MX2013002336A - Liposomas pegilados para la liberacion de arn de codificacion de inmunogeno. - Google Patents

Liposomas pegilados para la liberacion de arn de codificacion de inmunogeno.

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Abstract

La presente invención se relaciona con la inmunización de ácidos nucleicos que se logra liberando el ARN encapsulado dentro de un liposoma PEGilatado. El ARN codifica un inmunógeno de interés. El PEG tiene una masa molecular promedio de entre 1 kDa y 3 kDa. De esta manera, la invención proporciona un liposoma que tiene una bicapa de lípido que encapsula un centro acuoso, en donde: (i) la bicapa de lípido comprende por lo menos un lípido que incluye un radical de polietilenglicol, de modo que el polietilenglicol está presente en el exterior del liposoma, en donde la masa molecular promedio del polietilenglicol está entre 1 kDa y 3 kDa; y (ii) el centro acuoso incluye un ARN que codifica un inmunógeno. Estos liposomas son apropiados para la liberación in vivo del ARN a una célula de vertebrado y, de esta manera, son útiles como componentes en las composiciones farmacéuticas para inmunizar pacientes contra diferentes enfermedades.

Description

LIPOSOMAS PEGILADOS PARA LA LIBERACION DE ARN DE CODIFICACION DE INMUNOGENO CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con el campo de la liberación no viral de ARN para inmunización.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La liberación de ácidos nucleicos para inmunizar animales ha sido un objetivo durante muchos años. Se han probado varios métodos, que incluyen el uso de ADN o ARN, de vehículos de liberación virales y no virales (o incluso un vehículo de no liberación, en una vacuna "desnuda") de vectores de replicación o no replicación, o de vectores virales y no virales .
Hay una necesidad de vacunas de ácidos adicionales y mejoradas y, en particular, de maneras mejoradas para liberar vacunas de ácidos nucleicos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De acuerdo con la invención, la inmunización de ácidos nucleicos se logra liberando el ARN encapsulado dentro de un liposoma. El ARN codifica un inmunógeno de interés. El liposoma incluye un lípido PEGilado, es decir, el lípido se modifica por la unión covalente de un polietilenglicol . El PEG proporciona los liposomas con un recubrimiento que puede conferir características farmacocinéticas favorables, por Ref.: 239595 ejemplo, puede aumentar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Los inventores han encontrado que la longitud del PEG puede afectar la expresión in vivo del ARN encapsulado y, de esta manera, la invención usa los liposomas que comprenden PEG, el cual tiene una masa molecular promedio de entre 1 kDa y 3 kDa. El PEG con un peso molecular menor (por ejemplo, 500 ó 750 Da) no forma liposomas estables.
De esta manera, la invención proporciona un liposoma dentro del cual está encapsulado el ARN que codifica un inmunógeno de interés, en donde el liposoma comprende por lo menos un lípido que incluye un radical de polietilenglicol , de modo que el polietilenglicol está presente en el exterior del liposoma, en donde la masa molecular promedio del polietilenglicol está entre 1 kDa y 3 kDa. Estos liposomas son apropiados para la liberación in vivo del ARN a una célula de vertebrados y, de esta manera, son útiles como componentes en las composiciones farmacéuticas para inmunizar a los pacientes contra diferentes enfermedades.
La invención también proporciona un proceso para preparar un liposoma que contiene ARN, que comprende una etapa de mezclar el ARN con uno o más lípidos, bajo condiciones de forma que los lípidos formen un liposoma, en el que el ARN está encapsulado, en donde por lo menos un lípido incluye un radical de polietilenglicol que llega a localizarse en el exterior del liposoma durante el proceso, y en donde la masa molecular promedio del polietilenglicol está entre 1 kDa y 3 kDa.
El liposoma La invención usa liposomas dentro de los cuales está encapsulado en ARN que codifica el inmunógeno. De esta manera, el ARN (como en un virus natural) se separa de cualquier medio externo. La encapsulación dentro del liposoma se ha encontrado que protege el ARN de la digestión de RNasa. Los liposomas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo, sobre su superficie) , pero por lo menos la mitad del ARN (e idealmente todo éste) está encapsulado en el centro del liposoma. La encapsulación dentro de los liposomas es distinta de, por ejemplo, los complejos de lípido/ARN descritos en la referencia 1, en donde el ARN se mezcla con los liposomas pre-formados .
Diferentes lípidos anfifílicos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un centro acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo de cabeza hidrofílico aniónico, catiónico o zwiteriónico . La formación de los liposomas de fosfolípidos aniónicos data nuevamente de 1960, y los lípidos que forman liposomas catiónicos se han estudiado desde 1990. Algunos fosfolípidos son aniónicos, mientras que otros son zwiteriónicos y otros son catiónicos. Las clases apropiadas de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas , fosf tidilcolinas , fosfatidilserinas y fosfatidil-gliceroles y algunos fosfolípidos útiles se listan en la Tabla 1. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP) , 1, 2-disteariloxi-N, -dimetil-3 -aminopropano (DSDMA) , 1, 2 -dioleiloxi-N, -dimetil-3 -aminopropano (DODMA) , 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA) , 1,2-dilinoleniloxi-N, -dimetil-3 -aminopropano (DLenDMA) . Los lípidos zwiteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos zwiteriónicos de acilo y lípidos zwiteriónicos de éter. Ejemplos de los lípidos zwiteriónicos útiles son DPPC, DOPC, DSPC, dodecilfosfocolina, 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE) y 1 , 2 -difitanoil- sn-glicero- 3 -fosfoetanolamina (DPyPE) . Los lípidos pueden ser saturados o insaturados . Se prefiere el uso de por lo menos un lípido saturado para preparar los liposomas. Si un lípido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas, o puede tener una cola saturada y una cola insaturada. Un lípido puede incluir un grupo esteroide en una cola, por ejemplo, como en RV05.
De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona un liposoma que tiene una bicapa de lípido que encapsula un centro acuoso, en donde: (i) la bicapa de lípido comprende por lo menos un lípido que incluye un radical de polietilenglicol, de modo que el polietilenglicol está presente en el exterior del liposoma, en donde la masa molecular promedio del polietilenglicol es entre 1 kDa y 3 kDa y (ii) el centro acuoso incluye un ARN que codifica un inmunógeno .
Los liposomas de la invención pueden formarse de un lípido simple o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos, (ii) una mezcla de lípidos catiónicos, (iii) una mezcla de lípidos zwiteriónicos , (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos, (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwiteriónicos, (vi) una mezcla de lípidos zwiteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwiteriónicos. De manera similar, una mezcla puede comprender ambos lípidos saturados e insaturados . Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwiteriónico, saturado, DlinDMA (catiónico, insaturado) y/o DMG (aniónico, saturado) . Cuando se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes en la mezcla necesitan ser anfifílicos, por ejemplo, puede mezclarse uno o más lípidos anfifílicos con colesterol.
Cuando un liposoma de la invención se forma de una mezcla de lípidos, se prefiere que la proporción de los lípidos que son PEGilados, como se describe en la presente, sea menor de 10% de la cantidad total de los lípidos, por ejemplo, entre 0.5-5%, entre 1-4%, o aproximadamente 2%. Por ejemplo, los liposomas útiles se muestran a continuación, en los que 2% del lípido total es un PEG-DMG. El resto puede hacerse de*, por ejemplo, colesterol (por ejemplo, 35-50% de colesterol) y/o lípido catiónico (por ejemplo, 30-70%) y/o DSPC (por ejemplo, 5-15%) . Estas mezclas se usan a continuación. Estos valores del porcentaje son porcentajes en mol .
De esta manera, un liposoma puede formarse de un lípido catiónico (por ejemplo, DlinDMA, RV05) , un lípido zwiteriónico (por ejemplo, DSPC, DPyPE) , un colesterol y un lípido PEGilatado. Se usa una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol en los ejemplos, así como diferentes mezclas adicionales .
Por lo menos un lípido dentro del liposomas incluye un radical de polietilenglicol . Los liposomas que incluyen estos lípidos PEGilados tendrán el PEG orientado, de modo que está presente en por lo menos el exterior del liposoma (pero algo del PEG también puede ser expuesto al interior del liposoma, es decir, al centro acuoso) . Esta orientación puede lograrse unión el PEG a una parte apropiada del lípido. Por ejemplo, en un lípido anfifílico, el PEG sería unido a la cabeza hidrofílica, ya que es esta cabeza la que se orienta al exterior de la cara acuosa de la bicapa de lípido. De esta manera, la PEGilacion puede lograrse por el enlace covalente de un PEG a un lípido, por ejemplo, usando las técnicas, tales como las descritas en la referencia i y ii .
De esta manera, los lípidos PEGilados comprenderán la estructura de PEG: en donde n proporciona un peso molecular para el PEG de entre l kDa y 3 kDa, por ejemplo, entre 23 y 68, o aproximadamente 45 para una PEGilación de 2 kDa (por ejemplo, ver la FIG. 16) .
El radical de PEG puede terminar con un grupo -O-metilo, y, de esta manera un lípido PEGilatado puede comprender: Incluyendo la unión a un nitrógeno en un grupo de cabeza de lípido, por lo tanto, un lípido PEGilatado útil con la invención puede comprender: Un lípido PEGilatado apropiado para el uso con la invención es PEG-DMG, como se usa en los ejemplos. Las Figuras 17A a 17E muestran lípidos PEGilados útiles adicionales. También puede usarse colesterol PEGilatado. Otros lípidos PEGilados pueden usarse, por ejemplo, los lípidos de la Fórmula (X) : en donde : Z es un componente de grupo de cabeza hidrofílica seleccionado de PEG y polímeros a base de poli (oxazolina) , poli (óxido de etileno) , poli (alcohol vinílico) , poli (glicerol) , poli (N-vinilpirrolidona) , poli [N- (2-hidroxipropil) metacrilamida] y poli (aminoácido) s , en donde el polímero puede ser lineal o ramificado, y en donde el polímero puede ser opcionalmente sustituido; Z se polimeriza por n subunidades; n es un grado promediado ponderal de polimerización entre 10 y 200 unidades de Z (y puede optimizarse para diferentes grupos Z) ; Li es un alquileno Ci-io opcionalmente sustituido o enlazador de heteroalquileno Ci-i0 que incluye cero, uno o dos de un éter (por ejemplo, -0-), éster (por ejemplo, -C(O)O-), succinato (por ejemplo, -O (O) C-CH2-CH2-C (0) 0- ) ) , carbamato (por ejemplo, -OC (O) -NR' - ) , carbonato (por ejemplo, -OC(0)0-), urea (por ejemplo, -NRC (0) R' - ) , amina (por ejemplo, -NR' -), amida (por ejemplo, -C(0)NR'-), imina (por ejemplo, C(NR')-), tioéter (por ejemplo, -S-) , xantato (por ejemplo, -OC(S)S-) y fosfodiéster (por ejemplo, -OP(0)2O-), en donde R' se selecciona independientemente de -H, -NH- , -NH2, -O-, -S-, un fosfato o un alquileno Ci_i0 opcionalmente sustituido; Xx y ?2 se seleccionan independientemente de un carbono o un heteroátomo seleccionado de -NH- , -O-, -S- o un fosfato; Ai y A2 se seleccionan independientemente de un alquilo C6-3o, alquenilo C6_30 y alquinilo C6-30, en donde Ax y A2 pueden ser el mismo o diferente, o Ai y A2 junto con el átomo de carbono al que se enlazan forman un esteroide opcionalmente sustituido .
Un liposoma de la invención incluirá típicamente un gran número de radicales de PEG, los cuales pueden ser el mismo o diferente. La masa molecular promedio del PEG en un liposoma de la invención está entre 1 kDa y 3 kDa, por ejemplo, entre 1.5-2.5 kDa, entre 1.7-2.3 kDa, entre 1.8-2.2 kDa, entre 1.9-2.1 kDa ó 2 kDa. De esta manera, el PEG puede ser un PEG que se conoce comúnmente como "PEG 2000" o "PEG 2k" , aunque también pueden usarse "PEG 1000" más corto y "PEG 3000" más largo .
El PEG comprenderá usualmente cadenas poliméricas lineales pero, en algunas modalidades, el PEG puede comprender cadenas poliméricas ramificadas.
También es posible que una molécula de lípido simple incluya más de un grupo PEG, por ejemplo, unido a diferentes átomos de carbono en un grupo de cabeza de lípido (por ejemplo ver la Figura 18) . En estas circunstancias, la referencia a la masa molecular de PEG en un liposoma es la masa molecular por molécula de lípido en lugar de por sustituyente de PEG. De esta manera, en un liposoma en el que el único lípido PEGilatado tiene la estructura mostrada en la Figura 18, en donde el peso molecular en el cuadro es de 2 kDa y se forma de dos cadenas de 1 kDa cada una, la masa molecular promedio del PEG es 2 kDa no de 1 kDa.
En algunas modalidades, el PEG puede ser un PEG sustituido, por ejemplo, en el que uno o más átomos de carbono en el polímero se sustituye por uno o más grupos alquilo, alcoxi, acilo o arilo.
En algunas modalidades, el PEG puede incluir grupos de copolímeros, por ejemplo, uno o más monómeros de propileno, para formar un polímero de polipropileno PEG.
Como una alternativa para la PEGilación, un lípido puede modificarse por un enlace covalente de un radical diferente de PEG. Por ejemplo, en algunas modalidades, un lípido puede incluir un polifosfaceno . En algunas modalidades, un lípido puede incluir una poli (vinil pirrolidona) . En algunas modalidades, un lípido puede incluir una poli(acril amida). En algunas modalidades, un lípido puede incluir una poli (2-metil-2-oxazolina) . En algunas modalidades, un lípido puede incluir una poli (2-etil-2-oxazolina) . En algunas modalidades, un lípido puede incluir un fosfatidil poliglicerol . En algunas modalidades, un lípido puede incluir un poli [N- (2-hidroxipropil) metacrilamida] . En algunas modalidades, un lípido puede incluir un polímero de polialquilen éter, diferente de PEG.
Los liposomas se dividen usualmente en tres grupos: vesículas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés) ; vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) ; y vesículas unilamelares grandes (LUV, por sus siglas en inglés) . Las MLVs tienen bicapas múltiples en cada vesícula, formando varios compartimientos acuosos separados. Las SUVs y LUVs tienen una bicapa simple que encapsula un centro acuoso; las SUVs tienen típicamente un diámetro =50 nm, y las LUVs tienen un diámetro de >50 nm. Los liposomas de la invención son idealmente LUVs con un diámetro en el intervalo de 60-180 nm, y de preferencia en el intervalo de 80-160 nm.
Un liposoma de la invención puede ser parte de una composición que comprende una pluralidad de liposomas, y los liposomas dentro de la pluralidad pueden tener un intervalo de diámetros. Para una composición que comprende una población de liposomas con diferentes diámetros: (i) por lo menos 80% ponderal de los liposomas deberían tener diámetros en el intervalo de 60-180 nm, y de preferencia, en el intervalo de 80-160 nm, y/o (ii) el diámetro promedio (por intensidad, por ejemplo, Z-promedio) de la población es idealmente en el intervalo de 60-180 nm, y de preferencia en el intervalo de 80-160 nm. Los diámetros dentro de la pluralidad deberían tener idealmente un índice de polidispersidad <0.2. Los complejos de liposoma/ARN de la referencia 1 se espera que tengan un diámetro en el intervalo de 600-800 nm y que tengan una alta polidispersidad.
Las técnicas para preparar los liposomas apropiadas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, ver las referencias 4 a 6. Un método útil se describe en la referencia 7 e involucra mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos (ii) una solución acuosa de ácido nucleico y (iii) amortiguador, seguido de mezclado, dilución de equilibrio, dilución y purificación. Los liposomas preferidos de la invención se obtienen por este proceso de mezclado.
Para obtener los liposomas con los diámetros deseados, el mezclado puede realizarse usando un proceso en el que dos corrientes de alimentación de solución de ARN acuoso se combinan en una zona de mezclado simple, con una corriente de una solución de lípido etanólico, a la misma velocidad de flujo, por ejemplo, en un canal microfluídico, como se describe a continuación.
El ARN Los liposomas de la invención incluyen una molécula de ARN que (a diferencia de siARN, como en la referencia 2) codifica un inmunógeno. Después de la administración in vivo de las partículas, el ARN se libera de las partículas y se traduce dentro de una célula para proporcionar el inmunógeno in situ.
El ARN se hebra +, y de esta manera, puede traducirse por las células sin la necesidad de intervenir las etapas de replicación, tales como transcripción inversa. También puede unirse a los receptores de TLR7 expresados por las células inmunes, por lo que se inicia un efecto adyuvante.
Los ARNs de hebra + preferidos son auto-replicados. Una molécula de ARN de auto-replicación (replicón) puede, cuando se libera a una célula de vertebrados, aun sin ningunas proteínas, conducir a la producción de ARNs hijos por transcripción del mismo (por medio de una copia antisentido que se genera de sí mismo) . De esta manera, una molécula de ARN de auto-replicación es típicamente de una molécula de hebra + que puede traducirse directamente después de la liberación a una célula, y esta traducción proporciona una polimerasa de ARN dependiente de ARN que luego produce las transcripciones antisentido y sentido del ARN liberado. De esta manera, el ARN liberado conduce a la producción de ARNs hijos múltiples. Estos ARNs hijos, así como transcripciones subgenómicas colineales, pueden traducirse por sí mismos para proporcionar la expresión in situ de un inmunógeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar transcripciones adicionales con el mismo sentido, como el ARN liberado que se traduce para proporcionar la expresión in situ del inmunógeno. El resultado global de esta secuencia de transcripciones es una amplificación enorme en el número de los AR s de replicón introducido, de modo que el inmunógeno codificado llega a ser un producto polipeptídico principal de las células.
Un sistema apropiado para lograr la auto-replicación es usar un replicón de ARN a base de alfavirus. Estos replicones de hebra + se traducen después de la liberación a una célula para dar una replicasa (o replicasa-transcriptasa) . La replicasa se traduce como una poliproteína que auto-escinde un complejo de replicación que crea copias de hebra - del ARN liberado de hebra +. Estas transcripciones de hebra - pueden transcribirse para dar copias adicionales de ARN padre de hebra + y también para dar una transcripción subgenómica que codifica el inmunógeno. De esta manera, la traducción de la transcripción subgenómica conduce a la expresión in situ del inmunógeno por la célula infectada. Los replicones de alfavirus apropiados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus forestal Semliki, un virus de encefalitis de equino oriental, un virus de encefalitis de equino Venezolano, etc. Se han usado en replicones las secuencias de virus imitantes o de tipo silvestre pueden usarse, por ejemplo, la mutante TC83 atenuada de VEEV [8] .
De esta manera, la molécula de ARN de auto-replicación preferida codifica (i) una polimerasa de ARN dependiente de ARN que puede transcribir el ARN de la molécula de ARN de auto-replicación y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más de las proteínas de alfavirus nsPl, nsP2, nsP3 y nsP4.
Mientras que los genomas de alfavirus naturales codifican las proteínas de viriones estructurales además de la poliproteína de replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN de auto-replicación de la invención no codifique las proteínas estructurales de alfavirus. De esta manera, un ARN de auto-replicación preferido puede conducir a la producción de copias de ARN genómico del mismo en una célula, pero no a la producción de los viriones que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN de auto-replicación non puede perpetuar por sí misma en la forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en los virus de tipo silvestre están ausentes de los ARNs de auto-replicación de la invención y su lugar se toma por el gene(s) que codifican el inmunógeno de interés, de modo que la transcripción subgenómica codifica el inmunógeno en lugar de las proteínas de viriones de alfavirus estructurales.
De esta manera, una molécula de ARN de auto-replicación útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abierta. El primer marco de lectura abierto (5') codifica una replicasa; el segundo marco de lectura abierto (3') codifica un inmunógeno. En algunas modalidades, el ARN puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo, en la dirección 3', por ejemplo, para codificar inmunógenos adicionales (ver a continuación) o para codificar polipéptidos accesorios.
Una molécula de ARN de auto-replicación puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
Las moléculas de ARN de auto-replicación pueden tener longitudes de viriones, pero son típicamente nucleótidos de 5000-25000 de largo, por ejemplo, nucleótidos de 8000-15000 o nucleótidos de 9000-12000. De esta manera, el ARN es mayor que el observado en la liberación de siRNA.
Una molécula de ARN útil con la invención puede tener una tapa 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina) . Esta tapa puede mejorar la traducción in vivo del ARN.
El nucleótido 5' de una molécula de ARN útil con la invención puede tener un grupo trifosfato 5' . En un ARN de tapa éste puede enlazarse a una 7-metilguanosina por medio de un puente 5' a 5' . Un trifosfato 5' puede mejorar la unión RIG-I y, de esta manera, promover efectos adyuvantes.
Una molécula de ARN puede tener una cola de poli-A 3'. También puede incluir una secuencia de reconocimiento de poli-A polimerasa (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3' .
Una molécula de ARN útil con la invención será típicamente de hebra simple. Los ARNs de hebra simple puede iniciar generalmente un efecto adyuvante uniendo a las helicasas TLR7, TLR8 , AR A y/o PKR. El ARN liberado en la forma de hebra doble (ARNds) puede unir a TLR3 , y este receptor también puede desencadenarse por el ARNds que se forma ya sea durante la replicación de un ARN de hebra simple o dentro de la estructura secundaria de un ARN de hebra simple .
Una molécula de ARN útil con la invención, puede prepararse convenientemente por transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) . La IVT puede usar un molde (ADNc) creado y propagado en la forma de plásmido en bacterias, o creado sintéticamente (por ejemplo, por los métodos de ingeniería de síntesis génica y/o reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) ) . Por ejemplo, una polimerasa de ARN dependiente de ADN (tal como el bacteriófago T7, T3 o polimerasa SP6 ARN) puede usarse para transcribir el ARN de un molde de ADN. La tapa apropiada y las reacciones de adición poli-A pueden usarse conforme se requiera (aunque el poli-A del replicón se codifica usualmente dentro del molde de ADN) . Estas polimerasas de ARN pueden tener requerimientos estrictos para el nucleótido 5' transcripto y, en algunas modalidades, estos requerimientos deben igualarse con los requerimientos de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN IVT-transcrito pueda funcionar eficientemente como un sustrato para su replicasa auto-codificada.
Como se describe en la referencia 9, el ARN de auto-replicación puede incluir (además de cualquiera estructura de tapa 5') uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada. De esta manera, el ARN puede comprender m5C (5-metilcitidina) , m5U (5-metiluridina) , m6A (N6-metiladenosina) , s2U (2-tiouridina) , Um (2 ' -O-metiluridina) , mlA (1-metiladenosina) m2A (2-metiladenosina) ; Am (2'-0-metiladenosina) ; ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina) ; i6A (N6-isopenteniladenosina) ; ms2i6A (2-metiltio- N6isopenteniladenosina) ; io6A (N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; ms2io6A (2-metiltio-N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina) ; t6A (N6-treonil carbamoiladenosina) ; ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina) ; m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina) ; hn6A (N6. -hidroxinorvalilcarbamoil adenosina) ; ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-0-ribosiladenosina (fosfato) ) ; I (inosina) ; mil (1-metilinosina) ; m'Im (1, 2 ' -O-dimetilinosina) ; m3C (3-metilcitidina) ; Cm (2T-0-metilcitidina) ; s2C (2-tiocitidina) ; ac4C (N4 -acetilcitidina) ; f5C ( 5 - fonilcitidina) ; m5Cm (5,2-0-dimetilcitidina) ; ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina) ; k2C (lisidina) ; mlG (1-metilguanosina) ; m2G (N2-metilguanosina) ; m7G (7-metilguanosina) ; Gm (2 ' -O-metilguanosina) ; m22G (N2,N2-dimetilguanosina) ; m2Gra (N2 , 2 ' -O-dimetilguanosina) ; m22Gm (N2 , N2 , 2 ' -O-trimetilguanosina) ; Gr(p) (2'-0-ribosilguanosina (fosfato) ) y (wibutosina) ; o2yW (peroxiwibutosina) ; OHyW (hidroxiwibutosine) ; OHyW* (hidroxiwibutosina submodificada) ; imG (wiosina) ; mirnG (metilguanosina) ; Q (queuosina) ; oQ (epoxiqueuosina) ; galQ (galtactosil-queuosina) ; manQ (manosil-queuosina) preQo (7-ciano-7-desazaguanosina) ; preQi (7-aminometil-7-desazaguanosina) G* (arcaeosina) ; D (dihidrouridina) m5Um (5, 2' -O-dimetiluridina) ; s4U (4 -tiouridina) ; m5s2U (5-metil-2 -tiouridina) ; s2Um (2-tio-2 ' -O-metiluridina) acp3U (3-(3-amino-3 -carboxipropil) uridina) ; ho5U (5-hidroxiuridina) ; mo5U (5-metoxiuridina) ; cmo5U (ácido uridin 5-oxiacético) mcmo5U (metil éster del ácido uridin 5-oxiacético) ; chm5U (5-(carboxihidroximetil) uridina) ) ; mchmSU (metil éster de 5-(carboxihidroximetil) uridina) ; mcm5U (5 -metoxicarbonil metiluridina) ; mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-0-metiluridina) ; mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina) ; nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina) ; mnm5U (5-metilaminometiluridina) ; mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina) ; mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina) ; ncm5U (5-carbamoilmetil uridina) ; ncm5Um (5-carbamoilmetil-2 ' -O-metiluridina) ; cmnm5U ( 5 -carboximetilaminometiluridina) ; cnmm5Um (5-carboximetilaminometil-2-L-0-metiluridina) ; cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina) ; m62A (N6 , 6-dimetiladenosina) ; Tm (2 ' -O-metilinosina) ; m4C (N4-metilcitidina) ; m4Cm (N4 , 2 -O-dimetilcitidina) ; hm5C (5-hidroximetilcitidina) ; m3U (3 -metiluridina) ; cm5U (5-carboximetiluridina) ; m6Am (N6 , T-O-dimetiladenosina) ; rn62Am (N6 , 6 , 0-2-trimetiladenosina) ; m2'7G (N2 , 7-dimetilguanosina) ; m2'2'7G (N2,N2, 7-trimetilguanosina) ; m3Um (3,2T-0-dimetiluridina) ; m5D (5-metildihidrouridina) ; f5Cm (5-formil-2 ' -O-metilcitidina) ; mlGm ( 1 , 2 ' -O-dimetilguanosina) ; m'Am (1 , 2-0-diraetil adenosina) irinometiluridina) ; tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina) ) ; imG-14 (4-demetil guanosina) ; imG2 (isoguanosina) ; o ac6A (N6 -acetiladenosina) , hipoxantina, inosina, 8 -oxo-adenina, derivados 7 sustituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2 -tiouracilo, 4- tiouracilo, 5-aminouracilo, 5- (C1-C6 ) -alquiluracilo, 5-metiluracilo, 5- (C2-C6) -alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5- (hidroximetil) uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5- (C1-C6) -alquilcitosina, 5-metilcitosina, 5- (C2-C6) -alquenilcitosina, 5- (C2-C6) -alquinilcitosina, 5 -clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-desazaguanina, 8 -azaguanina, guanina 7-desaza-7-sustituida, 7-desaza-7- (C2-C6) lquinilguanina, guanina 7-desaza-8-sustituida, 8 -hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2- aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2, 4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, desazapurina 7-sustituida, purina 7-desaza-7-sustituida, purina 7-desaza-8-sustituida, o un nucleótido abásico. Por ejemplo, un ARN de auto-replicación puede incluir uno o más nucleobases de pirimidina modificada, tales como residuos de pseudouridina y/o 5-metilcitosina. En algunas modalidades, sin embargo, el ARN incluye nucleobases no modificadas, y puede incluir nucleótidos no modificados es decir, todos los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos de A, C, G y U estándares (excepto para cualquier estructura de tapa 5', la cual puede incluir una 7 ' -metilguanosina) . En otras modalidades, el ARN puede incluir una tapa 5' que comprende una 7 ' -metilguanosina, y los primeros 1, 2 ó 3 5' ribonucleótidos pueden metilarse en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención incluye idealmente sólo enlaces fosfodiéster entre los nucleósidos, pero en algunas modalidades, puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato .
De manera ideal, un liposoma incluye menos de 10 diferentes especies de ARN, por ejemplo, 5, 4, 3, ó 2 diferentes especies; más preferentemente, un liposoma incluye una especie de ARN simple, es decir, todas las moléculas de ARN en el liposoma tienen la misma secuencia y la misma longitud.
La cantidad de ARN por liposoma puede variar. El número de moléculas de ARN de auto-replicación individual por liposoma es típicamente =50, por ejemplo, <20, <10, <5 ó 1-4 por liposoma.
El inmunógeno Las moléculas de ARN usadas con la invención codifican un inmunógeno polipeptídico. Después de la administración de los liposomas, el ARN se traduce in vivo y el inmunógeno puede provocar una respuesta inmune en el destinatario. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito (o, en algunas modalidades, contra un alérgeno; y en otras modalidades, contra un antígeno de tumor) . La respuesta inmune puede comprender una respuesta de anticuerpo (que incluye usualmente IgG) y/o una respuesta inmune mediada por células. El inmunógeno polipeptídico provocará típicamente una respuesta inmune que reconoce el polipéptido bacteriano, viral, fúngico o parásito correspondiente (o alérgeno o tumor) , pero en algunas modalidades, el polipéptido puede actuar como un mimótopo para provocar una respuesta inmune que reconoce un sacárido bacteriano, viral, fúngico o parásito. El inmunógeno será típicamente un polipéptido superficial, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, un glucoproteína envuelta, una glucoproteína espicular, etc.
La molécula de ARN puede codificar un inmunógeno polipeptídico simple o polipéptidos múltiples. Los inmunógenos múltiples pueden presentarse como un inmunógeno polipeptídico simple (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados de un replicón, entonces pueden proporcionarse uno o más de éstos con una IRES en la dirección 5' o un elemento promotor viral adicional. De manera alternativa, los inmunógenos múltiples pueden expresarse de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados a una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo, proteína 2A del virus de pie y boca) o como inteínas .
A diferencia de las referencias 1 y 10, el AR codifica un inmunógeno. Para evitar dudas, la invención no abarca un ARN que codifica una luciferasa de luciérnaga o que codifica una proteína de fusión de ß-galactosidasa de E. coli o que codifica una proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) . Estos polipéptidos pueden ser útiles como marcadores, o incluso en un contexto de terapia de gen, pero la invención se relaciona con la liberación de ARN para provocar un sistema de respuesta inmunológico . De esta manera, el inmunógeno tampoco es una auto-proteína que se libera al suplemento o sustituto para una proteína huésped defectuosa (como en una terapia de gen) . También, el ARN no es ARN de timo de ratón total .
En algunas modalidades, los inmunógenos provocan una respuesta inmune contra una de estas bacterias: Neisseria meningitidis: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas de membrana, tales como adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición dé hierro y proteína de unión de factor H. Una combinación de los tres polipéptidos útiles se describe en la referencia 11.
Streptococcus pneumoniae : los inmunógenos polipeptídicos útiles se describen en la referencia 12. Éstos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad pili RrgB, el precursor beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057) , spr0096, proteína de resistencia general GSP-781 (spr2021, SP2216) , cinasa StkP de serina/treonina (SP1732) y adhesina de superficie neumocócica PsaA.
Streptococcus pyogenes: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 13 y 14.
Moraxella catarrhalis .
Bordetella pertussis : los inmunógenos de pertussis útiles incluyen, pero no se limitan a, la toxina o toxoide de pertussis (PT) , hemaglutinina filamentosa (FHA) , pertactina y aglutinógenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 15, tales como una hemolisina, esxA, esxB, proteína de unión de ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína staOll .
Clostridium tetani: el inmunógeno típico es el toxoide de tétanos .
Cornynebacterium diphtheriae : el inmunógeno típico es el toxoide de difteria.
Haemophilus influenzae : Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 16 y 17.
Pseudomonas aeruginosa Streptococcus agalactiae: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencias 13.
Chlamydia trachomatis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA y MurG (por ejemplo, como se describe en la referencia 18. LcrE [19] y HtrA [20] son dos inmunógenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 21.
Helicobacter pylori: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, CagA, VacA, NAP y/o ureasa [22] .
Escherichia coli: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan . a, inmunógenos derivados de E. coli enterotoxigénica (ETEC) , E. coli enteroagregativa (EAggEC) , E. coli de adherencia difusamente (DAEC) , E. coli enteropatogénica (EPEC) , E. coli patogénica extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC) . Las cepas de ExPEC incluyen E.coli uropatogénica (UPEC) y E. coli asociada con meningitis/sepsis (MNEC) . Los inmunógenos polipeptídicos de UPEC útiles se describen en las referencias 23 y 24. Los inmunógenos de MNEC útiles se describen en la referencias 25. Los inmunógenos útiles para varios tipos de E. coli es AcfD [26] .
Bacillus anthracis Yersinia pestis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las referencias 27 y 28. Staphylococcus epidermis Clostridium perfringens o Clostridium botulinums Legionella pneumophila Coxiella burnetii Brucella, tales como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae .
Francisella, tales como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis .
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Haemophilus ducreyi Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium Staphylococcus saprophyticus Yersinia enterocolitica Mycobacteriu tuberculosis Rickettsia Listeria monocytogenes Vibrio cholerae Salmonella typhi Borrelia burgdorferi Porphyromonas gingivalis Klebsiella En algunas modalidades, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra uno de estos virus: Orthomyxovirus: Los inmunógenos útiles puede ser de un virus de influenza A, B o C, tales como las proteínas M2 de hemaglutinina, neuraminidasa o matriz. Cuando el inmunógeno es una hemaglutinina del virus de influenza A, puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12 , H13 , H14 , H15 o H16.
Virus de Paramyxoviridae: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Pneumoviruses (por ejemplo virus sincitial respiratorio (RSV) , Rubulaviruses (por ejemplo, virus de paperas) , Paramyxoviruses (por ejemplo, virus de parainfluenza) , Metapneumoviruses y Morbilliviruses (por ejemplo, virus de sarampión) .
Poxviridae: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Orthopoxvirus, tales como Varióla vera, que incluyen, pero no se limitan a, Varióla major y Varióla minor.
Picornavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Picornaviruses , tales como Enteroviruses , Rhinoviruses , Heparnavirus , Cardioviruses y Aphthoviruses . En una modalidad, el enterovirus es un poliovirus, por ejemplo, un poliovirus de tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra modalidad, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra modalidad, el enterovirus es un virus de Coxsackie A o B.
Bunyavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Orthobuny virus, tales como virus de encefalitis de California, un Phlejbovirus, tales como virus de fiebre de Rift Valley, o un Nairovirus, tal como virus de fiebre hemorrágica de Crimea-Congo.
Heparnavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Heparnavirus, tal como el virus de hepatitis A (HAV) .
Filovirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un filovirus, tales como el virus de Ebola (que incluyen un ebolavirus de Zaire, Costa de marfil, Reston o Sudán) o un virus de Marburg.
Togavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Togavirus, tales como un Rubivirus, un Alphavirus o un Arterivirus . Este incluye el virus de rubéola.
Flavivirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Flavivirus, encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, por sus siglas en inglés) , dengue (tipos 1, 2, 3 ó 4), fiebre amarilla, encefalitis japonesa, virus forestal de Kyasanur, encefalitis del Nilo Occidental, de encefalitis de San Luis, de encefalitis rusa de primavera y verano, de encefalitis de Powassan.
Pestivirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Pestivirus, tales como diarrea viral de bovino (BVDV, por sus siglas en inglés) , fiebre clásica de cerdo (CSFV, por sus siglas en inglés) o enfermedad de Border (BDV, por sus siglas en inglés) .
Hepadnavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Hepadnavirus, tales como virus de hepatitis B. Una composición puede incluir el antígeno superficial del virus de hepatitis B (HBsAg) .
Otros virus de hepatitis: Una composición puede incluir un inmunógeno de un virus de hepatitis C, virus de hepatitis delta, virus de hepatitis E o virus de hepatitis G.
R ajbdovirus : Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Rhabdovirus, tales como un Lyssavirus (por ejemplo, un virus de rabia) y Vesiculovirus (VSV) .
Caliciviridae : Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Calciviridae , tales como virus de Norwalk (Norovirus) y virus similares a Norwalk, tales como virus de Hawaii y virus de nieve de montaña.
Coronavirus: Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un coronavirus de SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV, por sus siglas en inglés) , virus de hepatitis de ratón (MHV, por sus siglas en inglés) y virus de gastroenteritis transmisible de porcino (TGEV, por sus siglas en inglés) . El inmunógeno de coronavirus puede ser un polipéptido espicular.
Retrovirus-, Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) o un Spumavirus .
Reovirus: Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Orthoreovirus , un Rotavirus, un Orbivirus o un Coltivirus.
Parvovirus: Los inmunógeno virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Parvovirus B19.
Virus de herpes: Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un virus de herpes de humano, tales como, sólo a manera de ejemplo, virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, los tipos de HSV 1 y 2) , virus de varicela zoster (VZV, por sus siglas en inglés) , virus de Epstein-Barr (EBV) , citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) , virus del herpes de humano 6 (HHV6) , virus del herpes de humano 7 (HHV7) y virus del herpes de humano 8 (HHV8) .
Papovavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, los derivados de los Papilomavirus y Poliomavirus . Los papilomavirus (humano) pueden ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ó 65, por ejemplo, de uno o más serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: Los inmunógenos virales incluyen los derivados del serotipo de adenovirus 36 (Ad-36) .
En algunas modalidades, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un virus que afecta el pescado, tales como: virus de anemia de salmón infecciosa (ISAV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad pancreática de salmón (SPDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis pancreática infecciosa (IP V, por sus siglas en inglés) , virus del pez gato de canal (CCV, por sus siglas en inglés) , virus de la enfermedad de linfocistis de pescado (FLDV) , virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV, por sus siglas en inglés) , virus de herpes koi, virus similar a picorna de salmón (también conocido como virus similar a picorna de salmón del atlántico) , virus de salmón encerrado (LSV, por sus siglas en inglés) , rotavirus de salmón del atlántico (ASR, por sus siglas en inglés) , virus de la enfermedad de fresa en la trucha (TSD, por sus siglas en inglés) , virus de salmón de tumor Cono (CSTV, por sus siglas en inglés) o virus de septicemia hemorrágica viral (VHSV, por sus siglas en inglés) .
Los inmunógenos fúngicos pueden derivarse de Dermatophytres , que incluyen: Epider ophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortu , Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini , Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. álbum, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizo yces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei , Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guillier ondi , Cladosporiu carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces der atidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi ; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp. , Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
En algunas modalidades ' el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito del género Plasmodium, tales como P. falciparum, P. vivax, P. alariae o P. ovale. De esta manera, la invención puede usarse para inmunizar contra malaria, en algunas modalidades el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente los de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, piojo de mar, tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas modalidades, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra: alérgenos de polen (alérgenos de polen de árbol, hierba, maleza y pasto) ; alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalantes, saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de garrapatas, alérgenos de cucaracha y mosquitos, alérgenos de veneno de hymenopthera) ; alérgenos de cabello y caspa de animales (de, por ejemplo, perro, gato caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de alimentos (por ejemplo, una gliadina) . Los alérgenos de polen importantes de los árboles, pastos y hierbas son tales que se originan de las órdenes taxonómicas de Fágales, Oléales, Piñales y platanaceae, que incluyen, pero no se limitan a, abedul (Betula) , alder (Alnus) , avellana (Corylus) , encanto (Carpinus) y olivo (Olea) , cedar (Cryptomeria y Juniperus) , árbol plano (Platanus) , el orden de Poales, que incluyen pastos de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación apropiados son los de garrapatas de polvo de casa del género Dermatophagoides y Euroglyphus, garrapatas de almacenes, por ejemplo, Lepidoglyphys , Glycyphagus y Tyrophagus, las de cucarachas, mosquitos y moscas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides , y las de mamíferos, tales como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno que incluyen los que se originan de mordeduras y picaduras de insectos, tales como las del orden taxonómico de Hymenoptera, que incluyen abejas {Apidae) , avispas (Vespidea) y hormigas ( Fórmicoidae) .
En algunas modalidades, el inmunógeno es un antígeno de tumor seleccionado de: (a) antigenos de cáncer de testículo, tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como los polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2 , MAGE- 3, MAGE-4 , MAGE- 5, MAGE- 6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para enfrentar los tumores de melanoma, pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, mama, gastrointestinal y vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, pulmón, cabeza y cuello) , p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal) , CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma) , MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma) , caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello) , CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma de no Hodgkins de células T) , BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica) , triosefosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT; (c) antígenos sobreexpresados , por ejemplo, Galectina 4 (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal) , Galectina 9 (asociado con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin) , proteinasa 3 (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica) , T 1 (asociado con, por ejemplo, varias leucemias) , anhidrasa carbónica (asociado con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociado con, por ejemplo, cáncer de pulmón) , PRAME (asociado con, por ejemplo, melanoma) , HER-2/neu (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y ovario) , mamaglobina, alfa-fetoproteína (asociado con, por ejemplo, hepatoma) , KSA (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal) , gastrina (asociado con, por ejemplo, cáncer pancreático y gástrico) , proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y ovario) , G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de células renales) , p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon) , y antígeno carcinoembriónico (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón y los cánceres del tracto gastrointestinal, tales como cáncer colorrectal) ; (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocito, tales como MART-l/Melan A, gplOO, MC1R, receptor de la hormona de estimulación de melanocito, tirosinasa, proteína- 1/TRP1 relacionada con tirosinasa y proteína-2/TRP2 relacionada con tirosinasa (asociado con, por ejemplo, melanoma) ; (e) antígenos asociados con la próstata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociado con, por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados, por ejemplo, con mieloma y linfornas de células B) . En algunas modalidades, los inmunógenos de tumor incluyen, pero no se limitan a, pl5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos de papilomavirus humano (HPV) , que incluyen E6 y E7, antígenos del virus de hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópicos de células T de humano, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CA 43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM) , HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA- 90 (proteína asociada con la proteína de unión de Mac-2/ciclofilina C) , TAAL6 , TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones farmacéuticas Los liposomas de la invención son útiles como componentes en las composiciones farmacéuticas para inmunizar pacientes contra diferentes enfermedades. Estas composiciones incluirán típicamente un vehículo farmacéuticamente aceptable además de los liposomas. Una descripción completa de los vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 29.
Una composición farmacéutica de la invención puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (por ejemplo, Pam3CSK4) , un agonista de TLR4 (por ejemplo, un fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como E6020) , un agonista de TLR7 (por ejemplo, imiquimod) , un agonista de TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (por ejemplo, IC31) . Cualquiera de estos agonistas tiene idealmente un peso molecular de <2000 Da. En algunas modalidades, estos agonista (s) también se encapsulan con el ARN dentro de los liposomas, pero en otras modalidades no están encapsulados .
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir los liposomas en agua pura (por ejemplo, w.f.i.) o en un amortiguador, por ejemplo, un amortiguador de fosfato, un amortiguador Tris, un amortiguador de borato, un amortiguador de succinato, un amortiguador de histidina o un amortiguador de citrato. Las sales amortiguadoras serán incluidas en el intervalo de 5-20 mM.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener un pH entre 5.0 y 9.5, por ejemplo, entre 6.0 y 8.0.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10+2 mg/ml de NaCl es típica, por ejemplo, de aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones de la invención pueden incluir quelantes de iones metálicos. Éstos pueden prolongar la estabilidad del ARN removiendo los iones que pueden acelerar la hidrólisis de fosfodiéster . De esta manera, una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc.. Estos quelantes están presentes típicamente entre 10-500 µ?, por ejemplo, 0.1 mM. Una sal de citrato, tal como citrato de sodio, también puede actuar como un quelante, mientras que también se proporcionan subsecuentemente la actividad amortiguadora.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservadores, tales como tiomersal ó 2 - fenoxietanol . Se prefieren las composiciones libres de mercurio, y pueden prepararse las vacunas libres de conservadores .
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente no pirogénicas, por ejemplo, que contienen <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y de preferencia <0.1 EU por dosis.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente libres de gluten.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en la forma de dosis unitaria. En algunas modalidades, una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0.1-1.0 mi, por ejemplo, aproximadamente 0.5 mi.
Las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, mediante un inhalador, usando una atomización fina. La composición puede prepararse para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como una atomización o gotas. Son típicos los inyectables para la administración intramuscular .
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de liposomas, así como cualesquiera otros componentes, conforme sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se entiende que la administración de tal cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y afección física del individuo que va a tratarse, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para la síntesis de anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica del médico tratante, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de las pruebas de rutina. En general, el contenido de liposoma y ARN de las composiciones de la invención será expresado en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene =100 g de ARN (por ejemplo, de 10-100 pg, tal como aproximadamente 10 g, 25 pg, 50 pg, 75 pg ó 100 pg) , pero la expresión puede observarse a niveles mucho menores, por ejemplo, =1 pg/dosis, =100 ng/dosis, =10 ng/dosis, =1 ng/dosis, etc.
La invención también proporciona un dispositivo de liberación (por ejemplo, jeringa, nebulizador, atomizador, inhalador, parche dérmico, etc. ) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo puede usarse para administrar la composición a un paciente vertebrado.
Los liposomas de la invención no contienen ribosomas.
Métodos de tratamiento y usos médicos Contrario con las partículas descritas en la referencia 10, los liposomas y las composiciones farmacéuticas de la invención son para el uso in vivo para provocar una respuesta inmune contra un inmunógeno de interés.
La invención proporciona un método para originar una respuesta inmune en un vertebrado, que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de un liposoma o composición farmacéutica de la invención. La respuesta inmune es preferentemente protectora e involucra preferentemente anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El método puede originar una respuesta de impulsión.
La invención también proporciona un liposoma o composición farmacéutica de la invención para el uso en un método para originar una respuesta inmune en un vertebrado.
La invención también proporciona el uso de un liposoma de la invención, en la manufactura de un medicamento para originar una respuesta inmune en un vertebrado.
Originando una respuesta inmune en el vertebrado mediante estos usos y métodos, el vertebrado puede protegerse contra varias enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o virales, como se describió anteriormente. Los liposomas y composiciones son inmunogénicas , y más preferentemente, composiciones de vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, prevenir una infección) o terapéuticas (es decir, tratar una infección) , pero serán típicamente profilácticas.
El vertebrado es preferentemente un mamífero, tal como un humano o un mamífero vertebrado grande (por ejemplo, caballos, vacas, venados, cabras, cerdos) . Cuando la vacuna es para el uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño o infante) o un adolescente,-cuando la vacuna es para el uso terapéutico, el humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada para los niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para valorar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar a los niños y adultos. De esta manera, un paciente humano puede ser menor de 1 año de edad, menor de 5 años de edad, de 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o por lo menos de 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, =50 años de edad, =60 años de edad y de preferencia =65 años de edad) , los jóvenes (por ejemplo, =5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores del cuidado de la salud, servicio de armada y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicamente o pacientes inmunodeficientes . Sin embargo, las vacunas no son apropiadas exclusivamente para estos grupos, y pueden usarse más generalmente en una población.
En general, las composiciones de la invención serán administradas directamente a un paciente. La liberación directa puede realizarse por inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente , intradérmicamente o al espacio intersticial de un tejido; a diferencia de la referencia 1, la inyección intraglosal típicamente no se usa con la presente invención) . Las rutas de liberación alternativas incluyen la administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, atomización) , bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosal . La administración intradérmica e intramuscular son dos rutas preferidas. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, aguja hipodérmica) , pero la inyección sin aguja puede usarse alternativamente. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mi .
La invención puede usarse para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosal, de preferencia para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosal mejorada.
La dosificación puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiple. Pueden usarse múltiples dosis en un esquema de inmunización primario y/o en un esquema de inmunización de refuerzo. En un esquema de dosis múltiple las diferentes dosis pueden administrarse por las mismas rutas o diferentes, por ejemplo, un refuerzo mucosal y cebado parenteral, un refuerzo parenteral y cebado mucosal, etc. Las dosis múltiples serán administradas típicamente por los menos una semana separadas (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas , aproximadamente 8 semanas , aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una modalidad, las dosis múltiples pueden administrarse a aproximadamente 6 semanas, 10 semanas 4 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo, en una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como a menudo se usa en el Programa Expandido de la Organización Mundial de la Salud sobre Inmunización ("EPI", por sus siglas en inglés) . En una modalidad alternativa, se administran dos dosis primarias de aproximadamente dos meses de separación, por ejemplo, aproximadamente 7, 8 ó 9 semanas de separación, seguido de una o más dosis de refuerzo en aproximadamente 6 meses a 1 año después de segundo dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10 ó 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una modalidad adicional, ~ se administran tres dosis primarias en aproximadamente dos meses de separación, por ejemplo, aproximadamente 7, 8 ó 9 semanas de separación, seguido de una o más dosis de refuerzo en aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10 ó 12 meses después de la tercera dosis primaria.
Fórmula (X) Los compuestos de la fórmula (X) contienen un grupo de cabeza de polímero hidrofílico enlazado a un radical lípido. Pueden describirse como "lípidos de cautela" y tienen la fórmula: en donde : Z es un componente de grupo de cabeza hidrofílico seleccionado de PEG y polímeros a base de poli (oxazolina) , poli (óxido de etileno) , poli (alcohol vinílico) , poli (glicerol) , poli (N-vinilpirrolidona) , poli [N- (2-hidroxipropil) metacrilamida] y poli (aminoácido) s , en donde el polímero puede ser lineal o ramificado, y en donde el polímero puede sustituirse opcionalmente; en donde Z se polimeriza por n subunidades; n es un grado de polimerización promedio ponderal entre 10 y 200 unidades de Z, en donde n se optimiza para diferentes tipos de polímeros; Li es un alquileno Ci-i0 opcionalmente sustituido o un enlazador de heteroalquileno Ci-i0 que incluye cero, uno o dos de un éter (por ejemplo, -0-), éster (por ejemplo, -C(O)O-), succinato (por ejemplo, -O (O) C-CH2-CH2-C (0) O- ) ) , carbamato (por ejemplo, -OC (0) -NR' - ) , carbonato (por ejemplo, -0C(0)0-) , urea (por ejemplo, -NRC (0) NR' - ) , amina (por ejemplo, -NR' - ), amida (por ejemplo, -C(0)NR'-), imina (por ejemplo, C(NR')-), tioéter (por ejemplo, -S-), xantato (por ejemplo, -OC(S)S-) y fosfodiéster (por ejemplo, -0P(0)20-), en donde R' se selecciona independientemente de -H, -NH-, -NH2, -0-, -S-, un fosfato o un alquileno ??.?? opcionalmente sustituido; Xx y X2 se seleccionan independientemente de un carbono o un heteroátomo seleccionado de -NH, - -O-, -S- o un fosfato; Ai y A2 se seleccionan independientemente de un alquilo C6-30, alquenilo C6-3o y alquinilo C6-3o, en donde Ax y A2 pueden ser el mismo o diferente, o Aj. y A2 junto con el átomo de carbono al que se enlazan forman un esteroide opcionalmente sustituido .
En una modalidad, el compuesto de la fórmula (X) tiene la fórmula (X' ) en donde : PEG es una subunidad de poli (etilenglicol) , en donde el PEG puede ser lineal o ramificado; n es un grado de polimerización promedio ponderal entre 10 y 200 unidades de PEG, de preferencia alrededor de 45 unidades ; Li es un enlazador de heteroalquileno Ci-io opcionalmente sustituido que contiene uno o dos de un éter, éster, succinato, carbamato, carbonato, urea, amina, amida, imina, tioéter, xantato y fosfodiéster ; Xx y X2 son oxígeno; Ai y A2 se seleccionan independientemente de un alquilo C6-30, alquenilo C6-3o, y alquinilo C6-3o, en donde Ai y A2 pueden ser el mismo o diferente, o en donde Ai y A2 junto con el átomo de carbono al que se enlazan forman un esteroide opcionalmente sustituido.
Los lípidos de las fórmulas (X) y (X' ) , cuando se formulan con lípidos catiónicos para formar liposomas, pueden aumentar la duración del tiempo para el cual un liposoma puede existir in vivo (por ejemplo, en la sangre) . Éstos pueden proteger la superficie de una superficie de liposoma y, de esta forma, reducir la opsonización por proteínas sanguíneas y la captación de macrófagos . Los detalles adicionales están en las referencias 30 y 31. En una modalidad, un lípido comprende un grupo seleccionado de PEG (a menudo referido como poli (óxido de etileno) ) y polímeros a base de poli (oxazolina) , poli (alcohol vinílico) , poli (glicerol) , poli (N-vinilpirrolidona) , poli [N- (2-hidroxipropil) metacrilamida] y poli (aminoácido) s .
Los lípidos PEGilados apropiados para el uso con la invención incluyen conjugados de polietilenglicol-diacilglicerol o polietilenglicol-diacilglicamida (PEG-DAG) que incluyen los que comprenden un grupo dialquilglicerol o dialquilglicaraida que tiene una longitud de cadena alquilo que comprende independientemente de aproximadamente C4 a aproximadamente C40 átomos de carbono saturados o insaturados. El grupo dialquilglicerol o dialquilglicamida además puede comprender uno o más grupos alquilo sustituidos. El lípido PEGilatado puede seleccionarse de PEG-dilaurilglicerol , PEG-dimiristilglicerol (catálogo #GM-020 de NOF) , PEG-dipalmitoilglicerol, PEG-disterilglicerol , PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimiristilglicamida, PEG-dipalmitoil-glicamida y PEG-disterilglicamida, PEG-colesterol (1-[8'- (Colest-5-en-3 [beta] -oxi) carboxamido-3 ' , 6 ' -dioxaoctanil] carbamoil- [omega] -metil-poli (etilenglicol) , PEG-DMB (3 , 4 -Ditetradecoxilbencil- [omega] -metil-poli (etilenglicol) éter), 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenglicol) -2000] (catálogo #880150P de Avanti Polar Lipids) . Otros lípidos PEGilados útiles son S001, S002, S003, S004, S005, S006, S007, S008, S009, S010, S011 y CS-020SA (NOF); S010 y S011 se describen en la referencia 32 bajo las etiquetas IVa y IVc, respectivamente. En la referencia 32, se usa una síntesis diferente de la reportada en la presente para preparar IVa y IVc.
Términos químicos y definiciones Halo El término "halógeno" (o "halo") incluye flúor, cloro, bromo y yodo.
Alquilo, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo etc.
Los términos "alquilo" , "alquileno" , "alquenilo" y "alquinilo" se usan en la presente para referirse a las formas acíclicas de cadena lineal y ramificada. Los análogos cíclicos de las mismas se refieren como cicloalquilo, etc.
El término "alquilo" incluye los grupos hidrocarbilo acíclico monovalente, lineal o ramificado, saturado. En una modalidad, alquilo es alquilo Ci-10, en otra modalidad alquilo C1-6, en otra modalidad alquilo Ci-4, tal los como los grupos metilo, etilo, n-propilo, i-propilo o t-butilo.
El término "cicloalquilo" incluye los grupos hidrocarbilo cíclico monovalente, saturado. En una modalidad, cicloalquilo es cicloalquilo C3-10, en otra modalidad cicloalquilo C3-6, tal como ciclopentilo y ciclohexilo.
El término "alcoxi" significa alquilo-O- .
El término "alquenilo" incluye grupos hidrocarbilo acíclico monovalente, lineal o ramificado, insaturado, que tienen por lo menos un enlace doble carbono-carbono y, en una modalidad, no tienen enlaces triples carbono-carbono . En una modalidad, alquenilo es alquenilo C2-io, en otra modalidad alquenilo C2-e, en otra modalidad alquenilo C2-4 · El término "cicloalquenilo" incluye grupos de hidrocarbilo cíclico monovalente, parcialmente insaturados que tienen por lo menos un enlace de carbono-carbono doble y, en una modalidad, no tienen enlaces triples carbono-carbono . En una modalidad, cicloalquenilo es cicloalquenilo C3-i0, en otra modalidad cicloalquenilo C5-i0, por ejemplo, ciclohexenilo o benzociclohexilo .
El término "alquinilo" incluye los grupos hidrocarbilo acíclicos insaturados, monovalentes, lineales o ramificados que tienen por lo menos un enlace triple carbono-carbono y, en una modalidad, no tienen enlaces dobles carbono-carbono . En una modalidad, alquinilo es alquinilo 2-ior en otra modalidad alquinilo C2-6, en otra modalidad alquinilo C2-4.
El término "cicloalquinilo" incluye los grupos de hidrocarbilo cíclicos monovalentes, parcialmente insaturados, que tienen por lo menos un enlace triple carbono- carbono y, en una modalidad, no tienen enlaces dobles carbono-carbono . En una modalidad, cicloalquinilo es cicloalquenilo C3-10, en otra modalidad cicloalquinilo C5-i0.
El término "alquileno" incluye grupos de hidrocarbilo acíclico divalente, lineal o ramificado, saturado. En una modalidad, alquileno es alquileno C1-10, en otra modalidad alquileno Ci-6, en otra modalidad alquileno Ci-4, tal como los grupos metileno, etileno, n-propileno, i-propileno o t-butileno .
El término "alquenileno" incluye grupos de hidrocarbilo acíclico divalente, lineal o ramificado, insaturado, que tienen por lo menos un enlace doble carbono-carbono y, en una modalidad, no tienen enlaces triples carbono-carbono . En una modalidad, alquenileno es alquenileno C2-i0, en otra modalidad alquenileno C2_6, en otra modalidad, alquenileno C2-4.
El término "alquinileno" incluye los grupos de hidrocarbilo acíclico insaturado, divalente, lineal o ramificado, que tienen por lo menos un enlace triple carbono-carbono y, en una modalidad, no tienen enlaces dobles carbono-carbono . En una modalidad, alquinileno es alquinileno C2-io, en otra modalidad, alquinileno C2-6/ en otra modalidad alquinileno C2-4.
Heteroalquilo etc.
El término "heteroalquilo" incluye los grupos alquilo en los que hasta seis átomos de carbono, en una modalidad, hasta cinco átomos de carbono, en otra modalidad hasta cuatro átomos de carbono, en otra modalidad hasta tres átomos de carbono, en otra modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad hasta un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por O, S(0)q, N, P(0)r o Si (y de preferencia O, S(0)q o N) , con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de alquilo. El grupo heteroalquilo puede ser enlazado a C o hetero-enlazado, es decir, puede enlazarse al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de 0, S(0)q, N, P(0)r o Si.
El término "heterocicloalquilo" incluye los grupos cicloalquilo, en los que hasta seis átomos de carbono, en una modalidad, hasta cinco átomos de carbono, en otra modalidad hasta cuatro átomos de carbono, en otra modalidad hasta tres átomos de carbono, en otra modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad hasta un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de cicloalquilo . Ejemplos de los grupos heterocicloalquilo incluyen oxiranilo, tiaranilo, aziridinilo, oxetanilo, tiatanilo, azetidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo , tetrahidrotiopiranilo, piperidinilo, 1 , 4 -dioxanilo , 1, 4 -oxatianilo, morfolinilo, 1 , 4 -ditianilo, piperazinilo, 1 , 4 -azatianilo, oxepanilo, tiepanilo, azepanilo, 1 , 4 -dioxepanilo, 1 , 4-oxatiepanilo, 1, 4-oxaazepanilo, 1, 4-ditiepanilo, 1 , 4 -tieazepanilo y 1 , 4 -diazepanilo . El grupo heterocicloalquilo puede enlazarse a C o enlazarse a N, es decir, puede enlazarse al resto de la molécula por medio de un átomo de carbono o a través de un átomo de nitrógeno.
El término "heteroalquenilo" incluye los grupos alquenilo en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad hasta un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por O, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de alquenilo. El grupo heteroalquenilo puede enlazarse a C o hetero-enlazarse, es decir, puede enlazarse al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de 0, S(0)q o N.
El término "heterocicloalquenilo" incluye los grupos cicloalquenilo en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad hasta un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por O, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de cicloalquenilo. Ejemplos de los grupos heterocicloalquenilo incluyen 3 , 4-dihidro-2H-piranilo, 5-6-dihidro-2H-piranilo, 2H-piranilo, 1, 2 , 3 , 4-tetrahidropiridinilo y 1,2,5,6-tetrahidropiridinilo . El grupo heterocicloalquenilo puede enlazarse a C o enlazarse a N, es decir, puede enlazarse al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de un átomo de nitrógeno.
El término "heteroalquinilo" incluye los grupos alquinilo en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de alquinilo. El grupo heteroalquinilo puede ser enlazado a C o hetero-enlazado, es decir, puede enlazarse al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de 0, S(0)q o N.
El término "heterocicloalquinilo" incluye los grupos cicloalquinilo en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de cicloalquinilo. El grupo heterocicloalquenilo puede enlazarse a C o enlazarse a N, es decir, puede enlazarse al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de un átomo de nitrógeno .
El término "heteroalquileno" incluye los grupos alquileno en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de alquileno.
El término "heteroalquenileno" incluye los grupos alquenileno en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de alquenileno.
El término "heteroalquinileno" incluye los grupos alquinileno en los que hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, se reemplazan cada uno independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que permanezca por lo menos uno de los átomos de carbono de alquinileno.
Arilo El término "arilo" incluye los grupos de hidrocarbilo monovalente, aromático, cíclico, tales como fenilo o naftilo (por ejemplo, 1-naftilo ó 2-naftilo) . En general, los grupos arilo pueden ser grupos aromáticos fusionados monocíclicos o policíclicos . El arilo preferido es arilo Cg.Ci4.
Otros ejemplos de los grupos arilo son los derivados monovalentes de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno , antraceno, azuleno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indeno, naftaleno, ovaleno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno y rubiceno.
El término "arilalquilo" significa alquilo sustituido con un grupo arilo, por ejemplo, bencilo.
El término "arileno" incluye los grupos hidrocarbilo cíclico divalente, aromático, tales como fenileno. En general, los grupos arileno pueden ser grupos aromáticos de anillo fusionado monocíclicos o policíclicos. El arileno preferido es arileno C6-C14. Otros ejemplos de los grupos arileno son los derivados divalentes de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indeno, naftaleno, ovaleno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno y rubiceno.
Heteroarilo El término "heteroarilo" incluye los grupos de hidrocarbilo cíclico monovalente, heteroaromático que además contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y N N, en donde RN se define a continuación (y en una modalidad, es H o alquilo (por ejemplo, alquilo Ci-6) ) .
En general, los grupos heteroarilo pueden ser grupos heteroaromáticos de anillo fusionado monocíclicos o policíclicos (por ejemplo, bicíclicos) . En una modalidad, los grupos heteroarilo contienen 5-13 miembros de anillo (de preferencia 5-10 miembros) y 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos de anillo seleccionados independientemente de O, S, N y NRN. En una modalidad, un grupo heteroarilo puede ser de 5, 6, 9 ó 10 miembros, por ejemplo, monocíclico de 5 miembros, monocíclico de 6 miembros, bicíclico de anillo fusionado de 9 miembros o bicíclico de anillo fusionado de 10 miembros.
Los grupos heteroaromáticos monocíclicos incluyen los grupos heteroaromáticos que contienen 5-6 miembros de anillo y 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados de O, S, o NRN.
En una modalidad, los grupos heteroarilo monocíclicos de 5 miembros contienen 1 miembro de anillo que es un grupo - NRN-, un átomo de -0- o un átomo de -S- y, opcionalmente, 1-3 miembros de anillo (por ejemplo, 1 ó 2 miembros de anillo) los cuales son átomos de =N- (en donde el resto de los miembros del anillo son átomos de carbono) .
Ejemplos de los grupos heteroarilo monocíclicos de 5 miembros son pirrolilo, furanilo, tiofenilo, pirazolilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxazolilo,, isotiazolilo, tiazolilo, 1,2,3 triazolilo, 1,2,4 triazolilo, 1,2,3 oxadiazolilo, 1,2,4 oxadiazolilo, 1,2,5 oxadiazolilo, 1,3,4 oxadiazolilo, 1,3,4 tiadiazolilo, piridilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, 1,3,5 triazinilo, 1,2,4 triazinilo, 1,2,3 triazinilo y tetrazolilo.
Ejemplos de los grupos heteroarilo monocíclicos de 6 miembros con piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo y pirazinilo.
En una modalidad, los grupos heteroarilo monocíclicos de 6 miembros contienen 1 ó 2 miembros de anillo que son átomos de =N- (en donde el resto de los 6 miembros de anillo son átomos de carbono) .
Los grupos heteroaromáticos bicíclicos incluyen grupos heteroaromáticos de anillo fusionado que contienen 9-13 miembros de anillo y 1, 2, 3, 4 o más heteroátomos seleccionados de 0, S, N o NRN.
En una modalidad, los grupos heteroarilo bicíclicos de 9 miembros contienen 1 miembro de anillo que es un grupo -NR-, un átomo de -0- o un átomo de -S- y, opcionalmente, 1-3 miembros de anillo (por ejemplo, 1 ó 2 miembros de anillo) que son átomos de =N- (en donde el resto de los 9 miembros de anillo son átomos de carbono) .
Ejemplos de los grupos heteroarilo bicíclicos de anillo fusionado de 9 miembros son benzofuranilo, benzotiofenilo, indolilo, bencimidazolilo, indazolilo, benzotriazolilo, pirrólo [2 , 3 -b] iridinilo, pirrólo [2 , 3-c] piridinilo, pirrólo [3 , 2-c] iridinilo, pirrólo [3 , 2-b] piridinilo, imidazo [4 , 5-b] iridinilo, imidazo [4 , 5-c] piridinilo, pirazolo [4, 3 -d] iridinilo , pirazolo [4, 3-c] piridinilo, pirazolo [3 , 4 -c] piridinilo, pirazolo [3 , 4-b] piridinilo, isoindolilo, indazolilo, purinilo, indolininilo, imidazo [1,2-a] piridinilo, imidazo [1, 5-a] piridinilo, pirazolo [1 , 2 -a] piridinilo, pirrólo [1 , 2-b] piridazinilo e imidazo [1,2-c] pirimidinilo .
En una modalidad, los grupos heteroarilo bicíclicos de 10 miembros contienen 1-3 miembros de anillo, los cuales son átomos de =N- (en donde el resto de los 10 miembros del anillo son átomos de carbono) .
Ejemplos de los grupos heteroarilo bicíclicos de anillo fusionado de 10 miembros son quinolinilo, isoquinolinilo, cinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, 1,6-naftiridinilo, 1, 7-naftiridinilo, 1 , 8-naftiridinilo, 1,5-naftiridinilo, 2 , 6-naftiridinilo, 2 , 7-naftiridinilo, pirido [3 , 2-d] pirimidinilo, pirido [4 , 3-d] pirimidinilo, pirido [3 , 4 -d] irimidinilo, pirido [2 , 3 -d] pirimidinilo, pirido [2 , 3-b] pirazinilo, pirido [3 , 4-b] pirazinilo, pirimido [5, 4 -d] pirimidinilo, pirazino [2 , 3-b] pirazinilo y pirimido [4 , 5-d] pirimidinilo.
El término "heteroarilalquilo" significa alquilo sustituido con un grupo heteroarilo.
El término "heteroarileno" incluye los grupos hidrocarbilo cíclico, heteroaromático, divalente que además contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y NRN, en donde RN se define a continuación (y en una modalidad, es H o alquilo (por ejemplo, alquilo Ci-S) ) . En general, los grupos heteroarileno pueden ser grupos heteroaromáticos de anillo fusionado monocíclicos o policíclicos (por ejemplo, bicíclicos) . En una modalidad, los grupos heteroarileno contienen 5-13 miembros de anillo (de preferencia 5-10 miembros) y 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos de anillo seleccionados independientemente de 0, S, N y NRN. En una modalidad, un grupo heteroarileno puede ser de 5 , 6, 9 ó 10 miembros, por ejemplo, monocíclico de 5 miembros, monocíclico de 6 miembros, bicíclico de anillo fusionado de 9 miembros o bicíclico de anillo fusionado de 10 miembros. El término "heteroarileno" incluye derivados divalentes de cada uno de los grupos heteroarilo descritos anteriormente.
Los términos "arilo" , "aromático" , "heteroarilo" y "heteroaromático" también incluyen los grupos que se reducen parcialmente. De esta manera, por ejemplo, "heteroarilo" incluye las especies fusionadas en las que uno de los anillos se ha reducido a un anillo saturado (por ejemplo, 1,2,3,4-tetrahidro-1, 8 -naftiridin-2-ilo) .
General A menos que se indique explícitamente lo contrario, cuando las combinaciones de los grupos que se refieren como un radical, por ejemplo, arilalquilo, el último grupo mencionado contiene el átomo mediante el cual el radical se enlaza al resto de la molécula.
Cuando se hace referencia a un átomo de carbono de un grupo alquilo u otro grupo que se reemplaza por O, S(0)q, N o P(0)r/ lo que se pretende es que: o E—p—e E donde E no puede ser -CH= se reemplaza por -N= o -P(0)r=; =C-H se reemplaza por =N o =P(0) r / O -CH2- se reemplaza por -O-, -S(0)q-, -NR N o -P(0)rRN-, en donde R es H o alquilo Ci-6 opcionalmente sustituido, heteroarilo Ci-6, cicloalquilo C3-6, heterocicloalquilo C3-s, alquenilo C2-6, heteroalquenilo C2-s, cicloalquenilo C3-6, heterocicloalquenilo C3-S, fenilo o heteroarilo que contiene 5 o 6 miembros de anillo. RN es preferentemente H, alquilo Ci-6 o cicloalquilo C3-6. q es independientemente 0, 1 ó 2. En una modalidad, q es 0. r es independientemente 0 ó 1. En una modalidad, r es 0. Cuando se hace referencia a un átomo de carbono que se reemplaza por Si, lo que se pretende es que el átomo de carbono sea cambiado por un átomo de silicio, pero que los enlaces permanezcan como los mismos. De esta manera, por ejemplo, -CH2- se reemplaza por -SiH2-; -CH= se reemplaza por -SiH=; y =C-H se reemplaza por =Si-H.
A manera de clarificación, con relación a los grupos que contienen heteroátomos mencionados anteriormente (tales como heteroalquilo etc.), cuando se proporciona un numérico de átomos de carbono, por ejemplo, heteroalquilo C3-s, lo que se pretende es que un grupo a base de alquilo C3-6, en el que uno o más de los 3-6 átomos de carbono de la cadena sea reemplazado por O, S(0)q o N. Por lo tanto, un grupo heteroalquilo C3-6, por ejemplo, contendría menos de 3-6 átomos de carbono de la cadena. Como otro ejemplo, un grupo piridilo séría clasificado como un grupo heteroarilo C6 aunque contenga 5 átomos de carbono .
Sustitución Los grupos de los compuestos de la invención (por ejemplo, los grupos alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, heteroalquilo, heterocicloalquilo, heteroalquenilo, heterocicloalquenilo, heteroalquinilo , heteroalquileno , heteroalquenilen arilo, arilalquilo, arilheteroalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo o heteroarilheteroalquilo etc.) pueden ser sustituidos o insustituidos , en una modalidad, insustituidos. Típicamente, la sustitución involucra el reemplazamiento teórico de un átomo de hidrógeno con un grupo sustituyente , o dos átomos de hidrógeno en el caso de la sustitución por =0.
Cuando se sustituyen, en general, habrá de 1 a 5 sustituyentes en cada grupo, en una modalidad de 1 a 3 sustituyentes , en una modalidad 1 ó 2 sustituyentes, en una modalidad 1 sustituyente. Una modalidad incluye más de un sustituyente en el mismo átomo, por ejemplo, un grupo acetal .
En una modalidad, el sustituyente es independientemente Sub1 o Sub2 (en una modalidad Sub2) en donde: Sub1 es independientemente halógeno, trihalometilo, trihaloetilo, -N02, -CN, -N+(RS)20", -C02H, -C02RS, -S03H, -SOR3, -S02R3, -S03RS, -0C(=0)0R3, -C(=0)H, -C(=0)Rs, -OC(=0)R3, =0, -NRS2/ -C(=0)NH2, -C(=0)NR32, -N (R3) C (=0) 0RS, N(Rs)C(=0)NRs2/ -0C(=0)NRS2, -N (Rs) C (=0) Rs, -C(=S)NRa2, NR9C(=S)RS, -S02NRS2, -NRsS02Rs, -N (Rs) C (=S) NRS2, -N (Rs) S02NRS2 , -Rs o -ZSRS, en donde; Zs es independientemente 0, S o NRS; R3 es independientemente H o alquilo C1-6, heteroalquilo Ci-6, - (Alqa) f-cicloalquilo C3.e, - (Alqa) f-heterocicloalquilo C3. 6, alquenilo C2.6, eteroalquenilo C2-6, - (Alqa) f-cicloalquenilo C3-6, - (Alqa) f-heterocicloalquenilo C3_6, alquinilo C2-6, heteroalquinilo C2-6, - (Alqa) -(Alqa)f-arilo C6 -14 <-> - (Alqa) f-heteroarilo (en donde heteroarilo contiene de 5-13 átomos del anillo) , en donde f es 0 ó 1 ; Alqa es alquileno Ci_6 o heteroalquileno Ci-6; y Rs se sustituye opcionalmente (en una modalidad insustituido) por 1 a 3 sustituyentes Sub2; Sub2 es independientemente halógeno, trihalometilo, trihaloetilo, -N02, -CN, -N+ (alquilo Ci-6)20", -C02H, C02alquiloCi-6/ -S03H, -SOalquilo Ci-6, -S02alquiloCi-6, -S03alquiloC1-e, -0C (=0) Oalquilo C1-s, -C(=0)H, -C (=0) alquilo C1-6, -0C(=O) alquilo ¾.6, =0, -N(alquilo Ci-6)2; -C(=0)NH2, -C(=0)N (alquilo C1-6)2, -N(alquilo C^g) C (=0) O (alquilo Ci-6) , -N(alquilo C1-6) C ( =0) N (alquilo 01-6)2, -0C (=0) N (alquilo Ci-6)2, -N(alquilo Ci-6) C (=0) alquilo C1-6, -C (=S) N (alquilo C1-6)2 -N(alquilo Ci-6) C (=S) alquilo Ci-6, -S02N (alquilo Ci-e)2, -N(alquilo C1-6) S02alquiloCi_6, -N(alquilo C1-e) C (=S) N (alquilo Ci-6)2, -N (alquilo Ci-S) S02N (alquilo C1-6)2, -alquilo C1-6, heteroalquilo Ci-6, -cicloalquilo C3-6, -heterocicloalquilo C3. 6, -alquenilo -C2-6, -heteroalquenilo C2-e, -cicloalquenilo C3- 6, -heterocicloalquenilo C3-6, -alquinilo C2-s, heteroalquinilo C2-6, -arilo C6-i4, -heteroarilo C5.13, -Zt-alquilo Ci-6, -Zfc-cicloalquilo C3-6, -Zt-alquenilo C2-6/ -Zt-cicloalquenilo C3-6 o -Zt-alquinilo C2-6; y Zfc es independientemente O, S, NH o N (alquilo Ci-6) .
Mientras que Rs en Sub1 puede sustituirse opcionalmente por 1 a 3 sustituyentes Sub2, Sub2 es insustituido . Sin embargo, en una modalidad, Rs es insustituido.
En una modalidad, Rs es H o alquilo C1-6, opcionalmente sustituido por 1 a 3 sustituyentes Sub2.
En una modalidad, Sub2 es independientemente halógeno, trihalometilo, trihaloetilo, -N02, -CN, -N+ (alquilo Ci_6)20", -C02H, -S03H, -SOalquilo Ci-6, -S02alquiloCi_6 , -C(=0)H, C(=0)alquilo C1-6, =0, -N(alquilo C1-6)2, -C(=0)NH2, -alquilo Ci-e, -cicloalquilo C3-6, heterocicloalquilo C3-g, -Zt-alquilo Ci-6 o -Zt-cicloalquilo C3-6.
En una modalidad, cuando el grupo sustituido es acíclico (por ejemplo, alquilo, heteroalquilo, alquenilo etc.), Sub1 no es -Rs y Sub2 no es alquilo Ci-6, heteroalquilo Ci-S, alquenilo C2-6, heteroalquenilo C2-6, alquinilo C2-6 o heteroalquinilo C2-e- Cuando un grupo diferente de Sub2 tiene por lo menos 2 posiciones que pueden ser sustituidas, el grupo puede sustituirse en ambos extremos de una cadena de alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno (en una modalidad, que contiene de 1 a 6 átomos, en una modalidad adicional de 3 a 6 átomos, y en una modalidad adicional 3 ó 4 átomos) para formar un radical cíclico. La cadena se sustituye opcionalmente por 1 a 3 sustituyentes Sub2. En una modalidad, la cadena no es sustituida. De esta manera, los términos "cicloalquilo" opcionalmente sustituido, "cicloalquenilo" , "cicloalquinilo" , "heterocicloalquilo" , "heterocicloalquenilo" , "heterocicloalquinilo" , "arilo" y "heteroarilo" incluyen las especies fusionadas. Por ejemplo, "cicloalquilo opcionalmente sustituido" incluye una especie en la cual se fusionan dos anillos de cicloalquilo, y "heteroarilo opcionalmente sustituido" incluye una especie en la que se fusiona un anillo de heterocicloalquilo al anillo aromático (por ejemplo, 5 , 6 , 7 , 8-tetrahidro-l , 8 -naftiridin-2-ilo) .
Cuando un grupo diferente de Sub2 tiene un átomo que puede ser sustituido dos veces, tal átomo puede sustituirse en ambos extremos de una cadena de alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno (en una modalidad, que contiene 2 a 8 átomos, en una modalidad adicional 3 a 6 átomos, y en una modalidad adicional 4 ó 5 átomos) para formar un radical cíclico. La cadena se sustituye opcionalmente por 1 a 3 sustituyentes Sub2. En una modalidad, tal cadena no está sustituida. De esta manera, los términos "cicloalquilo" opcionalmente sustituido, "cicloalquenilo" , "cicloalquinilo" , "heterocicloalquilo", "heterocicloalquenilo" , "heterocicloalquinilo" , "arilo" y "heteroarilo" incluyen las especies espiro.
A manera de clarificación, cuando un grupo tiene un heteroátomo, un sustituyente puede enlazarse al heteroátomo. De esta manera, por ejemplo, "heteroarilo opcionalmente sustituido" incluye -CH2-N (Sub1) -CH2-, -CH (Sub1) -NH-CH2- y -CHÍSub1) -NÍSub1) -CH2- etc.
Términos modificadores Cuando una lista está precedida por un modificador, se pretende que el modificador sea entendido como la aplicación en cada uno de los puntos de la lista. Por ejemplo, la frase grupo "heterocicloalquilo C3-2o opcionalmente sustituido, heterocicloalquenilo C3-20, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o" significa que cada uno de los cuatro puntos en la lista, es decir, el grupo heterocicloalquilo C3-20, el grupo heterocicloalquenilo C3-20, el grupo heterocicloalquinilo C3-20 y el grupo heteroarilo C6-20, pueden sustituirse opcionalmente.
Cuando un grupo se caracteriza por un primer modificador y después, el mismo grupo se caracteriza por un modificador subsecuente, lo que se entiende es que el grupo se caracteriza por ambos modificadores simult neamente. Por ejemplo, si se describe un grupo como un grupo "heterocicloalquinilo C3-20" (el primer modificador) y luego el mismo grupo se describe como un grupo "C5-i6" (el modificador subsecuente) , lo que significa es un grupo heterocicloalquinilo C5-i6.
Esteroides Como se usa en la presente, el término "esteroide" se refiere a cualquier grupo que comprende la siguiente estructura (tal estructura se refiere en la presente como el "esqueleto esteroide").
Puramente para los propósitos de ilustración, el esqueleto esteroide se ha dibujado anteriormente como completamente saturado. El término esteroide, sin embargo, también se pretende que cubra los casos en donde hay insaturación en el esqueleto esteroide. Por ejemplo, el término esteroide cubre un grupo que comprende el esqueleto básico completamente insaturado (mancude) , 15H-ciclopenta [a] fenantreno: El término esteroide también cubre un grupo que comprende un esqueleto esteroide parcialmente insaturado.
El término esteroide también cubre los derivados "seco" del esqueleto esteroide, es decir, los grupos en los que se ha efectuado el corte del anillo; derivados "ñor" y "homo" del esqueleto esteroide que involucran la contracción y expansión del anillo, respectivamente (ver Systemic Nomenclature of Organic Chemistry, por D. Hellwinkel, publicado por Springer, 2001, ISBN: 3-540-41138-0, página 203 para "seco" y la página 204 para "ñor" y "homo") . En una modalidad, sin embargo, tales derivados seco no se abarcan por el término "esteroide" . En otra modalidad, tales derivados ñor no se abarcan por el término "esteroide" . En otra modalidad, tales derivados homo no se abarcan por el término "esteroide" . De esta manera, en una modalidad, tales derivados seco, ñor y homo no se abarcan por el término "esteroide" .
El término esteroide también cubre los casos en donde uno o más de los átomos de carbono en el esqueleto esteroide marcado con la estructura se reemplaza por un heteroátomo. En tal modalidad, hasta seis átomos de carbono, en una modalidad hasta cinco átomos de carbono, en otra modalidad hasta cuatro átomos de carbono, en otra modalidad hasta tres átomos de carbono, en otra modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad hasta un átomo de carbono, se reemplazan independientemente por O, S(0)q, N, P(0)r o Si (y de preferencia 0, S(0)q o N) . En una modalidad, sin embargo, el término "esteroide" comprende las especies en las que el "esqueleto básico esteroide" no contiene heteroátomos .
Un sistema de anillo esteroide se numera de acuerdo con la convención establecida a continuación.
El término esteroide abarca esteróles, hormonas esteroides, ácidos biliares y sales de ácidos biliares. Un esterol en cualquier esteroide con un grupo hidroxilo en la posición 3 del anillo A.
Insaturación De acuerdo con el uso estándar, la posición omega-3 se refiere al tercer enlace de la terminal (metilo) de la cadena la posición omega-6 se refiere al sexto enlace de la terminal (metilo) de la cadena y la posición omega-9 se refiere al noveno enlace de la terminal (metilo) de la cadena .
General La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, los métodos convencionales de la química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro del experimentado en la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, las referencias 33-39, etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.
El término "aproximadamente" con relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" , por ejemplo, una composición que es "sustancialmente libre" de Y debe ser completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
Las referencias a carga, a cationes, a aniones, a zwiteriones, etc., se toman a pH 7.
TLR3 es el receptor 3 similar a Toll. Es un receptor de extensión de membrana simple que juega un papel clave en el sistema inmune innato. Los agonistas de TLR3 conocidos incluyen poly(I:C) . "TLR3" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC: 11849. La secuencia RefSeq para el gen TLR3 humano es GI.-2459625.
TLR7 es el receptor 7 similar a Toll. Es un receptor de extensión de membrana simple que juega un papel clave en el sistema inmune innato. Los agonistas de TLR7 conocidos incluyen, por ejemplo, imiquimod. "TLR7" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC : 15631. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI: 67944638.
TLR8 es el receptor 8 similar a Toll. Es un receptor de extensión de membrana simple que juega un papel clave en el sistema inmune innato. Los agonistas de TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo, resiquimod. "TLR8" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC: 15632. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI: 20302165.
La familia del receptor similar a RIG-I ( "RLR" , por sus siglas en inglés) incluye varias helicasas de ARN que juegan papeles clave en el sistema inmune innato [40] . RLR-1 (también se conoce como RIG-I o gen I inducible del ácido retinoico) tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la helicasa de RLR-1 es "DDX58" (para el polipéptido 58 del cuadro DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) ) y el HGNC ID único es HGNC: 19102. La secuencia RefSeq para el gen RLR-1 humano es GI:77732514. RLR-2 (también se conoce como MDA5 o gen 5 asociado con la diferenciación de melanoma) también tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la helicasa RLR-2 es "IFIH1" (para el interferón inducido con el dominio 1 de helicasa C) y el HGNC ID único es HGNC: 18873. La secuencia RefSeq para el gen RLR-2 humano es GI: 27886567. RLR-3 (también conocido como LGP2 o laboratorio de genética y fisiología 2) no tiene dominios de reclutamiento de caspasa. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la helicasa RLR-3 es "DHX58" (para el polipéptido 58 del cuadro DEXH (Asp-Glu-X-His) ) y el HGNC ID único es HGNC: 29517. La secuencia RefSeq para el gen RLR-3 humano es GI : 149408121.
PKR es una protexna cinasa dependiente de ARN de doble hebra, juega un papel en el sistema inmune innato. "EIF2AK2" (para la 2 -alfa cinasa 2 del factor de iniciación de traducción eucariota) es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica esta enzima, y su HGNC ID único es HGNC: 9437. La secuencia RefSeq para el gen PKR humano es GI : 208431825.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un gel con ARN teñido. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón después del tratamiento de RNasa (4) replicón encapsulado en el liposoma (5) liposoma después del tratamiento de RNasa (6) liposoma tratado con R asa luego sometido a extracción con fenol/cloroformo .
La Figura 2 es una micrografía electrónica de los liposomas .
La Figura 3 muestra la expresión proteínica (como unidades de luz relativas, RLU) en los días 1, 3 y 6 después de la liberación de ARN en liposomas con PEGs de diferentes longitudes: 1 kDa (triángulos); 2 kDa (círculos); 3 kDa (cuadrados) .
La Figura 4 muestra un gel con ARN teñido. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón encapsulado en el liposoma (4) liposoma tratado con RNasa luego sometido a extracción con fenol/cloroformo.
La Figura 5 muestra la expresión proteínica en los días 1, 3 y 6 después de la liberación de ARN como un replicón empaquetado con virión (cuadrados) , como ARN desnudo (diamantes), o en liposomas (+ = 0.1 µg, x = 1 g) .
La Figura 6 muestra la expresión proteínica en los días 1, 3 y 6 después de la recuperación de cuatro diferentes dosis de ARN encapsulado con liposoma.
La Figura 7 muestra las titulaciones anti-F IgG en animales que reciben el replicón empaquetado con virión (VRP o VSRP) , 1 g de ARN desnudo y 1 pg de ARN encapsulado con liposoma .
La Figura 8 muestra titulaciones anti-F IgG en animales que reciben VRP, 1 g de ARN desnudo y 0.1 g o 1 g de ARN encapsulado con liposoma.
La Figura 9 muestra la neutralización de titulaciones de anticuerpos en animales que reciben VRP o 0.1 g ó 1 pg de ARN encapsulado con liposoma.
La Figura 10 muestra los niveles de expresión después de la liberación de un replicón como ARN desnudo (círculos) , ARN encapsulado con liposoma (triángulo y cuadrado) o como un lipoplex (triángulo invertido) .
La Figura 11 muestra las titulaciones de F-específicas (2 semanas después de la segunda dosis) después de la liberación de un replicón como ARN desnudo (0.01-1 pg) , ARN encapsulado con liposoma (0.01-10 g) , o empaquetado como un virión (VRP, 106 unidades infecciosas o IU) .
La Figura 12 muestra las titulaciones IgG F-específicas (círculos) y titulaciones de PRNT (cuadrados) después de la liberación de un replicón como ARN desnudo (1 pg) , ARN encapsulado con liposoma (0.1 ó 1 pg) o empaquetado como un virión (VRP, 106 IU) . También se muestran las titulaciones en ratones ingenuos. Las líneas continuas muestran medios geométricos .
La Figura 13 muestra la producción de citosina intracelular después de la re-estimulación con péptidos sintéticos que representan los epítopos principales en la proteína F, 4 semanas después de una segunda dosis. El eje y muestra el % de citosina+ de CD8+CD4-.
La Figura 14 muestra la estructura del lipido "RV05" .
La Figura 15 muestra las titulaciones de F-específico (titulaciones log10 medias ± desviación estándar) durante 210 días después de la inmunización de becerros. Las tres líneas se distinguen fácilmente en el día 63 y son, desde abajo hasta arriba: control negativo de PBS ; ARN liberado con liposoma; y el producto "Triángulo 4" .
La Figura 16 muestra estructuras de los tres lípidos de DMG conjugados con PEG (1-3 kDa) .
Las Figuras 17A a 17E muestran estructuras de diferentes lípidos conjugados con PEG, en donde R es PEG de una longitud deseada.
La Figura 18 muestra la estructura de un lipido conjugado con PEG "separado" útil. El cuadro muestra el PM total de PEG en el lipido (que, en el siguiente ejemplo específico, fue de 2000) .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Replicones de ARN Se usan a continuación diferentes replicones. En general, éstos se basan en un genoma de alfavirus híbrido con proteínas no estructurales de virus de encefalitis de equino venezolano (VEEV) , una señal de empaquetado de VEEV y un 3 ' UTR de virus Sindbis o un mutante de VEEV. El replicón es de aproximadamente 10 kb de longitud y tiene una cola poly-A.
El ADN de plásmido que codifica los replicones de alfavirus (llamado: pT7-mVEEV-FL.RSVF o A317; pT7-mVEEV-SEAP o A306; pSP6-VCR-GFP o A50) sirvió como un molde para la síntesis de ARN RNA in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de alfavirus requeridos para la replicación de ARN, pero carecen de los productos del gen de codificación necesarios para el montaje de la partícula; las proteínas estructurales se reemplazan con una proteína de interés (ya sea un reportero, tal como SEAP o GFP, o un inmunógeno, tal como la proteína RSV F de longitud total) y, de esta manera, los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor en la dirección 5' del bacteriófago (T7 o SP6) de ADNc de alfavirus facilita la síntesis del ARN del replicón in vitro y una ribozima del virus de hepatitis delta (HDV) inmediatamente en la dirección 3' de la cola de poly(A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de auto-escisión.
Después de la linearización del ADN del plásmido en la dirección 3' de la ribozima de HDV con una endonucleasa de restricción apropiada, se sintetizaron escorrentías de transcripciones in vitro usando polimerasa de ARN dependiente de ADN derivada del bacteriófago T7 o SP6. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37°C en presencia de 7.5 mM (polimerasa de ARN T7) o 5 mM (polimerasa de ARN SP6) de cada uno de los trifosfatos nucleosídicos (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion) . Después de la transcripción, el ADN del molde se digirió con TURBO DNase (Ambion) . El ARN replicón se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. El ARN sin tapa se cubrió post - transcripcionalmente con Vaccinia Capping Enzyme (VCE) usando el ScriptCap m7G Capping System (Epicentre Biotechnologies), como se representa en el manual del usuario; de esta manera, a los replicones con tapa se les proporciona el prefijo "v" , por ejemplo, VA317 es el replicón A317 con tapa por VCE. El ARN con tapa post- transcripcionalmente se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. La concentración de las muestras de ARN se determinó midiendo OD26onm- La integridad de las transcripciones in vitro se confirmó por desnaturalización de electroforesis en gel de agarosa .
Encapsulación liposo al El ARN se encapsuló en liposomas hechos esencialmente por el método de las referencias 7 y 41. Los liposomas se elaboraron de 10% de DSPC (zwiteriónico) , 40% de DlinDMA (catiónico) , 48% de colesterol y 2% de DMG conjugado con PEG. Estas proporciones se refieren a los % en moles en el liposoma total.
DlinDMA (l, 2-dilinoleiloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano) se sintetizó usando el procedimiento de la referencia i. DSPC (1 , 2 -Diastearoil-sn-glicero-3 -fosfocolina) se compró en Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich . DMG conjugado con PEG (1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietietilenglicol) , sal de amonio), DOTAP (1, 2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC-chol (clorhidrato de 3 - [N- ( ' , ' -dimetilaminoetan) -carbamoil] colesterol) fueron de Avanti Polar Lipids .
En forma breve, los lípidos se disolvieron en etanol (2 mi), un replicón de ARN se disolvió en amortiguador (2 mi, citrato de sodio 100 mM, pH 6) y éstos se mezclaron con 2 mi de amortiguador, seguido de 1 hora de equilibrio. La mezcla se diluyó con 6 mi de amortiguador, después se filtró. El producto resultante contuvo liposomas, con -95% de eficiencia de encapsulación . La Figura 2 muestra un ejemplo de una micrografía electrónica de los liposomas preparados por estos métodos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifica el antígeno RSV F de longitud total. La dispersión de luz dinámica de un lote mostró un diámetro promedio de 141 nm (por intensidad) ó 78 nm (por número) .
En un método de encapsulación particular, se prepararon soluciones patrón de lípido fresco en etanol. 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de DMG conjugado con PEG se pesaron y disolvieron en 7.55 mL de etanol. Se usaron cinco diferentes PEGs conjugados: PEG-500, PEG-750, PEG-1000, PEG-2000 o PEG-3000. La solución patrón del lípido preparado frescamente se balanceó suavemente a 37°C durante aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Después, se adicionaron 226.7 pL del patrón a 1.773 mL de etanol para hacer una solución patrón del lípido de trabajo de 2 mL. Una solución de trabajo de 2 mL de ARN también se preparó de una solución patrón de ~ 1 pg/pL en amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Se enjuagaron tres ampolletas de vidrio de 20 mL (con barras agitadoras) con solución RNase Away y se lavaron con abundante agua de MilliQ antes del uso para descontaminar las ampolletas de RNAsas . Una de las ampolletas se usó la solución de trabajo de ARN y las otras para colectar las mezclas de lípido ARN (como se describe a continuación) . Las soluciones del lípido de trabajo y ARN se calentaron a 37°C durante 10 minutos antes de cargarse en jeringas luer-lok de 3 ce. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (unión ID PEEK™ de 500 pm) usando un tubo de FEP (etileno-propileno fluorado; todo el tubo de FEP usado tuvo un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 3 mm; obtenido de Idex Health Science) . La salida del mezclador T también fue de tubo FEP. La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato se conectó a una pieza separada del tubo. Todas las jeringas después se accionaron a una velocidad de flujo de 7 mL/min usando una bomba de jeringa. Las salidas del tubo se colocaron para colectar las mezclas en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . La barra agitadora después se retiró y la solución acuosa de etanol se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la mezcla se cargó en una jeringa de 5 ce, la cual se equipó a una pieza de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 ce con una longitud igual de tubo de FEP, y se cargó un volumen igual de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Las dos jeringas se accionaron a una velocidad de flujo de 7 mL/minuto usando una bomba de jeringa y la mezcla final se colectó en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . Luego, los liposomas se concentraron a 2 mL y se dializaron contra 10-15 volúmenes de PNS IX usando un sistema de Filtración de Flujo Tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs y se usaron de acuerdo con las guías del fabricante. Se usaron las membranas de filtración de fibra hueca con un corte de tamaño de poro de 100 kD y un área superficial de 20 era2. Para los experimentos in vítro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración de ARN requerida con IX PBS .
El porcentaje del ARN encapsulado y la concentración de ARN se determinaron por el kit del reactivo de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN ribosomal RNA estándar proporcionado en el kit se usó para generar una curva estándar. Los liposomas se diluyeron ??? ó lOOx en el amortiguador IX TE (del kit) antes de la adición del colorante. Separadamente, los liposomas se diluyeron lOx ó lOOx en el amortiguador IX TE que contiene 0.5% de Tritón X antes de la adición del colorante (para interrumpir los liposomas y, de esta manera para probar el ARN total) . Posteriormente, se adicionó una cantidad igual de colorante a cada solución y luego se cargaron -180 µ?? de cada amortiguador de solución después de la adición de colorante, por duplicado en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplaca. Todas las formulaciones de liposomas se dosificaron in vivo con base en la cantidad de ARN encapsulado .
Para obtener liposomas más pequeños, se reemplazó el método de jeringa/tubo mediante un método en el que las soluciones de lípido y ARN se mezclan en canales en un chip microfluídico . Se prepararon las soluciones patrón de lípido fresco en etanol . 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG-DMG se pesaron y disolvieron en 7.55 mL de etanol. La solución patrón de lípido preparado frescamente se balanceó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea.
Después, se adicionaron 226.7 µ?? de la solución patrón a 1.773 mL de etanol para elaborar una solución patrón de lípido de trabajo de 2 mL. Una solución de trabajo de 4 mL de ARN también se preparó de una solución patrón de ~ 1 pg/pL en amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Se enjuagaron cuatro ampolletas de vidrio de 20 mL (con barras agitadoras) con solución de RNase Away y se lavaron con abundante agua de MilliQ antes del uso para descontaminar las ampolletas de RNAsas. Dos de las ampolletas se usaron para la solución de trabajo de ARN (2 mL en cada ampolleta) y las otras para colectar las mezclas de lípido y ARN. Las soluciones del lípido de trabajo y ARN se calentaron a 37 °C durante 10 minutos antes de cargarse en jeringas luer-lok de 3 ce. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectaron a un Mitos Droplet junction Chip (un dispositivo microfluídico de vidrio obtenido de Syrris, Parte No. 3000158) usando un tubo de PTFE de 0.762mm (0.03 pulgadas) de diámetro interno (ID, por sus siglas en inglés) x 1/16 de diámetro externo (OD, por sus siglas en inglés) , (Syrris) usando un conector de borde de 4 vías. Dos corrientes de ARN y una corriente de lípido se accionaron mediante bombas de jeringa y el mezclado del etanol y la fase acuosa se realizó en la unión X (100 m x 105 m) del chip. La velocidad de flujo de todas las corrientes se mantuvo a 1.5 mL/min, por esto la relación de la velocidad de flujo acuoso total a etanólico fue de 2:1. La salida del tubo se colocó para colectar las mezclas en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . La barra agitadora se retiró y la solución de etanol/acuosa se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la mezcla se cargó en una jeringa de 5 ce que se ajustó a una pieza de tubo de PTFE de 0.762mm (0.03 pulgadas) de diámetro interno x 1.58mm (1/16 pulgadas) de diámetro externo y en otra jeringa de 5 ce con una longitud igual de tubo de PTFE, se cargó un volumen igual de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Las dos jeringas se accionaron a una velocidad de flujo de 3 mL/min usando una bomba de jeringa y la mezcla final se colectó en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . Luego, los liposomas se concentraron a 2 mL y se dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando el sistema TFF antes de recuperar el producto final. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca con un corte de tamaño de poro de 100 kDa y un área superficial de 20cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración de AR requerida con IX PBS. Mientras que los liposomas se prepararon usando el método de jeringa/tubo con 75 g de ARN, tuvieron un diámetro Z promedio (Zav) de 148 nm y un índice de polidispersidad (pdl) de 0.122, la mezcla de chip dio los liposomas con un Zav de 97 nm y un pdl de 0.086. La proporción del ARN encapsulado RNA disminuyó ligeramente de 90% a 87%.
La encapsulacion en los liposomas se mostró para proteger el ARN de la digestión de RNasa. Los experimentos usaron 3.8 mAU de RNasa A por microgramo de ARN, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. RNasa se inactivo con Proteinasa K a 55 °C durante 10 minutos. Una mezcla 1:1 v/v de la muestra a fenol : cloroformo : alcohol isoamílico 25:24:1 v/v/v después se adicionó para extraer el ARN de los lípidos en la fase acuosa. Las muestras se mezclaron formando el vórtice durante unos cuantos segundos y luego se colocaron en una centrífuga durante 15 minutos a 12k RPM. La fase acuosa (que contiene el ARN) se removió y se usó para analizar el ARN. Antes de cargar (400 ng de ARN por pozo) todas las muestras se incubaron con un colorante de carga de formaldehído, desnaturalizado durante 10 minutos a 65 °C y se enfriaron a temperatura ambiente. Los marcadores de Ambion Millennium se usaron para aproximar el peso molecular de la construcción de ARN. El gel se corrió a 90 V. El gel se tiñó usando 0.1% de oro SYBR de acuerdo con las guías del fabricante, en agua balanceando, a temperatura ambiente durante 1 hora . La Figura 1 muestra que RNasa digiere completamente el ARN en ausencia de encapsulacion (carril 3). El ARN es indetectable después de la encapsulacion (carril 4) , y no se observa un cambio si estos liposomas se tratan con RNasa (carril 4) . Después de que los liposomas tratados con RNasa se someten a extracción con fenol, se observa ARN no digerido (carril 6) . Aun después de 1 semana a 4°C, el ARN podría observarse sin ninguna fragmentación (Figura 4, flecha) . La expresión proteínica in vivo no se cambió después de 6 semanas a 4°C y un ciclo de congelado-descongelado. De esta manera, el ARN encapsulado con liposoma es estable.
Para valorar la expresión in vivo del ARNm una enzima reportera (SEAP; fosfatasa alcalina secretada) se codificó en el replicón, en lugar de un inmunógeno . Los niveles de expresión se midieron en sueros diluidos 1:4 en el amortiguador de dilución Phospha-Light IX usando un sustrato de fosfato alcalino quimioluminiscente . Se inyectaron ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) intramuscularmente en el día 0, 50 µ? por pata con una dosis de ARN de 0.1 g ó 1 pg. También se administró el mismo vector sin liposomas (en IX PBS libre de RNasa) a 1 g. También se probaron replicones empaquetados con virión. Los replicones empaquetados con virión usados en la presente (referido como "VRPs") se obtuvieron por los métodos de la referencia 42, en donde el replicón de alfavirus se deriva de VEEV mutante o una quimera derivada del genoma de VEEV diseñado para contener el virus de Sindbis 3' UTR y una señal de empaquetado del virus de Sindbis (PS) , empaquetado por co-electroporación en las células BHK con ARNs auxiliares defectuosos que codifican la cápside del virus Sindbis y los genes de glicoproteína .
Como se muestra en la Figura 5, la encapsulación aumentó los niveles de SEAP en aproximadamente ½ log a la dosis de 1 pg, y en la expresión del día 6 de una dosis de 0.1 g de niveles igualados de dosis encapsulada observados con 1 g de dosis no encapsulada. En el día 3, los niveles de expresión 3 excedieron los obtenidos con VRPs (cuadrados) . De esta manera, lo expresado aumentó cuando el ARN se formuló en los liposomas con relación al control de ARN desnudo, aun a una dosis menor de lOx. La expresión también fue mayor con relación al control de VRP, pero las cinéticas de expresión fueron muy diferentes (ver la Figura 5) . La liberación del ARN con electroporación resultó en un aumento en la expresión con relación al control de ARN desnudo, pero estos niveles fueron menores que con los liposomas .
Para valorar si el efecto observado en los grupos de liposoma fue debido exclusivamente a los componentes del liposoma, o se enlazó con la encapsulación, el replicón se administró en la forma encapsulada (con dos protocolos de purificación diferentes, 0.1 g de ARN) o mezclado con los liposomas después de su formación (un "lipoplex" no encapsulado, 0.1 g de ARN) o como ARN desnudo (1 µg) . La figura 10 muestra que el lipoplex dio los niveles de expresión más bajos, que muestran que la encapsulación es esencial para la expresión potente.
Los experimentos de SEAP adicionales mostraron una respuesta de la dosis clara in vivo, con la expresión observada después de la liberación de tan poco como 1 ng de ARN (figura 6) . Los experimentos adicionales que comparan la expresión de replicones encapsulados y desnudos indicaron que 0.01 pg de ARN encapsulado fue equivalente a 1 pg de ARN desnudo. A una dosis de 0.5 g de ARN, el material encapsulado dio una expresión 12 veces mayor en el día 6; a una dosis de 0.1 pg, los niveles fueron 24 veces mayores en el día 6.
En lugar de observar los niveles promedio en el grupo, también se estudiaron los animales individuales. Mientras que varios animales no fueron respondedores a los replicones desnudos, la encapsulación se eliminó de los no respondedores .
Los experimentos adicionales reemplazaron DlinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas de DOTAP dieron una mejor expresión que el replicón desnudo, fueron inferiores a los liposomas de DlinDMA (diferencia de 2 a 3 veces en el día 1) .
Para valorar la inmunogenicidad in vivo, se construyó un replicón para expresar la proteína F de longitud total del virus sincitial respiratorio (RSV) . Esto se liberó desnudo (1 pg) , encapsulado en liposomas (0.1 ó 1 pg) , o empaquetado en viriones (106 IU; "VRP" ) en los días 0 y 21. La Figura 7 muestra titulaciones de anti-F IgG, 2 semanas después de la segunda dosis, y los liposomas mejoran claramente la inmunogenicidad. La Figura 8 muestra titulaciones 2 semanas después, mediante tal punto no existió una diferencia significativa entre el ARN encapsulado a 0.1 g, el ARN encapsulado a l pg, o el grupo VRP. Las titulaciones de neutralización (medida como 60% de reducción de placa, "PR T60") no fueron signif cativamente diferentes en estos tres grupos, 2 semanas después de la segunda dosis (FIGURA 9) . La Figura 12 muestra las titulaciones de IgG y PRNT, 4 semanas después de la segunda dosis.
La Figura 13 confirma que el ARN provoca una respuesta de células CD8 T robusta.
Los experimentos adicionales compararon las titulaciones de IgG F-específicas en ratones que reciben VRP, 0.1 pg de ARN encapsulado con liposoma o 1 g de ARN encapsulado con liposoma. Las relaciones de titulación (VRP : liposoma) a varios tiempos después de la segunda dosis fueron como sigue: De esta manera, el ARN encapsulado con liposoma induce esencialmente la misma magnitud de respuesta inmune, como se observa con la liberación del virión.
Los experimentos adicionales mostraron respuestas de IgG F-específicas con una dosis de 10 g, respuestas equivalentes para dosis de 1 pg y 0.1 pg, y una respuesta menor con una dosis de 0.01 pg. La Figura 11 muestra las titulaciones de IgG en ratones que reciben el replicón en la forma desnuda, a 3 dosis diferentes, en liposomas a 4 dosis diferentes, o como VRP (106 IU) . La respuesta observada con 1 pg de ARN encapsulado con liposoma fue estadísticamente insignificante (ANOVA) cuando se compara con VRP, pero la respuesta mayor observada con 10 pg de ARN encapsulado con liposoma fue estadísticamente significativa (p<0.05) cuando se compara con ambos de estos grupos.
Un estudio adicional confirmó que 0.1 pg de ARN encapsulado con liposoma dio respuesta de anti-F IgG mucho mayores (post-segunda dosis de 15 días) que 0.1 pg de ADN liberado, y aun fue más inmunogénico que 20 pg de ADN de plásmido que codifica el antígeno F, liberado por electroporación (Elgen™ DNA Delivery System, Inovio) .
Métodos de manufacturación de liposoma En general, se han usado ocho diferentes métodos para preparar los liposomas de acuerdo con la invención. Éstos se refieren en el texto como métodos (A) a (H) y difieren principalmente con relación a las etapas de filtración y TFF. Los detalles se dan a continuación: (A) se prepararon soluciones patrón de lípido fresco en etanol. 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG DMG 2000 se pesaron y disolvieron en 7.55 mL de etanol. La solución patrón del lípido preparado frescamente se balanceó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Después, se adicionaron 755 L del patrón a 1.245 mL de etanol para hacer una solución patrón del lípido de trabajo de 2 mL. Esta cantidad de lipidos se usó para formar liposomas con 250 g de ARN. Una solución de trabajo de 2 mL de ARN también se preparó de una solución patrón de ~ 1 g/ L en amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Se enjuagaron tres ampolletas de vidrio de 20 mL (con barras agitadoras) con solución RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) y se lavaron con abundante agua de MilliQ antes del uso para descontaminar las ampolletas de RNAsas . Una de las ampolletas se usó la solución de trabajo de ARN y las otras para colectar las mezclas de lipido ARN (como se describe a continuación) . Las soluciones del lípido de trabajo y ARN se calentaron a 37°C durante 10 minutos antes de cargarse en jeringas luer-lok de 3 ce. 2 mL del amortiguador de citrato (pH 6) se cargó en otra jeringa de 3 ce. Las jeringas que contienen ARN y los lipidos se conectaron a un mezclador T (unión ID PEEK™ de 500 µp?, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) usando un tubo de FEP (etileno-propileno fluorado; todo el tubo de FEP usado tiene un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 3 mm; obtenido de Idex Health Science) . La salida del mezclador T también fue de tubo FEP. La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato se conectó a una pieza separada del tubo FEP. Todas las jeringas después se accionaron a una velocidad de flujo de 7 mL/min usando una bomba de jeringa. Las salidas del tubo se colocaron para colectar las mezclas en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . La barra agitadora después se retiró y la solución acuosa de etanol se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la mezcla se cargó en una jeringa de 5 ce, la cual se equipó a una pieza de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 ce con una longitud igual de tubo de FEP, y se cargó un volumen igual de amortiguador de citrato 100 m (pH 6) . Las dos jeringas se accionaron a una velocidad de flujo de 7 mL/minuto usando una bomba de jeringa y la mezcla final se colectó en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . Luego, la mezcla colectada de la segunda etapa de mezclado (liposomas) se pasaron a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio aniónico que une y remueve las moléculas aniónicas, obtenido de Pall Corporation, AnnArbor, MI, USA) . Antes de pasar los liposomas, se pasaron sucesivamente 4 mL de NaOH 1 M, 4 mL de NaCl 1 M y 10 mL de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) a través de la membrana Mustang. Los liposomas se calentaron 10 min a 37°C antes de pasar a través de la membrana, Luego, los liposomas se concentraron a 2 mL y se dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando TFF antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs y se usaron de acuerdo con las guías del fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona (parte número P/N: XIAB-100 -20P) con un corte de tamaño de poro de 100 kD y un área superficial de 8 cm2. Para los experimentos in vi tro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración de ARN requerida con IX PBS.
(B) Como el método (A) excepto que, después del balanceo, se adicionaron 226.7 L del patrón a 1.773 mL de etanol para hacer una solución patrón del lípido de trabajo de 2 mL, modificando de esta manera la relación de lípido : ARN.
(C) Como el método (B) excepto que se omitió la filtración Mustang, de esta manera los liposomas fuero de la ampolleta de vidrio de 20 mL en la diálisis de TFF.
(D) Como el método (C) excepto que TFF usó membranas de fibra hueca de poliétersulfona (PES) (parte número P-C1-100E-100-01N) con un corte de tamaño de poro de 100 kD y un área superficial de 20 cm2.
(E) Como el método (D) excepto que se usó una membrana Mustang, como en el método (A) .
(F) Como el método (A) excepto que se omitió la filtración Mustang, de esta manera, los liposomas fueron de la ampolleta de vidrio de 20 mL en la diálisis de TFF.
(G) Como el método (D) excepto que se preparó una solución de trabajo de 4 mL de ARN de una solución patrón de ~ 1 pg/pL en amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Después se prepararon cuatro ampolletas de 20 mL de la misma manera. Dos de éstas se usaron para la solución de trabajo de ARN (2 mL en cada ampolleta) y las otras para colectar las mezclas de lípido y ARN, como en (C) . En lugar de usar el mezclador T, las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectaron a un chip de unión Mitos Droplet (un dispositivo microfluídico de vidrio obtenido de Syrris, Parte No. 3000158) usando un tubo de PTFE (0.03 pulgadas de diámetro interno x 1/16 pulgadas de diámetro externo) usando un conector de borde de 4 vías (Syrris) . Dos corriente de ARN y una corriente de lípido se accionaron mediante bombas de jeringa del etanol y la fase acuosa se hizo en la unión X (100 µp x 105 m) del chip. La velocidad de flujo de las tres corrientes se mantuvo a 1.5 mL/min, por esto, la relación del acuoso total a la velocidad de flujo etanólico fue de 2:1. La salida del tubo se colocó para colectar las mezclas en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . La barra agitadora se retiró y la solución de etanol/acuosa se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 1 h. Luego la mezcla se cargó en una jeringa de 5 ce, la cual se ajustó a otra pieza del tubo de PTFE; en otra jeringa de 5 ce con una longitud igual del tubo de PTFE, se cargó un volumen igual de amortiguador de citrato 100 m (pH 6) . Las dos jeringas se accionaron a una velocidad de flujo de 3mL/min usando una bomba de jeringa y la mezcla final se colectó en una ampolleta de vidrio de 20 mL (mientras se agitaba) . Luego, los liposomas se concentraron a 2 mL y se dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando TFF, como en (D) .
(H) Como el método (A) excepto que la solución patrón de lípido de trabajo de 2 mL se realizó mezclando 120.9 L del patrón de lípido con 1.879 mL de etanol . También, después de mezclar en un mezclador T, los liposomas de la ampolleta de 20 mL se cargaron en un cásete de diálisis Pierce Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific, extra concentración, 0.5-3 mL de capacidad) y se dializó contra 400-500 mL de IX PBS durante la noche a 4°C en un recipiente de plástico sometido a autoclave antes de recuperar el producto final.
Inmunogenicidad RSV El replicón de auto-replicación de vA317 que codifica la proteína RSV F, se administró a ratones BALB/c, 4 u 8 animales por grupo, mediante vacunaciones laterales intramuscular (50 L por pata) en los días 0 y 21 con el replicón (1 pg) sólo o formulado como liposomas con DlinDMA ("RVOl") o DOTAP ("RV13") o el lípido mostrado en la Figura 14 ("RV05") . Los liposomas RVOl tuvieron 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG, pero con diferentes cantidades de ARN. Los liposomas RV05 tuvieron ya sea 40% de RV05, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG ó 60% de RV05, 38% de colesterol y 2% de PEG-DMG. Los liposomas RV13 tuvieron 40% de DOTAP, 10% de DOPE, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG. En todos los casos, el PEG fue PEG-2000 (es decir, PEG 2 kDa) . Por comparación, el plásmido de ADN desnudo (20 yg) que expresa el mismo antígeno RSV-F, se liberó ya sea usando electroporación o con liposomas RVOl (10) (0.1 g de ADN) . Se usaron cuatro ratones como un grupo de control ingenuo.
Los liposomas se prepararon mediante el método (A) o el método (B) . Para algunos liposomas hechos por el método (A) , se usó una cantidad doble o la mitad de ARN. El diámetro de partícula promedio Z y el índice de polidispersidad fueron: El suero se colectó para el análisis de anticuerpos en los días 14, 36 y 49. Los bazos se cosecharon de los ratones en el día 49 para el análisis de las células T.
Las titulaciones de IgG en suero F-específicas (GMT) fueron como sigue: La proporción de las células T que son positivas en citosina y específicas para el péptido RSV F51-66 son como sigue, mostrando solamente las cifras que son estadísticamente significativas mayores de cero: De esta manera, las formulaciones de liposoma mejoran significativamente la inmunogenicidad con relación a los controles de ARN desnudo, como se determina por el aumento en las titulaciones de IgG F-específ icas y las frecuencias de las células T. El plásmido de ADN formulado con liposomas, o liberado desnudo usando electroporación , fue significativamente menos inmunogénico que el ARN de auto-replicación formulado con liposoma.
Los liposomas de RV01 adicionales se prepararon por el método (H) , usando otra vez 2 kDa de PEG conjugado a DMG, y ya sea encapsulando 150 yg de ARN (replicón vA375 que codifica la glucoproteína de fusión superficial de RSV) o encapsulando solamente el amortiguador. De esta manera, estos liposomas tuvieron 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Colesterol y 2% de PEG-DMG. Los tamaños y la encapsulacion fueron como sigue: Los liposomas se administraron a ratones BALB/c (10 por grupo) por inyección intramuscular bilateral (50 µ? por pata) en los días 0 y 21. Las dosis fueron de 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 ó 1 \iq. Las titulaciones de IgG en suero F-específico y de PRNT60 (GMT) fueron como sigue, 2 semanas después de la primera o segunda inyección: Inmunogenicidad de citomegalovirus Los liposomas de RV01 con DLinDMA como el lípido catiónico y PEG de 2 kDa se usaron para liberar los replicones de AR que codifican glucoproteínas de CMV. El replicón MvA160" codifica glucoproteína de longitud total H y L (gH/gL) , mientras que el replicón "vA322" codifica una forma soluble (gHsol/gL) . Las dos proteínas están bajo el control de promotores subgenómicos separados en un replicón simple; co-administración de dos vectores separados, uno que codifica gH y uno que codifica gL, no dieron buenos resultados .
Ratones BALB/c, 10 por grupo, se administraron con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 por pata) en los días 0, 21 y 42 con expresión de VRPs gH/gL (1x10s IU) , expresando VRPs gHsol/gL (lxlO6 IU) y PBS como los controles. Dos grupos de prueba recibieron 1 µ? del replicón VA160 o vA322 formulado en liposomas (40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Colesterol, 2% de PEG-DMG; elaborado usando el método (D) pero con 150 g del tamaño del lote de ARN) . 1 Los liposomas vA160 tuvieron un diámetro Zav de 168.8 nm, un pdl de 0.144 y 87.4% de encapsulación . Los liposomas vA322 tuvieron un diámetro Zav de 162 nm, un pdl de 0.131 y 90% de encapsulación.
Los replicones fueron capaces de expresar dos proteínas de un vector simple.
Los sueros se colectaron para el análisis inmunológico en el día 63 (3wp3) . Las titulaciones de neutralización de CMV (el recíproco de la dilución sérica que produce una reducción de 50% en el número de focos de virus positivo por pozo, con relación a los controles) fueron como sigue: El ARN que expresa ya sea una forma de longitud total o una soluble del complejo de CMV gH/gL, de esta manera, provocó altas titulaciones para neutralizar anticuerpos, como se prueba en las células epiteliales. Las titulaciones promedio provocadas por los ARNs encapsulados con liposoma fueron, por lo menos, tan altas como para los VRPs correspondientes.
Los experimentos repetidos confirmaron que el replicón fue capaz de expresar dos proteínas de un vector simple. El replicón de ARN dio una titulación de 3wp3 de 11457, comparado con 5516 con VRPs .
Cinética de expresión Un replicón de ARN de auto- replicación ("vA311") que expresa un gen reportero de luciferasa (luc) se usó para estudiar la cinética de la expresión proteínica después de la inyección. Ratones BALB/c, 5 animales por grupo, recibieron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pL por pata) en el día 0 con: Grupo 1 ADN que expresa luciferasa, liberado usando electroporación (10 pg) Grupo 2 ARN de auto-replicación (1 g) formulado en liposomas (40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol, 2% de PEG-2000 conjugado a DMG Grupo 3 ARN de auto-replicación (1 g) formulado con una nanoemulsión catiónica (CNE17) Grupo 4 ARN de auto-replicación (1 vq) formulado con una nanoemulsión catiónica diferente Grupo 5 VRP (lxlO6 IU) que expresa luciferasa.
Antes de la vacunación los ratones se depilaron. Los ratones se anestesiaron (2% de isoflurano en oxígeno) , primero se retiró el cabello con un rastrillo eléctrico y después con crema depiladora química. Los datos de bioluminescencia después se adquirieron usando un sistema de imagen Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) en los días 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 y 70. Cinco minutos antes de la imagen, los ratones se inyectaron intraperitonealmente con 8 mg/kg de solución de luciferina. Los animales después se anestesiaron y se transfirieron al sistema de imagen. Los tiempos de adquisición de la imagen se mantuvieron constantes ya que la señal de bioluminiscencia se midió con una cámara CCD enfriada .
En términos visuales, las células que expresan luciferasa se observó que permanecen principalmente en el sitio de inyección de ARN, y los sometidos a la imagen después de la remoción de cuads no mostraron señal .
En términos cuantitativos, la expresión de luciferasa se midió como la radiación promedio durante un periodo de 70 días (p/s/cm2/sr) , y los resultados fueron como sigue para los 5 grupos: El ARN de auto-replicación formulado con nanoemulsiones catiónicas, mostró una bioluminiscencia medible en el día 3, que tuvo un pico en el día 7 y luego se redujo a los niveles de fondo en los días 28 a 35. Cuando se formula en liposomas, el ARN mostró una bioluminiscencia medible en el día 3, que tuvo un pico en el día 7 y se redujo a los niveles de fondo en el día 63. El ARN liberado usando VRPs mostró una bioluminiscencia mejorada en el día 21, cuando se compara con el ARN formulado, pero la expresión se había reducido a los niveles de fondo en el día 28. El ADN sometido a electroporación mostró el nivele más alto de bioluminiscencia en todos los intervalos medidos, y los niveles de bioluminiscencia no se reducen a los niveles de fondo dentro de los 70 días del experimento.
Volumen de liberación La liberación hidrodinámica emplea la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución para superar las barreras físicas de las membranas celulares, las cuales evitan que entren a las células compuestos grandes y de membranas impermeables . Este fenómeno se ha mostrado previamente que es útil para la liberación intracelular de las vacunas de ADN.
Un volumen de liberación de ratón típico para la inyección intramuscular es de 50 µ? en la pata trasera, que es un volumen relativamente alto para un músculo de la pata de un ratón. Por el contrario, una dosis intramuscular humana de -0.5 mi es relativamente pequeña. Si la inmunogenicidad en los ratones fuera dependiente del volumen, entonces la eficacia de las vacunas del replicón podría ser debida, por lo menos en parte, a las fuerza hidrodinámicas, que no sería motivador para usar las mismas vacunas en los humanos y animales más grandes.
El replicón vA317 se liberó a ratones BALB/c, 10 por grupo, por vacunaciones intramusculares bilaterales (5 ó 50 por pata) en el día 0 y 21: Grupo 1 recibió replicón desnudo, 0.2 µ? en 50 pL por pata Grupo 2 recibió el replicón desnudo, 0.2 pg en 5 pL por pata Grupo 3 recibió el replicón formulado con emulsión (0.2 pg, 50 pL por pata) Grupo 4 recibió el replicón formulado con emulsión (0.2 pg, 5 pL por pata) Grupo 5 recibió el replicón formulado con liposoma (0.2 g, 50 µ?_ por pata) Grupo 6 recibió el replicón formulado con liposoma (0.2 pg, 5 pL por pata) .
Los liposomas para los grupos 5 y 6 fueron 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-2000 conjugado a DMG.
El suero se colectó para el análisis de anticuerpo en los días 14 y 35. IgG GMTs séricos F-específico fueron: De esta manera, la inmunogenicidad del replicón formulado no varía de acuerdo con el volumen deliberado, indicando, de esta manera, que estas vacunas de ARN no dependen de la liberación hidrodinámica para su eficacia. Ratas algodón Se realizó un estudio en ratas algodón (Sigmodon hispidis) en lugar de ratones. A una dosis de 1 g, la encapsulacion de liposoma aumentó las titulaciones de IgG F-específico por 8.3 veces, comparado con el ARN desnudo y aumentó las titulaciones PRNT en 9.5 veces. La magnitud de la respuesta de anticuerpo fue equivalente a la inducida por VRP 5x10s IU. El ARN desnudo y encapsulado con liposoma fueron capaces de proteger las ratas algodón de la estimulación de RSV (lxlO5 unidades de formación de placa) , reduciendo la carga viral pulmonar en por lo menos 3.5 logs . La encapsulacion aumentó la reducción en aproximadamente 2 veces .
El trabajo adicional en las ratas algodón usó cuatro diferentes replicones: vA317 expresa RSV-F de longitud total; vA318 expresa RSV-F truncado (transmembrana y cola citoplásmica removida) ; vA142 expresa RSV-F con su péptido de fusión eliminado; vA140 expresa RSV-F truncado también sin su péptido. Las ratas algodón, 4 a 8 animales por grupo, se administraron vacunaciones intramusculares (100 pL en una pata) en los días 0 y 21 con los cuatro diferentes replicones a dos dosis (1.0 y 0.1 pg) formulados en los liposomas elaborados usando DMG PEG conjugado de 2 kDa por el método (D) , pero con un tamaño de lote de 150 pg de ARN. Los grupos de control recibieron una vacuna de proteína de subunidad RSV-F (5 pg) con adyuvantada de (8 animales/grupo) , VRPs que expresa RSV-F de longitud total (lxlO6 IU, 8 animales/grupo) o control ingenuo (4 animales/grupo) . El suero se colectó para el análisis de anticuerpo en los días 0, 21 y 34.
Las titulaciones de IgG en suero F-específicas y las titulaciones de anticuerpo neutralizante en suero de RSV en el día 21 y 34 fueron: Los cuatro replicones evaluados en este estudio (vA317, vA318, vA142, vA140) fueron inmunogénicos en las ratas algodón cuando se liberación por liposomas, aunque las titulaciones de neutralización en suero fueron por lo menos diez veces menores que las inducidas por las vacunas de proteína adyuvantada o por VRPs . Las vacunas de liposoma/ARN provocaron IgG F-especí f icas en suero y anticuerpos de neutralización de RSV después de la primera vacunación, y una segunda vacunación promovió la respuesta efectivamente. Las titulaciones de IgG F-específicas después de la segunda vacunación con 1 µg de replicón fueron 2 a 3 veces mayores que después de la segunda vacunación con 0.1 pg de replicón. Los cuatro replicones provocaron titulaciones de anticuerpos comparables, lo que sugieren que RSV-F de longitud total y truncado, cada uno con o sin el péptido de fusión, son similarmente inmunogénicos en las ratas algodón.
El trabajo adicional en ratas algodón usó nuevamente las replicones vA317, vA318 y vA142. Las ratas algodón, 2-8 animales por grupo, se administraron vacunaciones intramusculares (100 L en una pata) en los días 0 y 21 con los replicones (0.1 ó 1 µ?) encapsulado en liposomas RV01 (con PEG-2000) hecho por el método (D) , pero con un tamaño de lite de 150 de ARN . Los grupos de control recibieron la vacuna proteínica de subunidad de RSV-F (5 \iq) adyuvantada de alum o VRPs que expresa RSV-F de longitud total (lxlO6 IU, 8 animales/grupo) . Todos estos animales recibieron una tercera vacunación (día 56) con la vacuna proteínica de subunidad RSV-F (5 g) adyuvantada de alum. Además, hubo un control ingenuo (4 animales/grupo) . Además, un grupo adicional se administró con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 L por pata) en los días 0 y 56 con 1 µ? de vA317 RNA en los liposomas, pero no recibieron una tercera vacunación con la vacuna proteínica de subunidad.
El suero se colectó por el análisis de anticuerpos en los días 0, 21, 35, 56, 70, más los días 14, 28 y 42 para el grupo adicional. Las titulaciones de IgG séricas F específicas (GMT) fueron como sigue: Las titulaciones de neutralización en suero fueron como igue (60% de titulaciones de neutralización RSV para 2 fondos de -4 animales por grupo, GMT de estos 2 fondos por grupo) : Las titulaciones en suero y las titulaciones neutralizantes para el grupo adicional fueron como sigue: De esta manera, los replicones se confirman como en las ratas algodón, provocando anticuerpos neutralizantes de IgG y RSV F-específieos en suero después de la primera vacunación. Una segunda vacunación provocó las respuestas efectivamente. Las titulaciones de IgG F-específicas después de la segunda vacunación con 1.0 g de replicón fueron 1.5 a 4 veces mayor que después de la segunda vacunación con 0.1 de ]xg de replicón.
La tercera vacunación (proteína en el día 56) no provocó titulaciones en las ratas algodón vacunadas previamente con la subunidad del trímero F + alum, pero no proporcionó una gran respuesta a las titulaciones en las ratas algodón vacunadas previamente con replicón. En la mayoría de los casos, las titulaciones de neutralización de RSV en suero después de dos vacunaciones de replicón seguido de estímulos proteínicos fueron iguales a, o mayor que las titulaciones inducidas por dos o tres vacunaciones proteínicas secuenciales .
Este estudio evaluó la cinética de la respuesta del anticuerpo a 1.0 g de vA317. Las titulaciones de neutralización de IgG y RSV F-específicas en suero inducidas por una sola vacunación, alcanzaron su pico alrededor del día 21 y se mantuvieron a través de por lo menos el día 56 (caída de 50-70% en la titulación de IgG F-específico, poco cambio en la titulación de neutralización en RSV) . Una segunda vacunación homologa se administró a estos animales en el día 56, y estimuló las titulaciones del anticuerpo a un nivel por lo menos igual al obtenido cuando se administró la segunda vacunación en el día 21.
Los experimentos adicionales involucraron una estimulación viral. El replicón vA368 codifica la glucoproteína superficial de tipo silvestre de longitud total de RSV con el péptido de fusión eliminado, con la expresión activada por EV71 IRES . Las ratas algodón, 7 por grupo, se administraron vacunaciones intramusculares (100 L por pata) en los días 0 y 21 con vA368 en los liposomas preparados por el método (H) , 175 pg de tamaño de lote de ARN, o con VRPs que tienen el mismo replicón. Los liposomas incluyeron PEG de 2 kDa, conjugado a DMG. Un grupo de control recibió 5 uq de proteína de proteína alum-adyuvantada, y también se incluyó un grupo de control ingenuo.
Todos los grupos recibieron una estimulación intranasal (i.n.) con lxlO6 PFU RSV, cuatro semanas después de la inmunización final. El suero se colectó para el análisis de anticuerpos en los días 0, 21, 35. LAs titulaciones pulmonares virales se midieron 5 días post-estimulación. Los resultados fueron como sigue: De esta manera, la vacuna de ARN redujo la carga viral pulmonar en tres logaritmos, de aproximadamente 106 PFU/g en las ratas algodón de control no vacunadas a menos de 103 PFU/g en ratas algodón vacunadas.
Estudio en mamíferos grandes Se realizó un estudio en animales grandes en ganado. Becerros (de 4-6 semanas de edad, -60-80 kg, 5 por grupo) se inmunizaron con 66 pg d replicón vA317 que codifica la proteína RSV F de longitud total en los días 0, 21, 86 y 146. Los replicones se formularon dentro de los liposomas elaborados por el método (E) , pero con un tamaño de lote de ARN de 1.5 mg; tuvieron 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-2000 conjugado a DMG. Sólo se usó PBS como un control negativo, y se usó una vacuna con licencia como un control positivo ("Triángulo 4" de Fort Dodge, que contiene virus asesino) . Todos los becerros recibieron 15 pg de proteína F adyuvantada con la emulsión F59 en el día 146.
Las vacunas de ARN codificaron RSV F humano, mientras que la vacuna del "Triángulo 4" contiene RSV F bovino, pero la proteína RSV F se conserva altamente entre BRSV y HRSV.
Los becerros recibieron 2 mi de cada vacuna experimental, administrada intramuscularmente como 2x1 mi en cada lado del cuello. Por el contrario, la vacuna del "Triángulo 4" se administró como una sola dosis de 2 mi en el cuello .
El suero se colectó para el análisis de anticuerpo en los días 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 y 202. Si un animal individual tuvo una titulación menor del límite de detección se asignó una titulación de 5.
La Figura 15 muestra las titulaciones de IgG F-específicas durante 210 días. Durante los primeros 63 días, el replicón de ARN fue inmunogénico en las vacas por medio de liposomas, aunque dio titulaciones menores que la vacuna con licencia. Todas las vacas vacunadas mostraron anticuerpos F-específicos después de la segunda dosis, y las titulaciones fueron muy estables desde el periodo de 2 a 6 semanas después de la segunda dosis (y fueron particularmente estables para las vacunas de ARN) . Las titulaciones hasta el día 202 fueron como sigue: Las titulaciones de anticuerpo neutralizantes en suero de RSV fueron como sigue: El material usado para la segunda dosis de liposoma no se preparó de forma fresca, y el mismo lote de ARN mostró una disminución en la potencia en un estudio de inmunogenicidad de ratón. Por lo tanto, es posible que la vacuna hubiera sido más inmunogénica si el material fresco hubiera sido usado para todas las vacunaciones.
Cuando se prueba con el complemento, los anticuerpos neutralizantes se detectaron en todas las . vacas vacunadas. En esta prueba, todos becerros vacunados tuvieron buenos anticuerpos neutralizantes después de la segunda vacunación de ARN. Además, la vacuna de ARN provocó titulaciones de IgG en suero F-específicas que se detectaron en unos cuantos becerros después de la segunda vacunación y todos los becerros después de la tercera.
RSV-F con MF59 - adyuvantado fue capaz de estimular la respuesta de IgG en todos los becerros vacunados previamente, y estimular las titulaciones de neutralización independientes del complemento de los becerros previamente vacunados con ARN.
La prueba del concepto las vacunas de ARN en animales grandes es particularmente importante desde el punto de vista de la pérdida en la potencia observada previamente con las vacunas a base de ADN, cuando se mueven desde modelos de animales pequeños hasta animales y humanos más grandes. Una dosis típica para una vacuna de ADN en vacas sería de 0.5-1 mg [iv, v] y, de esta manera, es muy motivador que las respuestas inmunes se indu eran con solamente 66 µg de ARN.
Efecto de la longitud de PEG Como se mencionó anteriormente, los liposomas se prepararon usando DMG, al que se conjugaron cinco diferentes PEGs . El peso molecular promedio de PEG fue de 500Da, 750Da, lkDa, 2kDa ó 3kDa.
Los liposomas formados usando PEGs más cortos (500Da y 750Da) fueron inestables o se agregaron durante la purificación de TFF . PEG-750 dio liposomas con un diámetro promedio Z significativamente mayor (669 nm) y un índice de polidispersidad (0.21) , con 77% de encapsulación . Los liposomas de PEG-500 se agregaron visiblemente en solución durante el proceso TFF y se terminó el experimento. De esta manera, estos liposomas de PEG cortos fueron inestables, pero los PEGs más largos formaron liposomas estables.
Las diferentes longitudes del PEG (Figura 16) tuvieron un pequeño efecto sobre el diámetro del liposoma y el índice de polidispersidad. El diámetro promedio Z fue de 197 nm (pfl de 0.119) para PEG de 1 kDa, 142 nm (pdl de 0.137) para el PEG de 2 kDa y 147 nm (pdl de 0.075) para el PEG de 3 kDa. La encapsulación del ARN aumentó gradualmente conforme aumentó la longitud del PEG, de 81.7% a 85.9% a 91.5% (aunque esta relación no se observó siempre en los experimentos subsecuentes) .
Los liposomas se administraron a los ratones por inyección intramuscular en el día 0. Los niveles de SEAP en suero se midieron en los días 1, 3 y 6 mediante la prueba quimioluminiscente . Como se muestra en la Figura 3, las tres longitudes de PEG todas fueron efectivas, pero variando la longitud del PEG tuvo algún efecto sobre los niveles de SEAP en suero, dando el PEG 2000 la expresión más alta.
Diferentes lipidos y longitudes de PEG El replicón de vA317 se administró en liposomas que tienen una variedad de diferentes lipidos con diferentes longitudes de PEG. Los liposomas tuvieron todos 40% de DlinDMA, 10% de DSPC y 48% de colesterol, pero se varió el restante 2%, con diferentes lipidos PEGilados (por ejemplo, Figuras 17A a 17E) y diferentes longitudes de PEG.
Las características físicas de los liposomas, hechos el método (H) , fueron: Ratones BALB/c, 8 por grupo, se administraron con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pL por pata) en los días 0 y 21 con el replicón, ya sea desnudo (1 iq) o encapsulado en estos liposomas (0.1 pg) . El suero se colectó para el análisis del anticuerpo en los días 14 y 35.
Las titulaciones de IgG en suero F-específicas (GMT) fueron como sigue, 2 semanas después de las dos inyecciones (2wpl) : Los resultados muestran una tendencia, lo que indica que los grupos de cabeza PEG de peso molecular superior son más inmunogénicos . Ya que la longitud de PEG conjugado a DMG aumenta de 1000Da a 3000Da, las titulaciones de IgG F-específicas de 2wp2 aumentan de 7412 a 15659 a 22378.
Cambiando la región enlazadora del éster a éter no impactó las titulaciones sustancialmente . También, en el mismo peso molecular del grupo de cabeza (2000) hubo una tendencia que aumentando la longitud de las colas de lípidos disminuye las titulaciones (H con dialquilo C14 vs. I con dialquilo C18) . Reemplazando una cola de lípido de PEG dialquilo con colesterol tuvo poco impacto sobre la inmunogenicidad (A con DMG vs . G con colesterol) .
Los experimentos similares se realizaron con diferentes lípidos, en los que 2kDa de PEG se divide en grupos 2x de 1 kDa (Figura 18, con un PM total en la región del cuadro que es de 2000) . El replicón vA317 después se usó nuevamente, con los ratones BALB/c, 8 por grupo, administrado con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 uL por pata) en los días 0 y 21 con 1 µ? de ARN desnudo ó 0.1 µ? de ARN encapsulado con liposoma. Los liposomas tuvieron 40% de lípido catiónico (DlinDMA) , 10% de DSPC y 48% de colesterol, pero se varió el restante 2%, con diferentes lípidos PEGilados (pero todos con PEG de 2 kDa) . Se elaboraron por el método (H) .
Las características físicas de los liposomas fueron: Los liposomas adicionales se realizaron con RV05. Los liposomas tuvieron 40% de lípido catiónico (RV05) y 2% de DMG PEGilatado (PEG de 2 kDa) , mientras que los componentes restantes variaron (pero siempre se incluyó el colesterol) . Los liposomas se realizaron por el método (H) , pero con pH 5. Las características físicas fueron: aGC = a-galactosilceramida Ratones BALB/c, 8 por grupo, se administraron con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 L por pata) en los días 0 y 21 con el replicón, ya sea desnudo (1 pg) o encapsulado (0.1 µ?) . El suero se colectó para el análisis del anticuerpo en los días 14 y 35. Las titulaciones de IgG en suero F-específicas (GMT) fueron como sigue, 2 semanas después de las dos inyecciones (2wpl) : De esta manera, dividiendo los grupos de cabeza de PEG diminuyo las titulaciones in vivo. Incluyendo un enlace doble (1 grado de instauración por cola de alquilo) en las colas de lípidos de PEG aumentó las titulaciones de IgG, 6 veces en el día 14 y 7 veces en el día 35. Para un lípido catiónico con un cola de lípido asimétrica (alquilo + colesterol) , cambiando el lípido neutro de DSPC (cola de lípido C18 saturado) a 18:2 o 18:3 PC (con 2 y 3 enlaces dobles insaturados por cola) aumentó las titulaciones de IgG total. Se observaron resultados comparables con el reemplazamiento de DSPC con DPyPE.
Se entenderá que la invención se ha descrito sólo a manera de ejemplo y que pueden hacerse modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención.
Tabla 1: Fosfolípidos útiles DDPC 1 , 2-Didecanoil-sn-Glicero-3 -fosfatidilcolina DEPA 1, 2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfato DEPC 1, 2-Erucoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DEPE 1, 2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1, 2-Dierucoil-sn-Glicero-3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DLOPC 1, 2-Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DLPA 1, 2-Dilauroil-sn-glicero-3-fosfato DLPC 1 , 2 -Dilauroil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina DLPE 1, 2-Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DLPG 1, 2-Dilauroil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DLPS 1, 2-Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DMG 1, 2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DMPA 1, 2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato DMPC 1, 2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DMPE 1, 2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DMPG 1, 2-Miristoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DMPS 1 , 2-Dimiristoil-sn-glicero-3 -fosfatidilserina DOPA 1, 2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfato DOPC 1, 2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DOPE 1, 2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DOPG 1, 2-Dioleoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DOPS 1, 2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DPPA 1, 2-Dipalmitoil-sn-glicero-3 -fosfato DPPC 1, 2-Dipalraitoil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina DPPE 1, 2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DPPG 1, 2-Dipalmitoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DPPS 1, 2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DPyPE 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DSPA 1, 2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfato DSPC 1, 2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSPE 1, 2-Diostearil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DSPG 1, 2-Distearoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DSPS 1, 2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina EPC PC de huevo HEPC PC de huevo hidrogenado HSPC PC de soja hidrogenado de alta pureza HSPC PC de soja hidrogenado LYSOPC MYRISTIC l-Miristoil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina LYSOPC PALMITIC l-Palmitoil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina LYSOPC STEARIC 1-estearoil- sn-glicero- 3 - fosfatidilcolina Esfingomielina de leche MPPC 1-Miristoil, 2-palmitoil-sn-Glicero 3 -fosfatidilcolina MSPC 1-Miristoil , 2 -estearoil- sn-glicero-3-fos atidilcolina PMPC 1-Palmitoil, 2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina POPC 1-Palraitoil, 2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina POPE 1 -Palmitoil-2 -oleoil-sn-glicero- 3 -fosfatidiletanolamina POPG 1 , 2 -Dioleoil- sn-glicero- 3 [fosfatidil-rac- (1-glicerol) ... ] PSPC 1- Palmitoil , 2 -estearoil- sn-glicero- 3-fosfatidilcolina SMPC 1-estearoil, 2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SOPC 1-estearoil, 2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SPPC 1-estearoil, 2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina REFERENCIAS [1] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495-1501. [2] Heyes et al. (2005) J Controlled Reléase 107 :276-87. [3] WO2005/121348. [4] Liposomes: Methods and Protocols, Volumen 1: Pharmaceutical Nanocarriers : Methods and Protocols. (ed. eissig) . Humana Press, 2009. ISBN 160327359X. [5] Liposome Technology, volúmenes I, II & III. (ed.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un liposoma dentro del cual está encapsulado el ARN que codifica un inmunógeno de interés, caracterizado porque comprende por lo menos un lípido que incluye un radical de polietilenglicol, de modo que el polietilenglicol está presente en el exterior del liposoma, en donde la masa molecular promedio del polietilenglicol está entre 1 kDa y 3 kDa.
2. El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende PEG-DMG y/o un lípido de la fórmula (X) .
3. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene un diámetro en el intervalo de 80-160 nm.
4. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un lípido con un grupo de cabeza catiónico.
5. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un lípido con un grupo de cabeza zwitteriónico.
6. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARN es un ARN de auto-replicación.
7. El liposoma de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula de ARN de auto-replicación codifica (i) un ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir el ARN de la molécula de ARN de auto-replicación y (ii) un inmunogeno.
8. El liposoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula de ARN tiene dos marcos de lectura abiertos, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y el segundo de los cuales codifica un inmunogeno.
9. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la molécula de ARN es de 9000-12000 nucleótidos de largo.
10. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porgue el inmunogeno puede provocar una respuesta inmune in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
12. Un método para provocar una respuesta inmune protectora en un vertebrado, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al vertebrado, una cantidad efectiva del liposoma de conformidad con las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11.
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