura 41 mostra a mudança em concentração de hIgA no plasma em camundongos normais administrados com GA2-IgG1 e GA2-F1087.

[00361] A Figura 42 mostra a mudança em concentração de anticorpo no plasma de 278-IgG1 e 278-F1087 em camundongos normais.

[00362] A Figura 43 mostra a mudança em concentração de hIgE (Asp6) no plasma em camundongos C57BL/6J administrados com 278- IgG1 e 278-F1087.

[00363] A Figura 44 mostra um curso de tempo da concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana de camundongo no plasma de camundongos normais administrados com Fv4-mIgG1 e Fv4-mIgG1- MB367, a qual é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação aumentada ao FcyRIIb de camundongo.

[00364] A Figura 45mostra um curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humana solúvel no plasma de camundongos normais administrados com Fv4-mIgG1 e Fv4-mIgG1-MB367, a qual é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação aumentada ao FcyRIIb de camundongo.

[00365] Modo para Realização da Invenção

[00366] As definições e descrição detalhada abaixo são providas para auxiliar na compreensão da presente invenção ilustrada.

[00367] Aminoácidos

[00368] Aqui, aminoácidos são descritos em códigos de uma ou três letras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I ou Val/V

[00369] Alterações de aminoácidos

[00370] Para alterações de aminoácido na sequência de aminoácido de uma molécula de ligação a antígeno, métodos conhecidos tais como métodos de mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados. Adições, deleções e/ou substituições de um aminoácido são adicionadas apropriadamente por esses métodos conhecidos. Substituição de resíduos de aminoácido substituindo um resíduo de aminoácido com outro resíduo de aminoácido para o propósito de alteração de aspectos tais como (a) a (c) a seguir:

[00371] (a) estrutura principal de um polipeptídeo em uma região de estrutura helicoidal ou uma região de estrutura de folha;

[00372] (b) carga ou hidrofobicidade em um sítio alvo; ou

[00373] (c) comprimento de uma cadeia lateral.

[00374] Resíduos de aminoácido são classificados nos grupos que seguem com base nas propriedades de cadeias laterais incluídas em suas estruturas:

[00375] hidrofobicidade: norleucina, Met, Ala, Val, Leu e Ile;

[00376] hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn e Gln;

[00377] ácido: Asp e Glu;

[00378] básico: His, Lys e Arg;

[00379] resíduos que afetam a orientação da cadeia: Gly e Pro; e;

[00380] aromático: Trp, Tyr e Phe.

[00381] Substituição entre resíduos de aminoácido dentre cada um desses grupos é referida como substituição conservativa. Por outro lado, substituição entre resíduos de aminoácido de grupos de aminoácido diferentes é referida como substituição não conservativa. Substituições na presente invenção podem ser substituições conservativas ou substituições não conservativas ou uma combinação de substituições conservativas e não conservativas. Ainda, uma pluralidade de métodos conhecidos pode ser empregada como métodos de alteração de aminoácido para substituição de aminoácidos não nativos (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo um tRNA que tem o aminoácido não nativo ligado a um tRNA supressor âmbar complementar do códon UAG (códon âmbar), que é um dos códons de parada, é adequadamente usado.

[00382] Ainda, uma expressão que usa códigos de aminoácido de uma letra do aminoácido antes da alteração e do aminoácido após a alteração antes e após um número indicando uma posição específica, respectivamente, pode ser usada apropriadamente como uma expressão para uma alteração de aminoácido. Por exemplo, a alteração P238D, que é usada quando substituindo um aminoácido da região Fc incluída em uma região constante de anticorpo, expressa substituição de Pro na posição 238 (de acordo com a numeração EU) com Asp. Isto é, o número mostra a posição do aminoácido de acordo com a numeração EU, o código de aminoácido de uma letra escrito antes do número mostra o aminoácido antes da substituição e o código de aminoácido de uma letra escrito após o número mostra o aminoácido após substituição.

[00383] E/ou

[00384] Conforme aqui usado, o termo "e/ou" significa uma combinação dos termos antes e após a expressão "e/ou" e inclui cada combinação onde "e" e "ou" são adequadamente combinados. Especificamente, por exemplo, "os aminoácidos nas posições 326, 328 e/ou 428 são substituídos" inclui uma variação de alterações dos aminoácidos que seguem: aminoácido(s) na (a) posição 326, (b) posição 328, (c) posição 428, (d) posição 326 e 328, (e) posições 326 e 428, (f) posições 328 e 428 e (g) posições 326, 328 e 428.

[00385] Antígenos

[00386] Aqui, "antígenos" não estão particularmente limitados quanto à sua estrutura, contanto que eles compreendam epítopo aos quais domínios de ligação a antígeno se ligam. Em outras palavras, antígenos podem ser substâncias orgânicas ou inorgânicas. Antígenos incluem por exemplo, as moléculas a seguir: 17-1A, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, Ace-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, alfa-V/beta-1 antagonista, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti- Id, ASPARTIC, peptídeo natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7- 1, B7-2, B7-H, fator de estimulação de linfócito B (BlyS), BACE, BACE- 1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP- 2, BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr- 1, BMP-7 (OP-1), MBP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-1A (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, fator neutrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno associado a câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina Botulínica, toxina Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator regulador de complementaridade (Fator de aceleração de declínio), des (1-3)-IGF-1 (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina, EpCAM, efrina B2/EphB4, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio de estimulação de folículo, factalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio de liberação de hormônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína envelope HCMV gBm, glicoproteína envelope HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus herpes simplex (HSV), glicoproteína gD do HSV, HGFA, antígeno associado a melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 alça V3, HLA, HLA-DR, HM 1,24, HMGF PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-I, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor IgA, IgE, IGF, proteína de ligação a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF- I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)- alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator 1 de crescimento do tipo insulina, alfa2 integrina, alfa3 integrina, alfa4 integrina, alfa4 integrina/beta1, alfa4 integrina/beta7, alfa5 integrina (alfa V), alfa5 integrina/beta1, alfa5 integrina/beta 3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 latente bp1, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis- Y, antígeno associado a Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor da linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASES, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, , MMAC1, MMP, MMP- 1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Mucl), MUC18, substância inibidora Mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou -6, neurturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio paratireoide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placentária (PLAP), PIGF, PLP, PP14, pró-insulina, pré-relaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia A da relaxina, cadeia B da relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albumina do soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, MARCADOR-72 (glicoproteína-72 associada a tumor), TARC, TCA-3, receptor de célula T (por exemplo, receptor de célula T alfa/beta), TdT, TECK, TEMI, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina tipo PLAP do testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF- beta Pan Específico, TGF-betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF- beta5, trombina, Ck-1 do timo, hormônio de estimulação da tireoide, Tie, TIMP, TIQ, fator de tecido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TAC1), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, P55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, P75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR3 TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 P50), TNFRSF6 (Faz Apo-1, APTI, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ligante ODF, ligante OPG), TNFSF12 (TWEAK ligante Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT ligante HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (Conectina TNF- a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSFS5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (ligante CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, antígeno associado a tumor expressando carboidratos associados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, uroquinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Caderina, VE-Caderina-2, VEGFR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno de vírus, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrina, fator von Willebrand, WIF- 1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT76A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PSCK9, pré-calicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, quininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecam-1, Sindecam-2, Sindecam-3, Sindecam-4, LPA e receptores para hormônios e fatores de crescimento.

[00387] Embora receptores sejam citados como exemplos dos antígenos mencionados acima, quando estes receptores existem em formas solúveis em fluidos biológicos, tal como o plasma, eles podem formar complexos com as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Portanto, contanto que os receptores mencionados acima existam em suas formas solúveis em fluidos biológicos, tal como o plasma, eles podem ser usado como antígenos que podem formar complexos da presente invenção através de ligação a uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção. Um exemplo de uma modalidade não limitativa de tal receptor solúvel é IL-6R solúvel, o qual é uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 da sequência polipeptídica de IL-6R de SEQ ID NO: 1, conforme descrito em Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968).

[00388] Antígenos solúveis são citados como exemplos dos antígenos mencionados acima e as soluções nas quais os antígenos existem não estão limitadas. Os antígenos solúveis podem existir em fluidos biológicos ou, mais especificamente, em todos os fluidos que preenchem o espaço entre as células e os tecidos ou vasos em organismos. Em uma modalidade não limitativa, os antígenos aos quais as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam podem estar presentes em fluídos extracelulares. Em vertebrados, fluido extracelular é um termo geral para plasma, líquido intersticial, linfa, tecido conjuntivo compacto, líquido cefalorraquidiano, fluido espinhal, fluido de punção, fluido sinovial ou tais componentes no osso e cartilagem, fluido alveolar (lavado broncoalveolar), fluido peritoneal, fluido pleural, fluido do pericárdio, fluido de cisto, humor aquoso (hidatoide) ou tais fluidos transcelulares (vários fluidos nas cavidades glandulares e fluidos na cavidade do trato digestivo e outros fluidos de cavidades corporais produzidos como um resultado de transporte ativo/atividades secretoras de células).

[00389] Epítopo

[00390] "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antígeno e se refere a um sítio antigênico ao qual o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui apresentada se liga. Desta forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epítopo. Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especificado por sua estrutura de cadeia de açúcar específica.

[00391] Um epítopo linear é um epítopo que contém um epítopo cuja sequência de aminoácidos primária é reconhecida. Tal epítopo linear contém, tipicamente, pelo menos três e o mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 ou 6 a 20 aminoácidos na sua sequência específica.

[00392] Ao contrário do epítopo linear, o "epítopo conformacional" é um epítopo no qual a sequência de aminoácidos primária contendo o epítopo não é o única determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequência de aminoácidos primária de um epítopo conformacional não é necessariamente reconhecida por um anticorpo que define o epítopo). Os epítopos conformacionais podem conter um número maior de aminoácidos em comparação aos epítopos lineares. Um anticorpo que reconhece um epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra e forma uma estrutura tridimensional, as cadeias principais do aminoácido e/ou polipeptídeo que formam um epítopo conformacional ficam alinhados e o epítopo é tornado passível de reconhecimento pelo anticorpo. Os métodos para determinar as conformações do epítopo incluem, por exemplo, cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação spin de sítio-específica, e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limitados a estes. Vide, por exemplo Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).

[00393] Atividade de Ligação

[00394] Exemplos de um método para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R são descritos a seguir. De acordo com os exemplos abaixo, os métodos para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno para um antígeno diferente de IL-6R, também podem ser conduzidos apropriadamente.

[00395] Por exemplo, pode-se confirmar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo linear na molécula de IL-6R, por exemplo, como mencionado abaixo. Um peptídeo linear que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R é sintetizado para o propósito acima. O peptídeo pode ser sintetizado quimicamente, ou pode ser obtido por técnicas de engenharia genética usando uma região que codifica a sequência de aminoácidos que corresponde ao domínio extracelular em um cDNA de IL-6R representado por SEQ ID NO: 2. Então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL- 6R é avaliada para sua atividade de ligação a um peptídeo linear que compreende a sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular. Por exemplo, um peptídeo linear imobilizado pode ser usado como um antígeno por ELISA para avaliar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno ao peptídeo. Alternativamente, a atividade de ligação a um peptídeo linear pode ser avaliada com base no nível com que o peptídeo linear inibe a ligação da molécula de ligação ao antígeno a células que expressam IL-6R. Estes testes podem demonstram a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno ao peptídeo linear.

[00396] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional da seguinte forma. Células que expressam IL-6R são preparadas para o propósito acima. Pode-se determinar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional quando ela se liga fortemente às células que expressam IL-6R mediante contato, mas não se liga substancialmente a um peptídeo linear imobilizado que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R. Na presente invenção, "não se liga substancialmente" significa que a atividade de ligação é 80% ou menos, geralmente, 50% ou menos, de preferência 30% ou menos, e particularmente, de preferência, 15% ou menos em comparação à atividade de ligação às células que expressam IL-6R humano.

[00397] Métodos para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a células que expressam IL-6R incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Especificamente, a avaliação pode ser feita com base no princípio do ELISA ou classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando células que expressam IL-6R como antígeno.

[00398] No formato ELISA, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R às células que expressam IL-6R pode ser avaliada quantitativamente por comparar os níveis de sinal gerado por reação enzimática. Especificamente, um complexo polipeptídico de teste é adicionada a uma placa de ELISA sobre a qual as células que expressam IL-6R são imobilizadas. Então, a molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células é detectada usando um anticorpo marcado com enzima que reconhece a molécula de ligação ao antígeno de teste. Alternativamente, quando FACS é usado, uma série de diluições de uma molécula de ligação ao antígeno de teste é preparada, e o título de ligação do anticorpo para células que expressam IL-6R pode ser determinado para comparar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste às células que expressam IL-6R.

[00399] A ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similares, pode ser detectada usando um citômetro de fluxo. Os citômetros de fluxo conhecido incluem, por exemplo, os seguintes dispositivos:

[00400] FACSCanto® II

[00401] FACSAria®

[00402] FACSArray®

[00403] FACSVantage® SE

[00404] FACSCalibur® (todos são nomes comerciais da BD Biosciences)

[00405] EPICS ALTRA HyPerSort

[00406] Cytomics FC 500

[00407] EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

[00408] Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são nomes comerciais da Beckman Coulter).

[00409] Os métodos preferenciais para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a um antígeno incluem, por exemplo, o seguinte método. Primeiro, células que expressam IL-6R são reagidas com uma molécula de ligação ao antígeno de teste, e, então, elas são coradas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de ligação ao antígeno. A molécula de ligação ao antígeno de teste é diluída apropriadamente um tampão adequado para preparar a molécula em uma concentração desejada. Por exemplo, a molécula pode ser usada em uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. Então, a intensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCalibur (BD). A intensidade de fluorescência é obtida por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticorpo ligado às células. Ou seja, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste, que é representada pela quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada, pode ser determinada mediante a medição do valor geométrico médio.

[00410] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R compartilha um epítopo comum com outra molécula de ligação ao antígeno com base na competição entre as duas moléculas pelo mesmo epítopo. A competição entre as moléculas de ligação ao antígeno pode ser detectada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similares. Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado de preferência.

[00411] Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteína IL-6R imobilizada aos poços de uma placa de microtitulação é pré- incubada na presença ou ausência de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata e, então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste é adicionada a isso. A quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada à proteína IL-6R nos poços está correlacionada indiretamente com a capacidade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo. Ou seja, quanto maior a afinidade da molécula de ligação ao antígeno competidora pelo mesmo epítopo, menor será a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste aos poços revestidos com a proteína IL-6R.

[00412] A quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada aos poços através da proteína IL-6R pode ser facilmente determinada através de marcação da molécula de ligação ao antígeno antecipadamente. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno marcada com biotina é medida usando um conjugado de avidina/peroxidase e um substrato adequado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores de enzima como peroxidase é chamado "ensaio ELISA competitivo". A molécula de ligação ao antígeno também pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem a detecção ou medição. Especificamente, radiomarcadores, marcadores fluorescentes, e similares, são conhecidos.

[00413] Quando a molécula de ligação ao antígeno competidora candidata pode bloquear a ligação por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL- 6R em pelo menos 20%, de preferência ao menos 20 a 50%, e mais preferível pelo menos 50% em comparação à atividade de ligação em um experimento de controle conduzido na ausência do complexo de molécula de ligação ao antígeno competidora, é determinado que a molécula de ligação ao antígeno de teste se liga substancialmente ao mesmo epítopo ligado pela molécula de ligação ao antígeno competidora, ou compete pela ligação ao mesmo epítopo.

[00414] Quando a estrutura de um epítopo ligado por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R já tiver sido identificada, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e controle compartilham um epítopo comum através da comparação das atividades de ligação das duas moléculas de ligação ao antígeno a um peptídeo preparado pela introdução de mutações de aminoácido no peptídeo que forma o epítopo.

[00415] Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle a um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são comparadas no formato ELISA acima. Além dos métodos ELISA, a atividade de ligação ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada por fazer as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle fluírem na coluna, e, então, quantificar a molécula de ligação ao antígeno eluída na solução de eluição. Os métodos para adsorver um peptídeo mutante a uma coluna, por exemplo, sob a forma de um peptídeo de fusão de GST, são conhecidos.

[00416] Alternativamente, quando o epítopo identificado é um epítopo conformacional, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle compartilham um epítopo comum por meio do seguinte método. Primeiro, células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R com uma mutação introduzida no epítopo são preparadas. As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são adicionadas a uma suspensão de células preparada por suspender estas células em um tampão adequado, como PBS. A seguir, as suspensões de células são lavadas apropriadamente com um tampão, e um anticorpo marcado com FITC que reconhece as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é adicionado a elas. A intensidade de fluorescência e o número de células marcadas com o anticorpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são diluídas apropriadamente usando um tampão adequado, e são usadas nas concentrações desejadas. Por exemplo, elas podem ser usadas a uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. A intensidade de fluorescência é determinada por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticorpo marcado ligado às células. Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle, que são representadas pela quantidade de anticorpo marcado ligado, podem ser determinadas mediante a medição do valor geométrico médio.

[00417] No método acima, pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno que "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante", por exemplo, por meio do seguinte método. Primeiro, as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle ligadas às células que expressam IL-6R mutante são marcadas com um anticorpo marcado. Então, a intensidade de fluorescência das células é determinada. Quando FACSCalibur é usado para a detecção da fluorescência por citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência determinada pode ser analisada usando o programa CELL QUEST. A partir dos valores médios geométricos na presença e na ausência do complexo polipeptídico, o valor de comparação ^média-Geo) pode ser calculado de acordo com a seguinte fórmula para determinar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como resultado da ligação pela molécula de ligação ao antígeno.

[00418] Δmédia-Geo= média-Geo (na presença do complexo polipeptídico)/média-Geo (na ausência do complexo polipeptídico)

[00419] O valor de comparação da média geométrica (valor da Δmédia-Geo para a molécula de IL-6R mutante) determinado pela análise acima, que reflete a quantidade de uma molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R mutante, é comparado com o valor de comparação da Δmédia-Geo que reflete a quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R. Nesse caso, as concentrações da molécula de ligação ao antígeno de teste usadas para determinar os valores de comparação da Δmédia-Geo para células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R mutante são particularmente ajustadas, de preferência, para serem iguais ou substancialmente iguais. Uma molécula de ligação ao antígeno que foi confirmada como reconhecendo um epítopo em IL-6R é usada como uma molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00420] Se o valor de comparação da Δmédia-Geo de uma molécula de ligação ao antígeno de teste para células que expressam o IL-6R mutante for menor que o valor de comparação da Δmédia-Geo da molécula de ligação ao antígeno de teste para células que expressam IL-6R em pelo menos 80%, de preferência 50%, mais preferível, 30%, e particularmente, de preferência, 15% então, a molécula de ligação ao antígeno de teste "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante". A fórmula para determinar o valor da média- Geo (média geométrica) está descrita no guia do usuário do programa CELL QUEST (BD Biosciences). Quando a comparação mostra que os valores de comparação são substancialmente equivalentes, pode-se determinar que o epítopo para as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é o mesmo.

[00421] Domínio de Ligação a Antígeno

[00422] Na presente invenção, um "domínio de ligação ao antígeno" pode ter qualquer estrutura contanto que ele se ligue a um antígeno de interesse. Tais domínios incluem, de preferência, por exemplo:

[00423] regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo;

[00424] um módulo de cerca de 35 aminoácidos chamado domínio A que está contido na proteína de membrana celular in vivo Avímero (WO 2004/044011, WO 2005/040229);

[00425] adnectina contendo o domínio 10Fn3 que se liga à porção de proteína da fibronectina, uma glicoproteína expressa sobre a membrana celular (WO 2002/032925);

[00426] um aficorpo que é composto por um feixe de três hélices com 58 aminoácidos com base na estrutura do domínio de ligação à IgG da proteína A (WO 1995/001937);

[00427] proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) que são uma região exposta na superfície molecular das repetições de anquirina (AR) que têm uma estrutura na qual uma subunidade que consiste em uma volta compreendendo 33 resíduos de aminoácido, duas hélices antiparalelas, e um laço é repetidamente empilhada (WO 2002/020565);

[00428] anticalinas e similares, que são domínios que consistem em quatro alças que suportam um lado de uma estrutura de cilindro composta por oito fitas antiparalelas dispostas circularmente que são altamente conservadas entre as moléculas de lipocalina como lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo (NGAL) (WO 2003/029462); e

[00429] a região côncava formada pela estrutura de folha paralela dentro da estrutura com formato de ferradura constituída por repetições empilhadas do módulo de repetições ricas em leucina (LRR) do receptor de linfócito variável (VLR) que não tem a estrutura da imunoglobulina e é usada no sistema de imunidade adquirida em vertebrados sem mandíbulas como o peixe lampery e congro (WO 2008/016854). Os domínios de ligação ao antígeno preferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles tendo regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo. Os exemplos preferenciais de domínios de ligação ao antígeno incluem "Fv de cadeia única (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv 2 de cadeia única (scFv2)", "Fab", e "F(ab’)2".

[00430] Os domínios de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem se ligar a um epítopo idêntico. Tal epítopo pode estar apresentar, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, cada um dos domínios de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção pode se ligar a um epítopo diferente. Na presente invenção, o epítopo diferente pode estar presente, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[00431] "Específico"

[00432] Com relação à ligação de moléculas de ligação a antígeno fornecidas pela presente invenção a um antígeno, o termo "específico" significa que uma das moléculas que se liga especificamente não se liga substancialmente à outras moléculas que não sua única ou inúmeras moléculas parceiras de ligação. Aqui, "não se liga substancialmente" refere-se a mostrar 80% ou menos, geralmente 50% ou menos, de preferência 30% ou menos e, particularmente de preferência, 15% ou menos de atividade de ligação à outras moléculas que não as moléculas parceiras de ligação comparado com a atividade de ligação à(s) molécula(s) parceira(s), conforme descrito na seção mencionada acima sobre atividade de ligação. Além disso, "específico" também é usado quando um domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo particular dentre múltiplos epítopos em um antígeno. Quando um epítopo ligado por um domínio de ligação ao antígeno está contido em múltiplos antígenos diferentes, as moléculas de ligação ao antígeno contendo o domínio de ligação ao antígeno podem se ligar a vários antígenos que possuem o epítopo.

[00433] Atividade de Neutralização

[00434] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, uma composição farmacêutica compreendendo, como um ingrediente ativo, uma molécula de ligação a antígeno tendo atividade de neutralização de antígeno é fornecida, em que a molécula de ligação a antígeno compreende (i) um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, (ii) um domínio de ligação a FcyR tendo atividade de ligação seletiva ao FcyRIIb e (iii) um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido. Em geral, atividade de neutralização se refere à atividade de inibição da atividade biológica de um ligante, tais como vírus e toxinas, tendo atividade biológica sobre células. Desta maneira, substâncias tendo atividade de neutralização se refere a substâncias que se ligam ao ligante ou ao receptor ao qual o ligante se liga, e inibem a ligação entre o ligante e o receptor. Receptores bloqueados de ligação com o ligante pela atividade de neutralização não serão capazes de exibir atividade biológica através deste receptor. Quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, tal anticorpo tendo atividade de neutralização é geralmente chamado um anticorpo de neutralização. Atividade de neutralização de uma substância de teste pode ser medida comparando a atividade biológica na presença de um ligante entre quando a substância de teste está presente e ausente.

[00435] Por exemplo, os principais ligantes possíveis para o receptor de IL-6 incluem preferivelmente IL-6 conforme mostrado na SEQ ID NO: 3. O receptor de IL-6, que é uma proteína de membrana tipo I com seu terminal amino formando o domínio extracelular, forma um heterotetrâmero com um receptor gp130 que foi induzido dimerizar por IL-6 (Heinrich e outros (Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). Formação do heterotetrâmero ativa Jak que está associada com o receptor gp130. Jak sofre autofosforilação e fosforila o receptor. O sítio de fosforilação do receptor e Jak servem como um sítio de ligação para moléculas carregando SH2 pertencentes à família Stat tal como Stat3; MAP quinase; PI3/Akt; e outras proteínas e adaptadores carregando SH2. Em seguida, Stat ligada ao receptor gp130 é fosforilada por Jak. A Stat fosforilada dimeriza e se move para o núcleo, e regula a transcrição de genes alvo. Jak ou Stat pode também estar envolvida em cascatas de sinal via receptores de outras classes. Cascatas de sinal de IL-6 desreguladas são observadas em condições de inflamação e patológicas de doenças autoimunes e cânceres tais como câncer de próstata e mieloma múltiplo. Stat3 que pode agir como um oncogene é constitutivamente ativada em muitos cânceres. Em câncer de próstata e mieloma múltiplo, há uma interferência (crosstalk) entre a cascata de sinalização via o receptor de IL-6 e a cascata de sinalização via os membros da família de receptor de fator de crescimento epitelial (EGFR) (Epithelial Growth Factor Receptor) (Ishikawa e outros (J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46(2), 55-66)).

[00436] Tais cascatas de sinalização intracelular são diferentes para cada tipo de célula; desta maneira, moléculas alvo apropriadas podem ser determinadas para cada célula alvo de interesse e não são limitadas aos fatores mencionados acima. Atividade de neutralização pode ser avaliada através da medição da ativação de sinalização in vivo. Ainda, a ativação de sinalização in vivo pode ser detectada usando como um índice a ação de indução da transcrição de um gene alvo que existe a jusante da cascata de sinalização in vivo. Mudança na atividade de transcrição do gene alvo pode ser detectada pelo princípio de ensaios relatados. Especificamente, um gene repórter tal como proteína verde fluorescente (GFP) (Green Fluorescent Protein) ou luciferase é posto a jusante de uma região promotora ou um fator de transcrição do gene alvo, sua atividade de repórter é medida, e desta maneira mudança na atividade de transcrição pode ser medida como a atividade repórter. Estojos comercialmente disponíveis para medição da ativação de sinalização in vivo podem ser usados apropriadamente (por exemplo, Mercury Pathway Profiling Luciferase System (Clontech)).

[00437] Ainda, para métodos de medição da atividade de receptores/ligantes de neutralização da família de receptor EGF e similar, que normalmente agem sobre cascatas de sinalização que funcionam com relação à promoção de proliferação celular, a atividade de neutralização de anticorpos de neutralização pode ser avaliada através da medição da atividade de proliferação de células alvo. Por exemplo, quando células são promovidas para proliferar por fatores de crescimento da família EGF tal como HB-EGF, o efeito inibidor sobre a proliferação de tais células com base na atividade de neutralização de um anticorpo anti-HB-EGF pode ser adequadamente avaliado ou medido através dos métodos que seguem: Para avaliação ou medição da atividade inibidora de proliferação celular in vitro, um método de medição da incorporação de timidina marcada com [3H] adicionada ao meio por células viáveis como um índice de habilidade de replicação de DNA é usado. Como métodos mais convenientes, um método de exclusão de corante, onde a habilidade de uma célula em excluir um corante tal como azul tripano da célula é medida sob o microscópio, e o método MTT, são usados. O último método faz uso da habilidade de células viáveis em converter MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difenil tetrazólio), que é um sal de tetrazólio, em um produto azul de formazano. Mais especificamente, um anticorpo de teste é adicionado bem como um ligante à solução de cultura de uma célula de teste, e após um certo período de tempo, a solução de MTT é adicionada à solução de cultura e esta é deixada descansar um pouco para incorporação de MTT à célula. Como resultado, MTT, que é um composto amarelo, é convertido em um composto azul pela ação de succinato desidrogenase na mitocôndria da célula. Após dissolução deste produto azul para coloração, sua absorbância é medida e usada como um índice para o número de células viáveis. Em adição a MTT, reagentes tais como MTS, XTT, WST-1 e WST-8 estão também comercialmente disponíveis (Nacalai Tesque e similar) e podem ser adequadamente usados. Para medição da atividade, um anticorpo de ligação que é do mesmo isotipo que o anticorpo anti-HB-EGF, mas não tem a atividade inibidora de proliferação celular, pode ser usado como um anticorpo controle da mesma maneira que o anticorpo anti-HB-EGF, e a atividade pode ser determinada quando o anticorpo anti-HB-EGF mostra atividade inibidora de proliferação de célula mais forte do que o anticorpo controle.

[00438] Células que podem ser preferivelmente usadas para avaliação da atividade incluem, por exemplo, células promovidas para proliferar por HB-EGF, tal como linhagem de célula de câncer ovariano RMG-1, e células Ba/F3 de camundongo que foram transformadas por um vetor para expressão de um gene codificando hEGFR/mG-CSFR, que é uma proteína de fusão onde o domínio extracelular de EGFR humano é fundido em estrutura com o domínio intracelular de receptor de GCSF de camundongo. Desta maneira, aqueles versados na técnica podem selecionar apropriadamente células a serem usadas para avaliar a atividade e usá-las para medir a atividade de proliferação celular conforme mencionado acima.

[00439] Anticorpos

[00440] Na presente invenção, "anticorpo" se refere a uma imunoglobulina natural ou uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou completa. Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais como plasma e soro de ocorrência natural, ou sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpo. Alternativamente, os anticorpos podem ser sintetizados parcial ou completamente usando técnicas como recombinação genética. Os anticorpos preferenciais incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo ou subclasse de imunoglobulina que pertence a isso. As imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes a seguir (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. Destes isotipos, os anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Várias sequências de alótipo de regiões constantes de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana em virtude de polimorfismos genéticos são descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242. Qualquer uma de tais sequências pode ser usada na presente invenção. Em particular para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácido nas posições 356 a 358, conforme indicado pela numeração EU, pode ser ou DEL ou EEM. Várias sequências de alótipo em virtude de polimorfismos genéticos foram descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", Publicação NIH N° 91-3242 para a região constante de IgD (capa) humana e região constante de IgD (Lambda) humana e qualquer uma das sequências pode ser usada na presente invenção. Métodos para produzir um anticorpo com a atividade de ligação desejada são conhecidos pelos versados na técnica. Abaixo está um exemplo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga ao IL-6R (anticorpo anti-IL-6R). Anticorpos que se ligam a antígeno diferente de IL-6R também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito a seguir.

[00441] Os anticorpos anti-IL-6R podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando métodos conhecidos. Os anticorpos anti-IL-6R produzidos são, de preferência, anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Tais anticorpos monoclonais derivados de mamífero incluem anticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que transporta um gene do anticorpo por técnicas de engenharia genética. "Anticorpos humanizados" ou "anticorpos quiméricos" estão incluídos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.

[00442] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal podem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo. Especificamente, mamíferos são imunizados por métodos de imunização convencionais usando uma proteína IL-6R como um antígeno de sensibilização. As células imunes resultantes são fundidas com células parentais conhecidas por métodos de fusão celular convencionais. Então, os hibridomas que produzem um anticorpo anti- IL-6R podem ser selecionados por avaliação das células produtoras de anticorpo monoclonal usando métodos de avaliação convencionais.

[00443] Especificamente, os anticorpos monoclonais são preparados conforme mencionado abaixo. Primeiro, o gene de IL-6R cuja sequência de nucleotídeos é revelada na SEQ ID NO: 2 pode ser expresso para produzir uma proteína IL-6R mostrada na SEQ ID NO: 1, que será usada como um antígeno de sensibilização para a preparação do anticorpo. Ou seja, uma sequência gênica que codifica IL-6R é inserida em um vetor de expressão de conhecido, e as células hospedeiras adequadas são transformadas com este vetor. A proteína IL-6R humana desejada é purificada a partir das células hospedeiras ou seus sobrenadantes de cultura por métodos conhecidos. De modo a obter IL-6R solúvel a partir dos sobrenadantes de cultura, por exemplo, uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 na sequência de polipeptídeos de IL-6R da SEQ ID NO: 15, tal como descrito em Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), é expressa como um IL-6R solúvel, ao invés da proteína IL-6R da SEQ ID NO: 1. A proteína IL-6R nativa purificada também pode ser usada como um antígeno de sensibilização.

[00444] A proteína IL-6R purificada pode ser usada como um antígeno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo de IL-6R parcial pode, também, ser usada como um antígeno de sensibilização. Nesse caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por síntese química com base na sequência de aminoácidos do IL-6R humano, ou por inserir um gene IL-6R parcial em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parcial pode ser produzido por degradar uma proteína IL-6R com uma protease. O comprimento e a região do peptídeo de IL-6R parcial não se limitam a modalidades específicas. Uma região preferencial pode ser selecionada arbitrariamente a partir da sequência de aminoácidos nas posições de aminoácido 20 a 357 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. O número de aminoácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos cinco ou mais, seis ou mais, ou sete ou mais. Mais especificamente, um peptídeo com 8 a 50 resíduos, mais preferível, 10 a 30 resíduos pode ser usado como um antígeno de sensibilização.

[00445] Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é possível usar uma proteína de fusão preparada por fundir um polipeptídeo ou peptídeo parcial desejado da proteína IL-6R com um polipeptídeo diferente. Por exemplo, fragmentos Fc do anticorpo e marcadores de peptídeo são usados, de preferência, para produzir proteínas de fusão a serem usadas como antígenos de sensibilização. Os vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fundir na estrutura genes que codificam dois ou mais fragmentos do polipeptídeo desejado e inserir o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produzir proteínas de fusão são descritos em Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Os métodos para preparar IL-6R para ser usada como um antígeno de sensibilização, e métodos de imunização usando IL-6R são descritos especificamente nos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, e similares.

[00446] Não há limitação específica aos mamíferos a serem imunizados com o antígeno de sensibilização. Entretanto, é preferencial selecionar os mamíferos por considerar sua compatibilidade com as células progenitoras a serem usadas para a fusão celular. Em geral, roedores como camundongos, ratos, e hâmsters, coelhos, e macacos são preferencialmente usados.

[00447] Os animais acima são imunizados com um antígeno de sensibilização através de métodos conhecidos. Em geral, os métodos de imunização realizados incluem, por exemplo, a injeção intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização nos mamíferos. Especificamente, um antígeno de sensibilização é diluído apropriadamente com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou similares. Se for desejado, um adjuvante convencional como adjuvante completo de Freund é misturado com o antígeno, e a mistura é emulsionada. A seguir, o antígeno de sensibilização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias. Veículos adequados podem ser usados na imunização com o antígeno de sensibilização. Em particular, quando um peptídeo parcial de baixo peso molecular é usado como o antígeno de sensibilização, é algumas vezes desejável acoplar o peptídeo do antígeno de sensibilização a uma proteína carreadora como albumina ou hemocianina da lapa californiana para a imunização.

[00448] Alternativamente, hibridomas que produzem um anticorpo desejado podem ser preparados usando imunização com DNA, como mencionado abaixo. A imunização com DNA é um método de imunização que confere estimulação imunológica mediante expressão de um antígeno de sensibilização em um animal imunizado como um resultado da administração de um vetor de DNA construído para permitir a expressão de um gene que codifica a proteína do antígeno no animal. Em comparação aos métodos de imunização convencionais nos quais um antígeno proteico é administrado aos animais a serem imunizados, espera-se que a imunização com DNA seja superior em que:

[00449] - estimulação imunológica pode ser fornecida enquanto se mantém a estrutura de uma proteína da membrana como IL-6R; e

[00450] - não há necessidade de purificar o antígeno para imunização.

[00451] De modo a preparar um anticorpo monoclonal da presente invenção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que expressa uma proteína IL-6R é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que codifica IL-6R pode ser sintetizado por métodos conhecidos como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão adequado, e, então, ele é administrado a um animal a ser imunizado. De preferência, os vetores de expressão usados incluem, por exemplo, vetores de expressão disponíveis comercialmente como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um organismo usando métodos convencionais. Por exemplo, a imunização com DNA é feita pelo uso de uma arma de genes para introduzir as partículas de ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado. Os anticorpos que reconheceram IL-6R também podem ser produzidos pelos métodos descritos no WO 2003/104453.

[00452] Após imunizar um mamífero, conforme descrito acima, o aumento no título de um anticorpo de ligação a IL-6R é confirmado no soro. A seguir, as células imunes são coletadas do mamífero, e, então, submetidas à fusão celular. Em particular, esplenócitos são usados, de preferência, como células imunes.

[00453] Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes acima mencionadas. As células de mieloma compreendem, de preferência, um marcador de seleção adequado para avaliação. Um marcador de seleção confere características às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica. Deficiência em hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como deficiência de HGPRT) e deficiência em timidina quinase (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como deficiência de TK) são conhecidos como marcadores de seleção. Células com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipoxantina-aminopterina-timidina (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como sensibilidade à HAT). As células sensíveis à HAT não sintetizam o DNA em um meio de seleção com HAT e são então mortas. Entretanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção de HAT.

[00454] As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK podem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, 8- azaguanina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como 8AG), ou 5’-bromodeoxiuridina, respectivamente. As células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimidina no seu DNA. Entretanto, células que são deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio de seleção, uma vez que elas não podem incorporar estes análogos de pirimidina. Além disso, um marcador de seleção chamado de resistência à G418 fornecido pelo gene de resistência à neomicina confere resistência aos antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Diversos tipos de células de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos.

[00455] Por exemplo, células de mieloma que incluem as seguintes células podem ser preferencialmente usadas;

[00456] P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);

[00457] P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7);

[00458] NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);

[00459] MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);

[00460] SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);

[00461] FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);

[00462] S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);

[00463] R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

[00464] Fusões celulares entre os imunócitos e células de mieloma são essencialmente executadas usando métodos conhecidos, por exemplo, um método de Kohler e Milstein e outros (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

[00465] Mais especificamente, a fusão celular pode ser executada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente promotor de fusão celular. Os agentes promotores de fusão incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar como sulfóxido de dimetila também é adicionada para aprimorar a eficiência da fusão.

[00466] A razão entre as células imunes e as células de mieloma pode ser determinada como desejado, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos. Os meios de cultura a serem usados para as fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequados para o cultivo de linhagens celulares de mieloma, como meio RPMI1640 e meio MEM, e outro meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular. Além disso, suplemento de soro como soro fetal de bovino (FSB) pode ser adicionado, de preferência, ao meio de cultura.

[00467] Para a fusão celular, quantidades predeterminadas das células imunes acima e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima. A seguir, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) pré-aquecida para cerca de 37°C é adicionada a isto a uma concentração de geralmente 30% a 60% (p/v). Isto é suavemente misturado para produzir as células de fusão desejadas (hibridomas). A seguir, um meio de cultura adequado acima mencionado é adicionado gradualmente às células, e ele é centrifugado repetidamente para remover o sobrenadante. Desta forma, agentes de fusão celular e similares que são desfavoráveis para o crescimento do hibridoma podem ser removidos.

[00468] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados por cultura usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente (tipicamente, o período é vários dias a várias semanas). A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.

[00469] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando um meio de seleção com base no marcador de seleção possuído pelo mieloma usado para a fusão celular. Por exemplo, células deficientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Especificamente, quando as células de mieloma sensíveis a HAT são usadas para a fusão celular, as células fundidas de forma bem-sucedida com as células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT. Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Especificamente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por cultura geralmente por vários dias até várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.

[00470] Os anticorpos desejados podem ser, de preferência, selecionados e clonados isoladamente por métodos de avaliação com base na reação antígeno/anticorpo conhecida. Por exemplo, um anticorpo monoclonal ligação a IL-6R pode se ligar a IL-6R expressa sobre a superfície celular. Tal anticorpo monoclonal pode ser selecionado por seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). O FACS é um sistema que avalia a ligação de um anticorpo a uma superfície celular pela análise das células colocadas em contato com um anticorpo fluorescente usando um feixe de laser, e medindo a fluorescência emitida pelas células individuais.

[00471] Para avaliar hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal da presente invenção por FACS, células que expressam IL- 6R são primeiro preparadas. As células preferencialmente usadas para a seleção são células de mamífero nas quais a IL-6R é expressa de forma forçada. Como controle, a atividade de um anticorpo de se ligar a IL-6R da superfície celular pode ser detectada seletivamente usando células de mamífero não transformadas como células hospedeiras. Especificamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti-IL-6R podem ser isolados pela seleção de hibridomas que produzem um anticorpo que se liga às células forçadas a expressar IL- 6R, mas não às células hospedeiras.

[00472] Alternativamente, a atividade de um anticorpo de se ligar às células que expressam IL-6R imobilizadas pode ser avaliada com base no princípio do ELISA. Por exemplo, células que expressam IL-6R são imobilizadas aos poços de uma placa de ELISA. Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas são colocados em contato com as células imobilizadas nos poços, e os anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detectados. Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, anticorpos ligados às células podem ser detectados usando um anticorpo de imunoglobulina anticamundongo. Os hibridomas que produzem um anticorpo desejado que possui a capacidade de ligação ao antígeno são selecionados pela avaliação acima, e eles podem ser clonados por um método de diluição limitante ou similares.

[00473] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal assim preparados podem ser subcultivados em um meio de cultura convencional, e armazenados em nitrogênio líquido durante um longo período.

[00474] Os hibridomas acima são cultivados por um método convencional, e os anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura. Alternativamente, os hibridomas são administrados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anticorpos monoclonais são preparados a partir da ascite. O método anterior é adequado para preparar anticorpos com alta pureza.

[00475] Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clonados a partir de células que produzem anticorpos como os hibridomas acima também podem ser preferencialmente usados. Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor adequado, e ele é introduzido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene. Os métodos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em vetores, e transformar células hospedeiras já foram estabelecidos, por exemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos, conforme descrito abaixo.

[00476] Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (região V) de um anticorpo anti-IL-6R é preparado a partir de células de hibridoma que expressam o anticorpo anti-IL-6R. Para este propósito, o RNA total é primeiro extraído dos hibridomas. Os métodos usados para a extração de mRNAs das células incluem, por exemplo:

[00477] - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), e

[00478] - o método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156 159).

[00479] Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o kit de purificação de mRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similares. Alternativamente, kits para extrair mRNA total diretamente das células, como o kit de purificação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bioscience) também são comercialmente disponíveis. Os mRNAs podem ser preparados a partir de hibridomas que usam tais kits. Os cDNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs preparados usando uma transcriptase reversa. Os cDNAs podem ser sintetizados usando o kit de síntese de cDNA primeira fita de transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou similares. Além disso, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) e o método 5’-RACE baseado em PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser apropriadamente usados para sintetizar e amplificar cDNAs. Em tal processo de síntese de cDNA, os sítios de enzima de restrição adequados descritos a seguir podem ser introduzidos em ambas as extremidades de um cDNA.

[00480] O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do produto de PCR resultante, e, então, ele é ligado a um DNA vetor. O vetor recombinante é então construído, e introduzido em E. coli ou similares. Após seleção de colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E. coli formadora de colônia. A seguir, testa- se se o vetor recombinante tem a sequência de nucleotídeos de cDNA de interesse por um método conhecido como o método de terminação de cadeia com nucleotídeo didesóxi.

[00481] O método 5’-RACE que usa iniciadores para amplificar o gene da região variável é usado convenientemente para isolar o gene que codifica a região variável. Primeiro, uma biblioteca de cDNA 5’- RACE é construída por síntese de cDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como um molde. Um kit disponível para comercialização como o kit de amplificação de cDNA SMART RACE é usado apropriadamente para sintetizar a biblioteca de cDNA 5’-RACE.

[00482] O gene do anticorpo é amplificado por PCR usando a biblioteca de cDNA 5’-RACE preparada como um molde. Iniciadores para amplificar o gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados com base em sequências do gene do anticorpo conhecidas. As sequências de nucleotídeos dos iniciadores variam dependendo da subclasse de imunoglobulina. Portanto, é preferencial que a subclasse seja determinada com antecedência usando um kit disponível para comercialização como o kit para isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo Iso Strip (Roche Diagnostics).

[00483] Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a amplificação de genes que codificam as cadeias pesadas y1, y2a, y2b, e y3 e as cadeias leves K e y são usados para isolar genes que codificam IgG de camundongo. Em geral, um iniciador que anela a um sítio da região constante próximo da região variável é usado como um iniciador do lado 3’ para amplificar um gene da região variável de IgG. Entretanto, um iniciador ligado a um kit de construção da biblioteca de cDNA 5’ RACE é usado como um iniciador do lado 5’.

[00484] Os produtos de PCR assim amplificados são usados para reformar as imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pesadas e leves. Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando a atividade de ligação de IL-6R de uma imunoglobulina reformada como um indicador. Por exemplo, quando o objetivo é isolar um anticorpo contra IL-6R, é mais preferencial que a ligação do anticorpo a IL-6R seja específica. Um anticorpo ligação a IL-6R pode ser selecionado, por exemplo, por uma das seguintes etapas:

[00485] colocar uma célula que expressa IL-6R em contato com um anticorpo que compreende a região V codificada por um cDNA isolado de um hibridoma;

[00486] detectar a ligação do anticorpo à célula que expressa IL-6R; e

[00487] selecionar um anticorpo que se liga à célula que expressa IL- 6R.

[00488] Métodos para detectar a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R pode ser detectada pelas técnicas descritas acima como FACS. As amostras imobilizadas de células que expressam IL-6R são usadas apropriadamente para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo.

[00489] Os métodos de avaliação de anticorpos preferenciais que usam a atividade de ligação como um indicador incluem, também, métodos de separação usando vetores de fago. Os métodos de avaliação usando vetores de fago são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas das subclasses de cadeia pesada e cadeia leve de uma população de células que expressa um anticorpo policlonal. Os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligante adequada para formar um Fv de cadeia única (scFv). Os fagos que apresentam scFv na sua superfície podem ser produzidos por inserir um gene que codifica scFv em um vetor de fago. Os fagos são colocados em contato com um antígeno de interesse. Então, um codificação de DNA scFv que tem a atividade de ligação de interesse pode ser isolado por coletar os fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repetido conforme necessário para enriquecer o scFv que tem a atividade de ligação de interesse.

[00490] Após o isolamento do cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. As enzimas de restrição preferenciais reconhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na sequência de nucleotídeos do gene do anticorpo em uma baixa frequência. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremidade adesiva é introduzido, de preferência, em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação correta. O cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R é digerido conforme descrito acima, e ele é inserido em um vetor de expressão adequado para construir um vetor de expressão do anticorpo. Nesse caso, se um gene que codifica a região constante do anticorpo (região C) e um gene que codifica a região V acima forem fundidos na estrutura na estrutura, um anticorpo quimérico é obtido. Na presente invenção, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável. Desta forma, em adição aos anticorpos heteroquiméricos de camundongo/seres humanos, anticorpos aloquiméricos humano/humano estão incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico pode ser construído por inserir o gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante. Especificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que corta o gene da região V acima pode ser apropriadamente colocada no lado 5’ de um vetor de expressão que transporta um DNA que codifica uma região constante desejada do anticorpo . Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído por fundir na estrutura os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.

[00491] Para produzir um anticorpo monoclonal anti-IL-6R, os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os genes sejam expressos sob o controle de uma região reguladora da expressão. A região reguladora da expressão para expressão do anticorpo inclui, por exemplo, intensificadores e promotores. Além disso, uma sequência de sinal adequada pode ser ligada à terminação amino para que o anticorpo expresso seja secretado para o lado de fora das células. Nos exemplos descritos abaixo, um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3) pode ser usado como uma sequência de sinal. Entretanto, outras sequências de sinal adequadas podem ser ligadas. O polipeptídeo expresso é clivado na terminação carboxila da sequência acima, e o polipeptídeo resultante é secretado para o lado de fora das células como um polipeptídeo maduro. Então, as células hospedeiras adequadas são transformadas com o vetor de expressão, e células recombinantes que expressam o DNA que codifica o anticorpo anti-IL-6R são obtidas.

[00492] Os DNAs que codificam a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes vetores de expressão para expressar o gene do anticorpo. Uma molécula de anticorpo que tem as cadeias H e L pode ser expressa por cotransfectar a mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são inseridos, respectivamente. Alternativamente, as células hospedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual os DNAs que codificam as cadeias H e L são inseridos (consulte WO 1994/011523).

[00493] Há várias combinações de célula hospedeira/vetor de expressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticorpos isolados em hospedeiros adequados. Todos estes sistemas de expressão são aplicáveis ao isolamento dos domínios de ligação ao antígeno da presente invenção. As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiras incluem células animais, células vegetais, e células fúngicas. Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes células:

[00494] células de mamífero: CHO (linhagem de células de ovário de hâmster Chinês) , COS(linhagem de células de rim de macaco), mieloma (Sp2/O, NS0 e similares), BHK (linhagem de células de rim de hâmster bebê), Hela, Vero, HEK293 (linhagem de células de rim embriônica humana com DNA de adenovírus cisalhado (Ad)5), Freestyle293, células PER.C6 (linhagem de células retinais embriônica humana transformada com o Adenovírus de Tipo 5 (Ad5) genes E1A e E1B) e similares (Current Protocols in Protein Science (Maio de 2001, Unidade 5.9, Tabela 5.9.1));

[00495] células de anfíbio: oócitos de Xenopus, ou similares; e

[00496] células de inseto: sf9, sf21, Tn5 ou similares.

[00497] Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de expressão gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Nicotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido. Células cultivadas do calo podem ser usadas apropriadamente para transformar células vegetais.

[00498] Além disso, as seguintes células podem ser usadas como células fúngicas:

[00499] leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e

[00500] fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, como Aspergillus niger.

[00501] Além disso, os sistemas de expressão de genes de anticorpo que utilizam células procarióticas também são conhecidos. Por exemplo, quando se usa células bacterianas, células de E. coli, células de Bacillus subtilis, e similares, podem ser adequadamente utilizadas na presente invenção. Vetores de expressão transportando os genes de anticorpo de interesse são introduzidos nestas células por transfecção. As células transfectadas são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser preparado a partir da cultura de células transformadas.

[00502] Além das células hospedeiras descritas acima, animais transgênicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante. Ou seja, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene que codifica o anticorpo de interesse é introduzido. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão por inserção na estrutura em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. β-caseina de cabra ou similares pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite. Os fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene do anticorpo são injetados em um embrião de cabra, e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea. Os anticorpos desejados podem ser obtidos como uma proteína fundida com a proteína do leite a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra receptora do embrião (ou sua progênie). Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica, como necessário (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702.

[00503] Quando uma molécula de ligação a antígeno descrita aqui é administrada a seres humanos, um domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi modificado artificialmente para reduzir a antigenicidade heteróloga contra um ser humano e similares, pode ser usada apropriadamente como o domínio de ligação ao antígeno da molécula de ligação a antígeno. Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por exemplo, anticorpos humanizados. Estes anticorpos modificados são produzidos apropriadamente por métodos conhecidos.

[00504] Uma região variável do anticorpo usada para produzir o domínio de ligação ao antígeno de molécula de ligação a antígeno descrita aqui é formada geralmente por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são separadas por quatro regiões estruturais (FRs). A CDR é uma região que determina substancialmente a especificidade de ligação de um anticorpo. As sequências de aminoácidos das CDRs são altamente diversas. Por outro lado, as sequências de aminoácidos formadoras de FR têm frequentemente alta identidade mesmo entre anticorpos com diferentes especificidades de ligação. Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por enxertia de CDR.

[00505] Um anticorpo humanizado também é chamado de anticorpo humano reformado. Especificamente, os anticorpos humanizados preparados por enxertia da CDR de um anticorpo animal não humano, como um anticorpo de camundongo a um anticorpo humano e similares, são conhecidos. Técnicas de engenharia genética comuns para se obter anticorpos humanizados também são conhecidas. Especificamente, por exemplo, PCR por extensão de sobreposição é conhecida como um método para enxertar uma CDR de anticorpo de camundongo em uma FR humana. Na PCR por extensão de sobreposição, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores para sintetizar uma FR de anticorpo humano. Os iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRs. Geralmente se considera que quando se enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, selecionar uma FR humana que tem alta identidade a uma FR de camundongo é vantajoso para manter a função da CDR. Ou seja, é geralmente preferencial usar uma FR humana que compreende uma sequência de aminoácidos que tem alta identidade à sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo a ser enxertadas.

[00506] As sequências de nucleotídeos a serem ligadas são projetadas de modo a estarem conectadas umas às outras na estrutura. As FRs humanas são sintetizadas individualmente usando os respectivos iniciadores. Como resultado, são obtidos produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de camundongo é ligado aos DNAs que codificam a FR individual. Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são projetadas para que elas se sobreponham umas com as outras. A seguir, uma reação de síntese de fita complementar é conduzida para anelar às regiões CDR sobreposta dos produtos sintetizados usando um gene de anticorpo humano como molde. As FRs humanas são ligadas através das sequências de CDR de camundongo por esta reação.

[00507] O gene da região V de extensão completa, no qual três CDRs e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que anelam com a sua extremidade 5’ ou 3’, que são adicionados com sequências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas. Um vetor de expressão para um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserir o DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se liguem na estrutura. Após o vetor recombinante ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer as células recombinantes, as células recombinantes são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura celular (vide publicação de Patente europeia N° EP 239400 e Publicação de Patente internacional No. WO 1996/002576).

[00508] Ao medir qualitativamente ou quantitativamente e avaliar a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima, pode-se selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que as CDRs formem um sítio de ligação ao antígeno favorável quando ligados através das CDRs. Os resíduos de aminoácido nas FRs podem ser substituídos como necessário, para que as CDRs de um anticorpo humano reformado formem um sítio de ligação ao antígeno adequado. Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser introduzidas nas FRs por aplicar o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações parciais na sequência de nucleotídeos podem ser introduzidas em iniciadores que anelam à FR. Mutações na sequência de nucleotídeos são introduzidas nas FRs sintetizadas pelo uso de tais iniciadores. As sequências de FR mutantes que possuem as características desejadas podem ser selecionadas mediante a medição e avaliação da atividade do anticorpo mutante com aminoácido substituído para se ligar ao antígeno pelo método acima mencionado (Cancer Res. (1993) 53: 851856).

[00509] Alternativamente, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos pela imunização de animais transgênicos que possuem todo o repertório de genes de anticorpos humanos (consulte WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.

[00510] Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por separação usando bibliotecas de anticorpos humanos também são conhecidas. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície do fago pelo método de apresentação em fago. Os fagos que expressam um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados. A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada através da análise dos genes dos fagos selecionados. A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada. Um vetor de expressão é preparado por fundir a sequência da região V na estrutura com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado, e inserir isto em um vetor de expressão adequado. O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para expressão, como aquelas descritas acima. O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas células. Estes métodos já são conhecidos (consulte WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

[00511] Além das técnicas descritas acima, técnicas de clonagem de células B (identificação de cada sequência de codificação do anticorpo, clonagem e seu isolamento; uso na construção do vetor de expressão de modo a preparar cada anticorpo (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, em particular); e similares) tal como descrito em Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) ou no WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar os genes de anticorpo.

[00512] Sistema de numeração EU e Sistema de Numeração Kabat

[00513] De acordo com os métodos usados na presente invenção, as posições de aminoácido atribuídas à CDR e à FR do anticorpo são especificadas de acordo com a numeração Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). Na presente invenção, quando uma molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, os aminoácidos da região variável são indicados de acordo com o sistema de numeração Kabat, enquanto os aminoácidos da região constante são indicados de acordo com o sistema de numeração EU com base nas posições de aminoácido de Kabat.

[00514] Condições de Concentração de Íons

[00515] Condições de Concentração de Íons de Metal

[00516] Em uma modalidade da presente invenção, a concentração de íon se refere a uma concentração de íon de metal. "Íons de metal" se refere a íons de elementos do grupo I exceto hidrogênio tais como metais alcalinos e elementos do grupo cobre, elementos do grupo II tais como metais alcalino terrosos e elementos do grupo zinco, elementos do grupo III exceto boro, elementos do grupo IV exceto carbono e silício, elementos do grupo VIII tal como grupo ferro e elementos do grupo platina, elementos pertencentes ao subgrupo A de grupos V, VI e VII, e elementos de metal tais como antimônio, bismuto e polônio. Átomos de metal têm a propriedade de liberação de elétrons de valência para se tornarem cátions. Isso é referido como tendência à ionização. Metais com tendência à ionização forte são considerados ser quimicamente atraentes.

[00517] Na presente invenção, íons de metal preferidos incluem, por exemplo, íon de cálcio. Íon de cálcio está envolvido em modulação de muitos fenômenos biológicos, incluindo contração de músculos tais como músculos esquelético, liso e cardíaco; ativação de movimento, fagocitose e similar de leucócitos; ativação de mudança de formato, secreção e similar de plaquetas; ativação de linfócitos; ativação de mastócitos incluindo secreção de histamina; respostas celulares mediadas por receptor α de catecolamina ou receptor de acetilcolina; exocitose; liberação de substâncias transmissoras dos terminais de neurônio; e fluxo axoplásmico em neurônios. Receptores de íon de cálcio intracelulares conhecidos incluem troponina C, calmodulina, parvalbumina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivados de uma origem comum em termos de evolução molecular. Há também muitos motivos de ligação de cálcio conhecidos. Tais motivos bem conhecidos incluem, por exemplo, domínios de caderina, EF-hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína quinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação sanguínea, lectinas tipo C de receptor asialoglicoproteína e receptor de ligação à manose. Um domínio de receptores LDL, anexina, domínio tipo 3 de trombospondina e domínios tipo EGF.

[00518] Na presente invenção, quando o íon de metal é íon de cálcio, as condições de concentração de íon de cálcio incluem condições de baixa concentração de íons de cálcio e condições de alta concentração de íons de cálcio. "A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção varia dependendo das condições de concentração de íons de cálcio" significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio contido na da molécula de ligação a antígeno varia devido à diferença nas condições entre concentrações de íon de cálcio baixa e alta. Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno pode ser maior sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio. Alternativamente, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, maior sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio.

[00519] Aqui, a concentração de íon de cálcio alta não é particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferivelmente selecionada entre 100 μM e 10 mM. Em outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 μM e 5 mM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 400 μM e 3 mM. Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 μM e 2 mM. Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 400 μM e 1 mM. Em particular, uma concentração selecionada entre 500 μM e 2,5 mM, que é próxima da concentração de íon de cálcio no plasma (sangue) in vivo, é preferida.

[00520] Aqui, a concentração de íon de cálcio baixa não é particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferivelmente selecionada entre 0,1 μM e 30 μM. Em outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,2 μM e 20 μM. Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,5 μM e 10 μM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 1 μM e 5 μM. Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 2 μM e 4 μM. Em particular, uma concentração selecionada entre 1 μM e 5 μM, que é próxima da concentração de cálcio ionizado em endossomos iniciais in vivo, é preferida.

[00521] Na presente invenção , "a atividade de ligação a antígeno é menor sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio" significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio da presente invenção é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 0,1 μM e 30 μM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 100 μM e 10 mM. Preferivelmente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio da presente invenção é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 0,5 μM e 10 μM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 200 μM e 5 mM. Ela significa particularmente preferivelmente que a atividade de ligação a antígeno na concentração de íon de cálcio no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que aquela na concentração de íon de cálcio no plasma in vivo; e especificamente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio é mais fraca em concentração de íon de cálcio selecionada entre 1 μM e 5 μM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 500 μM e 2,5 mM.

[00522] Se a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio é mudada dependendo de concentrações de íon de metal pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "Atividade de Ligação" acima. Por exemplo, a fim de confirmar que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno se torna maior sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio do que em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio, a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno sob condições de alta e baixa concentrações de íons de cálcio é comparada.

[00523] Na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio" pode também ser expressa como "a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio é maior sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio do que em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio". Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio" é algumas vezes escrita como "a habilidade de ligação a antígeno é mais fraca em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio". Também, "a atividade de ligação a antígeno em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio é reduzida para ser menor do que aquela sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio" pode ser escrita como "a habilidade de ligação a antígeno em uma condição de baixa concentração de íons de cálcio é tornada mais fraca do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio".

[00524] Quando determinando a atividade de ligação a antígeno, as condições outras que não concentração de íon de cálcio podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica e não são particularmente limitadas. Por exemplo, a atividade pode ser determinada a 37°C em tampão HEPES. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar pode ser usado para a determinação. Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio pode ser avaliada fluindo o antígeno como um analito sobre um chip no qual a molécula de ligação a antígeno é imobilizada. Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno para o antígeno de membrana pode ser avaliada fluindo a molécula de ligação a antígeno como um analito sobre um chip no qual o antígeno é imobilizado.

[00525] Contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção seja mais fraca sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio, a razão da atividade de ligação a antígeno entre uma condição de baixa e alta concentração de íons de cálcio não é particularmente limitada; . Contudo, a razão da KD (constante de dissociação) da molécula de ligação a antígeno sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio em relação à KD sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio, isto é, o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM) é, de preferência, 2 ou mais; mais preferivelmente 10 ou mais e, ainda mais preferivelmente, 40 ou mais. O limite superior do valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000, contanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas por aqueles versados no campo.

[00526] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a KD (constante de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, KD aparente (constante de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade. KD (constante de dissociação) e KD aparente (constante de dissociação aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo.

[00527] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser também preferivelmente usada como um índice para representar a razão da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio da presente invenção entre concentrações de cálcio baixa e alta. Quando a constante de taxa de dissociação (kd) é usada ao invés da constante de dissociação (KD) como um índice para representar a razão de atividade de ligação, a razão da constante da taxa de dissociação (kd) entre concentrações de cálcio baixa e alta, isto é, o valor de kd (condição de baixa concentração de cálcio)/kd (condição de alta concentração de cálcio), é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente ainda 10 ou mais, e ainda mais preferivelmente 30 ou mais. O limite superior do valor de Kd (concentração de cálcio baixa)/kd (condição de alta concentração de cálcio) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200 contanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.

[00528] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a kd (constante da taxa de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a kd aparente (constante da taxa de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno. A kd (constante da taxa de dissociação) e a kd aparente (constante da taxa de dissociação aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare) ou citometria de fluxo. Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio é determinada em concentrações de íon de cálcio diferentes, é preferível usar as mesmas condições exceto para concentrações de cálcio.

[00529] Os métodos descritos no documento WO 2012/073992 (por exemplo, parágrafos 0200-0213) e similares podem ser apresentados como exemplos de um método de triagem de uma molécula de ligação a antígeno ou domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio é menor do que sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio, a qual é uma modalidade proporcionada presente invenção.

[00530] Bibliotecas

[00531] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode ser obtido de uma biblioteca que é principalmente composta de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno têm pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon. As concentrações de íon incluem preferivelmente, por exemplo, concentração de íon de metal e concentração de íon de hidrogênio.

[00532] Aqui, uma "biblioteca" se refere a uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antígeno ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando suas sequências. As sequências de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca não são idênticas, mas são diferentes uma das outras.

[00533] Aqui, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" na expressão "uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca são diferentes umas das outras. Especificamente, em uma biblioteca, o número de sequências diferentes umas das outras reflete o número de clones independentes com sequências diferentes e pode também ser referido como "tamanho da biblioteca". O tamanho da biblioteca de uma biblioteca de exibição de fago convencional varia de 106 a 1012. O tamanho da biblioteca pode ser aumentado até 1014 através do uso de técnicas conhecidas tal como exibição de ribossomo. No entanto, o número real de partículas de fago usadas em seleção por "separação" de uma biblioteca de fago é em geral 10-10000 vezes maior do que o tamanho da biblioteca. Essa multiplicidade em excesso é também referida como "o número de equivalentes de biblioteca" e significa que há 10 a 10.000 clones individuais que têm mesma sequência de aminoácido. Desta maneira, na presente invenção, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno independentes em uma biblioteca, excluindo equivalentes de biblioteca, são diferentes umas das outras. Mais especificamente, o acima significa que há 106 a 1014 moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras, preferivelmente 107 a 102 moléculas, mais preferivelmente 108 a 1011 e particularmente preferivelmente 108 a 1010 cujas sequências são diferentes umas das outras.

[00534] Na presente invenção, a expressão "uma pluralidade de" na expressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno" geralmente se refere a, no caso de, por exemplo, moléculas de ligação a antígeno, polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo, vetores ou vírus da presente invenção, um grupo de dois ou mais tipos da substância. Por exemplo, quando duas ou mais substâncias são diferentes umas das outras em uma característica particular, isso significa que há dois ou mais tipos da substância. Tais exemplos podem incluir, por exemplo, aminoácidos mutantes observados em posições de aminoácido específicas em uma sequência de aminoácido. Por exemplo, quando há duas ou mais moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos resíduos flexíveis ou exceto pelos aminoácidos mutantes particulares em posições hipervariáveis expostas na superfície, há uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Em outro exemplo, quando há duas ou mais moléculas de polinucleotídeo cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos nucleotídeos codificando resíduos flexíveis ou nucleotídeos codificando aminoácidos mutantes de posições hipervariáveis expostos sobre a superfície, há uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo na presente invenção.

[00535] Além disso, na presente invenção, a expressão "composta principalmente de" na expressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno" reflete o número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das concentrações de íon, dentre clones independentes com sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, é preferível que haja pelo menos 104 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação em uma biblioteca. Mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 105 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Mais preferivelmente ainda, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 106 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Particularmente preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 107 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Ainda mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 108 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Alternativamente, isso pode ser também preferivelmente expresso como a razão do número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das concentrações de íon com relação ao número de clones independentes tendo sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca em que moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação são responsáveis por 0,1% a 80%, preferivelmente 50% a 60%, mais preferivelmente 1% a 40%, ainda mais preferivelmente 2% a 20% e particularmente preferivelmente 4% a 10% de clones independentes com sequências diferentes na biblioteca. No caso de polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo ou vetores, expressões similares podem ser possíveis usando o número de moléculas ou a razão do número total de moléculas. No caso de vírus, expressão similar pode também ser possível usando o número de vírions ou a razão para número total de vírions.

[00536] Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de domínios de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íons

[00537] Domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno da presente invenção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos acima podem ser preparados de qualquer maneira. Por exemplo, quando o íon de metal é íon de cálcio, é possível usar domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno preexistentes, bibliotecas preexistentes (biblioteca de fago, etc.), anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de hibridomas obtidos através da imunização de animais ou a partir de células D de animais imunizados, anticorpos ou bibliotecas obtidos através da introdução de aminoácidos capazes de quelação de cálcio (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima (aminoácidos quelatáveis com cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico), bibliotecas com teor alto de aminoácidos não naturais, bibliotecas preparadas através da introdução de aminoácidos quelatáveis com cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais em posições particulares ou similar.

[00538] Exemplos dos aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon conforme descrito acima podem ser quaisquer tipos de aminoácidos contanto que os aminoácidos formem um motivo de ligação de cálcio. Motivos de ligação de cálcio são bem conhecidos daqueles versados na técnica e foram descritos em detalhes (por exemplo, Springer e outros (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki e Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief e outros (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux e outros (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch e Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer e outros (Genomics (1995) 25, 638643); Economou e outros (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg e outros (Structure (2006) 14, 6, 1049-1058)). Especificamente, quaisquer motivos de ligação de cálcio conhecidos, incluindo lecitinas tipo C tais como ASGPR, CD23, MBR e DC-SIGN, podem ser incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Exemplos preferidos de tais motivos de ligação de cálcio preferidos também incluem, em adição àqueles descritos acima, por exemplo, o motivo de ligação de cálcio no domínio de ligação de antígeno de SEQ ID NO: 5.

[00539] Ainda, como aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de domínios de ligação a antígeno incluídos nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção dependendo das condições de concentração de íons de cálcio, por exemplo, aminoácidos tendo atividade de quelação de metal podem ser também preferivelmente usados. Exemplos de tais aminoácidos de quelação de metal incluem, por exemplo, serina (Ser(S)), treonina (Thr(R)), asparagina (Asn(N)), glutamina (Gln(Q)), ácido aspártico (Asp(D)) e ácido glutâmico (Glu(E)).

[00540] As posições nos domínios de ligação a antígeno nos quais os aminoácidos descritos acima estão contidos não são particularmente limitadas a posições particulares e podem ser quaisquer posições dentro da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve que forma um domínio de ligação a antígeno, contanto que elas alterem a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Em uma modalidade não limitativa, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia pesada contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda outra modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 95, 96, 100a e/ou 101 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00541] Entretanto, em uma modalidade não limitante da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia leve contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio. Em outra modalidade não limitativa, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 30, 31 e/ou 32 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00542] Em outra modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em ainda outra modalidade não limitativa, a presente invenção provê bibliotecas compostas principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima na posição 50 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00543] Em ainda outra modalidade da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em uma modalidade alternativa, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CD3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima na posição 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00544] Ainda, em uma modalidade diferente da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e em que duas ou três CDRs selecionadas de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve descritas acima contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Além disso, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujas cadeias leves contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima em qualquer uma ou mais de posições 30, 31, 32, 50 e/ou 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00545] Em uma modalidade particularmente preferida, as sequências de estrutura principal da região variável de cadeia leve e/ou cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno contêm preferivelmente sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, quando as sequências de estrutura principal são sequências completamente humanas, é esperado que quando tal molécula de ligação a antígeno na presente invenção for administrada a seres humanos (por exemplo, para tratar doenças), ela induza pouca ou nenhum resposta imunogênica. No sentido acima, a expressão "contendo uma sequência de linhagem germinativa" na presente invenção significa que uma parte das sequências de estrutura principal da presente invenção é idêntica a uma parte de quaisquer sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Por exemplo, quando a sequência FR2 de cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno na presente invenção é uma combinação de sequências de FR2 de cadeia pesada de sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana diferentes, tal molécula é também uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção "contendo uma sequência de linhagem germinativa".

[00546] Exemplos preferidos das estruturas principais incluem, por exemplo, sequências de região de estrutura principal integralmente humanas atualmente conhecidas, que estão incluídas no website da V- Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) o outros. Essas sequências de região de estrutura principal podem ser apropriadamente usadas como uma sequência de linhagem germinativa contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção. As sequências de linhagem germinativa podem ser categorizadas de acordo com sua similaridade (Tomlinson e outros, (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams e Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox e outros (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Sequências de linhagem germinativa apropriadas podem ser selecionadas de Vk, que é agrupada em sete subgrupos: VÀ, que é agrupada em dez subgrupos; e VH, que é agrupada em sete subgrupos.

[00547] Sequências de VH integralmente humanas preferivelmente incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, sequências VH de:

[00548] subgrupo VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 e VH1-69);

[00549] subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26 e VH2-70);

[00550] subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 e VH3-74);

[00551] subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-39, VH4-59 e VH4-61);

[00552] subgrupo VH5 (VH5-51);

[00553] subgrupo VH6 (VH6-1); e

[00554] subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7-81).

[00555] Essas são também descritas em documentos conhecidos (Matsuda e outros, (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975) e similar e então, pessoas versadas na técnica podem apropriadamente projetar moléculas de ligação a antígeno da presente invenção com base na informação dessas sequências. É também preferível usar outras estruturas principais ou sub-regiões de estrutura principal integralmente humanas.

[00556] Sequências VK integralmente humanas incluem preferivelmente, mas não estão limitadas a, por exemplo:

[00557] A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 e O18 agrupados em subgrupo Vk1;

[00558] A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 E O11 agrupadas em subgrupo Vk2;

[00559] A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 e L25 agrupadas em subgrupo Vk3;

[00560] B3 agrupada em subgrupo Vk4;

[00561] B2 (aqui também referida como Vk5-2) agrupada em subgrupo Vk5; e

[00562] A10, A14 e A26 agrupadas em subgrupo VK6 (Kawasaki e outros (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable e Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Bresing-Kuppers e outros (Gene (1997) 191, 173-181).

[00563] Sequências de VL integralmente humanas preferivelmente incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo;

[00564] V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1 17, V1-18, V1-19, V1-20 e V1-22 agrupados em subgrupo VL1;

[00565] V2-1, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 e V2 19 agrupadas no subgrupo VL1;

[00566] V3-2, V3-3 e V3-4 agrupadas em subgrupo VL3;

[00567] V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 e V4-6 agrupados no subgrupo VL4; e

[00568] V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6 agrupadas no subgrupo VL5 (Kawasaki e outros (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).

[00569] Normalmente, essas sequências de estrutura principal são diferentes umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácido. Essas sequências de estrutura principal podem ser usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido" que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons" na presente invenção. Outros exemplos das estruturas principais integralmente humanas usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons" na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (por exemplo, Kabat e outros (1991) supra; Wu e outros (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

[00570] Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria particular, uma razão para a expectativa que o uso de sequências de linhagem germinativa exclui respostas imunes adversas na maioria dos indivíduos é acreditada ser como segue. Como um resultado do processo de maturação por afinidade durante respostas imunes normais, mutação somática ocorre frequentemente nas regiões variáveis de imunoglobulina. Tais mutações ocorrem principalmente em torno das CDRs cujas sequências são hipervariáveis, mas também afetam resíduos de regiões de estrutura principal. Tais mutações de estrutura principal não existem nos genes da linhagem germinativa, e também elas são menos prováveis de ser imunogênicas em pacientes. Por outro lado, a população humana normal é exposta à maioria das sequências de estrutura principal expressas a partir dos genes de linhagem germinativa. Como um resultado de imunotolerância, essas estruturas principais de linhagem germinativa são esperadas ter imunogenicidade baixa ou nenhuma em pacientes. Para maximizar a possibilidade de imunotolerância, genes de codificação de região variável podem ser selecionados de um grupo de genes de linhagem germinativa funcional de ocorrência comum.

[00571] Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para produzir as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção em que as sequências de região variável, sequências de região variável de cadeias pesada ou leve, sequências de CDR ou sequências de estrutura principal descritas acima contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons de cálcio.

[00572] Alternativamente, uma sequência de região variável de cadeia leve selecionada como uma região de estrutura principal contendo originalmente pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno conforme acima mencionado pode ser projetada para conter vários resíduos de aminoácido que não os resíduos de aminoácido acima. Na presente invenção, tais resíduos são referidos como resíduos flexíveis. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, contanto que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno ou domínio de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo de concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências de FR da cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 (Vk5-2) incluem os resíduos de aminoácido listados na Tabela 1 ou 2.

[00573] Aqui, resíduos flexíveis se referem a variações de resíduo de aminoácido presentes em posições hipervariáveis nas quais vários aminoácidos diferentes estão presentes nas regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada quando as sequências de aminoácido de anticorpos conhecidos e/ou nativos ou domínios de ligação a antígeno são comparadas. Posições hipervariáveis estão em geral localizadas nas regiões CDR. Em uma modalidade, os dados providos por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda, Md.) (1987 e 1991) são úteis para determinar posições hipervariáveis em anticorpos conhecidos ou nativos. Ainda, banco de dados na internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) provê as sequências coletadas de muitas cadeias leves e cadeias pesadas humanas e suas localizações. A informação sobre as sequências e localizações é útil para determinar posições hipervariáveis na presente invenção. De acordo com a presente invenção, quando uma certa posição de aminoácido tem preferivelmente cerca de 20 a cerca de 20 variações de resíduo de aminoácido possíveis, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 19, preferivelmente cerca de 4 a cerca de 18, preferivelmente 5 a 17, preferivelmente 6 a 16, preferivelmente 7 a 15, preferivelmente 8 a 14, preferivelmente 9 a 13 e preferivelmente 10 a 12 variações de resíduo de aminoácido possíveis, a posição é hipervariável. Em algumas modalidades, uma certa posição de aminoácido pode ter preferivelmente pelo menos cerca de 2, preferivelmente pelo menos cerca de 4, preferivelmente pelo menos cerca de 6, preferivelmente pelo menos cerca de 8, preferivelmente cerca de 10 e preferivelmente cerca de 12 variações de resíduo de aminoácido.

[00574] Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon conforme mencionado acima é introduzido. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem, por exemplo, bibliotecas em que regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada são combinadas com sequências de região variável de cadeia leve em que um resíduo(s) particular em uma sequência de linhagem germinativa tal como SEQ ID NO: 6 (Vk1), SEQ ID NO: 7 (Vk2), SEQ ID NO: 8 (Vk3) ou SEQ ID NO: 9 (Vk4) foi substituído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido em CDR1 de cadeia leve. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido em CDR2 de cadeia leve. Ainda, outros exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido também incluem resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve.

[00575] Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos em CDR1 de cadeia leve incluem aqueles nas posições 30, 31 e/ou 32 na CDR1 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numeração EU. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 50 na CDR2 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numeração Kabat. Além disso, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 92 na CDR3 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numeração Kabat. Os resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentrações de íon de cálcio. Entretanto, como troponina C, calmodulina, parvalbumina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivadas de uma origem comum em termos de evolução molecular, são conhecidas, a CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve pode ser projetada para ter seus motivos de ligação. Por exemplo, é possível usar domínios de caderina, EF hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína Quinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação de sangue, lectinas tipo C de receptor de asialoglicoproteína e receptor de ligação de manose, domínios A de receptores de LDL, anexina, domínio tipo 3 da trombospondina e domínios tipo EGF de uma maneira apropriada para os propósitos acima.

[00576] Quando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada e regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons foi introduzido são combinadas conforme descrito acima, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição de tais resíduos flexíveis não são particularmente limitados às modalidades particulares contanto que a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das condições de concentração de íons. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve incluem os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 1 e 2.

[00577] As regiões variáveis de cadeia pesada preferidas a serem combinadas incluem, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatorizadas. Métodos conhecidos são combinados conforme apropriado para produzir uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de linfócitos de animais imunizados com um antígeno específico, pacientes com infecções, pessoas com um título de anticorpo elevado no sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou pacientes com doença autoimune, pode ser preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.

[00578] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética produzida substituindo as sequências de CDR de genes V em DNA genômico ou genes V remodelados funcionais com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada. Neste caso, uma vez que diversidade de sequência é observada na sequência de CDR3 de cadeia pesada, é também possível substituir a sequência de CDR3 apenas. Um critério de concessão de origem à diversidade em aminoácidos na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é que esta diversidade é dada a resíduos de aminoácido em posições de superfície exposta na molécula de ligação a antígeno. A posição de superfície exposta se refere a uma posição que é considerada ser capaz de ser exposta na superfície e/ou contatada com um antígeno, com base em estrutura, conjunto de estruturas e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno. Em geral, tais posições são CDRs. Preferivelmente, posições de superfície exposta são determinadas usando coordenada de um modelo tridimensional de uma molécula de ligação a antígeno usando um programa de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). Posições de superfície exposta podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Determinação de posições de superfície exposta pode ser realizada usando software adequado para modelagem de proteína e informação estrutural tridimensional obtida de um anticorpo. O software que pode ser usado para esses propósitos preferivelmente inclui SYBYL Biopolymer Module software (Tripos Associates). Em geral ou preferivelmente, quando um algoritmo requer um parâmetro de tamanho de registro de usuário, o "tamanho" de uma sonda que é usada no cálculo é ajustado em cerca de 1,4 Angstroms ou menor em raio. Ainda, métodos para determinação de regiões e áreas de superfície exposta usando software para computadores pessoais são descritos por Pacios (Compu. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

[00579] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura, que é construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e cujo repertório consiste em sequências puras, que são sequências de anticorpo sem nenhuma predisposição, pode ser também particularmente preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso e outros (Scand, J. Immunol. (2000) 51, 337-344). Aqui, uma sequência de aminoácido compreendendo uma sequência nativa se refere a uma sequência de aminoácido obtida de tal biblioteca pura.

[00580] Em uma modalidade da presente invenção, um domínio de ligação a antígeno da presente invenção pode ser obtido a partir de uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras, preparadas através da combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íons". Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferivelmente aquelas construídas através de combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 11 (6KC4-1#85-IgG1). Alternativamente, tal biblioteca pode ser construída através de seleção de regiões variáveis de cadeia leve apropriadas a partir daquelas tendo sequências de linhagem germinativa, ao invés de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada. Tais bibliotecas preferidas incluem, por exemplo, aquelas em que a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 11 (6KC4-1#85-IgG1) é combinada com regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germinativa.

[00581] Alternativamente, a sequência de uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons" conforme mencionado acima pode ser projetada para conter resíduos flexíveis. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das condições de concentração de íons. Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 (6RL#9-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles na(s) posição(ões) 95, 96 e/ou 100a. Alternativamente, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 (6KC4-1#85-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles na(s) posição(ões) de aminoácido 95 e/ou 101.

[00582] Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germinativa com regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons" foi introduzido como acima mencionado. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferivelmente aquelas em que regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germinativa são combinadas com a sequência de uma região variável de cadeia pesada em que um resíduo(s) particular foi substituído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons de cálcio. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada. Exemplos não limitantes adicionais de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem também resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada incluem os aminoácidos na(s) posição(ões) 95, 96, 100a e/ou 101 na CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme indicado pela numeração Kabat. Ainda, esses resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das condições de concentração de íons de cálcio.

[00583] Quando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequência de linhagem germinativa são combinadas com uma região variável de cadeia pesada na qual pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente das condições de concentração de íons conforme mencionado acima foi introduzido, a sequência da região variável de cadeia pesada pode ser também projetada para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR de cadeia pesada e/ou FR podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Ainda, bibliotecas de região variável aleatorizada podem ser preferivelmente usadas como sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ao invés dos resíduos de aminoácido que alteram a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das condições de concentração de íons. Quando sequências de linhagem germinativa são usadas como regiões variáveis de cadeia leve, exemplos não limitantes de tais sequências incluem aqueles de SEQ ID NO: 6 (Vk1), SEQ ID NO: 7 (Vk2), SEQ ID NO: 8 (Vk3) e SEQ ID NO: 9 (Vk4).

[00584] Qualquer um dos aminoácidos descritos acima que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente das condições de concentração de íons de cálcio pode ser preferivelmente usado, contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio. Especificamente, tais aminoácidos incluem aminoácidos doadores de elétron. Exemplos preferidos de tais aminoácidos doadores de elétron incluem serina, treonina, asparagina, ácido glutâmico, ácido aspártico e ácido glutâmico.

[00585] Condição de Concentração de Íons de Hidrogênio

[00586] Em uma modalidade da presente invenção, a condição das condições de concentração de íons se refere à condição das condições de concentração de íons de hidrogênio ou condição de pH. Na presente invenção, a concentração de próton, isto é, o núcleo de átomos de hidrogênio, é tratada como sinônimo com índice de hidrogênio (pH). Quando a atividade de íon de hidrogênio em uma solução aquosa é representada como aH+, pH é definido como -log10aH+. Quando a resistência iônica da solução aquosa é baixa (por exemplo, menor do que 10-3), aH+ é quase igual à resistência do íon de hidrogênio. Por exemplo, o produto iônico de água a 25°C e 1 atmosfera é Kw=aH+aOH=10-14 e então em água pura, aH+=aOH=10-7. Neste caso, pH=7 é neutro; uma solução aquosa cujo pH é menor do que 7 é ácida ou cujo pH é maior do que 7 é alcalina.

[00587] Na presente invenção, quando a condição de pH é usada como a condição de concentração de íon, condições de pH incluem concentrações de íon de hidrogênio altas ou pHs baixos, isto é, uma faixa de pH ácido, e concentrações de íon de hidrogênio baixas ou pHs altos, isto é, uma faixa de pH neutro. "A atividade de ligação varia dependendo da condição de pH" significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno contido em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varia devido à diferença em condições de uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) e uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto (uma faixa de pH neutro). Isso inclui, por exemplo, o caso em que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno contido em uma molécula de ligação a antígeno é maior sob uma condição de faixa de pH neutro do que sob uma condição de faixa de pH ácido e o caso em que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior sob uma condição de faixa de pH ácido do que sob uma condição de faixa de pH neutro.

[00588] Aqui, a faixa de pH neutro não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH 6,7 e pH 10,0. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 6,7 e pH 9,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH9,0. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH8,0. Em particular, o pH preferido inclui pH 7,4, que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo.

[00589] Aqui, uma faixa de pH ácido não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH4,0 e pH6,5. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH4,5 e pH6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH5,0 e pH6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH5,5 e pH6,5. Em particular, o pH preferido inclui pH 5,8, que está próximo da concentração de cálcio ionizado no endossomo inicial in vivo.

[00590] Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) é menor do que sob uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou pH alto (uma faixa de pH neutro)" significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio da presente invenção em um pH selecionado entre pH 4,0 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 6,7 e pH 10,0; preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio em um pH selecionado entre pH 4,5 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH de 6,7 e pH 9,5; mais preferivelmente, significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 5,0 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 7,0 e pH 9,0; ainda mais preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 5,5 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 7,0 e pH 8,0; particularmente preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno no pH no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno no pH de plasma in vivo; e especificamente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em pH 5,8 é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno em pH 7,4.

[00591] Se a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio mudou pela condição do pH pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "Atividade de Ligação" acima. Por exemplo, a atividade de ligação é medida sob condições de pH diferentes usando os métodos de medição descritos acima. Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio é comparada sob as condições de faixa de pH ácido e faixa de pH neutro para confirmar que a atividade de ligação a antígeno do domínio ou da molécula de ligação a antígeno muda para ser maior sob a condição de faixa de pH neutro do que aquela sob a condição de faixa de pH ácido.

[00592] Ainda, na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela sob uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, pode ser também expressa como "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é maior do que aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido". Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é mais fraca do que a habilidade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro". Alternativamente, a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é reduzida para ser menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é reduzida para ser mais fraca do que a habilidade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro.

[00593] As condições que não concentração de íon de hidrogênio ou pH para medição da atividade de ligação a antígeno podem ser adequadamente selecionadas por aqueles versados na técnica e não são particularmente limitadas. As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão HEPES. As medições podem ser realizadas, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare). Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio pode ser determinada através da avaliação da atividade de ligação para o antígeno solúvel ao despejar o antígeno como um analito em um chip imobilizado com o domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio. Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação ao antígeno de membrana pode ser avaliada despejando a molécula de ligação a antígeno como um analito em um chip imobilizado com o antígeno.

[00594] Contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH baixo, seja mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, a razão da atividade de ligação a antígeno entre aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, e em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro, não é particularmente limitada, e o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido para a KD em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é preferivelmente 2 ou mais; mais preferivelmente, o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 10 ou mais; e mais preferivelmente ainda o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 40 ou mais. O limite superior de valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles versados na técnica.

[00595] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser adequadamente usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio da presente invenção entre aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio e pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido e uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro. Quando a kd (constante de taxa de dissociação ) é usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação ao invés de KD (constante de dissociação), o valor de kd (sob uma condição de faixa de pH ácido)/kd (sob uma condição de faixa de pH neutro), que é a razão de kd (constante de taxa de dissociação) para o antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido para kd (constante de taxa de dissociação) sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente e ainda 10 ou mais, e sobretudo preferivelmente 30 ou mais. O valor do limite superior (sob uma condição de faixa de pH ácido)/kd (sob uma condição de faixa de pH neutro) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles versados na técnica.

[00596] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada como o valor para atividade de ligação a antígeno e quando o antígeno é um antígeno de membrana, a constante de taxa de dissociação aparente (kd) pode ser usada. A constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de taxa de dissociação aparente (kd) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica e Biacore (GE Healthcare), citometria de fluxo e similar podem ser usados. Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio é medida em concentrações de íon de hidrogênio diferentes, isto é, pHs, condições outras que não a concentração de íon de hidrogênio, isto é, pH, são preferivelmente iguais.

[00597] Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, a qual é uma modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtido através de triagem de domínios d de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:

[00598] obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido;

[00599] obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH neutro; e

[00600] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH ácido é menor do que aquela na faixa de pH neutro.

[00601] Alternativamente, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, que é uma modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de avaliação de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno, ou uma biblioteca dos mesmos, compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:

[00602] contato de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno, ou uma biblioteca dos mesmos, sob uma condição de faixa de pH neutro com um antígeno;

[00603] colocação sob uma condição de faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno ligada ao antígeno na etapa (a); e

[00604] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno dissociada na etapa (b).

[00605] Um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, que é outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno , ou uma biblioteca dos mesmos, compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:

[00606] contato sob uma condição de faixa de pH ácido de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno;

[00607] seleção do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno que não se liga ao antígeno na etapa (a);

[00608] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno selecionada na etapa (b) se ligue com o antígeno sob uma condição de faixa de pH neutro; e

[00609] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno ligada ao antígeno na etapa (c).

[00610] Um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de triagem compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:

[00611] contato sob uma condição de faixa de pH neutro de uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno com uma coluna imobilizada com um antígeno;

[00612] eluição sob uma condição de faixa de pH ácido a partir da coluna do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno ligada à coluna na etapa (a); e

[00613] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno eluída na etapa (b).

[00614] Um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtida através de um método de triagem compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:

[00615] permitir, sob uma condição de faixa de pH ácido, que uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno passe por uma coluna imobilizada com um antígeno;

[00616] coleta do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno eluída sem ligação com a coluna na etapa (a);

[00617] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno coletada na etapa (b) se ligue com o antígeno sob uma condição de faixa de pH neutro; e

[00618] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno ligada ao antígeno na etapa (c).

[00619] Um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtida através de um método de triagem compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:

[00620] contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno s sob uma condição de faixa de pH neutro;

[00621] obtenção do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno ligada ao antígeno na etapa (a);

[00622] colocação sob uma condição de faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno obtida na etapa (b); e

[00623] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno o cuja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o padrão selecionado na etapa (b).

[00624] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a antígeno e moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido é menor do que aquela sob uma condição de faixa de pH neutro, que são obtidos através de um método de avaliação que compreende ainda as etapas de repetição das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descritos acima. O número de vezes que as etapas (a) a (c) ou (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado; no entanto, o número é 10 ou menos em geral.

[00625] Nos métodos de avaliação da presente invenção, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,0 e 6,5 e inclua a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,5 e 6,6 como o pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 5,0 e 6,5 e aquela em um pH entre 5,5 e 6,5 como outro pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH no endossomo inicial in vivo como o pH mais preferido, e especificamente aquela em pH 5,8. Entretanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em pH entre 6,7 e 10, e inclui a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 6,7 e 9,5 como o pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 7,0 e 9,5 e aquela em um pH entre 7,0 e 8,0 como outro pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH de plasma in vivo como o pH mais preferido e, especificamente, aquela em pH 7,4.

[00626] A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Aqueles versados na técnica podem determinar adequadamente condições que não concentração de cálcio ionizado. A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno pode ser avaliada com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), constante de taxa de dissociação (kd), constante de taxa de dissociação aparente (kd) e similar. Essas podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.

[00627] Na presente invenção, a etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é maior do que aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é sinônimo da etapa com seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro.

[00628] Contanto que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, seja maior do que aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, a diferença entre a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro, e aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada; no entanto, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais e ainda mais preferivelmente 40 vezes ou mais do que aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido.

[00629] Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno dependente das condições de concentração de íons de hidrogênio

[00630] O domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno da presente invenção a ser avaliado através dos métodos de avaliação descritos acima pode ser preparado de qualquer maneira. Por exemplo, moléculas de ligação a antígeno convencionais, bibliotecas convencionais (biblioteca de fago, etc.), anticorpos ou bibliotecas preparados através de células B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos através de animais de imunização, anticorpos ou bibliotecas (bibliotecas com teor de aminoácidos alto com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural em posições específicas, etc.) obtidos através da introdução de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.

[00631] Métodos para obtenção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é maior do que aquela sob uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou pH baixo, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, a partir de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos preparados a partir de hibridomas obtidos através de imunização de animais ou de células B de animais imunizados incluem preferivelmente, por exemplo, a molécula de ligação a antígeno ou anticorpo em que pelo menos um dos aminoácidos do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno é substituído com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou uma mutação de aminoácido não natural, ou o domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno inserido com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural, tais como aqueles descritos no WO 2009/125825.

[00632] Os sítios de introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina ou ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais não são particularmente limitados, e podem ser qualquer posição contanto que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido se torne mais fraca do que aquela sob uma condição de faixa de pH neutro (o valor de KD (sob uma condição de faixa de pH ácido)/KD (sob uma condição de faixa de pH neutro) ou kd (sob uma condição de faixa de pH ácido)/kd (sob uma condição de faixa de pH neutro) é aumentado) comparado com antes da substituição ou inserção. Por exemplo, quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, a região variável de anticorpo e CDRs são adequadas. Aqueles versados na técnica podem determinar apropriadamente o número de aminoácidos a serem substituídos ou o número de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais a serem inseridos. É possível substituir um único aminoácido tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou um aminoácido não natural único; é possível inserir um aminoácido único tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural único; é possível substituir dois ou mais aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais; e é possível inserir dois ou mais aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais. Alternativamente, outros aminoácidos podem ser deletados, adicionados, inseridos e/ou substituídos concomitantemente, com a exceção da substituição em aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais ou a inserção de aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais. Substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais pode ser realizada aleatoriamente através de métodos tal como varredura com histidina, em que a alanina de varredura de alanina conhecida daqueles versados na técnica é substituída com histidina. Moléculas de ligação a antígeno exibindo um valor de KD maior (sob uma condição de faixa de pH ácido)/KD (sob uma condição de faixa de pH neutro) ou kd (sob uma condição de faixa de pH ácido)/kd (sob uma condição de faixa de pH neutro) comparado com antes da mutação podem ser selecionadas de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos introduzidos com inserções aleatórias ou mutações de substituição de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.

[00633] Exemplos preferidos de moléculas de ligação a antígeno contendo a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais conforme acima descrito e cuja atividade de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido é menor do que aquela sob uma condição de faixa de pH neutro incluem moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH neutro após a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais é comparável àquela antes da mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais. Aqui, "uma molécula de ligação a antígeno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais tendo uma atividade de ligação a antígeno comparável com aquela antes da mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais" significa que, quando tomando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno antes da mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais como 100%, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais é pelo menos 10% ou mais, preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais e ainda mais preferivelmente 90% ou mais. A atividade de ligação a antígeno após a mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4 pode ser maior do que aquela antes da mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4. Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno for diminuída devido à inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, a atividade de ligação a antígeno pode ser feita para ser comparável com aquela antes da inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, através da introdução de uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos da molécula de ligação a antígeno. A presente invenção também inclui moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação foi ajustada para ser comparável através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos após substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.

[00634] Em uma modalidade da presente invenção, uma biblioteca contendo múltiplos domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser também construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada, produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada, com regiões variáveis de cadeia leve introduzidas com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio".

[00635] Tais resíduos de aminoácido incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de cadeia leve. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve.

[00636] Os resíduos de aminoácido descritos acima contidos na CDR1 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduo(s) de aminoácido de posição (ões) 24, 27, 28, 31, 32 e/ou 34 de acordo com numeração Kabat na CDR1 de região variável de cadeia leve. Entretanto, os resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduo(s)de aminoácido de posição(ões) 50,5 1, 52, 53, 54, 55 e/ou 56 de acordo com numeração Kabat na CDR2 de região variável de cadeia leve. Ainda, os resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido nas posições 89, 90, 91, 92, 93, 94 e/ou 95A de acordo com numeração Kabat na CDR3 de região variável de cadeia leve. Além disso, os resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou podem estar contidos em combinação de dois ou mais aminoácidos contanto que eles permitam a mudança na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da concentração de íon de hidrogênio.

[00637] Mesmo quando a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada é combinada com a região variável de cadeia leve descrita acima introduzida com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio", é possível projetar de maneira que os resíduos flexíveis estejam contidos na sequência da região variável de cadeia leve da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados a uma modalidade específica, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção mude dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio. Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequências das regiões variáveis de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 3 e 4. Entretanto, sequências de aminoácido de regiões variáveis de cadeia leve que não os resíduos flexíveis e resíduos de aminoácido que mudam a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio adequadamente incluem, mas não estão limitadas a, sequências de linhagem germinativa tais como Vk1 (SEQ ID NO: 6), Vk2 (SEQ ID NO: 7), Vk3 (SEQ ID NO: 8) e Vk4 (SEQ ID NO: 9). Tabela 3

(Posição indica numeração Kabat)

[00638] Qualquer resíduo de aminoácido pode ser adequadamente usado como os resíduos de aminoácido descritos acima que mudam a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno dependendo da condição da concentração de íon de hidrogênio. Especificamente, tais resíduos de aminoácido incluem aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0. Tais aminoácidos de liberação de elétron incluem preferivelmente, por exemplo, aminoácidos de ocorrência natural tais como histidina e ácido glutâmico, bem como aminoácidos não naturais tais como análogos de histidina (US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5- Br2-Tyr (pKa 7,21) e 3,5-12-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-3768). Resíduos de aminoácido particularmente preferidos incluem, por exemplo, aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 6,0-7,0. Tais resíduos de aminoácido de liberação de elétron incluem preferivelmente, por exemplo, histidina.

[00639] A região variável de cadeia pesada preferida que é usada em combinação inclui, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatorizadas. Métodos conhecidos são apropriadamente combinados como um método para produção de uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de animais imunizados com antígenos específicos, pacientes com infecção ou pessoas com um título de anticorpo elevado em sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou linfócitos de doenças autoimunes pode ser adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.

[00640] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, da mesma maneira que descrito acima, uma biblioteca sintética em que as sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V reconstruídos funcionais são substituídas com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo as sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada. Neste caso, a sequência de CDR3 sozinha pode ser substituída porque variedade na sequência de gene de CDR3 de cadeia pesada é observada. A base para dar origem a variações de aminoácido na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é gerar variações de resíduos de aminoácido de posições expostas à superfície da molécula de ligação a antígeno. A posição exposta à superfície se refere a uma posição em que um aminoácido é exposto na superfície e/ou contatado com um antígeno com base na conformação, conjunto estrutural e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno e, em geral, tais posições são as CDRs. As posições expostas à superfície são preferivelmente determinadas usando as coordenadas derivadas de um modelo tridimensional da molécula de ligação a antígeno usando programas de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). As posições expostas à superfície podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). As posições expostas à superfície podem ser determinadas com base na informação na estrutura tridimensional de anticorpos usando software adequado para modelagem de proteína. Software que é adequadamente usado para este propósito inclui o software de módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates). Quando o algoritmo requer o parâmetro de tamanho de registro do usuário, o "tamanho" de sonda para uso em computação é geralmente ou preferivelmente ajustado em cerca de 1,4 angstrom ou menos de raio. Ainda, um método para determinação de região e área expostas à superfície usando software de computador pessoal é descrito por Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; e J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

[00641] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e consistindo em sequências puras, que são repertório imparciais de sequências de anticorpo, pode ser também particularmente adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); e Cardoso e outros (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).

[00642] FcRn

[00643] Diferente do receptor Fcy pertencente à superfamília de imunoglobulina, FcRn, FcRn humano em particular, é estruturalmente similar a polipeptídeos de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (Major Histocompatibility Complex) Classe I, exibindo 22% a 29% de identidade de sequência com moléculas do MHC Classe I (Ghetie e outros, Immunol. Today (1997) 18 (2): 592-598). FcRn é expresso como um heterodímero consistindo em cadeia β solúvel ou leve (β2 microglobulina) complexada com cadeia α de transmembrana ou pesada. Tal como MHC, a cadeia α de FcRn compreende três domínios extracelulares (α1, α2 e α3) e seu domínio citoplásmico curto ancora a proteína na superfície celular. Os domínios α1 e α2 interagem com o domínio de ligação a FcRn da região Fc de anticorpo (Raghavan e outros, Immunity (1994) 1: 303-315).

[00644] FcRn é expresso em placenta materna e saco vitelino de mamíferos, e está envolvido em transferência de IgG de mãe-para-feto. Ainda, em intestino delgado neonatal de roedores, em que FcRn é expresso, FcRn está envolvido em transferência de IgG materno através do epitélio de borda em escova a partir de colostro ou leite ingerido. FcRn é expresso em uma variedade de outros tecidos e sistemas de célula endotelial de várias espécies. FcRn é também expresso em endotélio humano adulto, vasos sanguíneos musculares e capilares sinusoidais hepáticos. FcRn é acreditado desempenhar um papel na manutenção de concentração de IgG no plasma através da mediação da reciclagem de IgG para soro quando da ligação a IgG. Tipicamente, ligação de FcRn a moléculas de IgG é estritamente dependente do pH. A ligação ótima é observada sob uma condição de faixa de pH ácido abaixo de 7,0.

[00645] FcRn humano cujo precursor é um polipeptídeo tendo a sequência de sinal de SEQ ID NO: 12 (o polipeptídeo com a sequência de sinal é mostrado na SEQ ID NO: 13) forma um complexo com β2- microglobulina humana in vivo. Conforme mostrado nos Exemplos de Referência descritos abaixo, FcRn humano solúvel complexado com β2- microglobulina é produzido através do uso de técnicas de expressão recombinantes convencionais. Domínio de ligação a FcRn da presente invenção pode ser avaliado quanto à sua atividade de ligação a tal FcRn humano solúvel complexado com β2-microglobulina. Aqui, a menos que de outra maneira especificado, FcRn humano se refere a uma forma capaz de se ligar a um domínio de ligação a FcRn da presente invenção. Exemplos incluem um complexo entre FcRn humano e β2- microglobulina humana.

[00646] Atividade de ligação de um domínio de ligação a FcRn ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio ao FcRn, em particular FcRn humano

[00647] A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcRn contido em uma molécula de ligação a antígeno fornecida pela presente invenção ao FcRn, FcRn humano em particular, pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, conforme descrito na seção "Atividade de Ligação" acima. Aqueles versados na técnica podem determinar apropriadamente as condições outras que não pH. A atividade de ligação a antígeno e a atividade de ligação a FcRn humano de uma molécula de ligação a antígeno podem ser avaliadas com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), taxa de dissociação (kd), taxa de dissociação aparente (kd) e similar. Essas podem ser medidas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo pode ser usado.

[00648] Quando a atividade de ligação a FcRn de um domínio de ligação a FcRn é medida, condições que não o pH não são particularmente limitadas, e podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica. As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão MES, conforme descrito no WO 2009/125825). Alternativamente, a atividade de ligação a FcRn de um domínio de ligação a FcRn pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica e pode ser medida usando, por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar. A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcRn para FcRn pode ser avaliada despejando, como um analito, FcRn, um domínio de ligação a FcRn ou uma molécula de ligação a antígeno presente invenção contendo o domínio de ligação a FcRn em um chip imobilizado com um domínio de ligação a FcRn, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção contendo o domínio de ligação a FcRn, ou FcRn.

[00649] Na presente invenção, a faixa de pH ácido apresentada como a condição para ter atividade de ligação entre FcRn e um domínio de ligação a FcRn em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção geralmente se refere a pH 4,0 até pH 6,5. Preferivelmente ela se refere a pH 5,5 até pH 6,5 e particularmente preferivelmente ela se refere a pH 5,8 até pH 6,0 que está próximo do pH em um endossomo inicial in vivo. A faixa de pH neutro apresentada como a condição para ter atividade de ligação entre FcRn e uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou um domínio de ligação a FcRn incluído em tal molécula se refere geralmente a pH 6,7 até pH 10.0. A faixa de pH neutro é preferivelmente uma faixa indicada por qualquer valor de pH de a partir de pH 7,0 até pH 8,0 e é preferivelmente selecionado de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 e 8,0 e é particularmente preferivelmente pH 7,4 que está próximo do pH no plasma (em sangue) in vivo. Avaliar a afinidade de ligação entre FcRn humano e um domínio de ligação a FcRn humano ou uma molécula de ligação a antígeno contendo este domínio em pH 7,4 é difícil devido à afinidade de ligação baixa, pH 7,0 pode ser usado ao invés de pH 7,4. Como temperatura a ser usada em condições de ensaio, afinidade de ligação entre um domínio de ligação a FcRn e FcRn pode ser avaliada em qualquer temperatura de a partir de 10° C a 50° C. Preferivelmente, uma temperatura de a partir de 15° C a 40° C é usada para determinar a afinidade de ligação entre um domínio de ligação a FcRn e FcRn humano. Mais preferivelmente, qualquer temperatura de a partir de 20° C a 35° C tal como qualquer uma de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35° C é também igualmente usada para determinar a afinidade de ligação entre um domínio de ligação a FcRn e FcRn. Uma temperatura de 25° C é um exemplo não limitante de uma modalidade da presente invenção.

[00650] Domínio de ligação ao FcRn

[00651] Moléculas de ligação a antígeno da presente invenção têm um domínio de ligação ao FcRn tendo uma atividade de ligação direta ao FcRn sob condições de pH ácido. O domínio de ligação ao FcRn não está particularmente limitado, contanto que as moléculas de ligação a antígeno tenham uma atividade de ligação ao FcRn em uma faixa de pH ácido e que ele possa ser um domínio que tenha atividade de ligação direta ou indireta ao FcRn. Exemplos preferidos de tal domínio de ligação ao FcRn incluem a região Fc de imunoglobulina IgG, albumina, domínio 3 de albumina, anticorpo anti-FcRn descrito em Christianson et al. (mAbs (2012) 4(2), 208-216), o peptídeo anti-FcRn descrito no documento WO 2007/098420, molécula estrutural anti-FcRn e similares, os quais têm uma atividade de ligação direta ao FcRn, ou moléculas que se ligam à IgG ou albumina e similares, as quais têm uma atividade de ligação indireta ao FcRn. Se o domínio já tem atividade de ligação ao FcRn em uma faixa de pH ácido ele pode, de preferência, ser usado como está. Se o domínio não tem ou tem uma atividade de ligação ao FcRn fraca em uma faixa de pH ácido, os aminoácidos que constituem um domínio de ligação ao FcRn na molécula de ligação a antígeno podem ser alterados para conferir uma atividade de ligação ao FcRn. Alternativamente, os aminoácidos podem ser alterados em um domínio já tendo atividade de ligação ao FcRn em uma faixa de pH ácido para aumentar a atividade de ligação ao FcRn em uma faixa de pH ácido. Para alteração de aminoácidos do domínio de ligação ao FcRn, a alteração de interesse pode ser identificada comparando-se as atividades de ligação ao FcRn em uma faixa de pH ácido antes e após a alteração de aminoácidos.

[00652] Região Fc

[00653] Uma região Fc contém a sequência de aminoácidos derivada da região constante da cadeia pesada de um anticorpo. Uma região Fc é uma porção da região constante da cadeia pesada de um anticorpo começando a partir da extremidade N-terminal da região de dobradiça, a qual corresponde ao sítio de clivagem de papaína em torno de uma posição de aminoácido 216 de acordo com o sistema de numeração Norte Americano e contém a dobradiça, domínios CH2 e CH3. Embora a região Fc possa ser obtida a partir de IgG1 humana, ela não está limitada a uma subclasse particular de anticorpos IgG. Exemplos de tal modalidade não limitativa da região Fc incluem as regiões Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) humanas.

[00654] Domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido

[00655] Conforme descrito acima, em uma modalidade não limitativa da presente invenção, uma região Fc de uma imunoglobulina IgG humana é usada como o domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de pH ácido. Uma região Fc tendo originalmente atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser usada como este domínio e exemplos de tais regiões Fc incluem as regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 e variantes das mesmas). Quando uma região Fc tem atividade fraca ou nenhuma atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido, as regiões Fc com atividade de ligação ao FcRn desejada podem ser obtidas alterando-se aminoácidos da região Fc. Alternativamente, regiões Fc tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido desejada ou maior podem ser convenientemente obtidas por meio de alteração de aminoácidos na região Fc. Alterações de aminoácidos de uma região Fc que resultam em tal atividade de ligação desejada podem ser determinadas comparando-se a atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido antes e após a alteração de aminoácido. Por exemplo, tais alterações de aminoácidos podem ser determinadas através de métodos descritos na seção "atividade de um domínio de ligação ao FcRn ou molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio ao FcRn, em particular FcRn humano" mencionada acima.

[00656] Alterações da região Fc que aumentam a atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido são apresentadas abaixo como exemplos de uma modalidade não limitativa de tais alterações. Regiões Fc preferidas (regiões Fc iniciais) de uma imunoglobulina de tipo IgG para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e variantes das mesmas). A origem de iniciação de regiões Fc não está limitada e elas podem ser obtidas de organismos humanos ou quaisquer organismos não humanos. Tais organismos incluem, de preferência, camundongos, ratos, porquinhos- da-índia, hâmsters, gerbilos, gatos, coelhos, cães, cabras, ovelhas, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados de primatas não humanos. Em outra modalidade, as regiões Fc iniciais também podem ser obtidas de macacos cynomolgus, saguis, macacos Rhesus, chimpanzés ou seres humanos. Regiões Fc iniciais podem ser obtidas, de preferência, de IgG1 humana; contudo, elas não estão limitadas à qualquer subclasse de IgG em particular. Isto significa que uma região Fc representada por IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) humanas pode ser usada apropriadamente como uma região Fc inicial, e aqui também significa que uma região Fc de uma classe ou subclasse IgG arbitrária derivada de quaisquer organismos descritos acima pode ser preferivelmente usada como uma região Fc inicial. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos nos documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635; e WO 2006/105338); no entanto, elas não são limitadas aos exemplos.

[00657] Exemplos de alterações incluem aquelas com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações através da substituição de aminoácidos por resíduos de aminoácido diferentes de regiões Fc iniciais, através da inserção de um ou mais resíduos de aminoácido em regiões Fc iniciais ou através da deleção de um ou mais aminoácidos da região Fc inicial. Preferivelmente, as sequências de aminoácido de regiões Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácido de uma região Fc não nativa. Tais variantes têm necessariamente identidade ou similaridade de sequência de menos do que 100% com sua região Fc inicial. Em uma modalidade preferida, as variantes têm identidade ou similaridade de sequência de aminoácido de cerca de 75% a menos do que 100%, mais preferivelmente cerca de 80% a menos do que 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 85% a menos do que 100%, sobretudo preferivelmente 90% a menos do que 100% e ainda sobretudo preferivelmente cerca de 95% a menos do que 100% da sequência de aminoácido de sua região Fc inicial. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região Fc modificada da presente invenção e sua região Fc inicial. A diferença de aminoácido entre uma região Fc modificada da presente invenção e sua região Fc inicial pode ser também preferivelmente especificada com base nas diferenças de aminoácido nas posições de aminoácido particulares descritas acima de acordo com o sistema de numeração EU.

[00658] Contanto que a região Fc tenha uma atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido ou possa aumentar a atividade de ligação ao FcRn humano sob condições de pH ácido, aminoácidos em qualquer posição podem ser modificados por outros aminoácidos. Quando a molécula de ligação a antígeno da presente invenção contém a região Fc de IgG1 humana como o domínio de ligação ao FcRn, é preferível que a região Fc resultante contenha uma modificação que resulte no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc de IgG1 humana inicial. Aminoácidos que permitem tal modificação incluem, por exemplo, aminoácido(s) na posição(ões) 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433 e/ou 434, de acordo com a numeração EU e suas combinações de aminoácido(s) na posição(ões) 253, 310, 435 e/ou 426, conforme descrito no documento WO 1997/034631. Exemplos favoráveis incluem aminoácido(s) na(s) posição(ões) 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 conforme indicado pela numeração EU, conforme descrito no documento WO 2000/042072. Similarmente, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoácido(s) na posição(ões) 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU, conforme descrito no documento WO 2002/060919. Além disso, aminoácidos que permitem tal modificação incluem, por exemplo, aminoácido(s) na posição(ões) 250, 314 e 428 de acordo com a numeração EU, conforme descrito no documento WO2004/092219. Além disso, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoácido(s) na posição(ões) 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440 e/ou 442, conforme descrito no documento WO 2006/020114. Além disso, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoácido(s) na posição(ões) 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU, conforme descrito no documento WO 2010/045193. Modificação destes aminoácidos aumenta a ligação ao FcRn da região Fc de uma imunoglobulina de tipo IgG sob uma condição de faixa de pH ácido.

[00659] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana inclui pelo menos uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00660] Arg ou Leu para o aminoácido na posição 251;

[00661] qualquer um de Phe, Ser, Thr, e Tyr para o aminoácido na posição 252;

[00662] Ser ou Thr para o aminoácido na posição 254;

[00663] qualquer um de Arg, Gly, Ile, e Leu para o aminoácido na posição 255;

[00664] qualquer um de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, e Thr para o aminoácido na posição 256;

[00665] Ile ou Thr para o aminoácido na posição 308;

[00666] Pro para o aminoácido na posição 309;

[00667] qualquer um de Glu, Leu, e Ser para o aminoácido na posição 311;

[00668] Ala ou Asp para o aminoácido na posição 312;

[00669] Ala ou Leu para o aminoácido na posição 314;

[00670] qualquer um de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser, e Thr para o aminoácido na posição 385;

[00671] qualquer um de Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, e Thr para o aminoácido na posição 386;

[00672] qualquer um de Ala, Arg, His, Pro, Ser, e Thr para o aminoácido na posição 387;

[00673] Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido na posição 389;

[00674] qualquer um de Leu, Met, Phe, Ser, e Thr para o aminoácido na posição 428;

[00675] qualquer um de Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, e Ser para o aminoácido na posição 433;

[00676] qualquer um de His, Phe, e Tyr para o aminoácido na posição 434; e

[00677] qualquer um de Arg, Asn, His, Lys, Met, e Thr para o aminoácido na posição 436, conforme indicado pela numeração EU. Entretanto, o número de aminoácidos a serem modificados não está particularmente limitado; e o aminoácido pode ser modificado em apenas um local ou aminoácidos podem ser modificados em dois ou mais locais.

[00678] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento de ligação ao FcRn em uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Ile para o aminoácido na posição 308, Pro para o aminoácido na posição 309 e/ou Glu para o aminoácido na posição 311 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Thr para o aminoácido na posição 308, Pro para o aminoácido na posição 309, Leu para o aminoácido na posição 311, Ala para o aminoácido na posição 312 e/ou Ala para o aminoácido na posição 314. Além disso, outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Ile ou Thr para o aminoácido na posição 308, Pro para o aminoácido na posição 309, Glu, Leu, ou Ser para o aminoácido na posição 311, Ala para o aminoácido na posição 312 e/ou Ala ou Leu para o aminoácido na posição 314. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Thr para o aminoácido na posição 308, Pro para o aminoácido na posição 309, Ser para o aminoácido na posição 311, Asp para o aminoácido na posição 312 e/ou Leu para o aminoácido na posição 314.

[00679] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Leu para o aminoácido na posição 251, Tyr para o aminoácido na posição 252, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 254, Arg para o aminoácido na posição 255 e/ou Glu para o aminoácido na posição 256 de acordo com a numeração EU.

[00680] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Leu, Met, Phe, Ser, ou Thr para o aminoácido na posição 428, Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido na posição 433, His, Phe, ou Tyr para o aminoácido na posição 434 e/ou Arg, Asn, His, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido na posição 436 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir His ou Met para o aminoácido na posição 428 e/ou His ou Met para o aminoácido na posição 434.

[00681] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Arg para o aminoácido na posição 385, Thr para o aminoácido na posição 386, Arg para o aminoácido na posição 387 e/ou Pro para o aminoácido na posição 389 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Asp para o aminoácido na posição 385, Pro para o aminoácido na posição 386 e/ou Ser para o aminoácido na posição 389.

[00682] Além disso, quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana incluem pelo menos uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00683] Gln ou Glu para o aminoácido na posição 250; e

[00684] Leu ou Phe para o aminoácido na posição 428 de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a serem modificados não está particularmente limitado; e o aminoácido pode ser modificado em apenas um local ou aminoácidos pode ser modificado em dois locais.

[00685] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Gln para o aminoácido na posição 250 e/ou Leu ou Phe para o aminoácido na posição 428 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Glu para o aminoácido na posição 250 e/ou Leu ou Phe para o aminoácido na posição 428.

[00686] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana incluiu pelo menos duas ou mais modificações de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00687] Asp ou Glu para o aminoácido na posição 251;

[00688] Tyr para o aminoácido na posição 252;

[00689] Gln para o aminoácido na posição 307;

[00690] Pro para o aminoácido na posição 308;

[00691] Val para o aminoácido na posição 378;

[00692] Ala para o aminoácido na posição 380;

[00693] Leu para o aminoácido na posição 428;

[00694] Ala ou Lys para o aminoácido na posição 430;

[00695] qualquer um de Ala, His, Ser, e Tyr para o aminoácido na posição 434; e

[00696] Ile para o aminoácido na posição 436, conforme indicado pela numeração EU. O número de aminoácidos a serem modificados não está particularmente limitado; e o aminoácido pode ser modificado em apenas dois locais ou aminoácidos podem ser modificados em três ou mais locais.

[00697] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Gln para o aminoácido na posição 307, and Ala ou Ser para o aminoácido na posição 434 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Pro para o aminoácido na posição 308, and Ala para o aminoácido na posição 434. Além disso, outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Tyr para o aminoácido na posição 252, and Ala para o aminoácido na posição 434. Uma modalidade não limitativa diferente desta modificação pode incluir Val para o aminoácido na posição 378, and Ala para o aminoácido na posição 434. Outra modalidade não limitativa diferente desta modificação pode incluir Leu para o aminoácido na posição 428, and Ala para o aminoácido na posição 434. Outra modalidade não limitativa diferente desta modificação pode incluir Ala para o aminoácido na posição 434, and Ile para o aminoácido na posição 436. Além disso, outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Pro para o aminoácido na posição 308, and Tyr para o aminoácido na posição 434. Além disso, outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Gln para o aminoácido na posição 307, and Ile para o aminoácido na posição 436.

[00698] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo qualquer um de Gln para o aminoácido na posição 307, Ala para o aminoácido na posição 380, and Ser para o aminoácido na posição 434 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Gln para o aminoácido na posição 307, Ala para o aminoácido na posição 380, and Ala para o aminoácido na posição 434. Além disso, outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Tyr para o aminoácido na posição 252, Pro para o aminoácido na posição 308, and Tyr para o aminoácido na posição 434. Uma modalidade não limitativa diferente desta modificação pode incluir Asp para o aminoácido na posição 251, Gln para o aminoácido na posição 307, and His para o aminoácido na posição 434.

[00699] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana incluem modificação de pelo menos dois ou mais aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00700] Leu para o aminoácido na posição 238;

[00701] Leu para o aminoácido na posição 244;

[00702] Arg para o aminoácido na posição 245;

[00703] Pro para o aminoácido na posição 249;

[00704] Tyr para o aminoácido na posição 252;

[00705] Pro para o aminoácido na posição 256;

[00706] qualquer um de Ala, Ile, Met, Asn, Ser, e Val para o aminoácido na posição 257;

[00707] Asp para o aminoácido na posição 258;

[00708] Ser para o aminoácido na posição 260;

[00709] Leu para o aminoácido na posição 262;

[00710] Lys para o aminoácido na posição 270;

[00711] Leu ou Arg para o aminoácido na posição 272;

[00712] qualquer um de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, e Tyr para o aminoácido na posição 279;

[00713] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, e Tyr para o aminoácido na posição 283;

[00714] Asn para o aminoácido na posição 285;

[00715] Phe para o aminoácido na posição 286;

[00716] Asn ou Pro para o aminoácido na posição 288;

[00717] Val para o aminoácido na posição 293;

[00718] qualquer um de Ala, Glu, e Met para o aminoácido na posição 307;

[00719] qualquer um de Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val, e Trp para o aminoácido na posição 311;

[00720] Pro para o aminoácido na posição 312;

[00721] Lys para o aminoácido na posição 316;

[00722] Pro para o aminoácido na posição 317;

[00723] Asn ou Thr para o aminoácido na posição 318;

[00724] qualquer um de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, e Trp para o aminoácido na posição 332;

[00725] qualquer um de Asn, Thr, e Trp para o aminoácido na posição 339;

[00726] Pro para o aminoácido na posição 341;

[00727] qualquer um de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, e Tyr para o aminoácido na posição 343;

[00728] Arg para o aminoácido na posição 375;

[00729] qualquer um de Gly, Ile, Met, Pro, Thr, e Val para o aminoácido na posição 376;

[00730] Lys para o aminoácido na posição 377;

[00731] Asp ou Asn para o aminoácido na posição 378;

[00732] qualquer um de Asn, Ser, e Thr para o aminoácido na posição 380;

[00733] qualquer um de Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr para o aminoácido na posição 382;

[00734] Asn para o aminoácido na posição 423;

[00735] Asn para o aminoácido na posição 427;

[00736] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, e Tyr para o aminoácido na posição 430;

[00737] His ou Asn para o aminoácido na posição 431;

[00738] qualquer um de Phe, Gly, His, Trp, e Tyr para o aminoácido na posição 434;

[00739] qualquer um de Ile, Leu, e Thr para o aminoácido na posição 436;

[00740] qualquer um de Lys, Leu, Thr, e Trp para o aminoácido na posição 438;

[00741] Lys para o aminoácido na posição 440; e

[00742] Lys para o aminoácido na posição 442 de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a serem modificados não está particularmente limitado e aminoácidos em apenas dois locais podem ser modificados e aminoácidos em três ou mais locais podem ser modificados.

[00743] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como o domínio de ligação ao FcRn, uma modalidade não limitativa da modificação que resulta no efeito de aumento da ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido quando comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana podem ser modificações incluindo Ile para o aminoácido na posição 257, and Ile para o aminoácido na posição 311 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Ile para o aminoácido na posição 257, and His para o aminoácido na posição 434. Outra modalidade não limitativa desta modificação pode incluir Val para o aminoácido na posição 376, and His para o aminoácido na posição 434.

[00744] Receptor Fcy

[00745] Receptor Fcy se refere a um receptor capaz de se ligar à região Fc de anticorpos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonais e inclui todos os membros pertencentes à família de proteínas substancialmente codificadas por um gene de receptor Fcy. Em humanos, a família inclui FcyRI (CD64) incluindo isoformas FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRII (CD32) incluindo as isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16) incluindo a isoforma FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb- NA1 e FcyRIIIb-NA2); bem como todos FcyRs humanos não identificados, isoformas de FcyR e seus alótipos. No entanto, receptor Fcy não é limitado a esses exemplos. Sem ser limitado a eles, FcyR inclui aqueles derivados de humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. FcyR pode ser derivado de qualquer organismo. FcyR de camundongo inclui, sem ser limitado a, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FcyRIII-2 (FcyRIV, CD16-2), bem como FcyRs de camundongo não identificados, isoformas de FcyR e seus alótipos. Tais receptores Fcy preferidos incluem, por exemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), FcyRIIb (CD32), FcyRIIIa (CD16) e/ou FcyRIIIb (CD16). A sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyRI são mostradas nas SEQ ID NOs:18 (NM_000566.3) e 19 (NP_000557.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyRIIa são mostradas nas SEQ ID NOs: 20 (BC020823.1) e 21 (AAH20823.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyIIb são mostradas nas SEQ ID NOs: 22 (BC146678.1) e 23 (AAI46679.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyRIIIa são mostradas nas SEQ ID NOs: 24 (BC033678.1) e 25 (AAH33678.1), respectivamente; e a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyRIIIb são mostradas nas SEQ ID NOs: 26 (BC128562.1) e 27 (AAI28563.1), respectivamente (número de acesso RefSeq é mostrado em cada parênteses). Se um receptor Fcy tem atividade de ligação à região Fc de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonal pode ser avaliada através de avaliação ALPHA (Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificado) (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), método BIACORE baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Surface Plasmon Resonance) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), em adição aos formatos FACS e ELISA descritos acima.

[00746] Em FcyRI (CD64) incluindo FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc, e FcyRIII (CD16) incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2), cadeia α que se liga à porção Fc de IgG está associada com cadeia y comum tendo ITAM responsável por transdução de sinal de ativação intracelular. Entretanto, o domínio citoplásmico de FcyRII (CD32) incluindo isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131) e FcyRIIc contém ITAM. Esses receptores são expressos em muitas células imunes tais como macrófagos, mastócitos e células apresentando antígeno. O sinal de ativação transduzido quando da ligação desses receptores à porção Fc de IgG resulta em aumento da atividade fagocítica e produção de citocina inflamatória de macrófagos, desgranulação de mastócito e a função aumentada de células apresentando antígeno. Receptores Fcy tendo a habilidade em transduzir o sinal de ativação conforme descrito acima podem ser também referidos como receptores Fcy de ativação.

[00747] Entretanto, o domínio intracitoplásmico de FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) contém ITIM responsável pela transdução de sinais inibidores. A reticulação entre FcyRIIb e receptor de célula B (BCR) em células B suprime o sinal de ativação a partir de BCR, o que resulta em supressão de produção de anticorpo via BCR. A reticulação de FcyRIII e FcyRIIb em macrófagos suprime a atividade fagocítica e produção de citocina inflamatória. Receptores Fc tendo a habilidade em transduzir o sinal inibidor conforme acima descrito também são referidos como receptores Fcy inibidores.

[00748] Atividade de ligação ao receptor Fcy

[00749] A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcyR, que está incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, a qualquer um dos receptores Fcy humanos, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb, pode ser confirmada através de formato FACS ou ELISA acima descrito, bem como ALPHA Screen (Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificado), um método BIACORE usando o fenômeno de ressonância de plasmon de superfície (SPR) ou similar (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).

[00750] Avaliação ALPHA é realizada através da tecnologia ALPHA com base no princípio descrito abaixo usando dois tipos de contas: contas doadoras e aceitadoras. Um sinal luminescente é detectado apenas quando moléculas ligadas às contas doadoras interagem biologicamente com moléculas ligadas às contas aceitadoras e quando as duas contas estão localizadas em proximidade grande. Excitado por um feixe de laser, o fotossensibilizador em uma conta doadora converte oxigênio em torno da conta em oxigênio singleto excisado. Quando o oxigênio singleto difunde em torno das contas doadoras e atinge as contas aceitadores localizadas em proximidade grande, uma reação quimioluminescente dentro das contas aceitadoras é induzida. Esta reação resulta por fim em emissão de luz. Se moléculas ligadas às contas doadoras não interagem com moléculas ligadas a contas aceitadoras, o oxigênio singleto produzido por contas doadoras não atinge as contas aceitadoras e reação quimioluminescente não ocorre.

[00751] Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina compreendendo um domínio de ligação a FcyR é imobilizada para as contas doadoras e receptor Fcy marcado com glutationa S-transferase (GST) é imobilizado para as contas aceitadoras. Na ausência de uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a FcyR competitivo, receptor Fcy interage com uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a FcyR de tipo selvagem, induzindo um sinal de 520 a 620 nm como um resultado. Uma molécula de ligação a antígeno tendo um domínio de ligação a FcyR alterado não marcado compete com a molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a FcyR nativo pela interação com o receptor Fcy. A afinidade de ligação relativa pode ser determinada através da quantificação da redução de fluorescência como um resultado de competição. Métodos para biotinilação das moléculas de ligação a antígeno tais como anticorpos usando Sulfo-NHS-biotina ou similar são conhecidos. Métodos apropriados para adição de marcador GST a um receptor Fcy incluem métodos que envolvem fusão de polipeptídeos codificando Fcy e GST em estrutura, expressão do gene fundido usando células introduzidas com um vetor ao qual o gene é operativamente ligado, e então purificação usando uma coluna de glutationa. O sinal induzido pode ser preferivelmente analisado, por exemplo, ajustando a um modelo de competição de um sítio com base em uma análise de regressão não linear usando software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).

[00752] Uma das substâncias para observação de sua interação é imobilizada como um ligante sobre a camada fina de ouro de um sensor chip. Quando luz é posta sobre a superfície traseira do sensor chip de maneira que reflexão total ocorre na interface entre a camada fina de ouro e vidro, a intensidade de luz refletida é parcialmente reduzida em um certo sítio (sinal SPR). A outra substância para observação de sua interação é injetada como um analito sobre a superfície do sensor chip. A massa de molécula de ligante imobilizado aumenta quando o analito se liga ao ligante. Isso altera o índice de refração de solvente na superfície do sensor chip. A mudança em índice de refração causa uma mudança posicional de sinal SPR (por outro lado, a dissociação muda o sinal de volta para a posição original). No sistema Bioacore, a quantidade de mudança descrita acima (isto é, a mudança de massa na superfície do sensor chip) é posta em gráfico no eixo vertical, e então a mudança de massa com o tempo é mostrada como dados medidos (sensorgrama). Parâmetros cinéticos (constante de taxa de associação (ka) e constante de taxa de dissociação (kd)) são determinados a partir da curva de sensorgrama, e afinidade (KD) é determinada a partir da razão entre essas duas constantes. Ensaio de inibição é também, de preferência, usado nos métodos BIACORE. Exemplos de tal ensaio de inibição são descritos em Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010. As atividades de ligação do domínio de ligação ao FcyR incluído na molécula de ligação a antígeno da presente invenção em relação a qualquer um dos receptores de Fcy humanos, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb, pode ser determinada a partir da quantidade de ligação e o valor de KD para cada um dos receptores de Fcy humano calculados usando o sistema Biacore de acordo com os exemplos descritos acima. Aqui, a quantidade de ligação dos vários FcyRs pelos polipeptídeos também é representada por valores obtidos determinando-se a diferença entre os valores de RU de sensogramas que mudaram antes e após interação de vários FcyRs como o analito com cada polipeptídeo e dividindo-as pelas diferenças nos valores de RU de sensogramas que mudaram antes e após captura do polipeptídeos nos chips sensores.

[00753] Uma condição de faixa de pH ácido ou condição de faixa de pH neutro pode, adequadamente, ser usada para as condições de pH para medir a atividade de ligação ao receptor FcyR do domínio de ligação a FcyR incluído na molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio. Uma faixa de pH neutro, como uma condição para medir a atividade de ligação ao receptor Fcy do domínio de ligação ao FcyR da molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio geralmente refere-se a um pH 6,7 a pH 10,0. Preferivelmente, ela é uma faixa indicada com valores de pH arbitrários entre pH 7,0 e pH 8,0; e, preferivelmente, ela é selecionada de pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 e pH 8,0; e particularmente preferivelmente, ela é pH 7,4, que é mais próximo do pH de plasma (sangue) in vivo. Na presente invenção, uma faixa de pH ácido, como uma condição para ter uma atividade de ligação da região Fc e o receptor Fcy contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção e o receptor Fcy, geralmente indica pH 4,0 a pH 6,5. Preferivelmente, ela indica pH 5,5 a pH 6,5 e, particularmente preferivelmente, ela indica pH 5,8 a pH 6,0, que está próximo do pH no endossomo inicial in vivo. Com relação à temperatura usada como condição de medição, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação ao receptor Fcy e o receptor Fcy humano pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10° C e 50° C. Preferivelmente, uma temperatura entre 15 °C e 40 °C é usada para determinar a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a receptor Fcy humano e o receptor Fcy. Mais preferivelmente, qualquer temperatura entre 20 °C e 35 °C, tal como qualquer uma de a partir de 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C ou 35 °C, pode ser similarmente usada para determinar a afinidade de ligação entre o domínio de ligação ao receptor Fc e o receptor Fcy. Uma temperatura de 25 °C é um exemplo não limitante em uma modalidade da presente invenção.

[00754] Domínio de Ligação a FcyR

[00755] Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, um domínio de ligação a receptor Fcy tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido, um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy (daqui em diante também referido como um domínio de ligação seletiva ao FcyR). Exemplos preferidos do domínio de ligação ao FcyR incluem regiões Fc de imunoglobulinas de tipo IgG, domínios de ligação a FcyR de imunoglobulinas de tipo IgG, anticorpos anti-FcyR e moléculas estruturais anti-FcyR. Um domínio tendo originalmente atividade de ligação ao FcyR pode ser adequadamente usado como está como o domínio. Quando o domínio tem atividade de ligação ao FcyR mais fraca ou nenhuma, a atividade de ligação ao FcyR pode ser conferida alterando-se aminoácidos que formam o domínio de ligação ao FcyR na molécula de ligação a antígeno. Alternativamente, a atividade de ligação ao FcyR pode ser aumentada alterando-se aminoácidos no domínio tendo originalmente atividade de ligação ao FcyR. Alterações de aminoácidos do domínio de ligação ao FcyR que resultam em tal atividade de ligação desejada podem ser descobertas comparando-se a atividade de ligação ao FcyR antes e após a alteração de aminoácidos. Uma modalidade não limitativa de tais domínios de ligação a FcyR é, por exemplo, o domínio de ligação ao FcyR incluído na região Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) humanas. Por exemplo, quando a região Fc de um anticorpo IgG usado como o domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, o domínio de ligação ao FcyR incluído na região Fc pode ser usado como o domínio de ligação ao FcyR.

[00756] Domínio de ligação a FcyR tendo atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy

[00757] Se ou não um domínio de ligação a FcyR da presente invenção tem atividade de ligação seletiva pode ser confirmado comparando atividades de ligação dos respectivos receptores Fcy, determinadas através do método descrito na seção mencionada acima sobre atividade de ligação a receptores Fcy. Um domínio de ligação a FcyR com atividade de ligação maior a receptores Fcy inibidores do que receptores Fcy de ativação pode ser usado como o domínio de ligação a FcyR seletivo incluído na molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção. Em uma modalidade não limitante, um domínio de ligação a Fcy com atividade de ligação maior a FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) do que um receptor Fcy de ativação selecionado do grupo consistindo em FcyRI(CD64) incluindo FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIII(CD16) incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2) e FcyRII(CD32) incluindo isoformas FcyRIIa e FcyRIIc (incluindo alótipos H131 e R131) pode ser usado como um domínio de ligação a FcyR seletivo incluindo em uma molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção. Ainda, em uma modalidade não limitante da presente invenção, um domínio de ligação a FcyR com atividade de ligação maior a FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2 do que a FcyRIa, FcyRIIb e FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIc pode ser usado como um domínio de ligação a FcyR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção. Se um domínio de ligação a FcyR a ser testado tem atividade de ligação seletiva a receptores Fcy pode ser determinado comparando o valor (razão) obtido dividindo os valores KD do domínio de ligação a FcyR para FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIB incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIb pelos valores KD para FcyRIIb-1 e/ou FcyRII2-b, onde os valores KD são determinados através do método descrito na seção mencionada acima sobre atividade de ligação a receptores Fcy ou, mais especificamente, comparando os índices de seletividade de FcyR mostrados na Equação 1.

[00758] [Equação 1]

[00759] Índice de seletividade de FcyR = valor KD para FcyR de ativação/valor KD para Fcy inibidor

[00760] Na Equação 1 mencionada acima, "Fcy de ativação" se refere a FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIc e FcyR inibidor se refere a FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2. Embora o FcyR de ativação e FcyR inibidor usados para mas medições do valor KD possam ser selecionados de qualquer combinação, em uma modalidade não limitante, um valor (razão) obtido dividindo o valor KD para FcyRIIa incluindo alótipo H131 pelo valor KD para FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2 pode ser usado.

[00761] Por exemplo, os índices de seletividade para FcyR têm valores de 1,2 ou maior, 1,3 ou maior, 1,4 ou maior, 1,5 ou maior, 1,6 ou maior, 1,7 ou maior, 1,8 ou maior, 1,9 ou maior, 2 ou maior, 3 ou maior, 5 ou maior, 6 ou maior, 7 ou maior, 8 ou maior, 9 ou maior, 10 ou maior, 15 ou maior, 20 ou maior, 25 ou maior, 30 ou maior, 35 ou maior, 40 ou maior, 45 ou maior, 50 ou maior, 55 ou maior, 60 ou maior, 65 ou maior, 70 ou maior, 75 ou maior, 80 ou maior, 85 ou maior, 90 ou maior, 95 ou maior, 100 ou maior, 110 ou maior, 120 ou maior, 130 ou maior, 140 ou maior, 150 ou maior, 160 ou maior, 170 ou maior, 190 ou maior, 200 ou maior, 210 ou maior, 220 ou maior, 230 ou maior, 240 ou maior, 250 ou maior, 260 ou maior, 270 ou maior, 280 ou maior, 290 ou maior, 300 ou maior, 310 ou maior, 320 ou maior, 330 ou maior, 340 ou maior, 350 ou maior, 360 ou maior, 370 ou maior, 380 ou maior, 390 ou maior, 400 ou maior, 410 ou maior, 420 ou maior, 430 ou maior, 440 ou maior, 450 ou maior, 460 ou maior, 470 ou maior, 480 ou maior, 490 ou maior, 500 ou maior, 520 ou maior, 540 ou maior, 560 ou maior, 580 ou maior, 600 ou maior, 620 ou maior, 640 ou maior, 660 ou maior, 680 ou maior, 700 ou maior, 720 ou maior, 740 ou maior, 760 ou maior, 780 ou maior, 800 ou maior, 820 ou maior, 840 ou maior, 860 ou maior, 880 ou maior, 900 ou maior, 920 ou maior, 940 ou maior, 960 ou maior, 980 ou maior, 1000 ou maior, 1500 ou maior, 2000 ou maior, 2500 ou maior, 3000 ou maior, 3500 ou maior, 4000 ou maior, 4500 ou maior, 5000 ou maior, 5500 ou maior, 6000 ou maior, 6500 ou maior, 7000 ou maior, 7500 ou maior, 8000 ou maior, 8500 ou maior, 9000 ou maior, 9500 ou maior, 10000 ou maior ou 100000 ou maior.

[00762] Uma modalidade não limitante do domínio de ligação a FcyR seletivo em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção inclui, por exemplo, regiões Fc produzidas através da modificação do domínio de ligação a FcyR incluído em uma região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (EQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17). Um exemplo de um método para produção das regiões Fc modificadas inclui o método descrito na seção mencionada acima sobre alterações de aminoácido. Exemplos de tais regiões Fc alteradas incluem uma região Fc onde aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp ou uma região Fc onde aminoácido na posição 328 (numeração EU) é Glu em IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). Uma região Fc onde aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp ou uma região Fc onde aminoácido na posição 328 (numeração EU) é Glu em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc mostram atividade de ligação maior a FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2 do que a FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo FV158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIc.

[00763] Regiões Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo que estão incluídas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc podem ser também regiões Fc e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc que mantém ou mostra atividade de ligação reduzida a FcyR de ativação (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-Na2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIc) quando comparado com uma região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (daqui em diante referida como uma região Fc do tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc do tipo selvagem.

[00764] Comparado com uma região Fc do tipo selvagem e uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc do tipo selvagem, o grau da redução mencionada acima em atividade de ligação a FcyR de ativação de uma região Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo incluída em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc é, por exemplo, 99% ou menos, 98% ou menos, 97% ou menos, 96% ou menos, 95% ou menos, 94% ou menos, 93% ou menos, 92% ou menos, 91% ou menos, 90% ou menos, 88% ou menos, 86% ou menos, 84% ou menos, 82% ou menos, 80% ou menos, 78% ou menos, 76% ou menos, 74% ou menos, 72% ou menos, 70% ou menos, 68% ou menos, 66% ou menos, 64% ou menos, 62% ou menos, 60% ou menos, 58% ou menos, 56% ou menos, 54% ou menos, 52% ou menos, 50% ou menos, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos, 0,5% ou menos, 0,4% ou menos, 0,3% ou menos, 0,2% ou menos, 0,1% ou menos, 0,05% ou menos, 0,01% ou menos ou 0,005% ou menos ou menos.

[00765] As regiões Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc que estão incluídas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, podem também ser regiões Fc e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc que mostram atividade de ligação aumentada a FcyR inibidor (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) quando comparado com uma região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (daqui em diante referida como região Fc do tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc do tipo selvagem.

[00766] Comparado com uma região Fc do tipo selvagem e uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc do tipo selvagem, o grau do aumento mencionado acima em atividade de ligação a FcyR inibidor de uma região Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo incluída em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc é, por exemplo, 101% ou maior, 102% ou maior, 103% ou maior, 104% ou maior, 105% ou maior, 106% ou maior, 107% ou maior, 108% ou maior, 109% ou maior, 110% ou maior, 112% ou maior, 114% ou maior, 116% ou maior, 118% ou maior, 120% ou maior, 122% ou maior, 124% ou maior, 126% ou maior, 128% ou maior, 130% ou maior, 132% ou maior, 134% ou maior, 136% ou maior, 138% ou maior, 140% ou maior, 142% ou maior, 144% ou maior, 146% ou maior, 148% ou maior, 150% ou maior, 155% ou maior, 160% ou maior, 165% ou maior, 170% ou maior, 175% ou maior, 180% ou maior, 185% ou maior, 190% ou maior, 195% ou maior, 2 vezes ou maior, 3 vezes ou maior, 4 vezes ou maior, 5 vezes ou maior, 6 vezes ou maior, 7 vezes ou maior, 8 vezes ou maior, 9 vezes ou maior, 10 vezes ou maior, 20 vezes ou maior, 30 vezes ou maior, 40 vezes ou maior, 50 vezes ou maior, 60 vezes ou maior, 70 vezes ou maior, 80 vezes ou maior, 90 vezes ou maior, 100 vezes ou maior, 200 vezes ou maior, 300 vezes ou maior, 400 vezes ou maior, 500 vezes ou maior, 600 vezes ou maior, 700 vezes ou maior, 800 vezes ou maior, 900 vezes ou maior, 1000 vezes ou maior, 10000 vezes ou maior ou 100000 vezes ou maior.

[00767] Ainda, a região Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e a molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc pode ser uma região Fc e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc que mantém ou mostra atividade de ligação reduzida a FcyR de ativação (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIc) quando comparado com uma região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (daqui em diante referida como região Fc do tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc do tipo selvagem; e mostra atividade de ligação aumentada a FcyR inibidor (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) quando comparado com uma região Fc apresentada como IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (daqui em diante referida como uma região Fc do tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc do tipo selvagem.

[00768] Ainda, a região Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo incluída em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e a molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc pode ser uma região Fc e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc com grau maior de aumento de atividade de ligação a um receptor Fcy inibidor (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) do que a um receptor Fcy de ativação (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131), quando comparado com uma região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO:15), IgG3 (SEQ ID NO:16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (daqui em diante referida como uma região Fc do tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc do tipo selvagem.

[00769] Na presente invenção, pelo menos outra alteração na região Fc pode ser adicionada à região Fc em que aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e a região Fc em que aminoácido na posição 328 (numeração EU) é Glu, pelas modalidades e tal descrito na seção mencionada acima sobre alterações de aminoácido. Em adição a essas alterações, alterações adicionais podem ser também adicionadas. As alterações adicionais podem ser selecionadas de qualquer uma das substituições, deleções ou modificações de um aminoácido, e suas combinações. Por exemplo, alterações que aumentam atividade de ligação a FcyRIIb enquanto mantendo ou reduzindo atividade de ligação a FcyRIIa (tipo H) e FcyRIIa (tipo R) podem ser adicionadas. Adição de tais alterações melhora a seletividade de ligação a FcyRIIb com relação a FcyRIIa.

[00770] Dentre essas, alterações que melhoram a seletividade de ligação a FcyRIIb com relação a FcyRIIa (tipo R) é favorável, e alterações que melhoram a seletividade de ligação a FcyRIIb com relação a FcyRIIa (tipo H) é mais favorável. Exemplos de substituições de aminoácido preferidas para tais alterações incluem: uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Asn na posição 325 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Val; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Gly na posição 236 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) com Asn; uma alteração através de substituição de Asn na posição 325 (numeração EU) com Ser; uma alteração através de substituição de Leu na posição 235 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Val na posição 266 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Leu na posição 235 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Leu na posição 235 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) com Gly; uma alteração através de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) com Gly; uma alteração através de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Thr; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Ser; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Pro na posição 331 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Pro na posição 331 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Pro na posição 331 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) com Val; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Arg; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Gly; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Asn; uma alteração através de substituição de Ser na posição 324 (numeração EU) com Val; uma alteração através de substituição de Val na posição 266 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) com Gly; uma alteração através de substituição de Ile na posição 332 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Ser na posição 324 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Glu na posição 333 (numeração EU) com Pro; uma alteração através de substituição de Tyr na posição 300 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Ser na posição 337 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Tyr na posição 300 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Thr na posição 335 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) com Asn; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Val; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Pro; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Lyz na posição 326 (numeração EU) com His; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Val na posição 266 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Tyr na posição 300 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Val; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Thr; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Ser; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com His; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Pro; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Gln na posição 295 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) com Asn; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Lys; uma alteração através de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Arg; uma alteração através de substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Ser; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Thr; uma alteração através de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Asn; e uma alteração através de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Met.

[00771] Substituições de aminoácido favoráveis dentre essas alterações são, por exemplo, uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Phe; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Val; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Asn; uma alteração através de substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) com Gly; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Gln; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Tyr; uma alteração através de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Lys; uma alteração através de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Arg; uma alteração através de substituição de Glu na posição 2333 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de His na posição 268 (numeração EU) com Glu; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) com Trp; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Ser; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Thr; uma alteração através de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) com Ile; uma alteração através de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) com Leu; uma alteração através de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) com Met; uma alteração através de substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) com Asp; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Ala; uma alteração através de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) com Asn; uma alteração através de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Met.

[00772] A alteração mencionada acima pode ser em uma posição, ou alterações em duas ou mais posições podem ser combinadas. Exemplos favoráveis de tais combinações são aqueles descritos nas Tabelas 14 e 15, Tabelas 17 a 24 e Tabelas 26 a 28.

[00773] A região Fc produzida através da alteração do domínio de ligação a FcyR incluído na região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou Ig4 (SEQ ID NO: 17) podem ser dada como um exemplo de outra modalidade não limitante do domínio de ligação a FcyR seletivo incluído nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Um método para produção das regiões Fc modificadas é, por exemplo, o método descrito na seção mencionada acima sobre alterações de aminoácido. Exemplos de tais regiões Fc alteradas incluem uma região Fc onde aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG1 humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). Uma região Fc onde aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc mostra atividade de ligação maior com FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2 do que FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-Na1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131 e/ou FcyRIIc.

[00774] Na presente invenção, pelo menos uma alteração na região Fc pode ser adicionada à região Fc onde aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e o aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly, pelas modalidades e similar descritas na seção mencionada acima sobre alterações de aminoácido. Em adição a essas alterações, alterações adicionais podem ser também adicionadas. As alterações adicionais podem ser selecionadas de qualquer uma de substituições, deleções e modificações de um aminoácido e suas combinações. Por exemplo, alterações que mantêm ou reduzem atividade de ligação a receptores Fcy de ativação (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIib-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131) pode ser adicionadas. Alterações que aumentam a atividade de ligação a receptores Fcy inibidores (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) enquanto mantendo ou reduzindo a atividade de ligação a FcyRIIa (tipo H) e FcyRIIa (tipo R) podem ser adicionadas. Ainda, alterações onde o grau de aumento de atividade de ligação a receptores Fcy (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) é maior do que o grau de aumento de atividade de ligação a receptores Fcy de ativação (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alótipo V158, FcyRIIIa incluindo alótipo F158, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo alótipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo alótipo H131, FcyRIIa incluindo alótipo R131) podem ser também adicionadas. Adição de tais alterações melhora a seletividade de ligação a FcyRIIb com relação a FcyRIIa.

[00775] Um exemplo de uma modalidade não limitante da região Fc alterada compreendendo um domínio de ligação a FcyR seletivo inclui uma região Fc alterada onde pelo menos um ou mais dos aminoácidos selecionados do grupo que consiste naqueles das posições 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 332, 332, 333, 355, 356, 358, 396, 409 e 419 (numeração EU) são substituídas na região Fc onde aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[00776] Ainda, um exemplo de uma modalidade não limitante da região Fc alterada compreendendo um domínio de ligação a FcyR seletivo é uma região Fc alterada compreendendo qualquer um ou mais de:

[00777] Asp na posição de aminoácido 233,

[00778] Tyr na posição de aminoácido 234,

[00779] Asp na posição de aminoácido 237,

[00780] Ile na posição de aminoácido 264,

[00781] Glu na posição de aminoácido 265,

[00782] 266, Ile na posição de aminoácido 264, Glu na posição de aminoácido 265, qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido

[00783] 267, qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido

[00784] 268, qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido

[00785] Asp na posição de aminoácido 269,

[00786] Asp na posição de aminoácido 269, qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272,

[00787] 296, Gln na posição 274,Asp ou Phe na posição de aminoácido

[00788] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326,

[00789] Gly na posição de aminoácido 327,

[00790] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330,

[00791] Ser na posição de aminoácido 331,

[00792] Thr na posição de aminoácido 332,

[00793] 333, Ala ou Asp na posição de aminoácido 326, Gly na posição de aminoácido 327, Lys ou Arg na posição de aminoácido 330, Ser na posição de aminoácido 331, Thr na posição de aminoácido 332, qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido

[00794] Gln na posição de aminoácido 355,

[00795] Glu na posição de aminoácido 356,

[00796] Met na posição de aminoácido 358,

[00797] Gln na posição de aminoácido 355, Glu na posição de aminoácido 356, Met na posição de aminoácido 358, qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396,

[00798] Arg na posição de aminoácido 409,

[00799] Arg na posição de aminoácido 409, Glu na posição de aminoácido 419, mostradas pela numeração EU, na região Fc onde aminoácido na posição 238 é Asp e aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[00800] Exemplos de uma modalidade não limitante de região Fc que compreende ainda pelo menos outra alteração na região Fc e compreende ainda alterações adicionais mencionadas acima incluem regiões Fc mostradas nas Tabelas 5-1 a 5-7. Tabela 5-1

[00801] Molécula de Ligação a Antígeno

[00802] Na presente invenção, "uma molécula de ligação a antígeno" é usada no sentido mais amplo para referir-se a uma molécula compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação ao receptor Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy (um domínio de ligação seletiva ao FcyR). Especificamente, as moléculas de ligação a antígeno incluem vários tipos de moléculas contanto que elas exibam a atividade de ligação a antígeno. Moléculas em que um domínio de ligação a antígeno é ligado a uma região Fc incluem, por exemplo, anticorpos. Anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais únicos (incluindo anticorpos agonísticos ou anticorpos antagonísticos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e similar. Alternativamente, quando usados como fragmentos de anticorpo, eles preferivelmente incluem domínios de ligação de antígeno e fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, Fab, F(ab’)2, scFv e Fv). Moléculas de base em que estruturas tridimensionais, tais como a estrutura de proteína em barril α/β estável já conhecida, são usadas como uma base e apenas algumas porções das estruturas são transformadas em bibliotecas para construir domínios de ligação a antígeno que são também incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.

[00803] Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode conter pelo menos algumas porções de uma região Fc que faz a mediação da ligação de FcRn e receptor Fcy. Em uma modalidade não limitante, a molécula de ligação a antígeno inclui, por exemplo, anticorpos e proteínas de fusão Fc. Uma proteína de fusão se refere a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo tendo uma primeira sequência de aminoácido que é ligada a um polipeptídeo tendo uma segunda sequência de aminoácido que se ligaria naturalmente na natureza. Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender a sequência de aminoácido de pelo menos uma porção de uma região Fc (por exemplo, uma porção de uma região Fc responsável pela ligação a FcRn ou uma porção de uma região Fc responsável pela ligação ao receptor Fcy) e um polipeptídeo não imunoglobulina contendo, por exemplo, a sequência de aminoácido do domínio de ligação a ligante de um receptor ou um domínio de ligação a receptor de um ligante. As sequências de aminoácido podem estar presentes em proteínas separadas que são transportadas juntas para uma proteína de fusão ou geralmente podem estar presentes em uma proteína única; no entanto, elas estão incluídas em uma nova disposição em um polipeptídeo de fusão. Proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, através de síntese química ou através de técnicas de recombinação genética para expressar um polinucleotídeo codificando regiões de peptídeo em uma disposição desejada.

[00804] Os respectivos domínios da presente invenção, tais como o domínio de ligação a antígeno, o domínio tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e o domínio de ligação ao receptor de Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy (domínio de ligação seletiva ao FcyR), podem ser ligados entre si através de ligantes ou diretamente através de ligações polipeptídicas. Os ligantes compreendem ligantes de peptídeo arbitrários que podem ser introduzidos através de engenharia genética e ligantes revelados em, por exemplo, Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305. No entanto, ligantes de peptídeo são preferidos na presente invenção. O comprimento dos ligantes de peptídeo não é particularmente limitado e pode ser adequadamente selecionado por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito. O comprimento é preferivelmente de cinco aminoácidos ou mais (sem limitação particular, o limite superior é geralmente 30 aminoácidos ou menos, preferivelmente 20 aminoácidos ou menos) e particularmente preferivelmente 15 aminoácidos.

[00805] Por exemplo, tais ligantes de peptídeo incluem preferivelmente:

[00806] Ser

[00807] Gly-Ser

[00808] GlyGlySer

[00809] Ser-Gly-Gly

[00810] Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 28)

[00811] Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 29)

[00812] Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 30)

[00813] Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 31)

[00814] Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 32)

[00815] Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 33)

[00816] Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 34)

[00817] Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 35)

[00818] (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 30))n

[00819] (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 31))n

[00820] em que n é um inteiro de 1 ou mais. O comprimento ou sequências de ligantes de peptídeo podem ser selecionados consequentemente por aqueles versados na técnica dependendo do propósito.

[00821] Ligantes sintéticos (agentes de reticulação químicos) são rotineiramente usados para reticular peptídeos, e, por exemplo:

[00822] N-hidróxi succinimida (NHS),

[00823] dissuccinimidil suberato (DSS),

[00824] bis(sulfossuccinimidil) suberato (BS3),

[00825] ditiobis(succinimidil propionato) (DPS),

[00826] ditiobis(sulfossuccinimidil propionato) (DTSSP),

[00827] etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS),

[00828] etileno glicol bis(sulfossuccinimidil succinato) (sulf-EGS),

[00829] succinimidil tartrato (DST),

[00830] dissulfossuccinimidil tartrato (sulfo-DST),

[00831] bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES)e

[00832] bis[2-(sulfossuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo- BSOCOES).

[00833] Esses agentes de reticulação estão comercialmente disponíveis.

[00834] Quando ligantes múltiplos para ligação dos respectivos domínios são usados, eles podem ser todos do mesmo tipo ou podem ser de tipos diferentes.

[00835] Além dos ligantes exemplificados acima, ligantes com marcadores de peptídeo tais como marcador His, marcador HA, marcador myc e marcador FLAG podem ser também adequadamente usados. Ainda, ligação hidrogênio, ligação dissulfeto, ligação covalente, interação iônica e propriedades de ligação uns com os outros como um resultado de combinação dos mesmos podem ser adequadamente usadas. Por exemplo, a afinidade entre CH1 e CL de anticorpo pode ser usada, e regiões Fc se originando dos anticorpos biespecíficos descritos acima podem ser também usadas para associação de região Fc hetero. Além disso, ligações dissulfeto formadas entre domínios podem ser também adequadamente usadas.

[00836] A fim de ligar respectivos domínios via ligação de peptídeo, polinucleotídeos codificando os domínios são unidos em estrutura. Métodos conhecidos para ligação de polinucleotídeos em estrutura incluem técnicas tal como ligação de fragmentos de restrição, PCR de fusão e PCR de sobreposição. Tais métodos podem ser apropriadamente usados sozinhos ou em combinação para construir moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Na presença invenção, os termos "ligado" e "fundido" ou "ligação" e "fusão" são usados intercomutavelmente. Esses termos significam que dois ou mais elementos ou componentes tais como polipeptídeos são unidos para formar uma estrutura única através de qualquer meio incluindo os dispositivos de ligação químicos descritos acima e técnicas de recombinação genética. Fusão em estrutura significa, quando dois ou mais elementos ou componentes são polipeptídeos, ligação de duas ou mais unidades de estruturas de leitura para formar uma estrutura de leitura mais longa contínua enquanto mantendo as estruturas de leitura corretas dos polipeptídeos. Quando duas moléculas de Fab são usadas como um domínio de ligação a antígeno, um anticorpo, que é uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em que o domínio de ligação a antígeno é ligado em estrutura a uma região Fc via ligação de peptídeo sem ligante, pode ser usado como uma molécula de ligação a antígeno preferida da presente invenção. Exemplos de várias modalidades não limitativas da molécula de ligação a antígeno da presente invenção incluindo a estrutura de anticorpo são mostrados abaixo:

[00837] um anticorpo o qual compreende F(ab')2 compreendendo duas regiões variáveis e tendo atividade de ligação a antígeno que varia dependendo das condições de concentração de íons e uma região Fc tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de pH ácido e atividade de ligação seletiva ao um receptor de Fcy;

[00838] um anticorpo o qual compreende F(ab')2 em que uma das regiões variáveis que formam o F(ab')2 tem uma atividade de ligação a antígeno que varia dependendo das condições de concentração de íons e outra região variável tem uma atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy e uma região de Fc que tem atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido; e

[00839] um anticorpo que compreende F(ab')2, em que uma das regiões variáveis que formam o F(ab')2 tem atividade varia dependendo das condições de concentração de íons e outra região variável tem atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e uma região Fc tendo atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy.

[00840] Quando um anticorpo compreende a estrutura (3) mencionada acima, uma região variável tendo uma atividade de ligação ao FcRn que varia dependendo das condições de pH pode, de preferência, ser usada como a região variável tendo uma atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido mencionada acima. Sem estar preso a uma teoria em particular, se uma região variável cuja atividade de ligação ao FcRn varia dependendo das condições de pH é usada e se a região variável não tem atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro, o anticorpo é liberado do FcRn na superfície celular quando o anticorpo ligado ao FcRn no endossomo ácido é transportado para a superfície da célula e pode ser facilmente reciclado para o plasma.

[00841] Anticorpos biespecíficos e métodos para produzi-los

[00842] Métodos para produção de anticorpos biespecíficos podem ser aplicados como uma modalidade do método para preparo de anticorpos que compreendem as estruturas (2) e (3) mencionadas acima. Anticorpos biespecíficos são anticorpos que compreendem dois tipos de regiões variáveis que se ligam especificamente a diferentes epítopos. Anticorpos biespecíficos de tipo IgG podem ser secretados a partir de um hibridoma híbrido (quadroma) produzido pela fusão de dois tipos de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein et al. Nature (1983) 305, 537-540).

[00843] Quando um anticorpo biespecífico é produzido usando técnicas de recombinação, tal como aquelas descritas na seção mencionada acima sobre anticorpos, pode-se adotar um método que introduz genes que codificam cadeias pesadas contendo os dois tipos de regiões variáveis de interesse em células que os coexpressam. No entanto, mesmo quando somente a combinação de cadeia pesada é considerada, tal método de coexpressão produzirá uma mistura de (i) uma combinação de um par de cadeias pesadas no qual uma das cadeias pesadas contém uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e a outra cadeia pesada contém uma região variável que se liga a um segundo epítopo, (ii) uma combinação de um par de cadeias pesadas o qual inclui apenas cadeias pesadas contendo uma região variável que se liga ao primeiro epítopo e (iii) uma combinação de um par de cadeias pesadas o qual inclui apenas cadeias pesadas contendo uma região variável que se liga ao segundo epítopo, as quais estão presentes em uma proporção molecular de 2:1:1. É difícil purificar moléculas de ligação a antígeno que contêm a combinação desejada de cadeias pesadas a partir da mistura de três tipos de combinações de cadeias pesadas.

[00844] Quando de produção de anticorpos biespecíficos usando técnicas de recombinação tal como aquelas descritas acima, anticorpos biespecíficos que compreendem a hetero combinação de cadeias pesadas podem, de preferência, ser secretados ao alterar o domínio CH3 que constitui uma cadeia pesada usando substituições de aminoácidos apropriadas. Especificamente, ele é um método para aumentar a formação de cadeia pesada heterogênea e inibir a formação de cadeia pesada homogênea substituindo a cadeia lateral de aminoácido em um domínio CH3 de cadeia pesada por uma cadeia lateral mais densa (botão (ou significando "projeção")), ao mesmo tempo em que se substitui a cadeia lateral de aminoácido no outro domínio CH3 de cadeia pesada por uma cadeia lateral menor (buraco (significando "vazio")), de modo que o "botão" esteja colocado no "buraco" (documento WO 1996/027011 , Ridgway et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant et al. (Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).

[00845] Além disso, técnicas conhecidas para produção de anticorpos biespecíficos incluem aquelas nas quais um meio para regular a associação de polipeptídeo ou associação para formar multímeros heteroméricos constituídos pelos polipeptídeos é aplicado à associação de cadeias pesadas. Especificamente, para produzir anticorpos biespecíficos, pode-se usar métodos para regulação de associação de cadeias pesadas ao alterar resíduos de aminoácidos que formam a interface entre cadeias pesadas, de modo a formar duas cadeias pesadas com diferentes sequências, ao mesmo tempo em que se inibe a associação de cadeias pesadas tendo uma sequência idêntica (documento WO 2006/106905). Tais métodos podem ser usados para produzir anticorpos biespecíficos.

[00846] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc derivada de um anticorpo biespecífico descrito acima podem ser adequadamente usados como a região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno. Mais especificamente, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc podem ser adequadamente usados nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 349, conforme indicado pela numeração EU, é Cys e o aminoácido na posição 366 é Trp e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356, conforme indicado pela numeração EU, é Cys, o aminoácido na posição 366 é Ser, o aminoácido na posição 368 é Ala e o aminoácido na posição 407 é Val.

[00847] Em outra modalidade não limitativa da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser adequadamente usados como a região Fc. Na modalidade acima, o aminoácido na posição 409 pode ser Glu em vez de Asp e o aminoácido na posição 399 pode ser Arg em vez de Lys. Adicionalmente, além do aminoácido Lys na posição 399, Asp pode ser adequadamente adicionado como o aminoácido na posição 360 ou Asp pode ser adequadamente adicionado como o aminoácido na posição 392.

[00848] Em ainda outra modalidade não limitativa da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU é Glu e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser adequadamente usados como a região Fc.

[00849] Em ainda outra modalidade não limitativa da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU é Glu e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser adequadamente usados como a região Fc.

[00850] Em ainda outra modalidade não limitativa da presente invenção, qualquer uma das modalidades indicadas abaixo, nas quais o acima foram combinados, pode ser adequadamente usada como a região Fc:

[00851] (i) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e o aminoácido na posição 370 é Glu e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 357 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU pode ser Asp em vez de Glu e o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU pode ser usado em vez do aminoácido Glu na posição 370 de acordo com a numeração EU);

[00852] (ii) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e o aminoácido na posição 439 é Glu e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido Asp na posição 360 de acordo com a numeração EU, o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU ou o aminoácido Asp na posição 439 de acordo com a numeração EU pode ser usado em vez do aminoácido Glu na posição 439 de acordo com a numeração EU);

[00853] (iii) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU é Glu e o aminoácido na posição 439 é Glu e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys; e dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 370 é Glu e o aminoácido na posição 439 é Glu e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys, o aminoácido na posição 357 é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU pode ser substituído por Glu e, além disso, quando o aminoácido na posição 370 é substituído por Glu, o aminoácido na posição 439 pode ser Asp em vez de Glu ou o aminoácido Asp na posição 392 pode ser usado em vez do aminoácido Glu na posição 439).

[00854] Ainda, em outra modalidade não limitativa da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys e, da sequência de aminoácidos do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 435 de acordo com a numeração EU é Arg e o aminoácido na posição 439 é Glu, também podem ser adequadamente usados.

[00855] Em ainda outra modalidade não limitativa da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc nos quais, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 357 é Lys e, da sequência de aminoácidos do outra dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoácido na posição 435 é Arg e o aminoácido na posição 439 é Glu, podem também ser usados adequadamente.

[00856] Adicionalmente, além da técnica mencionada acima de associação cadeias pesadas heterólogas, a tecnologia CrossMab a qual é conhecida como uma tecnologia para associação de cadeias leves heterólogas, na qual uma cadeia leve que forma uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e uma cadeia leve que forma uma região variável que se liga a um segundo epítopo são, respectivamente, associadas a uma cadeia pesada que forma uma região variável que se liga ao primeiro epítopo e uma cadeia pesada que forma uma região variável que se liga ao segundo epítopo (Scaefer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011), 108, 11187-11192)) pode também ser usada para produzir as moléculas de ligação a antígeno proporcionadas pela presente invenção.

[00857] Aprimoramento de Farmacocinética

[00858] No presente invenção, a "capacidade de eliminar antígenos no plasma" refere-se à capacidade de eliminar antígenos do plasma que estão presentes no plasma quando as moléculas de ligação a antígeno são administradas in vivo ou quando as moléculas de ligação a antígeno são secretadas in vivo. Consequentemente, na presente invenção, a "capacidade de moléculas de ligação a antígeno de eliminar antígenos no plasma é aumentada" significa que, quando as moléculas de ligação a antígeno são administradas, a taxa de eliminação de antígeno do plasma é acelerada quando comparado com uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno não varia em função da concentração de íons, uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio de ligação ao FcRn sem atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido ou uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio de ligação ao receptor Fcy sem atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy é administrada. A capacidade de uma molécula de ligação a antígeno de eliminar antígenos no plasma de forma aumentada ou não pode ser determinada, por exemplo, através de administração de antígenos solúveis e da molécula de ligação a antígeno in vivo e, então, medindo a concentração de antígeno solúvel no plasma após administração. Quando a concentração de antígenos solúveis no plasma é reduzida após administração de antígenos solúveis e das moléculas de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons, o domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação ao receptor Fcy sem atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy (um domínio de ligação seletiva ao FcyR), a capacidade das moléculas de ligação a antígeno de eliminar antígenos no plasma é considerada como sendo aumentada. O antígeno solúvel pode ser um antígeno que está ligado a uma molécula de ligação a antígeno ou um antígeno que não está ligado a uma molécula de ligação a antígeno no plasma e sua concentração pode ser determinada como uma "concentração plasmática de antígeno ligado à molécula de ligação a antígeno" ou como uma "concentração plasmática de antígeno não ligado à molécula de ligação a antígeno", respectivamente (o último é sinônimo de "concentração plasmática de antígeno livre"). A "concentração plasmática total de antígeno" significa a soma de concentrações do antígeno ligado à molécula de ligação a antígeno e do antígeno não ligado por uma molécula de ligação a antígeno ou a "concentração plasmática de antígeno livre", a qual é a concentração do antígeno não ligado por uma molécula de ligação a antígeno. Assim, a concentração de antígeno solúvel pode ser determinada como a "concentração plasmática total de antígeno". Diversos métodos para medição da "concentração plasmática total de antígeno" ou da "concentração plasmática de antígeno livre" são bem conhecidos na técnica, conforme descrito a seguir.

[00859] Na presente invenção, "aumento da farmacocinética", "melhora da farmacocinética" e "farmacocinética superior" podem ser representadas como "aumento da retenção no plasma (sangue)", "melhora da retenção no plasma (sangue)", "retenção no plasma (sangue) superior" e "retenção no plasma (sangue) prolongada". As expressões são sinônimas.

[00860] Na presente invenção, "melhora da farmacocinética" significa não apenas prolongamento do período até a eliminação do plasma (por exemplo, até a molécula de ligação a antígeno ser degradada intracelularmente ou similar e não poder retornar para o plasma) após administração da molécula de ligação a antígeno a seres humanos, ou animais não seres humanos tais como camundongos, ratos, macacos, coelhos e cachorros, mas também prolongamento da retenção no plasma da molécula de ligação a antígeno em uma forma que permita ligação a antígeno (por exemplo, em uma forma livre de antígeno da molécula de ligação a antígeno) durante o período de administração até eliminação devido à degradação. IgG nativa pode se ligar a FcRn de animais não seres humanos. Por exemplo, camundongo pode ser preferivelmente usado para ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da invenção uma vez que IgG humana nativa pode se ligar a FcRn de camundongo muito mais forte do que FcRn humano (Int. Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). Como outro exemplo, camundongo em que seus genes FcRn nativos são deficientes e um transgene para gene FcRn humano é carregado para ser expresso (Methods Mol. Biol. 2010; 602: 93-104) pode ser também preferivelmente usado como um sujeito a ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da invenção descrita a seguir. Especificamente, "aperfeiçoamento da farmacocinética" também inclui prolongamento do período até eliminação devido à degradação da molécula de ligação a antígeno não ligada a antígenos (a forma livre de antígeno de molécula de ligação a antígeno).

[00861] A molécula de ligação ao antígeno no plasma não pode se ligar a um novo antígeno se a molécula de ligação ao antígeno já estiver ligada a um antígeno. Assim, quanto mais longo for o período em que a molécula de ligação ao antígeno não está ligada a um antígeno, mais longo é o período que esta pode se ligar a um novo antígeno (maior a chance de ligação a outro antígeno). Isto possibilita a redução do período de tempo que um antígeno fica livre da molécula de ligação ao antígeno in vivo e o prolongamento do período que um antígeno fica ligado à molécula de ligação ao antígeno. A concentração plasmática da forma livre de antígeno de molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada e o período que o antígeno fica ligado à molécula de ligação ao antígeno pode ser prolongado através da aceleração da eliminação dos antígenos do plasma através da administração da molécula de ligação ao antígeno. Especificamente, "aperfeiçoamento da farmacocinética de molécula de ligação a antígeno" inclui o aperfeiçoamento de um parâmetro farmacocinético da forma livre da molécula de ligação a antígeno (qualquer prolongamento da meia-vida em plasma, prolongamento de tempo de retenção médio em plasma e diminuição de eliminação do plasma), prolongamento do período que o antígeno é ligado à molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno e se os parâmetros farmacocinéticos são aceleração aperfeiçoada de eliminação de antígeno mediada por molécula de ligação a antígeno do plasma. O aperfeiçoamento de farmacocinética de molécula de ligação a antígeno pode ser avaliado através da determinação de qualquer um dos parâmetros, meia-vida em plasma, tempo de retenção médio no plasma e eliminação do plasma para a molécula de ligação a antígeno ou forma livre de antígeno da mesma ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Por exemplo, a concentração plasmática da molécula de ligação ao antígeno ou da sua forma livre de antígeno é determinada após a administração da molécula de ligação ao antígeno a camundongos, ratos, macacos, coelhos, cachorros ou seres humanos. Então, cada parâmetro é determinado. Quando a meia-vida no plasma ou o tempo médio de retenção no plasma é prolongado, a farmacocinética da molécula de ligação a antígeno pode ser julgada ser aperfeiçoada. Os parâmetros podem ser determinados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Os parâmetros podem ser apropriadamente avaliados, por exemplo, através de análise não compartimental utilizando o programa de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções em anexo. A concentração plasmática de molécula de ligação ao antígeno livre de antígeno pode ser determinada através de métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, utilizando o método de ensaio medido em um método conhecido (Clin Pharmacol. 2008 Abr; 48(4): 406-417.

[00862] Na presente invenção, "aperfeiçoamento da farmacocinética" também inclui prolongamento do período que um antígeno é ligado a uma molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno. Se o período que um antígeno é ligado à molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno é prolongado pode ser avaliado através da determinação da concentração no plasma do antígeno livre. O prolongamento pode ser julgado com base na concentração no plasma determinada do antígeno livre ou no período de tempo requerido para um aumento na razão de concentração de antígeno livre para a concentração de antígeno total.

[00863] A concentração no plasma do antígeno livre não ligado à molécula de ligação a antígeno ou a razão de concentração de antígeno livre para a concentração total pode ser determinada através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, o método medido em Pharm. Res. 2006 Jan; 23(1): 95-103 pode ser usado. Alternativamente, quando um antígeno mostra uma função particular in vivo, pode-se avaliar se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que netraliza a função do antígeno (molécula antagonista) pode ser determinada ao testar se a função do antígeno é neutralizada. Pode-se avaliar se a função do antígeno é neutralizada ao testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno. Pode-se avaliar se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que ativa a função do antígeno (molécula agonista) ao testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.

[00864] Determinação da concentração no plasma de antígeno livre e a razão da quantidade de antígeno livre no plasma para a quantidade de antígeno total em plasma, ensaio de marcador in vivo, e tais medições não são particularmente limitadas; entretanto, os ensaios são executados, de preferência, após um determinado período de tempo ter passado após a administração da molécula de ligação ao antígeno. Na presente invenção, o período após a administração da molécula de ligação ao antígeno não é particularmente limitado; os versados na técnica podem determinar o período adequado dependendo das propriedades e similar da molécula de ligação ao antígeno administrada. Tais períodos incluem, por exemplo, um dia após a administração da molécula de ligação ao antígeno, três dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno, sete dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno, 14 dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno, e 28 dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno. Aqui, "concentração de antígeno no plasma" se refere a ou "concentração de antígeno total no plasma" que é a soma de antígeno ligado à molécula de ligação a antígeno e concentração de antígeno não ligado ou "concentração de antígeno livre em plasma" que é a concentração de antígeno não ligado à molécula de ligação a antígeno.

[00865] A concentração de antígeno total no plasma pode ser diminuída através da administração de molécula de ligação a antígeno da presente invenção em 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou ainda maior comparado com a administração de uma molécula de ligação a antígeno de referência compreendendo a região Fc de IgG onde uma cadeia de açúcar ligada na posição 267 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar tendo fucose como domínio de ligação ao receptor Fcy ou comparado com quando a molécula de domínio de ligação a antígeno da presente invenção compreendendo o domínio de ligação a antígeno não é administrada.

[00866] A razão de antígeno /molécula de ligação a antígeno molar pode ser calculada conforme mostrado abaixo:

[00867] C=A/B

[00868] valor A: Concentração de antígeno molar em cada ponto de tempo

[00869] valor B: Concentração de molécula de ligação a antígeno molar em cada ponto de tempo

[00870] valor C: Concentração de antígeno molar com concentração de molécula de ligação a antígeno molar (razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar) em cada ponto de tempo

[00871] O valor C menor indica eficiência maior de eliminação de antígeno por molécula de ligação a antígeno enquanto valor de C maior indica eficiência menor de eliminação de antígeno por molécula de ligação a antígeno.

[00872] Razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar pode ser calculada conforme acima descrito.

[00873] Para avaliação dos efeitos de um domínio de ligação a receptor Fcy tendo atividade de ligação seletiva a receptores Fcy, quando uma molécula de ligação a antígeno não reage cruzado com um antígeno contraparte de camundongo, concentração de antígeno total em plasma ou diminuição em razão em mol de antígeno/anticorpo pode ser avaliada ou através do modelo de injeção simultânea de antígeno- anticorpo ou o modelo de injeção de antígeno de estado uniforme usando os camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River, Japão). Quando uma molécula de ligação a antígeno reage cruzado com a contraparte do camundongo, a molécula de ligação a antígeno pode simplesmente ser injetada em camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River, Japão) para realizar a avaliação.

[00874] No modelo de coinjeção, uma mistura da molécula de ligação a antígeno e antígeno é administrada a camundongos. No modelo de perfusão de antígeno em estado estacionário, uma bomba de perfusão com uma solução de antígeno é incorporada em camundongos para alcançar uma concentração plasmática constante de antígeno e, então, a molécula de ligação a antígeno é injetada nos camundongos. Moléculas de ligação a antígeno de teste são administradas na mesma dose. A concentração plasmática total de antígeno, a concentração de antígeno livre no plasma e a concentração plasmática da molécula de ligação a antígeno são medidas em pontos de tempo apropriados usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00875] A concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar podem ser medidas em 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após administração para avaliar o efeito a longo prazo da presente invenção. Em outras palavras, uma concentração de antígeno no plasma a longo prazo é determinada através da medição da concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar em 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após administração de uma molécula de ligação a antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da presente invenção. Se a redução da concentração de antígeno no plasma ou razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar for obtida através da molécula de ligação a antígeno descrita na presente invenção pode ser determinado através da avaliação da redução em qualquer um ou mais os pontos de tempo descritos acima.

[00876] Concentração de antígeno Total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar podem ser medidas em 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após administração para avaliar o efeito a curto prazo da presente invenção. Em outras palavras, uma concentração de antígeno no plasma baixa é determinada através da medição de concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno em 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após administração de uma molécula de ligação a antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da presente invenção.

[00877] A via de administração de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode ser selecionada de injeções intradérmica, intravenosa, intravítrea, subcutânea, intraperitoneal, parenteral e intramuscular.

[00878] Na presente invenção, o aperfeiçoamento da farmacocinética em humano é preferida. Quando a retenção no plasma em humano é difícil de determinar, ela pode ser prevista com base na retenção no plasma de camundongos (por exemplo, camundongos normais, camundongos transgênicos expressando antígeno humano, camundongos transgênicos expressando FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos cynomolgus).

[00879] "O aprimoramento da farmacocinética e retenção plasmática prolongada de uma molécula de ligação a antígeno" na presente invenção significa aprimoramento de qualquer parâmetro farmacocinético (qualquer um de prolongamento da meia-vida plasmática, prolongamento do tempo médio de retenção plasmática, redução de eliminação plasmática e biodisponibilidade) após administração in vivo da molécula de ligação a antígeno ou um aumento na concentração plasmática da molécula de ligação a antígeno em um tempo adequado após administração. Ele pode ser determinado medindo-se qualquer parâmetro, tal como meia-vida plasmática, tempo médio de retenção plasmática, eliminação plasmática e biodisponibilidade da molécula de ligação a antígeno (Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice), (Nanzando)). Por exemplo, quando uma molécula de ligação a antígeno é administrada a camundongos (camundongos normais e camundongos transgênicos para o FcRn humano), ratos, macacos, coelhos, cães, seres humanos e assim por diante, e a concentração plasmática da molécula de ligação a antígeno é determinada e cada um dos parâmetros é calculado, a farmacocinética da molécula de ligação a antígeno pode ser julgada como sendo aprimorada quando a meia- vida plasmática ou o tempo médio de retenção plasmática é prolongado. Estes parâmetros podem ser determinados por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os parâmetros podem ser adequadamente avaliados através de análise não compartimental usando software de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções anexo.

[00880] Quatro tipos de FcyRs, FcyRI, FcyRIIb, FcyRIII e FcyRIV, foram identificados em camundongos. Em humanos também, como FcyRs correspondentes, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIa e FcyRIIIb foram identificados. FcyRIIb que é considerado ser o único tipo inibidor dentre esses FcyRs é conservado em ambos humanos e camundongos. Os outros FcyRs, exceto FcyRIIIb, transmitem sinais de ativação via o motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) (Immunoreceptor Tyrosyne-Based Activatin Motif), enquanto FcyRIIb transmite sinais inibidores via o motivo inibidor baseado em tirosina imunorreceptora (ITIM) (Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motif) presente dentro das células (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).

[00881] FcyRIIb1 e FcyRIIb2 foram relatados como variantes unidas de FcyRIIb. Em ambos humanos e camundongos, FcyRIIb1 tem um domínio intracelular mais longo do que FcyRIIb2. FcyRIIb1 foi confirmado ser expresso em células B, e FcyRIIb2 foi confirmado ser expresso em macrófagos, mastócitos, células dendríticas, basófilos, neutrófilos e eosinófilos (J. Clin. Immunol. (2005) 25(1), 1-18).

[00882] Até agora, em seres humanos, disfunção e expressão diminuída de FcyRIIb foram relatadas estar relacionadas com início de doenças autoimunes. Por exemplo, foi relatado que em alguns pacientes SLE, ligação de ativadores transcricionais é atenuada devido a polimorfismo em uma região de promotor de expressão de FcyRIIb, que resulta na expressão de FcyRIIb diminuída (Human. Genet. (2005) 117, 220-227; J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199; e J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). Ainda, dentre os pacientes SLE, dois tipos de alótipos foram relatados, onde o aminoácido na posição 233 é Ile ou Thr em FcyRIIb. Esta posição existe na região de transmembrana de FcyRIIb e é relatado que FcyRIIb é menos provável de existir no número grande de lipídeo quando o aminoácido na posição 233 é Thr comparado com quando este aminoácido é Ile, e como resultado, função de transdução de sinal de FcyRIIb diminui (Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058; Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). Em camundongos também, camundongos inativados produzidos através de rompimento do gene de FcyRIIb em camundongos C57BL/6 foram relatados apresentar sintomas tipo SLE tal como produção de autoanticorpo e glomerulonefrite (Immunity 13 (2000) 277-285; J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). Ainda, até agora, nível de expressão reduzido de FcyRIIb e similar foram relatados em camundongos considerados ser modelos com início natural de SLE (Immunogenetics (2000) 51, 429-435; Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691; Curr. Biol. (2000) 10, 227-230; J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). A partir desse relatos, FcyRIIb é considerado regular imunidade humoral em camundongos bem como em humanos.

[00883] Quando um anticorpo carregando uma Fc da presente invenção elimina antígenos via FcyRIIb, a função de endocitose de FcyRIIb é considerada estar realizando a contribuição mais importante dentre as funções de FcyRIIb. Conforme acima descrito, FcyRIIb1 e FcyRIIb2 existem como variantes unidas de FcyRIIb, mas é relatado que a última está principalmente envolvida na endocitose de um complexo imune de um anticorpo e antígeno (J. Immunol. (1994), 152 574-588; Science (1992) 256, 1808-1812; Cell (1989) 58, 317-327). Até agora, FcyRIIb2 de camundongo foi relatado ser incorporado a uma vesícula revestida com clatrina e sofre endocitose (Cell (1989) 58, 317-327). Ainda, foi relatado que um motivo dileucina é necessário para endocitose mediada por FcyRIIb2 e o motivo dileucina é conservado em ambos humanos e camundongos (EMBO J. (1994) 13 (13), 2963-2969). A partir desses, FcyRIIb2 pode ter uma habilidade de endocitose em humanos como em camundongos.

[00884] Por outro lado, diferente de FcyRIIb2, foi relatado que FcyRIIb1 não causa endocitose. FcyRIIb1 tem uma sequência inserida em seu domínio intracelular que não é encontrado em FcyRIIb2. É considerado que esta sequência inibe a absorção de FcyRIIb1 em uma vesícula revestida com clatrina e como um resultado endocitose é inibida (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888; J. Cell Biol. (1989) 109, 32913302). Em humanos também, FcyRIIb1 tem uma sequência de inserção em um sítio similar àquele de FcyRIIb2 como em camundongos; desta maneira, diferença na capacidade de endocitose entre FcyRIIb1 e FcyRIIb2 é presumida ser causada por um mecanismo similar. Ainda, em ambos humanos e camundongos, aproximadamente 40% de complexo imunes na superfície celular são relatados ser absorvidos na célula em 20 minutos (Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337; Science (1992) 256, 1808-1812). Desta maneira, em humanos também, FcyRIIb2 é presumido absorver complexo imunes em células em taxas similares àquelas em camundongos.

[00885] Uma vez que FcyRIIb é o único que tem ITIM dentro da célula em ambos humanos e camundongos dentre a família FcyR e a distribuição de células de expressão é a mesma, é presumível que sua função em controle imune seja similar. Ainda, considerando o fato que complexo imunes são absorvidos em células em taxas similares em humanos e camundongos, efeitos de eliminação de antígeno de anticorpos mediados por FcyRIIb em humanos pode ser previsível usando camundongos. Moléculas de ligação a antígeno mF44 e mF46 têm propriedades de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH e têm afinidade aumentada com FcyRIIb e FcyRIII de camundongo comparado com mIgG1 que é uma molécula de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH. Na verdade, é mostrado no Exemplo 5 que eliminação de antígeno aumentou quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos normais comparado com quando mIgG1 foi administrado.

[00886] Ainda, no Exemplo 6 descrito por último, um experimento similar foi realizado usando camundongos deficientes em cadeia y de receptor de Fc. Foi relatado que FcyRIIs outros que não FcyRIIb são expressos apenas na copresença de cadeia gama em camundongos. Desta maneira, apenas FcyRIIb é expresso nos camundongos deficientes em cadeia y de receptor de Fc. Administração de mF44 ou mF46, que são moléculas de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH, a camundongos deficientes em cadeia y de receptor de Fc permite avaliação de efeitos de aceleração de eliminação de antígeno quando sítio de ligação a FcyRIIb é seletivamente aumentado. A partir dos resultados do Exemplo 6, quando mF44 ou mF46 (que são moléculas de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira deponente do pH) foi administrado a camundongos deficientes em cadeia y de receptor de Fc, eliminação de antígeno foi mostrada aumentar comparado com quando mIgG1 (que é uma molécula de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH) foi administrado aos camundongos. Ainda, os resultados do Exemplo 6 mostram que quando administrado a camundongos deficientes em cadeia y de receptor de Fc, mF44 ou mF46 causa graus similares de eliminação de antígeno como quando administrado a camundongos normais.

[00887] No Exemplo 6, um experimento similar foi realizado usando camundongos deficientes em FcyRIII. Uma vez que mIgGI, mF44 e mF46 se ligam apenas a FcyRIIb e FcyRIII dentre os FcyRs, administração dos anticorpos a camundongos deficientes em FcyRIII permite avaliação de efeitos de aceleração de eliminação de antígeno quando ligação a FcyRIIb é seletivamente aumentada. Os resultados do Exemplo 6 indicam que quando mF44 ou mF46 foi administrado a camundongos deficientes em FcyRIII, eliminação de antígeno foi aumentada comparado com quando mIgG1 foi administrado ao camundongo para eliminação de antígeno. Ainda, os resultados do Exemplo 6 mostraram que quando administrados a camundongos deficientes em FcyRIII, mF44 e mF46 causam graus similares de eliminação de antígeno como quando administrados a camundongos deficientes em cadeia y de receptor de Fc e quando administrados a camundongos normais.

[00888] Esses resultados revelaram que eliminação de antígeno pode ser acelerada através do aumento da ligação seletiva a FcyRIIb sozinho sem aumento da ligação a FcyRs ativos.

[00889] Em adição aos documentos relatados discutidos até agora, com base nos resultados de avaliação mencionados acima usando camundongos, é considerado que absorção de complexo imunes em células via FcyRIIb acontece in vivo em humanos como em camundongos e, como resultado, anticorpos que têm Fc com ligação seletivamente aumentada a FcyRIIb podem acelerar a eliminação de seus antígenos. Ainda, conforme discutido acima, uma vez que absorção de complexo imunes em células via FcyRIIb é considerada acontecer em taxas similares em camundongos e humanos, efeitos de aceleração de eliminação de antígeno comparáveis àqueles de anticorpos tendo Fc com afinidade aumentada com FcyRIIb de camundongo podem ser obtidos in vivo em humanos usando Fc onde afinidade com FcyRIIb humano é aumentada para um grau similar.

[00890] Conforme descrito no WO2009/125825, Fv4-IgG1 é um anticorpo que resulta da conferência a um anticorpo antirreceptor de IL6 H54/L28-IgG1 humanizado a atividade de se ligar ao antígeno de uma maneira dependente do pH, isto é, alterando a região variável para conferir a propriedade de se ligar a um antígeno em pH 7,4 e se dissociar do antígeno em pH 5,8. O WO2009/125825 mostrou que a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel é bastante acelerada em camundongos coadministrados com Fv4 IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno como comparado com camundongos coadministrados com H54/L28-IgG1 e o antígeno. Aqui, H54-IgG1 de cadeia pesada e L28-CK de cadeia leve incluídos em H54/L28-IgG1 são mostrados na SEQ ID NO: 36 e na SEQ ID NO: 37, respectivamente; e VH3-IgG1 de cadeia pesada e VL3-CK de cadeia leve incluídos em Fv4- IgG1 são mostrados na SEQ ID NO: 38 e na SEQ ID NO: 39, respectivamente.

[00891] Receptor de IL-6 humano solúvel ligado a um anticorpo H54/L28-IgG1, que se liga a receptor de IL-6 humano solúvel, é reciclado para o plasma junto com o anticorpo via FcRn. Entretanto, anticorpo Fv4-IgG1 que se liga a receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH se dissocia de receptor de IL-6 humano solúvel que foi ligado ao anticorpo sob uma condição ácida no endossomo. Uma vez que o receptor de IL-6 humano solúvel dissociado é degradado no lisossomo, eliminação do receptor de IL-6 humano solúvel pode ser bastante acelerada, e o anticorpo Fv4-IgG1 que se liga ao receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH é reciclado para o plasma após ligação a FcRn no endossomo. Uma vez que o anticorpo reciclado pode se ligar a um receptor de IL-6 humano solúvel novamente, ligação ao antígeno (receptor de IL-6 humano solúvel) e reciclagem para o plasma vis FcRn são repetidas. Como resultado, uma molécula de anticorpo única pode se ligar repetidamente ao receptor de IL-6 humano solúvel múltiplas vezes (Figura 1).

[00892] Por outro lado, conforme revelado na presente invenção, foi constatado que concentração no plasma do antígeno solúvel pode ser reduzida bastante através da administração de uma molécula de ligação a antígeno com atividade de ligação a FcyR aumentada do domínio de ligação a receptor Fcy incluído na molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon tal como pH, um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação a receptor Fcy.

[00893] Embora não sendo limitado a uma teoria particular, a diminuição inesperada em concentração de antígeno solúvel emplasma observada através da administração de uma molécula de ligação a antígeno com ligação aumentada a FcyRs, que compreende um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon tal como pH e um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser explicada como segue.

[00894] Conforme acima descrito, uma molécula de ligação a antígeno tal como Fv4-IgG1 compreendendo um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon pode ser capaz de se ligar repetidamente ao antígeno múltiplas vezes, mas o efeito de dissociação do antígeno solúvel no endossomo para acelerar a eliminação de antígeno a partir do plasma pode ser dependente da taxa de absorção do complexo do antígeno e molécula de ligação a antígeno para o endossomo. As moléculas de ligação a antígeno com atividades de ligação aumentadas a vários FcyRs, que compreendem um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição da concentração de íon, são ativamente absorvidas em células através de ligação a vários FcyRs expressos na membrana celular, e podem circular no plasma novamente através de reciclagem via ligação entre FcRn e o domínio de ligação a FcRn na molécula tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido. Mais especificamente, uma vez que as moléculas de ligação a antígeno mencionadas acima que formaram complexos com antígenos solúveis em plasma são absorvidas ativamente em células via FcyRs expressos na membrana celular, o efeito de aceleração de eliminação de antígenos solúveis emplasma pode ser mais pronunciado do que aquele de moléculas de ligação a antígeno cujas atividades para vários FcyRs não são aumentadas.

[00895] Atividades de ligação a FcyR de anticorpos que se ligam a antígenos de membrana têm um papel importante em atividade citotóxica dos anticorpos. Desta maneira, quando atividade citotóxica é necessária para um anticorpo ser usado como um agente farmacêutico, um isotipo de IgG1 humano que tem atividade de ligação a FcyR alta é usado, e a técnica de aumento das atividades de ligação a FcyR do anticorpo para aumentar a atividade citotóxica do anticorpo é amplamente utilizada. Por outro lado, o papel de atividades de ligação a FcyR de anticorpos que se ligam a antígenos solúveis e são usados como agentes farmacêuticos não eram conhecidos, e diferenças em efeitos fisiológicos sobre organismos administrados com IgG1 humano com atividades de ligação a FcyR altas e IgG2 humano e IgG4 humano com atividades de ligação a FcyR baixa, devido às suas diferenças em atividades de ligação a FcyR, não tinham até agora sido completamente examinadas. Conforme descrito mais tarde nos Exemplo, foi realmente confirmado que no plasma de indivíduos administrados com anticorpos cujas atividades de ligação a FcyR foram perdidas, mudanças em concentração de antígeno solúvel não foram afetadas. Por outro lado, na presente invenção, a concentração de antígenos solúveis no plasma foi verificada ser bastante reduzida em indivíduos administrados com moléculas de ligação a antígeno com atividades de ligação a FcyR aumentada e compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígenos solúveis muda dependendo da condição de concentração de íon. Mais especificamente, ao combinar um domínio de ligação a FcRn tendo uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação a antígeno cuja ligação a antígeno solúveis muda dependendo da condição de concentração de íon, que são domínios incluídos em moléculas de ligação a antígeno se direcionando a antígenos solúveis, uma vantagem de aumento da ligação a FcyR foi verificada pela primeira vez.

[00896] Método ex vivo de eliminação dos antígenos do plasma

[00897] Um exemplo de uma modalidade não limitante do uso de uma molécula de ligação a antígeno para o método de eliminação dos antígenos de plasma, que é provido pela presente invenção, inclui uso da molécula de ligação a antígeno para um chamado método ex vivo de eliminação de antígenos de plasma, o qual compreende contato da molécula de ligação a antígeno da presente invenção com plasma isolado de indivíduos que permite a formação de complexo imunes, e deixar que os complexo imunes contatem células expressando receptores Fcy e FcRn. A taxa de eliminação de antígenos do plasma pode ser promovida através da substituição/combinação de um método de administração de moléculas de ligação a antígeno in vivo com um chamado método ex vivo onde plasma contendo moléculas de ligação a antígeno e antígenos que se ligam às moléculas de ligação a antígeno é temporariamente retirado do organismo vivo, e então contatado com células expressando receptores Fcy e FcRn, e plasma contendo moléculas de ligação a antígeno extracelularmente recicladas (ou também referidas como ressecretadas ou recirculadas) sem antígeno ligado após um certo período de tempo é retornado para o organismo vivo.

[00898] Ainda, um exemplo de uma modalidade não limitante do uso de uma molécula de ligação a antígeno para o método de eliminação do antígeno a partir do plasma, que é provido pela presente invenção, inclui uso da molécula de ligação a antígeno para um então chamado método ex vivo de eliminação dos antígenos do plasma, o qual compreende contato de complexo imunes presentes em plasma isolado de indivíduos que foram administrados com as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção com células expressando FcRn e receptores Fcy.

[00899] Se ou não os antígenos são eliminados de plasma pode ser confirmado, por exemplo, através da avaliação de se ou não a taxa de eliminação de antígenos do plasma mencionada acima é promovida quando, ao invés da molécula de ligação a antígeno da presente invenção, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno onde a atividade de ligação a antígeno não muda dependendo da concentração de íons, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a FcRn cuja atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido não foi aumentada, ou uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a receptor Fcy que não tem atividade de ligação seletiva a receptores Fcy é usada como um controle para comparação.

[00900] Métodos para Produção de Moléculas de Ligação a Antígeno

[00901] A presente invenção proporciona um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno tendo a função de eliminar antígenos do plasma, em que o método compreende as etapas (a) a (e) abaixo:

[00902] obtenção de um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons;

[00903] obtenção de um gene que codifica para o domínio de ligação a antígeno selecionado na etapa (a);

[00904] ligação operativa do gene obtido na etapa (b) com um gene que codifica um domínio de ligação a FcRn-FcRn tendo atividade de ligação sob condições de pH ácido e um domínio de ligação ao receptor Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy;

[00905] cultura de células hospedeiras que contêm o gene operativamente ligado na etapa (c); e

[00906] isolamento de uma molécula de ligação a antígeno a partir da solução de cultura obtida na etapa (d).

[00907] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, após isolamento de um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação pode variar dependendo da condição selecionada conforme descrito acima, o polinucleotídeo é inserido em um vetor de expressão apropriado. Por exemplo, quando o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anticorpo, uma vez que um cDNA que codifica a região variável é obtido, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem sítios de restrição inseridos nas duas extremidades do cDNA. De preferência, as enzimas de restrição reconhecem e digerem uma sequência de nucleotídeos que aparece em uma baixa frequência na sequência de nucleotídeos que compõe o gene da molécula de ligação a antígeno. Além disso, enzimas de restrição que proporcionam extremidades coesivas são, de preferência, inseridas para inserir uma única cópia de um fragmento digerido dentro do vetor na orientação correta. O cDNA que codifica uma região variável de uma molécula de ligação a antígeno digerida conforme descrito acima é inserido em um vetor de expressão apropriado para se obter um vetor de expressão para a molécula de ligação a antígeno da presente invenção.

[00908] O polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a antígeno obtido conforme descrito acima é operativamente ligado ao gene que codifica um domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação ao receptor de Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy, os quais são descritos nas seções "domínio de ligação ao FcRn tendo atividade sob uma condição de faixa de pH ácido" e "domínio de receptor de Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy", respectivamente. Quando de ligação, os genes podem ser diretamente ligados no quadro ou os polinucleotídeos que codificam cada domínio podem ser ligados no quadro por meio de ligantes. Além de cada um dos domínios mencionados acima, eles podem ser operativamente ligados a um gene que codifica o domínio de ligação a FcyR descrito na seção "domínio de ligação ao FcyR" mencionada acima.

[00909] Quando um anticorpo é usado como molécula de ligação a antígeno da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica uma região Fc de anticorpo pode ser usado apropriadamente como o "domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido" e "domínio de ligação ao receptor Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy" mencionados acima. Regiões Fc cuja "atividade de ligação ao FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido" e "atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcy" são apropriadamente modificadas através de modificação dos polinucleotídeos também podem ser usadas. Exemplos de modalidades não limitativas de tais modificações são mostradas nas seções "domínio de ligação ao FcRn tendo atividade de ligação ao FcRn sob condições de pH ácido" e "domínio de ligação ao receptor de Fcy tendo atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy", mencionadas acima, respectivamente.

[00910] Para produzir uma molécula de ligação a antígeno de interesse, um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação a antígeno é inserida, de uma maneira operativamente ligada, em uma sequência reguladora em um vetor de expressão. Sequências reguladoras incluem, por exemplo, promotores e potencializadores. Além disso, uma sequência sinalizadora adequada pode ser ligada ao amino término, de modo que a molécula de ligação a antígeno expressa seja secretada para o exterior das células. Como sequência sinalizadora, por exemplo, um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 4) é usado; no entanto, também é possível ligar outras sequências sinalizadoras adequadas. O polipeptídeo expresso é clivado no carbóxi término da sequência descrita acima e o polipeptídeo clivado é segregado como um polipeptídeo maduro para o exterior das células. Então, células hospedeiras adequadas são transformadas com este vetor de expressão de modo que células recombinantes que expressam o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação a antígeno de interesse possam ser obtidas. As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem ser produzidas a partir de células recombinantes seguindo os métodos descritos acima na seção sobre anticorpos.

[00911] Para um ácido nucleico, "operativamente ligado" significa que o ácido nucleico tem uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um DNA que codifica uma pré-sequência ou um líder de secreção é operativamente ligado a um DNA que codifica um determinado polipeptídeo se ele é expresso como uma proteína precursora envolvida na secreção do polipeptídeo. Um promotor ou potencializador é operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência de codificação. Um sítio de ligação ribossômica é operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele está em uma posição que facilita a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA ligadas são contíguas e, no caso de um líder de secreção, isto significa que as sequências de DNA ligadas são contíguas e no quadro de leitura. No entanto, potencializadores não têm de ser contíguos. Ligação é conseguida por meio de ligação em sítios de restrição adequados. Se tais sítios não existirem, adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou ligantes são usados de acordo com a prática convencional. Além disso, ácidos nucleicos ligados podem ser produzidos através da técnica de PCR por extensão de sobreposição mencionada acima.

[00912] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, após isolamento de um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação a antígeno descrita acima cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo de uma condição selecionada, uma variante do polinucleotídeo é inserida em um vetor de expressão apropriado. Tais variantes incluem, de preferência, aquelas que são preparadas através de humanização com base na sequência de polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção obtida por meio de rastreio como uma biblioteca de região variável randomizada, uma biblioteca sintética ou uma biblioteca imune construída proveniente de animais não humanos. Os mesmos métodos conforme descrito acima para a produção de anticorpos humanizados descritos acima podem ser usados como um método para a produção de variantes de moléculas de ligação a antígeno humanizadas.

[00913] Em outra modalidade, tais variantes incluem, de preferência, aquelas obtidas através da introdução de uma alteração que aumenta a afinidade pelo antígeno (maturação de afinidade) de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em uma sequência de polinucleotídeo isolada para a molécula obtida por meio de rastreio usando uma biblioteca sintética ou um biblioteca virgem como uma biblioteca de região variável randomizada. Tais variantes podem ser obtidas através de vários procedimentos conhecidos para maturação de afinidade, incluindo mutagênese de CDR (Yang et al. (J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403), embaralhamento de cadeia (Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), uso de cepas de E. coli mutantes (Low et al. (J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368)), embaralhamento de DNA ((Patten et al. (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), visualização em fago (Thompson et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)) e PCR sexual (Clameri et al. (Nature (1998) 391, 288-291)).

[00914] Em uma modalidade de variantes da presente invenção, polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação a antígeno as quais têm uma cadeia pesada onde um polinucleotídeo que codifica uma região Fc modificada para ter uma mutação de aminoácido conforme descrito acima está ligado em quadro a um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação cuja atividade varia dependendo de uma condição selecionada de ligação a antígeno descrito acima.

[00915] A presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação a antígeno compreendendo coleta das moléculas de ligação a antígeno de meios de cultura de células introduzidas em vetores em que um polinucleotídeo que codifica uma região Fc está operativamente ligado em quadro com um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação varia dependendo da condição da concentração de íons. Além disso, a presente invenção também fornece métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno compreendendo coleta das moléculas de ligação a antígeno de meios de cultura de células introduzidas em vectores construídos através de ligação operativa de um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação varia dependendo da condição de concentração de íons em um polinucleotídeo que codifica uma região Fc a qual é previamente ligada operativamente a um vetor.

[00916] Nos "Métodos para a produção de moléculas de ligação a antígeno" da presente invenção, métodos conhecidos podem ser usados como métodos de avaliação da eliminação do antígeno do plasma pelas moléculas de ligação a antígeno. Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é administrada a cada grupo de animais não humanos, tais como camundongos, em uma idade apropriada. Conforme descrito depois na seção "Composição Farmacêutica", uma molécula de ligação a antígeno pode ser administrada sistêmica ou localmente através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, injeção intracraniana ou similar, como composições na forma de dosagem para preparados injetáveis, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdérmica.

[00917] Métodos espectroscópicos, tais como ressonância magnética nuclear (NMR) ou espectrometria de massa (MS), incluindo análises SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), análise com base em gel 1D, análise com base em gel 2D, cromatografia de líquido (por exemplo, cromatografia de líquido em alta pressão (HPLC) ou cromatografia de líquido em baixa pressão (LPLC)), cromatografia em camada fina e técnicas com base em LC-MS podem ser usadas para medir as concentrações. Exemplos de técnicas de LCMS adequadas incluem ICAT (marca registrada) (Applied Biosystems) e iTRAQ (marca registrada) (Applied Biosystems). Um método para detecção de fragmentos antigênicos que foram produzidos por meio de digestão adicional de um antígeno objetivado por uma enzima adequada podem também ser empregados quando apropriado. Além disso, a concentração de antígeno pode ser medida por um método de detecção direta ou indireta. Mais especificamente, o antígeno pode ser detectado direta ou indiretamente através de interação com um ligante ou ligantes, tais como enzimas, receptores ou proteínas de transporte, anticorpos, peptídeos, aptâmeros ou oligonucleotídeos ou quaisquer receptores químicos sintéticos ou compostos que podem se ligar especificamente ao antígeno. O ligante pode ser modificado com um marcador detectável, tal como um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador radioativo e/ou um marcador de afinidade. Um método imunológico pode ser fornecido como um exemplo.

[00918] Um método de medição preferido pode ser, por exemplo, um método imunológico que usa um anticorpo que se liga a um epítopo presente no antígeno. Exemplos de tal método imunológico incluem métodos de medição por ensaio imunoenzimático (ELISA, EIA), fluoroimunoensaio (FIA), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio de luminescência (LIA), técnica de anticorpo enzimático, técnica de imunofluorescência, método de imunocromatografia, imunoturbidimetria, turbidimetria em látex e aglutinação em látex. Além disso, as medições nestes métodos imunológicos podem ser realizadas manualmente ou com um dispositivo, tal como um analisador. O método imunológico na presente invenção pode ser realizado de acordo com um método conhecido, tal como o método em sanduíche. Por exemplo, um primeiro anticorpo imobilizado sobre um suporte é deixado reagir simultânea ou sequencialmente com uma amostra biológica e um segundo anticorpo modificado por uma substância de marcação. A reação mencionada acima leva à formação de um complexo compreendendo o primeiro anticorpo imobilizado sobre um suporte, o antígeno e um segundo anticorpo modificado por uma substância de marcação e quantificação da substância de marcação ligada ao segundo anticorpo incluída neste complexo permite medir a quantidade (concentração) do antígeno incluído na amostra biológica.

[00919] Por exemplo, no caso de imunoensaio enzimático, uma microplaca em que um primeiro anticorpo é imobilizado, amostras biológicas diluídas em série, um anticorpo secundário modificado por uma enzima, tal como HRP, tampão de lavagem e uma solução contendo um substrato com o qual uma enzima, tal como HRP, reage é, de preferência, usada. Em uma modalidade não limitativa da medição, um substrato é deixado reagir sob uma condição ótima com a enzima que modifica o anticorpo secundário e a quantidade do produto da reação enzimática pode ser determinada por meio de um método óptico. No caso de fluoroimunoensaio, um guia de ondas óptico em que um primeiro anticorpo é imobilizado, amostras biológicas diluídas em série, um anticorpo secundário modificado por uma substância fluorescente e tampão de lavagem é, de preferência, usado. Em uma modalidade não limitativa da medição, a intensidade da fluorescência emitida pela substância fluorescente através de irradiação de luz de excitação sobre a substância fluorescente que modifica o anticorpo secundário pode ser medida.

[00920] Além disso, no caso de radioimunoensaio, a quantidade de radiação emitida pela substância radioativa é medida. No caso de imunoensaio de luminescência, a quantidade de luminescência emitida pelo sistema de reação luminescente é medida. Além disso, no caso de imunoturbidimetria, turbidimetria de látex, método de medição de aglutinação em látex e similares, a luz transmitida ou luz dispersa é medida pelo método de endpoint ou o método de taxa. Quando medições imunocromatográficas são feitas por observação visual, a cor da substância marcada que aparece na linha de teste é determinada através de observação visual. Em vez de tal medição por observação visual, um instrumento, tal como um analisador, pode ser usado quando apropriado.

[00921] Composição Farmacêutica

[00922] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, moléculas de ligação a antígeno produzidas através de métodos de alteração da presente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através dos métodos de produção da presente invenção. Moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através dos métodos de produção da presente invenção são úteis como composições farmacêuticas uma vez que elas, quando administradas, têm o efeito forte de redução da concentração de antígeno no plasma comparado com moléculas de ligação a antígeno típicas, e exibem a resposta imune in vivo, farmacocinética e outros aperfeiçoada em animais administrados com as moléculas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[00923] Na presente invenção, as composições farmacêuticas geralmente se referem a agentes para tratamento ou prevenção ou teste e diagnóstico de doenças.

[00924] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, elas podem ser usadas parenteralmente, na forma de injeções de soluções ou suspensões estéreis incluindo água e outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, tais composições podem ser formuladas misturando na forma de dose unitária requerida na prática de fabricação de remédio geralmente aprovada, combinando apropriadamente com carreadores ou meios farmacologicamente aceitáveis, especificamente com água estéril, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, suspensão, tensoativo, estabilizador, agentes flavorizante, excipiente, veículo, conservante, ligante ou similar. Em tais formulações, a quantidade de ingrediente é ajustada para obter uma quantidade apropriada em uma faixa predeterminada.

[00925] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas usando veículos tal como água destilada para injeção, de acordo com prática de formulação padrão.

[00926] Soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica e soluções isotônicas contendo dextrose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio). É também possível usar em combinação solubilizantes apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similar), poliálcoois (propileno glicol, polietileno glicol e similar), tensoativos não iônicos (polissorbato 80®, HCO-50 e similar).

[00927] Óleos incluem óleo de sésamo e óleos de soja. Benzoato de benzila e/ou álcool de benzila pode ser usado em combinação como solubilizantes. É também possível combinar tampões (por exemplo, tampão de fosfato e tampão de acetato de sódio), agentes suavizantes (por exemplo, cloridrato de procaína), estabilizadores (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes. Ampolas apropriadas são cheias com as injeções preparadas.

[00928] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferivelmente administradas parenteralmente. Por exemplo, as composições na forma de dosagem para injeções, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdérmica são administradas. Por exemplo, elas podem ser administradas sistemicamente ou localmente através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similar.

[00929] Métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados em consideração da idade e sintomas do paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, de a partir de 0,0001 mg a 1.000 mg/kg para cada administração. Alternativamente, a dose pode ser, por exemplo, de a partir de 0,001 a 100.000 mg por paciente. No entanto, a presente invenção não é limitada pelos valores numéricos descritos acima. As doses e os métodos de administração variam dependendo do peso, idade e sintomas e similar do paciente. Aqueles versados na técnica podem determinar doses e métodos de administração apropriados em consideração dos fatores descritos acima.

[00930] Além disso, a presente invenção fornece kits para uso nos métodos da presente invenção que compreendem pelo menos uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção. Além do acima, veículos farmaceuticamente aceitáveis, meios, manuais de instrução que descrevem o método de uso e similares podem ser embalados nos kits.

[00931] Além disso, a presente invenção refere-se a agentes farmacêuticos para eliminação, do plasma, de complexos contendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas e duas ou mais moléculas de ligação a antígeno presentes no plasma as quais contêm, como ingrediente ativo, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou as moléculas de ligação a antígeno produzidas por meio dos métodos de produção da presente invenção.

[00932] A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de uma doença, os quais incluem administração, a indivíduos (pacientes, seres humanos, etc.), das moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou das moléculas de ligação a antígeno produzidas por meio dos métodos de produção da presente invenção. Um exemplo não limitativo de doença inclui câncer e doenças inflamatórias.

[00933] A presente invenção refere-se também ao uso de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou das moléculas de ligação a antígeno produzidas por meio dos métodos de produção da presente invenção na fabricação de um agente farmacêutico para eliminação, do plasma, de complexos contendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas e duas ou mais moléculas de ligação a antígeno presentes no plasma.

[00934] A presente invenção refere-se ainda ao uso de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou das moléculas de ligação a antígeno produzidas por meio dos métodos de produção da presente invenção para eliminação, do plasma, de complexos contendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas e duas ou mais moléculas de ligação a antígeno presentes no plasma.

[00935] Além disso, a presente invenção refere-se à moléculas de ligação a antígeno da presente invenção e moléculas de ligação a antígeno produzidas por meio dos métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos da presente invenção.

[00936] Aminoácidos contidos nas sequências de aminoácido da presente invenção podem ser pós-traducionalmente modificados (por exemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido piroglutâmico através de piroglutamilação é bem conhecida daqueles versados na técnica). Naturalmente, tais aminoácidos pós- traducionalmente modificados são incluídos nas sequências de aminoácido na presente invenção.

[00937] Todos os documentos da técnica anterior mencionados no relatório são incorporados aqui a título de referência.

[00938] Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não deve ser considerada como sendo limitada aos mesmos.

[00939] Exemplos

[00940] [Exemplo 1] Preparação de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR de camundongo sob uma condição de faixa de pH neutro é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa

[00941] Anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH

[00942] H54/L28-IgG que compreende H54-IgG1 (SEQ ID NO: 36) e L28CK (SEQ ID NO: 37) descritos no WO2009/125825 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado. Entretanto, Fv4-IgG1 que compreende VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 38) e VL3-CK (SEQ ID NO: 39) é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado resultante da conferência, a H54/L28- IgG1, da propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH (que se liga a pH 7,4 e se dissocia em pH 5,8). O teste de camundongo in vivo descrito no WO2009/125825 demonstrou que, no grupo administrado com a mistura de Fv4-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno, a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel do plasma foi significantemente acelerada comparado com o grupo administrado com uma mistura de H54/L28-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno.

[00943] O receptor de IL-6 humano solúvel ligado a H54/L28-IgG1, que é um anticorpo que se liga a um receptor de IL-6 humano solúvel, é, junto com o anticorpo, reciclado para o plasma através de FcRn. Entretanto, Fv4-IgG1, que é um anticorpo que se liga a um receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH, se dissocia de receptor de IL-6 humano solúvel sob a condição ácida no endossomo. O receptor de IL-6 humano solúvel dissociado é degradado nos lisossomos, desta maneira isso permite aceleração considerável da eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel. Ainda, após ligação a FcRn no endossomo, Fv4-IgG1, que é um anticorpo que se liga a um receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH, é reciclado para o plasma. Uma vez que o anticorpo reciclado pode se ligar a receptor de IL-6 humano solúvel novamente, o anticorpo se liga repetidamente ao antígeno (receptor de IL-6 humano solúvel) e é reciclado por FcRn para o plasma. É pensado que, como resultado, uma molécula de anticorpo única pode se ligar repetidamente várias vezes a receptor de IL-6 humano solúvel (Figura 1).

[00944] Preparação de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano com ligação a FcyR de camundongo aumentada e anticorpo antirreceptor de IL-6 humano sem ligação a FcyR de camundongo

[00945] VH3-IgG1-F1022 (SEQ ID NO: 40), uma molécula de ligação a antígeno com ligação a FcyR de camundongo aumentada, foi preparada substituindo Lys por Asp na posição 326 (numeração EU) e Leu por Tyr na posição 328 (numeração EU) em VH3-IgG1. Fv4-IgG1-F1022 contendo VH3-IgG1-F1022 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foi produzida usando o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00946] Entretanto, VH3-IgG1-F760 (SEQ ID NO: 41), uma molécula de ligação a antígeno sem ligação a FcyR de camundongo, foi preparado substituindo Leu por Arg na posição 235 e Ser por Lys na posição 239 (numeração EU) em VH3-IgG1. Fv4-IgG1-F760 contendo VH3-IgG1-F760 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foi produzido usando o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00947] Avaliação de atividade de ligação a FcyR de camundongo

[00948] VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F1022 e VH3/L(WT)- IgG1-F760, que contêm VH3-IgG1, VH3-IgG1-F1022 e VH3-IgG1-F760 como a cadeia pesada, e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve, foram produzidos usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Esses anticorpos foram cineticamente analisados quanto à sua ligação a FcyR de camundongo conforme descrito abaixo.

[00949] Análise cinética de ligação a FcyR de camundongo

[00950] A ligação de anticorpos a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIII e FcyRIV (daqui em diante referidos como FcyRs de camundongo (R&D Systems, SinoBiological ou preparados por meio do método do Exemplo de Referência 2) foi cineticamente analisada usando Biacore T100 e T200 (GE Healthcare). Uma quantidade apropriada de proteína L (ACTIGEN ou BioVision) foi imobilizada em um Sensor chip CM4 (GE Healthcare) através de um método de acoplamento de amino, e anticorpos de interesse foram capturados nele. Então, soluções diluídas de FcyRs de camundongo e um tampão de atividade como um blank foram injetados, e os FcyRs de camundongo foram deixados interagir com anticorpos capturados no sensor chip. O tampão de atividade usado era ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, Tween20 0,05% (p/v), pH 7,4. Este tampão foi também usado para diluir os FcyRs de camundongo. O sensor chip foi regenerado usando 10 mmol/l de glicina-HCl, pH 1,5. Todas as medições foram realizadas a 25° C. A constante de taxa de ligação ka (l/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (l/s), que são parâmetros cinéticos, foram calculados a partir dos sensogramas obtidos pela medição. KD (M) de cada anticorpo para FcyR humano foi calculada com base nos valores. Cada parâmetro foi calculado usando Biacore T100 ou T200 Evaluation Software (GE Healthcare).

[00951] O resultado mostrado na Tabela 6 foi obtido através da medição. VH3/L (WT)-IgG1-F1022 foi demonstrado ter atividade de ligação aumentada com mFcyRI, mFcyRIIb e mFcyRIII comparado com VH3/L (WT)-IgG1. Com relação a VH3/L (WT)-IgG1-F760, a ligação as vários FcyRs de camundongo foi não detectável, demonstrando que VH3/L (WT)-IgG1-F760 não tem a atividade de ligação aos vários FcyRs de camundongo. Na tabela, VH3/L (WT)-IgG1, VH3/L (WT)-IgG1-F1022 e VH3/L (WT)-IgG1-F760 são mostrados como IgG1, F1022 e F760, respectivamente. Tabela 6

00952] (1-5) Preparação de anticorpos com teor de fucose baixo

[00952] (1-5) Preparação de anticorpos com teor de fucose baixo

[00953] Métodos conhecidos para aumento da atividade de ligação a FcyR de anticorpos incluem métodos para fabricação de cadeias de açúcar ligadas a um anticorpo que são cadeias de açúcar com baixo teor de fucose (J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473) em adição a métodos para introdução de uma alteração de aminoácido na região Fc de um anticorpo. Um Fv4-IgG1 com baixo teor de fucose (daqui em diante abreviado como Fv4-IgG1-Fuc) foi produzido através da expressão de Fv4-IgG1 usando células CHO deficientes em gene transportador de fucose (WO2006/067913) como células hospedeiro de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 4. Foi relatado que, dos FcyRs (receptores Fcy de camundongo), anticorpos com teor de fucose baixo têm atividade de ligação a FcyRIV seletivamente aumentada (Science, 2005, 310 (5753) 1510-1512).

[00954] [Exemplo 2] Efeito de eliminação de antígenos do plasma por moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que a atividade de ligação a região Fc de IgG humana nativa

[00955] (2-1) Efeito de H54/L28-IgG1 e Fv4-IgG1 para eliminar antígenos de plasma

[00956] H54/L28-IgG1, que é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano, e Fv4-IgG1 tendo a propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH foram produzidos através do método descrito no Exemplo de Referência 1. Testes de infusão in vivo foram realizados usando os H54/L28-IgG1 e Fv4-IgG1 produzidos através do método descrito abaixo.

[00957] (2-1-1) Testes de infusão in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano

[00958] Um modelo animal onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida constante em plasma foi criado através de implante de uma bomba de infusão (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet) contendo o receptor de IL-6 humano solúvel sob a pele das costas de camundongos transgênicos FcRn humanos (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). A dinâmica in vivo após administração de um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi avaliada no modelo animal. Para suprimir a produção de anticorpos de neutralização contra receptor de IL-6 humano solúvel, um anticorpo monoclonal CD4 anticamundongo (preparado através de um método conhecido) foi administrado uma vez a 20 mg/kg na veia caudal. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutaneamente implantada nas costas dos camundongos. Três dias após implante da bomba de infusão, um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi administrado uma vez a 1 mg/kg na veia caudal. O sangue foi coletado de camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias e sete dias após administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humano. Imediatamente, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 15 minutos para preparar plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20° C ou abaixo até uso.

[00959] (2-1-2) Determinação da concentração do receptor de IL-6 humano solúvel hsIL-6R em plasma através de um método eletroquimioluminescente

[00960] As concentrações de receptor de IL-6 humano hsIL-6R em plasma de camundongo foram determinadas através de um método eletroquimioluminescente. Amostras de curva padrão de receptor de IL-6 humano hsIL-6R preparadas em 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 pg/ml e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram misturadas com Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody (R&D), Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody (R&D), Tocilizumab, que tinha sido rutenado com SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery). As misturas foram incubadas a 37° C de um dia para o outro. Tocilizumab foi preparado em uma concentração final de 333 μg/ml. Então, as misturas de reação foram separadas em alíquotas em uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). A solução reagida em temperatura ambiente por uma hora foi lavada, e então Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi separado em alíquotas. Imediatamente em seguida, a medição foi realizada usando SECTOR PR 400 Reader (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor de IL-6 humano hsIL-6R foi determinada com base na resposta da curva padrão usando software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices).

[00961] Um curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humano monitorada é mostrado na Figura 2. Comparado com H54/L28- IgG1, Fv4-IgG1 que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH poderia reduzir a concentração de receptor de IL-6 humano, mas não poderia reduzi-la abaixo da linha de base sem administração de anticorpo. Isto é, o anticorpo administrado que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH não poderia reduzir a concentração de antígeno em plasma abaixo no nível antes da administração do anticorpo.

[00962] (2-2) O efeito de eliminação de um antígeno de plasma por um anticorpo com atividade de ligação a FcyR aumentada ou reduzida

[00963] Se o curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano é influenciada pelo aumento ou redução da atividade de ligação a FcyR de Fv4-IgG1, que é um anticorpo de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH, foi avaliado através do método descrito abaixo. Usando Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F1022 e Fv4- IgG1-Fuc preparado conforme descrito no Exemplo 1, testes de infusão in vivo foram realizados através do método descrito abaixo.

[00964] (2-2-1) Testes de infusão in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano

[00965] Um modelo animal onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida constante em plasma foi criado através de implante de uma bomba de infusão (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet) contendo receptor de IL-6 humano solúvel sob a pele das costas de camundongos transgênicos com FcRn humano (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). No modelo animal, anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi administrado simultaneamente com Sanglopor (CSL Behring) que é uma preparação de imunoglobulina humana, para avaliar a dinâmica in vivo do receptor de IL-6 humano solúvel após administração de anticorpo. Para suprimir a produção de anticorpos de neutralização contra receptor de IL-6 humano solúvel, um anticorpo monoclonal CD4 anticamundongo (preparado através de um método conhecido) foi administrado uma vez a 20 mg/kg na veia caudal. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutaneamente implantada nas costas dos camundongos. Três dias após implante da bomba de infusão, um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano e Sanglopor foram administrados uma vez a 1 mg/kg e 1000 mg/kg, respectivamente, na veia caudal. O sangue foi coletado dos camundongo 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias, sete dias, 14 dias e 21 dias após administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humano. O sangue foi coletado dos camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias, sete dias, 14 dias e 21 dias após administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humano. Imediatamente, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 15 minutos para preparar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20° C ou abaixo até uso.

[00966] (2-2-2) Determinação da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R) em plasma através de um método de eletroquimioluminescência

[00967] As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel hsIL-6R em plasma de camundongo foram determinadas através do mesmo método de eletroquimioluminescência conforme descrito em (2-1-2).

[00968] O resultado é mostrado na Figura 3. O curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F760, do qual a ligação a FcyR de camundongo de Fv4-IgG1 é deletada, foi demonstrado ser comparável àquele em camundongos administrados com Fv4-IgG1. A atividade citotóxica para um antígeno de membrana depende da ligação a FcyR, e então a atividade citotóxica é perdida quando eliminado a ligação a FcyR. Por outro lado, mesmo quando administrando um anticorpo, do qual ligação a FcyR de camundongo é deletada, contra receptor de IL-6 humano que é um antígeno solúvel, não houve nenhum efeito sobre o curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma dos camundongos administrados. Desta maneira, seria pensado que a ligação a FcyR de um anticorpo contra o antígeno solúvel não tem nenhuma contribuição para o curso de tempo de concentração de antígeno no plasma de camundongos administrados com o anticorpo.

[00969] Surpreendentemente, no entanto, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1022 com ligação a FcyR de camundongo aumentada foi consideravelmente reduzida comparado com a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1. Como para o grau de redução, a concentração foi confirmada ser diminuída abaixo da concentração de receptor de IL-6 humano de linha de base sem administração de anticorpo. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1022 foi reduzida para cerca de 1/100 três dias após administração comparado com o caso de administração de Fv4-IgG1. Esta constatação demonstra que, através da administração a camundongos de um anticorpo que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH e cuja ligação a FcyR foi aumentada, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma dos camundongos pode ser significantemente reduzida, e como para o grau de redução, a concentração de antígeno em plasma pode ser reduzida abaixo do nível antes da administração do anticorpo.

[00970] Ainda, foi também demonstrado que, conforme comparado com camundongos administrados com Fv4-IgG1, a concentração de receptor de IL-6 humano em plasma foi reduzida em camundongos administrados com Fv4-IgG1-Fuc que tem cadeias de açúcar com teor de fucose baixo e com atividade de ligação a FcyRIV de camundongo aumentada. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-Fuc foi reduzida para menos de cerca de ^ sete dias após administração comparado com o caso de administração de Fv4-IgG1. A constatação acima demonstra que, através da administração a camundongos de uma molécula de ligação a antígeno dependente do pH que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH e cuja ligação a FcyR foi aumentada, a concentração de antígeno solúvel no plasma dos camundongos podem ser reduzida. Neste caso, métodos para aumento da ligação a FcyR não são particularmente limitados à introdução de alterações de aminoácido. Foi demonstrado que tal aumento pode ser obtido, por exemplo, usando uma região Fc de IgG humana à qual uma cadeia de açúcar com teor de fucose baixo é ligada na posição 297 (numeração EU); no entanto, o efeito de Fv4-IgG1-Fuc para reduzir a concentração de antígeno foi menor do que Fv4-F1022. Com base neste resultado, seria pensado que, para vários FcyRs (FcyRI, II, III e IV para camundongo), FcyIV, ao qual a ligação de Fv4- IgG1-Fuc é aumentada, não tem uma grande contribuição para a redução de concentração de antígeno como um FcyR.

[00971] Desta maneira, foi revelado que, através da administração a um indivíduo de um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e cuja ligação a FcyR foi aumentada, a concentração de antígeno solúvel no plasma do indivíduo pode ser notadamente reduzida.

[00972] Sem ser limitado por uma teoria particular, a redução inesperada de concentração de antígeno solúvel em plasma, que foi observada quando administrando uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio de ligação a antígeno cuja ligação a FcyR foi aumentada e cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da condição de concentração de íons tal como pH e um domínio de ligação a FcRn que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, pode ser explicada como segue.

[00973] Anticorpos IgG que são não especificamente incorporados a células retornam para a superfície celular através de ligação a FcRn sob a condição ácida no endossomo, e então se dissociam de FcRn sob a condição neutra em plasma. Em tal caso, quando um anticorpo que neutraliza a função de um antígeno solúvel através de ligação ao antígeno é administrado a camundongos onde a concentração do antígeno solúvel é mantida constante em plasma, o antígeno solúvel em plasma forma um complexo com o anticorpo administrado. O antígeno solúvel incorporado às células enquanto permanecendo como o complexo é pensado ser reciclado, em um estado ligado ao anticorpo, para o plasma junto com o anticorpo, porque a região Fc do anticorpo se liga a FcRn sob a condição ácida no endossomo.

[00974] Entretanto, quando o anticorpo contra o antígeno solúvel é um anticorpo que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH (isto é, um anticorpo que dissocia do antígeno solúvel sob a condição ácida no endossomo), o antígeno solúvel que não é especificamente incorporado a células enquanto permanecendo como um complexo com o anticorpo é dissociado do anticorpo no endossomo e degradado no lisossomo na célula; desta maneira, o antígeno solúvel não é reciclado para o plasma. Isto é, é pensado que Fv4-IgG1 incorporado como um complexo com o antígeno solúvel em células pode se dissociar do antígeno solúvel no endossomo e então acelera a eliminação do antígeno solúvel.

[00975] Conforme acima descrito, moléculas de ligação a antígeno tal como Fv4-IgG1, que contêm um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da concentração de íon, são pensadas ser capazes de ligação a antígenos repetidamente várias vezes. O efeito para acelerar a eliminação de antígenos solúveis do plasma através de dissociação deles no endossomo é pensado ser dependente da taxa de incorporação do complexo antígeno/molécula de ligação a antígeno no endossomo. Uma molécula de ligação a antígeno que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a vários FcyRs foi aumentada e cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da condição de concentração de íons é ativamente incorporada a células através de ligação a vários FcyRs expressos na membrana celular e pode ser transportada de volta para o plasma através de reciclagem via a ligação entre FcRn e o domínio de ligação a FcRn compreendido na molécula, que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição faixa de pH ácido. Isto é, é pensado que, uma vez que a molécula de ligação a antígeno acima que forma um complexo com um antígeno solúvel em plasma é ativamente incorporada a células via FcyR expresso na membrana celular, seu efeito de acelerar a eliminação do antígeno solúvel de plasma é mais notadamente mostrada do que moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a vários FcyRs não foi aumentada.

[00976] A atividade de ligação a FcyR de um anticorpo que se liga a um antígeno de membrana desempenha um papel importante na atividade citotóxica do anticorpo. Desta maneira, quando é necessário que um anticorpo usado como um agente farmacêutico tenha atividade citotóxica, um isotipo de IgG1 humano com atividade de ligação a FcyR forte é usado. Ainda, técnicas para aumentar a atividade citotóxica de tais anticorpos através do aumento da atividade de ligação a FcyR dos anticorpos são geralmente usadas na técnica.

[00977] Entretanto, o papel da atividade de ligação a FcyR de anticorpos que se ligam a antígenos solúveis e que são usados como agentes farmacêuticos não é conhecido na técnica. Não houve avaliação suficiente sobre que diferença no efeito do organismo vivo administrado com os anticorpos é causada pela diferença na atividade de ligação a FcyR entre IgG1 humana com atividade de ligação a FcyR alta e IgG2 humana e IgG4 humana com atividade de ligação a FcyR baixa. Na realidade, foi demonstrado no presente Exemplo que não houve nenhuma influência sobre o curso de tempo de concentração de antígeno solúvel no plasma dos indivíduos administrados com um anticorpo que não tem atividade de ligação a FcyR. Entretanto, na presente invenção, foi revelado que a concentração de antígeno solúvel foi significantemente reduzida no plasma dos indivíduos administrados com uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR foi aumentada e que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da condição de concentração de íons. Especificamente, pode ser dito que os inventores da presente invenção revelaram pela primeira vez o benefício do aumento de ligação a FcyR através da combinação de um domínio de ligação a FcRn que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido com um domínio de ligação a antígeno cuja ligação a antígeno solúvel é alterada dependendo da condição de concentração de íon, compreendido em uma molécula de ligação a antígeno direcionada a um antígeno solúvel.

[00978] [Exemplo 3] Efeito de eliminação de antígenos de plasma por moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido

[00979] (3-1) Preparação de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humana foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido

[00980] Um método relatado para aperfeiçoamento da retenção de anticorpo IgG em plasma é aperfeiçoar a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido. É pensado que, quando a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido é aperfeiçoada através da introdução de uma substituição de aminoácido na região Fc de um anticorpo IgG, isso aumenta a eficiência de reciclagem a partir do endossomo para o plasma resultando em um aperfeiçoamento da retenção no plasma do anticorpo IgG.

[00981] Há muitos relatos sobre alterações de aminoácido para aperfeiçoar a retenção no plasma através do aperfeiçoamento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido. Tais alterações incluem, por exemplo, o método para substituição de Met por Leu na posição 428 e Asn por Ser na posição 424 (numeração EU) em um anticorpo IgG (Nat. Biotechnol. (2010) 28, 157-159); o método para substituição de Asn por Ala na posição 434 (Drug Metab. Dispos. (2010) 38 (4), 600-605); o método de substituição de Met por Tyr na posição 252, Ser por Thr na posição 254 e Thr por Glu na posição 256 (J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23542); o método de substituição de Thr por Gln na posição 250 e Met por Leu na posição 428 (J. Immunol. (2006) 176 (1) 346-356); o método para substituição de Asn por His na posição 434 (Clin. Pharm. & Ther. (2011) 89 (2) 283290); e WO2010/106180; WO2010/045193; WO2009/058492; WO2008/022152; WO2006/050166, WO2006/053301, WO2006/031370; WO2005/123780; WO2005/047327; WO2005/037867; WO2004/035752; e WO2002/060919.

[00982] VH3-IgG1-F1093 (SEQ ID NO: 43) com substituição de Met por Leu na posição 428 e Asn por Ser na posição 434 (numeração EU) com VH3-IgG1-F1022 foi preparado para aperfeiçoar a farmacodinâmica de Fv4-IgG1-F1022 que foi demonstrado produzir, quando administrado, o efeito de reduzir significantemente a concentração de antígeno solúvel em plasma, conforme descrito no Exemplo 2. Fv4-IgG1-F1093 compreendendo VH3-IgG1-F1093 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foi construído usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.

[00983] (3-2) Efeito de eliminação de antígenos de plasma por moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido

[00984] Um teste de infusão in vivo foi realizado para Fv4-IgG1- F1093 através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo (2-1) usando camundongos transgênicos com FcRn humano onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida constante em plasma. Concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma de camundongos foram determinadas através dos métodos descritos no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Figura 4.

[00985] (3-2-1) Determinação da concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano em plasma através do método ELISA

[00986] Concentrações de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano em plasma de camundongo foram determinadas através do método ELISA. Primeiro, um fragmento F(ab')2 de IgG anti-humana (específico para cadeia y) (SIGMA) foi separado em alíquotas em uma Nunc- Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International). A placa foi deixada ficar a 4° C de um dia para o outro para preparar uma placa imobilizada com a IgG anti-humana Amostras de curva padrão contendo um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano (concentração em plasma: 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 e 0,0125 μg/ml) e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluído 100 vezes ou mais foram preparadas. 100 μl de cada uma da curva padrão e amostras de ensaio foram combinados com 200 μl de 20 ng/ml de receptor de IL-6 humano solúvel. As misturas resultantes foram deixadas descansar em temperatura ambiente por uma hora e separadas em alíquotas para cada cavidade da placa imobilizada com a IgG anti-humana. A placa foi deixada ficar em temperatura ambiente por mais uma hora. Então, Biotinylated Antihuman IL-6 R Antibody (R&D) foi reagido nela em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi reagida nela em temperatura ambiente por uma hora. A reação cromogênica da solução de reação foi realizada usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após terminar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm da solução de reação de cada cavidade foi medida com uma leitora de microplaca. Concentrações de anticorpo em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices).

[00987] O resultado é mostrado na Figura 5.

[00988] (3-3) Aperfeiçoamento de farmacodinâmica através do aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido

[00989] Conforme mostrado na Figura 5, no grupo administrado com Fv-IgG1-F1022 resultante do aumento da atividade de ligação a FcyR de Fv4-IgG1 sob uma condição de faixa de pH neutro, a retenção no plasma do anticorpo administrado foi demonstrada ser reduzida comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1. Entretanto, no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1093 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1022 sob uma condição de faixa de pH ácido, a retenção no plasma do anticorpo administrado foi demonstrada ser significantemente aperfeiçoada comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022.

[00990] Ainda, conforme mostrado na Figura 4, o curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma do grupo de Fv4-IgG1-F1022 era equivalente àquele do grupo administrado com Fv4-IgG1-F1093, até três dias após a administração do anticorpo. No dia três de administração, comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1, a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foi reduzida tanto quanto 100 vezes em ambos os grupos administrados com Fv4-IgG1-F1022 e Fv4-IgG1-F1093. No entanto, no dia sete após administração do anticorpo, a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foi observada ser elevada no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022 comparado com no dia três após administração. Por outro lado, no grupo administrado com Fv4-IgG1- F1093, um aumento na concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel não foi observado, mostrando que o efeito para reduzir a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel foi sustentado neste grupo de administração.

[00991] Especificamente, Fv4-IgG1-F1093, quando administrado, reduziu a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma do indivíduo administrado para cerca de 1/100 comparado com Fv4- IgG1 e, ainda, sustentou esta condição por um período longo. Desta maneira, Fv4-IgG1-F1093 foi demonstrado ser uma molécula de ligação a antígeno altamente excelente. Sem ser limitado por uma teoria particular, o fenômeno observado aqui pode ser explicado como segue. Fv4-IgG1-F1022 onde a atividade de ligação a FcyR de Fv4-IgG1 foi aumentada sob uma condição de faixa de pH neutro é pensado ser incorporado em uma grande quantidade principalmente em células expressando FcyR na membrana celular. O anticorpo incorporado é transferido para o endossomo, e através de ligação a FcRn no endossomo, o anticorpo é reciclado para o plasma. Quando a atividade de ligação a FcRn do anticorpo não é alta o suficiente sob a condição em pH ácido no endossomo, o anticorpo incorporado no endossomo é pensado ser incapaz de reciclagem suficiente. Especificamente, uma possível razão para a retenção no plasma reduzida de Fv4-IgG1-F1022 com relação a Fv4-IgG1 seria que a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido é insuficiente para reciclagem suficiente do anticorpo incorporado ao endossomo para o plasma através de ligação a FcRn, e o anticorpo que não foi reciclado foi degradado no lisossomo.

[00992] Por outro lado, como com Fv4-IgG1-F1022, Fv4-IgG1-F1093 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4- IgG1-F1022 sob uma condição de faixa de pH ácido é pensado ser incorporado em uma grande quantidade principalmente em células expressando FcyR na membrana celular. Um anticorpo incorporado e transferido para o endossomo é reciclado para o plasma através de ligação a FcRn no endossomo. Uma vez que a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada, Fv4-IgG1- F1093 é pensado ter atividade de ligação a FcRn suficiente no endossomo. Desta maneira, após incorporação em células, a maior parte do Fv4-IgG1-F1093 é reciclado para o plasma. Desta maneira, seria pensado que a retenção no plasma de Fv4-IgG1-F1093 foi aperfeiçoada em indivíduos administrados comparado com Fv4-IgG1-F1022.

[00993] Por outro lado, é conhecido que a retenção no plasma de anticorpos comuns é aperfeiçoada quando sua atividade de ligação a FcRn é aperfeiçoada sob uma condição de faixa de pH ácido. No entanto, é pensado que, quando a retenção do anticorpo no plasma é aperfeiçoada, a retenção no plasma de antígenos ligados a anticorpo é também aperfeiçoada, e isso resulta em um aumento da concentração de antígeno no plasma. Na realidade, conforme descrito no WO2010/088444, Anticorpo 18E introduzido com a alteração YTE no Anticorpo 18, que é um anticorpo IgG1 humano contra IL-6, para aumentar a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, mostrou retenção de anticorpo aperfeiçoada no plasma de macacos cinomólogo e ao mesmo tempo, a concentração do antígeno para IL-6 foi também elevada no plasma.

[00994] Surpreendentemente, no entanto, quando administrando Fv4-IgG1-F1093 introduzido com uma alteração similar a YTE para aumento da atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido em Fv4-F1022 que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH e tem atividade de ligação a FcyR aumentada, a retenção no plasma do anticorpo foi significantemente aperfeiçoada nos indivíduos administrados sem aumento da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel que é o antígeno. Ao contrário, no dia sete após administração do anticorpo, a concentração do receptor de IL-6 humano solúvel permaneceu baixa nos indivíduos administrados com Fv4-IgG1- F1093 comparado com aqueles administrados com Fv4-F1022.

[00995] Sem ser limitado por nenhuma teoria particular, o fenômeno observado aqui pode ser explicado como segue. Quando administrado a um organismo vivo, um anticorpo sem ligação a antígeno dependente do pH não é especificamente incorporado a células. Antígenos que permanecem para serem ligados ao anticorpo são reciclados para o plasma no mesmo nível que o anticorpo. Entretanto, para um anticorpo com atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido, o grau de reciclagem para o plasma em um organismo vivo administrado com o anticorpo é maior do que aquele de um anticorpo sem atividade de ligação a FcRn aumentada, e isso resulta em um nível aumentado de reciclagem de antígenos ligados ao antígeno para o plasma no organismo vivo. Desta maneira, devido à retenção no plasma aperfeiçoada do anticorpo administrado no organismo vivo, a concentração no plasma do antígeno ao qual o anticorpo se liga é pensada também ser aumentada no organismo vivo.

[00996] Entretanto, quando administrado a um organismo vivo, um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH e que tem atividade de ligação a FcyR aumentada é principalmente incorporado a células imunes expressando FcyR na membrana celular, e isso reduz a retenção no plasma. Ainda, após ser incorporado a células enquanto estando ligado ao anticorpo, o antígeno é dissociado do anticorpo no endossomo e então degradado no lisossomo, resultando em uma diminuição da concentração de antígeno no plasma no organismo vivo. Quando a atividade de ligação a FcRn é aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido, a retenção de anticorpo em plasma, mesmo se piorada devido à atividade de ligação a FcyR aumentada, é aperfeiçoada por um aumento na taxa de reciclagem por FcRn. Neste caso, uma vez que o antígeno ligado ao anticorpo que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH é dissociado do anticorpo no endossomo e diretamente degradado no lisossomo, não é pensado que a concentração de antígeno seja aumentada no plasma. Ainda, a retenção no plasma aperfeiçoada do anticorpo administrado ao organismo vivo é pensada permitir que o efeito de eliminação de antígeno do anticorpo seja sustentado, e a concentração de antígeno seja mantida baixa por um período mais longo.

[00997] As constatações acima demonstram que a retenção no plasma de um anticorpo administrado é aperfeiçoada em um organismo vivo administrado com o anticorpo onde a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada em uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa. Ainda, foi revelado que, neste caso, a retenção de anticorpo em plasma é aperfeiçoada sem deterioração do efeito de eliminação de antígeno.

[00998] [Exemplo 4] Avaliação adicional do efeito de eliminação de antígenos de plasma de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humana foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido.

[00999] (4-1) O efeito de eliminação de um anticorpo atividade de ligação a FcyR aumentada

[001000] Conforme descrito no Exemplo 2, a concentração de antígeno em plasma foi significantemente reduzida no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022 com ligação a FcyR de camundongo aumentada. Entretanto, conforme mostrado no Exemplo 3, a retenção no plasma reduzida observada no grupo administrado com Fv4-IgG1- F1022 foi notadamente aperfeiçoada através do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1022 sob uma condição de faixa de pH ácido. Em seguida, o efeito de eliminação de antígenos solúveis de plasma através do aumento da ligação a FcyR de camundongo e o efeito de aperfeiçoamento de retenção no plasma de um anticorpo através do aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido foram adicionalmente avaliados conforme descrito abaixo.

[001001] (4-2) Preparação de um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano com ligação a FcyR de camundongo aumentada

[001002] VH3-IgG1-F1087 (SEQ ID NO: 44) resultante da substituição de Lys por Asp na posição 326 (numeração EU) em VH3-IgG1 e VH3- IgG1-F1182 (SEQ ID NO: 45) resultante da substituição de Ser por Asp na posição 239 e Ile por Glu na posição 32 (numeração EU) em VH3- IgG1 foram preparados como moléculas de ligação a antígeno com ligação a FcyR de camundongo aumentada. Fv4-IgG1-F1087 que contém VH3-IgG1-F1087 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve e Fv4-IgG1-F1182 que contém VH3-IgG1-F1182 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foram produzidos usando o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[001003] (4-3) Avaliação de atividade de ligação a FcyR de camundongo

[001004] VH3/L (WT)-IgG1-F1087 3 VH3/L (WT)-IgG1-F1182 que contêm VH3-IgG1-F1087 e VH3-IgG1-F1182 como a cadeia pesada, respectivamente, e L (WT)-CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve, foram preparados através do método descrito no Exemplo de Referência 2. Esses anticorpos e VH3/L (WT)-IgG1-F1022 e VH3/L (WT)-IgG1 foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a FcyR de camundongo através do método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado é mostrado na Tabela 7. Ainda, a razão do aumento na atividade de ligação a FcyR de camundongo de cada variante com relação a IgG1 antes da alteração é mostrada na Tabela 8. Na tabela, VH3/L (WT)-IgG1, VH3/L (WT)-IgG1-F1022, VH3/L (WT)-IgG1-F1087 e VH3/L (WT)-IgG1-F1182 são mostrados como IgG1, F1022, F1087 e F1182, respectivamente. Tabela 7

[001005] Conforme mostrado na Tabela 8, foi demonstrado que F1087 e F1022 tinham atividade de ligação aumentada a FcyR de camundongo, FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo comparado com IgG1, enquanto sua atividade de ligação a FcyRIV não foi aumentada. Com relação à atividade de ligação de F1087 a FcyRI de camundongo, FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo e FcyRIV de camundongo, o grau do seu aumento foi revelado ser menor do que aquele de F1022. Entretanto, foi mostrado que a atividade de ligação de F1182 a FcyRI de camundongo e FcyRIV de camundongo foi consideravelmente aumentada, enquanto o grau de aumento em sua atividade de ligação a FcyRIIb e FcyRIII foi menor do que aquela de F1022 e F1087. Conforme mencionado acima, esses três tipos de variantes mostraram ligação aumentada a alguns FcyRs de camundongo; no entanto, foi mostrado que o FcyR ao qual a atividade de ligação é seletivamente aumentada e o grau do aumento variam dependendo da variante.

[001006] (4-4) O efeito de eliminação de antígenos do plasma de Fv4- IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182

[001007] Através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo 2, testes de infusão in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano foram realizados para determinar as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma do camundongo. O resultado é mostrado na Figura 6.

[001008] Em ambos os grupos administrados com Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182 in vivo, que têm atividade de ligação a FcRn de camundongo aumentada comparado com Fv4-IgG1, a concentração no plasma in vivo de receptor de IL-6 humano solúvel reduziu comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1. O efeito para reduzir a concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel foi especialmente alta no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1087 que tem ligação aumentada a FcyRII de camundongo e FcyRIII de camundongo. Entretanto, o efeito da administração de F1182 para reduzir a concentração em plasma de receptor de IL-6 humano solúvel foi pequeno no grupo administrado com F1182 in vivo que tem atividade de ligação consideravelmente aumentada a FcyRI de camundongo e FcyRIV de camundongo (bem como ligação várias vezes aumentada a FcyRII e camundongo e FcyRIII de camundongo). Foi pensado a partir desses resultados que os FcyRs de camundongo que contribuem mais significantemente por um efeito que diminui eficientemente a concentração de antígeno no plasma de camundongos administrados com um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH são FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo. Especificamente, foi pensado que a concentração de antígeno no plasma pode ser mais eficientemente reduzida in vivo através da administração a um organismo vivo de um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH com ligação aumentada a FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo.

[001009] (4-5) Preparação de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa e que tem atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido

[001010] Conforme descrito no Exemplo 3, quando comparado com camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4- IgG1-F1022, a retenção no plasma de um anticorpo administrado é notadamente aperfeiçoada em camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1-F1093 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido de Fv4-IgG1-F1022 onde a atividade de ligação a FcyR de camundongo foi aumentada. Se este efeito foi também observado em camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4- IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182 e se o mesmo efeito é observado em camundongos administrados com variantes cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido através da adição de uma alteração distinta da alteração avaliada no Exemplo 3 foi avaliado como segue.

[001011] VH3-IgG1-F1180 (SEQ ID NO: 46) e VH3-IgG1-F1181 (SEQ ID NO: 47) foram preparados substituindo Met por Leu na posição 428 e Asn por Ser na posição 434 (numeração EU) nas cadeias pesadas VH3-IgG1-F1087 e VH3-IgG1-F1182, a fim de aumentar sua atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182 sob uma condição de faixa de pH ácido. Ainda, VH3-IgG1-F1412 (SEQ ID NO: 48) foi preparado através da substituição de Asn por Ala na posição 434 (numeração EU) na cadeia pesada VH3-IgG1-F1087, a fim de aumentar a atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1087 sob uma condição de faixa de pH ácido. Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1- F1181 e Fv4-IgG1-F1412 que contêm as cadeias pesadas acima e VL3- CK como a cadeia leve foram preparados usando o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[001012] (4-6) Aperfeiçoamento de farmacodinâmica de anticorpos através de aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido

[001013] Testes de infusão in vivo foram realizados através da administração de Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1181 e Fv4-IgG1-F1412 a camundongos transgênicos com FcRn humano de acordo com o mesmo método que aquele descrito no Exemplo 2 para determinar as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma do camundongo. Os resultados sobre as concentrações de anticorpo no plasma dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1-F1087, Fv4-IgG1- F1180, Fv4-IgG1-F1412 e Fv4-IgG1 são mostrados na Figura 9. Os resultados das concentrações de anticorpo no plasma dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1-F1182, Fv4-IgG1-F1181 e Fv4-IgG1 são mostrados na Figura 10. Entretanto, as concentrações de anticorpo no plasma nos grupos de camundongo foram medidas através do método descrito no Exemplo 3. Os resultados sobre as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma de Fv4-IgG1- F1087, Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1412 e Fv4-IgG1 nos grupos de camundongo são mostrados na Figura 7; e os resultados sobre as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma de Fv4-IgG1- F1182, Fv4-IgG1-F1181 e Fv4-IgG1 são mostrados na Figura 8.

[001014] Foi confirmado que, comparado com o grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182, a retenção no plasma de anticorpos administrados foi aperfeiçoada no grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1181 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1182 sob uma condição de faixa de pH ácido. Entretanto, a concentração de anticorpo no plasma dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1-F1181 era comparável àquela no grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182. Quando comparado com os grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1, a concentração de anticorpo no plasma foi diminuída em ambos os grupos.

[001015] Por outro lado, comparado com o grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1087, a retenção no plasma de anticorpos administrados foi aperfeiçoada em ambos os grupos de camundongos administrados com FV4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4- IgG1-F1087 sob uma condição de faixa de pH ácido e, surpreendentemente, a retenção no plasma foi aperfeiçoada até um nível comparável com aquele dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1. Ainda, a sustentabilidade do efeito de redução da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foi aperfeiçoada através do aperfeiçoamento de retenção de anticorpo no plasma nos grupos de camundongos administrados. Especificamente, nos grupos de camundongos administrados, as concentrações de receptor de IL-6 solúvel em plasma 14 dias e 21 dias após administração de Fv4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412 foram significantemente reduzidas comparado com as concentrações 14 dias e 21 dias após administração de Fv4-IgG1-F1087.

[001016] Em vista do acima, como para os grupos de camundongos administrados com os quatro exemplos de anticorpos, Fv4-IgG1-F1093, Fv4-IgG1-F1181, Fv4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412, foi demonstrado que a retenção no plasma pode ser aperfeiçoada em um organismo vivo administrado com um anticorpo onde a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido foi aumentada em uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa. Foi demonstrado que, no organismo vivo administrado com a molécula de ligação a antígeno, a retenção no plasma é aperfeiçoada sem deterioração do efeito de eliminação de antígenos do organismo vivo e, ao contrário, o efeito de eliminação de antígeno pode ser sustentado.

[001017] É demonstrado que alteração para aumentar a atividade de ligação ao FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido poderia ser realizada por meio do método que substitui Ala por Asn na posição 434 (Numeração EU), além do método que substitui Leu por Met na posição 428 (Numeração EU) e Ser por Asn na posição 434 (Numeração EU). Portanto, alterações usadas para aumentar a atividade de ligação ao FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido não estão particularmente limitadas e o método que substitui Leu por Met na posição 428 (Numeração EU) e Ser por Asn na posição 434 (Numeração EU) em um anticorpo IgG (Nat. Biotechnol. (2010) 28, 157-159), o método que substitui Ala por Asn na posição 434 (Numeração EU) em um anticorpo IgG (Drug Metab. Dispos. (2010) 38 (4), 600-605), o método que substitui Tyr por Met na posição 252 (Numeração EU), Thr por Ser na posição 254 (Numeração EU) e Glu por Thr na posição 256 (Numeração EU) em um anticorpo IgG (J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23524), o método que substitui Gln por Thr na posição 250 (Numeração EU) e Leu por Met na posição 428 (Numeração EU) em um anticorpo IgG (J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356), o método que substitui His por Asn na posição 434 (Numeração EU) em um anticorpo IgG (Clin. Pharmacol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290), bem como alterações descritas nos documentos WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, WO 2002/060919 e similares podem ser usados.

[001018] (4-7) Preparação de moléculas de ligação a antígeno com atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido e ligação suprimida a um fator reumatoide

[001019] Nos últimos anos, uma molécula de anticorpo resultante de substituição de Asn por His na posição 434 (numeração EU) em um anticorpo anti-CD4 humanizado para aperfeiçoar a retenção no plasma através de aumento de sua atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido foi relatada se ligar ao fator reumatoide (RF) (Clin. Pharmacol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290). Este anticorpo tem uma região Fc de IgG1 humana e uma substituição de Asn por His na posição 434 (numeração EU) no sítio de ligação a FcRn. O fator reumatoide foi demostrado reconhecer e se ligar à porção substituída.

[001020] Conforme mostrado em (4-6), várias alterações foram reportadas como alterações para aumentar a atividade de ligação ao FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e introdução destas alterações no sítio de ligação ao FcRn em uma região Fc pode aumentar sua afinidade por um fator reumatoide que reconhece este sítio.

[001021] Contudo, moléculas de ligação a antígeno que têm atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido, mas não têm a ligação ao fator reumatoide podem ser produzidas através da introdução no sítio da região Fc de uma alteração que reduz a atividade de ligação a fator reumatoide sozinho sem redução da atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido.

[001022] Tais alterações usadas para redução da atividade de ligação a fator reumatoide incluem alterações nas posições 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 e 441-444 (numeração EU), preferivelmente aquelas nas posições 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 e 440 (numeração EU) e, particularmente preferivelmente, uma alteração que substitui Val por Glu ou Ser na posição 422, uma alteração que substitui Ser por Arg na posição 424, uma alteração que substitui His por Asp na posição 433, uma alteração que substitui Tyr por Thr na posição 436, uma alteração que substitui Gln por Arg ou Lys na posição 438 e uma alteração que substitui Ser por Glu ou Asp na posição 440 (numeração EU). Essas alterações podem ser usadas sozinhas ou em combinação.

[001023] Alternativamente, é possível introduzir sequências de glicosilação tipo N para reduzir a atividade de ligação a fator reumatoide. Especificamente, sequências de glicosilação tipo N conhecidas incluem Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx representa um aminoácido arbitrário que não Pro). Esta sequência pode ser introduzida na região Fc para adicionar uma cadeia açúcar tipo N e a ligação a RF pode ser inibida pelo impedimento estérico da cadeia de açúcar tipo N. Alterações usadas para adição de uma cadeia de açúcar tipo N incluem preferivelmente uma alteração que substitui Lys por Asn na posição 248, uma alteração que substitui Ser por Asn na posição 424, uma alteração que substitui Tyr por Asn na posição 436 e Gln por Thr na posição 438 e uma alteração que substitui Qln por Asn na posição 438, de acordo com a numeração EU, particularmente preferivelmente uma alteração que substitui Ser por Asn na posição 424 (numeração EU).

[001024] [Exemplo 5] Efeitos de eliminação de antígenos do plasma para moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação ao FcyR é maior do que aquela de uma região Rc de IgG de camundongo nativa

[001025] (5-1) O efeito de eliminação de antígeno de anticorpos de camundongo com atividade de ligação a FcyR aumentada

[001026] Conforme descrito nos Exemplos 1 a 4, foi demonstrado que a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel de plasma de camundongo é acelerado nos grupos de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com moléculas de ligação a antígeno resultantes de aumento da atividade de ligação a FcyR de camundongo de moléculas de ligação a antígeno que têm uma região de Fc de anticorpo humano e a propriedade de ligação a receptor de IL-6 de uma maneira dependente do pH. Se este efeito é também obtido em camundongos normais tendo FcRn de camundongo que foram administrados com moléculas de ligação a antígeno que têm uma região Fc de anticorpo de camundongo e propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH foi avaliado em camundongos normais tendo FcRn de camundongo como segue.

[001027] (5-2) Preparação de anticorpos de camundongo com atividade de ligação a FcyR aumentada

[001028] Para um anticorpo IgG1 de camundongo tendo a propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH, VH3-mIgG1 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 49) e VL3-mk1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 50) foram construídos usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Entretanto, para aumentar a atividade de ligação a FcyR de camundongo de VH3-mIgG1, VH3- mIgG1-mF44 (SEQ ID NO: 51) foi produzido substituindo Ala por Asp na posição 327 (numeração EU). Da mesma maneira, VH3-mIgG1- mF46 (SEQ ID NO: 52) foi produzido substituindo Ser por Asp na posição 239 e Ala por Asp na posição 327, de acordo com a numeração EU, em VH3-mIgG1. Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1 e Fv4-mIgG1-mF46, que contém VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 e VH3-mIgG1-mF46, respectivamente, como a cadeia pesada, e VL3-mk1 como a cadeia leve, foram preparados usando o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[001029] (5-3) Avaliação de atividade de ligação a FcyR

[001030] VH3/L (WT)/mIgG1, VH3/L (WT)-mIgG1-mF44 e VH3/L (WT)-mIgG1-mF46, que contêm VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 e VH3- mIgG1-mF46, respectivamente, como a cadeia pesada, e L (WT)-CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve, foram preparados através do método descrito no Exemplo de Referência 1. Esses anticorpos foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a FcyR de camundongo através do método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado é mostrado na Tabela 9. Ainda, a razão do aumento na atividade de ligação a FcyR de camundongo de cada variante com relação a mIgG1 antes da alteração é mostrada na Tabela 10. Na tabela, VH3/L (WT)- mIgG1, VH3/L (WT)-mIgG1-mF44 e VH3/L (WT)-mIgG1-mF46 são mostrados como mIgG1, mF44 e mF46, respectivamente. Tabela 9

[001031] O resultado de avaliação do Exemplo 4 mostrando que VH3/L (WT)-mIgG1 tendo a região Fc de anticorpo IgG1 de camundongo nativo se liga apenas a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo, mas não a FcyRI de camundongo e FcyRIV de camundongo, sugere que FcyRs de camundongo importantes para a redução de concentração de antígeno são FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo. VH3/L (WT)-mIgG-mF44 e VH3/L (WT)-mIgG1- mF46 introduzidos com uma alteração que é pensada aumentar a atividade de ligação a FcyR de VH3/L (WT)-mIgG1 foram demonstrados ter atividade de ligação aumentada a ambos FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo.

[001032] (5-4) Avaliação do efeito para reduzir a concentração de receptor de IL-6 solúvel no plasma de camundongos normais

[001033] O efeito para eliminar receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos normais administrados com o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 foi avaliado como segue.

[001034] Um modelo animal onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida em um estado uniforme em plasma foi criado através do implante de uma bomba de infusão (MINO-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet) contendo receptor de IL-6 humano solúvel sob a pele nas costas de camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). A dinâmica in vivo do receptor de IL-6 humano solúvel após administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi avaliada no modelo animal. Para suprimir a produção de anticorpos contra receptor de IL-6 humano solúvel, um anticorpo monoclonal C4 anticamundongo foi administrado uma vez a 20 mg/kg na veia caudal. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutaneamente implantada nas costas dos camundongos. Três dias após implante da bomba de infusão, o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi administrado uma vez a 1 mg/kg na veia da cauda. O sangue foi coletado dos camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias, sete dias, 14 dias (ou 15 dias) e 21 dias (ou 22 dias) após administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humano. Imediatamente em seguida, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 15 minutos para preparar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20° C ou abaixo até o uso.

[001035] As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foram determinadas através do método descrito em (2-1-2). O resultado é mostrado na Figura 11.

[001036] Surpreendentemente, foi demonstrado que, em camundongos administrados com mF44 e mF46 introduzidos com uma alteração para aumentar a atividade de ligação de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo, a concentração de receptor de IL-6 no plasma foi notadamente reduzida comparado com camundongos administrados com mIgG1. Em particular, mesmo no dia 21 após administração de mF44, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF44 foi reduzida em cerca de 6 vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 10 vezes comparado com o grupo administrado com mIgG1. Por outro lado, no dia sete após administração de mF46, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF46 foi notadamente reduzida cerca de 30 vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 50 vezes comparado com o grupo administrado com mIgG1.

[001037] As constatações acima demonstram que a eliminação de receptor de IL-6 solúvel do plasma foi também acelerada em camundongos administrados com anticorpos onde a atividade de ligação a FcyR de camundongo de uma molécula de ligação a antígeno tendo as regiões Fc de anticorpo IgG1 de camundongo é aumentada, como com anticorpos onde a atividade de ligação a FcyR de camundongo de uma molécula de ligação a antígeno tendo a região Fc de anticorpo IgG1 humano é aumentada. Sem ser limitado a nenhuma teoria particular, o fenômeno observado conforme acima descrito pode ser explicado como segue.

[001038] Quando administrado a camundongos, anticorpos que se ligam a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e têm atividade de ligação a FcyR aumentada são ativamente incorporados principalmente a células expressando FcyR na membrana celular. Os anticorpos incorporados dissociam o antígeno solúvel sob uma condição de pH ácido no endossomo, e então reciclados para o plasma via FcRn. Desta maneira, um fator que obtém o efeito de eliminação do plasma de antígeno solúvel de tal anticorpo é o nível de atividade de ligação a FcyR do anticorpo. Especificamente, como a atividade de ligação a FcyR é maior, a incorporação a células expressando FcyR ocorre mais ativamente, e isso torna a eliminação de antígenos solúveis do plasma mais rápida. Ainda, contanto que a atividade de ligação a FcyR tenha sido aumentada, o efeito pode ser avaliado da mesma maneira sem importar se a região Fc contida em um anticorpo se origina de IgG1 humana ou de camundongo. Especificamente, a avaliação pode ser obtida para uma região Fc de quaisquer espécies animais, tal como qualquer uma de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, IgG1 de camundongo, IgG2a de camundongo, IgG2b de camundongo, IgG3 de camundongo, IgG de rato, IgG de macaco e IgG de coelho, contanto que a atividade de ligação ao FcyR da espécie animal a ser administrada tenha sido aumentada.

[001039] [Exemplo 6] O efeito de eliminação de antígeno por anticorpos com a atividade de ligação aumentou de uma maneira seletiva de FcyRIIb

[001040] (6-1) O efeito de eliminação de antígeno de anticorpos onde a atividade de ligação a FcyR foi seletivamente aumentada

[001041] Camundongos deficientes em FcyRIII (B6.129P2- FcgrFcyR3tm1Sjv/J mouse, Jackson Laboratories) expressam FcyRI de camundongo, FcyRIIb de camundongo e FcyRIV de camundongo, mas não FcyRIII de camundongo. Entretanto, camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc (Fcer1g mouse, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529) expressam FcyRIIb sozinho, mas não FcyRI de camundongo, FcyRIII de camundongo e FcyRIV de camundongo.

[001042] Conforme descrito no Exemplo 5, foi demonstrado que mF44 e mF46 com atividade de ligação a FcyR aumentada de IgG1 de camundongo nativa mostram ligação seletivamente aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Foi concebido que, usando a atividade de ligação seletivamente aumentada dos anticorpos, a condição sob a qual um anticorpo com ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada é administrado pode ser imitada administrando mF44 e mF46 a camundongos deficientes em FcyRIII ou camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc que não expressam FcyRIII de camundongo.

[001043] (6-2) Avaliação do efeito de eliminação de antígeno através de aumento seletivo de ligação a FcyRIIb de camundongo usando camundongos deficientes em FcyRIII

[001044] O efeito para eliminar receptor de IL-6 solúvel de plasma em camundongos deficientes em FcyRIII administrados com o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4- mIgG1-mF46 foi avaliado através do mesmo método descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma dos camundongos foram determinadas através do método descrito no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Figura 12.

[001045] Surpreendentemente, foi demonstrado que as concentrações de receptor de IL-6 no plasma em camundongos deficientes em FcyRIII administrados com mF44 e mF46, que imitam a condição sob a qual a atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo de mIgG1 (IgG1 nativa) é seletivamente aumentada, foram notadamente reduzidas comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma em camundongos administrados com mIgG1. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo administrado com mF44 foi reduzida cerca de três vezes comparado com aquela do grupo administrado com mIgG1 e o acúmulo de concentração de anticorpo devido à administração de anticorpo foi suprimida. Entretanto, no dia três após administração, a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo administrado com mF46 foi notadamente reduzida cerca de seis vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo sem administração de anticorpo e cerca de 25 vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo administrado com mIgG1. Este resultado mostra que, como a atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo de um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH é maior, a concentração do receptor de IL-6 pode ser reduzida mais no plasma de camundongos administrados com o anticorpo.

[001046] (6-3) Avaliação do efeito de eliminação de antígeno por meio de aumento seletivo de ligação a FcyRIIb usando camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc

[001047] O efeito de eliminar receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc administrados com o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1- mF44 ou Fv4-mIgG1mF46, foi avaliado através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma dos camundongos foram determinadas através do método descrito no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Figura 13.

[001048] Como com o caso onde mF44 e mF46 foram administrados a camundongos deficientes em FcyRIII, a concentração de receptor de IL-6 no plasma em camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc administrados com mF44 e mF46, que imitam a condição resultante do aumento seletivo na atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa), foi demonstrada ser notadamente reduzida comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma nos camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc administrados com mIgG1. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF44 foi reduzida para cerca de três vezes aquela no grupo a administrado com mIgG1, e o acúmulo de concentração de antígeno devido à administração de anticorpo foi suprimido. Entretanto, no dia três após administração, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF46 foi notadamente reduzida cerca de cinco vezes comparado coma aquela no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 15 vezes comparado com aquela no grupo administrado com mIgG1.

[001049] Os resultados descritos nos Exemplo (6-2) e (6-3) mostram que a concentração de antígeno solúvel no plasma é notadamente reduzida no grupo administrado com um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e tem atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada.

[001050] [Exemplo 7] O efeito de eliminação de antígeno de anticorpos com aumento seletivo de ligação a FcyRIII

[001051] (7-1) O efeito de eliminação de antígeno de anticorpos com ligação a FcyRIII seletivamente aumentada

[001052] Camundongos deficientes em FcyRIIb (FcgrFcyR2b (FcyRII) mouse) Taconic) (Nature (1996) 379 (6563), 346-349) expressam FcyR de camundongo, FcyRIII de camundongo e FcyRIV de camundongo, mas não FcyRIIb de camundongo. Conforme descrito no Exemplo 5, foi demonstrado que mF44 e mF46 resultantes de aumento da atividade de ligação a FcyR de IgG1 de camundongo nativa mostra ligação seletivamente aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Foi concebido que, com base no uso da atividade de ligação seletivamente aumentada dos anticorpos, a condição de administração de um anticorpo com ligação seletivamente aumentada a FcyRIII de camundongo pode ser imitada administrando mF44 ou mF46 a camundongos deficientes em FcyRIIb que não expressam FcyRIIb de camundongo.

[001053] Conforme descrito no Exemplo 6, a concentração de antígeno solúvel foi reduzida no plasma de camundongos deficientes em FcyRIII, que imitam a condição de administração de um anticorpo com atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada. Entretanto, se a concentração de antígeno solúvel for reduzida no plasma de camundongos deficientes em FcyRIIb, que imitam a condição de administração de um anticorpo com atividade de ligação a FcyRIII de camundongo seletivamente aumentada, foi avaliada através do método descrito abaixo.

[001054] (7-2) Avaliação do efeito de eliminação de antígeno através do aumento seletivo de ligação a FcyRIII de camundongo usando camundongos deficientes em FcyRIIIb

[001055] O efeito de eliminar receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongo deficientes em FcyRIIb administrados com um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4- mIgG1mF46, foi avaliado através do mesmo método descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foram determinadas através do método descrito no Exemplo (21-2). O resultado é mostrado na Figura 14.

[001056] Surpreendentemente, nos grupos administrados com mF44 e mF46, que imitam aumento seletivo da atividade de ligação a FcyRIII de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa), a concentração de receptor de IL-6 no plasma foi reduzida, mas a redução acentuada não foi confirmada comparado com aquela mostrada no Exemplo 6.

[001057] Sem ser limitado a nenhuma teoria particular, com base nos resultados descritos nos Exemplos 5, 6 e 7, a discussão que segue é possível. A eliminação de receptor de IL-6 solúvel de plasma foi verificada ser notadamente acelerada em camundongos normais expressando ambos FcyRIIb de camundongo e FcyRII de camundongo que foram administrados com mF44 e mF46 com atividade de ligação seletivamente aumentada de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Ainda, foi revelado que, quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos que expressam FcyRIIb de camundongo, mas não FcyRIII de camundongo (isto é, camundongos deficientes em FcyRIII e camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc), a eliminação de receptor de IL-6 solúvel de plasma foi também acelerada notadamente nos camundongos. Entretanto, quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos que expressam FcyRIII de camundongo, mas não FcyRIIb de camundongo (isto é, camundongos deficientes em FcyRII), a eliminação de receptor de IL-6 solúvel do plasma não foi acelerada nos camundongos.

[001058] A partir das constatações acima, foi pensado que os anticorpos mF44 e mF46 onde a atividade de ligação de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo é aumentada são incorporados a células expressando FcyR principalmente por FcyRIIb de camundongo, e então o antígeno solúvel no plasma que se liga aos anticorpos é eliminado. Entretanto, a incorporação mediada por FcyRIII de complexos de anticorpo/antígeno em células expressando FcyR é pensada não contribuir significantemente para a eliminação do antígeno solúvel do plasma.

[001059] Ainda, conforme mostrado no Exemplo 4, a concentração no plasma de receptor de IL-6 foi notadamente reduzida em camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1087 tendo atividade de ligação aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo, em particular. Entretanto, o efeito para eliminar receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182 com atividade de ligação aumentada a FcyRI de camundongo e FcyRVI de camundongo, em particular, foi mentor do que de Fv4-IgG1-F1087.

[001060] Ainda, conforme mostrado no Exemplo 2, em camundongos administrados com Fv4-IgG1-Fuc cuja atividade de ligação a FcyRIV tinha sido consideravelmente aumentada por ter cadeias de açúcar com teor de fucose baixo (Science (2005) 310 (5753) 1510-1512), a concentração no plasma de receptor de IL-6 solúvel foi reduzida comparado com aquela em camundongos administrados com Fv4-IgG1; no entanto, o efeito de redução foi tão pequeno quanto duas vezes. Desta maneira, incorporação mediada por FcyRIV de camundongo de anticorpos a células expressando FcyR é pensada não contribuir significantemente para a eliminação de antígeno solúvel de plasma.

[001061] Em vista do acima, foi demonstrado que, de vários FcyRs de camundongo FcyRIIb desempenha um papel principal em incorporação de anticorpo em células expressando FcyR em camundongos. Desta maneira, seria pensado que mutações a serem introduzidas no domínio de ligação a FcyR de camundongo incluem, particularmente de preferência, mas não estão limitados a, mutações que aumentam a ligação a FcyRIIb de camundongo.

[001062] As constatações acima demonstram que, em camundongos, a atividade de ligação a FcyRIIb dos anticorpos a serem administrados é mais preferivelmente aumentada para acelerar a eliminação de antígenos solúveis do plasma de um organismo vivo através da sua administração a moléculas de ligação a antígeno que se ligam a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH e têm atividade de ligação a FcyR aumentada. Especificamente, quando administradas a um organismo vivo, as moléculas de ligação a antígeno que se ligam a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH e têm atividade de ligação aumentada podem acelerar a eliminação de antígenos solúveis de plasma e reduzir efetivamente a concentração no plasma de antígenos solúveis e, então, as moléculas de ligação a antígeno foram reveladas mostrar uma ação muito eficaz.

[001063] [Exemplo 8] Avaliação da habilidade de agregação de plaqueta de anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb

[001064] (8-1) Preparação de anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb

[001065] Conforme descrito no Exemplo 7, antígenos podem ser eficientemente eliminados do plasma dos organismos vivos através da administração de anticorpos com atividade de ligação a FcyRIIb seletivamente aumentada ao organismo vivo. Ainda, a administração de anticorpos contendo uma região Fc com atividade de ligação a FcyRIIb seletivamente aumentada é pensada ser preferida a partir do ponto de vista de segurança e efeitos colaterais no organismo vivo administrado com tais anticorpos.

[001066] No entanto, a ligação a FcyRIIb de camundongo e ligação a FcyRIII de camundongo são ambas aumentadas em mF44 e mF46, e então o aumento de ligação não é seletivo para FcyRIIb de camundongo. Uma vez que a homologia entre FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo é alta, seria difícil encontrar uma alteração que aumente a ligação seletiva a FcyRIIb de camundongo enquanto distinguindo os dois. Além disso, não há nenhum relato anterior de regiões Fc com ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada. Também, a homologia entre FcyRIIb humano e FcyRIIa humano (os dois alótipos, 131Arg e 131His) é também conhecida ser alta. Além disso, não há nenhum relato de regiões Fc que contenham uma alteração que aumente a ligação seletiva a FcyRIIb humano enquanto distinguindo os dois (Seung e outros (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933); Greenwood e outros (Eur. J. Immunol. (1993) 23 (5), 1098-1104). Ainda, foi reportado que anticorpos com ligação aumentada ao FcyRIIa têm atividade de agregação de plaqueta aumentada e podem aumentar o risco do desenvolvimento de trombose quando administrado a organismos (Meyer e outros (J. Thromb. Haemost. (2009), 7 (1), 171-181); Robles-Carrilo e outros (J. Immunol. (2010), 185 (3), 1577-1583)). Desta maneira, se anticorpos com ligação a FcyRIIa aumentada têm uma atividade de agregação de plaqueta aumentada foi avaliado como segue.

[001067] (8-2) Avaliação da atividade de ligação a FcyR humano de anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb

[001068] Anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb foram analisados quanto à sua afinidade a FcyRIa, tipo R e FcyRIIa, tipo H, FcyR IIb e FcyRIIIa através do procedimento que segue. Uma cadeia H foi construída para ter, como a região variável de cadeia H de anticorpo, a região variável de anticorpo IL6R-H (SEQ ID NO: 53) contra receptor da interleucina humana que é revelada no WO2009/125825, e como a região constante de cadeia H de anticorpo, IL6R-G1d (SEQ ID NO: 54) que tem G1d resultante da remoção de Gly e Lys C-terminais de IgG1 humana. Então, IL6R-G1d-v3 (SEQ ID NO: 55) foi construído alterando a região Fc de IL6R-G1d pela substituição de Ser por Glu na posição 267 (numeração EU) e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU), conforme descrito em Seung e outros (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933). IL6R-L (SEQ ID NO: 56) que é a cadeia L de anticorpo antirreceptor de interleucina 6 humana foi usada como uma cadeia L de anticorpo comum, e expressa em combinação com respectivas cadeias H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1, e os anticorpos resultantes foram purificados. Em seguida anticorpos contendo IL6R-G1d e IL6R-G1d-v3 como a cadeia pesada são referidos como IgG1 e IgG1-v3, respectivamente.

[001069] Então, a interação entre FcyR e os anticorpos acima foi cineticamente analisada usando Biacore T100 (GE Healthcare). O ensaio para a interação foi realizado a 25° C usando HBS-EP+ (GE Healthcare) como um tampão de atividade. O chip usado foi um Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) imobilizado com Proteína A por um método de acoplamento de amino. Cada FcyR diluído com o tampão de atividade foi deixado interagir com os anticorpos de interesse capturados no chip para medir a ligação dos anticorpos a cada FcyR. Após medição, glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) foi reagida para o chip para retirar os anticorpos capturados para repetidamente usar o chip regenerado. Um sensorgrama obtido como um resultado da medição foi analisado usando modelo de ligação Langmuir com Biacore Evaluation Software, e constante de taxa de ligação ka (L/mol/s) e constante de taxa de dissociação kd (l/s) foram calculadas, e a constante de dissociação KD (mol/l) foi calculada a partir desses valores. Os valores KD de IgG1 e IgG1-v3 para cada FcyR são mostrados na Tabela 11 (os valores KD de cada anticorpo para cada FcyR), enquanto os valores KD relativos de IgG1-v3, que são obtidos dividindo KD de IgG1 para cada FcyR pela KD de IgG1-v3 para cada FcyR, são mostrados na Tabela 12. Tabela 11

[001070] Estes resultados confirmaram que, comparado com o anticorpo contendo a região Fc de IgG1, o anticorpo contendo uma região Fc alterada na qual Ser na posição 267 foi substituída por Glu e Leu na posição 328 tinha sido substituída por Phe, conforme indicado pela numeração EU, na região Fc de IgG1 (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933), tem afinidade 408 vezes aumentada pelo FcgRIIb e, embora a afinidade pelo FcgRIIa de tipo R fosse diminuída 0,51 vezes, a afinidade pelo FcgRIIa de tipo R foi aumentada 522 vezes.

[001071] (8-3) Avaliação da habilidade em agregar plaquetas

[001072] Em seguida, se a afinidade de FcyRIIa aumentada/reduzida do anticorpo contendo a região Fc com a substituição de Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU) na região Fc de IgG1 muda a habilidade de agregação de plaqueta foi avaliada usando plaquetas derivadas de doadores com FcyRIIa tipo H e tipo R. O anticorpo compreendendo como a cadeia leve omalizumab_VL-CK (SEQ ID NO: 58) e omalizumabe_VH-G1d (SEQ ID NO: 57) que contém a região variável de cadeia pesada de anticorpo hIgG1 (região constante de IgG1 humana) que se liga a IgE e a região constante de cadeia pesada G1d foi construído usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Ainda, omalizumabe_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) foi construído substituindo Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU) em omalizumabe_VH-G1d. Omalizumabe-G1d-v3, que contém omalizumabe_VH-G1d-v3 como a cadeia pesada e omalizumab_VL-CK como a cadeia leve, foi preparado usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Este anticorpo foi avaliado quanto à habilidade de agregação de plaqueta.

[001073] Agregação de plaqueta foi ensaiada usando o agregômetro de plaqueta HEMA TRACER 712 (LMS Co.). Primeiro, cerca de 50 ml de sangue integral foram coletados em uma quantidade fixa em tubos de coleta de sangue evacuados de 4,5 ml contendo 0,5 ml de citrato de sódio 3,8% e este foi centrifugado a 200 g por 15 minutos. O sobrenadante resultante foi coletado e usado como plasma rico em plaqueta (PRP). Após PRP ter sido lavado com tampão A (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,42 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 5 mM, dextrose 5,55 mM, apirase 1,5 U/ml, BSA 0,35%), o tampão foi substituído com tampão B (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,42 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 5 mM, dextrose 5,55 mM, CaCl2 2 mM, BSA 0,35%). Isso rendeu plaquetas lavadas em uma densidade de cerca de 300.000/μl. 156 μl das plaquetas lavadas foram separadas em alíquotas em cuvetas de ensaio contendo uma barra de agitação no agregômetro de plaqueta. As plaquetas foram agitadas a 1000 rpm com a barra de agitação nas cuvetas mantidas a 37,0o C no agregômetro de plaqueta. 44 μl do complexo imune de omalizumabe-G1d-v3 e IgE em uma razão molar de 1:1, preparado em concentrações finais de μg/ml e 686 μg/ml, respectivamente, foram adicionados às cuvetas. As plaquetas foram reagidas com o complexo imune por cinco minutos. Então, uma concentração que não permite agregação de plaqueta secundária, difosfato de adenosina (ADP, SIGMA) foi adicionada à mistura de reação para testar se a agregação é aumentada.

[001074] O resultado de agregação de plaqueta para cada doador com uma forma polimórfica de FcyRIIa (R/H ou H/H) obtido a partir do ensaio acima é mostrado nas Figs. 15 e 16, respectivamente. A partir do resultado na Figura 15, é mostrado que a agregação de plaqueta é aumentada quanto o complexo imune é adicionado às plaquetas de um doador com a forma polimórfica de FcyRIIa (R/H). Entretanto, conforme mostrado na Figura 18, agregação de plaqueta não foi aumentada quando o complexo imune é adicionado às plaquetas de um doador com a forma polimórfica de FcyRIIa (H/H).

[001075] Em seguida, ativação de plaqueta foi avaliada usando marcadores de ativação. Ativação de plaqueta pode ser medida com base na expressão aumentada de um marcador de ativação tal como CD62p (p-selectina) ou integrina ativa na superfície de membrana de plaqueta. 2,3 μl do complexo imune foram adicionados a 7,7 μl das plaquetas lavadas preparadas através do método descrito acima. Após cinco minutos de reação em temperatura ambiente, ativação foi induzida adicionando ADP em uma concentração final de 30 μM, e se o complexo imune aumenta a ativação dependente de ADP foi avaliada. Uma amostra adicionada com tampão de fosfato (pH 7,4) (Gibco), ao invés do complexo imune, foi usada como um controle negativo. Tingimento foi realizado adicionando, a cada amostra pós-reação, anticorpo anti- CD62 marcado com PE (BECTON DICKINSON), anticorpo anti-CD61 marcado com PerCP e anticorpo PAC-1 marcado com FITC (BD Biosciences). Intensidade de fluorescência para cada tingimento foi medida usando um citômetro de fluxo (FACS CantoII, BD Biosciences).

[001076] O resultado sobre expressão de CD62p, obtido através do método de ensaio acima, é mostrado na Figura 17. O resultado sobre a expressão da integrina ativada é mostrado na Figura 18. As plaquetas lavadas usadas foram obtidas de uma pessoa saudável com a forma polimórfica FcyRIIa R/H. Tanto CD62p quanto integrina ativa são expressas sobre superfície da membrana da plaqueta, que é induzida pela estimulação de ADP, foi aumentada na presença do complexo imune.

[001077] Os resultados acima demonstram que o anticorpo tendo a região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb humana, que é a substituição de Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU) na região Fc de IgG1, promove a agregação de plaquetas expressando FcyRIIa com o alótipo FcyRIIa onde o aminoácido na posição 131 é R, comparado com plaquetas expressando FcyRIIa com a forma polimórfica FcyRIIa onde o aminoácido na posição 131 é H. Isto é, foi sugerido que o risco de desenvolvimento de trombose devido à agregação de plaqueta pode ser aumentado quando um anticorpo contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb humano existente é administrado a humanos tendo FcyRIIa tipo R em pelo menos um alelo. Foi mostrado que as moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc da presente invenção que aumenta a ligação a FcyRIIb mais seletivamente não apenas melhora a retenção do antígeno em plasma, mas também possivelmente resolve os problemas acima. Desta maneira, a utilidade das moléculas de ligação a antígeno da presente invenção é óbvia.

[001078] [Exemplo 9] Análise compreensiva de ligação a FcyRIIb de variantes introduzidas com uma alteração na porção de dobra em adição à alteração P238D

[001079] Em uma Fc produzida através da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp em uma IgG1 humana de ocorrência natural, um efeito combinatorial antecipado não poderia ser obtido mesmo com a sua combinação com outra alteração prevista aumentar mais ligação a FcyRIIb da análise de anticorpos de ocorrência natural. Desta maneira, a fim de encontrar variantes que aumentem mais a ligação a FcyRIIb, alterações foram compreensivamente introduzidas na Fc alterada produzida substituindo Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp. IL6R-F11 (SEQ ID NO: 60) foi produzido introduzindo uma alteração de substituição de Met na posição 252 (numeração EU) com Tyr e uma alteração de substituição de Ans na posição 434 (numeração EU) com Tyr em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 54) que foi usado como a cadeia H de anticorpo. Ainda, IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142) foi preparado introduzindo uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) cm Asp em IL6R-F11. Plasmídeos de expressão contendo uma sequência de cadeia H de anticorpo foram preparados para cada uma das sequências de cadeia H de anticorpo produzidas substituindo a região próximo do resíduo na posição 238 (numeração EU) (posições 234 a 237 e 239) (numeração EU) em L6R-F652 cada um com 18 aminoácidos excluindo os aminoácidos originais e Cisteína. IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi utilizado como uma cadeia L de anticorpo. Essas variantes foram expressas e purificadas através do método do Exemplo de Referência 1. Essas variantes Fc são chamadas variantes PD. Interações de cada variante PD com FcyRIIa tipo R e FcyRIIb foram compreensivamente avaliadas através do método do Exemplo de Referência 2.

[001080] Uma figura que mostra os resultados de análise de interação com os respectivos FcyRs foi produzida de acordo com o método que segue. O valor obtido dividindo o valor para a quantidade de ligação de cada variante PD para cada FcyR pelo valor para a quantidade de ligação de FcyR do anticorpo pé-alterado que é usado como o controle (IL6R-F652/IL6R-L), que tem uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp e então multiplicação do resultado por 100, foi mostrado como o valor de atividade de ligação relativo de cada variante PD para cada FcyR. O eixo horizontal mostra valores relativos da atividade de ligação a FcyRIIb de cada variante PD e o eixo vertical mostra valores relativos dos valores de atividade de ligação a tipo R FcyRIIa de cada variante de PD (Figura 19).

[001081] Como resultado, foi constatado que a ligação a FcyRIIb de onze tipos de alterações foi aumentada comparado com o anticorpo antes da introdução de alterações, e eles têm efeitos de manutenção ou aumento de ligação a tipo R FcyRIIa. As atividades dessas onze variantes para ligação a R FcyRIIb e FcyRIIa são sumarizadas na Tabela 13. Na Tabela, os números de ID de sequência se referem àqueles de cadeias H das variantes e alterações se referem à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 60). Tabela 13

[001082] A Figura 20 mostra valores relativos para a atividade de ligação a FcyRIIb obtida introduzindo adicionalmente as onze alterações acima em uma variante carregando a alteração P238D e valores relativos para a atividade de ligação a FcyRIIb de uma variante obtida através da introdução das alterações em uma Fc que não contém a P238D. Essas onze alterações aumentaram a quantidade de ligação a FcyRIIb comparado com antes da introdução quanto elas foram introduzidas na variante P238D. Ao contrário, o efeito de diminuição da ligação a FcyRIIb foi observado para oito dessas alterações exceto G237F, G237W e S239D, quando elas foram introduzidas na variante que não contém P238D (dados não mostrados).

[001083] Esses resultados mostraram que, com base nos efeitos de introdução de alterações em uma IgG1 de ocorrência natural, é difícil prever os efeitos de combinação e introdução das mesmas alterações na variante contendo a alteração P238D. Em outras palavras, não seria possível descobrir essas oito alterações identificadas desta vez sem esta investigação que introduz as mesmas alterações que são combinadas e introduzidas na variante contendo a alteração P238D.

[001084] Os resultados de medição dos valores KD das variantes indicadas na Tabela 13 para FcyRIa, FcyRIIaR, FcyRIIaH, FcyRIIb e FcyRIIIaV através do método do Exemplo de Referência 2 são sumarizados na Tabela 14. Na Tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 60). O molde usado para produção de IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD (IIaR)/KD (IIb) e KD (IIaH)/KD (IIb) na Tabela mostram respectivamente o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcyRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb e o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcyRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) da variante se refere a um valor obtido dividindo o valor KD do polipeptídeo parental para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb.

[001085] Ainda, a Tabela 14 mostra valores KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de cada variante/valores KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R-F11 (SEQ ID NO: 60) como a cadeia H. Foi determinado que devido à ligação fraca de FcyR à IgG, foi impossível analisar com precisão através de análise cinética, e então as células preenchidas de cinza na Tabela 14 mostram valores calculados usando a Equação 2 do Exemplo de Referência 2.

[001086] Equação 2

[001087] A Tabela 14 mostra que todas as variantes aperfeiçoaram sua afinidade com FcyRIIb em comparação com IL6R-F11, e a faixa de aperfeiçoamento foi 1,9 vez a 5,0 vezes. A razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaR/valor KD de cada variante para FcyRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaH/valor KD de cada variante para FcyRIIb representam uma atividade de ligação a FcyRIIb com relação à atividade de ligação a FcyRIIaR e atividade de ligação a FcyRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcyRIIb, e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcyRIIb. Para o polipeptídeo parental IL6R-F11/IL6R-L, a razão de valor KD para FcyRIIaR/valor KD para FcyRIIb e a razão de valor KD para FcyRIIaH/valor KD para FcyRIIb são ambas 0,7, e desta maneira todas as variantes na Tabela 14 mostraram aperfeiçoamento de seletividade de ligação para FcyRIIb em comparação com o polipeptídeo parental. Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação de FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante/valor KD para a mais forte das atividades de ligação para FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou reduzida comparado com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental. Uma vez que este valor era 0,7 a 0,5 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH das variantes obtidas desta vez era quase a mesma ou menor em comparação com o polipeptídeo parental. Esses resultados mostraram que comparado com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram as atividades de ligação a FcyRIIa tipo R e tipo H e aumentaram a atividade de ligação a FcyRIIb e então têm seletividade aperfeiçoada para FcyRIIb. Ainda, comparado com IL6R-F11, todas as variantes tinham afinidade menor com FcyRIa e FcyRIIIaV.

[001088] [Exemplo 10] Análise de estrutura de cristal por raios X de um complexo formado entre uma Fc contendo P238D e uma região extracelular de FcyRIIb

[001089] Conforme indicado anteriormente no Exemplo 9, mesmo uma alteração que é prevista a partir da análise de anticorpos IgG1 de ocorrência natural melhorar atividade de ligação a FcyRIIb ou seletividade para FcyRIIb sendo introduzida em uma Fc contendo P238, a atividade de ligação a FcyRIIb foi verificada diminuir, e a razão para isso pode ser que a estrutura na interface de interação entre Fc e FcyRIIb é modificada devido à introdução de P238D. Desta maneira, para buscar a razão para este fenômeno, a estrutura tridimensional do complexo formado entre uma Fc de IgG1 contendo a mutação P238D (daqui em diante referida como Fc (P238D)) e a região extracelular de FcyRIIb foi elucidada por análise de estrutura de cristal de raios X e isso foi comparado com a estrutura tridimensional do complexo formado entre a Fc de uma IgG1 de ocorrência natural (daqui em diante referida como Fc (WT)) e a região extracelular de FcyRIIb, e os modos de ligação foram comparados. Múltiplos relatos foram feitos sobre a estrutura tridimensional de um complexo formato entre uma Fc e uma região extracelular de FcyR; e as estruturas tridimensionais do complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIIb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276, 16469-16466, o complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674) e o complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIa (J. Immunol. (2011) 187, 3208-3217) foram analisadas. Embora a estrutura tridimensional do complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIb não tenha sido analisada, a estrutura tridimensional de um complexo formado com Fc (WT) é conhecida para FcyRIIa e FcyRIIb, e suas regiões extracelulares são 93% compatíveis em sequência de aminoácido e têm homologia muito alta. Desta maneira, a estrutura tridimensional do complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIb foi prevista através de modelagem usando a estrutura de cristal do complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIa.

[001090] A estrutura tridimensional do complexo Fc (P238)/região extracelular de FcyRIIb foi determinada através de análise de estrutura de cristal de raios X em resolução de 2,6 Â. A estrutura obtida como um resultado desta análise é mostrada na Figura 21. A região extracelular de FcyRIb é ligada entre dois domínios de CH2 de Fc e isso era similar às estruturas tridimensionais de complexos formados entre Fc (WT) e a respectiva região extracelular de FcyRIIIa, FcyRIIIb ou FcyRIIa analisada até agora. Em seguida, para comparação detalhada, a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc (WT)/região extracelular FcyRIIb foram superpostas pelo ajuste dos quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα com relação à região extracelular de FcyRIIb e o domínio A de CH2 de Fc (Figura 22). Neste caso, o grau de sobreposição entre os domínios B de CH2 de Fc não foi satisfatório, e diferenças conformacionais foram encontradas nesta porção. Ainda, usando a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIb, pares de átomos que têm uma distância de 3,7 Â ou menos entre a região extracelular de FcyRIIb e domínio B de CH2 de Fc foram extraídos e comparados a fim de comparar a interação interatômica entre FcyRIIb e domínio B de CH2 de Fc (WT) com a interação interatômica entre FcyRIIb e (P238D) de Fc. Conforme mostrado na Tabela 15, as interações interatômicas entre domínio B de CH2 de Fc e FcyRIIb em Fc (P238D) e Fc (WT) não eram compatíveis.

[001091] Ainda, as estruturas detalhadas em torno de P238D foram comparadas através de superposição de estrutura de cristal de raios X do complexo Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb na estrutura modelo do complexo Fc (WT)/região extracelular FcyRIIb usando o método dos quadrados mínimos com base na distância atômica entre de Cα entre os domínios A e B de CH2 de Fc sozinhos. Como a posição do resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU), isto é, uma posição de mutagênese de Fc (P238D), é alterada de Fc (WT), a estrutura de alça em torno do resíduo de aminoácido na posição 238 seguindo a região de dobra é verificada ser diferente entre Fc (P238D) e Fc (WT) (Figura 33). Pro na posição 238 (numeração EU) está originalmente localizado dentro de Fc (WT), formando um núcleo hidrofóbico com resíduos em torno da posição 238. No entanto, se Pro na posição 238 (numeração EU) é alterado para altamente hidrofílico e Asp carregado, a presença do resíduo Asp alterado no núcleo hidrofóbico é energeticamente desvantajosa em termos de dessolvação. Desta maneira, em Fc (P238D), para cancelar esta situação energeticamente desvantajosa, o resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU) muda sua orientação para facear a região do solvente, e isso pode ter causado esta mudança em estrutura da alça próximo do resíduo de aminoácido na posição 238. Ainda, uma vez que esta alça não está distante da região de dobra reticulada por uma ligação S-S, sua mudança estrutural não será limitada a uma mudança local, e afetará o posicionamento relativo do domínio A e do domínio B de FcCH2. Como resultado, as interações interatômicas entre FcyRIIb e domínio B de CH2 de Fc foram presumidas como tendo sido alteradas. Desta maneira, efeitos previstos não puderam ser observados quando alterações que melhoram seletividade e atividade de ligação com relação a FcyRIIb em uma IgG de ocorrência natural foram combinadas com uma Fc contendo a alteração P238D.

[001092] Ainda, como um resultado de mudanças estruturais devido à introdução de P238D em domínio A de CH2 de Fc, uma ligação hidrogênio foi encontrada entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (numeração EU), que está adjacente a P238D mutada, e Tyr na posição 160 em FcyRIIb (Figura 24). O resíduo em FcyRIIa que corresponde a este Tyr 160 é Phe; e quando a ligação é com FcyRIIa, esta ligação hidrogênio não é formada. Considerando que o aminoácido na posição 160 é uma das poucas diferenças entre FcyRIIa e FcyRIIb na interface de interação com Fc, a presença desta ligação hidrogênio que é específica para FcyRIIb é presumida ter levado a aperfeiçoamento de atividade de ligação a FcyRIIb e diminuição de atividade e ligação a FcyRIIa em Fc (P238D) e aperfeiçoamento de sua seletividade. Ainda, em domínio B de CH2 de Fc, uma interação eletrostática é observada entre Asp na posição 270 (numeração EU) e Arg na posição 131 em FcyRIIb (Figura 25). Em FcyRIIa tipo H, que é um dos alótipos de FcyRIIa, o resíduo correspondendo a Aar na posição 131 de FcyRIIb é His, e então não pode formar esta interação eletrostática. Isso pode explicar o porquê da atividade de ligação a Fc (P238D) ser diminuída em FcyRIIa tipo H comparado com FcyRIIa tipo R. Observações baseadas em tais resultados de análise de estrutura de cristal de raios X mostraram que a mudança da estrutura de alça próximo de P238D devido à introdução de P238D e a mudança acompanhante no posicionamento de domínio relativo causa formação de novas interações que não são encontradas na ligação de IgG e FcyR de ocorrência natural e isso poderia levar a um perfil de ligação seletivo de variantes P238D para FcyRIIb.

[001093] Expressão e purificação de Fc (P238D)

[001094] Uma Fc contendo a alteração P238D foi preparada como segue. Primeiro, Cys na posição 220 (numeração EU) de hIL6R-IgG1- v1 (SEQ ID NO: 62) foi substituído com Ser. Então, sequência genética de Fc (P238D) de Glu na posição 236 (numeração EU) a seu terminal C foi clonado por PCR. Usando esta sequência genética clonada, produção de vetores de expressão e expressão e purificação de Fc (P238D) foram realizadas de acordo com o método dos Exemplo de Referência 1. Cys na posição 220 (numeração EU) forma uma ligação dissulfeto com Cys da cadeia L em IgG1 geral. A cadeia L não é coexpressa quando Fc sozinha é preparada, e, então, o resíduo cisteína foi substituído com Ser para evitar formação de ligações dissulfeto desnecessárias.

[001095] Expressão e purificação da região extracelular de FcyRIIb

[001096] A região extracelular de FcyRIIb foi preparada de acordo com o método do Exemplo de Referência 2.

[001097] Purificação do complexo Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIb

[001098] A 2 mg da amostra de região extracelular de FcyRIIb obtida para uso em cristalização, 0,29 mg de Endo F1 (Protein Science (1996) 5: 2617-2622) expressa e purificada a partir de Escherichia coli como uma proteína de fusão glutationa S-transferase foi adicionado. Isso foi deixado permanecer em temperatura ambiente por três dias em um tampão de Bis-Tris 0,1M em pH 6,5 e as cadeias de açúcar N-ligadas foram clivadas, exceto N-acetilglicosamina diretamente ligada a Asn da região extracelular FcyRIIb. Em seguida, a amostra de região extracelular de FcyRIIb submetida a tratamento de clivagem da cadeia de açúcar, que foi concentrada através de ultrafiltragem com 5000 MWCO, foi purificada através de cromatografia de filtragem em gel (Superdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPES 20 mM em pH 7,5 contendo NaCl 0,05M. Ainda, à fração de região extracelular de FcyRIIb clivada com carboidrato, Fc (P238D) foi adicionada de maneira que a razão molar da região extracelular de FcyRIIb estaria presente em ligeiro excesso. A mistura concentrada através de ultrafiltragem com 10.000 MWCO foi purificada através de cromatografia de filtragem em gel (Superdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPES 20 mM em pH 7,5 contendo NaCl 0,05M. Desta maneira, uma amostra do complexo Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb foi obtida.

[001099] Cristalização do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb

[001100] Usando a amostra do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb que foi concentrado para aproximadamente 10 mg/mL através de ultrafiltragem com 10.000 MWCO, cristalização do complexo foi realizada através do método de difusão de vapor de gota assentada (sitting drop). Hydra II Plus One (MATRIX) foi usado para cristalização; e para uma solução de reservatório contendo Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 17%, acetato de amônio 0,2% e D-Galactose 2,7% (p/v), uma gota de cristalização foi produzida misturando em uma razão de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,2 μl : 0,2 μl. A gota de cristalização após vedação foi deixada permanecer a 20° C e então cristais tipo placa fina foram obtidos.

[001101] Medição de dados de difração de raios X de um cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb

[001102] Um dos cristais simples obtidos do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb foi embebido em uma solução de Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 20%, acetato de amônio, D- Galactose 2,7% (p/v), etileno glicol 22,5% (v/v). O cristal simples foi pescado da solução usando um pino com alça de náilon fina presa e congelado em nitrogênio líquido. Então, os dados de difração de raio-X do cristal foram medidos em instalação de radiação sincrotron Photon Factory BL-1A em High Energy Accelerator Research Organization. Durante a medição, o cristal foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter em um estado congelado, e um total de 225 imagens de difração de raios X foi coletado usando Quantum 270 CCD detector (ADSC) preso a uma linha de feixe com rotação do cristal 0,8° de cada vez. Determinação de parâmetros celulares, indexação de pontos de difração e processamento de dados de difração a partir das imagens de difração obtidas foram realizados usando o programa Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite); e, finalmente, dados de intensidade de difração do cristal até resolução de 2,46 Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial P21 e tem os parâmetros celulares que seguem: a = 48,85 Â, b = 76,01 Â, c = 115,09 Â, α = 90°, β = 100,70°, y = 90°.

[001103] Análise da estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb

[001104] A estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb foi determinada através do método de substituição molecular usando o programa Phaser (CCP5 Software Suite). A partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc (P238D)/região extracelular FcyRIIb, o número de complexos em unidade assimétrica foi previsto ser um. A partir das coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ que é a estrutura de cristal do complexo de Fc (WT)/região extracelular FcyRIIb, as porções de resíduo de aminoácido das posições 239-340 da cadeia A e posições 239-340 da cadeia B foram consideradas como coordenadas separadas e elas foram ajustadas respectivamente como modelos para pesquisa dos domínios CH de Fc. As porções de resíduo de aminoácido das posições 341-444 da cadeia A e das posições 341-443 da cadeia B foram consideradas como um conjunto único de coordenadas das mesmas coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ; e isso foi ajustado como um modelo para pesquisa dos domínios CH3 de Fc. Finalmente, a partir das coordenadas estruturais de código PDB: 2FCB que é uma estrutura de cristal da região extracelular de FcyRIIb, as porções de resíduo de aminoácido das posições 6-178 da cadeia A foram consideradas e ajustadas como um modelo para pesquisa da região extracelular de FcyRIIb. A orientação e a posição de cada modelo de pesquisa no látice de cristal foram determinadas na ordem do domínio CH3 de Fc, região extracelular de FcyRIIb, e domínio CH2 de Fc, com base na função de rotação e função de translação para obter o modelo inicial para a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIb. Quando refinamento de corpo rígido que move os dois domínios CH2 de Fc, os dois domínios CH3 de Fc e a região extracelular de FcyRIIb foi realizado no modelo inicial obtido, o fator de confiabilidade cristalográfica, valor R se tornou 40,4%, e o valor R Livre se tornou 41,9% para dados de intensidade de difração de 25 Â a 3,0 Â neste ponto. Ainda, refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) e revisão do modelo para observar os mapas de densidade de elétron cujo coeficiente tem 2Fo-Fc ou Fo-Fc, que são calculados com base no fator Fo estrutural experimentalmente determinado, no fator Fc estrutural calculado e na fase calculada usando o modelo, foi realizado através do programa Coot (Paul Emsley). Refinamento de modelo foi realizado através de repetição dessas etapas. Finalmente, como um resultado de incorporação de moléculas de água no modelo baseado em mapas de densidade de elétron que usam 2Fo-Fc ou Fo-Fc como o coeficiente, e seguindo refinamento, o fator de confiabilidade cristalográfica, valores R e o valor R Livre do modelo contendo 4846 átomos de não hidrogênio se tornaram 23,7% e 27,6% para 24291 dados de intensidade de difração de resolução de 25 Â a 2,6 Â, respectivamente.

[001105] Produção de uma estrutura modelo do complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIb

[001106] Com base nas coordenadas estruturais de código PDB: 3RY6 que é uma estrutura de cristal do complexo Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIa, a função Build Mutants do Discovery Studio 3.1 program (Accelrys) foi usado para introduzir mutações para serem compatíveis com a sequência de aminoácido de FcyRIIb em FcyRIIa nessas coordenadas estruturais. Neste caso, o Nível de Otimização foi ajustado para Alto, o Raio de Corte foi ajustado para 4,5, cinco modelos foram gerados e o um com o melhor score de energia de todos eles foi determinado como a estrutura modelo para o complexo Fc (WT)/FcyRIIb.

[001107] [Exemplo 11] Análise de ligação a FcyRIIb de variantes Fc cujos sítios de alteração foram determinados com base em estruturas de cristal

[001108] Com base nos resultados de análise de estrutura de cristal de raios X no complexo formado entre Fc (P238D) e a região extracelular de FcyRIIb obtido no Exemplo 10, variantes foram construídas introduzindo compreensivamente alterações em sítios na Fc alterada tendo substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp que foram previstas afetar interação com FcyRIIb (resíduos de posições 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 e 334 (numeração EU) e se combinações de alterações que aumentam mais a ligação de FcyRIIb em adição à alteração P238D podem ser obtidas foi examinado.

[001109] IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63) foi produzido introduzindo em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 54) a alteração produzida substituindo Lys na posição 439 (numeração EU) com Glu. Em seguida, IL6R-BF648 foi produzido através da introdução em IL6R-B3 da alteração produzida pela substituição de Pro na posição 238 (Numeração EU) com Asp. IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi utilizado como a cadeia de anticorpo comum. Essas variantes de anticorpo expressas foram purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. A ligação dessas variantes de anticorpo a cada um dos FcyRs (FcyRIa, FcyRIIa tipo H, FcyRIIa tipo R, FcyRIIb e FcyRIIIa tipo V) foi compreensivamente avaliada através do método do Exemplo de Referência 2.

[001110] Uma figura foi produzida de acordo com o método que segue para mostrar os resultados de análise de interações com os respectivos FcyRs. O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcyRIIb foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L, alteração através da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp) a cada FcyR, e o obtido foi então multiplicado por 100 e mostrado como o valor de atividade de ligação relativo de cada variante a cada FcyR. O eixo horizontal mostra o valor de atividade de ligação relativo de cada variante a FcyRIIb e o eixo vertical mostra o valor de atividade de ligação relativo de cada variante a FcyRIIa tipo R (Figura 26).

[001111] Conforme mostrado na Figura 26, os resultados mostram que de todas as alterações, 24 tipos de alterações foram verificados manter ou aumentar ligação a FcyRIIb em comparação com o anticorpo pré-alterado. A ligação dessas variantes a cada um dos FcyRs é mostrada na Tabela 16. Na Tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L é indicado com um asterisco (*). Tabela 16

[001112] Os resultados de medição de valores de KD das variantes mostradas na Tabela 16 para FcyRIa, FcyRIIaR, FcyRIIaH, FcyRIIb e FcyRIIIa tipos V através do método do Exemplo de Referência 2 são sumarizados na Tabela 17. Na Tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD (IIaR)/KD (IIb) e KD (IIaH)/KD (IIb) na Tabela respectivamente representam o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcyRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb e o valor obtido dividindo o valor KF de cada variante para FcyRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) do polipeptídeo alterado se refere ao valor obtido dividindo o valor KD do polipeptídeo parental para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Ainda, o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de cada variante/valor KD para a mais forte das atividades de FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental são mostrados na Tabela 17. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63) como a cadeia H. Foi determinado que devido à ligação fraca de FcyR a IgG1, foi impossível analisar com precisão através de análise cinética, e então as células preenchidas de cinza na Tabela 17 mostram valores calculados usando a Equação 2 do Exemplo de Referência 2. Equação 2

[001113] A Tabela 17 mostra que em comparação com IL6R-B3, todas as variantes mostraram aperfeiçoamento de afinidade com FcyRIIb, e a faixa de aperfeiçoamento foi 2,1 vezes a 9,7 vezes. A razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaR/valor KD de cada variante para FcyRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaH/valor KD de cada variante para FcyRIIb representa uma atividade de ligação a FcyRIIb relativa à atividade de ligação a FcyRIIaR e atividade de ligação a FcyRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcyRIIb e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcyRIIb. Uma vez que a razão de valor KD para FcyRIIaR/valor KD para FcyRIIb e a razão de valor KD para FcyRIIaH/valor KD para FcyRIIb no polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L foram 0,3 e 0,2, respectivamente, todas as variantes na Tabela 17 mostraram aperfeiçoamento de seletividade de ligação a FcyRIIb em comparação com o polipeptídeo parental. Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante/valor KD para a mais fortes das atividade de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou menor comparado com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental. Uma vez que esse valor era 4,6 a 34,0 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que em comparação com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez tinham ligação reduzida pela mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH. Esses resultados mostraram que comparado com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram atividades de ligação a FcyRIIa tipo R e tipo H, aumentaram a atividade de ligação a FcyRIIb e melhoraram a seletividade para FcyRIIb. Ainda, comparado com IL6R-B3, todas as variantes tiveram afinidade menor com FcyRIa e FcyRIIIaV.

[001114] Com relação às variantes promissoras dentre as variantes de combinação obtidas, os fatores que levam a esses efeitos foram investigados usando a estrutura de cristal. A Figura 27 mostra a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIb. Nesta figura, a cadeia H posicionada no lado esquerdo é a Cadeia A de Fc e a cadeia H posicionada no lado direito é a Cadeia B de Fc. Aqui, pode ser visto que o sítio na posição 233 (numeração EU) na Cadeia A de Fc está localizada próximo de Lys na posição 113 de FcyRIIb. No entanto, nesta estrutura de cristal, a cadeia lateral E233 está em uma condição de mobilidade consideravelmente alta e sua densidade de elétron não é bem observada. Desta maneira, a alteração produzida pela substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) com Asp leva à diminuição no grau de liberdade da cadeia lateral uma vez eu a cadeia lateral se torna um carbono mais curto. Como resultado, a perda de entropia quando formando uma interação com Lys na posição 113 de FcyRIIb pode ser diminuída e, consequentemente, isso é especulado contribuir para aperfeiçoamento de ligação livre de energia.

[001115] Similarmente, a Figura 28 mostra o ambiente circundante próximo do sítio na posição 330 (numeração EU) na estrutura do complexo de Fc (P238D)/FcyRIIb. Esta figura mostra que o ambiente circundante do sítio na posição 330 (numeração EU) da Cadeia A de Fc de Fc (P238D) é um ambiente hidrofílico composto de Ser na posição 85, Glu na posição 86, Lys na posição 163 e similar de FcyRIIb. Desta maneira, a alteração produzida pela substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Lys ou Arg é especulada contribuir para o fortalecimento da interação com Ser na posição 85 ou Glu na posição 86 em FcyRIIb.

[001116] A Figura 29 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (numeração EU) da Cadeia B de Fc após superposição das estruturas de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIb e o complexo de Fc (WT)/FcyRIIIa pelo ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα com relação à Cadeia B de Fc. Essas duas estruturas são bastante compatíveis, mas têm estruturas tridimensionais diferentes de Pro na posição 271 (numeração EU). Quando a densidade de elétron fraca em torno desta área na estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D)/região extracelular de FcyRIIIb é também levada em consideração, é sugerido que há possibilidade que Pro na posição 271 (numeração EU) em Fc (P238D)/FcyRIIb cause um grande estiramento na estrutura, desta maneira perturbando a estrutura da alça na obtenção de uma estrutura ótima. Desta maneira, a alteração produzida substituindo Pro na posição 271 (numeração EU) com Gly dá flexibilidade a esta estrutura de alça, e é especulada contribuir para aumento de ligação através de redução da barreira energética quando permitindo que uma estrutura ótima se forme durante interação com FcyRIIb.

[001117] [Exemplo 12] Exame do efeito combinatorial de alterações que aumentam a ligação a FcyRIIb quando combinadas com P238D

[001118] Das alterações obtidas nos Exemplos 9 e 11, aquelas que aumentaram a ligação a FcyRIIb ou mantiveram a ligação a FcyRIIb e mostraram efeitos de supressão da ligação a outros FcyRs foram combinadas umas com as outras, e seu efeito foi examinado.

[001119] Alterações particularmente boas selecionadas das Tabelas 13 e 17 foram introduzidas na cadeia H de anticorpo IL6R-BF648 de uma maneira similar ao método do Exemplo 11. IL6R-L foi utilizado como a cadeia L de anticorpo, os anticorpos expressos foram purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. A ligação a cada um dos FcyRs (FcyRIa, FcyRIIa tipo H, FcyRIIa tipo R, FcyRIIb e FcyRIIIa tipo V) foi compreensivamente avaliada através do método do Exemplo de Referência 2.

[001120] De acordo com o método que segue, atividades de ligação relativas foram calculadas para os resultados de análise de interações com os respectivos FcyRs. O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcyR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp para cada FcyR, e multiplicado por 100; e então o valor foi mostrado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante para cada FcyR (Tabela 18). Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R- G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*).

[001121] A Tabela 18-2 é uma tabela continuação da Tabela 18-1.

[001122] Os resultados de medição dos valores KD das variantes mostradas na Tabela 18 para FcyRIa, FcyRIIaR, FcyRIIaH, FcyRIIb e FcyRIIIa tipos V através do Método do Exemplo de Referência 2 são sumarizados nas Tabelas 19-1 e 19-2. Na tabela, alteração refere-se à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD (IIaR)/KD (IIb) e KD (IIaH)/KD (IIb) na tabela respectivamente representam o valor obtido dividindo o valor KD da variante para FcyRIIaR pelo valor KD da variante para FcyRIIb e o valor obtido através da divisão do valor KD da variante para FcyRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) do polipeptídeo alterado se refere ao valor obtido pela divisão do valor KD do polipeptídeo parental para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Ainda, o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de cada variante/valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental são mostrados nas Tabelas 19-1 e 19-2. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63) como a cadeia H. Foi determinado que devido à ligação fraca de FcyR à IgG, foi impossível analisar precisamente através de análise cinética, e então os valores de células preenchidas de cinza nas Tabelas 20-1 e 20-2 mostram valores calculados usando a Equação 2 do Exemplo de Referência 2. Equação 2

[001123] As Tabelas 19-1 e 19-2 mostram que em comparação com IL6R-B3, todas as variantes mostraram aperfeiçoamento de afinidade com FcyR e a faixa de aperfeiçoamento foi 3,0 vezes a 99,0 vezes. A razão de valor KD de cada variante para FcyRRIIaR/valor KD de cada variante para FcyRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaH/valor KD de cada variante para FcyRIIb representa uma atividade de ligação a FcyRIIb relativa à atividade de ligação a FcyRIIaR e atividade de ligação a FcyRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcyRIIb e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcyRIIb. Uma vez que a razão de valor KD para FcyRIIaR/valor KD para FcyRIb e a razão de valor KD para FcyRIIaH/valor KD para FcyRIIb do polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L foram 0,3 e 0,2, respectivamente, todas as variantes nas Tabelas 19-1 e 19-2 mostram aperfeiçoamento de seletividade de ligação para FcyRIIb em comparação com o polipeptídeo parental. Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante/valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou menor comparado com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental. Uma vez que esse valor foi 0,7 a 29,9 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH das variantes obtidas desta vez era quase equivalente ou menor comparado com aquela do polipeptídeo parental. Esses resultados mostraram que comparado com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram as atividades de ligação a FcyRIIa tipo R e tipo H, aumentaram a atividade de ligação a FcyRIIb e melhoraram a seletividade para FcyRIIb. Ainda, comparado com IL6R-B3, todas as variantes tinham afinidade menor com FcyRIa e FcyRIIIaV.

[001124] A Tabela 19-2 é uma tabela continuação da Tabela 19-1. Tabela 19-2

[001125] [Exemplo 13] Preparação de variantes com ligação a FcyRIIb aumentada

[001126] Conforme mostrado no Exemplo 8, quando aumentando a ligação a FcyRIIb, é preferível que a ligação a FcyRIIb seja aumentada enquanto suprimindo ao máximo a ligação a outros FcyRs de ativação. Desta maneira, os presentes inventores adicionalmente produziram variantes com ligação a FcyRIIb aumentada ou seletividade aperfeiçoada para FcyRIIb através da combinação de alterações que aumentam a ligação a FcyRIIb ou melhoram a seletividade para FcyRIIb. Especificamente, as alterações descritas nos Exemplos 9, 11 e 12 que foram verificadas ser eficazes quando combinadas com a alteração P238D foram combinadas umas com as outras, com base na alteração P238D que mostrou o efeito excelente de aumento da ligação a FcyRIIb e melhorou a seletividade para FcyRIIb.

[001127] Variantes foram produzidas combinando as regiões Fc de IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133) e IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63) com alterações E233D, L234Y, G237D, S267Q, H268D, P271G, Y296D, K326D, K326A, A330R e A330K descritas nos Exemplos 9, 11 e 12 que foram verificadas ser eficazes quando combinadas com a alteração P238D. Usando IL6R-L (SEQ ID NO: 56) como a cadeia L de anticorpo, anticorpos compreendendo as variantes descritas acima na cadeia pesada foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. As variantes resultantes foram respectivamente avaliadas quanto à ligação a cada um de FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2.

[001128] O KD de cada variante para cada FcyR é mostrado na Tabela 20. "Alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). IL6R-IL6R-L que é usado como o molde para produzir cada variante é indicado pelo asterisco (*). "KD (IIaR)/KD (IIb)" na tabela mostra o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcyRIIaR pela KD de cada variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, maior a seletividade para FcyRIIb. "KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado" mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R- B3/IL6R-L para FcyRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcyRIIaR. Na Tabela 21, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

[001129] descrita no Exemplo de Referência 2

[001130] Quando considerando a ligação a cada um de FcyR por IL6R-B3/IL6R-L resultante da introdução da alteração de K439E em IL6R-G1d/IL6R-L contendo a sequência de IgG1 humana nativa como 1, a ligação de IL6R-G1d/IL6R-L a FcyRIa como 1,3 vez; a ligação de IL6R-G1ds/IL6R-L a FcyRIIaR foi 1,1 vez; a ligação de IL6R-G1d/IL6R- G1d/IL6R-L a FcyRIIaH foi 1,1 vez, a ligação de IL6R-G1d/IL6R-L para ligação de FcyRIIb foi 1,2 vez e a ligação de IL6R-G1d/IL6R-L a FcyRIIIaV foi 0,9 vez. Desta maneira, para qualquer dado tipo de FcyR, a ligação de I6R-B3/IL6R-L a FcyR era comparável à ligação de IL6R- G1d/IL6R-L a FcyR. Desta maneira, a comparação da ligação de cada variante a cada FcyR com aquela de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração é suposta ser equivalente à comparação da ligação de cada variante a cada FcyR com a ligação a cada FcyR por IL6R-G1d/IL6R-L contendo a sequência de IgG1 humana nativa. Por esta razão, nos subsequentes Exemplos abaixo, a atividade de ligação de cada variante a cada FcyR será comparada com aquela para cada FcyR por IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração. A Tabela 20 mostra que todas as variantes têm atividade de ligação a FcyRIIb aumentada comparado com IL6R-B3 antes da introdução da alteração. A atividade de ligação de IL6R-BF648/IL6R-L, que era a mais baixa, foi aumentada em 2,6 vezes, enquanto a atividade de ligação de IL6R- BP230/IL6R-L, que é a mais alta, foi aumentada em 147,6 vezes. Com relação ao valor de KD (IIaR)/KD (IIb) que representa a seletividade, o valor para IL6R-BP234/IL6R-L, que era o mais baixo, foi 10,0, enquanto o valor para IL6R-BP23/IL6-L, que era o mais alto, era 32,2. Comparado com 0,3 para IL6R-B3/IL6-L antes da introdução da alteração, esses valores implicam que todas as variantes têm seletividade aperfeiçoada. Todas as variantes mostraram atividade de ligação menor a FcyRIa, FcyRIIaH e FcyRIIIaV do que aquela de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração.

[001131] [Exemplo 14] Análise de estrutura de cristal de raios X dos complexos de região extracelular de FcyRIIb ou região extracelular de FcyRIIaR e região Fc com ligação a FcyRIIb aumentada

[001132] Conforme mostrado no Exemplo 13, a ligação a FcyRIIb de variante IL6R-BP230/IL6R-L, cuja ligação a FcyRIIb foi a mais aumentada, foi aumentada para cerca de 150 vezes comparado com IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração, enquanto o aumento de sua ligação a FcyRIIaR foi suprimida para um grau de cerca de 1,9 vez. Desta maneira, IL6R-BP230/IL6R-L é uma variante excelente em ambas ligação e seletividade a FcyRIIb. No entanto, os presentes inventores viram uma possibilidade de criar variantes mais preferidas com ligação a FcyRIIb maior enquanto suprimindo a ligação a FcyRIIaR possível.

[001133] Conforme mostrado na Figura 25 descrita no Exemplo 10, na região Fc com alteração P238D, Asp na posição 270 (numeração EU) em seu domínio B de CH2 forma uma interação eletrostática estreita com Arg na posição 131 em FcyRIIb. Este resíduo de aminoácido na posição 131 é His em FcyRIIIa e FcyRIIaH, enquanto ele é Arg em FcyRIIaR tal como em FcyRIIb. Desta maneira, não há nenhuma diferença entre FcyRIIaR e FcyRIIb em termos da interação do resíduo de aminoácido na posição 131 com Asp na posição 270 (numeração EU) no domínio B de CH2. Isso é suposto ser um fator principal para a seletividade pobre entre a ligação a FcyRIIb e FcyRIIaR da região Fc.

[001134] Por outro lado, as regiões extracelulares de FcyRIIa e FcyRIIb são 93% idênticas em sequência de aminoácido, e então elas têm homologia muito alta. Com base na análise de estrutura de cristal do complexo da região Fc de IgG1 nativa (daqui em diante abreviada como Fs (WT)) e da região extracelular de FcyRIIaR (J. Immunol. (2011) 187, 3208-3217), uma diferença encontrada em torno da interface entre as duas interagindo uma com a outra foi apenas três aminoácidos (Gln127, Leu132, Phe160) entre FcyRIIaR e FcyRIIb. Desta maneira, os presentes inventores previram que era extremamente difícil melhorar a seletividade da região Fc entre a ligação a FcyRIIb e ligação a FcyRIIaR.

[001135] Neste contexto, os presentes inventores conceberam que, a fim de aumentar mais a atividade de ligação a FcyRIIb da região Fc e melhorar a seletividade das regiões Fc entre a ligação a FcyRIIb e ligação a FcyRIIaR, era importante esclarecer diferenças sutis entre a interação região Fc-FcyRIIb e a interação região Fc- FcyRIIaR através da análise não apenas da estrutura tridimensional do complexo da região Fc com ligação a FcyRIIb aumentada e a região extracelular de FcyRIIb, mas também a estrutura tridimensional do complexo da região Fc com ligação a FcyRIIb aumentada e a região extracelular de FcyRIIaR. Primeiro, os presentes inventores, analisaram a estrutura de cristal de raios X do complexo da região extracelular de FcyRIIb ou FcyRIIaR e Fc (P208) resultante da eliminação da alteração K439E da região Fc de IL6R-BP208/IL6R-L criada conforme descrito no Exemplo 12, que foi a variante usada como a base na produção de IL6R- BP230/IL6R-L.

[001136] (14-1) Análise de estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208) e a região extracelular de FcyRIIb

[001137] Expressão e purificação de Fc (P208)

[001138] Fc (P208) foi preparada conforme descrito abaixo. Primeiro, IL6R-P208 foi produzido substituindo Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) em IL6R-BP208, como é o caso da sequência de IgG1 humana nativa. Então, a sequência de gene de Fc (P208), que foi clonada por PCR a partir de Glu na posição 216 (numeração EU) para o terminal C usando como um molde um DNA codificando uma variante com uma substituição de Cys por Ser na posição 220 (numeração EU), foi clonada. Construção, expressão e purificação de vetor de expressão foram obtidas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Entretanto, Cys na posição 220 (numeração EU) em IgG1 comum forma uma ligação dissulfeto com um Cys na cadeia L. Quando preparando a região Fc sozinha, a cadeia L não é coexpressa. Desta maneira, Cys na posição 220 foi substituída por Ser para evitar formação de ligação dissulfeto desnecessária.

[001139] Expressão e purificação da região extracelular de FcyRIIb

[001140] A região extracelular de FcyRIIb foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2.

[001141] Purificação do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb

[001142] 0,15 mg do produto purificado de Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) expresso em E. coli como uma proteína de fusão com glutationa S-transferase foi adicionado 1,5 mg de uma amostra de cristalização da região extracelular de FcyRIIb. Esta amostra adicionada em tampão de Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5) foi deixada descansar em temperatura ambiente por três dias para clivar cadeias de açúcar tipo N exceto N-acetilglicosamina diretamente ligada ao Asn na amostra da região extracelular de FcyRIIb. Então, a amostra da região extracelular de FcyRIIb submetida a tratamento de clivagem de cadeia de açúcar foi concentrada com um filtro de ultrafiltragem 5000MWCO e purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem em gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 20 mM (pH 7,5)/NaCl 0,1 M. Além disso, ao Fcy purificado com suas cadeias de açúcar clivadas , Fc (P208) foi adicionado de modo que a proporção molar de região extracelular de FcyRIIb estivesse presente em ligeiro excesso. A mistura foi concentrada por meio de ultrafiltragem com 10000 MWCO, a fração purificada da região extracelular de FcyRIIb submetida à clivagem de cadeia de açúcar foi purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem em gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 25 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M. A fração purificada preparada conforme descrito acima foi usada como uma amostra de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb na avaliação subsequente .

[001143] Cristalização do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb

[001144] Uma amostra de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb concentrada para cerca de 10 mg/ml com um filtro de ultrafiltragem de 10000MWCO foi cristalizada usando o método de difusão de vapor de gota pendente em combinação com o método de semeadura. Placa VDXm (Hampton Research) foi usada para cristalização. Usando uma solução de reservatório de Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5), 19% (p/v) PEG3350/fosfato de potássio dibásico 0,2 M, gotas de cristalização foram preparadas em uma razão de mistura de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,85 μl : 0,85 μl. Cristais do complexo obtido sob a mesma condição foram triturados com Seed Bead (Hampton Research) para preparar uma solução de cristal de semente. As gotas de cristalização foram adicionadas com 0,15 μl de uma solução diluída preparada a partir da solução de semente e deixada descansar a 20°C em cavidades de reservatório vedadas. Isso forneceu cristais tipo placa.

[001145] Medições de dados de difração de raios X de um cristal de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb

[001146] Um cristal simples de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb preparado conforme descrito acima foi embebido em uma solução de Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5)/24% (p/v) PEG3350/fosfato d e potássio dibásico 0,2M/etileno glicol 20% (v/v). Então, o cristal simples foi pescado da solução usando um pino com uma alça de náilon fino presa e congelado em nitrogênio líquido. Dados de difração de raios X do cristal simples foram coletados com Spring-8 BL32XU. Durante a medição, o cristal foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter em um estado congelado. Um total de 300 imagens de difração de raios X do cristal simples foi coletado usando detector CCD MX-225HE (RAYONIX) preso a uma linha de feixe com giro do cristal simples 0,6° de cada vez. Com base nas imagens de difração obtidas, determinação da constante do látice, indexação de ponto de difração e processamento de dados de difração foram realizados usando programas Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186190), XDS Package (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) e Scala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Finalmente, os dados de intensidade de difração do cristal simples até resolução de 2,81 Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial C2221 com a constante de látice a = 156,69Â, b = 260,17 Â, c = 56,85 Â, α = 90°, β = 90° e y = 90°.

[001147] Análise de estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb

[001148] A estrutura do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb foi determinada através do método de substituição molecular usando o programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). O número de complexos em uma unidade assimétrica foi estimado ser um a partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb. As porções de resíduos de aminoácidos das posições 239-340 da cadeia A e das posições 239-340 da cadeia B, que foram tiradas como uma coordenada distinta a partir da coordenada estrutural de código PDB: 3SGJ para a estrutura de cristal de complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIb, foram usados, respectivamente, como modelos para pesquisa do domínio CH2 da região Fc. Da mesma maneira, porções de resíduos de aminoácido nas posições 341-444 da cadeia A e nas posições 341443 da cadeia B, que foram recuperadas como uma coordenada única a partir da coordenada estrutura de código PDB: 3GSJ, foram usados como um modelo para pesquisa do domínio CH3 da região Fc. Finalmente, porções de resíduos de aminoácido nas posições 6-178 da cadeia A, que foram tiradas da coordenada estrutural de código PDB: 2CFB para a estrutura de cristal da região extracelular de FcyRIIb, foi usado como um modelo para pesquisa Fc (P208). Os presentes inventores tentaram determinar as orientações e posições dos respectivos modelos de pesquisa do domínio CH3 da região Fc, da região extracelular de FcyRIIb e do domínio CH2 da região Fc nos látices de cristal com base na função de rotação e na função de translação, mas falharam em determinar a posição de um dos domínios CH2. Então, com referência à estrutura de cristal do complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIb, a posição do último domínio A de CH2 foi determinada a partir de um mapa de densidade de elétrons que foi calculado com base na fase determinada para as três partes restantes. Desta maneira, os presentes inventores obtiveram um modelo inicial para a estrutura de cristal do complexo de Fv (P208)/região extracelular de FcyRIIb). O valor R do fator de confiabilidade cristalográfica do modelo estrutural para os dados de intensidade difratada a 25 a 3,0 Â foi 42,6% e o valor R livre foi 43,7% após refinamento de corpo rígido onde os dois domínios CH2 e dois domínios CH3 da região Fc e a região extracelular de FcyRIIb foram deixados desviar do modelo estrutural inicial obtido. Então, refinamento de modelo estrutural foi obtido através da repetição de refinamento estrutural usando programa REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) seguido por revisão do modelo estrutural realizada usando programa Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) com referência aos mapas de densidade de elétron onde os coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc foram calculados usando fator Fo estrutural experimentalmente determinado, região Fc de fator estrutural calculada de acordo com o modelo estrutural e a fase calculada de acordo com o modelo estrutural. Finalmente, como um resultado de incorporação de moléculas de água no modelo com base nos mapas de densidade de elétron com coeficientes de Fo-Fc e 2Fo-Fc como o coeficiente e o refino a seguir, valores de confiabilidade cristalográfica e o valor R livre do modelo contendo 4758 átomos de não hidrogênio se torna de 24,5% e 28,2% para dados de intensidade de difração 27259 a partir de uma resolução de 25 Â a 2,87 Â, respectivamente.

[001149] A estrutura tridimensional do complexo de Fc/região extracelular de FcyRIIb foi determinada em uma resolução de 2,81 Â através de análise de estrutura. A estrutura obtida através de análise é mostrada na Figura 30. A região extracelular de FcyRIIb foi revelada ser ligada e entre os dois domínios CH2 da região Fc, que lembra as estruturas tridimensionais dos complexos de Fc (WT) anteriormente analisados, que é a Fc de IgG nativa, e cada uma das regiões extracelulares de FcyRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674), FcyRIIb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276,16469-16477 e FcyRIIa (J. Immunol. (2011) 187 (6), 3208-3217).

[001150] Uma observação atenta do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb revelou uma mudança em estrutura de alça nas posições 233 a 239 (numeração EU) seguindo a região de dobra no domínio A de CH2 da região Fc devido a uma influência das alterações G237D e P238D introduzidas comparado com o complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcyRIIaR (Figura 31). Isso leva que a cadeia principal de Asp na posição 237 (numeração EU) em Fc (P208) formou uma ligação hidrogênio firme com a cadeia lateral de Tyr na posição 160 em FcyRIIb (Figura 32). Em ambos FcyRIIaH e FcyRIIaR, o resíduo de aminoácido na posição 160 é Phe, que é incapaz de formar tal ligação hidrogênio. Isso sugere que a ligação hidrogênio descrita acima tem contribuição importante para o aumento da ligação a FcyRIIb e a aquisição da seletividade de ligação para FcyRIIa de Fc (P208), isto é, aperfeiçoamento da atividade de ligação a FcyRIIb e redução da atividade de ligação a FcyRIIa de Fc (P208).

[001151] Por outro lado, a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) em Fc (P208) não forma nem interação na ligação FcyRIIb particularmente significante nem interação com outros resíduos dentro da região Fc. Ile na posição 332, Glu na posição 333, Lys na posição 334 (numeração EU) na região Fc estão localizados próximos de Asp na posição 237 (numeração EU) (Figura 33). Quando os resíduos de aminoácido dessas posições são substituídos por resíduos hidrofílicos para formar uma interação com a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) em Fc (P208) e a estrutura da alça pode ser estabilizada pela interação, isso pode levar à redução da perda de energia entrópica devido à ligação hidrogênio entre a região Fc e Tyr na posição 160 em FcyRIIb e desta maneira a um aumento na energia livre de ligação, isto é, um aumento na atividade de ligação.

[001152] Quando a estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P238D) com a alteração P238D e região extracelular de FcyRIIb descrito no Exemplo 10 é comparada com a estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208) e região extracelular de FcyRIIb, alterações são observadas em cinco porções em Fc (P208) comparado com Fc (P238D) e a maioria das mudanças é vista apenas no nível de cadeia lateral. Entretanto, um desvio posicional no nível de cadeia principal devido à alteração Pro-para-Gly na posição 271 (numeração EU) é também observada não domínio B de CH2 da região Fc, e ainda há uma mudança estrutura na alça nas posições 266 a 270 (numeração EU) (Figura 34). Conforme descrito no Exemplo 11, é sugerido que, quando Asp na posição 270 (numeração EU) em Fc (P238D) forma uma interação eletrostática forte com Arg na posição 131 em FcyRIIb, a interação pode induzir estresse estereoquímico em Pro na posição 271 (numeração EU). O experimento descrito aqui sugere que a mudança estrutural observada com a alteração para Gly para o aminoácido na posição 271 (numeração EU) é suposto ser um resultado de eliminação da distorção estrutural acumulada em Pro antes da alteração e a eliminação resulta em um aumento na energia livre para a ligação a FcyRIIb, isto é, um aumento na atividade de ligação.

[001153] Ainda, foi demonstrado que, devido à mudança da estrutura da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU), Arg na posição 292 (numeração EU) sofreu uma mudança estrutura com dois estágios. Neste caso, é sugerido que a interação eletrostática (Figura 34) formada entre Arg na posição 292 (numeração EU) e Asn na posição 268 (numeração EU) que é um resíduo alterado em Fc (P208) pode contribuir para a estabilização da estrutura da alça. Uma vez que a interação eletrostática formada entre Asp na posição 270 (numeração EU) na alça e Arg na posição 131 em FcyRIIb contribui muito para a atividade de ligação de Fc (P208) a FcyRIIb, a estabilização da estrutura da alça na conformação de ligação era provável reduzir a perda de energia entrópica quando da ligação. Desta maneira, a alteração é esperada resultar em um aumento na energia livre de ligação, isto é, um aumento na atividade de ligação.

[001154] Além disso, a possibilidade de alteração para aumentar a atividade foi investigada com base no resultado de análise estrutural. Ser na posição 239 (numeração EU) foi verificado ser um candidato para o sítio para introduzir alteração. Conforme mostrado na Figura 35, Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio B de CH2 está presente na posição para a qual Lys na posição 117 em FcyRIIb se estende mais naturalmente em estrutura. No entanto, uma vez que a densidade de elétron não foi observada para Lys na posição 117 em FcyRIIb através da análise descrita acima, o Lys não tem nenhuma estrutura definitiva. Nesta situação, Lys 117 é provável ter apenas um efeito limitado sobre a interação com Fc (P208). Quando Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio B de CH2 é substituído com Asp ou Glu negativamente carregado, tal alteração é esperada causar uma interação eletrostática com o Lys positivamente carregado na posição 117 em FcyRIIb, desta maneira resultando em atividade de ligação a FcyRIIb aperfeiçoada.

[001155] Por outro lado, uma observação da estrutura de Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio A de CH2 revelou que, através da formação de uma ligação hidrogênio com a cadeia principal de Gly na posição 236 (numeração EU), a cadeia lateral deste Ser estabilizou a estrutura da alça nas posições 233 a 239, incluindo Asp na posição 237 (numeração EU) que forma uma ligação hidrogênio com a cadeia lateral de Tyr na posição 160 em FcyRIIb, seguindo a região de dobra (Figura 35). A estabilização da estrutura da alça na conformação de ligação pode reduzir a perda de energia entrópica quando da ligação, e resulta em um aumento na energia livre de ligação, isto é, um aperfeiçoamento da atividade de ligação. Entretanto, quando Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio A de CH2 é substituído com Asp ou Glu, a estrutura da alça pode se tornar instável devido à perda da ligação hidrogênio para a cadeia principal de Gly na posição 236 (numeração EU). Ainda, a alteração pode resultar em repulsão eletrostática para Asp na posição 265 (numeração EU) em proximidade grande, levando à desestabilização adicional da estrutura da alça. A energia para a desestabilização corresponde à perda de energia livre para a ligação a FcyRIIb, que pode resultar em redução na atividade de ligação.

[001156] (14-2) Análise de estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208) e região extracelular de FcyRIIaR

[001157] Expressão e purificação da região extracelular de FcyRIIaR

[001158] A região extracelular de FcyRIIaR foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2.

[001159] Purificação do complexo de Fc (P208)/região extracelular de tipo FcyRIIaR

[001160] 1,5 mg de amostra purificada da região extracelular de FcyRIIaR foi adicionado com 0,15 mg do produto purificado de Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) expresso em E. coli como uma proteína de fusão com S-transferase, 20 μl de 5 U/ml Endo F2 (QA-bio) e 20 μl de 5 U/ml Endo F3 (QA-bio). Após 9 dias de incubação em temperatura ambiente em tampão de acetato de Na 0,1 M (pH 4,5), a amostra foi adicionada mais com 0,07 mg do Endo F1 descrito acima, 7,5 μl do Endo F2 descrito acima e 7,5 μl do Endo F3 descrito acima e foi incubado por três dias para clivar cadeias de açúcar tipo N exceto N- acetilglicosamina diretamente ligada a Asn na amostra da região extracelular de FcyRIIa R. Então, a amostra da região extracelular de FcyRIIaR concentrada com um filtro de ultrafiltragem 10000MWCO e submetida a tratamento de clivagem de cadeia de açúcar descrito acima foi purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem em gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 25 mM (pH 7), NaCl 0,1 M. Em seguida, ao Fcy purificado, a fração de região extracelular com suas cadeias de açúcar clivadas, Fc (P208) foi adicionado, de modo que a proporção molar da região extracelular de FcyRIIaR estivesse presente em ligeiro Excesso. A mistura concentrada por meio de ultracentrifugação com 10.000 MWCO foi purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem de gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 25 mM (pH 7), NaCl 0,1 M. A fração purificada preparada conforme acima descrito foi usada como uma amostra de complexo de Fc (P208)/ região extracelular de FcyRIIaR na avaliação subsequente .

[001161] Cristalização do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR

[001162] Uma amostra de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIa tipo R concentrada para cerca de 10 mg/ml com filtro de ultrafiltragem 10000MWCO foi cristalizada usando o método de difusão de vapor de gota assentada. Usando uma solução de reservatório de Bis-Tris 0,1 M (pH 7,5), PEG3350 26% (p/v), sulfato de amônio 0,2M, gotas de cristalização foram preparadas em uma razão de mistura de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,8 μl : 1,0 μl. As gotas foram firmemente unidas e deixadas permanecer a 20° C. Isso rendeu cristais tipo placa.

[001163] Medição de dados de difração de raios X de cristal de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR

[001164] Um cristal simples de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR preparado conforme acima descrito foi embebido em uma solução de Bis-Tris 0,1 M (PH 7,5)/PEG3350)), 27,5% (p/v)/sulfato de amônio, 0,2 M/glicerol 20% (v/v). Então, o cristal foi pescado da solução usando um pino com alça de náilon de fino presa e congelado em nitrogênio líquido. Dados de difração de raios X do cristal simples foram coletados na unidade de radiação Synchroton Photon Factory BL-17a na High Energy Accelerator Research Organization. O cristal foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter em um estado congelado durante a medição. Um total de 225 imagens de difração de raios X do cristal simples foi coletado usando o CCD detector Quantum 315r (ADSC) equipado com a linha de feixe com giro do cristal simples a 0,6° de cada vez. Com base nas imagens de difração obtidas, determinação da constante de látice, indexação de ponto de difração e processamento de dados de difração foram realizados usando programas Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) e Scala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Finalmente, dados de intensidade de difração até resolução de 2,87Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial C2221 com a constante de látice a = 154,31Â, b = 257,61 Â, c = 56,19 Â, α = 90°, β = 90° e y = 90°.

[001165] Análise de estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR

[001166] A estrutura do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR foi determinada através do método de substituição molecular usando o programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). O número de complexos em uma unidade assimétrica foi estimado ser um a partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR. Usando, como um modelo de pesquisa, a estrutura cristalográfica do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb obtido conforme descrito no Exemplo (14-1), a orientação e a posição do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR nos látices de cristal foram determinadas com base na função de rotação e na função de translação. O valor R do fator de confiabilidade cristalográfica do modelo estrutural para os dados de intensidade difratada a 25 a 3,0 Â foi 38,4% e o valor R livre foi 30,0% após refinamento de corpo rígido do modelo estrutural inicial obtido o qual se move dos dois domínios CH2 e dois domínios CH3 da região Fc e a região extracelular de FcyRIIb foram deixados desviar independentemente do modelo estrutural inicial obtido. Então, refinamento de modelo estrutural foi obtido através da repetição de refinamento estrutural usando programa REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) seguido por revisão do modelo estrutural realizada usando programa Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) com referência aos mapas de densidade de elétron onde os coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc foram calculados usando fator Fo estrutural experimentalmente determinado, Fc de fator estrutural calculada de acordo com o modelo estrutural e as fases calculadas de acordo com o modelo. Finalmente, como um resultado de incorporação de moléculas de água no modelo com base nos mapas de densidade de elétron com coeficientes de Fo-Fc e 2Fo-Fc como o coeficiente e o refino a seguir, valores de confiabilidade cristalográfica e o valor R livre do modelo contendo 4758 átomos de não hidrogênio se torna de 26,3% e 38,0% para dados de intensidade de difração 24838 a partir de uma resolução de 25 Â a 2,87 Â, respectivamente.

[001167] A estrutura tridimensional do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR foi determinada em uma resolução de 2,87Â através de análise de estrutura. Uma comparação da estrutura de cristal entre o complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR e o complexo de Fc (P-208)/região extracelular de FcyRIIb descrito no Exemplo (14-1) não detectou quase nenhuma diferença no nível de estrutura geral (Figura 36), refletindo a identidade de aminoácido muito alta entre os dois receptores Fcy.

[001168] No entanto, uma observação precisa das estruturas no nível de densidade de elétron detectou algumas diferenças que podem levar a aperfeiçoamentos da seletividade entre a ligação a FcyRIIb e a ligação a FcyRIIaR da região Fc. O resíduo de aminoácido na posição 160 em FcyRIIaR não é Tyr, mas Phe. Conforme mostrado na Figura 37, a ligação hidrogênio entre a cadeia principal do resíduo de aminoácido na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da região Fc e Tyr na posição 160 em FcyRIIb, embora formada quando da ligação entre FcyRIIb e a região Fc com alteração P238D, é esperada não ser formada quando da ligação entre FcyRIIaR e a região Fc com alteração P238D. A ausência da formação de ligação hidrogênio pode ser um fator principal para aperfeiçoamento da seletividade entre a ligação a FcyRIIb e a ligação a FcyRIIab da região Fc introduzida com alteração P238D. Comparação adicional no nível de densidade de elétron mostrou que, no complexo de Fc/região de FcyRIIb, densidade de elétron era claramente observável para as cadeias laterais de Leu nas posições 235 (numeração EU) e 234 (numeração EU), enquanto a densidade de elétron das cadeias laterais não era clara no complexo de Fc/região de FcyRIIaR. Isso sugere que a posição próximo da alça 237 (numeração EU) se torna flexível devido à interação com FcyRIIaR reduzida em torno desta posição. Entretanto, uma comparação estrutural do domínio B de CH2 da região Fc (Figura 38) na mesma região revelou que, no complexo da região Fc e FcyRIIb, densidade de elétron era observável até Asp na posição 237 (numeração EU), enquanto, na estrutura do complexo da região Fc e FcyRIIaR, a densidade de elétrons era observável até três resíduos antes da Asp na posição 237 (numeração EU), isto é, até em torno de Leu na posição 234 (numeração EU), sugerindo que a ligação a FcyRIIaR forma uma interação em uma região maior comparado com a ligação a FcyRIIb. A constatação descrita acima sugere a possibilidade que, no domínio A de CH2 da região Fc, a região da posição 234 até a 238 (numeração EU) tem uma contribuição grande para a ligação entre a região Fc e FcyRIIb, enquanto o domínio B de CH2 da região Fc da posição 234 até a 238 (numeração EU) tem uma contribuição grande para a ligação entre a região Fc e FcyRIIaR.

[001169] [Exemplo 15] Variantes Fc para as quais sítios de alteração foram determinados com base em estrutura de cristal

[001170] Conforme descrito no Exemplo 14, Asp na posição 268 (numeração EU) foi sugerido interagir eletrostaticamente com Arg na posição 292 (numeração EU) (Figura 34) como um resultado da mudança estrutural local devido à introdução da alteração P271G no domínio B da variante com ligação a FcyRIIb aumentada (P208). Há uma possibilidade que a estrutura da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU) seja estabilizada pela formação da interação, resultando em aumento da ligação a FcyRIIb. Desta maneira, os presentes inventores avaliaram se a ligação a FcyRIIb da variante poderia ser aumentada pela estabilização adicional desta estrutura de alça devido a aumento da interação eletrostática através da substituição de Asp por Glu na posição 268 (numeração EU) na variante. Por outro lado, conforme mostrado na Figura 33, Tyr na posição 160 (numeração EU) em FcyRIIb interage com a cadeia principal de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de P208. Entretanto, a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) está localizada próximo da posição 332, Glu na posição 333 e Lys na posição 334 (numeração EU) na molécula sem formação de nenhuma interação particularmente significante. Desta maneira, os presentes inventores também avaliaram se a interação com Tyr na posição 160 em FcyRIIb pode ser aumentada através de estabilização da estrutura da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU) devido à interação aumentada com a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) através da substituição de resíduos de aminoácido hidrofílicos nas posições descritas acima.

[001171] Variantes de IL6R-BP230/IL6R-L preparadas conforme descrito no Exemplo 13 foram produzidas por meio de introdução com cada uma das alterações H268E, I332T, I332E, I332K, E333K, E333R, E333S, E333T, K334S, K334T e K334E. IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2.

[001172] O KD de cada variante para cada FcyR é mostrado na Tabela 21. Na tabela, "alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP3 (SEQ ID NO: 63). IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o molde para produzir IL6R-BP230 é indicado por asterisco(*). KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado na tabela mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcyRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaR pelo KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 21, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR à IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

[001173] descrita no Exemplo de Referência 2.

[001174] Ambas atividade de ligação a FcyRIIb e seletividade para FcyRIIb de IL6R-BP264/IL6R-L, IL6R-BP465/IL6R-L, IL6R-BP466/IL6R- L e IL6R-BP470, resultantes da introdução das alterações H268E, E333K, E333R e E333T, respectivamente, em IL6R-BP230/IL6R-L foram aumentadas comparado com aquelas de IL6R-BP230/IL6R-L. A seletividade para FcyRIIb de IL6R-BP391/IL6R-L introduzido com a alteração I332T foi reduzida enquanto sua atividade de ligação a FcyRIIb foi aumentada comparado com IL6R-BP230/IL6R-L.

[001175] [Exemplo 16] Introdução compreensiva de alterações em resíduos de aminoácido em torno da posição 271 (numeração EU)

[001176] Na comparação estrutural entre Fc (P208) e FcyRIIb e Fc (P238D)/ FcyRIIb, a diferença mais significante é encontrada na estrutura em torno da posição 271 (numeração EU) no domínio B de CH2 da região Fc (Figura 33). Conforme descrito no Exemplo 11, é sugerido que, quando, em Fc (P238D), Asp na posição 270 (numeração EU) forma uma interação eletrostática firme com Arg na posição 131 em FcyRIIb, a interação pode induzir estresse estereoquímico em Pro na posição 271 (numeração EU). Na estrutura de Fc (P208)/ FcyRIIb, devido à substituição de Pro por Gly na posição 271 (numeração EU), um desvio posicional ocorreu no nível de cadeia principal de maneira a eliminar a distorção estrutural, resultando em uma mudança estrutural grande em torno da posição 271. Há uma possibilidade que estabilização adicional da estrutura modificada em torno da posição 271 reduza mais a perda de energia entrópica causada pela ligação quando da formação de uma interação eletrostática com Arg na posição 131 em FcyRIIb. Desta maneira, alterações que aumentam a ligação a FcyRIIb ou aumentam a seletividade para FcyRIIb da região Fc foram buscadas através de introdução compreensiva de alterações em resíduos de aminoácido em torno da posição 271 (numeração EU).

[001177] IL6R-BP267 foi construído como um molde em introdução compreensiva de alterações através de introdução de alterações E233D, G237D, P238D, H268E e P271G em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acimas foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcgR (FcgRIa, FcgRIIaH, FcgRIIaR, FcgRIIb ou FcgRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2. Os aminoácidos nas posições 264, 265, 266, 267, 269 e 272 (numeração EU) em IL6R-BP267 foram substituídos com cada um dos 18 tipos de aminoácidos, exceto Cys e o aminoácido antes da substituição. IL6R-IL (SEQ ID NO: 56) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcgR (FcgRIa, FcyRIIaR, FcgRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) por meio do método descrito no Exemplo de Referência 2. Variantes cuja ligação ao FcgRIIb tinha sido aumentada ou seletividade pelo FcgRIIb tinha sido aumentada quando comparado com a ligação ao FcgRIIb ou seletividade pelo FcgIIb de IL6R-BP267/IL6R-L antes de introdução das alterações são mostradas na Tabela 22.

[001178] O valor KD de cada variante para cada FcyR é mostrado na Tabela 22. Na tabela, "alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP3, que foi usado como um molde. IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o molde para produzir IL6R-BP267 é indicado pelo asterisco(*). Na tabela, KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) do polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R- B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo a KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIaR pela KD de cada variante para FcyRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido através de divisão do valor KD de cada variante para FcyRIIaR pelo valor KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 22, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

[001179] descrita no Exemplo de Referência 2.

[001180] Todas as atividades de ligação de variantes mostradas na Tabela 22 para FcyRIa, FcyRIIaH e FcyRIIIaV eram comparáveis ou reduzidas comparado com aquelas de IL6R-B3/IL6R-L. Entretanto, a atividade de ligação a FcyRIIb de variantes resultantes da adição de alterações S267A, V264I, E269D, S267E, V266F, S267G e V266M, respectivamente, a IL6R-BP267/IL6R-L foi aumentada comparado com aquela de IL6R-BP267/IL6R-L antes da adição da alteração. Entretanto, os valores KD (IIaR)/KD (IIb) de variantes resultantes da adição das alterações S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I e E272F, respectivamente, a IL6R-BP267/IL6R-L foram aumentados comparado com aqueles de IL6R-BP267/IL6R-L antes da adição de alteração. Isso demonstra que as alterações S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I e E272F produzem o efeito de aperfeiçoamento da seletividade para FcyRIIb.

[001181] [Exemplo 17] Aumento da ligação a FcyRIIb através da introdução de alterações na região CH3

[001182] Uma alteração de substituição de Pro por Leu na posição 396 (numeração EU) foi relatada aumentar a ligação a FcyRIIb (Cancer Res. (2007) 67, 8882-8890). O aminoácido na posição 396 (numeração EU) está presente em uma posição que não está diretamente envolvida na interação com FcyR. No entanto, o aminoácido pode ser suposto ter um efeito sobre a interação com FcyR através da mudança da estrutura do anticorpo. Desta maneira, os presentes inventores avaliaram se a ligação a FcyRIIb da região Fc é aumentada ou sua seletividade para FcyRIIb é aumentada através de introdução exaustiva de alterações de aminoácido na posição 396 (numeração EU) na região Fc.

[001183] IL6R-BP423 foi construído como um modelo em introdução compreensiva de alterações através da introdução das alterações E233D, G237D, P238D, S267A, H268E, P271G e A330R em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 63). Variantes, onde o aminoácido na posição 396 (numeração EU) em IL6R-BP423 foi substituído com cada um de 18 tipos de aminoácidos, exceto cisteína e o aminoácido antes da substituição, foram construídas. IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2. A ligação das variantes resultantes a cada FcyR é mostrada na Tabela 23.

[001184] Na tabela, "alteração introduzida em IL6R-BP423" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP423, que foi usado como um modelo. IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o modelo para produzir IL6R-BP423 é indicado como um asterisco(*). Na tabela, KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IlaR) de polipeptídeo parental/KD (IIar) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido através da divisão do valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyR IIaR pelo valor KD de cada variante para FcyR IIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaR pela KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 23, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

[001185] descrita no Exemplo de Referência 2 [001184] Na tabela, "alteração introduzida em IL6R-BP423" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP423, que foi usado como um modelo. IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o modelo para produzir IL6R-BP423 é indicado como um asterisco(*). Na tabela, KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcgRIIb pelo valor KD de cada variante para FcgRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIar) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido através da divisão do valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcgR IIaR pelo valor KD de cada variante para FcgR IIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcgRIIaR pela KD da variante para FcgRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcgRIIb. Na Tabela 23, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcgR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2 .

[001186] O resultado mostrado na Tabela 23 demonstra que: a atividade de ligação a FcyRIIb de IL6R-BP456/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396M em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R- BP455/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396L em IL6R- BP423/IL6R-L, IL6R-BP464/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396Y em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP450/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396F em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP448/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396D em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP458/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396Q em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP453/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396I em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP449/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396E em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP454/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396K em IL6R-BP423/IL6R-L, e IL6R-BP459/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396R em IL6R-BP423/IL6R-L foi aumentada comparado com aquela de IL6R-BP423/IL6R-L antes da introdução das alterações. Entretanto, o valor KD (IIaR)/KD (IIb) de IL6R-BP456/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396M em IL6R-BP423/IL6R-L foi maior comparado com aquele de IL6R- BP423/IL6R-L antes da introdução da alteração, demonstrando a seletividade aperfeiçoada de FcyRIIb. Como visto na Tabela 23, a atividade de ligação das variantes preparadas para FcyRIa, FcyRIIaH e FcyRIIIaV foi menor do que aquela de IL6R/B3/IL6R-L, que foi o polipeptídeo parental.

[001187] [Exemplo 18] Preparação de variantes com ligação a FcyRIIb aumentada usando sequências de subclasse

[001188] O perfil de ligação de FcyR varia dependendo da subclasse de IgG humano. Os presentes inventores avaliaram se a diferença na atividade de ligação a cada FcyR entre IgG1 e IgG4 poderia ser utilizada para aumentar a atividade de ligação a FcyRIIb e/ou melhorar a seletividade. Primeiro, IgG1 e IgG4 foram analisadas quanto à sua atividade de ligação a cada FcyR. IL6R-G4d (SEQ ID NO: 64) contendo G4d foi construído como a cadeia H de anticorpo. G4d é uma região Fc que não tem Gly e Lys C-terminais e contém uma substituição de Ser por Pro na posição 228 (numeração EU) em IgG4 humano. IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e IL6R-G1d/IL6R-L ou IL6R-G4d/IL6R-L foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25. A ligação das variantes resultantes a cada FcyR é sumarizada na Tabela 24. Tabela 24

[001189] Foi demonstrado que a ligação a FcyRIIb de IL6R-IL6R-L era 1,5 vez mais forte do que aquela de IL6R-G1d/IL6R-L enquanto a ligação a FcyRIIaR de IL6R-G4d/IL6R-L era 2,2 vezes mais fraca do que aquela de IL6R-G1d/IL6R-L. Entretanto, a atividade de ligação de IL6R- G4d/IL6R-L a FcyRIa, FcyRIIaH e FcyRIIIaV era menor do que aquela de IL6R-G1d/IL6R-L. O resultado descrito acima revelou que IL6R-G4d tinha características preferíveis comparado com IL6R-G1d em termos de ambas atividade e seletividade de ligação a FcyRIIb.

[001190] A Figura 39 é um alinhamento para comparar as sequências CH1 de G1d e G4d até o terminal C (posições 118 a 445 (numeração EU)). Na Figura 39, resíduos de aminoácido que são diferentes entre G1d e G4d estão marcadas de preto. Os presentes inventores avaliaram se a ligação a FcyRIIb poderia ser aumentada mais e/ou seletividade para FcyRIIb poderia ser aperfeiçoada mais através de seleção, a partir dos aminoácidos diferentes descritos acima, de algumas porções que são previstas estar envolvidas na interação com FcyR, e enxerto de pelo menos um resíduo de aminoácido ou mais da sequência G4d, que confere uma propriedade preferível do ponto de vista de ambas a atividade de ligação a e seletividade para FcyRIIb, a uma variante com ligação a FcyRIIb aumentada.

[001191] Especificamente, os presentes inventores produziram: IL6R- BP473 resultante da introdução da alteração A327G em IL6R-BP230; IL6R-BP472 resultante da introdução da alteração A330S em IL6R- BP230; IL6R-BP471 resultante da introdução da alteração P331S em IL6R-BP230; IL6R-BP474 resultante da introdução das alterações A330S e P331S em IL6R-BP230; L6R-BP475 resultante da introdução das alterações A327G e P330S em IL6R-BP230; IL6R-BP476 resultante da introdução das alterações A327G e P331S em IL6R-BP230; eIL6R- BP477 resultante da introdução das alterações A327G e P331S em IL6R-BP230. Ainda, para construir IL6R-BP478, os aminoácidos de Ala na posição 118 até Thr na posição 225 (numeração EU) em IL6R-BP230 foram substituídos com os aminoácidos da sequência G4d de Ala na posição 118 para Pro na posição 222 (numeração EU). IL6R-L (SEQ ID NO: 56) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2.

[001192] O valor KD de cada variante para cada FcyR é mostrado na Tabela 25. KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado na tabela mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R- B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Na tabela, "alteração introduzida em IL6R-BP230" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP230. IL6R-B3/IL6R-L usado como o modelo para produzir IL6R-BP230 é indicado por *1. Entretanto, IL6R- BP478, onde o segmento de a partir de Ala na posição 118 até Thr na posição 225 substituiu a sequência G4 de a partir de Ala na posição 118 até Pro na posição 222 (numeração EU) em IL6R-BP230, é indicado por *2. KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6-R para FcyR IIaR pelo valor KD da variante para FcyR IIa. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaR pela KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 25, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

[001193] descrita no Exemplo de Referência 2.

[001194] Das variantes mostradas na Tabela 25, IL6R-BP473/IL6R-L introduzida com a alteração A327G mostrou ligação a FcyRIIb aumentada 1,2 vez comparado com aquela de IL6R-BP230/IL6R-L. IL6R-BP478/IL6R-L, produzida por meio de substituição de aminoácidos de Ala na posição 118 até Thr na posição 225 (numeração EU) de IL6R- BP230 foram substituídos pelos aminoácidos de Ala na posição 118 até Pro na posição 222 (numeração EU) da sequência de G4d, tem ligação 1,1 vez aumentada pelo Fcy em relação àquela de IL6R-BP230/IL6R-L e ligação de IL6R-BP478/IL6R-L ao Fcy e ligação de IL6R-BP478/IL6R- L ao Fcy (numeração EU). As atividades de ligação de todas as variantes ao Fcy foram menores do que aquelas do polipeptídeo parental IL6R- B3/IL6R-L.

[001195] No exame realizado até o momento, foi mostrado que introdução da alteração A327G, a qual substitui o aminoácido na sequência de IgG4 humana pelo aminoácido na posição 327 (numeração EU) na variante IL6R-BP230/IL6R-L, aumenta a ligação ao Fcy. Exame adicional da variante IL6R-BP230/ILA foi realizado para aminoácidos que não correspondem entre as sequências de IgG4 e IgG1 e aqueles que não o aminoácido na posição 327 (numeração EU). Especificamente, foram produzidas variantes por meio de introdução das seguintes alterações em IL6R-BP230, a qual foi usada como a cadeia H de anticorpo, K274Q foi introduzida para produzir IL6R-BP541; Y296F foi introduzida para produzir IL6R-BP542; H268Q foi introduzida para produzir IL6R-BP543; R355Q foi introduzida para produzir IL6R- BP544; D35E foi introduzida para produzir IL6R-BP545; L358M foi introduzida para produzir IL6R-BP546; K409R foi introduzida para produzir IL6R-BP547; e Q419E foi introduzida para produzir IL6R- BP548, conforme indicado pela numeração Eu, respectivamente. Entretanto, IL6R-L foi usada como a cadeia L de anticorpo comum. Anticorpos que contêm a variante de cadeia pesada acima e o IL6R-L de cadeia leve foram purificados de acordo com os métodos descritos no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2.

[001196] A KD de cada variante para cada FcyR é mostrado na Tabela 26. Na Tabela, "KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) do polipeptídeo alterado" representa o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/L6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Na Tabela, "alteração de IL6R-BP230" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP230. IL6R/IL6R-L usado como o modelo para produzir IL6R-BP230 é indicado com *1. "KD (IIaR) do polipeptídeo parental/KD (IIaR) do polipeptídeo alterado" representa o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIaR pelo valor KD da mesma variante para FcyRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) representa o valor obtido dividindo KD de cada variante para FcyRIIaR pelo KD da mesma variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 26, o numeral na célula preenchida com cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi fraca, e foi determinado que a análise não poderia ser corretamente realizada através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

[001197] descrita no Exemplo de Referência 2.

[001198] Conforme mostrado na Tabela 26, IL6R-BP541/IL6R-L resultante da introdução de K274Q (cada uma representada pela numeração EU) em IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP544/IL6R-L resultante da introdução de R355Q em IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L resultante da introdução de D356E em IL6R-BP230/IL6R-L e IL6R- BP546/IL6R-L resultante da introdução de L358M em IL6R- BP230/IL6R-L mostraram ligação a FcyRIIb aumentada comparado com IL6R-BP230/IL6R-L antes da introdução da alteração. Deles, IL6R- BP544/IL6R-L resultante da introdução de R355Q em IL6R- BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L resultante da introdução de D356E (cada uma representada pela numeração EU) em IL6R-BP230/IL6R-L e IL6R-BP546/IL6R-L resultante da introdução de L358M em IL6R- BP230/IL6R-L foram mostrados ter um valor de KD(IIaR)/KD(IIb) aumentado e seletividade aperfeiçoada para FcyRIIb, comparado com IL6R-BP230/IL6R-L antes da introdução de alteração.

[001199] [Exemplo 19] Avaliação de combinações de alterações que aumentam a ligação a FcyRIIb ou melhoram a seletividade para FcyRIIb

[001200] Combinações adicionais das alterações as quais foram verificadas ser eficazes por meio da avaliação descrita acima como aprimorando a ligação a FcyRIIb ou o aperfeiçoamento da seletividade para FcyRIIb, foram avaliadas. Especificamente, as alterações que tinham sido avaliadas como sendo eficazes em aumento da ligação a FcyRIIb e/ou aperfeiçoamento da seletividade para FcyRIIb foram introduzidas em combinação em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Ainda, alterações existentes S267E e L328F que aumentam a ligação a FcyRIIb (Seung e outros (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933)) foram introduzidas em IL6R-B3 para produzir IL6R-BP253 como um controle de comparação. IL6R-L (SEQ ID NO: 63) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método conforme descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 2. A KD de cada variante para cada FcyR é mostrada na Tabela 27. Na tabela, "alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP3 (SEQ ID NO: 63). IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o molde para produzir cada variante é indicado pelo asterisco (*). KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyR IIaR pelo valor KD de cada variante para FcyRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaR pela KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb comparado com FcyRIIaR. Entretanto, KD (IIaH)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaH pela KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, maior a seletividade para FcyRIIb comparado com FcyRIIaH. Na Tabela 27, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR à IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando: Equação 2

descrita no Exemplo de Referência 2.

[001212] Das variantes mostradas na Tabela 27, IL6R-BP253/IL6R-L adicionados com as alterações existentes que aumentam a ligação a FcyRIIb exibiram atividades de ligação a FcyRIIb e FcyRIIaR aumentadas 277 vezes e 529 vezes aquelas de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução das alterações, respectivamente. Ainda, a atividade de ligação a FcyRIa de IL6R-BP253/IL6R-L foi também maior do que aquela de IL6R-B3/IL6R-L. Entretanto, a ligação a FcyRIIaH e ligação a FcyRIIIaV de IL6R-BP253/IL6R-L foram reduzidas comparado com aquelas de IL6R-B3/IL6R-L. Dentre outras variantes, IL6R-BP436/IL6R- L e IL6R-BP438/IL6R-L mostraram uma ligação a FcyRIa ligeiramente aumentada comparado com aquela de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução das alterações. Todas as outras variantes mostraram uma ligação a FcyRIa reduzida. Ainda, todas as variantes exibiram ligação a FcyRIIaH e ligação a FcyRIIIaV reduzidas comparado com aquelas de IL6R-B3/IL6R-L.

[001213] Em relação à IL6R-BP559/IL6R-L, IL6R-BP487/IL6R-L, IL6R- BP499/IL6R-L, IL6R-BP498/IL6R-L, IL6R-BP503/IL6R-L, BP488/IL6R-L, IL6R-BP490/IL6R-L, IL6R-BP445/IL6R-L, BP552/IL6R-L, IL6R-BP507/IL6R-L, IL6R-BP536/IL6R-L, BP534/IL6R-L, IL6R-491/IL6R-L, IL6R-BP553/IL6R-L, IL6R-BP532/IL6R- L, IL6R-BP506/IL6R-L, IL6R-BP511/IL6R-L, IL6R-BP502/IL6R-L, IL6R- BP438/IL6R-L, IL6R-BP565/IL6R-L, IL6R-BP540/IL6R-L, BP426/IL6R-L, IL6R-BP437/IL6R-L, IL6R-BP439/IL6R-L, IL6R-BP551/IL6R-L, IL6R- BP494/IL6R-L, IL6R-BP537/IL6R-L, IL6R-BP550/IL6R-L, IL6R- BP556/IL6R-L, IL6R-BP539/IL6R-L, IL6R-BP558/IL6R-L, IL6R- BP425/IL6R-L e IL6R-BP495/IL6R-L, sua ligação a FcyRIIb foi maior do que aquela de IL6R-BP253/IL6R-L adicionado com a alteração existente que aumenta a ligação a FcyRIIb. Do acima, o aumento da ligação a FcyRIIb varia de a partir de 321 vezes (mais baixa) a 3100 vezes (mais alta), comparado com a ligação a IL6R-B3/IL6R-L (que é definida ser 1), de IL6R-BP495/IL6R-L a IL6R-BP498/IL6R-L, respectivamente. Desta maneira, pode ser dito que essas variantes são superiores em ambos o nível e seletividade de aumento da atividade de ligação a FcyRIIb comparado com a técnica anterior.

[001214] Comparação de variantes produzidas neste exame com a variante existente IL6R-BP253/IL6R-L tendo ligação aumentada ao FcyRIIb mostrou que o valor de KD (IIaR)/KD (IIb) é de 16,1 para IL6R- BP479/IL6R-L, a qual mostrou o menor valor, e é de 64,4 para IL6R- BP567/IL6R-L, a qual mostrou o maior valor, e os valores para todas as variantes são maiores do que 0,2 para IL6R-BP253/IL6R-L. Além disso, o valor de KD (IIaR)/KD (IIb) é de 107,7 para IL6R-BP480/IL6R-L, a qual mostrou o menor valor e é de 8362 para IL6R-BP426/IL6R-L, a qual mostrou o maior valor e os valores para todas as variantes foram maiores do que 107,1 para IL6R-BP253/IL6R-L. A partir destes resultados, foi mostrado que todas as variantes mostradas na Tabela 27 são variantes com seletividade aprimorada pelo FcyRIIb quando comparado com a variante conhecida na qual alteração(ões) para aumentar a ligação ao FcyRIIb é/são introduzida(s). Em particular, IL6R- BP559/IL6R-L, IL6R-BP493/IL6R-L, IL6R-BP557/IL6R-L, IL6R- BP492/IL6R-L e IL6R-BP500/IL6R-L têm todas uma ligação ao FcyRIIaR mantida em não mais do que 1,5 vezes aquela de IL6R- B3/IL6R-L e, ao mesmo tempo, atividade de ligação ao FcyRIIb aumentada em 100 vezes; portanto, espera-se que estas variantes mostrem efeitos conferidos pela ligação aumentada ao FcyRIIb, ao mesmo tempo em que evita os efeitos colaterais causados pela ligação aumentada ao FcyRIIaR. Consequentemente, estas variantes podem ser consideradas como tendo melhores propriedades em termos de atividades de ligação e seletividade pelo FcyRIIb do que anticorpos produzidos por meio de técnicas existentes.

[001215] Sem estar limitado por uma teoria em particular, variantes IL6R-BP568/IL6R-L e IL6R-BP492/IL6R-L, as quais têm uma sequência Tregítopo conservada tendo maior capacidade de indução de Treg (De Groot et al. (Blood (2008) 112, 3303-3311)) e, assim, consideradas como tendo maior atividade de indução de Treg do que as variantes tendo Y296D, IL6R-BP567/IL6R-L e IL6R-BP493/IL6R-L, podem ser mais eficazes. Em relação à atividade de ligação e seletividade destas variantes pelo FcyRIIb, comparação com o tipo nativo mostra que ligação ao FcyRIIaR é 1,6 vezes e ligação ao FcyRIIb é 211 vezes aquela do tipo nativo para IL6R-BP568/IL6R-L e ligação ao FcyRIIaR é 1,2 vezes e ligação ao FcyRIIb é 131 vezes aquela do tipo nativo para IL6R-BP492/IL6R-L e descobriu-se que estas variantes têm alta atividade e seletividade de ligação pelo FcyRIIb.

[001216] [Exemplo 20] Preparação de anticorpos que se ligam a IgA humana de uma maneira dependente de cálcio

[001217] (20-1) Preparação de IgA humana (hIgA)

[001218] Os Exemplos 2 a 4 mostram que moléculas que têm ligação a FcyR de camundongo aumentada e que se ligam de uma maneira dependente do pH a receptor de IL-6 humano como um antígeno podem reduzir significantemente a concentração do antígeno em plasma. Então, um teste adicional foi realizado usando anticorpos para IgA humana como um antígeno, a fim de avaliar a presença de um efeito similar de eliminação de antígenos solúveis do plasma em um organismo vivo administrado com anticorpos que têm ligação a FcyR de camundongo aumentada e que se ligam de uma maneira dependente do pH a antígenos outros que não receptor de IL-6 humano. O antígeno, IgA humana (daqui em diante também referida como hIgA) (sua região variável é de um anticorpo anti- IL6R humano) foi preparado usando a técnica de recombinação que segue. hIgA foi expressa através de cultura de células hospedeiro contendo um vetor recombinante carregando H (WT)-IgA1 (SEQ ID NO: 65) e L (WT)-CK (SEQ ID NO: 42) e purificado através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando cromatografia de troca de íons e cromatografia de filtragem em gel.

[001219] (20-2) Expressão e purificação de um anticorpo que se liga a hIgA

[001220] GA2-IgG1 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 66; cadeia leve, SEQ ID NO: 67) é um anticorpo que se liga a hIgA. Uma sequência de DNA codificando GA2-IgG1 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 66; cadeia leve, SEQ ID NO: 67) foi inserida em um plasmídeo de expressão de célula animal através de um método conhecido daqueles versados na técnica. O anticorpo foi expresso e purificado através do método descrito abaixo. Células da linhagem 293-F FreeStyle derivada de célula de rim fetal humano (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen). A suspensão celular foi colocada em placas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml em 3 ml a cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Então, o plasmídeo preparado foi introduzido em células através do método de lipofecção. As células foram cultivadas em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm) por 4 dias. A partir do sobrenadante de cultura isolado, o anticorpo foi purificado através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Bioscience). A absorbância (comprimento de onda: 280 nm) da solução do anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi determinada usando o coeficiente de extinção calculado a partir do valor medido através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[001221] (20-3) Avaliação do anticorpo isolado quanto à sua habilidade de ligação a hIgA dependente de cálcio

[001222] O anticorpo isolado conforme descrito no Exemplo (20-2) foi avaliado quanto à sua atividade de ligação a hIgA (constante de dissociação, KD (M) usando Biacore T200 (GE Healthcare). A atividade de ligação foi medida usando um tampão de atividade, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l (pH 7,4 ou pH 5,8) contendo 3 μM ou CaCl2 1,2 mM. Uma quantidade apropriada de Proteína A/G recombinante (Thermo Scientific) foi imobilizada em um Sensor chip CM5 (GE Healthcare) através de um método de acoplamento de amino, e o anticorpo foi deixado se ligar a ele. Então, uma concentração apropriada de hIgA (descrito em (A1-1)) foi injetada como um analito e deixada interagir com o anticorpo no sensor chip. A medição foi realizada a 37° C. Após a medição, 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o sensor chip. A partir do resultado da medição, a constante de dissociação KD (M) foi calculada através da análise do ajuste de curva e análise de equilíbrio usando Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare). O resultado é mostrado na Tabela 28. GA2-IgG1 se ligou fortemente a hIgA em uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM e se ligou fracamente a hIgA em uma concentração de Ca2+ de 3 μM. Entretanto, em uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM, GA2- IgG1 se ligou fortemente a IgA humano em pH 7,4 e se ligou fracamente a IgA humano em pH 5,8. Em suma, GA2-IgG1 foi demonstrado se ligar a IgA humano de uma maneira dependente do pH e cálcio. Tabela 28

001223] [Exemplo 21] Preparação de variantes de anticorpo que se ligam a hIgA de uma maneira dependente de cálcio

[001223] [Exemplo 21] Preparação de variantes de anticorpo que se

[001224] Em seguida, para acelerar mais a eliminação de antígeno (hIgA) do plasma, GA2-F1087 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 68) foi produzido substituindo Tyr por Leu na posição 328 (numeração EU) em GA2-IgG1 para aumento da ligação a FcyR de camundongo de GA2- IgG1 que se liga a hIgA de uma maneira dependente de cálcio. Uma sequência de DNA codificando GA2-F1087 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 68; cadeia leve, SEQ ID NO: 67) foi inserida em um plasmídeo de expressão animal através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Variantes de anticorpo foram expressas através do método descrito acima usando o plasmídeo. As concentrações das variantes foram medidas após purificação. Anticorpos compreendendo a alteração acima exibiram ligação a FcyR de camundongo significantemente aumentada, conforme mostrado no Exemplo (4-3).

[001225] [Exemplo 22] Avaliação do efeito sobre a retenção de antígeno no plasma em camundongos normais administrados com anticorpos de ligação a hIgA dependente de Ca

[001226] hIgA (IgA humano, preparado conforme descrito no Exemplo (20-1) foi administrado sozinho ou em combinação com um anticorpo anti-hIgA a camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Após administração, a dinâmica in vivo de anticorpos hIgA e anti-hIgA foi avaliada. Uma solução de hIgA (80 μg/ml) ou uma solução mista de hIgA e um anticorpo anti-hIgA foi administrada de uma vez em uma dose de 10 mg/kg na veia caudal. Os anticorpos anti-hIgA usados foram GA2-IgG1 e GA2-F1087 descritos acima.

[001227] Em todas as soluções misturadas, a concentração de hIgA foi 80 μg/ml e a concentração de anticorpo anti-hIgA foi 2,69 mg/ml. Neste experimento, os anticorpos anti-hIgA estavam presentes significantemente em excesso com relação a hIgA, e então a maior parte do hIgA foi pensada se ligar aos anticorpos. No grupo administrado com GA-hIgG1, de camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias e sete dias após administração. Entretanto, no grupo administrado com GA-F1087, de camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, 30 minutos, uma hora, duas horas, um dia, três dias e sete dias após a administração. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 12.000 rpm e 4° C por 15 minutos para isolar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador a -20° C ou abaixo até o uso.

[001228] (22-2) Determinação da concentração de anticorpo anti-hIgA no plasma em camundongos normais através do método ELISA

[001229] Concentrações de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Primeiro, para preparar uma placa imobilizada com IgG anti-humano, Fragmento F(ab’)2 (específico de cadeia y) de IgG Anti-Humano de Anticorpo (SIGMA) foi separado em alíquotas para cada cavidade de uma Nunc- Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International) e a placa foi deixada ficar a 4° C de um dia para o outro. Amostras de curva de calibragem de anticorpo anti-hIgA preparado como soluções padrão para a concentração no plasma (0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563 e 0,007813 μg/ml) e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluído 100 vezes ou mais foram separadas em alíquotas para a placa imobilizada com IgG anti-humano mencionada acima. Após uma hora de incubação da placa a 25° C, Conjugado de Biotina (BIOT) (específica de cadeia y) de IgG Anti-Humano de Cabra (Southern Biotechnology Associates Inc.) foi separado em alíquotas para cada cavidade da placa. Então, a placa foi incubada a 25° C por uma hora. Em seguida, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi separado em alíquotas para cada cavidade da placa. Então, a placa foi incubada a 25° C por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após o término da reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância da solução de reação em cada cavidade foi medida a 450 nm com uma leitora de microplaca. Concentrações de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo das concentrações de anticorpo de GA2- IgG1 e GA2-F1087 no plasma de camundongos normais após administração intravenosa, que foram medidas através do método descrito acima, é mostrado na Figura 40. Os resultados demonstram que, com relação ao clone GA2-IgG1 que tem atividade de ligação a hIgA forte, dependente do pH, a concentração no plasma do anticorpo não é significantemente reduzida mesmo se a ligação a FcyR for aumentada.

[001230] (22-3) Determinação da concentração de hIgA no plasma através do método ELISA

[001231] Concentrações de hIgA em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Primeiro, para preparar uma placa imobilizada com IgA anti-humano, Anticorpo IgA Anti-Humano de Cabra (BETHYL) foi separado em alíquotas para cada cavidade de uma Nunc- Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International), e a placa foi deixada ficar a 4°C de um dia para o outro. Amostras de curva de calibragem de anticorpo hIgA foram preparadas como soluções padrão para a concentração no plasma (0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 μg/ml) foram usadas. 100 μl e cada uma das amostras de curva de calibragem e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídos 100 vezes ou mais foram combinados com 200 μl de 500 ng/ml de hsL6R. Isso foi misturado e incubado em temperatura ambiente por uma hora. Então, 100 μl da mistura foram separados em alíquotas para a placa imobilizada com IgA anti-humano. A placa foi deixada permanecer em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, Anticorpo IL-6 R Anti-humano Biotinilado (R&D) foi separado em alíquotas para cada cavidade da placa. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi separada em alíquotas para cada cavidade da placa. A placa foi incubada em temperatura ambiente por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após terminar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância da solução de reação em cada cavidade foi medida a 450 nm com uma leitora de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo da concentração de hIgA no plasma de camundongos normais após administração intravenosa, que foi medida através do método acima, é mostrado na Figura 41.

[001232] O resultado mostrou que, em camundongos administrados com hIgA em combinação com GA2-IgG1 tendo uma atividade de ligação a hIgA dependente de Ca de 100 vezes ou mais, eliminação de hIgA foi acelerada comparado com a administração de hIgA sozinho. Entretanto, no plasma de camundongos administrados com GA2-F1087 com ligação aumentada a hIgA e FcyR, a concentração de hIgA foi reduzida abaixo da faixa mensurável (0,006 μg/ml ou mais) um dia após administração, e então a eliminação de hIgA foi significantemente acelerada comparado com o plasma de camundongos administrados com GA-IgG1. As constatações descritas nos Exemplos 2 a 7 acima demonstram o efeito de eliminação de antígeno aumentado de anticorpos com ligação a FcyR em camundongos administrados com anticorpo IL6R e anti-IL6R. Da mesma maneira, um efeito similar foi também demonstrado ser obtido em camundongos administrados com o antígeno hIgA e anticorpo anti-hIgA. A partir dos resultados obtidos até o momento nos Exemplos, eliminação de antígeno neste caso pode também ser mediada por FcyRIIb.

[001233] [Exemplo 23] Preparação de um anticorpo anti-IgE dependente do pH

[001234] (23-1) Preparação de anticorpo IgE anti-humano

[001235] A fim de preparar um anticorpo IgE anti-humano dependente do pH, IgE humano (cadeia pesada, SEQ ID NO: 69; cadeia leve, SEQ ID NO: 70) (sua região variável é de um anticorpo glipicano 3 anti- humano) foi expresso como um antígeno usando FreeStyle293 (Life Technologies). O IgE humano expresso foi preparado e purificado através de um método cromatográfico geral conhecido daqueles versados na técnica. Um anticorpo que se liga a IgE humano de um maneira dependente do pH foi selecionado de muitos anticorpos isolados. As regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo IgE anti-humano selecionado foram fundidas com uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana e uma região constante de cadeia leve humana, e o gene de anticorpo resultante foi inserido em um vetor. Usando o vetor, um anticorpo IgE anti-humano recombinante foi expresso e purificado. O anticorpo preparado foi chamado clone 278 (daqui em diante referido como 278-IgG1; cadeia pesada, SEQ ID NO: 71, cadeia leve, SEQ ID NO: 72).

[001236] (23-2) Avaliação do anticorpo IgE anti-humano quanto à atividade de ligação a IgE humano e atividade de ligação dependente do pH

[001237] Anticorpos capazes de dissociação de antígenos no endossomo podem ser produzidos de tal maneira que eles se ligam a antígenos não apenas de uma maneira dependente do pH, mas também de uma maneira dependente de Ca. Desta maneira, 278-IgG1 e o anticorpo IgG1 humano controle Xolair (omalizumab, Novartis) sem habilidade de ligação a IgE dependente do pH/Ca foram avaliados quanto à habilidade de ligação dependente do pH e habilidade de ligação dependente do pH/Ca a IgE humano (hIgE). Especificamente, 278-IgG1 e Xolair foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a hIgE (constante de dissociação, KD (M)) usando Biacore T200 (GE Healthcare). As medições foram realizadas usando os três tipos de tampões de processo que seguem:

[001238] CaCl2 1,2 mmol, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 7,4

[001239] CaCl2 1,2 mmol, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 5,8

[001240] CaCl2 3 μmol, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCI 150 mmol/l, pH 5,8

[001241] Uma quantidade apropriada de um peptídeo (daqui em diante referido como "peptídeo GPC3 biotinilado") resultante da adição de biotina ao Lys C-terminal de uma sequência quimicamente sintetizada derivada de proteína glipicano 3 humana (SEQ ID NO: 73) foi carregada em um Sensor chip SA (GE Healthcare) e imobilizada no Sensor Chip AS com base em afinidade com biotina/estreptavidina. Uma concentração apropriada de IgE humano foi injetada e capturada pelo peptídeo GPC3 biotinilado para imobilizar IgE humano no chip. Uma concentração apropriada de 278-IgG1 foi injetada como um analito, e deixada interagir com IgE humano no sensor chip. Então, 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o sensor chip. Todo o ensaio para a interação foi realizado a 37° C. Usando Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare), os resultados do ensaio foram analisados através de ajuste de curva para determinar a constante de taxa de ligação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s). A constante de dissociação KD (M) foi calculada a partir das constantes acima. Então, a ligação dependente do pH foi avaliada através do cálculo da razão de KD de cada anticorpo entre as condições de pH 5,8/Ca 1,2 mM e pH 7,4/Ca 1,2 mM. A ligação dependente do pH/Ca foi avaliada através do cálculo da razão de KD de cada anticorpo entre as condições de pH 5,8/Ca 3 μM e pH 7,4/Ca 1,2 mM. Os resultados são mostrados na Tabela 29. Tabela 29

[001242] [Exemplo 24] Preparação de uma variante de anticorpo que se liga a IgE humano de uma maneira dependente do pH

[001243] Em seguida, para acelerar mais a eliminação de antígeno (IgE humano) do plasma, uma sequência de DNA codificando 278- F1087 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 74; cadeia leve, SEQ ID NO: 72) com uma substituição de Tyr para Leu na posição 328 (numeração EU) em 278-IgG1 foi inserida em um plasmídeo de expressão animal através de um método conhecido daqueles versados na técnica a fim de aumentar a ligação a Fcy de camundongo de 278-IgG1 que se liga a IgE humano de uma maneira dependente do pH. As variantes de anticorpo foram expressas através do método mencionado acima usando células animais introduzidas com o plasmídeo. As concentrações das variantes de anticorpo foram determinadas após purificação.

[001244] [Exemplo 25] Avaliação In vivo de 278-IgG1

[001245] (25-1) Preparação de IgE humano (hIgE (Asp6)) para avaliação in vivo

[001246] hIgE (Asp6) (sua região variável é de um anticorpo glipicano 3 anti-humano), que é um IgE humano para avaliação in vivo, que consistia na cadeia pesada (SEQ ID NO: 75) e cadeia leve (SEQ ID NO: 70), foi preparado através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo (23-1). hIgE (Asp6) é uma molécula onde asparagina foi substituída com ácido aspártico nos seis sítios de N-glicosilação em IgE humano, de maneira que mudanças dependentes do tempo na concentração de IgE humano como um antígeno no plasma não afetam a heterogeneidade de cadeias de açúcar N-ligadas de IgE humano.

[001247] (25-2) Avaliação do efeito de aceleração de eliminação de IgE humano do plasma de camundongos normais administrados com clone 278

[001248] Conforme descrito nos Exemplos 2 a 4, e 22, a concentração de antígeno foi demonstrada ser significantemente reduzida no plasma de camundongos administrados com as moléculas que se ligam de uma maneira dependente do pH a receptor de IL-6 humano ou IgA humano como um antígeno, e cuja ligação a FcyR de camundongo foi aumentada. Um teste adicional foi realizado usando anticorpos para IgE humano como um antígeno para avaliar se um efeito similar de eliminação de antígenos solúveis do plasma de um organismo vivo administrado com anticorpos com ligação a FcyR de camundongo aumentada que se ligam de uma maneira dependente do pH a antígenos outros que não receptor de IL-6 humano e IgA humano, quando a ligação a FcyR de camundongo é aumentada.

[001249] hIgE (Asp6) e anticorpos IgE anti-humanos foram avaliados quanto à sua dinâmica in vivo após administração de hIgE (Asp6) sozinho ou hIgE (Asp6) em combinação com os anticorpos anti-hIgE (278-IgG1 e 278-F1087) a camundongos C57BL/6J (Charles River Japão). hIgE (Asp6) (20 μg/ml) ou uma mistura de hIgE (Asp6) e um anticorpo IgE anti-humano foi administrado uma vez a 10 mL/Kg na veia caudal (conforme descrito na Tabela 30, todos os anticorpos foram preparados na mesma concentração). Neste caso, cada anticorpo estava presente significantemente em excesso com relação a hIgE (Asp6) e então quase todo do hIgE (Asp6) foi pensado se ligar ao anticorpo. No grupo administrado com clone 278 (278-IgG1), dos camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, duas horas, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias, cinco dias, sete dias, 14 dias e 21 dias após administração. No grupo administrado com 278-F1087, dos camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, 30 minutos, uma hora, duas horas, um dia, três dias, sete dias, 14 dias e 21 dias após administração. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 5 minutos para isolar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador a -20° C ou abaixo até o uso. Tabela 30

[001250] (25-3) Determinação da concentração de anticorpo IgE antihumano no plasma em camundongos normais

[001251] Concentrações de anticorpo anti-hIgE em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Amostras de curva padrão foram preparadas em 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 μg/ml para concentrações no plasma. Para assegurar a homogeneidade do complexo imune entre hIgE (Asp6) e anticorpo anti- hIgE, hIgE (Asp6) foi adicionado a 1 μg/ml às amostras de curva padrão e amostras de ensaio de plasma de camundongo. As amostras do grupo de administração de 278-hIgG1 e das amostras de curva padrão correspondentes foram deixadas permanecer em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, as amostras do grupo de administração de 278-F1087 e as amostras de curva padrão correspondentes foram agitadas a 37° C de um dia para o outro. Após incubação ou agitação, as amostras de curva padrão e amostras de ensaio de plasma de camundongo foram separadas em alíquotas para uma immunoplate (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)) imobilizada com Anti-Human Kappa Light Chain Antibody (Bethyl Laboratories), e isso foi deixado permanecer/agitado em temperatura ambiente por duas horas (as amostras do grupo de administração de 278-F1087 e as amostras de curva padrão de 278-F1087) ou deixado permanecer a 4° C de um dia para o outro (as amostras do grupo de administração de 278-hIgG1 e as amostras de curva padrão de 278-hIgG1). Então, Anticorpo Secundário IgG (Fc) Anti-Humano de Coelho, conjugado à Biotina (Pierce Biotechnology) e Streptavidin-Poly HRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram cada um reagidos em sucessão por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Componente HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após o término da reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), as concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base no desenvolvimento de cor através de um método para medição da absorbância a 450 nm com uma leitora de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo de concentrações de anticorpo em plasma após administração intravenosa, que foram determinadas através do método acima, é mostrado na Figura 42. O resultado demonstra que, em camundongos administrados com as variantes resultantes do aumento da ligação a FcyR de 278-IgG1 com atividade de ligação a IgE humano forte, dependente do pH, a concentração de anticorpo no plasma dos camundongos não foi significantemente reduzida comparado com aquela de 278-IgG1.

[001252] (25-4) Determinação da concentração de hIgE (Asp6) no plasma em camundongos normais

[001253] Concentrações de hIgE (Asp6) em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Amostras de curva de calibragem foram preparadas em 192, 96, 48, 24, 12, 6 e 3 ng/ml para concentrações no plasma. Para assegurar a homogeneidade do complexo imune entre anticorpo hIgE (Asp6) e anti-hIgE, no grupo administrado com 278-hIgG1, Xolair (Novartis) foi adicionado a 10 μg/ml às amostras de curva padrão e ensaio de plasma de camundongo e as misturas foram deixadas permanecer em temperatura ambiente por 30 minutos. No grupo administrado com 278-F1087, 278-F1022 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 76; cadeia leve, SEQ ID NO: 72; preparados da mesma maneira que no Exemplo 24) ou 278-F760 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 77; cadeia leve, SEQ ID NO: 72; preparado da mesma maneira que no Exemplo A5) foi adicionado a 20 μg/ml, e as misturas foram agitadas a 37° C por 60 horas. As amostras de ensaio de plasma de camundongo foram separadas em alíquotas para uma immunoplate (MABTECH) imobilizada com IgE anti-humano ou uma immunoplate (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge Nunc International)) imobilizada com IgE anti-humano (clone 107, MABTECH) e disso foi deixado permanecer ou agitar em temperatura ambiente por duas horas ou deixado permanecer a 4° C de um dia para o outro. Então, proteína de núcleo GPC3 humana (SEQ ID NO: 78), anticorpo anti-GPC3 (preparação na casa) biotinilado com NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific) e Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram cada um reagidos em sucessão por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Componente HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após o término da reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), as concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base no desenvolvimento de cor através de um método para medição da absorbância a 450 nm com uma leitora de microplaca. Alternativamente, reação cromogênica foi realizada usando como um substrato SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific), e as concentrações em plasma de camundongo foram determinadas através de um método para medição da intensidade de luminescência com uma leitora de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância ou intensidade de luminescência da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo de concentrações de hIgE (Asp6) em plasma após administração intravenosa, que foram determinadas através do método acima, é mostrado na Figura 43.

[001254] Com relação à eliminação de IgE humano sozinho, o resultado demonstra que, em camundongos administrados com IgE humano em combinação com 278-IgG1 tendo forte atividade de ligação dependente do pH, a eliminação de IgE humano foi acelerada comparado com a administração de IgE humano sozinho. Ainda, em camundongos administrados com IgE humano em combinação com 278-F1087 resultante do aumento da ligação a Fcy de 278-IgG1, a eliminação de IgE humano foi demonstrada ser significantemente acelerada comparado com os camundongos administrados com IgE humano sozinho ou IgE humano em combinação com 278-IgG1. Isto é, foi mostrado que eliminação de antígeno foi acelerada não apenas em camundongos administrados com o anticorpo anti-IL6R mencionado acima e anticorpo anti-IgA com ligação a Fcy aumentada, mas também em camundongos administrados com anticorpo anti-IgE com ligação a Fcy aumentada. A partir dos resultados obtidos até o momento nos Exemplos, eliminação de antígeno neste caso também pode ser mediada principalmente por FcyRIIb.

[001255] [Exemplo 26] Efeitos de eliminação de antígenos do plasma para moléculas de ligação a antígeno com atividade de ligação ao FcyRIIb maior do que aquela de uma região Fc de IgG de camundongo nativa

[001256] (26-1) Efeito de eliminação de antígeno de anticorpos de camundongo com atividade de ligação seletivamente aumentada ao FcyRIIb

[001257] Nos Exemplos 5 a 7, um grupo de camundongos normais administrados com uma molécula de ligação a antígeno produzida por meio de aumento da atividade de ligação ao FcyR de camundongo de uma molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de anticorpo de camundongo e tendo propriedades de ligação ao receptor de IL-6 humano dependente de pH e um grupo de camundongos deficientes em cadeia y do receptor Fc e um grupo de camundongos deficientes em FcyRIII, o qual simula a condição onde um anticorpo com atividade de ligação ao FcyRIIb seletivamente aumentada é administrado, foram examinados. A partir destes resultados, foi mostrado que moléculas de ligação a antígeno que exibem ligação dependente de pH a antígenos solúveis e tendo atividade de ligação ao FcyRIIb seletivamente aumentada são capazes de eliminar eficientemente antígenos solúveis em plasma quando administradas in vivo. Foi examinado se este efeito será observado em camundongos normais administrados com uma molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc de camundongo com atividade de ligação ao FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada e tendo propriedades de ligação ao receptor de IL-6 humano dependente de pH, conforme indicado abaixo.

[001258] (26-2) Produção de anticorpos de camundongo com atividade de ligação seletivamente aumentada ao FcgRIIb

[001259] VH3-mIgG1 (SEQ ID NO: 49) e VL3-mk1 (SEQ ID NO: 50) foram produzidos como a cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente, de um anticorpo IgG1 de camundongo tendo propriedades de ligação ao receptor de IL-6 humano dependente de pH usando o método do Exemplo de Referência 1. Além disso, para aumentar a atividade de ligação ao FcgRIIb de VH3-mIgG1, substituições de Glu por Thr na posição 230, Ala por Val na posição 231, Asn por Pro na posição 232, Glu por Ser na posição 238 e Asp por Ser na posição 239, conforme indicado pela numeração EU, foram realizadas para produzir VH3-mIgG1-MB367 (SEQ ID NO: 79). Fv4- mIgG1 ou Fv4-mIgG1-MB367 compreendendo VL3-mk1 como a cadeia leve e VH3-mIgG1 ou VH3-mIgG1-MB367, respectivamente, como a cadeia pesada, foi expresso e purificado usando o método do Exemplo de Referência 1.

[001260] (26-3) Confirmação de atividade de ligação a FcgR de camundongo

[001261] VH3/L(WT)-mIgG 1 ou VH3/L(WT)-mIgG1-MB367 compreendendo L(WT)-CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve e VH3- mIgG1 ou VH3-mIgG1-MB367, respectivamente, como a cadeia pesada, foi expresso e purificado usando o método do Exemplo de Referência 1. Atividades de ligação ao FcgR de camundongo destes anticorpos foram avaliadas por meio do método do Exemplo de Referência 2 e os resultados são mostrados na Tabela 31. Além disso, quanto a atividade de ligação ao FcgR de camundongo de cada variante é aumentada, comparado com mIgG1 antes da alteração, é mostrado na Tabela 32.

[001262] De acordo com os resultados mostrad os na Tabela 32, VH3/L(WT)-mIgG1-MB367 produzido através de introdução das cinco alterações mencionadas acima em VH3/L(WT)-mIgG1 tinha uma atividade de ligação ao FcgRIIb de camundongo que foi aumentada aproximadamente 160 vezes e atividade de ligação ao FcgRIII de camundongo que foi aumentada 6,2 vezes quando comparado com antes de alteração. Isto é, VH3/L(WT)-mIgG1-MB367 mostrou atividade de ligação seletiva e aumentada ao FcgRIIb de camundongo.

[001263] (26-4) Confirmação de efeitos de redução da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma usando camundongos normais

[001264] Efeitos de eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma de camundongos normais administrados com Fv4-mIgG1 ou Fv4-mIgG1-MB367 como o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foram examinados conforme descrito abaixo.

[001265] (26-4-1) Testes in vivo usando camundongos normais

[001266] Camundongos normais (camundongos C57BL/6J; Charles River Japan) foram coadministrados com receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano e, então, avaliados quanto à sua dinâmica in vivo. Uma solução mista de receptor de IL-6 humano solúvel e um anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano foi administrada uma vez em uma dose de 10 mL/kg na veia da cauda. Neste caso, o receptor de IL-6 humano solúvel e o anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano foram administrados em uma dose de 50 μg/kg e 1 mg/kg, respectivamente. Fv4-mIgG1 ou Fv4-mIgG1-MB367 antes mencionados foi usado como um anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano. Sangue foi coletado dos camundongos a 5 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após administração do anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente centrifugadas a 4 °C e 15.000 rpm durante 15 minutos para obter o plasma. O plasma separado foi armazenado em um congelador a -20 °C ou abaixo até medição.

[001267] (26-4-2) Determinação ELISA da concentração de anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano no plasma

[001268] A concentração de anticorpo de camundongo antirreceptor de IL-6 humano em plasma de camundongo foi determinada por ELISA. Primeiro, receptor de IL-6 solúvel humano foi separado em alíquotas sobre uma Nunc-Immuno Plate MaxiSoup (Nalge Nunc International) e deixado descansar durante a noite a 4° C para preparar uma placa com receptor de IL-6 humano solúvel imobilizado. Amostras de curva de calibragem contendo um anticorpo de camundongo antirreceptor de IL- 6 humano foram preparadas em concentrações plasmáticas de 2,50, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078 e 0,039 μg/mL e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas. 100 μL destas amostras de curva de calibração e amostras de ensaio de plasma foram divididas em alíquotas em cada cavidade da placa com receptor de IL-6 humano solúvel imobilizado e esta foi agitada em temperatura ambiente durante duas horas. Subsequentemente, a reação de desenvolvimento da cor de uma solução de reação a qual foi deixada reagir em temperatura ambiente durante duas horas com anticorpo de camundongo anti-IgG-peroxidase de camundongo (SIGMA) foi realizada usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato. Após interromper a reação mediante a adição de ácido sulfúrico a 1N (Showa Chemical), a absorbância da solução de reação em cada cavidade a 450 nm foi medida por um leitor de microplacas. A concentração de anticorpo em plasma de camundongo foi calculada com base na absorbância a partir da curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na Figura 44.

[001269] (26-4-3) Determinação da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma através de um método eletroquimioluminescente

[001270] Uma concentração de hsIL-6R no plasma de camundongo foi determinada através de um método eletroquimioluminescente. Amostras de curva de calibragem de hsIL-6R foram preparada em concentrações plasmáticas de 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,781, 0,391 e 0,195 ng/mL. Amostras de ensaio de plasma de camundongo foram preparadas por meio de diluição de 50 vezes ou maior. Anticorpo anti- IL-6R humano monoclonal (R & D), o qual tinha sido marcado com rutênio usando SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), Anticorpo anti-IL6 R humano biotinilado (R & D) e solução de tocilizumab (Chugai Pharmaceutical Co. Ltda.) foram misturados e deixados reagir durante a noite a 37 °C. Então, Streptavidin Gold Multi-ARRAY Plate (Meso Scale Discovery) foi bloqueada com solução de PBS-Tween contendo BSA a 0,5% (peso/v) a 5 °C durante a noite e a solução misturada foi colocada em alíquotas sobre a placa. Após reação adicional da placa durante duas horas em temperatura ambiente, a placa foi lavada. Então, Read Buffer T (x2) (Meso Scale Discovery) foi transformado em alíquotas na placa e medições foram realizadas imediatamente usando o SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Concentrações de hsIL-6R foram calculadas com base na resposta a partir da curva de calibragem usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na Figura 45.

[001271] Conforme mostrado na Figura 44, no grupo administrado com Fv4-mIgG1-MB367 tendo atividade de ligação ao FcgRIIb de camundongo seletivamente aumentada, embora a alteração de curso com o tempo na concentração de anticorpo no plasma fosse equivalente àquela no grupo administrado com Fv4-mIgG1, diminuição na retenção plasmática de anticorpo em virtude de aumento de atividade de ligação ao FcgRIIb de camundongo não foi observada. Entretanto, conforme mostrado na Figura 45, no grupo administrado com Fv4-mIgG1-MB367 tendo atividade de ligação ao FcgRIIb de camundongo seletivamente aumentada, a concentração plasmática de receptor de IL-6 solúvel foi acentuadamente diminuída quando comparado com aquela do grupo administrado com Fv4-mIgG1.

[001272] O acima mostrou que, quando administrado in vivo, uma molécula de ligação a antígeno a qual se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e tem atividade de ligação ao FcgRIIb seletivamente aumentada pode eliminar eficientemente antígenos solúveis no plasma em camundongos normais também. Sem estar restrito a uma teoria em particular, o fenômeno observado aqui pode ser explicado como segue.

[001273] Quando um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e tem atividade de ligação ao FcgRIIb aumentada é administrado a um camundongo, o anticorpo é ativamente captado principalmente por células que expressam FcgRIIb sobre sua membrana celular. O anticorpo internalizado dissocia do antígeno solúvel sob a condição de pH ácido no endossomo e, então, é reciclado para o plasma via FcRn. Portanto, um dos elementos que leva a um efeito de eliminação de antígenos solúveis no plasma em virtude de tal anticorpo pode incluir a intensidade de atividade de ligação ao FcgRIIb. Isto é, uma atividade de ligação ao FcgRIIb mais forte leva a uma internalização mais ativa em células que expressam FcgRIIb e antígenos solúveis no plasma podem ser rapidamente eliminados. Além disso, tais efeitos podem ser verificados de uma maneira similar, a despeito se a região Fc incluída no anticorpo é derivada de uma IgG1 humana ou uma IgG1 de camundongo, contanto que a atividade de ligação ao FcgRIIb seja aumentada. Mais especificamente, verificação pode ser realizada usando a região Fc de qualquer espécie de animal, tal como de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, IgG1 de camundongo, IgG2a de camundongo, IgG2b de camundongo, IgG3 de camundongo, IgG de rato, IgG de macaco ou IgG de coelho, contanto que a atividade de ligação primária seja aumentada para FcgRIIb da espécie de animal à qual ele é administrado.

[001274] [Exemplo de Referência 1] Construção de vetores de expressão de anticorpo e expressão e purificação de anticorpos

[001275] Síntese de genes de comprimento total que codificam as sequências de nucleotídeo da cadeia H e cadeia L das regiões variáveis de anticorpo foi realizada por meio de métodos de produção conhecidos por aqueles versados na técnica usando Assemble PCR e similares. Introdução de substituições de aminoácido foi realizada por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica usando PCR e similares. O fragmento de plasmídeo obtido foi inserido em um vetor de expressão de célula animal e o vetor de expressão de cadeia H e vetor de expressão de cadeia L foram produzidos. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão obtido foi determinada por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os plasmídeos produzidos foram introduzidos transitoriamente na linhagem de células HEK293H derivada de células de câncer de rim embriônico humano (Invitrogen) ou células FreeStyle293 (Invitrogen) para expressão de anticorpo. O sobrenadante de cultura obtido foi coletado e, então, passado através de um filtro de 0,22 μm para células FreeStyle293 (Invitrogen) para expressão de anticorpo. O sobrenadante de cultura obtido foi coletado e, então, anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura por meio de métodos conhecidos daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) ou Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para a concentração de anticorpos purificados, sua absorbância a 280 nm foi medida usando um espectrofotômetro. A partir do valor obtido, o coeficiente de extinção calculado através de métodos, tal como PACE, foi usado para calcular a concentração de anticorpo (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).

[001276] [Exemplo de Referência 2] Método de preparo de FcgR e método para análise da interação entre um anticorpo alterado e FcgR

[001277] Domínios extracelulares de FcgRs foram preparados através do método que segue. Primeiro, um gene do domínio extracelular de FcgR foi sintetizado através de um método bem conhecido daqueles versados na técnica. Neste momento, a sequência de cada FcgR foi produzida com base na informação registrada em NCBI. Especificamente, FcgR foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_000566 (Versão No. NM_000566.3), FcgRIIa foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_001136219 (Versão No. NM_001136219.1), FcgRIIb foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_004001 (Versão No. NM_004001.3). FcgRIIIa foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_001127593 (Versão No. NM_001127593.1) e FcgRIIIb foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_000570 (Versão No. NM_000570.3) e um marcador His foi preso ao terminal C. Ainda, a existência de polimorfismo é conhecida para FcgRIIa, FcgRIIIa e FcgRIIIb, e os sítios polimórficos foram produzidos através de referência a Warmerdam e outros (J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25) para FcgRIIa; Wu e outros (J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070) para FcgRIIIa; e Ory e outros (J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691) para FcgRIIIb.

[001278] Os fragmentos gênicos obtidos foram inseridos em um vetor de expressão de célula animal e vetores de expressão foram produzidos. Os vetores de expressão produzidos foram introduzidos transientemente na linhagem de células derivada de câncer de rim embriônico FreeStyle293 d (Invitrogen) para expressar as proteínas de interesse. Em relação ao FcgRIIb usado para análise cristalográfica, a proteína de interesse foi expressa na presença de Quifunesina em uma concentração final de 10 μg/ml, de modo que a cadeia de açúcar adicionada ao FcgRIIb fosse do tipo manose. As células foram cultivadas e, após coleta do sobrenadante de cultura obtido, este foi passado através de um filtro de 0,22 μm para obter o sobrenadante de cultura. Em princípio, os sobrenadantes de cultura obtidos foram purificados através das quatro etapas que seguem. As etapas realizadas foram cromatografia em coluna de troca de cátions (SP Sepharose FF) na etapa 1, cromatografia em coluna de afinidade (HisTrap HP) para marcador His na etapa 2, cromatografia em coluna de filtração em gel (Superdex200) na etapa 3 e cromatografia asséptica na etapa 4. Contudo, para FcgR, cromatografia de coluna de troca de ânion usando Q Sepharose FF foi realizada conforme na etapa 1. As proteínas purificadas foram submetidas à medições de absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro e, a partir dos valores obtidos, as concentrações das proteínas purificadas foram calculadas usando o coeficiente de absorção calculado usando métodos tal como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).

[001279] Análise de interação entre cada anticorpo alterado e o receptor FcgR mencionado acima foi realizada usando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 e Biacore 4000. O HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado como o tampão contínuo e a temperatura de medição foi ajustada a 25° C. Chips produzidos por meio de imobilização do peptídeo antigênico, Proteína A (Thermo Scientific), Proteína A/G (Thermo Scientific) e Proteína L (ACTIGEN ou BioVision) pelo método de acoplamento de amina a um Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) ou Series S sensor Chip CM4 (GE Healthcare) ou, alternativamente, chips produzidos permitindo que peptídeos antigênicos preliminarmente biotinilados interagissem com e imobilizassem sobre um Series S Sensor Chip AS (certificado) (GE Healthcare) foram usados.

[001280] Após captura de anticorpos de interesse sobre estes chips sensores, um Fcg, a quantidade ligada ao anticorpo foi medida e os anticorpos foram comparados. Contudo, uma vez que a quantidade de ligação de receptor Fcg depende da quantidade do anticorpos capturados, a quantidade de Fcg ligado foi dividida pela quantidade de cada anticorpo capturado para obter os valores corretos e estes valores foram comparados. Além disso, anticorpos capturados sobre os chips foram lavados por meio de reação com glicina 10 mM-HCl, pH de 1,5, e os chips foram regenerados e usados repetidamente

[001281] Análises cinéticas para cálculo dos valores de KD de cada anticorpo alterado para FcgR foram realizados de acordo com o método que segue. Primeiro, anticorpos de interesse foram capturados nos chips sensores mencionados acima, e um Fcg. O software Biacore Evaluation foi usado para adaptar globalmente os resultados medidos com o sensorgrama obtido usando o modelo de ligação Langmuir 1:1 e a constante de taxa de associação ka (l/mol/s) e a constante de taxa de dissociação kd (l/s) foram calculadas e, a partir destes valores, as constante de dissociação KD (mol/l) foram calculadas.

[001282] Quando a interação entre cada um dos anticorpos alterados e FcgR foi fraca e análise correta foi determinada ser impossível através do método de análise cinética mencionado acima, a KD para tais interações foi calculada usando a equação modelo de ligação 1:1 que segue descrita no Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edição AE.

[001283] O comportamento de moléculas de interação de acordo com o modelo de ligação 1:1 em Biacore pode ser descrito pela Equação 3 mostrada abaixo: Equação 3

[001284] Req: um gráfico de níveis de ligação em estado uniforme contra concentração de analito

[001285] C: concentração

[001286] RI: contribuição do índice de refrativo de massa na amostra

[001287] Rmax: capacidade de ligação de analito da superfície

[001288] Quando esta equação é rearrumada, KD pode ser expressa como Equação 2 mostrada abaixo. Equação 2

[001289] KD pode ser calculada substituindo os valores de Rmax, RI e C nesta equação. Os valores de RI e C podem ser determinados a partir do sensorgrama dos resultados de medição e das condições de medição. Rmax foi calculado de acordo com o método que segue. Como um alvo para comparação, para anticorpos que tinham interações suficientemente fortes, conforme avaliado simultaneamente no mesmo ciclo de medição, o valor Rmax foi obtido através de ajuste global usando com o modelo de ligação Langmuir 1:1 e, então, ele foi dividido pela quantidade do anticorpo de comparação capturado no sensor chip e multiplicado pela quantidade capturada de um anticorpo alterado a ser avaliado.

Claims (7)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo e veículos ou meios farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo compreende uma região variável de anticorpo e uma região constante IgG na qual o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU, em que a região variável de anticorpo tem um valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4), que é a razão de KD para o antígeno em uma condição de faixa de pH ácido para o KD em uma condição de faixa de pH neutro, de 2 ou mais, em que pelo menos um aminoácido da região variável do anticorpo foi substituído por histidina, ou pelo menos uma histidina foi inserida em uma CDR da região variável do anticorpo.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos da região constante IgG incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU: Asp na posição de aminoácido 233; Tyr na posição de aminoácido 234; Asp na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 264; Glu na posição de aminoácido 265; qualquer um dentre Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266; qualquer um dentre Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267; qualquer um dentre Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268; Asp na posição de aminoácido 269; qualquer um dentre Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272; Gln na posição de aminoácido 274; Asp ou Phe na posição de aminoácido 296; Ala ou Asp na posição de aminoácido 326; Lys ou Arg na posição de aminoácido 330; Gly na posição de aminoácido 327; Ser na posição de aminoácido 331; Thr na posição de aminoácido 332; qualquer um dentre Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333; Gln na posição de aminoácido 355; Glu na posição de aminoácido 356; Met na posição de aminoácido 358; qualquer um dentre Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396; Arg na posição de aminoácido 409; e Glu na posição de aminoácido 419.

3. Método de produção de uma molécula de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas (a) a (e) abaixo: (a) obtenção de uma região variável de anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons; (b) obtenção de um gene que codifica uma região variável de anticorpo selecionado na etapa (a); (c) ligação operativa do gene obtido na etapa (b) com um gene que codifica uma região constante IgG na qual o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU; (d) cultura de células hospedeiras contendo o gene operativamente ligado na etapa (c); e (e) isolamento de uma molécula de ligação a antígeno da solução de cultura obtida na etapa (d), em que a atividade de ligação ao antígeno da região variável de anticorpo que varia dependendo da condição de concentração de íon é definida por um ou ambos dos seguintes (a) e (b): (f) o valor de KD (Ca 3uM) / KD (Ca 2 mM), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno em uma condição de baixa concentração de íons cálcio para o KD em uma condição de alta concentração de íons cálcio, é 2 ou mais; e (g) o valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4), que é a razão de KD para o antígeno em uma condição de faixa de pH ácido para o KD em uma condição de faixa de pH neutro, é 2 ou mais.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos da região constante IgG incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU: Asp na posição de aminoácido 233; Tyr na posição de aminoácido 234; Asp na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 264; Glu na posição de aminoácido 265; qualquer um dentre Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266; qualquer um dentre Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267; qualquer um dentre Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268; Asp na posição de aminoácido 269; qualquer um dentre Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272; Gln na posição de aminoácido 274; Asp ou Phe na posição de aminoácido 296; Ala ou Asp na posição de aminoácido 326; Gly na posição de aminoácido 327; Lys ou Arg na posição de aminoácido 330; Ser na posição de aminoácido 331; Thr na posição de aminoácido 332; qualquer um dentre Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333; Gln na posição de aminoácido 355; Glu na posição de aminoácido 356; Met na posição de aminoácido 358; qualquer um dentre Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396; Arg na posição de aminoácido 409; e Glu na posição de aminoácido 419.

5. Método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas (a) a (e) abaixo: (a) obtenção de uma região variável de anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons; (b) obtenção de um gene que codifica uma região variável de anticorpo selecionado na etapa (a); (c) ligação operativa do gene obtido na etapa (b) com um gene que codifica uma região constante IgG na qual o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly, conforme indicado pela numeração EU; (d) cultura de células hospedeiras contendo o gene operativamente ligado na etapa (c); e (e) isolamento de uma molécula de ligação a antígeno da solução de cultura obtida na etapa (d), em que a atividade de ligação ao antígeno da região variável de anticorpo que varia dependendo da condição de concentração de íon é definida por um ou ambos dos seguintes (a) e (b): (a) o valor de KD (Ca 3uM) / KD (Ca 2 mM), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno em uma condição de baixa concentração de íons cálcio para o KD em uma condição de alta concentração de íons cálcio, é 2 ou mais; e (b) o valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4), que é a razão de KD para o antígeno em uma condição de faixa de pH ácido para o KD em uma condição de faixa de pH neutro, é 2 ou mais.

6. Método de produção de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos da região constante IgG incluem qualquer um ou mais dos seguintes aminoácidos indicados pela numeração EU: Asp na posição de aminoácido 233; Tyr na posição de aminoácido 234; Asp na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 264; Glu na posição de aminoácido 265; qualquer um dentre Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266; qualquer um dentre Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoácido 267; qualquer um dentre Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 268; Asp na posição de aminoácido 269; qualquer um dentre Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro e Gln na posição de aminoácido 272; Gln na posição de aminoácido 274; Asp ou Phe na posição de aminoácido 296; Ala ou Asp na posição de aminoácido 326; Gly na posição de aminoácido 327; Lys ou Arg na posição de aminoácido 330; Ser na posição de aminoácido 331; Thr na posição de aminoácido 332; qualquer um dentre Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333; Gln na posição de aminoácido 355; Glu na posição de aminoácido 356; Met na posição de aminoácido 358; qualquer um dentre Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396; Arg na posição de aminoácido 409; e Glu na posição de aminoácido 419.

7. Método como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de anticorpo é uma região variável de anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das condições de concentração de íons de cálcio, ou uma região variável de anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno varia de modo que a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de baixa concentração de íons de cálcio é menor do que uma atividade de ligação a antígeno sob uma condição de alta concentração de íons de cálcio.

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